JP2024517939A

JP2024517939A - 編集タンパク質の発現のための方法および組成物

Info

Publication number: JP2024517939A
Application number: JP2023569888A
Authority: JP
Inventors: ルーカスクリストフバックマン，; サミュエルローレンスパフ，
Original assignee: ソークインスティテュートフォーバイオロジカルスタディーズ
Priority date: 2021-05-14
Filing date: 2022-05-16
Publication date: 2024-04-23
Also published as: EP4341419A1; WO2022241316A1

Abstract

ＲＮＡ分子を使用するための方法を含めた、ＲＮＡ分子を再構成するための組成物および系が本明細書で提供される。例えば、そのような分子を使用して、タンパク質コード配列を２つまたはそれよりも多くのウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を通じて送達し、それにより、細胞における全長タンパク質の再構成をもたらすことができる。そのような方法を使用して、核酸分子の編集に関与するタンパク質を送達する、例えば、遺伝子疾患またはがんを処置することができる。

Description

関連出願との相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年５月１４日出願の米国特許仮出願第６３／１８９，０４８号の優先権を主張するものである。

分野
本開示は、２つまたはそれよりも多くのＲＮＡ分子の結合を可能にし、それにより、遺伝子編集に関与するタンパク質、例えばＣａｓヌクレアーゼまたは触媒として不活性な形態のＣａｓヌクレアーゼ、などの全長タンパク質の発現を可能にする系、キット、組成物、および方法を提供する。

背景
遺伝子療法は、機能喪失型変異によって引き起こされる遺伝子疾患を処置するための有望な方法である。一般には置換遺伝子がＡＡＶなどのベクターを使用して標的細胞に再導入され、これはこのウイルスが細胞への進入に関して一般に安全かつ効率的であるからである。しかし、ＡＡＶの場合では、従来のカプシドを使用して約５０００ヌクレオチドよりも多くを封入することが難しい。大きなタンパク質をコードする遺伝子の長さは多くの場合にＡＡＶのパッケージングに関する制約を超え、多くの遺伝子疾患は依然として処置不可能なままである。この制限を克服するための戦略がこれまで探究されてきたが、非効率的であることが判明したか、潜在的に毒性がある短縮されたタンパク質の高レベルの発現がもたらされたか、またはその両方である。疾患を処置するために大きなタンパク質を送達するための安全な高効率の戦略が必要とされている。

概要
標的タンパク質、例えば、核酸配列（例えば、遺伝子などの標的ＤＮＡまたはＲＮＡ）を編集するために使用されるタンパク質を発現させるための組成物が本明細書で提供される。同じ細胞に個別に導入された２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子から産生される核酸編集タンパク質を発現させるための組成物および方法が包含される。この戦略を使用することで、全長核酸編集タンパク質および１つまたは複数のガイドＲＮＡを同じ細胞に提供し、それにより、標的化核酸編集をもたらすことができる。細胞は、例えば必須遺伝子の変異を修復するために標的化核酸編集を必要とするものであり得る。一実施例では、組成物は（ａ）第１のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）核酸編集タンパク質のＮ末端部分のコード配列；（ｉｉ）スプライスドナー；および（ｉｉｉ）第１の二量体形成ドメインを含む、第１のＲＮＡ分子；ならびに（ｂ）第２のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；（ｉｉ）分岐点配列；（ｉｉｉ）ポリピリミジントラクト；（ｉｖ）スプライスアクセプター；および（ｖ）核酸編集タンパク質のＣ末端部分のコード配列を含む、第２のＲＮＡ分子を含む。一部の実施例では、そのような組成物は、（ｃ）第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第３のＲＮＡ分子であって、少なくとも１つの第１のｇＲＮＡが、核酸編集タンパク質を第１の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第３のＲＮＡ分子；（ｄ）（ｉ）核酸編集タンパク質を第１の核酸分子上の同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第２のｇＲＮＡ、もしくは（ｉｉ）核酸編集タンパク質を第２の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第２のｇＲＮＡを含む、第４のＲＮＡ分子；（ｅ）（ｉ）核酸編集タンパク質を第１の核酸分子上の第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、（ｉｉ）核酸編集タンパク質を第２の核酸分子上の第２のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、もしくは（ｉｉｉ）核酸編集タンパク質を第３の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第３の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｇＲＮＡを含む、第５のＲＮＡ分子；ならびに／または、（ｆ）（ｉ）核酸編集タンパク質を第１の核酸分子上の第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、および第３のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、（ｉｉ）核酸編集タンパク質を第２の核酸分子上の第２のｇＲＮＡおよび第３のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）核酸編集タンパク質を第３の標的核酸分子上の第３のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第３の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、もしくは（ｉｖ）核酸編集タンパク質を第４の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第４の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡを含む、第６のＲＮＡ分子、のうちの１つまたは複数をさらに含む。

一実施例では、組成物は（ａ）第１のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）核酸編集タンパク質のＮ末端部分のコード配列；（ｉｉ）スプライスドナー；および（ｉｉｉ）第１の二量体形成ドメインを含む、第１のＲＮＡ分子；ならびに（ｂ）第２のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；（ｉｉ）分岐点配列；（ｉｉｉ）ポリピリミジントラクト；（ｉｖ）スプライスアクセプター；および（ｖ）核酸編集タンパク質のＣ末端部分のコード配列を含む、第２のＲＮＡ分子を含む。一部の実施例では、そのような組成物は、（ｃ）それぞれ第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第１のｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および少なくとも１つの第１のｔｒａｃｒＲＮＡを含み、少なくとも１つの第１のｃｒＲＮＡおよび少なくとも１つの第１のｔｒａｃｒＲＮＡが、核酸編集タンパク質を第１の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第３のＲＮＡ分子および第４のＲＮＡ分子；（ｄ）（ｉ）それぞれ第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第２のｃｒＲＮＡおよび少なくとも１つの第２のｔｒａｃｒＲＮＡを含み、少なくとも１つの第２のｃｒＲＮＡおよび少なくとも１つの第２のｔｒａｃｒＲＮＡが、核酸編集タンパク質を第１の核酸分子上の第１のｃｒＲＮＡおよび第１のｔｒａｃｒＲＮＡおよび第２のｃｒＲＮＡ、および第２のｔｒａｃｒＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付けるか、もしくは（ｉｉ）第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第２のｃｒＲＮＡを含み、少なくとも１つの第２のｃｒＲＮＡおよび少なくとも１つの第２のｔｒａｃｒＲＮＡが、核酸編集タンパク質を第２の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第５のＲＮＡ分子および第６のＲＮＡ分子；（ｅ）（ｉ）それぞれ第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｃＲＮＡおよび少なくとも１つの第３のｔｒａｃｒＲＮＡを含み、少なくとも１つの第３のｃｒＲＮＡおよび少なくとも１つの第３のｔｒａｃｒＲＮＡが、核酸編集タンパク質を第１の核酸分子上の第１のｃｒＲＮＡおよび第１のｔｒａｃｒＲＮＡおよび第２のｃｒＲＮＡおよび第２のｔｒａｃｒＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付けるか、（ｉｉ）第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｃＲＮＡを含み、少なくとも１つの第３のｃｒＲＮＡおよび少なくとも１つの第３のｔｒａｃｒＲＮＡが、核酸編集タンパク質を第２の核酸分子上の第２のｃｒＲＮＡおよび第２のｔｒａｃｒＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付けるか、もしくは（ｉｉｉ）第３の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｃＲＮＡを含み、少なくとも１つの第３のｃｒＲＮＡおよび少なくとも１つの第３のｔｒａｃｒＲＮＡが、核酸編集タンパク質を第３の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第７のＲＮＡ分子および第８のＲＮＡ分子；ならびに／または（ｆ）（ｉ）それぞれ第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｃｒＲＮＡ、および少なくとも１つの第４のｔｒａｃｒＲＮＡを含み、少なくとも１つの第４のｃｒＲＮＡおよび少なくとも１つの第４のｔｒａｃｒＲＮＡが、核酸編集タンパク質を第１の核酸分子上の第１のｃｒＲＮＡおよび第１のｔｒａｃｒＲＮＡ、第２のｃｒＲＮＡおよび第２のｔｒａｃｒＲＮＡ、および第３のｃｒＲＮＡおよび第３のｔｒａｃｒＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付けるか、（ｉｉ）第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｃｒＲＮＡを含み、少なくとも１つの第４のｃｒＲＮＡおよび少なくとも１つの第４のｔｒａｃｒＲＮＡが、核酸編集タンパク質を第２の核酸分子上の第２のｃｒＲＮＡおよび第２のｔｒａｃｒＲＮＡ、および第３のｃｒＲＮＡおよび第３のｔｒａｃｒＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付けるか、（ｉｉｉ）第３の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｃｒＲＮＡを含み、少なくとも１つの第４のｃｒＲＮＡおよび少なくとも１つの第４のｔｒａｃｒＲＮＡが、核酸編集タンパク質を第３の標的核酸分子上の第３のｃｒＲＮＡおよび第３のｔｒａｃｒＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付けるか、もしくは（ｉｖ）第４の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｃｒＲＮＡを含み、少なくとも１つの第４のｃｒＲＮＡおよび少なくとも１つの第４のｔｒａｃｒＲＮＡが、核酸編集タンパク質を第４の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第９のＲＮＡ分子および第１０のＲＮＡ分子のうちの１つまたは複数をさらに含む。

一部の実施例では、第１の二量体形成ドメインと第２の二量体形成ドメインは、直接結合、間接結合、または両方によって結合している。

一部の実施例では、二量体形成ドメインは、キッシングループドメインまたは低多様性（ｈｙｐｏｄｉｖｅｒｓｅ）ドメインである。

一部の実施例では、第１のＲＮＡ分子および／または第２のＲＮＡ分子は、少なくとも１つのスプライスエンハンサーを含む。

標的タンパク質を発現させるための組成物も提供される。そのような組成物は（ｉ）（ａ）のＲＮＡ分子および（ｃ）のＲＮＡ分子、または（ａ）のＲＮＡ分子（ｃ）のＲＮＡ分子および（ｄ）のＲＮＡ分子をコードする第１の合成ＤＮＡ分子；ならびに（ｉｉ）（ｂ）のＲＮＡ分子および（ｅ）のＲＮＡ分子、または（ｂ）のＲＮＡ分子、（ｅ）のＲＮＡ分子および（ｆ）のＲＮＡ分子をコードする第２の合成ＤＮＡ分子を含み得る。一部の実施例では、第１の合成ＤＮＡ分子は（ｉ）第１のＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第１のプロモーター；および（ｂ）第２のＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第２のプロモーターを含む。

記載の組成物を含む、核酸編集タンパク質を発現させるための系も提供される。

本明細書に開示される系または系によってコードされるＲＮＡを例えば標的核酸分子とハイブリダイズする妥当なガイド核酸分子と組み合わせて使用して、細胞において核酸編集タンパク質を発現させる方法も提供される。そのような方法は、系を細胞に導入するステップと、第１の合成ＲＮＡ分子および第２の合成ＲＮＡ分子を同じ細胞において発現させるステップとを含み得る。一部の実施例では、細胞は対象内に存在し、方法により、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、遺伝子）の変異によって引き起こされる遺伝子疾患などの、対象における疾患が処置される。一部の実施例では、遺伝子疾患は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、血友病Ａ、スタルガルト病、またはアッシャー症候群である。

添付図を参照しながら進める以下の詳細な説明から本明細書に開示される前述のおよび他の目的および特色がより明白になる。

本特許または出願のファイルは、カラーで製作された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面（複数可）を伴う本特許または特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払えば、特許庁により提供される。

図１Ａは、ベクター設計（左）ならびにＲＮＡ相互作用およびスプライシング（右）の概略図を示す。左：５’トランススプライス（ｔｒｓｐ）ＤＮＡベクター：白抜きの矢印は２つの反対方向のプロモーターである。ＲＦＰをコードするドメインおよびポリアデニル化エレメントを伴う３’ＵＴＲは、ＹＦＰのＮ末端部分（ｎ－ｙｆｐ）、続いて、スプライスドナー配列（ＳＤ）、下流イントロンスプライシングエンハンサー（ＤＩＳＥ）、および２つのイントロンスプライシングエンハンサー（２×ＩＳＥ）、結合ドメイン（ＢＤ、二量体形成ドメインとも称される）、および安定なステムループボックスＢエレメント（ボックスＢ）、自己切断性ハンマーヘッド型リボザイム（ＨＨｒｚ）、最後にポリアデニル化エレメントを含有する３’ＵＴＲから反対方向に発現される。ｎ－ｙｆｐセグメントには小さなイントロンが挿入されている（ｎ－ｙｆｐ内の白色のセグメント）。３’ｔｒｓｐＤＮＡベクター：白抜きの矢印は２つの反対方向のプロモーターである。ＢＦＰをコードするドメインおよびポリアデニル化エレメントを伴う３’ＵＴＲは、相補的結合ドメイン（抗ＢＤ、二量体形成ドメインとも称される）、続いて、３つのイントロンスプライシングエンハンサー配列（３×ＩＳＥ）、分岐点（ＢＰ）、ポリピリミジントラクト（ＰＰＴ）、スプライスアクセプター配列（ＳＡ）、ＹＦＰコード配列のＣ末端部分（c-terminal proton）、最後にポリアデニル化エレメントを含有する３’ＵＴＲから反対方向に発現される。右：ＹＦＰタンパク質をコードするｍＲＮＡが生成されるプレｍＲＮＡ相互作用（５’ｔｒｓｐ－ＲＮＡ＋３’ｔｒｓｐ－ＲＮＡ）およびトランス－スプライシングが示されている。

図１Ｂは、Ｎ末端発現プラスミドのみのトランスフェクションではＹＦＰ蛍光がもたらされないことを示す。

図１Ｃは、Ｃ末端発現プラスミドのみのトランスフェクションではＹＦＰ蛍光がもたらされないことを示す。

図１Ｄは、結合ドメインを有さないＮ末端断片およびＣ末端断片の発現では、低レベルのＹＦＰ誘導が示されることを示す。

図１Ｅは、ループ状構成の合理的に設計された二量体形成／結合ドメイン（二本鎖ステム構造を形成する相補配列によって中断された、全てピリミジンからなるかまたは全てプリンからなる低多様性配列）を示す。

図１Ｆは、「ループ状」二量体形成ドメイン構成の３Ｄレンダリングを示す。

図１Ｇは、Ｃ末端側半分に結合ドメインを有さない陰性対照を示す。

図１Ｈは、Ｎ末端側半分に結合ドメインを有さない陰性対照を示す。

図１Ｉは、Ｎ末端側半分およびＣ末端側半分の両方におけるループ状構成のマッチする結合ドメインにより、細胞の９０％において強力なＹＦＰ誘導が示されることを示す。

図１Ｊ～１Ｎは、完全に開いた構成をもたらす配列を含有する排他的にピリミジン（またはその代わりに排他的にプリン）で構成される１５０ヌクレオチドの低多様性配列を有する結合ドメインの構成についての図１Ｅ～１Ｉにおけるものと等価のデータを表す。

図１Ｊは、相補的な（complimentary）塩基対合のための完全に開いた構成を
もたらす１５０ヌクレオチドの低多様性ピリミジン配列を示す。

図１Ｋは、（１Ｊ）の１５０ヌクレオチドの低多様性ピリミジン配列の３Ｄレンダリングを示す。

図１Ｌは、相補的な低多様性結合ドメインを欠く、Ｃ末端ＹＦＰをコードする構築物を用いた対照ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションを示す。ＹＦＰを発現するトランスフェクトされた細胞はわずかである。

図１Ｍは、相補的な低多様性結合ドメインを欠く、Ｎ末端ＹＦＰをコードする構築物を用いた対照ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションを示す。ＹＦＰを発現するトランスフェクトされた細胞はわずかである。

図１Ｎは、どちらも相補的な低多様性の二量体形成結合ドメインを有するＮ末端ＹＦＰ構築物およびＣ末端ＹＦＰ構築物を用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションを示す。多くの細胞がＹＦＰを高レベルで発現する。

図１Ｏは、図１Ｇに示されている細胞についての代表的な蛍光画像を示す。トランスフェクションについての陽性マーカー（ＲＦＰ＋ＢＦＰ）は発現されるが、ＹＦＰタンパク質は効率的には再構成されない。

図１Ｐは、図１Ｌに示されている細胞についての代表的な蛍光画像を示す。トランスフェクションについての陽性マーカー（ＲＦＰ＋ＢＦＰ）が発現され、ＲＦＰおよびＢＦＰダブルポジティブである細胞においてＹＦＰタンパク質が高レベルで再構成される。

図１Ｑは、図１Ｄ、図１Ｇ～１Ｉ、および図１Ｌ～１Ｎに示されている条件の比較を示す。Ｎ：結合ドメインなし、ループ：ループ状低多様性結合ドメイン構成、Ｌｉｎ：直鎖状低多様性構成。

図２Ａは、ベクター設計の概略図を示す。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のタンパク質コード配列はＮ末端、中間断片（ｍ－ｙｆｐ）およびＣ末端断片に分割される。ｎ断片をコードするＲＮＡとｍ断片をコードするＲＮＡの結合部がループ状設計の結合ドメイン（ＢＤ１）によって結合し、ｍ断片とｃ断片の結合部がループ状結合ドメイン（ＢＤ２）によって結合する。ピリミジン（Ｙ）配列およびプリン（Ｒ）配列は、ｍ断片の自己環状化が回避され、また、Ｎ断片とＣ断片の直接の組換えが回避されるように配置される。Ｎ末端断片をトランスフェクション対照として赤色蛍光タンパク質と共発現させ、Ｃ末端断片をトランスフェクション対照として青色蛍光タンパク質と共発現させる。プロモーター配列が白抜きの矢印で示されている。スプライスドナー（ＳＤ）部位およびスプライスアクセプター（ＳＡ）部位が示されている。図１ＡにおけるＳＡの上流（５’側）およびＳＤの下流（３’側）に使用したものと類似したスプライスエンハンサー、ポリピリミジントラクトおよび分岐点を含むイントロンスプライシングエレメントを含める。

図２Ｂは、プラスミドＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩ（図２Ａを参照されたい）のヒト細胞株へのトランスフェクションにより、トランスフェクトされた細胞の８０％において高レベルのＹＦＰ発現が効率的に再構成されることを示す。

図２Ｃは、ｙｆｐ蛍光が示されない、ｎ断片およびｍ断片（プラスミドＩ＋ＩＩ、図２Ａを参照されたい）の発現（陰性対照）の代表的な蛍光画像を示す。

図２Ｄは、ｙｆｐ蛍光が示されない、ｍ断片およびｃ断片（プラスミドＩＩ＋ＩＩＩ、図２Ａを参照されたい）の発現（陰性対照）の代表的な蛍光画像を示す。

図２Ｅは、３つの断片全て（プラスミドＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、図２Ａを参照されたい）の共トランスフェクションによって強力なＹＦＰ蛍光が誘導されることを示す代表的な蛍光画像を示す。

図３Ａ～３Ｄは、マウス新生仔（Ｐ３）への全身投与後に２つのＡＡＶ２／８から発現された２つの断片（配列番号１および２）からの黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）の効率的な再構成を表す。（Ａ）ＹＦＰのＮ末端側半分の断片をコードするＡＡＶ１、およびＣ末端側半分の断片をコードするＡＡＶ２を示す。ＡＡＶ１＋ＡＡＶ２を等しい力価で混合し、マウスに静脈内注射した。注射の３週間後に組織試料を採取した。（Ｂ）屠殺時点の若齢マウスの肝臓におけるＹＦＰ蛍光を示す（緑色）。注射していない肝臓が比較のために示されている（対照：ＹＦＰは検出されなかった）。コンテキストとしてＤＲＡＱ５核染色が赤紫色で示されている。（Ｃ）屠殺時点の心筋における強力なＹＦＰ蛍光（緑色）を示す。上のパネルは、肉眼で見える像およびコンテキストとして赤色自家蛍光（赤紫色）を示す。下のパネルは、コンテキストとしてＤＲＡＱ５核染色を用いた断面（赤紫色）を示す。ＹＦＰを欠く、注射していないマウス心臓が対照として示されている。（Ｄ）屠殺時点の肢の骨格筋における強力なＹＦＰ蛍光を示す。比較として注射していないマウス肢が示されている（陰性対照、ＹＦＰは検出されなかった）。上のパネルは、赤紫色の赤色自家蛍光を伴う肉眼で見える像を示す。下のパネルは、肢を通した断面の顕微鏡レベルの画像を示す。下のパネルは、コンテキストとして赤紫色のＤＲＡＱ５核染色を示す。

図４Ａ～４Ｂは、マウス新生仔（Ｐ３）における、３つのＡＡＶ２／８を筋肉内注射した後のマウス前脛骨筋における３つの断片（それぞれ配列番号１４５、１４６および２）からの黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）の効率的な再構成を表す。（Ａ）ＹＦＰのＮ末端断片、Ｍ断片、およびＣ末端断片を別々に有する３つのＡＡＶ粒子の概略図を示す（図２Ａと類似）。（Ｂ）３つのウイルス粒子全てを注射したマウスの前脛骨筋の縦断面における強力なＹＦＰ蛍光を示す。コンテキストとしてＤＲＡＱ５核染色が赤紫色で示されている。

図５Ａ～５Ｆは、成体マウス前脛骨筋における２つの断片からおよび３つの断片からの黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）の効率的な再構成を表す。（Ａ）合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメインを備えたＹＦＰコード配列のＮ末端側半分およびＣ末端側半分を示す。（Ｂ）これらの２つの断片を発現する２つのＡＡＶ移入プラスミドを成体マウス前脛骨（ＴＡ）筋に経皮的に電気穿孔により導入し、電気穿孔の５日後に強力な蛍光が検出されたことを示す。（Ｃ）反対側の注射していないＴＡでは蛍光は検出可能でなかったことを示す。（Ｄ）合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメインを備えたＹＦＰコード配列のＮ末端、中間、およびＣ末端を示し、各断片がそれに隣接する断片と連結する。（Ｅ）これらの３つの断片を発現する３つのＡＡＶ移入プラスミドの経皮的な電気穿孔を示す。３つの断片からのＹＦＰの効率的な再構成を示す強力なＹＦＰ蛍光が検出される。（Ｆ）反対側の注射していないＴＡにおける蛍光を示す。コンテキストとして蛍光チャネルがグレースケール写真に重ね合わせられている。

図６Ａは、２つの核酸分子１１０、１５０を使用する、本明細書に開示されるＲＮＡ組換え方法のための例示的な系であって、標的タンパク質が２つの部分に分けられ、各部分が異なる核酸分子によってコードされている、系を提示する概略図である。一部の実施例では、系の核酸分子１１０、１５０はＤＮＡであり、プロモーター１１２、１５２を含む。一部の実施例では、系の核酸分子１１０、１５０はＲＮＡであり、したがって、プロモーター１１２、１５２を欠く。図面は一定の縮尺ではない。

図６Ｂは、ステムを形成し得る配列が散在する低多様性配列を含み、それにより、シュードノット形成の非存在下で開いており、塩基対合に利用可能な局所的なＲＮＡループがもたらされる、例示的な二量体形成ドメイン（例えば、図６Ａの１２２、１５４）を提示する概略図である。図面は一定の縮尺ではない。

図６Ｃは、分子１１０のプレｍＲＮＡ二量体形成ドメイン１２２（図６Ａ）と分子１５０のプレｍＲＮＡ二量体形成ドメイン１５４（図６Ａ）の相互作用およびハイブリダイゼーション（塩基対合）により、スプライソソーム成分によるＮ末端コード配列１１４およびＣ末端コード配列１６４の組換えが可能になることを示す概略図である。これにより、融合したＮ末端タンパク質コード配列１１４の３’末端とＣ末端タンパク質配列１６４の５’末端、およびＮ末端部分とＣ末端部分の間のシームレス結合部がもたらされる。図面は一定の縮尺ではない。

図６Ｄは、３つの核酸分子１１０、２００、１５０を使用する本明細書に開示されるＲＮＡ組換え方法のための例示的な系であって、標的タンパク質が３つの部分（Ｎ末端、中間、Ｃ末端）に分けられ、各部分が異なる核酸分子によってコードされている、系を提示する概略図である。転写前は、系の核酸分子１１０、１５０、２００はＤＮＡであり、プロモーター１１２、１５２、２０２を含む。転写後は、系の核酸分子１１０、１５０、２００はＲＮＡであり、したがって、プロモーター１１２、１５２、２０２を欠く。図面は一定の縮尺ではない。

図６Ｅは、分子１１０の二量体形成ドメイン１２２（図６Ｄ）と分子２００の二量体形成ドメイン２０４（図６Ｄ）の相互作用およびハイブリダイゼーション（塩基対合）、ならびに分子２００の二量体形成ドメイン２２６（図６Ｄ）と分子１５０の二量体形成ドメイン１５４（図６Ｄ）の相互作用およびハイブリダイゼーション（塩基対合）により、スプライソソーム成分によるＮ末端コード配列１１４、中間コード配列２１６、およびＣ末端コード配列１６４の組換えが可能になることを示す概略図である。これにより、融合したＮ末端コード配列１１４の３’末端と中間タンパク質配列２１６の５’末端、ならびに融合した中間コード配列２１６の３’末端とＣ末端配列２１６の５’末端、ならびにＮ末端部分、中間部分、およびＣ末端部分の間のシームレス結合部がもたらされる。一部の実施例では、例えば、転写後には、示されているエレメントはＲＮＡである。図面は一定の縮尺ではない。

図６Ｆは、２つの核酸分子１１０、１５０を使用する、本明細書に開示されるＲＮＡ組換え方法のための例示的な系であって、標的タンパク質が２つの部分に分けられ、各部分が異なる核酸分子によってコードされている、系を提示する概略図である。この例では、ＤＮＡがＲＮＡに転写されており、したがって、系の核酸分子１１０、１５０はＲＮＡであり、したがって、ＤＮＡには存在するプロモーター１１２、１５２を欠く（図６Ａを参照されたい）。図面は一定の縮尺ではない。

図６Ｇは、２つのＤＮＡ分子１１０、１５０を使用する、本明細書に開示されるＲＮＡ組換え方法のための例示的な組成物または系であって、核酸編集タンパク質が２つの部分１１４、１６４に分けられ、各部分がそれぞれ異なるＤＮＡ分子１１０、１５０によってコードされている、組成物または系を提示する概略図である。一部の実施例では、プロモーター１１２、１５２により各コード配列１１４、１６４の発現を駆動する。この例の系は、１つまたは複数の標的核酸分子に特異的な１つまたは複数のガイド核酸分子（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡコード配列）１４０、１４１、１７１、１７２を含む。しかし、そのようなガイド核酸分子１４０、１４１、１７１、１７２は必要に応じたものであり、一部の実施例では、分子１１０、１５０の一部として提供される代わりに、別々に、例えば別々のベクターの一部として提供される。この例では、核酸分子１１０、１５０の５’末端および３’末端の付近に必要に応じたガイド核酸分子１４０、１４１、１７１、１７２が示されているが、本開示はそのような位置に限定されない。１つまたは複数のガイド核酸分子１４０、１４１、１７１、１７２が存在する場合、それらの発現をプロモーター１４２、１４３、１７３、１７４によって駆動することができる。系は、分子１１０、１５０の各５’末端および３’末端にパルボウイルス末端逆位反復配列（ＩＴＲ）１７６、１７７、１７８、１７９を必要に応じて含み得る。この図は、分子１１０、１５０がＤＮＡである実施形態を示すものであるが、一部の実施例では（例えば、転写後）、系の核酸分子１１０、１５０はＲＮＡであり、したがって、ガイド核酸分子１４０、１４１、１７１、１７２、プロモーター１１２、１５２、１４２、１４３、１７３、１７４およびパルボウイルスＩＴＲ１７６、１７７、１７８、１７９を欠く。図面は一定の縮尺ではない。

図６Ｈは、３つのＤＮＡ分子１１０、２００、１５０を使用する本明細書に開示されるＲＮＡ組換え方法のための例示的な系または組成物であって、核酸編集タンパク質が３つの部分（Ｎ末端、中間、Ｃ末端、それぞれ１１４、２１６、１５４）に分けられ、各部分がそれぞれ異なる核酸分子１１０、２００、１５０によってコードされている、系または組成物を提示する概略図である。一部の実施例では、プロモーター１１２、２０２、１５２により各コード配列１１４、２１６、１６４の発現を駆動する。この例の系は、１つまたは複数の標的核酸分子に特異的な１つまたは複数のガイド核酸分子（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡコード配列）１４０、１４１、２３１、２３２、１７１、１７２を含む。しかし、そのようなガイド核酸分子１４０、１４１、２３１、２３２、１７１、１７２は必要に応じたものであり、一部の実施例では、分子１１０、２００、１５０の一部として提供される代わりに、別々に、例えば、別々のベクターの一部として提供される。この例は、核酸分子１１０、２００、１５０の５’末端および３’末端の付近の必要に応じたガイド核酸分子１４０、１４１、２３１、２３２、１７１、１７２を示すものであるが、本開示はそのような位置に限定されない。１つまたは複数のガイド核酸分子１４０、１４１、２３１、２３２、１７１、１７２が存在する場合、それらの発現は、プロモーター１４２、１４３、２３３、２３４、１７３、１７４によって駆動することができる。系は、分子１１０、２００、１５０の各５’末端および３’末端にパルボウイルス末端逆位反復配列（ＩＴＲ）１７６、１７７、２３５、２３６、１７８、１７９を必要に応じて含み得る。この図は、系の分子１１０、１５０、２００がＤＮＡである実施形態を示すものであるが、転写後は、系の核酸分子１１０、１５０、２００はＲＮＡになり、したがって、ガイド核酸分子１４０、１４１、１７１、１７２、３２１、２３２、プロモーター１１２、１５２、２０２、１４２、１４３、２３３、２３４、１７３、１７４およびパルボウイルスＩＴＲ１７６、１７７、２３５、２３６、１７８、１７９を欠く。図面は一定の縮尺ではない。

図７Ａは、本明細書に開示されるＲＮＡ組換え方法のための例示的な系であって、図６Ａと同様に２つの核酸分子５００、６００を使用するが、二量体形成ドメインが、同じ標的分子７００を認識するアプタマー５１２、６０２である、系を提示する概略図である。一部の実施例では、例えば、転写後には、示されているエレメントはＲＮＡである。図面は一定の縮尺ではない。

図７Ｂは、本明細書に開示されるＲＮＡ組換え方法のための例示的な系であって、図７Ａに関連し、同じ標的分子を認識する二量体形成ドメインを使用する、系を提示する概略図である。ここで、二量体形成ドメインによって認識される標的は、特定のＲＮＡ分子である（図７Ａの分子７００、例えば、タンパク質または小分子の代わりに）。各ドメインは、例えば、がん特異的転写物などの、標的細胞（すなわち、標的タンパク質の発現が望まれる細胞）においてのみ発現されるｍＲＮＡ分子の異なる部分を認識する。一部の実施例では、例えば、転写後には、示されているエレメントはＲＮＡである。図面は一定の縮尺ではない。

図７Ｃは、図６Ａおよび７Ａと同様に２つの核酸分子８００、９００を使用する、本明細書に開示されるＲＮＡ組換え方法のための例示的な系を提示する概略図であり、二量体形成ドメイン８１２、９０２が、二量体形成ドメインが互いに相互作用することを妨げ、したがって、Ｎ末端コード配列８０２とＣ末端コード配列９１４の組換えを妨げるかまたは低減するオリゴヌクレオチド１０００とハイブリダイズしていることを示す。一部の実施例では、例えば、転写後には、示されているエレメントはＲＮＡである。図面は一定の縮尺ではない。

図８は、３’非翻訳領域内のＷＰＲＥ３配列の存在下（ｗ／）または非存在下（ｗ／ｏ）でのＹＦＰタンパク質の発現の再構成を比較した棒グラフである。試料当たりＮ＝３の反復実験が示されている。

図９Ａは、高親和性の二量体形成のためのキッシングループ相互作用を含む二量体形成ドメイン（例えば、図６Ａの１２２、１５４）の使用の例を提示する概略図である。本明細書に提示される教示を使用すれば、本明細書に開示されるコード部分のいずれか（例えば、ＹＦＰ）を他の標的タンパク質コード配列で置き換えることができることが理解されよう。図面は一定の縮尺ではない。

図９Ｂは、分割されたＹＦＰの半分の両方をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＲＦＰ、ＢＦＰ、およびＹＦＰシグナルを示す。低多様性設計原理と接着した直鎖状二量体形成ドメインまたはキッシングループ－ループ相互作用のために設計された構造化された二量体形成ドメインのいずれかが備わっている。強力な黄色蛍光シグナルにより効率的な再構成が示される。

図１０Ａ～１０Ｚは、系および方法と共に使用することができる例示的な合成核酸分子である。一部の実施例では、合成核酸分子は、配列番号１（図１０Ａ～１０Ｂ）、２（図１０Ｃ～１０Ｅ）、７（図１０Ｅ）、８（図１０Ｆ）、９（図１０Ｇ）、１０（図１０Ｈ）、１１（図１０Ｉ）、１２（図１０Ｊ）、１３（図１０Ｋ）、１４（図１０Ｌ）、１５（図１０Ｍ）、１６（図１０Ｎ）、１７（図１０Ｏ）、１８（図１０Ｐ）、１９（図１０Ｑ）、２０（図１０Ｒ～１０Ｕ）、および２１（図１０Ｖ～１０Ｚ）のうちのいずれか１つの配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する（as）が、異なる標的タンパク質コード配列を有する。したがって、本明細書に提示される系または方法のいずれかと共に使用されるイントロン領域は、配列番号１、２、３、４、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１のイントロン配列のいずれかに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有し得る。例えば、図１０Ａ～Ｄは、全長ＹＦＰを発現させるために使用することができる例示的な（Ａ、Ｂ）第１の合成分子（配列番号１）および（Ｃ、Ｄ）第２の合成分子（配列番号２）を示し、一方、配列番号３および４は、対応する、ＹＦＰコード部分を伴わない合成イントロン部分を提示する。一部の実施例では、合成イントロン配列は、配列番号３または４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する。したがって、本明細書に提示される任意の合成分子（例えば、配列番号１のｎｔ５４４～１０３２および配列番号２のｎｔ９０５～１１４１）のコード配列部分を別のコード配列部分で置き換えることができる。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。

図１１は、長さが異なるランダムな相補的な塩基対合する結合ドメイン（５０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、および５００ｂｐ）の再構成効率を示す棒グラフである。ＹＦＰ蛍光強度中央値が匹敵するＲＦＰおよびＢＦＰトランスフェクションレベルを有する細胞間で比較されている。条件当たりｎ＝３の試料。条件当たりｎ＝３の試料。

図１２Ａ～１２Ｂは、スプライスエンハンサーを合成イントロンに含めることにより再構成効率が上昇することを示す。図１２Ａは、使用した５’－Ｎ末端構築物および３’－Ｃ末端構築物（配列番号１および２）の概略図である。（略語に関しては図１Ａを参照されたい）。図１２Ｂは、細胞への配列番号１および２またはΔによって示されるそれらの種々の短縮のトランスフェクション後に得られたＹＦＰ蛍光を示す棒グラフである。条件当たりｎ＝３の試料。

図１３Ａ～１３Ｄは、２つの断片（配列番号１４７および１４８）からの全長ｆｌｐリコンビナーゼ（Ｆｌｐｏ）の再構成による正中線交差皮質ニューロン（midline-crossing cortical neuron）追跡を示す。（Ａ）ｆｌｐｏを再構成するために使用した５’配列および３’配列の略図（図１２Ａの構築物と類似）。（Ｂ）Ｎ－ｆｌｐｏをコードするＡＡＶウイルスおよびＣ－ｆｌｐｏをコードするＡＡＶウイルスをそれぞれ皮質の左側領域および右側領域に注射した、注射したｆｌｐ－レポーターマウス系統の略図である。（ＣおよびＤ）は、脳の反対側の半球に突き出し、したがって、Ｎ－ｆｌｐｏウイルスおよびＣ－ｆｌｐｏウイルスの両方に感染した皮質ニューロンのニューロン細胞体および軸索標識を示す。コンテキストとしてＨｏｅｃｈｓｔ染色（核）が示されている。

図１４Ａ～１４Ｄは、細胞培養物中およびマウス一次運動野におけるｉｎｖｉｖｏでの特大カーゴ（すなわち、長いＲＮＡによってコードされるタンパク質）の発現を示す。（Ａ）長いスタッファー配列（中断なしのオープンリーディングフレーム；それぞれ配列番号２２および２３）を含む、ＹＦＰを再構成するために使用した５’配列および３’配列の略図。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における特大ＹＦＰ構築物の再構成効率の定量的リアルタイムＰＣＲ分析。条件当たりＮ＝３。（Ｃ）一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリーによって評価した、全長特大ＹＦＰ発現および分割－ＲＥＪ発現からの再構成されたＹＦＰタンパク質の発現。異なる条件に対して等しいトランスフェクション対照（青色および赤色）蛍光を有する細胞集団間で黄色蛍光強度中央値が比較されている。Ｙ軸は黄色蛍光強度中央値［ａ．ｕ．］を示す。条件当たりＮ＝３。（Ｄ）マウス一次運動野への注射の概略図、および、ｉｎｖｉｖｏにおける長い（２４０１アミノ酸）ＹＦＰタンパク質の上首尾の再構成を示す注射の１０日後の脳組織の画像。同上。

図１５Ａ～１５Ｃは、Ｎ末端ＨＡタグ（Ｎ末端シグナルペプチドの代わり）を有する全長ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）（２３１７アミノ酸）の効率的な再構成を示す。（Ａ）ＦＶＩＩＩを再構成するために使用した５’配列および３’配列の略図（それぞれ配列番号２４および２５）。（Ｂ）結合部のＰＣＲ増幅。（Ｃ）ＦＶＩＩＩの発現を示すウエスタンブロット。レーン１～３：全長ＦＶＩＩＩの発現（２９０ｋＤａのバンドは全長プロセシングされていないＦＶＩＩＩを示す）。レーン４～６：再構成されたＦＶＩＩＩの発現（２９０ｋＤａのバンドは首尾よく再構成されたＦＶＩＩＩを示す）。レーン７および８：Ｎ末端のみの発現は、２９０ｋＤａの全長ＦＶＩＩＩバンドが存在しないことを示す。全てのレーンに関して：予測されるタンパク質プロセシング産物が約７５ｋＤａから約２１０ｋＤａまでにわたって観察される。ＦＶＩＩＩはマウス抗ＨＡ一次抗体を使用してプローブする。全てのレーンに清澄化した細胞タンパク質抽出物５マイクログラムをローディングした。ローディング対照としてＧＡＰＤＨ（ウサギ抗ＧＡＰＤＨ）をプローブする。同上。

図１６Ａ～１６Ｆは、Ｃ末端ＦＬＡＧタグを有する全長ヒトＡｂｃａ４（２３００アミノ酸）の効率的な再構成を示す。（Ａ）Ａｂｃａ４を再構成するために使用した５’配列および３’配列の略図（それぞれ配列番号２０および２１）、ならびに結合部にわたるサンガーシーケンシングトレース。（Ｂ）結合部のＰＣＲ増幅。（Ｃ）５’断片および３’断片の組換えをアッセイするために使用したプローブの略図。（Ｄ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における発現の２日後の再構成効率のＰＣＲによる定量化。条件当たりＮ＝２。（Ｅ）Ａｂｃａ４の発現を示すウエスタンブロット。レーン１～３：全長Ａｂｃａ４の発現（約２６０ｋＤａのバンドは全長Ａｂｃａ４を示す）。レーン４～６：再構成されたＡｂｃａ４の発現（２６０ｋＤａのバンドは首尾よく再構成されたＡｂｃａ４を示す）。レーン７および８：トランスフェクションなし対照（すなわち、ＨＥＫ２９３ｔ溶解物のみ）は、いかなるシグナルも存在しないことを示す。Ａｂｃａ４はマウス抗ＦＬＡＧ一次抗体を使用してプローブする。全てのレーンに清澄化した細胞タンパク質抽出物５マイクログラムをローディングした。ローディング対照としてＧＡＰＤＨ（ウサギ抗ＧＡＰＤＨ）をプローブする。（Ｆ）示差的ＢＦＰ濃度について正規化した（Ｅ）におけるウエスタンブロットの定量化。データは全長発現対照の平均に対して正規化されたものとして示されている。同上。

図１７Ａおよび１７Ｂは、（Ａ）ＨＩＶ－１に基づくキッシングループ二量体形成ドメイン（Ｎ断片、配列番号１３９、Ｃ断片、配列番号１４０）；および（Ｂ）ＨＩＶ－２に基づくキッシングループ二量体形成ドメイン（Ｎ断片、配列番号１４１、Ｃ断片、配列番号１４２）を提示する。

図１８Ａ～１８Ｃは、Ｃ末端ＦＬＡＧタグを有する全長マウスＯｔｏｆ（２０１９アミノ酸）の効率的な再構成を示す。使用した５’分子および３’分子のＤＮＡ配列が配列番号１５５および１５６に示されている。（Ａ）Ｏｔｏｆの発現を示すウエスタンブロット。レーン１～３：全長Ｏｔｏｆの発現（約２５０ｋＤａのバンドは全長Ｏｔｏｆを示す）。レーン４～６：再構成されたＯｔｏｆの発現（２５０ｋＤａのバンドは首尾よく再構成されたＯｔｏｆを示す）。レーン７：トランスフェクションなし対照（すなわち、ＨＥＫ２９３ｔ溶解物のみ）は、いかなるシグナルも存在しないことを示す。Ｏｔｏｆはマウス抗ＦＬＡＧ一次抗体を使用してプローブする。全てのレーンに清澄化した細胞タンパク質抽出物５マイクログラムをローディングした。ローディング対照としてＧＡＰＤＨ（ウサギ抗ＧＡＰＤＨ）をプローブする。（Ｂ）ウエスタンブロットの生の定量化および（Ｃ）示差的ＢＦＰ濃度について正規化。データは全長発現対照の平均に対して正規化されたものとして示されている。

図１９Ａ～１９Ｃは、Ｃ末端ＦＬＡＧタグを有する全長ヒトＭｙｏ７ａ（２２４３アミノ酸）の効率的な再構成を示す。使用した５’分子および３’分子のＤＮＡ配列が配列番号１５７および１５８に示されている。（Ａ）Ｍｙｏ７ａの発現を示すウエスタンブロット。レーン１～３：全長Ｍｙｏ７ａの発現（約２７０ｋＤａのバンドは全長Ｍｙｏ７ａを示す）。レーン４～６：再構成されたＭｙｏ７ａの発現（２７０ｋＤａのバンドは首尾よく再構成されたＭｙｏ７ａを示す）。レーン７：トランスフェクションなし対照（すなわち、ＨＥＫ２９３ｔ溶解物のみ）は、いかなるシグナルも存在しないことを示す。Ｍｙｏ７ａはマウス抗ＦＬＡＧ一次抗体を使用してプローブする。全てのレーンに清澄化した細胞タンパク質抽出物５マイクログラムをローディングした。ローディング対照としてＧＡＰＤＨ（ウサギ抗ＧＡＰＤＨ）をプローブする。（Ｂ）ウエスタンブロットの生の定量化および（Ｃ）示差的ＢＦＰ濃度について正規化。データは全長発現対照の平均に対して正規化されたものとして示されている。

図２０Ａ～２０Ｄは、全長ＤＣａｓ９－ＶＰＲ（１９５１アミノ酸）の効率的な再構成を示す。使用した５’分子および３’分子のＤＮＡ配列が配列番号１５９および１６０に示されている。（Ａ）ＤＣａｓ９－ＶＰＲの発現を示すウエスタンブロット。レーン１～３：全長ＤＣａｓ９－ＶＰＲの発現（約２５０ｋＤａのバンドは全長ＤＣａｓ９－ＶＰＲを示す）。レーン４～６：再構成されたＤＣａｓ９－ＶＰＲの発現（２５０ｋＤａのバンドは首尾よく再構成されたＤＣａｓ９－ＶＰＲを示す）。レーン７：トランスフェクションなし対照（すなわち、ＨＥＫ２９３ｔ溶解物のみ）は、いかなるシグナルも存在しないことを示す。ＤＣａｓ９－ＶＰＲをマウス抗Ｃａｓ９一次抗体を使用してプローブする。全てのレーンに清澄化した細胞タンパク質抽出物５マイクログラムをローディングした。ローディング対照としてＧＡＰＤＨ（ウサギ抗ＧＡＰＤＨ）をプローブする。（Ｂ）ウエスタンブロットの生の定量化および（Ｃ）示差的ＢＦＰ濃度について正規化。データは全長発現対照の平均に対して正規化されたものとして示されている。（Ｄ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＹＦＰ発現プラスミドの転写活性化の例。全長ｄＣａｓ９－ＶＰＲ（上のパネル）または二方向分割ＲＥＪデュアルｄＣａｓ９－ＶＰＲ（下のパネル）を非標的化ガイドＲＮＡ発現プラスミド（左側のパネル）またはＵＡＳ標的化ガイドＲＮＡ発現プラスミド（右側のパネル）と共に一過性にトランスフェクトする。全ての細胞に、ｄＣａｓ９－ＶＰＲが黄色蛍光タンパク質の発現をもたらす最小プロモーターの上流領域にターゲティングされるまで転写的に不活性であるＵＡＳ－ＹＦＰプラスミドもトランスフェクトする。赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をｄＣａｓ９－ＶＰＲのＮ末端断片と共に発現させ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）をそれぞれ全長ｄＣａｓ９－ＶＰＲまたはｄＣａｓ９－ＶＰＲのＣ末端断片と共に発現させる。ＲＦＰおよびＢＦＰはトランスフェクション対照としての役割を果たす。ＵＡＳ標的化ガイドＲＮＡと対合した全長ｄＣａｓ９－ＶＰＲならびに二方向分割ｄＣａｓ９－ＶＰＲどちらが発現されても、黄色蛍光タンパク質の発現が観察され、これにより、再構成された全長タンパク質の機能性が確認される。

図２１Ａ～２１Ｄは、全長ヒト化プライムエディター（２１１８アミノ酸）の効率的な再構成を示す。使用した５’分子および３’分子のＤＮＡ配列が配列番号１６１および１６２に示されている。（Ａ）プライムエディターの発現を示すウエスタンブロット。レーン１～３：全長プライムエディターの発現（約２６０ｋＤａのバンドは全長プライムエディターを示す）。レーン４～６：再構成されたプライムエディターの発現（２６０ｋＤａのバンドは首尾よく再構成されたプライムエディターを示す）。レーン７：トランスフェクションなし対照（すなわち、ＨＥＫ２９３ｔ溶解物のみ）は、いかなるシグナルも存在しないことを示す。プライムエディターをマウス抗Ｃａｓ９一次抗体を使用してプローブする。全てのレーンに清澄化した細胞タンパク質抽出物５マイクログラムをローディングした。ローディング対照としてＧＡＰＤＨ（ウサギ抗ＧＡＰＤＨ）をプローブする。（Ｂ）ウエスタンブロットの生の定量化および（Ｃ）示差的ＢＦＰ濃度について正規化。データは全長発現対照の平均に対して正規化されたものとして示されている。（Ｄ）プライムエディターにより誘導されるＧからＴへの塩基転換変異がＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＦＡＮＣＦ遺伝子座およびＶＥＧＦＡ３遺伝子座において誘導されたことを示す。上のパネルは、それぞれＦＡＮＣＦ遺伝子座およびＶＥＧＦＡ３遺伝子座の配列コンテキストを示す。灰色の矢印はプライムエディターガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）によって標的化される配列を示す。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が灰色の四角で示されている。Ｔへの塩基転換の標的とされるＧが配列内で強調表示されている。ゲノム遺伝子座についてサンガーシーケンシングを３つの条件で使用して配列決定する。上のパネルは、無編集野生型条件についての代表的なサンガートレースを示す。上から２番目のパネルは、全長の発現されたプライムエディター構築物を表す代表的なサンガートレースを示す。黒い四角で強調表示されている領域は、サンガーシーケンシングにおけるＴバンドの出現を示し、これにより、細胞の一部への編集の上首尾の組み入れが示される。一番下のパネルは、二方向分割再構成プライムエディターを用いて編集された細胞についての代表的なサンガートレースを示す。Ｔトレース（黒い四角）の出現により、２つの断片から再構成された場合のプライムエディターの機能性が実証される。

図２２Ａ～２２Ｃは、全長ヒト化シトシン塩基エディター（ＡｎｃＢＥ４）（１８５４アミノ酸）の効率的な再構成を示す。使用した５’分子および３’分子のＤＮＡ配列が配列番号１６３および１６４に示されている。（Ａ）ＡｎｃＢＥ４の発現を示すウエスタンブロット。レーン１～３：全長ＡｎｃＢＥ４の発現（約２３０ｋＤａのバンドは全長ＡｎｃＢＥ４を示す）。レーン４～６：再構成されたＡｎｃＢＥ４の発現（２３０ｋＤａのバンドは首尾よく再構成されたＡｎｃＢＥ４を示す）。レーン７：トランスフェクションなし対照（すなわち、ＨＥＫ２９３ｔ溶解物のみ）は、いかなるシグナルも存在しないことを示す。ＡｎｃＢＥ４をマウス抗Ｃａｓ９一次抗体を使用してプローブする。全てのレーンに清澄化した細胞タンパク質抽出物５マイクログラムをローディングした。ローディング対照としてＧＡＰＤＨ（ウサギ抗ＧＡＰＤＨ）をプローブする。（Ｂ）ウエスタンブロットの生の定量化。データは全長発現対照の平均に対して正規化されたものとして示されている。（Ｃ）ＡｎｃＢＥ４により誘導されるＣからＴへの転位変異がＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＥＭＸ１遺伝子座およびＨＥＫ部位３遺伝子座において誘導されたことを示す。上のパネルは、それぞれＥＭＸ１およびＨＥＫ部位３遺伝子座の配列コンテキストを示す。灰色の矢印は、ＡｎｃＢＥ４ｇＲＮＡによって標的化される配列を示す。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が灰色の四角で示されている。Ｔへの転位の標的とされるＣが配列内で強調表示されている。ゲノム遺伝子座についてサンガーシーケンシングを３つの条件で使用して配列決定する。上のパネルは、無編集野生型条件についての代表的なサンガートレースを示す。上から２番目のパネルは、全長の発現されたＡｎｃＢＥ４構築物を表す代表的なサンガートレースを示す。黒い四角で強調表示されている領域は、サンガーシーケンシングにおけるＴバンドの出現を示し、これにより、細胞の一部への編集の上首尾の組み入れが示される。一番下のパネルは、二方向分割再構成ＡｎｃＢＥ４を用いて編集された細胞についての代表的なサンガートレースを示す。Ｔトレース（黒い四角）の出現により、２つの断片から再構成された場合のＡｎｃＢＥ４の機能性が実証される。

図２３Ａ～２３Ｃは、全長ヒト化アデニン塩基エディター（ＡＢＥ８ｅ）（１６０６アミノ酸）（例えば、配列番号２２５、２２６）の効率的な再構成を示す。使用した５’分子および３’分子のＤＮＡ配列が配列番号１６５および１６６に示されている。（Ａ）ＡＢＥ８ｅの発現を示すウエスタンブロット。レーン１～３：全長ＡＢＥ８ｅの発現（約２３０ｋＤａのバンドは全長ＡＢＥ８ｅを示す）。レーン４～６：再構成されたＡＢＥ８ｅの発現（２３０ｋＤａのバンドは首尾よく再構成されたＡＢＥ８ｅを示す）。レーン７：トランスフェクションなし対照（すなわち、ＨＥＫ２９３ｔ溶解物のみ）は、いかなるシグナルも存在しないことを示す。ＡＢＥ８ｅをマウス抗Ｃａｓ９一次抗体を使用してプローブする。全てのレーンに清澄化した細胞タンパク質抽出物５マイクログラムをローディングした。ＧＡＰＤＨ（ウサギ抗ＧＡＰＤＨ）をローディング対照としてプローブする。（Ｂ）ウエスタンブロットの生の定量。データは全長発現対照の平均に対して正規化されたものとして示されている。（Ｃ）ＡＢＥ８ｅにより誘導されるＡからＧへの転位変異がＨＥＫ２９３ｔ細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子座およびＨＧＢ１／２遺伝子座において誘導されたことを示す。上のパネルは、それぞれＢＣＬ１１ＡおよびＨＧＢ１／２遺伝子座の配列コンテキストを示す。灰色の矢印はＡＢＥ８ｅガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって標的化される配列を示す。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が灰色の四角で示されている。Ｇへの転位の標的とされるＡが配列内で強調表示されている。ゲノム遺伝子座についてサンガーシーケンシングを３つの条件で使用して配列決定する。上のパネルは、無編集野生型条件についての代表的なサンガートレースを示す。上から２番目のパネルは、全長発現されたＡＢＥ８ｅ構築物を表す代表的なサンガートレースを示す。黒い四角で強調表示されている領域は、サンガーシーケンシングにおけるＧバンドの出現を示し、これにより、細胞の一部への編集の上首尾の組み入れが示される。一番下のパネルは、二方向分割再構成ＡＢＥ８ｅを用いて編集された細胞についての代表的なサンガートレースを示す。Ｇトレース（黒い四角）の出現により、２つの断片から再構成された場合のＡＢＥ８ｅの機能性が実証される。

図２３Ｄ～Ｇは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルにおける中途終止コドンを補正するための、全長ヒト化アデニン塩基エディター（ＡＢＥ８ｅ）（１６０６アミノ酸）の効率的な再構成を示す。（Ｄ）実験の概略図。ＡＢＥ８ｅ塩基エディターを、コードＤＮＡが２つの別々のアデノ随伴ウイルスカプシドに個別にパッケージングされた２つの断片に分割する。ＣＲＩＳＰＲｇＲＮＡを、ＡからＧへの変換によりＴＡＡ終止コドンがＣＡＡコドンに変換されるように、中途終止コドンの遺伝子座を標的とするように設計する。（Ｅ）黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を、中途終止コドンの周囲のｍｄｘコード配列の短い一続きで接続された２つのコード断片に分割する。ＹＦＰの第１の半分は、オープンリーディングフレームが中途ＴＡＡ終止コドンによって終止する場合、非蛍光である。終止コドン補正の結果、蛍光が付与された完全なＹＦＰ配列の翻訳がもたらされる（この構築物は、ＹＦＰ－編集－レポーターと称される）。左側のパネルは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＹＦＰ－編集－レポーター（赤色蛍光トランスフェクション対照を共発現する）、およびＮ末端ＡＢＥ８ｅベクター、およびＣ末端ＡＢＥ８ｅベクター、および非標的化ｇＲＮＡをトランスフェクトした場合にはＹＦＰ蛍光が存在しないことを示す。右側のパネルは、ＹＦＰ－編集－レポーター（赤色蛍光トランスフェクション対照を共発現する）、およびＮ末端ＡＢＥ８ｅベクター、およびＣ末端ＡＢＥ８ｅベクター、およびｍｄｘ遺伝子座標的化ｇＲＮＡを共トランスフェクトした場合には高いパーセンテージの細胞においてＹＦＰ蛍光が発現されることを示す。（Ｆ）処置された筋肉におけるジストロフィンの発現をもたらす、ｍｄｘ中途終止コドンのｉｎｖｉｖｏ編集を示す。雄ｍｄｘ変異マウスに、アデノ随伴ウイルス８ベクターにパッケージングされたＮ末端ＡＢＥ８ｅとＣ末端ＡＢＥ８ｅの混合物（ベクター当たり５×１０^１０個のウイルスゲノム、合計で筋肉当たり１×１０^１１個のウイルスゲノム）を注射した。ウイルスゲノムは、２つのゲノムのそれぞれに２つのｇＲＮＡ発現カセット（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターおよびｇＲＮＡ配列で構成される）を含有する。ウイルスミックスを前脛骨筋に筋肉内注射した。右上のパネルは、参照として野生型前脛骨筋横断面におけるジストロフィン染色を示す。左下のパネルは、無処置の前脛骨筋組織を示す。右下のパネルは、２つのアデノ随伴ウイルスを注射した前脛骨筋におけるジストロフィンの発現を示す。（Ｇ）ＡＢＥ８ｅを発現させるためにアデノ随伴ウイルスミックスを用いて処置した前脛骨筋のジストロフィン発現（上のパネル）、ＡＢＥ８ｅ発現（中央のパネル）、およびＧＡＰＤＨローディング対照（下のパネル）を示す。これにより、ＡＢＥ８ｅ塩基エディターを使用したジストロフィン発現のレスキューが例示される。同上。同上。同上。

下流イントロンスプライシングエンハンサー（ＤＩＳＥ）およびイントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）およびアクセプター配列のＲＮＡ末端結合の効率に対する影響。（Ａ）スクリーニング設定の概略図。５’断片は、ＤＮＡ構築物からヒトＣＭＶプロモーターおよびエンハンサーを使用して転写されるＲＮＡ分子である。生じるＲＮＡ分子は、大きなカーゴサイズをシミュレートするための長いスタッファーオープンリーディングフレームを含有する。このスタッファー配列は２Ａ自己切断性ペプチド配列で終わり、続いて、黄色蛍光タンパク質の５’断片のコード領域（ｎ－ｙｆｐ）が続く。ｙｆｐの５’断片はスプライスドナー部位（ＳＤ）で終わる。このスプライスドナー部位の後にＲＮＡ末端結合モジュールの５’イントロン部分が続く。ＤＩＳＥおよびＩＳＥ配列のＲＮＡ末端結合反応効率に対する影響を決定するために、５’イントロン部分は３つの断片：５’から３’に：ｄｓ：下流セグメント；ｍ：中間イントロンセグメント；ｄｄ：ドナー遠位セグメントに細分される。５’イントロン部分の後に三峰性キッシングループＲＮＡ二量体形成ドメインが続く。メッセージは短いポリアデニル化シグナルで終結する。この５’ＲＮＡ分子の全体の長さは、大きなカーゴの再構成シナリオをシミュレートするために、約４ｋｂである。３’断片は、ＤＮＡ構築物からヒトＣＭＶプロモーターおよびエンハンサーを使用して転写されるＲＮＡ分子である。３’断片は５’断片をコードするＲＮＡ分子のものと相補的な三峰性キッシングループＲＮＡ二量体形成ドメインで始まる。二量体形成ドメインの後にＲＮＡ末端結合モジュールの３’イントロン部分が続く。この３’イントロン部分は３つのセグメント：ａｄ：アクセプター遠位セグメント；ｍ：中間イントロンセグメント；ａｐ：アクセプター近位セグメントに細分される。アクセプター近位セグメントは、どちらもスプライソソーム媒介性ＲＮＡ結合反応に必須である分岐点およびポリピリミジントラクトのバリエーションを有する。スプライスアクセプター（ＳＡ）部位の後に３’ｙｆｐコード配列が続き、その後に自己切断性２Ａ配列が続き、その後に長いスタッファーオープンリーディングフレームが続く。メッセージはＳＶ４０ポリアデニル化シグナルで終結する。３’ＲＮＡ分子の全体の長さは、大きなカーゴの再構成シナリオをシミュレートするために、約４ｋｂである。２つのＲＮＡ分子（５’断片と３’断片）の会合は三峰性キッシングループＲＮＡ二量体形成ドメインによって媒介され、スプライソソームの動員およびＲＮＡ末端結合反応はイントロンセグメントによって媒介される。上首尾のＲＮＡ末端結合により、ｙｆｐオープンリーディングフレームの再構成およびその後のＹＦＰの翻訳がもたらされる。（Ｂ）フローサイトメトリーによって決定されるＹＦＰ蛍光強度中央値が複数のイントロン構成について示されている。第１の群分け（棒１～９）では、潜在的な下流イントロンスプライシングエンハンサー配列の選択を、棒１～８に示されているコンセンサススプライスドナー部位（ＤＮＡ構築物ではＧＴＡＡＧＴＡＴＴおよびＲＮＡ配列ではＧＵＡＡＧＵＡＵＵ）と対にした。これらを、４つの塩基全ての等しい部分で構成されるスクランブル配列が後ろに続くコンセンサススプライスドナー（ｄｓ９）と比較する。第２の群分け、ｍ１～ｍ１６では、潜在的なイントロンスプライシングエンハンサーの選択をスクランブル配列（ｍ１６）と比較した。最後の群分けでは、潜在的な強力な分岐点、ポリピリミジントラクト、およびスプライスアクセプターの選択を比較した。参照構築物は、全てが非可変位置にあるスクランブル配列とコンセンサスドナー、続いて、ｄｓ位置にあるスクランブル配列およびコンセンサススプライスアクセプター配列で構成された（ここで、ポリピリミジントラクト全体は、それぞれＤＮＡ構築物ではＴで構成され、ＲＮＡ断片ではＵで構成される）。（Ｃ）使用した異なるＤＩＳＥ、ＩＳＥ、およびスプライスアクセプターエレメントの一覧表。同上。同上。

図２５Ａ～２５Ｂは、本明細書に開示される方法を使用したマウス筋肉における塩基エディターのｉｎｖｉｖｏ発現、およびジストロフィン遺伝子変異の補正を示す。（Ａ）野生型（ｗｔ）マウス、無処置のｍｄｘ－４ｃｖマウス、および処置されたｍｄｘ－４ｃｖマウス由来の筋肉抽出物におけるジストロフィン、Ｃａｓ９－ＡＢＥ、およびＧＡＰＤＨの発現を示すウエスタンブロット。（Ｂ）野生型（ｗｔ）マウス、無処置のｍｄｘ－４ｃｖマウス、および処置されたｍｄｘ－４ｃｖマウスの筋肉におけるジストロフィン発現の免疫組織化学的分析。

配列表
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されている通り、ヌクレオチド塩基については標準的な文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖への言及のいずれにも相補鎖が含まれると理解されたい。配列表は、２０２２年５月１６日に作成された２９９ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、それは参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表において：

配列番号１および２は、それぞれ、全長ＹＦＰを発現させるために使用したＮ末端配列およびＣ末端配列である。配列番号１、ＣＭＶプロモーターｎｔ１～５４３、ＹＦＰコード配列ｎｔ５４４～１０３２、合成イントロンｎｔ１０３３～１４３６、および非翻訳ポリＡ領域ｎｔ１４３７～１４９１。配列番号２、ＣＭＶプロモーターｎｔ１～５２２、合成イントロンｎｔ５２３～９０４、ＹＦＰコード配列ｎｔ９０５～１１４１、およびｎｔ１１４２～１３０２は非翻訳ポリＡ領域である。

配列番号３および４は、それぞれ、所望の全長タンパク質を発現させるために使用することができる５’イントロン配列および３’イントロン配列であり、ここで、全長タンパク質のＮ末端部分を配列番号３のｎｔ１に付加することができ、全長タンパク質のＣ末端部分を配列番号４のｎｔ３８２に付加することができる。

配列番号５および６は、それぞれ、全長ＹＦＰを発現させるために使用したＮ末端コード配列およびＣ末端コード配列である。

配列番号７は、例示的な合成イントロン二量体形成ドメインである（図１０Ｅ）。

配列番号８は、イントロンスプライシングエンハンサーを有さない例示的な合成イントロンである（図１０Ｆ）。

配列番号９は、イントロンスプライシングエンハンサーを有さない例示的な合成イントロンである（図１０Ｇ）。

配列番号１０は、イントロンスプライシングエンハンサーを有さない例示的な合成イントロンである（図１０Ｈ）。

配列番号１１は、結合ドメインを有さない例示的な合成イントロンである（図１０Ｉ）。

配列番号１２は、二量体形成ドメインを有する例示的な合成イントロンである（図１０Ｊ）。

配列番号１３は、二量体形成ドメインを有する例示的な合成イントロンである（図１０Ｋ）。

配列番号１４は、イントロンスプライシングエンハンサーを有さない例示的な合成イントロンである（図１０Ｌ）。

配列番号１５は、ＤＩＳＥのみを有する例示的な合成イントロンである（図１０Ｍ）。

配列番号１６は、ＨＨｒｚを有さない例示的な合成イントロンである（図１０Ｎ）。

配列番号１７は、イントロンスプライシングエンハンサーを有さない例示的な合成イントロンである（図１０Ｏ）。

配列番号１８は、結合ドメインを有する例示的なＵ１２依存性イントロンである（図１０Ｐ）。

配列番号１９は、結合ドメインを有する例示的なＵ１２依存性イントロンである（図１０Ｑ）。

配列番号２０および２１は、それぞれ、全長Ａｂｃａ４をもたらすＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）を発現させるために使用したＮ末端ＤＮＡ配列およびＣ末端ＤＮＡ配列である。配列番号２０において、Ｎ末端Ａｂｃａ４コード領域に対応する配列がｎｔ２２～３７０２に存在し、ｎｔ３７０３～３９１２は合成イントロンであり、３９２１～３９６９は非翻訳ポリＡ領域である。配列番号２０は、ｎｔ３７０３～３７１１のスプライスドナー、ｎｔ３７１４～３７３７のラットＦＧＦＲ２ＤＩＳＥ、ｎｔ３７４７～３７７０のｃＴＮＴイントロンスプライシングエンハンサー、ｎｔ３７８２～３７９４のＭ２イントロンスプライシングエンハンサー、およびｎｔ３８０１～３９７５のキッシングループ二量体形成ドメインも含有する。配列番号２１において、ｎｔ１～２２８は合成イントロンであり、ｎｔ２２９～３３６６はＣ末端Ａｂｃａ４コード領域であり、３３６７～３４４７はＦＬＡＧエピトープタグであり、ｎｔ３４７６～３６０７は非翻訳ポリＡ領域（シグナル）である。配列番号２１は、ｎｔ３～１１４のキッシングループ二量体形成ドメイン、ｎｔ１２１～１３３のＭ２イントロンスプライシングエンハンサー、ｎｔ１４０～１６３のｃＴＮＴイントロンスプライシングエンハンサー、ｎｔ１７５～１８７のＭ２イントロンスプライシングエンハンサー、ｎｔ１９４～２０１の分岐点モチーフ、ｎｔ２０７～２２６のポリピリミジントラクト、およびｎｔ２２８にスプライスアクセプターも含有する。

配列番号２２および２３は、それぞれ、長い全長ＹＦＰをもたらすＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）を発現させるために使用したＮ末端ＤＮＡ配列およびＣ末端ＤＮＡ配列あり、それぞれスプライスエンハンサーを含む。配列番号２２において、Ｎ末端ＹＦＰコード領域はｎｔ２２～３７０２であり、ｎｔ３７０３～３９１２は合成イントロンであり、３９２１～３９６９は非翻訳ポリＡ領域である。配列番号２２は、ｎｔ３７０３～３７１１のスプライスドナー、ｎｔ３７１４～３７３７のラットＦＧＦＲ２ＤＩＳＥ、ｎｔ３７４７～３７７０のｃＴＮＴイントロンスプライシングエンハンサー、３７８２～３７９４にＭ２イントロンスプライシングエンハンサー、および３８０１～３９７５にキッシングループ二量体形成ドメインも含有する。配列番号２３において、ｎｔ１～２２５は合成イントロンであり、ｎｔ２２６～３７４７はＣ末端ＹＦＰコード領域であり、ｎｔ３７４８～３９１２は非翻訳ポリＡ領域である。配列番号２３は、ｎｔ３～１１４のキッシングループ二量体形成ドメイン、ｎｔ１１８～１３０のＭ２イントロンスプライシングエンハンサー、ｎｔ１３７～１６０のｃＴＮＴイントロンスプライシングエンハンサー、ｎｔ１７２～１８４のＭ２イントロンスプライシングエンハンサー、ｎｔ１９１～１９８の分岐点モチーフ、ｎｔ２０４～２２３のポリピリミジントラクト、およびｎｔ２２５にスプライスアクセプターを含む。

配列番号２４および２５は、それぞれ、全長ヒト第ＶＩＩＩ因子をもたらすＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）を発現させるために使用したＮ末端配列およびＣ末端配列である。配列番号２４において、Ｎ末端ＨＡエピトープタグｎｔを有するＮ末端ＦＶＩＩＩコード領域がｎｔ２２～３５６１に存在し、ｎｔ３５６２～３７７１は合成イントロンであり、ｎｔ３７８０～３８２８は非翻訳ポリＡ領域である。配列番号２４は、ｎｔ３５６２～３５７０のスプライスドナー、ｎｔ３５７３～３５９６のラットＦＧＦＲ２ＤＩＳＥ、ｎｔ３６０６～３６２９のｃＴＮＴイントロンスプライシングエンハンサー、ｎｔ３６４１～３６５３のＭ２イントロンスプライシングエンハンサー、およびｎｔ３６６０～３８３４のキッシングループ二量体形成ドメインも含有する。配列番号２５において、ｎｔ１～２２５は合成イントロンであり、ｎｔ２２６～３６３６はＣ末端ＦＶＩＩＩコード領域であり、ｎｔ３６６５～３７９７は非翻訳ポリＡ領域である。配列番号２５は、ｎｔ３７０３～３７１１のスプライスドナー、ｎｔ３７１４～３７３７のラットＦＧＦＲ２ＤＩＳＥ、ｎｔ３７４７～３７７０のｃＴＮＴイントロンスプライシングエンハンサー、３７８２～３７９４のＭ２イントロンスプライシングエンハンサー、およびｎｔ３８０１～３９７５のキッシングループ二量体形成ドメインも含有する。

配列番号２６～１３６は、本明細書に提示される系で使用することができる例示的なスプライシングエンハンサーである（例えば、図６Ａの１１８、１２０、１５６）。

配列番号１３７および１３８は、例示的なスプライスドナー配列である。

配列番号１３９および１４０は、それぞれ、ＨＩＶ－１に基づくキッシングループ二量体形成ドメインのＮ断片およびＣ断片である。

配列番号１４１および１４２は、それぞれ、ＨＩＶ－２に基づくキッシングループ二量体形成ドメインのＮ断片およびＣ断片である。

配列番号１４３は、例示的な潜在スプライスアクセプター配列である。

配列番号１４４は、例示的な分岐点コンセンサス配列である。

配列番号１４５および１４６は、それぞれ、全長ＹＦＰを発現させるために配列番号２（Ｃ末端断片）と一緒に使用したＮ配列および中間配列である。配列番号１４５において、ｎｔ１～５４３はＣＭＶプロモーター配列であり、ｎｔ５４４～８４９はＮ末端ＹＦＰコード領域であり、ｎｔ８５０～１３０５は合成イントロンである。配列番号１４６において、ｎｔ１～５２２はＣＭＶプロモーター配列であり、ｎｔ５２３～９０１は合成イントロンであり、ｎｔ９０２～１０８４は中間ＹＦＰコード領域であり、ｎｔ１０８５～１５４３は非翻訳ポリＡ領域である。

配列番号１４７および１４８は、それぞれ、全長Ｆｌｐｏを発現させるために使用した５’合成配列および３’合成配列である。配列番号１４７において、ｎｔ１～５４０はＣＭＶプロモーター配列であり、ｎｔ５４１～１１１２はＮ末端Ｆｌｐｏコード領域であり、ｎｔ１１１３～１５７１は合成イントロンである。配列番号１４８において、ｎｔ１～５２２はＣＭＶプロモーター配列であり、ｎｔ５２３～９０４は合成イントロンであり、ｎｔ９０５～１６０４はＣ末端Ｆｌｐｏコード領域であり、ｎｔ１６０５～１７６５は非翻訳ポリＡ領域である。

配列番号１４９および１５０は、例示的な低多様性配列である。

配列番号１５１および１５２は、例示的なスプライスドナーコンセンサス配列である。

配列番号１５３は、ＨＩＶ－２キッシングループ二量体形成ドメイン（配列番号１４１および１４２、図１７Ｂ）に基づく例示的なキッシングループである。

配列番号１５４は、例示的なコザック増強開始コドンである。

配列番号１５５および１５６は、マウスＯｔｏｆコード配列をｉｎｖｉｖｏで発現させるために使用することができる例示的な構築物である。配列番号１５５は、Ｎ末端ＯｔｏｆＲＮＡを生成するために使用される。配列番号１５５は、ｎｔ１～５２２のヒトＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター、ｎｔ５２３の推定転写開始部位、およびｎｔ４２６３～４３１１のポリアデニル化シグナルを含む。配列番号１５５は、Ｎ末端ＯｔｏｆＲＮＡエレメントを以下の通りコードする：コザック配列を含む５’非翻訳領域ｎｔ５２３～５４６；５’オトフェルリンコード配列ｎｔ５４７～４０４４；５’合成イントロン配列ｎｔ４０４５～４１４２；５’三峰性キッシングループ二量体形成ドメインｎｔ４１４３～４２５４；およびｎｔ４２５５～４２６２のリンカー。配列番号１５５は、Ｃ末端ＯｔｏｆＲＮＡを生成するために使用される。それは、ｎｔ１～５２２のヒトＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター、ｎｔ５２３の推定転写開始部位、およびｎｔ３３３５～３４６７のポリアデニル化シグナルを含む。それは、Ｃ末端ＯｔｏｆＲＮＡエレメントを以下の通りコードする：３’三峰性キッシングループ二量体形成ドメインｎｔ５２５～６３６；３’合成イントロン配列ｎｔ６３７～７４７；３’オトフェルリンコード配列ｎｔ７４８～３２２５；Ｃ末端３×Ｆｌａｇタグｎｔ３２２６～３３０６；およびｎｔ３３０７～３３３４のリンカー。

配列番号１５７および１５８は、ヒトミオシンＶＩＩＡ（Ｍｙｏ７ａ）コード配列をｉｎｖｉｖｏで発現させるために使用することができる例示的な構築物である。配列番号１５７は、Ｎ末端Ｍｙｏ７ａＲＮＡを生成するために使用される。配列番号１５７は、ｎｔ１～５２２のヒトＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター、ｎｔ５２３の推定転写開始部位、およびｎｔ４３４４～４３９２のポリアデニル化シグナルを含む。配列番号１５７は、Ｎ末端Ｍｙｏ７ＡＲＮＡエレメントを以下の通りコードする：コザック配列を含む５’非翻訳領域ｎｔ５２３～５４３；５’Ｍｙｏ７ａコード配列ｎｔ５４４～４１２５；５’合成イントロン配列ｎｔ４１２６～４２２３；５’三峰性キッシングループ二量体形成ドメインｎｔ４２２４～４３３５；およびｎｔ４３３６～４３４３のリンカー。配列番号１５８は、Ｃ末端Ｍｙｏ７ａＲＮＡを生成するために使用される。配列番号１５８は、ｎｔ１～５２２のヒトＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター、ｎｔ５２３の推定転写開始部位、およびｎｔ３９２３～４０５５のポリアデニル化シグナルを含む。配列番号１５８は、Ｃ末端Ｍｙｏ７ａＲＮＡエレメントを以下の通りコードする：３’三峰性キッシングループ二量体形成ドメインｎｔ５２５～６３６；３’合成イントロン配列ｎｔ６３７～７４７；３’Ｍｙｏ７ａコード配列ｎｔ７４８～３８１３；Ｃ末端３×Ｆｌａｇタグｎｔ３８１４～３８９４；およびｎｔ３８９５～３９２２のリンカー。

配列番号１５９および１６０は、ＶＰＲ転写活性化因子ドメインと融合した全長の酵素的に不活性型のＣａｓ９（ｄＣａｓ９－ＶＰＲ）コード配列をｉｎｖｉｖｏで発現させるために使用することができる例示的な構築物である。配列番号１５９は、Ｎ末端ＤＣａｓ９－ＶＰＲＲＮＡを生成するために使用される。配列番号１５９は、ｎｔ１～５２２のヒトＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター、ｎｔ５２３の推定転写開始部位、およびｎｔ４１１２～４１６１のポリアデニル化シグナルを含む。配列番号１５９は、Ｎ末端ＤＣａｓ９－ＶＰＲＲＮＡエレメントを以下の通りコードする：コザック配列を含む５’非翻訳領域ｎｔ５２３～５４３；５’ＤＣａｓ９－ＶＰＲコード配列ｎｔ５４４～３８９４；５’合成イントロン配列ｎｔ３８９５～３９９２；５’三峰性キッシングループ二量体形成ドメインｎｔ３９９３～４１０４；およびリンカーｎｔ４１０５～４１１２。配列番号１６０は、Ｃ末端ＤＣａｓ９－ＶＰＲＲＮＡを生成するために使用される。配列番号１６０は、ｎｔ１～５２２のヒトＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター、ｎｔ５２３の推定転写開始部位、およびポリアデニル化シグナルｚｔｎｔ３２７８～３４１０を含む。配列番号１６０は、Ｃ末端ＤＣａｓ９－ＶＰＲＲＮＡエレメントを以下の通りコードする：３’三峰性キッシングループ二量体形成ドメインｎｔ５２５～６３６；３’合成イントロン配列ｎｔ６３７～７４７；３’ＤＣａｓ９－ＶＰＲコード配列ｎｔ７４８～３２４９；およびｎｔ３２５０～３２７７のリンカー。

配列番号１６１および１６２は、全長ヒト化Ｃａｓ９プライムエディター（プライムエディター）コード配列をｉｎｖｉｖｏで発現させるために使用することができる例示的な構築物である。配列番号１６１は、Ｎ末端プライムエディター配列を以下の通りコードする：ヒトＣＭＶエンハンサーおよびプロモーターｎｔ１～５２２；推定転写開始部位ｎｔ５２３；コザック配列を含む５’非翻訳領域ｎｔ５２３～５４３；５’プライムエディターコード配列ｎｔ５４４～３８９４；５’合成イントロン配列ｎｔ３８９５～３９９２；５’三峰性キッシングループ二量体形成ドメインｎｔ３９９３～４１０４；リンカーｎｔ４１０５～４１１２；ポリアデニル化シグナルｎｔ４１１２～４１６１。配列番号１６２は、Ｃ末端プライムエディター配列を以下の通りコードする：ヒトＣＭＶエンハンサーおよびプロモーターｎｔ１～５２２；推定転写開始部位ｎｔ５２３；３’三峰性キッシングループ二量体形成ドメインｎｔ５２５～６３６；３’合成イントロン配列ｎｔ６３７～７４７；３’プライムエディターコード配列ｎｔ７４８～３７５０；リンカーｎｔ３７５１～３７７８；ポリアデニル化シグナルｎｔ３７７９～３９１１。

配列番号１６３および１６４は、全長ヒト化シトシン塩基エディター（ＡｎｃＢＥ４）コード配列をｉｎｖｉｖｏで発現させるために使用することができる例示的な構築物である。配列番号１６３は、Ｎ末端ＡｎｃＢＥ４配列を以下の通りコードする：ヒトＣＭＶエンハンサーおよびプロモーターｎｔ１～５２２；推定転写開始部位ｎｔ５２３；コザック配列を含む５’非翻訳領域ｎｔ５２３～５４０；５’ＡｎｃＢＥ４コード配列ｎｔ５４１～２８９２；５’合成イントロン配列ｎｔ２８９３～２９９０；５’三峰性キッシングループ二量体形成ドメインｎｔ２９９１～３１０２；リンカーｎｔ３１０３～３１１０；ポリアデニル化シグナルｎｔ３１１１～３１５９。配列番号１６４は、Ｃ末端ＡｎｃＢＥ４配列を以下の通りコードする：ヒトＣＭＶエンハンサーおよびプロモーターｎｔ１～５２２；推定転写開始部位ｎｔ５２３；３’三峰性キッシングループ二量体形成ドメインｎｔ５２５～６３６；３’合成イントロン配列ｎｔ６３７～７４７；３’ＡｎｃＢＥ４コード配列ｎｔ７４８～３９５７；リンカーｎｔ３９５８～３９８２；ポリアデニル化シグナルｎｔ３９８３～４１１５。

配列番号１６５および１６６は、全長ヒト化アデニン塩基エディター（ＡＢＥ８ｅ）コード配列をｉｎｖｉｖｏで発現させるために使用することができる例示的な構築物である。配列番号１６５は、Ｎ末端ＡＢＥ８ｅ配列を以下の通りコードする：ヒトＣＭＶエンハンサーおよびプロモーターｎｔ１～５２２；推定転写開始部位ｎｔ５２３；コザック配列を含む５’非翻訳領域ｎｔ５２３～５４０；５’ＡＢＥ８ｅコード配列ｎｔ５４１～２７０６；５’合成イントロン配列ｎｔ２７０７～２８０４；５’三峰性キッシングループ二量体形成ドメインｎｔ２８０５～２９１６；リンカーｎｔ２９１７～２９２４；ポリアデニル化シグナルｎｔ２９２５～２９７３。配列番号１６６は、Ｃ末端Ａｂｅ８ｅ配列を以下の通りコードする：ヒトＣＭＶエンハンサーおよびプロモーターｎｔ１～５２２；推定転写開始部位ｎｔ５２３；３’三峰性キッシングループ二量体形成ドメインｎｔ５２５～６３６；３’合成イントロン配列ｎｔ６３７～７４７；３’ＡＢＥ８ｅコード配列ｎｔ７４８～３３９９；リンカーｎｔ３４００～３４２７；ポリアデニル化シグナルｎｔ３４２８～３５６０。

配列番号１６７は、例示的なキッシングループドメイン（ＧＡＴＴＴＴＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＧＡＴＴＧＴＣＣＡＣＴＧＣＧＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴＴＴＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＴＣＣＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＣ）である。

配列番号１６８は、例示的なＩＳＥ、Ｍ２（ＧＧＧＴＴＡＴＧＧＧＡＣＣ）である。

配列番号１６９は、例示的なＩＳＥ、ｃＴＮＴ（ＧＧＣＴＧＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴＣＣＴＧＧＧ）である。

配列番号１７０は、例示的なＤＩＳＥ、ラットＦＧＦＲ２（ＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡＴＧＧＧＴＴＧＧＣＣＴ）である。

配列番号１７１および１７２は、全長ＹＦＰコード配列を発現させるために使用することができる例示的な構築物である。配列番号１７１は、Ｎ末端ＹＦＰ配列を以下の通りコードする：ヒトＣＭＶエンハンサーおよびプロモーターｎｔ１～５２２；推定転写開始部位ｎｔ５２３；コザック配列を含む５’非翻訳領域ｎｔ５２３～５４３；５’スタッファーオープンリーディングフレームｎｔ５４４～３６５４；自己切断性２Ａ配列ｎｔ３６５５～３７２９；５’黄色蛍光タンパク質セグメントｎｔ３７３０～４２２４；５’合成イントロン配列（可変）ｎｔ４２２５～４２９４；５’三峰性キッシングループ二量体形成ドメイン（大文字）：４２９５～４４０６；リンカーｎｔ４４０７～４４１４；ポリアデニル化シグナルｎｔ４４１５～４４６３。配列番号１７２は、Ｃ末端ＹＦＰ配列を以下の通りコードする：名称：３’イントロンスクリーニング分割ＹＦＰ；ヒトＣＭＶエンハンサーおよびプロモーターｎｔ１～５２２；推定転写開始部位ｎｔ５２３；３’三峰性キッシングループ二量体形成ドメインｎｔ５２５～６３６；３’合成イントロン配列（可変）ｎｔ６３７～７０６；３’ｙｆｐコード配列ｎｔ７０７～９４０；自己切断性２Ａ配列ｎｔ９４１～１００６；３’スタッファーオープンリーディングフレームｎｔ１００７～４２２８；リンカーｎｔ４２２９～４２６５；ポリアデニル化シグナルｎｔ４２５７～４３８８。

配列番号１７３～１８０は、例示的なイントロンスプライシングエンハンサー配列である。

配列番号１８１は、スクランブル配列である。

配列番号１８２～１９６は、例示的なイントロンスプライシングエンハンサー配列である。

配列番号１９７～１９８は、スクランブル配列である。

配列番号１９９～２０３は、例示的なイントロンスプライシングエンハンサー配列である。

配列番号２０４は、スクランブル配列である。

配列番号２０５は、例示的な分岐点配列（ＴＡＣＴＡＡＣＡ）である。

配列番号２０６は、例示的なポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧである。

配列番号２０７および２０８は、それぞれ例示的なＣａｓ９コード配列およびタンパク質配列である。

配列番号２０９および２１０は、それぞれ例示的なｄＣａｓ９コード配列およびタンパク質配列である。

配列番号２１１および２１２は、それぞれ例示的なＣａｓ１３ｄの核酸配列およびアミノ酸配列である。

配列番号２１３および２１４は、それぞれ例示的なＣａｓ１３ｄの核酸配列およびアミノ酸配列である。

配列番号２１５および２１６は、例示的な死んだ（ｄｅａｄ）Ｃａｓ１３ｄ（例えば、触媒として不活性な）アミノ酸配列である。

配列番号２１７は、例示的なネイティブなＨＥＰＮドメインＲＸＸＸＸＨである。

配列番号２１８～２２１は、例示的な核局在化シグナルコード配列およびタンパク質配列である。

配列番号２２２は、例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２２３は、ｇＲＮＡ配列に含まれ、ＲＮＡの編集のために配列番号２１２のＣａｓ１３ｄタンパク質と共に使用され得る例示的なＤＲ配列である。

配列番号２２４は、ｇＲＮＡ配列に含まれ、ＲＮＡの編集のために配列番号のＣａｓ１３ｄタンパク質と共に使用され得る例示的なＤＲ配列である。

配列番号２２５および２２６は、全長ヒト化アデニン塩基エディター（ＡＢＥ８ｅ）コード配列をｉｎｖｉｖｏで発現させるために使用することができる例示的な構築物である。配列番号２２５は、Ｎ末端ＡＢＥ８ｅ配列をコードし、以下の通り２つのｇＲＮＡ発現カセットを含む：ｎｔ１～１４１ＡＡＶ２末端逆位反復配列；ｎｔ１５９～２５５ＣＲＩＳＰＲｇＲＮＡ（逆向き）、ｎｔ２５６～５０４ヒトＵ６ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（逆向き）、ｎｔ５１２～１０１９ＣＭＶプロモーター、ｎｔ１０３４～１０５１５’非翻訳領域、ｎｔ１０５２～３２１７Ｎ末端ＡＢＥ８ｅエディター、ｎｔ３２１８～３３１５合成イントロン配列、ｎｔ３３１６～３４２７二量体形成ドメイン、ｎｔ３４３６～３４８５ポリアデニル化シグナル、ｎｔ３４９２～３７０６Ｈ１ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ｎｔ３７０７～３８０３ＣＲＩＳＰＲｇＲＮＡ、およびｎｔ３８２５～３９６５ＡＡＶ２末端逆位反復配列。配列番号２２５は、配列番号１６５および追加されたｇＲＮＡ発現カセットを含む。配列番号２２６は、Ｃ末端ＡＢＥ８ｅ配列をコードし、以下の通り２つのｇＲＮＡ発現カセットを含む：ｎｔ１～１４１ＡＡＶ２末端逆位反復配列、ｎｔ１５９～２５５ＣＲＩＳＰＲｇＲＮＡ（逆向き）、ｎｔ２５６～５０４ヒトＵ６ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（逆向き）、ｎｔ５１２～１０１９ＣＭＶプロモーター、ｎｔ１０３６～１１４７二量体形成ドメイン、ｎｔ１２５９～３９１０３’ＡＢＥ８ｅコード配列、ｎｔ３９３９～４０６９ポリアデニル化シグナル、ｎｔ４０７８～４２９２Ｈ１ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ｎｔ４２９３～４３８９ＣＲＩＳＰＲｇＲＮＡ、およびｎｔ４４１１～４５５１ＡＡＶ２末端逆位反復配列。配列番号２２６は、配列番号１６６および追加されたｇＲＮＡ発現カセットを含む。

詳細な説明
特に断りのない限り、技術用語は従来の使用に従って使用されている。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes VII, published by Oxford University Press, 1999；Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994;およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995；および他の同様の参考文献において見いだすことができる。

本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、単数ならびに複数の両方を指す。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「核酸分子を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇａｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、他の要素を排除せず、「核酸分子を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｍｏｌｅｃｕｌｅ）」を意味する。核酸に関して示されるありとあらゆる塩基サイズは、別段の指定のない限り、おおよそのものであり、説明目的で提示されることもさらに理解されるべきである。本明細書に記載のものと同様または同等である多くの方法および材料を使用することができるが、特定の適切な方法および材料を以下に記載する。矛盾する場合は、用語の説明を含めた本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。特許出願および特許を含めた全ての参考文献、ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示される種々の実施形態の概説を容易にするために、以下の特定の用語に関する説明を提示する：

投与：対象に、本明細書に提示される治療用核酸分子（例えば、核酸エディタータンパク質、ｇＲＮＡ、もしくは両方の１つもしくは複数の部分をコードするもの）または他の治療剤などの作用物質を任意の効果的な経路によって提供または与薬すること。例示的な投与経路としては、これだけに限定されないが、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、髄腔内、腫瘍内、骨内、および静脈内）、経皮、鼻腔内、および吸入経路が挙げられる。投与は、全身性のものまたは局所的なものであり得る。

アプタマー：特定の標的作用物質または分子に高い親和性および特異性で結合する核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）。アプタマーは、本明細書に開示される核酸分子に二量体形成ドメインとして使用することができる。一実施例では、２つのアプタマーが互いに、例えば、標準的な塩基対合、非標準的な塩基対相互作用、非塩基対合相互作用、またはこれらの組合せによって結合して、二量体形成を媒介し得る。一実施例では、アプタマーにより、アプタマーによって認識される１つまたは複数の標的の存在下でのみ、ＲＮＡ二量体形成（およびその後の組換え）が可能になる。アプタマーは、試験管内進化法（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）（ＳＥＬＥＸ）と称されるコンビナトリアル選択プロセスによって得られている（例えば、Ellington et al., Nature 1990, 346, 818-822；Tuerk and Gold Science 1990, 249, 505-510；Liu et al., Chem. Rev. 2009, 109, 1948-1998；Shamah et al., Acc. Chem. Res. 2008, 41, 130-138；Famulok, et al., Chem. Rev. 2007, 107, 3715-3743；Manimala et al., Recent Dev. Nucleic Acids Res. 2004, 1, 207-231；Famulok et al., Acc. Chem. Res. 2000, 33, 591-599；Hesselberth, et al., Rev. Mol. Biotech. 2000, 74, 15-25；Wilson et al., Annu. Rev. Biochem. 1999, 68, 611-647；Morris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998, 95, 2902-2907を参照されたい）。そのようなプロセスにおいて
、目的の標的分子に結合することができるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、１０^１４～１０^１５種の異なる配列からなる核酸ライブラリーから、選択、増幅および変異の反復ステップによって選択される。アプタマーのそれらの標的に対する親和性は抗体の親和性と競合し得、解離定数はピコモル濃度範囲の低さである（Morris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998, 95, 2902-2907；Green et al., Biochemistry 1996,
35, 14413-14424）。

アデノシンなどの小有機分子から、トロンビンなどのタンパク質、さらにはウイルスおよび細胞までの広範囲の標的に対して特異的なアプタマーが同定されている（Liu et al., Chem. Rev. 2009, 109, 1948-1998；Lee et al., Nucleic Acids Res. 2004, 32, D95-D100；Navani and Li, Curr. Opin. Chem. Biol. 2006, 10, 272-281；Song et al., TrAC, Trends Anal. Chem. 2008, 27, 108-117）。例えば、金属イオン、例えば、Ｚｎ（ＩＩ）（Ciesiolka et al., RNA 1: 538-550, 1995）およびＮｉ（ＩＩ）（Hofmann et al., RNA、3: 1289-1300, 1997）；ヌクレオチド、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）（Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34: 656-665, 1995）；およびグアニン（Kiga et al., Nucleic Acids Res., 26: 1755-60, 1998）；補因子、例えば、ＮＡＤ（Kiga et al., Nucleic Acids Res., 26: 1755-60, 1998）およびフラビン（Lauhon and Szostak, J. Am. Chem. Soc., 117: 1246-57, 1995）；抗生物質、例えば、バイオマイシン（Wallis et al., Chem. Biol. 4: 357-366, 1997）およびストレプトマイシン（WallaceおよびSchroeder, RNA 4: 112-123, 1998）；タンパク質、例えば、ＨＩＶ逆転写酵素（Chaloin et al., Nucleic Acids Res., 30: 4001-8, 2002）およびＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Biroccio et al., J. Virol. 76: 3688-96, 2002）；毒素、例えば、コレラ全毒素およびブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Bruno and Kiel, BioTechniques, 32:pp. 178-180 and 182-183, 2002）；ならびに細菌胞子、例えば、炭疽菌（Bruno and Kiel, Biosensors & Bioelectronics, 14: 457-464, 1999）を認識するアプタマーが利用可能である。

結合：２つの二量体形成ドメイン間など、１つの核酸分子と別の核酸分子（またはそれ自体）のハイブリダイゼーション、またはアプタマーとその標的の結合などの、２つの物質または分子間の会合。オリゴヌクレオチド分子と別の核酸分子は、それらのオリゴヌクレオチド分子と標的核酸の間に結合の検出を可能にする十分な数の相補的な塩基対が存在する場合、結合するまたは安定に結合する。一部の実施例では、核酸分子間の結合は直接起こり得る。一部の実施例では、核酸分子間の結合は、間接的に、例えば中間分子を通じて起こり得る。直接結合または間接結合のいずれも標準的な塩基対合によって、非標準的な塩基対相互作用によって、非塩基対相互作用によって、またはこれらの組合せで起こり得る。非標準的な塩基対相互作用は、これだけに限定されないが、フーグスティーン塩基対およびゆらぎ塩基対を含めた当業者に公知の任意の安定化の手段によって起こり得る。非塩基対相互作用は、中間分子を通じた結合を含み得る。一部の実施例では、直接結合は、キッシングループ二量体形成ドメイン間のものである。一部の実施例では、直接結合は低多様性二量体形成ドメイン間のものである。一部の実施例では、直接結合はアプタマー領域間のものである。一部の実施例では、アプタマー領域間の直接結合は非標準的な塩基対相互作用を伴う。一部の実施例では、アプタマー領域間の直接結合は標準的な塩基対合および非標準的な塩基対相互作用を伴う。一部の実施例では、間接結合は核酸架橋を通じて起こる。一部の実施例では、核酸架橋はｍＲＮＡである。核酸架橋の非限定的な例は図７Ｂに示されている。一部の実施例では、間接結合はアプタマー分子を通じて起こる。アプタマー分子を通じた間接結合の非限定的な例は図７Ａに示されている。一部の実施形態では、アプタマー分子を通じた間接結合はアプタマー分子と結合領域の間の非塩基対相互作用を伴う。一部の実施形態では、アプタマー分子を通じた間接結合はアプタマー分子と結合領域の間の非塩基対相互作用、および結合領域間の塩基対合相互作用を伴う。

Ｃ末端部分：タンパク質のＣ末端残基またはその付近から始まる連続した一続きのアミノ酸を含むタンパク質配列の領域。タンパク質のＣ末端部分は、連続した一続きのアミノ酸（例えば、いくつかのアミノ酸残基）によって定義することができる。

がん：異常なまたは制御されない細胞成長を特徴とする悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ
ｔｕｍｏｒ）。多くの場合がんに関連する他の特色としては、転移、近隣の細胞の正常機能への干渉、サイトカインまたは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、および炎症応答または免疫学的応答の抑制または増悪、周囲または遠位の組織または器官、例えば、リンパ節などへの浸潤が挙げられる。「転移性疾患」は、元の腫瘍部位を離れ、例えば血流またはリンパ系を介して体の他の部分に移動するがん細胞を指す。

Ｃａｓ９：原核生物ウイルスに対するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ免疫防御に関与するＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素。Ｃａｓ９は、二重らせんの各鎖に１つずつ、２つの活性なカット部位（ＨＮＨおよびＲｕｖＣ）を有する。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の例示的なネイティブなＣａｓ９配列が配列番号２０８に示されている。

エンドヌクレアーゼ活性は低減または消失しているが、ｄｓＤＮＡにはなお結合する、触媒として不活性な（非活性化または死んだ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質も本開示に包含される。一部の実施例では、ｄＣａｓ９は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインに１つまたは複数の変異、例えば、以下の点変異のうちの１つまたは複数を含む：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、およびＤ９８６Ａ（例えば、配列番号２０８における番号付けに基づいて）。Ｄ１０Ａ置換およびＨ８４０Ａ置換を有する例示的なｄＣａｓ９配列が配列番号２１０に示されている。一実施例では、ｄＣａｓ９タンパク質は、変異Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｄ８３９Ａ、およびＮ８６３Ａを有する（例えば、Esvelt et al., Nat. Meth. 10: 1116-21, 2013を参照されたい）。

Ｃａｓ９およびｄＣａｓ９配列は公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＣＰ０１２０４５．１のヌクレオチド７９６６９３．．８００７９９およびＣＰ０１４１３９．１のヌクレオチド１１０００４６．．１１０４１５２によりＣａｓ９核酸が開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿２６９２１５．１、ＡＭＡ７０６８５．１、およびＡＫＰ８１６０６．１によりＣａｓ９タンパク質が開示される。一部の実施例では、非活性化形態のＣａｓ９（ｄＣａｓ９）は、ヌクレアーゼ欠損したものである（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＫＡ６０２４２．１およびＫＲ０１１７４８．１に示されているもの）。活性化可能なＣａｓ９タンパク質が米国特許出願公開第２０１８－００７３００２－Ａ１号に提示されている。ある特定の実施例では、本明細書において開示される組成物または方法において使用されるＣａｓ９またはｄＣａｓ９は、そのような配列（例えば、配列番号２０７、２０８、２０９、および２１０）に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有し、本明細書において開示される組成物および方法への使用可能性を保持する（例えば、本明細書に開示される２つまたはそれよりも多くの別々の分子によってコードすることができ、その後、本明細書に提示されるＲＥＪ法によって組み換えることができる）。

Ｃａｓ１３ｄ：ＲＮＡをカットし得るまたはそれに結合し得る、ＲＮＡ誘導型ＲＮＡエンドヌクレアーゼ酵素。Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、特定の二次構造を有するｇＲＮＡに存在するダイレクトリピート（ＤＲ）配列を特異的に認識する。Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、１つまたは２つのＨＥＰＮドメインを含む。ネイティブなＨＥＰＮドメインは、配列ＲＸＸＸＸＨ（配列番号２１７）を含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。変異したＨＥＰＮドメイン（複数可）を含み、したがって、ＲＮＡをカットすることができないが、ｇＲＮＡをプロセシングすることはできる、触媒として不活性なまたは「死んだ」Ｃａｓ１３ｄも本開示に包含される（例えば、配列番号２１５および２１６参照）。そのような死んだＣａｓ１３ｄ（ｄＣａｓ１３ｄ）をプレｍＲＮＡのシス－エレメントにターゲティングして、選択的スプライシングを操作することができる。

例示的なネイティブなおよびバリアントＣａｓ１３ｄタンパク質配列はＷＯ２０１９／０４０６６４、ＵＳ１０，８７６，１０１およびＵＳ１０，３９２，６１６（全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に、ならびに本明細書において配列番号２１２、２１４、２１５、２１６、および２２２として、提示される。

一実施例では、全長（短縮されていない（non-truncated））Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、８７０アミノ酸から１０８０アミノ酸の間の長さである。一実施例では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ目の細菌のゲノム配列またはメタゲノム配列に由来する。一実施例では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質の対応するＤＲ配列は、Ｃａｓ１３ｄｇＲＮＡを含む分子内のスペーサー配列の５’末端に位置する。一実施例では、Ｃａｓ１３ｄｇＲＮＡ内のＤＲ配列は、プロセシングされていないＣａｓ１３ｄガイドアレイ転写物のＤＲ配列と比べて５’末端において短縮されている（例えば、少なくとも１ｎｔ、少なくとも２ｎｔ、少なくとも３ｎｔ、少なくとも４ｎｔ、少なくとも５ｎｔ、例えば、１～３ｎｔ、３～６ｎｔ、５～７ｎｔ、または５～１０ｎｔ短縮されている）。一実施例では、Ｃａｓ１３ｄｇＲＮＡ内のＤＲ配列は、Ｃａｓ１３ｄタンパク質によって５’末端において５～７ｎｔ短縮されている。一実施例では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質により、スペーサー－標的２重鎖の３’末端に隣接する標的ＲＮＡを、ａ、Ｕ、ＧまたはＣリボヌクレオチドのいずれかで、および５’末端に隣接する標的ＲＮＡを、ａ、Ｕ、ＧまたはＣリボヌクレオチドのいずれかでカットすることができる。

一実施例では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列番号２１２、２１４、２１５、２１６、または２２２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。一実施例では、Ｃａｓ１３ｄコード配列は、配列番号２１２、２１４、２１５、２１６、または２２２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するＣａｓ１３ｄタンパク質をコードする。一実施例では、Ｃａｓ１３ｄコード配列は、配列番号２１１または２１３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。

相補性：核酸の、別の核酸配列と従来のワトソン・クリック塩基対合または他の従来のものではない型のいずれかによって水素結合（複数可）を形成する能力。パーセント相補性は、核酸分子（例えば、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ）内の、第２の核酸配列、例えばｇＲＮＡと水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対合）を形成し得る残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個のうち５個、６個、７個、８個、９個、１０個であれば、５０％相補的、６０％相補的、７０％相補的、８０％相補的、９０％相補的、および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の連続した残基の全てが第２の核酸配列内の同じ数の連続した残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」とは、本明細書で使用される場合、相補性の程度が、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、もしくはそれよりも長い領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であることを指すか、または、２つの核酸がストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを指す。したがって、一部の実施例では、第１の二量体形成ドメインと第２の二量体形成ドメインは、互いに完全に相補的である（例えば、１００％）。他の例では、第１の二量体形成ドメインと第２の二量体形成ドメインは、互いに実質的に相補的である（例えば、少なくとも８０％）。

接触：固体または液体の形態を含め、直接の物理的な関連に置かれること。接触は、ｉｎｖｉｔｒｏもしくはｅｘｖｉｖｏでは、例えば、試薬を試料（例えば、細胞を含有するものなど）に添加することによって、またはｉｎｖｉｖｏでは対象に投与することによって生じさせることができる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系：プラスミドおよびファージなどの外来遺伝子エレメントに対する抵抗性を付与し、獲得免疫の一形態をもたらす原核生物免疫系。系は、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３ｄ）と、標的ＲＮＡまたはＤＮＡに特異的に結合し、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位に方向付けるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。本明細書において開示される組成物、系、および方法を使用して、２つまたはそれよりも多くの異なるＤＮＡ分子からＣａｓヌクレアーゼを発現させることができ、一部の実施例では、当該ＤＮＡ分子は、遺伝子発現を調節するため、例えば、標的核酸分子の発現を増加もしくは低減させるため、および／または標的核酸分子の配列を編集するため（例えば、疾患に関連する１つもしくは複数の変異、例えば、置換、挿入もしくは欠失を修復するため）の１つまたは複数のｇＲＮＡをさらにコードする。

死んだガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）：野生型Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を標的核酸に向けてガイドすることはできるが二本鎖ＤＮＡ切断は誘導しないガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。短くされたｇＲＮＡは約１４～１５ヌクレオチドの短くされた標的化配列を含有し、一方、死んでいないｇＲＮＡは約２０ヌクレオチドの標的化配列を含有する。ｄｇＲＮＡは、例えば、全てその全体が参照により本明細書に組み込まれるDahlman et al. (2015) Nat. Biotechnol. 33: 1159-1161；Kiani et al. (2015) Nat. Methods, 12: 1051-1054；およびHsin-Kai Liao et al. (2017) Cell, 171: 1495-1507にさらに記載されている。一部の実施例では、ｄｇＲＮＡは、ＲＮＡ分子である（例えば、細胞において発現させる場合）。一部の実施例では、ｄｇＲＮＡは、ＤＮＡ分子によってコードされる（例えば、ウイルスベクターなどのベクター内にある場合）。

ＤＮＡ編集：ＤＮＡ内の所望の位置における部位特異的な鎖の切断を作り出すヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３ｄまたはその死んだバージョン）を使用して細胞または生物体においてＤＮＡ分子（またはＤＮＡのヌクレオチド）を挿入する、欠失させるまたは置き換える、遺伝子操作の型。誘導された切断は修復され、それにより、標的化変異または修復がもたらされる。例えば、本明細書に提示されるＲＥＪ系を使用してＣａｓヌクレアーゼを発現させるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ法を使用して、がん（例えば、乳がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、黒色腫）、感染性疾患（例えば、ＨＩＶ、肝炎、ＨＰＶ、およびウエストナイルウイルス）、または神経変性障害（例えば、ハンチントン病またはＡＬＳ）に関連するものなどの１つまたは複数の標的ＤＮＡの配列を編集することができる。例えば、ＤＮＡ編集を使用して、疾患またはウイルス感染を処置することができる。

ＤＮＡ挿入部位：外因性ポリヌクレオチドの挿入の標的とされるまたは外因性ポリヌクレオチドの挿入を受けたＤＮＡの部位。本明細書に開示される方法は、ＤＮＡをＤＮＡ挿入部位における操作の標的とするために使用することができる、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの核酸分子から発現される核酸エディターの使用を包含する。

ダウンレギュレートされたまたはノックダウンされた：標的核酸またはタンパク質などの分子の発現に関して使用される場合、標的核酸またはタンパク質の産生の低減をもたらすが、一部の実施例では標的ＲＮＡ産物または標的核酸機能の完全な排除をもたらすものではない任意のプロセスを指す。一実施例では、ダウンレギュレーションまたはノックダウンは、検出可能な標的核酸／タンパク質の発現または活性の完全な排除をもたらすものではない。一部の実施例では、標的核酸のダウンレギュレーションまたはノックダウンは、標的ＲＮＡの翻訳を低減し、したがって、対応するタンパク質の存在を低減し得るプロセスを含む。本明細書に開示される系を、任意の標的核酸／目的のタンパク質をダウンレギュレートするために使用することができる。

ダウンレギュレーションまたはノックダウンは、標的核酸／タンパク質の任意の検出可能な低減を含む。ある特定の実施例では、細胞または無細胞系における検出可能な標的核酸／タンパク質は、対照（対応する無処理の細胞または試料において検出される標的核酸／タンパク質の量など）と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％低減する（例えば、４０％～９０％、４０％～８０％または５０％～９５％の低減など）。一実施例では、対照は、正常な細胞（例えば、本明細書に提示されるＲＮＡ組換えのための核酸分子を含まない非組換え細胞）における発現の相対量である。

有効量：有益なまたは所望の結果をもたらすために十分である、作用物質（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１３ｄタンパク質などの核酸編集タンパク質の異なる部分をそれぞれがコードする複数のベクターを、例えば、有効量の、核酸標的とハイブリダイズすることができる１つまたは複数のｇＲＮＡと組み合わせて提供する系）の量。有効量は、例えば核酸標的とハイブリダイズすることができる１つまたは複数のｇＲＮＡと組み合わせて有益なまたは所望の結果をもたらすために十分である、正しく結合したＲＮＡまたは産生された核酸編集タンパク質の量を指す場合もある。

有効量（治療有効量とも称される）は、処置される対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式などの１つまたは複数に応じて変動し得、それは当業者が決定することができる。有益な治療効果としては、診断的決定の実施可能性；疾患、症状、障害、または病的状態の好転；疾患、症状、障害または状態の発症の減少または防止；および疾患、症状、障害または病的状態を概ね打ち消すことを挙げることができる。

一実施形態では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の「有効量」は、遺伝子疾患またはがんなどの疾患を処置するために十分なものである。一実施形態では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の「有効量」は、処置される患者の生存時間を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を投与しない場合と比較して）増大させるために十分な量である。一実施形態では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の「有効量」は、処置される患者の生存時間を、例えば、少なくとも６カ月、少なくとも９カ月、少なくとも１年、少なくとも１．５年、少なくとも２年、少なくとも２．５年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１２年、少なくとも１５年、または少なくとも２０年（本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を投与しない場合と比較して）増大させるために十分な量である。一実施形態では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の「有効量」は、処置される患者（ＤＭＤ患者など）の可動性を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を投与しない場合と比較して）増大させるために十分な量である。一実施形態では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の「有効量」は、処置される患者（ＤＭＤ患者など）の可動性を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を投与しない場合と比較して）増大させるために十分な量である。一実施形態では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の「有効量」は、処置される患者（ＤＭＤ患者など）の認知能力を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を投与しない場合と比較して）増大させるために十分な量である。一実施形態では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の「有効量」は、処置される患者（ＤＭＤ患者など）の呼吸機能を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を投与しない場合と比較して）増大させるために十分な量である。一実施形態では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の「有効量」は、処置される患者（血友病患者など）の血液凝固を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を投与しない場合と比較して）増大させるために十分な量である。一実施形態では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の「有効量」は、処置される患者（アッシャー症候群またはスタルガルト病の患者など）の視覚を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を投与しない場合と比較して）増大させるために十分な量である。一実施形態では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の「有効量」は、処置される患者（アッシャー症候群の患者など）の聴覚を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を投与しない場合と比較して）増大させるために十分な量である。

一実施形態では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の「有効量」は、処置されるＤＭＤ患者の腓腹筋サイズを、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％（本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を投与しない場合と比較して）減少させるために十分な量である。一実施形態では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の「有効量」は、処置されるＤＭＤ患者の心筋症筋肉のサイズを、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％（本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を投与しない場合と比較して）減少させるために十分な量である。一部の実施例では、これらの効果の組合せが実現される。

ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）：Ｃａｓヌクレアーゼ（または死んだＣａｓヌクレアーゼ）タンパク質を標的ＤＮＡ（例えば、ゲノム配列）または標的ＲＮＡ配列などの標的核酸配列に方向付けるために使用される合成核酸配列。ｇＲＮＡ分子は、単一の核酸分子の一部としてか、または２つもしくはそれよりも多くの核酸分子に分けてかを問わず、（１）標的核酸に対して配列相補性を有する部分（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の配列相補性、および（２）Ｃａｓヌクレアーゼに結合する二次構造、を有する部分を含む。したがって、Ｃａｓタンパク質の標的核酸を、単にｇＲＮＡ内に存在する標的配列を変化させることによって変化させることができる（CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Fuguo Jiang and Jennifer A. Doudna, Annual Review of Biophysics, 46:1, 505-529 (2017)を参照されたい）。一部の実施例では、ｇＲＮＡは、ＲＮＡ分子である（例えば、細胞において発現させる場合）。一部の実施例では、ｇＲＮＡは、ＤＮＡ分子によってコードされる（例えば、ウイルスベクターなどのベクターの一部の場合）。ｇＲＮＡは、修飾塩基または化学修飾を含んでよい（例えば、Latorre et al., Angewandte Chemie 55: 3548-50, 2016を参照されたい）。

一部の実施例では、ｇＲＮＡは、２つまたはそれよりも多くのＭＳ２結合ループ配列を含み、これらを、ＧＣ含量を増加させるように、および／または反復コンテンツを短くするようにネイティブなＭＳ２結合ループ配列から改変することができる。一部の実施例では、ＧＣ含量を増加させるように、および／または反復コンテンツを短くするようにｇＲＮＡが改変される。

一部の実施例では、ｇＲＮＡは、死んだガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である。ｇＲＮＡのＧＣ含量を増加させることおよび／または反復コンテンツを短くすることを使用して、ｇＲＮＡを、ｄｇＲＮＡ、すなわち、Ｃａｓヌクレアーゼを標的核酸配列に方向付けることはできるが、ＤＮＡ二本鎖切断（またはＲＮＡ一本鎖切断）は誘導しないガイド核酸分子に変換することができる。

一実施例では、ｇＲＮＡは、ＣａｓＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を標的ＤＮＡに方向付ける。そのような一実施例では、ｇＲＮＡは、５’から３’に、（１）標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズする（および一部の実施例では標的ＤＮＡ配列を編集する）ように設計された配列を含むＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）領域、およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とハイブリダイズする領域、ならびに（２）Ｃａｓとの結合に必要な足場配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。したがって、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを組み合わせて単一のＲＮＡ転写物にしたものであってよい（当技術分野では単一ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡと称される；簡単にするために、本明細書では「ｇＲＮＡ」という用語に包含される）。この実施例では、ｃｒＲＮＡのある領域が、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズして、Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と結合し、当該タンパク質を標的ＤＮＡ分子にガイドする独特の二重ＲＮＡハイブリッド構造を形成する。一部の実施例では、ｃＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子である（例えば、２ピースのｇＲＮＡ；簡単にするために、これも本明細書では「ｇＲＮＡ」という用語に包含される）。一部の実施例では、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、編集される標的ＤＮＡの部位（例えば、ＰＡＭの約３ｎｔ上流のＣａｓ９切断部位）のすぐ後ろに続く。

別の実施例では、ｇＲＮＡは、ＣａｓＲＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ１３ｄ）を標的ＲＮＡに方向付ける。そのような一実施例では、ｇＲＮＡは、５’から３’に、（１）ダイレクトリピート（ＤＲ）領域を含有するｃｒＲＮＡ、ならびに（２）例えばＣａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｃ、およびＣａｓ１３ｄヌクレアーゼに対するスペーサーを含む。一実施例では、ｇＲＮＡは、約３６ｎｔのＤＲ、その後に約２８～３２ｎｔのスペーサー配列を含む。別のそのような実施例では、ｇＲＮＡは、５’から３’に、（１）スペーサー、および（２）例えば、Ｃａｓ１３ｂヌクレアーゼに対するＤＲ領域を含有するｃｒＲＮＡを含む。一部の実施例では、ｇＲＮＡは、ＣａｓＲＮＡヌクレアーゼまたは他のＲＮａｓｅによってプロセシング（短縮／修飾）されて、より短い「成熟」形態になる。ＤＲは、ＣａｓＲＮＡヌクレアーゼタンパク質とｇＲＮＡの相互作用を容易にする二次構造を含有する、ｇＲＮＡの定常部分である。スペーサー部分は、ｇＲＮＡの可変部分であり、標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズするように（および一部の実施例では標的ＲＮＡ配列を編集するように）設計された配列を含む。一部の実施例では、全長スペーサーは約２８～３２ｎｔ（例えば、３０～３２ｎｔ）の長さであり、一方、成熟（プロセシングされた）スペーサーは約１４～３０ｎｔである。

ハイブリダイゼーション：核酸のハイブリダイゼーションは、２つの核酸分子が互いにある量の水素結合をなす場合に生じる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸周囲の環境条件、ハイブリダイゼーション方法の性質、ならびに使用される組成物および核酸の長さに応じて変動し得る。特定の程度のストリンジェンシーを達成するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する算出は、Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001）；およびTijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2（Elsevier, New York, 1993）において考察されている。Ｔ_ｍ
は、核酸の所与の鎖の５０％がその相補鎖とハイブリダイズする温度である。

増加または減少：それぞれ、対照値（例えば、本明細書で提供される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の投与がないなど、治療剤なしを表す値）からの数量（quantity）の統計的に有意な正の変化または負の変化。増加は正の変化であり、例えば、対照値と比較して少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％または少なくとも５００％の増加である。減少は負の変化であり、例えば、対照値と比較して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の減少である。一部の実施例では、減少は、１００％未満、例えば、９０％以下、９５％以下、または９９％以下の減少である。

単離された：「単離された」生物学的成分（例えば、核酸分子またはタンパク質）は、その成分が存在する生物体の細胞または組織内の他の生物学的成分、例えば、他の細胞（例えば、ＲＢＣ）、染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質から実質的に分離されているか、それとは別に作製されているか、またはそれから離して精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞において組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸およびタンパク質も包含する。

キッシングループ／キッシングステムループ：２つのヘアピンループ間の塩基がペア相互作用を形成する場合に形成されるＲＮＡ構造。これらの分子間「キッシング相互作用」は、１つのヘアピンループ内の対合していないヌクレオチドが、別のヘアピンループ内の対合していないヌクレオチドと塩基対合して、安定な相互作用複合体を形成する場合に生じる。例として図９Ａを参照されたい。

Ｎ末端部分：タンパク質のＮ末端残基から始まる連続した一続きのアミノ酸を含むタンパク質配列の領域。タンパク質のＮ末端部分は、連続した一続きのアミノ酸（例えば、いくつかのアミノ酸残基）によって定義することができる。

天然に存在しない、合成の、または操作された：本明細書では互換的に使用され、人間の手の関与を示す用語。これらの用語は、核酸分子またはポリペプチドについて言及する場合、その核酸分子またはポリペプチドが、それらが天然では天然に関連し、天然に見いだされる少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを示す。さらに、これらの用語は、核酸分子またはポリペプチドが天然に見いだされない配列を有することを示し得る。

核酸分子：天然のヌクレオチド／リボヌクレオチド、および／または、天然に存在するヌクレオチドと同様に核酸分子とハイブリダイズする、天然のヌクレオチド／リボヌクレオチドの類似体を含み得るデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）ポリマー。核酸分子は、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡまたはＲＮＡ分子または二本鎖（ｄｓ）核酸分子であり得る。ＲＮＡまたはｍＲＮＡは、本明細書で使用される場合、プレｍＲＮＡ分子、または成熟ＲＮＡ転写物を指し得る。プレｍＲＮＡ分子は、プロセシングによって除去される配列、例えば、本明細書に記載の二量体形成ドメインの結合後にスプライシングによって除去されるイントロン配列を含む。本明細書に記載の核酸分子は、例えば、ＤＮＡ発現ベクターに関してはＤＮＡ上のプロモーターによりＲＮＡが転写されるところのＤＮＡ分子であり得る。

作動可能に連結した：第１の核酸配列が第２の核酸配列との機能的関係に置かれている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列に作動可能に連結している。例えば、プロモーターが核酸配列の発現に影響を及ぼす、例えば、プロモーターが、スプライスされるとタンパク質（例えば、核酸編集タンパク質コード配列の一部）の発現をもたらし得るプレｍＲＮＡの転写に影響を及ぼす場合、プロモーター配列はその核酸配列に作動可能に連結している。

薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体は従来のものである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)には、本明細書に開示される核酸分子などの治療剤の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。

一般に、担体の性質は、使用される特定の投与形式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、例えば、水、生理的食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的にかつ生理的に許容される流体を含む注射可能な流体をビヒクルとして含む。投与される医薬組成物は、生物学的に中性の担体に加えて、微量の無毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。

ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質：任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは直鎖であっても分枝であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、また、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語は、修飾されたアミノ酸ポリマー；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作を受けたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤ光学異性体またはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含めた、天然アミノ酸および／または天然ではないアミノ酸または合成アミノ酸を含む。一実施例では、タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３ｄ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼなどの核酸編集タンパク質である。一実施例では、タンパク質は、遺伝子疾患などの疾患に関連するものである（例えば、表１～４参照）。一実施例では、タンパク質は、例えばがんなどの疾患の処置に使用されるものなどの、治療用タンパク質である。一実施例では、タンパク質は、少なくとも５０アミノ酸の長さ、少なくとも１００アミノ酸の長さ、少なくとも５００アミノ酸の長さ、少なくとも１０００アミノ酸の長さ、少なくとも１５００アミノ酸の長さ、例えば、少なくとも２０００アミノ酸、少なくとも２５００アミノ酸、少なくとも３０００アミノ酸、または少なくとも５０００アミノ酸である。

ポリピリミジントラクト：転写後修飾のプロセスの間にＲＮＡスプライシングを行うために特殊化されたタンパク質複合体であるスプライソソームのアセンブリを促進する、プレメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の領域。このトラクトは、主にウラシルなどのピリミジンヌクレオチドであり得、一部の実施例では、１５～２０塩基対の長さであり、スプライスされるイントロンの３’末端の約５～４０塩基対前に位置する。

プロモーター／エンハンサー：核酸配列の転写を方向付ける一群の核酸制御配列。プロモーターは、転写の開始部位近くに必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合ではＴＡＴＡエレメントを含む。プロモーターはまた、必要に応じて、転写の開始部位から数千塩基対ものところに位置し得る遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。一部の実施例では、プロモーター配列＋その対応するコード配列は、ＡＡＶの容量よりも大きい。一部の実施例では、標的タンパク質のプロモーター配列は、少なくとも３５００ｎｔ、少なくとも４０００ｎｔ、少なくとも５０００ｎｔ、またはさらには少なくとも６０００ｎｔである。

「構成的プロモーター」は、絶えず活性であり、外部のシグナルまたは分子による調節を受けないプロモーターである。対照的に、「誘導性プロモーター」の活性は、外部のシグナルまたは分子（例えば、転写因子）によって調節される。構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターのどちらも本明細書に提示される方法および系において使用することができる（例えば、Bitter et al., Methods in Enzymology 153: 516-544, 1987を参照されたい）。組織特異的プロモーターは、本明細書に提示される方法および系において、例えば、主に所望の組織または目的の細胞、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の器官（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞型（例えば、リンパ球）における発現を方向付けるために使用することができる。一部の実施例では、本明細書で使用されるプロモーターは、発現させる標的タンパク質に対して内因性である。一部の実施例では、本明細書で使用されるプロモーターは、発現させる標的タンパク質に対して外因性である。

プロモーター依存性遺伝子発現を細胞型特異的、組織特異的に制御可能にする、または外部のシグナルもしくは作用物質による誘導性にするために十分であるプロモーターエレメントも包含され、そのようなエレメントは、遺伝子の５’領域または３’領域に位置し得る。組換えＤＮＡまたは合成技法によって作製されたプロモーターを使用して核酸配列の転写をもたらすこともできる。

本明細書に提示される方法および系と共に使用することができる例示的なプロモーターとしては、これだけに限定されないが、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（必要に応じてＣＭＶエンハンサーを伴う）、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーター）、ｐｏｌＩＩプロモーター（例えば、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じてＲＳＶエンハンサーを伴う）、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター）が挙げられる。

組換え：組換え核酸分子またはタンパク質配列は、天然に存在しない配列を有するか、または、２つの、そうでなければ分離されている配列のセグメントの人工的な組合せによって作出された配列を有するものである（例えば、核酸編集タンパク質コード配列の一部、例えば、コード配列の約３分の１、半分、または３分の２を含むウイルスベクター）。この人工的な組合せは、例えば、単離された核酸のセグメントの化学合成または人工的な操作によって、例えば、遺伝子操作技法によって達成することができる。同様に、組換えまたはトランスジェニック細胞は、組換え核酸分子を含有するものである。

ＲＮＡ編集：ＲＮＡ内の所望の位置における部位特異的な鎖の切断を作り出す操作されたヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ１３ｄおよびｄＣａｓ１３ｄタンパク質）を使用して細胞または生物体におけるＲＮＡ分子（またはＲＮＡのリボヌクレオチド）を挿入する、欠失させる、または置き換える遺伝子操作の型。誘導された切断は修復され、それにより、標的化変異または修復がもたらされる。例えば、本明細書に提示されるＲＥＪ系を使用してＣａｓヌクレアーゼを発現させるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ法を使用して、がん（例えば、乳がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、黒色腫）、感染性疾患（例えば、ＨＩＶ、肝炎、ＨＰＶ、およびウエストナイルウイルス）、または神経変性障害（例えば、ハンチントン病またはＡＬＳ）に関連するものなどの１つまたは複数の標的ＲＮＡの配列を編集することができる。例えば、ＲＮＡ編集を使用して、疾患またはウイルス感染を処置することができる。

ＲＮＡ挿入部位：外因性ポリヌクレオチドもしくはポリリボヌクレオチドの挿入の標的とされるまたは外因性ポリヌクレオチドもしくはポリリボヌクレオチドの挿入を受けたＲＮＡの部位。本明細書に開示される方法は、ＲＮＡをＲＮＡ挿入部位における操作の標的とするために使用することができる、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの核酸分子から発現された核酸エディターの使用を包含する。

配列同一性：アミノ酸（またはヌクレオチド）配列間の類似性は、他には配列同一性と称される、配列間の類似性に関して表される。配列同一性は、パーセンテージ同一性（または類似性または相同性）に関して測定される頻度が高い；パーセンテージが高いほど、２つの配列の類似性が大きい。

比較のために配列をアラインメントする方法は公知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970；Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988；Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988；Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988；およびPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988に記載されている。Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994には、配列アラインメント法および相同性の算出に関する詳細な考察が提示されている。

配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するためのＮＣＢＩＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403, 1990）がＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）およびインターネットを含めたいくつかの供給源から入手可能である。このプログラムを使用してどのように配列同一性を決定するかの説明は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。

ネイティブなタンパク質またはコード配列（例えば、ＤＭＤ、第８因子、第９因子、またはＡＢＣＡ４配列）のバリアントは、一般には、ＮＣＢＩＢｌａｓｔ２．０、デフォルトパラメータに設定されたギャップ挿入ｂｌａｓｔｐを使用してアミノ酸配列とのアラインメント全長にわたって計数して、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有することを特徴とする。約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較に関しては、Ｂｌａｓｔ２配列関数を用い、デフォルトパラメータ（ギャップ存在コスト（ｇａｐｅｘｉｓｔｅｎｃｅｃｏｓｔ）１１、および１残基当たりのギャップコスト（ｐｅｒｒｅｓｉｄｕｅｇａｐｃｏｓｔ）１）に設定されたデフォルトのＢＬＯＳＵＭ６２行列を使用する。短いペプチド（およそ３０アミノ酸未満）をアラインメントする場合には、Ｂｌａｓｔ２配列関数を使用し、デフォルトパラメータ（オープンギャップ（ｏｐｅｎｇａｐ）９、エクステンションギャップ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｇａｐ）１ペナルティ）に設定されたＰＡＭ３０行列を用いてアラインメントを実施すべきである。参照配列に対してさらに大きな類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合、ますます大きなパーセンテージ同一性、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を示す。配列の全体未満を配列同一性について比較する場合、ホモログおよびバリアントは、一般には、１０～２０アミノ酸の短いウインドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を有し、参照配列に対するそれらの類似性に応じて少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有し得る。そのような短いウインドウにわたって配列同一性を決定するための方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。これらの配列同一性の範囲は単にガイダンスとして提供され、提供された範囲外の極めて意義深いホモログを得ることができる可能性がある。

本明細書に開示される核酸配列のバリアント（例えば、合成イントロン配列およびコード配列）は、一般には、デフォルトパラメータに設定されたＮＣＢＩＢｌａｓｔ２．０、ギャップ挿入ｂｌａｓｔｎを使用し、核酸配列とのアラインメント全長にわたって計数して、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有することを特徴とする。これらの配列同一性の範囲は単にガイダンスとして提供され、提供された範囲外の機能的配列を得ることができる可能性があることが当業者には理解されよう。

対象：哺乳動物、例えば、ヒト。哺乳動物としては、これだけに限定されないが、マウス、サル、ヒト、農場動物、競技動物、および愛玩動物が挙げられる。一実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物対象、例えば、サルもしくは他の非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イルカ、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシである。一部の実施例では、対象は、マウス、ウサギ、またはラットなどの実験動物／生物体である。一部の実施例では、本明細書に開示される方法を使用して処置される対象はヒトである。

一部の実施例では、対象は、本明細書に開示される方法を使用して処置することができる、表１～４に列挙されているものなどの遺伝子疾患を有する。一部の実施例では、本明細書に開示される方法を使用して処置される対象は遺伝子疾患を有するヒト対象である。一部の実施例では、本明細書に開示される方法を使用して処置される対象はがんを有するヒト対象である。一部の実施例では、本明細書に開示される方法を使用して処置される対象は、細菌またはウイルス感染などの感染を有するヒト対象である。

標的核酸：変更されるおよび／またはその発現がモジュレートされる配列を有する遺伝子などの核酸分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ配列。一部の実施例では、標的核酸分子は、１つの核酸分子、同じ核酸分子（例えば、同じＲＮＡもしくは遺伝子）の２つもしくはそれよりも多くの部分、２つもしくはそれよりも多くの異なる核酸分子（例えば、２つの異なる遺伝子もしくは２つの異なるＲＮＡ）、または２つもしくはそれよりも多くの異なる核酸分子の２つもしくはそれよりも多くの部分である。標的核酸分子は、１つまたは複数の標的編集部位を含み得、当該標的編集部位は、変更される、例えば、置換、欠失、または挿入がなされる、標的核酸分子の領域（例えば、標的の１つまたは複数のヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、例えば、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、または少なくとも３０個の連続したヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）である。一部の実施例では、標的核酸分子は、発現がモジュレートされる、例えば、遺伝子産物の発現（例えば、タンパク質）が増加または低減されるものである。一実施例では、標的核酸分子は、発現の活性化が望まれるＤＮＡ、ＲＮＡ、または遺伝子である。一実施例では、標的核酸分子は、発現の低減または消失が望まれるＤＮＡ、ＲＮＡ、または遺伝子である。一実施例では、標的核酸分子は、疾患をもたらす１つまたは複数の点変異を有するＤＮＡ、ＲＮＡ、または遺伝子である（例えば、表１～４に列挙されているもの）。一部の実施例では、標的化配列（例えば、ｇＲＮＡのもの）は、標的遺伝子／核酸に対して相補性を有する。他の例では、標的化配列（例えば、ｇＲＮＡのもの）は、標的核酸分子のプロモーターおよび／または調節エレメントに対して相補性を有する。一部の実施例では、標的核酸配列はＤＮＡであり、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）のすぐ隣に存在する。一部の実施例では、標的核酸配列は、細胞内の他の核酸配列と比較して独特である。

標的化配列：標的核酸配列に対して相補性を有するｇＲＮＡの部分。一部の実施例では、標的化配列は、発現の活性化または抑止が望まれる標的核酸のプロモーターまたは調節エレメントに対して相補性を有する。一部の実施例では、ｇＲＮＡの標的化配列は約１４～３０ｎｔであり、標的核酸配列に対して、標的配列とハイブリダイズし、Ｃａｓヌクレアーゼの標的核酸配列への配列特異的結合を方向付けるために十分な相補性を有する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列とその対応する標的核酸の間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントした場合、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９８％、約９９％、もしくはそれよりも大きい、または約５０％よりも大きい、約６０％よりも大きい、約７５％よりも大きい、約８０％よりも大きい、約８５％よりも大きい、約９０％よりも大きい、約９５％よりも大きい、約９７．５％よりも大きい、約９８％よりも大きい、約９９％よりも大きい、もしくはそれよりも大きい。一部の実施形態では、相補性の程度は１００％である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用することで決定することができ、アルゴリズムの非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－ＷｈｅｅｌｅｒＴｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、ＢｕｒｒｏｗｓＷｈｅｅｌｅｒＡｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（ＮｏｖｏｃｒａｆｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて入手可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて入手可能）が挙げられる。

治療剤：対象に投与されるといくらかの有益な効果をもたらす１つまたは複数の分子または化合物を指す。本明細書に開示される合成核酸分子および本明細書に提示される系は治療剤である。有益な治療効果としては、診断的決定の実施が可能になること；疾患、症状、障害、または病的状態の好転；疾患、症状、障害または状態の発症の減少または防止；および疾患、症状、障害または病的状態を概ね打ち消すことを挙げることができる。

転写活性化因子：遺伝子などの核酸分子の転写を増加させるタンパク質またはタンパク質ドメイン。そのようなタンパク質を本明細書に提示される組成物、系および方法に使用することができる。そのようなタンパク質およびタンパク質ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写を活性化するためのドメインを有し得る。これらの活性化因子を、ＣａｓヌクレアーゼまたはｇＲＮＡに結合させることによって系に導入することができる。そのような活性化因子の例としては、ＶＰ６４、ｐ６５、筋原性分化１（ＭｙｏＤ１）、熱ショック転写因子（ＨＳＦ）１、ＲＴＡ、ＣＢＰ、ＳＥＴ７／９、またはこれらの任意の組合せ（例えば、ｐ６５およびＨＳＦ１）が挙げられる。

形質導入された、形質転換された、およびトランスフェクトされた：ウイルスまたはベクターにより核酸分子が細胞に移入された場合、ウイルスまたはベクターにより細胞への「形質導入」がなされた。細胞は、核酸の細胞ゲノムへの組み入れによってか、またはエピソーム複製によってのいずれかで核酸が細胞によって安定に複製される場合、細胞に形質導入された核酸により「形質転換」または「トランスフェクト」されたものである。

これらの用語は、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション、プラスミドベクターを用いた形質転換、ならびに電気穿孔、リポフェクション、パーティクルガン加速および当技術分野における他の方法によるネイキッドＤＮＡの導入を含めた、核酸分子をそのような細胞に導入することができる全ての技法を包含する。一部の実施例では、方法は、化学的方法（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション）、物理的方法（例えば、電気穿孔、微量注射、粒子衝撃）、融合（例えば、リポソーム）、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、ＤＮＡ－タンパク質複合体、ウイルスエンベロープ／カプシド－ＤＮＡ複合体）および組換えウイルスなどのウイルスによる生物学的感染である（Wolff, J. A.、ed, Gene Therapeutics, Birkhauser, Boston, USA, 1994）。核酸分子を細胞に導入するための方法は公知である（例えば、米国特許第６，１１０，７４３号を参照されたい）。これらの方法を使用して、本明細書に開示される核酸分子を細胞に形質導入することができる。

導入遺伝子：例えばＡＡＶなどのベクターによって供給される、外因性遺伝子。一実施例では、導入遺伝子は、例えば、プロモーター配列に作動可能に連結した、核酸編集タンパク質の一部、例えば、核酸編集タンパク質の約３分の１、半分、または３分の２をコードする。一実施例では、導入遺伝子は、例えば、プロモーター配列に作動可能に連結した、Ｃａｓヌクレアーゼコード配列の一部、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼコード配列の約３分の１、半分、または３分の２を含む。

処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）、処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、および治療（ｔｈｅｒａｐｙ）：症状の軽減、寛解、減少などの任意の客観的または主観的パラメータ、または状態を患者がより耐えられるものにすること、退化もしくは減退の速度を緩徐化すること、退化の最終点を衰弱がより小さいものにすること、対象の身体もしくは精神的ウエルビーイングを改善すること、または生存の長さを延長することを含めた、傷害、病変または状態の減弱または好転に関する任意の成功または成功のしるし。処置は、身体検査、血液検査および他の臨床検査などの結果を含めた客観的または主観的パラメータによって評価することができる。一部の実施例では、本明細書に開示される方法を用いた処置により、遺伝子疾患に付随する症状の数または重症度の低減、例えば、処置される、遺伝子疾患を有する患者の生存時間の増大がもたらされる。

一部の実施例では、本明細書に開示される方法を用いた処置により、ＤＭＤまたは他の遺伝子疾患に付随する症状の数または重症度の低減、例えば、生存の増加、可動性（例えば、歩行、よじのぼり）の増大、認知能力の改善、腓腹筋サイズの低下、心筋症の低減、視覚の改善、聴覚の改善、血液凝固の改善、または呼吸機能の改善がもたらされる。一部の実施例では、これらの効果の組合せが実現される。

腫瘍、新形成、悪性疾患またはがん：新生物は、過剰な細胞分裂に起因する組織または細胞の異常な成長である。新生物の成長により、腫瘍が生じ得る。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる「腫瘍量」である。転移しない腫瘍は「良性」と称される。周囲の組織に浸潤し、かつ／または転移する可能性がある腫瘍は「悪性」と称される。「非がん組織」は、悪性新生物が形成されるものと同じ器官に由来するが、新生物の特徴的な病変を有さない組織である。一般に、非がん組織は、組織学的に正常に見える。「正常組織」は、ある器官に由来する組織であり、ここで、当該器官は、がんまたは当該器官の別の疾患もしくは障害の影響を受けていない。「がんを有さない」対象は、当該器官のがんを有すると診断されておらず、検出可能ながんを有していない。

本明細書に開示される方法および系を用いて処置することができるがんなどの例示的な腫瘍としては、固形腫瘍、例えば、乳癌（例えば、小葉癌および腺管癌）、肉腫、肺癌（例えば、非小細胞癌、大細胞癌、扁平上皮癌、および腺癌）、肺の中皮腫、結腸直腸腺癌、胃癌、前立腺腺癌、卵巣癌（例えば、漿液性嚢胞腺癌および粘液性嚢胞腺癌）、卵巣胚細胞腫瘍、精巣癌および胚細胞腫瘍、膵臓腺癌、胆管腺癌、肝細胞癌、膀胱癌（例えば、移行上皮癌、腺癌、および扁平上皮癌を含む）、腎細胞腺癌、子宮内膜癌（例えば、腺癌およびミュラー管混合腫瘍（癌肉腫）を含む）、子宮頚内膜癌、子宮頸外膜癌、および膣癌（例えば、子宮頚内膜、子宮頸外膜、および膣のそれぞれの腺癌および扁平上皮癌）、皮膚の腫瘍（例えば、扁平上皮癌、基底細胞癌、悪性黒色腫、皮膚付属器腫瘍（ｓｋｉｎ
ａｐｐｅｎｄａｇｅｔｕｍｏｒ）、カポジ肉腫、皮膚リンパ腫、皮膚付属器腫瘍（ｓｋｉｎａｄｎｅｘａｌｔｕｍｏｒ）および種々の型の肉腫およびメルケル細胞癌）、食道癌、上咽頭癌および中咽頭癌（上咽頭および中咽頭の扁平上皮癌および腺癌を含む）、唾液腺癌、脳および中枢神経系の腫瘍（例えば、グリア起源の腫瘍、ニューロン起源の腫瘍、および髄膜起源の腫瘍を含む）、末梢神経の腫瘍、軟部組織肉腫、および骨および軟骨の肉腫、ならびにリンパ腫瘍（Ｂ細胞およびＴ細胞悪性リンパ腫を含む）が挙げられる。一実施例では、腫瘍は腺癌である。

方法および系はまた、液性腫瘍、例えば、リンパ性、白血球、または他の型の白血病を処置するために使用することもできる。特定の例では、処置される腫瘍は、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病、および成人Ｔ細胞白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、ならびに骨髄腫などの、血液の腫瘍である。

アップレギュレートされた：標的核酸／タンパク質などの分子の発現に関して使用される場合、標的核酸／タンパク質の産生の増加をもたらす任意のプロセスを指す。一部の実施例では、標的ＲＮＡのアップレギュレーションまたは活性化は、標的ＲＮＡの翻訳を増加させ、したがって、対応するタンパク質の存在を増加し得るプロセスを含む。アップレギュレートされる分子は、本明細書に記載の組成物および方法の標的核酸もしくは当該核酸分子から発現されるタンパク質、例えば、ＲＥＪ分割系において組み換えられた転写物から産生される核酸エディタータンパク質；編集された標的核酸および／もしくは当該核酸から産生される、得られるタンパク質；または標的核酸もしくはタンパク質もしくは編集された標的核酸および／もしくは得られるタンパク質の代表的なマーカー、代理、もしくは機能的指標であり得る。

アップレギュレーションは、標的核酸／タンパク質の任意の検出可能な増加を含む。ある特定の実施例では、細胞または無細胞系における検出可能な標的核酸／タンパク質の発現が、対照と比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％増加する。対照は、本明細書に提示される核酸分子を用いて処理されていない対応する試料において検出される標的核酸／タンパク質の量であり得る。一実施例では、対照は、正常な細胞（例えば、本明細書に提示される系を含まない非組換え細胞）における発現の相対量である。対照と、本明細書に記載の組成物および方法の核酸分子から発現される標的核酸もしくはタンパク質、例えば、ＲＥＪ分割系において組み換えられた転写物から産生された核酸エディタータンパク質；編集された標的核酸および／もしくは当該核酸から産生される、得られるタンパク質；または標的核酸もしくはタンパク質もしくは編集された標的核酸および／もしくは得られるタンパク質の代表的なマーカー、代理、もしくは機能的指標を比較することができる。比較のために使用される対照は、当業者によって決定される任意の妥当な対照であってよい。陽性対照は、対応するｍＲＮＡおよび／または全長構築物から産生されるタンパク質の量であり得る。陰性対照は、対応するｍＲＮＡおよび／または空もしくは他の点で欠陥のある構築物から産生されるタンパク質の量であり得る。対照と、標的核酸、または、細胞において、本明細書に提示される組成物および方法を使用して核酸分子から発現された核酸エディタータンパク質の存在下で産生されたタンパク質を比較することができる。本明細書に記載の通り、細胞において本組成物および方法を使用して核酸分子から核酸編集タンパク質を発現させると、組み換えられた核酸編集タンパク質がその標的核酸を編集し得る。編集された核酸および／または当該核酸から産生されたタンパク質を、正常な細胞（例えば、編集が必要な標的核酸を有さず、本明細書に提示される系を含まない非組換え「正常」細胞）における対応する核酸、例えばｍＲＮＡ、および／または標的核酸から産生されたタンパク質の量であり得る陽性対照と比較することができる。編集された核酸および／または当該核酸から産生されたタンパク質を、無処理の細胞（例えば、編集が必要な標的核酸を有し、本明細書に提示される系を含まない非組換え「変異」細胞）における対応する核酸、例えばｍＲＮＡ、および／または標的核酸から産生されたタンパク質の量であり得る陰性対照と比較することができる。検出可能な陽性対照である標的核酸および／またはタンパク質の発現（例えば、細胞または無細胞系）と比べた検出可能な標的核酸および／またはタンパク質の発現は、それぞれ、陽性対照における発現の２０％～５００％であり得る。陽性対照における発現と比べた細胞または無細胞系における検出可能な標的核酸および／またはタンパク質の発現は、約２０％～約５００％であり得る。陽性対照における発現と比べた細胞または無細胞系における検出可能な標的核酸および／またはタンパク質の発現は、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約９０％、約２０％～約９５％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約５００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約９０％、約３０％～約９５％、約３０％～約１００％、約３０％～約１５０％、約３０％～約２００％、約３０％～約５００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約９０％、約４０％～約９５％、約４０％～約１００％、約４０％～約１５０％、約４０％～約２００％、約４０％～約５００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約５００％、約６０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～約１００％、約６０％～約１５０％、約６０％～約２００％、約６０％～約５００％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～約１００％、約７０％～約１５０％、約７０％～約２００％、約７０％～約５００％、約９０％～約９５％、約９０％～約１００％、約９０％～約１５０％、約９０％～約２００％、約９０％～約５００％、約９５％～約１００％、約９５％～約１５０％、約９５％～約２００％、約９５％～約５００％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約５００％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約５００％、または約２００％～約５００％であり得る。陽性対照における発現と比べた細胞または無細胞系における検出可能な標的核酸および／またはタンパク質の発現は、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約９０％、約９５％、約１００％、約１５０％、約２００％、または約５００％であり得る。陽性対照の発現と比べた細胞または無細胞系における検出可能な標的核酸および／またはタンパク質の発現は、少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約９０％、約９５％、約１００％、約１５０％、または約２００％であり得る。陽性対照における発現と比べた細胞または無細胞系における検出可能な標的核酸および／またはタンパク質の発現は、多くとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約９０％、約９５％、約１００％、約１５０％、約２００％、または約５００％であり得る。

編集された核酸および／または当該核酸から産生されたタンパク質を、無処理の細胞（例えば、編集が必要な標的核酸を有し、本明細書に提示される系を含まない非組み換え「変異」細胞）における対応する核酸、例えば、ｍＲＮＡ、および／または標的核酸から産生されたタンパク質の量であり得る陰性対照と比較することができる。検出可能な標的核酸および／またはタンパク質の発現は、検出可能な陰性対照である標的核酸および／またはタンパク質の発現と比べて、それぞれ２０％～５００％増加し得る。細胞または無細胞系における検出可能な標的核酸／タンパク質の発現は、陰性対照と比べて、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約９０％、約２０％～約９５％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約５００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約９０％、約３０％～約９５％、約３０％～約１００％、約３０％～約１５０％、約３０％～約２００％、約３０％～約５００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約９０％、約４０％～約９５％、約４０％～約１００％、約４０％～約１５０％、約４０％～約２００％、約４０％～約５００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約５００％、約６０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～約１００％、約６０％～約１５０％、約６０％～約２００％、約６０％～約５００％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～約１００％、約７０％～約１５０％、約７０％～約２００％、約７０％～約５００％、約９０％～約９５％、約９０％～約１００％、約９０％～約１５０％、約９０％～約２００％、約９０％～約５００％、約９５％～約１００％、約９５％～約１５０％、約９５％～約２００％、約９５％～約５００％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約５００％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約５００％、または約２００％～約５００％増加し得る。細胞または無細胞系における検出可能な標的核酸／タンパク質の発現は、陰性対照と比べて、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約９０％、約９５％、約１００％、約１５０％、約２００％、または約５００％増加し得る。細胞または無細胞系における検出可能な標的核酸／タンパク質の発現は、陰性対照と比べて、少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約９０％、約９５％、約１００％、約１５０％、または約２００％増加し得る。細胞または無細胞系における検出可能な標的核酸／タンパク質の発現は、陰性対照と比べて、多くとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約９０％、約９５％、約１００％、約１５０％、約２００％、または約５００％増加し得る。

～のために十分な条件下で：所望の活性を可能にする任意の環境を説明するために使用される句。一実施例では、所望の活性は、疾患の処置に必要な、タンパク質の発現または活性の増加である。一実施例では、所望の活性は、疾患の処置に必要な、タンパク質の発現または活性の低減である。一実施例では、所望の活性は、疾患の処置に必要な、補正されたタンパク質配列の発現である。一実施例では、所望の活性は、例えば、本明細書に開示される方法および系を使用した、ｉｎｖｉｖｏにおけるＤＭＤ（または表１～４に列挙されている他の遺伝子疾患）などの遺伝子疾患の処置またはその進行の緩徐化である。

ベクター：宿主細胞において複製するおよび／または宿主細胞に組み込まれるベクターの能力を妨害することなく外来核酸分子を導入することができる核酸分子。ベクターとしては、これだけに限定されないが、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖の核酸分子；１つまたは複数の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方を含む核酸分子；および他の種類のポリヌクレオチドが挙げられる。

ベクターは、複製開始点などの、宿主細胞における複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子および他の遺伝子エレメントも含み得る。組込みベクターは、それ自体を宿主核酸に組み込むことが可能である。発現ベクターは、挿入された遺伝子（１つまたは複数）の転写および翻訳を可能にするために必要な調節配列を含有するベクターである。

ベクターの型の１つは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技法によってなどで追加的なＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターはウイルスベクターであり、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）へのパッケージングのためのウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列がベクター内に存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含む。一部の実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクター（例えば、組込み欠損レンチウイルスベクター）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ．１０などのＡＡＶである。一部の実施形態では、ベクターは、例えば静脈内投与後に血液脳関門を透過することができるものである。アデノ随伴ウイルス血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶ．ｒｈ１０）ベクターは血液脳関門を部分的に透過し、高レベルかつ広がった導入遺伝子発現をもたらす。
ＩＩ．いくつかの実施形態の概要

遺伝子疾患に罹患している患者を治癒させるための１つの手法は、遺伝子編集治療（一般に遺伝子治療と称される）である。そのような手法では、欠陥のある遺伝子を、例えばウイルスベクターによって送達されるその遺伝子のインタクトなバージョンで置き換え、それにより、数カ月から数年までの持続的な発現が実現される。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は臨床的な遺伝子置換療法に使用されてきたが、パッケージング容量が制限される（例えば、約５ｋｂ未満）。したがって、約５ｋｂというサイズの制限を超える遺伝子の遺伝子置換を実現するためには、このパッケージングの制限を克服するための戦略が必要である。例えば、一部のプロモーターが単独で、コード配列が単独で、またはプロモーターとコード配列の組合せで、ＡＡＶの約５ｋｂというサイズの制限を超える。したがって、そのようなプロモーターおよびコード配列によってコードされるそのようなタンパク質を、本明細書に開示される系を使用して発現させることができる。

核酸編集、例えば、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の編集、例えば、遺伝子編集のいくつかの方法を使用して、標的の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすること、ならびに標的における変異を補正することができる。そのような方法の例としては、ＤＮＡを編集するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ法（例えば、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９ＤＮＡエンドヌクレアーゼを使用する）、ＲＮＡを編集するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ法（例えば、Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄＲＮＡエンドヌクレアーゼを使用する）、ゲノム編集のジンクフィンガーヌクレアーゼ法（例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ切断ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼを使用する）、ならびにゲノム編集の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に基づく方法（例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）タンパク質を使用する）が挙げられる。そのような方法は全て、細胞において標的核酸配列（例えば、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列）を挿入する、欠失させる、および／または横断することができるヌクレアーゼである核酸編集タンパク質の使用に依拠する。したがって、核酸編集タンパク質により、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列における１つまたは複数の選択されたヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換をもたらすことができる。しかし、上記の通り、ＡＡＶなどのベクターのカーゴの制限により、疾患を処置するために十分なレベルの核酸編集タンパク質を（および一部の実施例では対応するｇＲＮＡも）産生させることが難しい可能性がある。

２つのＲＮＡ分子の、これらのＲＮＡ断片の一方または両方の天然に存在するイントロン配列を使用したスプライシング媒介性組換えは非効率的である。第１に、これらの天然のイントロン配列は、天然に存在するイントロン由来の配列であり、４種のＲＮＡヌクレオチド全ての混合で構成される。そのような配列は、分子間相互作用に利用可能になるのではなく強力な分子内塩基対を形成することによりトランス相互作用を妨害し得る構造に折りたたまれる傾向がある。第２に、高等真核生物におけるエクソン定義はイントロンではなくエクソンによって駆動されるので、これらの天然に存在するイントロン配列はスプライソソーム成分を強力に誘引するように進化していない。以前の戦略のこれらの２つの制限は、本発明において、天然には見いだされない合成イントロン配列を設計することによって対処される。これらの合成配列は、スプライソソーム動員を強力に誘引および刺激する一方で、２つのＲＮＡ断片が１つにまとまることを妨害する二次構造（および一部の実施例では三次構造などの他の構造）を最小化するエレメントを含有する。

本発明者らは、大きな遺伝子のコード配列を複数の一連の断片から効率的に再構成するために使用することができる、新規の核酸に基づくエレメントを開発した。本明細書に提示される組成物、系および方法は、全長ＲＮＡを複数の一連の断片から再構成することを可能にする。全長ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ転写物の再構成により今度は全長の「再構成された」タンパク質の産生がもたらされる。本明細書に開示される方法および系は先行方法とは異なる。本明細書に開示される高度に効率的な合成イントロンには、非共有結合により連結したＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）間でのＲＮＡスプライシング反応を効率的に駆動するＲＮＡエレメント（またはこれらのエレメントをコードするＤＮＡ）の最適な配置を利用する。当該方法／系は、標的核酸分子を編集して遺伝子疾患を処置するための核酸編集タンパク質の治療レベルにより密接に近づく高レベルの機能的核酸編集タンパク質を生じさせるので、トランス－スプライシングを利用する以前の試みからの著しい前進である。この革新は、相補鎖を有する（本質的に低いシス結合能も有する）第２のＲＮＡとのトランス相互作用に干渉する強力なシス結合相互作用を形成することが本質的に不可能である非天然ＲＮＡドメインを選択することに基づく。パートナーとなった二量体形成ドメイン、例えば、第１の二量体形成ドメインと第２の二量体形成ドメイン、第２の二量体形成ドメインと第３の二量体形成ドメイン、第３の二量体形成ドメインと第４の二量体形成ドメイン、第４の二量体形成ドメインと第５の二量体形成ドメイン、または第５の二量体形成ドメインと第６の二量体形成ドメインの結合領域間の分子間相互作用は、単一の二量体形成ドメイン上の結合領域と、同じ二量体形成ドメイン内の他の配列との分子内相互作用よりも強力であり得る。例えば、第１のキッシングループ二量体形成ドメイン内の一本鎖キッシングループ構造は、第２のキッシングループ二量体形成ドメイン内のその相補的なキッシングループ構造と、同じ二量体形成ドメイン上の他の配列よりも強力に結合、ハイブリダイズ、または会合し得る。同じ二量体形成ドメイン内に、分子間よりも分子内でより強力に結合する領域、例えば、ステムループ構造のステムが存在し得ることが理解される。得られた二量体形成ドメインは、それらの意図された標的、すなわち、パートナー二量体形成ドメイン上の相補的な結合領域に選択的にかつ効率的に結合する安定して利用手可能な一本鎖結合領域を含む。この戦略により、別々の鋳型から合成される転写物の前例のない再構成効率が可能になり、それにより、高レベルの標的タンパク質または治療用核酸の産生がもたらされる。そのような最適化された合成核酸分子およびそれらを使用するための方法の多数の例が本明細書に提示される。これらの最適化された二量体形成ドメインおよび／または合成イントロンは、ＲＮＡスプライシングを容易にする最適化されたモチーフ（スプライスドナー、スプライスアクセプター、スプライスエンハンサー、およびスプライス分岐点配列を含む）と組み合わせて使用される非天然配列（例えば、ヒト細胞において見いだされず、かつ／または別の生物系において見いだされない配列）を含み得る。合成核酸は、非天然核酸配列、例えば、ヒト細胞において見いだされず、かつ／または別の生物系において見いだされない配列であり得る。ＲＮＡ鎖のトランス二量体形成を、効率的なスプライシングを媒介する妥当なＲＮＡモチーフに関して最適化することにより、ｉｎｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏにおいて、高レベルの機能的核酸編集タンパク質を産生する同じ細胞において２つまたは３つの異なるＲＮＡを正確にかつ効率的に共有結合により連結することができることが本明細書で初めて実証される。最終的にシスでのＲＮＡスプライシングが後に続いてＤＮＡ組換え部位が成熟転写物から削除されるＤＮＡ組換えによってＤＮＡレベルで非効率的な組合せがもたらされる「ハイブリッド」手法とは異なり、本明細書に開示される方法／系では、２つのタンパク質コードＲＮＡ断片がプレｍＲＮＡレベルで結合し、非機能的および／または有害な産物をコードする組換え産物が産生されるリスクがより低い、より効率的な反応が促進される。

データから、効率的な合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメイン（ｓＲｄＲドメイン、ＲＮＡ末端結合（ＲＥＪ）ドメインとも称される）を使用することにより、同じ細胞において２つの別々の核酸構築物から発現させた２つの別々の遺伝子断片から核酸編集タンパク質の全長ｍＲＮＡを再構成することによって核酸編集タンパク質を効率的に産生させることができることが実証される。所望のガイドＲＮＡ、例えばｇＲＮＡを２つの構築物のうちの一方から、または異なる構築物から発現させることができる。任意の標的核酸を編集して任意の遺伝子疾患を処置するために、本明細書に開示される方法および系を使用して、ＡＢＥ８ｅのような大きな遺伝子をコードする転写物を再構成することができる。これらの知見に基づいて、核酸編集タンパク質の発現が役立つものなどの任意の遺伝子疾患（例えば、表１～４に列挙されている障害を参照されたい）を処置することができる。核酸編集タンパク質を使用して処置することができる他の疾患としては、がんおよび感染性疾患（例えば、細菌またはウイルス感染）が挙げられる。他の適用としては、研究およびバイオテクノロジーへの適用が挙げられる。

一部の実施形態では、本開示は、処置することを必要とする対象を、対象の細胞における標的核酸配列を変更することによって処置するために本開示の核酸編集組成物および系を使用するための方法を提供する。核酸編集の使用は、文献、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０２０／３９２４７３号、"Novel CRISPR enzymes and systems"に記載されている。

一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物、系、および方法を、疾患または障害を有する対象を、タンパク質または別の遺伝子産物、例えば、ＲＮＡの産生の欠陥または低減を引き起こす核酸変異を修復することによって処置するために使用する。一部の実施形態では、欠陥のあるタンパク質または遺伝子産物は、活性が低下している、非機能的である、または毒性である。一部の実施形態では、変異は遺伝子のコード領域または非コード領域内に存在する。一部の実施形態では、疾患または障害は、非機能的なまたは他の点で欠陥のある遺伝子産物をもたらす、遺伝子のコード領域内の変異によって引き起こされるものであり、変異を修復することにより、機能的な遺伝子産物の発現が回復する。一部の実施形態では、疾患または障害は、遺伝子の調節領域、例えば、プロモーター領域またはスプライシングエレメント内の変異によって引き起こされるものであり、変異を修復することにより、遺伝子産物の正常なまたは望ましいレベルの発現がアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションによって回復する。一部の実施形態では、スプライシングがエクソンをスキップするように変更され、それにより、正常なまたは望ましいレベルの機能的な遺伝子産物が回復するように変異を導入することができる。一部の実施形態では、機能的な遺伝子産物のレベルが対照、例えば無処置対照と比較してモジュレートされる。

一部の実施形態では、機能喪失型変異を有する疾患遺伝子は、参照により本明細書に組み込まれるChen and Altman, 2017, "Opportunities for developing therapies for rare genetic diseases: focus on gain of function and allostery," Orphanet Journal of Rare Diseases 12: 61の表２から複写した表１に列挙されている疾患遺伝子である。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸編集組成物、系、および方法を使用して、表１に列挙されている疾患を処置する。
表１．機能喪失型変異に起因する遺伝子疾患
対応する疾患名、ＯＭＩＭ識別子、変異遺伝子および公知のアロステリック活性化因子が列挙されている。アロステリック活性化因子はアロステリックデータベースで検索されたものである。残りの潜在的な候補は追加ファイル１：表Ｓ８において見いだすことができる

一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、疾患または障害を有する対象を、核酸変異を導入して、望ましくないゲノム配列を破壊するおよび／または対象の細胞における望ましくない遺伝子産物の産生をダウンレギュレートすることによって処置するために有用である。一部の実施形態では、望ましくないゲノム配列および／または望ましくない遺伝子産物の産生を、コード領域または非コード領域を変更することによってダウンレギュレートする。一部の実施形態では、１つまたは複数の調節配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）を変更する。一部の実施形態では、スプライシングまたはＲＮＡプロセシングの他の側面（例えば、ポリアデニル化、細胞内局在化、または半減期）をモジュレートする配列を、望ましくないゲノム配列が破壊されるおよび／または望ましくない遺伝子産物のレベルがダウンレギュレートされるように変更する。一部の実施形態では、望ましくないゲノム配列のコード領域を、変異、例えば、欠失、ミスセンス変異、フレームシフト変異、または終止コドンが導入され、それにより、望ましくないゲノム配列の活性のダウンレギュレーションおよび／または望ましくない遺伝子産物の産生のダウンレギュレーションがもたらされるように変更する。一部の実施形態では、活性および／または遺伝子産物のレベルが対照、例えば、無処置対照と比較してダウンレギュレートされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸編集組成物、系、および方法を使用して標的化するための望ましくないゲノム配列には、文献に記載されているいずれか、例えば、機能獲得型変異を有する癌遺伝子または疾患遺伝子が含まれ得る。一部の実施形態では、癌遺伝子は、表２に列挙されているいずれかである。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸編集組成物、系、および方法を使用して、表２に列挙されているがんを処置する。
表2. 癌遺伝子

一部の実施形態では、機能獲得型変異を有する疾患遺伝子は、神経変性疾患遺伝子である。一部の実施形態では、神経変性疾患遺伝子は、Chen and Altman, 2017の表１から複写した表３に列挙されているいずれかである。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸編集組成物、系、および方法を使用して、表３に列挙されている神経変性疾患を処置する。
表３．機能獲得型変異に起因する遺伝子疾患
対応する疾患名、ＯＭＩＭ識別子、および変異遺伝子が列挙されている。疾患は型の列に示されている通り分子機構ごとに群分けされている。残りの潜在的な候補は追加ファイル１：表Ｓ７において見いだすことができる

断片化された遺伝子を複数のＡＡＶから再構成するための既存の戦略に伴う制限のいくつかに対処するために、標的細胞において２つまたはそれよりも多くの個々の合成ＲＮＡ分子を連続してアラインメントし、組み換える系を本明細書において提供する。個々の合成ＲＮＡ分子は、それぞれが、二量体形成ドメインおよびＲＮＡスプライシングに必要なエレメントを含有する合成イントロン配列を含み、それにより、二量体形成ドメインが互いに正しい順序で結合すると、個々の断片の効率的なＲＮＡ組換えが媒介される。一実施例では、２つの断片からのコード配列の再構成は、第１の合成イントロン（Ａ）をＮ末端コード断片の３’末端に付加し、相補的な第２の合成のドメイン（Ａ’）をＣ末端コード断片の５’末端に付加することによって実現される。２つのＲＮＡは細胞の内在性ＲＮＡスプライシング機構（すなわち、スプライソソーム機構）によって組み換えられる。合成イントロンドメインは、二機能性エレメント：（１）組み換えられる両半分（two halves）間の塩基対合を媒介するための二量体形成ドメイン、および（２）２つのＲＮＡ分子の効率的な再構成を媒介するためにスプライシング機構を効率的に動員するように最適化されたドメインを含有する。
合成イントロンドメインは、スプライシングされていないＲＮＡによってタンパク質がコードされることを防止するためのエレメントを含み得る。一部の実施例では、合成イントロンは、配列番号１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５および１６６に提示される任意の合成イントロンに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む（例えば、図１０Ａ～１０Ｚ参照）。一部の実施例では、合成イントロンは、配列番号１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、および１６６に提示される任意の合成イントロンに対して少なくとも５０％少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するが、提示されるプロモーター配列を伴わない配列によってコードされるＲＮＡ分子である。配列番号１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、および１６６に提示される分子はいずれも、タンパク質コード部分（例えば、図６Ａの１１４および１６４）が目的の別の核酸編集タンパク質コード配列で置き換えられるように改変することができる（例えば、配列番号１、２、２２または２３のＹＦＰコード配列をＣａｓ９またはＣａｓ１３ｄタンパク質コード配列で置き換えることができる）ことが当業者には理解されよう。したがって、配列番号１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、および１６６に提示される任意の合成イントロン部分に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する合成イントロン分子も本明細書に提示される。配列番号１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、および１６６に提示される任意の合成イントロンに対して少なくとも５０％少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するが、提示されるプロモーター配列を伴わない配列によってコードされる合成イントロンＲＮＡ分子も提供される。

例示的な二量体形成ドメインを、それらの内部の二次／三次構造が最小限になる／最適化されるようにバイオインフォマティクスにより選択した。試験した二量体形成ドメインは、分子内アニーリングを回避するために、長いひと続きの、多様性が低いヌクレオチド配列を含有するものであった。分子内アニーリングを回避することにより、これらの二量体形成ドメインは開いた構成で存在し、したがって、対応する相補的な二量体形成ドメイン配列との対合に利用可能になる。合成イントロンドメインは、スプライシング機構の効率的な動員をもたらすイントロンスプライス増強エレメントを含有する。

本明細書に開示されるＲＮＡ分子は、少なくとも、相補的な二量体形成ドメインと結合させてＲＮＡの効率的なスプライシングおよび組換えを可能にするために利用可能な、開いた、利用可能な一本鎖領域を有するように設計される。一部の実施例では、これは、結合ドメインにプリンのみまたはピリミジンのみを利用することによって実現される。プリンがそれら自体と対合することができないこと（ピリミジンも同様）に起因して、これらのひと続きのＲＮＡは、開いた予測される構造を有する。

ＲＮＡ分子は細胞において一本鎖として存在する。一本鎖であることで、ＲＮＡ分子は本質的にそれら自体とハイブリダイズしやすく、それにより、強力な二次構造および三次構造を形成する。最も安定な塩基対はＧとＣ、ＡとＵ、およびＧとＵのゆらぎ対である。熱力学的に、２つの塩基の対合が開いた構成よりも選好される。効率的な合成核酸分子を設計するためには、互いに相補性を有する２つの二量体形成ドメインが開いた構成で存在し、したがって、二量体形成ドメインが分子間塩基対合に利用可能になるようにする。合成核酸分子の他の部分間の分子内塩基対合を回避するために、適合しない塩基を含有する長いひと続きの多様でない配列を含めることができる。例えば、長いひと続きの、ピリミジン（すなわち、ＣおよびＴ）またはプリン（すなわち、ＡおよびＧ）を合成核酸分子内に存在させることができる。ピリミジンは他のピリミジンと標準の塩基対を形成することができず、プリンは他のプリンと標準の塩基対を形成することができない。そのような一続きの、プリンまたはピリミジンは、２～３塩基から２００～３００塩基までにわたり得る。これらのひと続きは分子内で結合することができないので、相補的な断片との分子間塩基対合に利用可能である。例えば、合成核酸分子ＡおよびＡ’を、Ａがピリミジンストレッチ（例えば、５’－ＣＣＵＵ（．．．）ＣＣＵＵ－３’）を含有し、Ａ’が相補的なプリン配列（例えば、５’－ＡＡＧＧ（．．．）ＡＡＧＧ－３’）を含有するように構成することができる。

本明細書に開示される合成核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＲＮＡをコードするＤＮＡ）を、ゲノム内の正しくない部位へのあらゆるオフターゲットの結合が最小限になるように設計する。オフターゲットの結合は、核酸分子の配列を変更することによって低減することができる。

開いた合成核酸構成を実現するために一続きの低多様性ＲＮＡ塩基を使用するという同じ設計原理を、二量体形成ドメインにおける一続きの一塩基の使用、例えば、一連のＣと塩基対合する一連のＧ、および一連のＵと塩基対合する一連のＡの使用に拡張することができる。

２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の組換えを増加させるために、以下の方法を使用することができる。ＲＮＡスプライシングは、イントロンの５’末端（スプライスドナー部位）およびイントロンの３’末端（スプライスアクセプター部位、それに付随する分岐点配列およびポリピリミジントラクトと共に）へのスプライソソーム成分の動員に依存する。異なるリボ核タンパク質がイントロンにタンパク質関連低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）とイントロン配列の塩基対合を通じて動員される。完全にマッチするコンセンサス配列をＲＮＡ二量体形成および組換えドメイン内に置くことにより、スプライソソーム成分の動員を容易にすることができ、それにより今度はスプライソソーム媒介性組換えの効率を増強する。以前に特徴付けられたイントロンスプライスエンハンサー配列により、イントロンスプライスエンハンサーと称される追加的なスプライシング促進因子を動員することができる。

一部の実施例では、ＲＮＡスプライシング配列に天然に存在するＲＮＡ配列を使用する代わりに、コンセンサス配列を使用する。例えば、スプライスドナー、スプライスアクセプター、スプライスエンハンサーおよびスプライス分岐点配列を含めた、スプライシングに関与する任意の配列にコンセンサス配列を使用することができる。これらの合成核酸分子を用い、ｅｘｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｔｒｏ、またはｉｎｖｉｖｏで細胞において２つ（またはそれよりも多く）のＲＮＡ分子を順次結合することができる。合成核酸分子は、コードされる合成イントロンドメインの外側に、任意のプロモーターおよびコード配列を含み得る。例えば、２つの合成核酸分子に単一の核酸編集遺伝子の両半分を担持させることができる。これをｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいて、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）の両半分を再構成することによって試験し、効率的であることが示された（図３Ａ～３Ｄ参照）。

合成核酸分子のモジュラー性により、最適化された相補的な二量体形成ドメインのコンビナトリアルセットを使用した複数のＲＮＡ断片の一連の組換え（すなわち、＞２）の実現の効率を試験することが可能になった（図４Ａ～４Ｂ）。トランスフェクトされた細胞の＞８０％で３分割黄色蛍光タンパク質が効率的に再構成され、高レベルで発現された。

これらの結果から、単一の遺伝子治療ベクター、例えばＡＡＶに収まるには長すぎるプロモーターおよび／またはコード配列を有する核酸編集タンパク質を発現させる場合などに、少なくとも３つの異なる合成核酸分子から単一のＲＮＡ分子を再構成することができることが実証される。

一部の実施例では、本発明の組成物、系、キット、および方法の合成核酸分子、例えば合成ＤＮＡ分子は、逆転写酵素によるＲＮＡウイルスゲノムの転写によって作製される。

本明細書に開示される系により、個々の断片間の効率的なＲＮＡ組換えが可能になる。一部の実施例では、本開示の組成物、系または方法を使用して実現される再構成（すなわち、スプライシングまたは組換え）効率を、当業者に公知の任意の適切な方法を使用して決定する。一部の実施例では、再構成効率は、対照ＲＮＡと比べた正しく結合されたＲＮＡの尺度、または対照タンパク質と比べた全長核酸編集タンパク質もしくはタンパク質活性の尺度によって表される。一部の実施例では、対照ＲＮＡは結合していないＲＮＡであり、その場合、再構成効率は、結合していないＲＮＡと比べた結合したＲＮＡの尺度によって表される。この測定は、結合部ＲＮＡおよび結合していない３’ＲＮＡ種３’を検出し、比較することによって行うことができる（例えば、結合部ＲＮＡ：３’ＲＮＡ）。２つよりも多くのＲＮＡを結合させる一部の実施例では、結合部のいずれかまたは全てにおける結合を評価する。一部の実施例では、再構成効率は、タンパク質断片または不活性タンパク質と比べた全長または活性核酸編集タンパク質の尺度によって表される。

一部の実施例では、再構成、組換えまたはスプライシングの効率（異なるＲＮＡ分子上に存在する２つもしくはそれよりも多くの異なるコード配列の正しい結合、および／または所望の全長タンパク質の産生の尺度）は、約１０％～約１００％である。合成イントロンドメインは、スプライシングされていないＲＮＡによってタンパク質がコードされることを防止するエレメントを含み得る。一部の実施例では、再構成効率は、約１０％～約１５％、約１０％～約２０％、約１０％～約２５％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約１０％～約５０％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約１０％～約１００％、約１５％～約２０％、約１５％～約２５％、約１５％～約３０％、約１５％～約４０％、約１５％～約５０％、約１５％～約６０％、約１５％～約７０％、約１５％～約８０％、約１５％～約９０％、約１５％～約１００％、約２０％～約２５％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約２０％～約１００％、約２５％～約３０％、約２５％～約４０％、約２５％～約５０％、約２５％～約６０％、約２５％～約７０％、約２５％～約８０％、約２５％～約９０％、約２５％～約１００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３０％～約１００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４０％～約１００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５０％～約１００％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約６０％～約１００％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、または約９０％～約１００％である。一部の実施例では、再構成効率は、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約100%である。一部の実施例では、再構成効率は、少なくとも約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、または約90%である。一部の実施例では、再構成効率は、多くとも約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約100%である。

一部の実施例では、再構成、組換えまたはスプライシングの効率（本実施例では、異なるＲＮＡ分子上に存在する２つの異なる核酸編集タンパク質コード配列の正しい結合、および／または所望の核酸編集全長タンパク質の産生の尺度であり、ここで、２つの異なる核酸編集タンパク質コード配列は、約３２００ｎｔ～９０００ｎｔ、例えば、約４０００～９０００ｎｔ、約４４００～９０００ｎｔ、約３２００～４０００ｎｔ、約３２００～３６００ｎｔ、例えば、約４５００ｎｔ、約４０００ｎｔ、約３８００ｎｔ、約３６００ｎｔ、または約３２００ｎｔの転写物をコードする）は、約１０％～約１００％である。一部の実施例では、２つの部分からなる系を使用した再構成効率は、約10%～約15%、約10%～約20%、約10%～約25%、約10%～約30%、約10%～約40%、約10%～約50%、約10%～約60%、約10%～約70%、約10%～約80%、約10%～約90%、約10%～約100%、約15%～約20%、約15%～約25%、約15%～約30%、約15%～約40%、約15%～約50%、約15%～約60%、約15%～約70%、約15%～約80%、約15%～約90%、約15%～約100%、約20%～約25%、約20%～約30%、約20%～約40%、約20%～約50%、約20%～約60%、約20%～約70%、約20%～約80%、約20%～約90%、約20%～約100%、約25%～約30%、約25%～約40%、約25%～約50%、約25%～約60%、約25%～約70%、約25%～約80%、約25%～約90%、約25%～約100%、約30%～約40%、約30%～約50%、約30%～約60%、約30%～約70%、約30%～約80%、約30%～約90%、約30%～約100%、約40%～約50%、約40%～約60%、約40%～約70%、約40%～約80%、約40%～約90%、約40%～約100%、約50%～約60%、約50%～約70%、約50%～約80%、約50%～約90%、約50%～約100%、約60%～約70%、約60%～約80%、約60%～約90%、約60%～約100%、約70%～約80%、約70%～約90%、約70%～約100%、約80%～約90%、約80%～約100%、または約90%～約100%である。一部の実施例では、再構成効率は、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約100%である。一部の実施例では、再構成効率は、少なくとも約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、または約90%である。一部の実施例では、再構成効率は、多くとも約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約100%である。

一部の実施例では、再構成、組換えまたはスプライシングの効率（本実施例では、異なるＲＮＡ分子上に存在する２つの異なる核酸編集タンパク質コード配列の正しい結合、および／または所望の全長核酸編集タンパク質の産生の尺度であり、ここで、２つの異なる核酸編集タンパク質コード配列は、約４０００ｎｔの転写物をコードする）は、約４０％～約６０％、例えば、約４０％～約５０％、約４２％～約４７％、例えば、約４５％である。

一部の実施例では、再構成、組換えまたはスプライシングの効率（本実施例では、異なるＲＮＡ分子上に存在する２つの異なる核酸編集タンパク質コード配列の正しい結合、および／または所望の核酸編集全長タンパク質の産生の尺度であり、ここで、２つの異なる核酸編集タンパク質コード配列は、約３８００ｎｔの転写物をコードする）は、約４０％～約６０％、例えば、約４０％～約５０％、約４２％～約４７％、例えば、約４５％である。

一部の実施例では、再構成、組換えまたはスプライシングの効率（本実施例では、異なるＲＮＡ分子上に存在する２つの異なる核酸編集タンパク質コード配列の正しい結合、および／または所望の核酸編集全長タンパク質の産生の尺度であり、ここで、２つの異なる核酸編集タンパク質コード配列は、約３６００ｎｔの転写物をコードする）は、約２５％～約５０％、例えば、約３０％～約４０％、例えば、約３５％である。

一部の実施例では、再構成、組換えまたはスプライシングの効率（本実施例では、異なるＲＮＡ分子上に存在する２つの異なる核酸編集タンパク質コード配列の正しい結合、および／または所望の核酸編集全長タンパク質の産生の尺度であり、ここで、２つの異なる核酸編集タンパク質コード配列は、約３２００ｎｔの転写物をコードする）は、約２５％～約５０％、例えば、約３０％～約４０％、例えば、約３５％である。

一部の実施例では、再構成、組換えまたはスプライシングの効率（本実施例では、異なるＲＮＡ分子上に存在する３つの異なる核酸編集タンパク質コード配列の正しい結合、および／または所望の全長核酸編集タンパク質の産生の尺度であり、ここで、３つの異なる核酸編集タンパク質コード配列は、約３２００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、例えば、約４０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約６０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約６０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、または約８０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、例えば、最大約１３，５００ｎｔの転写物をコードする）は、約１０％～約１００％である。一部の実施例では、３つの部分からなる系を使用した再構成効率は、約１０％～約１５％、約１０％～約２０％、約１０％～約２５％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約１０％～約５０％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約１０％～約１００％、約１５％～約２０％、約１５％～約２５％、約１５％～約３０％、約１５％～約４０％、約１５％～約５０％、約１５％～約６０％、約１５％～約７０％、約１５％～約８０％、約１５％～約９０％、約１５％～約１００％、約２０％～約２５％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約２０％～約１００％、約２５％～約３０％、約２５％～約４０％、約２５％～約５０％、約２５％～約６０％、約２５％～約７０％、約２５％～約８０％、約２５％～約９０％、約２５％～約１００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３０％～約１００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４０％～約１００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５０％～約１００％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約６０％～約１００％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、または約９０％～約１００％である。一部の実施例では、再構成効率は、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％である。一部の実施例では、再構成効率は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％である。一部の実施例では、再構成効率は、多くとも約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％である。

一部の実施例では、再構成、組換えまたはスプライシングの効率（本実施例では、異なるＲＮＡ分子上に存在する４つの異なる核酸編集タンパク質コード配列の正しい結合、および／または所望の全長核酸編集タンパク質の産生の尺度であり、ここで、４つの異なる核酸編集タンパク質コード配列は、約３２００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、例えば、約４０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約４０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、または約１２，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、例えば、最大約１８，０００ｎｔの転写物をコードする）は、約１０％～約１００％である。一部の実施例では、４つの部分からなる系を使用した再構成効率は、約１０％～約１５％、約１０％～約２０％、約１０％～約２５％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約１０％～約５０％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約１０％～約１００％、約１５％～約２０％、約１５％～約２５％、約１５％～約３０％、約１５％～約４０％、約１５％～約５０％、約１５％～約６０％、約１５％～約７０％、約１５％～約８０％、約１５％～約９０％、約１５％～約１００％、約２０％～約２５％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約２０％～約１００％、約２５％～約３０％、約２５％～約４０％、約２５％～約５０％、約２５％～約６０％、約２５％～約７０％、約２５％～約８０％、約２５％～約９０％、約２５％～約１００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３０％～約１００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４０％～約１００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５０％～約１００％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約６０％～約１００％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、または約９０％～約１００％である。一部の実施例では、再構成効率は、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％である。一部の実施例では、再構成効率は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％である。一部の実施例では、再構成効率は、多くとも約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％である。一部の実施例では、本開示の組成物、系または方法を、当業者に公知の任意の適切な方法を使用してＲＮＡまたはタンパク質の産生レベルを決定することによって評価する。一部の実施例では、ＲＮＡ産生レベルは、対照ＲＮＡと比べた正しく結合されたＲＮＡの尺度、または対照と比べた全長タンパク質の尺度によって表される。一部の実施例では、対照ＲＮＡは対応する変異体ＲＮＡまたは内因性ＲＮＡである。例えば、トランスフェクトされた細胞において産生された結合したＲＮＡの量の変異体または内因性ＲＮＡの量に対する比をトランスフェクトされていない細胞における同じ比と比較して、正しく結合されたＲＮＡの産生レベルを決定する。一部の実施例では、正しく結合されたＲＮＡ、全長タンパク質、またはタンパク質活性の量の、対照ＲＮＡの量、または対照タンパク質の量もしくは活性に対する比を比較する。

一部の実施例では、実現されるＲＮＡ産生レベルは、５％～１００％である。一部の実施例では、実現されるＲＮＡ産生レベルは、約５％～約１００％である。一部の実施例では、実現されるＲＮＡ産生レベルは、約５％～約１０％、約５％～約２０％、約５％～約２５％、約５％～約３０％、約５％～約４０％、約５％～約５０％、約５％～約６０％、約５％～約７０％、約５％～約８０％、約５％～約９０％、約５％～約１００％、約１０％～約２０％、約１０％～約２５％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約１０％～約５０％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約１０％～約１００％、約２０％～約２５％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約２０％～約１００％、約２５％～約３０％、約２５％～約４０％、約２５％～約５０％、約２５％～約６０％、約２５％～約７０％、約２５％～約８０％、約２５％～約９０％、約２５％～約１００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３０％～約１００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４０％～約１００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５０％～約１００％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約６０％～約１００％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、または約９０％～約１００％である。一部の実施例では、実現されるＲＮＡ産生レベルは、約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％である。一部の実施例では、実現されるＲＮＡ産生レベルは、少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％である。一部の実施例では、実現されるＲＮＡ産生レベルは、多くとも約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％である。

一部の実施例では、タンパク質産生レベルは、対照タンパク質の全長核酸編集タンパク質または核酸編集タンパク質活性の量と比べた全長核酸編集タンパク質または核酸編集タンパク質活性の量の尺度によって表される。一部の実施例では、対照タンパク質は、対応する変異体タンパク質または内因性タンパク質である。例えば、トランスフェクトされた細胞において産生された全長核酸編集タンパク質またはタンパク質活性の量の変異体タンパク質または内因性タンパク質の量に対する比をトランスフェクトされていない細胞における同じ比と比較する。一部の実施例では、対照タンパク質は、例えば、対照全長タンパク質を発現するように操作された細胞（ここで、細胞は本発明の構築物をトランスフェクトされていない）または対照全長タンパク質を発現する正常な対象由来のトランスフェクトされていない細胞において産生される全長核酸編集タンパク質であり、タンパク質産生レベルは、トランスフェクトされた細胞における核酸編集タンパク質の量または活性を測定し、それを対照タンパク質のものと比較することによって決定される。一部の実施例では、対照タンパク質は、構築物をトランスフェクトされた細胞またはトランスフェクトされていない細胞において産生されるタンパク質の変異体形態であり、全長タンパク質またはタンパク質活性の量を対照タンパク質のものと比較して、タンパク質産生レベルを決定する。一部の実施例では、全長タンパク質またはタンパク質活性の量を内因性タンパク質またはハウスキーピングタンパク質のものと比較して、タンパク質産生レベルを決定する。

一部の実施例では、実現されるタンパク質産生レベルは、約１％～約１００％である。一部の実施例では、実現されるタンパク質産生レベルは、約１０％～約１００％である。一部の実施例では、実現されるタンパク質産生レベルは、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約１０％～約５０％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約７５％、約１０％～約８０％、約１０％～約８５％、約１０％～約９０％、約１０％～約１００％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約７５％、約２０％～約８０％、約２０％～約８５％、約２０％～約９０％、約２０％～約１００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約７５％、約３０％～約８０％、約３０％～約８５％、約３０％～約９０％、約３０％～約１００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約７５％、約４０％～約８０％、約４０％～約８５％、約４０％～約９０％、約４０％～約１００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約７５％、約５０％～約８０％、約５０％～約８５％、約５０％～約９０％、約５０％～約１００％、約６０％～約７０％、約６０％～約７５％、約６０％～約８０％、約６０％～約８５％、約６０％～約９０％、約６０％～約１００％、約７０％～約７５％、約７０％～約８０％、約７０％～約８５％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約７５％～約８０％、約７５％～約８５％、約７５％～約９０％、約７５％～約１００％、約８０％～約８５％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、約８５％～約９０％、約８５％～約１００％、または約９０％～約１００％である。一部の実施例では、実現されるタンパク質産生レベルは、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約１００％である。一部の実施例では、実現されるタンパク質産生レベルは、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、または約９０％である。一部の実施例では、実現されるタンパク質産生レベルは、多くとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約１００％である。

一部の実施例では、実現されるタンパク質活性レベルは、約５０％～約１００％である。一部の実施例では、実現されるタンパク質活性レベルは、約５０％～約１００％である。一部の実施例では、実現されるタンパク質活性レベルは、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約６５％、約５０％～約７０％、約５０％～約７５％、約５０％～約８０％、約５０％～約８５％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～約１００％、約５５％～約６０％、約５５％～約６５％、約５５％～約７０％、約５５％～約７５％、約５５％～約８０％、約５５％～約８５％、約５５％～約９０％、約５５％～約９５％、約５５％～約１００％、約６０％～約６５％、約６０％～約７０％、約６０％～約７５％、約６０％～約８０％、約６０％～約８５％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～約１００％、約６５％～約７０％、約６５％～約７５％、約６５％～約８０％、約６５％～約８５％、約６５％～約９０％、約６５％～約９５％、約６５％～約１００％、約７０％～約７５％、約７０％～約８０％、約７０％～約８５％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～約１００％、約７５％～約８０％、約７５％～約８５％、約７５％～約９０％、約７５％～約９５％、約７５％～約１００％、約８０％～約８５％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８０％～約１００％、約８５％～約９０％、約８５％～約９５％、約８５％～約１００％、約９０％～約９５％、約９０％～約１００％、または約９５％～約１００％である。一部の実施例では、実現されるタンパク質活性レベルは、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％である。一部の実施例では、実現されるタンパク質活性レベルは、少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％である。一部の実施例では、実現されるタンパク質活性レベルは、多くとも約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％である。

一部の実施例では、細胞において産生される正しく結合されたＲＮＡまたは全長核酸編集タンパク質の量は、例えば、１つまたは複数のｇＲＮＡの発現と組み合わせて、特定の状態または疾患に関して当業者によって理解される通り、対象における状態または疾患を好転させるまたは治癒させるために十分なものである。一部の実施例では、細胞において産生される正しく結合されたＲＮＡまたは全長核酸編集タンパク質の量は（例えば、１つまたは複数のｇＲＮＡの発現と組み合わせて）有効量である。一部の実施例では、この量は、正常な細胞において産生されるＲＮＡまたはタンパク質の量の約５０％～１００％に相当する。一部の実施例では、この量は、正常な細胞において産生されるＲＮＡまたはタンパク質の量の約４０％～約１００％に相当する。一部の実施例では、この量は、正常な細胞において産生されるＲＮＡまたはタンパク質の量の約４０％～約４５％、約４０％～約５０％、約４０％～約５５％、約４０％～約６０％、約４０％～約６５％、約４０％～約７０％、約４０％～約７５％、約４０％～約８０％、約４０％～約８５％、約４０％～約９０％、約４０％～約１００％、約４５％～約５０％、約４５％～約５５％、約４５％～約６０％、約４５％～約６５％、約４５％～約７０％、約４５％～約７５％、約４５％～約８０％、約４５％～約８５％、約４５％～約９０％、約４５％～約１００％、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約６５％、約５０％～約７０％、約５０％～約７５％、約５０％～約８０％、約５０％～約８５％、約５０％～約９０％、約５０％～約１００％、約５５％～約６０％、約５５％～約６５％、約５５％～約７０％、約５５％～約７５％、約５５％～約８０％、約５５％～約８５％、約５５％～約９０％、約５５％～約１００％、約６０％～約６５％、約６０％～約７０％、約６０％～約７５％、約６０％～約８０％、約６０％～約８５％、約６０％～約９０％、約６０％～約１００％、約６５％～約７０％、約６５％～約７５％、約６５％～約８０％、約６５％～約８５％、約６５％～約９０％、約６５％～約１００％、約７０％～約７５％、約７０％～約８０％、約７０％～約８５％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約７５％～約８０％、約７５％～約８５％、約７５％～約９０％、約７５％～約１００％、約８０％～約８５％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、約８５％～約９０％、約８５％～約１００％、または約９０％～約１００％に相当する。一部の実施例では、この量は、正常な細胞において産生されるＲＮＡまたはタンパク質の量の約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約１００％に相当する。一部の実施例では、この量は、正常な細胞において産生されるＲＮＡまたはタンパク質の量の、少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、または約９０％に相当する。一部の実施例では、この量は、正常な細胞において産生されるＲＮＡまたはタンパク質の量の、多くとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約１００％に相当する。

組換え効率または産生レベルを決定するために使用するＲＮＡまたはタンパク質の測定は、当業者に公知の任意の適切な方法によって行うことができる。一部の実施例では、発現された機能的タンパク質の量を例えばウエスタンブロット法によって測定することにより、組換え効率または産生レベルを決定する。一部の実施例では、例えば、２つのプローブに基づく定量的リアルタイムＰＣＲを使用してＲＮＡ転写物を測定することにより、組換え効率または産生レベルを決定する。例えば、第１のアッセイは、３’エクソンコード配列に完全に含有される配列（３’プローブで標識）にわたる。第２のアッセイは、５’エクソンコード配列と３’エクソンコード配列の間の結合部（結合部プローブで標識）にわたる。再構成効率は、（結合部プローブ計数）／（３’プローブ計数）の比として算出することができる。「再構成効率」、「組換え効率」および「スプライシング効率」は、本明細書では互換的に使用される。

本明細書に提示される組成物および方法を使用して実現される再構成されたタンパク質の発現のレベル、または核酸配列の上首尾の編集のレベル（および、例えば、コードされるタンパク質の産生）は、間接的な測定値、例えば、代表的なマーカー、代理、または機能的指標のレベルに基づいて評価することができる。当業者に公知の任意のそのようなマーカーを、本開示に従って再構成または編集されたタンパク質のレベルの評価に使用し、それに基づいて対照と比較することができる。例えば、ジストロフィン－糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）またはそのサブ複合体の形成により、ジストロフィン機能の回復が表され得る。例えば、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれるGao and McNally, 2015, "The Dystrophin Complex: structure, function and implications for therapy" Compr Physiol. 2015 5(3): 1223-39、およびOmairi, et al., 2019, "Regulation of the dystrophinassociated glycoprotein complex composition by the metabolic properties of muscle fibres," Scientific Reports (2019) 9: 2770を参照されたい。

一部の実施例では、二量体形成ドメインは、約２０～約１０００ｎｔ、または約５０～約１６０ｎｔ、または約５０～約５００ｎｔ、または約５０～１０００ｎｔであり、ここで、再構成効率は、有効量の正しく結合されたＲＮＡまたは全長核酸編集タンパク質の産生をもたらすものである。一部の実施例では、二量体形成ドメインは約５０～約１６０ｎｔであり、ここで、再構成効率は、有効量の正しく結合されたＲＮＡまたは全長核酸編集タンパク質の産生をもたらすものである。

複数のＲＮＡ分子間の効率的な組換えの実現により、単一のＡＡＶのパッケージングの制限を超えた導入遺伝子のＡＡＶへのパッケージングおよび送達が可能になる。ＡＡＶパッケージングの制限は、大きな遺伝子の非存在／欠陥によって引き起こされる疾患に対する遺伝子療法の手法の主要な障害である。この系の適用の１つは、核酸編集タンパク質および標的遺伝子に特異的な１つまたは複数のｇＲＮＡを、パッケージング容量が制限されたウイルスベクターを使用して発現させることである。疾患および遺伝子としては、これだけに限定されないが、（疾患（遺伝子、ＯＭＩＭ遺伝子識別子））：１）デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびベッカー型筋ジストロフィー（ジストロフィン、ＯＭＩＭ：３００３７７）；２）ジスフェルリン異常症（ジスフェルリン、ＯＭＩＭ：６０３００９）；３）嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ、ＯＭＩＭ：６０２４２１）；４）アッシャー症候群１Ｂ（ミオシンＶＩＩＡ、ＯＭＩＭ：２７６９０３）；５）スタルガルト病１（ＡＢＣＡ４、ＯＭＩＭ：６０１６９１）；６）血友病Ａ（凝固第ＶＩＩＩ因子、ＯＭＩＭ：３００８４１）；７）フォン・ヴィルブランド病（フォン・ヴィルブランド因子、ＯＭＩＭ：６１３１６０）；８）マルファン症候群（フィブリリン１、ＯＭＩＭ：１３４７９７）；９）フォンレックリングハウゼン病（神経線維腫症－１、ＯＭＩＭ：１６２２００）、および聴力損失（ＯＴＯＦ、ＯＭＩＭ：６０３６８１）が挙げられる。一部の実施形態では、標的核酸は、ジストロフィン；ジスフェルリン；ミオシンＶＩＩＡ；フィブリリン１；神経線維腫症－１；ヘモグロビンのβ－グロビン鎖；凝固因子Ｉ；凝固因子ＩＩ；凝固因子ＩＩＩ；凝固因子ＩＶ；凝固因子Ｖ；凝固因子ＶＩ；凝固因子ＶＩＩ；凝固因子ＶＩＩＩ；凝固因子ＩＸ；凝固因子Ｘ；凝固因子ＸＩ；凝固因子ＸＩＩ；凝固因子ＸＩＩＩ；ＨＢＡ１；ＨＢＡ２；ＨＢＢ；ＨＢＤ；フォン・ヴィルブランド因子；ＭＴＨＦＲ；ＦＡＮＣＡ；ＦＡＮＣＣ；ＦＡＮＣＤ２；ＦＡＮＣＧ；ＦＡＮＣＪ；ＡＤＡＭＴＳ１３；第Ｖ因子ライデンプロトロンビン；ＩＬ－２ＲＧ、ＪＡＫ３、ＩＬ－２受容体ガンマ鎖；ＩＬ－４受容体ガンマ鎖；ＩＬ－７受容体ガンマ鎖；ＩＬ－９受容体ガンマ鎖；ＩＬ－１５受容体ガンマ鎖；ＩＬ－２１受容体ガンマ鎖；ＲＡＧ１；ＲＡＧ２；ＣＸＣＲ４；ＩＬ７受容体；ＡＤＡ；ＰＮＰ；ＷＡＳ；ＣＹＢＡ、ＣＹＢＢ、ＮＣＦ１、ＮＣＦ２、ＮＣＦ４；ベータ２インテグリン；Ｃ－Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）、ＭＳＲＢ１；ＣＳＣＲ４；Ｐ１７；ＰＳＩＰ１；ＣＣＲ５；ＤＭＤ；Ｇ６Ｐａｓｅ；ＣＥＰ２９０；ＡＢＣＡ４；ＭＡＧＴ１；アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）；ＡＢＣＤ１；ＩＤＳ；ＩＤＵＡ；ＩＤＵＡ；ＳＧＳＨ；ＮＡＧＬＵ；ＨＧＳＮＡＴ；ＧＮＳ；ＧＡＬＮＳ；ＧＬＢ１；ＡＲＳＢ；ＧＵＳＢ；ＨＹＡＬ１；ＭＡＮ２Ｂ１；ＳＭＰＤ１；ＮＰＣ１；ＮＰＣ２；ＣＦＴＲ；ＰＫＤ－１；ＰＤＫ－２；ＰＤＫ－３；ＨＥＸＡ；ＧＢＡ；ＨＴＴ；ＮＦ－１；ＮＦ２；ＡＰＯＢ；ＬＤＬＲ；ＬＤＬＲＡＰ１；ＰＣＳＫ９；ＢＣＲ－ＡＢＬ；ＡＳＸＬ１；ＲＵＮＸ２；ＥＰＨＡ１；ＰＤ－１；アンドロゲン受容体；Ｅ６；Ｅ７；ＣＤ；ＮＧＦ；ＡＲＳＡ；ＭＢＰ；ＷＡＳＰ；ＡＡＤＣ；ＣＬＮ２；ＡＳＰＡ；ＧＡＮ；ＭＴ－ＮＤ４；ＳＧＳＨ；ＳＵＭＦ１；ＧＡＤ；ＮＴＲＮ；ＴＨ；ＣＨ１；ＧＤＮＦ；ＧＡＡ；ＳＭＮ；およびチミジンキナーゼから選択されるタンパク質をコードする（野生型の場合）遺伝子に存在する。他のものを表１～４に提示する。例えば、ゲノム点変異を処置するまたは遺伝子を活性化するもしくは過剰発現させるために、核酸編集タンパク質、および、例えば１つまたは複数の（for example or more）標的核酸に特異的なｇＲＮＡの発現を、本明細書に提示される開示される系を使用して発現させることができる。核酸編集タンパク質の送達は、本明細書に提示される手法を使用して当該タンパク質を複数の断片に分割することによって実現することができる。

本明細書に開示される方法および系の追加的な適用としては、標的化遺伝子発現のための交差遺伝子送達（intersectional gene delivery）が挙げられる。断片化された遺伝子をコードする２つのウイルスの示差的感染／発現パターンを使用することができる。再構成されたタンパク質は、いずれのウイルスもそれ自体で発現する交差を表す重複する細胞集団において発現される。そのような適用の例としては、以下を挙げることができる：（１）タンパク質の両半分（または３つの３分の１、または他の部分）を、逆行輸送されるウイルスベクターを使用して２つ（またはそれよりも多く）の投影標的から送達して、二股のデュアル投影ニューロンを標識すること、（２）集団Ａにおいて活性であるプロモーターの制御下にある１つの断片および、集団Ｂにおいて活性なプロモーターからの第２の断片を送達して、Ａ∪Ｂ集団に対する特異的なタグ付け／操作を行うこと、（３）タンパク質の第１の半分を、集団Ａに対するトロピズムを有するウイルスベクターを用いて送達し、第２の半分を、集団Ｂに対するトロピズムを有するウイルスベクターを用いて送達して、Ａ∪Ｂ集団に対する特異的なタグ付け／操作を行うこと。またはこれらの手法の組合せ。

一実施例では、二量体形成ドメインは、例えば、（ａ）アプタマーによって認識される小分子トリガー、または（ｂ）両半分に結合し、したがって、二量体形成を刺激する、細胞内に存在するタンパク質の存在下で二量体形成を容易にするためのアプタマー配列である。

一部の実施形態では、末端結合に必要なＲＮＡ－ＲＮＡ相互作用を、例えば、（ａ）両半分に対する相同性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（ｓｓＤＮＡにより誘発される二量体形成）など、他のヌクレオチドによって正にまたは負に制御することができる。そのような実施例では、両方の半分に対する相補配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが２つの分子に架橋してひとつにし、したがって、２つの分子のスプライソソーム媒介性組換えが容易になる。（ｂ）２つの結合しているＲＮＡのうちの一方に対する相同性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、２つの分子のＲＮＡ二量体形成を妨げ、遺伝子発現のためのオフスイッチの役割を果たすことができるか、または、（ｃ）両半分に対して相同性を有する内因性細胞ＲＮＡ（ＲＮＡにより誘発される二量体形成）。そのような実施例では、両方の半分に対する相補配列を有する細胞ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはレトロエレメント）が２つの分子に架橋してひとつにし、したがって、２つの分子のスプライソソーム媒介性組換えが容易になる。

これらの分子、タンパク質、またはＲＮＡ媒介性相互作用により、制御可能な／微調整された遺伝子発現レベルが可能になる：結合ドメイン（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子、内因性細胞ＲＮＡ）と相互作用する分子の用量設定を行うことにより、両半分間の二量体形成効率をモジュレートして、プロモーター活性とは無関係に発現レベルを調節することができる。そのような分割方式（installment）は、狭い範囲のタンパク質の発現レベルが必要な場合に使用することができる。

ＩＩＩ．系
２つまたはそれよりも多くのＲＮＡ分子、例えば、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、または少なくとも５種の異なるＲＮＡ分子（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種または１０種の異なるＲＮＡ分子）を、二量体形成配列を含有する合成イントロンを使用して組み換えるために使用することができる系が本明細書に提示される。タンパク質レベルでの２つの断片の断片化および再構成とは異なり、本明細書に開示される手法では、適切な分割点を見つけるための広範囲にわたるタンパク質操作が必要ない。ＲＮＡレベルでの再構成により、タンパク質の２つの断片のシームレス結合が可能になる。本明細書に開示される方法および系により、大きな遺伝子（および対応するタンパク質）、例えば、約４．５ｋｂよりも大きい、少なくとも５ｋｂよりも大きい、少なくとも５．５ｋｂよりも大きい、少なくとも６ｋｂよりも大きい、少なくともｋｂよりも大きい、少なくとも８ｋｂよりも大きい、少なくとも８ｋｂよりも大きい、少なくとも１０ｋｂよりも大きい、少なくとも１３．５ｋｂよりも大きい、または少なくとも１８ｋｂよりも大きいものを、２つまたはそれよりも多くの断片または部分に分けることが可能になり、そのそれぞれを別々のベクター、例えば複数のＡＡＶによって細胞または対象に導入することができる。一部の実施例では、本明細書に開示される方法および系により、核酸編集遺伝子（および対応するタンパク質、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）、例えば、少なくとも約２ｋｂよりも大きい、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも３．５ｋｂ、または少なくとも４ｋｂのものを、２つまたはそれよりも多くの断片または部分に分けることが可能になり、そのそれぞれを別々のベクター、例えば複数のＡＡＶによって細胞または対象に導入することができ、ここで、そのようなベクターは、１つまたは複数の標的核酸分子に特異的な（例えば、編集される、例えば、１つまたは複数のヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの欠失、挿入、または置換がなされる１つまたは複数の標的部位に対して特異的な）１つまたは複数のｇＲＮＡコード配列をさらに含み得る。一部の実施例では、例えば、ベクターから発現されるｇＲＮＡ分子の数を増加させるために、同じ１つまたは複数のｇＲＮＡコード配列の複数のコピーが存在する。一実施例では、系は、２つのＲＮＡ分子を組み換えるための２つの部分を含み、ここで、例えば、標的タンパク質は少なくとも約４５００ｎｔ～約９０００ｎｔ、例えば、４０００ｎｔ～５０００ｎｔによってコードされる。一実施例では、系は、３つのＲＮＡ分子を組み換えるための３つの部分を含み、ここで、例えば、核酸編集タンパク質は、最大約１３，５００ｎｔ、例えば、約２０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔまたは３０００ｎｔ～５０００ｎｔによってコードされる。一実施例では、系は、４つのＲＮＡ分子を組み換えるための４つの部分を含み、ここで、例えば、核酸編集タンパク質は、最大約１８，０００ｎｔ、例えば、約２０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔまたは２０００ｎｔ～５０００ｎｔによってコードされる。これは、ベクターにおいて利用可能な空間の制限を克服するのに役立つ。一部の実施例では、内因性プロモーターの長さが、ＡＡＶで発現されるその対応する遺伝子の容量を制限する。一部の実施例では、コード配列の長さが、ＡＡＶで発現されるその容量を制限する。一部の実施例では、内因性プロモーターの長さおよびそのコード配列の長さが、ＡＡＶで共に発現されるそれらの容量を制限する。本明細書に開示される系は、以前はＡＡＶで発現させることが難しかったそのような長い配列を発現させるために使用することができる。本明細書に開示される系はまた、ｇＲＮＡの量が律速となり得るため、例えば、核酸編集タンパク質と組み合わせて、１つまたは複数のｇＲＮＡの多数のコピーを発現させるためにも使用することができる。一部の実施例では、本明細書に開示されるＤＮＡおよび系は、少なくとも２のｇＲＮＡ、少なくとも３のｇＲＮＡ、少なくとも４のｇＲＮＡ、少なくとも５のｇＲＮＡ、少なくとも１０のｇＲＮＡ、少なくとも２０のｇＲＮＡ、少なくとも５０のｇＲＮＡ、少なくとも７５のｇＲＮＡ、少なくとも１００のｇＲＮＡ、少なくとも２００のｇＲＮＡ、少なくとも５００のｇＲＮＡ、または少なくとも１０００のｇＲＮＡを発現させ、ここで、ｇＲＮＡは、同じ核酸分子および同じ標的部位を標的とすることができる、同じ核酸分子および同じ核酸分子内の２つまたはそれよりも多くの標的部位を標的とすることができる、２つまたはそれよりも多くの異なる核酸分子（例えば、それぞれ異なる標的核酸分子内の１つまたは複数の標的部位）を標的とすることができる、またはこれらの組合せであり得る。

一部の実施例では、１つまたは複数のｇＲＮＡは、単一遺伝子疾患、劣性遺伝子疾患、遺伝子の変異によって引き起こされる疾患などの疾患に関連する遺伝子などの核酸分子を標的とする。そのような疾患の例としては、これだけに限定されないが、血友病Ａ（凝固第ＶＩＩＩ因子とも称されるＦ８遺伝子、７ｋｂコード領域の変異によって引き起こされる）、血友病Ｂ（Ｆ９遺伝子の変異によって引き起こされる）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ジストロフィン遺伝子、１１ｋｂコード領域の変異によって引き起こされる）、鎌状赤血球貧血（約３．５ｋｂのプロモーターを有するヘモグロビンのベータグロビンドメインの変異によって引き起こされる）、スタルガルト病（ＡＢＣＡ４遺伝子、６．９ｋｂのコード領域の変異によって引き起こされる）、アッシャー症候群（ＭＹＯ７Ａ、７ｋｂコード領域の変異によって引き起こされ、聴力損失および視覚障害）が挙げられる。一実施例では、遺伝子は、遺伝子の点変異によって引き起こされるものである。

一実施例では、１つまたは複数のｇＲＮＡは、がん、例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、肝臓がん、腎臓がん、脳がん、骨がん、卵巣がん、子宮がん、皮膚がん、または結腸がんなどの疾患を処置するために、遺伝子などの核酸分子を標的とする。

一部の実施例では、核酸編集タンパク質をコードし、本明細書に開示される方法および系に使用されるＲＮＡ配列を、標的生物体または細胞における発現のためにコドン最適化する、例えば、ヒト、イヌ、ブタ、ネコ、マウス、またはラットの細胞における発現のためにコドン最適化する。したがって、一部の実施例では、ＲＮＡコード配列は、好ましいコドンを含む（例えば、利用が少ない稀なコドンを含まない）。コドン最適化は、標的生物体または細胞において豊富なｔＲＮＡレベルを同定することによって実施することができる。一部の実施例では、ＲＮＡ組換え反応を最大にするために、タンパク質をコードするＲＮＡ配列を潜在スプライスドナーおよびアクセプター部位について脱富化する。

一部の実施例では、核酸編集タンパク質を２つの部分、例えば、およそ２つの等しい半分（または他の割合、例えば、約１／３を発現する部分Ａと約２／３を発現する部分Ｂ、または約１／４を発現する部分Ａと約３／４を発現する部分Ｂなど）に分ける。しかし、各部分のヌクレオチドの数が同じである必要はない（または同じ数のアミノ酸をコードする必要はない）。そのような実施例では、方法に２つの合成核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはそのようなＲＮＡをコードするＤＮＡ）を使用することができ、そのうちの一方はタンパク質のＮ末端部分のコード配列を含み、他方はタンパク質のＣ末端部分のコード配列を含む。この基礎に基づいて、タンパク質を２つの断片または部分に分けることに加えて、核酸編集タンパク質を２つよりも多くの断片、例えば３つの断片に分けるまたは分割することができることが当業者には理解されよう。３つのＲＮＡ分子のイントロン配列の設計原理は２つのＲＮＡ分子のものと同様であるが、代わりに、２つの結合部のうちの一方について二量体形成ドメインの異なる対を利用する。したがって、例えば、Ｎ末端タンパク質コード配列の後には特定の結合ドメイン（例えば、第１の二量体形成配列）を有するイントロン配列が続き、中間コード配列は、第１の二量体形成配列に対する相補配列（第２の二量体形成配列）を有するイントロン配列を含む。中間コード断片の後には別の二量体形成配列（第３の二量体形成配列、第２の二量体形成配列とは異なる）を有する別のイントロン断片が続く。第３の断片はタンパク質のＣ末端コード配列を含み、また、第３の二量体形成配列と相補的な二量体形成配列（第４の二量体形成配列）を有するイントロン領域を含む。１つよりも多くの中間部分の使用では、２つの中間部分を、それぞれの部分が区別されることが理解されるように、例えば、中間部分および第１の中間部分、または第１の中間部分および第２の中間部分、または、第１の中間部分、第２の中間部分および第３の中間部分と称することができる。

一実施例では、核酸編集タンパク質をＮ末端部分とＣ末端部分に分け（例えば、大まかに半分、または等しくない配分、例えば、１／３と２／３または１／４と３／４に分け）、それらを、本明細書に開示される系および方法を使用して再構成することができる。図６Ａおよび６Ｇを参照すると、そのような実施例では、系は、少なくとも２つの合成核酸分子１１０、１５０を含む。各核酸分子１１０、１５０はＤＮＡまたはＲＮＡで構成され得る（ＲＮＡの場合、対応するプロモーター１１２、１５２は存在しない）。一部の実施例では、１１０、１５０はそれぞれ、およそ少なくとも１００ヌクレオチド／リボヌクレオチド（ｎｔ）の長さ、例えば、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、少なくとも１０００ｎｔ、少なくとも２０００ｎｔ、少なくとも３０００ｎｔ、少なくとも４０００ｎｔ、少なくとも５０００ｎｔ、少なくとも６０００ｎｔ、少なくとも７０００ｎｔ、少なくとも８０００ｎｔ、少なくとも１０，０００ｎｔ、例えば、２００～１０，０００ｎｔ、２００～８０００ｎｔ、５００～５０００ｎｔ、８００～３０００ｎｔ、１０００～３００ｎｔ、または２００～１０００ｎｔである。分子１１０、１５０は、天然および／または非天然ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得る。

分子１１０は、スプライスドナー１１６を含むので、系の５’に位置する分子である。分子１１０がＤＮＡである実施形態では、分子１１０は、ＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結したプロモーター１１２を含み、ＲＮＡ分子は、５’から３’に：標的タンパク質コード配列の３’末端にスプライスジャンクションを含む、標的タンパク質のＮ末端部分のコード配列１１４、ＳＤ１１６、必要に応じたＤＩＳＥ１１８、必要に応じたＩＳＥ１２０、二量体形成ドメイン１２２、および必要に応じたポリアデニル化配列１２４を含む。任意のプロモーター１１２（またはエンハンサー）、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩを利用するもの、例えば構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを使用することができる。一部の実施例では、プロモーター１１２は、筋組織（例えば、骨格筋組織もしくは心筋組織）、眼の組織（例えば、網膜組織）、内耳組織、肝組織、膵組織、肺組織、皮膚組織、骨、または腎組織において構成的に活性なものなどの、組織特異的プロモーターである。一部の実施例では、プロモーター１１２は、がん細胞、または正常な細胞において構成的に活性なものなどの細胞特異的プロモーターである。一部の実施例では、プロモーター１１２は、発現させるタンパク質の内因性プロモーターであり、一部の実施例では、長い（例えば、少なくとも２５００ｎｔ、少なくとも３０００ｎｔ、少なくとも４０００ｎｔ、少なくとも５０００ｎｔ、または少なくとも７５００ｎｔ）。一部の実施例では、プロモーター１１２は、少なくとも約５０ヌクレオチド（ｎｔ）の長さ、例えば、少なくとも100の長さ、少なくとも200の長さ、少なくとも300の長さ、少なくとも500の長さ、少なくとも1000の長さ、少なくとも2000の長さ、少なくとも3000の長さ、少なくとも4000の長さ、少なくとも5000の長さ、少なくとも6000の長さ、少なくとも7000の長さ、少なくとも8000ntの長さ、少なくとも9000ntの長さ、または少なくとも10,000ntの長さ、例えば、50～10,000ntの長さ、100～5000ntの長さ、500～5000ntの長さ、または50～1000ntの長さである。一部の実施例では、分子１１０はＤＮＡであり、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、少なくとも８００ｎｔ、少なくとも１０００ｎｔ、少なくとも２０００ｎｔ、少なくとも３０００ｎｔ、少なくとも４０００ｎｔ、少なくとも５０００ｎｔ、少なくとも６０００ｎｔ、少なくとも７０００ｎｔ、または少なくとも８０００ｎｔ、例えば、２００～１０，０００ｎｔ、２００～８０００ｎｔ、５００～５０００ｎｔ、８００～３０００ｎｔ、１０００～３００ｎｔ、または２００～１０００ｎｔの長さである。図６Ｆに示されている通り、分子１１０がＲＮＡである実施形態では、例えば、ＤＮＡのＲＮＡへの転写後、分子１１０はプロモーター１１２を含まず、１１４は、核酸編集タンパク質のＮ末端部分のコード配列によってコードされるＲＮＡである。一部の実施例では、分子１１０はＲＮＡであり、プロモーター１１２を含まず、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、少なくとも１０００ｎｔ、少なくとも２０００ｎｔ、少なくとも３０００ｎｔ、少なくとも４０００ｎｔ、少なくとも５０００ｎｔ、少なくとも６０００ｎｔ、少なくとも７０００ｎｔ、または少なくとも８０００ｎｔ、例えば、２００～１０，０００ｎｔ、２００～８０００ｎｔ、５００～５０００ｎｔ、８００～３０００ｎｔ、１０００～３００ｎｔ、または２００～１０００ｎｔの長さである。分子１１０（プロモーター１１２を有するまたは有さない）は、天然および／または非天然ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得る。

Ｎ末端コード配列（またはそれによってコードされるＲＮＡ配列）１１４の３’末端の周囲のスプライスジャンクションは、分子１１０、１５０が導入される標的細胞または生物体において見いだされるコンセンサス配列とマッチし得る。ヒトでは、スプライスジャンクション配列は、Ｕ２依存性イントロンに関しては５’スプライス部位の－１位および－２位のＡＧ（アデニン－グアニン）もしくはＵＧ（ウラシル－グアニン）またはＵ１２依存性イントロンに関してはＡＧ、ＵＧ、ＣＵ（シトシン－ウラシル）、もしくはＵＵである。したがって、一部の実施例では、スプライスジャンクションは２ｎｔの長さであり、Ｎ末端コード部分１１４の３’末端はＡＧ、ＵＧ、ＣＵまたはＵＵである。一部の実施例では、核酸編集タンパク質の一部をコードするＤＮＡ分子は、複数のスプライスジャンクションの一部をコードする配列を、例えば、核酸編集タンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ分子の３’末端、および核酸編集タンパク質のＣ末端部分をコードするＤＮＡ分子の５’末端に含む。

分子１１０の残りの３’末端部分はイントロン１３０である。一部の実施例では、イントロン配列１３０は、およそ少なくとも１０ｎｔ、例えば、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも２５０ｎｔ、少なくとも２５０ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、または少なくとも５００ｎｔの長さ、例えば、２０～５００ｎｔ、２０～２５０ｎｔ、２０～１００ｎｔ、５０～１００ｎｔ、または５０～２００ｎｔの長さである。Ｎ末端コード配列（またはそれによってコードされるＲＮＡ）１１４のすぐ後ろはスプライスドナー（ＳＤ）１１６（例えば、ＳＤヒトコンセンサス配列などのＳＤコンセンサス配列）である。したがって、イントロン配列１３０のＳＤ１１６はＮ末端コード配列１１４に対して３’側にある。ＳＤ１１６はＲＮＡ分子に結合するためのスプライソソーム成分の認識配列を形成する。ＳＤ１１６の配列は、分子１１０、１５０が導入される標的細胞または生物体において見いだされるＳＤコンセンサス配列であり得る。一部の実施例では、ＳＤ１１６は、少なくとも２ｎｔ、例えば、少なくとも５ｎｔ、または少なくとも１０ｎｔの長さ、例えば、２～１０ｎｔ、２～８ｎｔ、２～５または５～１０ｎｔである。ＳＤ１１６を使用してＵ２またはＵ１２依存性スプライシング機構を動員することができる。一実施例では、Ｕ２依存性スプライシングをヒト細胞において使用し、ＳＤ１１６配列はＧＵＡＡＧＵＡＵＵを含むかまたはＧＵＡＡＧＵＡＵＵである。一実施例では、Ｕ１２依存性スプライシングをヒト細胞において使用し、ＳＤ１１６配列はＡＵＡＵＣＣＵＵＵＵＵＡ（配列番号１３７）またはＧＵＡＵＣＣＵＵＵＵＵＡ（配列番号１３８）を含むかまたはＡＵＡＵＣＣＵＵＵＵＵＡ（配列番号１３７）またはＧＵＡＵＣＣＵＵＵＵＵＡ（配列番号１３８）である。全体を通して、ＲＮＡ配列はヌクレオチドＡ、Ｇ、ＵおよびＣを使用して記載することができ、ＤＮＡ配列はヌクレオチドＡ、Ｇ、ＴおよびＣを使用して記載することができることが理解される。転写されて１つまたは複数のＲＮＡ分子を形成するＤＮＡ分子によって構成されると本明細書に記載される配列、および翻訳され得る（すなわち、タンパク質コード配列）または翻訳され得ない（例えば、ｇＲＮＡ）ＲＮＡ分子によって構成されると記載される配列は、当業者が認識することができる意図された機能を有する配列であることも理解される。例えば、本開示のＤＮＡ分子に存在するｇＲＮＡ配列は、その転写後に機能的になる配列を有する。別の例として、本開示のＤＮＡ分子に存在する標的タンパク質コード配列は、ＤＮＡから転写されるｍＲＮＡから標的タンパク質に翻訳され得る配列を有する。ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子によってコードされる、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ分子によって構成されると称される配列は、本開示を読めば当業者には理解される、意図された機能的産物をもたらすものである。

イントロン配列１３０は、必要に応じて、スプライソソームの作用を刺激する（例えば、活性を増大させる）、下流イントロンスプライスエンハンサー（ＤＩＳＥ）１１８およびイントロンスプライスエンハンサー（ＩＳＥ）１２０と称されるスプライシングエンハンサー配列のセットのうちの一方または両方を含む。一部の実施例では、イントロン配列１３０は、少なくとも２つのスプライシングエンハンサー配列、例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのスプライシングエンハンサー配列を含む。例示的なスプライシングエンハンサー配列はＤＩＳＥ１１８およびＩＳＥ１２０を含む。一部の実施例では、１つまたは複数のスプライシングエンハンサー配列１１８、１２０をイントロン配列１３０に含めることにより、スプライシング効率が少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％上昇する。使用することができる例示的なスプライシングエンハンサー配列は、配列番号２６～１３６、１５１、および１５２、ならびにＧＧＧＴＴＴ、ＧＧＴＧＧＴ、ＴＴＴＧＧＧ、ＧＡＧＧＧＧ、ＧＧＴＡＴＴ、ＧＴＡＡＣＧ、ＧＧＧＧＧＴＡＧＧ、ＧＧＡＧＧＧＴＴＴ、ＧＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＣＡＴ、ＣＣＡＴＴＴ、ＴＴＴＴＡＡＡ、ＴＧＣＡＴ、ＴＧＣＡＴＧ、ＴＧＴＧＴＴ、ＣＴＡＡＣ、ＴＣＴＣＴ、ＴＣＴＧＴ、ＴＣＴＴＴ、ＴＧＣＡＴＧ、ＣＴＡＡＣ、ＣＴＧＣＴ、ＴＡＡＣＣ、ＡＧＣＴＴ、ＴＴＣＡＴＴＡ、ＧＴＴＡＧ、ＴＴＴＴＧＣ、ＡＣＴＡＡＴ、ＡＴＧＴＴＴ、ＣＴＣＴＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧ（Ｎ）２－４ＧＧＧ、ＴＧＧＧ、ＹＣＡＹ、ＵＧＣＡＵＧ、または３ｘ（Ｇ_３～６Ｎ_１～７）に提示される。一部の実施例では、ＤＩＳＥ１１８は、存在する場合、少なくとも３ｎｔ、少なくとも４ｎｔ、少なくとも５ｎｔ、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも２５ｎｔ、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも７５ｎｔ、または少なくとも１００ｎｔの長さ、例えば、３～１０ｎｔ、３～１１ｎｔ、４～１１ｎｔ、５～１１ｎｔ、１０～５０ｎｔ、５～１００ｎｔ、１０～２５ｎｔ、１０～２０ｎｔ、または２０～７５ｎｔであってよく、ＤＩＳＥ１１８の配列は、ＣＵＣＵＵＵＣＵＵＵＴＣＣＡＵＧＧＧＵＵＧＧＣＵ（配列番号１３４）、ＴＧＣＡＴＧ、ＣＴＡＡＣ、ＣＴＧＣＴ、ＴＡＡＣＣ、ＡＧＣＴＴ、ＴＴＣＡＴＴＡ、ＧＴＴＡＧ、ＴＴＴＴＧＣ、ＡＣＴＡＡＴ、ＡＴＧＴＴＴまたはＣＴＣＴＧであるかまたはそれを含む。一部の実施例では、ＩＳＥ１２０は、存在する場合、およそ少なくとも３ｎｔ、少なくとも４ｎｔ、少なくとも５ｎｔ、少なくとも１０ｎｔ、例えば、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２５ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、少なくとも４０ｎｔ、または少なくとも５０ｎｔの長さ、例えば、３～１０ｎｔ、３～１１ｎｔ、４～１１ｎｔ、５～１１ｎｔ、１０～５０ｎｔ、２０～２５ｎｔ、１０～２５ｎｔ、１０～２０ｎｔ、または２０～４０ｎｔの長さであり得る。一実施例では、ＩＳＥ１２０の配列は、ＧＧＣＵＧＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＵＧＵＣＣＵＧＧＧ（配列番号１３５）、ＧＧＧＵＵＡＵＧＧＧＡＣＣ（配列番号１３６）、ＴＴＣＡＴ、ＣＣＡＴＴＴ、ＴＴＴＴＡＡＡ、ＴＧＣＡＴ、ＴＧＣＡＴＧ、ＴＧＴＧＴＴ、ＣＴＡＡＣ、ＴＣＴＣＴ、ＴＣＴＧＴ、またはＴＣＴＴＴであるかまたはそれを含む。一部の実施例では、イントロン配列１３０は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのＩＳＥ１２０を含む。一部の実施例では、ＩＳＥ１２０は、配列番号１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０１、２０２、または２０３に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１つの配列、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つのそのような配列、例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのそのような配列であるかまたはそれを含む。一部の実施例では、ＤＩＳＥ１１８は、配列番号１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０１、２０２、または２０３に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１つの配列、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つのそのような配列、例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのそのような配列であるかまたはそれを含む。

ＳＤ１１６（および存在する場合、エンハンサー配列１１８、１２０も）の３’側に、Ｎ末端コード配列（またはそれによってコードされるＲＮＡ）１１４とＣ末端コード配列１５４をひとつに合わせるために使用される二量体形成ドメイン１２２が続く。分子１１０のイントロン配列１３０部分は、必要に応じて、３’末端に、その断片の転写を終結させるポリアデニル化部位１２４を含み得る。一部の実施例では、ポリアデニル化配列１２４は、少なくとも１５個のＡ、例えば、１５～３０個または１５～２０個のＡのポリＡ配列である。

一部の実施例では、第１の二量体形成ドメイン１２２（および分子１５０の第２の二量体形成ドメイン１５４）は、複数の対合していないヌクレオチドを含む（すなわち、分子１１０自体の構造内で対合していない）。二量体形成ドメイン内に対合していないヌクレオチドを有することにより、５’（または第１の）二量体形成ドメイン１２２と３’（または第２の）二量体形成ドメイン１５４が塩基対合を通じて相互作用することが可能になる。この相互作用を通じて、分子１１０と１５０が近傍に保たれ、それにより、スプライソソームがＮ末端コード領域（またはそれによってコードされるＲＮＡ）１１４とＣ末端コード領域（またはそれによってコードされるＲＮＡ）１６４を結合することによって２つの分子を組み換えるように促される。

一実施例では、二量体形成ドメイン１２２（および１５４）は多様性が限られたヌクレオチドを含有する「低多様性配列」を含み、したがって、各分子１１０、１５０の二次構造において二量体形成ドメイン１２２（および１５４）自体がステムループを形成する可能性は低い。そのような低多様性二量体形成ドメイン１２２（および１５４）は、タンパク質のＮ末端およびＣ末端をコードするＤＮＡ（またはそれによってコードされるＲＮＡ）１１４、１６４の配列とは無関係に、比較的開いた構成であり得る。これにより、第１の二量体形成ドメイン１２２のヌクレオチドを対応する分子１５０の第２の二量体形成ドメイン１５４との塩基対の形成に利用可能にすることが可能になり、それにより、その後のＮ末端コード配列（またはそれによってコードされるＲＮＡ）１１４とＣ末端コード配列（またはそれによってコードされるＲＮＡ）１６４の結合が可能になる。一部の実施例では、第１の二量体形成ドメインおよび第２の二量体形成ドメイン１２２、１５４は、ステムを形成し得る配列が散在する低多様性配列を含み、それにより、シュードノット形成の非存在下で開いており、塩基対合に利用可能な局所的なＲＮＡループがもたらされる（図６Ｂ）。例示的な低多様性配列は、繰り返される一連のＵ（例えば、３０～５００個のＵ）、繰り返される一連のＡ（例えば、３０～５００個のＡなど）、繰り返される一連のＧ（例えば、３０～５００個のＧ）、繰り返される一連のＣ（例えば、３０～５００個のＣ）、ＡおよびＧのみを含有する混合物（例えば、３０～５００個のＡおよびＧ、例えば、繰り返され得るＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡ（．．．）（配列番号１４９））、ＣおよびＵのみを含有する混合物（例えば、３０～５００個のＣおよびＵ、例えば、繰り返され得るＣＵＵＵＣＵＵＵＵＣＵＵ（．．．）（配列番号１５０））を含む。他の例示的な低多様性配列は、低多様性配列によって挟まれたヘリックスを形成する相補配列を含む。

一部の実施例では、第１の二量体形成ドメインおよび第２の二量体形成ドメイン１２２、１５４は、プリンのみを含むか、またはピリミジンのみを含む。一実施例では、第１の二量体形成ドメイン１２２はプリンのみを含み、一方、第２の二量体形成ドメイン１５４ピリミジンのみを含む。別の例では、第１の二量体形成ドメイン１２２はピリミジンのみを含み、一方、第２の二量体形成ドメイン１５４はプリンのみを含む。プリンはそれら自体で対合することができないので（ピリミジンも同様に）、これらの一続きのＲＮＡは、開いた予測される構造を有する。

一部の実施例では、第１の二量体形成ドメインおよび第２の二量体形成ドメイン１２２、１５４は、スプライスドナーコンセンサス配列ＮＮＮＡＧＧＵＮＮＮＮ（配列番号１５１）またはＮＮＮＵＧＧＵＮＮＮＮ（配列番号１５２）（式中、Ｎは任意のヌクレオチドを指す）と同様の配列などの、ＲＮＡ組換えと競合する可能性がある潜在スプライスアクセプターを含まない。一部の実施例では、第１の二量体形成ドメイン１２２は、１０００ｎｔ以下、例えば７５０ｎｔ以下、または５００ｎｔを超える、例えば、６～１０００ｎｔ、１０～１０００ｎｔ、２０～１０００ｎｔ、３０～１０００ｎｔ、３０～７５０ｎｔ、３０～５００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１００ｎｔ、もしくは１００～２５０ｎｔである。一部の実施例では、第１の二量体形成ドメイン１２２は、５０ｎｔよりも大きい、例えば、少なくとも５１ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも１６１ｎｔ、または少なくとも１７０ｎｔ、例えば、５１～１５９ｎｔ、５１～１５０ｎｔ、５１～１２０ｎｔ、５１～１００ｎｔ、もしくは５１～７０ｎｔである。一部の実施例では、第１の二量体形成ドメイン１２２は、１６０ｎｔよりも大きい、例えば、少なくとも１６１ｎｔ、少なくとも１７０ｎｔ、少なくとも１８０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、少なくとも６００ｎｔ、少なくとも７００ｎｔ、少なくとも８００ｎｔ、少なくとも９００ｎｔ、もしくは少なくとも１０００ｎｔ、例えば、１６１～１００ｎｔ、１６１～５００ｎｔ、１６１～３００ｎｔ、１６１～２００ｎｔ、もしくは１６１～１７０ｎｔである。一部の実施例では、第１の二量体形成ドメイン１２２は、５０ｎｔ未満、例えば、６～４９ｎｔ、６～４５ｎｔ、６～４０ｎｔ、６～３０ｎｔ、６～２０ｎｔ、または６～１０ｎｔである。

一部の実施例では、二量体形成ドメインは、２０～１６０ｎｔ、５０～５００ｎｔ、または５００～１０００ｎｔである。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、約２０ｎｔ～約１６０ｎｔである。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、約２０ｎｔ～約４０ｎｔ、約２０ｎｔ～約５０ｎｔ、約２０ｎｔ～約７０ｎｔ、約２０ｎｔ～約９０ｎｔ、約２０ｎｔ～約１００ｎｔ、約２０ｎｔ～約１１０ｎｔ、約２０ｎｔ～約１２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約１３０ｎｔ、約２０ｎｔ～約１４０ｎｔ、約２０ｎｔ～約１５０ｎｔ、約２０ｎｔ～約１６０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約４０ｎｔ～約７０ｎｔ、約４０ｎｔ～約９０ｎｔ、約４０ｎｔ～約１００ｎｔ、約４０ｎｔ～約１１０ｎｔ、約４０ｎｔ～約１２０ｎｔ、約４０ｎｔ～約１３０ｎｔ、約４０ｎｔ～約１４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約１５０ｎｔ、約４０ｎｔ～約１６０ｎｔ、約５０ｎｔ～約７０ｎｔ、約５０ｎｔ～約９０ｎｔ、約５０ｎｔ～約１００ｎｔ、約５０ｎｔ～約１１０ｎｔ、約５０ｎｔ～約１２０ｎｔ、約５０ｎｔ～約１３０ｎｔ、約５０ｎｔ～約１４０ｎｔ、約５０ｎｔ～約１５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約１６０ｎｔ、約７０ｎｔ～約９０ｎｔ、約７０ｎｔ～約１００ｎｔ、約７０ｎｔ～約１１０ｎｔ、約７０ｎｔ～約１２０ｎｔ、約７０ｎｔ～約１３０ｎｔ、約７０ｎｔ～約１４０ｎｔ、約７０ｎｔ～約１５０ｎｔ、約７０ｎｔ～約１６０ｎｔ、約９０ｎｔ～約１００ｎｔ、約９０ｎｔ～約１１０ｎｔ、約９０ｎｔ～約１２０ｎｔ、約９０ｎｔ～約１３０ｎｔ、約９０ｎｔ～約１４０ｎｔ、約９０ｎｔ～約１５０ｎｔ、約９０ｎｔ～約１６０ｎｔ、約１００ｎｔ～約１１０ｎｔ、約１００ｎｔ～約１２０ｎｔ、約１００ｎｔ～約１３０ｎｔ、約１００ｎｔ～約１４０ｎｔ、約１００ｎｔ～約１５０ｎｔ、約１００ｎｔ～約１６０ｎｔ、約１１０ｎｔ～約１２０ｎｔ、約１１０ｎｔ～約１３０ｎｔ、約１１０ｎｔ～約１４０ｎｔ、約１１０ｎｔ～約１５０ｎｔ、約１１０ｎｔ～約１６０ｎｔ、約１２０ｎｔ～約１３０ｎｔ、約１２０ｎｔ～約１４０ｎｔ、約１２０ｎｔ～約１５０ｎｔ、約１２０ｎｔ～約１６０ｎｔ、約１３０ｎｔ～約１４０ｎｔ、約１３０ｎｔ～約１５０ｎｔ、約１３０ｎｔ～約１６０ｎｔ、約１４０ｎｔ～約１５０ｎｔ、約１４０ｎｔ～約１６０ｎｔ、または約１５０ｎｔ～約１６０ｎｔである。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、約２０ｎｔ、約４０ｎｔ、約５０ｎｔ、約７０ｎｔ、約９０ｎｔ、約１００ｎｔ、約１１０ｎｔ、約１２０ｎｔ、約１３０ｎｔ、約１４０ｎｔ、約１５０ｎｔ、または約１６０ｎｔである。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、少なくとも約２０ｎｔ、約４０ｎｔ、約５０ｎｔ、約７０ｎｔ、約９０ｎｔ、約１００ｎｔ、約１１０ｎｔ、約１２０ｎｔ、約１３０ｎｔ、約１４０ｎｔ、または約１５０ｎｔである。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、多くても約４０ｎｔ、約５０ｎｔ、約７０ｎｔ、約９０ｎｔ、約１００ｎｔ、約１１０ｎｔ、約１２０ｎｔ、約１３０ｎｔ、約１４０ｎｔ、約１５０ｎｔ、または約１６０ｎｔである。

一部の実施例では、二量体形成ドメインは、約５０ｎｔ～約５００ｎｔである。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、約５０ｎｔ～約１００ｎｔ、約５０ｎｔ～約１５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約２００ｎｔ、約５０ｎｔ～約２５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約３００ｎｔ、約５０ｎｔ～約３５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約４００ｎｔ、約５０ｎｔ～約５００ｎｔ、約１００ｎｔ～約１５０ｎｔ、約１００ｎｔ～約２００ｎｔ、約１００ｎｔ～約２５０ｎｔ、約１００ｎｔ～約３００ｎｔ、約１００ｎｔ～約３５０ｎｔ、約１００ｎｔ～約４００ｎｔ、約１００ｎｔ～約５００ｎｔ、約１５０ｎｔ～約２００ｎｔ、約１５０ｎｔ～約２５０ｎｔ、約１５０ｎｔ～約３００ｎｔ、約１５０ｎｔ～約３５０ｎｔ、約１５０ｎｔ～約４００ｎｔ、約１５０ｎｔ～約５００ｎｔ、約２００ｎｔ～約２５０ｎｔ、約２００ｎｔ～約３００ｎｔ、約２００ｎｔ～約３５０ｎｔ、約２００ｎｔ～約４００ｎｔ、約２００ｎｔ～約５００ｎｔ、約２５０ｎｔ～約３００ｎｔ、約２５０ｎｔ～約３５０ｎｔ、約２５０ｎｔ～約４００ｎｔ、約２５０ｎｔ～約５００ｎｔ、約３００ｎｔ～約３５０ｎｔ、約３００ｎｔ～約４００ｎｔ、約３００ｎｔ～約５００ｎｔ、約３５０ｎｔ～約４００ｎｔ、約３５０ｎｔ～約５００ｎｔ、または約４００ｎｔ～約５００ｎｔである。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、約５０ｎｔ、約１００ｎｔ、約１５０ｎｔ、約２００ｎｔ、約２５０ｎｔ、約３００ｎｔ、約３５０ｎｔ、約４００ｎｔ、または約５００ｎｔである。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、少なくとも約５０ｎｔ、約１００ｎｔ、約１５０ｎｔ、約２００ｎｔ、約２５０ｎｔ、約３００ｎｔ、約３５０ｎｔ、または約４００ｎｔである。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、多くても約１００ｎｔ、約１５０ｎｔ、約２００ｎｔ、約２５０ｎｔ、約３００ｎｔ、約３５０ｎｔ、約４００ｎｔ、または約５００ｎｔである。

一部の実施例では、第１の二量体形成ドメインおよび第２の二量体形成ドメイン１２２および１５４の配列をｉｎｓｉｌｉｃｏ構造予測スクリーニング（例えば、ＲＮＡフォールディング構造予測を使用して、可能性のある二量体形成ドメイン配列のライブラリーをスクリーニングする；二量体形成ドメインおよび対応する抗二量体形成ドメインの両方における対合していないヌクレオチドの割合が大きい配列を選択する）、低多様性ヌクレオチド設計（例えば、二量体形成ドメインを、それ自体と折りたたむことができない配列であるＵのみ、Ａのみ、Ｃのみ、Ｇのみ、Ｒ（ＧおよびＡ）のみ、またはＹ（ＵおよびＣ）のみのリピート配列などの一続きの低多様性配列を含むように設計する）、または経験的スクリーニング（例えば、二量体形成ドメインおよび対応する抗二量体形成ドメインのライブラリーを合成し、最大の組換え効率についてスクリーニングする）によって決定する。

一部の実施例では、第１の二量体形成ドメインおよび第２の二量体形成ドメイン１２２、１５４の配列を、それらの対応物との強力なキッシングループ相互作用を形成することができる相補的なＲＮＡヘアピン構造（ステムループとも称される）を含有するように設計する。一部の実施例では、コード配列の３つまたはそれよりも多くの部分を結合するために、３個またはそれよりも多くの二量体形成ドメイン、例えば、４個またはそれよりも多くまたは５個またはそれよりも多くの二量体形成ドメイン、例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の二量体形成ドメインを使用する場合にキッシングループを使用する（例えば、図６Ｅ）。キッシングループの各ヘアピンループ（またはステムループ）は、非相補配列の領域（例えば、ループを形成する）によって分離された少なくとも２つの相補配列（例えば、ステムを形成する）で構成される。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、１個またはそれよりも多く（例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、もしくは２０個）のループで構成され得る。複数のループを用いる一部の実施例では、ループの全部または一部を繰り返すことができる。複数のループを用いる一部の実施例では、全部または一部のループは異なり得る。一部の実施例では、各相補配列は約４～１００ｎｔであり、約３～２０ｎｔのループによって分離されている。２つの相補配列間の塩基対合により、例えば、少なくとも４ｂｐ、少なくとも５ｂｐ、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも７５ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、または少なくとも１００ｂｐ、例えば、４～１００ｂｐ、５～７５ｂｐ、または１０～５０ｂｐのヘリックス（またはステム）がもたらされる。一部の実施例では、ループ部分は、少なくとも３ｎｔ、少なくとも５ｎｔ、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ、または少なくとも２０ｎｔ、例えば、３～２０ｎｔ、５～１５ｎｔもしくは５～１０ｎｔであり、ここで、ループは塩基対合していない。２つのヘアピンループ間の相補配列により、塩基対合、およびキッシングループ／キッシングステムループ相互作用の生成がもたらされる。一部の実施例では、２つのヘアピンループ間の相補配列は、１つのループの少なくとも３ヌクレオチドと第２のループの少なくとも３ヌクレオチドの間、例えば、第１のループの少なくとも４ｎｔ、少なくとも５ｎｔ、少なくとも６ｎｔ、少なくとも７ｎｔ、少なくとも８ｎｔ、少なくとも９ｎｔ、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも１１ｎｔ、少なくとも１２ｎｔ、少なくとも１３ｎｔ、少なくとも１４ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも１６ｎｔ、少なくとも１７ｎｔ、少なくとも１９ｎｔ、または少なくとも２０ｎｔ（例えば、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔまたは２０ｎｔ）と、第２のループの少なくとも４ｎｔ、少なくとも５ｎｔ、少なくとも６ｎｔ、少なくとも７ｎｔ、少なくとも８ｎｔ、少なくとも９ｎｔ、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも１１ｎｔ、少なくとも１２ｎｔ、少なくとも１３ｎｔ、少なくとも１４ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも１６ｎｔ、少なくとも１７ｎｔ、少なくとも１９ｎｔ、または少なくとも２０ｎｔ（例えば、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔまたは２０ｎｔ）の間に存在する。一部の実施例では、２つのヘアピンループ間の相補配列は、総ループ配列の少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の間で存在する。

一部の場合では、キッシングループのステムを、２つのＲＮＡ分子間でトランスに塩基対合するように選択する。そのような実施例では、１つの分子上の１つのヘアピンループと第２の分子上の別のヘアピンループのキッシングループ相互作用の形成後、最初のヘアピンループのそれぞれのステム（またはヘリックス）領域が、鎖置換／侵入および２重鎖形成の伸長を通じて２つのＲＮＡ分子間でトランスに塩基対合し得る。一部の実施例では、最初のループ配列内で、２重鎖形成の伸長後にヌクレオチドの最大約８５％が塩基対合していないまま残り得る（例えば、ヌクレオチドの約１５％が２つのループ間で対合している）。一部の実施例では、キッシングループは、ＨＩＶ－１ＤＩＳループに基づくものであり（配列番号１３９および１４０、図１７Ａ）、６ヌクレオチドの相補配列の５’側に２つのＡヌクレオチド、続いて、３’側に１つのＡヌクレオチドを含む（例えば、ＡＡＮＮＮＮＮＮＡ、式中、ＮはＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣのいずれであってもよい）。一部の実施例では、キッシングループは、ＨＩＶ－２キッシングループ二量体形成ドメインに基づくものであり（配列番号１４１および１４２、図１７Ｂ）、６ヌクレオチドの相補配列の５’側にＧヌクレオチドおよびＡヌクレオチド、続いて、３’側に３つのＡヌクレオチドを含む（例えば、ＧＡＮＮＮＮＮＮＡＡＡ（配列番号１５３）、式中、Ｎは、Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣであり得る）。

１つの構成では、伸長した２重鎖における高いパーセンテージのマッチをもたらす最初のステムにミスマッチが含まれることにより、２重鎖形成の伸長が選好される。したがって、一部の実施例では、ヘアピンループのヘリックスまたはステム領域は、最初に対合していない塩基対を最大３０％含有し得る（例えば、塩基対の３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下、例えば、１～３０％、５～３０％、１０～３０％、または２５～３０％が最初に対合していない）。対合していないこれらの領域は、バルジ、ミスマッチ、または内部ループを形成し得る。

２つのヘアピンループの相互作用（キッシングループ相互作用）に加えて、他の形態のループ相互作用を第１の二量体形成ドメインおよび第２の二量体形成ドメイン１２２、１５４に対して利用することができる。一実施例では、ループはバルジであり、塩基対合したヘリックスの一方の鎖は、ステム構造からはみ出た１つまたは複数のヌクレオチドを含有する。例示的なバルジは、少なくとも１ｎｔ、少なくとも２ｎｔ、少なくとも３ｎｔ、少なくとも４ｎｔ、少なくとも５ｎｔ、少なくとも１０ｎｔまたは少なくとも２０ｎｔ、例えば、１～２０ｎｔ、１～１５ｎｔ、１～１０ｎｔ、もしくは５～１０ｎｔ、または１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔもしくは２０ｎｔである。一実施例では、ループは内部ループであり、例えば、ヘリックス内の１つまたはそれよりも多くのヌクレオチドがミスマッチであり、その結果、ミスマッチの位置で内部ループによって中断されたヘリックスが生じる。一部の実施例では、ヘリックスは、鎖のそれぞれにおいて少なくとも４ｎｔ（例えば、少なくとも５ｎｔ、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、少なくとも４０ｎｔ、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも７５ｎｔ、少なくとも９０ｎｔ、または少なくとも１００ｎｔ、例えば、４～１００ｎｔ、５～７５ｎｔ、または１０～５０ｎｔ、例えば、４～１００ｎｔ）であり、内部ループの両側において少なくとも１ｎｔ（例えば、鎖のそれぞれにおいて少なくとも２ｎｔ、少なくとも３ｎｔ、少なくとも４ｎｔ、少なくとも５ｎｔ、少なくとも１０ｎｔもしくは少なくとも２０ｎｔ、例えば、１～２０ｎｔ、１～１５ｎｔ、１～１０ｎｔ、もしくは５～１０ｎｔ、または１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔもしくは２０ｎｔ）である。一実施例では、ループは多分枝ループであり、３つのヘリックスまたはステムが、１つまたは複数の対合していないヌクレオチドにより３つのヘリックスが接続された三角形を形成する（from）。一部の実施例では、ヘリックスのそれぞれは少なくとも４ｂｐ（例えば、少なくとも５ｂｐ、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも７５ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、または少なくとも１００ｂｐ、例えば、４～１００ｂｐ、５～７５ｂｐ、または１０～５０ｂｐ）であり、三角形を形成する対合していないヌクレオチドは少なくとも３ｎｔ（例えば、少なくとも４ｎｔ、少なくとも５ｎｔ、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも２０、少なくとも１５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、または少なくとも６０ｎｔ、例えば、３～６０ｎｔ、３～３０ｎｔ、３～２５ｎｔ、または５～２０ｎｔ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０ヌクレオチド）である。キッシング相互作用はこれらの型のループの任意の２つの間（例えば、それぞれが１つまたは複数のヘリックスを含む２つまたはそれよりも多くの結合ドメインの間）で生じ得る。一部の実施例では、最初のループキッシング相互作用後に２重鎖形成の伸長を可能にするために、一方の二量体形成ドメイン（例えば、第１の二量体形成ドメイン１２２）内のヘリックスは他方の結合ドメイン（例えば、第２の二量体形成ドメイン１５４）内に直接対応物を有する。一部の実施例では、ループを生成するためのヘリックスを含有する二量体形成ドメインは、２つまたはそれよりも多くの二量体形成ドメイン（例えば、図６Ａの１２２、１５４）が相互作用すると単一のキッシングステムループを形成する。一部の実施例では、ヘリックスを含有する二量体形成ドメインは、２つまたはそれよりも多くの二量体形成ドメイン（例えば、図６Ａの１２２、１５４）が相互作用すると、キッシングループ相互作用のための複数のループを形成する。一部の実施例では、１つまたは複数の二量体形成ドメイン（例えば、図６Ａの１２２）は、バルジ、一塩基バルジ、ミスマッチまたは内部ループ、またはＧ－Ｕゆらぎ対が含まれることによって不安定化するヘリックスを含有するが、他方の結合ドメイン（例えば、図６Ａの１５４）とマッチして、最初のキッシング／対合後の２重鎖形成の伸長が選好される。一部の実施例では、１つまたは複数の二量体形成ドメイン（例えば、図６Ａ、６Ｇの１２２）は、不安定化されたヘリックスを含有し、これが安定化されると（例えば、テオフィリン切り換えキッシングループ）、第２の二量体形成ドメイン（例えば、図６Ａ、６Ｇの１２２）とループ－ループ相互作用（例えば、キッシング／対合）を通じて相互作用することができるループが露出する。

一部の実施例では、これらのステムループは、少なくとも１０ｎｔ、例えば、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２５ｎｔ、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも７５ｎｔ、または少なくとも１００ｎｔの長さ、例えば、１０～５０ｎｔ、２０～２５ｎｔ、１０～１００ｎｔ、１０～２０ｎｔ、または２０～４０ｎｔの長さを含有する。各二量体形成ドメインは、個々のステムループを少なくとも１個、例えば、個々のステムループを少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または少なくとも２０個、例えば、１～２０個、２～５個または１～１０個含有し得る。

一部の実施例では、コード配列の３～１０個の部分を２～９個のキッシングループによって結合する、例えば、３個の部分を２個のキッシングループによって結合する、４個の部分を３個のキッシングループによって結合するなどであり、ここで、２～９個のキッシングループのそれぞれは異なるものである。一部の実施例では、キッシングループは、複数のステムループ、例えば、２～２０個のステムループを含む。一部の実施例では、キッシングループ内の複数のステムループのそれぞれは同じものである。一部の実施例では、キッシングループ内の複数のステムループのそれぞれは異なるものである。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、１～２０個のステムループを含む。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、１個のステムループ～２０個のステムループを含む。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、１個のステムループ～２個のステムループ、１個のステムループ～３個のステムループ、１個のステムループ～４個のステムループ、１個のステムループ～５個のステムループ、１個のステムループ～６個のステムループ、１個のステムループ～７個のステムループ、１個のステムループ～８個のステムループ、１個のステムループ～９個のステムループ、１個のステムループ～１０個のステムループ、１個のステムループ～１５個のステムループ、１個のステムループ～２０個のステムループ、２個のステムループ～３個のステムループ、２個のステムループ～４個のステムループ、２個のステムループ～５個のステムループ、２個のステムループ～６個のステムループ、２個のステムループ～７個のステムループ、２個のステムループ～８個のステムループ、２個のステムループ～９個のステムループ、２個のステムループ～１０個のステムループ、２個のステムループ～１５個のステムループ、２個のステムループ～２０個のステムループ、３個のステムループ～４個のステムループ、３個のステムループ～５個のステムループ、３個のステムループ～６個のステムループ、３個のステムループ～７個のステムループ、３個のステムループ～８個のステムループ、３個のステムループ～９個のステムループ、３個のステムループ～１０個のステムループ、３個のステムループ～１５個のステムループ、３個のステムループ～２０個のステムループ、４個のステムループ～５個のステムループ、４個のステムループ～６個のステムループ、４個のステムループ～７個のステムループ、４個のステムループ～８個のステムループ、４個のステムループ～９個のステムループ、４個のステムループ～１０個のステムループ、４個のステムループ～１５個のステムループ、４個のステムループ～２０個のステムループ、５個のステムループ～６個のステムループ、５個のステムループ～７個のステムループ、５個のステムループ～８個のステムループ、５個のステムループ～９個のステムループ、５個のステムループ～１０個のステムループ、５個のステムループ～１５個のステムループ、５個のステムループ～２０個のステムループ、６個のステムループ～７個のステムループ、６個のステムループ～８個のステムループ、６個のステムループ～９個のステムループ、６個のステムループ～１０個のステムループ、６個のステムループ～１５個のステムループ、６個のステムループ～２０個のステムループ、７個のステムループ～８個のステムループ、７個のステムループ～９個のステムループ、７個のステムループ～１０個のステムループ、７個のステムループ～１５個のステムループ、７個のステムループ～２０個のステムループ、８個のステムループ～９個のステムループ、８個のステムループ～１０個のステムループ、８個のステムループ～１５個のステムループ、８個のステムループ～２０個のステムループ、９個のステムループ～１０個のステムループ、９個のステムループ～１５個のステムループ、９個のステムループ～２０個のステムループ、１０個のステムループ～１５個のステムループ、１０個のステムループ～２０個のステムループ、または１５個のステムループ～２０個のステムループを含む。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、１個のステムループ、２個のステムループ、３個のステムループ、４個のステムループ、５個のステムループ、６個のステムループ、７個のステムループ、８個のステムループ、９個のステムループ、１０個のステムループ、１５個のステムループ、または２０個のステムループを含む。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、少なくとも１個のステムループ、２個のステムループ、３個のステムループ、４個のステムループ、５個のステムループ、６個のステムループ、７個のステムループ、８個のステムループ、９個のステムループ、１０個のステムループ、または１５個のステムループを含む。一部の実施例では、二量体形成ドメインは、多くても２個のステムループ、３個のステムループ、４個のステムループ、５個のステムループ、６個のステムループ、７個のステムループ、８個のステムループ、９個のステムループ、１０個のステムループ、１５個のステムループ、または２０個のステムループを含む。

２つまたはそれよりも多くの二量体形成ドメイン（例えば、図６Ａ、６Ｇの１２２、１５４）が、コード配列の組換えを生じさせるために十分に、互いに結合するまたは相互作用することを可能にする他の機構を使用することができる。一部の実施例では、２つまたはそれよりも多くの二量体形成ドメイン（例えば、図６Ａ、６Ｇの１２２、１５４）は、互いに、例えば、非塩基対合相互作用を通じて相互作用することができるか、または、共通の分子（例えば、タンパク質、ＡＴＰ、金属イオン、補因子、または合成リガンド）に結合することができる、核酸アプタマー（例えば、ＲＮＡアプタマー）である。一部の実施例では、２つまたはそれよりも多くの二量体形成ドメイン（例えば、図６Ａ、６Ｇの１２２、１５４）は、互いにはハイブリダイズしないが、両方とも（または全て）同じ架橋核酸分子とハイブリダイズする。一部の実施例では、そのような架橋核酸分子を細胞、組織、または生物体に外因的に提供することができる。一部の実施例では、そのような架橋核酸分子は細胞内部のＤＮＡまたはＲＮＡ配列、例えば、転写物またはゲノム遺伝子座であり得る。一部の実施例では、２つまたはそれよりも多くの二量体形成ドメイン（例えば、図６Ａ、６Ｇの１２２、１５４）は互いに、例えば非塩基対合相互作用を通じて相互作用することができる配列である。

分子１５０は、３’に位置する分子であり、スプライスアクセプター（ＳＡ）１６２および第２の二量体形成ドメイン１５４を含む。分子１５０がＤＮＡである実施形態では、分子１５０は、第２のプロモーター１５２、続いて、イントロン配列１７０を含む。プロモーター１５２をイントロン配列１７０に作動可能に連結することができる。構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの任意のプロモーター１５２を使用することができる。一部の実施例では、プロモーター１５２は、筋組織（例えば、骨格筋組織もしくは心筋組織）、眼の組織（例えば、網膜組織）、内耳組織、肝組織、膵組織、肺組織、皮膚組織、骨、または腎組織において構成的に活性なものなどの組織特異的プロモーターである。一部の実施例では、プロモーター１１２は、がん細胞、または正常な細胞において構成的に活性なものなどの細胞特異的プロモーターである。一部の実施例では、プロモーター１１２は、発現させる標的タンパク質の内因性プロモーターであり、一部の実施例では、長い（例えば、少なくとも２５００ｎｔ、少なくとも３０００ｎｔ、少なくとも４０００ｎｔ、少なくとも５０００ｎｔ、または少なくとも７５００ｎｔ）。一部の実施例では、プロモーター１１２は、少なくとも約５０ヌクレオチド（ｎｔ）の長さ、例えば、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、少なくとも１０００ｎｔ、少なくとも２０００ｎｔ、少なくとも３０００ｎｔ、少なくとも４０００ｎｔ、少なくとも５０００ｎｔ、少なくとも６０００ｎｔ、少なくとも７０００ｎｔ、少なくとも８０００ｎｔ、少なくとも９０００ｎｔ、または少なくとも１０，０００ｎｔ、例えば、５０～１０，０００ｎｔ、１００～５０００ｎｔ、５００～５０００ｎｔ、または５０～１０００ｎｔの長さである。一部の実施例では、プロモーター１１２とプロモーター１５２は同じプロモーターである。他の例では、プロモーター１１２とプロモーター１５２は異なるプロモーターである。一部の実施例では、分子１５０はＤＮＡであり、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、少なくとも１０００ｎｔ、少なくとも２０００ｎｔ、少なくとも３０００ｎｔ、少なくとも４０００ｎｔ、少なくとも５０００ｎｔ、少なくとも６０００ｎｔ、少なくとも７０００ｎｔ、または少なくとも８０００ｎｔ、例えば、２００～１０，０００ｎｔ、２００～８０００ｎｔ、５００～５０００ｎｔ、または２００～１０００ｎｔの長さである。図６Ｆに示されている通り、分子１５０がＲＮＡである、例えば、ＤＮＡからＲＮＡへの発現後の実施形態では、分子１５０はもはやプロモーター１５２を含まず、１６４は、核酸編集タンパク質のＣ末端部分のコード配列によってコードされるＲＮＡである。一部の実施例では、分子１５０はＲＮＡであり、プロモーター１５２を含まず、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、少なくとも１０００ｎｔ、少なくとも２０００ｎｔ、少なくとも３０００ｎｔ、少なくとも４０００ｎｔ、少なくとも５０００ｎｔ、少なくとも６０００ｎｔ、少なくとも７０００ｎｔ、または少なくとも８０００ｎｔ、例えば、２００～１０，０００ｎｔ、２００～８０００ｎｔ、５００～５０００ｎｔ、または２００～１０００ｎｔの長さである。分子１５０（プロモーター１５２を有するまたは有さない）は、天然および／または非天然ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得る。

イントロン配列１７０は、第２の二量体形成ドメイン１５４、必要に応じたＩＳＥ１５６、分岐点１５８、ポリピリミジントラクト１６０、続いて、スプライスアクセプター配列１６２を含む。一部の実施例では、イントロン配列１３０は、およそ少なくとも１０ｎｔ、例えば、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも２５０ｎｔ、少なくとも２５０ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、または少なくとも５００ｎｔの長さ、例えば、２０～５００、２０～２５０、２０～１００、５０～１００、３０～５００、または５０～２００ｎｔの長さである。

第２の二量体形成ドメイン１５４は、分子１１０の第１の二量体形成ドメイン１２２配列の逆相補物である配列を有する。したがって、上記の第１の二量体形成ドメイン１２２と同じ設計の特色および考慮事項が第２の二量体形成ドメイン１５４にも当てはまる。例えば、一部の実施例では、第２の二量体形成ドメイン１５４は、第１の二量体形成ドメイン１２２とキッシングループ相互作用を形成することができるステムループを含有する。一部の実施例では、第２の二量体形成ドメイン１５４は、ＲＮＡ組換えと競合する可能性がある潜在スプライスアクセプター（例えば、ＮＮＮＡＧＧＵＮＮＮ；配列番号１４３）を含まない。一部の実施例では、第２の二量体形成ドメイン１５４は低多様性配列を有する。一部の実施例では、第２の二量体形成ドメイン１５４は、１０００ｎｔ以下、例えば、７５０ｎｔ以下、または５００ｎｔを超える、例えば、３０～１０００ｎｔ、３０～７５０ｎｔ、３０～５００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１００ｎｔ、または１００～２５０ｎｔである。一部の実施例では、第２の二量体形成ドメイン１５４は、５０ｎｔよりも大きい、例えば、少なくとも５１ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも１６１ｎｔ、または少なくとも１７０ｎｔ、例えば、５１～１５９ｎｔ、５１～１５０ｎｔ、５１～１２０ｎｔ、５１～１００ｎｔ、または５１～７０ｎｔである。一部の実施例では、第２の二量体形成ドメイン１５４は、１６０ｎｔよりも大きい、例えば、少なくとも１６１ｎｔ、少なくとも１７０ｎｔ、少なくとも１８０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、少なくとも６００ｎｔ、少なくとも７００ｎｔ、少なくとも８００ｎｔ、少なくとも９００ｎｔ、または少なくとも１０００ｎｔ、例えば、１６１～１００ｎｔ、１６１～５００ｎｔ、１６１～３００ｎｔ、１６１～２００ｎｔ、または１６１～１７０ｎｔである。一部の実施例では、第２の二量体形成ドメイン１５４は、５０ｎｔ未満、例えば、６～４９ｎｔ、６～４５ｎｔ、６～４０ｎｔ、６～３０ｎｔ、６～２０ｎｔ、または６～１０ｎｔである。

第２の二量体形成ドメイン１５４に対して３’側は、必要に応じたＩＳＥ１５６、分岐点配列１５８（例えば、分岐点コンセンサス配列）、ポリピリミジントラクト１６０、続いて、スプライスアクセプター配列１６２である。ＩＳＥ１５６は、分子１１０のＩＳＥ１２０およびＤＩＳＥ１１８と同様に、スプライソソームを刺激して組換え反応を触媒する。一部の実施例では、イントロン配列１５０は、少なくとも２つのＩＳＥ１５６、例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのＩＳＥ１５６を含む。例示的なスプライシングエンハンサー配列はＩＳＥ１５６を含む。一部の実施例では、１つまたは複数のスプライシングエンハンサー配列１５６をイントロン配列１５０に含めることにより、組換えまたはスプライシングの効率が少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％上昇する。使用することができる例示的なスプライシングエンハンサー配列は、配列番号２６～１３６、１５１、および１５２、ならびにＧＧＧＴＴＴ、ＧＧＴＧＧＴ、ＴＴＴＧＧＧ、ＧＡＧＧＧＧ、ＧＧＴＡＴＴ、ＧＴＡＡＣＧ、ＧＧＧＧＧＴＡＧＧ、ＧＧＡＧＧＧＴＴＴ、ＧＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＣＡＴ、ＣＣＡＴＴＴ、ＴＴＴＴＡＡＡ、ＴＧＣＡＴ、ＴＧＣＡＴＧ、ＴＧＴＧＴＴ、ＣＴＡＡＣ、ＴＣＴＣＴ、ＴＣＴＧＴ、ＴＣＴＴＴ、ＴＧＣＡＴＧ、ＣＴＡＡＣ、ＣＴＧＣＴ、ＴＡＡＣＣ、ＡＧＣＴＴ、ＴＴＣＡＴＴＡ、ＧＴＴＡＧ、ＴＴＴＴＧＣ、ＡＣＴＡＡＴ、ＡＴＧＴＴＴ、ＣＴＣＴＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧ（Ｎ）２－４ＧＧＧ、ＴＧＧＧ、ＹＣＡＹ、ＵＧＣＡＵＧ、または３ｘ（Ｇ_３～６Ｎ_１～７）に提示される。一部の実施例では、ＩＳＥ１５６は、存在する場合、およそ少なくとも３ｎｔ、少なくとも４ｎｔ、少なくとも５ｎｔ、少なくとも１０ｎｔ、例えば、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２５ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、少なくとも４０ｎｔ、または少なくとも５０ｎｔの長さ、例えば、３～１０ｎｔ、３～１１ｎｔ、４～１１ｎｔ、５～１１ｎｔ、１０～５０ｎｔ、２０～２５ｎｔ、１０～２５ｎｔ、１０～２０ｎｔ、または２０～４０ｎｔの長さであり得る。一実施例では、ＩＳＥ１５６の配列は、ＧＧＣＵＧＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＵＧＵＣＣＵＧＧＧ（配列番号１３５）、ＧＧＧＵＵＡＵＧＧＧＡＣＣ（配列番号１３６）、ＴＴＣＡＴ、ＣＣＡＴＴＴ、ＴＴＴＴＡＡＡ、ＴＧＣＡＴ、ＴＧＣＡＴＧ、ＴＧＴＧＴＴ、ＣＴＡＡＣ、ＴＣＴＣＴ、ＴＣＴＧＴ、またはＴＣＴＴＴであるかまたはそれを含む。一部の実施例では、ＩＳＥ１２０とＩＳＥ１５６は同じ配列である。他の例では、ＩＳＥ１２０とＩＳＥ１５６は異なる配列である。

第２の二量体形成ドメイン１５４（および存在する場合にはＩＳＥ１５６）に対して３’側は、分岐点配列１５８（例えば、分岐点コンセンサス配列）、ポリピリミジントラクト１６０、続いて、スプライスアクセプター配列１６２（例えば、スプライスアクセプターコンセンサス配列）である。分岐点１５８の配列は、標的細胞または生物体の種のコンセンサス配列に基づく。例えば、ヒトスプライシングに関しては、コンセンサス配列は、ＹＵＮＡＹを含み得るかまたはＹＵＮＡＹであり得る。したがって、使用される配列はＵ２依存性イントロンに関してはＣＵＡＡＣ、またはＵ１２依存性イントロンに関してはＵＵＵＵＣＣＵＵＡＡＣＵ（配列番号１４４）であり得る。

ポリピリミジントラクト１６０は、Ｃ、Ｕ、またはＣおよびＵヌクレオチドの両方、例えば、ＣｎＵｙを含み（ここで、ｎ＋ｙは１０ヌクレオチドよりも大きいかまたはそれと等しい）、また、３’スプライスジャンクションに対してヌクレオチド－３～－２２を含み得る。一部の実施例では、ポリピリミジントラクト１６０は、少なくとも８０％のＹヌクレオチド（すなわち、Ｕ、Ｃ、またはＵおよびＣの両方）を含む。一部の実施例では、ポリピリミジントラクト１６０はポリＣまたはポリＵ配列である。一部の実施例では、ポリピリミジントラクト１６０は少なくとも１５個のＵ、例えば、１５～３０個または１５～２０個のＵであるポリＵ配列である。分岐点１５８およびポリピリミジントラクト１６０は必須のスプライシング成分である。ＳＡ１６２の配列は、標的細胞または生物体の種のコンセンサス配列に基づくものであり得る。例えば、ヒトでは、ＳＡ配列は、Ｕ２依存性イントロンに関しては３’スプライス部位に対して－１位および－２位のＡＧであり、Ｕ１２依存性イントロンに関してはＡＣまたはＡＧであり得る。したがって、一部の実施例では、ＳＡ１６２は２ｎｔの長さ、例えば、ＡＧまたはＡＣであり得る。

ＳＡ１６２のすぐ後ろは、５’末端にスプライスジャンクションを有する標的タンパク質１６４のＣ末端部分をコードするＤＮＡ配列を含むエクソン配列である。核酸編集タンパク質１６４のＣ末端部分をコードするＤＮＡ配列の５’末端のスプライスジャンクションは分子１１０、１５０が導入される標的細胞または生物体において見いだされるコンセンサス配列とマッチし得る。一部の実施例では、スプライスジャンクションは、Ｕ２依存性イントロンに関しては３’スプライス部位に対して＋１位および＋２位のＧＡもしくはＧＵ、またはＵ１２依存性イントロンに関してはＧＵもしくはＡＵであり得る。したがって、一部の実施例では、スプライスジャンクションは２ｎｔの長さであり、Ｃ末端コード部分１６４の５’末端はＧＡ、ＧＵ、またはＡＵである。

分子１５０のイントロン部分１７０の後のエクソン配列は、核酸編集タンパク質の第２のコード部分（例えば、半分）、例えば、Ｃ末端断片１６４、および必要に応じたポリアデニル化配列１６６を含む。したがって、分子１５０は、核酸編集タンパク質のＣ末端部分をコードする配列１６４を含む。分子１５０の３’末端は、必要に応じて、スプライソソームのアセンブリを促進するポリアデニル化配列１６６を含む。一部の実施例では、ポリアデニル化配列１６６は、少なくとも１５個のＡ、例えば、１５～３０個または１５～２０個のＡのポリＡ配列である。一部の実施例では、ポリアデニル化配列１６６とポリアデニル化配列１２４は同じ配列である。他の例では、ポリアデニル化配列１６６とポリアデニル化配列１２４は異なる配列である。

一部の実施例では、Ｎ末端コード領域１１４および／またはＣ末端コード領域１６４はネイティブなコード配列である。例えば、コード配列は、本明細書に開示される系が導入される細胞または生物体において見いだされるもの（例えば、ヒト細胞または対象への導入の場合、ヒトコード配列）である。一部の実施例では、例えば、ｔＲＮＡ利用可能性を最大にするため、または潜在スプライス部位を脱富化させるため（例えば、正しくないスプライシングを減少させるかまたは回避し、正しい結合部形成を促進するため）に、Ｎ末端コード領域１１４および／またはＣ末端コード領域１６４をネイティブなコード配列と比べてコドン最適化する。一部の実施例では、Ｎ末端コード領域１１４および／またはＣ末端コード領域１６４の一部をネイティブなコード配列と比べてコドン最適化する、例えば、各結合部（例えば、１１４の３’末端、および１６４の５’末端）に隣接する約２００ｎｔをコドン最適化するかまたはエクソンスプライスエンハンサー部位（ＥＳＥ）（ＳＲタンパク質に結合する）を含有するように変更することができる。例えば、コード配列は、本明細書に開示される系が導入される細胞または生物体において見いだされないものであり得る（例えば、マウス細胞または対象への導入の場合、ヒトコード配列）。

一部の実施例では、Ｎ末端コード領域１１４および／またはＣ末端コード領域１６４は、天然のまたは合成のいずれかの性質であるイントロンを含み、スプライスドナー部位とアクセプター部位の両方を含有する。例えば、発現させるコード配列の内部に包埋されたイントロンを配列１１６の上流（例えば、約２００ｎｔ上流）、Ｎ末端コード領域１１４の内部に含めることもでき、発現させるコード配列の内部に包埋されたイントロンを配列１６２の下流（例えば、約２００ｎｔ下流）およびＣ末端コード領域１６４の内部を含めることもでき、あるいはその両方である。そのようなイントロンを含めることを使用して、トランス－スプライシングイントロンドナーおよびアクセプターへのスプライシング機構の付着を刺激することができる。一部の実施例では、そのような（刺激性）イントロンは、１１０および１５０を発現させる宿主に由来するものであり得る。一部の実施例では、そのような（刺激性）イントロンは、他の生物体に由来するもの、またはウイルス起源、または合成起源のものであり得る。

一部の実施例では、分子１５０を安定化するための配列を含めること（例えば、図６Ａの１５０の３’非翻訳領域内の１６４と１６６の間に配置する）により、組み換えられた産物の発現効率を少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７５％、例えば、２５～９５％、２５～７５％、２５～６０％、２５～５０％、４０～９５％、４０～６０％、または５０～６０％上昇させることができる。一部の実施例では、組み換えられた産物の発現効率を増強するための安定化エレメントとしてウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）またはその短縮型（例えば、ＷＰＲＥ３）を３’－ＵＴＲ内に含める。一部の実施例では、ＷＰＲＥ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０４５１４のｎｔ１０９３～１６８４またはＷＰＲＥ３の２４７ｂｐの配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の配列同一性を有する。

図６Ｇに示されている通り、一部の実施例では、核酸編集タンパク質を発現させるために使用される系またはＤＮＡは、１つまたは複数のｇＲＮＡコード配列１４０、１４１、１７１、１７２をさらに含み得る。各ｇＲＮＡは、標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の部分（一部の実施例では、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも１６ｎｔ、少なくとも１７ｎｔ、少なくとも１８ｎｔ、少なくとも１９ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２５ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、少なくとも３５ｎｔ、少なくとも４０ｎｔ、例えば、１５～５０ｎｔ、１５～４０ｎｔ、１５～３０ｎｔ、１５～２５ｎｔ、２８～３２ｎｔ、２５～３５ｎｔ、１７～２４ｎｔ、または１７～２０ｎｔ、例えば、約２０ｎｔである）、および、核酸編集タンパク質に結合する第２の部分（一部の実施例では、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、少なくとも４０ｎｔ、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも６０ｎｔ、少なくとも７０ｎｔ、少なくとも７５ｎｔ、少なくとも８０ｎｔ、少なくとも９０ｎｔ、または少なくとも１００ｎｔ、例えば、２０～２００ｎｔ、２５～１５０ｎｔ、３０～１００ｎｔ、１５～３０ｎｔ、３０～７５ｎｔ、または７５～１００ｎｔである）を含む。一部の実施例では、標的核酸分子と特異的にハイブリダイズするｇＲＮＡの部分のＧＣ含量は約４０～８０％である。一部の実施例では、１つのｇＲＮＡコード配列１４０、１４１、１７１、および１７２は、少なくとも約６０ｎｔ、少なくとも約７５ｎｔ、少なくとも約８０ｎｔ、少なくとも約９０ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約１１０ｎｔ、または少なくとも約１２０ｎｔ、例えば、６０～３００ｎｔ、６０～２００ｎｔ、８０～２００ｎｔ、９０～２００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、または１００～１２０ｎｔである。各ｇＲＮＡ１４０、１４１、１７１、１７２の発現は、それぞれ、ｇＲＮＡに作動可能に連結したプロモーター１４２、１４３、１７３、１７４によって駆動することができる。一実施例では、各プロモーター１４２、１４３、１７３、１７４は同じである。しかし、各ガイド核酸分子１４０、１４１、１７１、１７２に対するプロモーターは異なってもよい。一部の実施例では、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えば、ヒトまたはマウスＵ６またはＨ１プロモーターである。発現されると、得られたｇＲＮＡは、発現された核酸エディターと複合体を形成し、それにより、ｇＲＮＡがハイブリダイズする核酸分子の編集が可能になる。したがって、一部の実施例では、系またはＲＮＡ組成物は図６Ｃに示されている通りであり、Ｎ末端コード配列１１４とＣ末端コード配列１６４の結合を示しており、ここで、系またはＲＮＡは、１つまたは複数の追加のＲＮＡ分子、すなわち、１つまたは複数の（on or more）ｇＲＮＡ分子（各ｇＲＮＡ１４０、１４１、１７１、１７２から発現される）を含み得る。一部の実施例では、図６Ｃの系またはＲＮＡ組成物は、互いとハイブリダイズして示されている（shown hybridized to one another）２つのＲＮＡ分子を含み、また（ａ）第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第１のｇＲＮＡを含む第３のＲＮＡ分子であって、少なくとも１つの第１のｇＲＮＡが、核酸編集タンパク質を第１の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第３のＲＮＡ分子；（ｂ）（ｉ）核酸編集タンパク質を第１の核酸分子上の同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第２のｇＲＮＡ、または（ｉ）核酸編集タンパク質を第２の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第２のｇＲＮＡ、を含む第４のＲＮＡ分子；（ｃ）（ｉ）核酸編集タンパク質を第１の核酸分子上の第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、（ｉｉ）核酸編集タンパク質を第２の核酸分子上の第２のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、または（ｉｉｉ）核酸編集タンパク質を第３の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第３の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、を含む第５のＲＮＡ分子；ならびに（ｄ）（ｉ）核酸編集タンパク質を第１の核酸分子上の第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、および第３のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、（ｉｉ）核酸編集タンパク質を第２の核酸分子上の第２のｇＲＮＡおよび第３のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）核酸編集タンパク質を第３の標的核酸分子上の第３のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第３の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、または（ｉｖ）核酸編集タンパク質を第４の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第４の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、を含む第６のＲＮＡ分子のうちの１つまたは複数をさらに含む。

１つまたは複数のｇＲＮＡコード配列１４０、１４１、１７１、１７２は図６Ｇでは各分子１１０、１５０の５’末端および３’末端付近に示されているが、ｇＲＮＡコード配列１４０、１４１、１７１、１７２は、各分子１１０、１５０内の他の箇所に位置していてもよい。さらに、プロモーター－ｇＲＮＡコード配列は、Ｎ末端およびＣ末端コード配列１１４、１６４の発現の方向に対して順向きであっても逆向きであってもよい。したがって、一部の実施例では、分子１１０は（ａ）Ｎ末端コード配列１１４の上流の１つもしくは複数のプロモーター／ｇＲＮＡコード配列（例えば、１４２／１４０）（ｂ）Ｎ末端コード配列１１４の下流の１つもしくは複数のプロモーター／ｇＲＮＡコード配列（例えば、１４３／１４１）、または（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方を含み、一部の実施例では、分子１４０は（ｄ）Ｃ末端コード配列１６４の上流の１つもしくは複数のプロモーター／ｇＲＮＡコード配列（例えば、１７３／１７１）（ｅ）Ｃ末端コード配列１６４の下流の１つもしくは複数のプロモーター／ｇＲＮＡコード配列（例えば、１７４／１７２）、または（ｄ）と（ｅ）の両方を含む。

図６Ｇは、４つのｇＲＮＡ１４０、１４１、１７１、１７２の存在を例証する。しかし、系またはＤＮＡは、４つよりも少ないまたは４つよりも多くのｇＲＮＡを含んでもよい。一部の実施例では、系、ＤＮＡ、またはＲＮＡは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、または少なくとも５００のｇＲＮＡ配列またはコード配列を含む。系、ＤＮＡまたはＲＮＡ組成物のｇＲＮＡは（１）同じ核酸分子（例えば、遺伝子）および標的核酸の同じ標的編集部位を標的とすることができる；（２）同じ核酸分子（例えば、遺伝子）および標的核酸の異なる標的編集部位を標的とすることができる；（３）異なる核酸分子（例えば、遺伝子）を標的とすることができる；または（４）これらの任意の組合せであり得る。一部の実施例では、ｇＲＮＡコード配列１４０、１４１、１７１、１７２のうちの１つまたは複数は、２つまたはそれよりも多くのｇＲＮＡを含み、より多量のｇＲＮＡの発現を可能にするカセットである。一部の実施例では、カセットは、少なくとも２のｇＲＮＡ、少なくとも３のｇＲＮＡ、少なくとも４のｇＲＮＡ、少なくとも５のｇＲＮＡ、少なくとも１０のｇＲＮＡ、少なくとも２０のｇＲＮＡ、少なくとも５０のｇＲＮＡ、少なくとも１００のｇＲＮＡ、または少なくとも５００のｇＲＮＡをコードし、ここで、カセット内の各ｇＲＮＡコード配列の配列は同じであっても異なっていてもよい。

図６Ｇは、４つのｇＲＮＡコード配列１４０、１４１、１７１、１７２を分子１１０、１５０の一部として例証する。しかし、一実施例では、１つまたは複数のｇＲＮＡコード配列１４０、１４１、１７１、１７２は、分子１１０、１５０の一部ではなく、その代わりに、１つまたは複数の別々のＤＮＡ合成分子、例えば、１つまたは複数の他のベクターから発現される。したがって、一部の系およびＤＮＡ実施形態では、１つまたは複数のｇＲＮＡをコードする追加の合成ＤＮＡ分子が提供される（例えば、分子１１０、１５０に加えて）。一実施例では、系またはＤＮＡは、プロモーターに作動可能に連結した第１のｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの追加の合成ＤＮＡ、例えば、プロモーターに作動可能に連結した１つまたは複数のｇＲＮＡをコードする合成ＤＮＡをさらに含む。

図６Ｇは、各分子１１０、１５０上の５’末端および３’末端のパルボウイルス末端逆位反復配列（ＩＴＲ）１７６、１７７、１７８、１７９の存在を例証する。パルボウイルスＩＴＲは、複製開始点（original of replication）を含み、ＡＡＶの複製を補助するために使用される。そのようなＩＴＲをＡＡＶなどのパルボウイルスパッケージングプラスミドと共に使用することができる。しかし、配列１７６、１７７、１７８、１７９は必要に応じたものである。一実施例では、パルボウイルスＩＴＲはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲである。

図６Ｃに示されている通り、分子１１０の第１の二量体形成ドメイン１２２と分子１５０の第２の二量体形成ドメイン１５４の相互作用およびハイブリダイゼーション（塩基対合）により、スプライソソーム成分によるＮ末端コード配列１１４およびＣ末端コード配列１６４の組換えが可能になる。具体的には、Ｎ末端タンパク質コード配列１１４の３’末端がＣ末端タンパク質配列１６４の５’末端と２つの部分の間のシームレス結合部として融合する。図６Ｇに例示されているものなどの、系またはＤＮＡ組成物がｇＲＮＡコード配列を含む実施例では、同じ相互作用およびハイブリダイゼーションが起こって、Ｎ末端コード配列１１４およびＣ末端コード配列１６４が組み換えられ、機能的な核酸編集タンパク質の発現が可能になる。１４０、１４１、１７１、および１７２から発現されるｇＲＮＡ（分子１１０、１５０の一部としてであるか、１つまたは複数の異なるＤＮＡ分子から発現されるかにかかわらず）は、発現が起こった細胞内に存在し、発現された核酸編集タンパク質と複合体を形成して（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｇＲＮＡのＤＲ配列との相互作用によって）、標的核酸分子の核酸編集を可能にする。

図６Ｄおよび６Ｈは、核酸編集タンパク質が３つの部分、Ｎ末端部分、中間部分、およびＣ末端部分（各部分は同様のサイズであっても異なるサイズであってもよい）に分けられる系の概略図を示す。したがって、核酸編集タンパク質を任意の数の所望のセグメントまたは部分に分けることができ、分子の妥当な数を本明細書に提示される情報を使用して設計することができることが当業者には理解されよう。そのような実施例では、系は、少なくとも３つの合成核酸分子１１０、２００、および１５０を含み、ここで、分子１１０はタンパク質のＮ末端部分をコードする分子１１４を含み、分子２００はタンパク質の中間部分をコードする分子２１６を含み、分子１５０はタンパク質のＣ末端部分をコードする分子１６４を含む。各核酸分子１１０、２００、１５０はＤＮＡで構成され得、翻訳後は、プロモーター１１２、２０２、１５２が存在しないＲＮＡであり得る。一部の実施例では、１１０、２００、１５０（プロモーター１１２、２０２、１５２を有するまたは有さない）はそれぞれ、少なくとも約１００ヌクレオチド／リボヌクレオチド（ｎｔ）の長さ、例えば、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、少なくとも１０００ｎｔ、少なくとも２０００ｎｔ、少なくとも３０００ｎｔ、少なくとも４０００ｎｔ、少なくとも５０００ｎｔ、少なくとも６０００ｎｔ、少なくとも７０００ｎｔ、または少なくとも８０００ｎｔ、例えば、２００～１０，０００ｎｔ、２００～８０００ｎｔ、５００～５０００ｎｔ、または２００～１０００ｎｔである。分子１１０、１５０、２００（プロモーター１１２、２０２、１５２を有するまたは有さない）は、天然および／または非天然ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得る。２つ（またはそれよりも多く）の直交性の二量体形成ドメインを使用することに加えて、２つのイントロンのうちの一方はＵ２型イントロンであり得、第２のイントロンはＵ１２型イントロンであり得る。Ｕ２依存性イントロンおよびＵ１２依存性イントロンのスプライスドナーおよびアクセプターは、この２つの型のイントロン間でコンセンサス認識配列が異なるので、最小の交差反応性を示す。どちらの戦略（すなわち、直交性の二量体形成ドメイン、およびＵ２型イントロン対Ｕ１２型イントロン）によっても、３つの断片の正しい順序での組換えが促進される（例えば、第１の断片が最後の断片と直接結合することが回避され、および中間断片がそれ自体で環状化することが回避される）。

図６Ｄおよび６Ｈの分子１１０は、図１Ａおよび６Ｇに関して上に開示されていると同じ特色、すなわち、ＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結したプロモーター１１２を含み、ＲＮＡ分子は、５’から３’に：標的タンパク質コード配列の３’末端にスプライスジャンクションを含む、標的タンパク質のＮ末端部分のコード配列１１４、ＳＤ１１６、必要に応じたＤＩＳＥ１１８、必要に応じたＩＳＥ１２０、二量体形成ドメイン１２２、および必要に応じたポリアデニル化配列１２４を含むが、第１の二量体形成ドメイン１２２は分子２００の第３の二量体形成ドメイン２０４に対する逆相補性を有する。図６Ｆに示されている通り、分子１１０がＲＮＡである、例えば、ＤＮＡのＲＮＡへの発現後の実施形態では、分子１１０は、プロモーター１１２を含まず、１１４は、標的タンパク質のＮ末端部分のコード配列によってコードされるＲＮＡである。分子１１０（プロモーター１１２を有するまたは有さない）は、天然および／または非天然ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得る。

図６Ｄおよび６Ｈの分子１５０は、図１Ａおよび６Ｇに関して上に開示されているものと同じ特色、すなわち、ＲＮＡ分子をコードする配列と作動可能に連結したプロモーター１５２を含み、ＲＮＡ分子は、５’から３’に：第２の二量体形成ドメイン１５４、必要に応じたＩＳＥ１５６、分岐点配列１５８、ポリピリミジントラクト１６０、スプライスアクセプター（ＳＡ）１６２；および標的タンパク質コード配列の５’末端にスプライスジャンクションを含む、標的タンパク質のＣ末端部分のコード配列１６４、および必要に応じてポリアデニル化配列１６６を含む。第２の二量体形成ドメイン１５４は分子２００の第４の二量体形成ドメイン２２６に対する逆相補性を有する。分子１５０（プロモーター１５２を有するまたは有さない）は、天然および／または非天然ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得る。

分子２００によりそれぞれ分子１１０および分子１５０の二量体形成ドメイン１２２、１５４に対して逆相補性を有する二量体形成ドメインが提供されることによってＮ末端コード領域１１４とＣ末端コード領域１６４の結合が可能になる。分子２００は、２つのイントロン配列２３０、２４０を含め、分子１１０および分子１５０の両方の特色を含む。具体的には、分子２００がＤＮＡである実施形態では、分子２２０は、ＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結したプロモーター２１０（プロモーター１１２および／または１５２と同じものであっても異なるものであってもよい）を含み、ＲＮＡ分子は、５’から３’に：第３の二量体形成ドメイン２０４（図６Ｄの分子１１０の第１の二量体形成ドメイン１２２に対して逆相補物である）、必要に応じたＩＳＥ２０６、分岐点２０８、ポリピリミジントラクト２１０、ＳＡ２１２、標的タンパク質の中間部分のコード配列２１６であって、標的タンパク質コード配列の５’末端にスプライスジャンクションを含み、標的タンパク質コード配列の３’末端にスプライスジャンクションを含む、標的タンパク質の中間部分のコード配列２１６、ＳＤ２２０、必要に応じたＤＩＳＥ２２２、必要に応じたＩＳＥ２２４、第４の二量体形成ドメイン２２６（図６Ｄの分子１５０の第４の二量体形成ドメイン１５４に対して逆相補物である）、および必要に応じたポリアデニル化配列２２８を含む。一部の実施例では、分子２２０はＤＮＡであり、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、少なくとも１０００ｎｔ、少なくとも２０００ｎｔ、少なくとも３０００ｎｔ、少なくとも４０００ｎｔ、少なくとも５０００ｎｔ、少なくとも６０００ｎｔ、少なくとも７０００ｎｔ、または少なくとも８０００ｎｔ、例えば、２００～１０，０００ｎｔ、２００～８０００ｎｔ、５００～５０００ｎｔ、または２００～１０００ｎｔの長さである。分子２００がＲＮＡである、例えば、ＤＮＡのＲＮＡへの発現後の実施形態では、分子２００はもはやプロモーター２０２を含まず、２１６は標的タンパク質の中間部分のコード配列によってコードされるＲＮＡである。一部の実施例では、分子２００はＲＮＡであり、プロモーター２０２を含まず、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、少なくとも１０００ｎｔ、少なくとも２０００ｎｔ、少なくとも３０００ｎｔ、少なくとも４０００ｎｔ、少なくとも５０００ｎｔ、少なくとも６０００ｎｔ、少なくとも７０００ｎｔ、または少なくとも８０００ｎｔ、例えば、２００～１０，０００ｎｔ、２００～８０００ｎｔ、５００～５０００ｎｔ、または２００～１０００ｎｔの長さである。分子２００（プロモーター２０２を有するまたは有さない）は、天然および／または非天然ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得る。

図６Ｈに示されている通り、一部の実施例では、核酸編集タンパク質を発現させるために使用される系またはＤＮＡは、１つまたは複数のｇＲＮＡコード配列１４０、１４１、１７１、１７２、２３１、２３２をさらに含み得る。各ｇＲＮＡは、標的核酸分子と特異的にハイブリダイズする第１の部分（一部の実施例では、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも１６ｎｔ、少なくとも１７ｎｔ、少なくとも１８ｎｔ、少なくとも１９ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２５ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、少なくとも３５ｎｔ、少なくとも４０ｎｔ、例えば、１５～５０ｎｔ、１５～４０ｎｔ、１５～３０ｎｔ、１５～２５ｎｔ、２８～３２ｎｔ、２５～３５ｎｔ、１７～２４ｎｔ、または１７～２０ｎｔ、例えば、約２０ｎｔである）、および、核酸編集タンパク質に結合する第２の部分（一部の実施例では、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、少なくとも４０ｎｔ、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも６０ｎｔ、少なくとも７０ｎｔ、少なくとも７５ｎｔ、少なくとも８０ｎｔ、少なくとも９０ｎｔ、または少なくとも１００ｎｔ、例えば、２０～２００ｎｔ、２５～１５０ｎｔ、３０～１００ｎｔ、１５～３０ｎｔ、３０～７５ｎｔ、または７５～１００ｎｔである）を含む。一部の実施例では、標的核酸分子と特異的にハイブリダイズするｇＲＮＡの部分のＧＣ含量は約４０～８０％である。一部の実施例では、１つのｇＲＮＡコード配列１４０、１４１、１７１、１７２、２３１、２３２は、少なくとも約６０ｎｔ、少なくとも約７５ｎｔ、少なくとも約８０ｎｔ、少なくとも約９０ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約１１０ｎｔ、または少なくとも約１２０ｎｔ、例えば、６０～３００ｎｔ、６０～２００ｎｔ、８０～２００ｎｔ、９０～２００ｎｔ、１００～１５０ｎｔ、または１００～１２０ｎｔである。各ｇＲＮＡ１４０、１４１、１７１、１７２、２３１、２３２の発現は、それぞれ、ｇＲＮＡに作動可能に連結したプロモーター１４２、１４３、１７３、１７４、２３３、２３４によって駆動することができる。一実施例では、各プロモーター１４２、１４３、１７３、１７４、２３３、２３４は同じである。しかし、各ガイド核酸分子１４０、１４１、１７１、１７２、２３３、２３４に対するプロモーターは異なってもよい。一部の実施例では、プロモーター１４２、１４３、１７３、１７４、２３３、２３４は、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えば、ヒトまたはマウスＵ６またはＨ１プロモーターである。発現されると、得られたｇＲＮＡは、発現された核酸エディターと複合体を形成し、それにより、ｇＲＮＡがハイブリダイズする核酸分子の編集が可能になる。したがって、一部の実施例では、系またはＲＮＡ組成物は、Ｎ末端コード配列１１４、中間コード配列２１６、およびＣ末端コード配列１６４の結合を示す図６Ｅに示されている通りであり、ここで、系またはＲＮＡは、１つまたは複数の追加のＲＮＡ分子、すなわち、１つまたは複数のｇＲＮＡ分子（各ｇＲＮＡ１４０、１４１、１７１、１７２、２３１、２３２から発現される）を含み得る。一部の実施例では、図６Ｅの系またはＲＮＡ組成物は、互いとハイブリダイズして示されている３つのＲＮＡ分子を含み、（ａ）第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第１のｇＲＮＡを含む第４のＲＮＡ分子であって、少なくとも１つの第１のｇＲＮＡが、核酸編集タンパク質を第１の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第４のＲＮＡ分子；（ｂ）（ｉ）核酸編集タンパク質を第１の核酸分子上の同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第２のｇＲＮＡ、または（ｉ）核酸編集タンパク質を第２の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第２のｇＲＮＡ、を含む第５のＲＮＡ分子；（ｃ）（ｉ）核酸編集タンパク質を第１の核酸分子上の第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、（ｉｉ）核酸編集タンパク質を第２の核酸分子上の第２のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、または（ｉｉｉ）核酸編集タンパク質を第３の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第３の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、を含む第６のＲＮＡ分子；（ｄ）（ｉ）核酸編集タンパク質を第１の核酸分子上の第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、および第３のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ（ｉｉ）核酸編集タンパク質を第２の核酸分子上の第２のｇＲＮＡおよび第３のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）核酸編集タンパク質を第３の標的核酸分子上の第３のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、第３の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、または（ｉｖ）核酸編集タンパク質を第４の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第４の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、を含む第７のＲＮＡ分子；（ｅ）少なくとも１つの第５のｇＲＮＡを含む第７のＲＮＡ分子、ならびに（ｆ）少なくとも１つの第６のｇＲＮＡを含む第８のＲＮＡ分子、のうちの１つまたは複数をさらに含む。

１つまたは複数のｇＲＮＡコード配列１４０、１４１、１７１、１７２、２３１、２３２が図６Ｈでは各分子１１０、１５０の５’末端および３’末端付近に示されているが、ｇＲＮＡコード配列１４０、１４１、１７１、１７２は各分子１１０、１５０内の他の箇所に位置していてもよい。さらに、プロモーター－ｇＲＮＡコード配列は、Ｎ末端コード配列、中間コード配列、およびＣ末端コード配列１１４、２１６、１６４の発現の方向に対して順向きであっても逆向きであってもよい。さらに、プロモーター－ｇＲＮＡコード配列は、Ｎ末端コード配列、中間コード配列、およびＣ末端コード配列１１４、２１６、１６４の発現の方向に対して順向きであっても逆向きであってもよい。したがって、一部の実施例では、分子１１０は、（ａ）Ｎ末端コード配列１１４の上流の１つもしくは複数のプロモーター／ｇＲＮＡコード配列（例えば、１４２／１４０）（ｂ）Ｎ末端コード配列１１４の下流の１つもしくは複数のプロモーター／ｇＲＮＡコード配列（例えば、１４３／１４１）、または（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方を含み、一部の実施例では、分子１４０は、（ｄ）Ｃ末端コード配列１６４の上流の１つもしくは複数のプロモーター／ｇＲＮＡコード配列（例えば、１７３／１７１）（ｅ）Ｃ末端コード配列１６４の下流の１つもしくは複数のプロモーター／ｇＲＮＡコード配列（例えば、１７４／１７２）、または（ｆ）（ｄ）と（ｅ）の両方を含み、一部の実施例では、分子２００は、（ｇ）中間コード配列２１６の上流の１つもしくは複数のプロモーター／ｇＲＮＡコード配列（例えば、２３３／２３１）、（ｈ）中間コード配列２１６の下流の１つもしくは複数のプロモーター／ｇＲＮＡコード配列（例えば、２３４／２３２）、または（ｉ）（ｇ）と（ｈ）の両方を含む。

図６Ｈは、６つのｇＲＮＡ１４０、１４１、１７１、１７２、２３１、２３２の存在を例証する。しかし、系またはＤＮＡは、６つよりも少ないまた６つよりも多くのｇＲＮＡを含んでもよい。一部の実施例では、系、ＤＮＡ、またはＲＮＡは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、または少なくとも５００のｇＲＮＡ配列またはコード配列を含む。系、ＤＮＡまたはＲＮＡ組成物のｇＲＮＡは、（１）同じ核酸分子（例えば、遺伝子）および標的核酸の同じ標的編集部位を標的とするもの；（２）同じ核酸分子（例えば、遺伝子）および標的核酸の異なる標的編集部位を標的とする；（３）異なる核酸分子（例えば、遺伝子）を標的とする；または（４）これらの任意の組合せであり得る。一部の実施例では、ｇＲＮＡコード配列１４０、１４１、１７１、１７２、２３１、２３２のうちの１つまたは複数は、２つまたはそれよりも多くのｇＲＮＡを含み、より多量のｇＲＮＡの発現を可能にするカセットである。一部の実施例では、カセットは、少なくとも２のｇＲＮＡ、少なくとも３のｇＲＮＡ、少なくとも４のｇＲＮＡ、少なくとも５のｇＲＮＡ、少なくとも１０のｇＲＮＡ、少なくとも２０のｇＲＮＡ、少なくとも５０のｇＲＮＡ、少なくとも１００のｇＲＮＡ、または少なくとも５００のｇＲＮＡをコードし、ここで、カセット内の各ｇＲＮＡコード配列の配列は同じまたは異なり得る。

図６Ｈは、４つのｇＲＮＡコード配列１４０、１４１、１７１、１７２、２３１、２３２を分子１１０、１５０、２００の一部として例証する。しかし、一実施例では、１つまたは複数のｇＲＮＡコード配列１４０、１４１、１７１、１７２、２３１、２３２は、分子１１０、１５０、２００の一部ではなく、その代わりに、１つまたは複数の別々のＤＮＡ合成分子、例えば、１つまたは複数の他のベクターから発現される。したがって、一部の系およびＤＮＡ実施形態では、１つまたは複数のｇＲＮＡをコードする追加の合成ＤＮＡ分子が提供される（例えば、分子１１０、１５０、２００に加えて）。一実施例では、系またはＤＮＡは、プロモーターに作動可能に連結した第１のｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの追加の合成ＤＮＡ、例えば、プロモーターに作動可能に連結した１つまたは複数のｇＲＮＡをコードする合成ＤＮＡをさらに含む。

図６Ｈは、各分子１１０、２００、１５０上の５’末端および３’末端のパルボウイルス末端逆位反復配列（ＩＴＲ）１７６、１７７、１７８、１７９、２３５、２３６の存在を例証する。そのようなＩＴＲをＡＡＶなどのパルボウイルスパッケージングプラスミドと共に使用することができる。しかし、配列１７６、１７７、１７８、１７９、２３５、２３６は必要に応じて存在する。

図６Ｅに示されている通り、分子１１０の第１の二量体形成ドメイン１２２と分子２００の第３の二量体形成ドメイン２０４の相互作用およびハイブリダイゼーション（塩基対合）、および分子２００の第４の二量体形成ドメイン２２６と分子１５０の第２の二量体形成ドメイン１５４の相互作用およびハイブリダイゼーション（塩基対合）により、スプライソソーム成分によるＮ末端コード配列１１４、中間コード配列２１６、およびＣ末端コード配列１６４の組換えが可能になる。具体的には、３つの部分間のシームレス結合部として、Ｎ末端タンパク質コード配列１１４の３’末端が中間タンパク質配列２１６の５’末端と融合し、中間タンパク質配列２１６の３’末端がＣ末端タンパク質配列１６４の５’末端と融合する。図６Ｈに例示されているものなどの、系またはＤＮＡ組成物がｇＲＮＡコード配列を含む実施例では、同じ相互作用およびハイブリダイゼーションが起こって、Ｎ末端コード配列１１４、中間コード配列２１６、およびＣ末端コード配列１６４が組み換えられ、それにより、機能的な核酸編集タンパク質の発現が可能になる。１４０、１４１、１７１、１７２、２３１、２３２から発現されるｇＲＮＡ（分子１１０、１５０、２００の一部としてか、１つまたは複数の異なるＤＮＡ分子から発現されるかにかかわらず）は、発現が起こった細胞内に存在し、発現された核酸編集タンパク質と複合体を形成して（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｇＲＮＡのＤＲ配列との相互作用によって）、標的核酸分子の核酸編集を可能にする。

代替二量体形成ドメインが図７Ａ～７Ｂおよび９Ａに示されている。すなわち、互いにハイブリダイズする二量体形成ドメイン（例えば、１１２～２０４、２２６～１５４、図６Ｃ、６Ｅ）の使用に対する代替として、一実施例では、アプタマー配列を使用する。図７Ａに示されている通り、合成核酸分子５００、６００の両方において、アプタマー配列５１２、６０２を二量体形成ドメインの代わりに使用し、アプタマーがそれらと標的（例えば、アデノシン、ドーパミン、またはカフェイン）との相互作用を介して一体となる。そのような実施例では、各分子５００、６００のアプタマー配列５１２、６０２が同じ配列であり得る、またはさらには異なる配列であり得る。図７Ａの分子５００は、図６Ａおよび６Ｇの分子１１０に関して上に開示されているものと同じ特色を含み、ＤＮＡである場合には、ＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結したプロモーターを含み、ＲＮＡ分子は、５’から３’に：核酸編集タンパク質コード配列の３’末端にスプライスジャンクションを含む、核酸編集タンパク質のＮ末端部分のコード配列５０２、ＳＤ５０６、必要に応じたＤＩＳＥ５０８、必要に応じたＩＳＥ５１０、第１の二量体形成ドメインの代わりに第１のアプタマー５１２、および必要に応じたポリアデニル化配列を含む。分子５００がＲＮＡである実施形態では、例えば、ＤＮＡ分子から転写された場合、分子５００はプロモーターを含まない（例えば図７Ａに示されている通り）。同様に、図７Ａの分子６００は、図６Ａおよび６Ｇの分子１５０に関して上に開示されているものと同じ特色を含み、ＤＮＡである場合には、ＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結したプロモーターを含み、ＲＮＡ分子は、５’から３’に：第２の二量体形成ドメイン１５４の代わりにアプタマー６０２、必要に応じたＩＳＥ６０４、分岐点６０６、ポリピリミジントラクト６０８、ＳＡ６１０、５’末端にスプライスジャンクションを有する、標的タンパク質のＣ末端部分６１４をコードするＤＮＡ、および必要に応じたポリアデニル化配列６１６を含む。分子６００がＲＮＡである実施形態では、例えば、ＤＮＡ分子から転写された場合、分子５００はプロモーターを含まない（例えば図７Ａに示されている通り）。２つのアプタマー５１２、６０２の互いとのまたは分子７００との相互作用により、スプライソソーム成分によるＮ末端コード配列５０２とＣ末端コード配列６１４の組換えが可能になる。具体的には、Ｎ末端タンパク質コード配列５０２の３’末端がＣ末端タンパク質配列６１４の５’末端と２つの部分の間のシームレス結合部として融合する。分子５００および６００は、天然および／または非天然ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得る。

一部の実施例では、アプタマー配列５１２、６０２は、同じ標的７００に認識する（例えば、特異的に結合する）（図７Ａ）、またはさらには異なる標的を認識し得る（その場合、カフェイン／ドーパミンハイブリッド分子などの、各アプタマーによって特異的に認識される各分子、またはアプタマーによって認識される分子の一部を含む合成分子も本明細書に提示される系と共に投与する）。アプタマーによって認識される例示的な標的としては、細胞タンパク質、小分子、外因性タンパク質、またはＲＮＡ分子が挙げられる。

図７Ｂは、図７Ａと同様の例を示す。二量体形成ドメイン（図７Ａの５１２、６０２）はＲＮＡ分子を認識する。図７Ｂに示されている例では、各ドメインは、標的細胞（核酸編集タンパク質の発現が望まれる細胞）においてのみ発現されるｍＲＮＡ分子の異なる部分、例えば、がん特異的転写物を認識する。そのような実施例では、ＲＮＡで構成されるコード配列（図７Ａの５０２、６１４）は、二量体形成ドメインによって認識される特定のＲＮＡ分子の存在下でのみ組み換えられる。ここで、核酸編集タンパク質はがん細胞においてのみ発現され、正常な細胞では発現されない。そのような系により、核酸編集タンパク質の発現を制御することが可能になる。

図７Ｃは、例示的な「オフスイッチ」例を提示する。ここで、結合／ハイブリダイゼーションについて競合する抗結合ドメインオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）１０００（１つが８１２の逆相補物であり、１つが９１２の逆相補物である２つの異なる抗結合ドメインオリゴヌクレオチド１０００であり得る）を提供することにより、合成核酸分子８００、９００の二量体形成ドメイン８１２、９０２（互いに逆相補物である）のハイブリダイゼーション／結合を低減することができる。したがって、抗結合ドメインオリゴヌクレオチド１０００は、それぞれＮ末端およびＣ末端コード部分８０２および９１４によってコードされるタンパク質の再構成に対する「オフスイッチ」として作用し得る。図７Ｃの分子８００は、ＲＮＡ分子（したがって、プロモーターを欠く）である図６Ａおよび６Ｇの分子１１０に関して上に開示されているものと同じ特色を含み、ＲＮＡ分子は、５’から３’に：核酸編集タンパク質コード配列の３’末端にスプライスジャンクションを含む、核酸編集タンパク質のＮ末端部分のコード配列８０２、ＳＤ８０６、必要に応じたＤＩＳＥ８０８、必要に応じたＩＳＥ８１０、二量体形成ドメイン８１２、および必要に応じたポリアデニル化配列８１４を含む。同様に、図７Ｃの分子９００は、ＲＮＡ分子（したがって、プロモーターを欠く）である図６Ａおよび６Ｇの分子１５０に関して上に開示されているものと同じ特色を含み、ＲＮＡ分子は、５’から３’に：抗二量体形成ドメイン９０２、必要に応じたＩＳＥ９０４、分岐点９０６、ポリピリミジントラクト９０８、ＳＡ９１０、核酸編集タンパク質のＣ末端部分をコードするＲＮＡ９１４、および必要に応じたポリアデニル化配列９１６を含む。２つの二量体形成ドメイン８１２、９０２は、抗結合ドメインオリゴヌクレオチド１０００の存在下では互いに相互作用／ハイブリダイズすることができず、したがって、Ｎ末端コード配列８０２とＣ末端コード配列９１４の組換えが妨げられるかまたは低減する。分子８００および９００は、天然および／または非天然ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得る。

図９Ａは、二量体形成のために逆相補配列ハイブリダイゼーションの代わりにキッシングループ相互作用を使用する例示的な二量体形成ドメインを提示する。キッシングループ相互作用は、２つのＲＮＡヘアピンのループ内の塩基が２つのＲＮＡ分子間に相互作用する対を形成した場合に形成される。ｎ－ｙｆｐと標識された左側の分子は、スプライスドナー部位、下流イントロンスプライシングエンハンサーエレメント、および２つのイントロンスプライシングエンハンサーエレメントを含有する合成イントロンと連結した、ｙｆｐのＮ末端断片をコードするＲＮＡ分子を表す。この分子の二量体形成ドメインは３つのＲＮＡヘアピンループを含み、それらはそれぞれがステム（ＲＮＡがそれ自体とハイブリダイズする）およびループ（ＲＮＡがそれ自体とハイブリダイズしない）で構成される。この例では、二量体形成ドメインは、３つのステムおよびループエレメント（ヘアピンループとも称される）を含有し、三峰性キッシングループ二量体形成ドメインと称される。ｃ－ｙｆｐと標識された右側の分子は、ｙｆｐのＣ末端の部分をコードするＲＮＡ分子を表す。この分子は、５’から３’まで、３つのヘアピンループのセットを含有する三峰性キッシングループ二量体形成ドメインで構成される。ループ部分は、相補的なｎ－ｙｆｐ分子上の対応するループとキッシングループ相互作用を形成し得る。三峰性キッシングループ二量体形成ドメインの後には、３つのイントロンスプライシングエンハンサー配列、分岐点配列、ポリピリミジントラクト、およびスプライスアクセプター部位を含有する合成イントロン配列が続く。合成イントロン配列の後にＣ末端ｙｆｐコード配列が続き、その後、ポリアデニル化シグナルを含有する３’非翻訳領域が続く。図の上部にキッシングループ相互作用の代表的な三次元レンダリングが示されている。このレンダリングは、ねじれた形態のヘアピンループがどのようにループ残基を外側に露出させ、キッシングループ相互作用に利用可能にするかを例示する。

２つの分子が結び付くと、スプライソソームによりトランス－スプライシング反応が媒介され、その結果、Ｎ末端ｙｐｆコード配列とＣ末端ｙｐｆコード配列が結合され、次いで、それにより全長蛍光タンパク質の発現が可能になる。

図６Ａ～６Ｃ、６Ｆ、６Ｇ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃおよび９Ａには系に２つの合成核酸分子を使用する（すなわち、核酸編集タンパク質コード配列を２つの合成核酸分子に分割する）実施形態が示されているが、そのような実施形態を、本明細書における教示を使用して２つよりも多くの合成核酸分子、例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の合成核酸分子を用いて同様に使用することができることが当業者には理解されよう。

一部の実施例では、系は、アセンブルされていない／組み換えられていない断片の発現を抑制する核酸分子を含む。そのような実施例では、全長コード配列の２つまたはそれよりも多くの部分（例えば、それぞれ図６Ａおよび６Ｇの１１０の１１４、１５０の１６４）が組み換えられていない場合、核酸分子により、組み換えられなかった全長コード配列の各部分の全長核酸編集タンパク質の発現が抑制される。例えば、そのような抑制性核酸分子は、ＲＮＡが核の外に出たらＲＮＡを不安定化すること、翻訳を妨げること、シフトした開始コドンからの翻訳を刺激すること、マイクロＲＮＡ標的部位を含有すること、または、翻訳されるとタンパク質活性を抑制するかもしくはタンパク質に分解のためのフラグを立てるタンパク質デグロンもしくは不安定化ドメインを含有することができる。

一実施例では、組み換えられていないＲＮＡ分子の不安定化は、自己切断性ＲＮＡ配列（例えば、ハンマーヘッド型リボザイムまたはＨＤＶリボザイム）を合成イントロンへと、例えば、図６Ａ、６Ｆまたは６Ｇのイントロン配列１３０内の任意の位置に含めることによって実現される。一実施例では、ＲＮＡ分子の切断により、ＲＮＡを安定化するポリＡ尾部の喪失がもたらされ、それにより、組み換えられていないタンパク質の図６Ａ、６Ｆまたは６Ｇのオープンリーディングフレーム１１４からの発現が抑制され得る。一実施例では、図６Ａ、６Ｆまたは６Ｇのコード配列１６４の一部または全部を含むオープンリーディングフレームの発現の低減をもたらし得る５’末端ＣＡＰを切断するために、自己切断性ＲＮＡ配列を図６Ａ、６Ｆまたは６Ｇのイントロン配列１７０内の任意の位置に含める。一実施例では、自己切断性ＲＮＡ配列をＣｓｙ４標的部位などのＲＮＡ切断酵素標的部位で置換する。

一部の実施例では、抑制性核酸分子は、図６Ａ、６Ｆまたは６Ｇのオープンリーディングフレーム配列１６４に対して－１、－２、＋１、または＋２ヌクレオチドシフトしたオープンリーディングフレームの翻訳を方向付ける開始コドン（ＡＴＧ）またはコザック増強開始コドン（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧ（配列番号１５４）もしくはＧＣＣＡＣＣＡＴＧもしくはＡＣＣＡＴＧ）を図６Ａ、６Ｆまたは６Ｇのイントロン配列１７０内の任意の位置に含む。一実施例では、このデコイ開始コドン戦略を使用して、抑制されるべき図６Ａ、６Ｆまたは６Ｇの配列１６４のオープンリーディングフレームから離れるように翻訳を方向付けることにより、アセンブルされていない断片の発現を低減または抑制する。

一部の実施例では、抑制性核酸分子は、１つまたは複数のマイクロＲＮＡ標的部位を図６Ａ、６Ｆまたは６Ｇのイントロン配列１３０内の任意の位置、および／または図６Ａまたは６Ｆのイントロン配列１７０内の任意の位置に含む。特定の分子（例えば、図６Ａ、６Ｆまたは６Ｇの１１０または１５０）が核から送り出されると、マイクロＲＮＡ／低分子ヘアピン型ＲＮＡ依存性分解を受け、それにより、核から送り出された結合していないＲＮＡを分解／抑制することにより、意図されたものではない結合していない断片の発現が抑制され得る。一実施例では、そのようなマイクロＲＮＡ標的配列は、図６Ａ、６Ｆまたは６Ｇの分子１１０および１５０が導入される細胞、または組織、または動物において発現されることが分かっているマイクロＲＮＡと相補的なものであり得る。一実施例では、このマイクロＲＮＡ標的配列は、細胞、または組織、または動物に導入される配列と相補的である。一実施例では、そのようなマイクロＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターから低分子ヘアピン型ＲＮＡの形式で発現させることができる。一実施例では、そのようなマイクロＲＮＡをＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターから発現させ、マイクロＲＮＡプロセシングループに包埋させる（例えば、ｍｉｒ３０足場）ことができる。

一部の実施例では、オープンリーディングフレーム（例えば、図６Ａ～６Ｈの１１４）からの組み換えられていないタンパク質産物の不安定化を、図６Ａ、６Ｆまたは６Ｇのイントロン配列１３０における終止コドンの出現を枯渇させ、図６Ａ、６Ｆまたは６Ｇのイントロン配列１３０内の任意の位置に配置され、図６Ａ、６Ｆまたは６Ｇの配列１１４から外側に伸びたオープンリーディングフレームとインフレームである、タンパク質に分解のためのフラグを立てることができるインフレームのタンパク質シグナルをコードするＲＮＡ配列（例えば、デグロン配列）を追加的に含めることによって実現することができる。一実施例では、デグロン配列は、ＰＥＳＴ配列のもの、またはＣＬ１デグロン配列のものであり得る。使用するデグロン配列はプロテアソーム依存性、プロテアソーム非依存性、ユビキチン依存性、またはユビキチン非依存性経路を使用し得る。一実施例では、組み換えられていないタンパク質の不安定化を、同じまたは異なるデグロン配列のいくつかを含めることによって増強する。

一部の実施例では、図６Ａ～６Ｈのいずれかのオープンリーディングフレーム配列１６４からの組み換えられていないタンパク質産物の不安定化は、図６Ａ～６Ｈのいずれかの配列１６４内のオープンリーディングフレームとインフレームの開始コドン（ＡＴＧ）、その後にデグロン配列を図６Ａ～６Ｈのいずれかのイントロン配列１７０の任意の位置に導入することによって実現される。この例では、デグロン配列はＮ末端で組み換えられていないタンパク質断片と結合し、組み換えられていないタンパク質断片は分解のフラグを立てられることによって抑制される。
ＩＶ．例示的な核酸エディター

図６Ａ～６Ｈに示されている通り、２つ（またはそれよりも多く）の核酸分子１１０、２００、１５０を使用する本明細書に開示されるＲＮＡ組換え方法を使用して、核酸編集タンパク質を発現させることができる。図６Ｇおよび６Ｈに示されている通り、一部の実施例では、核酸分子１１０、２００、１５０は、１つまたは複数のｇＲＮＡコード配列（例えば、１４０、１４１、２３１、３２３、１７１、１７２）をさらに含み、これらの発現はプロモーター（例えば、１４２、１４３、３２２、２３４、１７３、１７４）によって駆動することができる。しかし、一部の実施例では、核酸分子１１０、２００、１５０はｇＲＮＡコード配列を含まず、その代わりに、そのようなｇＲＮＡコード配列（およびプロモーター）を１つまたは複数の他の合成ＤＮＡ分子（例えば、１つまたは複数のベクター）で提供することができる。一部の実施例では、本明細書に提示される系、ＤＮＡ組成物、またはＲＮＡ組成物は、２つまたはそれよりも多くのｇＲＮＡ分子またはコード配列を含み、それらは、一部の実施例では、１つまたは複数のカセットの一部であり得る。一部の実施例では、本明細書に提示される系、ＤＮＡ組成物、またはＲＮＡ組成物は、２つまたはそれよりも多くのｇＲＮＡ分子またはコード配列、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡ分子またはコード配列を含み、ここで、各ｇＲＮＡは同じであり得る（例えば、同じｇＲＮＡの複数のコピー）、または異なり得る（例えば、特定の標的それぞれに対するｇＲＮＡ）、またはこれらの組合せ（例えば、複数の標的に対する複数のｇＲＮＡ）であり得る。

核酸配列を編集する能力を有するタンパク質を、遺伝子配列などのＤＮＡまたはＲＮＡ配列を編集するために使用することができる。一部の実施例では、そのようなタンパク質を、（ａ）標的核酸分子から１つまたは複数のヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを欠失させるまたは除去するため、（ｂ）標的核酸分子から１つまたは複数のヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを挿入するため、（ｃ）標的核酸分子内の１つまたは複数のヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを置換するため、または（ａ）（ｂ）および（ｃ）の組合せのために使用する。特定の実施例では、核酸編集タンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼである。一実施例では、核酸編集タンパク質はＣａｓヌクレアーゼである。例示的なＣａｓヌクレアーゼとしては、ＤＮＡ分子（例えば、ゲノム配列）を編集することができるもの、例えば、Ｃａｓ９およびｄＣａｓ９、ならびに、ＲＮＡを編集することができるもの、例えば、Ｃａｓ１３ｄおよびｄＣａｓ１３ｄが挙げられる。他の例示的な核酸編集タンパク質としては、ＴＡＬＥＮＳ、およびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。一部の実施例では、核酸編集タンパク質は、別のペプチドまたはタンパク質を含む融合タンパク質である。一実施例では、核酸エディターコード配列（例えば、１１４、２１６、１６４）は、哺乳動物のまたはヒトの細胞に対してコドン最適化される。

一実施例では、核酸エディターとして、ＤＮＡを編集するためのＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１４ａが挙げられる。一実施例では、核酸エディターは、ＤＮＡを編集するためのＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ、高忠実度Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９－ＨＦ－１）、ｅＳＰＣａｓ９、ＨｙｐａＣａｓ９、ＦｏｋＩと融合したｄＣａｓ９、ｘＣａｓ９、ＳｐＲＹ、またはＳｐＧである。一実施例では、核酸エディターは、触媒として死んだＣａｓ９（dead Cas9）（ｄＣａｓ９）である。一実施例では、核酸エディターは、ＤＮＡを編集するためのこれらのＣａｓヌクレアーゼのいずれかと、少なくとも１つの他のペプチドまたはタンパク質（例えば、シトシン塩基エディター、アデニン塩基エディター、または両方）とを含む融合タンパク質である。一部の実施例では、Ｃａｓヌクレアーゼは融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に存在する。

一実施例では、核酸エディターは、ＲＮＡを編集するためのＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃおよびＣａｓ１３ｄである。一実施例では、核酸エディターは、触媒として死んだＣａｓ１３ａ（ｄＣａｓ１３ａ）、Ｃａｓ１３ｂ（ｄＣａｓ１３ｂ、例えば、ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ）、Ｃａｓ１３ｃ（ｄＣａｓ１３ｃ）またはＣａｓ１３ｄ（ｄＣａｓ１３ｄ）である。一実施例では、核酸エディターは、これらのＤＮＡを編集するためのＣａｓヌクレアーゼのいずれかと、少なくとも１つの他のペプチドまたはタンパク質（例えば、シトシン塩基エディター、アデニン塩基エディター、または両方）とを含む融合タンパク質である。一部の実施例では、Ｃａｓヌクレアーゼは融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に存在する。

一実施例では、核酸エディターは、不活性な／死んだＣａｓ酵素（例えば、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１３）と、プログラム可能なエピゲノム操作のためのエピジェネティック修飾因子、例えば、ｐ３００、ＬＳＤ１、ＭＱ１、およびＴＥＴ１を含む融合タンパク質である。一部の実施例では、Ｃａｓヌクレアーゼは融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に存在する。

したがって、一部の実施例では、核酸エディターを２つ（またはそれよりも多く）の部分に分け、ここで、各部分は、異なる核酸分子１１０、２００、１５０によってコードされる。例えば、タンパク質を２つの区画（例えば、半分または大まかに半分）に分ける場合、核酸エディター１１４のＮ末端部分を核酸分子１１０にコードさせることができ、一方、核酸エディター１６４のＣ末端部分を核酸分子１５０にコードさせることができる。系または組成物がＤＮＡである実施例では、コード配列１１４、１６４の発現を駆動するために１つまたは複数のプロモーター１１２、１５２を含めることができる。系または組成物がＲＮＡである場合、１つまたは複数のプロモーター１１２、２０２、１５２、ｇＲＮＡコード配列１４０、１４１、２３１、２３２、１７１、１７２、ならびにそれらの対応するプロモーター１４２、１４３、２３３、２３４、１７３、１７４、およびＩＴＲ１７６、１７７、２３５、２３６、１７６、１７９は存在しない。一部の実施例では、核酸エディタータンパク質（融合タンパク質の一部であり得る）は、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、少なくとも７００アミノ酸、少なくとも８００アミノ酸、少なくとも９００アミノ酸、少なくとも１０００アミノ酸、少なくとも１１００アミノ酸、少なくとも１２００アミノ酸、または少なくとも１３００アミノ酸である。

一部の実施例では、本明細書に開示される方法によって編集されるＤＮＡまたはＲＮＡは、１つまたは複数の変異、例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または付加を含み、ネイティブな／変異していない配列を含むように編集することができる。一実施例では、細胞、例えばヒト細胞、例えば対象内の細胞における標的ＤＮＡまたはＲＮＡの発現をモジュレートする（すなわち、アップレギュレートするまたはダウンレギュレートする）ために、そのような方法を使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を編集する。一実施例では、複数の標的を同時にまたは同時期に編集する（例えば、少なくとも２つの異なる標的、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の異なる標的を、例えば、複数のｇＲＮＡを使用することによって）。一部の実施例では、複数の標的は、同じ遺伝子内に存在する。他の例では、複数の標的は異なる遺伝子に存在する。標的の例が表１～４に提示されている。
Ａ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９

一部の実施例では、分子１１０、１５０のＮ末端およびＣ末端コード部分１１４、１６４（および３つの分子を使用する場合、２００の中間コード部分２１６）は、遺伝子配列などのＤＮＡ配列を編集するためのＣａｓヌクレアーゼをコードする。一部の実施例では、分子１１０、１５０のＮ末端およびＣ末端コード部分１１４、１６４（および３つの分子を使用する場合、２００の中間コード部分２１６）は、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、配列番号２０８）またはｄＣａｓ９タンパク質（例えば、配列番号２１０）をコードする。そのような実施例では、１１０、１５０を含むＤＮＡ組成物は、１つまたは複数のｇＲＮＡコード配列をさらに含み得る。ｇＲＮＡは、１１４、１６４（または１１４、２１６、１６４）によってコードされる特定のＣａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質に基づいて設計され、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質を標的核酸配列に方向付けるために使用される。ＤＮＡ編集の実施例におけるｇＲＮＡとしては、標的ＤＮＡと相補的な部分（例えば、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも１２ｎｔ、少なくとも１３ｎｔ、少なくとも１４ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも１６ｎｔ、少なくとも１７ｎｔ、少なくとも１８ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、または少なくとも２５ｎｔ、例えば、１４～３０ｎｔ、例えば、１７～２０ｎｔ）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓヌクレアーゼについての結合足場）を有するｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が挙げられる。ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分内の標的化配列を変化させることにより、任意の目的のＤＮＡを標的化することができる。一部の実施例では、ｇＲＮＡは、死んだガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である。一部の実施例では、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質の使用には、編集されるＤＮＡ内の標的遺伝子座／配列にＰＡＭ配列が存在する必要がある。１つまたは複数のｇＲＮＡを、分子１１０、分子１５０、または両方にコードさせる、例えば、プロモーターから発現させることができる。一部の実施例では、１つまたは複数のｇＲＮＡを１つまたは複数の追加のＤＮＡ分子、例えば、異なるベクターにコードさせることができる。

一部の実施例では、ネイティブなまたは野生型Ｃａｓ９配列を使用する（例えば、配列番号２０７および２０８）。一実施例では、変異したＣａｓ９配列を使用する（例えば、配列番号２０９および２１０）。一実施例では、変異した「ニッカーゼ」バージョンのＣａｓ９（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ酵素のＤ１０Ａ変異体）を使用し、それにより、二本鎖切断の代わりに一本鎖ＤＮＡ切断を生じさせる。一実施例では、触媒として不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）を使用して、標的核酸分子の転写に干渉することによって遺伝子発現をノックダウンする。ｄＣａｓ９を追加のリプレッサーペプチドと融合することができる。活性化因子ペプチドと融合した触媒として不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）により、遺伝子発現を活性化するまたは増加させることができる（例えば、標的遺伝子のアップレギュレーションが望まれる遺伝障害を処置するために）。

一実施例では、１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４によってコードされるＣａｓ９タンパク質、または１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４によってコードされる融合タンパク質のＣａｓ９部分は、配列番号２０８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を保持する。一実施例では、１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４のＣａｓ９コード配列、または１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４によってコードされる融合タンパク質のＣａｓ９コード配列部分は、配列番号２０７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする。

一実施例では、１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４によってコードされるｄＣａｓ９タンパク質、または１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４によってコードされる融合タンパク質のｄＣａｓ９部分は、配列番号２１０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が低下しているまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有さないが、ｄｓＤＮＡに結合することができ、一部の実施例では、１つまたは複数のＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、およびＤ９８６Ａ置換を含む。一実施例では、１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４のｄＣａｓ９コード配列、または１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４によってコードされる融合タンパク質のｄＣａｓ９コード配列部分は、配列番号２０９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性が低下しているまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有さないが、ｄｓＤＮＡに結合することができるタンパク質をコードし、一部の実施例では、１つまたは複数のＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、およびＤ９８６Ａ置換を有するタンパク質をコードする。

一部の実施例では、１１４、１６４または１１４、２１６、１６４によってコードされるＣａｓ９またはｄＣａｓ９は、例えば、Ｃａｓ９もしくはｄＣａｓ９のＮ末端もしくはＣ末端に、またはＣａｓ９もしくはｄＣａｓ９内の任意の場所に別のタンパク質またはペプチドをさらに含む融合タンパク質である。

本明細書に提示される組成物によってコードされるＣａｓ９またはｄＣａｓ９は、１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含み得る。したがって、一部の実施例では、ＮＬＳ－Ｃａｓ９またはＮＬＳ－ｄＤａｓ９融合タンパク質がコードされる。例示的なＮＬＳ配列としては、ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ（配列番号２１８；例えば、ＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＡｇＡＡＧＡＧａＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣ、配列番号２１９によってコードされる）およびＧＰＫＫＫＲＫＶＡＡＡ（ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ、配列番号２２０；例えば、ｇｇａｃｃｔａａｇａａａａａｇａｇｇａａｇｇｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｔ、配列番号２２１によってコードされる）が挙げられる。一部の実施例では、ＮＬＳは、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質のＮ末端に存在する。一部の実施例では、ＮＬＳは、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質のＣ末端に存在する。一部の実施例では、ＮＬＳ－Ｃａｓ９またはＮＬＳ－ｄＤａｓ９融合タンパク質は、例えばＣａｓ９／ｄＣａｓ９タンパク質のＮ末端とＣ末端に、２つまたはそれよりも多くのＮＬＳを含む。一部の実施例では、ＮＬＳはＣａｓ９／ｄＣａｓ９タンパク質の内部に存在する。

一実施例では、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９融合タンパク質は、転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＣＢＰ、ＳＥＴ７／９、またはこれらの任意の組合せを含む。したがって、一部の実施例では、１１４、１６４または１１４、２１６、１６４は、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９と、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＣＢＰ、およびＳＥＴ７／９のうちの１つまたは複数とを含む融合タンパク質をコードする。一実施例では、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４である（ＶＰ６４の１つまたは複数のコピー、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのＶＰ６４タンパク質を含み得る）。一実施例では、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－Ｐ６５－Ｒｔａ（ＶＰＲ）である。一実施例では、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９－ＣＢＰである。ＣＢＰは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメインである。転写活性化ドメインの存在を使用して、標的遺伝子の転写を活性化することができる。一部の実施例では、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９は、転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＣＢＰ、ＳＥＴ７／９、またはこれらの任意の組合せをさらに含まない。

一部の実施例では、１１４、１６４または１１４、２１６、１６４によってコードされるＣａｓ９またはｄＣａｓ９は、塩基エディター（ＢＥ）、例えば、シトシン塩基エディター（ＣＢＥ）またはアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）をさらに含む融合タンパク質である。ＣＢＥは、ＣからＴへの変化（または逆の鎖のＧからＡへの変化）を媒介する。ＡＢＥはＡをＧに変化させる（または逆の鎖のＴをＣに変化させる）。

一部の実施例では、１１４、１６４または１１４、２１６、１６４によってコードされるＣａｓ９またはｄＣａｓ９は、ＤＮＡにおけるＴ・ＡからＣ・Ｇへの点変異を補正するシトシン塩基エディター（ＣＢＥ）をさらに含む融合タンパク質である。例示的なＣＢＥは、シチジンデアミナーゼ（例えば、ウミヤツメ由来のもの［ＡＩＤ］、ＣＤＡ１、またはＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）である。これらの融合物により、ＤＮＡがカットされることなくシトシンがウラシルに変換される。続いてＤＮＡ複製または修復によってウラシルがチミンに変換される。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＧＩ）のインヒビターをｄＣａｓ９と融合することにより、ＵをＣ変異に戻す塩基除去修復が防止される。一実施例では、Ｃａｓニッカーゼ－シチジンデアミナーゼ融合タンパク質（ＢＥ３）を使用し、それにより、改変されていないＤＮＡ鎖にニックが生じ、したがって、細胞には「新たに合成された」ものに見える。したがって、細胞はＵ含有鎖を鋳型として使用してそのＤＮＡを修復し、それにより、塩基編集をコピーする。一実施例では、融合タンパク質は、シチジンデアミナーゼと融合した高忠実度Ｃａｓ９バリアントＨＦ－Ｃａｓ９（ＨＦ－ＢＥ３）である。一実施例では、Ｃａｓニッカーゼ－シチジンデアミナーゼ融合タンパク質（ターゲット－ＡＩＤ）を使用する。一実施例では、融合タンパク質ＨＦ－Ｃａｓ９－ＢＥ３を使用する。一実施例では、融合タンパク質ＢＥ４、ＢＥ４ｍａｘ、ＡｎｃＢＥ４またはＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用する。一実施例では、融合タンパク質は、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）の１つ（ＢＥ３）または２つ（ＢＥ４）の単量体とつながった、機能が損なわれた形態のＣａｓ９（Ｄ１０Ａニッカーゼ）と融合したシチジンデアミナーゼを含み、それにより、ヒトゲノムＤＮＡにおける、ウラシル中間体の形成を通じたＣ・Ｇ塩基対のＴ・Ａ塩基対への変換が可能になる。一実施例では、融合タンパク質は、ＲｒＡ３Ｆ、ＡｍＡＰＯＢＥＣ１、ＳｓＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、またはＰｐＡＰＯＢＥＣ１のいずれかを有するＢＥ４を含む。一実施例では、融合タンパク質は、ＲｒＡ３Ｆ［ｗｔ、Ｆ１３０Ｌ］、ＡｍＡＰＯＢＥＣ１、ＳｓＡＰＯＢＥＣ３Ｂ［ｗｔ、Ｒ５４Ｑ］、またはＰｐＡＰＯＢＥＣ１［ｗｔ、Ｈ１２２Ａ、Ｒ３３Ａ］のいずれかを有するＢＥ４を含む。

一実施例では、１１４、１６４または１１４、２１６、１６４によってコードされるＣａｓ９またはｄＣａｓ９は、アデニンをイノシンに変換することができ、それにより、ゲノムＤＮＡにおけるＡ・ＴのＧ・Ｃへの変換をもたらし得るアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）をさらに含む融合タンパク質である。例示的なＡＢＥとしては、ＡＢＥ６．３、７．８、７．９および７．１０、ならびにＡＢＥｍａｘ、ＡＢＥ８ｓ（例えば、ＡＢＥ８ｅ（ＴａｄＡ－８ｅＶ１０６Ｗ）Richter et al., Nature biotech. 38: 883-91, 2020を参照されたい）が挙げられる。

一実施例では、１１４、１６４または１１４、２１６、１６４によってコードされるＣａｓ９またはｄＣａｓ９は、ＡＢＥおよびＣＢＥ、例えば、ＳＰＡＣＥ（Ｃａｓ９に対してｍｉｎｉＡＢＥｍａｘ－Ｖ８２Ｇおよびターゲット－ＡＩＤを使用する）、ならびにシチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼの両方とＣａｓ９ニッカーゼの融合物をさらに含む融合タンパク質である。

一実施例では、１１４、１６４または１１４、２１６、１６４によってコードされるＣａｓ９またはｄＣａｓ９は、逆転写酵素をさらに含む融合タンパク質である。一実施例では、ｄＣａｓ９は、ｄＣａｓ９Ｈ８４０Ａニッカーゼである。一部のそのような実施例では、使用されるｇＲＮＡは、典型的なｇＲＮＡよりも長いプライム編集ｇＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）である。ｐｅｇＲＮＡは、プライマー結合部位（ＰＢＳ）および逆転写酵素（ＲＴ）鋳型配列を含有する伸長したｇＲＮＡを含む。

一実施例では、１１４、１６４または１１４、２１６、１６４によってコードされるＣａｓ９またはｄＣａｓ９は、バクテリオファージタンパク質Ｇａｍをさらに含む融合タンパク質である（例えば、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９のＮ末端に含み、シチジンデアミナーゼ（例えば、ＡＩＤ、ＣＤＡ１、またはＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）をさらに含み得る）。

一部の実施例では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用する代わりに、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ誘導型Ｆｏｋｌヌクレアーゼを使用する（例えば、Tsai et al., Nature Biotechnol. 32: 569-76, 2014を参照されたい）。したがって、一部の実施例では、１１４、１６４または１１４、２１６、１６４は、Ｆｏｋ１コード配列を含む。二量体ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）は、ヒト細胞における伸長した配列を認識し、内因性遺伝子を編集することができる。ＲＦＮ切断活性は、２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のＤＮＡへの規定された間隔および方向での結合に依存する。
Ｂ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｄまたはＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ１３ｄ

一部の実施例では、分子１１０、１５０のＮ末端およびＣ末端コード部分１１４、１６４（および３つの分子を使用する場合、２００の中間コード部分２１６）は、ＲＮＡ配列を編集するためのＣａｓ１３ｄタンパク質（例えば、配列番号２１２、２１４、２２２）をコードする。一部の実施例では、分子１１０、１５０のＮ末端およびＣ末端コード部分１１４、１６４（および３つの分子を使用する場合、２００の中間コード部分２１６）は、ＲＮＡ配列を編集するための死んだＣａｓ１３ｄ（ｄＣａｓ１３ｄ）タンパク質（例えば、配列番号２１６）をコードする。そのような実施例では、１１０、１５０を含むＤＮＡ組成物は、１つまたは複数のｇＲＮＡコード配列をさらに含み得る。ｇＲＮＡは、１１４、１６４（または１１４、２１６、１６４）によってコードされる特定のＣａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３タンパク質に基づいて設計され、Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３タンパク質を標的核酸配列に方向付けるために使用される。ＤＮＡ編集の実施例におけるｇＲＮＡは、（１）Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄとｇＲＮＡの相互作用を容易にする二次構造を有するダイレクトリピート（ＤＲ）領域を含有するｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）（例えば、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも１２ｎｔ、少なくとも１３ｎｔ、少なくとも１４ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも１６ｎｔ、少なくとも１７ｎｔ、少なくとも１８ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２５ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、または少なくとも３６ｎｔ、例えば、２０～４０ｎｔ、例えば、３０～３６ｎｔ）、および（２）標的ＲＮＡと相補的な部分を有するスペーサー（例えば、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも１２ｎｔ、少なくとも１３ｎｔ、少なくとも１４ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも１６ｎｔ、少なくとも１７ｎｔ、少なくとも１８ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２５ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、または少なくとも３２ｎｔ、例えば、２０～４０ｎｔ、３０～３２ｎｔ、または２５～３５ｎｔ）を含む。一部の実施例では、ｇＲＮＡ（またはそれをコードするＤＮＡ）は、５’末端に一定のダイレクトリピートＤＲを含み、３’末端に可変のスペーサーを含む。一部の実施例では、プロセシングされていないｇＲＮＡは、３６ｎｔのＤＲの後に３０～３２ｎｔのスペーサー配列が続く。ｇＲＮＡは、発現された後、Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３または他のＲＮａｓｅによってプロセシング（短縮／修飾）されて、より短い「成熟」形態になる。ｇＲＮＡのスペーサー部分内の標的化配列を変化させることにより、任意の目的のＲＮＡを標的化することができる。一部の実施例では、Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄタンパク質を使用することにより、編集されるＲＮＡ内の標的遺伝子座／配列にＰＡＭ配列が存在する必要がなくなる。１つまたは複数のｇＲＮＡを分子１１０、分子１５０、または両方によってコードさせる、例えば、プロモーターから発現させることができる。一部の実施例では、１つまたは複数のｇＲＮＡを１つまたは複数の追加のＤＮＡ分子、例えば、異なるベクターによってコードさせることができる。ＤＲ配列はＣａｓ１３ｄタンパク質に依存する。例えば、配列番号２１２に示されているＣａｓ１３ｄを使用する場合、ｇＲＮＡのＤＲ配列は、
であり得る（配列番号２２３；下線は、予測される成熟形態の配列を示し、標的ＲＮＡと相補的な約１０～４０ｎｔまたは１４～３０ｎｔを有するスペーサーがＤＲの３’末端に付加されていてもよい）。例えば、配列番号２１４に示されているＣａｓ１３ｄを使用する場合、ｇＲＮＡのＤＲ配列は、
であり得る（配列番号２２４；下線は、予測される成熟形態の配列を示し、標的ＲＮＡと相補的な約１０～４０ｎｔまたは１４～３０ｎｔを有するスペーサーがＤＲの３’末端に付加されていてもよい）。

一部の実施例では、ネイティブなまたは野生型またはネイティブなＣａｓ１３ｄ配列を使用する（例えば、配列番号２０７および２０８）。一実施例では、変異したＣａｓ９配列を使用する（例えば、配列番号２１２、２１４および２２２）。一実施例では、変異バージョンのＣａｓ１３ｄ、例えば、死んだＣａｓ１３ｄ（一方または両方の変異ＨＥＰＮドメイン（複数可）を有しており、したがって、ＲＮＡをカットすることはできないが、ｇＲＮＡをプロセシングすることはできる、Ｃａｓ１３の触媒として不活性なもの。配列番号２１６参照）を使用する。

一実施例では、１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４によってコードされるＣａｓ１３ｄタンパク質、または１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４によってコードされる融合タンパク質のｄＣａｓ１３ｄ部分は、配列番号２１２、２１４、または２２２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を保持する。一実施例では、１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４のＣａｓ１３ｄコード配列、または１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４によってコードされる融合タンパク質のＣａｓ１３ｄコード配列部分は、配列番号２１１または２１３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする。

一実施例では、１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４によってコードされるｄＣａｓ１３ｄタンパク質、または１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４によってコードされる融合タンパク質のｄＣａｓ１３ｄ部分は、配列番号２１６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性、触媒として不活性であるが、ｇＲＮＡをプロセシングすることはでき、一部の実施例では、一方または両方のＨＥＰＮドメインに変異を含む。一実施例では、１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４のｄＣａｓ１３ｄコード配列、または１１４、１６４もしくは１１４、２１６、１６４によってコードされる融合タンパク質のｄＣａｓ１３ｄコード配列部分は、配列番号２１５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し、触媒として不活性であるタンパク質をコードするが、ｇＲＮＡをプロセシングすることはでき、一部の実施例では、一方または両方のＨＥＰＮドメインにおける変異をコードする。

一部の実施例では、１１４、１６４または１１４、２１６、１６４によってコードされるＣａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄは、別のタンパク質またはペプチドを、例えば、ａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄのＮ末端またはＣ末端、またはａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄ内の任意の場所にさらに含む融合タンパク質である。

本明細書に提示される組成物によってコードされるＣａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄは、１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含み得る。したがって、一部の実施例では、ＮＬＳ－Ｃａｓ１３ｄまたはＮＬＳ－ｄＤａｓ１３ｄ融合タンパク質がコードされる。例示的なＮＬＳ配列としては、ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ（配列番号２１８；例えば、ＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＡｇＡＡＧＡＧａＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣ、配列番号２１９によってコードされる）およびＧＰＫＫＫＲＫＶＡＡＡ（ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ、配列番号２２０；例えば、ｇｇａｃｃｔａａｇａａａａａｇａｇｇａａｇｇｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｔ、配列番号２２１によってコードされる）が挙げられる。一部の実施例では、ＮＬＳは、ａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄタンパク質のＮ末端に存在する。一部の実施例では、ＮＬＳは、ａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄタンパク質のＣ末端に存在する。一部の実施例では、ＮＬＳ－Ｃａｓ１３ｄまたはＮＬＳ－ｄＤａｓ１３ｄ融合タンパク質は、２つまたはそれよりも多くのＮＬＳを、例えば、ａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄタンパク質のＮ末端とＣ末端に含む。一部の実施例では、ＮＬＳは、Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄタンパク質の内部に存在する。

一部の実施例では、１１４、１６４または１１４、２１６、１６４によってコードされるＣａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄは、塩基エディター（ＢＥ）、例えば、ＲＮＡ塩基エディター、例えば、ＡＤＡＲ（ＲＮＡに対して作用するアデノシンデアミナーゼ）をさらに含む融合タンパク質である。このタンパク質はアデニンをイノシンに変換する。
Ｃ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、非特異的ＤＮＡ切断ドメイン（例えば、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼ）に連結されたプログラム可能な配列特異的ＤＮＡ結合モジュールで構成されるキメラヌクレアーゼである。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、特定のゲノム位置における、誤りがちな非相同末端結合または相同組換え修復を刺激するＤＮＡ二本鎖切断を誘導することによって広範囲の遺伝子改変を可能にする（総説についてはGaj et al., Trends Biotechnol. 31: 397-405, 2013を参照されたい）。ジンクフィンガータンパク質およびＴＡＬＥを、酵素的ドメイン、例えば、ＤＮＡの組込み、除去、および逆位を触媒する部位特異的ヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよびトランスポザーゼと融合することができる。標的化遺伝子付加を必要とする適用に関しては、リコンビナーゼ活性およびトランスポザーゼ活性は、ドナーＤＮＡのゲノム内への挿入を特徴とし、それにより、オフターゲットの効果を直接モニタリングすることが可能になる。

一部の実施例では、分子１１０、１５０のＮ末端およびＣ末端コード部分１１４、１６４（および３つの分子を使用する場合、２００の中間コード部分２１６）は、遺伝子配列などのＤＮＡ配列を編集するための少なくとも１つ（例えば、１つまたは２つ）のＺＦＮタンパク質またはＺＦＮ融合タンパク質をコードする。そのような実施例では、ｇＲＮＡ配列は含まれない（例えば、１４０、１４１、１４２、１４３、１７１、１７２、１７３、および１７４は省かれる）。

ジンクフィンガーヌクレアーゼに基づく操作では、ＺＦＮを使用して、ゲノムＤＮＡを所望の位置でカットする。それぞれが２つの機能性ドメインを含有する２つのＺＦＮを使用する。第１のドメインは、それぞれがＤＮＡの独特の六量体（６ｂｐ）配列を認識する少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ）のジンクフィンガーモジュールの鎖で構成されるＤＮＡ結合ドメインである。それぞれが≧２４ｂｐの特異性を有する２つのフィンガーモジュールをつなぎ合わせてジンクフィンガータンパク質を形成する。第２のドメインは、Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼを含むＤＮＡ切断ドメイン（例えば、触媒ドメイン）である。ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインを融合すると、高度に特異的な「ゲノムのはさみ」の対が作り出される。これにより、ゲノムの編集、例えば、遺伝子をダウンレギュレートまたはアップレギュレートすることが可能になる。例えば、本明細書に開示される系および組成物を使用して細胞において２つのＺＦＮを発現させることにより、標的部位の周囲を認識し、ヘテロ二量体形成するＺＦＮ対がもたらされる。ＺＦＮ対は二本鎖切断を生じさせ、次いで、標的ＤＮＡから解離する。対応する修復鋳型がＺＦＮ対と共トランスフェクトされていれば、それにより、相同組換えによる標的遺伝子の修復（例えば、欠失、挿入、置換、または他の遺伝的変更を修復する）がもたらされる。したがって、修復鋳型を、変異した遺伝子が修復されるようにまたは遺伝子発現もしくは活性がアップレギュレートされるように設計することができる。対応する修復鋳型がＺＦＮ対と共トランスフェクトされていなければ、標的遺伝子の破壊（例えば、非相同末端結合によって導入された変異に起因したダウンレギュレーション）がもたらされる。

いくつかの手法を使用して、表１～４に列挙されている遺伝子（または本明細書に提示される障害に関連する他の遺伝子）などの標的核酸（複数可）に対して特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼを設計することができる。最も普及しているものは、ジンクフィンガーユニットと公知の特異性を組み合わせること（モジュラーアセンブリ）を伴う。最良の特異性および最良の細胞の耐性をもたらす組合せを同定するために、細菌、酵母または哺乳動物の細胞を使用する種々の選択技法が開発されている。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化された結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つまたは複数のジンクフィンガーによってＤＮＡに配列特異的に結合するタンパク質ドメインである。ジンクフィンガー結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーの認識へリックスを、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる（例えば、ＣＸＣＲ４または他の標的に結合するように操作する）。ジンクフィンガー結合ドメインの設計に関する合理的な基準としては、既存のＺＦＮ対設計および結合データの情報が保存されているデータベース内の情報を処理するための置換規則およびコンピュータ化されたアルゴリズムの適用が挙げられる。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第５，９２５，５２３号；米国特許第６，００７，９８８号；米国特許第６，０１３，４５３号；米国特許第６，１４０，０８１号；米国特許第６，２００，７５９号；米国特許第６，４５３，２４２号；および米国特許第６，５３４，２６１号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９５／１９４３１号；同第ＷＯ９６／０６１６６号；同第ＷＯ９８／５３０５７号；同第ＷＯ９８／５３０５８号；同第ＷＯ９８／５３０５９号；同第ＷＯ９８／５３０６０号；同第ＷＯ９８／５４３１１号；同第ＷＯ００／２７８７８号；同第ＷＯ０１／６０９７０号；同第ＷＯ０１／８８１９７号；同第ＷＯ０２／０１６５３６号；同第ＷＯ０２／０９９０８４および同第ＷＯ０３／０１６４９６号を参照されたい。

一部の実施例では、ＺＦＮの２種の異なるセット（対）を使用し、例えば、一方のセットが１つの標的核酸分子に特異的であり、他方のセットが第２の標的核酸分子に特異的であるようにする。ＺＦＮの２種よりも多くの異なるセット（例えば、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、または少なくとも５種の異なるセット、例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種の異なるセット）を使用することができることが当業者には理解されよう。一実施例では、分子の１１０、１５０（または１１０、１５０、２００）の複数の組合せを使用し、ここで、それぞれの組合せで１つのＺＦＮが発現される。

一部の実施例では、分子１１０、１５０のＮ末端およびＣ末端コード部分１１４、１６４（および３つの分子を使用する場合、２００の中間コード部分２１６）は、遺伝子配列などのＤＮＡ配列を編集するためのＴＡＬＥＮまたはＴＡＬＥＮ融合タンパク質をコードする。ＴＡＬＥＮを設計するための方法（例えば、Bogdanove and Voytas, Science. 333 (6051) : 1843-6, 2011；Cermak et al., Nucleic Acids Res. 39: e82, 2011；Sander et al., Nat Biotechnol. 29 (8): 697-8, 2011を参照されたい）およびＴＡＬＥＮ媒介性遺伝子標的化を実施するための方法（例えば、Hockenmeyer et al., Nat Biotechnol 29: 731-734を参照されたい）を本開示に適用することができる。

ＴＡＬＥＮ法では、任意の所望のＤＮＡ配列（例えば、表１～４の遺伝子）に結合するように設計することができるＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインは、植物に感染するある特定の細菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）によって分泌されるＤＮＡ結合タンパク質であるＴＡＬエフェクターに由来する。これらをＤＮＡ切断ドメインと組み合わせる。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目および１３番目のアミノ酸以外は高度に保存された３３～３５アミノ酸配列のリピートを含有する。これらの２つの位置は高度に可変性であり（反復可変二残基、ＲＶＤ）、特定のヌクレオチド認識を有する。このアミノ酸配列とＤＮＡ認識の関連性により、妥当なＲＶＤを含有するリピートセグメントの組合せを選択することによって特定のＤＮＡ結合ドメインを操作することが可能になっている。例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの末端に由来する非特異的ＤＮＡ切断ドメインを使用して、ハイブリッドヌクレアーゼを構築することができる。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、したがって、標的ゲノム内の部位に対する独特のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を適当な向きおよび間隔で使用することにより、優れた特異性が可能になる。ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインの間のアミノ酸残基の数、および２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の塩基の数はどちらも変動させることができる。

ＴＡＬＥＮはジンクフィンガーヌクレアーゼを設計するためにも同様に使用される。ＴＡＬＥ特異性は、反復可変二残基（ＲＶＤ）として公知の２つの超可変アミノ酸によって決定される。ジンクフィンガーと同様に、モジュラーＴＡＬＥリピートを、連続したＤＮＡ配列を認識するように連結する。しかし、ジンクフィンガータンパク質とは対照的に、ゲノム内の単一の部位に対応することができるＴＡＬＥの長いアレイを構築するためにリピート間の連結を再操作する必要はない。

一部の実施例では、ＴＡＬＥＮの２つの異なるセット（対）を使用し、例えば、一方のセットが１つの標的核酸分子に特異的であり、他方のセットが第２の標的核酸分子に特異的であるようにする。ＺＦＮの２種よりも多くの異なるセット（例えば、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、または少なくとも５種の異なるセット、例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種の異なるセット）を使用することができることが当業者には理解されよう。一実施例では、分子の１１０、１５０（または１１０、１５０、２００）の複数の組合せを使用し、ここで、それぞれの組合せで１つのＴＡＬＥＮが発現される。

本開示の組成物および方法を、全長核酸エディタータンパク質のｉｎｖｉｖｏにおける発現を実現するため、例えば、ゲノム点変異を処置するために使用することができる。例えば、第１のＲＮＡ分子は、第１の合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメイン（イントロンおよび結合ドメインである）に付加した核酸エディタータンパク質コード配列の第１の部分を含む。この分子は第１のベクター／プラスミドから発現される。第２のＲＮＡ分子は、相補的な第２のＲＮＡ二量体形成および組換えドメインに付加した核酸タンパク質コード配列（nucleic protein coding sequence）の第２の部分を含み、第２のベクター／プラスミドから発現される。これらのＤＮＡベクター／プラスミド（第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子）の一方または両方は、例えば図６Ｇに例示されている通り、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターおよびｇＲＮＡ／ガイドＲＮＡ／ｇＲＮＡ配列で構成されるｇＲＮＡ／ガイドＲＮＡ／ｇＲＮＡ発現カセットを含有し得る。例えば、本開示の組成物は、ｇＲＮＡ／ガイドＲＮＡ／ｇＲＮＡ発現カセットを１～８個含み得る。本開示の組成物中のｇＲＮＡ／ガイドＲＮＡ／ｇＲＮＡ発現カセットの数は、１～２個、１～３個、１～４個、１～５個、１～６個、１～７個、１～８個、２～３個、２～４個、２～５個、２～６個、２～７個、２～８個、３～４個、３～５個、３～６個、３～７個、３～８個、４～５個、４～６個、４～７個、４～８個、５～６個、５～７個、５～８個、６～７個、６～８個、または７～８個であり得る。本開示の組成物中のｇＲＮＡ／ガイドＲＮＡ／ｇＲＮＡ発現カセットの数は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個であり得る。本開示の組成物中のｇＲＮＡ／ガイドＲＮＡ／ｇＲＮＡ発現カセットの数は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個であり得る。本開示の組成物中のｇＲＮＡ／ガイドＲＮＡ／ｇＲＮＡ発現カセットの数は、多くて２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個であり得る。２つのＲＮＡ分子が同じ標的細胞において発現されると、核酸エディタータンパク質コード転写物の２つの部分が組み換えられて全長核酸エディタータンパク質転写物が形成され、次いでそれがタンパク質に翻訳される。

第１のＤＮＡ分子は、５’から３’に、以下の配列を含み得る：ＡＡＶ末端逆位反復配列；ｇＲＮＡ配列（逆向き）；プロモーター（逆向き）；プロモーター；５’非翻訳領域；核酸エディターコード配列のＮ末端部分；第１の二量体形成ドメインを含むおよび／またはそれと重複する合成イントロン配列；ポリアデニル化シグナル配列；プロモーター；ｇＲＮＡ配列；ならびにＡＡＶ末端逆位反復配列。第２のＤＮＡ分子は、５’から３’に、以下の配列を含み得る：ＡＡＶ末端逆位反復配列；ｇＲＮＡ配列（逆向き）；プロモーター（逆向き）、プロモーター、第２の二量体形成ドメインを含むおよび／またはそれと重複する合成イントロン配列；核酸エディターコード配列のＣ末端部分；ポリアデニル化シグナル配列；プロモーター；ｇＲＮＡ配列；ならびにＡＡＶ末端逆位反復配列。

第１のＤＮＡ分子は、５’から３’に、以下の配列を含み得る：ＡＡＶ末端逆位反復配列；ｇＲＮＡ配列（逆向き）；ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（逆向き）；プロモーター；５’非翻訳領域；核酸エディターコード配列のＮ末端部分；第１の二量体形成ドメインを含むおよび／またはそれと重複する合成イントロン配列；ポリアデニル化シグナル配列；ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター；ｇＲＮＡ配列；ならびにＡＡＶ末端逆位反復配列。第２のＤＮＡ分子は、５’から３’に、以下の配列を含み得る：ＡＡＶ末端逆位反復配列；ｇＲＮＡ配列（逆向き）；ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（逆向き）、プロモーター、第２の二量体形成ドメインを含むおよび／またはそれと重複する合成イントロン配列；核酸エディターコード配列のＣ末端部分；ポリアデニル化シグナル配列；ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター；ｇＲＮＡ配列；ならびにＡＡＶ末端逆位反復配列。

第１のＤＮＡ分子は、５’から３’に、以下の配列を含み得る：ＡＡＶ２末端逆位反復配列；ｇＲＮＡ配列（逆向き）；ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（逆向き）；プロモーター；５’非翻訳領域；核酸エディターコード配列のＮ末端部分；第１の二量体形成ドメインを含むおよび／またはそれと重複する合成イントロン配列；ポリアデニル化シグナル配列；ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター；ｇＲＮＡ配列；ならびにＡＡＶ２末端逆位反復配列。第２のＤＮＡ分子は、５’から３’に、以下の配列を含み得る：ＡＡＶ２末端逆位反復配列；ｇＲＮＡ配列（逆向き）；ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（逆向き）、プロモーター、第２の二量体形成ドメインを含むおよび／またはそれと重複する合成イントロン配列；核酸エディターコード配列のＣ末端部分；ポリアデニル化シグナル配列；ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター；ｇＲＮＡ配列；ならびにＡＡＶ２末端逆位反復配列。

第１のＤＮＡ分子は、５’から３’に、以下の配列を含み得る：ＡＡＶ２末端逆位反復配列；ｇＲＮＡ配列（逆向き）；ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（逆向き）；ＣＭＶプロモーター；５’非翻訳領域；核酸エディターコード配列のＮ末端部分；第１の二量体形成ドメインを含むおよび／またはそれと重複する合成イントロン配列；ポリアデニル化シグナル配列；Ｈ１ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター；ｇＲＮＡ配列；ならびにＡＡＶ２末端逆位反復配列。第２のＤＮＡ分子は、５’から３’に、以下の配列を含み得る：ＡＡＶ２末端逆位反復配列；ｇＲＮＡ配列（逆向き）；ヒトＵ６ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（逆向き）、ＣＭＶプロモーター；第２の二量体形成ドメインを含むおよび／またはそれと重複する合成イントロン配列；核酸エディターコード配列のＣ末端部分；ポリアデニル化シグナル配列；Ｈ１ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター；ｇＲＮＡ配列；ならびにＡＡＶ２末端逆位反復配列。

一部の実施形態では、それぞれ、第１のＤＮＡ分子は、ｄＣａｓ９－ＶＰＲのＮ末端部分、プライムエディターのＮ末端部分、ＡｎｃＢＥ４のＮ末端部分、またはＡＢＥ８ｅのＮ末端部分をコードする第１のＲＮＡ分子をコードする配列を含み、第２のＤＮＡ分子は、ｄＣａｓ９－ＶＰＲのＣ末端部分、プライムエディターのＣ末端部分、ＡｎｃＢＥ４のＣ末端部分、またはＡＢＥ８ｅのＣ末端部分をコードする第１のＲＮＡ分子をコードする配列を含む。

一部の実施形態では、ｄＣａｓ９－ＶＰＲタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のＲＮＡ分子をコードする第１のＤＮＡ分子の配列は、配列番号１５９を含む。一部の実施形態では、配列は、配列番号１５９に対して約８０％～約１００％のパーセント配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１５９に対して約８０～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１５９に対して約８０～約８５、約８０～約９０、約８０～約９５、約８０～約９６、約８０～約９７、約８０～約９８、約８０～約９９、約８０～約１００、約８５～約９０、約８５～約９５、約８５～約９６、約８５～約９７、約８５～約９８、約８５～約９９、約８５～約１００、約９０～約９５、約９０～約９６、約９０～約９７、約９０～約９８、約９０～約９９、約９０～約１００、約９５～約９６、約９５～約９７、約９５～約９８、約９５～約９９、約９５～約１００、約９６～約９７、約９６～約９８、約９６～約９９、約９６～約１００、約９７～約９８、約９７～約９９、約９７～約１００、約９８～約９９、約９８～約１００、または約９９～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１５９に対して約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１５９に対して少なくとも約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１５９に対して多くとも約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。

一部の実施形態では、ｄＣａｓ９－ＶＰＲタンパク質のＣ末端部分をコードする第１のＲＮＡ分子をコードする第２のＤＮＡ分子の配列は、配列番号１６０を含む。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６０に対して約８０％～約１００％のパーセント配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６０に対して約８０～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６０に対して約８０～約８５、約８０～約９０、約８０～約９５、約８０～約９６、約８０～約９７、約８０～約９８、約８０～約９９、約８０～約１００、約８５～約９０、約８５～約９５、約８５～約９６、約８５～約９７、約８５～約９８、約８５～約９９、約８５～約１００、約９０～約９５、約９０～約９６、約９０～約９７、約９０～約９８、約９０～約９９、約９０～約１００、約９５～約９６、約９５～約９７、約９５～約９８、約９５～約９９、約９５～約１００、約９６～約９７、約９６～約９８、約９６～約９９、約９６～約１００、約９７～約９８、約９７～約９９、約９７～約１００、約９８～約９９、約９８～約１００、または約９９～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６０に対して約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６０に対して少なくとも約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６０に対して多くとも約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。

一部の実施形態では、プライムエディタータンパク質のＮ末端部分をコードするＲＮＡをコードする配列は、配列番号１６１を含む。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６１に対して約８０％～約１００％のパーセント配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６１に対して約８０～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６１に対して約８０～約８５、約８０～約９０、約８０～約９５、約８０～約９６、約８０～約９７、約８０～約９８、約８０～約９９、約８０～約１００、約８５～約９０、約８５～約９５、約８５～約９６、約８５～約９７、約８５～約９８、約８５～約９９、約８５～約１００、約９０～約９５、約９０～約９６、約９０～約９７、約９０～約９８、約９０～約９９、約９０～約１００、約９５～約９６、約９５～約９７、約９５～約９８、約９５～約９９、約９５～約１００、約９６～約９７、約９６～約９８、約９６～約９９、約９６～約１００、約９７～約９８、約９７～約９９、約９７～約１００、約９８～約９９、約９８～約１００、または約９９～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６１に対して約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６１に対して少なくとも約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６１に対して多くとも約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。

一部の実施形態では、プライムエディタータンパク質のＣ末端部分をコードするＲＮＡをコードする配列は、配列番号１６２を含む。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６２に対して約８０％～約１００％のパーセント配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６２に対して約８０～約１００の％配列同一性を有する。
一部の実施形態では、配列は、配列番号１６２に対して約８０～約８５、約８０～約９０、約８０～約９５、約８０～約９６、約８０～約９７、約８０～約９８、約８０～約９９、約８０～約１００、約８５～約９０、約８５～約９５、約８５～約９６、約８５～約９７、約８５～約９８、約８５～約９９、約８５～約１００、約９０～約９５、約９０～約９６、約９０～約９７、約９０～約９８、約９０～約９９、約９０～約１００、約９５～約９６、約９５～約９７、約９５～約９８、約９５～約９９、約９５～約１００、約９６～約９７、約９６～約９８、約９６～約９９、約９６～約１００、約９７～約９８、約９７～約９９、約９７～約１００、約９８～約９９、約９８～約１００、または約９９～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６２に対して約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６２に対して少なくとも約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６２に対して多くとも約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。

一部の実施形態では、ＡｎｃＢＥ４タンパク質のＮ末端部分をコードするＲＮＡをコードする配列は、配列番号１６３を含む。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６３に対して約８０％～約１００％のパーセント配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６３に対して約８０～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６３に対して約８０～約８５、約８０～約９０、約８０～約９５、約８０～約９６、約８０～約９７、約８０～約９８、約８０～約９９、約８０～約１００、約８５～約９０、約８５～約９５、約８５～約９６、約８５～約９７、約８５～約９８、約８５～約９９、約８５～約１００、約９０～約９５、約９０～約９６、約９０～約９７、約９０～約９８、約９０～約９９、約９０～約１００、約９５～約９６、約９５～約９７、約９５～約９８、約９５～約９９、約９５～約１００、約９６～約９７、約９６～約９８、約９６～約９９、約９６～約１００、約９７～約９８、約９７～約９９、約９７～約１００、約９８～約９９、約９８～約１００、または約９９～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６３に対して約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６３に対して少なくとも約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６３に対して多くとも約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。

一部の実施形態では、ＡｎｃＢＥ４タンパク質のＣ末端部分をコードするＲＮＡをコードする配列は、配列番号１６４を含む。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６４に対して約８０％～約１００％のパーセント配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６４に対して約８０～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６４に対して約８０～約８５、約８０～約９０、約８０～約９５、約８０～約９６、約８０～約９７、約８０～約９８、約８０～約９９、約８０～約１００、約８５～約９０、約８５～約９５、約８５～約９６、約８５～約９７、約８５～約９８、約８５～約９９、約８５～約１００、約９０～約９５、約９０～約９６、約９０～約９７、約９０～約９８、約９０～約９９、約９０～約１００、約９５～約９６、約９５～約９７、約９５～約９８、約９５～約９９、約９５～約１００、約９６～約９７、約９６～約９８、約９６～約９９、約９６～約１００、約９７～約９８、約９７～約９９、約９７～約１００、約９８～約９９、約９８～約１００、または約９９～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６４に対して約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６４に対して少なくとも約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６４に対して多くとも約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。

一部の実施形態では、ＡＢＥ８ｅタンパク質のＮ末端部分をコードするＲＮＡをコードする配列は、配列番号１６５を含む。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６５に対して約８０％～約１００％のパーセント配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６５に対して約８０～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６５に対して約８０～約８５、約８０～約９０、約８０～約９５、約８０～約９６、約８０～約９７、約８０～約９８、約８０～約９９、約８０～約１００、約８５～約９０、約８５～約９５、約８５～約９６、約８５～約９７、約８５～約９８、約８５～約９９、約８５～約１００、約９０～約９５、約９０～約９６、約９０～約９７、約９０～約９８、約９０～約９９、約９０～約１００、約９５～約９６、約９５～約９７、約９５～約９８、約９５～約９９、約９５～約１００、約９６～約９７、約９６～約９８、約９６～約９９、約９６～約１００、約９７～約９８、約９７～約９９、約９７～約１００、約９８～約９９、約９８～約１００、または約９９～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６５に対して約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６５に対して少なくとも約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６５に対して多くとも約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。

一部の実施形態では、ＡＢＥ８ｅタンパク質のＣ末端部分をコードするＲＮＡをコードする配列は、配列番号１６６を含む。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６６に対して約８０％～約１００％のパーセント配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６６に対して約８０～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６６に対して約８０～約８５、約８０～約９０、約８０～約９５、約８０～約９６、約８０～約９７、約８０～約９８、約８０～約９９、約８０～約１００、約８５～約９０、約８５～約９５、約８５～約９６、約８５～約９７、約８５～約９８、約８５～約９９、約８５～約１００、約９０～約９５、約９０～約９６、約９０～約９７、約９０～約９８、約９０～約９９、約９０～約１００、約９５～約９６、約９５～約９７、約９５～約９８、約９５～約９９、約９５～約１００、約９６～約９７、約９６～約９８、約９６～約９９、約９６～約１００、約９７～約９８、約９７～約９９、約９７～約１００、約９８～約９９、約９８～約１００、または約９９～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６６に対して約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６６に対して少なくとも約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６６に対して多くとも約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。

ＡＢＥ８ｅタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のＲＮＡ分子をコードし、少なくとも１つのｇＲＮＡ／ガイドＲＮＡ／ｇＲＮＡ発現カセットをさらに含む第１のＤＮＡ分子の配列は、配列番号２２５を含み得る。一部の実施形態では、配列は、配列番号２２５に対して約８０～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号２２５に対して約８０～約８５、約８０～約９０、約８０～約９５、約８０～約９６、約８０～約９７、約８０～約９８、約８０～約９９、約８０～約１００、約８５～約９０、約８５～約９５、約８５～約９６、約８５～約９７、約８５～約９８、約８５～約９９、約８５～約１００、約９０～約９５、約９０～約９６、約９０～約９７、約９０～約９８、約９０～約９９、約９０～約１００、約９５～約９６、約９５～約９７、約９５～約９８、約９５～約９９、約９５～約１００、約９６～約９７、約９６～約９８、約９６～約９９、約９６～約１００、約９７～約９８、約９７～約９９、約９７～約１００、約９８～約９９、約９８～約１００、または約９９～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号２２５に対して約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号２２５に対して少なくとも約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号２２５に対して多くとも約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。

ＡＢＥ８ｅタンパク質のＮ末端部分をコードする第２のＲＮＡ分子をコードし、少なくとも１つのｇＲＮＡ／ガイドＲＮＡ／ｇＲＮＡ発現カセットをさらに含む第２のＤＮＡ分子の配列は、配列番号２２６を含み得る。一部の実施形態では、配列は、配列番号２２６に対して約８０～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号２２６に対して約８０～約８５、約８０～約９０、約８０～約９５、約８０～約９６、約８０～約９７、約８０～約９８、約８０～約９９、約８０～約１００、約８５～約９０、約８５～約９５、約８５～約９６、約８５～約９７、約８５～約９８、約８５～約９９、約８５～約１００、約９０～約９５、約９０～約９６、約９０～約９７、約９０～約９８、約９０～約９９、約９０～約１００、約９５～約９６、約９５～約９７、約９５～約９８、約９５～約９９、約９５～約１００、約９６～約９７、約９６～約９８、約９６～約９９、約９６～約１００、約９７～約９８、約９７～約９９、約９７～約１００、約９８～約９９、約９８～約１００、または約９９～約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号２２６に対して約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号２２６に対して少なくとも約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９の％配列同一性を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号２２６に対して多くとも約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または約１００の％配列同一性を有する。
ＩＶ．組成物およびキット

本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を含む組成物およびキットが提供され、ここで、２つまたはそれよりも多く（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）の合成核酸分子は、組み換えられると全長タンパク質をコードする。一部の実施例では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子は、ＤＮＡである。一部の実施例では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子は、ＲＮＡであり、プロモーター配列を含まない。一実施例では、組成物またはキットは、本明細書に提示される２つの合成核酸分子を含み、２つの合成核酸分子のそれぞれが、核酸編集タンパク質の異なる部分をコードする（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端、ここで、２つの分子間で組換えが起こるとコード配列全体が生成される）。一実施例では、組成物またはキットは、本明細書に提示される３つの合成核酸分子を含み、３つの合成核酸分子のそれぞれが、核酸編集タンパク質、例えば、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、Ｃａｓ１３ｄ、またはｄＣａｓ１３ｄ（またはこれらのうちのいずれか１つの融合タンパク質）の異なる部分をコードする（すなわち、Ｎ末端、中間、およびＣ末端、ここで、３つの分子間で組換えが起こるとコード配列全体が生成される）。一実施例では、組成物またはキットは、本明細書に提示される４つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を含み、４つまたはそれよりも多くの（four of more）合成核酸分子のそれぞれが、核酸編集タンパク質の異なる部分をコードする（すなわち、Ｎ末端、第１の中間、第２の中間（および必要に応じて追加の中間）、およびＣ末端、ここで、４つまたはそれよりも多くの合成核酸分子間で組換えが起こるとコード配列全体が生成される）。一実施例では、組成物またはキットは、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の２つまたはそれよりも多くのセットを含み、合成核酸分子のセットのそれぞれが、異なる核酸編集タンパク質をコードする。一部の実施例では、組成物およびキットは、プロモーターに作動可能に連結していてよい、１つもしくは複数のｇＲＮＡ（例えば、複数のｇＲＮＡを含有するカセット）を含有する核酸分子、または１つもしくは複数のｇＲＮＡコード配列をコードする（例えば、複数のｇＲＮＡを含有するカセットをコードする）核酸分子をさらに含む。

一実施例では、組成物またはキット中の各合成核酸分子は、ＡＡＶまたは他の遺伝子療法用ベクターなどのベクターの一部である。一実施例では、組成物またはキットは、２つまたはそれよりも多くの開示される合成核酸分子を含む細胞、例えば細菌細胞または真核細胞を含み、ここで、合成核酸分子は組み換えられると全長核酸編集タンパク質をコードする。

そのような組成物は、薬学的に許容される担体（例えば、食塩水、水、グリセロール、ＤＭＳＯ、またはＰＢＳ）を含み得る。一部の実施例では、組成物は、液体、凍結乾燥粉末、または凍結保存されたものである。

一部の実施例では、キットは、例えば、細胞型特異的取り込みを方向付けるため／エンドソームからの脱出を増強するため／血液脳関門の横断を可能にするなどのために送達系（例えば、リポソーム、粒子、エキソソーム、または微小胞）を含む。一部の実施例では、キットは、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞を成長させるための妥当な媒体などの細胞培養培地または成長培地をさらに含む。一部の実施例では、キットのそのようなパーツは別々の容器に入れられている。例示的な容器としてはプラスチックまたはガラスバイアルまたは管が挙げられる。

一部の実施例では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子はそれぞれ別々の容器に入れられている。一部の実施例では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子の２つまたはそれよりも多くのセットは別々の容器に入れられている。
Ｖ．処置方法

本明細書に開示される方法および系は、任意の目的の核酸編集タンパク質を、例えば、治療用ウイルス（例えば、ＡＡＶ）によって発現させるにはタンパク質が大きすぎる場合、または治療用ウイルス（例えば、ＡＡＶ）によって発現させるには完全な遺伝子配列（例えば、内因性プロモーター＋コード配列）が大きすぎる場合に、発現させるために使用することができる。そのような場合では、本明細書に開示される系を使用して核酸編集タンパク質（the nucleic acid editing protein protein）のコード配列を２つまたはそれよりも多くの部分に分け、正しい順序で組み換え、それにより、所望のときと場所でタンパク質を発現させることを可能にすることができる。組成物および系は、編集される（例えば、表１～４のいずれかに列挙されている疾患を処置するために）核酸分子を標的とする１つまたは複数のｇＲＮＡ（またはプロモーターに作動可能に連結した１つまたは複数のｇＲＮＡをコードする核酸分子）をさらに含み得る。

処置される対象は、表１～４に列挙されているものなどの単一遺伝子（ｍｏｎｏｇｅｎｅｔｉｃ）障害を有するものなどの任意の哺乳動物であり得る。一実施例では、対象はがんを有する。したがって、ヒト、ネコ、ブタ、ラット、マウス、ウシ、ヤギ、およびイヌを開示される方法で処置することができる。一部の実施例では、対象は６カ月齢未満のヒト乳児である。一部の実施例では、対象は１歳未満のヒト乳児である。一部の実施例では、対象は若年のヒトである。一部の実施例では、対象は少なくとも１８歳のヒト成人である。一部の実施例では、対象は女性である。一部の実施例では、対象は男性である。

対象を処置するために使用される本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を処置される対象に適合させることができる。したがって、例えば、処置される対象がイヌの場合、核酸編集タンパク質のイヌコード配列を使用することができ、イントロン配列をイヌ細胞における発現のために最適化することができ、処置される対象がヒトの場合、核酸編集タンパク質のヒトコード配列を使用することができ、イントロン配列をヒト細胞における発現のために最適化することができる。

本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子は、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、例えば、ＡＡＶ血清型ｒｈ．１０などのベクターの一部として投与することができる。一部の実施例では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子のうちの１つを含むベクター（例えば、ＡＡＶ）を、静脈内になど、全身的に投与する。したがって、コード配列を本明細書に提示される２つの合成核酸分子に分ける場合、２つのＡＡＶを投与し、各ＡＡＶが本明細書に提示される２つの合成核酸分子のうちの１つを含む。

本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を、治療有効量で、例えば、ＡＡＶとして投与する。一部の実施例では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）の一部である場合、対象当たり少なくとも１×１０^１０ゲノムコピー（ｇｃ）、少なくとも１×１０^１１ｇｃ、少なくとも２×１０^１１ｇｃ、少なくとも１×１０^１２ｇｃ、少なくとも２×１０^１２ｇｃ、少なくとも１×１０^１３ｇｃ、少なくとも２×１０^１３ｇｃ、または対象当たり少なくとも１×１０^１４ｇｃ、例えば、対象当たり２×１０^１０ｇｃ、対象当たり２×１０^１１ｇｃ、対象当たり２×１０^１２ｇｃ、対象当たり２×１０^１３ｇｃ、または対象当たり２×１０^１４ｇｃの用量で投与する。一部の実施例では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）の一部である場合、少なくとも１×１０^１０ｇｃ／ｋｇ、少なくとも５×１０^１０ｇｃ／ｋｇ、少なくとも１×１０^１１ｇｃ／ｋｇ、少なくとも５×１０^１１ｇｃ／ｋｇ、少なくとも１×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、少なくとも５×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、少なくとも１×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、または少なくとも４×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、例えば、４×１０^１０ｇｃ／ｋｇ、４×１０^１１ｇｃ／ｋｇ、４×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、または４×１０^１３ｇｃ／ｋｇの用量で投与する。

一部の実施例では、本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）の一部として、対象当たり、または対象の処置面積当たり約１×１０^１０ゲノムコピー（ｇｃ）～約１×１０^１４の用量で投与する。一部の実施形態では、対象当たり、または対象の処置面積当たりの投与される用量は、約１×１０^１０ｇｃ～約１×１０^１４ｇｃである。一部の実施形態では、対象当たり、または対象の処置面積当たりの投与される用量は、約１×１０^１０ｇｃ～約１×１０^１１ｇｃ、約１×１０^１０ｇｃ～約１×１０^１２ｇｃ、約１×１０^１０ｇｃ～約１×１０^１３ｇｃ、約１×１０^１０～約１×１０^１４ｇｃ、約１×１０^１１ｇｃ～約１×１０^１２ｇｃ、約１×１０^１１ｇｃ～約１×１０^１３ｇｃ、約１×１０^１１ｇｃ～約１×１０^１４ｇｃ、約１×１０^１２ｇｃ～約１×１０^１３ｇｃ、約１×１０^１２ｇｃ～約１×１０^１４ｇｃ、または約１３ｇｃ～約１×１０^１４ｇｃである。一部の実施形態では、対象当たり、または対象の処置面積当たりの投与される用量は、約１×１０^１０ｇｃ、約１×１０^１１ｇｃ、約１×１０^１２ｇｃ、約１×１０^１３ｇｃ、または約１×１０^１４ｇｃである。部の実施形態では、対象当たり、または対象の処置面積当たりの投与される用量は、少なくとも約１×１０^１０ｇｃ、約１×１０^１１ｇｃ、約１×１０^１２ｇｃ、または約１×１０^１３ｇｃである。一部の実施形態では、対象当たり、または対象の処置面積当たりの投与される用量は、多くて約１×１０^１１ｇｃ、約１×１０^１２ｇｃ、約１×１０^１３ｇｃ、または約１×１０^１４ｇｃである。

一部の実施形態では、治療有効量の本開示の系を投与することにより、標的核酸の発現および／または標的核酸からのタンパク質の産生が対照（例えば、無処置）と比較して回復する。一部の実施形態では、対象当たりまたは対象の処置面積当たり約１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、または１×１０^１１ｇｃを含めた、約１×１０^１０ｇｃ～約１×１０^１１を含む、約１×１０^１０ｇｃ～約１×１０^１４ｇｃの用量を含む治療有効量の本開示の系を投与することにより、標的核酸の発現および／または標的核酸からのタンパク質の産生が対照（例えば、無処置）と比較して回復する。一部の実施形態では、対照発現と比較した発現の回復は、約２０％～１００％、またはそれよりも大きい。一部の実施形態では、対照発現と比較した発現の回復は、約２０％～約１００％、またはそれよりも大きい。一部の実施形態では、対照発現と比較した発現の回復は、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約７５％、約２０％～約８０％、約２０％～約８５％、約２０％～約９０％、約２０％～約９５％、約２０％～約１００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約７５％、約３０％～約８０％、約３０％～約８５％、約３０％～約９０％、約３０％～約９５％、約３０％～約１００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約７５％、約４０％～約８０％、約４０％～約８５％、約４０％～約９０％、約４０％～約９５％、約４０％～約１００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約７５％、約５０％～約８０％、約５０％～約８５％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～約１００％、約６０％～約７０％、約６０％～約７５％、約６０％～約８０％、約６０％～約８５％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～約１００％、約７０％～約７５％、約７０％～約８０％、約７０％～約８５％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～約１００％、約７５％～約８０％、約７５％～約８５％、約７５％～約９０％、約７５％～約９５％、約７５％～約１００％、約８０％～約８５％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８０％～約１００％、約８５％～約９０％、約８５％～約９５％、約８５％～約１００％、約９０％～約９５％、約９０％～約１００％、または約９５％～約１００％、またはそれよりも大きい。一部の実施形態では、対照発現と比較した発現の回復は、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％、またはそれよりも大きい。一部の実施形態では、対照発現と比較した発現の回復は、少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％、またはそれよりも大きい。一部の実施形態では、対照発現と比較した発現の回復は、多くとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％、またはそれよりも大きい。一部の実施形態では、回復するタンパク質はジストロフィンであり、処置領域は筋肉または筋肉群である。一部の実施形態では、筋肉または筋肉群は、試験動物、例えばマウスの後肢の前脛骨筋（ＴＡ）である。一部の実施形態では、投与は、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、髄腔内、腫瘍内、骨内、または静脈内）によるものである。

一部の実施形態では、治療有効量の本開示の系を投与することにより、標的核酸の発現および／または標的核酸からのタンパク質の産生が対照（例えば、無処置）と比較して低減する。一部の実施形態では、対象当たりまたは対象の処置面積当たり約１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、または１×１０^１１ｇｃを含めた、約１×１０^１０ｇｃ～約１×１０^１１を含む、約１×１０^１０ｇｃ～約１×１０^１４ｇｃの用量を含む治療有効量の本開示の系を投与することにより、標的核酸の発現および／または標的核酸からのタンパク質の産生が対照（例えば、無処置）と比較して低減する。一部の実施形態では、対照発現と比較した発現の低減は約２０％～１００％である。一部の実施形態では、対照発現と比較した発現の低減は約２０％～約１００％である。一部の実施形態では、対照発現と比較した発現の低減は約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約７５％、約２０％～約８０％、約２０％～約８５％、約２０％～約９０％、約２０％～約９５％、約２０％～約１００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約７５％、約３０％～約８０％、約３０％～約８５％、約３０％～約９０％、約３０％～約９５％、約３０％～約１００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約７５％、約４０％～約８０％、約４０％～約８５％、約４０％～約９０％、約４０％～約９５％、約４０％～約１００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約７５％、約５０％～約８０％、約５０％～約８５％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～約１００％、約６０％～約７０％、約６０％～約７５％、約６０％～約８０％、約６０％～約８５％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～約１００％、約７０％～約７５％、約７０％～約８０％、約７０％～約８５％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～約１００％、約７５％～約８０％、約７５％～約８５％、約７５％～約９０％、約７５％～約９５％、約７５％～約１００％、約８０％～約８５％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８０％～約１００％、約８５％～約９０％、約８５％～約９５％、約８５％～約１００％、約９０％～約９５％、約９０％～約１００％、または約９５％～約１００％である。一部の実施形態では、対照発現と比較した発現の低減は約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％である。一部の実施形態では、対照発現と比較した発現の低減は少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％である。一部の実施形態では、対照発現と比較した発現の低減は多くとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％である。

血液中のＡＡＶカプシド特異的Ｔ細胞などの有害な症状が発生した場合、コルチコステロイドを投与することができる（例えば、Nathwani et al., N Engl J Med. 365 (25): 2357-65, 2011を参照されたい）。

本明細書に開示される方法を用いて処置することができる疾患としては、任意の血液の遺伝子疾患（例えば、鎌状赤血球症、原発性免疫不全疾患）、ＨＩＶ（例えばＨＩＶ－１）、および血液悪性腫瘍またはがんが挙げられる。原発性免疫不全疾患およびそれらの対応する変異の例としては、Al-Herz et al. (Frontiers in Immunology, volume 5, article 162, April 22, 2014、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に列挙されているものが挙げられる。血液悪性腫瘍またはがんは、血液、骨髄、およびリンパ節に影響を及ぼす腫瘍である。例としては、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性単球性白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、および骨髄腫が挙げられる。一部の実施例では、疾患は単一遺伝子疾患である。表１に本明細書に開示される系および方法によって標的化することができる例示的な障害および遺伝子の一覧を提示する。さらなる例がｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｄｉｓｅａｓｅｓ－ｂｙ－ｃａｔｅｇｏｒｙ／５／ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ－ａｎｄ－ｇｅｎｅｔｉｃ－ｄｉｓｅａｓｅｓ（一覧が参照により本明細書に組み込まれる）に提示される。タンパク質の欠失（例えば、劣性変異）またはタンパク質の不足によって引き起こされるあらゆる遺伝子疾患に本明細書に開示される系および方法が有益であり得る。遺伝子のコード領域が比較的小さい場合、本明細書に開示される系および方法は、遺伝子発現を妥当な細胞型に妥当なレベルで方向付けるための組織特異的プロモーターまたは特異的非コードＲＮＡセグメントなどの調節配列を付加するために有用である。
表4: 例示的な障害および対応する変異

本明細書に開示される方法および系の使用を、表１に列挙されている障害のいずれかまたは他の公知の遺伝障害を処置するために使用することができる。本明細書に開示される方法は、がん細胞において毒素またはチミジンキナーゼなどの治療用タンパク質を発現させることが有益であり得るがんなどの他の障害を処置するためにも使用することができる。全長チミジンキナーゼを発現する本明細書に提示される２つまたはそれよりも多くの合成分子を対象に投与する場合、対象にガンシクロビルも投与する。処置により、障害の全ての特徴を１００％除去する必要はないが、それらを低減することができる。特定の実施例を以下に提示するが、この教示に基づいて、他の障害の症状に同様に影響を及ぼすことができることが理解されよう。例えば、本明細書に開示される方法を使用して、対象によって発現されないかもしくは発現が低減しているタンパク質の発現を増大させること、または対象によって望ましくなく発現されるかもしくは発現が低減しているタンパク質の発現を低減することができる。例えば、本明細書に開示される方法を使用して、遺伝子疾患の望ましくない影響を処置または低減することができる。

例えば、本明細書に開示される方法および系により、ヘモグロビンの全長野生型β－グロビン鎖を発現させることによって鎌状赤血球症の望ましくない影響を処置または低減することができる。一実施例では、本明細書に開示される方法により、レシピエント対象における鎌状赤血球症の症状（例えば、血液中の鎌状赤血球の存在、疼痛、虚血、壊死、貧血、血管閉塞性発作、無形成発作、脾臓血球貯留発作（splenic sequestration crisis）、および溶血性発作のうちの１つまたは複数）が低減し、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％低減する（治療用核酸分子を投与しない場合と比較して）。一実施例では、本明細書に開示される方法により、レシピエント対象における鎌状赤血球の数が減少し、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少する（治療用核酸分子を投与しない場合と比較して）。

例えば、本明細書に開示される方法および系により、全長野生型第Ｖ因子ライデンまたはプロトロンビン遺伝子を発現させることによって血栓形成傾向の望ましくない影響を処置または低減することができる。一実施例では、本明細書に開示される方法により、レシピエント対象（recipie7nt subject）における血栓形成傾向の症状（例えば、深部静脈血栓症などの血栓症、肺塞栓症、静脈血栓塞栓症、腫脹、胸痛、動悸のうちの１つまたは複数）が低減し、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％の低減である（治療用核酸分子を投与しない場合と比較して）。一実施例では、本明細書に開示される方法により、レシピエント対象における凝固因子の活性が低下し、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の低下である（治療用核酸分子を投与しない場合と比較して）。

例えば、本明細書に開示される方法および系により、全長野生型ＣＤ４０リガンド遺伝子を発現させることによってＣＤ４０リガンド欠損症の望ましくない影響を処置または低減することができる。一実施例では、本明細書に開示される方法により、レシピエント対象におけるＣＤ４０リガンド欠損症（例えば、血清中ＩｇＭの上昇、他の免疫グロブリンの低血清中レベル、日和見感染症、自己免疫および悪性腫瘍のうちの１つまたは複数）の症状が低減し、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％の低減である（治療用核酸分子を投与しない場合と比較して）。一実施例では、本明細書に開示される方法により、レシピエント対象におけるＣＤ４０リガンド欠損の量または活性が増大し、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも５００％の増大である（治療用核酸分子を投与しない場合と比較して）。

例えば、本明細書に開示される方法を使用して、遺伝子欠陥に起因する原発性免疫不全疾患の望ましくない影響を処置または低減することができる。例えば、本明細書に開示される方法および系（例えばＡＡＶを使用し、２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を使用して対象において欠如しているかまたは欠陥がある機能的タンパク質を発現させることができる）により、原発性免疫不全疾患の望ましくない影響を処置または低減することができる。一実施例では、本明細書に開示される方法により、レシピエント対象における原発性免疫不全疾患の症状（例えば、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、リンパ腺腫脹、脾腫、創傷、および体重減少のうちの１つまたは複数）が低減し、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％の低減である（治療用核酸分子を投与しない場合と比較して）。一実施例では、本明細書に開示される方法により、原発性免疫不全障害を有するレシピエント対象における免疫細胞（例えば、ＣＤ８細胞などのＴ細胞）の数が増加し、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％の増加である（治療用核酸分子を投与しない場合と比較して）。一実施例では、本明細書に開示される方法により、原発性免疫不全障害を有するレシピエント対象における感染症（例えば、細菌、ウイルス、真菌、またはこれらの組合せ）の数が一定期間にわたって（例えば、１年を超えて）減少し、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の減少である（治療用核酸分子を投与しない場合と比較して）。

例えば、本明細書に開示される方法を使用して、単一遺伝子障害の望ましくない影響を処置または低減することができる。例えば、本明細書に開示される方法（例えばＡＡＶを使用し、２つまたはそれよりも多くの合成核酸分子を使用して対象において欠如しているかまたは欠陥がある機能的タンパク質を発現させることができる）により、単一遺伝子障害の望ましくない影響を処置または低減することができる。一実施例では、本明細書に開示される方法により、レシピエント対象における単一遺伝子障害の症状が低減し、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％の低減である（治療用核酸分子を投与しない場合と比較して）。一実施例では、本明細書に開示される方法により、単一遺伝子障害を有するレシピエント対象では通常発現されない正常なタンパク質の量が増加し、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％の増加である（治療用核酸分子を投与しない場合と比較して）。

例えば、本明細書に開示される方法を使用して、レシピエント対象における血液悪性腫瘍の望ましくない影響を処置または低減することができる。一実施例では、本明細書に開示される方法により、レシピエント対象（例えば、白血病を有する対象）における異常な白血球（例えばＢ細胞）の数が減少し、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％の減少である（本明細書に開示される治療を施行しない場合と比較して）。一実施例では、本明細書に開示される治療の施行は、リンパ腫の望ましくない影響を処置または低減する、例えば、リンパ腫のサイズ、リンパ腫の体積、リンパ腫の成長速度、リンパ腫の転移を低減するために使用することができ、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％の低減である（本明細書に開示される治療を施行しない場合と比較して）。一実施例では、本明細書に開示される治療の施行は、多発性骨髄腫の望ましくない影響を処置または低減する、例えば、レシピエント対象における異常な形質細胞の数を減少させるために使用することができ、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％の減少である（本明細書に開示される治療を施行しない場合と比較して）。

例えば、本明細書に開示される方法を使用して、レシピエント対象における遺伝子欠陥に起因するものなどの悪性腫瘍の望ましくない影響を処置または低減することができる。一実施例では、本明細書に開示される方法により、レシピエント対象（例えば、本明細書において列挙されているがんを有する対象）におけるがん細胞の数、腫瘍のサイズ、腫瘍の体積、または転移の数が低減し、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％の低減である（本明細書に開示される治療を施行しない場合と比較して）。一実施例では、本明細書に開示される治療の施行は、リンパ腫の望ましくない影響を処置または低減する、例えば、腫瘍のサイズ、腫瘍の体積、がんの成長速度、がんの転移を低減するために使用することができ、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％の低減である（本明細書に開示される治療を施行しない場合と比較して）。

例えば、本明細書に開示される方法を使用して、レシピエント対象における遺伝子欠陥に起因する神経疾患の望ましくない影響を処置または低減することができる。一実施例では、本明細書に開示される方法により、レシピエント対象（例えば、上に列挙されている神経疾患を有する対象）における神経機能が増大し、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％の増大である（本明細書に開示される治療を施行しない場合と比較して）。
ＶＩ．例示的な実施形態

１核酸編集タンパク質を発現させるための組成物であって、
（ａ）第１のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、
（ｉ）前記核酸編集タンパク質のＮ末端部分のコード配列；
（ｉｉ）スプライスドナー；および
（ｉｉｉ）第１の二量体形成ドメイン
を含む、第１のＲＮＡ分子；ならびに
（ｂ）第２のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、
（ｉ）前記第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；
（ｉｉ）分岐点配列；
（ｉｉｉ）ポリピリミジントラクト；
（ｉｖ）スプライスアクセプター；および
（ｖ）前記核酸編集タンパク質のＣ末端部分のコード配列
を含む、第２のＲＮＡ分子；
（ｃ）必要に応じて、第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第３のＲＮＡ分子であって、前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡが、前記核酸編集タンパク質を前記第１の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第３のＲＮＡ分子；
（ｄ）必要に応じて、（ｉ）前記核酸編集タンパク質を前記第１の核酸分子上の同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、前記第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第２のｇＲＮＡ、または（ｉｉ）前記核酸編集タンパク質を第２の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、前記第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第２のｇＲＮＡを含む、第４のＲＮＡ分子、
（ｅ）必要に応じて、（ｉ）前記核酸編集タンパク質を前記第１の核酸分子上の前記第１のｇＲＮＡおよび前記第２のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、前記第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、（ｉｉ）前記核酸編集タンパク質を前記第２の核酸分子上の前記第２のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、前記第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、または（ｉｉｉ）前記核酸編集タンパク質を第３の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、前記第３の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｇＲＮＡを含む、第５のＲＮＡ分子；ならびに
（ｆ）必要に応じて、（ｉ）前記核酸編集タンパク質を前記第１の核酸分子上の前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、および前記第３のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、前記第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、（ｉｉ）前記核酸編集タンパク質を前記第２の核酸分子上の前記第２のｇＲＮＡのおよび前記第３のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、前記第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）前記核酸編集タンパク質を前記第３の標的核酸分子上の前記第３のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、前記第３の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、または（ｉｖ）前記核酸編集タンパク質を第４の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、前記第４の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡを含む、第６のＲＮＡ分子
を含む、組成物。

２前記第１の二量体形成ドメインと前記第２の二量体形成ドメインが、直接結合、間接結合、またはこれらの組合せによって結合している、実施形態１に記載の組成物。

３直接結合または間接結合が、塩基対合相互作用、非標準的な塩基対合相互作用、非塩基対合相互作用、またはこれらの組合せを含む、実施形態２に記載の組成物。

４直接結合が、キッシングループ間または低多様性領域間の塩基対合相互作用を含む、実施形態２または３に記載の組成物。

５直接結合が、アプタマー領域間の非標準的な塩基対合相互作用、非標準的な塩基対合相互作用、非塩基対合相互作用、またはこれらの組合せを含む、実施形態２または３に記載の組成物。

６間接結合が、核酸架橋を通じた塩基対合相互作用を含む、実施形態２または３に記載の組成物。

７間接結合が、アプタマーとアプタマーの標的との間、または２つのアプタマー間の非塩基対合相互作用を含む、実施形態２に記載の組成物。

８前記第１の二量体形成ドメインまたは前記第２の二量体形成ドメインが、潜在スプライスアクセプターを含まない、実施形態１から７までのいずれか一項に記載の組成物。

９前記二量体形成ドメインが、アプタマー配列二量体形成ドメインと直接結合しているかまたは間接的に結合している、実施形態１から８までのいずれか一項に記載の組成物。

１０前記二量体形成ドメインが、キッシングループ相互作用ドメインである、実施形態１から９までのいずれか一項に記載の組成物。

１１前記標的編集部位が、疾患に関連する標的核酸分子または標的核酸分子の調節領域の一部である、実施形態１から１０までのいずれか一項に記載の組成物。

１２前記疾患が、単一遺伝子疾患である、実施形態１１に記載の組成物。

１３前記第１の標的核酸分子、前記第２の標的核酸分子、前記第３の標的核酸分子、および／または前記第４の標的核酸分子が、前記疾患をもたらす１つまたは複数の点変異を含む、実施形態１から１２までのいずれか一項に記載の組成物。

１４前記疾患ならびに前記第１の標的核酸分子、前記第２の標的核酸分子、前記第３の標的核酸分子、および／または前記第４の標的核酸分子が、表１～４に列挙されているものである、実施形態１１から１３までのいずれか一項に記載の組成物。

１５前記第１のＲＮＡ分子が、前記スプライスドナーに対して３’側であり前記第１の二量体形成ドメインに対して５’側の下流イントロンスプライスエンハンサー（ＤＩＳＥ）、前記スプライスドナーに対して３’側であり前記第１の二量体形成ドメインに対して５’側のイントロンスプライスエンハンサー（ＩＳＥ）のうちの一方もしくは両方をさらに含む；および／または

前記第２のＲＮＡ分子が、前記第２の二量体形成ドメインに対して３’側であり前記分岐点配列に対して５’側のＩＳＥ、および前記スプライスドナーに対して３’側であり前記二量体形成ドメインに対して５’側のＤＩＳＥのうちの一方もしくは両方をさらに含む；
またはこれらの任意の組合せである、実施形態１から１４までのいずれか一項に記載の組成物。

１６前記第１のＲＮＡ分子が、前記スプライスドナーに対して３’側の任意の場所に位置を占めた自己切断性ＲＮＡ配列またはＲＮＡ切断酵素標的配列をさらに含み、したがって、３’に位置するポリアデニル化尾部を切断して、組み換えられていないＲＮＡ分子からのタンパク質断片の発現を低減または抑制するか；
前記第２のＲＮＡ分子が、前記分岐点配列に対して５’側の任意の場所に位置を占めた自己切断性ＲＮＡ配列またはＲＮＡ切断酵素標的配列をさらに含み、したがって、５’に位置するＲＮＡキャップを切断して、組み換えられていないＲＮＡ分子からのタンパク質断片の発現を低減または抑制するか；
前記第２のＲＮＡ分子が、前記スプライスアクセプターの３’側にあるオープンリーディングフレームに関してシフトされる開始コドンを前記分岐点配列に対して５’側の任意の場所にさらに含んで、組み換えられていないＲＮＡ分子からの核酸編集タンパク質断片の翻訳を低減または抑制するか；
前記第１のＲＮＡ分子が、前記スプライスドナーに対して３’側の任意の場所にマイクロＲＮＡ標的部位をさらに含み、したがって、結合していないＲＮＡ断片が核の外側に出るとマイクロＲＮＡ依存性分解を受けるか；
前記第２のＲＮＡ分子が、前記コード配列に対して３’側の任意の場所にマイクロＲＮＡ標的部位をさらに含み、したがって、結合していないＲＮＡ断片が核の外側に出るとマイクロＲＮＡ依存性分解を受けるか；
前記第１のＲＮＡ分子が、デグロンタンパク質分解タグをコードする配列を、前記スプライスドナーに対して３’側の任意の場所に前記スプライスドナー部位の５’側にある前記核酸編集タンパク質のオープンリーディングフレームとインフレームになるようにさらに含み、したがって、結合していないタンパク質断片が分解に関してタグ付けされるか；
前記第２のＲＮＡ分子が、開始コドンおよびインフレームのデグロンタンパク質分解タグを、前記分岐点配列に対して５’側の任意の場所に前記スプライスアクセプター部位の３’側の前記核酸編集タンパク質のオープンリーディングフレームとインフレームになるようにさらに含み、したがって、結合していないタンパク質断片が分解に関してタグ付けされるか；
またはこれらの任意の組合せである、実施形態１から１５までのいずれか一項に記載の組成物。

１７前記核酸編集タンパク質が、Ｃａｓヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを含む、実施形態１から１６までのいずれか一項に記載の組成物。

１８前記第１の標的核酸分子、前記第２の標的核酸分子、前記第３の標的核酸分子、および／または前記第４の標的核酸分子が、標的ＤＮＡ分子であり、前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、および／または第４のｇＲＮＡが、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、実施形態１から１７までのいずれか一項に記載の組成物。

１９前記核酸編集タンパク質が、Ｃａｓ９または死んだＣａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む、実施形態１８に記載の組成物。

２０前記Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号２０８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含み、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能し得るか；
前記Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号２０７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む配列によってコードされ、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするか；
前記ｄＣａｓ９タンパク質が、配列番号２１０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含み、触媒として不活性であるか；
前記ｄＣａｓ９タンパク質が、配列番号２０９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む配列によってコードされ、触媒として不活性であるタンパク質をコードする、実施形態１９に記載の組成物。

２１前記Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９が、融合タンパク質の一部である、実施形態１９または２０に記載の組成物。

２２前記融合タンパク質が、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９と、転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＣＢＰ、ＳＥＴ７／９、またはこれらの任意の組合せ；
シトシン塩基エディター（ＣＢＥ）、例えば、ウミヤツメ由来のもの［ＡＩＤ］、ＣＤＡ１、またはＡＰＯＢＥＣ３Ｇ；
バクテリオファージタンパク質Ｇａｍ；および
アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、ＡＢＥ６．３、７．８、７．９、７．１０、ＡＢＥｍａｘ、ＡＢＥ８ｅ（ＴａｄＡ－８ｅＶ１０６Ｗ）などのＡＢＥ８ｓのうちの１つまたは複数とを含む、実施形態２１に記載の組成物。

２３前記第１の標的核酸分子、前記第２の標的核酸分子、前記第３の標的核酸分子、および／または前記第４の標的核酸分子が、標的ＲＮＡであり、前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、および／または第４のｇＲＮＡが、１つまたは複数のダイレクトリピートおよび１つまたは複数のスペーサーを含む、実施形態１から１７までのいずれか一項に記載の組成物。

２４前記核酸編集タンパク質が、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄまたは死んだＣａｓ１３ｄ（ｄＣａｓ１３ｄ）を含む、実施形態２３に記載の組成物。

２５前記Ｃａｓ１３ｄタンパク質が、配列番号２１２、２１５、または２２２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含み、ＲＮＡ誘導型ＲＮＡエンドヌクレアーゼとして機能し得るか；
前記Ｃａｓ１３ｄタンパク質が、配列番号２１１または２１３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む配列によってコードされ、ＲＮＡ誘導型ＲＮＡエンドヌクレアーゼをコードするか；
前記ｄＣａｓ１３ｄタンパク質が、配列番号２１５または２１６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含み、触媒として不活性であるか；
前記ｄＣａｓ１３ｄタンパク質が、配列番号２１５または２１６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むタンパク質をコードし、触媒として不活性であるタンパク質をコードする配列によってコードされる、実施形態２４に記載の組成物。

２６前記Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄが、融合タンパク質の一部である、実施形態２４または２５に記載の組成物。

２７前記融合タンパク質が、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄと、
転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＣＢＰ、ＳＥＴ７／９、またはこれらの任意の組合せ；
シトシン塩基エディター（ＣＢＥ）、例えば、ウミヤツメ由来のもの［ＡＩＤ］、ＣＤＡ１、またはＡＰＯＢＥＣ３Ｇ；
バクテリオファージタンパク質Ｇａｍ；および
アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、ＡＢＥ６．３、７．８、７．９、７．１０、ＡＢＥｍａｘ、ＡＢＥ８ｅ（ＴａｄＡ－８ｅＶ１０６Ｗ）などのＡＢＥ８ｓのうちの１つまたは複数とを含む、実施形態２６に記載の組成物。

２８前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、および／または第４のｇＲＮＡが、前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、前記第３のｇＲＮＡ、および／または前記第４のｇＲＮＡのそれぞれの複数のコピーを含む、実施形態１から２７までのいずれか一項に記載の組成物。

２９前記第１のＲＮＡ分子および前記第２のＲＮＡ分子のそれぞれの５’末端および３’末端にパルボウイルス末端逆位反復配列（ＩＴＲ）をさらに含む、実施形態１から２７までのいずれか一項に記載の組成物。

３０実施形態１から２９までのいずれか一項に記載の組成物を発現させるためのＤＮＡ分子組成物であって、
（ｉ）（ａ）のＲＮＡ分子、および必要に応じて、（ｃ）のＲＮＡ分子、（ｄ）のＲＮＡ分子、または（ｃ）のＲＮＡ分子と（ｄ）のＲＮＡ分子の両方をコードする第１の合成ＤＮＡ分子；ならびに
（ｉｉ）（ｂ）のＲＮＡ分子、および必要に応じて、（ｅ）のＲＮＡ分子、（ｆ）のＲＮＡ分子、または（ｅ）のＲＮＡ分子と（ｆ）のＲＮＡ分子の両方をコードする第２の合成ＤＮＡ分子
を含む、ＤＮＡ分子組成物。

３１（ａ）前記核酸編集タンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結した第１のプロモーター；
（ｂ）前記核酸編集タンパク質のＣ末端部分をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結した第２のプロモーター
（ｃ）前記第１の合成ＤＮＡ分子が前記（ｃ）のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含む場合、前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結した第３のプロモーター；
（ｄ）前記第１の合成ＤＮＡ分子が前記（ｄ）のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含む場合、前記少なくとも１つの第２のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結した第４のプロモーター；
（ｅ）前記第２の合成ＤＮＡ分子が前記（ｅ）のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含む場合、前記少なくとも１つの第３のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結した第５のプロモーター；および
（ｆ）前記第２の合成ＤＮＡ分子が前記（ｄ）のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含む場合、前記少なくとも１つの第４のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結した第６のプロモーター
をさらに含む、実施形態３０に記載のＤＮＡ分子。

３２各プロモーターが、独立に選択される、実施形態３１に記載の組成物。

３３前記第１プロモーターと前記第２のプロモーターが同じプロモーターである；
前記第１のプロモーターと前記第２のプロモーターが異なるプロモーターである；
前記第３のプロモーター、前記第４のプロモーター、前記第５のプロモーターおよび前記第６のプロモーターが同じプロモーターである；
前記第３のプロモーター、前記第４のプロモーター、前記第５のプロモーターおよび前記第６のプロモーターが異なるプロモーターである、または
これらの組合せである、
実施形態３１または３２に記載の組成物。

３４前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターのそれぞれが、独立に、構成的プロモーター；組織特異的プロモーター；および前記核酸編集タンパク質に対して内因性のプロモーターから選択される、実施形態３０から３２までのいずれか一項に記載の組成物。

３５前記第３のプロモーター、前記第４のプロモーター、前記第５のプロモーターおよび前記第６のプロモーターのそれぞれが、Ｕ６またはＨ１プロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、実施形態３０から３４までのいずれか一項に記載の組成物。

３６実施形態３０から３５までのいずれか一項に記載の組成物を含む、核酸編集タンパク質を発現させるための系。

３７細胞に導入されると、前記ＲＮＡ分子を適当な順序で産生させ、組み換え、それにより、前記核酸編集タンパク質の全長コード配列をもたらす、実施形態３６に記載の系。

３８前記第１の合成ＲＮＡ分子と前記第２の合成ＲＮＡ分子のそれぞれが、別々のウイルスベクターから転写される、実施形態３６または３７に記載の系。

３９前記ウイルスベクターが、ＡＡＶである、実施形態３８に記載の系。

４０合成ＤＮＡ分子のそれぞれが、約２５００ｎｔ～約５０００ｎｔ、２，５００ｎｔ～約２，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，７５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ、約４，５００ｎｔ、約４，７５０ｎｔ、および約５，０００ｎｔから独立に選択されるサイズを有する、実施形態３６から３９までのいずれか一項に記載の系。

４１前記系の合成ＤＮＡ分子によってコードされる前記核酸編集タンパク質のＮ末端部分のコード配列、または前記核酸編集タンパク質のＣ末端部分のコード配列のそれぞれが、約２５００～４５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約２，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ、および約４，５００ｎｔから独立に選択されるサイズを有する、実施形態３６から４０までのいずれか一項に記載の系。

４２前記系の合成ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子のいずれか一方または両方が、それぞれ、約２５００～４５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約２，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ、および約４，５００ｎｔから独立に選択されるサイズを有する、実施形態３６から４１までのいずれか一項に記載の系。

４３実施形態３０から３５までのいずれか一項に記載の組成物を含み、
前記合成ＤＮＡ分子が、約５０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ、および約１０，０００ｎｔから選択される総サイズを有し；
総核酸編集タンパク質コード配列が、約２０００ｎｔ～約８０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、または約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔから選択され、総標的タンパク質コード配列が、約２，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、および約８，０００ｎｔであり；かつ／または、
２つの前記合成ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子の合計サイズが、約５，０００ｎｔ～約９０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、および約９，０００ｎｔから選択される、実施形態３６から４２までのいずれか一項に記載の系。

４４前記第１の二量体形成ドメインおよび前記第２の二量体形成ドメインが、それぞれ、１０００ｎｔ以下、例えば、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、５０～１０００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１５０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、または５００ｎｔであり；前記系の組換え効率が、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である、実施形態３６から４３までのいずれか一項に記載の系。

４５各二量体形成ドメインが、１０００ｎｔ以下、例えば、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、５０～１０００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１５０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、または５００ｎｔであり；前記系の組換え効率が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または約１００％である、実施形態３６から４４までのいずれか一項に記載の系。

４６ＲＮＡ組換え効率が、約１０％～約１００％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約３５％、約１０％～約４０％、約１０％～約４５％、約１０％～約５０％、約１０％～約５５％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約２０％～約３０％、約２０％～約３５％、約２０％～約４０％、約２０％～約４５％、約２０％～約５０％、約２０％～約５５％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約３０％～約３５％、約３０％～約４０％、約３０％～約４５％、約３０％～約５０％、約３０％～約５５％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３５％～約４０％、約３５％～約４５％、約３５％～約５０％、約３５％～約５５％、約３５％～約６０％、約３５％～約７０％、約３５％～約８０％、約３５％～約９０％、約４０％～約４５％、約４０％～約５０％、約４０％～約５５％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４５％～約５０％、約４５％～約５５％、約４５％～約６０％、約４５％～約７０％、約４５％～約８０％、約４５％～約９０％、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５５％～約６０％、約５５％～約７０％、約５５％～約８０％、約５５％～約９０％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約１０％、約２０％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％である、実施形態３６から４５までのいずれか一項に記載の系。

４７実施形態３６から４６までのいずれか一項に記載の系を含む組成物。

４８それぞれ核酸編集タンパク質の少なくとも一部分をコードする第１のＲＮＡ分子、第２のＲＮＡ分子、第３のＲＮＡ分子および必要に応じて第４のＲＮＡ分子を含む、実施形態４７に記載の組成物。

４９実施形態３６から４６までのいずれか一項に記載の系、または実施形態４７および４８のいずれか一項に記載の組成物を含むキットであって、前記第１の合成核酸分子、前記第２の合成核酸分子、前記第３の合成核酸分子および前記第４の合成核酸分子のいずれかが別々の容器に入っていてよく、必要に応じて薬学的に許容される担体などのバッファーをさらに含む、キット。

５０細胞において核酸編集タンパク質を発現させる方法であって、実施形態３６から４６までのいずれか一項に記載の系、または実施形態４７もしくは４８に記載の組成物を細胞に導入するステップと、前記第１のＲＮＡ分子と前記第２のＲＮＡ分子を前記細胞において発現させるステップとを含み、前記細胞において前記核酸編集タンパク質が産生される、方法。

５１前記細胞が、対象内に存在し、導入するステップが、治療有効量の前記系を前記対象に投与することを含む、実施形態５０に記載の方法。

５２前記対象における標的核酸分子の変異によって引き起こされる遺伝子疾患を処置し、前記核酸編集タンパク質および必要に応じて前記第１のｇＲＮＡおよび前記第２のｇＲＮＡの発現、ならびに前記対象における前記変異の補正をもたらす、実施形態５１に記載の方法。

５３前記遺伝子疾患が、機能喪失型変異に起因するものであり、前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡおよび／もしくは第４のｇＲＮＡが、表１に列挙されている核酸を標的とする配列を含み、前記方法により、表１に列挙されている対応する疾患が処置されるか；
前記標的核酸が、癌遺伝子であり、前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡおよび／もしくは第４のｇＲＮＡが、表２の癌遺伝子を標的とする配列を含み、前記方法により、表２に列挙されている対応するがんが処置されるか；
前記遺伝子疾患が、機能獲得型変異に起因するものであり、前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡおよび／もしくは第４のｇＲＮＡが、表３に列挙されている核酸を標的とする配列を含み、前記方法により、表３に列挙されている対応する疾患が処置されるか；または
前記遺伝子疾患が、表４に列挙されているものであり、少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡおよび／もしくは第４のｇＲＮＡが、表４に列挙されている核酸を標的とする配列を含み、前記方法により、表４に列挙されている対応する疾患が処置される、実施形態５２に記載の方法。

５４前記第１のＲＮＡ分子および前記第２のＲＮＡ分子のうちの一方または両方が、配列番号１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、２２５、および２２６のうちのいずれか１つに提示される合成イントロンに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む、実施形態３６から４６までのいずれか一項に記載の系、実施形態１から３５まで、４７および４８のいずれか一項に記載の組成物、または実施形態５０から５３までのいずれか一項に記載の方法。

５５前記第１のＲＮＡ分子および前記第２のＲＮＡ分子のうちの一方または両方が、配列番号１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、２２５、または２２６によってコードされるＲＮＡから選択される合成イントロンを含む、実施形態３６から４６までおよび５４のいずれか一項に記載の系、実施形態１から３５まで、４７および４８のいずれか一項に記載の組成物、または実施形態５０から５３までのいずれか一項に記載の方法。

５６前記第１のＲＮＡ分子および前記第２のＲＮＡ分子のうちの一方または両方が、タンパク質コード配列の一部をさらに含む、実施形態３６から４６まで、５４、および５５のいずれかに記載の系、実施形態１から１６まで、３２および３３のいずれか一項に記載の組成物、または実施形態３５から３８までのいずれか一項に記載の方法。

５７前記タンパク質コード配列の前記一部が、前記タンパク質コード配列のＮ末端側半分、Ｎ末端部分、Ｃ末端側半分、またはＣ末端部分を含む、実施形態３６から４６までおよび５４から５６までのいずれかに記載の系、実施形態１から３５まで、４７および４８のいずれか一項に記載の組成物、または実施形態５０から５３までのいずれか一項に記載の方法。

５７（ａ）第１のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、（ｉｉ）前記核酸編集タンパク質のＮ末端部分のコード配列；（ｉｉｉ）スプライスドナー；（ｉｉ－２）ＤＩＳＥ、ＩＳＥ、または両方；（ｉｖ）第１の二量体形成ドメイン；および（ｖ）少なくとも１つの第２のｇＲＮＡを含む、第１のＲＮＡ分子、ならびに（ｂ）第２のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、（ｉｉ）前記第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；（ｉ－２）少なくとも１つのＩＳＥ配列；（ｉｉｉ）分岐点配列；（ｉｉ）ポリピリミジントラクト；（ｖ）スプライスアクセプター；（ｖｉ）前記核酸編集タンパク質のＣ末端部分のコード配列、および（ｖｉｉ）少なくとも１つの第４のｇＲＮＡを含む、第２のＲＮＡ分子を含む、実施形態３６から４６までおよび５４から５６までのいずれか一項に記載の系、実施形態１から３５まで、４７および４８のいずれか一項に記載の組成物、または実施形態５０から５３までのいずれか一項に記載の方法。

５８（ａ）第１のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、（ｉｉ）前記核酸編集タンパク質のＮ末端部分のコード配列；（ｉｉｉ）スプライスドナー；（ｉｉ－２）ＤＩＳＥ、ＩＳＥ、およびＩＳＥ；および（ｉｖ）第１の二量体形成ドメイン；および（ｖ）少なくとも１つの第２のｇＲＮＡを含む、第１のＲＮＡ分子、ならびに（ｂ）第２のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、（ｉｉ）前記第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；（ｉ－２）３つのＩＳＥ配列；（ｉｉｉ）分岐点配列；（ｉｖ）ポリピリミジントラクト；（ｖ）スプライスアクセプター；（ｖｉ）前記核酸編集タンパク質のＣ末端部分のコード配列および（ｖｉｉ）少なくとも１つの第４のｇＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子を含む、実施形態３６から４６までおよび５４から５７までのいずれか一項に記載の系、実施形態１から３５まで、４７および４８のいずれか一項に記載の組成物、または実施形態５０から５３までのいずれか一項に記載の方法。

５９前記第１のＲＮＡ分子および前記第２のＲＮＡ分子のうちのいずれか１つまたは２つのそれぞれが、約２５００～４５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約２，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ、および約４，５００ｎｔから独立に選択されるサイズを有する、実施形態１から３５までのいずれか一項に記載の組成物。

６０前記総核酸編集タンパク質コード配列のサイズが、約２０００ｎｔ～約８０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、もしくは約８，０００ｎｔであり、かつ／または、
２つの前記ＲＮＡ分子の合計サイズが、約５，０００ｎｔ～約９０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、もしくは約９，０００ｎｔである、実施形態１から３５までのいずれか一項に記載の組成物。

６１前記第１の二量体形成ドメインおよび前記第２の二量体形成ドメインのそれぞれが、１０００ｎｔ以下、例えば、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、５０～１０００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１５０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、または５００ｎｔであり、前記系の組換え効率が、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である、実施形態１から３５までのいずれか一項に記載の組成物。

６２各二量体形成ドメインが、１０００ｎｔ以下、例えば、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、５０～１０００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１５０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、または５００ｎｔであり、前記系の組換え効率が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％である、実施形態１から３５までのいずれか一項に記載の組成物。

６３ＲＮＡ組換え効率が、約１０％～約１００％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約３５％、約１０％～約４０％、約１０％～約４５％、約１０％～約５０％、約１０％～約５５％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約２０％～約３０％、約２０％～約３５％、約２０％～約４０％、約２０％～約４５％、約２０％～約５０％、約２０％～約５５％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約３０％～約３５％、約３０％～約４０％、約３０％～約４５％、約３０％～約５０％、約３０％～約５５％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３５％～約４０％、約３５％～約４５％、約３５％～約５０％、約３５％～約５５％、約３５％～約６０％、約３５％～約７０％、約３５％～約８０％、約３５％～約９０％、約４０％～約４５％、約４０％～約５０％、約４０％～約５５％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４５％～約５０％、約４５％～約５５％、約４５％～約６０％、約４５％～約７０％、約４５％～約８０％、約４５％～約９０％、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５５％～約６０％、約５５％～約７０％、約５５％～約８０％、約５５％～約９０％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約１０％、約２０％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％である、実施形態１から３５までのいずれか一項に記載の組成物。

６４（ａ）前記第１のＲＮＡ分子および前記第２のＲＮＡ分子のそれぞれが、約２５００ｎｔ～４５００ｎｔであり；
（ｂ）前記総核酸編集タンパク質コード配列のサイズが、約２０００ｎｔ～約８０００ｎｔであり；かつ／または、
（ｃ）２つの前記ＲＮＡ分子の合計サイズが、約５，０００ｎｔ～約９０００ｎｔであり；
ＲＮＡ組換え効率が、約１０％～約１００％である、実施形態１から３５までのいずれか一項に記載の組成物。

６５１つまたは複数の標的核酸分子に特異的な１つまたは複数のｇＲＮＡを含む１つまたは複数の追加のＲＮＡ分子をさらに含む、実施形態１から２９までのいずれか一項に記載の組成物。

６６１つまたは複数の標的核酸分子に特異的な１つまたは複数のｇＲＮＡをコードする１つまたは複数の追加のＤＮＡ分子をさらに含む、実施形態３０から３５までのいずれか一項に記載の組成物。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の処置
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ、ＭＩＭ：３１０２００）は、進行性の筋力低下および変性を特徴とする致死的な遺伝性疾患である。疾患が進行するにつれ、変性している筋線維が脂肪および線維化組織によって置き換えられる。ＤＭＤの起源は遺伝子ジストロフィン（ＭＩＭ：３００３７７）の欠損である。ジストロフィン遺伝子は２２ｋｂｐの領域にわたり、変異を起こしやすい。したがって、ＤＭＤは、一部の場合では、疾患を引き起こす変異の家族歴を有さない患者においても散発的に顕在化し得る。ＤＭＤは、ジストロフィン異常症として公知の４つの状態のうちの１つである。この群に属する他の３つの疾患は、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ、ＤＭＤの軽症型）；ＤＭＤとＢＭＤの中間の臨床所見；および臨床的な骨格筋疾患または随意筋疾患がほとんどまたは全く伴わないＤＭＤ関連拡張型心筋症（心疾患）である。したがって、一部の実施例では、ＤＭＤ、ＢＭＤ、ＤＭＤとＢＭＤの中間の臨床所見；または臨床的な骨格筋疾患または随意筋疾患がほとんどまたは全く伴わないＤＭＤ関連拡張型心筋症（心疾患）を有する患者を、本明細書に開示される系および方法を用いて処置する。

本明細書に開示される方法および系を、ジストロフィン変異を標的とする１つまたは複数のｇＲＮＡを発現させることによってＤＭＤの単一遺伝子性の原因を処置するために使用することができる。ジストロフィンを単一のＡＡＶから発現させる現行の方法では、短くした／短縮されたバージョンのジストロフィン（マイクロジストロフィンおよびミニジストロフィン）を利用する。これらの短縮されたジストロフィン送達治療のいくつかが第Ｉ／ＩＩ相臨床試験において試験されている（ＮＣＴ０３３６２５０２、ＮＣＴ００４２８９３５、ＮＣＴ０３３６８７４２、ＮＣＴ０３３７５１６４）。これらの短縮されたバージョンのジストロフィンは、ＤＭＤにおけるジストロフィン欠損の最悪の結果を好転させることはできるが、短縮されたバージョンでは全長タンパク質のロッド領域およびヒンジ領域の重要なドメインが欠如しているので、全長ジストロフィンと比較して完全な機能性を有さないことが予測される。本明細書に開示される方法および系では、「多重化された」ＡＡＶの組合せを使用することにより、高い感染効率（ＭＯＩ、すなわち、高力価）で導入した場合に複数のＡＡＶウイルスを同じ細胞に効率的に感染させることができるので、ＡＡＶのトランスジェニックペイロードのサイズ制限が緩和される。

したがって、一部の実施例では、組み換えられると全長核酸エディタータンパク質コード配列が生じる、２つ、３つ、４つまたは５つの異なる合成ＲＮＡ分子（それぞれ異なるＡＡＶとして）を含むセットなど、開示される合成分子のセットの１つをそれぞれが含有する２つまたはそれよりも多くのＡＡＶを含む組成物をＤＭＤ対象に治療有効量で投与し（例えば、ｉ．ｖ．）、ここで、組成物は、ジストロフィン変異を標的とする１つまたは複数のｇＲＮＡをさらに含む。
ＶＩＩ．例示的な実施形態－２

１．標的タンパク質を発現させるための系であって、（ａ）５’から３’に：標的タンパク質のＮ末端部分のコード配列；スプライスドナー；および第１の二量体形成ドメインを含むＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第１のプロモーターを含む第１の合成核酸分子；ならびに（ｂ）５’から３’に：第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；分岐点配列；ポリピリミジントラクト；スプライスアクセプター；および標的タンパク質のＣ末端部分のコード配列を含むＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第２のプロモーターを含む第２の合成核酸分子を含む、系。

２．標的タンパク質を発現させるための系であって、（ａ）５’から３’に：標的タンパク質のＮ末端部分のコード配列；スプライスドナー；および第１の二量体形成ドメインを含むＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第１のプロモーターを含む第１の合成核酸分子；ならびに（ｂ）５’から３’に：第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；分岐点配列；ポリピリミジントラクト；スプライスアクセプター；および標的タンパク質の中間部分のコード配列；第２のスプライスドナー；および第３の二量体形成ドメインを含むＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第２のプロモーターを含む第２の合成核酸分子；ならびに（ｃ）５’から３’に：第３の二量体形成ドメインに結合する第４の二量体形成ドメイン；分岐点配列；ポリピリミジントラクト；スプライスアクセプター；および標的タンパク質のＣ末端部分のコード配列を含むＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第３のプロモーターを含む第３の合成核酸分子を含む、系。

３．標的タンパク質を発現させるための系であって、
（ａ）５’から３’に：標的タンパク質のＮ末端部分のコード配列、スプライスドナー、および第１の二量体形成ドメインを含むＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第１のプロモーターを含む第１の合成核酸分子；（ｂ）５’から３’に：第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；分岐点配列；ポリピリミジントラクト；スプライスアクセプター；および標的タンパク質の中間部分のコード配列；第２のスプライスドナー；および第３の二量体形成ドメインを含むＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第２のプロモーターを含む第２の合成核酸分子；ならびに（ｃ）５’から３’に：第３の二量体形成ドメインに結合する第４の二量体形成ドメイン；分岐点配列；ポリピリミジントラクト；スプライスアクセプター；および標的タンパク質の第１の中間部分のコード配列；第２のスプライスドナー；および第５の二量体形成ドメインを含むＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第３のプロモーターを含む第３の合成核酸分子；ならびに（ｃ）５’から３’に：第５の二量体形成ドメインに結合する第６の二量体形成ドメイン；分岐点配列；ポリピリミジントラクト；スプライスアクセプター；および標的タンパク質のＣ末端部分のコード配列を含むＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第４のプロモーターを含む第４の合成核酸分子を含む、系。

４．各プロモーターが、独立に選択される、実施形態１から３までのいずれか１つの系。

５．第１のプロモーターと第２のプロモーターが同じプロモーターである；第１のプロモーターと第２のプロモーターが異なるプロモーターである；第１のプロモーター、第２のプロモーター、および第３のプロモーターが同じプロモーターである；第１のプロモーター、第２のプロモーター、および第３のプロモーターが異なるプロモーターである；第１のプロモーター、第２のプロモーター、第３のプロモーター、および第４のプロモーターが同じプロモーターである；または、第１のプロモーター、第２のプロモーター、第３のプロモーターおよび第４のプロモーターが異なるプロモーターである、実施形態１から４までのいずれか１つの系。

６．第１のプロモーター、第２のプロモーター、第３のプロモーター、および第４のプロモーターのそれぞれが、独立に、構成的プロモーター；組織特異的プロモーター；および標的タンパク質に対して内因性のプロモーターから選択される、実施形態１から５までのいずれか１つの系。

７．第１の二量体形成ドメインと第２の二量体形成ドメイン、第３の二量体形成ドメインと第４の二量体形成ドメイン、および／または第５の二量体形成ドメインと第６の二量体形成ドメインが、直接結合、間接結合、またはこれらの組合せによって結合している、実施形態１から６までのいずれか１つの系。

８．直接結合または間接結合が、塩基対合相互作用、非標準的な塩基対合相互作用、非塩基対合相互作用、またはこれらの組合せを含む、請求項７に記載の組成物。

９．直接結合が、キッシングループ間または低多様性領域間の塩基対合相互作用を含む、請求項７または８の組成物。

１０．直接結合が、アプタマー領域間の非標準的な塩基対合相互作用、非標準的な塩基対合相互作用、非塩基対合相互作用、またはこれらの組合せを含む、請求項７または８の組成物。

１１．間接結合が、核酸架橋を通じた塩基対合相互作用を含む、請求項７または８の組成物。

１２．間接結合が、アプタマーとアプタマーの標的との間、または２つのアプタマー間の非塩基対合相互作用を含む、請求項７または８の組成物。

１３．第１の二量体形成ドメイン、第２の二量体形成ドメイン、第３の二量体形成ドメイン、第４の二量体形成ドメイン、第５の二量体形成ドメインおよび／または第６の二量体形成ドメインが、潜在スプライスアクセプターを含まない、実施形態１から１２までのいずれか１つの系。

１４．直接結合しているかまたは間接的に結合しているアプタマー配列二量体形成ドメインの対を少なくとも１つ含む、実施形態１から１３までのいずれか１つの系。

１５．キッシングループ相互作用二量体形成ドメインの対を少なくとも１つ含む、実施形態１から１４までのいずれか１つの系。

１６．標的タンパク質が、疾患に関連するタンパク質、または治療用タンパク質である、実施形態１から１５までのいずれか１つの系。

１７．疾患が、単一遺伝子疾患である、実施形態１６の系。

１８．治療用タンパク質が、毒素である、実施形態１７の系。

１９．疾患および標的タンパク質が、表１に列挙されているものである、実施形態１６から１８までのいずれか１つの系。

２０．第１の合成核酸分子、第２の合成核酸分子、第３の合成核酸分子、および／または第４の合成核酸分子が、第１の合成核酸分子、第２の合成核酸分子、第３の合成核酸分子、または第４の合成核酸分子の３’末端にポリアデニル化配列をさらに含む、実施形態１から１９までのいずれか１つの系。

２１．第１の合成核酸分子が、スプライスドナーに対して３’側かつ第１の二量体形成ドメインに対して５’側の下流イントロンスプライスエンハンサー（ＤＩＳＥ）、スプライスドナーに対して３’側かつ第１の二量体形成ドメインに対して５’側のイントロンスプライスエンハンサー（ＩＳＥ）の一方または両方をさらに含む；ならびに／または、第２の合成核酸分子が、第２の二量体形成ドメインに対して３’側かつ分岐点配列に対して５’側のＩＳＥ、およびスプライスドナーに対して３’側かつ二量体形成ドメインに対して５’側のＤＩＳＥのうちの一方または両方をさらに含む；ならびにこれらの任意の組合せである、実施形態１または４から２０までのいずれか１つの系。

２２．第１の合成核酸分子が、第１のスプライスドナーに対して３’側かつ第１の二量体形成ドメインに対して５’側のＤＩＳＥ、第１のスプライスドナーに対して３’側かつ第１の二量体形成ドメインに対して５’側のＩＳＥ、またはＤＩＳＥとＩＳＥの両方をさらに含む；第２の合成核酸分子が、第２の二量体形成ドメインに対して３’側かつ第１の分岐点配列に対して５’側のＩＳＥ、第２のスプライスドナーに対して３’側かつ第２の二量体形成ドメインに対して５’側のＤＩＳＥ、第２のスプライスドナーに対して３’側かつ第３の二量体形成ドメインに対して５’側のＩＳＥ、もしくはこれらの組合せをさらに含む；ならびに／または第３の合成核酸分子が、第４の二量体形成ドメインに対して３’側かつ第２の分岐点配列に対して５’側のＩＳＥをさらに含む；ならびにこれらの任意の組合せである、実施形態２または４から２０までのいずれか１つの系。

２３．第１の合成核酸分子が、第１のスプライスドナーに対して３’側かつ第１の二量体形成ドメインに対して５’側のＤＩＳＥ、第１のスプライスドナーに対して３’側かつ第１の二量体形成ドメインに対して５’側のＩＳＥ、またはＤＩＳＥとＩＳＥの両方をさらに含む；第２の合成核酸分子が、第２の二量体形成ドメインに対して３’側かつ第１の分岐点配列に対して５’側のＩＳＥ、第２のスプライスドナーに対して３’側かつ第２の二量体形成ドメインに対して５’側のＤＩＳＥ、第２のスプライスドナーに対して３’側かつ第３の二量体形成ドメインに対して５’側のＩＳＥ、もしくはこれらの組合せをさらに含む；第３の合成核酸分子が、第４の二量体形成ドメインに対して３’側かつ第２の分岐点配列に対して５’側のＩＳＥをさらに含む；ならびに／または第４の合成核酸分子が、第５の二量体形成ドメインに対して３’側かつ第３の分岐点配列に対して５’側のＩＳＥ、第３のスプライスドナーに対して３’側かつ第５の二量体形成ドメインに対して５’側のＤＩＳＥ、第３のスプライスドナーに対して３’側かつ第６の二量体形成ドメインに対して５’側のＩＳＥ、もしくはこれらの組合せをさらに含む；ならびにこれらの任意の組合せである、実施形態３から２０までのいずれか１つの系。

２４．細胞に導入されると、ＲＮＡ分子を適当な順序で産生させ、組み換え、それにより、標的タンパク質の全長コード配列をもたらす、実施形態１から２３までのいずれか１つの系。

２５．第１の合成核酸分子、第２の合成核酸分子、第３の合成核酸分子および第４の合成核酸分子のそれぞれが、別々のウイルスベクターの一部である、実施形態１から２４までのいずれか１つの系。

２６．ウイルスベクターが、ＡＡＶである、実施形態２５の系。

２７．
第１の合成核酸分子および／または第３の合成核酸分子が、スプライスドナーに対して３’側の任意の場所に位置を占めた自己切断性ＲＮＡ配列またはＲＮＡ切断酵素標的配列をさらに含み、したがって、当該配列により３’に位置するポリアデニル化尾部が切断されて、組み換えられていないＲＮＡ分子からのタンパク質断片の発現が低減または抑制される；
第２の合成核酸分子および／または第４の合成核酸分子が、分岐点配列に対して５’側の任意の場所に位置を占めた自己切断性ＲＮＡ配列またはＲＮＡ切断酵素標的配列をさらに含み、したがって、当該配列により５’に位置するＲＮＡキャップが切断されて、組み換えられていないＲＮＡ分子からのタンパク質断片の発現が低減または抑制される；
第２の合成核酸分子および／または第４の合成核酸分子が、スプライスアクセプターに対して３’側にあるオープンリーディングフレームに対してシフトされる開始コドンを分岐点配列に対して５’側の任意の場所にさらに含んで、組み換えられていないＲＮＡ分子からの標的タンパク質断片の翻訳が低減または抑制される；
第１の合成核酸分子および／または第３の合成核酸分子が、スプライスドナーに対して３’側の任意の場所にマイクロＲＮＡ標的部位をさらに含み、したがって、結合していないＲＮＡ断片が、核の外側に出るとマイクロＲＮＡ依存性分解を受ける；
第２の合成核酸分子および／または第４の合成核酸分子が、コード配列に対して３’側の任意の場所にマイクロＲＮＡ標的部位をさらに含み、したがって、結合していないＲＮＡ断片が、核の外側に出るとマイクロＲＮＡ依存性分解を受ける；
第１の合成核酸分子および／または第３の合成核酸分子が、デグロンタンパク質分解タグをコードする配列を、スプライスドナーに対して３’側の任意の場所にスプライスドナー部位の５’側にある標的タンパク質のオープンリーディングフレームとインフレームになるようにさらに含み、したがって、結合していないタンパク質断片が分解に関してタグ付けされる；
第２の合成核酸分子および／または第４の合成核酸分子が、開始コドンおよびインフレームのデグロンタンパク質分解タグを、分岐点配列に対して５’側の任意の場所にスプライスアクセプター部位の３’側の標的タンパク質のオープンリーディングフレームとインフレームになるようにさらに含み、したがって、結合していないタンパク質断片が分解に関してタグ付けされる；
またはこれらの組合せである、
実施形態１から２６までのいずれか１つの系。

２８．系の任意の１つ、２つ、３つ、または４つの合成核酸分子のそれぞれが、約２５００ｎｔ～約５０００ｎｔ、２，５００ｎｔ～約２，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，７５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ、約４，５００ｎｔ、約４，７５０ｎｔ、および約５，０００ｎｔから独立に選択されるサイズを有する、実施形態１から２７までのいずれか１つの系。

２９．系の合成核酸分子によってコードされる標的タンパク質のＮ末端部分のコード配列、標的タンパク質の中間部分のコード配列、または標的タンパク質のＣ末端部分のコード配列のそれぞれが、約１０００ｎｔ～約４０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約１，５００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約２，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約２，５００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約１，５００ｎｔ～約２，０００ｎｔ、約１，５００ｎｔ～約２，５００ｎｔ、約１，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約１，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約１，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約２，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ、約１，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ、および約４，０００ｎｔから独立に選択されるサイズを有する、実施形態１から２８までのいずれか１つの系。

３０．それぞれ系の１つ、２つ、３つまたは４つのいずれかの合成核酸分子によってコードされる１つ、２つ、３つ、または４つのいずれかのＲＮＡのそれぞれが、約２５００～４５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約２，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ、および約４，５００ｎｔから独立に選択されるサイズを有する、実施形態１から２９までのいずれか１つの系。

３１．合成核酸分子が、約５０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ、および約１０，０００ｎｔから選択される総サイズを有する；
総標的タンパク質コード配列が、約２０００ｎｔ～約８０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、または約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔから選択され、総標的タンパク質コード配列が、約２，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、および約８，０００ｎｔである；ならびに／または
２つの合成核酸分子によってコードされるＲＮＡが、約５，０００ｎｔ～約９０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、もしくは約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔから選択される総サイズを有し、２つの合成核酸分子によってコードされるＲＮＡが、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、および約９，０００ｎｔの総サイズを有する、
実施形態１および４から３０までのいずれか１つの系。

３２．合成核酸分子が、約７５００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、または約１４，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔから選択される総サイズを有し、合成核酸分子が、約７，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ、および約１５，０００ｎｔの総サイズを有する；
総標的タンパク質コード配列が、約３０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、もしくは約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔから選択され、総標的タンパク質コード配列が、約３，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、および約１２，０００ｎｔである；ならびに／または
３つの合成核酸分子によってコードされるＲＮＡが、約７５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、もしくは約１３，０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔから選択される総サイズを有し、２つの合成核酸分子によってコードされるＲＮＡが、約７，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、および約１３，５００ｎｔの総サイズを有する、
実施形態２および４から３０までのいずれか１つの系。

３３．合成核酸分子が、約１０，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１７，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１７，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１７，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１８，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１８，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、もしくは約１９，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔから選択される総サイズを有し、合成核酸分子が、約１０，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ、約１７，０００ｎｔ、約１８，０００ｎｔ、約１９，０００ｎｔ、および約２０，０００ｎｔの総サイズを有する；
総標的タンパク質コード配列が、約４０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、または約１５，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔから選択され、総標的タンパク質コード配列が、約５，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ、もしくは約１６，０００ｎｔであり、総標的タンパク質コード配列が、少なくとも約５，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ、および約１５，０００ｎｔである；ならびに／または、
２つの合成核酸分子によってコードされるＲＮＡが、約１０，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、もしくは約１７，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔから選択される総サイズを有し、２つの合成核酸分子によってコードされるＲＮＡが、約１０，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ、約１７，０００ｎｔ、および約１８，０００ｎｔの総サイズを有する、
実施形態３および４から３０までのいずれか１つの系。

３４．ＲＮＡ組換え効率が、約１０％～約９５％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約３５％、約１０％～約４０％、約１０％～約４５％、約１０％～約５０％、約１０％～約５５％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約２０％～約３０％、約２０％～約３５％、約２０％～約４０％、約２０％～約４５％、約２０％～約５０％、約２０％～約５５％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約３０％～約３５％、約３０％～約４０％、約３０％～約４５％、約３０％～約５０％、約３０％～約５５％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３５％～約４０％、約３５％～約４５％、約３５％～約５０％、約３５％～約５５％、約３５％～約６０％、約３５％～約７０％、約３５％～約８０％、約３５％～約９０％、約４０％～約４５％、約４０％～約５０％、約４０％～約５５％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４５％～約５０％、約４５％～約５５％、約４５％～約６０％、約４５％～約７０％、約４５％～約８０％、約４５％～約９０％、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５５％～約６０％、約５５％～約７０％、約５５％～約８０％、約５５％～約９０％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約１０％、約２０％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％、または約９５％である、実施形態１から３３までのいずれか１つの系。

３５．第１の二量体形成ドメインおよび第２の二量体形成ドメイン、第３の二量体形成ドメインおよび第４の二量体形成ドメイン、ならびに／または第５の二量体形成ドメインおよび第６の二量体形成ドメインのそれぞれが、１０００ｎｔ以下、例えば、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、５０～１０００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１５０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、または５００ｎｔであり；系の組換え効率が、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である、実施形態１から３４までのいずれか１つの系。

３６．各二量体形成ドメインが、１０００ｎｔ以下、例えば、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、５０～１０００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１５０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、または５００ｎｔであり；系の組換え効率が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％である、実施形態１から３５までのいずれか１つの系。

３７．実施形態１から３６までのいずれか１つの系を含む組成物。

３８．実施形態１から３７までのいずれか１つに記載のＲＮＡ分子を含む組成物。

３９．実施形態１から３７までのいずれか１つに記載のＲＮＡ分子を１つ、２つ、３つ、または４つ含む組成物。

４０．それぞれジストロフィン、第８因子、ＡＢＣＡ４、またはＭＹＯ７Ａの少なくとも一部分をコードする、第１の合成核酸またはＲＮＡ分子、第２の合成核酸またはＲＮＡ分子、第３の合成核酸またはＲＮＡ分子および必要に応じて第４の合成核酸またはＲＮＡ分子を含む、実施形態３７から３９までのいずれか１つの組成物。

４１．実施形態１から３６までのいずれか１つに記載のＲＮＡ分子。

４２．実施形態１から４１までのいずれか１つの系、または実施形態３７から４０までのいずれか１つの組成物を含み、第１の合成核酸分子、第２の合成核酸分子、第３の合成核酸分子および第４の合成核酸分子のいずれかが別々の容器に入っていてよく、必要に応じて薬学的に許容される担体などのバッファーをさらに含む、キット。

４３．細胞において標的タンパク質を発現させる方法であって、実施形態１から３６までのいずれか１つの系または実施形態３５から３７までのいずれか１つの組成物を細胞に導入するステップと、第１の合成ＲＮＡ分子と第２の合成ＲＮＡ分子、第１の合成ＲＮＡ分子、第２の合成ＲＮＡ分子、および第３の合成ＲＮＡ分子、または第１の合成ＲＮＡ分子、第２の合成ＲＮＡ分子、第３の合成ＲＮＡ分子および第４の合成ＲＮＡ分子を細胞において発現させるステップとを含み、細胞において標的タンパク質が産生される、方法。

４４．細胞が、対象内に存在し、導入するステップが、系を治療有効量で対象に投与することを含む、実施形態４３の方法。

４５．対象における標的タンパク質をコードする遺伝子の変異によって引き起こされる遺伝子疾患を処置し、対象における機能的標的タンパク質の発現をもたらす、実施形態４４の方法。

４６．
遺伝子疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーであり、標的タンパク質がジストロフィンである；
遺伝子疾患が血友病Ａであり、標的タンパク質がＦ８である；
遺伝子疾患がスタルガルト病であり、標的タンパク質がＡＢＣＡ４である；または
遺伝子疾患がアッシャー症候群であり、標的タンパク質がＭＹＯ７Ａである、
実施形態４５の方法。

４７．配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、１４５、１４６、１４７、１４８、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、および１６６のうちのいずれか１つに提示される合成イントロンに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む核酸分子。

４８．合成イントロンが、配列番号２０のｎｔ３７０３～３９７５、配列番号２１のｎｔ１～２２８、配列番号２２のｎｔ３７０３～３９７５、配列番号２３のｎｔ１～２２５、配列番号２４のｎｔ３５６０～３８２８、または配列番号２５のｎｔ１～２２５である、実施形態４７の核酸分子。

４９．タンパク質コード配列の一部をさらに含む、実施形態４７または４８の合成核酸分子。

５０．タンパク質コード配列の一部が、タンパク質コード配列のＮ末端側半分、Ｎ末端側の３分の１、中間部分、Ｃ末端側半分、またはＣ末端側の３分の１を含む、実施形態４９の合成核酸分子。

５１．少なくとも１つの合成核酸分子が、実施形態４７から５０までのいずれか１つに記載の核酸分子を含む合成イントロンを含む、実施形態１から３６までのいずれか１つの系または実施形態３７から４０までのいずれか１つの組成物。

５２．合成核酸が、逆転写酵素によるＲＮＡウイルスゲノムの転写によって生じたＤＮＡである、先行する実施形態のいずれかの組成物、系、方法、またはキット。
ＶＩＩＩ．例示的な実施形態－３

１．標的タンパク質を発現させるための組成物であって、（ａ）第１のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）標的タンパク質のＮ末端部分のコード配列；（ｉｉ）スプライスドナー；および（ｉｉｉ）第１の二量体形成ドメインを含む、第１のＲＮＡ分子；ならびに（ｂ）第２のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；（ｉｉ）分岐点配列；（ｉｉｉ）ポリピリミジントラクト；（ｉｖ）スプライスアクセプター；および（ｖ）標的タンパク質のＣ末端部分のコード配列を含む、第２のＲＮＡ分子を含む、組成物。

２．標的タンパク質を発現させるための組成物であって（ａ）第１のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）標的タンパク質のＮ末端部分のコード配列；（ｉｉ）スプライスドナー；および（ｉｉｉ）第１の二量体形成ドメインを含む、第１のＲＮＡ分子；ならびに（ｂ）第２のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；（ｉｉ）分岐点配列；（ｉｉｉ）ポリピリミジントラクト；（ｉｖ）スプライスアクセプター；（ｖ）標的タンパク質の中間部分のコード配列；（ｖｉ）第２のスプライスドナー；および（ｖｉｉ）第３の二量体形成ドメインを含む、第２のＲＮＡ分子；ならびに（ｃ）第３のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）第３の二量体形成ドメインに結合する第４の二量体形成ドメイン；（ｉｉ）分岐点配列；（ｉｉｉ）ポリピリミジントラクト；（ｉｖ）スプライスアクセプター；および（ｖ）標的タンパク質のＣ末端部分のコード配列を含む、第３のＲＮＡ分子を含む、組成物。

３．標的タンパク質を発現させるための組成物であって（ａ）第１のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）標的タンパク質のＮ末端部分のコード配列、（ｉｉ）スプライスドナー；および（ｉｉｉ）第１の二量体形成ドメインを含む、第１のＲＮＡ分子；（ｂ）第２のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；（ｉｉ）分岐点配列；（ｉｉｉ）ポリピリミジントラクト；（ｉｖ）スプライスアクセプター；（ｖ）標的タンパク質の中間部分のコード配列；（ｖｉ）第２のスプライスドナー；および（ｖｉｉ）第３の二量体形成ドメインを含む、第２のＲＮＡ分子；ならびに（ｃ）第３のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）第３の二量体形成ドメインに結合する第４の二量体形成ドメイン；（ｉｉ）分岐点配列；（ｉｉｉ）ポリピリミジントラクト；（ｉｖ）スプライスアクセプター；（ｖ）標的タンパク質の第１の中間部分のコード配列；（ｖｉ）第２のスプライスドナー；および（ｖｉｉ）第５の二量体形成ドメインを含む、第３のＲＮＡ分子；ならびに（ｄ）第４のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）第５の二量体形成ドメインに結合する第６の二量体形成ドメイン；（ｉｉ）分岐点配列；（ｉｉｉ）ポリピリミジントラクト；（ｉｖ）スプライスアクセプター；および（ｖ）標的タンパク質のＣ末端部分のコード配列を含む、第４のＲＮＡ分子を含む、組成物。

４．第１の二量体形成ドメインと第２の二量体形成ドメイン、第３の二量体形成ドメインと第４の二量体形成ドメイン、および／または第５の二量体形成ドメインと第６の二量体形成ドメインが、直接結合、間接結合、またはこれらの組合せによって結合している、実施形態１から３までのいずれか１つに記載の組成物。

５直接結合または間接結合が、塩基対合相互作用、非標準的な塩基対合相互作用、非塩基対合相互作用、またはこれらの組合せを含む、実施形態４に記載の組成物。

６直接結合が、キッシングループ間または低多様性領域間の塩基対合相互作用を含む、実施形態４または５に記載の組成物。

７直接結合が、アプタマー領域間の非標準的な塩基対合相互作用、非標準的な塩基対合相互作用、非塩基対合相互作用、またはこれらの組合せを含む、実施形態４または５に記載の組成物。

８間接結合が、核酸架橋を通じた塩基対合相互作用を含む、実施形態４または５に記載の組成物。

９．間接結合が、アプタマーとアプタマーの標的剤との間、または２つのアプタマー間の非塩基対合相互作用を含む、請求項４または５に記載の組成物。

１０．第１の二量体形成ドメイン、第２の二量体形成ドメイン、第３の二量体形成ドメイン、第４の二量体形成ドメイン、第５の二量体形成ドメインおよび／または第６の二量体形成ドメインが、潜在スプライスアクセプターを含まない、実施形態１から９までのいずれか１つに記載の組成物。

１１．直接結合しているかまたは間接的に結合しているアプタマー配列二量体形成ドメインの対を少なくとも１つ含む、実施形態１から１０までのいずれか１つに記載の組成物。

１２．キッシングループ相互作用二量体形成ドメインの対を少なくとも１つ含む、実施形態１から１１までのいずれか１つに記載の組成物。

１３．標的タンパク質が、疾患に関連するタンパク質、または治療用タンパク質である、実施形態１から１２までのいずれか１つに記載の組成物。

１４．疾患が、単一遺伝子疾患である、実施形態１３の組成物。

１５．治療用タンパク質が、毒素である、実施形態１４の組成物。

１６．疾患および標的タンパク質が、表１に列挙されているものである、実施形態１３から１５までのいずれか１つに記載の組成物。

１７．第１のＲＮＡ分子、第２のＲＮＡ分子、第３のＲＮＡ分子、および／または第４のＲＮＡ分子が、第１のＲＮＡ分子、第２のＲＮＡ分子、第３のＲＮＡ分子、または第４のＲＮＡ分子の３’末端にポリＡ尾部をさらに含む、実施形態１から１６までのいずれか１つに記載の組成物。

１８前記第１のＲＮＡ分子が、前記スプライスドナーに対して３’側であり前記第１の二量体形成ドメインに対して５’側の下流イントロンスプライスエンハンサー（ＤＩＳＥ）、前記スプライスドナーに対して３’側であり前記第１の二量体形成ドメインに対して５’側のイントロンスプライスエンハンサー（ＩＳＥ）のうちの一方もしくは両方をさらに含む；および／または
前記第２のＲＮＡ分子が、前記第２の二量体形成ドメインに対して３’側であり前記分岐点配列に対して５’側のＩＳＥ、および前記スプライスドナーに対して３’側であり前記二量体形成ドメインに対して５’側のＤＩＳＥのうちの一方もしくは両方をさらに含む；
またはこれらの任意の組合せである、実施形態１または４から１７までのいずれか一項に記載の組成物。

１９．
第１のＲＮＡ分子が、第１のスプライスドナーに対して３’側かつ第１の二量体形成ドメインに対して５’側のＤＩＳＥ、第１のスプライスドナーに対して３’側かつ第１の二量体形成ドメインに対して５’側のＩＳＥ、もしくは両方をさらに含む；
ＲＮＡ分子が、第２の二量体形成ドメインに対して３’側かつ第１の分岐点配列に対して５’側のＩＳＥ、第２のスプライスドナーに対して３’側かつ第２の二量体形成ドメインに対して５’側のＤＩＳＥ、第２のスプライスドナーに対して３’側かつ第３の二量体形成ドメインに対して５’側のＩＳＥ、もしくはこれらの任意の組合せをさらに含む；ならびに／または
第３のＲＮＡ分子が、第４の二量体形成ドメインに対して３’側かつ第２の分岐点配列に対して５’側のＩＳＥをさらに含む；
またはこれらの任意の組合せである、
実施形態２または４から１７までのいずれか１つの組成物。

２０．
第１のＲＮＡ分子が、第１のスプライスドナーに対して３’側かつ第１の二量体形成ドメインに対して５’側のＤＩＳＥ、第１のスプライスドナーに対して３’側かつ第１の二量体形成ドメインに対して５’側のＩＳＥ、または両方をさらに含む；
第２のＲＮＡ分子が、第２の二量体形成ドメインに対して３’側かつ第１の分岐点配列に対して５’側のＩＳＥ、第２のスプライスドナーに対して３’側かつ第２の二量体形成ドメインに対して５’側のＤＩＳＥ、第２のスプライスドナーに対して３’側かつ第３の二量体形成ドメインに対して５’側のＩＳＥ、もしくはこれらの任意の組合せをさらに含む；
第３のＲＮＡ分子が、第４の二量体形成ドメインに対して３’側かつ第２の分岐点配列に対して５’側のＩＳＥをさらに含む；ならびに／または
第４のＲＮＡ分子が、第５の二量体形成ドメインに対して３’側かつ第３の分岐点配列に対して５’側のＩＳＥ、第３のスプライスドナーに対して３’側かつ第５の二量体形成ドメインに対して５’側のＤＩＳＥ、第３のスプライスドナーに対して３’側かつ第６の二量体形成ドメインに対して５’側のＩＳＥ、もしくはこれらの任意の組合せをさらに含む；
またはこれらの任意の組合せである、
実施形態３から１７までのいずれか１つの組成物。

２４．第１のＲＮＡ分子および／または第３のＲＮＡ分子が、スプライスドナーに対して３’側の任意の場所に位置を占めた自己切断性ＲＮＡ配列またはＲＮＡ切断酵素標的配列をさらに含み、したがって、当該配列により３’に位置するポリアデニル化尾部が切断されて、組み換えられていないＲＮＡ分子からのタンパク質断片の発現が低減または抑制される；
第２のＲＮＡ分子および／または第４のＲＮＡ分子が、分岐点配列に対して５’側の任意の場所に位置を占めた自己切断性ＲＮＡ配列またはＲＮＡ切断酵素標的配列をさらに含み、したがって、当該配列により５’に位置するＲＮＡキャップが切断されて、組み換えられていないＲＮＡ分子からのタンパク質断片の発現が低減または抑制される；
第２のＲＮＡ分子および／または第４のＲＮＡ分子が、スプライスアクセプターに対して３’側にあるオープンリーディングフレームに対してシフトされる開始コドンを分岐点配列に対して５’側の任意の場所にさらに含んで、組み換えられていないＲＮＡ分子からの標的タンパク質断片の翻訳が低減または抑制される；
第１のＲＮＡ分子および／または第３のＲＮＡ分子が、スプライスドナーに対して３’側の任意の場所にマイクロＲＮＡ標的部位をさらに含み、したがって、結合していないＲＮＡ断片が、核の外側に出るとマイクロＲＮＡ依存性分解を受ける；
第２のＲＮＡ分子および／または第４のＲＮＡ分子が、コード配列に対して３’側の任意の場所にマイクロＲＮＡ標的部位をさらに含み、したがって、結合していないＲＮＡ断片が、核の外側に出るとマイクロＲＮＡ依存性分解を受ける；
第１のＲＮＡ分子および／または第３のＲＮＡ分子が、デグロンタンパク質分解タグをコードする配列を、スプライスドナーに対して３’側の任意の場所にスプライスドナー部位の５’側にある標的タンパク質のオープンリーディングフレームとインフレームになるようにさらに含み、したがって、結合していないタンパク質断片が分解に関してタグ付けされる；
第２のＲＮＡ分子および／または第４のＲＮＡ分子が、開始コドンおよびインフレームのデグロンタンパク質分解タグを、分岐点配列に対して５’側の任意の場所にスプライスアクセプター部位の３’側の標的タンパク質のオープンリーディングフレームとインフレームになるようにさらに含み、したがって、結合していないタンパク質断片が分解に関してタグ付けされる；
またはこれらの任意の組合せである、
実施形態１から２３までのいずれか１つの組成物。

２５．標的タンパク質を発現させるための組成物であって、（ａ）実施形態１および４から２４までのいずれか１つの第１のＲＮＡ分子をコードする第１の合成ＤＮＡ分子であって、（ｉ）第１のＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第１のプロモーターを含む、第１の合成ＤＮＡ分子；ならびに（ｂ）実施形態１および４から２４までのいずれか１つの第２のＲＮＡ分子をコードする第２の合成ＤＮＡ分子であって、（ｉ）第２のＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第２のプロモーターを含む、第２の合成ＤＮＡ分子を含む組成物。

２６．標的タンパク質を発現させるための組成物であって、（ａ）実施形態２および４から２４までのいずれか１つの第１のＲＮＡ分子をコードする第１の合成ＤＮＡ分子であって、（ｉ）第１のＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第１のプロモーターを含む、第１の合成ＤＮＡ分子；（ｂ）実施形態２および４から２４までのいずれか１つの第２のＲＮＡ分子をコードする第２の合成ＤＮＡ分子であって、（ｉ）第２のＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第２のプロモーターを含む、第２の合成ＤＮＡ分子；および（ｃ）実施形態２および４から２４までのいずれか１つの第３のＲＮＡ分子をコードする第３の合成ＤＮＡ分子であって、（ｉ）第３のＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第３のプロモーターを含む、第３の合成ＤＮＡ分子を含む組成物。

２７．標的タンパク質を発現させるための組成物であって、（ａ）実施形態３および４から２４までのいずれか１つの第１のＲＮＡ分子をコードする第１の合成ＤＮＡ分子であって、（ｉ）第１のＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第１のプロモーターを含む、第１の合成ＤＮＡ分子；（ｂ）実施形態３および４から２４までのいずれか１つの第２のＲＮＡ分子をコードする第２の合成ＤＮＡ分子であって、（ｉ）第２のＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第２のプロモーターを含む、第２の合成ＤＮＡ分子；（ｃ）実施形態３および４から２４までのいずれか１つの第３のＲＮＡ分子をコードする第３の合成ＤＮＡ分子であって、（ｉ）第３のＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第３のプロモーターを含む、第３の合成ＤＮＡ分子；および（ｄ）実施形態３および４から２４までのいずれか１つの第４のＲＮＡ分子をコードする第４の合成ＤＮＡ分子であって、（ｉ）第４のＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結した第４のプロモーターを含む、第４の合成ＤＮＡ分子を含む組成物。

２８．各プロモーターが、独立に選択される、実施形態２５から２７までのいずれか１つの組成物。

２９．
第１のプロモーターと第２のプロモーターが同じプロモーターである；
第１のプロモーターと第２のプロモーターが異なるプロモーターである；
第１のプロモーター、第２のプロモーター、および第３のプロモーターが同じプロモーターである；
第１のプロモーター、第２のプロモーター、および第３のプロモーターが異なるプロモーターである；
第１のプロモーター、第２のプロモーター、第３のプロモーター、および第４のプロモーターが同じプロモーターである；または、
第１のプロモーター、第２のプロモーター、第３のプロモーターおよび第４のプロモーターが異なるプロモーターである、
実施形態２５から２８までのいずれか１つの組成物。

３０．第１のプロモーター、第２のプロモーター、第３のプロモーター、および第４のプロモーターのそれぞれが、独立に、構成的プロモーター；組織特異的プロモーター；および標的タンパク質に対して内因性のプロモーターから選択される、実施形態２５から２９までのいずれか１つの組成物。

３１．実施形態２５から３０までのいずれか１つの組成物を含む、標的タンパク質を発現させるための系。

３２．細胞に導入されると、ＲＮＡ分子を適当な順序で産生させ、組み換え、それにより、標的タンパク質の全長コード配列をもたらす、実施形態３１の系。

３３．第１のＲＮＡ分子および第２のＲＮＡ分子（２つの部分からなる系において）のそれぞれ、第１のＲＮＡ分子、第２のＲＮＡ分子および第３のＲＮＡ分子（３つの部分からなる系において）のそれぞれ、または第１のＲＮＡ分子、第２のＲＮＡ分子、第３のＲＮＡ分子および第４のＲＮＡ分子（４つの部分からなる系において）のそれぞれが、別々のウイルスベクターから転写される、実施形態３１または３２に記載の系。

３４．ウイルスベクターが、ＡＡＶである、実施形態３１から３３までのいずれか１つの系。

３５．系の第１の合成ＤＮＡ分子、第２の合成ＤＮＡ分子、第３の合成ＤＮＡ分子、または第４の合成ＤＮＡ分子のそれぞれが、約２５００ｎｔ～約５０００ｎｔ、２，５００ｎｔ～約２，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，７５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ、約４，５００ｎｔ、約４，７５０ｎｔ、および約５，０００ｎｔから独立に選択されるサイズを有する、実施形態３１から３４までのいずれか１つの系。

３６．系の合成ＤＮＡ分子によってコードされる標的タンパク質のＮ末端部分のコード配列（２つの部分からなる系、３つの部分からなる系、または４つの部分からなる系において）、標的タンパク質の中間部分のコード配列（３つの部分からなる系において）、標的タンパク質の第１の中間部分のコード配列（４つの部分からなる系において）、または標的タンパク質のＣ末端部分のコード配列（２つの部分からなる系、３つの部分からなる系、または４つの部分からなる系において）は、約１，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔから独立に選択されるサイズをそれぞれが有し、から独立に選択されるサイズをそれぞれが有し、約１，０００ｎｔ～約１，５００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約２，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約２，５００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約１，５００ｎｔ～約２，０００ｎｔ、約１，５００ｎｔ～約２，５００ｎｔ、約１，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約１，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約１，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約１，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約２，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約１，０００ｎｔ、約１，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ、または約４，５００ｎｔから独立に選択されるサイズをそれぞれが有する、実施形態３１から３５までのいずれか１つの系。

３７．それぞれ系の１つ、２つ、３つ、または４つの合成ＤＮＡ分子のいずれかによってコードされる１つ、２つ、３つ、または４つのＲＮＡ分子のいずれかが、それぞれ、約２５００～４５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約２，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ、および約４，５００ｎｔから独立に選択されるサイズを有する、実施形態３１から３６までのいずれか１つの系。

３８．実施形態２５および２８から３０までの組成物を含み、
第１の合成ＤＮＡ分子および第２の合成ＤＮＡ分子が、約５０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ、および約１０，０００ｎｔから選択される総サイズを有する；
総標的タンパク質コード配列のサイズが、約２０００ｎｔ～約８０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、もしくは約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔから選択され、総標的タンパク質コード配列が、約２，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、および約８，０００ｎｔである；ならびに／または、
２つの合成ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子の合計サイズが、約５，０００ｎｔ～約９０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、または約９，０００ｎｔである、
実施形態３１から３７までのいずれか１つの系。

３９．実施形態２６および２８から３０までのいずれか１つの組成物を含み、
第１の合成ＤＮＡ分子、第２の合成ＤＮＡ分子、および第３の合成ＤＮＡ分子が、約７５００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、または約１４，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ、または約１５，０００ｎｔの総サイズを有する；
総標的タンパク質コード配列が、約３０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、もしくは約１２，０００ｎｔ；ならびに／または、
３つの合成ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子の合計サイズが、約７５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、または約１３，５００ｎｔである、
実施形態３１から３６までのいずれか１つの系。

４０．
実施形態２７および２８から３０までのいずれか１つの組成物を含み、
第１の合成ＤＮＡ分子、第２の合成ＤＮＡ分子、第３の合成ＤＮＡ分子および第４の合成ＤＮＡ分子が、約１０，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１７，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１７，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１７，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１８，０００ｎｔ～約１９，０００ｎｔ、約１８，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１９，０００ｎｔ～約２０，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ、約１７，０００ｎｔ、約１８，０００ｎｔ、約１９，０００ｎｔ、もしくは約２０，０００ｎｔの総サイズを有する；
総標的タンパク質コード配列が、約４０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、もしくは約１５，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔであり、総標的タンパク質コード配列が、約５，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ、もしくは約１５，０００ｎｔである；ならびに／または
４つの合成ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子の合計サイズが、約１０，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１７，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ、約１７，０００ｎｔ、もしくは約１８，０００ｎｔである、
実施形態３１から３６までのいずれか１つの系。

４１．第１の二量体形成ドメインおよび第２の二量体形成ドメイン、第３の二量体形成ドメインおよび第４の二量体形成ドメイン、および／または第５の二量体形成ドメインおよび第６の二量体形成ドメインが、それぞれ、１０００ｎｔ以下、例えば、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、５０～１０００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１５０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、または５００ｎｔであり；系の組換え効率が、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である、実施形態３１から４０までのいずれか１つの系。

４２．各二量体形成ドメインが、１０００ｎｔ以下、例えば、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、５０～１０００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１５０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、または５００ｎｔであり；系の組換え効率が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または約１００％である、実施形態３１から４１までのいずれか１つの系。

４３．ＲＮＡ組換え効率が、約１０％～約１００％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約３５％、約１０％～約４０％、約１０％～約４５％、約１０％～約５０％、約１０％～約５５％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約２０％～約３０％、約２０％～約３５％、約２０％～約４０％、約２０％～約４５％、約２０％～約５０％、約２０％～約５５％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約３０％～約３５％、約３０％～約４０％、約３０％～約４５％、約３０％～約５０％、約３０％～約５５％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３５％～約４０％、約３５％～約４５％、約３５％～約５０％、約３５％～約５５％、約３５％～約６０％、約３５％～約７０％、約３５％～約８０％、約３５％～約９０％、約４０％～約４５％、約４０％～約５０％、約４０％～約５５％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４５％～約５０％、約４５％～約５５％、約４５％～約６０％、約４５％～約７０％、約４５％～約８０％、約４５％～約９０％、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５５％～約６０％、約５５％～約７０％、約５５％～約８０％、約５５％～約９０％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約１０％、約２０％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％である、実施形態３１から４２までのいずれか１つの系。

４４．実施形態３１から４３までのいずれか１つの系を含む組成物。

４５．それぞれジストロフィン、第８因子、ＡＢＣＡ４、またはＭＹＯ７Ａの少なくとも一部分をコードする第１のＲＮＡ分子、第２のＲＮＡ分子、第３のＲＮＡ分子および必要に応じて第４のＲＮＡ分子を含む、実施形態４４の組成物。

４６．実施形態３１から４３までのいずれか１つの系、または実施形態４４および４５のいずれか１つの組成物を含むキットであって、第１の合成核酸分子、第２の合成核酸分子、第３の合成核酸分子および第４の合成核酸分子のいずれかが別々の容器に入っていてよく、必要に応じて薬学的に許容される担体などのバッファーをさらに含む、キット。

４７．細胞において標的タンパク質を発現させる方法であって、実施形態３１から４３までのいずれか１つの系、または実施形態４４および４５のいずれか１つの組成物を細胞に導入するステップと、第１のＲＮＡ分子と第２のＲＮＡ分子、第１のＲＮＡ分子、第２のＲＮＡ分子、および第３のＲＮＡ分子、または第１のＲＮＡ分子、第２のＲＮＡ分子、第３のＲＮＡ分子および第４のＲＮＡ分子を細胞において発現させるステップとを含み、細胞において標的タンパク質が産生される、方法。

４８．細胞が、対象内に存在し、導入するステップが、系を治療有効量で対象に投与することを含む、実施形態４７の方法。

４９．対象における標的タンパク質をコードする遺伝子の変異によって引き起こされる遺伝子疾患を処置し、対象における機能的標的タンパク質の発現をもたらす、実施形態４８の方法。

５０．
遺伝子疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーであり、標的タンパク質がジストロフィンである；
遺伝子疾患が血友病Ａであり、標的タンパク質がＦ８である；
遺伝子疾患がスタルガルト病であり、標的タンパク質がＡＢＣＡ４である；または
遺伝子疾患がアッシャー症候群であり、標的タンパク質がＭＹＯ７Ａである、
実施形態４９の方法。

５１．１つ、２つ、３つ、または４つのＲＮＡ分子が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、１４５、１４６、１４７、１４８、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、および１６６のうちのいずれか１つに提示される合成イントロンに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む、実施形態３１から４３までのいずれか１つの系、実施形態１から２４まで、４４および４５のいずれか１つの組成物、実施形態４６のキット、または実施形態４７から５０までのいずれか１つの方法。

５２．１つ、２つ、３つ、または４つのＲＮＡ分子が、配列番号２０のｎｔ３７０３～３９７５、配列番号２１のｎｔ１～２２８、配列番号２２のｎｔ３７０３～３９７５、配列番号２３のｎｔ１～２２５、配列番号２４のｎｔ３５６０～３８２８、および配列番号２５のｎｔ１～２２５から選択される合成イントロンを含む、実施形態３１から４３まで、および５１のいずれか１つの系、実施形態１から２４まで、４４および４５のいずれか１つの組成物、実施形態４６のキット、または実施形態４７から５０までのいずれか１つの方法。

５３．１つ、２つ、３つ、または４つのＲＮＡ分子が、タンパク質コード配列の一部をさらに含む、実施形態３１から４３まで、５１、および５２のいずれかの系、実施形態１から２４まで、４４および４５のいずれか１つの組成物、または実施形態４７から５０までのいずれか１つの方法。

５４．タンパク質コード配列の一部が、タンパク質コード配列のＮ末端側半分、Ｎ末端側の３分の１、中間部分、第１の中間部分、Ｃ末端側半分、またはＣ末端側の３分の１を含む、実施形態３１から４３まで、および５１から５３までのいずれかの系、実施形態１から２４まで、４４および４５のいずれか１つの組成物、または実施形態４７から５０までのいずれか１つの方法。

５５．（ａ）第１のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）標的タンパク質のＮ末端部分のコード配列；（ｉｉ）スプライスドナー；（ｉｉ－２）ＤＩＳＥ、ＩＳＥ、または両方；および（ｉｉｉ）第１の二量体形成ドメインを含む、第１のＲＮＡ分子；ならびに（ｂ）第２のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；（ｉ－２）少なくとも１つのＩＳＥ配列；（ｉｉ）分岐点配列；（ｉｉｉ）ポリピリミジントラクト；（ｉｖ）スプライスアクセプター；および（ｖ）標的タンパク質のＣ末端部分のコード配列を含む、第２のＲＮＡ分子を含む、実施形態３１から４３までおよび５１から５４までのいずれか１つの系、実施形態１から２４まで、４４および４５のいずれか１つの組成物、または実施形態４７から５０までのいずれか１つの方法。

５６．（ａ）第１のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）標的タンパク質のＮ末端部分のコード配列；（ｉｉ）スプライスドナー；（ｉｉ－２）ＤＩＳＥ、ＩＳＥ、およびＩＳＥ；および（ｉｉｉ）第１の二量体形成ドメインを含む、第１のＲＮＡ分子；ならびに（ｂ）第２のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；（ｉ－２）３つのＩＳＥ配列；（ｉｉ）分岐点配列；（ｉｉｉ）ポリピリミジントラクト；（ｉｖ）スプライスアクセプター；および（ｖ）標的タンパク質のＣ末端部分のコード配列を含む、第２のＲＮＡ分子を含む、実施形態３１から４３までおよび５１から５５までのいずれか１つの系、実施形態１から２４まで、４４および４５のいずれか１つの組成物、または実施形態４７から５０までのいずれか１つの方法。

５７．それぞれ、２つのＲＮＡ分子のうちのいずれか１つもしくは２つ、または、３つのＲＮＡ分子のうちのいずれか１つ、２つもしくは３つ、または、４つのＲＮＡ分子のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、もしくは４つが、それぞれ、約２５００～４５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約２，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ、および約４，５００ｎｔから独立に選択されるサイズを有する、実施形態１および４から２４までのいずれか１つの組成物、または、実施形態２および４から２４までのいずれか１つの組成物、または、実施形態３および４から２４までのいずれか１つの組成物。

５８．総標的タンパク質コード配列が、約２０００ｎｔ～約８０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、もしくは約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔであり、総標的タンパク質コード配列が、約２，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、もしくは約８，０００ｎｔである；および／または、
２つのＲＮＡ分子の合計サイズが、約５，０００ｎｔ～約９０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、もしくは約９，０００ｎｔである、実施形態１および４から２４までのいずれか１つの組成物。

５９．総標的タンパク質コード配列のサイズが、約３０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、もしくは約１２，０００ｎｔである；および／または、
３つのＲＮＡ分子の合計サイズが、約７５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１０，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１１，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１２，５００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１３，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ、約１０，５００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１１，５００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１２，５００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、もしくは約１３，５００ｎｔである、
実施形態２および４から２４までのいずれか１つの組成物。

６０．総標的タンパク質コード配列のサイズが、約４０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、または約１５，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔであり、総標的タンパク質コード配列が、約５，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ、または約１５，０００ｎｔである；ならびに／または
４つの合成ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子の合計サイズが、約１０，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１１，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１２，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１３，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１４，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１５，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１６，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ～約１７，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１７，０００ｎｔ～約１８，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ、約１１，０００ｎｔ、約１２，０００ｎｔ、約１３，０００ｎｔ、約１４，０００ｎｔ、約１５，０００ｎｔ、約１６，０００ｎｔ、約１７，０００ｎｔ、または約１８，０００ｎｔである、
実施形態３および４から２４までのいずれか１つの組成物。

６１．第１の二量体形成ドメインおよび第２の二量体形成ドメイン、第３の二量体形成ドメインおよび第４の二量体形成ドメイン、および／または第５の二量体形成ドメインおよび第６の二量体形成ドメインが、それぞれ、１０００ｎｔ以下、例えば、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、５０～１０００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１５０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、または５００ｎｔであり；系の組換え効率が、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である、実施形態１から２４までおよび５７から６０までのいずれか１つの系。

６２．各二量体形成ドメインが、１０００ｎｔ以下、例えば、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、５０～１０００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１５０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、または５００ｎｔであり；系の組換え効率が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％である、実施形態１から２４までおよび５７から６１までのいずれか１つの系。

６３．ＲＮＡ組換え効率が、約１０％～約１００％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約３５％、約１０％～約４０％、約１０％～約４５％、約１０％～約５０％、約１０％～約５５％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約２０％～約３０％、約２０％～約３５％、約２０％～約４０％、約２０％～約４５％、約２０％～約５０％、約２０％～約５５％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約３０％～約３５％、約３０％～約４０％、約３０％～約４５％、約３０％～約５０％、約３０％～約５５％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３５％～約４０％、約３５％～約４５％、約３５％～約５０％、約３５％～約５５％、約３５％～約６０％、約３５％～約７０％、約３５％～約８０％、約３５％～約９０％、約４０％～約４５％、約４０％～約５０％、約４０％～約５５％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４５％～約５０％、約４５％～約５５％、約４５％～約６０％、約４５％～約７０％、約４５％～約８０％、約４５％～約９０％、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５５％～約６０％、約５５％～約７０％、約５５％～約８０％、約５５％～約９０％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約１０％、約２０％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％である、実施形態１から２４までおよび５７から６２までのいずれか１つの組成物。

６４．合成ＤＮＡが、逆転写酵素によるＲＮＡウイルスゲノムの転写によって生じたものである、実施形態２５から３０までおよび４４から４５までのいずれか１つの組成物、実施形態３１から４３までのいずれか１つの系、または実施形態４７から５０のいずれか１つの方法。

本明細書に記載の本明細書に開示される任意の実施形態を、必要に応じて、核酸エディタータンパク質の発現に関する記載の組成物、系、方法およびキットに適用できることが理解される。本開示は、対象における疾患を処置する、または他の点でそれを必要とする対象に利益をもたらすための、本明細書に記載の組成物、系、方法またはキットの使用、および、対象における疾患の処置における使用のため、または他の点でそれを必要とする対象に利益をもたらすための、本明細書に記載の組成物、系、方法またはキットを包含する。

（実施例１）
合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメイン
図１Ａは、ベクター設計（左）ならびにＲＮＡ相互作用およびスプライシング（右）の概略図を示す。左：５’トランススプライス（ｔｒｓｐ）ＤＮＡベクター：白抜きの矢印は２つの反対方向のプロモーターである。ＲＦＰをコードするドメインおよびポリアデニル化エレメントを伴う３’ＵＴＲは、ＹＦＰのＮ末端部分（ｎ－ｙｆｐ）、続いて、スプライスドナー配列（ＳＤ）、下流イントロンスプライシングエンハンサー（ＤＩＳＥ）、および２つのイントロンスプライシングエンハンサー（２×ＩＳＥ）、結合ドメイン（ＢＤ、二量体形成ドメインとも称される）、および安定なステムループボックスＢエレメント（ボックスＢ）、自己切断性ハンマーヘッド型リボザイム（ＨＨｒｚ）、最後にポリアデニル化エレメントを含有する３’ＵＴＲから反対方向に発現される。ｎ－ｙｆｐセグメントには小さなイントロンが挿入されている（ｎ－ｙｆｐ内の白色のセグメント）。３’ｔｒｓｐＤＮＡベクター：白抜きの矢印は２つの反対方向のプロモーターである。ＢＦＰをコードするドメインおよびポリアデニル化エレメントを伴う３’ＵＴＲは、相補的結合ドメイン（抗ＢＤ、二量体形成ドメインとも称される）、続いて、３つのイントロンスプライシングエンハンサー配列（３×ＩＳＥ）、分岐点（ＢＰ）、ポリピリミジントラクト（ＰＰＴ）、スプライスアクセプター配列（ＳＡ）、ＹＦＰコード配列のＣ末端部分、最後にポリアデニル化エレメントを含有する３’ＵＴＲから反対方向に発現される。右：ＹＦＰタンパク質をコードするｍＲＮＡが生成されるプレｍＲＮＡ相互作用（５’ｔｒｓｐ－ＲＮＡ＋３’ｔｒｓｐ－ＲＮＡ）およびトランス－スプライシングが示されている。

図１Ｂは、Ｎ末端発現プラスミドのみのトランスフェクションではＹＦＰ蛍光がもたらされないことを示す。２０ｋのＲＦＰ＋細胞を示すフローサイトメトリー。

図１Ｃは、Ｃ末端発現プラスミドのみのトランスフェクションではＹＦＰ蛍光がもたらされないことを示す。２０ｋのＢＦＰ＋細胞を示すフローサイトメトリー。

図１Ｄは、結合ドメインを有さないＮ末端断片およびＣ末端断片の発現では、低レベルのＹＦＰ誘導が示されることを示す。２０ｋのＢＦＰ＋細胞についての赤色蛍光値および緑色蛍光値を示すフローサイトメトリー。

図１Ｅは、ループ状構成の合理的に設計された二量体形成／結合ドメインを示す。排他的にピリミジンまたは排他的にプリンを含有する低多様性配列のセグメントの間を安定なステム配列が占める。ＲＮＡフォールディング予測により、結合ドメインとその相補配列の間の塩基対合に利用可能な、６つの、開いた一続きの配列が示される（１～６の番号が付されている）。

図１Ｆは、６つの、開いた一続きの配列（１～６の番号が付されている）を示す、「ループ状」二量体形成ドメイン構成の３Ｄレンダリングを示す。

図１Ｇは、Ｃ末端側半分に結合ドメインを有さない陰性対照を示す。２０ｋのＢＦＰ＋細胞についての赤色蛍光値および緑色蛍光値を示すフローサイトメトリー。

図１Ｈは、Ｎ末端側半分に結合ドメインを有さない陰性対照を示す。２０ｋのＢＦＰ＋細胞についての赤色蛍光値および緑色蛍光値を示すフローサイトメトリー。

図１Ｉは、Ｎ末端側半分およびＣ末端側半分の両方におけるマッチする結合ドメインにより、細胞の９０％において強力なＹＦＰ誘導が示されることを示す。２０ｋのＢＦＰ＋細胞についての赤色蛍光値および緑色蛍光値を示すフローサイトメトリー。

図１Ｊ～１Ｎは、完全に開いた構成をもたらす、一続きの、１５０個の排他的にピリミジンまたは排他的にプリンを含有する低多様性配列を有する結合ドメインの構成についての図１Ｅ～１Ｉにおけるものと等価のデータを表す。

図１Ｏは、図１Ｇに示されている細胞についての代表的な蛍光画像を示す。

図１Ｐは、図１Ｌに示されている細胞についての代表的な蛍光画像を示す。

図１Ｑは、図１Ｄ、図１Ｇ～１Ｉ、および図１Ｌ～１Ｎに示されている条件の比較を示す。ＹＦＰ誘導係数が算出される：（＃Ｒ＋Ｙ＋÷＃Ｒ＋Ｙ－）×１００×ｍｅｄ．Ｙ－ｆｌｕｏｒ（Ｒ＋Ｙ＋）。Ｎ末端上のネイティブなイントロン（マウスパルブアルブミン遺伝子のイントロンＩ）およびＣ末端断片上のそのイントロンに対して最適化された結合ドメインの組換え効率の比較について示されている（白色の棒）。これにより、最適化された合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメインが有益であることが例示される。

（実施例２）
３つの合成断片からのタンパク質の再構成
図２Ａは、例示的なベクター設計の概略図を示す。ＹＦＰのタンパク質コード配列をＮ末端断片、中間断片（ｍ－ｙｆｐ）およびＣ末端断片に分割する。ｎ断片とｍ断片の結合部をループ状設計の結合ドメイン（ＢＤ１）によって結合し、ｍ断片とｃ断片の結合部をループ状結合ドメイン（ＢＤ２）によって結合する。ピリミジン（Ｙ）配列およびプリン（Ｒ）配列を、ｍ断片の自己環状化が回避され、また、Ｎ断片とＣ断片の直接組換えが回避されるように配置する。Ｎ末端断片をトランスフェクション対照としての赤色蛍光タンパク質と共発現させ、Ｃ末端断片をトランスフェクション対照としての青色蛍光タンパク質と共発現させる。

図２Ｂは、３つの断片上のマッチする結合ドメイン全てにより、細胞の８０％において強力なＹＦＰ誘導が示されることを示す。２０ｋのＢＦＰ＋細胞についての赤色蛍光値および緑色蛍光値を示すフローサイトメトリー。

図２Ｃは、ｎ断片およびｍ断片のみの発現ではＹＦＰ蛍光が示されないことの代表的な蛍光画像を示す（陰性対照）。

図２Ｄは、ｍ断片およびｃ断片のみの発現ではＹＦＰ蛍光が示されないことの代表的な蛍光画像を示す（陰性対照）。

図２Ｅは、３つの断片全ての共トランスフェクションによって強力なＹＦＰ蛍光が誘導されることを示す代表的な蛍光画像を示す。

（実施例３）
２つの部分に分けられ再構成された全長ＹＦＰのｉｎｖｉｖｏ送達
２つの断片からのＹＦＰコード配列の再構成は、１つがＹＦＰのＮ末端をコードする半分の断片を含み、１つがＣ末端をコードする半分の断片を含む、２つの合成ＲＮＡ配列（図３Ａ）（配列番号１および２）を使用することによって実現される。各断片が、マウス新生仔（Ｐ３）への全身（ｉｖ）投与後にＡＡＶ２／８から発現された。マウス当たり、２つの断片のそれぞれについて合計１．８８×１０^１１個のウイルスゲノムを投与した。３週間後に蛍光顕微鏡法を使用して肝臓、心筋、および骨格筋におけるＹＦＰの発現を検出した。

図３Ｂに示されている通り、若齢マウスの肝臓において全長ＹＦＰの発現が検出されたが、注射していない肝臓ではＹＦＰ発現は示されなかった。

図３Ｃに示されている通り、若齢マウスの心筋において全長ＹＦＰの発現が検出されたが、注射していない心筋ではＹＦＰ発現は示されなかった。

図３Ｄに示されている通り、肢の骨格筋において全長ＹＦＰの発現が検出されたが、注射していない肝臓ではＹＦＰ発現は示されなかった。

したがって、本明細書に開示される系を使用して、ｉｎｖｉｖｏにおいて２つまたはそれよりも多くの別々の合成ＲＮＡ分子から全長タンパク質を発現させることができる。

（実施例４）
３つの部分に分けられ再構成された全長ＹＦＰのｉｎｖｉｖｏ送達
３つの断片からのＹＦＰコード配列の再構成は、１つがＹＦＰのＮ末端断片を含み、１つがＹＦＰの中間断片を含み、１つがＣ末端断片を含む、３つの合成ＲＮＡ配列（図４Ａ）（それぞれ配列番号１４５、１４６および２）によって実現される。

各断片が、マウス新生仔（Ｐ３）の前脛骨筋への筋肉内注射後にＡＡＶ２／８から発現された。断片それぞれについて合計１×１０^１１個のウイルスゲノムを筋肉内投与した。３週間後に蛍光顕微鏡法を使用して骨格筋におけるＹＦＰの発現を検出した。

図４Ｂに示されている通り、全長ＹＦＰ蛍光の発現が前脛骨筋において観察された。

したがって、本明細書に開示される系を使用して、ｉｎｖｉｖｏにおいて３つまたはそれよりも多くの別々の合成ＲＮＡ分子から全長タンパク質を発現させることができる。

（実施例５）
再構成された全長タンパク質のｉｎｖｉｖｏ送達
ｉｎｖｉｖｏにおける３部分ｓＲｄＲ系の実現性を実証するために、ＹＦＰの断片を含有する２つまたは３つのいずれかのＡＡＶ移入プラスミド（ＡＡＶのＤＮＡ前駆体プラスミド）の組合せを成体マウスの後肢の前脛骨筋（ＴＡ）に経皮的に電気穿孔により導入した。筋肉内電気穿孔の５日後に、２つの部分に分割したＹＦＰ系ならびに３つの部分に分割したＹＦＰ系の両方の効率的な再構成が観察された（図５Ａ～５Ｆ）。

図５Ａ～５Ｆは、成体マウス前脛骨筋における２つの断片からおよび３つの断片からのＹＦＰの効率的な再構成を表す。図５Ａは、合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメインを備えたＹＦＰコード配列のＮ末端側半分およびＣ末端側半分を示す。図５Ｂは、これらの２つの断片を発現する２つのＡＡＶ移入プラスミドを成体マウス前脛骨（ＴＡ）筋に経皮的に電気穿孔により導入し、電気穿孔の５日後に強力な蛍光が検出されたことを示す。図５Ｃは、反対側の注射していないＴＡでは蛍光は検出可能でなかったことを示す。図５Ｄは、Ｎ末端、中間、およびＣ末端ＹＦＰコード配列が、各断片をその隣接する断片（複数可）に結合する合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメインを備えていることを示す。図５Ｅは、これらの３つの断片を発現する３つのＡＡＶ移入プラスミドの経皮的な電気穿孔を示す。３つの断片からのＹＦＰの効率的な再構成を示す強力なＹＦＰ蛍光が検出される。図５Ｆは、反対側の注射していないＴＡにおける蛍光を示す。コンテキストとして蛍光チャネルがグレースケール写真に重ね合わせられている。

２つまたは３つのベクターを使用して、肝臓、心筋（ｃａｒｄｉａｃｍｕｓｃｌｅ）および骨格筋（２つのＡＡＶベクター）、ならびに骨格筋（３つのＡＡＶベクター）においてＹＦＰを首尾よく発現させた。

したがって、本明細書に提示される合成ＲＮＡ二量体形成および組換え系を筋肉において配置することができる。これらの結果に基づいて、ＹＦＰコード配列をジストロフィン（または他の遺伝子）コード配列で置換して、所望の対象および／または組織におけるＡＡＶからの治療用全長ジストロフィン（または他の遺伝子）発現を実現することができる。

（実施例６）
ＤＭＤを処置するための、再構成された全長ジストロフィンの送達
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に罹患している患者に対する全長ジストロフィンを使用した効果的な遺伝子療法は依然として困難なままであり、それは、この大きなタンパク質のコード配列が大多数のウイルスベクターの容量を超えるからである。遺伝子置換療法における一般的かつ好ましい遺伝子送達方法はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、無毒性であり、忍容性が良好であり、また、ゲノムへのランダムな組込みを伴わずに置換遺伝子の長期にわたる発現をもたらす。しかし、ジストロフィン遺伝子は、単一のウイルスによって送達するには大きすぎる。断片に分解する場合、全長ジストロフィンは、最低３つのウイルスを使用することでのみ送達することができる。

「マイクロジストロフィン」または「ミニジストロフィン」と称されるより小さなバージョンのジストロフィンが現在ジストロフィン遺伝子置換療法に関して試験されているが、これらの短縮されたバージョンのジストロフィンは、タンパク質のロッドおよびヒンジ区画内の重要なドメインが欠如しているので、完全な機能性を有さないことが予測される。現在まで、この制限を克服するための過去の試みでは、ＤＭＤを処置するために必要な効率は得られていない。

ジストロフィンを含めた大きな遺伝子のコード配列を複数の一連の断片から効率的に再構成するために使用することができる新規の技術が本明細書に提示される。この技術を送達ベクターとしてのＡＡＶと組み合わせて使用することで、全長ジストロフィンがＤＭＤのマウスモデル（ならびにブタおよびイヌモデル）において発現される。一実施例では、対象はＤＭＤを有するヒト成人、若年、または乳児である。例えば、本明細書に開示される方法および系を使用して、全長ジストロフィンをコードする合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメインを２つまたは３つのＡＡＶによって送達することができる（例えば、各ＡＡＶにより全長コード配列の半分または３分の１を送達する）。一実施例では、ＡＡＶは、筋指向性ＡＡＶ（例えば、筋肉に優先的に感染するもの）。この手法を使用して、ＤＭＤのマウスまたはイヌモデルにおいて、ならびにヒト対象においてジストロフィーの症状を好転させるかまたはその発症を防止することができる。

パート１：効率的に再構成される３分割ジストロフィン発現カセットを構築する。ｉｎ
ｖｉｔｒｏにおいて全長ジストロフィンコード配列を効率的に再構成すると同時に、個々の発現カセットがそれぞれ従来のＡＡＶベクターのパッケージングの制限の範囲内に入る３つの発現カセットを構築する。治療的に有効なレベルのジストロフィンを実現するために、ジストロフィンのおよそ生理的なレベルまたは適度に超生理的なレベルが実現されるように発現系を最適化することができる。ジストロフィンの最大５０倍の過剰発現が許容され、有害作用は伴わない。ジストロフィンコード配列をその長さに沿って複数の異なる点で分割することができる。しかし、再構成の効率は局所的なＲＮＡ微小環境の影響を受け、再構成効率の極大化は、いくつかの可能な分割点での効率を比較することによって経験的に行われる。天然のジストロフィンコード配列を最適な発現のためにコドン最適化し、最大の再構成効率に適応するように改変することができる。本明細書に開示される合成ＲＮＡ二量体形成および組換え手法を使用して３分割前駆体から全長ジストロフィンコード配列を再構成することができることが予想される。異なる構成のスクリーニングにおいて、最も効率的なジストロフィンの再構成（例えば、ほぼ生理的または適度に超生理的なレベル）をもたらす３つの発現カセットのセットを選択する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはヒト骨格筋細胞（ＨＳｋＭＣ、初代またはトランス分化させたもの）において実験を実施することができる。内因性定量的ＲＴ－ＰＣＲプローブと外因性特異的定量的ＲＴ－ＰＣＲプローブとを使用し、外因性ジストロフィンタンパク質におけるエピトープタグの検出およびウエスタンブロット分析により、異なる構成の分割／再構成されたジストロフィンの再構成効率を決定する。

パート２：再構成されていない断片に対する全長ジストロフィン発現を最大にする。再構成されていないジストロフィンの断片化されたバックグラウンド発現の抑制を、合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメインを改変することによって実現することができる。ＲＮＡ組換えが無効であることによって引き起こされる再構成されていない断片の発現により、ジストロフィン断片のバックグラウンド発現がもたらされ得る。さらに、この断片化されたバックグラウンド発現抑制を、合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメインを改変することによって実現することができる。本明細書に開示される手法を用いて、ジストロフィンの各断片を別々に転写する。ＲＮＡレベルで再構成が起こる。したがって、個々の断片がそれぞれ、再構成されることなく潜在的に翻訳され得る。ウエスタンブロットにおいて、全長ジストロフィンはおよそ４３０ｋＤａで泳動氏、これらの断片はその約２／３（約２９０ｋＤａ）および１／３（約１４０ｋＤａ）のサイズで泳動する。再構成されていない断片の発現が回避され、ジストロフィンの全長発現が選好されるように合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメインを最適化することができる。これは、例えば、デグロン配列を戦略的に配置すること、組み換えられていない断片のＲＮＡ核外移行を妨害すること、およびデコイ翻訳開始点を導入することによって実現することができる。実験をＨＥＫ２９３ＴおよびＨＳｋＭＣに対して行う。ジストロフィンコード配列を、ウエスタンブロット分析を使用してジストロフィンの十分に再構成されていない断片を同定および定量化することを可能にするエピトープタグでブックエンドすることができる。これらのジストロフィン断片の細胞分布をヒト骨格筋細胞における免疫組織化学的検査を使用して評価する。さらに、定量的ＲＴＰＣＲ組換え結合部を使用して、ＲＮＡレベルで効率的な再構成がどのくらい起こるかを決定することを含め、従来の分子生物学技法を使用して断片抑制の定量的評価を行う。断片化されたジストロフィン発現が低レベルで観察されることが予想される。合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメインを改変することにより、これらの断片を抑制することができる。

パート３．ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおける発現のための全長ジストロフィンモジュールの高力価ＡＡＶストックを創出する。ジストロフィンを発現するＡＡＶを高純度および３×１０^１３ＧＣ／ｍｌよりも多いウイルスゲノム計数で作製する。３つの筋指向性ＡＡＶ血清型を作製する：ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、およびＡＡＶ２／ｒｈ１０。３部分に分割された蛍光タンパク質、エピトープタグでブックエンドされた、３部分に分割された全長ジストロフィン（上のパート２を参照されたい）、および、タグ付けされていない、３部分に分割された全長ジストロフィンを作製し、その結果、２７種の高力価ＡＡＶ調製物が生じる。治療用ＡＡＶ粒子の全身送達には高濃度の大きなウイルス調製物が必要である。３つの別々のウイルスからのジストロフィンの再構成された発現を実現するために、ウイルスの反復投与を実施することができる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＡＶ産生。イオジキサノールまたはＣｓＣｌ精製。全てのバッチをｉｎｖｉｔｒｏにおいてＨＥＫ２９３Ｔおよびヒト骨格筋細胞で試験する。パート１および２における概説の通り、再構成効率および望ましくない断片発現を評価する。

パート４．ｉｎｖｉｖｏにおけるＦＬＤ－ＡＡＶモジュールの発現／再構成レベルならびにｉｎｖｉｖｏにおける全長ジストロフィンを発現するＡＡＶモジュールの組織分布を測定する。これらを、代理指標として３部分に分割された蛍光タンパク質に関して評価する。ｉｎｖｉｖｏ送達に関しては、新生マウスおよび若齢マウスにおける直接筋肉内送達（心筋および骨格筋）と全身性静脈内送達を比較する。上記の実施例において示されている通り、ＦＬＤ－ＡＡＶの直接筋肉注射により全長ジストロフィンの効率的な発現がもたらされ得る。ＦＬＤ－ＡＡＶの全身送達を免疫組織化学的検査およびウエスタンブロット分析を使用して調査する。新生マウスおよび若齢マウスにおける直接筋肉内送達および全身性静脈内送達を含めた異なる投与経路を比較する。この分析は以下に焦点を当てる：（１）骨格筋（主要な前肢、後肢、肩、腹部および顔の筋肉）、および速筋と遅筋とでの示差的感染力（differential infectivity）を、前脛骨筋とヒラメ筋を比較することによって評価する、（２）心筋（ｃａｒｄｉａｃｍｕｓｃｌｅ）における発現、ならびに（３）肝臓における発現。この動物のコホートを高力価ＡＡＶ注射に関する可能性のある有害作用についてモニタリングする。

ＡＡＶの直接筋肉注射はＦＬＤ－ＡＡＶモジュールを送達するための手法であるが（図５Ａ～５Ｆにおける結果が上首尾である可能性があることを踏まえて）、それにもかかわらず、臨床的展望から、ウイルスの全身性ｉ．ｖ．送達を使用して全長ジストロフィン発現を実現することが望ましい。ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＦＬＤ－ＡＡＶ試験を使用して、ＡＡＶコピー数と再構成されるジストロフィンレベルがどのように相関するかを決定する。組織分布および再構成の効率をｉｎｖｉｖｏで評価し、また、最適な組織分布を実現するために異なる送達パラダイム（例えば、血清型、ウイルス力価、適用の経路、繰り返し適用の数）を調査する。組織カバレッジおよび発現レベルを評価する。筋線維の一部しかジストロフィンを発現しない場合であっても（例えば、非ストレス条件下で心筋細胞の約５０％のみでジストロフィンが欠損している正常な心機能）、有益な転帰を実現することができる。生理的なレベルのジストロフィンおよび超生理的なレベルのジストロフィンのどちらにも治療的価値がある。定量的評価をパート１および２に概説の通り実施する。ｉｎｖｉｖｏにおける筋肉内ウイルス適用および全身性ウイルス適用を新生仔マウスまたは若齢マウスに対して無菌条件下で実施する。

パート５．ＦＬＤ－ＡＡＶを用いてＤＭＤマウスモデル（ｍｄｘ）を処置し、疾患の発症／進行を評価する。新生仔ｍｄｘマウスにおけるＦＬＤ－ＡＡＶ送達により、ミオパチーおよび心筋症の発症および進行が防止され得る。再構成された全長ジストロフィンのウイルスによる送達の最適化（パート１～４）の後、ＦＬＤ－ＡＡＶによる処置をＤＭＤのマウスモデルに施行する。これらのマウスは、それらが交配される遺伝的背景に応じて、ヒトＤＭＤよりもあまり目立たないミオパチーを示す。より重症の表現型を示す遺伝的背景を有するマウス（Ｄ２．Ｂ１０－Ｄｍｄｍｄｘ）では、後肢衰弱、筋重量減少、筋線維の減少、ならびに脂肪および線維症の増加が示される。これらのパラメータを野生型対照マウス、処置されたｍｄｘマウス、および処置されていないｍｄｘマウスの間で比較することができる。所望の転帰は疾患の発症／進行の好転または防止である。

ジストロフィン遺伝子に変異を有する２種のマウス系統、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ－Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊ、およびＤ２．Ｂ１０－Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊを使用する。ＦＬＤ－ＡＡＶを、パート４の下で記載されている確立されたパラメータに従って送達する。動物に、出生後第１週に、ｍｄｘマウスにおける筋壊死の発症前の時間ウインドウ内に注射を行う。野生型マウス、処置されたｍｄｘマウスおよびビヒクル／擬処置されたｍｄｘマウスを、骨格および心臓のミオパチーに関する行動および解剖学的徴候について評価する。運動学的および筋電図記録試験装置を使用して、平均台、握力、水平はしご、トレッドミルスピード負荷、地上での自発運動の運動学的評価、および水泳の運動学的評価（周辺温度および冷水負荷）などの種々の運動課題に関するこれらのマウスの成績を評価する。化学的負荷後にｍｄｘマウスにおいてＦＬＤ－ＡＡＶ治療により心筋症が示されることを防止できるかどうかを決定する。

これらの実験の所望の転帰は疾患の発症／進行の好転または防止である。

（実施例７）
再構成された全長ＭＹＯ７Ａの送達によりアッシャー症候群を処置する
ＭＹＯ７Ａコード配列の第１の半分を合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメインに付加し、第１のベクター／プラスミドから発現させる。ＭＹＯ７Ａの第２の半分を相補的なＲＮＡ二量体形成および組換えドメインに付加し、第２のベクター／プラスミドから発現させる。同じ細胞において一緒に発現させると、ＭＹＯ７Ａの両半分が組み換えられて全長ＭＹＯ７Ａ転写物が形成され、次いでそれがタンパク質に翻訳される。

（実施例８）
転写／発現論理ゲート
標的遺伝子を２つの非機能性の半分に割り、それを２つの異なるプロモーターから、または２つの異なる送達ビヒクルを使用して発現させることにより、交差発現パターンをもたらすことができる。

例えば、本明細書に提示される第１の合成核酸分子のプロモーター１により、例えば、細胞型Ａ、Ｂ、およびＣにおけるコード配列のＮ末端側半分の発現を駆動することができ、一方、本明細書に提示される第２の合成核酸分子のプロモーター２により、細胞Ａ、Ｄ、Ｅ、およびＦのサブセットにおけるＣ末端側半分の発現を駆動する。そのような実施例では、標的タンパク質をコードするエフェクター遺伝子は重複する領域（本実施例では細胞集団Ａ）においてのみ発現される。

両半分を条件付きで、例えば、リコンビナーゼの存在下で発現されるようにすることにより、同様の交差性を使用することができる。別のレベルでは、両半分を、異なるトロピズムを有する２つのウイルスを用いて送達することによって交差性を実現することができる。

（実施例９）
相補性
本明細書に開示される方法および系を使用して、別々のプラスミドに、両方のプラスミドが存在する場合にのみ活性になる２つの非機能性の半分をコードさせることにより、任意の遺伝子（および対応する標的タンパク質）を相補性の部分にすることができる（ＬａｃＺのアルファ相補性の原理と同様）。

（実施例１０）
トリガーＲＮＡ
本明細書に開示される系および方法を、標的タンパク質のコード配列の２つまたはそれよりも多くの部分の再構成が特定の「トリガー」ＲＮＡ分子の存在に依存するように構成することができる。図７Ｂに示されている通り、本実施例では、各合成核酸分子の二量体形成ドメインは互いに逆相補物ではないが、その代わりに、２つの合成核酸分子に架橋してひとつにする橋としての機能を果たす「トリガーＲＮＡ」である第３のＲＮＡ分子の隣接する領域と特異的にハイブリダイズする。この例では、系により、レポーター／エフェクタータンパク質の「細胞型特異的誘発」を可能にする特定のＲＮＡ分子の存在を「報告」することができる。

（実施例１１）
３’－ＵＴＲへの安定化エレメントの包含
本実施例では、ＲＮＡを安定化する３’－ＵＴＲ内の配列の存在下での分割されたコード配列の組換えを評価するために使用する方法を記載する。ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント３（ＷＰＲＥ３）を例示的な安定化配列として使用した。ＷＰＲＥ３の代わりに他のＲＮＡ配列安定化物質を使用することができることが当業者には理解されよう。

本明細書に開示される合成ＲＮＡ二量体形成および組換え手法を使用して再構成される二方向分割ＹＦＰについてのＹＦＰ蛍光中央値をフローサイトメトリーによって測定した。Ｃ末端ＹＦＰコード断片の後にはポリアデニル化シグナルのみが続くか（ＷＰＲＥ３なし）、または短縮されたバージョンのウッドチャック肝炎転写後調節エレメント、ＷＰＲＥ３が続き、その後、ポリアデニル化シグナルが続く（ＷＰＲＥ３で標識する）。Ｎ末端ＹＦＰコード断片を双方向プロモーターからトランスフェクション対照としての赤色蛍光タンパク質と共発現させる。Ｃ末端断片を双方向プロモーターからトランスフェクション対照としての青色蛍光タンパク質と共発現させる。赤色蛍光対照値と青色蛍光対照値が等しい細胞を条件間で比較する。

図８に示されている通り、３’－ＵＴＲに安定化エレメントを含めることにより、組み換えられた全長ＹＦＰの発現効率が約５０～６０％上昇した。この増強は、ＷＰＲＥ配列により、ＷＰＲＥ配列が含有されるＲＮＡ分子の核外移行が刺激され、このＲＮＡ分子の核外移行は、スプライソソーム媒介性ＲＮＡ結合が起こり得る前に図６Ａの分子１５０が核外に運ばれ、したがって分子１５０が非機能的になることによってＲＮＡ結合反応（したがって、遺伝子発現）に負の影響を及ぼし得るにもかかわらず、観察される。

したがって、本明細書に開示される合成分子（例えば、配列番号１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、および１６６のいずれか）を、ＲＮＡ配列安定化物質をさらに含むように改変することができる。

（実施例１２）
結合ドメインの長さの再構成効率に対する影響
結合ドメインの長さを以下の通り評価した。ＹＦＰを２つの非蛍光の半分に分割した（配列番号１および２、結合ドメインの長さが異なる）。培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞における異なる長さの結合ドメイン（５０～５００ヌクレオチドにわたる）についての再構成効率を評価した。Ｎ末端ＹＦＰを双方向ＣＭＶプロモーターからトランスフェクション対照としての赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）と共に発現させる。Ｃ末端ＹＦＰを双方向ＣＭＶプロモーターからトランスフェクション対照としての青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）と共に発現させる。異なる結合ドメインの長さについて、ＹＦＰ蛍光強度中央値を比較した。匹敵するＲＦＰおよびＢＦＰトランスフェクションレベルを有する細胞を条件間で比較する。

図１１に示されている通り、全ての分子でいくらかのレベルの全長ＹＦＰの発現が実現され、再構成効率の程度は様々であった。結合ドメインの長さが１５０ｂｐおよびそれよりも短い（例えば、５０～１５０ｂｐ）場合に最大の性能が観察されたが、最大５００ｂｐの結合ドメインの長さでもなお組み換えられ、全長ＹＦＰの発現が可能であった。

（実施例１３）
スプライシングエンハンサー配列の影響
本実施例では、本明細書に開示される合成イントロンに１つまたは複数のイントロンスプライシングエンハンサー配列（例えば、図６Ａの１１８、１２０、１５６）を含めることの影響を評価するために使用する方法を記載する。

ＹＦＰを２つの非蛍光の半分に分割した（図１２Ａ）。培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞における異なるイントロン構成についての再構成効率を評価した。Ｎ末端ＹＦＰを双方向ＣＭＶプロモーターからトランスフェクション対照としての赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）と共に発現させた。Ｃ末端ＹＦＰを双方向ＣＭＶプロモーターからトランスフェクション対照としての青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）と共に発現させた。異なるイントロン構成について、ＹＦＰ蛍光強度中央値を比較する。匹敵するＲＦＰおよびＢＦＰトランスフェクションレベルを有する細胞を条件間で比較する。

図１２Ａに示されている通り、５’分子（配列番号１）は、ＹＦＰのＮ末端部分のコード領域（ｎ－ｙｆｐ）、続いて、スプライスドナー配列（ＳＤ）、下流イントロンスプライシングエンハンサー（ＤＩＳＥ）、および２つのイントロンスプライシングエンハンサー（２×ＩＳＥ）、結合ドメイン（ＢＤ）、自己切断性ハンマーヘッド型リボザイム（ＨＨｒｚ）、最後にポリアデニル化シグナル（ｐＡ）を含む。３’分子（配列番号２）は、相補的結合ドメイン（抗ＢＤ）、続いて、３つのイントロンスプライシングエンハンサー配列（３×ＩＳＥ）、分岐点（ＢＰ）、ポリピリミジントラクト（ＰＰＴ）、スプライスアクセプター配列（ＳＡ）、ＹＦＰコード配列のＣ末端部分、最後にポリアデニル化シグナル（ｐＡ）を含む。

図１２Ｂに示されている通り、５’分子および３’分子の両方にスプライスエンハンサーを含めることにより、全長ＹＦＰの再構成効率が上昇する。スプライスエンハンサーを除去することにより、２つのコード配列の再構成効率が約５０～９０％低下する。最初の縦棒では、ＹＦＰが参照構成（配列番号１および２）を用いて再構成されており、２番目の縦棒は、５’断片のＩＳＥエレメントの欠失を伴う場合の再構成効率を示し、３番目の縦棒は、５’断片のＩＳＥおよびＤＩＳＥの欠失後の再構成効率を示す。４番目の縦棒は、５’断片のＨＨｒｚの欠失後の再構成効率を示す。５番目の縦棒は、参照構成を使用した再構成効率を示す。６番目の縦棒は、３’断片のＩＳＥエレメントの欠失後の再構成効率を示す。７番目は５’断片および３’断片の両方のＩＳＥならびに５’断片のＤＩＳＥの欠失後の再構成効率を示す。

（実施例１４）
デュアル投影追跡
本実施例では、２つの断片（配列番号１４７および１４８）からの全長ｆｌｐリコンビナーゼ（Ｆｌｐｏ）の再構成によるデュアル投影追跡を実施するための方法を記載する。図１３Ａに示されている通り、Ｆｌｐリコンビナーゼ遺伝子を２つの非機能性の半分に分割した。Ｆｌｐｏ遺伝子のＮ末端側半分をその３’末端において合成イントロン配列、続いて二量体形成ドメイン配列（ＲＮＡ末端結合モジュール、ＲＥＪ）と結合した。Ｆｌｐｏ遺伝子のＣ末端側半分をその５’末端において合成イントロンおよび二量体形成ドメイン（ＲＥＪ－モジュール）と結合した。細胞に両方の構築物が感染し、各構築物からプレｍＲＮＡが発現されると、プレｍＲＮＡが二量体形成ドメイン（図１３Ａにおいて濃い並行した棒によって示されている）で結合し、得られた複合体がスプライスされて全長ＦｌｐｏリコンビナーゼｍＲＮＡ転写物が生じる。したがって、２つの断片の再構成によって機能的なリコンビナーゼタンパク質が生じた。図１３Ｂは、ｆｌｐｏ依存性赤色蛍光タンパク質（ｔｄＴｏｍａｔｏ）（Ｒｏｓａ－ＣＡＧ－ｆｒｔ－ＳＴＯＰ－ｆｒｔ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）を有するｆｌｐ活性レポーターマウスの概略図を示す。２つの合成核酸（ＤＮＡ）構築物を別々のアデノ随伴ウイルス（逆行輸送される血清型ＡＡＶ２／ｒｅｔｒｏ）にパッケージングした。第１の構築物を運ぶウイルスであるＡＡＶ２／ｒｅｔｒｏ－ｎ－ｆｌｐｏをマウスの左一次運動野に注射し、第２の構築物を運ぶウイルスであるＡＡＶ２／ｒｅｔｒｏ－ｃ－ｆｌｐｏをマウスの右一次運動野に注射した。

図１３Ｃ～１３Ｄに示されている通り、軸索が正中線を交差している一次運動野細胞が赤色蛍光タンパク質で標識される（図１３Ｃおよび１３Ｄにおいて白色に見える）。コンテキストとしてＨｏｅｃｈｓｔ染色（核）が示されている。

（実施例１５）
ｉｎｖｉｖｏにおける長いタンパク質の発現
本実施例では、細胞培養物中およびマウス一次運動野におけるｉｎｖｉｖｏでの特大カーゴの効率的な発現を実現するために使用する方法を記載する。

２つのウイルスのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カーゴ容量をいっぱいにする（すなわち、単一のＡＡＶのパッケージング容量を超える）、疾患を引き起こす大きな遺伝子をシミュレートするために、分割したＹＦＰコード配列を大きな中断なしのオープンリーディングフレームの内部に包埋した。Ｎ末端（すなわち、５’側）では、２Ａ自己切断性ペプチドをコードする配列が後に続く長いスタッファー配列（すなわち、中断なしのオープンリーディングフレーム）にＹＦＰコード配列の第１の部分が隣接する。Ｃ末端（すなわち、３’側）では、ＹＦＰコード配列の第２の部分の後に２Ａ自己切断性ペプチドコード配列が続き、次いで、長いスタッファー配列（すなわち、および中断なしのオープンリーディングフレーム）が続く（図１４Ａ）。プレｍＲＮＡ分子をコードする第１の合成ＤＮＡ分子および第２の合成ＤＮＡ分子が、プロモーター配列を除いて、配列番号２２および２３に示されている。得られる発現されたＲＮＡ分子はそれぞれ配列番号２２の１位にある転写開始部位および配列番号２３の１位にある転写開始部位とポリＡ尾部の間の約４０００ｎｔである。得られる転写されたプレｍＲＮＡ分子（５’断片；配列番号２２から転写される）は、スタッファーオープンリーディングフレームを含有し、その後には自己切断性２Ａペプチドコード配列が続き、その後、ＹＦＰのＮ末端部分をコードする配列が続き、その後、合成イントロンおよび二量体形成ドメイン（キッシングループアーキテクチャを有する）、ならびにポリＡ尾部が続く。Ｃ末端プレｍＲＮＡ分子（３’断片；配列番号２３から転写される）は、相補的なキッシングループ二量体形成ドメイン、合成イントロン配列、その後のＣ末端ＹＦＰコード配列、その後の自己切断性２Ａペプチドコード配列、その後のスタッファーオープンリーディングフレーム、その後のポリＡ尾部で構成される。

プレｍＲＮＡ分子が産生された後、二量体形成ドメインが結合し、スプライシングによりプレｍＲＮＡが結合して全長ｍＲＮＡが生じる。翻訳の間に、ＹＦＰに隣接する２Ａ切断配列によりＮ末端スタッファー配列およびＣ末端スタッファー配列の切断ならびに機能的ＹＦＰタンパク質の産生がもたらされる。

ＲＮＡレベルでの再構成効率を決定するために、２つのプローブに基づく（５’加水分解）定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを使用する。第１のアッセイは、３’エクソンＹＦＰ配列に完全に含有される配列にわたる（３’プローブで標識）。第２のアッセイは、５’エクソンＹＦＰ配列と３’エクソンＹＦＰ配列の結合部にわたる（結合部プローブで標識）。再構成効率は（結合部プローブ計数）／（３’プローブ計数）の比として算出される。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における特大ＹＦＰ構築物の再構成効率の定量的リアルタイムＰＣＲ分析を実施した。全長特大ＹＦＰを参照として使用する。全長特大ＹＦＰ比を１に設定する（図１４Ｂ）。再構成された比を、全長に対する分率として表す（標識された分割－ＲＥＪ（分割ＲＮＡ末端結合））。再構成効率は以下の通り算出される：結合部／３’プライム。図１４Ｂに示されている通り、分割－ＲＥＪ系でＲＮＡの約６０％が結合した。

全長特大ＹＦＰ発現および分割－ＲＥＪ発現からの再構成されたＹＦＰタンパク質の発現を、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリーによって評価した。図１４Ｃに示されている通り、分割ＲＥＪ系により、大きなカーゴであっても約４５％の結合効率が実現された。

大きなＹＦＰタンパク質の再構成に関するｉｎｖｉｖｏ分析を以下の通り実施した。３×１０^９ｖｇ／注射／断片を含有するアデノ随伴ウイルス２／８を６０ｎｌ、マウスの一次運動野に注射した。注射の１０日後に組織を回収した。図１４Ｄに示されている通り、バルク組織においてＹＦＰ蛍光が容易に検出可能である（左上、中央上のパネル、マウス脳の肉眼で見える上面図、ＹＦＰ蛍光に加えてコンテキストとして自家蛍光が示されている）。運動野の層５内のウイルス注射部位およびその周囲において強力なＹＦＰシグナルが検出される（右側のパネル、皮質層に１～６の番号が付されている、おおよその注射の深さが灰色の棒で示されている、スケールバー＝１００マイクロメートル）。したがって、本明細書に開示される系を使用して、大きなタンパク質をｉｎｖｉｖｏで発現させることができる。

（実施例１６）
第ＶＩＩＩ因子の発現
本実施例では、全長ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の効率的な再構成を実現するために使用する方法を記載する。

図１５Ａに示されている実験に使用した５’核酸分子および３’核酸分子の概略図（プレＲＮＡ分子をコードするＤＮＡがそれぞれ配列番号２４および２５に記載されている）。各半分が約３．８ｋｂのＦＶＩＩＩコード配列を含む。得られる、ＦＶＩＩＩコード配列のＲＮＡ５’配列を含有するＮ末端側半分（例えば、図６Ａの１１０に概略的に示されている）はその後に効率的な合成イントロンおよび二量体形成ドメイン（キッシングループアーキテクチャ）、ならびにポリＡ尾部が続く。ＦＶＩＩＩコード配列の３’配列を含有するＣ末端側半分（例えば、図６Ａの１５０）はその前に相補的なキッシングループ二量体形成ドメイン、および効率的な合成イントロン配列がある。ＲＮＡレベルでの再構成効率を決定するために、２つのプローブに基づく（５’－加水分解）定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを使用する。第１のアッセイは、３’エクソンＦＶＩＩＩ配列に完全に含有される配列にわたる（３’プローブで標識）。第２のアッセイは、５’エクソンＦＶＩＩＩ配列と３’エクソンＦＶＩＩＩ配列の結合部にわたる（結合部プローブで標識）。再構成効率は（結合部プローブ計数）／（３’プローブ計数）の比として算出される。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における発現の２日後の再構成効率のＰＣＲによる定量化を実施した。全長ＦＶＩＩＩを参照として使用する。全長ＦＶＩＩＩ比を１に設定する。再構成されたＦＶＩＩＩアッセイ比を全長に対する分率として表す（分割－ＲＥＪで標識）。図１５Ｂに示されている通り、約４０～６０％の再構成効率が実現された（つまり、２つのＲＮＡのうちの約４０～６０％が分割－ＲＥＪ系において結合された）。

ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＦＶＩＩＩの発現を実証するためにウエスタンブロッティングを使用した。ＦＶＩＩＩのＮ末端にＨＡタグでタグ付けした。構築物を２日間にわたってＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させる。図１５Ｃに示されている通り、本明細書に開示される分割－ＲＥＪ系により、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて全長ＦＶＩＩＩが首尾よく発現された。

これらの知見に基づいて、例えば、血友病Ａを処置するために、ｉｎｖｉｖｏにおける全長ＦＶＩＩＩタンパク質の発現を実現することができる。例えば、ＦＶＩＩＩコード配列の第１の半分を合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメインに付加し、第１のベクター／プラスミドから発現させる。ＦＶＩＩＩの第２の半分を相補的なＲＮＡ二量体形成および組換えドメインに付加し、第２のベクター／プラスミドから発現させる。同じ細胞において一緒に発現させると、ＦＶＩＩＩの両半分が組み換えられ全長ＦＶＩＩＩ転写物が形成され、次いでそれがタンパク質に翻訳される。例えば、Ｎ末端ＦＶＩＩＩコード配列を含む、配列番号２４に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列、およびＣ末端ＦＶＩＩＩコード配列を含む配列番号２５をｉｎｖｉｖｏ発現に利用することができる。

（実施例１７）
Ａｂｃａ４の発現
本実施例では、全長ヒトＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（Ａｂｃａ４）の効率的な再構成を実現するために使用する方法を記載する。

使用した５’分子および３’分子の概略図が図１６Ａ示されている（プレＲＮＡ分子をコードするＤＮＡはそれぞれ配列番号２０および２１に記載されている）。５’側半分は約３．６ｋｂのＡｂｃａ４コード配列を含み、３’側半分は約３．２ｋｂのＡｂｃａ４コード領域とそれに加えてＣ末端３×ＦＬＡＧタグを含む。５’側配列は、コード配列のＮ末端側半分、その後に効率的な合成イントロン配列および第１の二量体形成ドメイン（キッシングループ）を含有する。コード配列のＣ末端側半分を含有する３’側配列の前には相補的な（キッシングループ）二量体形成ドメインおよび効率的な合成イントロン配列がある。結合部にわたるサンガーシーケンシングトレースが示されている。

図１６Ｂに示されている通り、結合部のＰＣＲ増幅により、２つのコード配列の忠実な結合が実証される。ＲＮＡレベルでの再構成効率を決定するために、２つのプローブに基づく（５’－加水分解）定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを使用する（図１６Ｃ）。第１のアッセイは、３’エクソンＡｂｃａ４配列に完全に含有される配列にわたる（３’プローブで標識）。第２のアッセイは、５’エクソンＡｂｃａ４配列と３’エクソンＡｂｃａ４配列の結合部にわたる（結合部プローブで標識）。再構成効率は（結合部プローブ計数）／（３’プローブ計数）の比として算出される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における発現の２日後の再構成効率のＰＣＲによる定量が図１６Ｄに示されている。全長Ａｂｃａ４を参照として使用する。平均全長Ａｂｃａ４比を１に設定する。再構成されたＡｂｃａ４アッセイ比を全長に対する分率として表す（分割－ＲＥＪで標識）。図１６Ｄに示されている通り、約３５％の再構成効率が実現された（つまり、２つのＲＮＡのうちの約３０～４０％が分割－ＲＥＪ系において結合された）。

ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＡｂｃａ４の発現を実証するためにウエスタンブロッティングを使用した。Ａｂｃａ４のＣ末端に３×ＦＬＡＧ－タグでタグ付けする。構築物を２日間にわたってＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させる。図１６Ｅに示されている通り、本明細書に開示される分割－ＲＥＪ系により、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて全長Ａｂｃａ４が首尾よく発現された。

ウエスタンブロットの定量が図１６Ｆに示されている。条件間での示差的トランスフェクション効率について正規化するために、全長プラスミドおよびＣ末端プラスミドをトランスフェクション対照としての青色蛍光タンパク質と共発現させる。各試料におけるＢＦＰ濃度をドットブロットによって決定し、条件間での正規化に使用した。図１６Ｆに示されている通り、再構成されたＡｂｃａ４が直接全長発現と比較しておよそ４０％のレベルで発現される。したがって、ウエスタンブロットによって決定されるタンパク質レベルによりｑＰＣＲによって決定されるＲＮＡ再構成効率がよく追跡される。

これらの知見に基づいて、例えば、スタルガルト病を処置するために、ｉｎｖｉｖｏにおける全長ＡＢＣＡ４タンパク質の発現を実現することができる。例えば、ＡＢＣＡ４コード配列の第１の半分を合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメインに付加し、第１のベクター／プラスミドから発現させる。ＡＢＣＡ４の第２の半分を相補的なＲＮＡ二量体形成および組換えドメインに付加し、第２のベクター／プラスミドから発現させる。同じ細胞において一緒に発現させると、ＡＢＣＡ４の両半分が組み換えられ全長ＡＢＣＡ４転写物が形成され、次いでそれがタンパク質に翻訳される。例えば、Ｎ末端Ａｂｃａ４コード配列を含む、配列番号２０に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列（図１０Ｒ～１０Ｕ）、およびＣ末端Ａｂｃａ４コード配列を含む配列番号２１（図１０Ｖ～１０Ｚ）をｉｎｖｉｖｏ発現に利用することができる。

（実施例１８）
Ｏｔｏｆの発現
本実施例では、全長マウスオトフェルリン（Ｏｔｏｆ）の効率的な再構成を実現するために使用する方法を記載する。

使用した５’ＤＮＡ分子および３’ＤＮＡ分子の配列がそれぞれ配列番号１５５および１５６に示されている。５’側半分は約３．５ｋｂのＯｔｏｆコード配列を含み、３’側半分は約２．５ｋｂのＯｔｏｆコード領域とそれに加えてＣ末端３×ＦＬＡＧタグを含む。Ｃ末端側半分を含有する３’側配列（例えば、図６Ａの１５０）の前には相補的結合ドメインおよび効率的な合成イントロン配列がある。ヒトＯＴＯＦコード配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２８７４８９．２またはＮＭ＿１９４２４８．３）で配列番号１５５および１５６のマウスコード配列を置換することができることが当業者には理解されよう。

ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＯｔｏｆの発現を実証するためにウエスタンブロッティングを使用した。ウエスタンブロットによる検出のためにＯｔｏｆをＣ末端に３×ＦＬＡＧ－タグでタグ付けする。構築物を２日間にわたってＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させる。図１８Ａに示されている通り、本明細書に開示される分割－ＲＥＪ系により、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて全長Ｏｔｏｆが首尾よく発現された。

ウエスタンブロットの定量が図１８Ｂ～Ｃに示されている。生の定量が左側の棒プロット（図１８Ｂ）に全長対照に対する分率として示されている。条件間での示差的トランスフェクション効率について正規化するために、全長プラスミドおよびＣ末端プラスミドをトランスフェクション対照としての青色蛍光タンパク質と共発現させる。細胞を回収する前に各試料におけるＢＦＰ濃度を共焦点蛍光顕微鏡法によって決定し、条件間での正規化に使用した。正規化された定量が右側の棒プロット（図１８Ｃ）に全長対照に対する正規化された分率として示されている。図１８Ｃに示されている通り、再構成されたＯｔｏｆが直接全長発現と比較しておよそ３０％のレベルで発現される。

これらの知見に基づいて、例えば、常染色体劣性聴覚消失９を処置するために、ｉｎｖｉｖｏにおける全長ＯＴＯＦタンパク質の発現を実現することができる。例えば、ＯＴＯＦコード配列の第１の半分を合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメイン（イントロンおよび結合ドメインである）に付加し、第１のベクター／プラスミドから発現させる。ＯＴＯＦの第２の半分を相補的なＲＮＡ二量体形成および組換えドメインに付加し、第２のベクター／プラスミドから発現させる。同じ細胞において一緒に発現させると、２つのＲＮＡ分子が標的細胞において発現され、ＯＴＯＦコード転写物の両半分が組み換えられ全長ＯＴＯＦ転写物が形成され、次いでそれがタンパク質に翻訳される。例えば、聴力損失を処置するために、例えば、Ｎ末端Ｏｔｏｆコード配列を含む、配列番号１５５に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列、およびＣ末端Ｏｔｏｆコード配列を含む配列番号１５６をｉｎｖｉｖｏ発現に利用することができる。

（実施例１９）
Ｍｙｏ７ａの発現
本実施例では、全長ヒトミオシンＶＩＩＡ（Ｍｙｏ７ａ）の効率的な再構成を実現するために使用する方法を記載する。

使用した５’ＤＮＡ分子および３’ＤＮＡ分子の配列がそれぞれ配列番号１５７および１５８に示されている。５’側半分は約３．６ｋｂのＭｙｏ７ａコード配列を含み、３’側半分は約３．１ｋｂのＭｙｏ７ａコード領域とそれに加えてＣ末端３×ＦＬＡＧタグを含む。Ｃ末端側半分を含有する３’側配列（例えば、図６Ａの１５０）の前には相補的結合ドメインおよび効率的な合成イントロン配列がある。

ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＭｙｏ７ａの発現を実証するためにウエスタンブロッティングを使用した。ウエスタンブロットによる検出のためにＭｙｏ７ａのＣ末端に３×ＦＬＡＧ－タグでタグ付けする。構築物を２日間にわたってＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させる。図１９Ａに示されている通り、本明細書に開示される分割－ＲＥＪ系により、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて全長Ｍｙｏ７ａが首尾よく発現された。

ウエスタンブロットの定量が図１９Ｂ～１９Ｃに示されている。生の定量が左側の棒プロット（図１９Ｂ）に全長対照に対する分率として示されている。条件間での示差的トランスフェクション効率について正規化するために、全長プラスミドおよびＣ末端プラスミドをトランスフェクション対照としての青色蛍光タンパク質と共発現させる。細胞を回収する前に各試料におけるＢＦＰ濃度を共焦点蛍光顕微鏡法によって決定し、条件間での正規化に使用した。正規化された定量が右側の棒プロット（図１９Ｃ）に全長対照に対する正規化された分率として示されている。図１９Ｃに示されている通り、再構成されたＭｙｏ７ａが直接全長発現と比較しておよそ６０％のレベルで発現される。

これらの知見に基づいて、例えば、アッシャー症候群、１Ｂ型を処置するために、ｉｎ
ｖｉｖｏにおける全長ＭＹＯ７Ａタンパク質の発現を実現することができる。例えば、ＭＹＯ７Ａコード配列の第１の半分を合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメイン（イントロンおよび結合ドメインである）に付加し、第１のベクター／プラスミドから発現させる。ＭＹＯ７Ａの第２の半分を相補的なＲＮＡ二量体形成および組換えドメインに付加し、第２のベクター／プラスミドから発現させる。同じ細胞において一緒に発現させると、２つのＲＮＡ分子が標的細胞において発現され、両半分のＭＹＯ７Ａコード転写物が組み換えられ全長ＭＹＯ７Ａ転写物が形成され、次いでそれがタンパク質に翻訳される。例えば、Ｎ末端Ｍｙｏ７ａコード配列を含む、配列番号１５７に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列、およびＣ末端Ｍｙｏ７ａコード配列を含む配列番号１５８をｉｎｖｉｖｏ発現に利用することができる。
（実施例２０）
２つの部分からなる系におけるｄＣａｓ９－ＶＰＲの発現

本実施例では、ＶＰＲ転写活性化因子ドメインに融合した全長の酵素的に不活性型のＣａｓ９（ｄＣａｓ９－ＶＰＲ）の効率的な再構成を実現するために使用する方法を記載する。

使用した５’ＤＮＡ分子および３’ＤＮＡ分子（第１のＲＮＡ分子および第２のＲＮＡ分子をコードする第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子）の配列がそれぞれ配列番号１５９および１６０に示されている。第１のＤＮＡ分子は約３．３ｋｂのｄＣａｓ９－ＶＰＲコード配列（ｄＣａｓ９Ｎ末端部分）を含み、第２のＤＮＡ分子は約２．５ｋｂのｄＣａｓ９－ＶＰＲコード配列（ｄＣａｓ９Ｃ末端部分）を含む。５’側配列（第１のＤＮＡ分子）によってコードされるＲＮＡは、ｄＣａｓ９のＮ末端部分（例えば、図６Ａの１１０）、その後の効率的な合成イントロン配列および相補的な結合ドメイン（第１の二量体形成ドメイン）をコードする。３’側配列（第２のＤＮＡ分子）によってコードされるＲＮＡは、ｄＣａｓ９のＣ末端部分（例えば、図６Ａの１５０）、その前の相補的な結合ドメイン（第２の二量体形成ドメイン）および効率的な合成イントロン配列をコードする。

ｉｎｖｉｔｒｏにおけるｄＣａｓ９－ＶＰＲの発現を実証するために、ウエスタンブロッティングを使用した。構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞において２日間にわたって発現させた。図２０Ａに示されている通り、本明細書に開示される分割－ＲＥＪ系（「ＲＥＪ－デュアル」）によりｉｎｖｉｔｒｏで全長ｄＣａｓ９－ＶＰＲが首尾よく発現された。

ウエスタンブロットの定量が図２０Ｂ～２０Ｃに示されている。生の定量が左側の棒プロット（図２０Ｂ）に全長対照に対する分率として示されている。全長対照ｄＣａｓ９－ＶＰＲはインタクトな遺伝子を含む単一の構築物から産生された。条件間での示差的トランスフェクション効率について正規化するために、使用した全長プラスミドおよびＣ末端プラスミドをトランスフェクション対照としての青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）と共発現させる。細胞を回収する前に各試料におけるＢＦＰ濃度を共焦点蛍光顕微鏡法によって決定し、条件間での正規化に使用した。正規化された定量が右側の棒プロット（図２０Ｃ）に全長対照に対する正規化された分率として示されている。図２０Ｃに示されている通り、再構成されたｄＣａｓ９－ＶＰＲが直接全長発現と比較しておよそ３５％のレベルで発現される。ＨＥＫ２９３ｔ細胞においてＵＡＳを標的とするガイドＲＮＡと共に発現させると（図２０Ｄ）、全長ｄＣａｓ９－ＶＰＲおよび二方向分割再構成ｄＣａｓ９－ＶＰＲのどちらによってもＵＡＳ－ＹＦＰプラスミドからの黄色蛍光タンパク質の発現が誘導され、それにより、再構成されたｄＣａｓ９－ＶＰＲの機能性が実証される。

これらの知見に基づいて、例えば、遺伝子を活性化するまたは過剰発現させるために、ｉｎｖｉｖｏにおける全長ｄＣａｓ９－ＶＰＲタンパク質の発現を実現することができる。例えば、第１のＲＮＡ分子は、第１の合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメイン（イントロンおよび結合ドメインである）に付加したｄＣＡＳ９－ＶＰＲタンパク質コード配列の第１の部分を含む。この分子は第１のベクター／プラスミドから発現される。第２のＲＮＡ分子は相補的な第２のＲＮＡ二量体形成および組換えドメインに付加したｄＣＡＳ９－ＶＰＲタンパク質コード配列の第２の部分を含み、第２のベクター／プラスミドから発現される。２つのＲＮＡ分子が同じ標的細胞において発現されると、ＤＣＡＳ９－ＶＰＲコード転写物の２つの部分が組み換えられて全長ｄＣＡＳ９－ＶＰＲ転写物が形成され、次いでそれがタンパク質に翻訳される。例えば、Ｎ末端ｄＣａｓ９－ＶＰＲコード配列を含む配列番号１５９、およびＣ末端ｄＣａｓ９－ＶＰＲコード配列を含む配列番号１６０に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列をｉｎｖｉｖｏ発現に利用することができる。
（実施例２１）
２つの部分からなる系におけるプライムエディターの発現

本実施例では、全長ヒト化Ｃａｓ９プライムエディター（プライムエディター）の効率的な再構成を実現するために使用する方法を記載する。

使用した５’ＤＮＡ分子および３’ＤＮＡ分子（第１のＲＮＡ分子および第２のＲＮＡ分子をコードする第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子）の配列がそれぞれ配列番号１６１および１６２に示されている。第１のＤＮＡ分子は約３．３ｋｂのプライムエディターコード配列（Ｎ末端部分）を含み、第２の部分は、約３．０ｋｂのプライムエディターコード配列（Ｃ末端部分）を含む。５’側配列（第１のＤＮＡ分子）によってコードされるＲＮＡは、プライムエディターのＮ末端部分（例えば、図６Ａの１１０）、その後の効率的な合成イントロン配列および相補的な結合ドメイン（第１の二量体形成ドメイン）をコードする。３’側配列（第２のＤＮＡ分子）によってコードされるＲＮＡは、プライムエディターのＣ末端部分（例えば、図６Ａの１５０）、その前の相補的な結合ドメイン（第２の二量体形成ドメイン）および効率的な合成イントロン配列をコードする。

ｉｎｖｉｔｒｏにおけるプライムエディターの発現を実証するために、ウエスタンブロッティングを使用した。構築物をＨＥＫ２９３ｔ細胞において２日間にわたって発現させた。図２１Ａに示されている通り、本明細書に開示される分割－ＲＥＪ系により、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて全長プライムエディターが首尾よく発現された。

ウエスタンブロットの定量が図２１Ｂ～２１Ｃに示されている。生の定量が左側の棒プロット（図２１Ｂ）に全長対照に対する分率として示されている。全長対照プライムエディターはインタクトな遺伝子を含む単一の構築物から産生された。条件間での示差的トランスフェクション効率について正規化するために、使用した全長プラスミドおよびＣ末端プラスミドをトランスフェクション対照としての青色蛍光タンパク質と共発現させた。細胞を回収する前に各試料におけるＢＦＰ濃度を共焦点蛍光顕微鏡法によって決定し、条件間での正規化に使用した。正規化された定量が右側の棒プロット（図２１Ｃ）に全長対照に対する正規化された分率として示されている。図２１Ｃに示されている通り、再構成されたプライムエディターが直接全長発現と比較しておよそ６０％のレベルで発現される。図２１Ｄは、全長プライムエディターおよび二方向分割プライムエディターを使用して標的化されたＧからＴへの塩基転換変異を導入することができることを示し、それにより、二方向分割プライムエディター構築物から産生されたタンパク質の機能性が実証される。

これらの知見に基づいて、例えば、ゲノム点変異を処置するために、ｉｎｖｉｖｏにおける全長プライムエディタータンパク質の発現を実現することができる。例えば、第１のＲＮＡ分子は、第１の合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメイン（イントロンおよび結合ドメインである）に付加されたプライムエディターコード配列の第１の部分を含む。この分子は第１のベクター／プラスミドから発現される。第２のＲＮＡ分子は、第２の相補的なＲＮＡ二量体形成および組換えドメインに付加されたプライムエディタータンパク質コード配列の第２の部分を含み、第２のベクター／プラスミドから発現される。２つのＲＮＡ分子が同じ標的細胞において発現されると、プライムエディターコード転写物の２つの部分が組み換えられて全長プライムエディター転写物が形成され、次いでそれがタンパク質に翻訳される。例えば、Ｎ末端プライムエディターコード配列を含む配列番号１６１、およびＣ末端プライムエディターコード配列を含む配列番号１６２に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列をｉｎｖｉｖｏ発現に利用することができる。
（実施例２２）
２つの部分からなる系におけるＡｎｃＢＥ４の発現

本実施例では、全長ヒト化Ｃａｓ９シトシン塩基エディター（ＡｎｃＢＥ４）の効率的な再構成を実現するために使用する方法を記載する。

使用した５’ＤＮＡ分子および３’ＤＮＡ分子（第１のＲＮＡ分子および第２のＲＮＡ分子をコードする第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子）の配列がそれぞれ配列番号１６３および１６４に示されている。第１のＤＮＡ分子は約２．４ｋｂのＡｎｃＢＥ４コード配列（ＡｎｃＢＥ４Ｎ末端部分）を含み、第２のＤＮＡ分子は約３．２ｋｂのＡｎｃＢＥ４コード配列（ＡｎｃＢＥ４Ｃ末端部分）を含む。５’側配列（第１のＤＮＡ分子）によってコードされるＲＮＡは、ＡｎｃＢＥ４のＮ末端部分（例えば、図６Ａの１１０）、その後の効率的な合成イントロン配列および相補的な結合ドメイン（第１の二量体形成ドメイン）をコードする。３’側配列によって（第２のＤＮＡ分子によって）コードされるＲＮＡは、Ｃ末端部分（例えば、図６Ａの１５０）、その前の相補的な結合ドメインおよび効率的な合成イントロン配列をコードする。

ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＡｎｃＢＥ４の発現を実証するために、ウエスタンブロッティングを使用した。構築物を２日間にわたってＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させる。図２２Ａに示されている通り、本明細書に開示される分割－ＲＥＪ系により、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて全長ＡｎｃＢＥ４が首尾よく発現された。

ウエスタンブロットの定量が図２２Ｂに示されている。生の定量が左側の棒プロット（図２２Ｂ）に全長対照に対する分率として示されている。全長対照ＡｎｃＢＥ４はインタクトな遺伝子を含む単一の構築物から産生された。図２２Ｂに示されている通り、再構成されたＡｎｃＢＥ４が直接全長発現と比較しておよそ４０～５０％のレベルで発現される。図２２Ｃは、全長および二方向分割ＡｎｃＢＥ４を使用して標的化されたＣからＴへの転位変異を導入することができることを示し、それにより二方向分割ＡｎｃＢＥ４構築物の機能性が実証される。

これらの知見に基づいて、例えば、ゲノム点変異を処置するために、ｉｎｖｉｖｏにおける全長ＡＮＣＢＥ４タンパク質の発現を実現することができる。例えば、第１のＲＮＡ分子は、第１の合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメイン（イントロンおよび結合ドメインである）に付加したＡＮＣＢＥ４タンパク質コード配列の第１の部分を含む。この分子は第１のベクター／プラスミドから発現される。相補的なＲＮＡ二量体形成および組換えドメインに付加したＡＮＣＢＥ４タンパク質コード配列の第２の部分を含む第２のＲＮＡ分子を第２のベクター／プラスミドから発現させる。２つのＲＮＡ分子が同じ標的細胞において発現されると、ＡＮＣＢＥ４コード転写物の２つの部分が組み換えられて全長ＡＮＣＢＥ４転写物が形成され、次いでそれがタンパク質に翻訳される。例えば、Ｎ末端ＡｎｃＢＥ４コード配列を含む、配列番号１６３に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列、およびＣ末端ＡｎｃＢＥ４コード配列を含む配列番号１６４をｉｎｖｉｖｏ発現に利用することができる。
（実施例２３）
ｉｎｖｉｖｏにおけるＡＢＥ８ｅの発現およびジストロフィン変異のレスキュー

本実施例では、ｉｎｖｉｖｏにおける全長ヒト化Ｃａｓ９アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ８ｅ）の効率的な再構成を実現し、それにより、ｍｄｘ中途終止コドンの編集および処置された筋肉におけるジストロフィンの発現をもたらすために使用する方法を記載する。

使用した５’ＤＮＡ分子および３’ＤＮＡ分子の配列がそれぞれ配列番号２２５および２６に示されている（上記のｇＲＮＡ発現カセットを含む）。配列番号２２５および２２６内の塩基エディター発現構築物はそれぞれ配列番号１６５および１６６によって構成される。第１のＤＮＡ分子（配列番号２２５および１６５内）は約２．４ｋｂのＡＢＥ８ｅコード配列（ＡＢＥ８ｅＮ末端部分）を含み、第２のＤＮＡ分子（配列番号２２６および１６６内）は約３．２ｋｂのＡＢＥ８ｅコード配列を含む。５’側配列（第１のＤＮＡ分子）によってコードされるＲＮＡは、ＡＢＥ８ｅのＮ末端部分（例えば、図６Ａの１１０）をコードする。３’側配列（第２のＤＮＡ分子）によってコードされるＲＮＡは、Ｃ末端部分（例えば、図６Ａの１５０）およびその前の相補的な結合ドメイン（第２の二量体形成ドメイン）および効率的な合成イントロン配列をコードする。

ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＡＢＥ８ｅの発現を実証するために、ウエスタンブロッティングを使用した。構築物をＨＥＫ２９３ｔ細胞において２日間にわたって発現させた。図２３Ａに示されている通り、本明細書に開示される分割－ＲＥＪ系により、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて全長ＡＢＥ８ｅが首尾よく発現された。

ウエスタンブロットの定量が図２３Ｂに示されている。生の定量が左側の棒プロット（図２３Ｂ）に全長対照に対する分率として示されている。全長対照ＡＢＥ８ｅはインタクトな遺伝子を含む単一の構築物から産生された。図２３Ｂに示されている通り、再構成されたＡＢＥ８ｅが直接全長発現と比較しておよそ７０％のレベルで発現される。図２３Ｃは、全長および二方向分割ＡＢＥ８ｅ構築物を使用して標的化されたＣからＴへの転位変異を導入することができることを示し、それにより、二方向分割ＡＢＥ８ｅ構築物の機能性が実証される。

中途終止コドンを補正するための全長ヒト化アデニン塩基エディター（ＡＢＥ８ｅ）（１６０６アミノ酸）の効率的な再構成および発現を実証するために、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのｍｄｘ－４ｃｖマウスモデルにおいて中途終止コドンを補正する実施例が図２３Ｄ～Ｇに示されている。図２３Ｄは実験の概略図を示す。ＡＢＥ８ｅ塩基エディターを２つの断片に分割し、そのコードＤＮＡを２つの別々のアデノ随伴ウイルスカプシドに個別にパッケージングする。ＣＲＩＳＰＲｇＲＮＡを、ＡからＧへの変換によりＴＡＡ終止コドンがＣＡＡコドンに変換されるように、中途終止コドンの遺伝子座を標的とするように設計する。

ＡＢＥ８ｅ塩基エディターおよび設計されたＣＲＩＳＰＲｇＲＮＡの機能性を実証するために、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を、中途終止コドンの周囲のｍｄｘコード配列の短い一続きで接続された２つのコード断片に分割することを図２３Ｅに示す。ＹＦＰの第１の半分は、オープンリーディングフレームが中途ＴＡＡ終止コドンによって終止する場合には非蛍光である。終止コドン補正の結果、蛍光が付与された完全なＹＦＰ配列の翻訳がもたらされる（この構築物はＹＦＰ－編集－レポーターと称される）。左側のパネルは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＹＦＰ－編集－レポーター（赤色蛍光トランスフェクション対照を共発現する）、Ｎ末端ＡＢＥ８ｅベクター、Ｃ末端ＡＢＥ８ｅベクター、および非標的化ｇＲＮＡをトランスフェクトした場合にはＹＦＰ蛍光が存在しないこと示す。右側のパネルは、ＹＦＰ－編集－レポーター（赤色蛍光トランスフェクション対照を共発現する）、Ｎ末端ＡＢＥ８ｅベクター、Ｃ末端ＡＢＥ８ｅベクター、およびｍｄｘ遺伝子座標的化ｇＲＮＡを共トランスフェクトした細胞では高いパーセンテージでＹＦＰ蛍光が発現されること示す。

効率的な合成イントロン配列を使用して再構成された分割ＡＢＥ８ｅ塩基エディターのｉｎｖｉｖｏ活性を実証するために、処置された筋肉におけるジストロフィンの発現をもたらすｍｄｘ中途終止コドンのｉｎｖｉｖｏ編集を図２３Ｆに示す。雄ｍｄｘ変異マウスに、アデノ随伴ウイルス８ベクター中にパッケージングされたＮ末端ＡＢＥ８ｅ構築物とＣ末端ＡＢＥ８ｅ構築物の混合物を注射する。ウイルスゲノムはそれぞれが２つのｇＲＮＡ発現カセット（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターとｇＲＮＡ配列で構成される）を含有する。ウイルスミックスを前脛骨筋に筋肉内注射した。右上のパネルは、参照として野生型前脛骨筋横断面におけるジストロフィン染色を示す（例えば、陽性対照）。左下のパネルは、無処置の前脛骨筋組織を示す（例えば、陰性対照）。右下のパネルは、２つのアデノ随伴ウイルスを注射した前脛骨筋におけるジストロフィンの発現を示す。

効率的な合成イントロン配列を使用して再構成された分割ＡＢＥ８ｅ塩基エディターを使用した中途終止コドンの補正をさらに実証するために、ＡＢＥ８ｅを発現させるためにアデノ随伴ウイルスミックスを用いて処置した前脛骨筋のジストロフィン発現（上のパネル）、ＡＢＥ８ｅ発現（中央のパネル）、およびＧＡＰＤＨローディング対照（下のパネル）を図２３Ｇに示す。これにより、ＡＢＥ８ｅ塩基エディターを使用したジストロフィン発現のレスキューが例示される。

これらの知見に基づいて、例えば、ゲノム点変異を処置するために、ｉｎｖｉｖｏにおける全長ＡＢＥ８ｅタンパク質の発現を実現することができる。例えば、第１のＲＮＡ分子は、第１の合成ＲＮＡ二量体形成および組換えドメイン（イントロンおよび結合ドメインである）に付加したＡＢＥ８ｅタンパク質コード配列の第１の部分を含む。この分子は第１のベクター／プラスミドから発現される。第２のＲＮＡ分子は、相補的な第２のＲＮＡ二量体形成および組換えドメインに付加したＡＢＥ８ｅタンパク質コード配列の第２の部分を含み、第２のベクター／プラスミドから発現される。例えば図６Ｇに例示される通り、これらのＤＮＡベクター／プラスミドの一方または両方が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターとｇＲＮＡ／ガイドＲＮＡ／ｇＲＮＡ配列で構成されるｇＲＮＡ／ガイドＲＮＡ／ｇＲＮＡ発現カセットを含有する。例えば、本開示の組成物は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つのｇＲＮＡ／ガイドＲＮＡ／ｇＲＮＡ発現カセットを含み得る。２つのＲＮＡ分子が同じ標的細胞において発現されると、ＡＢＥ８ｅコード転写物の２つの部分が組み換えられて全長ＡＢＥ８ｅ転写物が形成され、次いでそれがタンパク質に翻訳される。例えば、Ｎ末端ＡＢＥ８ｅコード配列を含む配列番号１６５、およびＣ末端ＡＢＥ８ｅコード配列を含む配列番号１６６に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列をｉｎｖｉｖｏ発現に利用することができる。

（実施例２４）
ＲＮＡ断片の長さが増すと二方向分割遺伝子の再構成が低減する
５’断片をコードするＲＮＡ分子および３’断片をコードするＲＮＡ分子の長さの影響を評価した。

黄色蛍光タンパク質（ｙｆｐ）コード配列を２つの断片に分割した。ＲＮＡコード分子を伸長させるために、スタッファーオープンリーディングフレームをそれぞれ５’断片の５’末端および３’断片の３’末端に組み込んだ。５’ｙｆｐコード配列を、伸長させたスタッファーオープンリーディングフレームに自己切断性２Ａ配列を介して融合した。ｙｆｐの３’ｙｆｐコード配列を伸長させたスタッファーオープンリーディングフレームに自己切断性２Ａ配列を介して連結した。ｙｆｐの５’断片とｙｆｐの３’断片の分割点にＲＮＡ末端結合モジュール（合成イントロンとそれに加えて結合ドメイン）を組み込んだ。自己切断性２Ａ配列により、翻訳後にＹＦＰタンパク質をそれぞれのスタッファーオープンリーディングフレームから分離することが可能になる。異なる長さのスタッファーオープンリーディングフレームを組み入れることにより、４種の５’断片コード構築物および４種の３’断片コード構築物をアセンブルした。これらの構築物から転写されたＲＮＡ（タンパク質コード配列とそれに加えて合成イントロンおよび結合ドメイン）の長さは、５’断片については１０００ｎｔ、２０００ｎｔ、３０００ｎｔ、および４０００ｎｔであり、３’断片については１０００ｎｔ、２０００ｎｔ、３０００ｎｔ、および４０００ｎｔであった。

ＹＦＰ再構成の効率を全部で１６種の５’断片と３’断片の対の間で比較した。この比較では、最も短い構築物（すなわち、５’－１０００ｎｔと３’－１０００ｎｔ）を対にした場合にＹＦＰが最も効率的に再構成された。より長いスタッファー配列を有する断片を対にした場合には再構成効率の低下が観察された。最も短い対（５’－１０００ｎｔと３’－１０００ｎｔ）に対するパーセントとして、以下のＹＦＰ再構成効率が認められた：
５’－１０００ｎｔと３’－１０００ｎｔ：１００％
５’－１０００ｎｔと３’－２０００ｎｔ：約４０％
５’－１０００ｎｔと３’－３０００ｎｔ：約２０％
５’－１０００ｎｔと３’－４０００ｎｔ：約１６％
５’－２０００ｎｔと３’－１０００ｎｔ：約５５％
５’－２０００ｎｔと３’－２０００ｎｔ：約３０％
５’－２０００ｎｔと３’－３０００ｎｔ：約２０％
５’－２０００ｎｔと３’－４０００ｎｔ：約１５％
５’－３０００ｎｔと３’－１０００ｎｔ：約６０％
５’－３０００ｎｔと３’－２０００ｎｔ：約４０％
５’－３０００ｎｔと３’－３０００ｎｔ：約２５％
５’－３０００ｎｔと３’－４０００ｎｔ：約２０％
５’－４０００ｎｔと３’－１０００ｎｔ：約４０％
５’－４０００ｎｔと３’－２０００ｎｔ：約３５％
５’－４０００ｎｔと３’－３０００ｎｔ：約２０％
５’－４０００ｎｔと３’－４０００ｎｔ：約１５％。

これらのデータにより、分割された遺伝子の５’コード配列および３’コード配列をコードする断片の長さが増すにつれて分割された遺伝子の再構成の効率が低下することが例示される。

（実施例２５）
下流イントロンスプライシングエンハンサーおよびイントロンスプライシングエンハンサー配列を用いたＲＮＡ末端結合反応の増強。

本実施例では、特定のスプライシングエンハンサー配列を組み入れることによって２つのＲＮＡ分子の効率的な結合を実現するために使用する方法を記載する。

イントロンスプライシングエンハンサー配列を選択することの効果を、分割された黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を三峰性キッシングループＲＮＡ二量体形成ドメインおよびイントロンセグメントの種々のライブラリーで構成されるＲＮＡ末端結合モジュールを使用して再構成するスクリーニングプラットフォームを使用して調査した。使用した５’ＤＮＡ分子および３’ＤＮＡ分子の配列がそれぞれ配列番号１７１および１７２に示されている（以下の表５の配列のうちの少なくとも１つ、例えば、これらの配列の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つなど、配列内の一連のＮはイントロンライブラリー配置の部位を示す）。

ｉｎｖｉｔｒｏにおける再構成されたｙｆｐの発現を実証するために、フローサイトメトリーを使用して、５’ＤＮＡ分子および３’ＤＮＡ分子をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｙｆｐ蛍光強度を決定した。図２４Ａに示されている通り、本明細書に開示される分割－ＲＥＪ系のイントロン部分を個々のセグメントに細分して、ＲＮＡ結合反応を容易にする効率的なイントロンスプライシングエンハンサー配列についてスクリーニングした。構築物の５’イントロン部分の３つの位置および３’イントロン部分の３つの位置に使用した配列が配列番号１７３～２０４に示され（表５）、図２４Ｃに列挙されている。
表5: 例示的なイントロンスプライシングエンハンサー配列

フローサイトメトリーの定量が図２４Ｂに示されている。５’スプライス部位選択促進スプライシング因子ＴＩＡ－１（Ｔ細胞により制限される細胞内抗原－１）の動員を刺激するためにイントロン配列を組み入れることにより、ＲＮＡ末端結合を増加させることができる。一部の実施例では、ＷＧＧＧモチーフを含有する配列によりＲＮＡ末端結合が増強される。

これらの知見に基づいて、ｉｎｖｉｖｏにおける分割されたタンパク質全長の発現を、ＲＮＡ末端結合モジュールの特定のイントロンスプライシングエンハンサー配列をイントロン部分に組み入れることによって増強することができる。例えば、配列番号１７３～１８０、１８２～１９６、または１９９～２０３のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する１つまたは複数の配列（例えば、１つ、２つ、または３つの配列）をＲＮＡ末端結合反応産物のｉｎｖｉｖｏ発現に利用することができる（例えば、本明細書に提示される任意の実施形態のＩＳＥとして使用することができる）。
（実施例２６）
ｉｎｖｉｖｏにおけるジストロフィンの補正

本実施例では、本明細書に開示される方法を使用してｉｎｖｉｖｏにおいて遺伝子を編集することができることをさらに実証する方法および結果を記載する。

使用した２つの部分からなる（デュアル）ＲＥＪＣａｓ９－アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）系は、それぞれがＡＡＶ８ベクターにパッケージングされた配列番号２２５および２２６を含む、実施例２３に記載のものであった。これらの２つの構築物（第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子）では、核酸編集タンパク質が、それぞれ配列番号１６５および１６６の部分配列によって２つの部分にコードされる。系をｍｄｘ－４ｃｖマウス（変異Ｄｍｄ遺伝子を有し、筋線維の壊死、線維症および中心に核を有する骨格筋線維を示す）の前脛骨筋に２つのＡＡＶ８ベクターを直接筋肉内注射することによって投与した（全部で筋肉当たり２×１０^１１個のウイルスゲノム）。４週齢の時点で注射を行い、その後、８週齢の時点で安楽死させた。野生型（ｗｔ）マウス、無処置のマウス、および処置されたマウスにおける、Ｃａｓ９－ＡＢＥおよび筋肉抽出物におけるジストロフィン発現をウエスタンブロットによって定量した。

図２５Ａに示されている通り、処置されたｍｄｘ－４ｃｖマウスでは、Ｃａｓ９－ＡＢＥが頑強に発現され、それにより、筋肉におけるジストロフィン発現の回復がもたらされるが、一方、無処置のｍｄｘ－４ｃｖマウスではそのような発現は示されない。ＧＡＰＤＨ発現を使用してタンパク質抽出物濃度をモニタリングした。

図２５Ｂに示されている通り、抗ジストロフィン一次抗体を使用して免疫組織化学的検査によって可視化した筋肉におけるジストロフィン発現から、処置されたマウスでは筋肉片における特徴的なジストロフィン－サルコグリカン（sacroglycan）複合体の回復が示されるが、無処置のマウスではそれが示されないことが実証される。

本明細書に開示される原理を適用することができる多くの可能性のある実施形態を考慮して、例示されている実施形態は単に本発明の例であり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことが認識されるべきである。そうではなく、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、これらの特許請求の範囲の範囲および主旨に入る全てが本発明者らの発明であることを主張する。

Claims

核酸編集タンパク質を発現させるための組成物であって、
（ａ）第１のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、
（ｉ）前記核酸編集タンパク質のＮ末端部分のコード配列；
（ｉｉ）スプライスドナー；および
（ｉｉｉ）第１の二量体形成ドメイン
を含む、第１のＲＮＡ分子；ならびに
（ｂ）第２のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、
（ｉ）前記第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；
（ｉｉ）分岐点配列；
（ｉｉｉ）ポリピリミジントラクト；
（ｉｖ）スプライスアクセプター；および
（ｖ）前記核酸編集タンパク質のＣ末端部分のコード配列
を含む、第２のＲＮＡ分子；
（ｃ）必要に応じて、第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第３のＲＮＡ分子であって、前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡが、前記核酸編集タンパク質を前記第１の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、第３のＲＮＡ分子；
（ｄ）必要に応じて、（ｉ）前記核酸編集タンパク質を前記第１の核酸分子上の同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、前記第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第２のｇＲＮＡ、または（ｉｉ）前記核酸編集タンパク質を第２の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、前記第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第２のｇＲＮＡを含む、第４のＲＮＡ分子、
（ｅ）必要に応じて、（ｉ）前記核酸編集タンパク質を前記第１の核酸分子上の前記第１のｇＲＮＡおよび前記第２のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、前記第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、（ｉｉ）前記核酸編集タンパク質を前記第２の核酸分子上の前記第２のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、前記第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、または（ｉｉｉ）前記核酸編集タンパク質を第３の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、前記第３の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第３のｇＲＮＡを含む、第５のＲＮＡ分子；ならびに
（ｆ）必要に応じて、（ｉ）前記核酸編集タンパク質を前記第１の核酸分子上の前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、および前記第３のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、前記第１の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、（ｉｉ）前記核酸編集タンパク質を前記第２の核酸分子上の前記第２のｇＲＮＡのおよび前記第３のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、前記第２の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）前記核酸編集タンパク質を前記第３の標的核酸分子上の前記第３のｇＲＮＡと同じもしくは異なる標的編集部位に方向付ける、前記第３の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡ、または（ｉｖ）前記核酸編集タンパク質を第４の標的核酸分子上の標的編集部位に方向付ける、前記第４の標的核酸分子に特異的な少なくとも１つの第４のｇＲＮＡを含む、第６のＲＮＡ分子
を含む、組成物。
前記第１の二量体形成ドメインと前記第２の二量体形成ドメインが、直接結合、間接結合、またはこれらの組合せによって結合している、請求項１に記載の組成物。
直接結合または間接結合が、塩基対合相互作用、非標準的な塩基対合相互作用、非塩基対合相互作用、またはこれらの組合せを含む、請求項２に記載の組成物。
直接結合が、キッシングループ間または低多様性領域間の塩基対合相互作用を含む、請求項２または３に記載の組成物。
直接結合が、アプタマー領域間の非標準的な塩基対合相互作用、非標準的な塩基対合相互作用、非塩基対合相互作用、またはこれらの組合せを含む、請求項２または３に記載の組成物。
間接結合が、核酸架橋を通じた塩基対合相互作用を含む、請求項２または３に記載の組成物。
間接結合が、アプタマーとアプタマーの標的との間、または２つのアプタマー間の非塩基対合相互作用を含む、請求項２に記載の組成物。
前記第１の二量体形成ドメインまたは前記第２の二量体形成ドメインが、潜在スプライスアクセプターを含まない、請求項１から７までのいずれか一項に記載の組成物。
前記二量体形成ドメインが、アプタマー配列二量体形成ドメインと直接結合しているかまたは間接的に結合している、請求項１から８までのいずれか一項に記載の組成物。
前記二量体形成ドメインが、キッシングループ相互作用ドメインである、請求項１から９までのいずれか一項に記載の組成物。
前記標的編集部位が、疾患に関連する標的核酸分子または標的核酸分子の調節領域の一部である、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の組成物。
前記疾患が、単一遺伝子疾患である、請求項１１に記載の組成物。
前記第１の標的核酸分子、前記第２の標的核酸分子、前記第３の標的核酸分子、および／または前記第４の標的核酸分子が、前記疾患をもたらす１つまたは複数の点変異を含む、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の組成物。
前記疾患ならびに前記第１の標的核酸分子、前記第２の標的核酸分子、前記第３の標的核酸分子、および／または前記第４の標的核酸分子が、表１～４に列挙されているものである、請求項１１から１３までのいずれか一項に記載の組成物。
前記第１のＲＮＡ分子が、前記スプライスドナーに対して３’側であり前記第１の二量体形成ドメインに対して５’側の下流イントロンスプライスエンハンサー（ＤＩＳＥ）、前記スプライスドナーに対して３’側であり前記第１の二量体形成ドメインに対して５’側のイントロンスプライスエンハンサー（ＩＳＥ）のうちの一方もしくは両方をさらに含む；および／または
前記第２のＲＮＡ分子が、前記第２の二量体形成ドメインに対して３’側であり前記分岐点配列に対して５’側のＩＳＥ、および前記スプライスドナーに対して３’側であり前記二量体形成ドメインに対して５’側のＤＩＳＥのうちの一方もしくは両方をさらに含む；
またはこれらの任意の組合せである、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の組成物。
前記第１のＲＮＡ分子が、前記スプライスドナーに対して３’側の任意の場所に位置を占めた自己切断性ＲＮＡ配列またはＲＮＡ切断酵素標的配列をさらに含み、したがって、３’に位置するポリアデニル化尾部を切断して、組み換えられていないＲＮＡ分子からのタンパク質断片の発現を低減または抑制するか；
前記第２のＲＮＡ分子が、前記分岐点配列に対して５’側の任意の場所に位置を占めた自己切断性ＲＮＡ配列またはＲＮＡ切断酵素標的配列をさらに含み、したがって、５’に位置するＲＮＡキャップを切断して、組み換えられていないＲＮＡ分子からのタンパク質断片の発現を低減または抑制するか；
前記第２のＲＮＡ分子が、前記スプライスアクセプターの３’側にあるオープンリーディングフレームに関してシフトされる開始コドンを前記分岐点配列に対して５’側の任意の場所にさらに含んで、組み換えられていないＲＮＡ分子からの核酸編集タンパク質断片の翻訳を低減または抑制するか；
前記第１のＲＮＡ分子が、前記スプライスドナーに対して３’側の任意の場所にマイクロＲＮＡ標的部位をさらに含み、したがって、結合していないＲＮＡ断片が核の外側に出るとマイクロＲＮＡ依存性分解を受けるか；
前記第２のＲＮＡ分子が、前記コード配列に対して３’側の任意の場所にマイクロＲＮＡ標的部位をさらに含み、したがって、結合していないＲＮＡ断片が核の外側に出るとマイクロＲＮＡ依存性分解を受けるか；
前記第１のＲＮＡ分子が、デグロンタンパク質分解タグをコードする配列を、前記スプライスドナーに対して３’側の任意の場所に前記スプライスドナー部位の５’側にある前記核酸編集タンパク質のオープンリーディングフレームとインフレームになるようにさらに含み、したがって、結合していないタンパク質断片が分解に関してタグ付けされるか；
前記第２のＲＮＡ分子が、開始コドンおよびインフレームのデグロンタンパク質分解タグを、前記分岐点配列に対して５’側の任意の場所に前記スプライスアクセプター部位の３’側の前記核酸編集タンパク質のオープンリーディングフレームとインフレームになるようにさらに含み、したがって、結合していないタンパク質断片が分解に関してタグ付けされるか；
またはこれらの任意の組合せである、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の組成物。
前記核酸編集タンパク質が、Ｃａｓヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを含む、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の組成物。
前記第１の標的核酸分子、前記第２の標的核酸分子、前記第３の標的核酸分子、および／または前記第４の標的核酸分子が、標的ＤＮＡ分子であり、前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、および／または第４のｇＲＮＡが、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の組成物。
前記核酸編集タンパク質が、Ｃａｓ９または死んだＣａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む、請求項１８に記載の組成物。
前記Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号２０８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含み、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能し得るか；
前記Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号２０７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む配列によってコードされ、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするか；
前記ｄＣａｓ９タンパク質が、配列番号２１０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含み、触媒として不活性であるか；
前記ｄＣａｓ９タンパク質が、配列番号２０９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む配列によってコードされ、触媒として不活性であるタンパク質をコードする、請求項１９に記載の組成物。
前記Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９が、融合タンパク質の一部である、請求項１９または２０に記載の組成物。
前記融合タンパク質が、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９と、転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＣＢＰ、ＳＥＴ７／９、またはこれらの任意の組合せ；
シトシン塩基エディター（ＣＢＥ）、例えば、ウミヤツメ由来のもの［ＡＩＤ］、ＣＤＡ１、またはＡＰＯＢＥＣ３Ｇ；
バクテリオファージタンパク質Ｇａｍ；および
アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、ＡＢＥ６．３、７．８、７．９、７．１０、ＡＢＥｍａｘ、ＡＢＥ８ｅ（ＴａｄＡ－８ｅＶ１０６Ｗ）などのＡＢＥ８ｓのうちの１つまたは複数とを含む、請求項２１に記載の組成物。
前記第１の標的核酸分子、前記第２の標的核酸分子、前記第３の標的核酸分子、および／または前記第４の標的核酸分子が、標的ＲＮＡであり、前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、および／または第４のｇＲＮＡが、１つまたは複数のダイレクトリピートおよび１つまたは複数のスペーサーを含む、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の組成物。
前記核酸編集タンパク質が、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄまたは死んだＣａｓ１３ｄ（ｄＣａｓ１３ｄ）を含む、請求項２３に記載の組成物。
前記Ｃａｓ１３ｄタンパク質が、配列番号２１２、２１５、または２２２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含み、ＲＮＡ誘導型ＲＮＡエンドヌクレアーゼとして機能し得るか；
前記Ｃａｓ１３ｄタンパク質が、配列番号２１１または２１３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む配列によってコードされ、ＲＮＡ誘導型ＲＮＡエンドヌクレアーゼをコードするか；
前記ｄＣａｓ１３ｄタンパク質が、配列番号２１５または２１６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含み、触媒として不活性であるか；
前記ｄＣａｓ１３ｄタンパク質が、配列番号２１５または２１６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むタンパク質をコードし、触媒として不活性であるタンパク質をコードする配列によってコードされる、請求項２４に記載の組成物。
前記Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄが、融合タンパク質の一部である、請求項２４または２５に記載の組成物。
前記融合タンパク質が、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄと、
転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＣＢＰ、ＳＥＴ７／９、またはこれらの任意の組合せ；
シトシン塩基エディター（ＣＢＥ）、例えば、ウミヤツメ由来のもの［ＡＩＤ］、ＣＤＡ１、またはＡＰＯＢＥＣ３Ｇ；
バクテリオファージタンパク質Ｇａｍ；および
アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えば、ＡＢＥ６．３、７．８、７．９、７．１０、ＡＢＥｍａｘ、ＡＢＥ８ｅ（ＴａｄＡ－８ｅＶ１０６Ｗ）などのＡＢＥ８ｓのうちの１つまたは複数とを含む、請求項２６に記載の組成物。
前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ、および／または第４のｇＲＮＡが、前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、前記第３のｇＲＮＡ、および／または前記第４のｇＲＮＡのそれぞれの複数のコピーを含む、請求項１から２７までのいずれか一項に記載の組成物。
前記第１のＲＮＡ分子および前記第２のＲＮＡ分子のそれぞれの５’末端および３’末端にパルボウイルス末端逆位反復配列（ＩＴＲ）をさらに含む、請求項１から２７までのいずれか一項に記載の組成物。
請求項１から２９までのいずれか一項に記載の組成物を発現させるためのＤＮＡ分子組成物であって、
（ｉ）（ａ）のＲＮＡ分子、および必要に応じて、（ｃ）のＲＮＡ分子、（ｄ）のＲＮＡ分子、または（ｃ）のＲＮＡ分子と（ｄ）のＲＮＡ分子の両方をコードする第１の合成ＤＮＡ分子；ならびに
（ｉｉ）（ｂ）のＲＮＡ分子、および必要に応じて、（ｅ）のＲＮＡ分子、（ｆ）のＲＮＡ分子、または（ｅ）のＲＮＡ分子と（ｆ）のＲＮＡ分子の両方をコードする第２の合成ＤＮＡ分子
を含む、ＤＮＡ分子組成物。
（ａ）前記核酸編集タンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結した第１のプロモーター；
（ｂ）前記核酸編集タンパク質のＣ末端部分をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結した第２のプロモーター
（ｃ）前記第１の合成ＤＮＡ分子が前記（ｃ）のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含む場合、前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結した第３のプロモーター；
（ｄ）前記第１の合成ＤＮＡ分子が前記（ｄ）のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含む場合、前記少なくとも１つの第２のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結した第４のプロモーター；
（ｅ）前記第２の合成ＤＮＡ分子が前記（ｅ）のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含む場合、前記少なくとも１つの第３のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結した第５のプロモーター；および
（ｆ）前記第２の合成ＤＮＡ分子が前記（ｄ）のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含む場合、前記少なくとも１つの第４のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結した第６のプロモーター
をさらに含む、請求項３０に記載のＤＮＡ分子。
各プロモーターが、独立に選択される、請求項３１に記載の組成物。
前記第１プロモーターと前記第２のプロモーターが同じプロモーターである；
前記第１のプロモーターと前記第２のプロモーターが異なるプロモーターである；
前記第３のプロモーター、前記第４のプロモーター、前記第５のプロモーターおよび前記第６のプロモーターが同じプロモーターである；
前記第３のプロモーター、前記第４のプロモーター、前記第５のプロモーターおよび前記第６のプロモーターが異なるプロモーターである、または
これらの組合せである、
請求項３１または３２に記載の組成物。
前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターのそれぞれが、独立に、構成的プロモーター；組織特異的プロモーター；および前記核酸編集タンパク質に対して内因性のプロモーターから選択される、請求項３０から３２までのいずれか一項に記載の組成物。
前記第３のプロモーター、前記第４のプロモーター、前記第５のプロモーターおよび前記第６のプロモーターのそれぞれが、Ｕ６またはＨ１プロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、請求項３０から３４までのいずれか一項に記載の組成物。
請求項３０から３５までのいずれか一項に記載の組成物を含む、核酸編集タンパク質を発現させるための系。
細胞に導入されると、前記ＲＮＡ分子を適当な順序で産生させ、組み換え、それにより、前記核酸編集タンパク質の全長コード配列をもたらす、請求項３６に記載の系。
前記第１の合成ＲＮＡ分子と前記第２の合成ＲＮＡ分子のそれぞれが、別々のウイルスベクターから転写される、請求項３６または３７に記載の系。
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶである、請求項３８に記載の系。
合成ＤＮＡ分子のそれぞれが、約２５００ｎｔ～約５０００ｎｔ、２，５００ｎｔ～約２，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約４，７５０ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，７５０ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ、約４，５００ｎｔ、約４，７５０ｎｔ、および約５，０００ｎｔから独立に選択されるサイズを有する、請求項３６から３９までのいずれか一項に記載の系。
前記系の合成ＤＮＡ分子によってコードされる前記核酸編集タンパク質のＮ末端部分のコード配列、または前記核酸編集タンパク質のＣ末端部分のコード配列のそれぞれが、約２５００～４５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約２，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ、および約４，５００ｎｔから独立に選択されるサイズを有する、請求項３６から４０までのいずれか一項に記載の系。
前記系の合成ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子のいずれか一方または両方が、それぞれ、約２５００～４５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約２，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ、および約４，５００ｎｔから独立に選択されるサイズを有する、請求項３６から４１までのいずれか一項に記載の系。
請求項３０から３５までのいずれか一項に記載の組成物を含み、
前記合成ＤＮＡ分子が、約５０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約９，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ～約１０，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、約９，０００ｎｔ、約９，５００ｎｔ、および約１０，０００ｎｔから選択される総サイズを有し；
総核酸編集タンパク質コード配列が、約２０００ｎｔ～約８０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、または約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔから選択され、総標的タンパク質コード配列が、約２，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、および約８，０００ｎｔであり；かつ／または、
２つの前記合成ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子の合計サイズが、約５，０００ｎｔ～約９０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、および約９，０００ｎｔから選択される、請求項３６から４２までのいずれか一項に記載の系。
前記第１の二量体形成ドメインおよび前記第２の二量体形成ドメインが、それぞれ、１０００ｎｔ以下、例えば、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、５０～１０００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１５０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、または５００ｎｔであり；前記系の組換え効率が、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である、請求項３６から４３までのいずれか一項に記載の系。
各二量体形成ドメインが、１０００ｎｔ以下、例えば、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、５０～１０００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１５０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、または５００ｎｔであり；前記系の組換え効率が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または約１００％である、請求項３６から４４までのいずれか一項に記載の系。
ＲＮＡ組換え効率が、約１０％～約１００％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約３５％、約１０％～約４０％、約１０％～約４５％、約１０％～約５０％、約１０％～約５５％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約２０％～約３０％、約２０％～約３５％、約２０％～約４０％、約２０％～約４５％、約２０％～約５０％、約２０％～約５５％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約３０％～約３５％、約３０％～約４０％、約３０％～約４５％、約３０％～約５０％、約３０％～約５５％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３５％～約４０％、約３５％～約４５％、約３５％～約５０％、約３５％～約５５％、約３５％～約６０％、約３５％～約７０％、約３５％～約８０％、約３５％～約９０％、約４０％～約４５％、約４０％～約５０％、約４０％～約５５％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４５％～約５０％、約４５％～約５５％、約４５％～約６０％、約４５％～約７０％、約４５％～約８０％、約４５％～約９０％、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５５％～約６０％、約５５％～約７０％、約５５％～約８０％、約５５％～約９０％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約１０％、約２０％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％である、請求項３６から４５までのいずれか一項に記載の系。
請求項３６から４６までのいずれか一項に記載の系を含む組成物。
それぞれ核酸編集タンパク質の少なくとも一部分をコードする第１のＲＮＡ分子、第２のＲＮＡ分子、第３のＲＮＡ分子および必要に応じて第４のＲＮＡ分子を含む、請求項４７に記載の組成物。
請求項３６から４６までのいずれか一項に記載の系、または請求項４７および４８のいずれか一項に記載の組成物を含むキットであって、前記第１の合成核酸分子、前記第２の合成核酸分子、前記第３の合成核酸分子および前記第４の合成核酸分子のいずれかが別々の容器に入っていてよく、必要に応じて薬学的に許容される担体などのバッファーをさらに含む、キット。
細胞において核酸編集タンパク質を発現させる方法であって、請求項３６から４６までのいずれか一項に記載の系、または請求項４７もしくは４８に記載の組成物を細胞に導入するステップと、前記第１のＲＮＡ分子と前記第２のＲＮＡ分子を前記細胞において発現させるステップとを含み、前記細胞において前記核酸編集タンパク質が産生される、方法。
前記細胞が、対象内に存在し、導入するステップが、治療有効量の前記系を前記対象に投与することを含む、請求項５０に記載の方法。
前記対象における標的核酸分子の変異によって引き起こされる遺伝子疾患を処置し、前記核酸編集タンパク質および必要に応じて前記第１のｇＲＮＡおよび前記第２のｇＲＮＡの発現、ならびに前記対象における前記変異の補正をもたらす、請求項５１に記載の方法。
前記遺伝子疾患が、機能喪失型変異に起因するものであり、前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡおよび／もしくは第４のｇＲＮＡが、表１に列挙されている核酸を標的とする配列を含み、前記方法により、表１に列挙されている対応する疾患が処置されるか；
前記標的核酸が、癌遺伝子であり、前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡおよび／もしくは第４のｇＲＮＡが、表２の癌遺伝子を標的とする配列を含み、前記方法により、表２に列挙されている対応するがんが処置されるか；
前記遺伝子疾患が、機能獲得型変異に起因するものであり、前記少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡおよび／もしくは第４のｇＲＮＡが、表３に列挙されている核酸を標的とする配列を含み、前記方法により、表３に列挙されている対応する疾患が処置されるか；または
前記遺伝子疾患が、表４に列挙されているものであり、少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡおよび／もしくは第４のｇＲＮＡが、表４に列挙されている核酸を標的とする配列を含み、前記方法により、表４に列挙されている対応する疾患が処置される、請求項５２に記載の方法。
前記第１のＲＮＡ分子および前記第２のＲＮＡ分子のうちの一方または両方が、配列番号１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、２２５、および２２６のうちのいずれか１つに提示される合成イントロンに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む、請求項３６から４６までのいずれか一項に記載の系、請求項１から３５まで、４７および４８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項５０から５３までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１のＲＮＡ分子および前記第２のＲＮＡ分子のうちの一方または両方が、配列番号１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、２２５、または２２６によってコードされるＲＮＡから選択される合成イントロンを含む、請求項３６から４６までおよび５４のいずれか一項に記載の系、請求項１から３５まで、４７および４８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項５０から５３までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１のＲＮＡ分子および前記第２のＲＮＡ分子のうちの一方または両方が、タンパク質コード配列の一部をさらに含む、請求項３６から４６まで、５４、および５５のいずれかに記載の系、請求項１から１６まで、３２および３３のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３５から３８までのいずれか一項に記載の方法。
前記タンパク質コード配列の前記一部が、前記タンパク質コード配列のＮ末端側半分、Ｎ末端部分、Ｃ末端側半分、またはＣ末端部分を含む、請求項３６から４６までおよび５４から５６までのいずれかに記載の系、請求項１から３５まで、４７および４８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項５０から５３までのいずれか一項に記載の方法。
（ａ）第１のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、（ｉｉ）前記核酸編集タンパク質のＮ末端部分のコード配列；（ｉｉｉ）スプライスドナー；（ｉｉ－２）ＤＩＳＥ、ＩＳＥ、または両方；（ｉｖ）第１の二量体形成ドメイン；および（ｖ）少なくとも１つの第２のｇＲＮＡを含む、第１のＲＮＡ分子、ならびに（ｂ）第２のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、（ｉｉ）前記第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；（ｉ－２）少なくとも１つのＩＳＥ配列；（ｉｉｉ）分岐点配列；（ｉｉ）ポリピリミジントラクト；（ｖ）スプライスアクセプター；（ｖｉ）前記核酸編集タンパク質のＣ末端部分のコード配列、および（ｖｉｉ）少なくとも１つの第４のｇＲＮＡを含む、第２のＲＮＡ分子を含む、請求項３６から４６までおよび５４から５６までのいずれか一項に記載の系、請求項１から３５まで、４７および４８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項５０から５３までのいずれか一項に記載の方法。
（ａ）第１のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）少なくとも１つの第１のｇＲＮＡ、（ｉｉ）前記核酸編集タンパク質のＮ末端部分のコード配列；（ｉｉｉ）スプライスドナー；（ｉｉ－２）ＤＩＳＥ、ＩＳＥ、およびＩＳＥ；および（ｉｖ）第１の二量体形成ドメイン；および（ｖ）少なくとも１つの第２のｇＲＮＡを含む、第１のＲＮＡ分子、ならびに（ｂ）第２のＲＮＡ分子であって、５’から３’に、（ｉ）少なくとも１つの第３のｇＲＮＡ、（ｉｉ）前記第１の二量体形成ドメインに結合する第２の二量体形成ドメイン；（ｉ－２）３つのＩＳＥ配列；（ｉｉｉ）分岐点配列；（ｉｖ）ポリピリミジントラクト；（ｖ）スプライスアクセプター；（ｖｉ）前記核酸編集タンパク質のＣ末端部分のコード配列および（ｖｉｉ）少なくとも１つの第４のｇＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子を含む、請求項３６から４６までおよび５４から５７までのいずれか一項に記載の系、請求項１から３５まで、４７および４８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項５０から５３までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１のＲＮＡ分子および前記第２のＲＮＡ分子のうちのいずれか１つまたは２つのそれぞれが、約２５００～４５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約２，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約２，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約３，７５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約３，７５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，２５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，５００ｎｔ、約２，７５０ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，２５０ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約３，７５０ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，２５０ｎｔ、および約４，５００ｎｔから独立に選択されるサイズを有する、請求項１から３５までのいずれか一項に記載の組成物。
前記総核酸編集タンパク質コード配列のサイズが、約２０００ｎｔ～約８０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約２，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約３，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約３，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約４，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約４，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約２，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ、約３，５００ｎｔ、約４，０００ｎｔ、約４，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、もしくは約８，０００ｎｔであり、かつ／または、
２つの前記ＲＮＡ分子の合計サイズが、約５，０００ｎｔ～約９０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約５，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約５，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約６，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約６，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約７，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約７，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約８，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ～約９，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ、約５，５００ｎｔ、約６，０００ｎｔ、約６，５００ｎｔ、約７，０００ｎｔ、約７，５００ｎｔ、約８，０００ｎｔ、約８，５００ｎｔ、もしくは約９，０００ｎｔである、請求項１から３５までのいずれか一項に記載の組成物。
前記第１の二量体形成ドメインおよび前記第２の二量体形成ドメインのそれぞれが、１０００ｎｔ以下、例えば、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、５０～１０００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１５０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、または５００ｎｔであり、前記系の組換え効率が、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である、請求項１から３５までのいずれか一項に記載の組成物。
各二量体形成ドメインが、１０００ｎｔ以下、例えば、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも１５０ｎｔ、少なくとも２００ｎｔ、少なくとも３００ｎｔ、少なくとも４００ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、５０～１０００ｎｔ、５０～５００ｎｔ、５０～１５０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、または５００ｎｔであり、前記系の組換え効率が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％である、請求項１から３５までのいずれか一項に記載の組成物。
ＲＮＡ組換え効率が、約１０％～約１００％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約３５％、約１０％～約４０％、約１０％～約４５％、約１０％～約５０％、約１０％～約５５％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約２０％～約３０％、約２０％～約３５％、約２０％～約４０％、約２０％～約４５％、約２０％～約５０％、約２０％～約５５％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約３０％～約３５％、約３０％～約４０％、約３０％～約４５％、約３０％～約５０％、約３０％～約５５％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３５％～約４０％、約３５％～約４５％、約３５％～約５０％、約３５％～約５５％、約３５％～約６０％、約３５％～約７０％、約３５％～約８０％、約３５％～約９０％、約４０％～約４５％、約４０％～約５０％、約４０％～約５５％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４５％～約５０％、約４５％～約５５％、約４５％～約６０％、約４５％～約７０％、約４５％～約８０％、約４５％～約９０％、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５５％～約６０％、約５５％～約７０％、約５５％～約８０％、約５５％～約９０％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約１０％、約２０％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％である、請求項１から３５までのいずれか一項に記載の組成物。
（ａ）前記第１のＲＮＡ分子および前記第２のＲＮＡ分子のそれぞれが、約２５００ｎｔ～４５００ｎｔであり；
（ｂ）前記総核酸編集タンパク質コード配列のサイズが、約２０００ｎｔ～約８０００ｎｔであり；かつ／または、
（ｃ）２つの前記ＲＮＡ分子の合計サイズが、約５，０００ｎｔ～約９０００ｎｔであり；
ＲＮＡ組換え効率が、約１０％～約１００％である、請求項１から３５までのいずれか一項に記載の組成物。
１つまたは複数の標的核酸分子に特異的な１つまたは複数のｇＲＮＡを含む１つまたは複数の追加のＲＮＡ分子をさらに含む、請求項１から２９までのいずれか一項に記載の組成物。
１つまたは複数の標的核酸分子に特異的な１つまたは複数のｇＲＮＡをコードする１つまたは複数の追加のＤＮＡ分子をさらに含む、請求項３０から３５までのいずれか一項に記載の組成物。