JP2001523106A - 真核遺伝子発現カセットおよびその使用 - Google Patents

真核遺伝子発現カセットおよびその使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、機能し得る形で連結された(i)ミオシンＬ鎖エンハンサー１個、(ii)ミオシンＨ鎖プロモーターおよびウイルスプロモーターから選択されるプロモーター１個ならびに(iii)目的のポリヌクレオチド配列１個を含む、発現カセットを提供する。この発現カセットは医学的治療および予防接種の方法において使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 真核遺伝子発現カセットおよびその使用 本発明は遺伝子発現カセットに関する。この発現カセットは真核細胞中での異 種遺伝子の発現を目的として使用することができる。本発明は遺伝子治療および ワクチンの製造におけるこの発現カセットの使用にも関する。さらに、この発現 カセットを含むウイルス株などのベクターにも関する。発明の背景 アンダーソン−ファブリ(Anderson-Fabry)病はリソソーム酵素、αガラクトシ ダーゼ（α-gal(alpha-gal)、EC 3.2.1.22）の欠損に起因するリソソーム蓄積症 （LSD）の１種である。この酵素の欠損は大部分の組織中に中性スフィンゴ糖脂 質の蓄積をもたらし、内皮細胞中の蓄積の進行の結果である、腎臓、心臓または 脳などの器官中の虚血および梗塞が、病理学上および臨床上の疾病発現となる。 トランスゴルジ網中で機能する選別機構の他に、マンノース６リン酸受容体を 介して細胞外空間からリソソーム酵素を再捕捉することもできる。これを支持す るものとして、培地への精製リソソーム酵素の投与によって、各種の型のLSDの 患者からの繊維芽細胞中のこの酵素の欠損を矯正することができることが示され た。この酵素を取り込む細胞のこうした能力は、この類の障害のための代償療法 の使用の基礎を提供した。ファブリ病の場合、初期の研究では、各種の起源から 部分的に精製されたα-galを培地に添加した時、これがファブリ半接合体からの 皮膚繊維芽細胞によって取り込まれ、蓄積された基質、グロボトリアオシルセラ ミド(globotriaosylceramide)（CTH）を異化することが示された。このことから 、1970年代には酵素代償のいくつかの臨床試験が促進され、これによってファブ リ病の酵素療法の実現可能性が証明された。しかし、十分な量の精製されたヒト 酵素が入手できないため、現在までのところ、代償療法の有効性の正当な評価が 妨げられている。 LSDの治療用の活性酵素源を提供するための代替法として、骨髄移植、さらに 最近になって、増血幹細胞中への遺伝子の導入または遺伝子改変された細胞によ る全器官中への酵素の送達などがあった。例えば、レトロウイルスベクターでト ランスフェクトし、コラーゲン格子(lattices)上で増殖させて、腹膜腔中に埋め 込んだ繊維芽細胞が、うまくβグルクロニダーゼを分泌して、ムコ多糖症VIIマ ウスの肝臓および脾臓中の蓄積病変を矯正することが、最近示された。犬におけ る同一の試みの結果、この酵素の長期の分泌が得られ、またα-L-イズロニダー ゼを分泌しているネオ器官(neo-organ)を移植したヌードマウスでも同様の結果 が得られた。 プラスミドDNAの筋内注射によってin vivoで骨格筋をトランスフェクトするこ とができるという発見以来、分泌される治療用タンパク質の可能な起源として、 この器官系が相当の注目を集めるようになった。プラスミドDNA構築物の注射は ジストロフィン(dystrophin)、因子Vii、アポリポタンパク質Ｅおよびα-1抗ト リプシンの発現のために良好に使用され、一方遺伝子改変された筋芽細胞の筋内 注射はヒト成長ホルモン、因子IX、βグルクロニダーゼ、ヒトおよびマウスエリ スロポエチンならびにヒトグルコセレブロシダーゼの分泌に有望な結果を与えた 。しかし、これらのトランスフェクションの方法の効率は、DNAの注射の前に筋 肉毒性物質の注射によって筋肉の変性および再生を誘導しても、なお低い。プラ スミドの筋肉への直接の注入はウイルスベクターよりも良好なトランスフェクシ ョン効率を示し、またプラスミドDNAは染色体外に少なくとも19ヵ月維持される ことがわかった。さらに、プラスミドDNAの安全で簡単で低コストの筋内注射は 他の方法よりも非常に魅力的な代替法となる。しかし、これまでの大部分の研究 では、発現が循環タンパク質の血中レベルを上昇させるために十分高くはないこ とが示されている。発明の概要 本発明は、機能し得る形で連結された(i)ミオシンＬ鎖エンハンサー１個、(ii )ミオシンＨ鎖プロモーターおよびウイルスプロモーターから選択されるプロモ ーター１個ならびに(iii)目的のポリヌクレオチド配列１個を含む、発現カセッ トに関する。 こうした発現カセットを含むウイルス株などの核酸構築物を、例えばファブリ 病などの疾病の治療方法における治療用遺伝子の送達、または予防接種の目的で の特異的抗原をコードする遺伝子の送達のために使用することができる。 したがって、本発明は、機能し得る形で連結された(i)ミオシンＬ鎖エンハン サー１個、(ii)ミオシンＨ鎖プロモーターおよびウイルスプロモーターから選択 されるプロモーター１個ならびに(iii)目的のポリヌクレオチド配列１個を含む 、発現カセットを提供する。 好ましくは、エンハンサーはミオシンＬ鎖1/3エンハンサーである。好ましく は、ミオシンＨ鎖プロモーターは哺乳動物Ｈ鎖プロモーター、さらに好ましくは 末端切断型ウサギミオシンＨ鎖プロモーターである。好ましくは、ウイルスプロ モーターはサイトメガロウイルス（CMV）または単純ヘルペスウイルス（HSV）プ ロモーターである。 このように、目的のポリヌクレオチド配列１個を、これを発現させようとする 真核細胞の１つに送達するために、本発明の発現カセットを使用することができ る。目的のポリヌクレオチド配列１個を、これを発現させようとする真核細胞の １つに送達するために、本発明の発現カセットを含むベクターおよびウイルス株 を使用することもできる。好ましくは細胞は脊椎動物細胞、より好ましくは鳥類 、魚類または哺乳動物筋細胞である。こうした発現カセット、ベクターおよびウ イルス株は各種の適用において、例えば遺伝子療法を含む医学的治療の方法にお いて、およびワクチンとして有用である。 好ましくは、目的のポリヌクレオチド配列は異種遺伝子を含むものである。異 種遺伝子は野性型遺伝子の任意の対立遺伝子変異体でよく、または変異遺伝子で もよい。異種遺伝子は好ましくは治療上有用なポリペプチドをコードする。 本発明はさらに、ヒトおよび動物の治療における使用のための、発現カセット ならびにこの発現カセットを含むベクターおよびウイルスの使用を提供する。 また、本発明は本発明の発現カセットを含むウイルス株の製造方法をも提供す る。この方法はウイルス株のゲノム中への、好ましくは相同的組換えによる、本 発明の発現カセットの導入を含む。発明の詳細な説明 Ａ．発現カセット−ミオシンＬ鎖エンハンサー、ミオシンＨ鎖プロモーター／ ウイルスプロモーター、目的のポリヌクレオチド配列。 本発明の発現カセットは、機能し得る形で連結された(i)ミオシンL鎖エンハン サー１個、(ii)ミオシンＨ鎖プロモーターおよびウイルスプロモーターから選択 されるプロモーター１個ならびに(iii)目的のポリヌクレオチド配列１個を含む 。用語「機能し得る形で連結された」とは、成分が意図される様式で機能し得る 関係になるように並列していることを意味する。したがって、例えば、目的のポ リヌクレオチド配列に機能し得る形で連結されたプロモーターは、このプロモー ターによる発現の活性化に適合する条件下で目的のポリヌクレオチド配列の発現 が達成されるように連結されている。 発現カセットは当業者に既知の一般的なクローニング技術を使用して構築する ことができる（例えば、Sambrookら、1989,Molecular Cloning-a laboratory ma nual；Cold Spring Harbor Press、参照）。 ２．ミオシンエンハンサー 今日までミオシンＬ鎖およびミオシンＨ鎖遺伝子の両方から、いくつかのミオ シンエンハンサーが同定されている。好ましくは、本発明の発現カセット中で使 用するエンハンサーは脊椎動物起源であり、より好ましくは鳥類、魚類または哺 乳動物起源である。ミオシンＬ鎖エンハンサーが好ましい。ラットミオシンＬ鎖 1/3エンハンサー（Donoghueら、1988；Nevilleら、1996）が特に好ましい。エン ハンサーはプロモーターに機能し得る形で連結される。用語「機能し得る形で連 結される」は上記定義の通りである。エンハンサーはプロモーターの上流または 下流のいずれでもよい。エンハンサーはいずれかの方向で使用することができる 。 ３．プロモーター 本発明の発現カセット中のプロモーターは脊椎動物細胞、好ましくは鳥類、魚 類および／または哺乳動物、好ましくはヒトの細胞中で機能するミオシンＨ鎖プ ロモーターまたはウイルスプロモーターから選択される。ミオシンＨ鎖プロモー ターは末端切断型ウサギβ心臓ミオシンＨ鎖プロモーター、特に転写開始部位の 上流789塩基対までを含むものが好ましい。特に好ましいもう１つのミオシンＨ 鎖プロモーターはコイFG2プロモーター、特に転写開始部位の上流901塩基対まで を含むもの（Gauvryら、1996）である。ラット、ウサギ、ヒト、ブタおよびニワ トリのミオシンＨ鎖遺伝子に由来するミオシンＨ鎖プロモーターの詳細はGauvry ら、1996およびその中の参照文献からさらに得られる。ウイルスプロモーターと してはCMVおよびHSVプロモーターが挙げられる。CMV IEプロモーターが特に好ま しい。 ４．目的のポリヌクレオチド配列 用語「目的のポリヌクレオチド配列」とは、少なくとも転写されることが可能 な核酸配列を網羅することを意図している。配列はプロモーターに対してセンス またはアンチセンス方向のいずれでもよい。アンチセンス構築物は周知の技術に したがって細胞中の遺伝子の１つの発現を阻害するために使用することができる 。目的のポリヌクレオチド配列は異種遺伝子を含んでいてもよい。用語、異種遺 伝子はあらゆる遺伝子を包含する。したがって、mRNA、tRNAおよびrRNAをコード する配列はこの定義の中に含まれる。異種遺伝子は野性型遺伝子のどんな対立遺 伝子変異体でもよく、あるいは突然変異遺伝子でもよい。mRNAをコードする配列 は場合によって、転写されるが翻訳されない5'および／または3'フランキング配 列のいくつかまたはすべてをそのまま含むか、あるいは翻訳されるコード配列と 結合することとなる。目的のポリヌクレオチド配列には場合によってさらに、通 常は転写された配列に結合する転写制御配列、例えば転写停止シグナル、ポリア デニル化部位および下流エンハンサー要素を含んでいてもよい。 目的のポリヌクレオチド配列は好ましくは治療用産物をコードするものである 。このような治療用産物として、例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質ま たはリボ核酸が可能である。さらに特定すると、このコード配列は酵素（例えば βガラクトシダーゼ）、血液誘導体、ホルモン、サイトカイン、すなわちインタ ーロイキン、インターフェロン若しくはTNF、成長因子（例えばIGF-1）、神経伝 達物質若しくはその前駆体、または合成酵素、BDNF，CNTF，NGF，IGF，GMF，aFG F，bFGF，NT3およびNT5などのトロフィック因子、などのポリペプチド産物、Apo Al，ApoAIVなどのアポリポタンパク質、ならびにジストロフィン若しくはミニジ ストロフィンをコードするDNA配列（cDNAまたはゲノムDNAなど）、p53，Rb，Rap 1A，DCCおよびk-revなどの腫瘍抑制遺伝子、因子VII，VIIIおよびIXなどの凝固 に関与する因子、あるいは天然若しくは人工のイムノグロブリンの全部若しくは 部分（例えばFabおよびScFv）をコードする遺伝子である。 コード配列としては、標的細胞中での発現によって遺伝子発現または制御すベ き細胞mRNAの転写が可能になるようなアンチセンス配列でもよい。こうした配列 は、例えば欧州特許第140,308号に記載された技術にしたがって、標的細胞中で 細胞mRNAに相補的なRNAに転写され、したがってそれらのタンパク質への翻訳を 妨害することができる。アンチセンス配列は特に、炎症性または異化性サイトカ インに起因する関節炎および組織損傷の治療において、これらのサイトカインの 翻訳を阻止するために使用することができる。 毒性因子をコードする配列の発現のために本発明を使用することもできる。毒 性因子としては特に細胞毒（ジフテリア毒素、シュードモナス毒素およびリシン (ricin)Ａなど）、外来薬剤に対する感受性を誘導する産物（自殺遺伝子；例え ばチミジンキナーゼおよびシトシンデアミナーゼ）、あるいは細胞死を誘導する ことができるキラー遺伝子（例えばGrb3-3および抗ラスScFv）が可能である。 好ましくは、目的のポリヌクレオチド配列は治療上有用なポリペプチドをコー ドするものである。例えば、上記のタンパク質の中で、αガラクトシダーゼはフ ァブリ病を治療するために使用することができる。 目的のポリヌクレオチド配列はワクチンとして使用するための抗原性ポリペプ チドまたは核酸をコードするものでもよい。好ましくはこうした抗原性ポリペプ チドまたは核酸は病原性生物、例えば細菌またはウイルス由来のものである。一 例として、抗原性ポリペプチドまたは核酸をＣ型肝炎ウイルスゲノムの領域およ び遺伝子産物から選択することができる。例えば、ウイルス性出血性敗血症、細 菌性腎疾患、ビブリオ病およびフレンケル症の原因物質のゲノムまたは遺伝子産 物中に存在する抗原決定物質が特に好ましい。 異種遺伝子として、マーカー遺伝子（例えばガラクトシダーゼまたは緑色蛍光 タンパク質をコードするもの）またはその産物が別の遺伝子の発現を調節する遺 伝子もまた含まれる。 Ｂ．ベクター 発現カセットは裸の核酸構築物の形態で使用することができる。あるいは、こ れを各種の核酸ベクター中に導入してもよい。こうしたベクターとしては、プラ スミドおよびウイルスベクターが挙げられる。ベクターにさらに真核ゲノム配列 、好ましくは哺乳動物ゲノム配列、またはウイルスゲノム配列に相同な配列を含 む、発現カセットに隣接させた配列を含ませることができる。これによって、相 同組み換えによる真核細胞またはウイルスのゲノム中への発現カセットの導入が 可能になる。特に、ウイルスの配列に隣接した発現カセットを含むプラスミドベ クターを使用して、魚類、鳥類または哺乳動物を含む脊椎動物の細胞に発現カセ ットを送達するのに好適なウイルスベクターを調製することができる。使用する 技術は当業者に周知である。 Ｄ．投与 このように、治療が必要なヒトまたは動物に治療用遺伝子を送達するために、 本発明の発現カセットを使用することができる。あるいは、予防接種の目的で、 特に魚の予防接種として、潜在的に免疫原性のポリペプチドをコードする遺伝子 をin vivoで送達するために、本発明の発現カセットを使用することができる。 本発明の発現カセットを直接裸の核酸構築物として、好ましくは宿主細胞ゲノ ムに相同なフランキング配列をさらに含ませて、投与することができる。ビオリ スティック(biolistic)形質転換およびリポフェクション(lipofection)を含むい くつかの既知の技術によって、脊椎動物細胞による裸の核酸構築物の取り込みを 強化することができる。 あるいは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターなどの核酸ベクターの 一部分として、発現カセットを投与することができる。 医薬組成物を製造するためには、好ましくは、送達用ビヒクル（すなわち、例 えば裸の核酸構築物または発現カセットを含むウイルスベクター）を製薬上許容 される担体または希釈剤と組み合わせる。好適な担体および希釈剤としては、等 張性生理食塩水溶液、例えばリン酸緩衝化生理食塩水が挙げられる。組成物は典 型的には筋内投与用に製剤化される。 好ましくは、この物質は注射剤型で使用される。したがって、注射剤、好まし くは治療する部位への直接の注射のために、製薬上許容されるどんなビヒクルで も混合することができる。医薬用の担体または希釈剤としては、例えば無菌また は等張溶液が挙げられる。物質を経口活性剤として製剤化することも好ましい。 魚の筋肉中に核酸を注射する方法はGauvryら、1996中に記載されている。 使用する現実の製剤は当業者によって容易に決定され、また投与すべき物質の 性質および投与経路に応じて変更される。 使用する物質の用量は各種のパラメーターにしたがって、特に使用する物質、 治療する患者の年齢、体重および状態、使用する投与のモード、ならびに必要な 治療方式にしたがって、調整される。医師はあらゆる特定の患者および症状に対 して必要な投与経路および投与量を決定することができるであろう。 本発明を以下の実施例を参照して記載するが、これは説明のみのためであって 限定するものではない。 実施例１図１〜５の簡単な説明 図１および図２は３種の構築物を使用して得られたα-galおよびβ-galの活性 の比較を示すグラフである。 図３は３種の構築物でトランスフェクトした筋芽細胞から得られた細胞抽出物 ／上清中のα-galの活性を示すグラフである。 図４はα-gal発現構築物でトランスフェクトしたファブリ病患者の繊維芽細胞 からの細胞抽出物中のα-galの活性を示すグラフである。 図５はα-gal発現構築物の注射後７日目の筋抽出物中のα-galの活性を示すグ ラフである。図１〜５の詳細な説明 図１： Ａ．C2C12筋芽細胞のトランスフェクション後の構築物pIVGF，pX4FおよびpMC agalFの比較（構築物の詳細については表１参照）。Plasmidミディカラム（Qiag en,Dorking,UK）を使用してトランスフェクション用のDNAを調製した。増殖培地 （ペニシリン−ストレプトマイシン−アンフォテリシンＢを含むDMEM／10％FCS ）中にC2Cl2マウス筋芽細胞を1.5×104細胞／cm2となるようにプレーティングし 、一晩増殖させた。Optimem-1（Gibco,Paisley,UK）200μl中のDNA2μgとともに Lipofectamine（Gibco,Paisley,UK）10gを混合して、トランスフェクションを実 施した。室温で30分インキュベートした後、混合物をOptimem-1中１mlまで希釈 し、細胞に添加した。37℃／５％CO2で６〜８時間、βガラクトシダーゼの発現 を推進するpCMV-b（典型的には総DNA２μg中200ng）を含ませて、トランスフェ クションを実施した。後者はトランスフェクションの効率の内部対照として使用 した。トランスフェクション後、プレートをPBSで洗浄し、その後DMEM／2％ウマ 血清（分化用培地）を添加した。これらの条件下で、筋芽細胞は融合および筋管 への分化の過程を開始し、これは48時間後には可視化し、４〜６日発生を持続す る。細胞抽出物中のαガラクトシダーゼおよびβガラクトシダーゼの酵素活性を 、両反応が何ら交差反応性を示さないように、特異的な基質を使用して蛍光測定 によってアッセイした。トランスフェクション後18時間目の標準化したα-gal酵 素活性（α-galユニット／β-galユニット）を示す（未分化筋芽細胞）。ハイ− ロウバー(high-low bar)は２回の実験の結果を示す。 Ｂ．上記のようなC2Cl2筋芽細胞のトランスフェクション後の構築物、pIVGF、 pX4FおよびpMCagalFの比較。トランスフェクション後10日目の標準化したα-gal 酵素活性（α-galユニット／β-galユニット）を示す（完全に分化した筋管）。 数値はα-galの変化ばかりでなくβ-gal（トランスフェクション効率を補正する ために使用したリポーター酵素）の減少も反映していることに注目されたい。こ れはCMVプロモーターのみによって推進されるものである。したがって、各構築 物の実際の標準化単位を、（図１Ａに示される）未分化筋芽細胞から得られた数 値と直接比較することはできない。しかし、すべての構築物は正確に同一の量の 同一の内部対照プラスミドで同時トランスフェクトされるので、トランスフェク ト後一定の時点で構築物を直接比較することができる。ハイ−ロウバーは２回の 実験の結果を示す。 図２：図１に示したようなC2C12筋芽細胞のトランスフェクション後の構築物 、pX3F、pX4FおよびpX7Fの比較。トランスフェクション後48時間目（小さい筋管 ）のβ-galおよびα-galの酵素活性（ユニット／タンパク質mg、左軸）ならびに 標準化したα-gal酵素活性（α-galユニット／β-galユニット）を示す。ハイ− ロウバーは２回の実験の結果を示す。 図３：３種の構築物でトランスフェクト（擬似(Mock)−DNAをトランスフェク トしない）し、トランスフェクション後48時間目に収穫したC2Cl2筋芽細胞から の細胞抽出物および上清の総α-gal活性（ユニット、１ユニット＝１nmol／時間 ）。総α-gal活性は細胞抽出物中（ユニット／mg）または上清中（ユニット／L ）の当初の酵素活性から誘導した。ハイ−ロウバーは２回の実験の結果を示す。 図４：図示したようにトランスフェクトしたC2Cl2筋芽細胞によって馴化した 培地中で、その培地中に5mMマンノース-6-リン酸（Sigma,Poole,UK）の不在また は存在（＋M6P）下で４日間培養したファブリ病患者の繊維芽細胞からの細胞抽 出物中のα-gal活性。リポソームDNA複合体のキャリーオーバーを回避するため 、繊維芽細胞に添加する前に、馴化培地を0.22mm濾過した。ビシンコン酸(bicin chonic acid)法（Sigma,Poole,UK）を使用して、タンパク質を測定した。 エラーバー＝S.E.M．(n＝6) *他群のいずれとも有意な差（p＜0.01）（不対サンプルに対するMann-Whitney ランク−サム(rank-sum)検定） 図５：注射後７日目の前脛骨(tibialis anterior)筋抽出物中のα-gal活性（ ユニット／タンパク質mg）。Endo-free Plasmid Kit（Qiagen,Dorking,UK）を使 用して、構築物pX7FのDNAを調製した。従来の推奨例31にしたがって、5〜6週齢C 57B1/6マウスの前脛骨筋に、エンドトキシンを含まない無菌生理食塩水50ml中の DNA 30mg（または対照筋肉中には生理食塩水50ml）を注射した。マウスをHypnor m-Diazepamで麻酔し、27G針を付けたツベルクリン注射器で垂直進入法を使用し て、DNA溶液を筋肉の中心に経皮注射した。 注射後７日目に動物を殺し、筋肉を剥離し、-70℃に凍結し、予冷したモータ ー上で細かく摩砕し、次にReporter Lysis Buffer（Promega,Southampton,UK）5 00ml中、室温で15分ボルテックスし、4℃で3分間遠心し、上清を-70℃で保存 した。上記のようにタンパク質およびα-gal酵素活性を測定し、その結果をユニ ット／タンパク質mgで表現した。 変性／再生のサイクルを誘導するため、DNAの注射の５日前に、筋肉のいくつ かにミオトキシン物質（1.2％BaCl2またはNaja nigricollisからの0.1Mカルジオ トキシン）を予備注射した。 エラーバー＝S.E.M．(n＝6) これら２群間でｐ＜0.01（不対サンプルに対するMann-Whitneyランク−サム(r ank-sum)検定） 筋特異的調節要素の影響 我々はヒトα-galの発現を推進する数種のベクターを作成し、筋原細胞系C2Cl 2のトランスフェクション後、これらを比較した。この細胞系は、これらの筋芽 細胞が一定の培養条件下で融合および分化する能力があるため、筋特異的調節要 素の研究における筋分化モデルとして広く使用されてきた。成熟筋管が形成され た後は、これらは非ウイルス法ではトランスフェクトすることができない。した がって、標準的トランスフェクションプロトコルはカチオン性リポソームでの未 分化筋芽細胞のトランスフェクションから開始され、その後成熟筋管に分化させ る。遺伝子発現は分化過程中のどの時点でも測定することができるので、このシ ステムによれば筋特異的遺伝子の活性化の前および後の調節要素の活性の比較が 可能である。しかし、トランスフェクションの効率は、リポーター遺伝子の発現 を推進する別種のプラスミドでの同時トランスフェクションによって、注意深く 制御しなければならない。これは、構築物間およびプレート間の差異を補正する 内部対照として使用される。 我々は最初に、筋特異的プロモーター（ウサギミオシンＨ鎖）またはミオシン Ｌ鎖1/3エンハンサーと組合せたヒトサイトメガロウイルスプロモーターを含有 する３種の構築物（構築物の詳細については、表１参照）を比較した。MLC1/3エ ンハンサーはトランスジェニックマウスおよびゼブラフィッシュ中で異種遺伝子 の筋特異的発現をもたらすことが示されている。 未分化筋芽細胞（トランスフェクション後18時間目）中で、CMVプロモーター のみによってα-gal発現が推進される構築物（pIVGF）が最高の活性を示し、pX4 FおよびpMCagalFがこの順番で続いた（図1A）。対照的に、完全分化筋管（トラ ンスフェクション後10日目）の分析では、α-gal酵素活性がpIVGFよりもpX4F中 の方が明らかに高いことがわかった（図1B）。これらの両構築物の差異はpX4F中 のMLC1/3エンハンサーの存在のみである。我々の結果は、このエンハンサー要素 は分化した筋原細胞中でCMVプロモーターによって推進される発現の強度を増加 することができるが、未分化の筋芽細胞ではほとんどまたは全く増強効果を与え ないことを示している。我々は、MLC1/3エンハンサーの方向のみが異なっている pX3FおよびpX4Fによって産生される発現レベルも比較した。両構築物は分化中期 の６日目に同一の活性を示し（図２）、エンハンサーの方向は発現レベルに影響 しないことが確認された。このことは、このエンハンサーが成熟筋管中でSV40プ ロモーターの活性を方向に無関係な様相で増強することを示した以前のデータを 支持するものであり、また、筋肉の分化では、この要素が異種プロモーターの基 本的活性を強化することを可能にするのに必要な、筋特異的因子が供給されるこ とを示唆している。 表１ 表１：この研究で使用した発現ベクターの詳細。ウサギβ心臓ミオシンＨ鎖（ MHC）プロモーターは781塩基対のプロモーター領域で構成される。ミオシンＬ鎖 1/3エンハンサー（MLC1/3）は受け入れ番号がXl4726である。CMVはヒトサイトメ ガロウイルスの主要中間体早期(intermediate early)プロモーター／エンハンサ ー領域である。構築物pX3F、pX4FおよびpX7Fは、示したように転写方向（センス ）または逆方向（アンチセンス）のいずれかでクローン化したMLC1/3エンハンサ ーを含有している。pX3F、pX4FおよびpIVGFの作製のため、αガラクトシダーゼ をコードするcDNAをRT-PCRによって増幅し、pCRII（登録商標、Invitrogen,DeSc help,The Netherlands）中にクローン化して、pGal-wtを生成させた。pGal-wtの EcoRI消化によってフランキング配列を持たないα-gal cDNAを放出させ、これを 適切なベクター中で使用した。pX7Fの構築のためには、我々はα-galのためのcD NAを含有する別種の断片（Dr.H.Sakurabaよりの寄贈）を使用した。これは25bp の5'-UTRのみを含有し、フランキング配列は含有していない。したがって、pX3F およびpX7Fはα-galの5'-UTRの長さのみが異なっている（pX3Fが35bp長い）。 ヒトα-galの培地への分泌およびα-gal欠損繊維芽細胞による取り込み 別の実験セットにおいて、我々は対照（擬似トランスフェクト、DNAを含まな い）に比較した、構築物pX3F、pX4FまたはpX7Fでトランスフェクトした後48時間 馴化した細胞抽出物または上清中のα-galの総活性をアッセイした。トランスフ ェクトした細胞の培地中のα-gal活性の総量は対照中よりも有意に高かった（対 照中で0.10単位に対し、３構築物の平均＝2.17単位、結果は示していない）。in vitroで発現され、そして分泌されたα-galが正しい翻訳後プロセシングを受け たことを確認するため、我々はα-gal欠損繊維芽細胞についてpX7Fでトランスフ ェクトしたC2Cl2筋芽細胞によって馴化した培地から酵素を取り込む能力を調べ た。ヘミ接合ファブリ病患者からの繊維芽細胞（低酵素活性を示す）を、pX7Fで トランスフェクトしたC2Cl2筋芽細胞によって馴化しておいた分化用培地で４日 間培養した。図３はこれらの条件下で維持された繊維芽細胞中のα-gal酵素活性 を示している；擬似トランスフェクト筋芽細胞によって馴化した培地で培養した ものよりも、pX7Fでトランスフェクトした筋芽細胞によって馴化した培地で培養 したものの方で有意に高レベルが検出された（p＜0.01）。馴化培地にマ ンノース-6-リン酸（5mM）を添加することによって、この効果は完全に消失し（ 図３）、α-gal活性のこの増加がマンノース-6-リン酸受容体を介した酵素の取 り込みの結果であることを示した。このことはこの酵素がホスホマンノシル残基 などの適切な翻訳後改変を含有していることを強く示唆している。我々の知見で は、これは、分化した筋細胞からヒトα-galの正しくグリコシル化した形態が発 現されて分泌された最初の報告である。 プラスミドDNAの筋内注射後のヒトα-galの産生 我々はこれらの結果をin vivoで再現できるかどうかを知るため、プラスミドD NAを筋内注射したマウスからの筋抽出物におけるα-gal活性を分析した。この手 法では、in vitroでは可能な、トランスフェクトされた繊維の数について補正す ることはできない。このため、何らかの可能な統計的差異を検出するために、適 当な規模のサンプルを使用する必要がある。我々の実験（各群について６筋肉） において、構築物pX7Fの前脛骨中への注射の結果、注射後７日目に、生理食塩水 を注射した対照筋肉に対して、α-gal活性レベルが有意に増加した（p＜0.01） （図５）。筋肉中の外来タンパク質の発現はこのタンパク質を発現する繊維に対 する免疫応答を誘発し、これらの数が減少して、注射後２週間で完全に消失する ことが示されている。この理由により、我々は１週間だけ発現を進行させて、ヒ トα-galに対する免疫応答のエフェクター期(effector phase)の開始よりもかな り前に、酵素活性を分析した。我々の実験室での予備試験結果は、マウスα-gal cDNAを含有するベクターが注射された筋肉中で少なくとも４週間酵素の発現を 推進することができることを意味している（示していない）。治療用遺伝子の同 質遺伝子のタンパク質産物も、遺伝子治療中にこれらの送達後の免疫応答を誘発 することがある。したがって、標的タンパク質の免疫原性を防止するかまたはこ れと戦う手段を開発すべきである。遺伝子治療時の、免疫抑制剤ならびに抗CD4 または抗CD40L抗体を含む数種の免疫モジュレート剤の投与は、有望な結果を与 えた。こうしたCD4+Ｔ細胞の一時的な除去は遺伝子産物に対する免疫応答のエフ ェクター期を妨害するらしい。さらに、ファブリ病患者の中で、存在する何らか の非機能性タンパク質によると考えられるミスセンス変異を有するものがある。 これらの場合、遺伝子治療産物に対する免疫応答の誘導が阻止されることがある 。 トランスフェクトされた繊維に対する免疫反応とは別に、別の著者は、リポー ター遺伝子を有するプラスミド構築物の注射後、CMV-プロモーターによって推進 される発現の活性が低下することを示した。対照的に、RSVプロモーターを含有 するベクターはより持続する発現を示した。プロモーター間のこれらの差異の理 由はよくわからないが、機構の１つとして、プロモーターのシャットオフ(shut- off)が提案された。しかし、我々の結果は、成熟筋繊維に類似した状態中で、ML Cl/3エンハンサー要素がCMVプロモーターによって推進される発現を増加させ、 そして長期化させることができることを示唆している。これは筋肉中の直接のプ ラスミドの注射のために設計するベクターの開発にとって、興味深い暗示となる であろう。なぜならば、これによってCMVプロモーターの活性をより長期間維持 することができると考えられるからである。 要約すると、我々のinvivoの結果は、プラスミド発現ベクターの注射後、筋肉 内でのα-galの産生の有意な増加を示している。筋細胞がヒトα-galを正しくプ ロセスされた形態で分泌することができることを示す我々のデータと合わせて、 ここに示した結果はこの発現系の改良およびin vivoでの筋肉からのα-galの製 造のための戦略の作製に向けて、有意なステップを与えるものである。 ファブリ病のマウスモデルへのαガラクトシダーゼ遺伝子の移入 National Institutes of Health(USA)より、αガラクトシダーゼ遺伝子が非機 能性になっているノックアウトマウスを入手した。ファブリ病を特徴付ける不全 はαガラクトシダーゼの欠損であり、この酵素がないかまたは不適切なレベルで 産生される（Ohshima,T.ら、(1977)）ものであるから、これらのマウスはヒトに おけるファブリ病のモデルである。 本発明の構築物（pX61およびpX62、これらはpX3F、pX4FおよびpX7Fと同様にCM Vプロモーター、MLC1/3エンハンサーを含有するが、後者において使用したアン ピシリン抵抗性マーカーの代わりにカナマイシン抵抗性マーカーを含有している ）を使用して、既知の手法によって、これらのマウス中にαガラクトシダーゼ遺 伝子を導入した。上記のように、構築物はラットミオシンＬ鎖1/3エンハンサー と 組合せたCMVプロモーターの制御下でαガラクトシダーゼ遺伝子を発現する。マ ウスの年令および性別ならびに注射部位の各種の組合せについて試験し、１週間 または３週間後にこのマウスの筋肉中のαガラクトシダーゼ活性をアッセイした 。構築物を筋内注射によって若いマウスに注射し、αガラクトシダーゼレベルを １週間後にアッセイした場合に、最も顕著な結果が得られた。 結果を以下に示す。数字は筋肉中、タンパク質１mg当たりのαガラクトシダー ゼ活性の単位を表す。（m）および(f)はマウスの雄および雌を表す。参考として 、正常なマウス中のαガラクトシダーゼ活性のレベルは4〜5単位の範囲である（ 表中の対照はαガラクトシダーゼ遺伝子が特別にノックアウトされているので、 正常レベル以下である）。 実施例2 我々は多数の筋特異的プロモーターとミオシンＬ鎖エンハンサーをリポーター 遺伝子であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子へ つないだ場合に得られる発現レベルを、in vitroおよびin vivoでマウスの速筋 および遅筋に注射することによって調べた。その結果、末端切断型ミオシンＨ鎖 プロモーターとエンハンサーの組み合わせで最高レベルの発現が見られ、その他 の試験した組み合わせでは全範囲に及ぶ発現レベルが得られた。このデータはこ れらの構成要素に基づいて作られたカセットが、裸のDNAを筋肉内に注射した後 の遺伝子の導入と発現のための効率的なベクターを提供するであろうことを示し ている。図6から9の説明 図6．種々の筋特異的プロモーター断片を図示したもの。主要な筋特異的要素 は各線画中に示している。略語解:1．SV-40-CAT，2．MHC-CAT，ウサギβ-ミオシ ンＨ鎖断片＋ミオシンＬ鎖エンハンサー，3は2と同じだがエンハンサーのないも の，4．MLCl-CAT，ラットミオシンＬ鎖プロモーター＋ミオシンＬ鎖エンハンサ ー，5は4と同じものにエンハンサーを加えたもの，6．MCK-CAT，M-CKプロモータ ーの筋特異的断片，7．HMHC-CAT，ヒトβ-ミオシンＨ鎖断片。 図7．C2Cl2細胞中で種々の筋特異的プロモーター断片を用いて得られた発現。 試験構築物とβガラクトシダーゼ含有プラスミドを用いてC2Cl2細胞をトランス フェクトした後のCAT活性の定量（方法の項を参照せよ）。0.5吸光度ユニットの βガラクトシダーゼ活性に対応する量の細胞抽出物をアッセイした。結果は4枚 の皿の平均と標準偏差で示す。構築物の順番は図６と同様である。 図8．筋特異的プロモーター断片によって得られた正常マウスの前脛骨筋及び ヒラメ筋中での発現。各試験構築物を6個の筋肉中に注射した。0.5吸光度ユニッ トのβガラクトシダーゼ(前脛骨筋)および0.2ユニットのβガラクトシダーゼ(ヒ ラメ筋)に対応する細胞抽出物をアッセイした。構築物の順番は図6と同様である 。 図9．エンハンサーのある場合とない場合での前脛骨筋中での末端切断型ウサ ギミオシンＨ鎖構築物の発現。(a,c)抗CAT染色，(b,d)ミオシンATPase，アルカ リプレインキュベーション。ミオシンＨ鎖プロモーターでエンハンサーなし(a,b )。速筋線維(A)、中間線維(Ｂ)、および遅筋線維(Ｃ)の染色が得られた。ミオシ ンＬ鎖エンハンサーにミオシンＨ鎖プロモーターがついたもの(c,d)。速筋線維( E)は、中間線維で染色が少し観察される時に主として染色される。 C2Cl2細胞中における筋特異的プロモーターの転写活性 多数のプロモーター断片をCATのベーシックプラスミド中にサブクローン化し た。そのうちのいくつかについては900bpのミオシンＬ鎖エンハンサーをCATの下 流のプラスミドのBamHl部位に挿入した。試験した構築物は：βMHC-CAT(βMHC) ，ウサギβ心筋ミオシンＨ鎖の780bp断片で骨格筋中で特異的に発現することが 前もって示されているもの7，ミオシンＬ鎖1/3fプロモーターの1500bp断片8,ヒ トβミオシンＨ鎖の1400bp断片9，およびクレアチンキナーゼの筋特異的な形で あるM-CKの200bpのプロモーター/エンハンサー断片10(図6)である。また、ウサ ギのβ心筋ミオシンＨ鎖およびＬ鎖プロモーター断片をミオシンＬ鎖エンハンサ ーとともに用いて調べた。骨格筋内で高いレベルで発現されることが示されてい るSV40初期プロモーターを含むSV40-CAT構築物を発現の参照ポイントとして用い 、プロモーターを持たないCATベーシックベクターも発現のバックグラウンドレ ベルを知るために用いた。CMVプロモーターではなくSV40プロモーターを選択し たのは、我々の研究室の最近の研究で、CMVプロモーターが筋芽細胞培養では強 く発現されるが筋管では発現が悪く、従って成熟した筋肉中での発現が良いとは 思えないからである。全てのトランスフェクションにおいてβガラクトシダーゼ リポーター遺伝子を有するプラスミドをトランスフェクションの効率をキャリブ レートするために同時にトランスフェクションさせた。 構築物をC2Cl2筋芽細胞中にトランスフェクトさせ、4日間かけて分化させた。 筋管からのタンパク質抽出物のβガラクトシダーゼ活性をまずアッセイした。次 いで、相対的な転写活性を直接比較したデータが得られるように、βガラクトシ ダーゼ活性が等しくなるように対応させたタンパク質抽出物のCAT活性をアッセ イした。結果を図7に示す。試験したプロモーター断片の全てが、プロモーター を持たない構築物で得られたバックグラウンドレベルを超える発現レベルを示し た。ミオシンＬ鎖エンハンサーを持つウサギβミオシンＨ鎖で最も高い発現レベ ルが得られた。この組み合わせでの転写活性はSV40初期プロモーターを含有する 構築物の約60%であった。これらの結果は、ここで用いた異なるプラスミド構築 物は全て機能を有し、ここに試験したプロモーター断片の全てが程度の差はある が活性があったことを示している。しかし、C2Cl2筋管は胚性の筋肉の特徴を示 している。従って、筋線維におけるこれらの構築物の活性を評価するためにはin vivoでの実験を行うことが必要であった。 速筋および遅筋中での転写活性 in vivoで異なる構築物の相対的な活性を評価するため、試験プラスミド100μ gをマウスの前脛骨筋（ＴＡ）に60μgのプラスミドCH110とともに注射した。ヒ ラメ筋への注射には80μgの試験プラスミドと60μgのCH110を用いた。注射の10 日後に筋肉を摘出し、CAT活性のアッセイのための処理をした。図8は前脛骨筋お よびヒラメ筋の双方で全ての構築物で程度の差はあるが発現がみられたことを示 している。最も高いレベルの発現は末端切断型のウサギβ心筋ミオシンＨ鎖断片 およびミオシンＬ鎖エンハンサーを有するプラスミドで得られた。この構築物で 得られた発現レベルは、参照として用いたプラスミドであるSV40-CATでの発現レ ベルの約80%であった。その他のプラスミドでは様々なレベルの発現が見られ、 前脛骨筋中での発現レベルは、SV40-CATでの発現レベルに対し、エンハンサーを 有するβMHC-CATプラスミドでの69.4%から、MLC-CATプラスミドでの32.5%までの 範囲であった。ヒラメ筋中での発現レベルも様々であった。βMHC-CAT構築物で は低レベル(SV40-CATの19.6%)の発現が観察された。この断片が遅筋MyHCのもの であることから考えると、これは予期していなかった結果である。この構築物に ミオシンＬ鎖エンハンサーを含ませた場合には発現は約４倍に増加した。我々は 現在、このプロモーターの筋線維特異性、およびエンハンサーの存在が筋線維特 異性を変化させることになるのか、あるいは同一の筋線維内で発現レベルを上げ るにすぎないのかを免疫細胞化学的に調べている。 速筋および遅筋によるプラスミドの取り込み 筋線維によるプラスミドの取り込みの機作はこれまでのところほとんど解明さ れていない。一つの可能性としては取り込みが線維のタイプによって異なること が挙げられる。このことを調べるための第１段階として、βガラクトシダーゼ含 有プラスミドの発現レベルをタンパク質含量を規準化して2種類の筋肉中で比較 した。表2はβガラクトシダーゼ活性がヒラメ筋中ではより低いことを示してい る。このことは筋線維のタイプによって取り込みが異なること、すなわち遅筋線 維でのプラスミドの取り込みはより低いことを反映しているといえる。しかし、 取り込みは2種類の筋肉の血管形成の程度に依存することもあり得る。ヒラメ筋 は血管形成が高度である。従って、注射されたプラスミドのうちのいくらかが筋 線維中に入る前に循環系によって除去されてしまうことが起こりうる。この点を 明確にするためには線維のタイプが混合した筋肉を用いてさらに実験を行うこと が必要である。 表2 前脛骨筋とヒラメ筋中のβガラクトシダーゼ発現の比較 表2 前脛骨筋とヒラメ筋中のβガラクトシダーゼ発現の比較。注射された筋 肉をCAT活性の標準化の目的でアッセイした（方法の項参照）。数字は平均およ び標準偏差を示す。 末端切断型βミオシンＨ鎖構築物の速筋および遅筋での発現の分析 末端切断型ウサギβミオシンＨ鎖単独、あるいはミオシンＬ鎖エンハンサーと 共にミオシンＨ鎖を発現するいずれかの構築物を前脛骨筋に注射した。 アルカリでプレインキュベーションした後、筋肉の隣接横断切片をCATおよび ミオシンATPase活性を調べるために染色した。図9a,bに示すように、末端切断型 βミオシンＨ鎖構築物では速筋および中間のタイプの線維、ならびにいくつかの 遅筋線維で染色が陽性となった。このプロモーターとミオシンＬ鎖エンハンサー を有する構築物では染色は速筋線維に限定されていた(図9c,d)。このことは、こ のタイプの構築物中では筋節タンパク質のエンハンサーの存在によってもとの遺 伝子の特徴を示す表現型へのシフトが起こることを示している。これらの実験で は遅筋線維では染色の程度はより低かった。このことは、異なる筋線維のタイプ では膜の構成成分が異なることを反映してプラスミドの取り込みの程度が異なる ことから起きるのかもしれない。 本研究では、多数の異なるプラスミド構築物、その構築物中には対象となる遺 伝子の発現を推進するための筋特異的プロモーター断片が用いられているが、そ の構築物の速筋および遅筋による取り込みおよび発現のレベルについてのデータ を提示している。これらの結果は、広範囲の発現レベルを得ることができること 、および構築物中にエンハンサーが存在すれば発現レベルが非常に増大すること を示している。 筋肉中への遺伝子の導入と発現には今までに数種のタイプのベクターが用いら れてきており、それらは一般的にはレトロウイルスベクターおよびアデノウイル スベクターの２つのカテゴリーに分けられる。これらはリポーター遺伝子11およ びジストロフィン12,13の発現を十分なレベルで行うことが示されている。しか し、比較的低い比率の線維のみが陽性を示した。さらにウイルスベクターを使用 することによって、例えば外傷後の筋肉の再生の際などに組換え事象が起こった り、内因性遺伝子の活性化が起こる可能性がある。 試験プロモーターのうちで、ウサギ末端切断型β心筋ミオシンＨ鎖プロモータ ーは予期していなかった結果、すなわちその発現がヒラメ筋では低いという結果 を示した。この点を明確にするためにさらに実験を行っている。Rindtら14はマ ウスの等価物から得た600bpの断片をトランスジェニック実験に用い、発現はそ の構築物がゲノムに組み込まれる位置（point）に依存すると報告している15。 末端切断型のプロモーターは、おそらくいくつかの調節要素が除去されたために 、それが属しているアイソフォームでは不定型の性質を示す可能性がある。 Wolffら16は、プラスミドが筋肉中に導入されるとそれは長期間そこに保持さ れることを示した。さらに筋肉による保持はエピソーム性(episomatic)であり、 このことは組換え事象によって生じる副作用を排除するものである。筋肉による 取り込みの程度は年齢および性別に依存して変わることが示されている3。我々 の研究では、マウスの性別(雌)および年齢(8-12週令)のものはマウスの研究での 最も結果の悪いものに匹敵はするが、SV40初期プロモーター構築物、および筋特 異的プロモーターを有する構築物のうちのいくつかのいずれでもリポーター遺伝 子の高度の発現を観察した。このことはおそらく我々の研究で用いたプラスミド が高度にスーパーコイル化されているという事実によるものと思われ、そのこと によって筋線維によるより高い取り込みが可能となったものと思われる。より最 近になって、初代培養の研究において、筋管中に取り込まれたプラスミドDNAの 多くが細胞質コンパートメント中に隔離されるが、筋管の核のうちの高い比率の ものが残りのプラスミドを取り込むことが示された17。 材料と方法 プラスミド プロモーター断片は次のように得た：ウサギβ心筋プロモーターはDr.Patrick Umeda，University of Alabama，Birmingam，米国アラバマ州から、ヒトβ心筋 プロモーターはDr.Hans-Peter Vosberg，Max-Planck Institute，Bad Neuheim， ドイツから、M-CKプロモーター/エンハンサーはDr.Steve Hauschka，University of Washingtonから、ミオシンＬ鎖エンハンサーはDr.Nadia Rosenthal，Harvar d Universityから得た。CATプラスミド(Promega)中へのクローニングは標準的な 方法で行った。プラスミドの調製はMega-Prepキット(Qiagen，ドイツ)で行った 。これらの調製法で得られたプラスミドは高度にスーパーコイル化されている。 細胞培養とトランスフェクション C2Cl2細胞は、10%ウシ胎児血清(Gibco)、0.5%アンピシリン(Sigma，英国)、お よび0.5%ゲンタマイシン(Sigma)を含むDMEM培地(Gibco)中で培養した。分化培地 は上述の抗生物質を含むDMEM培地に5%ウマ血清(Gibco)を含有させたものからな る。筋芽細胞はトランスフェクトするため60mmの皿当たり細胞が2x105個となる ようにプレーティングした。各皿に10μgの試験プラスミドおよび5μgのβガラ クトシダーゼ遺伝子含有のプラスミドをトランスフェクトし、リポフェクタミン (Gibco)で複合体化した。トランスフェクションは一晩行った。次いで、細胞を 分化用の培地に変え、4日間分化させた。細胞を集め、CATおよびβガラクトシダ ーゼのアッセイのための処理を行った。 速筋および遅筋中への注射 8-12週令のC57B1/10マウス(Olac，Oxford，英国)を用いた。注射用混合液は、 前脛骨筋には試験プラスミド(100μg)およびSV40初期プロモーターで推進される βガラクトシダーゼリポーター遺伝子を含むプラスミドCH110(Promega)の60μg をPBS中に含有する液である。ヒラメ筋には80μgの試験プラスミド、および40μ gのCH110を注射した。マウスは注射10日後に屠殺し、その筋肉を酵素アッセイあ るいは染色のために処理した。 タンパク質アッセイ アッセイはBSAを標準物質として用いてビシンコニン酸(bicinchoninic acid) 法19で行った。 βガラクトシダーゼアッセイ 20mlの細胞または筋肉抽出物を用いたこと以外はShambrookら20の方法を用い 、反応は37℃で一晩インキュベートして行った。 CAT活性のアッセイ アッセイはAusubetら21の方法で行った。簡潔に記せば次のとおりである。細 胞をPBSで3回洗い、100μlの0.25M Tris.HCl pH7.6中に採取した。筋肉を0.25M Tris pH7.6の150μl中(前脛骨筋)および100μl中(ヒラメ筋)で小乳棒を用いてホ モジナイズした。CATアッセイ反応混液は4μlの[14C]クロラムフェニコールおよ び20μlの8mMアセチル補酵素Aを含有する。対応する量の細胞または筋肉抽出物 を37℃で2時間インキュベートし、1mlの酢酸エチルで抽出し、残さを30μlの酢 酸エチルに溶解した。サンプルをTLCクロマトグラフィープレート上にのせ、ク ロロホルム:メタノールを19:1とした中で2時間クロマトグラフィーを行った。結 果はオートラジオグラフィーで可視化した。クロラムフェニコールのアセチル化 型への変換を測定するためにスポットを掻き取り、液体シンチレーションカウン ターで放射能を測定した。クロラムフェニコールのアセチル化型への変換率を計 算した。 免疫細胞化学 上述のとおり筋肉に注射し、その筋肉を集め、融解したイソペンタン中に包埋 させた。12μmの冷凍切片を作り、それに隣接した切片を抗体染色あるいはATPas eを組織化学的に調べるために処理した。CAT酵素はヒツジポリクローナル抗体(B oehringer Mannheimm，ドイツ)で検出した。免疫染色法のプロトコールは次のと おり：切片をPBS中に4%パラホルムアルデヒドおよび0.2%ピクリン酸を含む液で3 0分間固定し、0.1%BSA含有のPBSで3回各10分間洗い、PBS中に3%H2O2 を含む液で20分間処理し、0.1%BSA含有のPBSで3回各10分間洗い、10%の免疫前の ヤギ血清中に1/50希釈の一次抗体を含有する液中で4℃で一晩インキュベートし た。PBS/BSA溶液で3回各30分間洗った後、1/200希釈の抗ヒツジIgM-HRP(Fab断片 )中で2時間室温でインキュベートした。最後に切片を3'3'-ジアミノベンチジン を基質として用いて展開した。 ミオシンATPase組織化学 アルカリによるプレインキュベーション(pH10.4)をGuth and Samaha22の方法 にHamalainen and Pette23の改変を加えて行った。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/00 Ａ６１Ｋ 35/12 9/10 35/76 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 7/00 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 35/12 Ａ６１Ｋ 37/02 35/76 37/54

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．機能し得る形で連結された(i)ミオシンＬ鎖エンハンサー１個、(ii)ミオシ ンＨ鎖プロモーターおよびウイルスプロモーターから選択されるプロモーター１ 個ならびに(iii)目的のポリヌクレオチド配列１個を含む、発現カセット。 ２．前記ミオシンＬ鎖エンハンサーがミオシンＬ鎖1/3エンハンサーである、請 求項１に記載の発現カセット。 ３．前記ミオシンＨ鎖プロモーターが魚類ミオシンＨ鎖プロモーターである、請 求項１または２に記載の発現カセット。 ４．前記魚類ミオシンＨ鎖プロモーターがコイFG2ミオシンＨ鎖プロモーターで ある、請求項３に記載の発現カセット。 ５．前記ミオシンＨ鎖プロモーターが哺乳動物ミオシンＨ鎖プロモーターである 、請求項１または２に記載の発現カセット。 ６．前記哺乳動物ミオシンＨ鎖プロモーターが末端切断型ウサギβ心臓ミオシン Ｈ鎖プロモーターである、請求項５に記載の発現カセット。 ７．前記ウイルスプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーターまたは単純 heルペスウイルスプロモーターである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の発 現カセット。 ８．前記目的のポリヌクレオチド配列が治療上有用なポリペプチドをコードする 、請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現カセット。 ９．前記ポリペプチドがαガラクトシダーゼである、請求項８に記載の発現カセ ット。 10．前記目的のポリヌクレオチドを真核細胞に送達するのに使用するための、請 求項１〜９のいずれか１項に記載の発現カセット。 11．前記真核細胞が鳥類、魚類または哺乳動物の筋細胞である、請求項10に記載 の発現カセット。 12．請求項１〜１１のいずれか１項で定義された発現カセットを含む、核酸ベク ター。 13．前記発現カセットに隣接する鳥類、魚類または哺乳動物のゲノム配列をさら に含む、請求項12に記載のベクター。 14．前記発現カセットに隣接するウイルスのゲノム配列をさらに含む、請求項12 または13に記載のベクター。 15．請求項1〜11のいずれか１項で定義された発現カセットを含む、ウイルス株 16．請求項1〜11のいずれか１項で定義された発現カセットをウイルスのゲノム 中に導入することを含む、請求項15に記載のウイルス株を製造する方法。 17．請求項14で定義されたベクターとウイルスのゲノム間での相同組み換えによ り、請求項1〜11のいずれか１項で定義された発現カセットを該ウイルスのゲノ ム中に導入することを含む、請求項15に記載のウイルス株を製造する方法。 18．ヒトまたは動物体の治療方法に使用するための、請求項1〜11のいずれか１ 項に記載の発現カセット、請求項12〜14のいずれか１項に記載のベクターまたは 請求項15に記載のウイルス株。 19．ファブリ病の治療において使用するための、請求項1〜11のいずれか１項に 記載の発現カセット、請求項12〜14のいずれか１項に記載のベクターまたは請求 項15に記載のウイルス株。 20．請求項1〜11のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項12〜14のいずれ か１項に記載のベクターまたは請求項15に記載のウイルス株の、ファブリ病の治 療における使用。 21．製薬上許容される担体または希釈剤とともに、請求項1〜11のいずれか１項 に記載の発現カセット、請求項12〜14のいずれか１項に記載のベクターまたは請 求項15に記載のウイルス株を含む、医薬組成物。 22．治療を必要とするヒトまたは動物に、有効で非毒性の量の請求項21に記載の 医薬組成物を投与することを含む、ヒトまたは動物体の治療方法。 23．ファブリ病の治療のための、請求項22に記載の方法。 24．治療を必要とするヒトまたは動物の細胞中に、該細胞中で治療用ポリペプチ ドをコードする異種遺伝子の有効な発現をもたらす量の、請求項1〜11のいずれ か１項に記載の発現カセット、請求項12〜14のいずれか１項に記載のベクターま たは請求項15に記載のウイルス株を導入することを含む、ヒトまたは動物の遺伝 子治療の効果をあげる方法。 25．前記目的のポリヌクレオチドが１以上のエピトープを含むポリペプチドをコ ードする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現カセット。 26．前記ポリペプチドが病原生物由来である、請求項25に記載の発現カセット。 27．請求項25または26に記載の発現カセットを含むベクター。 28．請求項25または26に記載の発現カセットを含むウイルス株。 29．鳥類、魚類または哺乳動物の予防接種法に使用するための、請求項25若しく は26に記載の発現カセット、請求項27に記載のベクターまたは請求項28に記載の ウイルス株。 30．製薬上許容される担体または希釈剤とともに、請求項25若しくは26に記載の 発現カセット、請求項27に記載のベクターまたは請求項28に記載のウイルス株を 含む、ワクチン。
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