KR20210049131A - 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 유전자 서열 및 이의 용도 - Google Patents

재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 유전자 서열 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase 유전자 서열 및 이의 적용. 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 암호화하는 핵산을 포함하는 융합 핵산. 핵산 또는 융합 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터. 핵산 또는 융합 핵산을 숙주로 도입시키는 형질전환체. 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 ADOA의 병리학적 소견을 효과적으로 개선시킬 수 있는 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase 유전자 불활성화를 기반으로 하는 비인간 포유류의 ADOA 모델. 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 암호화하는 핵산의 발현 수준이 더 높고, 이에 따라 미토콘드리아에서 더 많은 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase가 수득될 수 있고, ADOA와 같은 안질환이 더 잘 치료될 수 있다.

Description

재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 유전자 서열 및 이의 용도
본 발명은 생물학적 제제 분야, 특히 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사(dynein-like) GTPase의 유전자 서열 및 이의 용도에 관한 것이다.
상염색체 우성 시신경 위축(autosomal dominant optic atrophy: ADOA)은 발병률이 약 1:12,000 내지 1:50,000인 원발성 유전성 시신경병증의 가장 흔한 형태로서, 발병 개시는 아동기에 잠행성이다. 이의 임상적 특징은 경도(mild) 내지 중등도(moderate)의 시력 상실, 색각 결손, 중심 시야 결함 및 일시적 시신경유두 창백에 의해 증명된다. 먼저, 유두 혈관 다발이 손상되고, 그 다음 시신경의 상행 위축 및 시신경의 수초 손실이 일어난다.
ADOA는 내부 미토콘드리아 막 단백질을 암호화하는 유전자 및 유전자좌의 돌연변이에 의해 유발되고, 외국 학자들은 이러한 유전자가 주로 OPA1-OPA8인 것으로 결정하였다; 이 중에서, 처음에는 ADOA 환자의 약 75%가 엑손 740 및 2794에서의 부위 돌연변이가 가장 흔한 OPA1에 의해 운반되는 이형접합성 및 우성 돌연변이와 관련이 있는 것으로 확인되었다. OPA1 단백질은 내부 미토콘드리아 막에 위치하여 에너지 대사 및 아폽토시스를 제어하고, 크리스타 및 mtDNA의 무결성을 유지하며 GTPase 활성을 갖는다. ADOA의 병인은 돌연변이 OPA1이 대립유전자의 결실과 동등한 완전한 GTPase 도메인이 일반적으로 없는 단백질의 다양한 절두형을 암호화하는 것에 있고, 이는 OPA1의 양을 크게 감소시키며, 결과적으로 소위 일배체 부족을 초래하여 미토콘드리아 기능이 손상된다. 단편화된 미토콘드리아는 시신경 세포에 정상적으로 ATP를 공급할 수 없고, RGC 세포는 아폽토시스를 점차적으로 겪고, 이는 환자에게 ADOA 발생을 야기한다.
현재, ADOA는 치료 수단이 없으며 세계적으로 인정받는 유전성 시신경병증 중 하나이다. 유전자 요법의 발달에 의해, ADOA의 유전자 요법이 가능해지고 있고, 여기서 어려움은 다양한 형태의 OPA1 엑손 접합 및 다양한 형태의 돌연변이이며, 이는 다양한 유형과 돌연변이 형태이 병원성 단백질을 유발하고, 결과적으로 특정 유전자 약물을 사용하여 모든 환자를 치료하는 것은 불가능하다.
외국 연구에서 사람들은 OPA1 돌연변이에 의해 유발된 ADOA의 병인을 연구하였고 다양한 형태의 OPA1 전사 및 유전자 산물을 분석하였으며 재조합 OPA1 단백질에 대한 더 나은 정제 방법을 탐구하였다. 또한, 가족 병력을 조사하고 분석하여 결함성 OPA1을 운반하는지의 여부를 선별, 식별 및 진단하는 방법을 모색하였다. 또한, OPA1 돌연변이로 인한 ADOA의 예후적 유전자 진단 및 치료도 기대되고 있다. 그러나, 현재 아데노 관련 바이러스 벡터를 사용하여 임의의 유형의 인간 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase 유전자를 재조합하는 것, 뿐만 아니라 그 생산 및 사용에 대한 보고는 없다.
따라서, 본 기술분야에서는 치료 효과가 양호한 인간 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase에 대한 발현 시스템 및 제조 방법의 개발이 시급하다.
본 발명의 목적은 치료 효과가 양호한 인간 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 발현 시스템 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 인간 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 암호화하기 위한 최적화된 핵산 서열, 이의 벡터 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양상은 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 것으로서, 뉴클레오타이드 서열은 하기 서열로 이루어진 군에서 선택된다:
(a) 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열; 및
(b) 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 95% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열.
다른 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 DNA 서열, cDNA 서열 또는 mRNA 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 단일 가닥 서열 및 이중 가닥 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 완전히 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 제시된 것으로서, 여기서
위치 1 내지 288은 MIS의 암호 서열이고;
위치 289 내지 2772는 GTPase 도메인, 중심 다이네인 도메인 및 GTPase 효과기 도메인의 암호 서열이고;
위치 2773 내지 2775는 정지 코돈이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 서열번호 1의 서열은 서열번호 1의 위치 1 내지 288에 제시된 MIS 암호 서열; 및 서열번호 1의 위치 289 내지 2772에 제시된 GTPase 도메인, 중심 다이네인 도메인 및 GTPase 효과기 도메인의 암호 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 서열번호 2의 서열은 서열번호 2의 위치 1 내지 288에 제시된 MIS 암호 서열; 및 서열번호 2의 위치 289 내지 2772에 제시된 바와 같은 GTPase 도메인, 중심 다이네인 도메인 및 GTPase 효과기 도메인의 암호 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 MIS를 개별적으로 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1 또는 2의 위치 1 내지 288), 및 GTPase 도메인, 중심 다이네인 도메인 및 GTPase 효과기 도메인을 개별적으로 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1 또는 2의 위치 289 내지 2772 또는 289 내지 2775)을 제공한다.
본 발명의 제2 양상은 본 발명의 제1 양상에 기재된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 융합 핵산을 제공한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 융합 핵산은 UTR 서열, 프로모터 서열 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 추가로 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, UTR 서열은 3'-UTR 및/또는 5'-UTR을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, UTR 서열은 구조를 안정화하기 위한 폴리A(polyA) 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 융합 핵산은 5'-말단부터 3'-말단쪽으로 화학식 I의 구조를 갖는다:
Z1-Z2-Z3 (I)
식 중,
각 "-"는 독립적으로 결합 또는 뉴클레오타이드 링커 서열이고;
Z1은 없거나 또는 5'-UTR 서열이고;
Z2는 본 발명의 제1 양상에 기재된 뉴클레오타이드 서열이고;
Z3은 3'-UTR 서열이다.
다른 바람직한 실시형태에서, Z1은 5'-UTR 서열이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 각 뉴클레오타이드 링커 서열의 길이는 1 내지 30개 nt, 바람직하게는 1 내지 15개 nt, 더 바람직하게는 3 내지 6개 nt이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 링커 서열은 제한 엔도뉴클레아제를 통한 분해에 의해 형성된 뉴클레오타이드 링커 서열로부터 유래된다.
본 발명의 제3 양상은 본 발명의 제1 양상에 따른 뉴클레오타이드 서열 또는 본 발명의 제2 양상에 따른 융합 핵산을 함유하는 벡터를 제공한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 벡터는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터, 인핸서, 전사 종결 신호, 폴리아데닐화 서열, 복제 기점, 선택가능한 마커, 핵산 제한 부위 및/또는 상동성 재조합 부위를 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 벡터는 플라스미드 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 벡터는 AAV 벡터이다.
다른 바람직한 실시형태에서, AAV 벡터의 혈청형은 AAV2, AAV5, AAV7, AAV8 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 벡터는 DNA 바이러스 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 벡터는 본 발명의 제1 양상에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 본 발명의 제2 양상에 기재된 융합 핵산을 함유하거나 삽입된 AAV 벡터이고; 바람직하게는, 벡터는 AAV 벡터 플라스미드 pSNaV이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 벡터는 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 발현하기 위해 사용된다.
본 발명의 제4 양상은 숙주 세포를 제공하고, 상기 숙주 세포는 본 발명의 제3 양상에 기재된 벡터를 함유하거나, 또는 숙주 세포는 그 염색체에 외인적으로 통합된 본 발명의 제2 양상에 기재된 융합 핵산 또는 본 발명의 제1 양상에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
다른 바람직한 실시형태에서, 숙주 세포는 포유류 세포이고, 포유류는 인간 및 비-인간 포유류를 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 숙주 세포는 293T 세포, 광수용체 세포(원추 세포 및/또는 간상 세포 포함), 기타 시각 세포(예컨대, 양극성 세포), (시)신경 세포 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 숙주 세포는 간상 세포, 원추 세포, 온(on)-양극성 세포, 오프(off)-양극성 세포, 수평 세포, 신경절 세포, 무축삭 세포 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 숙주 세포는 (망막) 신경절 세포이다.
본 발명의 제5 양상은 대상체의 시력 회복 및/또는 안질환 치료를 위한 제제 또는 조성물을 제조하는데 사용되는, 본 발명의 제3 양상에 기재된 벡터의 용도를 제공한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 안질환은 망막병증이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 제제 또는 조성물은 유전성 시신경병증, 바람직하게는 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)을 치료하는데 사용된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 제제 또는 조성물은 망막 신경절 세포 아폽토시스를 치료하는데 사용된다.
본 발명의 제6 양상은 (a) 본 발명의 제3 양상에 기재된 벡터 및 (b) 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 약제학적 제제를 제공한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 약제학적 제제의 투여 형태는 동결건조 제제, 액체 제제 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 벡터는 AAV 벡터이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 약제학적 제제에서 벡터의 함량은 1×109 내지 1×1016, 바람직하게는 1×101 내지 1×1013 바이러스/㎖, 보다 바람직하게는 2×1011 내지 1×1012 바이러스/㎖이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 약제학적 제제는 안질환 치료, 바람직하게는 망막 신경절 세포 아폽토시스 치료에 사용된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 약제학적 제제는 유전성 시신경병증, 바람직하게는 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)을 치료하기 위해 사용된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 약제학적 제제는 안구에서 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 발현 및/또는 활성을 유의적으로 증가시킬 수 있다.
본 발명의 제7 양상은 장시간 동안 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 방법으로서, 본 발명의 제3 양상에 기재된 벡터를 도입시키는 것, 및/또는 본 발명의 제6 양상에 기재된 약제학적 제제를 투여하는 것을 를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 방법은 세포에서 생성된 ATP의 함량을 효과적으로 증가시킬 수 있고/있거나, 미토콘드리아의 아폽토시스를 억제할 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 방법은 GTPase의 발현 및/또는 활성을 지속적으로 상향조절할 수 있다.
본 발명의 제8 양상은 본 발명의 제3 양상에 기재된 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 벡터는 AAV 벡터이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 벡터는 필요로 하는 대상체의 눈에 도입된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 필요로 하는 대상체는 인간 및 비인간 포유류를 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 치료 방법은 안질환을 치료하는 방법이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 안질환은 유전성 시신경병증, 바람직하게는 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)이다.
치료 방법은 안구에서 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 발현 및/또는 활성을 효과적으로 증가시킬 수 있다.
치료 방법은 최대 6 개월, 바람직하게는 최대 3 개월 동안 안구에서 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 발현 및/또는 활성을 효과적으로 증가시킬 수 있다.
치료 방법은 망막 ATP 함량을 효과적으로 증가시킬 수 있고 및/또는 미토콘드리아 아폽토시스를 억제할 수 있다.
본 발명의 제9 양상은 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 제조하는 방법으로서, 본 발명의 제4 양상에 기재된 숙주 세포를 배양하여 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 수득하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제10 양상은 OPA1 유전자의 발현 또는 생존력이 감소된 ADOA(상염색체 우성 시신경 위축)의 세포 모델을 제공한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 세포는 망막 신경절 세포(RGC)를 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, OPA1 유전자는 완전히 발현되지 않거나 비활성이다.
본 발명의 제11 양상은 ADOA(상염색체 우성 시신경 위축)의 세포 모델을 제조하는 방법으로서, 세포를 제공하는 것, 세포 내에서 OPA1 유전자에 점 돌연변이를 수행하여 OPA1 유전자의 점 돌연변이를 갖는 세포를 수득하는 것; 및 선별을 통해 양성 점 돌연변이를 갖는 단일클론 세포를 수득하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.
다른 바람직한 실시형태에서, OPA1 유전자 점 돌연변이는 Q(글루타민) 285 Stop 점 돌연변이를 지칭한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 세포는 RGC 세포를 포함한다.
본 발명의 제12 양상은 GRC 세포에서 OPA1 유전자의 발현 및/또는 생존력이 감소된 ADOA(상염색체 우성 시신경 위축)의 비인간 포유류 모델을 제공한다.
다른 바람직한 실시형태에서, OPA1 유전자는 점 돌연변이, 구체적으로 Q(글루타민) 285 Stop 점 돌연변이를 갖는다.
본 발명의 제13 양상은 ADOA(상염색체 우성 시신경 위축)의 비인간 포유류 모델을 제조하는 방법으로서,
(a) 비인간 포유류 세포를 제공하고, 세포 내에서 OPA1 유전자에 점 돌연변이를 수행하여 OPA1 유전자의 점 돌연변이를 갖는 세포를 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득한 OPA1 유전자의 점 돌연변이를 갖는 세포를 이용하여 OPA1 유전자의 점 돌연변이를 갖는 동물 모델을 제조하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 바람직한 실시형태에서, OPA1 유전자의 점 돌연변이는 이형접합성 또는 동형접합성이다.
다른 바람직한 실시형태에서, OPA1 단백질의 위치 285에 있는 글루타민 부위는 전사 종결을 위해 돌연변이된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 비인간 포유류는 설치류 또는 영장류이며, 바람직하게는 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 단계 (b)는 하기 단계를 포함한다:
(b1) OPA1 유전자의 키메라 점 돌연변이를 수득한 동물 모델을 제조한 후, 교배를 통해 OPA1 유전자의 동형접합성 또는 이형접합성 점 돌연변이를 갖는 동물 모델을 수득하는 단계.
다른 바람직한 실시형태에서, 방법은 하기를 포함한다:
(1) OPA1의 285번 위치에 Q(글루타민) 돌연변이를 갖는 재조합 플라스미드를 CRISPR-CAS9 기술을 이용하여 정지(즉, Q285 Stop) 점 돌연변이로 작제하고, 상동성 돌연변이에 대한 선택가능한 마커를 갖는 DNA 서열로 대체하여 OPA1의 양성 점 돌연변이 Q285 Stop을 갖는 단일클론 배아 줄기 세포를 수득하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 수득한 OPA1 점 돌연변이를 갖는 마우스 배아 줄기 세포 클론을 이용하여 키메라 마우스를 제조 및 수득하는 단계;
(3) 단계 (2)에서 수득한 키메라 마우스를 정상 야생형 마우스와 교미시켜 번식시키고, OPA1 점 돌연변이를 수득한 자손, 즉 OPA1의 Q285 Stop 점 돌연변이를 갖는 마우스 모델로부터 이형접합성 마우스를 선별하는 단계.
다른 바람직한 실시형태에서, 이형접합성 마우스를 교미 및 번식하도록 하고, 그 자손으로부터 OPA1 점 돌연변이를 수득한 동형접합성 마우스를 선별한다.
상기 기재된 다양한 기술적 특징 및 이하(예컨대, 실시예)에 구체적으로 기재된 다양한 기술적 특징 모두는 본 발명의 범위 내에서 서로 조합되어, 새로운 또는 바람직한 기술적 해법을 형성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이들은 공간 제한으로 인해, 여기서 반복되지 않을 것이다.
도 1은 최적화된 뉴클레오타이드 서열과 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 원래 유전자 서열 사이의 오픈 리딩 프레임 서열의 비교를 나타낸다. 두 서열 사이의 상동성은 72.25%(2005/2775)이며, 그 중 동일한 염기는 "|"로 표시되고, 위쪽 열은 최적화된 오픈 리딩 프레임 뉴클레오타이드 서열이고, 아래쪽 열은 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 원래 유전자 서열(최적화되지 않은 야생 암호 서열)이다.
도 2는 OPA1 동형(isoform) 2의 전사체의 단백질 구조의 개략도를 나타낸다.
도 3은 재조합 클론으로부터 선별된 약 3000bp의 표적 밴드를 갖는 정확한 클론을 나타낸다, M: 단백질 마커; 레인 1: rAAV2/2-hOPA1 동형 2의 정확한 재조합 클론; 레인 2: 양성 대조군; 레인 3: 음성 대조군.
도 4는 재조합 아데노 관련 바이러스 플라스미드 pSNaV/rAAV2/2-hOPA1 구조의 개략도를 나타낸다.
도 5는 SDS-PAGE 전기영동에 의해 rAAV2/2-hOPA1 동형 2의 순도를 검출하기 위한 쿠마시 브릴리언트 블루 염색의 결과를 나타낸다. 이 중에서, 레인 1: 단백질 마커; 레인 2: rAAV2/2-hOPA1 동형 2.
도 6은 유리체 절제술을 받은 토끼 눈의 안저 사진을 나타내며, 여기서 A는 rAAV2/2-ZsGreen이 주사된 군(대조군)이고, B는 rAAV2/2-최적화된 hOPA1 동형 2가 주사된 군(실험군 A)이다.
도 7은 토끼 안구 절편의 면역형광 검출을 나타내며, 여기서 실험군 A는 rAAV2/2-최적화된 hOPA1 동형 2가 주사된 군이고, 실험군 B는 rAAV2/2-원래 hOPA1 동형 2가 주사된 군이다.
도 8은 유리체 절제술을 받은 토끼 눈의 OCT 사진을 나타낸다. 이 중에서, A는 rAAV2/2-ZsGreen(대조군)이 주사된 군이고, B는 rAAV2/2-최적화된 hOPA1 동형 2가 주사된 군(실험군 A)이다.
도 9는 현미경 하에 관찰된 토끼 안구의 HE 절편의 망막을 나타낸다. 이 중에서, A는 rAAV2/2-ZsGreen이 주사된 군(대조군)이고 B는 rAAV2/2-최적화된 hOPA1 동형 2가 주사된 군(실험군 A)이다.
도 10은 상이한 플라스미드가 주사된 토끼의 안구 망막에서 hOPA1 단백질의 상대적 발현량에 대한 실시간 형광 PCR 검출 결과를 나타낸다; 실험군 A는 rAAV2/2-최적화된 hOPA1 동형 2가 주사된 군이고, 실험군 B는 rAAV2/2-원래 hOPA1 동형 2가 주사된 군이며, 대조군은 rAAV2/2-ZsGreen이 주사된 군이다.
도 11은 상이한 플라스미드가 주사된 토끼의 안구 망막에서 hOPA1 단백질의 웨스턴 블롯 검출 결과를 나타낸다; 실험군 A는 rAAV2/2-최적화된 hOPA1 동형 2가 주사된 군이고, 실험군 B는 rAAV2/2-원래 hOPA1 동형 2가 주사된 군이며, 대조군은 rAAV2/2-ZsGreen이 주사된 군이다.
도 12는 ADOA(상염색체 우성 시신경 위축) 모델 마우스의 작제를 나타낸다.
도 13은 ADOA(상염색체 우성 시신경 위축)의 점 돌연변이의 모델 마우스의 유전자형 식별을 나타낸다.
도 14는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 검출된, 투여 후 마우스 망막에서의 ATP 함량 변화를 나타낸다.
도 15는 투과 전자 현미경(TEM)에 의해 관찰된 미토콘드리아의 형태를 나타낸다.
광범위하고 심층적인 연구 후, 본 발명자들은 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase(OPA1)의 유전자 암호 서열에 대해 표적화된 최적화 설계를 수행하여, 포유류(예컨대, 인간) 세포에서 OPA1 단백질이 효율적으로 전사되고 효율적으로 발현되기에 특히 적합한 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1)을 수득하고 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 위한 재조합 발현 벡터가 작제되도록 하였다. 실험 결과는 최적화되지 않은 암호 서열에 비해, 특별히 최적화된 OPA1 암호 서열(서열번호 1)이 약간 개선된 전사 효율을 가지며, 그 발현량은 5배가 넘게 유의적으로 증가하였고, 이는 포유류(특히 인간) 세포에서 발현되기에 매우 적합하며, ADOA 및 기타 안질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 보여준다. 본 발명은 이를 기반으로 하여 본 발명자들에 의해 달성된다.
정의
본 개시내용이 보다 쉽게 이해되도록 하기 위해 먼저 특정 용어가 정의된다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 하기 용어들은 각각 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한, 다음과 같은 의미를 가질 것이다. 다른 정의는 본 출원에 전반적으로 명시된다.
용어 "약"은 본 기술분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 결정된 특정 값 또는 조성의 허용되는 오차 범위 내의 값 또는 조성을 지칭할 수 있으며, 이는 그 값 또는 조성이 측정되거나 결정되는 방식에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 사용된, 표현 "약 100"은 99와 101 사이의 모든 값(예를 들어, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "포함하는(comprising)" 또는 "포함하는(including)(함유하는)"은 개방적, 반폐쇄적 및 폐쇄적일 수 있다. 즉, 이 용어는 또한 "본질적으로 이루어지는" 또는 "이루어지는"도 포함한다.
서열 동일성은 소정의 비교 창(참조 뉴클레오타이드 서열 또는 단백질 길이의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%일 수 있음)을 따라 두 개의 정렬된 서열을 비교하고 동일한 잔기가 나타나는 위치의 수를 결정함에 의해 결정된다. 일반적으로, 이것은 백분율로 표현된다. 뉴클레오타이드 서열의 서열 동일성의 측정은 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려진 방법이다.
본 명세서에 사용된 용어 "대상체" 및 "필요로 하는 대상체"는 임의의 포유류 또는 비포유류를 지칭한다. 포유류에는 인간, 설치류와 같은 척추 동물, 비인간 영장류, 소, 말, 개, 고양이, 돼지, 양 및 염소가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
OPA1(시신경 위축 1)
본 명세서에 사용되는 용어 "(재조합) 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase", "시신경 위축 단백질 1", "OPA1 (단백질)", "hOPA1 (단백질)", "폴리펩타이드", "본 발명의 폴리펩타이드" 및 "본 발명의 단백질"은 동일한 의미를 가지며 본 명세서에서 호환적으로 사용될 수 있다. OPA1은 내부 미토콘드리아 막에 위치한 GTPase 활성을 갖는 막관통 단백질이고; 이 단백질은 미토콘드리아 이입 서열(MIS), 막관통 영역(TR) 및 소수성 영역(HR)을 갖는 N-말단 막관통 영역, GTPase 도메인, 중심 다이네인 도메인, 및 GTPase 효과기 도메인(GED)을 갖는 C-말단을 포함한다. OPA1의 MIS 폴리펩타이드의 기능은 GTP 단백질을 미토콘드리아로 안내하는 것이다.
ADOA는 내부 미토콘드리아 막 단백질을 암호화하는 유전자 및 유전자좌에 돌연변이에 의해 유발되고, 외국 학자들은 이러한 유전자가 주로 OPA1-OPA8임을 결정하였다; 이 중에서, ADOA 환자의 약 75%는 OPA1에 의해 운반되는 이형접합성 및 우성 돌연변이와 관련이 있으며, 이때 엑손 740 및 2794에서의 부위 돌연변이가 가장 흔하다는 것이 처음 확인되었다. OPA1 단백질은 내부 미토콘드리아 막에 위치하여 에너지 대사 및 아폽토시스를 제어하고, 크리스타 및 mtDNA의 무결성을 유지하며, GTPase 활성을 갖는다. ADOA의 병인은 돌연변이 OPA1이 일반적으로 완전한 GTPase 도메인이 없는 다양한 절두 형태의 단백질을 암호화하는 것에 있고, 이는 대립 유전자의 결실과 동등한 것으로서, 이는 OPA1의 양을 크게 감소시켜 소위 일배체형 기능부족을 초래하고, 이에 따라 미토콘드리아 기능이 손상된다. 단편화된 미토콘드리아는 시신경 세포에 정상적으로 ATP를 공급할 수 없으며, RGC 세포는 점차적으로 아폽토시스를 겪고, 이는 환자에게 ADOA의 발생을 야기한다.
아데노 관련 바이러스
아데노 관련 바이러스(Adeno-Associated Virus)라고도 알려진 AAV(Adeno-associated virus)는 파보바이러스과(Parvoviridae)의 디펜도바이러스(Dependovirus)에 속한다. 지금까지 발견된 단일 가닥 DNA 결함성 바이러스 중 가장 단순한 유형이며 복제에 참여하기 위해 헬퍼 바이러스(일반적으로 아데노바이러스)를 필요로 한다. 이것은 양 말단의 역위 반복체(ITR)에서 cap 및 rep 유전자를 암호화한다. ITR은 바이러스 복제 및 패키징에 결정적인 역할을 한다. cap 유전자는 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하고 rep 유전자는 바이러스 복제 및 통합에 관여한다. AAV는 다양한 세포를 감염시킬 수 있다.
재조합 아데노 관련 바이러스 벡터(rAAV)는 비병원성 야생형 아데노 관련 바이러스에서 유래된다. 이의 우수한 안전성, 광범위한 숙주 세포(분열성 및 비분열성 세포), 낮은 면역원성, 생체내 외인성 유전자의 장기 발현 능력 및 기타 특성으로 인해, rAAV는 가장 유망한 유전자 전이 벡터 중 하나로 간주되고 전세계적으로 유전자 요법 및 백신 연구에 널리 사용되고 있다. 10년이 넘는 연구 후, 재조합 아데노 관련 바이러스의 생물학적 특성은 깊이 이해되었으며, 특히 다양한 세포, 조직 및 생체내 실험에서 그의 적용 효과면에서 많은 데이터가 축적되었다. 의학 연구에서 rAAV는 다양한 질병에 대한 유전자 요법의 연구(생체내 및 시험관내 실험 포함)에 사용되고 있다. 동시에, 특징적인 유전자 전이 벡터로서, 유전자 기능 연구, 질병 모델 제작, 및 유전자 녹아웃 마우스의 제조 및 기타 양상에서도 널리 사용된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 벡터는 재조합 AAV 벡터이다. AAV는 이에 의해 감염된 세포의 게놈 내에 안정적이고 부위 특이적 방식으로 통합될 수 있는 비교적 작은 DNA 바이러스이다. 이 바이러스는 세포의 성장, 형태 또는 분화에 어떠한 영향도 주지 않고 광범위한 세포를 감염시킬 수 있으며 인간 병리에 관여하지 않는 것으로 보인다. AAV의 게놈은 클로닝, 서열분석 및 특성화되었다. AAV는 약 4,700개의 염기 및 각 말단에 약 145개의 염기의 역위 말단 반복체(ITR) 영역을 함유하며, 이 영역은 바이러스의 복제 기점 역할을 한다. 나머지 게놈은 캡슐화 기능을 가진 두 개의 중요한 영역으로 나뉜다: 바이러스 복제 및 바이러스 유전자 발현에 관여하는 rep 유전자를 함유하는 게놈의 왼쪽 부분; 및 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 캡 유전자를 함유하는 게놈의 오른쪽 부분.
AAV 벡터는 본 기술분야의 표준 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 임의의 혈청형의 아데노 관련 바이러스가 적합하다. 벡터를 정제하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제6,566,118호, 제6,989,264호 및 제6,995,006호에서 찾아볼 수 있으며, 그 개시내용은 전체가 본 명세서에 참조에 의해 편입된다. 혼성 벡터의 제조는, 예를 들어, PCT 출원 번호 PCT/US2005/027091에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 전체가 본 명세서에 참조에 의해 편입된다. 시험관내 및 생체내에서 유전자를 전이시키기 위한 AAV-유래 벡터의 용도는 기술되어 있다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO91/18088 및 WO93/09239; 미국 특허 제4,797,368호, 제6,596,535호 및 제5,139,941호, 및 유럽 특허 제0,488,528호 참조, 이들 모두는 전체가 본 명세서에 참조에 의해 편입됨). 이 특허 공보들은 rep 및/또는 cap 유전자가 결실되고 관심 유전자로 대체된 다양한 AAV-유래 작제물, 및 관심 유전자를 시험관내(배양 세포로 진입) 또는 생체내(유기체로 직접 진입)에서 수송하는데 사용되는 상기 작제물의 용도를 기술하였다. 복제-결핍성 재조합 AAV는 인간 헬퍼 바이러스(예컨대, 아데노바이러스)에 의해 감염된 세포주에 하기 플라스미드를 공동형질감염시켜 제조할 수 있다: AAV 역위 말단 반복체(ITR)의 두 영역이 측면에 있는 관심 핵산 서열을 함유하는 플라스미드, 및 AAV 캡슐화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라스미드. 생성된 AAV 재조합체는 그 다음 표준 기술에 의해 정제된다.
일부 실시형태에서, 재조합 벡터는 바이러스 입자(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16) 내로 캡시드화된다. 따라서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 벡터를 함유하는 재조합 바이러스 입자(재조합 폴리뉴클레오타이드를 함유하기 때문에 재조합체라고 불림)를 포함한다. 이러한 입자를 생산하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있으며 미국 특허 6,596,535에 기술되어 있다.
핵산 암호 서열
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 문제는 종래 기술에서의 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 낮은 발현량 및 빈약한 치료 효과의 기술적 결함을 극복하는 것이다. 본 발명의 목적은 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 최적화된 유전자 서열을 제공하는 것이다. 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 유전자는 서열번호 1에 나타낸 최적화된 CDS 뉴클레오타이드 서열 및 2,775bp의 크기를 가지며, 코돈 ATG로 시작하고 924 개의 아미노산을 암호화하며, 여기서 1 내지 288bp는 GTP 단백질이 미토콘드리아로 들어가 생리적 기능을 발휘하도록 안내하는 역할을 하는 96개 아미노산의 펩타이드 사슬을 암호화하는 OPA1-MIS의 암호 서열이고; 289 내지 2,772bp는 GTP 기능성 단백질로 작용하는 828개 아미노산의 펩타이드 사슬을 암호하고; 마지막 3bp는 정지 코돈이다. 연구에 따르면, 본 발명의 최적화된 OPA1 유전자 서열(서열번호 1)은 OPA1 단백질의 발현 효율을 높이고 환자의 시신경절 세포에 생리적 역할을 하는 더 많은 OPA1 단백질이 있음을 발견하였다.
본 발명의 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 암호화하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 제시되어 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 95% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상 동일하다. 본 발명에서, 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 암호화하는 핵산은 또한 OPA1-최적화된 유전자 또는 OPA1-최적화된 핵산으로도 불린다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA의 형태일 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오타이드는 DNA이다. DNA의 형태에는 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA가 포함된다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 암호 가닥 또는 비암호 가닥일 수 있다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 암호화한다. OPA1-MIS 신호 펩타이드는 단백질이 미토콘드리아로 들어가도록 유도하고, 프로테아제에 의해 가수분해된 후 성숙한 OPA1 동형 2 단백질은 미토콘드리아로 들어가서 역할을 한다.
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핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA 또는 PNA일 수 있다. 핵산 서열은 게놈, 재조합체 또는 합성일 수 있다. 핵산 서열은 단리되거나 정제될 수 있다. 핵산 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 바람직하게는, 핵산 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같은 감광성 단백질을 암호화할 것이다. 핵산 서열은 클로닝, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재된 바와 같은, 제한 분해, 결찰, 및 겔 전기영동을 포함하는 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 유도될 수 있다. 핵산 서열은 단리, 예를 들어 PCR 기술을 사용하여 단리될 수 있다. 단리(isolation)는 그의 근원에서 핵산 서열과 결합하고 있는 것으로 당연히 발견되는 임의의 불순물 및 기타 핵산 서열 및/또는 단백질로부터 핵산 서열의 분리를 의미한다. 바람직하게는, 정제/생산 공정으로부터의 세포 물질, 배양 배지 또는 기타 화학물질도 없는 것일 것이다. 핵산 서열은, 예를 들어, 직접 화학적 합성에 의해 생성된, 합성일 수 있다. 핵산 서열은 네이키드(naked) 핵산으로 제공될 수 있거나, 단백질 또는 지질과 복합체로 제공될 수 있다.
본 발명의 전체 길이의 뉴클레오타이드 서열 또는 그 단편은 보통 PCR 증폭 방법, 재조합 방법 또는 인공 합성 방법에 의해 수득할 수 있다. PCR 증폭 방법의 경우, 공개된 관련 뉴클레오타이드 서열, 특히 오픈 리딩 프레임 서열에 따라 프라이머가 설계될 수 있으며, 시판되는 cDNA 라이브러리 또는 본 기술분야의 기술자에게 알려진 통상적인 방법에 의해 제조된 cDNA 라이브러리는 주형으로서 사용될 수 있고; 관련 서열은 증폭에 의해 수득된다. 서열이 비교적 긴 경우에는, 종종 2개 이상의 PCR 증폭을 수행한 다음, 개별 증폭된 단편을 정확한 순서로 함께 접합(splice)시킬 필요가 있다. 현재, 본 발명의 폴리펩타이드(또는 이의 단편 또는 유도체)를 암호화하는 DNA 서열은 화학적 합성을 통해 완전하게 수득될 수 있다. 그 후 DNA 서열은 본 기술분야에 공지된 다양한 기존 DNA 분자(또는 예컨대 벡터) 및 세포 내로 도입될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터, 및 본 발명의 벡터 또는 폴리펩타이드 암호 서열을 사용하여 유전자 조작에 의해 생산된 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 언급된 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 숙주 세포는 단리될 수 있다.
본 명세서에서 "단리된"은 물질을 원래 환경에서 분리하는 것을 지칭한다(천연물인 경우, 원래 환경은 자연 환경을 지칭함). 예를 들어, 살아있는 세포에서 자연 상태에 있는 폴리뉴클레오타이드와 폴리펩타이드는 분리 및 정제된 것이 아니고, 자연 상태에 공존하는 다른 물질로부터 분리된 경우, 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 분리 및 정제된 것이다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 제시된다.
일단 관련 서열이 수득되면, 재조합 방법은 관련 서열을 대규모로 수득하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 일반적으로 관련 서열을 벡터에 클로닝한 다음, 세포로 전이시키고, 그 다음 증식된 숙주 세포로부터 관련 서열을 통상적인 방법에 의해 단리하여 수행한다.
또한, 관련 서열은 특히 단편 길이가 짧은 경우에는, 인공 합성 방법을 사용하여 합성할 수도 있다. 보통, 매우 긴 서열을 갖는 단편은 먼저 복수의 작은 단편을 합성한 다음, 이들을 결찰시켜 수득할 수 있다.
PCR 기술을 이용한 DNA/RNA 증폭 방법은 본 발명의 유전자를 수득하는데 바람직하게 사용된다. PCR에 사용되는 프라이머는 본 명세서에 개시된 본 발명의 서열 정보에 따라 적절하게 선택될 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 합성될 수 있다. 증폭된 DNA/RNA 단편은 겔 전기영동과 같은 통상적인 방법에 의해 분리 및 정제될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터, 본 발명의 벡터 또는 단백질 암호 서열을 이용하여 유전자 조작에 의해 생산된 숙주 세포, 및 재조합 기술을 통해 숙주 세포를 이용하여 OPA1 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 OPA1 단백질을 발현하는 숙주 세포(예컨대, 포유류 세포)는 통상적인 재조합 DNA 기술을 통해 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용하여 수득할 수 있다. 일반적으로, 하기 단계가 포함된다: 본 발명의 제1 양상에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 제3 양상에 기재된 벡터를 숙주 세포로 형질도입시키는 단계.
본 기술분야의 기술자에게 잘 알려진 방법은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열 및 적절한 전사/해독 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 작제하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법에는 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체내 재조합 기술이 포함된다. DNA 서열은 mRNA 합성을 유도하도록 발현 벡터에서 적절한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 발현 벡터는 또한 해독 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사 종결인자를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바람직하게는 형질전환된 숙주 세포를 선택하기 위한 표현형적 특색을 제공하는 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자, 예컨대 진핵 세포 배양물을 위한 다이하이드로폴레이트 환원효소, 네오마이신 내성 및 녹색 형광 단백질(GFP), 또는 이.콜라이(E.coli)를 위한 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성을 함유한다.
상기 기재된 적절한 DNA 서열 및 적절한 프로모터 또는 제어 서열을 함유하는 벡터는 폴리펩타이드를 발현할 수 있도록 적절한 숙주 세포를 형질전환하는데 사용될 수 있다.
숙주 세포는 원핵 세포, 하등 진핵 세포 또는 고등 진핵 세포, 예컨대 포유류 세포(인간 및 비인간 포유류 포함)일 수 있다. 대표적인 예는 CHO, NSO, COS7 또는 293 세포와 같은 동물 세포이다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 293T 세포, 광수용체 세포(원추 세포 및/또는 간상 세포 포함), 다른 시각 세포(예컨대, 양극성 세포) 및 신경 세포가 숙주 세포로서 선택된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 숙주 세포는 간상 세포, 원추 세포, 온-양극성 세포, 오프-양극성 세포, 수평 세포, 신경절 세포, 무축삭 세포 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
재조합 DNA를 이용한 숙주 세포의 형질전환은 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려진 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 숙주가 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 원핵생물인 경우, DNA를 흡수할 수 있는 컴피턴트 세포는 지수 성장기 후에 수확하여 CaCl2 방법에 의해 처리될 수 있으며, 사용된 관련 단계는 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 다른 방법은 MgCl2를 사용하는 것이다. 필요한 경우, 전기천공법에 의해 형질전환을 수행할 수도 있다. 숙주가 진핵생물인 경우에는, 다음과 같은 DNA 형질감염 방법이 선택될 수 있다: 인산 칼슘 공동침전법, 및 미세주입, 전기천공, 리포좀 패키징 등과 같은 통상적인 기계적 방법.
수득된 형질전환체는 본 발명의 유전자에 의해 암호화된 단백질을 발현하기 위해 통상적인 방법에 의해 배양될 수 있다. 사용된 숙주 세포에 따라 배양에 사용된 배지는 다양한 통상적인 배양 배지로부터 선택될 수 있다. 배양은 숙주 세포의 성장에 적합한 조건에서 수행된다. 숙주 세포가 적절한 세포 밀도로 성장하면, 적절한 방법(예컨대, 온도 전환 또는 화학적 유도)을 사용하여 선택된 프로모터를 유도하고, 세포를 일정 기간 동안 추가로 배양한다.
상기 방법에서, 폴리펩타이드는 세포 내에서 또는 세포막 상에서 발현되거나 세포로부터 분비될 수 있다. 필요한 경우, 단백질은 이의 물리적, 화학적 특성 및 기타 특성을 사용하여 다양한 분리 방법을 통해 분리 및 정제할 수 있다. 이러한 방법은 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법의 예는 다음을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: 통상적인 재생(renaturation) 처리, 단백질 침전제 처리(염석 방법), 원심분리, 삼투압을 통한 세포 파괴, 초처리(ultra-treatment), 초원심분리, 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 기타 다양한 액체 크로마토그래피 기술 및 이들 방법의 조합.
서열 최적화
본 발명에서, 포유류 세포에서의 발현에 특히 적합한 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 최적화된 암호 서열이 제공되고, 암호 서열은 서열번호 1에 제시된다.
본 명세서에 사용된, "최적화된 OPA1 암호 서열" 및 "최적화된 OPA1 암호 유전자"는 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 암호화하기 위한 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 암호화한다.
본 발명에서, 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 야생 DNA 암호 서열(최적화되지 않은 DNA 암호 서열)은 서열번호 2에 제시된다. 최적화되지 않은 야생 DNA 암호 서열의 발현량은 매우 낮다.
야생 호모 사피엔스: OPA1 동형 2 CDS 2775bp
Figure pct00002
본 발명은 유전자 발현 및 단백질 국재화에 영향을 미치는 서열 단편을 최적화하였으며, 이때 이들 서열 단편의 최적화는 코돈 용법 편향; 발현에 도움이 되지 않는 2차 구조(예컨대, 헤어핀 구조)의 제거; 및 GC 함량, CpG 다이뉴클레오타이드의 함량, mRNA의 2차 구조, 잠재성 접합 부위, 초기 폴리아데닐화 부위, 내부 리보솜 진입 및 결합 부위, 음성 CpG 섬, RNA의 불안정한 영역, 반복 서열(직접 반복 서열, 역위 반복 서열 등) 및 클로닝에 영향을 미칠 수 있는 제한 부위의 변경을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 분석 및 실험 선별을 통해 서열번호 1에 제시된 바와 같은 특별히 최적화된 DNA 암호 서열이 최종적으로 수득된다. 이 서열은 특별히 최적화되어, 이의 전사 수준이 약간 증가되고 이의 발현량은 유의적으로 증가된다. 서열번호 1에 제시된 특별히 최적화된 암호 서열과 서열번호 2에 제시된 야생 암호 서열 사이의 유사성은 도 1에 제시된 바와 같이 72.25%(2005/2775)이다.
최적화된 호모 사피엔스: OPA1 동형 2 CDS 2775bp
Figure pct00003
융합 핵산
본 발명은 또한 본 발명의 제1 양상에 기재된 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 융합 핵산을 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "융합 핵산"은 상이한 근원으로부터의 2개 이상의 뉴클레오타이드 서열을 결찰함으로써 형성된 핵산, 또는 동일한 근원으로부터의 2개 이상의 뉴클레오타이드 서열을 결찰함으로써 형성된 핵산을 지칭하지만, 이들의 자연적 위치에서는 서로 결찰되지 않는 것이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 융합 핵산은 UTR 서열, 프로모터 서열 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 추가로 포함한다.
바람직하게는, 융합 핵산은 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 UTR 서열을 갖는다.
다른 바람직한 실시형태에서, UTR 서열은 3'-UTR 및/또는 5'-UTR을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, UTR 서열은 구조를 안정화하기 위한 폴리A 서열을 함유한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 융합 핵산은 5'-말단부터 3'-말단쪽으로 화학식 I의 구조를 갖는다:
Z1-Z2-Z3 (I)
식 중,
각 "-"는 독립적으로 결합 또는 뉴클레오타이드 링커 서열이고;
Z1은 5'-UTR 서열이고;
Z2는 본 발명의 제1 양상에 기재된 뉴클레오타이드 서열이며; 그리고
Z3은 3'-UTR 서열이다.
발현 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 최적화된 OPA1 암호 서열을 함유하는 OPA1 단백질에 대한 발현 벡터를 제공한다.
제공된 서열 정보를 가지고, 본 기술분야의 기술자는 이용가능한 클로닝 기술을 사용하여 세포로의 형질도입에 적합한 핵산 서열 또는 벡터를 생성할 수 있다.
바람직하게는, OPA1 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 벡터, 바람직하게는 발현 벡터로서 제공된다. 바람직하게는, 망막 표적 세포에서의 형질도입 및 발현에 바람직하게 적합한 유전자 요법 벡터로서 제공될 수 있다. 벡터는 바이러스성 또는 비바이러스성(예컨대, 플라스미드)일 수 있다. 바이러스 벡터는 하기 바이러스로부터 유래된 것을 포함한다: 아데노바이러스, 돌연변이 형태를 포함한 아데노 관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스바이러스, 우두 바이러스, MMLV, GaLV, 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), HIV, 폭스바이러스 및 SV40. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 복제 결함성이며, 복제 결핍성일 수 있을 것으로 예상되지만, 복제 또는 조건부 복제할 수 있다. 바이러스 벡터는 보통 표적 망막 세포의 게놈에 통합됨이 없이 염색체외 상태를 유지할 수 있다. OPA1 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 망막 표적 세포로 도입시키기에 바람직한 바이러스 벡터는 자기 상보성 아데노 관련 바이러스(scAAV)와 같은 AAV 벡터이다. 선택적 표적화는 특정 AAV 혈청형(AAV 혈청형 2 내지 AAV 혈청형 12) 또는 이러한 혈청형 중 어느 하나의 변형된 버전(AAV 4YF 및 AAV 7m8 벡터 포함)을 사용하여 달성할 수 있다.
바이러스 벡터는 임의의 불필요한 서열을 결실시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, AAV의 경우, 바이러스는 IX 유전자, E1a 및/또는 E1b 유전자의 전부 또는 일부를 결실시키기 위해 변형될 수 있다. 야생형 AAV의 경우, 아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스가 없다면, 복제 효율이 매우 낮다. 재조합 아데노 관련 바이러스의 경우, 바람직하게는 복제 유전자 및 캡시드 유전자는 트랜스에(pRep/Cap 플라스미드에) 제공되고 AAV 게놈의 2ITR만이 보유되고 비리온에 패키징되는 반면, 필요한 아데노바이러스 유전자는 아데노바이러스 또는 다른 플라스미드에 의해 제공된다. 렌티 바이러스 벡터에도 유사한 변형이 이루어질 수 있다.
바이러스 벡터는 세포에 들어가는 능력이 있다. 그러나, 플라스미드와 같은 비바이러스 벡터는 표적 세포에 의한 바이러스 벡터의 흡수를 용이하게 하는 제제와 복합체화될 수 있다. 이러한 제제에는 다가양이온성 제제가 포함된다. 선택적으로, 리포솜 기반 전달 시스템과 같은 전달 시스템이 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 벡터는 바람직하게는 생체내 또는 시험관내 사용하기에 적합하고, 바람직하게는 인간에 사용하기에 적합하다.
벡터는 바람직하게는 망막 표적 세포에서 핵산 서열의 발현을 유도하는 하나 이상의 조절 서열을 함유할 것이다. 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 전사 종결 신호, 폴리아데닐화 서열, 복제 기점, 핵산 제한 부위 및 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 상동성 재조합 부위를 포함할 수 있다. 벡터는, 또한, 예를 들어, 성장 시스템 (예를 들어, 박테리아 세포) 또는 망막 표적 세포에서 벡터의 발현을 결정하기 위한 선택가능한 마커를 포함할 수 있다.
"작동 가능하게 연결된"은 핵산 서열이 여기에 작동 가능하게 연결된 서열과 기능적으로 관련되어 있어 서로의 발현 또는 기능에 영향을 미치는 방식으로 연결되도록 한 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열은 프로모터에 의해 영향을 받는 발현 패턴을 가질 것이다.
프로모터는 연결된 핵산 서열의 발현을 매개한다. 프로모터는 구성적이거나 유도성일 수 있다. 프로모터는 내부 망막 세포에서 편재적 발현 또는 뉴런 특이적 발현을 유도할 수 있다. 후자의 경우에, 프로모터는 예를 들어 시신경절 세포와 같은 세포 유형 특이적 발현을 유도할 수 있다. 적합한 프로모터는 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 적합한 프로모터는 L7, thy-1, 리커버린(recoverin), 칼빈딘(calbindin), 인간 CMV, GAD-67, 닭 β-액틴, hSyn, Grm6 및 Grm6 인핸서 SV40 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 표적화는 시신경 세포를 선택적 표적으로 삼기 위한 Grm6-SV40과 같은 세포 특이적 프로모터를 사용하여 달성할 수 있다. Grm6 프로모터는 Grm6 유전자의 200개 염기쌍 인핸서 서열과 SV40 진핵 프로모터의 융합체이며, Grm6 유전자는 시신경 세포에 특이적인 대사성 글루타메이트 수용체인 mGluR6을 암호화한다. Grm6 유전자의 바람직한 근원은 마우스 및 인간이다. 편재적 발현은 범-뉴런성 프로모터를 사용하여 달성할 수 있으며, 그 예는 본 기술분야에 공지되어 있고 입수용이하다. 그러한 일례는 CAG이다. CAG 프로모터는 CMV 초기 인핸서와 닭 β-액틴 프로모터의 융합체이다.
적절한 프로모터의 예는 즉시 초기 거대세포바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 프로모터 서열은 이것이 작동 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강한 구성적 프로모터 서열이다. 적절한 프로모터의 다른 예는 연신 성장 인자-1α(elongation growth factor-1α: EF-1α)이다. 그러나, 다른 구성적 프로모터 서열, 예를 들어 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복체(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인 바(Epstein-Barr) 바이러스 즉시 초기 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 프로모터 및 인간 유전자 프로모터, 예를 들어 비제한적으로 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헴 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하는 것도 사용될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명은 구성적 프로모터의 적용에 제한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터도 본 발명의 일부로 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현이 필요한 경우, 그 발현을 켤 수 있고, 또는 그 발현이 필요하지 않은 경우 그 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오네인 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
포유류 세포(바람직하게는 인간 세포, 보다 바람직하게는 인간 시신경 세포 또는 광수용체 세포)에서 OPA1 단백질을 발현시키는 데에는 많은 발현 벡터가 사용될 수 있다. 본 발명에서는 발현 벡터로서 아데노 관련 바이러스가 바람직하게 사용된다.
본 발명은 또한 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase 유전자의 재조합체 적용을 위해 아데노 관련 바이러스 벡터를 작제하는 방법으로서, 패키징되어 복제 결함성 아데노 관련 바이러스 벡터를 수득하는, 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 유전자를 운반하는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터를 빠르고 쉽게 작제할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 OPA1 단백질을 발현하기 위한 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 OPA1 단백질의 발현량을 증가시키는 포유류 세포(바람직하게는 인간 세포, 보다 바람직하게는 인간 시신경 세포 또는 광수용체 세포)이다.
제제 및 조성물
본 발명은 (a) 본 발명의 제3 양상에 따른 벡터, 및 (b) 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 제제 또는 조성물을 제공한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 약제학적 제제는 안질환 치료에 사용된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 약제학적 제제는 유전성 시신경병증, 바람직하게는 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)을 치료하는데 사용된다.
본 발명에 기재된 약제학적 조성물에서 "활성 성분"은 바이러스 벡터(아데노 관련 바이러스 벡터 포함)와 같은 본 발명의 벡터를 지칭한다. 본 발명에 기재된 "활성 성분", 제제 및/또는 조성물은 안질환 치료에 사용될 수 있다. "안전하고 효과적인 양"은 활성 성분의 양이 심각한 부작용을 일으킴이 없이 병원성 상태 또는 증상을 명백하게 개선시킬 수 있음을 의미한다. "약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제"는 인간용으로 적합하고, 또한 충분한 순도와 충분히 낮은 독성을 가져야 하는 하나 이상의 융화성 고체 또는 액체 충전제 또는 겔 물질을 의미한다. 본 명세서에서 "융화성"은 조성물의 개별 성분이 본 발명의 활성 성분과 혼합될 수 있고 활성 성분의 약물 효과를 명백하게 감소시킴이 없이 서로 혼합될 수 있음을 의미한다.
조성물은 액체 또는 고체, 예컨대 분말, 겔 또는 페이스트일 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 액체이고, 바람직하게는 주사용 액체이다. 적합한 부형제는 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있을 것이다.
본 발명에서, 담체는 망막하 투여 또는 유리체내 투여에 의해 눈에 투여될 수 있다. 어느 투여 방식에서든지, 담체는 바람직하게는 주사용 액체로서 제공된다. 바람직하게는, 주사용 액체는 캡슐 또는 주사기로서 제공된다.
약제학적으로 허용 가능한 담체의 예로는 셀룰로스 및 이의 유도체(예컨대, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 소듐 에틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 등), 젤라틴, 활석, 고체 윤활제(예컨대, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트), 황산 칼슘, 식물성 오일(예컨대, 대두유, 참기름, 땅콩유, 올리브유 등), 폴리올(예컨대, 프로필렌 글리콜, 글리세린, 만니톨, 소르비톨 등), 유화제(예컨대, Tween®), 습윤제(예컨대, 소듐 라우릴 설페이트), 착색제, 향미제, 안정제, 산화방지제, 보존제, 발열원이 없는 물 등을 포함한다.
조성물은 생리학적 허용성 멸균 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 및 주사용 멸균 용액 또는 분산액에 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 부형제는 물, 에탄올, 폴리올 및 이들의 적합한 혼합물을 포함한다.
본 발명에 의해 제공된 OPA1을 암호화하는 핵산 또는 융합 핵산은 OPA1 단백질 또는 OPA1 융합 단백질을 시험관내 또는 생체내에서 생산할 수 있고, 융합 단백질 또는 융합 단백질을 함유하는 제제는 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)을 치료하기 위한 약물을 제조하는데 사용될 수 있다.
인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 암호화하는 최적화된 핵산은 더 높은 발현량을 가지고 있어 더 많은 OPA1 단백질을 해독하고, 최적화된 OPA1 단백질의 MIS 서열은 GTP 기능성 단백질이 미토콘드리아로 정확하게 들어가도록 만들 수 있으므로 더 많은 GTPase가 미토콘드리아에 형질감염되어 있다. 본 발명의 핵산을 함유하는 약제는 토끼 눈의 유리체강에 주사되고, 약제는 유리체강에서 활성을 유지하고 핵산은 시신경 세포로 형질감염된다. 종래 기술에 비해, OPA1을 암호화하는 최적화된 핵산은 더 많은 OPA1 단백질을 발현하여 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)을 더 잘 치료할 수 있다.
종래 기술에 비해, 본 발명은 주로 다음과 같은 이점을 갖는다:
1. OPA1에서 MIS 암호 서열 및 GTPase 도메인의 암호 서열의 최적화를 포함하여, 본 발명의 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase(OPA1)의 유전자 암호 서열은 특별히 최적화되었다. OPA1의 최적화되지 않은 DNA 암호 서열에 비해, 발현량이 유의적으로 증가하며 더 많은 OPA1 단백질이 미토콘드리아로 형질감염된다. 최적화된 서열은 OPA1 단백질이 유의적으로 증가된 양으로 발현되고 높은 생물학적 활성을 갖도록 보장한다.
2. 본 발명에서 최적화된 OPA1 암호화 유전자(서열번호 1) 또는 융합 핵산은 우수한 안전성으로 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)을 효과적으로 치료할 수 있다.
3. 본 발명은 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase 유전자의 불활성화를 기반으로 한 ADOA의 비인간 포유류 모델을 제공하며, 이 모델은 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)과 유사한 병리학적 소견, 예컨대, 망막 ATP의 감소된 함량 및 미토콘드리아의 아폽토시스 변화를 나타내고, 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)에 대한 실험 연구, 평가 또는 약물 선별에 사용될 수 있다.
4. 본 발명에서 제공하는 rAAV2-hOPA1 재조합 아데노 관련 바이러스는 ADOA(상염색체 우성 시신경 위축)의 점 돌연변이 모델 마우스의 병리학적 상태에 유의적이고 효율적인 개선 효과를 가지며, 지속적인 개선 효과를 제공할 수 있다; 단일 투여 3 개월 후 모델 마우스에서 질병의 영향을 완전하고 효과적으로 역전시킬 수 있다.
본 발명은 다음과 같은 특정 실시예와 관련하여 추가로 예시된다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 예시하는 것이며 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 이하 실시예에 명시되지 않은 특정 조건을 가진 실험 방법은 일반적으로 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 조건, 또는 제조업체에서 권장하는 조건과 같은 통상적인 조건에 따른다. 모든 백분율 및 부는 달리 표시되지 않는 한 중량을 기준으로 계산된다.
실시예 1 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 유전자를 위한 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터의 작제 및 이의 바이러스 패키징 및 정제 방법
1. 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 유전자를 함유하는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터의 작제
1) 벡터 작제
특별히 최적화된 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 유전자(서열번호 1)에 2개의 제한효소 분해 부위 Kpn I 및 Sal I을 첨가하였다; 대안 적으로, 이 신규 유전자에 따라 프라이머를 설계하여 유전자를 PCR에 의해 증폭시켜 산물을 제공하고, 산물 및 pSNaV 플라스미드 벡터를 각각 Kpn I 및 Sal I로 이중 분해 처리하였고; 분해된 산물을 회수하여 T4 DNA Ligase를 이용하여 밤새 결찰시키고, 결찰 산물을 컴피턴트 세포에 형질전환시켜 재조합 pSNaV/rAAV2/2-hOPA1 동형 2를 수득하였다(도 2).
2) 재조합체 선별 및 식별
37℃에서 배양 후 LB 평판에는 청색 플라크와 흰색 플라크가 나타났고, 백색 플라크는 재조합체 클론이었다. 백색 콜로니를 채취하여 100 ㎎/ℓ의 Amp를 함유하는 LB 액체 배지에 첨가하고 37℃에서 200 rpm 하에 8시간 동안 배양하였다. 플라스미드는 Biomiga의 지침을 지칭하는 플라스미드 추출 단계를 이용하여 배양된 박테리아 현탁액으로부터 추출하였다. 1㎕의 플라스미드를 주형으로 취했고, 특정 프라이머는 다음과 같다:
1F: 5'-ATGTGGCGACTACGTCG-3'(서열번호 4);
1R: 5'-TTATTTCTCCTGATGAAGAG-3'(서열번호 5);
Figure pct00004
PCR 산물은 전기영동으로 검출하였고, 결과는 도 3에 나타내었다. 약 3000bp 크기의 관심 밴드를 수득하였다. 식별 결과는 클론이 관심 유전자를 함유한 것으로 나타났다.
3) 박테리아 현탁액의 보존, PCR 증폭 및 단편 서열분석
식별된 박테리아의 현탁액 1㎖를 피펫팅하고 멸균된 글리세롤과 1:3의 비율로 혼합하고 -80℃에서 보관하였다; 박테리아 현탁액을 서열분석으로 처리하였다; 서열분석을 통해 수득한 서열은 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase의 유전자와 정렬하였고, 정확한 서열을 가진 재조합 아데노 관련 바이러스 플라스미드 pSNaV/rAAV2/2-hOPA1이 성공적으로 수득되었다(도 4).
2. rAAV2/2-hOPA1 동형 2 재조합 아데노 관련 바이러스의 외피화
1) 형질감염 전날에, 293T 세포를 225cm2 세포 배양 플라스크에 3.0×107 세포/㎖의 파종 밀도로 접종하였고, 이때 배지는 DMEM + 10% 소 혈청이었고, 5% CO2가 함유된 항온배양기에서 밤새 37℃에서 배양하였다.
2) 형질감염 당일에, 배지를 교체하였고 10% 소혈청을 함유한 신선한 DMEM 배지로 배양을 계속하였다. 배양 배지는 세포가 80 내지 90%까지 성장하였을 때 버렸고, PlasmidTrans II(VGTC) 형질감염 키트를 이용하여 형질감염을 수행하였다. 구체적인 단계는 하기와 같다:
(a) 플라스미드 pAdHelper, pAAV-r2c5, 및 pSNaV-hOPA1을 각 형질감염 플라스크에서 취하고 시약 A로 번호가 매겨진 1.5㎖ 멸균 Ep 튜브에서 필요한 비율에 따라 DMEM + PlasmidTrans II(VGTC)(형질감염 시약)와 혼합하였고, 그 후 시약 A를 10-15분 동안 실온에서 유지시켰다;
(b) 시약 B로 번호가 매겨진 DMEM + 10% 소 혈청 30㎖와 시약 A를 혼합하였다;
(c) 시약 B를 세포 배양 플라스크에 균일하게 첨가하였고, 37℃에서 5% CO2를 함유하는 항온배양기에서 배양을 계속하였다;
(d) 형질감염 16시간 후 교체하기 위해 완전 배지(DMEM + 10% 소 혈청)를 첨가하였다.
3) 형질감염 48시간 후에 세포를 수집하였다.
4) 수집된 세포를 PBS에 현탁하고 3회 반복적으로 동결 해동하였다.
3. rAAV2/2-hOPA1 동형 2 바이러스의 정제 및 농축
클로로폼 처리-PEG/NaCl 침전-클로로폼 추출의 3단계를 사용하여 rAAV2/2-hOPA1 바이러스를 분리, 농축 및 정제하였다. 총 회수율 = 최종 산물의 바이러스 입자 수/출발 물질의 바이러스 입자 수.
4. 바이러스의 순도 및 역가 확인
SDS-PAGE 분리 겔 및 스태킹 겔을 로딩하였고, 여기서 분리 겔의 농도는 10%이다. 15㎍의 샘플을 각 샘플 웰에 각각 첨가하였다. 전기영동 후, 겔을 Coomassie Brilliant Blue로 염색하고 배경이 낮은 선명한 밴드가 나타날 때까지 상응하는 탈색 용액으로 탈색하였다(도 5).
결과는 도 5에 VP1/VP2/VP3 = 1:1:10으로 나타내었고, 밴드는 선명하였고 비율은 정상이며 불순물 밴드는 없었고 순도는 99% 이상이었다.
rAAV2/2-hOPA1 동형 2의 역가를 결정하기 위해 형광 정량적 PCR 방법을 사용하여 rAAV2/2-hOPA1 동형 2의 물리적 역가를 결정하였다.
실험 재료: SYBRII(takara); 관심 단편용 프라이머(20μM); 바이러스 패키징을 위한 관심 플라스미드(알려진 농도); 결정되어야 하는 바이러스; PCR 8개 스트립 튜브(Bio-red).
실험 방법: 주형 1㎕, SYBRII 7㎕, 프라이머 1 0.25㎕ 및 프라이머 2 0.25㎕를 취하고 뉴클레아제가 없는 물을 14㎕까지 첨가하였다.
PCR 반응 조건: 사전 변성: 95℃ 10분; 사이클: 95℃ 15초, 60℃ 1분.
마지막으로, 게놈 역가는 1×1012 vg/㎖인 것으로 결정되었다.
실시예 2: ADOA(상염색체 우성 시신경 위축)에 대한 rAAV2/2-hOPA1 재조합 아데노 관련 바이러스의 효과 실험
1. 토끼 눈의 유리체강에 주사
24마리의 토끼를 실험군 A, 실험군 B 및 대조군을 포함하여 3군으로 나누었다. 50㎕의 1×1012 vg/㎖ rAAV2/2-최적화된 hOPA1 동형 2, rAAV2/2-원래 hOPA1 동형 2 및 rAAV-ZsGreen을 각각 추출하고, 각막 윤부에서 3㎜ 떨어진 섬모체의 편평부를 천공하여 유리체강에 주사하였다.
2. 세극등, 안압, 안저 촬영 검사
두 그룹의 토끼는 수술 후 1일, 3일, 7일 및 30일에 각각 세극등 및 안압 검사를 받았다. 수술 1개월 후 안저 사진에서 나타나듯이 모든 토끼는 명백한 이상, 결막 울혈 및 분비물, 안구내염, 및 안압 상승이 모두 없었다.
결과는 도 6에 제시된다: 모든 토끼는 망막 혈관과 시신경에 명백한 합병증이나 손상이 없었으며, 이는 유리체강에 정상적인 표준 주사가 명백한 염증 반응이나 기타 합병증을 유발하지 않을 것이라는 것을 시사한다.
3. 망막의 형광 사진
유리체강 주사 30일 후, ZsGreen 군(대조군)의 망막 형광 사진은 GFP가 망막에서 성공적으로 발현되었음을 나타내었고, 이는 rAAV가 GFP를 운반하는 벡터로 사용되어 토끼 눈의 유리체로 형질감염되었음을 시사하는 것으로서, rAAV2/2-hOPA1 동형 2 재조합 유전자가 망막에서 발현될 수 있음을 입증하였다.
4. hOPA1의 면역형광 검출
유리체강 주사 30일 후 실험군 A 및 B 및 대조군의 안구를 벗겨 내어 파라핀 절편으로 만들었다. 파라핀 절편을 65℃ 오븐에 넣어 2시간 동안 오븐 건조하고, 물에 넣을 때까지 탈파라핀화 처리하였고, PBS로 각각 5분 동안 3회 헹구었다. 절편을 EDTA 완충 용액에 넣어 마이크로파 수복을 수행한 다음, 중간 열에서 비등한 후 전원을 끄고, 간격기간으로서 10분 방치한 다음, 절편을 비등 시까지 약한 열에 둔다. 자연 냉각 후, 절편을 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척하였다. 절편을 3% 과산화수소 용액에 넣고 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 절편을 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척하고, 스핀 건조한 후 5% BSA를 이용하여 20분 동안 차단시켰다. BSA 용액을 제거한 다음, 각 절편에 희석된 1차 항체 50㎕를 첨가하여 조직을 덮고 4℃에서 밤새 방치하였다. 그 다음, 절편을 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척하였다. PBS 용액을 제거하고, 상응하는 종의 형광 2차 항체 50㎕ 내지 100㎕를 각 절편에 첨가하였고, 절편을 실온에서 빛이 닿지 않는 곳에서 50분 내지 1시간 동안 항온처리하였다. 절편을 빛이 닿지 않는 곳에서 매회 5분 동안 3회 PBS로 세척하였다. PBS 용액을 제거하였다. 빛이 닿지 않는 곳에서 5분 동안 핵을 염색하기 위해 각 절편에 50 내지 100㎕의 DAPI를 첨가하였다. 절편을 PBS로 3회, 매회 5분 동안 세척하였다. 절편을 약간 건조한 후, 항-형광 소광 탑재 배지를 사용하여 절편을 탑재하고, 촬영 준비를 위해 4℃의 빛이 닿지 않는 곳에 보관하였다.
망막의 항-hOPA1 면역형광 결과는 도 7에 나타내었고, 실험군 A의 형광 강도는 실험군 B의 형광 강도보다 유의적으로 높았고, 유의적인 차이 및 증가는 1배가 넘었다. 실험군 A의 망막에서 hOPA1의 발현량은 대조군 및 실험군 B보다 유의적으로 더 높은 것으로 나타났다.
5. OCT 검출
결과는 실험군 A 및 실험군 B의 망막 신경 섬유층 두께가 각각 67.55㎛ 및 66.00㎛로서, 유의적인 차이가 없음을 보여주었다(P>0.05, 도 8).
6. HE 검출
HE 결과는 실험군 및 대조군의 망막 신경절 세포 수가 실질적으로 동일하였고 구조가 완전하였음을 보여주었고, 이는 rAAV-hOPA1 재조합 유전자가 안전하고 망막 손상을 유발하지 않았음을 시사한다(도 9).
7. hOPA1 발현 검출을 위한 실시간 PCR
먼저, NCBI의 보존된 도메인 분석 소프트웨어를 사용하여 hOPA1의 보존된 구조가 설계된 프라이머에 의해 증폭된 단편이 비-보존 영역에 위치하도록 하는지 분석하였고; 그 다음, Primer premier 5를 사용하여 형광 정량적 PCR의 프라이머 설계 원칙에 따라 프라이머를 설계하였다:
토끼-액틴-F:
Figure pct00005
(서열번호 6)
토끼-액틴-R:
Figure pct00006
(서열번호 7)
원래 hOPA1-F:
Figure pct00007
(서열번호 8)
원래 hOPA1-R:
Figure pct00008
(서열번호 9)
최적화된 hOPA1-F:
Figure pct00009
(서열번호 10)
최적화된 hOPA1-R:
Figure pct00010
(서열번호 11)
1) RNA 추출 및 역전사
상이한 실험군의 토끼 망막으로부터 총 RNA를 추출하기 위하여 TRIZOL 키트를 사용하였고, 역전사를 수행하여 cDNA 주형을 생성하였다.
2) 형광 정량적 PCR 반응 시스템 및 반응 절차
Real-time PCR Detection System에서 형광 정량적 PCR을 수행하였다. 12.5㎕의 SYBR Green mix, 8㎕의 ddH2O, 각 프라이머 쌍 1 ㎕, cDNA 샘플 2.5㎕를 0.2㎖ PCR 반응 튜브에 첨가하였고 총 시스템은 25㎕였다. 각 샘플은 관심 유전자 및 내부 참조 유전자 토끼-액틴의 증폭을 위해 사용하였고, 각 유전자의 증폭은 3 반복으로 수행하였다. 샘플을 실제로 첨가할 때, 오류를 줄이기 위해 각 PCR 반응 튜브에 공통된 시약은 함께 첨가할 수 있고, 그 다음 분취할 수 있다. 시료 첨가를 완료한 후 형광 정량적 PCR을 수행하였다.
증폭은 다음 반응 절차에 따라 수행하였다: 95℃에서 1초 동안 사전 변성, 94℃에서 15초 동안 변성, 55℃에서 15초 동안 어닐링, 72℃에서 45초 동안 연신으로 이루어진 사이클 총 40회, 형광 신호는 각 사이클의 연신 단계 동안 수집하였다. 반응이 완료된 후, 94℃ 내지 55℃에서의 용융 곡선을 분석하였다.
유전자 발현량의 차이를 연구하기 위해 2-ΔΔCT 상대적 정량법(Livak et al., 2001)을 사용하였다. 이 방법은 표준 곡선을 만들 필요가 없었고; 하우스키핑 유전자 토끼-액틴을 내부 참조 유전자로 사용하였고, 기기와 함께 제공되는 분석 소프트웨어는 발현 값을 자동으로 생성할 수 있다.
결과는 도 10에 나타내었으며, 실험군 A 및 실험군 B에서 hOPA1 유전자 mRNA의 상대적 발현량은 대조군에서 hOPA1 유전자의 상대적 발현량보다 모두 높았고, 실험군 A에서 mRNA의 상대적 발현 수준은 실험군 B에서보다 약간 더 높았다.
8. hOPA1 단백질 발현을 검출하기 위한 웨스턴 블롯
상이한 실험군의 토끼의 안구 망막을 벗겨 내고 100㎕/50mg 조직에 따라 해당 부피의 RIPA 용해 용액을 첨가한 후, 균질화기로 균질화하고 원심분리하여 상층액을 수집하였다. BCA 법으로 단백질 농도를 결정한 후, 총 단백질 50㎍에 따라 실험군 및 대조군의 샘플 로딩량을 계산하고, SDS-PAGE 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 항체와 함께 항온처리한 후 ECL 발색을 수행하였다.
결과는 도 11에 나타내었고, 웨스턴 블롯팅에 의한 실험군 A(1.13)의 hOPA1의 상대적 발현 수준은 실험군 B(0.19) 및 대조군(0.05)에서보다 유의적으로 더 높았고, 유의적인 차이는 P>0.05이며, 이는 실험군 A의 망막에서 hOPA1의 발현 수준이 유의적으로 증가하여 실험군 B 및 대조군보다 각각 약 5배 및 22배 더 높았다.
실시예 3: ADOA(상염색체 우성 시신경 위축)에 대한 rAAV2-hOPA1 재조합 아데노 관련 바이러스의 장기간 효과 실험
1. 마우스 눈의 유리체강에 주사
야생형 C57BL/6J 마우스에게 유리체강을 통해 투여하였고, 마우스를 케이지당 2마리씩 무작위로 그룹화하고, rAAV2/2-OPA1을 유리체하 주사를 통해 2E11vg/㎖의 농도 및 1㎕의 부피로 투여하였다. 마우스는 투여 후 7일군, 15일군, 20일군, 30일군, 45일군, 60일군, 및 90일군으로 나누었다. 상이한 군의 마우스를 지정된 날짜에 도달했을 때 희생시키고 안구 샘플을 수득하였고, 관련 검출 및 분석을 수행하였다.
2. hOPA1의 발현을 검출하기 위한 실시간 PCR
실시예 2에 기재된 방법 및 단계로서, 총 RNA 추출, RNA 농도 결정 및 전기영동 식별, 역전사 및 실시간 PCR 식별을 수행하였다.
여기서 사용된 프라이머 서열은 하기와 같다:
프라이머 F:
Figure pct00011
(서열번호 12)
프라이머 R:
Figure pct00012
(서열번호 13)
사용된 반응 조건: 95℃에서 3분 동안 사전 변성, 95℃에서 10초 동안 변성, 60℃에서 15초 동안 어닐링, 및 72℃에서 25초 동안 연신으로 이루어진 사이클 40회의 반응 절차에 따라 증폭을 수행하였고, 형광 신호는 각 사이클의 연신 단계 동안 수집하였다. 반응이 완료된 후 95℃ 내지 60℃에서의 용융 곡선을 분석하였다.
유전자 발현량의 차이를 연구하기 위해 2-ΔΔCT 상대적 정량법(Livak et al., 2001)을 사용하였다. 이 방법은 표준 곡선을 만들 필요가 없었고; 하우스키핑 유전자 액틴을 내부 참조 유전자로서 사용하였고, 기기와 함께 제공되는 분석 소프트웨어는 발현값을 자동으로 생성할 수 있다.
결과는 도 11에 제시된다: rAAV2-OPA1 바이러스를 사용하여 마우스 눈의 유리체강에 주사한 후, RT-PCR에 의해 검출된 7일, 15일, 20일, 30일, 45일, 60일 및 90일에 관심 유전자는 모두 투여 전의 수준보다 높았고, 발현량은 대략 20일부터 30일까지 가장 높았다.
실시예 4: ADOA(상염색체 우성 시신경 위축)의 모델 마우스 제작 및 식별
1. CRISPR/Cas9 기술을 이용하여 마우스 OPA1 Q285Stop 점 돌연변이를 수행하였고, 돌연변이된 엑손은 exon8[고도로 보존된 GTPase 영역(엑손 8-16)]이었다. NGG로 끝나는 표적을 돌연변이 부위에 설계하였고 CRISPR/Cas9의 작용으로 절단하였다. 약 120bp의 공여체를 시험관내에서 작제하고, 외인성 공여체를 상동성 재조합에 의해 절단 부위에 삽입하였다. 가이드RNA의 설계, OPA1 구조 및 설계 전략은 도 12에 나타내었다.
그 중에는 암호 영역(대문자), 비암호 영역(검정색), 및 인트론 영역(소문자)이 있다;
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
OPA1(Q285*)-120bp 올리고:
Figure pct00016
2. ADOA(상염색체 우성 시신경 위축) 모델 마우스 제작
(1) CRISPR-CAS9 기술을 이용하여 OPA1 Q285Stop 점 돌연변이를 갖는 재조합 플라스미드를 작제한 후, 상동성 돌연변이에 대한 선택성 마커를 갖는 DNA 서열로 대체하여 양성 Q285Stop OPA1 점 돌연변이를 갖는 단일클론 배아 줄기 세포를 수득 하였다;
(2) 단계 (1)에서 수득한 OPA1 점 돌연변이를 갖는 마우스 배아 줄기 세포 클론을 사용하여 키메라 마우스를 제조하였다;
(3) 단계 (2)에서 수득한 키메라 마우스를 정상적인 야생형 마우스와 교미시킨 다음, 번식시키고, 자손을 OPA1 점 돌연변이를 갖는 이형접합성 마우스에 대해 선별하였다;
(4) 단계 (3)에서 수득한 이형접합성 마우스의 교배를 통해 OPA1 Q(글루타민) 285Stop 점 돌연변이를 갖는 동형접합성 마우스를 수득하였고, 이에 의해 OPA1 Q(글루타민) 285Stop 점 돌연변이의 마우스 모델을 수득하였다.
3. ADOA(상염색체 우성 시신경 위축)의 점 돌연변이 모델 마우스의 식별
3.1 게놈 DNA 추출
(1) 분해: 생후 1주일 이내의 마우스로부터 0.5cm의 마우스 발가락을 잘라 1.5㎖ EP 튜브에 넣고, 약하게 원심분리한 후, 500㎕의 용해 용액(포뮬레이션: 100mM Tris pH 8.0, 5mM EDTA pH 8.0, 0.5% SDS, NaCl 1.17 g/100㎖), 0.5㎕ 단백질분해효소 K(농도: 20 mg/㎖, 20mM Tris pH 7.4 및 1mM CaCl2에 용해, 50% 글리세롤 완충액, -20℃에 저장), 균일하게 혼합하고 밤새 55℃ 수조에서 분해함;
(2) 이소프로판올 침전을 통한 DNA 추출:
1) 원심분리 튜브를 수조 케틀에서 꺼내어 실온에서 10 내지 15분 동안 방치하여 샘플 온도를 실온으로 낮추고 원심분리 튜브를 뒤집어 균일하게 혼합하였다. 원심분리는 실온에서 13,000 rpm으로 15분 동안 수행하였다.
2) 400㎕의 상청액을 다른 새로운 원심분리 튜브에 피펫팅하였다. 동일한 부피의 이소프로판올을 첨가하고 튜브를 즉시 부드럽게 뒤집어 철저하게 혼합하였고; 백색 응집 침전물이 나타나면 실온에서 12000rpm으로 10분간 원심분리하고 상청액은 버렸다.
3) 700㎕의 빙냉 75% 에탄올을 원심분리 튜브에 첨가하여 산물을 헹구고, 튜브를 부드럽게 뒤집어 균일하게 혼합하였다. 원심분리는 실온에서 12000rpm으로 5분 동안 수행하였고, 모든 상청액은 버렸다.
4) 에탄올을 흡수하도록 흡수지 위에 원심분리기 튜브를 뒤집어 놓았다. 공기 건조 후, DNA를 50㎕의 멸균 ddH2O에 용해하고, 55℃에서 2시간 동안 용해시켰다(즉시 사용하지 않는 경우, -20℃에 보관함).
5) DNA의 농도를 결정하고 100 내지 200ng의 DNA를 취하여 PCR 주형으로서 사용하였다.
3.2 프라이머 및 PCR 반응
프라이머 쌍을 합성하여 PCR 증폭을 통해 Q285 부위를 함유하는 핵산 증폭 산물(길이 530bp)을 수득하였다.
3.3 식별 결과
마우스의 총 DNA를 추출하고 PCR 산물을 서열분석하였다.
결과는 도 13에 나타내었으며, 이는 285번 위치의 염기 C가 T로 돌연변이되었음을 보여주었고, 이는 점 돌연변이 마우스가 성공적으로 제조되었음을 시사한다.
실시예 5: rAAV2-hOPA1 재조합 아데노 관련 바이러스를 이용한 ADOA(상염색체 우성 시신경 위축)의 점 돌연변이 모델 마우스의 개선 실험
1. 방법
OPA1 돌연변이 마우스를 케이지당 2마리씩 취하여 3개의 그룹으로 나누었다. rAAV-OPAl 농도는 2E11 vg/㎖이었고 투여 부피는 1㎕였으며, 마우스에게 유리체하로 주사하였다. 상이한 그룹의 마우스를 1개월 및 3개월 후에 희생시켜 안구 샘플을 수득하였다. OPA 돌연변이 그룹에게 1㎕의 PBS를 유리체하로 주사하였고, 야생형 마우스는 케이지당 2마리씩 취하여 대조군으로서 1㎕의 PBS를 유리체하로 주사하였다. ATP 함량의 변화 및 미토콘드리아 형태 관찰에 대해 검출 및 분석을 수행하였다.
2. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한, 투여 후 마우스 망막 내 ATP 함량의 변화
2.1 투여 후 야생형 마우스 및 OPA1 돌연변이 마우스의 망막을 취하고, 예냉된 PBS로 1회 세척하고 액체 질소에 넣었다.
2.2 ATP 추출
(1) 액체 질소 분쇄
(2) 빙냉된 페놀-TE(DTT 함유) 1㎖, 클로로폼 200㎕ 및 초순도 물 150㎕를 첨가한 후, 4℃에서 20초 동안 균일하게 진탕 혼합하고, 10,000g에서 10분 동안 원심분리를 수행하였다.
(3) 200㎕의 수상을 취하고 0.22㎛ 필터 멤브레인으로 여과하고 HPLC에 의해 ATP를 검출하기 위해 기계 위에 로딩하였다.
(4) 단백질 농도는 BCA 방법을 사용하여 결정하였다.
2.3 크로마토그래피 분석 방법
크로마토그래피 컬럼: Sepax GP-C18, (4.6㎜×250㎜, 5㎛)
이동상 A: 15mM KH2PO4, 15mM KCL, 및 pH를 6.0으로 조정하는데 사용된 0.1M KOH
이동상 B: 15% 아세토나이트릴과 혼합된 85% 이동상 A
로딩 부피: 20㎕
검출 파장: 254㎚
구배 용출 조건:
Figure pct00017
결과는 도 14에 나타내었다. HPLC 검출은 대조군의 OPA1 돌연변이 마우스에서 ATP 함량이 감소한 반면, rAAV2-OPA1 바이러스가 마우스 안구의 유리체강 내로 주사된 실험군에서는 투여 후 함량이 정상 수준으로 증가하였고, 이는 OPA1 투여 후 ATP 함량이 회복될 수 있음을 시사한다.
도 14로부터 투여 1개월 후 및 3개월 후, 마우스 안구의 ATP 함량은 시간이 지남에 따라 증가하였고; 투여 후 3개월까지 OPA1 돌연변이 마우스 안구 내의 ATP 함량은 야생형 마우스의 안구내 ATP 함량과 동등했으며, 이는 rAAV2-OPA1 바이러스의 사용이 질병의 발생을 효과적으로 역전시켰음을 암시한다.
3. 투과 전자 현미경(TEM)에 의한 미토콘드리아의 형태 관찰
마우스 안구를 취한 후, 2.5% 글루타르알데하이드에 각각 담그고 밤새 고정시키고 0.1 ㏖/ℓ 인산염 완충 용액으로 매회 15분간 3회 세척한 후, 오스민산으로 2시간 동안 고정시키고, 0.1 ㏖/ℓ 인산염 완충 용액으로 매회 15분씩 3회 세척하고, 에탄올(50%, 70%, 80%, 90%, 100%)을 이용하여 구배 탈수를 수행한 후, 순수 아세톤을 사용하기 위해 수송하여 순수 아세톤으로 2회 탈수시켰다. 각 단계는 15분 동안 지속하였다. 구배 침투는 812 수지:아세톤을 3:1, 3:2 및 3:3의 비율로 사용하고 각 단계는 40분 동안 지속시켜 수행하였고, 그 다음 순수 매립제를 사용하여 45℃에서 밤새 매립하고, 60℃에서 중합시키고, 절편화하고, 염색하고, 투과 전자 현미경으로 관찰하였다.
결과는 도 15에 나타내었으며, TEM 전자 현미경 검사 결과, OPA1 돌연변이 마우스에서 미토콘드리아 크리스타의 소실이 관찰되었고, 이는 아폽토시스의 발생을 시사하였다. OPA1 돌연변이 마우스에서 미토콘드리아 크리스타의 회복은 투여 1개월 후에 관찰되었고, 3개월 후 유의적인 회복이 관찰되었으며, 이는 rAAV2-OPA1 바이러스의 사용이 질병의 발생을 효과적으로 역전시켰음을 암시한다.
토론
안질환 치료에 유전자 요법의 급속한 발전으로 인해 ADOA의 치유는 어렵지 않을 것이다. 인간의 눈과 토끼 눈은 해부학적 구조 및 용적이 비슷하기 때문에 본 발명에서는 rAAV2/2-hOPA1 동형 2의 유리체강 주사 모델로서 토끼 눈을 사용하였다. 이 실험은 주사 투여량, 안전성 수준 및 수술후 합병증을 연구하고 향후 임상 시험에 대한 중요한 참고자료를 제공하였다. 모든 토끼는 세극등 및 안압 검사를 받았으며 명백한 이상, 결막 울혈 및 분비물, 안구내염, 안압 상승이 모두 없었다. 수술 한 달 뒤 찍은 안저 사진은 모든 토끼가 망막 혈관과 시신경에 명백한 합병증 또는 손상이 없는 것으로 나타났고, 이는 이 실험이 안전하였음을 암시한다.
면역형광, 실시간 정량적 PCR 및 웨스턴 블롯의 결과는 hOPA1이 토끼의 망막에서 안정적으로 발현될 수 있음을 입증할 수 있었다. ADOA 병변은 시신경유두 주변의 망막 신경절 세포의 아폽토시스를 유발할 수 있기 때문에, 시신경유두 주변의 망막에서 안정적인 형광 발현은 rAAV-ZsGreen 군의 망막 절편에서 검출될 수 있다. hOPA1의 형광 염색 결과는 망막 신경절 세포에 도달할 수 있음을 입증할 수 있었으며, 이는 rAAV2/2-hOPA1 동형 2가 환자 눈의 병든 부위에 도달할 수 있음을 시사한다. 안저 사진과 OCT의 결과는 5×1010 vg/㎖ rAAV2/2-hOPA1 동형 2의 단일 유리체강 주사가 안전하고 망막 독성이 없으며, 향후 임상 시험에 사용될 수 있을 것임을 나타내었다.
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<110> Wuhan Neurophth Biological Technology Limited Company <120> Gene sequence of recombinant human type II mitochondrial dynein-like GTPase and uses thereof <130> WO/2020/038473 <140> PCT/CN2019/102352 <141> 2019-08-23 <150> CN2018109681730 <151> 2018-08-23 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2775 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Optimized hOPA1 gene sequence <400> 1 atgtggcgcc tgcgccgcgc cgccgtggcc tgcgaggtgt gccagagcct ggtgaagcac 60 agcagcggca tcaagggcag cctgcccctg cagaagctgc acctggtgag ccgcagcatc 120 taccacagcc accaccccac cctgaagctg cagcgccccc agctgcgcac cagcttccag 180 cagttcagca gcctgaccaa cctgcccctg cgcaagctga agttcagccc catcaagtac 240 ggctaccagc cccgccgcaa cttctggccc gcccgcctgg ccacccgcct gctgaagctg 300 cgctacctga tcctgggcag cgccgtgggc ggcggctaca ccgccaagaa gaccttcgac 360 cagtggaagg acatgatccc cgacctgagc gagtacaagt ggatcgtgcc cgacatcgtg 420 tgggagatcg acgagtacat cgacttcggc agccccgagg agaccgcctt ccgcgccacc 480 gaccgcggca gcgagagcga caagcacttc cgcaaggtga gcgacaagga gaagatcgac 540 cagctgcagg aggagctgct gcacacccag ctgaagtacc agcgcatcct ggagcgcctg 600 gagaaggaga acaaggagct gcgcaagctg gtgctgcaga aggacgacaa gggcatccac 660 caccgcaagc tgaagaagag cctgatcgac atgtacagcg aggtgctgga cgtgctgagc 720 gactacgacg ccagctacaa cacccaggac cacctgcccc gcgtggtggt ggtgggcgac 780 cagagcgccg gcaagaccag cgtgctggag atgatcgccc aggcccgcat cttcccccgc 840 ggcagcggcg agatgatgac ccgcagcccc gtgaaggtga ccctgagcga gggcccccac 900 cacgtggccc tgttcaagga cagcagccgc gagttcgacc tgaccaagga ggaggacctg 960 gccgccctgc gccacgagat cgagctgcgc atgcgcaaga acgtgaagga gggctgcacc 1020 gtgagccccg agaccatcag cctgaacgtg aagggccccg gcctgcagcg catggtgctg 1080 gtggacctgc ccggcgtgat caacaccgtg accagcggca tggcccccga caccaaggag 1140 accatcttca gcatcagcaa ggcctacatg cagaacccca acgccatcat cctgtgcatc 1200 caggacggca gcgtggacgc cgagcgcagc atcgtgaccg acctggtgag ccagatggac 1260 ccccacggcc gccgcaccat cttcgtgctg accaaggtgg acctggccga gaagaacgtg 1320 gccagcccca gccgcatcca gcagatcatc gagggcaagc 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actggaagaa gcgctggctg 2220 tactggaaga accgcaccca ggagcagtgc gtgcacaacg agaccaagaa cgagctggag 2280 aagatgctga agtgcaacga ggagcacccc gcctacctgg ccagcgacga gatcaccacc 2340 gtgcgcaaga acctggagag ccgcggcgtg gaggtggacc ccagcctgat caaggacacc 2400 tggcaccagg tgtaccgccg ccacttcctg aagaccgccc tgaaccactg caacctgtgc 2460 cgccgcggct tctactacta ccagcgccac ttcgtggaca gcgagctgga gtgcaacgac 2520 gtggtgctgt tctggcgcat ccagcgcatg ctggccatca ccgccaacac cctgcgccag 2580 cagctgacca acaccgaggt gcgccgcctg gagaagaacg tgaaggaggt gctggaggac 2640 ttcgccgagg acggcgagaa gaagatcaag ctgctgaccg gcaagcgcgt gcagctggcc 2700 gaggacctga agaaggtgcg cgagatccag gagaagctgg acgccttcat cgaggccctg 2760 caccaggaga agtaa 2775 <210> 2 <211> 2775 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgtggcgac tacgtcgggc cgctgtggcc tgtgaggtct gccagtcttt agtgaaacac 60 agctctggaa taaaaggaag tttaccacta caaaaactac atctggtttc acgaagcatt 120 tatcattcac atcatcctac cttaaagctt caacgacccc aattaaggac atcctttcag 180 cagttctctt ctctgacaaa ccttccttta cgtaaactga 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tgaagctctt 2760 catcaggaga aataa 2775 <210> 3 <211> 924 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Trp Arg Leu Arg Arg Ala Ala Val Ala Cys Glu Val Cys Gln Ser 1 5 10 15 Leu Val Lys His Ser Ser Gly Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Gln Lys 20 25 30 Leu His Leu Val Ser Arg Ser Ile Tyr His Ser His His Pro Thr Leu 35 40 45 Lys Leu Gln Arg Pro Gln Leu Arg Thr Ser Phe Gln Gln Phe Ser Ser 50 55 60 Leu Thr Asn Leu Pro Leu Arg Lys Leu Lys Phe Ser Pro Ile Lys Tyr 65 70 75 80 Gly Tyr Gln Pro Arg Arg Asn Phe Trp Pro Ala Arg Leu Ala Thr Arg 85 90 95 Leu Leu Lys Leu Arg Tyr Leu Ile Leu Gly Ser Ala Val Gly Gly Gly 100 105 110 Tyr Thr Ala Lys Lys Thr Phe Asp Gln Trp Lys Asp Met Ile Pro Asp 115 120 125 Leu Ser Glu Tyr Lys Trp Ile Val Pro Asp Ile Val Trp Glu Ile Asp 130 135 140 Glu Tyr Ile Asp Phe Gly Ser Pro Glu Glu Thr Ala Phe Arg Ala Thr 145 150 155 160 Asp Arg Gly Ser Glu Ser Asp Lys His Phe Arg Lys Val Ser Asp Lys 165 170 175 Glu Lys Ile Asp Gln Leu Gln Glu Glu Leu Leu His Thr Gln Leu Lys 180 185 190 Tyr Gln Arg Ile Leu Glu Arg Leu Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Arg 195 200 205 Lys Leu Val Leu Gln Lys Asp Asp Lys Gly Ile His His Arg Lys Leu 210 215 220 Lys Lys Ser Leu Ile Asp Met Tyr Ser Glu Val Leu Asp Val Leu Ser 225 230 235 240 Asp Tyr Asp Ala Ser Tyr Asn Thr Gln Asp His Leu Pro Arg Val Val 245 250 255 Val Val Gly Asp Gln Ser Ala Gly Lys Thr Ser Val Leu Glu Met Ile 260 265 270 Ala Gln Ala Arg Ile Phe Pro Arg Gly Ser Gly Glu Met Met Thr Arg 275 280 285 Ser Pro Val Lys Val Thr Leu Ser Glu Gly Pro His His Val Ala Leu 290 295 300 Phe Lys Asp Ser Ser Arg Glu Phe Asp Leu Thr Lys Glu Glu Asp Leu 305 310 315 320 Ala Ala Leu Arg His Glu Ile Glu Leu Arg Met Arg Lys Asn Val Lys 325 330 335 Glu Gly Cys Thr Val Ser Pro Glu Thr Ile Ser Leu Asn Val Lys Gly 340 345 350 Pro Gly Leu Gln Arg Met Val Leu Val Asp Leu Pro Gly Val Ile Asn 355 360 365 Thr Val Thr Ser Gly Met Ala Pro Asp Thr Lys Glu Thr Ile Phe Ser 370 375 380 Ile Ser Lys Ala Tyr Met Gln Asn Pro Asn Ala Ile Ile Leu Cys Ile 385 390 395 400 Gln Asp Gly Ser Val Asp Ala Glu Arg Ser Ile Val Thr Asp Leu Val 405 410 415 Ser Gln Met Asp Pro His Gly Arg Arg Thr Ile Phe Val Leu Thr Lys 420 425 430 Val Asp Leu Ala Glu Lys Asn Val Ala Ser Pro Ser Arg Ile Gln Gln 435 440 445 Ile Ile Glu Gly Lys Leu Phe Pro Met Lys Ala Leu Gly Tyr Phe Ala 450 455 460 Val Val Thr Gly Lys Gly Asn Ser Ser Glu Ser Ile Glu Ala Ile Arg 465 470 475 480 Glu Tyr Glu Glu Glu Phe Phe Gln Asn Ser Lys Leu Leu Lys Thr Ser 485 490 495 Met Leu Lys Ala His Gln Val Thr Thr Arg Asn Leu Ser Leu Ala Val 500 505 510 Ser Asp Cys Phe Trp Lys Met Val Arg Glu Ser Val Glu Gln Gln Ala 515 520 525 Asp Ser Phe Lys Ala Thr Arg Phe Asn Leu Glu Thr Glu Trp Lys Asn 530 535 540 Asn Tyr Pro Arg Leu Arg Glu Leu Asp Arg Asn Glu Leu Phe Glu Lys 545 550 555 560 Ala Lys Asn Glu Ile Leu Asp Glu Val Ile Ser Leu Ser Gln Val Thr 565 570 575 Pro Lys His Trp Glu Glu Ile Leu Gln Gln Ser Leu Trp Glu Arg Val 580 585 590 Ser Thr His Val Ile Glu Asn Ile Tyr Leu Pro Ala Ala Gln Thr Met 595 600 605 Asn Ser Gly Thr Phe Asn Thr Thr Val Asp Ile Lys Leu Lys Gln Trp 610 615 620 Thr Asp Lys Gln Leu Pro Asn Lys Ala Val Glu Val Ala Trp Glu Thr 625 630 635 640 Leu Gln Glu Glu Phe Ser Arg Phe Met Thr Glu Pro Lys Gly Lys Glu 645 650 655 His Asp Asp Ile Phe Asp Lys Leu Lys Glu Ala Val Lys Glu Glu Ser 660 665 670 Ile Lys Arg His Lys Trp Asn Asp Phe Ala Glu Asp Ser Leu Arg Val 675 680 685 Ile Gln His Asn Ala Leu Glu Asp Arg Ser Ile Ser Asp Lys Gln Gln 690 695 700 Trp Asp Ala Ala Ile Tyr Phe Met Glu Glu Ala Leu Gln Ala Arg Leu 705 710 715 720 Lys Asp Thr Glu Asn Ala Ile Glu Asn Met Val Gly Pro Asp Trp Lys 725 730 735 Lys Arg Trp Leu Tyr Trp Lys Asn Arg Thr Gln Glu Gln Cys Val His 740 745 750 Asn Glu Thr Lys Asn Glu Leu Glu Lys Met Leu Lys Cys Asn Glu Glu 755 760 765 His Pro Ala Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ile Thr Thr Val Arg Lys Asn 770 775 780 Leu Glu Ser Arg Gly Val Glu Val Asp Pro Ser Leu Ile Lys Asp Thr 785 790 795 800 Trp His Gln Val Tyr Arg Arg His Phe Leu Lys Thr Ala Leu Asn His 805 810 815 Cys Asn Leu Cys Arg Arg Gly Phe Tyr Tyr Tyr Gln Arg His Phe Val 820 825 830 Asp Ser Glu Leu Glu Cys Asn Asp Val Val Leu Phe Trp Arg Ile Gln 835 840 845 Arg Met Leu Ala Ile Thr Ala Asn Thr Leu Arg Gln Gln Leu Thr Asn 850 855 860 Thr Glu Val Arg Arg Leu Glu Lys Asn Val Lys Glu Val Leu Glu Asp 865 870 875 880 Phe Ala Glu Asp Gly Glu Lys Lys Ile Lys Leu Leu Thr Gly Lys Arg 885 890 895 Val Gln Leu Ala Glu Asp Leu Lys Lys Val Arg Glu Ile Gln Glu Lys 900 905 910 Leu Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu His Gln Glu Lys 915 920 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 4 atgtggcgac tacgtcg 17 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 5 ttatttctcc tgatgaagag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 6 ccttctacaa cgagctgcgc 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 7 tacagggaca gcacggcc 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ttaggttatt ttgctgttgt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ttgtagtcac ttggtgtgcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 10 ctgggctact tcgccgtggt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 11 gggtggtcac ctggtgggcc 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 12 ctttaggtta ttttgctgtt gt 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 13 ttgtagtcac ttggtgtgcc 20 <210> 14 <211> 1150 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 ttgcactgca gccttcccag ttcttaggct gcgtaagctc tcttgcttga acactgaccc 60 tgaccacttc tctactctgt tccaggctct cacacgcccg tgctcccagc ctgctcttac 120 acgcatgcgc tccctgccta atactccttc cccttcttct ctgttctcac agagcctagt 180 cttggcagag tgtgatttct ctgttagttg gtcacctgac agtgtatttg actcttatgg 240 tgttaatggt taactcatta atgttaatag gctttctctt ttactgtcta actagattat 300 gaaatcctaa attaataaat aaactgaaga agtagcatta attcttatac tagttttact 360 atgaaaacat atagtaagaa aaaaacaatg caaatttgaa tgtatctaca ttttctcttc 420 atgtatctgt ggtctttgtt ttattttcac tgacttttgc taattttaat ttttttgcag 480 aaatctttga ttgatatgta ttctgaagtt cttgatgttc tttctgatta tgatgccagt 540 tacaatacac aagatcacct accacgggta aggggaaaat agaccaggac ctgctgtcag 600 caggaaagtt ctttccttgt gtcatagtaa tttctgtatt tcccatgata cctcagatac 660 aaagcattgc ttcgttcctt attttggaga ccataaaagc aaatatatat gttttggaag 720 aaaaatgtca gatatttgcc attatacatt cattatagtg ttaaaatacc taggcaaaaa 780 ctgtaaacgt ttggatgaaa tttagtctaa cagaatccaa aagtatgttt gtaaaatgta 840 aactggttat ggaaaatatt tgtggaaagt taatgatctg gttttagaaa taactttcaa 900 ttggcatagt tttcaaaaca aaaatttgaa tgtaaatagt ggagccaatt aattcttttg 960 ctatatgtat ctccagagta cctacatgca tcaaacttca ttctttcaaa aaaaaaagaa 1020 aacaaacaaa caaacacttt ttttggctct aaatatctta aaatatgttt taaatgataa 1080 cattcaaacc ctacatacat ttaatttggt atcagaagag aactaatgta tgctccttgt 1140 cttgtgatag 1150 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA sequence corresponding to sgRNA1 <400> 15 atacacaaga tcacctacca cgg 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA sequence corresponding to sgRNA2 <400> 16 ccagttacaa tacacaagat cac 23 <210> 17 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Homologous fragment for introducing point mutation <400> 17 ttgatatgta ttctgaagtt cttgatgttc tttctgatta tgatgccagt tacaatacat 60 aagatcacct accacgggta aggggaaaat agaccaggac ctgctgtcag caggaaagtt 120

Claims (20)

  1. 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사(human type II mitochondrial dynein-like) GTPase를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로서,
    (a) 서열번호 1에 제시된 뉴크레오타이드 서열;
    (b) 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 95% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열;
    (c) 서열번호 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열; 및
    (d) 서열번호 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 95% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 뉴클레오타이드 서열.
  2. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 제시된, 뉴클레오타이드 서열.
  3. 제1항의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 융합 핵산.
  4. 제3항에 있어서, 상기 융합 핵산은 5'-말단부터 3'-말단쪽으로 하기 화학식 I의 구조를 갖는, 융합 핵산:
    Z1-Z2-Z3 (I)
    식 중,
    각 "-"는 독립적으로 결합 또는 뉴클레오타이드 링커 서열이고;
    Z1은 없거나 또는 5'-UTR 서열이며;
    Z2는 제1항의 뉴클레오타이드 서열이고; 그리고
    Z3은 3'-UTR 서열이다.
  5. 제1항의 뉴클레오타이드 서열 또는 제3항의 융합 핵산을 포함하는, 벡터.
  6. 제4항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터로부터 선택되고, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 벡터는 AAV 벡터이고, 혈청형은 AAV2, AAV5, AAV7, AAV8 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 벡터는 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 융합 핵산이 삽입된 AAV 벡터인, 벡터.
  9. 제5항에 있어서, 상기 벡터는 DNA 바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택되는, 벡터.
  10. 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 제5항의 벡터를 포함하거나, 또는 제1항의 외인성 뉴클레오타이드 서열 또는 제3항의 융합 핵산이 상기 숙주 세포의 염색체에 통합된, 숙주 세포.
  11. 제10항에 있어서, 상기 숙주 세포는 293T 세포, 광수용체 세포(원추 세포 및/또는 간상 세포 포함), 다른 시각 세포(예컨대, 양극성 세포), (시)신경 세포 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 숙주 세포.
  12. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터의 용도로서, 상기 벡터는 대상체의 시력 회복 및/또는 안질환 치료를 위한 제제 또는 조성물을 제조하는데 사용되는, 용도.
  13. 약제학적 제제로서, (a) 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터, 및 (b) 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 제제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 약제학적 제제의 투여 형태는 동결건조 제제, 액체 제제 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 제제.
  15. 제13항에 있어서, 상기 약제학적 제제 중 상기 (a) 벡터의 함량이 1×109 내지 1×1016 바이러스/㎖, 바람직하게는 1×1011 내지 1×1013 바이러스/㎖, 보다 바람직하게는 2×1011 내지 1×1012 바이러스/㎖인, 약제학적 제제.
  16. 제13항의 약제학적 제제의 용도로서, 상기 약제학적 제제는 안질환 치료, 바람직하게는 망막 신경절 세포 아폽토시스 치료에 사용되는, 용도.
  17. 제13항의 약제학적 제제의 용도로서, 상기 약제학적 제제는 유전성 시신경병증, 바람직하게는 상염색체 우성 시신경 위축(ADOA)의 치료에 사용되는, 용도.
  18. 미토콘드리아 다이네인-유사(dynein-like) GTPase의 발현 및/또는 활성을 장기간 동안 증가시키는 방법으로서, 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터를 도입시키는 단계 및/또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 약제학적 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 치료 방법으로서, 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터를 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  20. 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 제조하는 방법으로서, 제10항의 숙주 세포를 배양함으로써, 재조합 인간 II형 미토콘드리아 다이네인-유사 GTPase를 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
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