JP7498499B2 - 心臓、骨格筋、及び筋幹細胞におけるインビボ相同組換え修復 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１８年５月３日出願の米国仮特許出願第６２／６６６，６８５号の利益を主張し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などの配列標的化ヌクレアーゼは、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復の細胞機構に関与することによって、哺乳動物のゲノムを編集する高性能なツールを提供する。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え修復（ＨＤＲ）は、ヌクレアーゼ生成ＤＳＢを修復し、ゲノム損傷及び細胞死を防止するために細胞が使用する主な経路である。ＮＨＥＪは細胞周期全体を通して、かつ非分裂細胞において活性であるが、このエラーが発生しやすい経路は、非常に予測不能なヌクレオチドの挿入及び欠失ゆえに様々な配列結果をもたらす。

対照的に、ＨＤＲは、より正確な遺伝子編集結果に加えて、全く新しい配列要素を導入する独自の能力を提供するが、ＨＤＲは一般に、有糸分裂後の臓器では非効率的であると考えられ、内因性染色体または外因性鋳型のいずれかに存在する相同ＤＮＡを必要とする。最近の研究では、培養細胞、受精卵における、かつ特定の組織への局所送達によるＣＲＩＳＰＲ誘導ＨＤＲの使用が調査されているが、出生後の哺乳動物においてインビボでの多臓器ＨＤＲを達成する可能性は試験されていない。加えて、進行中の組織の代謝回転及び修復を支持するために編集細胞の貯蔵所を提供する、再生幹細胞中でインビボＨＤＲ標的化が達成され得るかどうかは、まだ探究されていない。

本発明者らは、驚くべきことに、かつ予想外にも、出生後の心筋、骨格筋、及び筋幹細胞が、マウスの異なる発達時点で鋳型相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ）修復（ＨＤＲ、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）とも称される）を受けることを見出した。これは、骨格筋及び心筋、すなわち、両方とも主にこのアプローチでは到達できないと広く考えられている有糸分裂後の組織において、ＨＤＲによる正確な標的遺伝子置換の予想外の機会を提供する。発明者らの知る限りでは、このデータは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の全身的なＡＡＶ送達による、出生後の心臓における重要なインビボＨＤＲ編集に関する最初の実証を提供し、局所的な筋肉内送達によって骨格筋で達成可能な、これまでに報告されたＨＤＲ編集率の大幅な改善を示す。本明細書に記載される本発明はまた、細胞の天然ニッチ内の組織幹細胞におけるＨＤＲ編集の成功に関する最初の実証を提供し、これによって、これらの希少細胞を単離、増殖または移植する必要なく、治療的及び実験的に幹細胞ゲノムの対象となる操作が比類なく可能となる。最終的に、新生児の哺乳動物の心臓及び出生後の哺乳動物の骨格筋衛星細胞に不可逆的かつ永続的に正確なゲノム改変の可能性を刻み込む能力が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を含む、現時点では難治性の多くの心臓及び筋肉疾患に対する今後の治療的介入に刺激的な新しい道を開く。

本発明のいくつかの態様は、対象においてインビボで（例えば、筋前駆体ニッチにおいて）筋前駆細胞のゲノムを改変する方法を対象とし、本方法は筋細胞を１つ以上のウイルスと接触させることを含み、１つ以上のウイルスは、筋前駆細胞中で配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入し、筋前駆細胞中でドナー鋳型を形質導入し、改変は、ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含む。

いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列及びドナー鋳型を形質導入する第１ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ウイルス、及びドナー鋳型を形質導入する第２ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ウイルス、ならびにドナー鋳型及び１つ以上のｇＲＮＡ（例えば、１つまたは２つ）を形質導入する第２ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）、またはそれらの機能的断片である。

いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、筋前駆細胞特異的プロモーター、構成的プロモーター、またはユビキタスプロモーターで形質導入される。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型、及び場合により、１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸配列は、Ｕ６またはＨ１プロモーターで形質導入される。いくつかの実施形態では、筋前駆細胞は筋幹細胞である。

いくつかの実施形態では、対象における筋前駆細胞の少なくとも１％が、ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含むように改変される。いくつかの実施形態では、改変は、１つのアレルのものである。いくつかの実施形態では、改変は、両方のアレルのものである。いくつかの実施形態では、対象（例えば、ヒトまたはマウス）は、乳児、または若年者、または３０歳未満ではない。

いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶ血清型６、８、９、１０またはＡｎｃ８０である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、対象に全身投与されるか、またはウイルスは筋肉内注射によって投与される。

本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示される方法によって改変されたゲノムを有する核（例えば、筋核）を含む筋線維を対象とする。

本開示のいくつかの態様は、対象においてインビボで心臓細胞のゲノムを改変する方法を対象とし、本方法は心臓細胞を１つ以上のウイルスと接触させることを含み、１つ以上のウイルスは、心臓細胞中で配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入し、心臓細胞中でドナー鋳型を形質導入し、改変は、ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含み、心臓細胞は、ＤＮＡ合成心臓細胞または複製心臓細胞である。

いくつかの実施形態では、心臓細胞は、哺乳動物の有糸分裂後心筋細胞、分裂／増殖せずにＤＮＡ合成が可能な哺乳動物の有糸分裂後心筋細胞、ヒト有糸分裂後心筋細胞、分裂／増殖せずにＤＮＡ合成が可能なヒト有糸分裂後心筋細胞、心筋細胞前駆細胞、増殖間葉系心臓細胞、増殖内皮心臓細胞、及び心筋前駆細胞からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、対象（例えば、ヒトまたはマウス）は、乳児、または若年者、またはヒトの場合、３０歳未満である。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列及びドナー鋳型を形質導入する第１ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ウイルス、及びドナー鋳型を形質導入する第２ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ウイルス、ならびにドナー鋳型及び１つ以上のｇＲＮＡを形質導入する第２ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）、またはそれらの機能的断片である。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、心臓特異的プロモーター、ユビキタスプロモーターまたは非特異的プロモーターで形質導入される。

いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶ血清型６、８、９、１０またはＡｎｃ８０である。いくつかの実施形態では、対象における心筋細胞の少なくとも１．６％が改変される。

本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示される方法によって改変された心筋細胞を含む心臓組織を対象とする。

本開示のいくつかの態様は、相同組換え修復による対象におけるインビボでのゲノム改変のために特定の横紋筋タイプを標的とする方法を対象とし、本方法は１つ以上のウイルスが全身投与されることを含み、１つ以上のウイルスは、横紋筋細胞中で配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入し、横紋筋細胞中でドナー鋳型を形質導入し、改変はドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含み、対象の年齢ゆえに、ゲノム改変は少なくとも１つの横紋筋タイプに選択的に生じる。いくつかの実施形態では、筋細胞（例えば、前駆筋細胞）のゲノムが選択的に改変される。いくつかの実施形態では、心臓細胞（例えば、増殖またはＤＮＡ合成心臓細胞）のゲノムが選択的に改変される。

本発明の上述した、かつ他の多くの特徴及び付随する利点は、本発明の以下の詳細な説明を参照することによってより良く理解されることになる。

本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、要請に応じて必要な手数料を支払うことによって特許庁より提供されることになる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
対象におけるインビボでの筋前駆細胞のゲノム改変方法であって、前記筋細胞を１つ以上のウイルスと接触させることを含み、前記１つ以上のウイルスが、
ａ．前記筋前駆細胞中で配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入し、
ｂ．前記筋前駆細胞中でドナー鋳型を形質導入し、
前記改変が、前記ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含む、前記方法。
（項目２）
前記１つ以上のウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列及びドナー鋳型を形質導入する第１ウイルスを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記１つ以上のウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ウイルスと、ドナー鋳型を形質導入する第２ウイルスとを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記１つ以上のウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ウイルスと、ドナー鋳型及び１つ以上のｇＲＮＡを形質導入する第２ウイルスとを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓヌクレアーゼ、またはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントである、項目１～４に記載の方法。
（項目６）
前記ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、項目５に記載の方法。
（項目７）
配列標的化ヌクレアーゼをコードする前記核酸配列が、筋前駆細胞特異的プロモーター、構成的プロモーター、またはユビキタスプロモーターで形質導入される、項目１～６に記載の方法。
（項目８）
ドナー鋳型、及び場合により、１つ以上のｇＲＮＡをコードする前記核酸配列が、Ｕ６またはＨ１プロモーターで形質導入される、項目１～７に記載の方法。
（項目９）
前記筋前駆細胞が筋幹細胞である、項目１～８に記載の方法。
（項目１０）
前記対象における筋前駆細胞の少なくとも１％が、前記ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含むように改変される、項目１～９に記載の方法。
（項目１１）
前記対象における筋前駆細胞の少なくとも４０％が、前記ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含むように改変される、項目１～９に記載の方法。
（項目１２）
前記ウイルスが、ＡＡＶ血清型６、８、９、１０またはＡｎｃ８０である、項目１～１１に記載の方法。
（項目１３）
前記対象が若年者である、項目１～１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ウイルスが前記対象に全身投与される、項目１～１３に記載の方法。
（項目１５）
項目１～１４に記載の方法によって改変されたゲノムを有する筋核を含む、筋線維。
（項目１６）
対象におけるインビボでの心臓細胞のゲノム改変方法であって、前記心臓細胞を１つ以上のウイルスと接触させることを含み、前記１つ以上のウイルスが、
ａ．前記心臓細胞中で配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入し、
ｂ．前記心臓細胞中でドナー鋳型を形質導入し、
前記改変が、前記ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含み、前記心臓細胞が、ＤＮＡ合成心臓細胞または複製心臓細胞である、前記方法。
（項目１７）
前記心臓細胞が、分裂／増殖せずにＤＮＡ合成が可能な哺乳動物の有糸分裂後心筋細胞、分裂／増殖せずにＤＮＡ合成が可能なヒト有糸分裂後心筋細胞、心筋細胞前駆細胞、増殖間葉系心臓細胞、増殖内皮心臓細胞、及び心筋前駆細胞からなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記対象が、乳児、若年者、または３０歳未満である、項目１６～１７に記載の方法。
（項目１９）
前記１つ以上のウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列及びドナー鋳型を形質導入する第１ウイルスを含む、項目１６～１８に記載の方法。
（項目２０）
前記１つ以上のウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ウイルスと、ドナー鋳型を形質導入する第２ウイルスとを含む、項目１６～１９に記載の方法。
（項目２１）
前記１つ以上のウイルスが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ウイルスと、ドナー鋳型及び１つ以上のｇＲＮＡを形質導入する第２ウイルスとを含む、項目１６～１９に記載の方法。
（項目２２）
前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓヌクレアーゼ、またはそれらの機能的断片である、項目１６～２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
配列標的化ヌクレアーゼをコードする前記核酸配列が、心臓特異的プロモーター、ユビキタスプロモーター、または非特異的プロモーターで形質導入される、項目１６～２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ウイルスが、ＡＡＶ血清型６、８、９、１０またはＡｎｃ８０である、項目１６～２４に記載の方法。
（項目２６）
前記対象における前記心筋細胞の少なくとも１．６％が改変される、項目１６～２５に記載の方法。
（項目２７）
項目１６～２６に記載の方法によって改変された心筋細胞を含む、心臓組織。
（項目２８）
相同組換え修復による対象におけるインビボでのゲノム改変を目的とした特定の横紋筋タイプの標的化方法であって、１つ以上のウイルスを全身投与することを含み、前記１つ以上のウイルスが、
ａ．横紋筋細胞中で配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入し、
ｂ．横紋筋細胞中でドナー鋳型を形質導入し、
前記改変が、前記ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含み、前記対象の年齢ゆえに、ゲノム改変が少なくとも１つの横紋筋タイプに選択的に生じる、前記方法。
（項目２９）
筋細胞または筋前駆細胞の前記ゲノムが選択的に改変される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
心臓細胞または心臓前駆細胞の前記ゲノムが選択的に改変される、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記対象が、乳児、若年者、または成人である、項目２８～３０に記載の方法。

図１Ａ～１Ｊは、ＮＨＥＪ及びＨＤＲ編集筋芽細胞の識別及び追跡を可能にするＧＦＰ／ＢＦＰカラースイッチレポーターシステムを図示する。（図１Ａ）は、ＨＤＲと不正確なＮＨＥＪを区別するための青色／緑色カラースイッチレポーターの概略図である。不正確なＮＨＥＪはＧＦＰ蛍光を妨害するが、ＨＤＲ置換はＧＦＰからＢＦＰへのスペクトルシフトを可能にし、ＲＦＬＰ分析用のＢｔｇＩ制限部位を作成する。（図１Ｂ）は、トランスフェクション及びウイルス産生に使用されるＡＡＶ構築物を示す。ＩＴＲ、逆方向末端反復配列、Ｕ６、Ｕ６プロモーター、ＣＭＶ、ＣＭＶプロモーター、ＮＬＳ、核局在化シグナル、ｐＡ：ポリＡ。（図１Ｃ）は、実験計画を提供する。骨格筋幹細胞（衛星細胞）を、単一のＣＡＧ－ＧＦＰアレルを保有するマウスから単離し、（図１Ｂ）に示したプラスミド構築物でトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を培養下で増殖させ、次いで損傷前のレシピエントマウスへの筋肉内移植のために青色または緑色蛍光に基づいて選別した。（図１Ｄ、１Ｅ）は、ｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型のみでトランスフェクトした筋芽細胞（図１Ｄ、対照）またはＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型でトランスフェクトした筋芽細胞（図１Ｅ、実験）の代表的なフローサイトメトリー分析である。（図１Ｆ、１Ｇ）は、対照または実験培養物中におけるＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集ＢＦＰ＋筋芽細胞（図１Ｆ）及びＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ編集ＧＦＰ－／ＢＦＰ－筋芽細胞（図１Ｇ）の頻度（％）を示す。個々のデータ点は、平均±ＳＤを重ねて表示され、Ｎ＝３の独立したトランスフェクションを表す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対応のない両側ｔ検定、ＤＦ＝４。（図１Ｈ）は、編集されたＢＦＰ＋ＳＭＰが筋電位を保持していることを示す。ＧＦＰ＋及びＢＦＰ＋骨格筋前駆細胞をＦＡＣＳで単離し、ｍｄｘマウスの前脛骨筋（ＴＡ）にＧＦＰ＋（下段）またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ＨＤＲ編集ＢＦＰ＋（上段）幹細胞を注射した。次いで、ＴＡをＢＦＰまたはＧＦＰの蛍光検出によって検査した。スケールバー、５０ｕｍ。緑色、ＧＦＰ、青色、ＢＦＰ、赤色、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、白色、ＴＯ－ＰＲＯ－３。（図１Ｉ）は、ＧＦＰ座でのＰＣＲ増幅に続いて、ＦＡＣＳ選別トランスフェクト細胞のＢｔｇＩ消化を示す。３つの異なる集団を見出した：ＧＦＰ＋ＳＭＰ（編集なし）、ＢＦＰ＋ＳＭＰ（ＨＤＲ）、及びＧＦＰ－／ＢＦＰ－ＳＭＰ（ＮＨＥＪ）。（図１Ｊ）は、選別されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ＨＤＲ編集ＢＦＰ＋ＳＭＰが、増殖後もＢＦＰ発現を保持していることを示す。ＢＦＰ＋ＳＭＰを２週間の増殖後に分析した。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２Ａ～２Ｇは、全身的ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲが、３週齢のＧＦＰ^＋／－ｍｄｘマウスの肝臓、心臓及び骨格筋においてインビボＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲを可能にすることを図示する。（図２Ａ）は、実験計画を示している。単一のＣＡＧ－ＧＦＰアレルを保有するＭｄｘマウスに、ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型のみ（対照）またはＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型とＡＡＶ－ＳａＣａｓ９（二重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム）を保有するＡＡＶを注射した。臓器を蛍光及びゲノム分析のために４週間後に採取した。（図２Ｂ、２Ｄ、２Ｆ）は、ＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型及びＡＡＶ－ＳａＣａｓ９の全身同時注入後の、肝臓（図２Ｂ）、心臓（図２Ｄ）、及び前脛骨筋（骨格筋、図２Ｆ）におけるＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ編集（ＧＦＰ－／ＢＦＰ－）及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集（ＢＦＰ＋）細胞の検出に関する代表的な蛍光画像を示す。スケールバー、５０ｕｍ。緑色、ＧＦＰ、青色、ＢＦＰ、赤色、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、白色、ＴＯ－ＰＲＯ－３。（図２Ｃ、２Ｅ、２Ｇ）は、肝臓（図２Ｃ）、心臓（図２Ｅ）または前脛骨筋（図２Ｇ）におけるＢＦＰ＋（ＨＤＲ編集、左プロット）またはＧＦＰ－／ＢＦＰ－（ＮＨＥＪ編集、右プロット）細胞の頻度（％）を示す。この組織の高度な多核化のために、ＮＨＥＪ編集を骨格筋線維（すなわち、筋線維）では定量化できず、これによって、ほぼ全ての筋核が標的とされない限り、緑色蛍光消失の検出が妨げられる。ＡＡＶ－ｇＲＮＡ鋳型及びＡＡＶ－ＳａＣａｓ９の同時注射については、Ｎ＝４マウス（実験ＡＡＶ－ＨＤＲ群）、ＡＡＶ－ｇＲＮＡ鋳型注射のみについてはＮ＝３（ＡＡＶ対照群）。頻度データを生成するために、各マウスの組織ごとに３つの視野を定量化した。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図３Ａ～３Ｄは、衛星細胞がＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲによってインビボで標的され、インビトロで筋管を融合かつ形成する能力を保持し得ることを示す。（図３Ａ）は、ＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲを可能にするために、ビヒクルもしくはＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型のみを対照として、またはＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型及びＡＡＶ－ＳａＣａｓ９を静脈内に注射した若年ｍｄｘマウスからの骨格筋衛星細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。（図３Ｂ、３Ｃ）は、ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集ＢＦＰ＋衛星細胞（図３Ｂ）及びＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ編集ＧＦＰ－／ＢＦＰ－衛星細胞（図３Ｃ）の頻度（％）を示す。個々のデータ点は、平均±ＳＤを重ねて表示され、ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－ｇＲＮＡ鋳型（実験）、注射したマウスはＮ＝４、ＡＡＶ－ｇＲＮＡ鋳型のみ（対照）、注射したマウスはＮ＝３、ビヒクル、注射したマウスはＮ＝３。＊ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．、（図３Ｂ）ではｐ＝０．９９９、（図３Ｃ）ではｐ＝０．７７３７と有意ではない、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ、ＤＦ＝７。（図３Ｄ）は、ＦＡＣＳ選別インビボＡＡＶ－ＨＤＲ注射ＧＦＰ＋（非編集）、ＢＦＰ＋（ＨＤＲ）及びＧＦＰ－／ＢＦＰ－（ＮＨＥＪ）衛星細胞から分化した筋管の代表的な蛍光検出を示す。スケールバー、１００ｕｍ。緑色、ＧＦＰ、青色、ＢＦＰ、赤色、ミオシン重鎖素（ＭＨＣ）、白色、ＴＯ－ＰＲＯ－３。 同上。 同上。 同上。 図４Ａ～４Ｆは、Ｐ３マウスにおけるＡＡＶ８による色変換システムの送達によって、インビボＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ標的化における組織依存的な時間制限が明らかとなることを示す。（図４Ａ）は、実験計画を示している。単一のＣＡＧ－ＧＦＰアレルを保有するＰ３仔（野生型及びＭＤＸ）に、ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型のみ（対照）またはＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型とＡＡＶ－ＳａＣａｓ９を保有するＡＡＶを注射した。臓器を蛍光及びゲノム分析のために４週間後に採取した。（図４Ｂ、４Ｄ、４Ｆ）は、ＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型及びＡＡＶ－ＳａＣａｓ９（実験）またはＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型のみ（対照）の腹腔内注射後の、ＧＦＰ^＋／－；ｍｄｘマウスの肝臓（図４Ｂ）、心臓（図４Ｄ）、及び前脛骨筋（図４Ｆ）におけるＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ編集（ＧＦＰ－／ＢＦＰ－）及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集（ＢＦＰ＋）細胞の検出に関する代表的な蛍光画像を示す。スケールバー、５０ｕｍ。緑色、ＧＦＰ、青色、ＢＦＰ、赤色、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、白色、ＴＯ－ＰＲＯ－３。（図４Ｃ、４Ｅ）は、処置したＧＦＰ；ｍｄｘ及び野生型（ＣＡＧ－ＧＦＰ）マウスの肝臓（図４Ｃ）及び心臓（図４Ｅ）におけるＧＦＰ－／ＢＦＰ－（ＮＨＥＪ）及びＢＦＰ＋（ＨＤＲ）細胞の頻度（％）を示す。骨格筋ではＨＤＲ編集を検出せず、この組織の高度な多核化のために、ＮＨＥＪ編集を定量化できなかった。実験群についてはＮ＝５（Ｎ＝２のｍｄｘ、Ｎ＝３のＣ５７ＢＬ／６Ｊ動物）、対照群についてはＮ＝３（Ｎ＝１のｍｄｘ、Ｎ＝２のＣ５７ＢＬ／６Ｊ動物）。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＧＦＰ／ＢＦＰカラースイッチングレポーターシステム構成成分のインビトロ試験を図示する。（図５Ａ）は、ＧＦＰ及びＢＦＰがフローサイトメトリーによって区別され得ることを示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。ｍｄｘＴＴＦ（蛍光タンパク質なし）をＣＡＧ－ＧＦＰまたはＣＡＧ－ＢＦＰのいずれかのプラスミドでトランスフェクトし、３日後にフローサイトメトリーで分析した。 ＧＦＰ／ＢＦＰカラースイッチングレポーターシステム構成成分のインビトロ試験を図示する。（図５Ｂ）は、カラースイッチング置換及びＧＦＰｇＲＮＡの設計を示す。２塩基置換によってスペクトルシフトが引き起こされ、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析用のＢｔｇＩ部位が作成される。置換部位近傍のＧＦＰを標的とする３つのＳａＣａｓ９適合性ｇＲＮＡを選択した。ＧＦＰｇＲＮＡ２は、所望の色決定塩基に最も近い箇所を切断し、このｇＲＮＡによる認識はＨＤＲ置換によって無効となり、これによってＢＦＰ鋳型及びゲノムＨＤＲ産物をさらなるＣａｓ９標的化から防ぐ。 ＧＦＰ／ＢＦＰカラースイッチングレポーターシステム構成成分のインビトロ試験を図示する。（図５Ｃ）は、ＧＦＰｇＲＮＡによるＧＦＰ破壊を示す。ＧＦＰ^＋／－；ｍｄｘＴＴＦを、ＳａＣａｓ９のみ（対照）で、またはＳａＣａｓ９とＧＦＰを標的とする３つのｇＲＮＡのうち１つでトランスフェクトした（図５Ｂを参照のこと）。３つのｇＲＮＡは全て、ＧＦＰ発現を妨害する。ＧＦＰｇＲＮＡ２はカラースイッチング変異に近接しているため、それを後続の実験で使用するために選択した。ＧＦＰｇＲＮＡ２は、本文中ではＧＦＰｇＲＮＡまたはｇＲＮＡと称される。ＳＳＣ、側方散乱。 ＧＦＰ／ＢＦＰカラースイッチングレポーターシステム構成成分のインビトロ試験を図示する。（図５Ｄ）は、ＢＦＰ鋳型を含まないＳａＣａｓ９＋ＧＦＰｇＲＮＡ２でトランスフェクトした筋芽細胞中におけるＧＦＰ破壊及びＢＦＰ発現の欠如を示す。ＧＦＰ^＋／－；ｍｄｘ筋芽細胞を、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみ（ｌｉｐｏ、対照）で、またはＢＦＰ鋳型の不存在下においてＳａＣａｓ９＋ＧＦＰｇＲＮＡ２でトランスフェクトし、ＧＦＰ及びＢＦＰ発現についてフローサイトメトリーで分析した。ＢＦＰ＋ではなく、ＧＦＰ－／ＢＦＰ－（ＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ編集）細胞が、ＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡでトランスフェクトした培養物中に存在し、このことは、ＮＨＥＪだけでは緑色から青色へのスペクトルシフトを誘導できないことを示していた。 エクスビボＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及びＨＤＲ編集筋芽細胞の分化及びシーケンシングの確認を図示する。（図６Ａ）は、あらかじめＳａＣａｓ９及びＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型でトランスフェクトしたＦＡＣＳ選別ＧＦＰ＋（非編集）、ＢＦＰ＋（ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集）及びＧＦＰ－／ＢＦＰ－（ＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ編集）筋芽細胞から分化した筋管の代表的な蛍光画像を示す。スケールバー、１００ｕｍ。緑色、ＧＦＰ、青色、ＢＦＰ、赤色、ミオシン重鎖素（ＭＨＣ）。 エクスビボＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及びＨＤＲ編集筋芽細胞の分化及びシーケンシングの確認を図示する。（図６Ｂ）は、ＦＡＣＳ選別した培養増殖筋芽細胞からのゲノムＰＣＲ産物の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析を示す。Ｍ、マーカー。 エクスビボＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及びＨＤＲ編集筋芽細胞の分化及びシーケンシングの確認を図示する。（図６Ｃ）は、ＧＦＰ及びＢＦＰ参照配列にアラインメントしたゲノムアンプリコンのサンガーシーケンシングによって、選別ＢＦＰ＋細胞のＨＤＲ及び選別ＧＦＰ－／ＢＦＰ－細胞のＮＨＥＪが確認されることを示す。 全身的ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲによって、若年ｍｄｘ動物の前脛骨筋の筋線維においてインビボＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集が可能になることを図示する。ＡＡＶ－対照（ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型のみ）またはＡＡＶ－実験（ｇＲＮＡ鋳型＋ＳａＣａｓ９）を受けたマウスの前脛骨筋における、ＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ編集（ＧＦＰ－／ＢＦＰ－）及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集（ＢＦＰ＋）細胞の検出に関する代表的な蛍光画像。各画像は、２５枚の２０倍画像を互いに合成している。スケールバー、２００ｕｍ。緑色、ＧＦＰ、青色、ＢＦＰ、赤色、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、白色、ＴＯ－ＰＲＯ－３。 ＧＦＰ＋、ＧＦＰ－／ＢＦＰ－及びＢＦＰ＋細胞の再選別による、インビボにおける骨格筋衛星細胞のＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及びＨＤＲ編集の確認を図示する。（図８Ａ）は、ビヒクルＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型のみを対照として、またはＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型及びＡＡＶ－ＳａＣａｓ９をあらかじめ静脈内に注射した若年ｍｄｘマウスから単離した骨格筋衛星細胞によるＧＦＰ及びＢＦＰ発現の分析を示す代表的なフローサイトメトリーデータを示す。ＧＦＰ＋（非編集）、ＧＦＰ－／ＢＦＰ－（ＮＨＥＪ編集）、及びＢＦＰ＋（ＨＤＲ編集）細胞の単離に使用した選別ゲートが示されている。選別した集団を培養下で２週間別々に増殖させ、次いで、再分析のために採取した（図８Ｂに示す）。（図８Ｂ）は、ＡＡＶ－ＨＤＲ注射マウスからあらかじめ選別した培養増殖ＧＦＰ－／ＢＦＰ－、ＧＦＰ＋、及びＢＦＰ＋細胞中におけるＧＦＰ及びＢＦＰ発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。 全身的ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲによって、新生児Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ動物においてインビボＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集が可能になることを図示する。ＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型及びＡＡＶ－ＳａＣａｓ９（実験）またはＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型（対照）を新生児ＧＦＰ^＋／－；Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに腹腔内注射した後の、肝臓（図９Ａに示す）及び心筋（図９Ｂに示す）における、ＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ編集（ＧＦＰ－／ＢＦＰ－）及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集（ＢＦＰ＋）細胞の検出に関する代表的な蛍光画像。スケールバー、５０ｕｍ。スケールバー、５０ｕｍ。緑色、ＧＦＰ、青色、ＢＦＰ、赤色、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、白色、ＴＯ－ＰＲＯ－３。 インビボＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集のゲノムＰＣＲ及び次世代シーケンシングの検証を図示する。（図１０Ａ）は、ゲノムＰＣＲに使用されるＧＦＰ／ＢＦＰゲノム導入遺伝子座及びプライマーの概略図を示す。フォワードプライマーは、鋳型ＤＮＡではなく、ゲノム配列上のＧＦＰ／ＢＦＰ開始部位の上流に結合し、リバースプライマーは、Ｃａｓ９切断部位及びカラースイッチング置換の下流に結合する。このプライマー対は、ゲノム導入遺伝子座を増幅するが、鋳型配列は増幅しない（鋳型にはフォワードプライマー結合配列がないため）。 インビボＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集のゲノムＰＣＲ及び次世代シーケンシングの検証を図示する。（図１０Ｂ）は、Ｐ２１ ＡＡＶ－ＨＤＲ注射ＧＦＰ^＋／－；ｍｄｘマウスのインビボＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集衛星細胞、ＴＡ筋、心臓、及び肝臓のゲノムＮＧＳ分析からの代表的なアラインメント配列を示す。＊は代表的なＮＨＥＪ配列を示し、＊＊は不正確なＮＨＥＪによる挿入部位をマークする。 インビボＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集のゲノムＰＣＲ及び次世代シーケンシングの検証を図示する。（図１０Ｃ）は、ＡＡＶ－ＨＤＲまたはＡＡＶ－対照をインビボで投与したＰ２１ ＧＦＰ^＋／－；ｍｄｘマウスから選別した衛星細胞中で検出されたＨＤＲ及びＮＨＥＪ編集アレルのリード数及びアレル頻度（ＧＦＰ／ＢＦＰ配列にマッピングした非編集、ＨＤＲ編集、またはＮＨＥＪ編集リード数／合計リード数）を示す。ＢＦＰ^＋及びＧＦＰ^－／ＢＦＰ^－細胞をＡＡＶ－ＳａＣａｓ９及びＡＡＶ－ｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型注射実験マウス（ＡＡＶ－ＨＤＲ）から選別し、ＧＦＰ^＋細胞をＡＡＶ－ｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型注射対照マウス（ＡＡＶ－対照）から選別した。 図１１Ａ～１１Ｃは、新生児骨格筋の衛星細胞が、全身的ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲで稀に標的とされることを図示する。（図１１Ａ）は、ＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲを可能にするために、ＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型のみを対照として、またはＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型及びＡＡＶ－ＳａＣａｓ９を腹腔内注射してから４週間後の、新生児（Ｐ３）ｍｄｘ及びＣ５７ＢＬ／６マウスから単離した骨格筋衛星細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。（図１１Ｂ、１１Ｃ）は、ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集ＢＦＰ＋衛星細胞（図１１Ｂ）及びＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ編集ＧＦＰ－／ＢＦＰ－衛星細胞（図１１Ｃ）の頻度（％）を示す。個々のデータ点は、平均±ＳＤを重ねて表示され、ＡＡＶ－Ｃａｓ９及びＡＡＶ－ｇＲＮＡ鋳型（実験）の注射したｍｄｘマウスはＮ＝２、注射したＣ５７ＢＬ６マウスはＮ＝３、ＡＡＶ－ｇＲＮＡ鋳型のみ（対照）の注射したｍｄｘマウスはＮ＝１、注射したＣ５７ＢＬ６マウスはＮ＝２。＊ｐ＜０．０５、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ＤＦ＝４。 同上。 同上。 ＣＲＩＳＰＲ媒介編集が、３日齢（Ｐ３）または２１日齢（Ｐ２１）で処置したマウスの肝臓、心臓、及び前脛骨筋において、ＧＦＰマウスのＧＦＰ蛍光強度の低減をもたらすことを示す。 同上。 ＣＲＩＳＰＲ媒介編集が、ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲを注射したＰ２１（処置時に２１日齢のマウス）の前脛骨筋においてＢＦＰ蛍光と、ＧＦＰ蛍光強度の低減をもたらすことを示す。各ヒストグラムについて、ｎ＝１４００。個々の筋線維を、ＩｍａｇｅＪにおいて別個の目的の領域として丸で囲み、各線維の平均蛍光強度を「測定」機能を使用して測定した。Ｐｒｉｓｍ８を使用してヒストグラムを生成した。マン・ホイットニーＵ検定を使用して中央値を比較した。 同上。 ＨＤＲ編集筋肉の層下単核細胞がＢＦＰ＋であることを示す。衛星細胞は、層下単核細胞として定義される。

本明細書に記載されるのは、骨格筋及び心筋、すなわち、両方とも主にこのアプローチでは到達できないと広く考えられている有糸分裂後の組織における、ＨＤＲによる正確な標的遺伝子置換の方法である。具体的には、発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の全身的なＡＡＶ送達による、出生後の心臓における重要なインビボＨＤＲ編集、及び骨格筋におけるＨＤＲ編集率の大幅な改善を実証する。本明細書に記載される方法はまた、細胞の天然ニッチ内の組織幹細胞におけるＨＤＲ編集を可能にし、これによって、これらの希少細胞を単離、増殖または移植する必要なく、治療的及び実験的に幹細胞ゲノムの対象となる操作が可能となる。

筋細胞のゲノムを改変する方法

本開示のいくつかの態様は、対象においてインビボで筋前駆細胞のゲノムを改変する方法を対象とし、本方法は筋細胞を１つ以上のウイルスと接触させることを含み、１つ以上のウイルスは、筋前駆細胞中で配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入し、筋前駆細胞中でドナー鋳型を形質導入し、改変は、ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入（例えば、ドナー配列との相同組換えによる）を含む。相同組換え（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＨＲ）媒介修復（相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）修復（ＨＤＲ）とも称される）は、二本鎖ＤＮＡ切断を修復するための鋳型として相同ドナーＤＮＡを使用する。ドナーＤＮＡの配列がゲノム配列と異なる場合、このプロセスにより、ゲノムに配列変化が導入される。

「ゲノムの改変」という語句は、本明細書で使用される場合、調節配列または遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列の相同組換えによる追加（すなわち、ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入）を包含する。いくつかの実施形態では、改変は、疾患または状態（例えば、遺伝子変異）と関連するゲノム領域と、非病理学的ゲノム領域との相同組換えによる置換を含む。例えば、いくつかの実施形態では、改変は、変異を含むゲノム領域と、野生型または非変異ゲノム領域との置換を含む。いくつかの実施形態では、変異は、置換または欠失変異を含む。いくつかの実施形態では、改変は、欠失変異の欠失部分に対応するゲノムへのヌクレオチド配列の相同組換えによる挿入を含む。いくつかの実施形態では、ゲノムの改変は、遺伝子産物の発現、活性または安定性を調節するゲノム配列の相同組換えによる挿入及び／または置換を含む。いくつかの実施形態では、ゲノムの改変は、対象の両方のアレルの改変を含む。いくつかの実施形態では、ゲノムの改変は、対象の１つのアレルの改変を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム改変は、生物学的プロセスと関連する１つ以上の遺伝子の改変を含む。いくつかの実施形態では、生物学的プロセスは、エピジェネティックな調節またはタンパク質恒常性（例えば、オートファジー、ユビキチン・プロテアソーム、熱ショック応答、抗酸化応答、小胞体ストレス応答）を含む。

本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒトまたは動物（例えば、霊長類）を意味する。通常、動物は脊椎動物、例えば、霊長類、げっ歯類、飼育動物または狩猟動物などである。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えば、アカゲザルが挙げられる。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターが挙げられる。飼育及び狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科の種、例えば、イエネコ、イヌ科の種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類の種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚、例えば、マス、ナマズ及びサケが挙げられる。患者または対象は、前述の、例えば、上記した全ての任意のサブセットを含むが、ヒト、霊長類またはげっ歯類などの１つ以上の群または種を除く。ある特定の実施形態では、対象は哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。「患者」、「個体」及び「対象」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。対象はオスまたはメスであり得る。「対象」は、様々な実施形態において任意の脊椎動物であってよい。対象は、例えば、実験、診断、及び／または治療を目的として薬剤が投与される個体または試料が得られる個体または手順が実施される個体であってよい。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、新生児～６か月齢である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、６～２４か月齢である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、２～６歳、６～１２歳、または１２～１８歳である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、１８～３０歳、３０～５０歳、５０～８０歳、または８０歳を超える。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０歳である。いくつかの実施形態では、対象は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０歳未満である。いくつかの実施形態では、対象は成人である。この目的のために、若くとも１８歳のヒトが成人であると見なされる。いくつかの実施形態では、対象は若年者（例えば、ヒト対象では約１８、１２または６歳未満）である。いくつかの実施形態では、対象は若年者（例えば、ヒト対象では約１８、１２または６歳未満）ではない。いくつかの実施形態では、対象は胚である。いくつかの実施形態では、対象は胎児である。ある特定の実施形態では、子宮内の胚または胎児に対する生物学的効果を処置するか、または引き起こすために、薬剤が妊婦に投与される。

いくつかの実施形態では、対象は、筋組織が関与する疾患または状態を有する。いくつかの実施形態では、対象は、筋ジストロフィーを有するか、または筋ジストロフィーと診断されている。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、筋強直性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、及びエメリ・ドレフュス型筋ジストロフィーから選択される。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、ベッカー型筋ジストロフィーまたはデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、対象の疾患または状態を処置するために使用される。

本明細書で使用される場合、細胞を１つ以上のウイルスと「接触させること」は、対象の全身に（例えば、静脈内に）または局所的に（例えば、筋肉内注射）ウイルスを投与することを含み得る。あるいは、他の投与経路が選択されてよい（例えば、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、及び他の親経路）。接触方法は限定されず、当該技術分野において利用可能な任意の好適な方法であってよい。

いくつかの実施形態では、ウイルス組成物は、ヒト患者に対して約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１５ＧＣの範囲内（体重が７０ｋｇの平均的な対象を処置するために）、好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣである複製欠損ウイルスの量を含有するために投与単位で製剤化され得る。好ましくは、製剤中の複製欠損ウイルスの用量は、１．０×１０^９ＧＣ、５．０×１０^９ＧＣ、１．０×１０^１０ＧＣ、５．０×１０^１０ＧＣ、１．０×１０^１１ＧＣ、５．０×１０^１１ＧＣ、１．０×１０^１２ＧＣ、５．０×１０^１２ＧＣ、または１．０×１０^１３ＧＣ、５．０×１０^１３ＧＣ、１．０×１０^１４ＧＣ、５．０×１０^１４ＧＣ、または１．０×１０^１５ＧＣである。

いくつかの実施形態では、筋前駆細胞またはそのサブセットのゲノムの少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上が改変される。いくつかの実施形態では、筋前駆細胞またはそのサブセットのゲノムの少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上が、相同組換えによって改変される（例えば、ゲノム配列が相同組換えによって置換または挿入される）。いくつかの実施形態では、筋前駆細胞またはそのサブセットのゲノムの少なくとも約４０％以上が、相同組換えによって改変される（例えば、ゲノム配列が相同組換えによって置換または挿入される）。いくつかの実施形態では、対象における筋前駆細胞の少なくとも１％が、ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含むように改変される。いくつかの実施形態では、対象における筋前駆細胞の少なくとも１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上が、ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含むように改変される。いくつかの実施形態では、改変は、少なくとも１つのアレルの改変を含む。いくつかの実施形態では、改変は、両方のアレルの改変を含む。

本明細書全体にわたって開示される方法での使用に好適なウイルスとしては、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）、ワクシニアウイルス及び他のポックスウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）などが挙げられる。ウイルスは、宿主細胞に導入される場合、感染性ウイルスを産生するのに十分なウイルス遺伝情報を含有する場合または含有しない場合があり、すなわち、ウイルスベクターは複製可能な場合または複製欠損性の場合がある。

いくつかの実施形態では、ウイルスは、アデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、小さな（２０ｎｍ）複製欠損性の非エンベロープウイルスである。ＡＡＶゲノムは、約４．７キロベース長の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、ならびに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐ及びｃａｐを含む。ＡＡＶゲノムは、１９番染色体上の特定の部位に最も頻繁に組み込まれる。ゲノム中へのランダムな組込みは、ごくわずかな頻度で生じる。組込み能力は、ベクターからｒｅｐ ＯＲＦの少なくとも一部を除去することによって排除される場合があり、結果としてエピソームの状態を保持し、少なくとも非分裂細胞中で持続的な発現を提供するベクターをもたらす。ＡＡＶを遺伝子導入ベクターとして使用するために、プロモーターに機能的に連結される、所望のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列、例えば、ＡＴＰＩＦ１を阻害するポリペプチドまたはＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸が、ＡＡＶゲノムの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）間に挿入される。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及びベクターとしての、例えば、遺伝子治療のためのそれらの使用は、Ｓｎｙｄｅｒ，ＲＯ ａｎｄ Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｐ．，Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８０７．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０１１でも述べられている。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６、８、９、１０またはＡｎｃ８０である（ＷＯ２０１５０５４６５３に開示され、参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ血清型２である。任意のＡＡＶ血清型、または改変ＡＡＶ血清型が適宜使用されてよく、かつ限定されない。

別の好適なＡＡＶは、例えば、ｒｈｌＯであってよい［例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７を参照のこと］。さらに他のＡＡＶ供給源としては、例えば、ＡＡＶ９［例えば、ＵＳ７，９０６，１１１、ＵＳ２０１１－０２３６３５３－Ａ１を参照のこと］、及び／またはｈｕ３７［例えば、ＵＳ７，９０６，１１１、ＵＳ２０１１－０２３６３５３－Ａ１を参照のこと］、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８［例えば、米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号を参照のこと］などが挙げられてよい。これらの及び他の好適なＡＡＶの配列に加えて、ＡＡＶベクターを生成する方法については、例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号、及びＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照のこと。さらに他のＡＡＶが、場合により、選択されたＡＡＶカプシドの組織選択性を考慮に入れて選択されてよい。組換えＡＡＶベクター（ＡＡＶウイルス粒子）は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた、５’ＡＡＶ ＩＴＲ、本明細書に記載される発現カセット及び３’ＡＡＶ ＩＴＲを含有する核酸分子を含んでよい。本明細書に記載されるように、発現カセットは、各発現カセット内にオープンリーディングフレーム（複数可）のための調節エレメントを含有してよく、核酸分子は、場合により追加の調節エレメントを含有してよい。

ＡＡＶベクターは、全長ＡＡＶ ５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）及び全長３’ＩＴＲを含有してよい。ＡＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮型が記載されていて、それはＤ－配列及び末端分解部位（ｔｒｓ）が欠失している。「ｓｃ」という略語は、自己相補的であることを指す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列が保有しているコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染時、第２鎖の細胞媒介合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、すぐに複製及び転写を行う準備ができている１本の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成することになる。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ） ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照のこと。自己相補的ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３号に記載され、その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

偽型ＡＡＶが産生される場合、ＩＴＲは、カプシドのＡＡＶ供給源とは異なる供給源から選択される。例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、選択された細胞受容体、標的組織またはウイルス標的に対して特定の効率を有するＡＡＶカプシドと共に使用するために選択される場合がある。一実施形態では、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列、またはその欠失型（ＡＩＴＲ）が、便宜上、かつ規制当局の承認を早めるために使用される。しかしながら、他のＡＡＶ供給源に由来するＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２に由来し、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源に由来する場合、得られたベクターは偽型と称される場合がある。しかしながら、ＡＡＶ ＩＴＲの他の供給源が利用されてもよい。

一本鎖ＡＡＶウイルスベクターが使用されてよい。対象への送達に好適なＡＡＶウイルスベクターを生成及び単離する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、及びＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照のこと。１つのシステムでは、産生細胞株が、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードする構築物ならびにｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（複数可）で一過性トランスフェクトされる。第２システムでは、ｒｅｐ及びｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株が、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードする構築物で（一過性または安定に）トランスフェクトされる。これらの各システムでは、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答してＡＡＶビリオンが産生されるため、混入ウイルスからｒＡＡＶを分離する必要がある。より最近では、ＡＡＶを回収するのにヘルパーウイルスの感染を必要としないシステムが開発され、必要なヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥｌ、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）も、システムによってトランスに供給される。これらの新しいシステムでは、ヘルパー機能は、必要なヘルパー機能をコードする構築物で細胞を一過性トランスフェクトすることによって供給され得るか、または細胞が、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含有するように操作され得、その発現は転写もしくは転写後レベルに制御され得る。さらに別のシステムでは、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子は、バキュロウイルスベースのベクターの感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに関する概説については、一般に、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照し、その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。これらの及び他のＡＡＶ産生システムを作製かつ使用する方法は、以下の米国特許にも記載され、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、及び７，４３９，０６５。

別の実施形態では、他のウイルスベクターが使用されてよく、組込みウイルス、例えば、ヘルペスウイルスまたはレンチウイルスを含むが、他のウイルスが選択されてもよい。好適には、これらの他のベクターのうち１つが生成される場合、それは複製欠損ウイルスベクターとして産生される。「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」は、合成または人工ウイルス粒子を指し、その中では目的の遺伝子を含有する発現カセットがウイルスカプシドまたはエンベロープ中にパッケージングされ、ウイルスカプシドまたはエンベロープ内にさらにパッケージングされている任意のウイルスゲノム配列が複製欠損性である、すなわち、それらは子孫ビリオンを生成できないが、標的細胞に感染する能力を保持し得る。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まない（このゲノムは「ガットレス」である、すなわち、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに隣接する目的の導入遺伝子のみを含有するように操作され得る）が、これらの遺伝子は産生中に供給されてもよい。

１つ以上のウイルスは、哺乳動物細胞中で発現（例えば、配列標的化ヌクレアーゼ、ドナー鋳型、及び／または１つ以上のｇＲＮＡの発現）を誘導できるプロモーターを含有してよく、例えば、好適なウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、シミアンウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、ヘルペスウイルスもしくは哺乳動物細胞に感染する他のウイルスに由来するものなど、または例えば、ＥＦ１アルファ、ユビキチン（例えば、ユビキチンＢもしくはＣ）、グロビン、アクチン、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの遺伝子に由来する哺乳動物プロモーター、または複合プロモーター、例えば、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ初期エンハンサーエレメント及びニワトリベータ－アクチンプロモーターの組合せ）などである。いくつかの実施形態では、ヒトプロモーターが使用されてよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、構成的プロモーター、及びユビキタスプロモーターから選択される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、特定の細胞型における発現を誘導する。例えば、筋前駆細胞特異的プロモーター。

本明細書に開示される各方法のいくつかの実施形態では、好適な組織特異的プロモーターは、ワールドワイドウェブのｔｉｐｒｏｄ．ｂｉｏｉｎｆ．ｍｅｄ．ｕｎｉ－ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ．ｄｅ／で利用可能な「ＴｉＰｒｏＤ：Ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ」に記載されている組織特異的プロモーターから当業者であれば得られ得る。

本明細書に開示される方法に使用され得る配列標的化ヌクレアーゼは限定されることなく、本明細書に開示される任意の配列標的化ヌクレアーゼであってよい。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）、またはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントである。

現在使用されている配列標的化ヌクレアーゼ（すなわち、標的化可能なヌクレアーゼ、部位特異的ヌクレアーゼ）には、主に４つの種類がある：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＩＩ型システムのＣａｓタンパク質など、ならびに操作されたメガヌクレアーゼ。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、選択されたＤＮＡ配列をタンパク質の標的とするように適切に設計されている、部位特異的ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合された制限酵素ＦｏｋＩ（またはその操作されたバリアント）のヌクレアーゼドメインを含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、ジンクフィンガーＤＢＤを含む。ＴＡＬＥＮの場合、部位特異的ＤＢＤは、キサントモナス種などの植物病原菌に見られる部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質のファミリーである転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）によって用いられるＤＮＡ認識コードに基づいて設計される。

規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＩＩ型システムは、ゲノム工学用のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ技術として使用するために改変されている細菌適応免疫系である。細菌系は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる２つの内因性細菌ＲＮＡならびにＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡはｃｒＲＮＡと部分的に相補性を有し、それと複合体を形成する。Ｃａｓタンパク質は、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体によって標的配列に誘導され、これは標的内でｃｒＲＮＡ配列と相補配列との間にＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成する。ゲノム改変で使用するために、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ構成成分は、多くの場合に組み合わされて単一のキメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）となり、ｃｒＲＮＡの標的化特異性及びｔｒａｃｒＲＮＡの特性が組み合わされて、Ｃａｓタンパク質がＤＮＡを切断できるように標的配列にＣａｓタンパク質を局在化させる単一の転写物となる。ｓｇＲＮＡは、多くの場合に所望の標的配列に相補的な、またはそれと相同なおよそ２０ヌクレオチドのガイド配列に続いて、約８０ｎｔのハイブリッドｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。当業者は、ガイドＲＮＡが標的配列に完全に相補的である、またはそれと相同である必要はないことを十分に理解する。例えば、いくつかの実施形態では、それは１つまたは２つのミスマッチを有する場合がある。ｇＲＮＡがハイブリダイズするゲノム配列には、通常、片側にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が隣接しているが、当業者は、ある特定のＣａｓタンパク質がＰＡＭ配列に対して緩やかな要件を有する場合があることを十分に理解する。ＰＡＭ配列はゲノムＤＮＡ中に存在するが、ｓｇＲＮＡ配列中には存在しない。Ｃａｓタンパク質は、正確な標的配列及びＰＡＭ配列を有する任意のＤＮＡ配列を対象とすることになる。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓタンパク質が由来する細菌の種に応じて変化する。Ｃａｓタンパク質の具体例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９及びＣａｓ１０が挙げられる。いくつかの実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質を含む。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａに由来するＣａｓ９が使用されてよい。これらのＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列は、それぞれＮＧＧ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡ、ＮＡＡＡＡＣである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ｓａＣａｓ９）に由来する。

部位特異的ヌクレアーゼの操作されたバリアントは多数開発されていて、ある特定の実施形態で使用されてよい。例えば、Ｃａｓ９及びＦｏｋ１の操作されたバリアントは、当該技術分野において既知である。さらに、生物学的に活性な断片またはバリアントが使用され得ると理解されることになる。他の選択肢としては、ハイブリッド部位特異的ヌクレアーゼの使用が挙げられる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）では、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインが、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）タンパク質のアミノ末端に融合される。ＲＦＮは二量体として機能し、２つのガイドＲＮＡを利用する（Ｔｓａｉ，ＱＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２（６）：５６９－５７６）。一本鎖ＤＮＡ切断を生成する部位特異的ヌクレアーゼも、ゲノム編集に有用である。そのようなヌクレアーゼは「ニッカーゼ」と称されることもあり、２つのヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣａｓタンパク質など）の２つのヌクレアーゼドメインのうち１つにおいて、主要な触媒残基に変異（例えば、アラニン置換）を導入することによって生成され得る。そのような変異の例としては、ＳｐＣａｓ９のＤ１０Ａ、Ｎ８６３Ａ、及びＨ８４０Ａ、または他のＣａｓ９タンパク質の相同位置が挙げられる。ニックは、一部の細胞型では低効率でＨＤＲを刺激し得る。互いに近く、反対の鎖上に存在する一対の配列を標的とする２つのニッカーゼは、各鎖上に一本鎖切断を作成して（「ダブルニッキング」）、ＤＳＢを効果的に生成し得、これは場合によりドナーＤＮＡ鋳型を使用してＨＤＲによって修復され得る（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５４，１３８０－１３８９（２０１３））。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＳｐＣａｓ９バリアントである。いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ三重バリアントまたはＮ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ四重バリアントである。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ，” Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５２９，ｐｐ．４９０－４９５（及び補足資料）（２０１６）を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２タイプＶ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のＣ２ｃ１である。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“ＰＡＭ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ Ｃ２ｃ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ，” Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１６７，ｐｐ．１８１４－１８２８（２０１６）を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＵＳ２０１６０３１９２６０「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」に記載されている１つであり、参照によって本明細書に組み込まれる。

配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）中に含まれるのに十分に短くなければならない。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸は、４．４ｋｂ未満である。

いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、天然に存在する標的化可能なヌクレアーゼと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のポリペプチド配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列及びドナー鋳型を形質導入する第１ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列、ドナー鋳型及び１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つなど）のｇＲＮＡを形質導入する第１ウイルスを含む。単一のウイルスが配列標的化ヌクレアーゼ、ドナー鋳型、及び場合により、１つ以上のｇＲＮＡを形質導入する、本明細書に記載される方法の実施形態では、当業者は、必要なヌクレオチド配列をパッケージングできる好適なウイルスを選択し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ウイルス、及びドナー鋳型を形質導入する第２ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ウイルス、ならびにドナー鋳型及び１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つなど）のｇＲＮＡを形質導入する第２ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ウイルス、ならびにドナー鋳型及び２つのｇＲＮＡを形質導入する第２ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、第１ウイルスと第２ウイルスとの比は、約１：３～約１：１００であり、その間の比を含む。例えば、第１ウイルスと第２ウイルスとの比は、約１：５～約１：５０、または約１：１０、または約１：２０であってよい。好ましくはないが、比は１：１であってもよいか、または第２ウイルスが多く存在してもよい。

いくつかの実施形態では、本方法は、様々な送達組成物及びナノ粒子、例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物及び他のポリマー、脂質及び／またはコレステロールベースの核酸コンジュゲート、ならびに本明細書に記載されるものなどの他の構築物を含むものと一体となった、非ウイルス構築物、例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡによって媒介される１つ以上の構成成分（例えば、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸、ドナー鋳型、１つ以上のｇＲＮＡ（例えば、２つのｇＲＮＡ））の送達を含む。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７、ウェブ公開：２０１１年３月２１日、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照し、その全てが参照によって本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって改変された筋前駆細胞のゲノムを有するその細胞は、筋幹細胞（例えば、成体筋幹細胞）である。しかしながら、筋前駆細胞は限定されない。いくつかの実施形態では、対象における筋前駆細胞（例えば、筋幹細胞）の少なくとも１％が、ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含むように改変される。本発明の他の実施形態では、本明細書に開示される方法は、筋線維細胞の改変を含む。いくつかの実施形態では、筋前駆細胞及び筋線維細胞の両方とも、それらのゲノムが改変されている。いくつかの実施形態では、筋線維細胞のゲノムは、改変されていないか、または実質的に改変されていない。

本発明のいくつかの態様は、本明細書に開示される方法によって筋前駆細胞（例えば、衛星細胞）のゲノムを改変することによって、改変されたゲノムを有する筋線維を作製する方法を対象とする。改変された筋線維は、１つ以上の改変された筋前駆細胞核を含む。いくつかの実施形態では、筋線維は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、２０、５０、７５、１００、２００、２５０、３００、４００以上の改変された核を含む。いくつかの実施形態では、筋線維の核の少なくとも約１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５１％、６０％、７０％、９０％、９５％、または９９％が、本明細書に開示される方法によって改変されたゲノムを有する。いくつかの実施形態では、対象の筋線維の少なくとも約１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５１％、６０％、７０％、９０％、９５％、または９９％が、本明細書に開示される方法によって改変されたゲノムを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって改変された筋線維を有する対象は、筋ジストロフィーと診断されている。いくつかの実施形態では、対象は筋ジストロフィーを有する。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、筋強直性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、及びエメリ・ドレフュス型筋ジストロフィーから選択される。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、ベッカー型筋ジストロフィーまたはデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される方法によって改変されたゲノムを有する筋前駆細胞または筋線維の運命または機能を評価することをさらに含む。

心臓細胞のゲノムを改変する方法

本開示のいくつかの態様は、対象においてインビボで心臓細胞のゲノムを改変する方法を対象とし、本方法は心臓細胞を１つ以上のウイルスと接触させることを含み、１つ以上のウイルスは、心臓細胞中で配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入し、心臓細胞中でドナー鋳型を形質導入し、改変は、ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入（例えば、相同組換え）を含み、心臓細胞は、ＤＮＡ合成心臓細胞または複製心臓細胞である。

対象は限定されず、本明細書に記載されるような任意の対象であってよい。いくつかの実施形態では、対象は心臓の疾患または状態を有する。いくつかの実施形態では、心臓の疾患または状態は、遺伝子変異と関連する。いくつかの実施形態では、心臓の疾患または状態は、遺伝子変異を修正することによって改善または処置され得る。いくつかの実施形態では、心臓の疾患または状態は、心臓細胞のゲノムに遺伝子配列を挿入することによって改善または処置され得る。いくつかの実施形態では、心臓の疾患または状態の可能性は、遺伝子変異の修正によって低減または予防され得る。いくつかの実施形態では、心臓の疾患または状態の可能性は、心臓細胞のゲノムに遺伝子配列を挿入することによって低減または予防され得る。いくつかの実施形態では、対象は、乳児、または若年者、または３０歳未満である。いくつかの実施形態では、対象は、乳児、または若年者、または３０歳未満ではない。

いくつかの実施形態では、心臓細胞は、哺乳動物の有糸分裂後心筋細胞、分裂／増殖せずにＤＮＡ合成が可能な哺乳動物の有糸分裂後心筋細胞、ヒト有糸分裂後心筋細胞、分裂／増殖せずにＤＮＡ合成が可能なヒト有糸分裂後心筋細胞、心筋細胞前駆細胞、増殖間葉系心臓細胞、増殖内皮心臓細胞、及び心筋前駆細胞からなる群から選択される。

配列標的化ヌクレアーゼは限定されず、本明細書に記載される任意の配列標的化ヌクレアーゼであってよい。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはその機能的断片もしくは機能的バリアントである。

いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列及びドナー鋳型を形質導入する第１ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列、ドナー鋳型及び１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つなど）のｇＲＮＡを形質導入する第１ウイルスを含む。単一のウイルスが配列標的化ヌクレアーゼ、ドナー鋳型、及び場合により、１つ以上のｇＲＮＡを形質導入する、本明細書に記載される方法の実施形態では、当業者は、必要なヌクレオチド配列をパッケージングできる好適なウイルスを選択し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ウイルス、及びドナー鋳型を形質導入する第２ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ウイルス、ならびにドナー鋳型及び１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つなど）のｇＲＮＡを形質導入する第２ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、第１ウイルスと第２ウイルスとの比は、約１：３～約１：１００であり、その間の比を含む。例えば、第１ウイルスと第２ウイルスとの比は、約１：５～約１：５０、または約１：１０、または約１：２０であってよい。好ましくはないが、比は１：１であってもよいか、または第２ウイルスが多く存在してもよい。

いくつかの実施形態では、本方法は、様々な送達組成物及びナノ粒子、例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物及び他のポリマー、脂質及び／またはコレステロールベースの核酸コンジュゲート、ならびに本明細書に記載されるものなどの他の構築物を含むものと一体となった、非ウイルス構築物、例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡによって媒介される１つ以上の構成成分（例えば、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸、ドナー鋳型、１つ以上のｇＲＮＡ）の送達を含む。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７、ウェブ公開：２０１１年３月２１日、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照し、その両方が参照によって本明細書に組み込まれる。

１つ以上のウイルスは、哺乳動物細胞中で発現（例えば、配列標的化ヌクレアーゼ、ドナー鋳型、１つ以上のｇＲＮＡの発現）を誘導できるプロモーター、例えば、本明細書に記載されるような好適なウイルスプロモーターなどを含有してよい。いくつかの実施形態では、ヒトプロモーターが使用されてよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、構成的プロモーター、及びユビキタスプロモーターから選択される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、特定の細胞型における発現を誘導する。例えば、いくつかの実施形態では、プロモーターは、心臓特異的プロモーター（例えば、哺乳動物の有糸分裂後心筋細胞特異的プロモーター、分裂／増殖せずにＤＮＡ合成が可能な哺乳動物の有糸分裂後心筋細胞特異的プロモーター、ヒト有糸分裂後心筋細胞特異的プロモーター、分裂／増殖せずにＤＮＡ合成が可能なヒト有糸分裂後心筋細胞特異的プロモーター、心筋細胞前駆細胞特異的プロモーター、増殖間葉系心臓細胞特異的プロモーター、増殖内皮心臓細胞特異的プロモーター、もしくは心筋前駆細胞特異的プロモーター、またはこれらの列挙したサブタイプのうち１つ以上に特異的なプロモーター）である。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、心臓特異的プロモーター、ユビキタスプロモーターまたは非特異的プロモーターで形質導入される。

使用される１つ以上のウイルスは限定されず、任意の好適なウイルスまたは本明細書に開示されるウイルスであってよい。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶ血清型６、８、９、１０またはＡｎｃ８０である。

いくつかの実施形態では、ウイルス組成物は、ヒト患者に対して約１．０×１０^９ＧＣ（ゲノムコピー、本明細書においてはウイルスゲノム（ｖｇ）とも称される）～約１．０×１０^１５ＧＣの範囲内（体重が７０ｋｇの平均的な対象を処置するために）、好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣである複製欠損ウイルスの量を含有するために投与単位で製剤化され得る。好ましくは、製剤中の複製欠損ウイルスの用量は、１．０×１０^９ＧＣ、５．０×１０^９ＧＣ、１．０×１０^１０ＧＣ、５．０×１０^１０ＧＣ、１．０×１０^１１ＧＣ、５．０×１０^１１ＧＣ、１．０×１０^１２ＧＣ、５．０×１０^１２ＧＣ、または１．０×１０^１３ＧＣ、５．０×１０^１３ＧＣ、１．０×１０^１４ＧＣ、５．０×１０^１４ＧＣ、または１．０×１０^１５ＧＣである。

いくつかの実施形態では、対象の心臓細胞のゲノムのうち少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上が改変される。いくつかの実施形態では、心臓細胞のゲノムの少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上が、相同組換えによって改変される（例えば、ゲノム配列が相同組換えによって置換または挿入される）。いくつかの実施形態では、対象における心臓細胞の少なくとも１％、１．６％、２％が、ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含むように改変される。いくつかの実施形態では、改変は、少なくとも１つのアレルの改変を含む。いくつかの実施形態では、改変は、両方のアレルの改変を含む。

本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示される方法によって改変されたゲノムを有する心臓細胞を含む心臓組織を対象とする。いくつかの実施形態では、心臓組織は、本明細書に開示される方法によって改変された心臓細胞の子孫細胞を含む。いくつかの実施形態では、心臓組織の筋細胞の少なくとも約１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５１％、６０％、７０％、９０％、９５％、９９％が、本明細書に開示される方法によって改変されているか、または改変されている細胞の子孫である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって改変された心臓組織を有する対象は、心臓の疾患または状態と診断されている。いくつかの実施形態では、心臓の状態は、損傷した心筋である（例えば、心筋梗塞に続いて心筋を損傷した）。いくつかの実施形態では、心臓疾患は、心筋梗塞、虚血性心疾患、拡張型心筋症、心不全（例えば、うっ血性心不全）、虚血性心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、アルコール性心筋症、ウイルス性心筋症、頻脈媒介性心筋症、ストレス誘発性心筋症、アミロイド心筋症、不整脈源性右室異形成、左室緻密化障害、心内膜線維弾性症、大動脈弁狭窄症、大動脈弁逆流症、僧帽弁狭窄症、僧帽弁逆流症、僧帽弁逸脱症、肺動脈弁狭窄症、肺動脈弁狭窄症、肺動脈弁逆流症、三尖弁狭窄症、三尖弁逆流症、先天性障害、遺伝性障害、またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、それを必要とする対象で心筋再生を促進するために利用され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、ゲノム改変を伴う心臓細胞の運命または機能を評価することをさらに含む。

ゲノム改変のために特定の横紋筋タイプを標的とする方法

本開示のいくつかの態様は、相同組換え修復による対象におけるインビボでのゲノム改変のために特定の横紋筋タイプを標的とする方法を対象とし、本方法は１つ以上のウイルスが全身投与されることを含み、１つ以上のウイルスは、横紋筋細胞中で配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入し、横紋筋細胞中でドナー鋳型を形質導入し、改変はドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含み、対象の年齢ゆえに、ゲノム改変は少なくとも１つの横紋筋タイプに選択的に生じる。

いくつかの実施形態では、筋前駆細胞のゲノムは、選択的に改変される。いくつかの実施形態では、心臓細胞のゲノムは、選択的に改変される。

対象は限定されず、本明細書に記載されるような任意の対象であってよい。いくつかの実施形態では、対象は、筋肉または心臓の疾患または状態を有する。

配列標的化ヌクレアーゼは限定されず、本明細書に記載される任意の配列標的化ヌクレアーゼであってよい。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはその機能的断片もしくは機能的バリアントである。

いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列及びドナー鋳型を形質導入する第１ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列、ドナー鋳型及び１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つなど）のｇＲＮＡを形質導入する第１ウイルスを含む。単一のウイルスが配列標的化ヌクレアーゼ、ドナー鋳型、及び場合により、１つ以上のｇＲＮＡを形質導入する、本明細書に記載される方法の実施形態では、当業者は、必要なヌクレオチド配列をパッケージングできる好適なウイルスを選択し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ウイルス、及びドナー鋳型を形質導入する第２ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ウイルス、ならびにドナー鋳型及び１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つなど）のｇＲＮＡを形質導入する第２ウイルスを含む。いくつかの実施形態では、第１ウイルスと第２ウイルスとの比は、約１：３～約１：１００であり、その間の比を含む。例えば、第１ウイルスと第２ウイルスとの比は、約１：５～約１：５０、または約１：１０、または約１：２０であってよい。好ましくはないが、比は１：１であってもよいか、または第２ウイルスが多く存在してもよい。

いくつかの実施形態では、本方法は、様々な送達組成物及びナノ粒子、例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物及び他のポリマー、脂質及び／またはコレステロールベースの核酸コンジュゲート、ならびに本明細書に記載されるものなどの他の構築物を含むものと一体となった、非ウイルス構築物、例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡによって媒介される１つ以上の構成成分（例えば、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸、ドナー鋳型、１つ以上のｇＲＮＡ）の送達を含む。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７、ウェブ公開：２０１１年３月２１日、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照し、その両方が参照によって本明細書に組み込まれる。

１つ以上のウイルスは、哺乳動物細胞中で発現（例えば、配列標的化ヌクレアーゼ、ドナー鋳型、１つ以上のｇＲＮＡの発現）を誘導できるプロモーター、例えば、本明細書に記載されるような好適なウイルスプロモーターなどを含有してよい。いくつかの実施形態では、ヒトプロモーターが使用されてよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、構成的プロモーター、及びユビキタスプロモーターから選択される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、特定の細胞型における発現を誘導する。いくつかの実施形態では、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、ユビキタスプロモーターまたは非特異的プロモーターで形質導入される。

使用される１つ以上のウイルスは限定されず、任意の好適なウイルスまたは本明細書に開示されるウイルスであってよい。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶ血清型６、８、９、１０またはＡｎｃ８０である。

いくつかの実施形態では、ウイルス組成物は、ヒト患者に対して約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１５ＧＣの範囲内（体重が７０ｋｇの平均的な対象を処置するために）、好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣである複製欠損ウイルスの量を含有するために投与単位で製剤化され得る。好ましくは、製剤中の複製欠損ウイルスの用量は、１．０×１０^９ＧＣ、５．０×１０^９ＧＣ、１．０×１０^１０ＧＣ、５．０×１０^１０ＧＣ、１．０×１０^１１ＧＣ、５．０×１０^１１ＧＣ、１．０×１０^１２ＧＣ、５．０×１０^１２ＧＣ、または１．０×１０^１３ＧＣ、５．０×１０^１３ＧＣ、１．０×１０^１４ＧＣ、５．０×１０^１４ＧＣ、または１．０×１０^１５ＧＣである。

いくつかの実施形態では、対象の横紋筋細胞タイプ（例えば、心筋、筋前駆細胞、筋線維）のゲノムの少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上が改変される。いくつかの実施形態では、横紋筋細胞タイプ（例えば、心筋、筋前駆細胞、筋線維）のゲノムの少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上が、相同組換えによって改変される（例えば、ゲノム配列が相同組換えによって置換または挿入される）。いくつかの実施形態では、対象における横紋筋細胞タイプ（例えば、心筋、筋前駆細胞、筋線維など）の少なくとも約１％、１．６％、または２％が、ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含むように改変される。いくつかの実施形態では、改変は、少なくとも１つのアレルの改変を含む。いくつかの実施形態では、改変は、両方のアレルの改変を含む。

いくつかの実施形態では、ヒト対象は、６～２４か月齢である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、２～６歳、６～１２歳、または１２～１８歳である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、１８～３０歳、３０～５０歳、５０～８０歳、または８０歳を超える。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０歳である。いくつかの実施形態では、対象は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０歳未満である。いくつかの実施形態では、対象は成人である。この目的のために、若くとも１８歳のヒトが成人であると見なされる。いくつかの実施形態では、対象は若年者（例えば、ヒト対象では約１８、１２または６歳未満）である。いくつかの実施形態では、対象は若年者（例えば、ヒト対象では約１８、１２または６歳未満）ではない。いくつかの実施形態では、対象は１歳未満である。いくつかの実施形態では、対象は、１歳超～６歳未満である。いくつかの実施形態では、対象は、６歳超～１２歳未満である。いくつかの実施形態では、対象は、１２歳超～１８歳未満である。いくつかの実施形態では、対象は、１８歳超～２４歳未満である。いくつかの実施形態では、対象は１８歳超である。いくつかの実施形態では、対象は思春期後である。いくつかの実施形態では、対象は思春期前である。いくつかの実施形態では、対象は思春期を迎えている。いくつかの実施形態では、対象は胚である。いくつかの実施形態では、対象は胎児である。ある特定の実施形態では、子宮内の胚または胎児に対する生物学的効果を処置するか、または引き起こすために、薬剤が妊婦に投与される。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、ゲノム改変を伴う横紋筋細胞の運命または機能を評価することをさらに含む。

「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「減少する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「減少した」、「減少」、「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、及び「阻害する」という用語は全て、本明細書では一般に、参照と比較して統計的に有意な量の減少を意味するために使用される。しかしながら、誤解を避けるために、「減少する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「減少」または「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「阻害する」は通常、参照レベルと比較した場合に少なくとも１０％の減少を意味し、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、最大及び例えば、参照レベルと比較した場合に所与の実体もしくはパラメータの完全な欠如を含む減少、または所与の処置を行わない場合と比較して１０～９９％のいずれかの減少を含み得る。

「増加した」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」という用語は全て、本明細書では一般に、統計的に有意な量の増加を意味するために使用され、あらゆる誤解を避けるために、「増加した」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較した場合に少なくとも１０％の増加を意味し、例えば、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは最大及び１００％の増加を含む増加または参照レベルと比較した場合に１０～１００％のいずれかの増加、あるいは少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍もしくは少なくとも約１０倍の増加、または参照レベルと比較した場合に２倍～１０倍以上のいずれかの増加を意味する。

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、組成物、方法、及び方法または組成物に不可欠な、それらの各々の構成成分（複数可）に関連して使用されるが、不可欠であろうとなかろうと、指定されていない要素を含むことについて制限されない。

「からなる」という用語は、本明細書に記載されるような組成物、方法、及びそれらの各々の構成成分を指し、これは実施形態のその記載に列挙されていない要素をいずれも除外する。

本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要なそれらの要素を指す。本用語は、その実施形態の基本的かつ新規の、または機能的な特徴（複数可）に実質的には影響を及ぼさない要素の存在を許容する。

「統計的に有意」または「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、一般に０．０５を超える「ｐ」値（関連の統計的検定によって算出される）を意味する。当業者は、任意の特定の実験に関連する統計的検定が、分析されているデータの種類に依存することを容易に理解することになる。追加の定義は、以下で個々の節の本文中において提供される。

細胞生物学及び分子生物学の一般的な用語の定義は、“Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ”，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより出版，２００６（ＩＳＢＮ０－９１１９１０－１９－０）、ＲｏｂｅｒｔＳ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．により出版，１９９４（ＩＳＢＮ０－６３２－０２１８２－９）、Ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １４９）ｂｙ Ｃｒｏｗｔｈｅｒ Ｊ．Ｒ．（２０００）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒにより出版，２００６に見出され得る。分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｘ，Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇにより出版，２００９（ＩＳＢＮ－１０：０７６３７６６３２１）、Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により出版，１９９５（ＩＳＢＮ１－５６０８１－５６９－８）及びＣｕｎ－ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００９，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓにも見出され得る。

別段の記載がない限り、本発明は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｅｄ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２００１）及びＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９９５）に記載されているような、標準的な手順を使用して実施され、その両方とも、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は交換可能に使用され、隣接する残基のアルファ－アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結された一連のアミノ酸残基を示す。「タンパク質」、及び「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能にかかわらず、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）及びアミノ酸類似体を含む、タンパク質アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドに関連して多くの場合に使用されるのに対して、「ペプチド」という用語は、小さなポリペプチドに関連して多くの場合に使用されるが、当該技術分野においてこれらの用語の使用方法は重複する。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、精製して遺伝子産物及びその断片とする場合、本明細書では交換可能に使用される。

したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質としては、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の等価物、バリアント、断片、ならびに前述の類似体が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはそれらの類似体の単位を組み込んだ任意の分子、好ましくはポリマー分子を指す。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。一本鎖核酸は、変性二本鎖ＤＮＡの一本鎖核酸であり得る。あるいは、それは、いずれの二本鎖ＤＮＡにも由来しない一本鎖核酸であり得る。一態様では、鋳型核酸はＤＮＡである。別の態様では、鋳型はＲＮＡである。好適な核酸分子は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含むＤＮＡである。他の好適な核酸分子は、ｍＲＮＡを含むＲＮＡである。核酸分子は、ゲノムＤＮＡと同様に天然に存在し得るか、もしくはそれは合成の場合がある、すなわち、ヒトの行動に基づいて調製される場合がある、または２つの組合せの場合もある。核酸分子はまた、ある特定の修飾、例えば、米国特許出願第２００７０２１３２９２号に記載されるような２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、コレステロール付加、及びホスホロチオエート骨格など、ならびに米国特許第６，２６８，４９０号に記載されるような、２’－酸素原子と４’－炭素原子との間でメチレン単位によって連結されているある特定のリボヌクレオシドを有し得、両方の特許及び特許出願の全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、疾患、障害または病状に関連して使用される場合の「処置する」、「処置」、「処置すること」、または「改善」は、状態の治療的処置を指し、目的は、症状または状態の進行または重症度を逆転、軽減、改善、阻害、鈍化または停止することである。「処置すること」という用語は、状態の少なくとも１つの有害作用または症状を減少または軽減させることを含む。１つ以上の症状または臨床マーカーが減少する場合、処置は一般に「効果的」である。あるいは、状態の進行が減少または停止する場合、処置は「効果的」である。すなわち、「処置」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置が行われない場合に予想される症状の進行または悪化の停止または少なくとも遅延も含む。有益なまたは所望の臨床結果としては、処置が行われない場合に予想されるものと比較した場合に、１つ以上の症状（複数可）の軽減、欠損程度の縮小、安定した（すなわち、悪化しない）状態が挙げられるが、これらに限定されない。

障害または疾患に対する所与の処置の有効性は、熟練した臨床医によって決定され得る。しかしながら、処置は、本用語が本明細書で使用される場合に「効果的な処置」と見なされ、障害の徴候または症状のうちいずれか１つまたは全てが有益な方法で変化される場合、他の臨床的に認められている症状が、例えば、本明細書に記載されるような薬剤または組成物を用いた処置後に少なくとも１０％向上または改善する。有効性はまた、個体が入院によって評価されるように悪化しないこと、または医学的介入を必要としない（すなわち、疾患の進行が停止している）ことによって測定され得る。これらの指標を測定する方法は当業者に既知であり、及び／または本明細書に記載されている。

本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、または本開示を開示された正確な形式に限定することを意図するものではない。本開示の特定の実施形態、及びその実施例は、例示目的のために本明細書に記載されているが、関連分野の当業者が認識することになるように、様々な同等の修正が本開示の範囲内で可能である。例えば、方法のステップまたは機能が所与の順序で提示されているが、代替の実施形態は、異なる順序で機能を実施する場合があるか、または機能は実質的に同時に実施される場合がある。本明細書で提供される本開示の教示は、適宜、他の手順または方法に適用され得る。本明細書に記載される様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わされ得る。本開示の態様は、必要であれば、上記の参考文献及び用途の組成物、機能及び構想を用いて、本開示のよりさらなる実施形態を提供するように修正され得る。これらの及び他の変更は、詳細な説明に照らして本開示で行われ得る。

前述した実施形態のいずれかの特定の要素は、他の実施形態における要素と組み合わされ得るか、または置換され得る。さらに、本開示のある特定の実施形態と関連する利点が、これらの実施形態の文脈において記載されているが、他の実施形態もそのような利点を示す場合があり、全ての実施形態が、本開示の範囲内となるようにそのような利点を示す必要が必ずしもあるわけではない。

全ての特許及び他の確認された刊行物は、例えば、本発明と関連して使用される場合のあるそのような刊行物に記載される手法を記載かつ開示することを目的として、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日以前の、それらの開示のためにのみ提供される。この点で、本発明者らは、先行発明もしくは過去の刊行物によって、または他のいかなる理由によっても、そのような開示に先行する権利が付与されないことを認めるものと解釈されるべきではない。これらの文献の日付または内容に関する描写に関する記載の全ては、出願人に利用可能な情報に基づいているが、これらの文献の日付または内容の正確さについて認めるものではない。

当業者は、本発明が、目的を実行し、言及された目的及び利点に加えて、それに固有のものを得るために十分に適合されていることを容易に理解する。本明細書における説明及び実施例の詳細は、ある特定の実施形態を代表するものであり、例示的であって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書における修正及び他の使用は、当業者であれば想定するものである。これらの修正は、本発明の趣旨内に包含される。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、様々な置換及び修正が本明細書に開示される本発明に加えられる可能性があることが、当業者には容易に明らかとなる。

「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、本明細書及び特許請求の範囲で本明細書において使用される場合、特に明確な反対の指示がない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。群の１つ以上のメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、特に反対の指示がない限り、またはさもなければ文脈から明らかでない限り、群のメンバーのうち１つ、２つ以上、または全てが、所与の製品またはプロセス中に存在する、それらに用いられる、またはさもなければそれらに関連する場合に満たされると考えられる。本発明は、群のうちの正確に１つのメンバーが、所与の製品またはプロセス中に存在する、それらに用いられる、またはさもなければそれらに関連する実施形態を含む。本発明はまた、群のメンバーのうち２つ以上、または全てが、所与の製品またはプロセス中に存在する、それらに用いられる、またはさもなければそれらに関連する実施形態を含む。さらに、本発明は、別段の指示がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることになると当業者に明らかでない限り、列挙されている請求項のうち１つ以上からの１つ以上の制限、要素、条項、記述用語などが、同じ基本請求項（または関連するような任意の他の請求項）に従属する別の請求項に導入される全ての変更、組合せ、及び順列を提供すると理解されるべきである。本明細書に記載される全ての実施形態は、該当する場合、本発明の全ての異なる態様に適用可能であることが企図される。実施形態または態様のいずれかは、該当する場合は常に、１つ以上の他のそのような実施形態または態様と自由に組み合わされ得ることも企図される。要素が一覧表として、例えば、マルクーシュ群または同様の形式で提示される場合、要素の各サブグループも開示され、いずれの要素（複数可）もこの群から除去され得ると理解されるべきである。一般に、本発明、または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むと見なされる場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様が、そのような要素、特徴などからなるか、またはそれらから本質的になると理解されるべきである。簡潔にするために、それらの実施形態は、いずれの場合においても本明細書では多数の用語で具体的に記載されているわけではない。特定の除外が本明細書に列挙されているかどうかにかかわらず、本発明の任意の実施形態または態様が、特許請求の範囲から明示的に除外され得ることも理解されるべきである。例えば、任意の１つ以上の活性剤、添加剤、成分、任意の薬剤、生物の種類、障害、対象、またはそれらの組合せが除外され得る。

特許請求の範囲または説明が組成物に関する場合、別段の指示がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることになると当業者に明らかでない限り、本明細書に開示される方法のいずれかに従って組成物を作製または使用する方法、及び本明細書に開示される目的のいずれかのために組成物を使用する方法が、本発明の態様であると理解されるべきである。特許請求の範囲または説明が方法に関する場合、例えば、別段の指示がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることになると当業者に明らかでない限り、方法の実施に有用な組成物を作製する方法、及び方法に従って生成された製品が本発明の態様であると理解されるべきである。

範囲が本明細書で与えられる場合、本発明は、端点が含まれる実施形態、両方の端点が除外される実施形態、及び一方の端点が含まれ、他方が除外される実施形態を含む。別段の指示がない限り、両方の端点が含まれていると想定されるべきである。さらに、別段の指示がない限り、またはさもなければ文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、その文脈に別段の明確な指示がない限り、本発明の異なる実施形態に記載されている範囲内の任意の具体的な値または部分範囲を、その範囲における下限値の単位の１０分の１まで想定し得ると理解されるべきである。一連の数値が本明細書に記載されている場合、本発明は、一連の任意の２つの値によって定義される任意の介在する値または範囲と同様に関連する実施形態、及び最小値が最小と見なされる場合があり、最大値が最大と見なされる場合がある実施形態を含むとさらに理解される。数値は、本明細書で使用される場合、パーセンテージで表される値を含む。数値の前に「約」または「およそ」が付く本発明の任意の実施形態では、本発明は、正確な値が列挙されている実施形態を含む。数値の前に「約」または「およそ」が付かない本発明の任意の実施形態では、本発明は、値の前に「約」または「およそ」が付く実施形態を含む。

「およそ」または「約」は一般に、別段の記載がない限り、またはさもなければ文脈から明らかでない限り、いずれの方向にも（その数を超えて、またはその数未満で）１％の範囲内またはいくつかの実施形態では、数の５％の範囲内またはいくつかの実施形態では、数の１０％の範囲内となる数を含む（そのような数が、可能な値の１００％を許容できないほど超えてしまう場合を除く）。特に明確に反対の指示がない限り、２つ以上の行為を含む本明細書で請求される任意の方法において、方法の行為の順序は、方法の行為が列挙されている順序に必ずしも限定されるとは限らないが、本発明は順序がそのように限定されている実施形態を含むと理解されるべきである。別段の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書に記載される任意の製品または組成物が、「単離されている」と見なされる場合があることも理解されるべきである。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるインビボ遺伝子編集事象を高い感度で検出するために、増強した強力な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）シグナル^８を普遍的に発現するトランスジェニックマウス株を使用する、蛍光タンパク質ベースのレポーターシステム（図１Ａ）を開発した。青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）配列を、公開されているＢＦＰバリアント^９～１１に基づいて、ＧＦＰ配列と比較して最小限の２塩基置換（Ｃ１９７Ｇ及びＴ１９９Ｃ）を保有するように設計した。この単純な改変によって、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による２つの蛍光タンパク質の容易な識別が可能となる（図５Ａ～５Ｄ）。同じ２塩基置換によって、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析用のＢｔｇＩ部位も作成される。ＧＦＰの置換部位を標的とする一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＳａＣａｓ９）と適合するように設計し、ＧＦＰシグナルの効率的な破壊のために、ＧＦＰ^＋／－；ｍｄｘマウス由来の尾部線維芽細胞（ＴＴＦ）で試験した（図５Ｂ、５Ｃ）。このｇＲＮＡを、ＨＤＲ実験で使用するために、Ｋｏｚａｋまたは開始ＡＴＧ配列を欠くプロモーターのないＢＦＰ鋳型と共に、ＡＡＶ骨格を有するベクター中に挿入した（図１Ｂ）。

このカラースイッチシステムを使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が再生幹細胞集団中でＨＤＲを引き起こす能力を試験した。ＧＦＰ^＋／－；ｍｄｘマウスの骨格筋に由来する衛星細胞を単離し、エクスビボ増殖後に^{１２、１３}、ＡＡＶ－ＳａＣａｓ９及びＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型からなる二重ベクターでトランスフェクトした（図１Ｂ、１Ｃ）。この二重ベクターシステムを、最終目標がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及び鋳型をインビボで送達することであって、ＡＡＶの積載能力が約４．５～４．７ｋｂと限られるため、単一のベクターに全ての構成成分を含めることができなかった場合に採用した。次いで、フローサイトメトリーを使用して、トランスフェクト細胞集団中においてＮＨＥＪ事象とＨＤＲ事象とを単一細胞分解能で区別した。二重ベクターでトランスフェクトした実験群には、ＧＦＰリーディングフレームの不正確なＮＨＥＪ媒介破壊を表す、緑色蛍光の消失（ＧＦＰ－）を示す細胞に加えて、ＨＤＲを表す、ＧＦＰの消失及びＢＦＰシグナルの取得（ＢＦＰ＋）を示す細胞を含んだ（図１Ｄ～１Ｇ）。対照的に、ＧＦＰ－／ＢＦＰ－及びＢＦＰ＋細胞は対照トランスフェクションには存在せず、その中で細胞はＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型のみを受けた（図１Ｄ～１Ｇ）。同様に、ＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡを、ＢＦＰ鋳型を含めずにトランスフェクトした場合（図５Ｄ）、青色蛍光の取得を一切観察せず、これはＮＨＥＪだけではＧＦＰからＢＦＰへのスペクトルシフトを誘導できないことを示していた。ＧＦＰ－／ＢＦＰ－及びＢＦＰ＋集団をＦＡＣＳによって別々に選別し、ＲＦＬＰ及びサンガーシーケンシングによって検証して、それらをそれぞれＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及び－ＨＤＲで編集したことを示した（図１Ｉ、１Ｊ、６Ｂ、６Ｃ）。最後に、これらのエクスビボで編集した衛星細胞由来の筋芽細胞が、筋肉形成能力を保持しているかどうかを調査した。分化培地に切り替えると、ＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ（ＧＦＰ－／ＢＦＰ－）及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ（ＢＦＰ＋）筋芽細胞が融合してミオシン重鎖陽性筋管を形成した（図６Ａ）。さらに、ｍｄｘマウスの損傷前のＴＡ筋に移植した場合、選別したＢＦＰ＋筋芽細胞は、青色の筋線維を生じさせることによってインビボでの筋肉修復に寄与した（図１Ｈ）。これらのデータは、本明細書で開発したＧＦＰ／ＢＦＰカラースイッチングシステムが、ゲノムＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集事象について単一細胞分解能で正確かつ高い感度で報告し、編集細胞のインビボでの再生結果をその後も追跡可能であることを示している。

インビボでＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集事象を追跡することを目的とした発明者らのレポーターシステムの有用性を評価した。ＡＡＶを、上述したベクターを使用して生成し、血清型８でパッケージングしたが、これは肝臓、心臓及び骨格筋に高い向性を有する^１４。ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲベクターを、若年（Ｐ２１）オスＧＦＰ^＋／－；ｍｄｘマウスの静脈内に注射した（図２Ａ）。対照マウス（ＡＡＶ対照）に、１×１０^１３ウイルスゲノム（ｖｇ）のＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型のみを各マウスに施した一方で、実験マウス（ＡＡＶ－ＨＤＲ）には、１×１０^１３ｖｇのＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型と５×１０^１２ｖｇのＡＡＶ－ＳａＣａｓ９を施した。分析のために、注射の３週間後にマウスを安楽死させた（図２Ａ）。ＡＡＶ－ＨＤＲを注射した全ての実験マウスの肝臓で、ＧＦＰシグナルの広範囲にわたる消失及びＢＦＰシグナルの取得を検出したが、ＡＡＶ対照注射動物では検出しなかった（図２Ｂ）。平均して、６５．７％（範囲、６２～７０％）の肝細胞がＮＨＥＪで編集され、ＧＦＰ蛍光の減少を示したが、１１．９％（範囲、９～１３％）の細胞がＨＤＲで編集されてＢＦＰ＋となり（図２Ｃ）、これは最近報告された新生児の肝臓におけるＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集率と一致していた^６、７。ＢＦＰ＋肝臓細胞の大部分もＧＦＰ－であり、レポーターシステム及び定量化戦略の信頼度を高めた。次世代シーケンシングによって、実験マウスの肝臓におけるＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪ及びＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ編集をさらに確認した（図１０Ａ、１０Ｂ）。最近の論文^１５は、高用量のＡＡＶ（特に、ＡＡＶ９バリアント）を全身に注射した非ヒト霊長類及び子ブタの肝臓毒性について懸念を引き起こしたが、ＡＡＶ注射マウスの致死性または全体的な健康に対する明らかな有害作用は、本試験では一切観察されなかった。これらの試験によって、組織切片の免疫染色またはシグナル増幅の必要なく、ＣＲＩＳＰＲ編集事象をインビボで定量化することを目的とした、発明者らの蛍光イメージングベースのシステムにおける感度及び精度を確認する。

骨格筋は主に有糸分裂後の組織であり、衛星細胞に由来する筋原性前駆体の融合によって形成された多核筋線維で主に構成される。発明者らなどは、筋肉中でＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ媒介ＮＨＥＪを利用し、Ｄｍｄエクソン２３を削除またはスキップすることによって、ジストロフィーｍｄｘマウスのＤｍｄリーディングフレームを修正し、ジストロフィン発現及び機能を回復させた^{１６～１８}。しかしながら、筋肉中でのＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ媒介ＨＤＲの過去の試み^１９では、作製された編集はごくわずかであり（編集されたアレルはわずか０．１８％）、このことは筋特異的プロモーター（ＣＫ８）の使用に起因する可能性があり、これはＣａｓ９発現を成熟筋線維に限定している。したがって、発明者らは、ＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型のみを施した対照と比較して、筋線維及びそれらの前駆体中で発現することになる広範囲に活性な調節エレメントによって制御される、ＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型とＡＡＶ－ＳａＣａｓ９を全身に施したｍｄｘマウスの骨格筋におけるＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲの可能性を評価した（図２Ａ）。際だったことに、発明者らは、全ての実験マウスの前脛骨筋（ＴＡ）中で広範囲にわたるＢＦＰ＋筋線維を観察した（図２Ｆ、図７）。対照的に、ＢＦＰ＋線維は対照中には存在しなかった（図２Ｆ、図７）。平均で、３６．７％（範囲、３２～４１％）の線維が、ＡＡＶ－ＨＤＲ注射マウス（Ｐ２１）中でＢＦＰ＋であり、これは強力なＨＤＲ媒介遺伝子置換を示していた（図２Ｇ）。ＧＦＰシグナルの完全な消失を示した線維はほぼなかったが（緑色蛍光の完全な消失には、これらの細胞中における何百もの筋核の全てまたはほぼ全てをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的とする必要があるためと予想した通り）、ＨＤＲ編集及びＮＨＥＪ編集の両方のゲノム配列をＮＧＳによって検出及び確認した（図９Ａ～９Ｂ）。さらに、二重ＡＡＶ処置マウスの衛星細胞がＢＦＰ＋であることを見出した（図１４）。

本試験で検出したＢＦＰ＋筋線維のパーセンテージが比較的高いことを考慮すると、筋線維特異的プロモーターを使用する、これまでに報告されたＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ媒介ＨＤＲの低効率と比較して^１９、発明者らは、骨格筋幹細胞が発明者らのシステムで標的とされ得、その後、編集した前駆細胞が筋線維中に組み込まれたと推論した。したがって、発明者らは、広く検証された表面マーカープロファイル（Ｔｅｒ１１９^－ＣＤ４５^－Ｍａｃ１^－Ｓｃａ１^－ＣＸＣＲ４^＋β１－インテグリン^＋）を使用して、ＡＡＶ－ＨＤＲ注射マウスから筋幹細胞を単離した^{１２、１３、２０}。発明者らのグループがこれまでに公開したデータと一致して^１６、およそ５％のＦＡＣＳ単離筋幹細胞がＧＦＰ－／ＢＦＰ－であり、これはＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ－ＮＨＥＪによるインビボ破壊を示していた（図３Ａ、３Ｃ）。重要なことには、発明者らは、ＢＦＰ＋である筋幹細胞のより小さな集団（約１％）も検出し、これはＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲによるインビボＨＤＲ編集を示唆していた（図３Ａ、３Ｂ）。この集団における青色蛍光の取得及び緑色蛍光の消失を、培養増殖細胞の再選別（図７）及びシーケンシング分析（図９）によって検証した。これらのインビボで編集した衛星細胞の筋原性機能を試験するために、発明者らは、培養下でそれらを増殖させ、エクスビボで分化アッセイを実施した。インビボＮＨＥＪ及びＨＤＲ編集衛星細胞は、融合してそれぞれＧＦＰ－／ＢＦＰ－及びＢＦＰ＋筋管を形成する能力を保持していた（図７Ｄ）。

骨格筋と同様に、心筋は、インビボでの治療遺伝子編集から恩恵を受け得る幅広い遺伝子疾患に関与しているが、出生後の心臓は、限定的な増殖活性及び著しく低い再生能を示す^{２１、２２}。発明者らなどは、新生児及び若年マウスの心臓中におけるＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ媒介インビボ遺伝子破壊を記録したが、この組織中におけるＨＤＲ対ＮＨＥＪの相対的な効率は十分に試験されていない^{１６～１９、２３}。Ｐ２１の全身的ＡＡＶ－ＨＤＲ注射マウスでは、大半の心筋細胞（平均で６２％）がＧＦＰシグナルを消失し、これはゲノムＧＦＰ配列の高レベルなＮＨＥＪ媒介破壊を示していた（図２Ｄ～２Ｅ）。ＢＦＰ＋心筋細胞も、全ての実験マウス中において稀ではあるが（平均で約０．５８％）存在した（図２Ｄ～２Ｅ）。対照的に、ＧＦＰ破壊もＢＦＰ蛍光もＡＡＶ対照マウスでは検出しなかった（図２Ｄ～２Ｅ）。

発明者らは、Ｐ２１後のマウスにおける増殖心筋細胞の欠如、及び恒常性における内因性心筋前駆細胞からの寄与がごくわずかであることが、骨格筋とは対照的に、心筋で観察したＨＤＲの率が低かったことの根拠となる可能性があると仮定した^{２１、２２、２４}。発明者らはさらに、ＡＡＶの早期投与が、新生児期に増殖細胞を保持するが、後に有糸分裂後となる心臓などの臓器においてＨＤＲ編集効率を高める可能性があると推論した。発明者らはまた、ｍｄｘマウスの軽度の病態生理学^２５が、心筋細胞の編集効率に影響を及ぼす可能性があるかどうかを疑問に思った。したがって、発明者らは、Ｐ３のＧＦＰ^＋／－；ｍｄｘまたはＧＦＰ^＋／－；Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（オス及びメスの）マウスに腹腔内注射によってＡＡＶ－ＨＤＲベクターを投与した（図４Ａ）。ＡＡＶ対照動物には、３×１０^１２ｖｇ／マウスのＡＡＶ－ｇＲＮＡ鋳型のみを施し、実験マウス（ＡＡＶ－ＨＤＲ）には、同じ用量のＡＡＶ－ｇＲＮＡ鋳型を１×１０^１２ｖｇ／マウスのＡＡＶ－ＳａＣａｓ９と共に施した。遺伝的背景にかかわらず、類似したパーセンテージのＢＦＰ＋及びＧＦＰ－／ＢＦＰ－肝臓細胞を検出した（図４Ｂ及び図９Ａ）。加えて、ＢＦＰ＋肝細胞の頻度は、Ｐ３実験とＰ２１実験との間で同等であった（平均で約１０％ＢＦＰ＋肝細胞、図２Ｃ及び図４Ｃ）。しかしながら、ＮＨＥＪ編集肝臓細胞の頻度は新生児期に注射したマウスでは減少し（平均で約２８％の肝細胞、図４Ｃ）、これは初期の新生児肝細胞のより活発な増殖率を反映している可能性があり、これによって非組込みＡＡＶエピソームのより急速な希釈損失がもたらされる可能性がある^２６。

発明者らはまた、Ｐ３新生児のＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲの全身投与後に心筋及び骨格筋のＨＤＲ率を評価した。ＢＦＰ＋細胞は平均３．５％（範囲、１．６％～４．６％）の心筋細胞を占めていて、この頻度はＰ２１注射マウスの心臓におけるＢＦＰ＋細胞の頻度よりも有意に高かった（図４Ｄ～４Ｅ及び図２Ｄ～２Ｅ）。ＧＦＰ－／ＢＦＰ－心筋細胞を、２つの実験（図２Ｅ及び図４Ｅ）間で同様の率（＞６０％）で検出し、これはＨＤＲで観察した年齢依存的な差が、ＡＡＶ形質導入の効率差を反映する可能性がないことを示唆していた。対照的に、発明者らは、ｍｄｘまたはＣ５７ＢＬ／６Ｊ背景のいずれでも骨格筋切片でＢＦＰシグナルの実質的な取得を観察せず（図４Ｆ）、これはこれらの筋肉における稀なＢＦＰ＋骨格筋衛星細胞と一致していた（０．０５～０．１７％ＢＦＰ＋、図１１）。上で述べたように、ＧＦＰシグナルの消失を、筋線維多核化の交絡の影響によって評価できなかった。合わせて、これらのデータによって、横紋筋のインビボＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ遺伝子編集における個々の発達上の時間制限が明らかとなり、これはＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ投与のタイミングを調整することによって目的の特定の組織を標的とする（または標的解除する）可能性を提供する。ＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ到達性の類似した発達上の制御されたウィンドウが、他の細胞型に存在するかどうかは、今後の調査に対する興味深い道ということになる。

上述した結果を図１３に示したデータによってさらに検証し、これは二重ＡＡＶ処置動物（Ｐ３及びＰ２１の両方）の肝臓、心臓、及び筋肉（ＴＡ）におけるＧＦＰの消失に加えて、Ｐ２１筋肉組織及びＰ３心臓組織におけるＢＦＰシグナル（ＨＤＲを示す）の選択的取得を示している。

本発明者らは、驚くべきことに、かつ予想外にも、ゲノム編集結果のインビボ追跡を単一細胞レベルで可能にするＧＦＰ－ＢＦＰカラースイッチングレポーターシステムを使用して、出生後の心筋、骨格筋、及び筋幹細胞が、マウスの異なる発達時点で鋳型ＨＤＲを受けることを見出した。アデノ随伴ウイルスによるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集構成成分の全身送達（ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ）によって、肝臓の効率的なＮＨＥＪ及びＨＤＲが確認され、このことはこれまでの報告（Ｙａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，３３４－３３８（２０１６）、Ｙｉｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，３２８－３３３（２０１６））と一致した。加えて、ＨＤＲ編集筋幹細胞及び筋線維を、出生後２１日目（Ｐ２１）にＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲを注射したマウスで検出したが、Ｐ３では検出せず、一方でＨＤＲ編集心臓細胞をＰ３注射動物で検出したが、Ｐ２１注射動物ではほぼ検出しなかった。発明者らの結果によって、個々の出生後の時点における横紋筋及び筋幹細胞での配列特異的で全身に散在されるインビボＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ媒介ＨＤＲの可能性が明らかとなり、治療法開発の新たな機会を提供する。

結論として、発明者らの研究は、インビボでのＮＨＥＪ及びＨＤＲ遺伝子編集結果を単一細胞分解能で追跡する、単純であるが高性能なツールを報告する。さらに、ＡＡＶによるｇＲＮＡプログラムＣａｓ９の全身送達によって、発明者らは、骨格筋及び心筋、すなわち、両方とも主にこのアプローチでは到達できないと広く考えられている有糸分裂後の組織において、ＨＤＲによる正確な標的遺伝子置換の予想外の機会を明らかにする。発明者らの知る限りでは、発明者らのデータは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の全身的なＡＡＶ送達による、出生後の心臓における重要なインビボＨＤＲ編集に関する最初の実証を提供し、局所的な筋肉内送達によって骨格筋で達成可能な、これまでに報告されたＨＤＲ編集率の大幅な改善を示す^{１９、２７}。発明者らの研究はまた、細胞の天然ニッチ内の組織幹細胞におけるＨＤＲ編集の成功に関する最初の実証を提供し、これによって、これらの希少細胞を単離、増殖または移植する必要なく、治療的及び実験的に幹細胞ゲノムの対象となる操作が比類なく可能となる。最終的に、新生児の哺乳動物の心臓及び出生後の哺乳動物の骨格筋衛星細胞に不可逆的かつ永続的に正確なゲノム改変の可能性を刻み込む能力が、現時点では難治性の多くの心臓及び筋肉疾患に対する今後の治療的介入に刺激的な新しい道を開く。

動物

単一のトランスジェニックアレルを保有する半接合ＧＦＰトランスジェニックマウスを、ＣＡＧ－ＧＦＰマウス^８をＣ５７ＢＬ／６ＪまたはＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ－Ｄｍｄ^ｍｄｘ／Ｊ（ｍｄｘ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）のいずれかと交配させることによって生成した。出生後３日目（Ｐ３）のＧＦＰ^＋／－；ｍｄｘ及びＧＦＰ^＋／－；Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ仔（オス及びメスの両方）を新生児腹腔内（ＩＰ）注射に使用し、３週齢のオスのＧＦＰ^＋／－；ｍｄｘマウスを若年静脈内（後眼窩）注射に使用した。マウスを、Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された動物飼育及び実験プロトコールに従って、Ｈａｒｖａｒｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅで維持した。

ＡＡＶの産生及び投与

ＡＡＶを、Ｓｃｈｅｐｅｎｓ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ及びＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｅｙｅ ａｎｄ Ｅａｒ Ｉｎｆｉｒｍａｒｙ（ＳＥＲＩ／ＭＥＥＩ）のＧｒｏｕｓｂｅｃｋ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ＣｅｎｔｅｒのＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ（ＧＴＶＣ）によって産生かつ力価測定し、これまでに記載されたように血清型８でパッケージングした^２８。簡潔に述べると、セミコンフルエントなＨＥＫ２９３細胞をｒｅｐ２－ｃａｐ８パッケージング構築物、アデノウイルスヘルパー機能プラスミド、及びＩＴＲ隣接導入遺伝子構築物でトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、培地及び細胞を採取し、非粒子関連ＤＮＡを除去するために溶解及びｂｅｎｚｏｎａｓｅ消化を行った。粒子を、タンジェンシャルフロー濾過、イオジキサノール密度遠心分離、及びＰＢＳベースの緩衝液への緩衝液交換を使用して精製かつ濃縮した。新生児（Ｐ３）腹腔内注射では、対照マウスに３×１０^１２ウイルスゲノム（ｖｇ）のＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型のみを施し、実験マウスには、３×１０^１２ｖｇのＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型と１×１０^１２ｖｇのＡＡＶ－ＳａＣａｓ９を施した。ウイルスを注射ごとに７５μＬのビヒクル（３５ｍＭ ＮａＣｌを含むＰＢＳ）で希釈した。注射の４週間後に分析のためにマウスを安楽死させた。若年（Ｐ２１）後眼窩注射では、対照マウスに１×１０^１３ｖｇのＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型のみを施し、実験マウスには、１×１０^１３ｖｇのＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型と５×１０^１２ｖｇのＡＡＶ－ＳａＣａｓ９を施した。ウイルスを注射ごとに３１２μＬのビヒクル（３５ｍＭ ＮａＣｌを含むＰＢＳ）で希釈した。注射の３週間後に分析のためにマウスを安楽死させた。

遺伝子編集構築物

ＡＡＶ－ＳａＣａｓ９プラスミドは、これまでに記載された^１６。ＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型プラスミドを、３つの挿入を有するｐＺａｃ２．１ＡＡＶベクターのギブソンアセンブリによって生成した。ベクターを、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ及びＮｏｔＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）によって二重消化した。挿入片１（Ｕ６－ＧＦＰｇＲＮＡ）を、Ｕ６－ＧＦＰｇＲＮＡを含有するプラスミドからＰＣＲ増幅した。挿入２（ＢＦＰ）を、ｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）として合成したＢＦＰ配列からＰＣＲ増幅した。挿入３（ポリＡ）を、ＣＡＧ－ＧＦＰトランスジェニック動物のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＢＦＰ鋳型上の２塩基置換によって、カラースイッチ（緑色蛍光から青色蛍光）が可能となり、ＢｔｇＩ制限酵素によって検出可能な制限断片長多型（ＲＦＬＰ）が生成される。

衛星細胞の分離、培養及び分化

エクスビボ遺伝子編集用の衛星細胞を、これまでに記載された通りに単離した^１２。インビボ編集衛星細胞を単離するために、体の半分から三頭筋、腹部及び後肢の筋肉を採取し、ハサミを使用して細かく切り刻み、次いでＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中の０．２％コラゲナーゼＩＩ型及び０．０５％Ｄｉｓｐａｓｅを用いて３７℃で２ラウンドの消化に供した（１５分間、次いで１０分間）。ＦＢＳの添加によって酵素を不活性化し、細胞を遠心分離して７０ｕｍストレーナーに通して濾過してから、ＡＰＣ－Ｃｙ７－ＣＤ４５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：２００）、ＡＰＣ－Ｃｙ７－ＣＤ１１ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：２００）、ＡＰＣ－Ｃｙ７－ＴＥＲ１１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：２００）、ＡＰＣ－Ｓｃａ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：２００）、ＰＥ－ＣＤ２９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：１００）及びビオチン－ＣＤ１８４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：１００）を含有する抗体カクテルで３０分間染色した。一次抗体のインキュベーション後、細胞を染色培地（ＳＭ、ハンクス平衡塩類溶液＋２％血清）で洗浄し、次いでストレプトアビジンＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：２００）でさらに２０分間染色した。最後に、細胞をＳＭ中で２回洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有するＳＭ中に再懸濁させて、死細胞をマークした。衛星細胞を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、細胞のＰＩ組込みならびにＣＤ４５、Ｔｅｒ１１９、Ｓｃａ１及びＣＤ１１ｂ発現の欠如ならびにＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）及びβ１－インテグリン（ＣＤ２９）の陽性発現に基づいて選別したが、表面マーカープロファイルは、強力な筋原性能力によりＰａｘ７＋細胞を選択するために、複数の刊行物^{１２、１３、２０}で広く検証されている。別々に選別したＧＦＰ＋、ＢＦＰ＋、及びＧＦＰ－／ＢＦＰ－衛星細胞を、５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ）を毎日補充した増殖培地（Ｆ１０、２０％ウマ血清、１％Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ、及び１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ））中においてコラーゲンＩ型（１ｕｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）及びラミニン（１０ｕｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）コーティングプレート上で増殖させた。増殖細胞のサブセットからＤＮＡを単離し、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して採取し、ゲノムＰＣＲならびにそれに続くＲＦＬＰ及びシーケンシング分析に使用した。筋原性分化は、分化培地（ＤＭＥＭ、２％ウマ血清、１％Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ））に切り替えることによって開始し、３～４日間続いた。細胞を４％ＰＦＡによってイメージングのために２０分間固定した。

トランスフェクション

オスｍｄｘ；ＧＦＰ^＋／－動物から単離した衛星細胞を、毎日ｂＦＧＦを補充した増殖培地中において培養下で２～３週間増殖させ、次いでコラーゲン（１ｕｇ／ｍＬ）及びラミニン（１０ｕｇ／ｍＬ）でコーティングした２４ウェルプレート上に２０，０００細胞／ウェルで再播種した。筋芽細胞を、２日目にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、製造業者の指示に従って、対照群にはＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型プラスミドのみ、または実験群にはＡＡＶ－ＧＦＰｇＲＮＡ－ＢＦＰ鋳型及びＡＡＶ－ＳａＣａｓ９プラスミドを５：１の比で用いてトランスフェクトした（１群あたり３回の独立したトランスフェクション）。ＢＦＰ^＋及びＧＦＰ^＋細胞をトランスフェクションの５日後にＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩを使用して選別し、インビトロでさらに２週間増殖させた後に再選別して蛍光を確認した。次いで、再選別した細胞をインビトロ分化及びインビボ移植アッセイに使用した。

ｍｄｘ；ＧＦＰ^＋／－初代筋芽細胞中でＧＦＰ破壊を試験するために、細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみ（対照）で、または上記のようなＳａＣａｓ９及びＧＦＰｇＲＮＡ２（ＢＦＰ鋳型なし）を１：１の比でコードするプラスミドでトランスフェクトした。

ＧＦＰ標的化ｇＲＮＡのスクリーニングには、ｍｄｘ；ＧＦＰ^＋／－尾部線維芽細胞（ＴＴＦ）をＳａＣａｓ９のみ（対照）で、またはＳａＣａｓ９とＧＦＰを標的とする３つのｇＲＮＡのうち１つで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用し、製造業者の指示に従ってトランスフェクトした。

筋芽細胞移植

筋芽細胞移植の１日前に、２５μＬのＮａｊａ ｍｏｓｓａｍｂｉｃａ ｍｏｓｓａｍｂｉｃａ心臓毒（０．０３ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を麻酔したオスのｍｄｘレシピエントマウスの前脛骨筋（ＴＡ）に注射した。８００，０００ＧＦＰ^＋、８００，０００ＢＦＰ^＋筋芽細胞またはビヒクル（ＰＢＳ）のみを損傷前のＴＡ筋に注射した（Ｎ＝４のＴＡ筋）。注射したＴＡ筋を、凍結切片化及び蛍光検出のために移植の５週間後に採取した。

ゲノムＰＣＲ及びＲＦＬＰ分析

組織、衛星細胞及び増殖筋芽細胞からゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ／Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用し、製造プロトコールに従って抽出した。１～２μＬのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液を、Ｑ５ホットスタートポリメラーゼ（ＮＥＢ）による２５μＬのＰＣＲ反応物ごとに使用した。フォワードプライマーＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴＴＴＧＧＣ（配列番号：２１）（ＧＦＰ／ＢＦＰ開始部位の上流に結合する）及びリバースプライマーＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＧＴＣ（配列番号：２２）（Ｃａｓ９切断部位及びカラースイッチング置換の下流に結合する）を使用して、ゲノム導入遺伝子座を増幅したが、鋳型配列は増幅しなかった。ＲＦＬＰ分析では、ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ＢｔｇＩ（ＮＥＢ）で消化するか、または水で模擬消化してからＥ－Ｇｅｌ ＥＸ ２％アガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上でゲル電気泳動を行った。

サンガーシーケンシング及び次世代シーケンシング

精製したゲノムＰＣＲ産物を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＴＯＰＯ骨格にクローニングし、ＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。個々のクローンを、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡのＧｅｎｅｗｉｚによって実施された、細菌コロニーサンガーシーケンシングによって分析した。シーケンシング記録を、Ｇｅｎｅｉｏｕｓプログラムを使用してＧＦＰ導入遺伝子にアラインメントした。次世代シーケンシングでは、８塩基対（ｂｐ）のバーコードをゲノムＰＣＲプライマーに付加した。４～１０の一意的なバーコード付きＰＣＲ産物をプールし、ＰＣＲ精製してから、ＭＧＨ ＤＮＡ ｃｏｒｅでのＣＲＩＳＰＲシーケンシング（ワールドワイドウェブの／／ｄｎａｃｏｒｅ．ｍｇｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／で利用可能）により分析を行った。ＮＧＳの結果を、多重分離後にＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏプログラムを使用して分析した。代表的なＮＧＳ配列を示す。

切片化及び蛍光イメージング

組織を切離し、すぐに４％ＰＦＡ中において室温で９０分間固定し、次いでＰＢＳで洗浄して３０％スクロースに移し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、浸水させた組織をＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）内に包埋し、液体窒素浴中のイソペンタンで凍結した。Ｍｉｃｒｏｍ ＨＭ５５０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して組織を切片化し、製造業者の指示に従ってＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５－コムギ胚芽凝集素及びＴＯ－ＰＲＯ－３ヨウ化物（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。ＢＦＰ^＋、ＧＦＰ^－（ＢＦＰ^－も）及び全細胞の数を、ＩｍａｇｅＪによって手動で定量した。肝臓及び心臓では、視野ごとに約２００～３５０細胞を含む３つの代表的な視野を各組織について計数した。Ｐ２１注射ＴＡ切片では、合成した視野の画像（２５枚の２０倍画像）を、１画像あたり１０００個超の細胞で計数した。

統計分析

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０ソフトウェアを統計分析の実施に使用した。対応のない両側ｔ検定を図１Ｆ～１Ｇで実施した。Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを図３Ｂ～３Ｃ及び図１１Ｂ～１１Ｃで実施した。正確なｐ値及び自由度（ＤＦ）は、対応する図の説明文中に見出され得る。

参考文献

１．Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ，Ｌ．Ｓ．＆Ｇａｕｔｉｅｒ，Ｊ．Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｅｎｄ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ ｐａｔｈｗａｙ ｃｈｏｉｃｅ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ４５，２４７－２７１，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｇｅｎｅｔ－１１０４１０－１３２４３５（２０１１）．

２．Ｈｅｙｅｒ，Ｗ．Ｄ．，Ｅｈｍｓｅｎ，Ｋ．Ｔ．＆Ｌｉｕ，Ｊ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ４４，１１３－１３９，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｇｅｎｅｔ－０５１７１０－１５０９５５（２０１０）．

３．Ｉｓｈｉｚｕ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｖｉａ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｒｅｐａｉｒ ｉｎ Ｎｏｎ－ｄｉｖｉｄｉｎｇ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，９３６３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１７－０９７１６－ｘ（２０１７）．

４．Ｌｏｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＤＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５，１１８４－１１８８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５４４４５（２０１４）．

５．Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｊ．，Ｍｉｋｕｎｉ，Ｔ．＆Ｙａｓｕｄａ，Ｒ．Ｖｉｒｕｓ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｖｉａ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｒｅｐａｉｒ ｉｎ Ｍｉｔｏｔｉｃ ａｎｄ Ｐｏｓｔｍｉｔｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｂｒａｉｎ．Ｎｅｕｒｏｎ ９６，７５５－７６８ ｅ７５５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１７．１０．００４（２０１７）．

６．Ｙａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｄｕａｌ ＡＡＶ ｓｙｓｔｅｍ ｅｎａｂｌｅｓ ｔｈｅ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，３３４－３３８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３４６９（２０１６）．

７．Ｙｉｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，３２８－３３３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３４７１（２０１６）．

８．Ｗｒｉｇｈｔ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ／ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｃａｕｓｅｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ａｆｔｅｒ Ｍ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ．Ｂｌｏｏｄ ９７，２２７８－２２８５（２００１）．

９．Ｃｈｕ，Ｖ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，５４３－５４８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３１９８（２０１５）．

１０．Ｇｌａｓｅｒ，Ａ．，ＭｃＣｏｌｌ，Ｂ．＆Ｖａｄｏｌａｓ，Ｊ．ＧＦＰ ｔｏ ＢＦＰ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ：Ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ５，ｅ３３４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１６．４８（２０１６）．

１１．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．，Ｒａｙ，Ｇ．Ｊ．，ＤｅＷｉｔｔ，Ｍ．Ａ．，Ｃｕｒｉｅ，Ｇ．Ｌ．＆Ｃｏｒｎ，Ｊ．Ｅ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｎａｃｔｉｖｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｕｓｉｎｇ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，３３９－３４４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３４８１（２０１６）．

１２．Ｃｅｒｌｅｔｔｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｕｓｃｌｅｓ．Ｃｅｌｌ １３４，３７－４７（２００８）．

１３．Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｒ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈｉｎ ａｎｄ ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｃｅｌｌ １１９，５４３－５５４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００４．１０．０２１（２００４）．

１４．Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ，Ｃ．，Ｓｏｌｔｙｓ，Ｓ．，Ｒｅｎｇｏ，Ｇ．＆Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １－９ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｏｐｉｓｍ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６，１０７３－１０８０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２００８．７６（２００８）．

１５．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｖｅｒｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｐｉｇｌｅｔｓ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｈｉｇｈ－Ｄｏｓｅ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ ＳＭＮ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１８．０１５（２０１８）．

１６．Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，４０７－４１１，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５１７７（２０１６）．

１７．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，４０３－４０７，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５１４３（２０１６）．

１８．Ｌｏｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，４００－４０３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５７２５（２０１６）．

１９．Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８，１４４５４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４４５４（２０１７）．

２０．Ｍａｅｓｎｅｒ，Ｃ．Ｃ．，Ａｌｍａｄａ，Ａ．Ｅ．＆Ｗａｇｅｒｓ，Ａ．Ｊ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｓｏｌａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ．Ｓｋｅｌｅｔ Ｍｕｓｃｌｅ ６，３５，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３３９５－０１６－０１０６－６（２０１６）．

２１．Ａｌｋａｓｓ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎｏ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｎｕｍｂｅｒ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｅａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｅ．Ｃｅｌｌ １６３，１０２６－１０３６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．１０．０３５（２０１５）．

２２．Ｓｅｎｙｏ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｅａｒｔ ｒｅｎｅｗａｌ ｂｙ ｐｒｅ－ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４９３，４３３－４３６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１６８２（２０１３）．

２３．Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ａ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｏｓｔｎａｔａｌ Ｃａｒｄｉａｃ Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｗｉｔｈ ＡＡＶ９－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｓｈｏｒｔ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｍｏｓａｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ １２１，１１６８－１１８１，ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＲＥＳＡＨＡ．１１６．３１０３７０（２０１７）．

２４．Ｃａｉ，Ｃ．Ｌ．＆Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ，Ｊ．Ｄ．Ｔｈｅ Ｅｌｕｓｉｖｅ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ ｉｎ Ｃａｒｄｉａｃ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：Ｓｌｉｐ Ｓｌｉｄｉｎ’ Ａｗａｙ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ １２０，４００－４０６，ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＲＥＳＡＨＡ．１１６．３０９７１０（２０１７）．

２５．ＭｃＧｒｅｅｖｙ，Ｊ．Ｗ．，Ｈａｋｉｍ，Ｃ．Ｈ．，ＭｃＩｎｔｏｓｈ，Ｍ．Ａ．＆Ｄｕａｎ，Ｄ．Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ｆｒｏｍ ｂａｓｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｄｉｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ ８，１９５－２１３，ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｍｍ．０１８４２４（２０１５）．

２６．Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｂｅｌｌ，Ｐ．，ＭｃＭｅｎａｍｉｎ，Ｄ．＆Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｈｅｐａｔｉｃ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｍｉｃｅ ｂｙ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ８ ｖｅｃｔｏｒ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２３，５３３－５３９，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１１．１８３（２０１２）．

２７．Ｌｅｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １，８８９（２０１７）．

２８．Ｚｉｎｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｒａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｙｉｅｌｄｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １２，１０５６－１０６８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１５．０７．０１９（２０１５）．

Claims (26)

1. 対象におけるインビボでの出生後筋前駆細胞の相同組換え修復によるゲノム改変方法において使用するための、血清型８、１０またはＡｎｃ８０の１つ以上のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む組成物であって、前記１つ以上のＡＡＶが、
   ａ．前記出生後筋前駆細胞中で配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入し、
   ｂ．前記出生後筋前駆細胞中でドナー鋳型を形質導入し、
   前記方法が、出生後筋細胞を前記組成物と接触させることを含み、
   前記改変が、前記ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含む、前記組成物。
2. 前記１つ以上のＡＡＶが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列及びドナー鋳型を形質導入する第１ＡＡＶを含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記１つ以上のＡＡＶが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ＡＡＶと、ドナー鋳型を形質導入する第２ＡＡＶとを含む、請求項１に記載の組成物。
4. 前記１つ以上のＡＡＶが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ＡＡＶと、ドナー鋳型及び１つ以上のｇＲＮＡを形質導入する第２ＡＡＶとを含む、請求項１に記載の組成物。
5. 前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓヌクレアーゼ、またはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントである、請求項１～４に記載の組成物。
6. 前記ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項５に記載の組成物。
7. 配列標的化ヌクレアーゼをコードする前記核酸配列が、筋前駆細胞特異的プロモーター、構成的プロモーター、またはユビキタスプロモーターで形質導入される、請求項１～６に記載の組成物。
8. ドナー鋳型、及び場合により、１つ以上のｇＲＮＡをコードする前記核酸配列が、Ｕ６またはＨ１プロモーターで形質導入される、請求項１～７に記載の組成物。
9. 前記出生後筋前駆細胞が筋幹細胞である、請求項１～８に記載の組成物。
10. 前記対象における出生後筋前駆細胞の少なくとも１％が、前記ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含むように改変される、請求項１～９に記載の組成物。
11. 前記対象における出生後筋前駆細胞の少なくとも４０％が、前記ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含むように改変される、請求項１～９に記載の組成物。
12. 前記ウイルスが、ＡＡＶ血清型８である、請求項１～１１に記載の組成物。
13. 前記対象が若年者である、請求項１～１２に記載の組成物。
14. 前記対象に全身投与されるものである、請求項１～１３に記載の組成物。
15. 請求項１～１４に記載の組成物によって改変されたゲノムを有する筋核を含む、筋線維。
16. 対象におけるインビボでの出生後心臓細胞の相同組換え修復によるゲノム改変方法において使用するための、血清型８の１つ以上のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む組成物であって、前記１つ以上のＡＡＶが、
    ａ．前記出生後心臓細胞中で配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入し、
    ｂ．前記出生後心臓細胞中でドナー鋳型を形質導入し、
    前記方法が、前記出生後心臓細胞を前記組成物と接触させることを含み、
    前記改変が、前記ドナー鋳型のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の挿入を含み、前記出生後心臓細胞が、ＤＮＡを合成または複製することのできる出生後心臓細胞である、前記組成物。
17. 前記出生後心臓細胞が、分裂／増殖せずにＤＮＡ合成が可能な哺乳動物の有糸分裂後心筋細胞、分裂／増殖せずにＤＮＡ合成が可能なヒト有糸分裂後心筋細胞、心筋細胞前駆細胞、増殖間葉系心臓細胞、増殖内皮心臓細胞、及び心筋前駆細胞からなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
18. 前記対象が、乳児、若年者、または３０歳未満である、請求項１６～１７に記載の組成物。
19. 前記１つ以上のＡＡＶが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列及びドナー鋳型を形質導入する第１ＡＡＶを含む、請求項１６～１８に記載の組成物。
20. 前記１つ以上のＡＡＶが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ＡＡＶと、ドナー鋳型を形質導入する第２ＡＡＶとを含む、請求項１６～１９に記載の組成物。
21. 前記１つ以上のＡＡＶが、配列標的化ヌクレアーゼをコードする核酸配列を形質導入する第１ＡＡＶと、ドナー鋳型及び１つ以上のｇＲＮＡを形質導入する第２ＡＡＶとを含む、請求項１６～１９に記載の組成物。
22. 前記配列標的化ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓヌクレアーゼ、またはそれらの機能的断片である、請求項１６～２１に記載の組成物。
23. 前記ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項２２に記載の組成物。
24. 配列標的化ヌクレアーゼをコードする前記核酸配列が、心臓特異的プロモーター、ユビキタスプロモーター、または非特異的プロモーターで形質導入される、請求項１６～２３に記載の組成物。
25. 前記対象における前記心筋細胞の少なくとも１．６％が改変される、請求項１７、および、請求項１７を直接または間接的に引用する場合の請求項１８～２４に記載の組成物。
26. 請求項１６～２５に記載の組成物によって改変された心筋細胞を含む、出生後心臓組織。