JP2022524379A - 強力ながん治療薬としての合胞体腫瘍溶解性単純ヘルペス変異体 - Google Patents

強力ながん治療薬としての合胞体腫瘍溶解性単純ヘルペス変異体 Download PDF

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Abstract

本開示は、非天然単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）、ＨＳＶを含む、またはあるいはＨＳＶから本質的になる、またはさらにＨＳＶからなる組成物、およびＨＳＶを作製する方法、または細胞にＨＳＶを感染させる方法を提供する。がんを処置することまたはがん細胞の成長もしくは転移を阻害することを必要とする対象において、がんを処置することまたはがん細胞の成長もしくは転移を阻害する方法もまた、本明細書において提供される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、それぞれ２０１９年３月１４日および２０１９年１１月８日に出願された米国仮出願第６２／８１８，５７７号明細書および第６２／９３２，７２５号明細書に対する優先権を主張し、その各々の内容は参照により本開示に組み込まれる。
政府支援の記載
本発明は、国立衛生研究所および国立がん研究所（ＮＩＨ／ＮＣＩ）によって授与された助成金番号ＣＡ２２３１０４の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年３月１３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は１０６８８７－７６６０＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは２４５，０１４バイトである。
背景
最近ＦＤＡが黒色腫を処置するために承認したＩｍｌｙｇｉｃ（商標）などの腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）の抗腫瘍効果は、極めて有望である。これらのベクターは、（１）細胞の直接感染および溶解によって決定される溶解期、ならびに（２）抗腫瘍免疫の刺激によって駆動される免疫期、という２つの主要な作用機序を有する。しかしながら、一部のがんではウイルスの拡散が本質的に遅いため、全てのがんが同様に応答するわけではない。培養において、ウイルスに対する細胞の成長許容性のレベルは異なる。動物では、腫瘍の間質および免疫細胞組成の変動が、ウイルス拡散および免疫反応の能力の変動をもたらす。したがって、最適な治療上の有用性に到達するために溶解期の効力を改善するための戦略が依然として必要とされている。本開示は、これらのニーズを満たし、関連する利点も提供する。
概要
本開示は、非天然単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）であって、前記ウイルスが、（ａ）糖タンパク質Ｅ（「ｇＥ」）をコードする遺伝子、（ｂ）感染細胞タンパク質０（「ＩＣＰ０」）をコードする遺伝子、（ｃ）ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１をコードする遺伝子、（ｄ）ＩＣＰ８をコードする遺伝子または（ｅ）ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子の１またはそれより多くにおける変異を含む、または変異から本質的になる、または変異からなる非天然単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）を提供する。
別の態様において、本開示は、本開示の非天然ＨＳＶを含む、または本開示の非天然ＨＳＶから本質的になる、または本開示の非天然ＨＳＶからなる組成物または医薬組成物を提供する。別の態様において、細胞を感染させるための方法であって、細胞を非天然ＨＳＶまたは非天然ＨＳＶを含有する組成物もしくは医薬組成物と接触させることを含み、またはあるいは接触させることから本質的になり、またはなおさらに接触させることからなる、方法が本開示において提供される。
一態様では、本開示は、本開示の非天然ＨＳＶを調製する方法であって、非天然ＨＳＶウイルス粒子中の遺伝子を変異させることもしくは非天然ＨＳＶ中に導入遺伝子を導入することを含む、またはあるいは非天然ＨＳＶウイルス粒子中の遺伝子を変異させることもしくは非天然ＨＳＶ中に導入遺伝子を導入することから本質的になる、またはなおさらに非天然ＨＳＶウイルス粒子中の遺伝子を変異させることもしくは非天然ＨＳＶ中に導入遺伝子を導入することからなる、方法を提供する。別の態様において、非天然ＨＳＶベクターを作製する方法は、（ａ）１７ＴｅｒｍＡ ＨＳＶベクターおよびｒＲｐ４５０ ＨＳＶベクターを宿主細胞に導入することと；（ｂ）少なくとも３継代にわたって宿主細胞を成長させることと；ならびに（ｃ）宿主細胞によって産生されたＨＳＶ粒子を単離することと；を含む、またはあるいは（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から本質的になる、またはなおさらに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる。
がん細胞または転移性がん細胞の成長または転移を阻害する方法であって、細胞を、有効量の、非天然ＨＳＶベクターまたは本明細書に記載の非天然ＨＳＶベクターを含有する組成物もしくは医薬組成物と接触させることを含む、または接触させることから本質的になる、または接触させることからなる方法も提供される。接触させることは、インビトロまたはインビボである。一態様において、接触させることは、非天然ＨＳＶまたは組成物もしくは医薬組成物を対象に投与することによるインビボである。インビトロでは、本方法は、非天然ＨＳＶを細胞と接触させることによって実施される。インビトロ法は、新しい治療を試験するために、または治療が処置されるべきがんに適しているかどうかを決定するための個別化されたアッセイとして使用することができる。さらなるがん治療は、開示された方法と同時または逐次であり得る治療と組み合わせることができる。
処置されるべきがん細胞は、固形腫瘍または血液がん、例えば癌または肉腫であり得、このようなものの非限定的な例としては、膵臓がん、腎臓がん、小細胞肺がん、脳がん、神経芽細胞腫、神経がん、骨がん、リンパ腫、骨髄腫、結腸がん、子宮がん、乳がん、白血病、肝臓がん、前立腺がん、皮膚がんまたは黒色腫が挙げられる。細胞は、任意の種、例えば哺乳動物およびヒトのものであり、インビトロで実施される場合、細胞は、培養された細胞株または初代細胞、例えば組織生検からのものであり得る。細胞は、成体もしくは若年細胞またはがん幹細胞（すなわち、正常な幹細胞と関連する特徴、特に、特定のがん試料中に見出される全ての細胞型を生じさせる能力を有するがん細胞）または正常な幹細胞と関連するこのような特徴のないがん細胞であり得る。一実施形態において、細胞は、Ｎ－ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質（ＭＹＣＮ）を発現し、および／または非がん細胞よりも高いレベルでＭＹＣＮを発現する。
別の態様において、がんもしくは転移性がんを処置することまたはがん細胞の成長もしくは転移を阻害することを必要とする対象においてがんもしくは転移性がんを処置し、またはがん細胞の成長もしくは転移を阻害する方法であって、有効量の、本開示の非天然ＨＳＶ、組成物もしくは医薬組成物を対象に投与することを含む、またはあるいは投与することから本質的になる、またはなおさらに投与することからなる方法も本開示において、提供される。処置されるべき対象は、任意の種、例えば哺乳動物およびヒト、例えばイヌ、ウマ、ウシ、ネコ、サル、ラットまたはマウスであり得る。投与は、第一選択治療、第二選択治療、第三選択治療、第四選択治療または第五選択治療としてであり得る。さらなるがん治療は、開示された方法と同時または逐次であり得る治療と組み合わせることができる。処置されるべきがんは、固形腫瘍または血液がん、例えば癌または肉腫であり得、このようなものの非限定的な例としては、膵臓がん、腎臓がん、小細胞肺がん、脳がん、神経芽細胞腫、神経がん、骨がん、リンパ腫、骨髄腫、結腸がん、子宮がん、乳がん、白血病、肝臓がん、前立腺がん、皮膚がんまたは黒色腫が挙げられる。
本開示の方法は、疾患の寛解または進行をモニタリングするための適切な診断と組み合わせることができる。このようなモニタリングのためのいくつかの方法が当技術分野で公知である。
一態様において、本開示は、細胞溶解を誘導する方法であって、細胞を、有効量の、本開示の非天然ＨＳＶ、組成物および／もしくは医薬組成物と接触させることを含む、またはあるいは接触させることから本質的になる、またはなおさらに接触させることからなる方法を提供する。接触させることは、インビトロまたはインビボである。一態様において、接触させることは、非天然ＨＳＶまたは組成物もしくは医薬組成物を対象に投与することによるインビボである。インビトロでは、本方法は、非天然ＨＳＶを細胞と接触させることによって実施される。インビトロ法は、新しい治療を試験するために、または治療が処置されるべき対象に適しているかどうかを決定するための個別化されたアッセイとして使用することができる。さらなる細胞溶解治療は、開示された方法と同時または逐次であり得る治療と組み合わせることができる。
処置されるべき細胞は、固形腫瘍または血液がん、例えば癌または肉腫であり得、このようなものの非限定的な例としては、膵臓がん、腎臓がん、小細胞肺がん、脳がん、神経芽細胞腫、神経がん、骨がん、リンパ腫、骨髄腫、結腸がん、子宮がん、乳がん、白血病、肝臓がん、前立腺がん、皮膚がんまたは黒色腫が挙げられる。細胞は、任意の種、例えば哺乳動物およびヒトのものであり、インビトロで実施される場合、細胞は、培養された細胞株または初代細胞、例えば組織生検からのものであり得る。細胞は、成体もしくは若年細胞、またはがん幹細胞、または正常な幹細胞と関連する特徴を有しないがん細胞であり得る。治療は、治療の有効性、例えばがんの寛解または進行について試験するための適切なアッセイと組み合わせることができる。
別の態様において、本開示は、本開示の非天然ＨＳＶ、組成物および／もしくは医薬組成物を含む、またはあるいは本開示の非天然ＨＳＶ、組成物および／もしくは医薬組成物から本質的になる、またはなおさらに本開示の非天然ＨＳＶ、組成物および／もしくは医薬組成物からなるキットも提供する。
図１Ａ～図１Ｂは、Ｍｕｔ－３およびＭｕｔ－３Δ３４．５（図１Ａ）ならびにＭｕｔ－３ ＳＮＰ（図１Ｂ）の生成の概略図を示す。非許容性系（non-permissive line）中の１７ＴｅｒｍＡとｒＲｐ４５０を混合する連続継代からＨＳＶ Ｍｕｔ－３を単離し（「指向性進化」）、遺伝子編集（「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９」ステップとして表記されている）を通じて、弱毒化された変異体Ｍｕｔ－３Δ３４．５を構築した（図１Ａ）。図１Ｂは、Ｍｕｔ－３とその親ウイルスとの配列比較を示す。Ｍｕｔ－３においていずれかの親と異なる非同義変異には、ＵＬ１５、ＵＬ２９、ＵＳ８、ＲＬ１およびＲＬ２を含めて、右下方向への斜線が付されている。１７ＴｅｒｍＡと同一のゲノム配列は下のパネル中で空欄として示されており、ｒＲｐ４５０と同一のゲノム配列には左下方向への斜線が付されている。
図２Ａ～２Ｃは、Ｍｕｔ－３、Ｍｕｔ－３Δ３４．５、ｒＲｐ４５０および１７ＴｅｒｍＡのプラークサイズおよび受容体使用を示す。出願人は、４つのウイルスのプラークアッセイを同時に行い、３日後に、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＨＳ Ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＢＺ－ＩＩ Ａｎａｌｙｚｅｒを介してプラーク画像をスキャンおよび分析した。（図２Ａ）４つのウイルスの生の画像（上）およびマスクした画像（下、番号が付されたプラーク）。（図２Ｂ）４つのウイルスの平均プラークサイズ（左）およびプラークの数（右）を計算した。Ｍｕｔ－３およびＭｕｔ－３Δ３４．５のプラークサイズは、親ウイルスｒＲｐ４５０および１７ＴｅｒｍＡのいずれよりも有意に大きい。（図２Ｃ）ＣＨＯ細胞セットのインビトロ細胞傷害性／ＭＴＳアッセイ。出願人は、ＣＨＯ－Ｋ１（印のとおり）、ＣＨＯ－ネクチン－１（印のとおり）、ＣＨＯ－ネクチン－２（印のとおり）およびＣＨＯ－ＨＶＥＭ（印のとおり）に、異なる感染多重度（ＭＯＩ）で４つのウイルスを感染させた。出願人は、ウイルス感染の３日後（ｐｖｉ）に、非処理対照と比較して、細胞生存比色細胞増殖／ＭＴＳアッセイを測定した。ＣＨＯ－ネクチン－１およびＣＨＯ－ＨＶＥＭのみが４つのウイルスの処理に対して感受性であったが、ＣＨＯ－Ｋ１またはＣＨＯ－ネクチン－２（主にＨＳＶ－２侵入用）は感受性でなく、Ｍｕｔ－３およびＭｕｔ－３Δ３４．５は受容体バリアを迂回せず、細胞に感染するために標準的なＨＳＶ侵入受容体になお依拠（ｒｅｌａｙ ｏｎ）し得ることを示唆している。 図２Ａ～２Ｃは、Ｍｕｔ－３、Ｍｕｔ－３Δ３４．５、ｒＲｐ４５０および１７ＴｅｒｍＡのプラークサイズおよび受容体使用を示す。出願人は、４つのウイルスのプラークアッセイを同時に行い、３日後に、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＨＳ Ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＢＺ－ＩＩ Ａｎａｌｙｚｅｒを介してプラーク画像をスキャンおよび分析した。（図２Ａ）４つのウイルスの生の画像（上）およびマスクした画像（下、番号が付されたプラーク）。（図２Ｂ）４つのウイルスの平均プラークサイズ（左）およびプラークの数（右）を計算した。Ｍｕｔ－３およびＭｕｔ－３Δ３４．５のプラークサイズは、親ウイルスｒＲｐ４５０および１７ＴｅｒｍＡのいずれよりも有意に大きい。（図２Ｃ）ＣＨＯ細胞セットのインビトロ細胞傷害性／ＭＴＳアッセイ。出願人は、ＣＨＯ－Ｋ１（印のとおり）、ＣＨＯ－ネクチン－１（印のとおり）、ＣＨＯ－ネクチン－２（印のとおり）およびＣＨＯ－ＨＶＥＭ（印のとおり）に、異なる感染多重度（ＭＯＩ）で４つのウイルスを感染させた。出願人は、ウイルス感染の３日後（ｐｖｉ）に、非処理対照と比較して、細胞生存比色細胞増殖／ＭＴＳアッセイを測定した。ＣＨＯ－ネクチン－１およびＣＨＯ－ＨＶＥＭのみが４つのウイルスの処理に対して感受性であったが、ＣＨＯ－Ｋ１またはＣＨＯ－ネクチン－２（主にＨＳＶ－２侵入用）は感受性でなく、Ｍｕｔ－３およびＭｕｔ－３Δ３４．５は受容体バリアを迂回せず、細胞に感染するために標準的なＨＳＶ侵入受容体になお依拠（ｒｅｌａｙ ｏｎ）し得ることを示唆している。
図３Ａ～図３Ｃ：Ｍｕｔ－３Δ３４．５は、ヒトおよびマウスの神経芽細胞腫細胞を死滅させるのに１７ＴｅｒｍＡ（γ１３４．５－ヌル）より強力であり、これはインビトロでの感染性ウイルス粒子の収量の増加によるものではない。（図３Ａ）神経芽細胞腫細胞株のインビトロ細胞傷害性／ＭＴＳアッセイ。出願人は、ヒト（ＳＫ－Ｎ－ＡＳ）およびマウス（９７５Ａ２）の両神経芽細胞腫細胞を、Ｍｕｔ－３（印のとおり）、Ｍｕｔ－３Δ３４．５（印のとおり）または１７ＴｅｒｍＡ（印のとおり）を用いて異なる（ＭＯＩ）で感染させた。出願人は、非処理対照と比較して、ウイルス感染の４日後に、ＭＴＳアッセイによって細胞生存を測定した。Ｎ＝６、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、２元配置分散分析。（図３Ｂ）インビトロウイルス複製アッセイ。出願人は、ＭＯＩ＝０．１（上パネル、ヒト系ＳＫ－Ｎ－ＡＳ）またはＭＯＩ＝０．５（下パネル、マウス系９７５Ａ２）で、１７ＴｅｒｍＡ（印のとおり）またはＭｕｔ－３Δ３４．５（印のとおり）を神経芽細胞腫細胞株に感染させ、ウイルス感染の２時間後に細胞をＰＢＳで洗浄した。出願人は、ウイルス感染の２、２４、４８および７２時間後に細胞溶解物を採集し、プラークアッセイによってウイルス収量を決定した。Ｎ＝３。エラーバーは標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、２元配置分散分析。（図３Ｃ）Ｍｕｔ－３Δ３４．５に感染した神経芽細胞腫培養物と１７ＴｅｒｍＡに感染した神経芽細胞腫培養物中での相対的な遊離して放出されたビリオンの比較。出願人は、図３Ｂにおいて全培養物として測定したことに代えて、上清およびペレットを採取して２つの分離した部分で経時的にプラークアッセイを行うことによって、（図３Ｂ）に記載されているのと同様のアッセイを行った。出願人は、全培養物（上清＋ペレット）に対する上清中の感染性粒子の割合として相対的遊離ビリオンを計算した。Ｍｕｔ－３Δ３４．５は、４８時間で、１７ＴｅｒｍＡより有意に多くの相対的な放出されたビリオンを示す。Ｎ＝３。エラーバーは標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５。 図３Ａ～図３Ｃ：Ｍｕｔ－３Δ３４．５は、ヒトおよびマウスの神経芽細胞腫細胞を死滅させるのに１７ＴｅｒｍＡ（γ１３４．５－ヌル）より強力であり、これはインビトロでの感染性ウイルス粒子の収量の増加によるものではない。（図３Ａ）神経芽細胞腫細胞株のインビトロ細胞傷害性／ＭＴＳアッセイ。出願人は、ヒト（ＳＫ－Ｎ－ＡＳ）およびマウス（９７５Ａ２）の両神経芽細胞腫細胞を、Ｍｕｔ－３（印のとおり）、Ｍｕｔ－３Δ３４．５（印のとおり）または１７ＴｅｒｍＡ（印のとおり）を用いて異なる（ＭＯＩ）で感染させた。出願人は、非処理対照と比較して、ウイルス感染の４日後に、ＭＴＳアッセイによって細胞生存を測定した。Ｎ＝６、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、２元配置分散分析。（図３Ｂ）インビトロウイルス複製アッセイ。出願人は、ＭＯＩ＝０．１（上パネル、ヒト系ＳＫ－Ｎ－ＡＳ）またはＭＯＩ＝０．５（下パネル、マウス系９７５Ａ２）で、１７ＴｅｒｍＡ（印のとおり）またはＭｕｔ－３Δ３４．５（印のとおり）を神経芽細胞腫細胞株に感染させ、ウイルス感染の２時間後に細胞をＰＢＳで洗浄した。出願人は、ウイルス感染の２、２４、４８および７２時間後に細胞溶解物を採集し、プラークアッセイによってウイルス収量を決定した。Ｎ＝３。エラーバーは標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、２元配置分散分析。（図３Ｃ）Ｍｕｔ－３Δ３４．５に感染した神経芽細胞腫培養物と１７ＴｅｒｍＡに感染した神経芽細胞腫培養物中での相対的な遊離して放出されたビリオンの比較。出願人は、図３Ｂにおいて全培養物として測定したことに代えて、上清およびペレットを採取して２つの分離した部分で経時的にプラークアッセイを行うことによって、（図３Ｂ）に記載されているのと同様のアッセイを行った。出願人は、全培養物（上清＋ペレット）に対する上清中の感染性粒子の割合として相対的遊離ビリオンを計算した。Ｍｕｔ－３Δ３４．５は、４８時間で、１７ＴｅｒｍＡより有意に多くの相対的な放出されたビリオンを示す。Ｎ＝３。エラーバーは標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５。 図３Ａ～図３Ｃ：Ｍｕｔ－３Δ３４．５は、ヒトおよびマウスの神経芽細胞腫細胞を死滅させるのに１７ＴｅｒｍＡ（γ１３４．５－ヌル）より強力であり、これはインビトロでの感染性ウイルス粒子の収量の増加によるものではない。（図３Ａ）神経芽細胞腫細胞株のインビトロ細胞傷害性／ＭＴＳアッセイ。出願人は、ヒト（ＳＫ－Ｎ－ＡＳ）およびマウス（９７５Ａ２）の両神経芽細胞腫細胞を、Ｍｕｔ－３（印のとおり）、Ｍｕｔ－３Δ３４．５（印のとおり）または１７ＴｅｒｍＡ（印のとおり）を用いて異なる（ＭＯＩ）で感染させた。出願人は、非処理対照と比較して、ウイルス感染の４日後に、ＭＴＳアッセイによって細胞生存を測定した。Ｎ＝６、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、２元配置分散分析。（図３Ｂ）インビトロウイルス複製アッセイ。出願人は、ＭＯＩ＝０．１（上パネル、ヒト系ＳＫ－Ｎ－ＡＳ）またはＭＯＩ＝０．５（下パネル、マウス系９７５Ａ２）で、１７ＴｅｒｍＡ（印のとおり）またはＭｕｔ－３Δ３４．５（印のとおり）を神経芽細胞腫細胞株に感染させ、ウイルス感染の２時間後に細胞をＰＢＳで洗浄した。出願人は、ウイルス感染の２、２４、４８および７２時間後に細胞溶解物を採集し、プラークアッセイによってウイルス収量を決定した。Ｎ＝３。エラーバーは標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、２元配置分散分析。（図３Ｃ）Ｍｕｔ－３Δ３４．５に感染した神経芽細胞腫培養物と１７ＴｅｒｍＡに感染した神経芽細胞腫培養物中での相対的な遊離して放出されたビリオンの比較。出願人は、図３Ｂにおいて全培養物として測定したことに代えて、上清およびペレットを採取して２つの分離した部分で経時的にプラークアッセイを行うことによって、（図３Ｂ）に記載されているのと同様のアッセイを行った。出願人は、全培養物（上清＋ペレット）に対する上清中の感染性粒子の割合として相対的遊離ビリオンを計算した。Ｍｕｔ－３Δ３４．５は、４８時間で、１７ＴｅｒｍＡより有意に多くの相対的な放出されたビリオンを示す。Ｎ＝３。エラーバーは標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５。
図４Ａ～４Ｈ：神経芽細胞腫細胞におけるＭｕｔ３Δ３４．５および１７ＴｅｒｍＡ取り込みのＴＥＭ分析。神経芽細胞腫細胞ＳＫ－Ｎ－ＡＳおよび９７５Ａ２に、５０のＭＯＩで、３７℃で２０分間、Ｍｕｔ－３Δ３４．５または１７ＴｅｒｍＡを感染させた。（図４Ａ、４Ｂ、４Ｅおよび４Ｆ）挿入図は、Ｍｕｔ－３Δ３４．５ビリオンが主に細胞内小胞中（図４Ｂの右側の矢印を除く矢印）に見られ、原形質膜と融合したもの（図４Ｂの右側の矢印）はほとんど見られなかったことを示す。（図４Ｃ、４Ｄ、４Ｇおよび４Ｈ）挿入図は、１７ＴｅｒｍＡビリオンが主に細胞内小胞中（図４Ｇの下側の矢印を除く矢印）に見られ、原形質膜と融合しているもの（図４Ｇの下側の矢印）はほとんど見られなかったことを示す。ＴＥＭ分析は、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ－７６５０ ＴＥＭを介して行った。Ｎ：核。スケールバー：５００ｎｍ。
図５Ａ～５Ｃ：弱毒化された１７Δ３４．５ビリオンは、神経芽細胞腫細胞において１７ＴｅｒｍＡと同程度の効力を示した。出願人は、野生型株１７＋のｇ１３４．５遺伝子をＥＧＦＰ発現カセットで置き換えるためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術を介して１７Δ３４．５を作製した。（図５Ａ）ベロ細胞上の１７Δ３４．５クローンのプラーク画像。Ｂ４およびＧ１クローンはいずれも、３回のプラーク精製後に１００％のＧＦＰ陽性（左パネル）の非合胞体（右パネル、位相差）プラークを産生する。ウイルス感染の２日後。画像は、ＥＶＯＳ（登録商標）ＦＬ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを介して撮影した。スケールバー：４００μｍ（図５Ｂ）神経芽細胞腫細胞株のインビトロ細胞傷害性／ＭＴＳアッセイ。出願人は、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ－Ｎ－ＡＳおよび９７５Ａ２に、異なるＭＯＩで、野生型株１７＋（印のとおり）、１７ＴｅｒｍＡ（印のとおり）、１７Δ３４．５クローンＢ４（印のとおり）または１７Δ３４．５クローンＧ１（印のとおり）を感染させた。出願人は、非処理対照と比較して、ウイルス感染の３日後に、ＭＴＳアッセイによって細胞生存を測定した。いずれの１７Δ３４．５クローンの効力も、それらの野生型対応物である株１７＋より有意に低かったが、１７ＴｅｒｍＡと同程度であった。ＥＧＦＰカセットおよびＥＧＦＰ ＤＮＡ配列を図５Ｃに示す（配列番号１１）。 図５Ａ～５Ｃ：弱毒化された１７Δ３４．５ビリオンは、神経芽細胞腫細胞において１７ＴｅｒｍＡと同程度の効力を示した。出願人は、野生型株１７＋のｇ１３４．５遺伝子をＥＧＦＰ発現カセットで置き換えるためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術を介して１７Δ３４．５を作製した。（図５Ａ）ベロ細胞上の１７Δ３４．５クローンのプラーク画像。Ｂ４およびＧ１クローンはいずれも、３回のプラーク精製後に１００％のＧＦＰ陽性（左パネル）の非合胞体（右パネル、位相差）プラークを産生する。ウイルス感染の２日後。画像は、ＥＶＯＳ（登録商標）ＦＬ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを介して撮影した。スケールバー：４００μｍ（図５Ｂ）神経芽細胞腫細胞株のインビトロ細胞傷害性／ＭＴＳアッセイ。出願人は、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ－Ｎ－ＡＳおよび９７５Ａ２に、異なるＭＯＩで、野生型株１７＋（印のとおり）、１７ＴｅｒｍＡ（印のとおり）、１７Δ３４．５クローンＢ４（印のとおり）または１７Δ３４．５クローンＧ１（印のとおり）を感染させた。出願人は、非処理対照と比較して、ウイルス感染の３日後に、ＭＴＳアッセイによって細胞生存を測定した。いずれの１７Δ３４．５クローンの効力も、それらの野生型対応物である株１７＋より有意に低かったが、１７ＴｅｒｍＡと同程度であった。ＥＧＦＰカセットおよびＥＧＦＰ ＤＮＡ配列を図５Ｃに示す（配列番号１１）。 図５Ａ～５Ｃ：弱毒化された１７Δ３４．５ビリオンは、神経芽細胞腫細胞において１７ＴｅｒｍＡと同程度の効力を示した。出願人は、野生型株１７＋のｇ１３４．５遺伝子をＥＧＦＰ発現カセットで置き換えるためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術を介して１７Δ３４．５を作製した。（図５Ａ）ベロ細胞上の１７Δ３４．５クローンのプラーク画像。Ｂ４およびＧ１クローンはいずれも、３回のプラーク精製後に１００％のＧＦＰ陽性（左パネル）の非合胞体（右パネル、位相差）プラークを産生する。ウイルス感染の２日後。画像は、ＥＶＯＳ（登録商標）ＦＬ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを介して撮影した。スケールバー：４００μｍ（図５Ｂ）神経芽細胞腫細胞株のインビトロ細胞傷害性／ＭＴＳアッセイ。出願人は、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ－Ｎ－ＡＳおよび９７５Ａ２に、異なるＭＯＩで、野生型株１７＋（印のとおり）、１７ＴｅｒｍＡ（印のとおり）、１７Δ３４．５クローンＢ４（印のとおり）または１７Δ３４．５クローンＧ１（印のとおり）を感染させた。出願人は、非処理対照と比較して、ウイルス感染の３日後に、ＭＴＳアッセイによって細胞生存を測定した。いずれの１７Δ３４．５クローンの効力も、それらの野生型対応物である株１７＋より有意に低かったが、１７ＴｅｒｍＡと同程度であった。ＥＧＦＰカセットおよびＥＧＦＰ ＤＮＡ配列を図５Ｃに示す（配列番号１１）。 図５Ａ～５Ｃ：弱毒化された１７Δ３４．５ビリオンは、神経芽細胞腫細胞において１７ＴｅｒｍＡと同程度の効力を示した。出願人は、野生型株１７＋のｇ１３４．５遺伝子をＥＧＦＰ発現カセットで置き換えるためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術を介して１７Δ３４．５を作製した。（図５Ａ）ベロ細胞上の１７Δ３４．５クローンのプラーク画像。Ｂ４およびＧ１クローンはいずれも、３回のプラーク精製後に１００％のＧＦＰ陽性（左パネル）の非合胞体（右パネル、位相差）プラークを産生する。ウイルス感染の２日後。画像は、ＥＶＯＳ（登録商標）ＦＬ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを介して撮影した。スケールバー：４００μｍ（図５Ｂ）神経芽細胞腫細胞株のインビトロ細胞傷害性／ＭＴＳアッセイ。出願人は、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ－Ｎ－ＡＳおよび９７５Ａ２に、異なるＭＯＩで、野生型株１７＋（印のとおり）、１７ＴｅｒｍＡ（印のとおり）、１７Δ３４．５クローンＢ４（印のとおり）または１７Δ３４．５クローンＧ１（印のとおり）を感染させた。出願人は、非処理対照と比較して、ウイルス感染の３日後に、ＭＴＳアッセイによって細胞生存を測定した。いずれの１７Δ３４．５クローンの効力も、それらの野生型対応物である株１７＋より有意に低かったが、１７ＴｅｒｍＡと同程度であった。ＥＧＦＰカセットおよびＥＧＦＰ ＤＮＡ配列を図５Ｃに示す（配列番号１１）。 図５Ａ～５Ｃ：弱毒化された１７Δ３４．５ビリオンは、神経芽細胞腫細胞において１７ＴｅｒｍＡと同程度の効力を示した。出願人は、野生型株１７＋のｇ１３４．５遺伝子をＥＧＦＰ発現カセットで置き換えるためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術を介して１７Δ３４．５を作製した。（図５Ａ）ベロ細胞上の１７Δ３４．５クローンのプラーク画像。Ｂ４およびＧ１クローンはいずれも、３回のプラーク精製後に１００％のＧＦＰ陽性（左パネル）の非合胞体（右パネル、位相差）プラークを産生する。ウイルス感染の２日後。画像は、ＥＶＯＳ（登録商標）ＦＬ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを介して撮影した。スケールバー：４００μｍ（図５Ｂ）神経芽細胞腫細胞株のインビトロ細胞傷害性／ＭＴＳアッセイ。出願人は、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ－Ｎ－ＡＳおよび９７５Ａ２に、異なるＭＯＩで、野生型株１７＋（印のとおり）、１７ＴｅｒｍＡ（印のとおり）、１７Δ３４．５クローンＢ４（印のとおり）または１７Δ３４．５クローンＧ１（印のとおり）を感染させた。出願人は、非処理対照と比較して、ウイルス感染の３日後に、ＭＴＳアッセイによって細胞生存を測定した。いずれの１７Δ３４．５クローンの効力も、それらの野生型対応物である株１７＋より有意に低かったが、１７ＴｅｒｍＡと同程度であった。ＥＧＦＰカセットおよびＥＧＦＰ ＤＮＡ配列を図５Ｃに示す（配列番号１１）。
図６Ａ～６Ｃ：Ｍｕｔ－３Δ３４．５は、１７Δ３４．５と比較して、はるかに速いウイルス遺伝子導入および細胞殺滅を示す。本出願人は、異なるＭＯＩで、（図６Ａ）Ｖｅｒｏ（図６Ｂ）ＳＫ－Ｎ－ＡＳ（図６Ｃ）９７５Ａ２細胞を、モックＣＴＬ、Ｍｕｔ－３Δ３４．５または１７Δ３４．５のいずれかで処理し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ生細胞を使用して、ＧＦＰ陽性領域（上のパネル）および細胞密集度（下のパネル）を経時的にモニタリングした。条件ごとにＮ＝６ウェル、各時点についてウェルごとにｎ＝２測定。ウイルス感染後（ｐｖｉ）。マン・ホイットニーのＵ検定を使用して、（図６Ａ）について、ウイルス間で最大ＧＦＰ面積までの時間を比較する。エラーバーは標準偏差を表す。
図７：Ｍｕｔ－３Δ３４．５は、インビボでのヒト神経芽細胞腫成長を制御するために１７ＴｅｒｍＡより有効である。ｓｕｂ－ｑ ＳＫ－Ｎ－ＡＳ腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）対照（印のとおり、ｎ＝８）、３用量の１ｅ７ ｐｆｕの１７ＴｅｒｍＡ（印のとおり、ｎ＝８）またはＭｕｔ－３Δ３４．５（印のとおり、ｎ＝９）のいずれかを腫瘍内注射した。カプランマイヤー生存曲線をプロットした。ログランク検定を使用して、１７ＴｅｒｍＡとＭｕｔ－３Δ３４．５の間の統計学的有意性をスコア化した。＊ｐ＜０．０５。
図８Ａ～８Ｃ：Ｍｕｔ－３の弱毒化されたバージョンであるＭｕｔ－３ΔＩＣＰ６は、腫瘍溶解性ヘルペスウイルスｒＲｐ４５０と比較して、ヒト神経芽細胞腫細胞株ＣＨＰ－１３４において優れた細胞傷害性を誘導する。（図８Ａ）ＩＣＰ－６をコードするＵＬ３９遺伝子がＣＭＶによって駆動されるＧＦＰレポーターカセットで置き換えられた、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集戦略によって構築されたＭｕｔ－３ΔＩＣＰ６のマップ。ヒト神経芽細胞腫細胞株におけるＭｕｔ－３、ｒＲｐ４５０およびＭｕｔ３－ΔＩＣＰ６／Ｄ７－１の細胞傷害性プロフィールを比較するＭＴＳ細胞生存率アッセイ。９６ウェルディッシュ中に４０００細胞／ウェルで細胞を播種し、３７℃で一晩インキュベートし、次いで、細胞あたり０．００１、０．０１、０．１および１感染性ウイルス粒子の感染多重度（ＭＯＩ）で、列挙された各ウイルスを感染させた。アッセイは、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６ ＡＱｕｅｓｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ／ＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、製造者の指示に従って感染後３日目または４日目に行った。各サンプル群を四連で実行し、結果は非感染対照と比較したパーセント細胞生存として示された。エラーバーは標準偏差を表す。統計学的有意性は、ｔ検定を用いて評価した。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１。図８Ｂ ＳＫ－Ｎ－ＡＳおよび図８Ｃ ＣＨＰ－１３４は、結果をグラフで示す。
図９Ａ～９Ｂ：Ｍｕｔ－３ΔＩＣＰ６は、ｒＲｐ４５０と比較して、マウス神経芽細胞腫細胞株Ｎｅｕｒｏ－２ａおよび９７５Ａ２において優れた細胞傷害性を誘導する。図９Ａ～９Ｂは、マウス神経芽細胞腫細胞株におけるＭｕｔ－３、ｒＲｐ４５０およびＭｕｔ３－ΔＩＣＰ６／Ｄ７－１の細胞傷害性プロフィールを比較するＭＴＳ細胞生存率アッセイの結果を示す。９６ウェルディッシュ中に４０００細胞／ウェルで細胞を播種し、３７℃で一晩インキュベートし、次いで、細胞あたり０．００１、０．０１、０．１および１感染性ウイルス粒子の感染多重度（ＭＯＩ）で、列挙された各ウイルスを感染させた。アッセイは、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６ ＡＱｕｅｓｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ／ＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、製造者の指示に従って感染後３日目または４日目に行った。各サンプル群を四連で実行し、結果は非感染対照と比較したパーセント細胞生存として示された。エラーバーは標準偏差を表す。統計学的有意性は、ｔ検定を用いて評価した。＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１。図９Ａ：Ｎｅｕｒｏ－２ａおよび図９Ｂ：９７５Ａ２。
図１０Ａ～図１０Ｂ：Ｍｕｔ－３ΔＩＣＰ６は、４８時間および７２時間の感染期間にわたって、マウス神経芽細胞腫細胞株９７５Ａ２においてｒＲｐ４５０より有意に高いウイルス収量をもたらす。マウス９７５Ａ２（図１０Ａ）およびヒトＳＫ－Ｎ－ＡＳ（図１０Ｂ）神経芽細胞腫細胞を１２ウェルディッシュ中に２×１０５細胞／ウェルで播種し、３７℃で一晩インキュベートし、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞（図１０Ｂ）についてはＭＯＩ ０．０１で、または９７５Ａ２細胞（図１０Ａ）についてはＭＯＩ ０．５で、２０分ごとに穏やかに振盪しながら、２００μＬの無血清培地中で各ウイルスを２時間感染させた。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１ｍＬの完全培地で覆った。次いで、感染の２、２４、４８および７２時間後に細胞および上清を収集し、３回凍結解凍し、段階希釈し、標準的なプラークアッセイによって感染性ウイルス収量を決定するためにベロ細胞に対して滴定した。各試料は、３連でアッセイした。エラーバーは標準偏差を表す。統計学的有意性は、ｔ検定を用いて評価した。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
図１１Ａ～１１Ｂ：Ｍｕｔ－３Δ３４．５およびＭｕｔ－３ΔＩＣＰ６は、分化したヒトケラチン細胞に対してＭｕｔ－３ウイルスより有意に効力が低い。製造者の指示に従って、ヒトケラチン細胞成長補助剤が補充されたＥｐｉＬｉｆｅ Ｍｅｄｉａ（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）中で、ヒトケラチン細胞（ＨＦＫ）細胞を成長させた。９６ウェルプレート中に２０００細胞／ウェルの密度で、未分化ＨＦＫ（図１１Ａ）を播種し、一晩培養した。次いで、０．０００４、０．００４、０．０４、０．４および４のＭＯＩで、培養物にＭｕｔ－３、Ｍｕｔ－３Δ３４．５／Ｃ８Ｇ５またはＭｕｔ－３ΔＩＣＰ６ Ｄ７－１を感染させた。ウイルス感染の３日後に、ＭＴＳアッセイによって細胞生存を決定した。播種の２４時間後に、１０％ ＦＢＳおよび１ｍｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２をＨＦＫの培養培地に添加し、感染の前にさらに４８時間ＨＦＫをインキュベートさせることによって、分化したＨＦＫを産生した。ウイルス感染の４日後に、ＭＴＳアッセイによって、分化した細胞の生存（図１１Ｂ）を決定した。各試料は、４連でアッセイした。エラーバーは標準偏差を表す。統計学的有意性は、ｔ検定を用いて評価した。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
１ｅ６ ｐｆｕの野生型ＫＯＳ株ウイルスの静脈内注射は、ナイーブＢｌａｂ／ｃマウスにとって致死的である。Ｍｕｔ－３Δ３４．５およびＭｕｔ－３ΔＩＣＰ６の安全性試験の説明。出願人は、尾静脈を介してナイーブ非腫瘍担持Ｂａｌｂ／ｃマウス（雄２０匹、雌２０匹）に各ウイルスの１ｅ８プラーク形成単位（ｐｆｕ）を注射することによって、ウイルス生体内分布研究を開始した。次いで、出願人は、１、１４、２８、５６および８５日目にこれらの動物を屠殺し（ｎ＝４／時点）、分析のためにそれらの末梢血、精巣（雄）、卵巣（雌）、脾臓、肺、腎臓、心臓、肺および脳を収集した。出願人は、ウイルス投与後最初の２週間は毎日、その後屠殺予定日まで毎週２回、各マウスを観察した。ウイルスを付与する前の各マウスの体重を記録し、その後毎週記録した。並行して、陽性（非安全）対照として、マウスの群に野生型ＫＯＳウイルスを投与した［投与量範囲：１ｅ５～１ｅ７ ｐｆｕ／マウス（ｎ＝３）］。出願人は、採取した器官の病理学的分析も行い、変異型ウイルスを与えられたマウスから得られた試料を野生型ＫＯＳウイルスを与えられた試料と比較した。出願人は、これらのウイルスの複製能を検出するためにプラークアッセイも利用した。結果は、１ｅ５、１ｅ６または１ｅ７ ｐｆｕの野生型ＫＯＳウイルスの単回投与を受けたマウスの生存曲線を示す。
図１３Ａ～１３Ｂ：ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスは、最大１ｅ８ ｐｆｕのＭｕｔ－３Δ３４．５（Ｃ８Ｇ５）またはＭｕｔ－３ΔＩＣＰ６（Ｄ７－１）の静脈内注射に耐えることができる。出願人は安全性および体内分布研究を完了し、最大１ｅ８ ｐｆｕのＭｕｔ－３Δ３４．５（Ｃ８Ｇ５）またはＭｕｔ－３ΔＩＣＰ６（Ｄ７－１）を与えられたマウスが、指定の屠殺日まで（最長８５日目）健康な状態を保つことを身体検査によって見出した。雌マウスでは、プラークアッセイにより、感染後２４時間の時点でのみ、心臓、腎臓、肝臓、卵巣および脾臓における感染性ウイルスの存在が明らかになった。図１３Ａおよび図１３Ｂは、それぞれ雌マウスおよび雄マウスから得られた結果をグラフで示す。
１ｅ６ ｐｆｕまたはそれを超える野生型ＫＯＳウイルスを与えられたマウスの脳、腎臓および卵巣中で、複製しているＨＳＶを検出することができる。図１４は、１ｅ６または１ｅ７ ｐｆｕの野生型ＫＯＳウイルスを注射されたマウスの組織からのプラークアッセイの結果を要約する表である。マウスは、病的状態の外面的徴候（脊柱後弯、嗜眠後肢麻痺など）を示し始めた後、ウイルス注射後（ｐｖｉ）５～６日に屠殺した。「＋」は検出可能なプラーク（複数可）を示し、「－」は検出可能なプラーク（複数可）が存在しないことを示す。灰色の影が付された枠は、これらのデータが入手できないことを示す。
図１５は、ウイルス感染の２４時間後に、１ｅ８ ｐｆｕのＣ８Ｇ５またはＤ７－１を与えられたマウスの肺を除くほとんど全ての採取された組織中で、複製しているＨＳＶが検出され得ることを示す。表は、ウイルス感染の２４時間後の、ＭｕｔΔ３４．５またはＭｕｔ３ΔＩＣＰ６を注射されたマウスの組織からのプラークアッセイの結果を要約する。「＋」は検出可能なプラーク（複数可）を示し、「－」は検出可能なプラーク（複数可）が存在しないことを示す。灰色の影が付された枠は、これらのデータが入手できないことを示す。
図１６は、１ｅ８ ｐｆｕのＣ８Ｇ５またはＤ７－１を与えられたマウスの採取された組織のいずれにおいても、ウイルス感染の１４日後に、複製しているＨＳＶを検出することができないことを示す。表は、ウイルス感染の１４後の、ＭｕｔΔ３４．５またはＭｕｔ３ΔＩＣＰ６を注射されたマウスの組織からのプラークアッセイの結果を要約する。「－」は、検出可能なプラーク（複数可）が存在しないことを示す。
図１７は、１ｅ８ ｐｆｕのＣ８Ｇ５またはＤ７－１を与えられたマウスの採取された組織のいずれにおいても、ウイルス感染の２８日後に、複製しているＨＳＶを検出することができないことを示す。表は、ウイルス感染の２８後の、ＭｕｔΔ３４．５またはＭｕｔ３ΔＩＣＰ６を注射されたマウスの組織からのプラークアッセイの結果を要約する。「－」は、検出可能なプラーク（複数可）が存在しないことを示す。灰色の影が付された枠は、これらのデータが入手できないことを示す。
図１８は、１ｅ８ ｐｆｕのＣ８Ｇ５またはＤ７－１を与えられたマウスの採取された組織のいずれにおいても、ウイルス感染の５６日後に、複製しているＨＳＶを検出することができないことを要約する表である。表は、ウイルス感染の５６後の、ＭｕｔΔ３４．５またはＭｕｔ３ΔＩＣＰ６を注射されたマウスの組織からのプラークアッセイの結果を要約する。「－」は、検出可能なプラーク（複数可）が存在しないことを示す。
図１９は、１ｅ８ ｐｆｕのＣ８Ｇ５またはＤ７－１を与えられたマウスの採取された組織のいずれにおいても、ウイルス感染の８５日後に、複製しているＨＳＶを検出することができないことを示す。表は、ウイルス感染の８５後の、ＭｕｔΔ３４．５またはＭｕｔ３ΔＩＣＰ６を注射されたマウスの組織からのｑＰＣＲおよびプラークアッセイの結果を要約する。「－」は、検出可能なプラーク（複数可）が存在しないことを示す。
図２０Ａ～図２０Ｄは、Ｍｕｔ－３ΔｇＥのプラークサイズがＭｕｔ－３またはＭｕｔ－３Ｄ３４．５（Ｃ８Ｇ５）と比較してはるかに小さいことを示す研究の結果を示す。図２０Ａ：糖タンパク質ｇＥをコードするＵｓ８遺伝子がＣＭＶによって駆動されるＧＦＰレポーターカセットで置き換えられるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集戦略によって、Ｍｕｔ－３ΔｇＥを構築した。図２０Ｂ：Ｍｕｔ－３ΔｇＥクローン２８Ｄ５－Ｂ４および２８Ｄ５－Ｈ１－ベロ細胞の非合胞体ＧＦＰ陽性プラーク表現型に、連続希釈した２８Ｄ５－Ｂ４または２８Ｄ５－Ｈ１を２時間感染させ、重層培地で覆った。プラークの写真は、ウイルス感染の３日後に撮影した。図２０Ｃ：Ｍｕｔ－３ΔｇＥクローン２８Ｄ５－Ｂ４および２８Ｄ５－Ｈ１のｑＰＣＲ分析は、Ｕｓ８／ｇＥの喪失を明らかにする。ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞にＭｕｔ－３ΔｇＥクローン２８Ｄ５－Ｂ４または２８Ｄ５－Ｈ１を感染させ、５０％以上の細胞変性効果が観察された時点で、それらの溶解物を採取した。ウイルス感染したＢＨＫ細胞溶解物から単離された５０～１００ｎｇのゲノムＤＮＡをｑＰＣＲ反応において使用した。Ｕｓ８ａ対照ＨＳＶ遺伝子に対するｇＥ／Ｕｓ８またはＧＦＰ倍数として、結果が示されている。図２０Ｄ：ベロ細胞において行われた標準的なプラークアッセイから得られた、Ｍｕｔ－３ΔｇＥクローン２８Ｄ５－Ｂ４および２８Ｄ５－Ｈ１とＭｕｔ－３またはＭｕｔ－３Δ３４．５／Ｃ８Ｇ５とのプラークサイズの比較。Ｍｕｔ－３、Ｍｕｔ－３Δ３４．５、Ｍｕｔ－３ΔｇＥクローン２８Ｄ５－Ｂ４およびクローン２８Ｄ５－Ｈ１のプラーク写真は、ウイルス感染の３日後に撮影した。
図２１Ａ～図２１Ｄは、１７ΔｇＥのプラークサイズが１７ｓｙｎ＋または１７Δ３４．５と比較してはるかに小さいことを示す研究の結果を提供する。図２１Ａ：糖タンパク質ｇＥをコードするＵｓ８遺伝子がＣＭＶによって駆動されるＧＦＰレポーターカセットで置き換えられるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集戦略によって、１７ΔｇＥを構築した。図２１Ｂ：１７ΔｇＥクローン１２Ｇ５の非合胞体および小型ＧＦＰ陽性プラーク表現型－ベロ細胞に連続希釈された１７ΔｇＥ １２Ｇ５を２時間感染させ、重層培地で覆った。プラークの写真は、ウイルス感染の３日後に撮影した。図２１Ｃ：１７ΔｇＥクローン１２Ｇ５のｑＰＣＲ分析は、Ｕｓ８／ｇＥの喪失を明らかにする。ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞に１７ΔｇＥクローン１２Ｇ５を感染させ、５０％以上の細胞変性効果が観察された時点で、溶解物を採取した。ウイルス感染したＢＨＫ細胞溶解物から単離された５０～１００ｎｇのゲノムＤＮＡをｑＰＣＲ反応において使用した。ＩＣＰ６対照ＨＳＶ遺伝子に対するｇＥ／Ｕｓ８またはＧＦＰ倍数として、結果が示されている。図２１Ｄ：ベロ細胞において行われた標準的なプラークアッセイから得た、１７ΔｇＥクローン１２Ｇ５ １７ｓｙｎ＋と１７Δ３４．５クローンＢ４とのプラークサイズの比較。プラークの写真は、ウイルス感染の３日後に撮影した。
詳細な説明
本開示による実施形態は、以下でより完全に説明される。しかしながら、本開示の態様は、異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が綿密かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供されている。本明細書中の記述において使用される用語は、特定の実施形態を記述することを目的とするものに過ぎず、限定することは意図されていない。
別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての用語（技術用語および科学用語を含む）は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書で定義されているような用語は、本出願および関連技術の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書において明示的にそのように定義されていなければ、理想化されたまたは過度に形式張った意味で解釈されるべきではないことがさらに理解される。以下で明示的に定義されてはいないが、このような用語はそれらの一般的な意味に従って解釈されるべきである。
本明細書の記載において使用される用語は、特定の実施形態を記述することを目的とするものに過ぎず、本発明を限定することは意図されていない。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
別段の記述がなければ、本技術の実施は、本分野の技術に属する、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの慣用技術を使用する。
文脈が別段の指示をしない限り、本明細書に記載されている本発明の様々な特徴は任意の組み合わせで使用できることが特に意図されている。さらに、本開示は、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または省略できることも企図している。例示するために、複合体が成分Ａ、ＢおよびＣを含むと明細書が述べている場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれかまたはこれらの組み合わせを省略することができ、単独でまたは任意の組み合わせで権利範囲から除外され得ることが特に意図されている。
特に明記しない限り、すべての特定された実施形態、特徴および用語は、列挙された実施形態、特徴または用語とそれらの生物学的同等物の両方を含むことを意図している。
範囲を含む全ての数的表記、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、適宜、１．０または０．１の増分によって、または＋／－１５％、または＋／－１０％、または＋／－５％、または＋／－２％の変動によって、（＋）または（－）に変動される近似値である。常に明示的に述べられているわけではないが、全ての数的表記には、「約」という用語が前置されていることが理解されるべきである。常に明示的に述べられているわけではないが、本明細書に記載されている試薬は単に例示であること、およびこのようなものと同等な試薬が本分野において知られていることも理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「同程度の」という用語は、参照のレベルと同じレベルを有すること、または参照レベルと比較して＋／－５０％、またはあるいは４５％、またはあるいは４０％、またはあるいは３５％、またはあるいは３０％、またはあるいは２５％、またはあるいは２０％、またはあるいは１５％、またはあるいは１０％、またはあるいは５％、またはあるいは２％の変動内にあることを指す。
本開示を通じて、様々な刊行物、特許および公開された特許明細書が、識別引用によってまたはアラビア数字によって参照されている。アラビア数字によって識別される刊行物の完全な引用は、特許請求の範囲の直前に記載されている。これらの刊行物、特許および公開された特許明細書の開示は、本発明が関係する分野の技術水準をより完全に説明するために、参照によりその全体が本開示に組み込まれる。
定義
別段の記述がなければ、本技術の実施は、本分野の技術範囲に属する、有機化学、薬理学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照されたい。
本発明の説明および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形も含むことを意図している。
本明細書において使用される場合、「含む」という用語は、組成物および方法が表記された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することが意図される。本明細書で使用される場合、から本質的になるという移行句（および文法的変形）は、列挙された材料またはステップ、ならびに列挙された実施形態の基本的なおよび新規の特性に実質的に影響を及ぼさない材料またはステップを包含すると解釈されるべきである。これらの特徴は、方法の実施形態において列挙される。したがって、本明細書で使用される「から本質的になる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されるべきではない。「からなる」とは、微量を超えるその他の成分および本明細書に開示されている組成物を投与するための実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行語の各々によって定義される態様は、本開示の範囲に属する。
量または濃度などの測定可能な値を指すときに本明細書で使用される「約」という用語は、指定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変動を包含することが意図される。
本明細書に開示される任意の成分、範囲、剤形などの選択を説明するために使用される場合の「許容され得る」、「有効な」、または「十分な」という用語は、前記成分、範囲、剤形などが開示された目的に対して適切であることを意図する。
本明細書において使用される場合、「および／または」は、関連する列記された項目の１つまたはそれより多くのあらゆるすべての可能な組み合わせのみならず、選択的に（「ｏｒ」）解釈される場合には、組み合わせの欠如も表し、これらを包含する。
本明細書で使用される「細胞」という用語は、原核細胞または真核細胞のいずれかを指し得、必要に応じて、対象または市販の入手源から取得される。
「真核細胞」 モネラ界を除く全ての生物界。真核細胞は、膜に結合された核を通じて容易に識別することができる。動物、植物、真菌および原生生物は、真核生物、すなわち、内部の膜および細胞骨格によって、その細胞が複雑な構造へと組織されている生物である。最も特徴的な膜に結合された構造は核である。具体的に記載されていなければ、「宿主」という用語には、例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物の細胞を含む、真核生物宿主が含まれる。真核細胞または真核生物宿主の非限定的な例には、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、トリ、爬虫類およびヒト、例えば、ＨＥＫ２９３細胞および２９３Ｔ細胞が含まれる。
通常、核またはいずれかの他の膜結合型細胞小器官を欠く「原核細胞」は、細菌と古細菌という２つのドメインに分けられる。これらの細胞は、染色体ＤＮＡに加えて、エピソームと呼ばれる環状ループ中に遺伝情報を含有することもできる。細菌細胞は非常に小さく、およそ動物のミトコンドリアのサイズである（直径約１～２μｍ、長さ１０μｍ）。原核細胞は、棹形状、球形およびらせん状という３つの主要な形状を特徴としている。真核生物のような精巧な複製過程を経る代わりに、細菌細胞は二分裂によって分裂する。例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細菌、大腸菌およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌などがあるが、これらに限定されない。
核酸配列に対して適用される場合の「コードする」という用語は、その原型の状態でまたは当業者に周知の方法によって操作された場合に、転写および／または翻訳されてポリペプチドおよび／またはその断片に対するｍＲＮＡを産生することができれば、ポリペプチドを「コードする」と称されるポリヌクレオチドを表す。アンチセンス鎖は、このような核酸の相補物であり、コード配列はアンチセンス鎖から推定することができる。
「同等物」または「生物学的同等物」という用語は、特定の分子、生物学的または細胞材料を指すときに互換的に使用され、所望の構造または機能をなお維持しながら最小限の相同性を有するものを意図する。同等のポリペプチドの非限定的な例には、少なくとも６０％、もしくは少なくとも６５％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％、もしくは８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドもしくはポリペプチド配列、または高ストリンジェンシーの条件下でこのようなポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドもしくはその相補物によってコードされるポリペプチドが含まれる。高ストリンジェンシーの条件は、本明細書に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。あるいは、その同等物とは、参照ポリヌクレオチド、例えば野生型ポリヌクレオチドに対して、少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９７％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはその相補物によってコードされるポリペプチドである。一態様において、同等のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、それぞれ参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと同一のまたは実質的に同様の生物学的機能、例えば、本明細書に記載の適切な細胞アッセイまたは動物モデルによって決定される細胞溶解機能、抗腫瘍機能、抗転移機能または抗がん機能を有する。
同等のポリペプチドの非限定的な例には、参照ポリヌクレオチドに対して、少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドが含まれる。同等物は、高ストリンジェンシーの条件下で参照ポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドまたはその相補物も意図する。
別の配列に対してあるパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、整列されたときに、２つの配列を比較すると、そのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が同一であることを意味する。アラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、本分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ ７．７．１に記載されているものを用いて決定することができる。特定の実施形態では、初期設定パラメータがアラインメントのために使用される。非限定的な例示的なアラインメントプログラムは、初期設定パラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、例示的なプログラムには、以下の初期設定パラメータを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰが含まれる。遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ディスクリプション＝５０配列；ソート＝高スコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴに見出すことができる。配列同一性およびパーセント同一性は、それらをｃｌｕｓｔａｌＷ（Ｗｅｂアドレス：ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で入手可能、最終アクセス日は２０１７年１月１３日）中に組み込むことで決定することができる。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のために整列され得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列中の位置が同一の塩基またはアミノ酸によって占められるときに、その分子はその位置において相同である。配列間の相同性の程度は、これらの配列によって共有される合致または相同な位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同な」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、または２５％未満の同一性を共有する。
「相同性」または「同一性」または「類似性」はまた、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する２つの核酸分子を指すこともある。
「ハイブリダイゼーション」は、１またはそれを超えるポリヌクレオチドが反応してヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を表す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成、フーグスティーン結合によって、または任意の他の配列特異的様式で起こり得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３もしくはそれを超える鎖、単一の自己ハイブリッド形成鎖もしくはこれらの任意の組み合わせを含み得る、またあるいは二本鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３もしくはそれを超える鎖、単一の自己ハイブリッド形成鎖もしくはこれらの任意の組み合わせから本質的になり得る、またはなおさらに二本鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３もしくはそれを超える鎖、単一の自己ハイブリッド形成鎖もしくはこれらの任意の組み合わせからなり得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断などの、より大規模な過程中のステップを構成し得る。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約２５℃～約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ～約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％～約２５％のホルムアミド濃度；および約４×ＳＳＣ～約８×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。穏やかなハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃～約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％～約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高いストリンジェンシーの条件の例としては、約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％～約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの洗浄溶液または脱イオン水が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、５分～２４時間であり、１、２またはそれを超える洗浄工程を有し、洗浄のインキュベーション時間は、約１、２または１５分である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭシトラート緩衝液である。他の緩衝液系を使用するＳＳＣの同等物を使用できることが理解される。
本明細書において使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される過程および／または転写されたｍＲＮＡが、続いて、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳される過程を表す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。「遺伝子産物」または「遺伝子発現産物」は、遺伝子が転写および翻訳されるときに生成されるアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を指す。
「転写制御下」は、当技術分野で十分に理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常はＤＮＡ配列の転写が、転写の開始に寄与する、または転写を促進する要素に機能的に連結されていることに依存することを示す。「機能的に連結された」は、ポリヌクレオチドが細胞内で機能できるように、ポリヌクレオチドが配置されていることを意図する。一態様において、本発明は、下流配列、例えば、ＨＳＶ病原性遺伝子またはその変異体に機能的に連結されたプロモーターを提供する。
ポリヌクレオチドに対して適用される場合の「コードする」という用語は、その原型の状態でまたは当業者に周知の方法によって操作された場合に、転写および／または翻訳されてポリペプチドおよび／またはその断片に対するｍＲＮＡを産生することができれば、ポリペプチドを「コードする」と称されるポリヌクレオチドを表す。アンチセンス鎖は、このような核酸の相補物であり、コード配列はアンチセンス鎖から推定することができる。
本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、実質的に他の材料が存在しない分子または生物製剤または細胞性材料を表す。
本明細書で使用される場合、「機能的」という用語は、特定の指定された効果を達成することを意図するために、任意の分子、生物製剤または細胞材料を修飾するために使用され得る。
本明細書において使用される場合、「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー性形態を表すために互換的に使用される。このため、本用語には、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドまたはプリンおよびピリミジン塩基もしくは他の天然の、化学的にもしくは生化学的に修飾された、非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
「野生型」という用語は、天然に存在する供給源から単離された場合にその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。いくつかの実施形態において、野生型遺伝子または遺伝子産物は、１つのウイルス株に対してさえ、わずかに異なる配列を含む。
「変異体」という用語は、野生型遺伝子もしくは遺伝子産物または他の変異体株（複数可）由来の遺伝子もしくは遺伝子産物と比較した場合に、配列および／または機能的特性の修飾（すなわち、変更された特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。一実施形態において、他の変異体株は、１７ＴｅｒｍＡ株またはｒＲ４５０株を含む。
「変異」という用語は、野生型または他の変異体株（複数可）からのＤＮＡ配列の変動を指す。変異は、生物において機能特性を生成するか、または生成しない。挿入、欠失、切断、フレームシフト、置換または点変異を含むがこれらに限定されないが、複数の種類の変異が存在する。
「点変異」という用語は、遺伝物質であるＤＮＡまたはＲＮＡの単一ヌクレオチド塩基の変化、挿入または欠失を伴う変異を指す。
「欠失」は、染色体の一部またはＤＮＡの配列が欠損している変異を指す。
「フレームシフト」は、３で割り切れないＤＮＡ配列中のいくつかのヌクレオチドのインデル（挿入または欠失）によって引き起こされる変異を指す。
「置換」は、遺伝子の１個または数個のヌクレオチドの置換を伴う変異を指す。
「切断」は、タンパク質分解もしくは構造遺伝子の操作によるタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端部分の除去、またはナンセンス変異の結果としてのその構造遺伝子内の終止コドンの存在に起因するタンパク質伸長の早期終結を伴う変異を指す。
いくつかの実施形態において、変異は非同義変異である。「非同義変異」という用語は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させる変異を指し、アミノ酸配列を変化させない同義変異と対比される。
本明細書において使用される場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子などのコード配列の発現を制御する任意の配列を表す。プロモーターは、例えば、恒常的、誘導性、抑制可能または組織特異的であり得る。「プロモーター」は、そこにおいて転写の開始および速度が調節されるポリヌクレオチド配列の領域である調節配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子がそこに結合し得る遺伝要素を含有し得る。非限定的な例示的なプロモーターには、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じて、ＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーターまたはＥＦ１プロモーターが含まれる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ニワトリβ－アクチン（「ＣＢＡ」）プロモーターである。
特定の標的特異性を有するさらなる非限定的な例示的プロモーターが本明細書の以下に記載されており、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１（ヒトまたはマウス）、Ｐ５、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、ＵＡＳ、Ａｃ５、ポリヘドリン、ＣａＭＫＩＩａ、Ｇａｌ１、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｕｂｉ、Ｈ１、Ｕ６およびα－１－アンチトリプシンが含まれるが、これらに限定されない。合成由来のプロモーターは、遍在的または組織特異的な発現のために使用され得る。さらに、そのいくつかが上に記されているウイルス由来のプロモーター、例えば、ＣＭＶ、ＨＩＶ、アデノウイルスおよびＡＡＶプロモーターは、本明細書に開示される方法において有用であり得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、転写効率を増大させるためにエンハンサーに結合される。
エンハンサーは、標的配列の発現を増加させる調節エレメントである。「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーターおよびエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含有するポリヌクレオチドである。たとえば、レトロウイルスの末端反復配列は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方を含む。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」または「外因性」または「異種性」であり得る。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、自然の状態で、ゲノム中の特定の遺伝子と連結されているものである。「外因性」または「異種性」エンハンサー／プロモーターは、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって誘導されるように、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術）を用いて遺伝子に並置されているエンハンサー／プロモーターである。
本明細書で使用される「腫瘍特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーター」という用語は、所望の腫瘍細胞または組織中で特異的に、そのプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を可能にするプロモーターを意味する。本発明において使用され得る組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）プロモーター、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）プロモーター、カゼインプロモーター、ＩｇＧプロモーター、絨毛性胚性抗原プロモーター、エラスターゼプロモーター、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼプロモーター、インスリンプロモーター、成長ホルモン因子プロモーター、アセチルコリン受容体プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターおよびαまたはβグロビンプロモーターが挙げられる。
本発明で使用されるべき腫瘍特異的プロモーターの非限定的な例としては、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、グリア線維酸性タンパク質プロモーター、Ｅ２Ｆプロモーター、サバイビンプロモーター、ＣＯＸ－２プロモーター、ＥＧＤ－２プロモーター；ＥＬＦ－１プロモーター；低酸素特異的プロモーター；癌胎児性抗原プロモーターおよびストロメリシン３プロモーターが挙げられる。
「凍結保存剤」という用語は、１またはそれを超える、組織、ウイルスまたはその他の生物学的因子を、損傷されることまたは損なわれることから保護することができる化合物または材料を指す。凍結保存剤の例としては、コンドロイチン硫酸、グリコサミノグリカン ジメチルスルホキシド、細胞透過性有機溶質、多糖類、グリセロール、ダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）、グルタミン、Ｄ－グルコース、ピルビン酸ナトリウム、ウシ胎児血清、パパベリン、ＤＭＳＯ、グリセロール、トレハロース、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＣｌ、マンニトール、ＮａＨＣＯ３、アスコルビン酸ナトリウム、１，２－プロパンジオール、ホルムアミド、２，３－ブタンジオール、プロブコール、クルクミンおよびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は互換的に使用され、これらの最も広い意味において、アミノ酸、アミノ酸類縁体またはペプチド模倣物の２またはそれを超えるサブユニットの化合物を表す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結され得る。別の態様において、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結され得る。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列またはペプチドの配列を構成し得る、もしくはあるいはそれから本質的になり得る、もしくはなおさらにそれからなり得る、それを構成し得る、もしくはあるいはそれから本質的になり得る、もしくはなおさらにそれからなり得る、アミノ酸の最大数に制限はない。本明細書において使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンならびにＤおよびＬ型光学異性体の両方、アミノ酸類縁体およびペプチド模倣物を含む、天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸のいずれかを表す。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、例えば形質転換の過程によって細胞内に配置されたときにベクターが複製され得るような無傷のレプリコンを含む、もしくはあるいはそれから本質的になる、もしくはなおさらにそれからなる、非染色体核酸を指す。ベクターは、ウイルス性または非ウイルス性であり得る。ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）、バキュロウイルス、改変されたバキュロウイルス、パポウイルスまたはその他に改変された天然に存在するウイルスが含まれる。核酸を送達するための例示的な非ウイルス性ベクターには、裸のＤＮＡ；単独でまたは陽イオン性ポリマーと組み合わせて、陽イオン性脂質と複合体を形成したＤＮＡ；陰イオン性および陽イオン性リポソーム；ＤＮＡ－タンパク質複合体および異種ポリリジン、規定された長さのオリゴペプチドおよびポリエチレンイミンなどの、場合によってリポソーム中に含有された陽イオン性ポリマーと縮合したＤＮＡを含む、もしくはあるいはそれから本質的になる、もしくはなおさらにそれからなる、粒子；ならびにウイルスとポリリジン－ＤＮＡを含む、もしくはあるいはそれから本質的になる、もしくはなおさらにそれからなる、三元複合体の使用が含まれる。
「ウイルスベクター」は、インビボ、エクスビボまたはインビトロのいずれかで、宿主細胞中に送達されるべきポリヌクレオチドを含む、もしくはあるいはそれから本質的になる、もしくはなおさらにそれからなる、組換え的に産生されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、ＨＳＶベクター、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどが含まれる。セムリキ森林ウイルスベースのベクターおよびシンドビスウイルスベースのベクターなどのアルファウイルスベクターも、遺伝子治療および免疫治療において使用するために開発されてきた。Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｄｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４－４３９およびＹｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３－８２７を参照のこと。
別の実施形態では、ＨＳＶ病原性タンパク質（例えば、野生型または変異体）の発現は、誘導性プロモーターであるプロモーターによって制御される。特定の関連する実施形態において、プロモーターは、誘導性テトラサイクリンプロモーターである。Ｔｅｔ－ＯｆｆおよびＴｅｔ－Ｏｎ遺伝子発現系により、研究者は、Ｔｅｔ－ＯｆｆおよびＴｅｔ－Ｏｎとして記述された制御された高レベルの遺伝子発現系を直ちに利用できる。Ｔｅｔ－Ｏｆｆ系では、テトラサイクリン（Ｔｃ）またはドキシサイクリン（Ｄｏｘ；Ｔｃ誘導体）が培地から除去されると、遺伝子発現がオンになる。対照的に、Ｔｅｔ－Ｏｎ系では、Ｄｏｘを追加することによって、発現がオンになる。いずれの系でも、ＴｃまたはＤｏｘの濃度の変化に応じて遺伝子発現を厳密に制御できる。Ｔｅｔ系での最大発現レベルは非常に高く、ＣＭＶなどの強力な恒常的哺乳動物プロモーターから得られる最大レベルと比べて遜色がない。他の誘導性哺乳動物発現系とは異なり、Ｔｅｔ系における遺伝子調節は高度に特異的であるため、多面発現効果または非特異的誘導によって、結果の解釈が複雑化することがない。大腸菌では、Ｔｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）がＴｎ１０トランスポゾン上のテトラサイクリン耐性オペロンの遺伝子を負に調節する。ＴｅｔＲは、Ｔｃの不存在下でｔｅｔオペレーター配列（ｔｅｔＯ）に結合することにより、これらの遺伝子の転写を遮断する。ＴｅｔＲおよびｔｅｔＯは、哺乳類の実験系において使用するための調節および誘導の基礎を提供する。Ｔｅｔ－ｏｎ系では、調節タンパク質は、ＴｅｔＲ中の４つのアミノ酸変化によって作出された「リバース」Ｔｅｔリプレッサー（ｒＴｅｔＲ）に基づく（ＨｉｌｌｅｎおよびＢｅｒｅｎｓ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｎ１０ ｅｎｃｏｄｅｄ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９４；４８：３４５－６９；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９５ Ｊｕｎ ２３；２６８（５２１８）：１７６６－９）。得られたタンパク質ｒｔＴＡ（リバースｔＴＡはテトラサイクリン活性化タンパク質とも呼ばれる）は、ｐＴｅｔ－Ｏｎ調節プラスミドによってコードされている。
関連する実施形態において、ベクターは、さらに、テトラサイクリン活性化タンパク質をコードする核酸およびテトラサイクリン活性化タンパク質の発現を調節するプロモーターを含み、またはこれらから本質的になり、またはこれらからなる。
本明細書に記載されたベクター、単離された細胞、ウイルスパッケージング系および方法において有用なその他の誘導性の系には、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、二量体化の化学的誘導物質およびイソプロピル－β－Ｄ１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が含まれる。
本明細書で使用される場合、「組換え発現系」または「組換えベクター」という用語は、組換えによって形成された特定の遺伝物質の発現のための１つまたは複数の遺伝的構築物を指す。
「遺伝子送達ビヒクル」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞中に運ぶことができる任意の分子として定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、ミセル、天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；および細菌、またはバキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターならびに様々な真核生物および原核生物宿主中での発現について記載されており、単純なタンパク質発現のための他、遺伝子治療のために使用され得る当技術分野で典型的に使用されるその他の組換えビヒクルである。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して細胞または組織に送達することができる。本明細書で使用される「遺伝子送達」、「遺伝子導入」、「形質導入」などは、導入のために使用される方法とは関係なく、宿主細胞中への外因性ポリヌクレオチド（「導入遺伝子」と呼ばれることもある）の導入を指す用語である。このような方法には、ベクター媒介性遺伝子導入（例えば、ウイルス感染／形質移入、または他の様々なタンパク質ベースまたは脂質ベースの遺伝子送達複合体による）などの様々な周知の技術、ならびに「裸の」ポリヌクレオチドの送達を促進する技術（電気穿孔、「遺伝子銃」送達およびポリヌクレオチドの導入のために使用される他のさまざまな技術など）が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定的にまたは一過性に維持され得る。安定した維持には、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合性を有する複製起点を含有すること、または染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）などの宿主細胞のレプリコン中にもしくは核もしくはミトコンドリアの染色体中に組み込まれることが通例必要とされる。当技術分野において公知であり、本明細書に記載されているように、多くのベクターが、哺乳動物細胞への遺伝子の導入を媒介することができることが知られている。
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体ＤＮＡとは別個の染色体外ＤＮＡ分子である。多くの場合、プラスミドは環状であり、二本鎖である。プラスミドは、微生物の集団内での水平的な遺伝子導入のための機序を提供し、通例、所定の環境状態下での選択における利点を提供する。プラスミドは、競争的な生態的地位において、天然に存在する抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を運搬し得、または産生されるタンパク質が同様の状況下で毒素として作用し得る。
遺伝子工学において使用される「プラスミド」は、「プラスミドベクター」と呼ばれる。多くのプラスミドがこのような用途のために市販されている。複製されるべき遺伝子は、特定の抗生物質に対して細胞を耐性にする遺伝子とＤＮＡ断片をこの位置に挿入することを容易にする一般的に使用される数個の制限部位を含有する短い領域である多重クローニング部位（ＭＣＳ、またはポリリンカー）とを含有するプラスミドのコピー中に挿入される。プラスミドのもう１つの主な用途は、大量のタンパク質を作ることである。この場合、研究者は関心対象の遺伝子を有するプラスミドを含有する細菌を増殖させる。細菌が抗生物質耐性を与えるタンパク質を産生するのと同じように、挿入された遺伝子から大量のタンパク質を産生するように細菌を誘導することもできる。
本明細書で使用される「単純ヘルペスウイルス」または「ＨＳＶ」という用語は、本発明の効果を生じる単純ヘルペスウイルスを意味し、野生型または変異体単純ヘルペスウイルスが含まれる。一実施形態において、変異体非天然ＨＳＶは、野生型ＨＳＶの遺伝子のいずれかを変異もしくは修飾することによって、または外因性遺伝子のいずれかを挿入することによって得られる。ＨＳＶの血清型は、１型ＨＳＶ（またはＨＳＶ－１）もしくは２型ＨＳＶ（またはＨＳＶ－２）を含む、あるいは１型ＨＳＶ（またはＨＳＶ－１）もしくは２型ＨＳＶ（またはＨＳＶ－２）から本質的になる、またはなおさらに１型ＨＳＶ（またはＨＳＶ－１）もしくは２型ＨＳＶ（またはＨＳＶ－２）からなる。ＨＳＶ－１は、エンベロープに包まれた二本鎖ＤＮＡウイルスである。一実施形態において、ＨＳＶ－１はヒト細胞に感染することができる。別の実施形態において、配列、１つの遺伝子または複数の遺伝子をＨＳＶ－１に組み込むことができる。組み込まれる配列のサイズは、およそ１塩基、５塩基、１０塩基、１００塩基、１ｋｂ、１０ｋｂ、１００ｋｂまたは１５０ｋｂであり得る。ＨＳＶ－１は、比較的低い感染多重度（ＭＯＩ）で細胞溶解を誘導することができ、その増殖は抗ウイルス薬によって阻害することができる。一実施形態において、ＨＳＶウイルスＤＮＡは、宿主細胞のゲノム中に組み込まれることなく染色体の外側に留まる。ＨＳＶ－１は、様々な株（例えば、ＫＯＳおよびＭｃＫｒａｅ）を包含することができる。Ｗａｎｇら、（２０１３）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．１７３（２）：４３６－４４０を参照されたい。一実施形態において、ＨＳＶ－１はＨＳＶ－１ ＫＯＳ株である。別の実施形態において、ＨＳＶ－１はＨＳＶ－１ ＭｃＫｒａｅ株である。
いくつかのＨＳＶ変異体、例えば、１７ＴｅｒｍＡ ＨＳＶおよびｒＲｐ４５０ ＨＳＶが存在する。「１７ＴｅｒｍＡ ＨＳＶ」という用語は、ＩＣＰ３４．５遺伝子全体を含むが、１００ｂｐのコード領域の前に終止コドンが挿入されており、タンパク質発現の早期終結および３０アミノ酸の切断されたタンパク質の発現をもたらす変異体ＨＳＶ－１ウイルスを指す。１７ＴｅｒｍＡ ＨＳＶ変異体は、切断されたＩＣＰ３４．５タンパク質のために、成長欠陥を示す。Ｏｒｖｅｄａｈｌら、（２００７）Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ，１：１，２３－２５を参照されたい。「ｒＲｐ４５０」という用語は、ウイルスにコードされたリボヌクレオチド還元酵素またはＩＣＰ６が欠損した弱毒化された単純ヘルペス１ベクターを指す。Ａｇｈｉ Ｍら、（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９（１６）：３８６１－５を参照されたい。
ＨＳＶゲノムは、糖タンパク質Ｅ（「ｇＥ」）、感染細胞タンパク質０（「ＩＣＰ０」）、感染細胞タンパク質６（「ＩＣＰ６」）、ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１、感染細胞タンパク質８（「ＩＣＰ８」）および感染細胞タンパク質３４．５（「ＩＣＰ３４．５」）を含むがこれらに限定されない複数の病原性タンパク質をコードする。例示的なＨＳＶ１ゲノムは、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００１８０６．２、２０２０年３月１３日に最終アクセス、において見出すことができる。
「ｇＥをコードする遺伝子」という用語は、ｇＥタンパク質をコードする遺伝子またはそのＤＮＡ断片を指す。例示的なｇＥをコードする遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００１８０６．２において、ＨＳＶ－１ゲノム配列の３３～２５５５位に同定することができる。「ＩＣＰ６タンパク質」という用語は、ＨＳＶゲノムによってコードされる感染細胞タンパク質６を指す。ＩＣＰ６は、リボヌクレオチド還元酵素（「ＲＲ」）のサブユニットであり、非分裂細胞におけるヌクレオチド代謝およびウイルスＤＮＡ合成のための重要な酵素である。
「機能不全」タンパク質は、元のタンパク質の損なわれた機能を有するまたは元のタンパク質の機能を有しないタンパク質を表す。一実施形態において、機能不全タンパク質は、コード配列中の欠失または置換によって引き起こされる。例えば、機能不全ＩＣＰ６遺伝子が欠失または不活化であるため、ＨＳＶは正常な非分裂細胞中で複製することができない。しかしながら、増加したＲＲ活性を有する活発に分裂している細胞においては、ウイルスの欠損した酵素活性が補われ、ウイルスは複製することが可能になる。ＩＣＰ３４．５のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号１、２、および５～１０に提供されている。ｇＥのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号１２～１９に提供されている。ＩＣＰ０のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号２０～２６に提供されている。ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号３５～４２に提供されている。ＩＣＰ８のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号２７～３４に提供されている。ＩＣＰ６のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号４３～５０に提供されている。
「ＩＣＰ０をコードする遺伝子」という用語は、ＩＣＰ０タンパク質をコードする遺伝子またはそのＤＮＡ断片を指す。ＩＣＰ０の例示的なＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号２０～２６に提供されている。「ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１をコードする遺伝子」という用語は、ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子またはそのＤＮＡ断片を指す。ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１の例示的なＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号３５～４２に提供されている。「ＩＣＰ８をコードする遺伝子」という用語は、ＩＣＰ８タンパク質をコードする遺伝子またはそのＤＮＡ断片を指す。ＩＣＰ８の例示的なＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号２７～３４に提供されている。「ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子」という用語は、ＩＣＰ３４．５タンパク質をコードする遺伝子またはそのＤＮＡ断片を指す。ＩＣＰ３４．５の例示的なＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号１、２および５～１０に提供されている。「糖タンパク質Ｅ（「ｇＥ」）をコードする遺伝子」という用語は、ｇＥタンパク質をコードする遺伝子またはそのＤＮＡ断片を指す。ｇＥの例示的なＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号１２～１９に提供されている。
「遺伝子の欠失または不活化」という用語は、遺伝子の全部もしくは一部の欠失、または一部の塩基の置換、修飾、不要な配列の挿入などによる遺伝子の発現の抑制を意味する。ＨＳＶ遺伝子（例えば、ｇＥ、ＩＣＰ０およびＩＣＰ８）の欠失または不活化は、当業者によって、公知の方法またはそれに基づく方法において実施することができる。例えば、相同組換えを用いる方法を使用することができる。例えば、ＨＳＶ遺伝子の一部とＨＳＶ遺伝子とは無関係の配列とを含有するＤＮＡ断片を適切なプラスミドベクター中にクローニングした後、これをＨＳＶ中に導入してＨＳＶ遺伝子の一部の領域中で相同組換えを起こすことにより、ＨＳＶ遺伝子を分割し、不活化することができる。あるいは、ＨＳＶ遺伝子の変異または欠失は、ウイルスの継代における自然変異によって引き起こされ得る。
遺伝子導入が単純ヘルペスウイルスなどのＤＮＡウイルスベクターによって媒介される態様において、ベクター構築物は、ウイルスのゲノムもしくはその一部と導入遺伝子を含む、またはあるいはウイルスのゲノムもしくはその一部と導入遺伝子から本質的になる、またはなおさらにウイルスのゲノムもしくはその一部と導入遺伝子からなるポリヌクレオチドを指す。したがって、一態様において、非天然ＨＳＶは、治療用ポリヌクレオチドまたはタンパク質をコードする導入遺伝子をさらに含む。
プロモーターと、ポリヌクレオチドをその中に機能的に連結することができるクローニング部位とを両方を含有するベクターは、本分野において周知である。このようなベクターは、ＲＮＡをインビトロまたはインビボで転写することが可能であり、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などの入手先から商業的に入手可能である。発現および／またはインビトロでの転写を最適化するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、追加または変更して、転写または翻訳のいずれかのレベルで発現を妨害しまたは低下させ得る余分の潜在的な不適切な別の翻訳開始コドンまたはその他の配列を除去することが必要であり得る。あるいは、発現を増強するために、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンのすぐ５’に挿入することができる。
遺伝子送達ビヒクルには、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセ、および標的化されたウイルスタンパク質－ＤＮＡ複合体も含まれる。標的化抗体またはその断片も含む、もしくはあるいはそれから本質的になる、もしくはなおさらにそれからなる、それを含む、もしくはあるいはそれから本質的になる、もしくはなおさらにそれからなる、リポソームは、本明細書に開示される方法において使用することができる。細胞または細胞集団へのポリヌクレオチドの送達に加えて、タンパク質形質移入の非限定的な技術によって、細胞または細胞集団への本明細書に記載されたタンパク質の直接的な導入を行うことが可能であり、あるいは本明細書に開示されたタンパク質の発現を増強しおよび／またはその活性を増大させることができる培養条件は他の非限定的な技術である。
本明細書において使用される場合、「シグナルペプチド」または「シグナルポリペプチド」という用語は、新たに合成された分泌性または膜ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端終端に通常存在するアミノ酸配列を意図する。「シグナルペプチド」または「シグナルポリペプチド」は、ポリペプチドを特定の細胞位置に、例えば、細胞膜を横切って、細胞膜中にまたは核内に誘導するように作用する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、局在化の後に除去される。シグナルペプチドの例は、当技術分野において周知である。非限定的な例は、米国特許第８，８５３，３８１号、同第５，９５８，７３６号および同第８，７９５，９６５号に記載されているものである。
一態様において、ＨＳＶは検出可能に標識される。本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、「標識された」組成物を生成するために、検出されるべき組成物、例えば、ポリヌクレオチドまたは抗体などのタンパク質に直接的または間接的に接合される直接的または間接的に検出可能な化合物または組成物を意味する。本用語は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの、挿入された配列の発現時にシグナルを提供する、ポリヌクレオチドに接合された配列も含む。標識は、単独で検出可能であり得（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能である基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。標識は、小規模の検出に適することができ、または高処理スクリーニングにより適することができる。したがって、適切な標識には、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含むタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。標識は単に検出してもよく、または定量化してもよい。単に検出される応答は、一般に、その存在が単に確認されるだけの応答を含む、もしくはあるいはそれから本質的になる、もしくはなおさらにそれからなるのに対して、定量化される応答は、一般に、強度、極性化および／またはその他の特性などの定量化可能な（例えば、数値で報告可能な）値を有する応答を含む、もしくはあるいはそれから本質的になる、もしくはなおさらにそれからなる。発光または蛍光アッセイでは、検出可能な応答は、結合に実際に関与するアッセイ成分と会合した発光団もしくは蛍光団を使用して直接的に、または別の（例えば、レポーターまたは指示薬）成分と会合した発光団または蛍光団を使用して間接的に生成され得る。
シグナルを生成する発光標識の例には、生物発光および化学発光が含まれるが、これらに限定されない。検出可能な発光応答は、一般に、発光信号の変化または発生を含む、もしくはあるいはそれから本質的になる、もしくはなおさらにそれからなる。アッセイ成分を発光標識するための適切な方法および発光団は当技術分野において公知であり、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（６ｔｈ ｅｄ．）に記載されている。発光プローブの例には、エクオリンおよびルシフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
適切な蛍光標識の例には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイト（Ｍａｌａｃｉｔｅ）グリーン、スチルベン、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標）およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄが含まれるが、これらに限定されない。他の適切な光学色素は、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（６ｔｈ ｅｄ．）に記載されている。
別の態様では、蛍光標識は、細胞表面マーカーなどの、細胞または組織の表面中または表面上に存在する細胞成分への共有結合を促進するように官能基が付与されている。適切な官能基には、イソチオシアナート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステルおよびハロゲン化スルホニルが含まれるが、これらに限定されず、これらのすべては、蛍光標識を第２の分子に付着させるために使用され得る。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、薬剤、マーカーまたは第２の標識剤のいずれかへの付着部位に依存する。
蛍光標識の付着は、細胞成分もしくは化合物に直接的に、またはリンカーを介して行うことができる。蛍光標識を中間体に間接的に連結する際に使用するのに適した結合対には、抗原／抗体、例えば、ローダミン／抗ローダミン、ビオチン／アビジンおよびビオチン／ストレプタビジンが含まれるが、これらに限定されない。
「固体支持体」という語は、「培養プレート」、「遺伝子チップ」または「マイクロアレイ」などの非水性表面を指す。このような遺伝子チップまたはマイクロアレイは、当業者に公知の多くの技術によって診断および治療の目的のために使用することができる。１つの技術において、オリゴヌクレオチドは、米国特許第６，０２５，１３６号および同第６，０１８，０４１号に概説されているものなど、ハイブリダイゼーションアプローチによってＤＮＡ配列を決定するために遺伝子チップ上に付着および配列される。本発明のポリヌクレオチドは、プローブに改変することができ、プローブは、次いで、遺伝子配列の検出に使用することができる。このような技術は、例えば、米国特許第５，９６８，７４０号および同第５，８５８，６５９号に記載されている。Ｋａｙｅｍら、米国特許第５，９５２，１７２号およびＫｅｌｌｅｙら、（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：４８３０－４８３７によって記載されているように、プローブは、核酸配列の電気化学的検出のために、電極表面に付着させまたは貼り付けることもできる。
「組成物」は、活性ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体と、不活性（例えば、検出可能な標識）または活性（例えば、遺伝子送達ビヒクル）な別の化合物または組成物との組み合わせを意味することを意図している。
「医薬組成物」は、活性ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは抗体と、固体支持体などの不活性または活性な担体との組み合わせを含み、組成物をインビトロ、インビボまたはエクスビボでの診断または治療用途に適したものにすることが意図される。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」という用語は、リン酸緩衝食塩水溶液、水、および油／水または水／油エマルジョンなどのエマルジョン、ならびに様々なタイプの湿潤剤などの標準的な薬学的担体のいずれをも包含する。組成物は、安定剤および防腐剤を含むこともできる。担体、安定剤および佐剤の例については、Ｍａｒｔｉｎ（１９７５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１５ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ）を参照されたい。
診断または処置の「対象」は、細胞または哺乳動物などの動物またはヒトである。対象は特定の種に限定されず、診断または処置の対象となる非ヒト動物を含み、感染の対象となるものまたは動物モデル、例えば、サル、ラット、マウス、チンチラなどのネズミ科の動物、イヌなどのイヌ科の動物、ウサギなどのウサギ科の動物、家畜、スポーツ用動物およびペットである。ヒトの患者もこの用語に含まれる。
「組織」という用語は、本明細書では、生きているもしくは死んだ生物の組織、または生きているもしくは死んだ生物に由来し、もしくはこれを模倣するように設計された任意の組織を指すために使用される。組織は、健康であり得、病気であり得、および／または遺伝的変異を有し得る。生物学的組織は、任意の単一の組織（例えば、相互に接続され得る細胞の集合）、または生物の身体の器官または部分または領域を構成する組織の群を含み得る。組織は、均質な細胞物質を含み得る、もしくはあるいは均質な細胞物質から本質的になり得る、もしくはなおさらに均質な細胞物質からなり得る、均質な細胞物質を含み得る、もしくはあるいは均質な細胞物質から本質的になり得る、もしくはなおさらに均質な細胞物質からなり得るか、または、組織は、例えば肺組織、骨格組織および／または筋肉組織を含み得る胸部を含む身体の領域中に見出されるものなどの複合構造であり得る。例示的な組織には、肝臓、肺、甲状腺、皮膚、膵臓、血管、膀胱、腎臓、脳、胆管、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓および腸（これらの任意の組み合わせを含む）に由来する組織が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、対象中の疾患を「処置する」または対象中の疾患の「処置」は、（１）疾患の症候に対する素因があるもしくは疾患の症候をいまだ示していない対象において症候または疾患が起こることを予防すること、（２）疾患を阻止しもしくはその発達を停止すること、または（３）疾患もしくは疾患の症候を軽減しもしくは疾患もしくは疾患の症候の後退を引き起こすことを表す。本分野において理解されるとおり、「処置」は、臨床的結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本技術において、有益なまたは所望の結果としては、１またはそれを超える症候の緩和または軽減、症状（疾患を含む）の程度の縮小、症状（疾患を含む）の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、症状（疾患を含む）の遅延または減速、症状（疾患を含む）の進行、軽減または寛解、状態および緩解（部分的であるか、完全であるかを問わない）の１つまたはそれより多くを含むことができるが、これらに限定されず、検出可能かまたは検出不能かを問わない。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の効果を達成するのに十分な量を意味することを意図している。治療的または予防的適用の文脈において、有効量は、問題となっている症状の種類および重症度、ならびに一般的な健康、年齢、性別、体重および医薬組成物に対する耐性などの個々の対象の特徴に依存するであろう。遺伝子治療の文脈において、いくつかの実施形態では、有効量は、対象において欠損している遺伝子の部分的なまたは完全な機能の回復をもたらすのに十分な量である。一態様において、有効量は、細胞あたり０．００１～１の感染多重度（ＭＯＩ）の感染性ウイルス粒子を、この間の範囲で与える量である。非限定的な例としては、１細胞あたり少なくとも０．００１、または少なくとも０．０１、または少なくとも０．１、または少なくとも１、または０．０１～１、または０．１～１、または約０．０１～０．１、または１未満、または０．１未満、または０．０１未満の感染性ウイルス粒子の感染多重度（ＭＯＩ）が挙げられる。他の実施形態において、ＨＳＶウイルス粒子の有効量は、対象において細胞溶解をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態において、有効量は、ガラクトース代謝の増加を必要とする対象においてガラクトース代謝を増加させるのに必要とされる量である。当業者は、これらのおよびその他の要因に応じて適切な量を決定することができるであろう。
いくつかの実施形態において、有効量は、問題の適用の大きさおよび性質に依存するであろう。有効量は、目的の対象の性質および感受性ならびに使用されている方法にも依存する。当業者は、これらのおよびその他の考慮事項に基づいて有効量を決定することができるであろう。有効量は、実施形態に応じて、組成物の１もしくはそれを超える投与を含み得る、またはあるいは組成物の１もしくはそれを超える投与から本質的になり得る、またはなおさらに組成物の１もしくはそれを超える投与からなり得る。
本明細書で使用される場合、「投与する」または「投与」という用語は、動物またはヒトなどの対象への物質の送達を意味することを意図している。投与は、処置の過程を通じて継続的にまたは断続的に、例えば、腫瘍内にまたは静脈内に、１つの用量で影響されることができる。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に公知であり、治療のために使用される組成物、治療の目的および処置されている対象の年齢、健康または性別によって変動する。単回または複数回の投与を実施することができ、用量レベルおよびパターンは、処置を行う医師によってまたはペットおよび動物の場合には処置を行う獣医師によって選択される。適切な投薬用製剤および薬剤を投与する方法は本分野において公知である。投与経路も決定することができ、最も効果的な投与経路を決定する方法は当業者に公知であり、処置のために使用される組成物、処置の目的、処置されている対象の健康状態または疾患段階および標的細胞または組織によって異なる。投与経路の非限定的な例には、直接的および全身的、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、髄腔内、脳室下、硬膜外、脳内、腫瘍内、頭蓋内、脳室内、網膜下、硝子体内、関節内、眼内、腹腔内、子宮内、皮内、皮下、経皮、経粘膜および吸入が含まれる。
腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）
腫瘍に対するｏＨＳＶの有効性は、直接的な細胞殺滅（溶解期）および抗がん免疫の増強（免疫期）に由来する。これらのウイルスは、がん細胞を選択的に標的とするために様々な方法で構築されてきた。がん選択性を達成するために、最も一般的な変異は、神経病原性遺伝子γ１３４．５／ＲＬ１の欠失である。γ１３４．５／ＲＬ１によってコードされるＩＣＰ３４．５の発現は、ウイルス感染に応答して通常はｅ－ＩＦ２αをリン酸化し、タンパク質翻訳を停止させる宿主細胞の抗ウイルス性プロテインキナーゼＲＮＡ活性化（ＰＫＲ）経路に、ＨＳＶ－１が対抗するために不可欠である。ＩＣＰ３４．５は、ｅ－ＩＦ２αを脱リン酸化するように細胞のタンパク質ホスファターゼ－１（ＰＰ１）に再指示して、生産的なウイルス複製を可能にする。多くのがん細胞は、ＰＫＲ応答が欠損しており、したがって、γ１３４．５ヌル変異体を含むＨＳＶベクターの複製を支える。いくつかのベクターは、リボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ、その大サブユニットはＩＣＰ６／ＵＬ３９遺伝子によってコードされる）などの重要な代謝ウイルス遺伝子を変異させることによって構築される。多くの悪性細胞はＲＲの発現および活性が増加しているので、ＩＣＰ６ヌル変異体は、存在する巨大なリボヌクレオチドプールの故に、高度に増殖しているがん細胞中で選択的に複製する。
ＨＳＶ侵入、細胞－細胞拡散および合胞体形成
ＨＳＶ－１の侵入は、ウイルスの糖タンパク質が細胞の表面分子と相互作用する連続的ステップを含む。まず、糖タンパク質ＢおよびＣ（ｇＢおよびｇＣ）が細胞ヘパラン硫酸プロテオグリカンに付着し、続いてｇＤがウイルス侵入受容体（すなわち、ネクチン－１、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）または３－Ｏ－硫酸化ヘパラン硫酸（３－ＯＳ－ＨＳ））に結合する。この過程は、さらに、ｇＨ／ｇＬがｇＢと相互作用し、ウイルスエンベロープの標的細胞膜への融合を誘発し、ビリオンキャプシドおよびテグメントタンパク質の細胞内への放出をもたらすことを可能にする。いくつかの報告は、膜融合が隣接細胞間でのウイルスのその後の側方拡散にも重要であることを示唆している。ウイルスの細胞－細胞の拡散は、ウイルスが細胞接触の領域を介して感染細胞から隣接する非感染細胞へと拡散するときに起こり、これはウイルス中和抗体の存在下でさえ起こり得る。ｇＥ／ｇＩの存在は細胞－細胞拡散を促進するが、ｇＥ低形質変異体は細胞－細胞融合およびプラークサイズを減少させる。合胞体は、複数の隣接細胞が多核巨細胞へと融合した結果である。合胞体を引き起こす変異が、少なくとも４つのＨＳＶウイルス遺伝子（すなわち、ｇＢ、ｇＫ、ＵＬ２０およびＵＬ２４）中に発見されている。
本開示は、臨床的に適切なウイルスベクターの開発のために「指向性進化」とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を組み合わせる戦略を提供する。この有効な組み合わせは、従来技術のアプローチからの実質的な脱却に相当する。理論に束縛されるものではないが、予想外の機構が腫瘍を死滅させるためのウイルスの効力の増加をもたらし得ることが予想される。高膜融合性表現型および効力の増加を生じさせるこれまで未知の変異（複数可）、ならびに次世代ｏＨＳＶを開発するための足がかりが、これによって明らかになると予想される。このようにして作製されたｏＨＳＶは、向上した溶解期、より長い持続性、および最大化された治療結果を有し、これは、国立がん研究所の臨床的および橋渡し的な探索／開発研究（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ／Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ）の目的と一致する。
ウイルス療法の「溶解期」に焦点が当てられているが、より長い持続的なウイルス応答はインビボで炎症応答を増強し、ウイルス療法の後続の「免疫期」に利益をもたらして最適な抗腫瘍効果に到達する。小児がんモデルにおける有効性研究は、小児がんに対処する上での非天然ＨＳＶの使用に対処することができる。得られた改善されたウイルスは、様々な成人のがんにわたっても活性を有すると予想される。
本開示を実施するための様式
ＨＳＶは広範囲の細胞を標的としてまたは広範囲の細胞に感染して溶解を誘導することができるにもかかわらず、ウイルス感染自体は細胞傷害性およびその他の障害、例えば脳炎、食道炎および間質性肺炎を引き起こしている。多数のＨＳＶ遺伝子が病原性に影響を及ぼす。例えば、γ３４．５（ＲＬ１）は神経病原性を引き起こすことができる。ＩＣＰ６（ＵＬ３９）、リボヌクレオチド還元酵素、チミジンキナーゼ（ＵＬ２３）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＬ２）、ｄＵＴＰアーゼ（ＵＬ５０）、およびＤＮＡポリメラーゼ（ＵＬ３０）は、ＨＳＶのヌクレオチド代謝および病原性に関与している。したがって、その副作用を最小限に抑えながらその腫瘍阻害の機能を実行するために、弱毒化されているが複製能を有するＨＳＶ粒子を作製する必要がある。
巨大合胞体プラーク表現型を示すＭｕｔ－３と呼ばれる新しいウイルスが本明細書で提供される。出願人は、非許容性系中の１７ＴｅｒｍＡとｒＲｐ４５０を混合する連続継代からＭｕｔ－３を単離し（「指向性進化」）、遺伝子編集（「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９」ステップ）を通じて、弱毒化された変異体Ｍｕｔ－３Δ３４．５を構築した（図１Ａ）。全ゲノム配列分析により、Ｍｕｔ－３がγ１３４．５／ＲＬ１およびＵＬ３９（ＩＣＰ６をコードする）の両方の完全なコピーを獲得し、このため、その遺伝子型は野生型（ＷＴ）ウイルスの遺伝子型と類似していることが明らかになった。理論に束縛されるものではないが、出願人らは、Ｍｕｔ－３の溶解活性が多くのＷＴウイルスよりはるかに大きいことを見出し、（その完全なウイルスゲノムに加えて）他のゲノム変化がその効力の増加に関与している可能性を示唆した。ｇＥをコードする遺伝子中の１５１位のアラニンからスレオニンへの変異（Ａ１５１Ｔ）を含む、いずれかの親ウイルスとは異なる、Ｍｕｔ－３中の５つの非同義変異が見出された。Ｍｕｔ－３Δ３４．５と命名された、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を介してγ１３４．５／ＲＬ１を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で置き換える（図１Ａ、下、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９」ステップと表記）Ｍｕｔ－３ウイルスの弱毒化されたバージョンが提供される。Ｍｕｔ－３とその親ウイルスとの配列比較の結果概要を示す図１Ｂを参照のこと。Ｍｕｔ－３においていずれかの親と異なる非同義変異には、ＵＬ１５、ＵＬ２９、ＵＳ８、ＲＬ１およびＲＬ２を含めて、右下方向への斜線が付されている。１７ＴｅｒｍＡと同一のゲノム配列は空欄として示されており、ｒＲｐ４５０と同一のゲノム配列には左下方向への斜線が付されている。
したがって、本開示は、非天然単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）であって、前記ウイルスが、（ａ）糖タンパク質Ｅ（「ｇＥ」）をコードする遺伝子、（ｂ）感染細胞タンパク質０（「ＩＣＰ０」）をコードする遺伝子、（ｃ）ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１をコードする遺伝子、（ｄ）ＩＣＰ８をコードする遺伝子または（ｅ）ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子の群からの１またはそれより多くである病原性遺伝子中に変異を含む、あるいは変異から本質的になる、またはなおさらに変異からなる非天然単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）を提供する。一実施形態において、ＨＳＶは、機能不全ＩＣＰ３４．５タンパク質をコードする遺伝子および／もしくは機能不全ＩＣＰ６タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、あるいは機能不全ＩＣＰ３４．５タンパク質をコードする遺伝子および／もしくは機能不全ＩＣＰ６タンパク質をコードする遺伝子から本質的になる、またはなおさらに機能不全ＩＣＰ３４．５タンパク質をコードする遺伝子および／もしくは機能不全ＩＣＰ６タンパク質をコードする遺伝子からなる。別の実施形態において、機能不全ＩＣＰ３４．５タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１、５、７、９もしくは５１と少なくとも９５％同一の配列を有するポリヌクレオチドおよびその同等物を含む、あるいは該ポリヌクレオチドおよびその同等物から本質的になる、またはなおさらに該ポリヌクレオチドおよびその同等物からなるが、ただし、同等物は変異したまたは変化したアミノ酸またはヌクレオチドを維持する。別の実施形態において、機能不全ＩＣＰ６タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号４３、４５、４７もしくは４９と少なくとも９５％同一の配列を有するポリヌクレオチドおよびその同等物を含む、あるいは該ポリヌクレオチドおよびその同等物から本質的になる、またはなおさらに該ポリヌクレオチドおよびその同等物からなるが、ただし、同等物は野生型配列と比較して変異したまたは変化したアミノ酸またはヌクレオチドを維持する。
ある特定の実施形態において、非天然単純ヘルペスウイルスのｇＥをコードする遺伝子は、配列番号１２、１４、１６、１８から選択される配列、配列番号１２、１４、１６および１８のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一の配列を有するポリヌクレオチドならびにその同等物を含む、あるいは該ポリヌクレオチドおよびその同等物から本質的になる、またはなおさらに該ポリヌクレオチドおよびその同等物からなるが、ただし、同等物は野生型配列と比較して変異したまたは変化したアミノ酸またはヌクレオチドを維持する。さらなる実施形態において、このような同等物を含むＨＳＶは、配列番号１３のアミノ酸配列を有する変異されたｇＥを含む非天然ＨＳＶと同程度のレベルで細胞に入り、および／または細胞間に広がり、および／またはＤＮＡを複製する。ＨＳＶが細胞に侵入し、細胞間に広がり、ＤＮＡを複製することを評価する非限定的な例は、実施例に見出すことができる。なおさらなる実施形態において、ｇＥをコードする遺伝子のポリヌクレオチドは、配列番号１３、１５、１７および１９から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
ある特定の実施形態において、非天然単純ヘルペスウイルスのＩＣＰ０をコードする遺伝子は、配列番号２０、２２、２４、２５および５３から選択される配列、イントロンの一方または両方を含まない配列番号２０、２２、２４、２５および５３のいずれか１つの配列、配列番号２０、２２、２４、２５および５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一の配列を有するポリヌクレオチドならびにその同等物を含む、あるいは該ポリヌクレオチドおよびその同等物から本質的になる、またはなおさらに該ポリヌクレオチドおよびその同等物からなるが、ただし、同等物は野生型配列と比較して変異したまたは変化したアミノ酸またはヌクレオチドを維持する。一実施形態において、イントロンは、配列表および以下に記載されている：配列番号２０のヌクレオチド（ｎｔ）５８～ｎｔ ８６１、配列番号２０のｎｔ １５２９～ｎｔ １６６３、配列番号２２のｎｔ ５８～ｎｔ ８２２、配列番号２２のｎｔ １４９０～ｎｔ １６２５、配列番号２４の５８～ｎｔ ８６２、配列番号２４のｎｔ １５３０～ｎｔ １６６８、配列番号２５のｎｔ ５８～ｎｔ ８６１、配列番号２５のｎｔ １５２９～ｎｔ １６６３、配列番号５３のｎｔ ５８～ｎｔ ８２２、および配列番号５３のｎｔ １４９０～ｎｔ １６２５。さらなる実施形態において、同等物は、野生型ＩＣＰ０または配列番号２１のアミノ酸配列を有する変異されたＩＣＰ０と同程度のレベルで（例えば、ウイルス遺伝子からの転写を促進し、核ドットまたは前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）核内構造体として知られる核内の構造を破壊し、神経細胞特異的タンパク質と組み合わせて宿主およびウイルス遺伝子の発現を変化させるという）機能を有するＩＣＰ０のポリペプチドをコードする。このような機能を評価する例は、Ｌｅｅ ＨＲ、Ｋｉｍ ＤＪ、Ｌｅｅ ＪＭら（Ｊｕｎｅ ２００４）に見出すことができる。”Ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ＩＥ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＭＬ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ” Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８（１２）：６５２７－４２；Ｇｕ Ｈ、Ｌｉａｎｇ Ｙ、Ｍａｎｄｅｌ Ｇ、Ｒｏｉｚｍａｎ Ｂ（Ｍａｙ ２００５）。”Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＲＥＳＴ／ＣｏＲＥＳＴ／ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｒｅ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ，ｍｏｄｉｆｉｅｄ，ａｎｄ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ＨＳＶ－１－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２（２１）：７５７１－６；およびＰｉｎｎｏｊｉ ＲＣ、Ｂｅｄａｄａｌａ ＧＲ、Ｇｅｏｒｇｅ Ｂ、Ｈｏｌｌａｎｄ ＴＣ、Ｈｉｌｌ ＪＭ、Ｈｓｉａ ＳＣ（２００７）。”Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｅｌｅｍｅｎｔ－１ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ／ｎｅｕｒｏｎａｌ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＳＴ／ＮＲＳＦ）ｃａｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ ＨＳＶ－１ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｖｉａ ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．４：５６。それに加えてまたはそれに代えて、このような同等物を含むＨＳＶは、配列番号２１のアミノ酸配列を有する変異されたＩＣＰ０を含む非天然ＨＳＶと同程度のレベルで細胞に入り、および／または細胞間に広がり、および／またはＤＮＡを複製する。ＨＳＶが細胞に侵入し、細胞間に広がり、ＤＮＡを複製することを評価する非限定的な例は、実施例に見出すことができる。なおさらなる実施形態において、ＩＣＰ０をコードする遺伝子のポリヌクレオチドは、配列番号２１、２３および２６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
ある特定の実施形態において、非天然単純ヘルペスウイルスのＩＣＰ８をコードする遺伝子は、配列番号２７、２９、３１、３３から選択される配列、配列番号２７、２９、３１および３３のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一の配列を有するポリヌクレオチドならびにその同等物を含む、あるいは該ポリヌクレオチドおよびその同等物から本質的になる、またはなおさらに該ポリヌクレオチドおよびその同等物からなるが、ただし、同等物は野生型配列と比較して変異したまたは変化したアミノ酸またはヌクレオチドを維持する。さらなる実施形態において、同等物は、野生型ＩＣＰ８または配列番号２８のアミノ酸配列を有する変異されたＩＣＰ８と同程度のレベルで（例えば、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）にアニーリングする、二本鎖ＤＮＡの小さな断片の融解する、または複製開始の間に二本鎖ＤＮＡを不安定化するという）機能を有するＩＣＰ８のポリペプチドをコードする。このような機能は、当技術分野で利用可能な方法、例えば、Ｂｏｅｈｍｅｒ，ＰＥ；Ｌｅｈｍａｎ，ＩＲ（１９９３）．”Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ＩＣＰ８：Ｈｅｌｉｘ－ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６７（２）：７１１－５を介して評価することができる。それに加えてまたはそれに代えて、このような同等物を含むＨＳＶは、配列番号２８のアミノ酸配列を有する変異されたＩＣＰ８を含む非天然ＨＳＶと同程度のレベルで細胞に入り、および／または細胞間に広がり、および／またはＤＮＡを複製する。ＨＳＶが細胞に侵入し、細胞間に広がり、ＤＮＡを複製することを評価する非限定的な例は、実施例に見出すことができる。なおさらなる実施形態において、ＩＣＰ８をコードする遺伝子のポリヌクレオチドは、配列番号２８、３０、３２および３４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
ある特定の実施形態において、非天然単純ヘルペスウイルスのＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１をコードする遺伝子は、配列番号３５、３７、３９、４１から選択される配列、配列番号３５、３７、３９および４１のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一の配列を有するポリヌクレオチドならびにその同等物を含む、あるいは該ポリヌクレオチドおよびその同等物から本質的になる、またはなおさらに該ポリヌクレオチドおよびその同等物からなるが、ただし、同等物は野生型配列と比較して変異したまたは変化したアミノ酸またはヌクレオチドを維持する。さらなる実施形態において、このような同等物を含むＨＳＶは、配列番号３６のアミノ酸配列を有する変異されたＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１を含む非天然ＨＳＶと同程度のレベルで細胞に入り、および／または細胞間に広がり、および／またはＤＮＡを複製する。ＨＳＶが細胞に侵入し、細胞間に広がり、ＤＮＡを複製することを評価する非限定的な例は、実施例に見出すことができる。さらなる実施形態において、ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１をコードする遺伝子のポリヌクレオチドは、配列番号３６、３８、４０および４２から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
ある特定の実施形態において、ＨＳＶは、配列番号１２、２０、２７および３５から選択される配列を有するポリヌクレオチドの１もしくはそれより多くを含む、あるいは配列番号１２、２０、２７および３５から選択される配列を有するポリヌクレオチドの１もしくはそれより多くから本質的になる、またはなおさらに配列番号１２、２０、２７および３５から選択される配列を有するポリヌクレオチドの１もしくはそれより多くからなる。さらなる実施形態において、ＨＳＶは機能性ＩＣＰ３４．５を有さない（すなわち、機能不全ＩＣＰ３４．５をコードするか、またはＩＣＰ３４．５をコードしない）。これに加えてまたはこれに代えて、ＨＳＶは機能的ＩＣＰ６を有さない（すなわち、機能不全ＩＣＰ６をコードするか、またはＩＣＰ６をコードしない）。別の実施形態において、病原性遺伝子中の変異は、例えばＩＣＰ３４．５遺伝子および／もしくはＩＣＰ６遺伝子の挿入、欠失、切断、フレームシフト、置換もしくは点変異を含む、または例えばＩＣＰ３４．５遺伝子および／もしくはＩＣＰ６遺伝子の挿入、欠失、切断、フレームシフト、置換もしくは点変異から本質的になる、またはなおさらに例えばＩＣＰ３４．５遺伝子および／もしくはＩＣＰ６遺伝子の挿入、欠失、切断、フレームシフト、置換もしくは点変異からなる。別の実施形態において、ＨＳＶは、機能的ＩＣＰ３４．５タンパク質および／または機能的ＩＣＰ６タンパク質をコードする遺伝子を欠く。別の実施形態において、変異は、病原性遺伝子中の非同義変異である。
一実施形態において、本開示の非天然ＨＳＶ上の変異は、（ａ）ｇＥタンパク質の１５１位のアラニンからトレオニンへの変異、（ｂ）ＩＣＰ０タンパク質の２５８位におけるアルギニンからヒスチジンへの変異、（ｃ）ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１タンパク質の３７６位におけるアラニンからトレオニンへの変異、（ｄ）ＩＣＰ８タンパク質の１１５５位におけるトレオニンからメチオニンへの変異、または（ｅ）ＩＣＰ３４．５タンパク質の１１９位におけるプロリンからヒスチジンへの変異の１またはそれより多くをコードする。別の実施形態において、非天然ＨＳＶは、配列番号２、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２８もしくは配列番号３６およびこれらの等価物の１もしくはそれより多くを含む、またはあるいは配列番号２、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２８もしくは配列番号３６およびこれらの同等物の１もしくはそれより多くから本質的になる、またはなおさらに配列番号２、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２８もしくは配列番号３６およびこれらの等価物の１もしくはそれより多くからなるが、ただし、同等物は変異したまたは変化したアミノ酸またはヌクレオチドを維持する。
ある特定の実施形態において、非天然単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）であって、ウイルスが、（ａ）ｇＥ、（ｂ）ＩＣＰ０、（ｃ）ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１、（ｄ）ＩＣＰ８もしくは（ｅ）ＩＣＰ３４．５の１もしくはそれより多くにおける変異を含む、あるいは（ａ）ｇＥ、（ｂ）ＩＣＰ０、（ｃ）ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１、（ｄ）ＩＣＰ８もしくは（ｅ）ＩＣＰ３４．５の１もしくはそれより多くにおける変異から本質的になる、またはなおさらに（ａ）ｇＥ、（ｂ）ＩＣＰ０、（ｃ）ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１、（ｄ）ＩＣＰ８もしくは（ｅ）ＩＣＰ３４．５の１もしくはそれより多くにおける変異からなる非天然単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）が提供される。ある特定の実施形態において、ＨＳＶは、機能的ＩＣＰ３４．５タンパク質（例えば、１７ＴｅｒｍＡ株またはｒＲｐ４５０株のＩＣＰ３４．５）を含まない。さらなる実施形態において、ＨＳＶはＩＣＰ３４．５タンパク質を含まない。これに加えてまたはこれに代えて、ＨＳＶは、機能的ＩＣＰ６タンパク質（例えば、１７ＴｅｒｍＡ株またはｒＲｐ４５０株のＩＣＰ６）を含まない。まだその上さらなる実施形態において、ＨＳＶはＩＣＰ６タンパク質を含まない。
一実施形態において、本開示の非天然ＨＳＶ上の１つまたは複数の変異は、（ａ）ｇＥタンパク質の１５１位のアラニンからトレオニンへの変異、（ｂ）ＩＣＰ０タンパク質の２５８位におけるアルギニンからヒスチジンへの変異、（ｃ）ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１タンパク質の３７６位におけるアラニンからトレオニンへの変異、（ｄ）ＩＣＰ８タンパク質の１１５５位におけるトレオニンからメチオニンへの変異、または（ｅ）ＩＣＰ３４．５タンパク質の１１９位におけるプロリンからヒスチジンへの変異の１またはそれより多くである。
ある特定の実施形態において、非天然ＨＳＶのｇＥは、配列番号１３、１５、１７および１９から選択されるアミノ酸配列を含む、あるいは配列番号１３、１５、１７および１９から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、またはなおさらに配列番号１３、１５、１７および１９から選択されるアミノ酸配列からなる。さらなる実施形態において、非天然ＨＳＶは、ｇＥのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号１２、１４、１６、１８から選択される配列を有するポリヌクレオチドおよびその同等物をさらに含む。ある特定の実施形態において、非天然ＨＳＶのＩＣＰ０は、配列番号２１、２３および２６から選択されるアミノ酸配列を含む、あるいは配列番号２１、２３および２６から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、またはなおさらに配列番号２１、２３および２６から選択されるアミノ酸配列からなる。さらなる実施形態において、非天然ＨＳＶは、ＩＣＰ０のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号２０、２２、２４、２５、５３から選択される配列を有するポリヌクレオチドおよびその同等物をさらに含む。ある特定の実施形態において、非天然ＨＳＶのＩＣＰ８は、配列番号２８、３０、３２および３４から選択されるアミノ酸配列を含む、あるいは配列番号２８、３０、３２および３４から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、またはなおさらに配列番号２８、３０、３２および３４から選択されるアミノ酸配列からなる。さらなる実施形態において、非天然ＨＳＶは、ＩＣＰ８のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号２７、２９、３１、３３から選択される配列を有するポリヌクレオチドおよびその同等物をさらに含む。ある特定の実施形態において、非天然ＨＳＶのＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１は、配列番号３６、３８、４０および４２から選択されるアミノ酸配列を含む、あるいは配列番号３６、３８、４０および４２から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、またはなおさらに配列番号３６、３８、４０および４２から選択されるアミノ酸配列からなる。さらなる実施形態において、非天然ＨＳＶは、ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号３５、３７、３９、４１から選択される配列を有するポリヌクレオチドまたはその同等物をさらに含む。
ある特定の実施形態において、非天然ＨＳＶは、配列番号１３、２１、２８および３６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの１もしくはそれより多くを含む、またはあるいは配列番号１３、２１、２８および３６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの１もしくはそれより多くから本質的になる、またはなおさらに配列番号１３、２１、２８および３６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの１もしくはそれより多くからなる。さらなる実施形態において、非天然ＨＳＶは、配列番号１３、２１、２８および３６から選択されるアミノ酸配列の１もしくはそれより多くをコードするポリペプチドの１もしくはそれより多くを含む、またはあるいは配列番号１３、２１、２８および３６から選択されるアミノ酸配列の１もしくはそれより多くをコードするポリヌクレオチドの１もしくはそれより多くから本質的になる、またはなおさらに配列番号１３、２１、２８および３６から選択されるアミノ酸配列の１もしくはそれより多くをコードするポリヌクレオチドの１もしくはそれより多くからなる。
ある特定の実施形態において、非天然ＨＳＶは、以下のもの：（ａ）配列番号２、６、８、１０および５２から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに／または配列番号１、５、７、９および５１から選択される配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号２、６、８、１０および５２から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｃ）配列番号１３、１５、１７および１９から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに／または配列番号１２、１４、１６および１８から選択される配列を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１３、１５、１７および１９から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｅ）配列番号２１、２３および２６から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに／または配列番号２０、２２、２４、２５および５３から選択される配列を有するポリヌクレオチド、または１つもしくは２つもしくはそれを超えるイントロンを含まないこれらの配列；（ｆ）配列番号２１、２３および２６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｇ）配列番号２８、３０、３２および３４から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに／または配列番号２７、２９、３１および３３から選択される配列を有するポリヌクレオチド；（ｈ）配列番号２８、３０、３２および３４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｉ）配列番号３６、３８、４０および４２から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに／または配列番号３５、３７、３９および４１から選択される配列を有するポリヌクレオチド；（ｊ）配列番号３６、３８、４０および４２から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｋ）配列番号４４、４６、４８および５０から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに／または配列番号４３、４５、４７および４９から選択される配列を有するポリヌクレオチド；（ｌ）配列番号４４、４６、４８および５０から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；の１もしくはそれより多くを含む、またはあるいは１もしくはそれより多くから本質的になる、またはなおさらに１もしくはそれより多くからなる。
別の実施形態において、非天然ＨＳＶは、さらに、１７ＴｅｒｍＡ ＨＳＶからの病原性遺伝子の少なくとも１つの断片と同一である配列を有するポリヌクレオチドおよびその同等物を含む、またはあるいは１７ＴｅｒｍＡ ＨＳＶからの病原性遺伝子の少なくとも１つの断片と同一である配列を有するポリヌクレオチドおよびその同等物から本質的になる、またはなおさらに１７ＴｅｒｍＡ ＨＳＶからの病原性遺伝子の少なくとも１つの断片と同一である配列を有するポリヌクレオチドおよびその同等物からなる。別の実施形態において、非天然ＨＳＶは、さらに、ｒＲｐ４５０ ＨＳＶからの病原性遺伝子の少なくとも１つの断片と同一である配列を有するポリヌクレオチドを含む、またはあるいはｒＲｐ４５０ ＨＳＶからの病原性遺伝子の少なくとも１つの断片と同一である配列を有するポリヌクレオチドから本質的になる、またはなおさらにｒＲｐ４５０ ＨＳＶからの病原性遺伝子の少なくとも１つの断片と同一である配列を有するポリヌクレオチドからなる。非天然ＨＳＶは、いくつかの実施形態において、ＨＳＶ１型（「ＨＳＶ－１」）またはＨＳＶ２型（「ＨＳＶ－２」）株に由来する。一実施形態において、非天然ＨＳＶは、ＨＳＶ－１ ＫＯＳ株に由来する。別の実施形態において、非天然ＨＳＶは、さらに、導入遺伝子を含む、またはあるいは導入遺伝子から本質的になる、またはなおさらに導入遺伝子からなる。
本明細書に開示されるＨＳＶはその溶解機能を保持しているので、別の態様において、本開示は、がんを処置することまたはがん細胞の成長もしくは転移を阻害することを必要とする対象において、がんを処置することまたはがん細胞の成長もしくは転移を阻害する方法であって、有効量の非天然ＨＳＶを、または非天然ＨＳＶを含むまたはあるいは非天然ＨＳＶから本質的になるまたはなおさらに非天然ＨＳＶからなる有効量の組成物を、対象に投与することを含む、または投与することから本質的になる、またはなおさらに投与することからなる、方法を提供する。一態様において、がんは、膵臓がん、腎臓がん、小細胞肺がん、脳がん、神経がん、神経芽細胞腫、骨がん、リンパ腫、骨髄腫、結腸がん、子宮がん、乳がん、白血病、肝臓がん、前立腺がん、皮膚がんまたは黒色腫を含む。処置される対象は、成体または小児患者、例えば哺乳動物またはヒト患者であり得る。別の実施形態において、非天然ＨＳＶベクターまたは組成物もしくは医薬組成物は、注射、注入、点滴注入および／または吸入によって局所的または全身的に投与される。別の実施形態において、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、マウス、ラット、モルモット、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギまたはヒツジである。別の実施形態において、対象はヒトである。
別の態様において、本開示は、細胞溶解を誘導する方法であって、細胞を、本開示の非天然ＨＳＶと、または非天然ＨＳＶを含む、またはあるいは非天然ＨＳＶから本質的になる、またはなおさらに非天然ＨＳＶからなる組成物と、接触させることを含む、または接触させることから本質的になる、またはなおさらに接触させることからなる方法を提供する。一実施形態において、細胞はがん細胞である。さらなる態様において、細胞は、（前臨床モデルまたは前臨床アッセイとして使用するための）培養細胞または対象から単離された細胞である。細胞は、培養することができ、または単離された組織内に存在することができる。このような細胞の非限定的な例には、膵臓がん、腎臓がん、小細胞肺がん、脳がん、神経芽細胞腫、神経がん、骨がん、リンパ腫、骨髄腫、結腸がん、子宮がん、乳がん、白血病、肝臓がん、前立腺がん、皮膚がんまたは黒色腫由来の細胞が含まれる。細胞は哺乳動物から単離することができ、例えば、ヒトは成人または若年者（小児）であり得る。
別の態様において、本開示は、細胞を感染させるための方法であって、細胞を非天然ＨＳＶと接触させることを含む、またはあるいは接触させることから本質的になる、またはなおさらに接触させることからなる、方法を提供する。一実施形態において、細胞は真核細胞である。別の実施形態において、細胞はリンパ球である。一実施形態において、細胞は、がん細胞、例えば血液がんまたは固形腫瘍細胞、例えば癌または肉腫である。さらなる態様において、細胞は、（前臨床モデルまたは前臨床アッセイとして使用するための）培養細胞または対象から単離された細胞である。細胞は、培養することができ、または単離された組織内に存在することができる。このような細胞の非限定的な例には、膵臓がん、腎臓がん、小細胞肺がん、脳がん、神経芽細胞腫、神経がん、骨がん、リンパ腫、骨髄腫、結腸がん、子宮がん、乳がん、白血病、肝臓がん、前立腺がん、皮膚がんまたは黒色腫由来の細胞が含まれる。細胞は哺乳動物から単離することができ、例えば、ヒトは成人または若年者（小児）であり得る。
出願人らは、エプスタイン・バー・ウイルス（「ＥＢＶ」）に感染したリンパ球の従来の群が従来の腫瘍溶解性ＨＳＶ（「ｏＨＳＶ」）に対して耐性であることを発見した。理論に拘束されるものではないが、耐性は、少なくとも部分的には、ＥＢＶに感染したリンパ球上のＨＳＶ侵入受容体の発現のレベルが低いことに起因する。驚くべきことに、特許請求の範囲に記載された発明のＨＳＶは、野生型株１７、ＫＯＳおよびＭｃＫｒａｅ ＨＳＶウイルスに対して耐性であるＥＢＶ感染リンパ球において溶解を誘導することができた。したがって、一実施形態において、細胞は、ＥＢＶによって感染された細胞もしくはＥＢＶに耐性の細胞を含む、またはあるいはＥＢＶによって感染された細胞もしくはＥＢＶに耐性の細胞から本質的になる、またはなおさらにＥＢＶによって感染された細胞もしくはＥＢＶに耐性の細胞からなる。別の実施形態において、細胞は、エプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）の病原性要素を含む、またはあるいはエプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）の病原性要素から本質的になる、またはなおさらにエプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）の病原性要素からなる。別の実施形態において、細胞は、ＥＢＶによって感染されたリンパ球を含む、またはあるいはＥＢＶによって感染されたリンパ球から本質的になる、またはなおさらにＥＢＶによって感染されたリンパ球からなる。別の実施形態において、特許請求の範囲に記載された発明のＨＳＶは、対照と比較してＥＢＶに感染した細胞に対する感染率がより高い。一実施形態において、対照は、従来のｏＨＳＶを含む、またはあるいは従来のｏＨＳＶから本質的になる、またはなおさらに従来のｏＨＳＶからなる。別の実施形態において、従来のｏＨＳＶは、野生型株１７ ＨＳＶ、ＫＯＳ ＨＳＶまたはＭｃＫｒａｅ ＨＳＶを含む。
ＨＳＶ変異体または誘導体の作製
ＨＳＶ変異体または誘導体の作製は、親ＨＳＶ株によってコードされる遺伝子または遺伝子の組み合わせの変化または変異を含む。例えば、誘導体は、ヌクレオチド置換、例えば１、２または３～１０、２５、５０または１００個の置換によって修飾されたＨＳＶ－１またはＨＳＶ－２ゲノムの配列を有し得る。ＨＳＶ－１またはＨＳＶ－２ゲノムは、これに代えてまたはこれに加えて、１もしくはそれを超える挿入および／もしくは欠失によって、ならびに／またはいずれかもしくは両方の末端での伸長によって修飾され得る。遺伝子修飾方法、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、組換え構築または点変異は、当技術分野で公知である。当業者は、必要に基づいてＨＳＶ変異体を作製する方法を知っている。
標的遺伝子修飾法に加えて、ＨＳＶ変異体は自発的に産生され得る。例えば、ＨＳＶなどのウイルスの培養は、連続継代として知られる技術を含む。ウイルスを成長および維持するために、適切な細胞にウイルスを感染させ、ウイルスが細胞内で複製し、次いでウイルスが採取され、次いで、新鮮な細胞に再感染させ、この過程が連続継代の１サイクルを構成する。このような各サイクルは、例えば、ＨＳＶの場合、数日を要し得る。上述のように、このような連続継代は、ＨＳＶの臨床適用に好ましい特性に関して選択が起こるという点で、ウイルス株の特性または遺伝子配列の変化をもたらし得る。例えば、増強された特性は、迅速な複製、またはヒト細胞に感染するために軸索に沿って移動する能力を含むことができる。さらに、自然変異は、細胞に１つのＨＳＶまたは１を超えるＨＳＶを感染させることによって生じさせることができる。
したがって、本開示は、ＨＳＶ中の遺伝子を変異させることによってＨＳＶまたはその変異体もしくは誘導体を調製するための方法を提供する。別の実施形態において、本方法は、導入遺伝子を非天然ＨＳＶに誘導することを含む、またはあるいは導入遺伝子を非天然ＨＳＶに誘導することから本質的になる、またはなおさらに導入遺伝子を非天然ＨＳＶに誘導することからなる。
別の態様において、ＨＳＶウイルス粒子を作製する方法であって、（ａ）宿主細胞に１７ＴｅｒｍＡ ＨＳＶベクターおよびｒＲｐ４５０ ＨＳＶベクターを導入することと；（ｂ）少なくとも３継代にわたって宿主細胞を成長させることと；（ｃ）宿主細胞によって産生されたＨＳＶ粒子を単離することと；を含む、またはあるいは（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から本質的になる、またはなおさらに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる方法が本明細書で提供される。一実施形態において、ＨＳＶは、形質移入、感染、形質転換、電気穿孔、注射、微量注入またはこれらの組み合わせによって細胞に導入される。別の実施形態において、宿主細胞を、少なくとも３継代、１０継代、２０継代、３０継代、４０継代または５０継代成長させる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、導入されたＨＳＶベクターの複製を支援するための相補遺伝子産物を含む、またはあるいは導入されたＨＳＶベクターの複製を支援するための相補遺伝子産物から本質的になる、またはなおさらに導入されたＨＳＶベクターの複製を支援するための相補遺伝子産物からなる。別の実施形態において、相補遺伝子は、ＩＣＰ６タンパク質および／またはＩＣＰ３４．５タンパク質をコードする。別の実施形態において、このように作製されたＨＳＶ粒子は、本開示中のＨＳＶベクターを含む、またはあるいは本開示中のＨＳＶベクターから本質的になる、またはなおさらに本開示中のＨＳＶベクターからなる。
ある特定の実施形態において、本開示の非天然ＨＳＶウイルス粒子を作製する方法が本明細書で提供される。この方法は、（ａ）宿主細胞に非天然ＨＳＶベクターを導入することと；（ｂ）宿主細胞を成長させることと；（ｃ）宿主細胞によって産生されたＨＳＶ粒子を単離することと；を含む、またはあるいは（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から本質的になる、またはなおさらに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる。
ある特定の実施形態において、本開示の非天然ＨＳＶウイルス粒子を作製する方法であって、（ａ）非天然ＨＳＶベクターのウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと；（ｂ）宿主細胞を成長させることと；（ｃ）宿主細胞によって産生されたＨＳＶ粒子を収集および単離することと；を含む、またはあるいは（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から本質的になる、またはなおさらに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる方法が本明細書において提供される。一実施形態において、ウイルスゲノムをコードする核酸配列は、形質移入、感染、形質転換、電気穿孔、注射、微量注入またはこれらの組み合わせによって宿主細胞に導入される。一実施形態において、ウイルスゲノムをコードする核酸配列は、ベクターで宿主細胞に導入される。さらなる実施形態において、ベクターはウイルスベクター（ＨＳＶなど）または非ウイルスベクター（プラスミドまたはナノ粒子など）である。さらなる実施形態において、ベクターはＨＳＶである。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、導入されたＨＳＶベクターの複製を支援するための相補遺伝子産物を含む、またはあるいは導入されたＨＳＶベクターの複製を支援するための相補遺伝子産物から本質的になる、またはなおさらに導入されたＨＳＶベクターの複製を支援するための相補遺伝子産物からなる。一実施形態において、このような相補遺伝子産物は、ヘルパーウイルスを介して宿主細胞中に与えられる。別の実施形態において、相補遺伝子は、ＩＣＰ６タンパク質および／またはＩＣＰ３４．５タンパク質をコードする。別の実施形態において、このように作製されたＨＳＶ粒子は、本開示中のＨＳＶベクターを含む、またはあるいは本開示中のＨＳＶベクターから本質的になる、またはなおさらに本開示中のＨＳＶベクターからなる。
一実施形態において、単離するステップは、例えば遠心分離、濾過、クロマトグラフィーまたはこれらの任意の組み合わせによって、他の材料、例えば、宿主細胞、細胞片、培養培地または宿主細胞の培養において使用される任意の他の作用物質からＨＳＶを実質的に分離する過程を指す。非限定的な例は、Ｓｉａら、Ｏｐｔｉｍａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｈｅｒｐｅｓ－ｂａｓｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｅｒｓ ｍｉｎｉｍａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｏｕｔｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００７ Ｆｅｂ；１３９（２）：１６６－７４に見出すことができる。
組成物
別の態様において、本開示は、本明細書に記載の非天然ＨＳＶを含む、または本明細書に記載の非天然ＨＳＶから本質的になる、またはなおさらに本明細書に記載の非天然ＨＳＶからなる組成物を提供する。本明細書に記載されている作用物質もしくはウイルス粒子を含む、またはあるいは本明細書に記載されている作用物質もしくはウイルス粒子から本質的になる、またはなおさらに本明細書に記載されている作用物質もしくはウイルス粒子からなる医薬組成物などの組成物は、従来の混合、溶解、造粒、湿式粉砕（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥過程によって製造することができる。組成物は、本明細書で提供されるウイルス粒子の薬学的に使用することができる調製物への加工を容易にする１またはそれを超える生理学的に許容され得る、担体、希釈剤、賦形剤または助剤を使用して従来の様式で製剤化することができる。
本技術の作用物質およびウイルス粒子は、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、脳室内（「ＩＣＶ」）、大槽内注射もしくは注入、皮下注射、またはインプラント）、経口、吸入スプレー経鼻、膣、直腸、舌下、尿道（例えば、尿道坐剤）または局所投与経路（例えば、ゲル、軟膏、クリーム、エアロゾルなど）によって投与することができ、各投与経路に適した従来の非毒性の薬学的に許容され得る、担体、アジュバント、賦形剤およびビヒクルを含有する適切な投与単位製剤で、単独でまたは一緒に製剤化することができる。
一実施形態において、本開示は、本明細書に記載されている非天然ＨＳＶウイルス粒子および担体を含む、または本明細書に記載されている非天然ＨＳＶウイルス粒子および担体から本質的になる、またはなおさらに本明細書に記載されている非天然ＨＳＶウイルス粒子および担体からなる組成物に関する。
別の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されている非天然ウイルス粒子および薬学的に許容され得る担体を含む、またはあるいは本明細書に記載されている非天然ウイルス粒子および薬学的に許容され得る担体から本質的になる、またはなおさらに本明細書に記載されている非天然ウイルス粒子および薬学的に許容され得る担体からなる医薬組成物に関する。別の実施形態において、組成物は、有意な病原性を失うことなく非天然ＨＳＶの凍結および解凍を容易にする凍結保存剤を含む、またはあるいは有意な病原性を失うことなく非天然ＨＳＶの凍結および解凍を容易にする凍結保存剤から本質的になる、またはなおさらに有意な病原性を失うことなく非天然ＨＳＶの凍結および解凍を容易にする凍結保存剤からなる。
別の実施形態において、本開示は、治療有効量の本明細書に記載されている非天然ＨＳＶウイルス粒子および薬学的に許容され得る担体を含む、またはあるいは本明細書に記載されている非天然ＨＳＶウイルス粒子および薬学的に許容され得る担体から本質的になる、またはなおさらに本明細書に記載されている非天然ＨＳＶウイルス粒子および薬学的に許容され得る担体からなる医薬組成物に関する。
ＨＳＶウイルス粒子を投与するための医薬組成物は、投薬単位形態で都合よく提供することができ、薬学の分野で周知の方法のいずれによっても調製することができる。医薬組成物は、例えば、本明細書で提供されるＨＳＶウイルス粒子を液体担体、微粉化された固体担体またはその両方と均一かつ緊密に混ぜ合わせ、次いで、必要であれば、生成物を所望の製剤へと成形することによって調製することができる。医薬組成物において、本明細書で提供される化合物は、所望の治療効果を生じるのに十分な量で含まれる。例えば、本開示の医薬組成物は、例えば、局所、眼、経口、頬側、全身、鼻、注射、注入、経皮、直腸および膣を含む実質的に任意の投与様式に適した形態、または吸入もしくは送気による投与に適した形態を取り得る。
局所投与のために、非天然ＨＳＶウイルス粒子は、当技術分野で周知のように、液剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、懸濁剤などとして製剤化することができる。
全身製剤には、注射による投与のために設計されたもの（例えば、皮下、静脈内、注入、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射）、ならびに経皮、経粘膜、経口または肺投与のために設計されたものが含まれる。
有用な注射用調製物には、水性または油性ビヒクル中の本明細書で提供されるＨＳＶウイルス粒子の無菌懸濁剤、液剤または乳剤が含まれる。組成物は、配合剤、例えば懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤も含有し得る。注射用製剤は、単位剤形、例えばアンプルまたは複数回投与容器で提供することができ、添加された防腐剤を含有し得る。
あるいは、注射用製剤は、使用前に、無菌発熱物質非含有水、緩衝液およびデキストロース溶液を含むがこれらに限定されない適切なビヒクルで再構成するための粉末形態で提供され得る。この目的のために、本明細書で提供されるＨＳＶウイルス粒子は、凍結乾燥などの任意の当技術分野で公知の技術によって乾燥させ、使用前に再構成することができる。
経粘膜投与の場合、透過されるべき障壁に適した浸透剤が製剤中で使用される。このような浸透剤は当技術分野で公知である。
経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容され得る賦形剤を用いて、従来の手段によって調製されたトローチ剤、錠剤またはカプセル剤の形態を取り得る。錠剤は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、糖、フィルムまたは腸溶コーティングでコーティングすることができる。
経口使用を意図した組成物は、医薬組成物の製造のための分野で公知の任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は、薬学的に洗練された口当たりのよい調製物を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤からなる群から選択される１またはそれを超える剤を含有し得る。錠剤は、本明細書で提供されるＨＳＶウイルス粒子を、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容され得る賦形剤と混合して含有する。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；造粒剤および崩壊剤（例えば、コーンスターチまたはアルギン酸）；結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム）；および滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）であり得る。錠剤はコーティングされていないままにすることができ、または胃腸管での崩壊および吸収を遅延させ、それによってより長期間にわたって持続的な作用を提供するために、錠剤は公知の技術によってコーティングすることができる。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を使用することができる。錠剤はまた、当業者に周知の技術によってコーティングされ得る。本技術の医薬組成物は、水中油型エマルジョンの形態であり得る。
経口投与用の液体調製物は、例えば、エリキシル剤、液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤の形態をとることができ、または使用前に水または他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品として提供することができる。このような液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、クレモフォール（商標）、または分別植物油）；および防腐剤（例えば、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）などの薬学的に許容され得る添加剤を用いて従来の手段によって調製することができる。調製物は、適宜、緩衝塩、防腐剤、香味剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。
一実施形態において、本開示は、本開示の非天然ＨＳＶを調製する方法であって、非天然ＨＳＶウイルス粒子中の遺伝子を変異させることもしくは非天然ＨＳＶ中に導入遺伝子を導入することを含む、またはあるいは非天然ＨＳＶウイルス粒子中の遺伝子を変異させることもしくは非天然ＨＳＶ中に導入遺伝子を導入することから本質的になる、またはなおさらに非天然ＨＳＶウイルス粒子中の遺伝子を変異させることもしくは非天然ＨＳＶ中に導入遺伝子を導入することからなる、方法が提供される。別の態様において、非天然ＨＳＶベクターを作製する方法は、（ａ）１７ＴｅｒｍＡ ＨＳＶベクターおよびｒＲｐ４５０ ＨＳＶベクターを宿主細胞に導入することと；（ｂ）少なくとも３継代にわたって宿主細胞を成長させることと；ならびに（ｃ）宿主細胞によって産生されたＨＳＶ粒子を単離することと；を含む、またはあるいは（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から本質的になる、またはなおさらに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる。
がん細胞または転移性がん細胞の成長または転移を阻害する方法であって、細胞を、有効量の、非天然ＨＳＶベクターまたは本明細書に記載の非天然ＨＳＶベクターを含有する組成物もしくは医薬組成物と接触させることを含む、または接触させることから本質的になる、またはなおさらに接触させることからなる方法も提供される。接触させることは、インビトロまたはインビボである。一態様において、接触させることは、非天然ＨＳＶまたは組成物もしくは医薬組成物を対象に投与することによるインビボである。インビトロでは、本方法は、非天然ＨＳＶを細胞と接触させることによって実施される。インビトロ法は、新しい治療を試験するために、または治療が処置されるべきがんに適しているかどうかを決定するための個別化されたアッセイとして使用することができる。さらなるがん治療は、開示された方法と同時または逐次であり得る治療と組み合わせることができる。
処置されるべきがん細胞は、固形腫瘍または血液がん、例えば癌または肉腫であり得、このようなものの非限定的な例としては、膵臓がん、腎臓がん、小細胞肺がん、脳がん、神経芽細胞腫、神経がん、骨がん、リンパ腫、骨髄腫、結腸がん、子宮がん、乳がん、白血病、肝臓がん、前立腺がん、皮膚がんまたは黒色腫が挙げられる。細胞は、任意の種、例えば哺乳動物およびヒトのものであり、インビトロで実施される場合、細胞は、培養された細胞株または初代細胞、例えば組織生検からのものであり得る。細胞は、組織生検からの、成体もしくは若年細胞またはがん幹細胞であり得る。細胞は、成体もしくは若年細胞またはがん幹細胞（すなわち、正常な幹細胞と関連する特徴、特に、特定のがん試料中に見出される全ての細胞型を生じさせる能力を有するがん細胞）または正常な幹細胞と関連するこのような特徴のないがん細胞であり得る。一実施形態において、細胞は、Ｎ－ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質（ＭＹＣＮ）を発現し、および／または非がん細胞よりも高いレベルでＭＹＣＮを発現する。
さらに、がんを処置することまたはがん細胞の成長もしくは転移を阻害することを必要とする対象においてがんを処置し、またはがん細胞の成長もしくは転移を阻害する方法であって、有効量の、本開示の非天然ＨＳＶ、組成物もしくは医薬組成物を対象に投与することを含む、またはあるいは投与することから本質的になる、またはなおさらに投与することからなる方法も本開示において提供される。処置されるべき対象は、任意の種、例えば哺乳動物およびヒト、例えばイヌ、ウマ、ウシ、ネコ、サル、ラットまたはマウスであり得る。投与は、第一選択治療、第二選択治療、第三選択治療、第四選択治療または第五選択治療としてであり得る。さらなるがん治療は、開示された方法と同時または逐次であり得る治療と組み合わせることができる。処置されるべきがんは、固形腫瘍または血液がん、例えば癌または肉腫であり得、このようなものの非限定的な例としては、膵臓がん、腎臓がん、小細胞肺がん、脳がん、神経芽細胞腫、神経がん、骨がん、リンパ腫、骨髄腫、結腸がん、子宮がん、乳がん、白血病、肝臓がん、前立腺がん、皮膚がんまたは黒色腫が挙げられる。
本開示の方法は、疾患の寛解または進行をモニタリングするための適切な診断と組み合わせることができる。このようなモニタリングのためのいくつかの方法が当技術分野で公知である。
細胞溶解を誘導する方法であって、細胞を、有効量の、本開示の非天然ＨＳＶ、組成物および／もしくは医薬組成物と接触させることを含む、またはあるいは接触させることから本質的になる、またはなおさらに接触させることからなる方法がさらに提供される。接触させることは、インビトロまたはインビボである。一態様において、接触させることは、非天然ＨＳＶまたは組成物もしくは医薬組成物を対象に投与することによるインビボである。インビトロでは、本方法は、非天然ＨＳＶを細胞と接触させることによって実施される。インビトロ法は、新しい治療を試験するために、または治療が処置されるべき対象に適しているかどうかを決定するための個別化されたアッセイとして使用することができる。さらなる細胞溶解治療は、開示された方法と同時または逐次であり得る治療と組み合わせることができる。
処置されるべき細胞は、固形腫瘍または血液がん、例えば癌または肉腫であり得、このようなものの非限定的な例としては、膵臓がん、腎臓がん、小細胞肺がん、脳がん、神経芽細胞腫、神経がん、骨がん、リンパ腫、骨髄腫、結腸がん、子宮がん、乳がん、白血病、肝臓がん、前立腺がん、皮膚がんまたは黒色腫が挙げられる。細胞は、任意の種、例えば哺乳動物およびヒトのものであり、インビトロで実施される場合、細胞は、培養された細胞株または初代細胞、例えば組織生検からのものであり得る。細胞は、正常な幹細胞に関連する特徴を有しない、成体もしくは若年細胞またはがん幹細胞またはがん細胞であり得る。治療は、治療の有効性、例えばがんの寛解または進行について試験するための適切なアッセイと組み合わせることができる。
医薬を調製するためのＨＳＶウイルス粒子の使用
本発明のＨＳＶおよび組成物は、本明細書に記載の様々な病状を処置するための医薬の調製においても有用である。組成物の医薬を調製するための方法および技術は、当技術分野において公知である。例示のみを目的として、医薬品製剤および送達の経路が本明細書に詳述されている。
したがって、当業者は、多くの特定の実施形態を含む上記組成物のいずれか１つまたはそれより多くが、本明細書に記載されている多くの障害を処置するための医薬を調製するための標準的な医薬品製造手順を適用することによって使用され得ることを容易に理解するであろう。このような医薬は、薬学技術で公知の送達方法を使用することによって対象に送達され得る。
さらなる治療剤の投与
本明細書に開示される方法は、開示されている方法の治療の有効性を増大または増強するために、さらに、有効量の追加の治療剤の投与を含む、またはあるいは有効量の追加の治療剤の投与から本質的になる、またはまだその上有効量の追加の治療剤の投与からなることができる。一実施形態では、追加の治療剤は、腫瘍の外科的切除、抗腫瘍剤、例えば小分子もしくは免疫療法もしくは細胞溶解療法を含む、またはあるいは腫瘍の外科的切除、抗腫瘍剤、例えば小分子もしくは免疫療法もしくは細胞溶解療法から本質的になる、またはなお上さらに腫瘍の外科的切除、抗腫瘍剤、例えば小分子もしくは免疫療法もしくは細胞溶解療法からなる。
本開示の治療剤または治療物質の患者への投与は、処置の毒性（存在する場合）を考慮して、その特定の一次療法または二次療法の投与のための一般的なプロトコルに従う。処置サイクルは必要に応じて繰り返されることが予想される。様々な標準的な治療および外科的介入が、記載された治療と組み合わせて適用され得ることも企図される。
当業者に明らかなように、併用療法は、同時投与または逐次投与のための併用療法の形態をとることができる。
キット
本明細書に記載されている作用物質または非天然ＨＳＶは、いくつかの実施形態において、治療、診断または研究用途におけるそれらの使用を容易にするために、薬学的または診断用または研究用キットに組み立てられ得る。キットは、本発明の構成成分を収容する１またはそれを超える容器および使用のための指示を含み得る。具体的には、このようなキットは、意図された用途およびこれらの作用物質の適切な使用を説明する指示とともに、本明細書に記載されている１またはそれを超える作用物質を含み得る。特定の実施形態において、キット中の薬剤は、特定の用途および薬剤の投与方法に適した薬学的製剤および投薬量であり得る。研究目的のキットは、さまざまな実験を実行するための適切な濃度または量で成分を含有し得る。
キットは、本明細書に記載された方法の使用を容易にするように設計され得、多くの形態をとることができる。キットの各組成物は、該当する場合、液体形態（例えば、溶液で）または固体形態（例えば、乾燥粉末）で提供され得る。特定の場合において、組成物のいくつかは、例えば、キットとともに提供されてもよくまたは提供されなくてもよい適切な溶媒またはその他の種（例えば、水または細胞培養培地）の添加によって、（例えば、活性形態へと）構成可能またはその他処理可能であり得る。いくつかの実施形態において、組成物は、保存溶液（例えば、凍結保存溶液）で提供され得る。保存溶液の非限定的な例には、ＤＭＳＯ、パラホルムアルデヒドおよびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）が含まれる。いくつかの実施形態において、保存溶液は、ある量のメタロプロテアーゼ阻害剤を含有する。
本明細書で使用される場合、「指示」は、指示および／または奨励の要素を規定することができ、典型的には、本発明のパッケージ上のまたはパッケージングに付随する書面での指示を含む。指示には、当該指示がキットと関連付けられるべきことを使用者が明確に認識できるような任意の様式で提供される任意の口頭でのまたは電子的な指示、たとえば、視聴覚的（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネットおよび／またはウェブベースの通信手段なども含まれ得る。書面での指示は、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式であり得、その指示は、動物投与のための製造、使用または販売の機関による承認も反映することができる。
キットは、本明細書に記載されている構成成分の任意の１つまたはそれより多くを１またはそれを超える容器中に含有し得る。一例として、一実施形態において、キットは、キットの１もしくはそれを超える構成成分を混合するための、ならびに／または試料を単離および混合し、対象に適用するための指示を含み得る。キットは、本明細書に記載されている作用物質を収容する容器を含み得る。ＨＳＶは、液体、ゲルまたは固体（粉末）の形態であり得る。ＨＳＶは無菌的に調製され、注射器中に梱包され、冷蔵されて出荷され得る。あるいは、それはバイアルまたは貯蔵用のその他の容器中に収容され得る。第２の容器は、無菌的に調製された他の薬剤を有し得る。あるいは、キットは、注射器、バイアル、チューブまたはその他の容器中にあらかじめ混合されて出荷された活性剤を含み得る。キットは、注射器、局所塗布装置またはＩＶ針チューブおよび袋など、対象に薬剤を投与するために必要とされる構成要素の１もしくはそれより多くまたはすべてを有し得る。
スクリーニングアッセイ
本開示は、公知のおよび新規の化合物および組み合わせの潜在的な治療剤を同定するためのスクリーニングアッセイも提供する。例えば、当業者は、ＨＳＶを処置されるべき試料細胞または組織と接触させることによって、ＨＳＶがインビトロで治療的利益を提供するかどうかを決定することもできる。細胞または組織は、任意の種、例えばサル、イヌ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウスまたはヒトに由来し得る。
接触させることは、適切な動物モデルまたはヒト患者においてインビボで行うこともできる。インビトロで実施される場合、ＨＳＶは細胞培養培地に直接添加することができる。インビトロで実施される場合、本方法は、動物またはヒト患者への投与前に、新規な併用療法、製剤または処置レジメンについてスクリーニングするために使用することができる。
別の態様では、アッセイは、適切な細胞または組織を含む第１の試料（「対照試料」）を有効量の本明細書に開示されているＨＳＶと接触させることと、適切な細胞または組織の第２の試料（「試験試料」）をアッセイされるべきＨＳＶ、作用物質または組み合わせと接触させることを必要とする。がんの場合の一態様では、第１および第２の細胞試料の成長の阻害が決定される。第２の試料の成長の阻害が第１の試料と実質的に同じであるまたは第１の試料より大きい場合、その作用物質は治療のための潜在的な薬物である。一態様において、細胞の成長の実質的に同じまたはそれより大きな阻害は、約１％未満、またはあるいは約５％未満、またはあるいは約１０％未満、またはあるいは約１０％超、またはあるいは約２０％超、またはあるいは約５０％超、またはあるいは約９０％超の差である。接触させることは、インビトロまたはインビボであり得る。細胞の成長の阻害を決定するための手段は、当技術分野で周知である。
さらなる態様において、試験剤は、対照および試験試料に対する正常なカウンターパートの細胞または組織を含む細胞または組織の第３の試料と接触させ、細胞または組織の第２の試料を処理するが第３の試料に悪影響を及ぼさない作用物質を選択する。本明細書に記載されているアッセイのために、本明細書に記載されているがんまたはその他の疾患などの適切な細胞または組織が本明細書に記載されている。そのようなものの例としては、生検によってまたは血液から得られたがん細胞または組織が挙げられるが、これらに限定されない。
試験組成物の有効性は、細胞生存率アッセイを含むがこれに限定されない当技術分野において公知の方法を使用して決定される。
さらなる態様において、アッセイは少なくとも２つの細胞型を必要とし、最初の細胞型は適切な対照細胞である。
アッセイは、処理されるべき細胞を含有する試料にＨＳＶを送達し、病態によって変化する処置のために、または新しい薬物および組み合わせについてのスクリーニングのためにアッセイすることによって、対象が本開示によって適切に処置されるかどうかを予測するためにも有用である。一態様において、細胞または組織は、生検によって対象または患者から得られる。本開示は、本開示の少なくとも１つの組成物および使用のための指示を提供することによって、病的細胞または患者がこの治療によって適切に処置されるかどうかを決定するためのキットも提供する。
試験細胞は、小さなマルチウェルプレートで成長させることができ、試験化合物の生物学的活性を検出するために使用される。本開示において、成功したＨＳＶまたは他の作用物質は、成長を阻止しまたはがん細胞を死滅させるが、対照細胞型は無傷のままに保つ。
以下の実施例は、本開示を例示するために提供され、本開示を限定するものではない。
ＨＳＶ変異体の作製
非許容性細胞株に１７ＴｅｒｍＡおよびｒＲｐ４５０を感染させ（「指向性進化」）、連続継代後に培養して、ＷＴ様遺伝子型を含むＨＳＶ Ｍｕｔ－３変異体を単離した。次いで、ＨＳＶ Ｍｕｔ－３変異体を使用して、遺伝子編集（「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９」と表記される）を介して弱毒化された変異体Ｍｕｔ－３Δ３４．５を構築した（図１Ａ）。Ｍｕｔ－３とその親ウイルスとの配列比較を図１Ｂに示す。Ｍｕｔ－３においていずれかの親と異なる非同義変異には、ＵＬ１５、ＵＬ２９、ＵＳ８、ＲＬ１およびＲＬ２を含めて、右下方向への斜線が付されている。１７ＴｅｒｍＡと同一のゲノム配列は空欄として示されており、ｒＲｐ４５０と同一のゲノム配列には斜線が付されている。
ＷＴ様遺伝子型を含有する強力なｏＨＳＶ変異体Ｍｕｔ－３を単離した。Ｍｕｔ－３および弱毒化されたバージョンＭｕｔ－３Δ３４．５の両方は、標準的なＨＳＶ侵入タンパク質であるネクチン－１またはヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）に依存して、首尾よく感染を達成する（図示せず）。検出可能なＧＦＰ陽性領域の発現によって測定されるＭｕｔ－３Δ３４．５ウイルス遺伝子導入の動態は、同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集戦略を介して野生型株１７に由来するγ１３４．５ヌルウイルスである１７Δ３４．５と比較すると、はるかに早い。さらに、Ｍｕｔ－３Δ３４．５感染は、より小さなその細胞密集領域によって測定されるように、より多くの細胞殺滅をもたらす。しかしながら、Ｍｕｔ－３Δ３４．５は、１７Δ３４．５と比較しても、またはＭｕｔ－３Δ３４．５ヌル親ウイルス１７ＴｅｒｍＡと比較しても、複製がより少ないようである。これらの結果は、弱毒化されたＭｕｔ－３Δ３４．５バージョンにおいてさえ、独特のゲノムの変化（複数可）が合胞体表現型（図示せず）をもたらし、増強された効力が残存していることを示している。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）再標的化ＨＳＶの研究では、合胞体変異を導入することは侵入および拡散の特異性を損なわないことが報告された。理論に束縛されるものではないが、本出願人らは、Ｍｕｔ－３Δ３４．５における合胞体表現型の根本原因が、侵入および／またはウイルス媒介性の細胞と細胞の融合に影響を及ぼし得る変化した動態を細胞膜へのウイルス融合時にもたらし得、これがより速い細胞殺滅と減少したウイルス粒子産生とを引き起こすと考えている。
ＨＳＶ－１侵入に関与する標準的な糖タンパク質であるｇＢ、ｇＤ、ｇＨおよびｇＬ中に変異は見られなかった。しかしながら、５つの遺伝子は、いずれの親とも異なるＭｕｔ－３中の非同義（ＮＳ）変異：ＲＬ１、ＲＬ２、ＵＬ１５、ＵＬ２９およびＵｓ８／ｇＥを含有する。Ｍｕｔ－３およびその弱毒化されたバージョンＭｕｔ－３Δ３４．５はいずれも膜融合性表現型を示し、この現象がＲＬ１関連ではないことを示唆している。Ｍｕｔ－３のアミノ酸配列は、ｇＫ／ＵＬ５３およびＵＬ２０においてはｒＲｐ４５０および参照株１７ゲノム（合胞体ウイルスではない）のいずれかと同一であり、またはｇＢ／ＵＬ２７およびＵＬ２４においては１７ＴｅｒｍＡ（合胞体ウイルスではない）と同一であるので、全ゲノム解析はこの表現型が以前に報告された変異に関連していないことも示唆する。ｇＥ／Ｕｓ８のＡ１５１Ｔ変異は、その親ウイルスと比較してＮＳ変化を有するＭｕｔ－３中の唯一の糖タンパク質（ビリオン表面タンパク質）である。ｇＥはウイルス付着または侵入のいずれにも関連していないが、ｇＥの変異はより小さなプラークサイズに関連しているので、ｇＥ／ｇＩ二量体化はウイルスの細胞間拡散を媒介する。＊＊出願人は、Ｍｕｔ－３Δ３４．５中のｇＥのＡ１５１Ｔが、その合胞体のおよび増大した効力の表現型の根本的な原因であり得ると仮定する。出願人の研究の順（上から下）に基づいて、表１において、出願人は、Ｍｕｔ－３中の５つの遺伝子に見られる５つのＮＳ変異全て、ならびに各遺伝子の対応する機能、Ｍｕｔ－３の増大した効力の表現型と関連する可能性のある役割、および出願人が提案した研究を列挙する。他の３つの変異（ＲＬ１を除く）も、ｇＥ Ａ１５１Ｔに対して行われたように決定され得る。
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ＨＳＶ変異体の比較
図１Ａに示されている４つのウイルスに対して同時にプラークアッセイを行い、３日後に、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＨＳ Ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＢＺ－ＩＩ Ａｎａｌｙｚｅｒを介してプラーク画像をスキャンおよび分析した。図１Ａおよび１Ｂに示されているように、Ｍｕｔ－３およびＭｕｔ－３Δ３４．５のプラークサイズは、親ウイルスｒＲｐ４５０および１７ＴｅｒｍＡのいずれよりも有意に大きかった。ＣＨＯ細胞の組のインビトロ細胞傷害性／ＭＴＳアッセイでは、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ネクチン－１、ＣＨＯ－ネクチン－２およびＣＨＯ－ＨＶＥＭに、異なる感染多重度（ＭＯＩ）で４つのウイルスを感染させた。ウイルス感染の３日後（ｐｖｉ）に、非処理対照と比較して、細胞生存比色細胞増殖およびＭＴＳアッセイを測定した。ＣＨＯ－ネクチン－１およびＣＨＯ－ＨＶＥＭのみが４つのウイルスの処理に対して感受性であったが、ＣＨＯ－Ｋ１またはＣＨＯ－ネクチン－２（主に、ＨＳＶ－２侵入用）は感受性ではなかった（図２Ｃ）。理論に拘束されるものではないが、結果は、Ｍｕｔ－３およびＭｕｔ－３Δ３４．５が受容体バリアを迂回せず、標準的なＨＳＶ侵入受容体になお依拠して（ｒｅｌａｙ ｏｎ）細胞を感染させることを示唆した。
１７ＴｅｒｍＡと比較したヒトおよびマウス神経芽細胞腫細胞の殺滅におけるＭｕｔ－３Δ３４．５の効力の増加は、感染性ウイルスの収量の増加によるものではなかった（図３）。透過型電子顕微鏡法（「ＴＥＭ」）による分析でも、神経芽細胞腫細胞に感染した後、Ｍｕｔ－３Δ３４．５ビリオンは主に細胞内小胞中に見られるのに対して、１７ＴｅｒｍＡビリオンは主に細胞内小胞に見られることが明らかになった（図４）。
野生型株１７＋のｇ１３４．５遺伝子をＥＧＦＰ発現カセットで置き換えるために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって、弱毒化された１７Δ３４．５変異体を作製した。１７Δ３４．５変異体は、その野生型株１７＋より低い効力を有したが、１７ＴｅｒｍＡと同程度であった（図５）。Ｍｕｔ－３Δ３４．５が１７Δ３４．５と比較してはるかに速いウイルス遺伝子導入および細胞殺滅を示す場合には、１７Δ３４．５の弱毒化がさらに確認された（図６）。さらに、Ｍｕｔ－３Δ３４．５は、インビボでのヒト神経芽細胞腫成長を制御するために１７ＴｅｒｍＡより有効であった（図７）。
機能喪失研究のためのＭｕｔ－３Δ３４．５におけるＵｓ８／ｇＥ復帰変異体
ウイルス複製中に複数コピーのゲノムが存在するためにおよびこの遺伝子編集には選択マーカーが伴うことができないために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術のみを介してＨＳＶゲノム中に単一ヌクレオチド変化を導入することは困難である。１つの構築物は、ｇＥコード領域全体をレポーター遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙまたは赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）など）で置き換えて、ｇＥ－ヌルＭｕｔ－３Δ３４．５を構築すること、次いで、２）レポーター遺伝子をＷＴ ｇＥコード領域で置換し、ｇＥ－ＷＴ Ｍｕｔ－３Δ３４．５復帰変異体を得ること、というＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術と組み合わせた２段階過程の結果であり得る。ｇＥ－ヌル中間体およびこのｇＥ復帰変異体Ｍｕｔ－３Δ３４．５の両方が表現型を失う程度の検査は、上記のように観察することができる。本開示は、この構築物も提供する。
機能獲得のためのＭｕｔ－３親１７ＴｅｒｍＡにおけるＵｓ８／ｇＥ Ａ１５１Ｔ変異
上記のように、ｇＥ変異体１７ＴｅｒｍＡは、１）ｇＥコード領域を完全にノックアウトし、それをレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）で置き換えること、次いで、２）Ａ１５１Ｔ変異を含有するｇＥコード領域をノックインすることによってレポーター遺伝子を置換すること、という以下の２つのステップで構築することができる。Ｍｕｔ－３Δ３４．５の表現型が決定される。本開示は、この構築物も提供する。
ｇＥ Ａ１５１Ｔが観察された表現型の一部にのみ関与するもしくは全く関与しない場合には、または関与する場合でさえ、Ｍｕｔ－３中の他の変異が本開示によって提供される。変異体は、本明細書に記載されるように、および表１に示されるように、単独でまたは組み合わせて、同様の機能獲得および機能喪失アプローチを体系的に試みることによって構築される。弱毒化されたＭｕｔ－３Δ３４．５の安全性プロファイルおよび有効性は、マウスモデルにおいて試験することができる。したがって、本開示は、変異体を試験するために使用される動物モデルおよびそのための方法を提供する。
強力かつＷＴ様のＨＳＶ変異体であるＭｕｔ－３株を、１７ＴｅｒｍＡとｒＲｐ４５０の組換えから構築した。臨床使用のための安全性を確保するために、ウイルスの病原性タンパク質であるγ１３４．５／ＲＬ１の欠失を通じて弱毒化されたバージョンであるＭｕｔ－３Δ３４．５を作製した。本出願人の予備的毒物学研究では、最大１ｅ８プラーク形成単位（ｐｆｕ）の静脈内投与後８５日を超えて、Ｂａｌｂ／ｃマウス中に有害な臨床徴候や体重の有意な変化は観察されなかった（データは示さず）。さらに、Ｍｕｔ－３Δ３４．５は、１７ＴｅｒｍＡと比較して、インビトロ（図３Ａ）およびインビボ（図７）の両方で、極めて悪性度が高い神経芽細胞腫モデルにおいても抗腫瘍効果を示す。
ナイーブ非腫瘍担持マウスにおけるＭｕｔ－３Δ３４．５の体内分布プロファイル
出願人自身の研究は、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスが、疾病の身体的徴候なしに８５日を超えて、最大１ｅ８ ｐｆｕの静脈内（ｉｖ）送達されたＭｕｔ－３Δ３４．５ウイルスに耐えることができることを示している。両性のナイーブ非腫瘍担持Ｂａｌｂ／ｃマウス（１つの性あたり３０匹のマウス）に、以前に試験された最高の用量（マウスあたり１ｅ８ ｐｆｕのＭｕｔ－３Δ３４．５ウイルス）を静脈内投与することから開始して、体内分布研究を行った。末梢血を採取し、次いでマウスを屠殺する。ウイルス感染の２４時間、１４日、２８日、５６日および８５日後に、精巣、卵巣、脾臓、肺、腎臓、心臓、肺および脳を採取する（各点につきｎ＝６）。病理分析用に保存するために臓器の半分をホルマリンに包埋し、各臓器中のウイルス量を入手するために、残りの半分をＨＳＶゲノムのｑＰＣＲ分析およびプラークアッセイのためにホモジナイズする。ウイルス投与後の最初の２週間、マウスを毎日観察し、次いで、予定された屠殺日まで毎週２回観察する。ウイルス投与前およびその後毎週、各マウスの体重を測定する。有害な臨床徴候の存在もしくは非存在を示すために、または２０％を超える体重減少を伴う場合にマウスを屠殺し、上記のように臓器中のウイルス活性について分析する。並行して、野生型ＫＯＳウイルス［投与量範囲：１×１０５～１×１０７ ｐｆｕ／マウス（ｎ＝３）］を陽性（非安全）対照としてマウスの群に投与する。出願人は、ＦＶＢＮマウスにおいて１×１０６ ｐｆｕのＫＯＳウイルスの用量が２～３日以内に一律に致死的であることを以前に見出した。ＨＳＶゲノムコピーを分析するためにｑＰＣＲを行い、疾病の徴候を示す陽性対照マウスの臓器中でのウイルス活性および病理分析を評価するためにプラークアッセイを行う。これらの結果は、Ｍｕｔ－３Δ３４．５処置されたマウスから収集されたデータを評価するための陽性指標／閾値として役立ち得る。陽性対照と同程度のウイルス量を示すために、Ｍｕｔ－３Δ３４．５処置群における組織／臓器の病理学的変化をさらに評価する。各性別について１群あたり６匹のマウスを使用して、異なる期間にわたって体内分布および安全性および耐容性を評価する。記述統計を用いて、異なる時間にわたる異なる臓器中でのゲノムＤＮＡのナノグラムあたりのＨＳＶゲノムのコピー数によって、Ｍｕｔ－３Δ３４．５の体内分布を測定し、単変量解析（適用可能な場合）と比較する。
インビトロでの様々な小児がん細胞株におけるＭｕｔ－３Δ３４．５と他のγ１３４．５－ヌルウイルス（１７ＴｅｒｍＡおよびＴ－ＶＥＣ）の細胞傷害性
ヒトおよびマウスの神経芽細胞腫細胞において、Ｍｕｔ－３Δ３４．５による優れた殺滅が、１７ＴｅｒｍＡと比較して観察された（図３Ａ）。図３Ａに示されている同じＭＴＳインビトロアッセイを使用して、増大した効力表現型が異なる腫瘍型にわたって適用可能であるかどうかを判定するために、肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）および脳腫瘍などの他の小児がん細胞に対して同じ分析を適用する（本出願人は多数のモデルを利用できる）。各細胞型からの最も有効な株が、インビボ有効性研究を行うために使用される。
他のｏＨＳＶ治療薬である１７ＴｅｒｍＡおよびＴ－ＶＥＣと比較して、ヒト小児腫瘍モデルにおけるＭｕｔ－３Δ３４．５の有効性を調べる。
５～６週齢の雌の無胸腺ヌードマウスを用いた異種移植片において有効性研究を行うために、各腫瘍型（合計３つ）の高度に応答性のモデルの１つを選択する。腫瘍が１５０～３００ｍｍ３に達したら、マウスをプールし、ｉ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）対照、ｉｉ）Ｍｕｔ－３Δ３４．５ウイルス、またはｉｉｉ）１７ＴｅｒｍＡもしくはＴ－ＶＥＣウイルスという３つの群へ無作為に割り当てる（それぞれｎ＝１１）。ウイルス間の有効性については、最小８０％の検出力で生存および腫瘍成長の大きな差（２０日目に２０％対８０％）を検出するために、群あたり最小１１匹のマウスを使用する。本出願人の以前の研究に基づき、合計３回の注射を行う処置レジメンを用いて、１００μｌのＰＢＳ中の１×１０７ ｐｆｕのウイルスまたはＰＢＳのみ（対照）のいずれかで１日おきに各マウスを腫瘍内処置する。ウイルス注射後８０日間、腫瘍体積（毎週２回）および体重（毎週）について、マウスをモニターする。評価項目基準には、２５００ｍｍ３を超える腫瘍体積、２ｃｍに達する腫瘍直径または２０％を超える体重減少が含まれる。動物の生存はカプラン・マイヤー曲線を使用して表示することができ、生存はログランク検定によって群間で比較することができる。
他のｏＨＳＶ治療薬（１７ＴｅｒｍＡおよびＴ－ＶＥＣ）と比較した、マウス小児腫瘍モデルにおけるＭｕｔ－３Δ３４．５の有効性
（５～６）週齢の性別を一致させたＣ５７ＢＬ６マウスにおいて出願人の有効性試験を実施するために、各腫瘍型（合計２つ）の高度に応答性のマウス腫瘍モデルの１つを選択する。同様に、マウスをプールし、ｉ）ＰＢＳ、ｉｉ）Ｍｕｔ－３Δ３４、ｉｉｉ）１７ＴｅｒｍＡまたはＴ－ＶＥＣという３つの群へ、それぞれｎ＝１１となるように無作為に割り当てる。本出願人の以前の研究のとおりに、合計３回の注射を行って、１００μｌのＰＢＳ中の１ｅ８ ｐｆｕのウイルスまたはＰＢＳのみのいずれかで１日おきに各マウスを腫瘍内処置する。評価項目基準には、２５００ｍｍ３を超える腫瘍体積、２ｃｍに達する腫瘍直径または２０％を超える体重減少が含まれる。動物の生存はカプラン・マイヤー曲線を使用して表示し、生存はログランク検定によって群間で比較する。
病理分析の要約
４匹の野生型のＫＯＳを注射されたマウス（１ｅ６および１ｅ７ ｐｆｕ、２匹のマウス／用量）からの組織を、ＯＳＵ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ＆Ｍｏｕｓｅ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅによる病理分析に供した。Ｍｕｔ－３Ｄ３４．５／Ｃ８Ｇ５およびＭｕｔ－３ＤＩＣＰ６／Ｄ７－１を注射されたマウス（ウイルス感染後２４時間および１４日の時点、２匹のマウス／時点）からの組織を続いて病理分析に供した。
病理報告（雌）：ＫＯＳを注射されたマウス
脳幹のリンパ形質細胞性脳炎は、ＨＳＶ－１を注射されたＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＣＮＳ病理の公表された報告と一致している。この投稿において調べられた全てのマウスはこの病変を有していたが、１つの提出された脳は脳幹の小さなセグメントのみを含み、したがって病変は他の３匹のマウスより軽度に見えた。これらのマウスのうちの２匹から、腎臓切片とともに副腎の切片が存在した。これらのマウスはいずれも、副腎皮質および髄質の両方の顕著な壊死を有していた。
病理報告（雌）：Ｍｕｔ－３Δ３４．５／Ｃ８Ｇ５およびＭｕｔ－３ΔＩＣＰ６／Ｄ７－１を注射された両マウスについて２４時間および１４日間
ＨＳＶ感染の２４時間後に屠殺されたマウスから得た試料は全て、中程度から顕著な重症度で以下の病変を有していた：個々の肝細胞および局所的に広範囲の肝索の壊死を含む門脈周囲から中間帯の肝壊死；予想より小さな小胞を伴った、顕著な脾臓の赤髄壊死および中程度の白髄壊死。数匹の２４時間マウスは、小胞中の細胞および卵巣組織中の黄体のアポトーシス／壊死が増加していた。数ヶ月前に評価された対照マウスにおいては、これは予想された量を超えては認められず、ここで注目したマウスでは予想された量を超えていた。
１４日目のマウスでは、卵形細胞過形成は、損傷を受けている肝臓の一般的な慢性反応であり、おそらく感染に対する応答である。肺のいくつかの試料は、２４時間の動物では認められなかった壊死性および炎症性病変を有していた。全体として、１４日目のマウスは、２４時間の動物よりずっと少なく、ずっと軽度の病変を有していた。
実験室で開発された変異型ウイルスは、特に２４時間で、肝細胞、赤髄および白髄中の脾細胞ならびに卵巣中の細胞を含む様々な細胞型の壊死に寄与している可能性がある。
均等物
別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
本明細書中に例示的に記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない、いずれかの１つまたは複数の要素、１つまたは複数の限定の非存在下で適切に実施され得る。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、拡張的に、限定なしに読まれるべきである。さらに、本明細書で用いられる用語および表現は、限定の用語でなく、記述の用語として使用されており、このような用語および表現の使用において、示されたおよび記載された特徴またはその一部のいずれの均等物をも除外する意図は存在せず、特許請求された発明の範囲内で様々な修飾が可能であることが認められる。
したがって、本発明は好ましい実施形態および必要に応じて存在し得る特徴によって具体的に開示されているが、その中で具体化された本明細書中に開示されている発明の修正、改善および変形が当業者によって用いられ得ること、ならびにそのような修正、改善および変形は本開示の範囲内にあると見なされることを理解すべきである。本明細書で提供されている材料、方法および例は、好ましい実施形態を代表するものであり、例示的なものであって、本開示の範囲に対する限定として意図されるものではない。
本発明は、本明細書において広く一般的に記載されている。一般的な開示の中に属するより狭い種および包括より下位の群の各々も本開示の一部を形成する。これには、削除された材料が本明細書中に具体的に挙げられているかどうかを問わず、属から何らかの主題を除去する但し書きまたは負の限定による本開示の包括的記載が含まれる。
本明細書中に挙げられている全ての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、全ての式および図面を含み、それぞれが個別に参照により組み込まれているのと同じ程度まで、それらの全体が参照により明示的に組み込まれる。抵触が生じる場合、定義を含む本明細書が優先される。
その他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内に記載されている。
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Claims (51)

  1. 非天然単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）であって、前記ウイルスが、
    （ａ）糖タンパク質Ｅ（「ｇＥ」）をコードする遺伝子、
    （ｂ）感染細胞タンパク質０（「ＩＣＰ０」）をコードする遺伝子、
    （ｃ）ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１をコードする遺伝子、
    （ｄ）ＩＣＰ８をコードする遺伝子または
    （ｅ）ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子
    の群からのものである病原性遺伝子中に１またはそれを超える変異を含む、非天然単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）。
  2. 前記ＨＳＶが、機能不全ＩＣＰ３４．５タンパク質をコードする遺伝子および／または機能不全ＩＣＰ６タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の非天然ＨＳＶ。
  3. 前記機能不全ＩＣＰ３４．５タンパク質をコードする前記遺伝子が、配列番号５、配列番号７、および配列番号５または７と少なくとも９５％同一の配列から選択される配列を有し、配列番号５または７のいずれか１つにおけるヌクレオチドにおいて前記変異を維持するポリヌクレオチドを含む、請求項２に記載の非天然ＨＳＶ。
  4. 前記機能不全ＩＣＰ６タンパク質をコードする前記遺伝子が、配列番号４５、配列番号４７、および配列番号４５または４７と少なくとも９５％同一の配列から選択される配列を有し、配列番号４５または４７のいずれか１つにおけるヌクレオチドにおいて前記変異を維持するポリヌクレオチドを含む、請求項２に記載の非天然ＨＳＶ。
  5. 前記病原性遺伝子中の前記変異が、挿入、欠失、切断、フレームシフト、置換または点変異を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶ。
  6. 前記ＨＳＶが、機能的ＩＣＰ３４．５タンパク質および／または機能的ＩＣＰ６タンパク質をコードする遺伝子を欠く、請求項１～５のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶ。
  7. 前記変異が前記病原性遺伝子中の非同義変異である、請求項１～６のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶ。
  8. 前記変異または同等物が、
    （ａ）前記ｇＥタンパク質の１５１位のアラニンからトレオニンへの変異、
    （ｂ）前記ＩＣＰ０タンパク質の２５８位におけるアルギニンからヒスチジンへの変異、
    （ｃ）前記ＤＮＡパッケージングターミナーゼサブユニット１タンパク質の３７６位におけるアラニンからトレオニンへの変異、
    （ｄ）前記ＩＣＰ８タンパク質の１１５５位におけるトレオニンからメチオニンへの変異、または
    （ｅ）前記ＩＣＰ３４．５タンパク質の１１９位におけるプロリンからヒスチジンへの変異、
    をコードする、請求項１～７のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶまたはその同等物。
  9. 以下のもの：
    （ａ）配列番号２、６、８、１０および５２から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに／または配列番号１、５、７、９および５１から選択される配列を有するポリヌクレオチド；
    （ｂ）配列番号２、６、８、１０および５２から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    （ｃ）配列番号１３、１５、１７および１９から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに／または配列番号１２、１４、１６および１８から選択される配列を有するポリヌクレオチド；
    （ｄ）配列番号１３、１５、１７および１９から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    （ｅ）配列番号２１、２３および２６から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに／または配列番号２０、２２、２４、２５および５３から選択される配列を有するポリヌクレオチド、または１つもしくは２つもしくはそれを超えるイントロンを含まないこれらの配列；
    （ｆ）配列番号２１、２３および２６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    （ｇ）配列番号２８、３０、３２および３４から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに／または配列番号２７、２９、３１および３３から選択される配列を有するポリヌクレオチド；
    （ｈ）配列番号２８、３０、３２および３４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    （ｉ）配列番号３６、３８、４０および４２から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに／または配列番号３５、３７、３９および４１から選択される配列を有するポリヌクレオチド；
    （ｊ）配列番号３６、３８、４０および４２から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    （ｋ）配列番号４４、４６、４８および５０から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに／または配列番号４３、４５、４７および４９から選択される配列を有するポリヌクレオチド；
    （ｌ）配列番号４４、４６、４８および５０から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    の１またはそれより多くを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶ。
  10. １７ＴｅｒｍＡ ＨＳＶ由来の病原性遺伝子の少なくとも１つの断片と同一である配列を有するポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶ。
  11. ｒＲｐ４５０ ＨＳＶ由来の病原性遺伝子の少なくとも１つの断片と同一である配列を有するポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶ。
  12. 前記ＨＳＶが、ＨＳＶ１型（「ＨＳＶ－１」）またはＨＳＶ２型（「ＨＳＶ－２」）株に由来する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶ。
  13. 前記ＨＳＶがＨＳＶ－１ ＫＯＳ株に由来する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶ。
  14. 導入遺伝子をさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶ。
  15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶと担体とを含む組成物。
  16. 前記担体が薬学的に利用可能な担体である、請求項１４に記載の組成物。
  17. 有意な病原性を失うことなく前記非天然ＨＳＶの凍結および解凍を促進する凍結保存剤をさらに含む、請求項１５または１６に記載の組成物。
  18. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶに感染した非ヒト哺乳動物。
  19. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶに感染した細胞、必要に応じてリンパ球。
  20. 細胞を感染させる方法であって、前記細胞を請求項１～１４のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶまたは請求項１５～１７のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む方法。
  21. 前記細胞がリンパ球である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記細胞が、エプスタイン・バー・ウイルス（「ＥＢＶ」）に感染している、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶ中に導入遺伝子を導入することを含む、ウイルスベクターを調製するための方法。
  24. がん細胞の成長または転移を阻害する方法であって、前記細胞を、有効量の、請求項１～１４のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶベクターまたは請求項１５～１７のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む方法。
  25. 前記接触させることがインビトロまたはインビボである、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記接触させることが、対象への前記非天然物の投与によるインビボである、請求項２４に記載の方法。
  27. 対象中のがんを処置する方法であって、有効量の、請求項１～１４のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶベクターまたは請求項１５～１７のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  28. 前記がんが以下の種類のがんであり、または前記がん細胞が、以下の種類：膵臓がん、腎臓がん、小細胞肺がん、脳がん、神経がん、骨がん、リンパ腫、骨髄腫、結腸がん、子宮がん、乳がん、白血病、肝臓がん、前立腺がん、皮膚がんもしくは黒色腫の細胞から選択される、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記ＨＳＶベクターまたは前記医薬組成物が、注射、注入、点滴注入および／または吸入によって投与される、請求項２７または２８に記載の方法。
  30. 前記投与が、第一選択治療、第二選択治療、第三選択治療、第四選択治療または第五選択治療の群の治療を含む、請求項２７～２８のいずれか一項に記載の方法。
  31. 有効量の抗がん治療を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
  32. 前記対象が哺乳動物である、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記哺乳動物が、ヒト、マウス、ラット、モルモット、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギまたはヒツジの群からのものである、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記対象がヒトである、請求項３２に記載の方法。
  35. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のＨＳＶベクターを作製する方法であって、
    （ａ）１７ＴｅｒｍＡ ＨＳＶベクターおよびｒＲｐ４５０ ＨＳＶベクターを宿主細胞に導入することと；
    （ｂ）少なくとも３継代にわたって前記宿主細胞を成長させることと；
    （ｃ）前記宿主細胞によって産生されたＨＳＶ粒子を単離することと；
    を含む、方法。
  36. 前記ＨＳＶが、形質移入、感染、形質転換、電気穿孔、注射、微量注入またはこれらの組み合わせによって前記宿主細胞に導入される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記宿主細胞を、少なくとも３継代、１０継代、２０継代、３０継代、４０継代または５０継代成長させる、請求項３５または３６に記載の方法。
  38. 前記宿主細胞が、前記導入されたＨＳＶベクターの複製を支援するための相補遺伝子産物を含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記相補遺伝子が、ＩＣＰ６タンパク質および／またはＩＣＰ３４．５タンパク質をコードする、請求項３８に記載の方法。
  40. 導入遺伝子を前記ＨＳＶベクター中に導入することをさらに含む、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 請求項３５～４０のいずれか一項に記載の方法によって作製されたＨＳＶ粒子。
  42. 細胞溶解を誘導するための方法であって、前記細胞を請求項１～１４のいずれか一項に記載の非天然ＨＳＶまたは請求項１５～１７のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
  43. 前記細胞ががん細胞である、請求項４２に記載の方法。
  44. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のＨＳＶベクターまたは請求項１５～１７のいずれか一項に記載の組成物と、使用のための指示とを含むキット。
  45. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のＨＳＶベクターを作製する方法であって、
    （ａ）前記ＨＳＶベクターのウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと；
    （ｂ）前記宿主細胞を成長させることと；
    （ｃ）前記宿主細胞によって産生されたＨＳＶ粒子を単離することと；
    含む、方法。
  46. 前記ポリヌクレオチドが、形質移入、感染、形質転換、電気穿孔、注射、微量注入またはこれらの組み合わせによって前記宿主細胞に導入される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記ウイルスゲノムをコードする前記核酸配列が、ベクターで前記宿主細胞に導入される、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 前記ベクターがＨＳＶまたはプラスミドである、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記宿主細胞が、前記導入されたＨＳＶベクターの複製を支援するための相補遺伝子産物を含む、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記単離されたＨＳＶが、宿主細胞、細胞片、培養培地または前記宿主細胞を培養する際に使用される任意の他の因子を実質的に含まない、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記単離が、遠心分離、濾過、クロマトグラフィーまたはこれらの任意の組み合わせによるものである、請求項４５～５０のいずれか一項に記載の方法。
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