JP2024015194A - アデノ随伴ウイルス変異キャプシドおよび血管新生の阻害のための使用 - Google Patents

アデノ随伴ウイルス変異キャプシドおよび血管新生の阻害のための使用 Download PDF

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Abstract

【課題】アデノ随伴ウイルス変異キャプシドおよび血管新生の阻害のための使用の提供。【解決手段】本明細書では、ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、修飾されていない親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、１つ以上の型の網膜細胞の増加した感染性を付与する、親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してアミノ酸配列に１つ以上の修飾を有する、変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質が提供される。また、本明細書に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンおよびその薬学的組成物、これらのｒＡＡＶキャプシドタンパク質およびビリオンを作製する方法、ならびにこれらのｒＡＡＶキャプシドタンパク質およびビリオンを、研究および臨床診療、例えば、例えば、網膜障害および疾患の治療のために網膜の１つ以上の細胞に核酸配列を送達することにおいて使用するための方法が提供される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１１月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／５９０，９７６号および２０１８年４月３０日に出願された同第６２／６６４，７２６号の利益を主張し、その各々の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
配列表は、２０１８年１１月２６日に作製された、サイズが２３８ＫＢのテキストファイル「０９０４００－５０１０－ＷＯ－ｓｅｑ－ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」として本明細書とともに提供される。テキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示される発明は一般に、変異キャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオン、および定向進化技術を使用したそのような変異キャプシドの生成の分野に関する。
遺伝性網膜疾患は、およそ３０００人に１人（世界中で２００万人を超える人々）に影響を及ぼし、重度の視力喪失または失明の主要な原因である異種遺伝性疾患の大きな群を包含する。滲出性加齢黄斑変性（ｗＡＭＤ）および糖尿病性網膜症（ＤＲ）などの複雑な多因子性網膜疾患はさらに多くの個人に影響を与えており、現在１７０万人の米国人がｗＡＭＤに関連する重度の中心視力喪失を抱え、糖尿病を患っている４０歳超の成人のほぼ３分の１が視覚障害を起こしている。これらの疾患は、典型的には、網膜細胞の１つ以上の型の細胞の機能障害または死に関連し、いくつかの事例では、重要なタンパク質、例えば、ＬＣＡ２におけるＲＰＥ６５の発現または機能の欠如に起因し、他の事例では、毒性遺伝子産物を創出する遺伝子突然変異、例えば、ロドプシンタンパク質の折畳みに影響を及ぼす優性突然変異に起因し、あるいはさらに他の事例では、タンパク質の異所性発現、例えば、ｗＡＭＤにおけるＶＥＧＦによって誘導される網膜生理学の変化に起因する。
この大きな満たされていない医学的必要性に対処するための１つのアプローチは、例えば、欠損遺伝子の代置、優性欠損遺伝子の矯正、または連続タンパク質療法のための鋳型の提供のために、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を使用して網膜細胞の１つ以上の型に遺伝子を送達する、遺伝子ベースのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を媒介した療法である。ＡＡＶベースの臨床遺伝子療法は、ますます成功を収めているが、例えば、高い効率で所望の網膜細胞を標的化することを含む、ウイルスベクター特性に関する欠点を依然として伴う。例えば、複数の同種霊長類ＡＡＶ血清型および多数の非ヒト霊長類血清型が同定され、特性評価されており、ＡＡＶ２は、ＡＡＶ血清型の中で最もよく特性評価され、眼内の遺伝子送達ビヒクルとして採用される最初のものである。しかしながら、これらのＡＡＶ（ＡＡＶ２を含む）は、硝子体内投与によって送達される場合、より深い網膜細胞型を形質導入するのに有効であるとは報告されていない。したがって、眼疾患の治療のために網膜細胞へのより効果的な遺伝子ベースの送達を提供する、優れた形質導入能力を有する新たなＡＡＶ変異体の必要性が当該技術分野に存在する。当該技術分野で既知である野生型ＡＡＶおよびＡＡＶ変異体と比較して、いくつかの事例では、広範な、他の事例では、ある特定の細胞型に優先的な、強化された網膜形質導入プロファイルを示すＡＡＶ変異体の必要性が当該技術分野に存在する。
天然に存在するＡＡＶは、３つの翻訳領域であるｒｅｐ、ｃａｐ、およびａａｐを含む、一本鎖ＤＮＡウイルスである。第１の遺伝子ｒｅｐは、ゲノム複製に必要な４つのタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）をコードし、第２のｃａｐは、ウイルスキャプシドを形成するように組み立てられる３つの構造タンパク質（ＶＰ１～３）を発現し、第３のものは、キャプシドの組み立てに不可欠な組み立て活性化タンパク質（ＡＡＰ）を発現する。ＡＡＶは、能動的複製のために、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在に依存する。ヘルパーウイルスが存在しない場合、ＡＡＶは、そのゲノムがエピソームに維持されるか、またはＡＡＶＳ１座の宿主染色体に組み込まれる、潜伏状態を確立する。
現在のＡＡＶベースの遺伝子送達ベクターと比べて改善をもたらすＡＡＶ変異体を選択するために、インビトロおよびインビボ定向進化技術を使用してもよい。そのような定向進化技術は、当該技術分野で既知であり、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１９４１３２号およびＫｏｔｔｅｒｍａｎ＆Ｓｃｈａｆｆｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＡＯＰ，２０１４年５月２０日にオンライン公開；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｇ３７４２）で説明されている。定向進化は、遺伝的多様化および選択プロセスの反復ラウンドを通して自然進化を模倣し、それによってＡＡＶベースのビリオンなどの生体分子の機能を漸進的に改善する有益な突然変異の蓄積を可能にする、キャプシド操作アプローチである。このアプローチでは、野生型ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を多様化して、ウイルス粒子のライブラリを生成するようにパッケージングされている大きな遺伝子ライブラリを創出し、選択圧を適用して、遺伝子送達障壁を克服することができる優れた表現型を有する固有の変異体を単離する。
ＡＡＶ変異体は、例えば、米国特許第９，１９３，９５６号、同第９；１８６；４１９号、同第８，６３２，７６４号、同第８，６６３，６２４号、同第８，９２７，５１４号、同第８，６２８，９６６号、同第８，２６３，３９６号、同第８，７３４，８０９号、同第８，８８９，６４１号、同第８，６３２，７６４号、同第８，６９１，９４８号、同第８，２９９，２９５号、同第８，８０２，４４０号、同第８，４４５，２６７号、同第８，９０６，３０７号、同第８，５７４，５８３号、同第８，０６７，０１５号、同第７，５８８，７７２号、同第７，８６７，４８４号、同第８，１６３，５４３号、同第８，２８３，１５１号、同第８，９９９，６７８号、同第７，８９２，８０９号、同第７，９０６，１１１号、同第７，２５９，１５１号、同第７，６２９，３２２号、同第７，２２０，５７７号、同第８，８０２，０８０号、同第７，１９８，９５１号、同第８，３１８，４８０号、同第８，９６２，３３２号、同第７，７９０，４４９号、同第７，２８２，１９９号、同第８，９０６，６７５号、同第８，５２４，４４６号、同第７，７１２，８９３；６，４９１，９０７号、同第８，６３７，２５５号、同第７，１８６，５２２号、同第７，１０５，３４５号、同第６，７５９，２３７号、同第６，９８４，５１７号、同第６，９６２，８１５号、同第７，７４９，４９２号、同第７，２５９，１５１号、および同第６，１５６，３０３号、米国公開第２０１３／０２９５６１４号、同第２０１５／００６５５６２号、同第２０１４／０３６４３３８号、同第２０１３／０３２３２２６号、同第２０１４／０３５９７９９号、同第２０１３／００５９７３２号、同第２０１４／００３７５８５号、同第２０１４／００５６８５４号、同第２０１３／０２９６４０９号、同第２０１４／０３３５０５４号、同第２０１３／０１９５８０１号、同第２０１２／００７０８９９号、同第２０１１／０２７５５２９号、同第２０１１／０１７１２６２号、同第２００９／０２１５８７９号、同第２０１０／０２９７１７７号、同第２０１０／０２０３０８３号、同第２００９／０３１７４１７号、同第２００９／０２０２４９０号、同第２０１２／０２２０４９２号、同第２００６／０２９２１１７号、および同第２００４／０００２１５９号、欧州公開第２６９２７３１Ａ１号、同第２３８３３４６Ｂ１号、同第２３５９８６５Ｂ１号、同第２３５９８６６ Ｂ１号、同第２３５９８６７Ｂ１号、および同第２３５７０１０Ｂ１号、同第１７９１８５８Ｂ１号、同第１６６８１４３Ｂ１号、同第１６６０６７８Ｂ１号、同第１６６４３１４Ｂ１号、同第１４９６９４４Ｂ１号、同第１４５６３８３Ｂ１号、同第２３４１０６８Ｂ１号、同第２３３８９００Ｂ１号、同第１４５６４１９Ｂ１号、同第１３１０５７１Ｂ１号、同第１４５６３８３Ｂ１号、同第１６３３７７２Ｂ１号、および同第１１３５４６８Ｂ１号、ならびに国際（ＰＣＴ）公開第ＷＯ２０１４／１２４２８２号、同第ＷＯ２０１３／１７００７８号、同第ＷＯ２０１４／１６００９２号、同第ＷＯ２０１４／１０３９５７号、同第ＷＯ２０１４／０５２７８９号、同第ＷＯ２０１３／１７４７６０号、同第ＷＯ２０１３／１２３５０３号、同第ＷＯ２０１１／０３８１８７号、および同第ＷＯ２００８／１２４０１５号、同第ＷＯ２００３／０５４１９７に記載されているが、これらの参考文献のいずれも、本明細書に開示されるＡＡＶ変異体の物質構造の実施形態および／または特徴および／または組成物を開示していない。
本明細書および参照された特許文書に引用される全ての文書および参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
国際公開第２０１４／１９４１３２号 米国特許第９，１９３，９５６号明細書 米国特許第９；１８６；４１９号明細書 米国特許第８，６３２，７６４号明細書 米国特許第８，６６３，６２４号明細書 米国特許第８，９２７，５１４号明細書 米国特許第８，６２８，９６６号明細書 米国特許第８，２６３，３９６号明細書 米国特許第８，７３４，８０９号明細書 米国特許第８，８８９，６４１号明細書 米国特許第８，６３２，７６４号明細書 米国特許第８，６９１，９４８号明細書 米国特許第８，２９９，２９５号明細書 米国特許第８，８０２，４４０号明細書 米国特許第８，４４５，２６７号明細書 米国特許第８，９０６，３０７号明細書 米国特許第８，５７４，５８３号明細書 米国特許第８，０６７，０１５号明細書 米国特許第７，５８８，７７２号明細書 米国特許第７，８６７，４８４号明細書 米国特許第８，１６３，５４３号明細書 米国特許第８，２８３，１５１号明細書 米国特許第８，９９９，６７８号明細書 米国特許第７，８９２，８０９号明細書 米国特許第７，９０６，１１１号明細書 米国特許第７，２５９，１５１号明細書 米国特許第７，６２９，３２２号明細書 米国特許第７，２２０，５７７号明細書 米国特許第８，８０２，０８０号明細書 米国特許第７，１９８，９５１号明細書 米国特許第８，３１８，４８０号明細書 米国特許第８，９６２，３３２号明細書 米国特許第７，７９０，４４９号明細書 米国特許第７，２８２，１９９号明細書 米国特許第８，９０６，６７５号明細書 米国特許第８，５２４，４４６号明細書 米国特許第７，７１２，８９３号明細書 米国特許第６，４９１，９０７号明細書 米国特許第８，６３７，２５５号明細書 米国特許第７，１８６，５２２号明細書 米国特許第７，１０５，３４５号明細書 米国特許第６，７５９，２３７号明細書 米国特許第６，９８４，５１７号明細書 米国特許第６，９６２，８１５号明細書 米国特許第７，７４９，４９２号明細書 米国特許第７，２５９，１５１号明細書 米国特許第６，１５６，３０３号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０２９５６１４号明細書 米国特許出願公開第２０１５／００６５５６２号明細書 米国特許出願公開第２０１４／０３６４３３８号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０３２３２２６号明細書 米国特許出願公開第２０１４／０３５９７９９号明細書 米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号明細書 米国特許出願公開第２０１４／００３７５８５号明細書 米国特許出願公開第２０１４／００５６８５４号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０２９６４０９号明細書 米国特許出願公開第２０１４／０３３５０５４号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１９５８０１号明細書 米国特許出願公開第２０１２／００７０８９９号明細書 米国特許出願公開第２０１１／０２７５５２９号明細書 米国特許出願公開第２０１１／０１７１２６２号明細書 米国特許出願公開第２００９／０２１５８７９号明細書 米国特許出願公開第２０１０／０２９７１７７号明細書 米国特許出願公開第２０１０／０２０３０８３号明細書 米国特許出願公開第２００９／０３１７４１７号明細書 米国特許出願公開第２００９／０２０２４９０号明細書 米国特許出願公開第２０１２／０２２０４９２号明細書 米国特許出願公開第２００６／０２９２１１７号明細書 米国特許出願公開第２００４／０００２１５９号明細書 欧州特許出願公開第２６９２７３１号明細書 欧州特許第２３８３３４６号明細書 欧州特許第２３５９８６５号明細書 欧州特許第２３５９８６６号明細書 欧州特許第２３５９８６７号明細書 欧州特許第２３５７０１０号明細書 欧州特許第１７９１８５８号明細書 欧州特許第１６６８１４３号明細書 欧州特許第１６６０６７８号明細書 欧州特許第１６６４３１４号明細書 欧州特許第１４９６９４４号明細書 欧州特許第１４５６３８３号明細書 欧州特許第２３４１０６８号明細書 欧州特許第２３３８９００号明細書 欧州特許第１４５６４１９号明細書 欧州特許第１３１０５７１号明細書 欧州特許第１４５６３８３号明細書 欧州特許第１６３３７７２号明細書 欧州特許第１１３５４６８号明細書 国際公開第２０１４／１２４２８２号 国際公開第２０１３／１７００７８号 国際公開第２０１４／１６００９２号 国際公開第２０１４／１０３９５７号 国際公開第２０１４／０５２７８９号 国際公開第２０１３／１７４７６０号 国際公開第２０１３／１２３５０３号 国際公開第２０１１／０３８１８７号 国際公開第２００８／１２４０１５号 国際公開第２００３／０５４１９７号
Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ＆Ｓｃｈａｆｆｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＡＯＰ，２０１４年５月２０日にオンライン公開；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｇ３７４２
本明細書では、ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、修飾されていない親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、１つ以上の型の網膜細胞の増加した感染性を付与する、親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してアミノ酸配列に１つ以上の修飾を有する、変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質が提供される。また、本明細書に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンおよびその薬学的組成物、変異ｒＡＡＶキャプシドタンパク質およびビリオンを作製する方法、ならびにこれらのｒＡＡＶキャプシドタンパク質およびビリオンを、研究および臨床診療、例えば、網膜障害および疾患の治療のために網膜の１つ以上の細胞に核酸配列を送達することにおいて使用するための方法が提供される。
本開示のいくつかの態様では、変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質が提供され、これらの変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、アミノ酸配列修飾を含まない親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、１つ以上の型の網膜細胞（例えば、光受容細胞（例えば、桿体、錐体）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、グリア細胞（例えば、ミュラーグリア細胞、マイクログリア細胞）、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、および／または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞）の増加した感染性を付与する、親ＡＡＶキャプシドに対してアミノ酸配列に１つ以上の修飾を有する。
本開示のいくつかの態様では、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンが提供され、これらのｒＡＡＶビリオンは、本明細書に記載の変異キャプシドタンパク質を含み、このｒＡＡＶビリオンは、対応する修飾されていない親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性に対して、１つ以上の型の網膜細胞（例えば、光受容細胞（例えば、桿体、錐体）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、グリア細胞（例えば、ミュラーグリア細胞、マイクログリア細胞）、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、および／または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞）の増加した感染性を呈する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンに対して、全ての網膜細胞の増加した感染性を示す。他の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンに対して、網膜のある特定の細胞型の増加した感染性を示すが、他のものの増加した感染性を示すわけではない。換言すれば、ｒＡＡＶビリオンは、網膜のある特定の細胞型に対して、優先的な感染性を示すが、他のものの増加した感染性を示すわけではなく、例えば、ｒＡＡＶは、光受容細胞、網膜神経節細胞、グリア細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、および／または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞から選択される１つ以上の細胞型の優先的に増加した感染性を実証するが、全ての細胞型の増加した感染性を実証するわけではない。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、異種核酸を含む。いくつかのそのような実施形態では、異種核酸は、ポリペプチドをコードするＲＮＡをコードする。他のそのような実施形態では、異種核酸配列は、ポリペプチドをコードしないＲＮＡをコードし、例えば、異種核酸配列は、ＲＮＡ干渉剤、ヌクレアーゼのためのガイドＲＮＡなどをコードする。
本明細書では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物も提供される。
また、標的細胞をｒＡＡＶビリオンと接触させることによって異種核酸を標的細胞（網膜細胞など）に送達する方法における、本明細書に記載の変異キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンの使用が提供される。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボである（眼疾患の治療を必要とする個体の眼など）。他の実施形態では、標的細胞は、インビトロである。
また、本明細書に記載の変異キャプシドタンパク質を含む有効量のｒＡＡＶビリオン、または有効量のｒＡＡＶビリオンを含む薬学的組成物を、眼疾患の治療を必要とする対象に投与することによって、眼疾患を治療する方法が提供される。
また、本明細書に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする配列を含む単離された核酸、および単離された核酸を含む宿主細胞が提供される。さらに他の実施形態では、単離された核酸および／または単離された宿主細胞は、ｒＡＡＶを含む。
いくつかの態様では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対して、キャプシドタンパク質のＧＨループに約５アミノ酸～約２０アミノ酸の挿入（「異種ペプチド」または「ペプチド挿入」）を含み、この変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）から本質的になる群から選択される配列を含む。いくつかの態様では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対して、１つ以上のアミノ酸置換を含み、この変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。
関連する態様では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対して、ペプチド挿入および１つ以上のアミノ酸置換を含み、この変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。
本明細書では、ＡＡＶ２に対して、異種ペプチドＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）およびＰ３４Ａ置換を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質も開示される。関連する実施形態では、本明細書では、配列番号４２として示される配列と少なくとも９０％同一の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質、およびＶＥＧＦ阻害剤、好ましくはＶＥＧＦａ阻害剤をコードする配列を含む異種核酸を含む、感染性組換えＡＡＶ、ならびにそれを含む薬学的組成物が開示される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤をコードする異種核酸配列は、アフリベルセプト、ラニビズマブ、ラニビズマブ（ｓｃ－ラニビズマブＬＨもしくはＨＬ）の一本鎖バージョン、ブロルシズマブ、ＩｇＧ Ｆｃドメインに融合したｓｃ－ラニビズマブ（ｓｃ－ラニビズマブ－Ｆｃ）、またはＩｇＧ Ｆｃドメインに融合したブロルシズマブ（ブロルシズマブ－Ｆｃ）から選択される。関連する実施形態では、組換えＡＡＶは、各々がＶＥＧＦａ阻害剤をコードする２つ以上の配列（例えば、アフリベルセプトをコードする第１の配列およびブロルシズマブをコードする第２の配列）を含む、異種核酸を含む。好ましい実施形態では、異種核酸配列は、配列番号６５、６７、６９、７０、７２、７４、７６のうちのいずれか１つの配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を有する。他の関連する実施形態では、眼内ＶＥＧＦａレベルの上昇に関連する眼疾患を有する患者を治療するための方法が提供され、この方法は、好ましくは硝子体内注射を介して、有効量の、配列番号４２として示される配列と少なくとも９０％同一の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む感染性組換えＡＡＶ、およびＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列を含む異種核酸を、患者に投与することを含む。
本明細書では、ＡＡＶ２に対して、異種ペプチドＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）およびアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、およびＬ７３５Ｑを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質も開示される。
本明細書では、変異ＡＡＶキャプシドを含むｒＡＡＶの製造および／または送達のための方法も開示される。加えて、本明細書では、本明細書に開示される変異ＡＡＶキャプシドを含むｒＡＡＶを含み、本明細書に記載の方法において使用するためのキットが提供される。
他の実施形態では、前段落における変異キャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンは、先行の実施形態または後続して開示される実施形態のいずれかを組み込んでもよい。実際に、明確にするために別個の実施形態の観点から記載されている本発明のある特定の特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の観点から記載されている本発明の様々な特徴は、別個にまたは任意の好適な部分的組み合わせで提供されてもよい。本発明に係る実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、まさにありとあらゆる組み合わせが個々にかつ明示的に開示されているかのように、本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態およびそれらの要素の全ての部分的組み合わせも、本発明によって具体的に包含され、まさにありとあらゆるそのような部分的組み合わせが本明細書に個々にかつ明示的に開示されているかのように、本明細書に開示される。
本発明の要約は、特許請求の範囲を定義することを意図するものでも、いかなる様式で本発明の範囲を限定するものでもない。
本明細書に開示される発明の他の特徴および利点は、以下の図面、発明を実施するための形態、および特許請求の範囲から明らかとなる。
本発明の方法および組成物を記載する前に、本発明は記載される特定の方法または組成物に限定されず、したがって変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものであるにすぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
本明細書に開示される発明は、図面および説明に例示されている。しかしながら、特定の実施形態が図面に例示されているものの、本発明を、例示および／または開示された特定の実施形態（複数可）に限定する意図はない。むしろ、本明細書に開示される発明は、本発明の趣旨および範囲内に入る全ての修正、代替構成、および等価物を網羅することを意図する。したがって、図面は、例示的であることを意図し、限定的であることを意図するものではない。
ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限との間に、文脈上明確に指示されない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されることが理解される。記載された範囲内の任意の記載された値または介在値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値または介在値との間のより小さい各範囲は、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、その範囲内に含まれても除外されてもよく、より小さい範囲に限界のいずれかが含まれる、限界のいずれも含まれない、または限界の両方が含まれる各範囲もまた、記載された範囲内の任意の具体的に除外される限界次第で、本発明に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界の一方または両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似または等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、いくつかの潜在的なかつ好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用されるものに関連して方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾が存在する限り、組み込まれる刊行物のいずれの開示にも優先することが理解される。
本開示の閲読時に当業者に明らかとなるように、本明細書に記載され図示される個々の実施形態の各々は、個別の構成要素および特徴を有し、これらは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴と容易に分離することもも、組み合わせることもできる。いずれの列挙される方法も、列挙される事象の順序で、または論理的に可能な他の順序で実施することができる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「組換えＡＡＶビリオン」への言及は、複数のそのようなビリオンを含み、「光受容細胞」への言及は、１つ以上の光受容細胞および当業者に既知のその等価物への言及を含む。特許請求の範囲は、いずれの任意選択の要素も排除するように作製され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連した「専ら」、「のみ」などのような排他的な用語の使用、または「否定的」限定の使用に対する先行詞として機能することを意図する。
本明細書で考察される刊行物は、専ら本出願の出願日前のそれらの開示のために提供される。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する資格を有さないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される公開日は、実際の公開日とは異なる可能性があり、これは独立して確認する必要があり得る。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、（ａ）変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対して前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入を含み、前記ペプチド挿入が、アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）を含む、変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質と、（ｂ）血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の活性を阻害するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、異種核酸であって、前記ヌクレオチド配列が、
（ｉ）配列番号６９として示されるヌクレオチド配列（ｓｃ－ラニビズマブ－ＬＨ１）、
（ｉｉ）配列番号６５として示されるヌクレオチド配列（アフリベルセプト）、
（ｉｉｉ）配列番号７４として示されるヌクレオチド配列（ブロルシズマブ）、
（ｉｖ）配列番号６７として示されるヌクレオチド配列（ｓｃ－ラニビズマブ－ＨＬ）、
（ｖ）配列番号７０として示されるヌクレオチド配列（ｓｃ－ラニビズマブ－ＬＨ２）、
（ｖｉ）配列番号７２として示されるヌクレオチド配列（ｓｃ－ラニビズマブ－ＬＨ－Ｆｃ）、
（ｖｉｉ）配列番号７６として示されるヌクレオチド配列（ブロルシズマブ－Ｆｃ）、および
（ｖｉｉｉ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のいずれかと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列からなる群から選択される、異種核酸と、を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
（項目２）
前記ペプチド挿入が、アミノ酸配列Ｙ１Ｙ２ＩＳＤＱＴＫＨＹ３を含み、Ｙ１～Ｙ３の各々が独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＰｒｏから選択される、項目１に記載のｒＡＡＶ。
（項目３）
前記ペプチド挿入が、アミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）を含む、項目２に記載のｒＡＡＶ。
（項目４）
前記挿入部位が、ＡＡＶ２（配列番号２）のＶＰ１のアミノ酸５８７および５８８に対応するアミノ酸の間、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質中の対応する位置にある、項目１～３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目５）
前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２（配列番号２）のＶＰ１キャプシドに対する１つ以上のアミノ酸置換、または別のＡＡＶ血清型における１つ以上の対応する置換を含む、項目１～４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目６）
前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２（配列番号２）のＶＰ１キャプシドに対するＰ３４Ａアミノ酸置換、または別のＡＡＶ血清型における対応する置換を含む、項目１～５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目７）
前記キャプシドタンパク質が、（ｉ）アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）および（ｉｉ）Ｐ３４Ａアミノ酸置換を含み、かつ配列番号４２として示される配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９９％同一である、項目１～６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目８）
前記キャプシドタンパク質が、配列番号４２として示されるアミノ酸配列から本質的になる、項目７に記載のｒＡＡＶ。
（項目９）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号６９として示される配列（ｓｃ－ラニビズマブＬＨ）の全長または配列番号６９のヌクレオチド６１～１５７８と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であり、かつ配列番号７１として示されるアミノ酸配列をコードするか、または配列番号７１のアミノ酸２１～５２５のアミノ酸配列をコードする、項目８に記載のｒＡＡＶ。（項目１０）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号６９のヌクレオチド６１～１５７８を含み、好ましくは配列番号６９のヌクレオチド１～１５７８を含む、項目９に記載のｒＡＡＶ。
（項目１１）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号６５として示される配列（アフリベルセプト）の全長または配列番号６５のヌクレオチド７９～１３７７と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であり、かつ配列番号６６として示されるアミノ酸配列をコードするか、または配列番号６６のアミノ酸２７～４５８のアミノ酸配列をコードする、項目８に記載のｒＡＡＶ。
（項目１２）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号６５のヌクレオチド７９～１３７７を含み、好ましくは配列番号６５のヌクレオチド１～１３７７を含む、項目１１に記載のｒＡＡＶ。
（項目１３）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号７４として示される配列（ブロルシズマブ）の全長または配列番号７４のヌクレオチド６１～８１６と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であり、かつ配列番号７５として示されるアミノ酸配列をコードするか、または配列番号７５のアミノ酸２１～２７１のアミノ酸配列をコードする、項目８に記載のｒＡＡＶ。
（項目１４）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号７４のヌクレオチド６１～８１６を含み、好ましくは配列番号７４のヌクレオチド１～８１６を含む、項目１３に記載のｒＡＡＶ。
（項目１５）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号６７として示される配列（ｓｃ－ラニビズマブ－ＨＬ）の全長または配列番号６７のヌクレオチド５８～１５７５と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であり、かつ配列番号６８として示されるアミノ酸配列をコードするか、または配列番号６８のアミノ酸２０～５２４のアミノ酸配列をコードする、項目８に記載のｒＡＡＶ。
（項目１６）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号６７のヌクレオチド５８～１５７５を含み、好ましくは配列番号６７のヌクレオチド１～１５７５を含む、項目１５に記載のｒＡＡＶ。
（項目１７）
前記異種核酸が、（ｉ）配列番号６５として示される核酸配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であり、配列番号６６として示されるアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列、および（ｉｉ）配列番号７４として示される核酸配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であり、配列番号７５として示されるアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列を含む、項目８に記載のｒＡＡＶ。
（項目１８）
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の活性を阻害するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現制御配列に作動可能に連結される、項目１～１７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目１９）
前記変異キャプシドタンパク質が、網膜細胞に対する前記対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質の感染性と比較して、前記網膜細胞の増加した感染性を付与する、項目１～１８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
（項目２０）
項目１～１９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
（項目２１）
対象の網膜細胞、脈絡膜細胞、レンズ細胞、毛様細胞、虹彩細胞、視神経細胞、および／または角膜細胞にＶＥＧＦ阻害剤を送達するための方法であって、項目１～１９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオンまたは項目２０に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目２２）
前記ｒＡＡＶビリオンまたは薬学的組成物が、前記対象に硝子体内投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
有効量の項目１～１９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶまたは有効量の項目２０に記載の組成物を前記対象に投与することによる、ＶＥＧＦａ関連眼疾患の治療を必要とする対象における、滲出型（新生血管、滲出性）加齢黄斑変性；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；網膜静脈閉塞に起因する網膜血管新生；糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症（非増殖性糖尿病性網膜症および増殖性糖尿病性網膜症の全段階を含む）；近視性黄斑変性；網膜静脈分枝閉塞、半網膜静脈閉塞、および網膜中心静脈閉塞；未熟児網膜症；特発性脈絡膜新生血管；近視黄斑変性ならびに続発性網膜および脈絡膜新生血管；網膜毛細血管拡張症；血管新生緑内障；硝子体出血；ぶどう膜炎（ｕｖｅｔｉｓ）、外傷、網膜変性障害、遺伝性網膜および／または脈絡膜疾患、眼腫瘍、角膜および虹彩血管新生を含むがこれらに限定されない、網膜疾患に続発する網膜および脈絡膜新生血管から選択される、ＶＥＧＦａ関連眼疾患を治療するための方法。
（項目２４）
前記ＶＥＧＦａ関連眼疾患が、滲出型（新生血管、滲出性）加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、および近視性脈絡膜血管新生から選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ｒＡＡＶまたは薬学的組成物が、前記対象に硝子体内投与される、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２６）
前記対象が、ヒトである、項目２１～２５のいずれか１項に記載の方法。
本発明は、添付の図面と併せて閲読したときに、以下の発明を実施するための形態から最もよく理解される。本特許または出願ファイルには、少なくとも１つのカラー図面が含まれる。カラー図面（複数可）を有する特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な費用の支払いにより、特許庁によって提供される。一般的な慣行に従って、図面の様々な特徴は原寸ではないことが強調される。むしろ、様々な特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大または縮小される。図面には、以下の図が含まれる。
定向進化法の実施形態を示す。ステップ（ａ）は、ＤＮＡ変異技術とキャプシド遺伝子との組み合わせを含むウイルスキャプシドライブラリの生成を示す。ステップ（ｂ）は、各ウイルス粒子が、そのキャプシドをコードするキャプシド遺伝子を取り囲む変異キャプシドで構成され、精製されるような、ウイルスのパッケージングを示す。次いで、キャプシドライブラリは、インビトロまたはインビボで選択圧下に置かれる。定向進化技術のこの態様では、目的の組織または細胞物質は、その標的の感染に成功したＡＡＶ変異体の単離のために採取され、成功したウイルスが回収される。ステップ（ｃ）は、反復選択による、成功したクローンの段階１の富化を示す。ステップ（ｄ）は、ウイルスの適合度を反復的に増加させるために再多様化およびさらなる選択ステップを経る、選択されたキャプシド遺伝子の段階２の富化を示す。ステップ（ｅ）は、組換えＡＡＶベクターとして製造され、様々な細胞型および組織標的の形質導入レベルについて特性評価される、ベクター選択段階１と２との間にヒットとして同定された変異体を示す。ＡＡＶ定向進化プロセスの性質により、本明細書に開示される変異体は、選択プロセス中に網膜細胞を形質導入し、ゲノム（変異キャプシド遺伝子をコードするゲノム）を送達する能力を既に実証している。 ウイルスゲノムが増幅される試料が網膜の広範な領域に渡って採取される場所を示す、網膜フラットマウントの模式図を提供する。 選択の代表的なラウンドに由来する、神経節細胞層（ＧＣＬ）、内顆粒層（ＩＮＬ）、光受容体／外顆粒層（ＯＮＬ）、および網膜色素上皮（ＲＰＥ）層網膜組織からのウイルスゲノムのＰＣＲ増幅を示す。右眼（上の画像）および左眼（下の画像）の両方に、ライブラリを注入した。内網膜（ｉｎ）、中間網膜（ｍｉｄ）、外／周辺網膜（ｏｕｔ）をサンプリングした。赤色のボックス内のバンドは、ウイルスゲノムの増幅に成功したことを表す。 図４Ａ～４Ｄは、配列決定分析におけるモチーフの頻度を示す。図４Ａは、ラウンド３の配列決定分析を提供する。図４Ｂは、ラウンド４の配列決定分析を提供する。図４Ｃは、ラウンド５の配列決定分析を提供する。図４Ｄは、ラウンド６の配列決定分析を提供する。 アミノ酸５８７に続くランダムヘプタマーを含むＡＡＶ２の代表的な三次元モデルを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 図６Ａ～図６Ｗは、野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す、野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントを提供する。 ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を送達するＡＡＶ２（ＡＡＶ２．ＣＭＶ．ＧＦＰ）の２×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）の硝子体内投与後のアフリカミドリザルの網膜の、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ（商標）で撮影した眼底蛍光画像を提供する。画像は、ベースライン（Ａ）、ならびに注射から１４日目（Ｂ）、２８日目（Ｃ）、および４２日目（Ｄ）に撮影した。 ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を送達する新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ（ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＭＶ．ＧＦＰ）の２×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）の硝子体内投与後のアフリカミドリザルの網膜の、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ（商標）で撮影した眼底蛍光画像を提供する。画像は、ベースライン（Ａ）、ならびに注射から１４日目（Ｂ）、２８日目（Ｃ）、および４２日目（Ｄ）に撮影した。 ＣＡＧプロモーターの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を送達する新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ（ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＡＧ．ＥＧＦＰ）の硝子体内投与後のカニクイザルの網膜の、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ（商標）で撮影した眼底蛍光画像を提供する。（Ａ）注射後１４日目（Ａ１）、２１日目（Ａ２）、および２８日目（Ａ３）に撮像した２×１０１１ｖｇのベクターを硝子体内に注射したサルの網膜。（Ｂ）注射後１４日目（Ｂ１）および２１日目（Ｂ２）に撮像した１×１０１２ｖｇのベクターを硝子体内に注射したサルの網膜。 図１０Ａ～１０Ｅは、注射の３週間後に分析した、ＣＡＧプロモーターの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を送達する１×１０１２ｖｇの新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａを硝子体内に注射したサルの網膜の、免疫組織化学分析の結果を提供する。全ての免疫組織化学は、対応する眼底蛍光画像とともに提供され、赤色のボックスは、分析を行った網膜内のおよその場所を示す。図１０Ａ：強固な網膜色素上皮（ＲＰＥ）および光受容体形質導入が、ＧＦＰ特異的抗体（赤色）を使用して観察された。Ｍ／Ｌオプシン抗体を使用した錐体光受容体免疫染色を、白色で示す。図１０Ｂおよび１０Ｃ：直接ＥＧＦＰ蛍光（緑色）、およびＧＦＰ特異的抗体（赤色）を使用した免疫組織化学によって、強固な桿体および錐体光受容体（図１０Ｂ）ならびにＲＰＥ（図１０Ｃ）の形質導入が観察された。ＲＰＥのメラノソームは、画像中で黒色に見える。図１０Ｄ：直接ＥＧＦＰ蛍光（緑色）、およびＧＦＰ特異的抗体（赤色）を使用した免疫組織化学によって、中心窩内およびその周辺の錐体光受容体（Ｍ／Ｌオプシン、白色によって同定）および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の形質導入が観察された。中央のパネルの画像は、より高い倍率（６３倍）の左パネルの白色ボックスによって示される領域である。図１０Ｅ：直接ＥＧＦＰ蛍光によって、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）および網膜神経節細胞層の形質導入が観察された（右パネル、緑色；右下パネルは右上パネルの６３倍の倍率、左上パネルは明視野照明下の領域を示す）。 図１０Ａ～１０Ｅは、注射の３週間後に分析した、ＣＡＧプロモーターの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を送達する１×１０１２ｖｇの新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａを硝子体内に注射したサルの網膜の、免疫組織化学分析の結果を提供する。全ての免疫組織化学は、対応する眼底蛍光画像とともに提供され、赤色のボックスは、分析を行った網膜内のおよその場所を示す。図１０Ａ：強固な網膜色素上皮（ＲＰＥ）および光受容体形質導入が、ＧＦＰ特異的抗体（赤色）を使用して観察された。Ｍ／Ｌオプシン抗体を使用した錐体光受容体免疫染色を、白色で示す。図１０Ｂおよび１０Ｃ：直接ＥＧＦＰ蛍光（緑色）、およびＧＦＰ特異的抗体（赤色）を使用した免疫組織化学によって、強固な桿体および錐体光受容体（図１０Ｂ）ならびにＲＰＥ（図１０Ｃ）の形質導入が観察された。ＲＰＥのメラノソームは、画像中で黒色に見える。図１０Ｄ：直接ＥＧＦＰ蛍光（緑色）、およびＧＦＰ特異的抗体（赤色）を使用した免疫組織化学によって、中心窩内およびその周辺の錐体光受容体（Ｍ／Ｌオプシン、白色によって同定）および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の形質導入が観察された。中央のパネルの画像は、より高い倍率（６３倍）の左パネルの白色ボックスによって示される領域である。図１０Ｅ：直接ＥＧＦＰ蛍光によって、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）および網膜神経節細胞層の形質導入が観察された（右パネル、緑色；右下パネルは右上パネルの６３倍の倍率、左上パネルは明視野照明下の領域を示す）。 図１０Ａ～１０Ｅは、注射の３週間後に分析した、ＣＡＧプロモーターの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を送達する１×１０１２ｖｇの新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａを硝子体内に注射したサルの網膜の、免疫組織化学分析の結果を提供する。全ての免疫組織化学は、対応する眼底蛍光画像とともに提供され、赤色のボックスは、分析を行った網膜内のおよその場所を示す。図１０Ａ：強固な網膜色素上皮（ＲＰＥ）および光受容体形質導入が、ＧＦＰ特異的抗体（赤色）を使用して観察された。Ｍ／Ｌオプシン抗体を使用した錐体光受容体免疫染色を、白色で示す。図１０Ｂおよび１０Ｃ：直接ＥＧＦＰ蛍光（緑色）、およびＧＦＰ特異的抗体（赤色）を使用した免疫組織化学によって、強固な桿体および錐体光受容体（図１０Ｂ）ならびにＲＰＥ（図１０Ｃ）の形質導入が観察された。ＲＰＥのメラノソームは、画像中で黒色に見える。図１０Ｄ：直接ＥＧＦＰ蛍光（緑色）、およびＧＦＰ特異的抗体（赤色）を使用した免疫組織化学によって、中心窩内およびその周辺の錐体光受容体（Ｍ／Ｌオプシン、白色によって同定）および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の形質導入が観察された。中央のパネルの画像は、より高い倍率（６３倍）の左パネルの白色ボックスによって示される領域である。図１０Ｅ：直接ＥＧＦＰ蛍光によって、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）および網膜神経節細胞層の形質導入が観察された（右パネル、緑色；右下パネルは右上パネルの６３倍の倍率、左上パネルは明視野照明下の領域を示す）。 図１０Ａ～１０Ｅは、注射の３週間後に分析した、ＣＡＧプロモーターの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を送達する１×１０１２ｖｇの新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａを硝子体内に注射したサルの網膜の、免疫組織化学分析の結果を提供する。全ての免疫組織化学は、対応する眼底蛍光画像とともに提供され、赤色のボックスは、分析を行った網膜内のおよその場所を示す。図１０Ａ：強固な網膜色素上皮（ＲＰＥ）および光受容体形質導入が、ＧＦＰ特異的抗体（赤色）を使用して観察された。Ｍ／Ｌオプシン抗体を使用した錐体光受容体免疫染色を、白色で示す。図１０Ｂおよび１０Ｃ：直接ＥＧＦＰ蛍光（緑色）、およびＧＦＰ特異的抗体（赤色）を使用した免疫組織化学によって、強固な桿体および錐体光受容体（図１０Ｂ）ならびにＲＰＥ（図１０Ｃ）の形質導入が観察された。ＲＰＥのメラノソームは、画像中で黒色に見える。図１０Ｄ：直接ＥＧＦＰ蛍光（緑色）、およびＧＦＰ特異的抗体（赤色）を使用した免疫組織化学によって、中心窩内およびその周辺の錐体光受容体（Ｍ／Ｌオプシン、白色によって同定）および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の形質導入が観察された。中央のパネルの画像は、より高い倍率（６３倍）の左パネルの白色ボックスによって示される領域である。図１０Ｅ：直接ＥＧＦＰ蛍光によって、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）および網膜神経節細胞層の形質導入が観察された（右パネル、緑色；右下パネルは右上パネルの６３倍の倍率、左上パネルは明視野照明下の領域を示す）。 図１０Ａ～１０Ｅは、注射の３週間後に分析した、ＣＡＧプロモーターの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を送達する１×１０１２ｖｇの新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａを硝子体内に注射したサルの網膜の、免疫組織化学分析の結果を提供する。全ての免疫組織化学は、対応する眼底蛍光画像とともに提供され、赤色のボックスは、分析を行った網膜内のおよその場所を示す。図１０Ａ：強固な網膜色素上皮（ＲＰＥ）および光受容体形質導入が、ＧＦＰ特異的抗体（赤色）を使用して観察された。Ｍ／Ｌオプシン抗体を使用した錐体光受容体免疫染色を、白色で示す。図１０Ｂおよび１０Ｃ：直接ＥＧＦＰ蛍光（緑色）、およびＧＦＰ特異的抗体（赤色）を使用した免疫組織化学によって、強固な桿体および錐体光受容体（図１０Ｂ）ならびにＲＰＥ（図１０Ｃ）の形質導入が観察された。ＲＰＥのメラノソームは、画像中で黒色に見える。図１０Ｄ：直接ＥＧＦＰ蛍光（緑色）、およびＧＦＰ特異的抗体（赤色）を使用した免疫組織化学によって、中心窩内およびその周辺の錐体光受容体（Ｍ／Ｌオプシン、白色によって同定）および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の形質導入が観察された。中央のパネルの画像は、より高い倍率（６３倍）の左パネルの白色ボックスによって示される領域である。図１０Ｅ：直接ＥＧＦＰ蛍光によって、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）および網膜神経節細胞層の形質導入が観察された（右パネル、緑色；右下パネルは右上パネルの６３倍の倍率、左上パネルは明視野照明下の領域を示す）。 図１１Ａ～１１Ｆは、新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４ＡキャプシドおよびＣＡＧプロモーターの制御下にあるＧＦＰ導入遺伝子を含む組換えＡＡＶウイルスによる、ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞のインビトロでの形質導入に関するデータを提供する。ヒト胚性幹細胞株（図１１Ａおよび１１Ｃ）またはヒト線維芽細胞由来誘導多能性幹細胞（ＦＢ－ｉＰＳＣ）（図１１Ｂおよび１１Ｄ）からＲＰＥ細胞に分化した細胞を、新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＡＧ．ＧＦＰまたは野生型対照ＡＡＶ２．ＣＡＧ．ＧＦＰに感染させた。図１１Ａおよび１１Ｂ：５００の感染効率での感染から７日後の細胞培養物の免疫蛍光撮像により、新規のＡＡＶ変異体キャプシド（左パネル）が野生型ＡＡＶ２キャプシド（右パネル）よりも良好にＲＰＥ細胞を形質導入することが実証される。図１１Ｃおよび図１１Ｄ：フローサイトメトリーによる各培養物中のＧＦＰ陽性ＲＰＥ細胞のパーセントの定量化により、新規のＡＡＶ変異体キャプシドが、細胞源にかかわらず、野生型ＡＡＶ２キャプシドと比べて形質導入された細胞数の有意な用量依存的改善を提供することが明らかとなる。図１１Ｅおよび図１１Ｆ：ウエスタンブロットによる各培養物中のＧＦＰの量の定量化により、新規のＡＡＶ変異体が、細胞源にかかわらず、野生型キャプシドと比べて導入遺伝子の発現の有意な改善を提供することが明らかとなる。 図１１Ａ～１１Ｆは、新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４ＡキャプシドおよびＣＡＧプロモーターの制御下にあるＧＦＰ導入遺伝子を含む組換えＡＡＶウイルスによる、ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞のインビトロでの形質導入に関するデータを提供する。ヒト胚性幹細胞株（図１１Ａおよび１１Ｃ）またはヒト線維芽細胞由来誘導多能性幹細胞（ＦＢ－ｉＰＳＣ）（図１１Ｂおよび１１Ｄ）からＲＰＥ細胞に分化した細胞を、新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＡＧ．ＧＦＰまたは野生型対照ＡＡＶ２．ＣＡＧ．ＧＦＰに感染させた。図１１Ａおよび１１Ｂ：５００の感染効率での感染から７日後の細胞培養物の免疫蛍光撮像により、新規のＡＡＶ変異体キャプシド（左パネル）が野生型ＡＡＶ２キャプシド（右パネル）よりも良好にＲＰＥ細胞を形質導入することが実証される。図１１Ｃおよび図１１Ｄ：フローサイトメトリーによる各培養物中のＧＦＰ陽性ＲＰＥ細胞のパーセントの定量化により、新規のＡＡＶ変異体キャプシドが、細胞源にかかわらず、野生型ＡＡＶ２キャプシドと比べて形質導入された細胞数の有意な用量依存的改善を提供することが明らかとなる。図１１Ｅおよび図１１Ｆ：ウエスタンブロットによる各培養物中のＧＦＰの量の定量化により、新規のＡＡＶ変異体が、細胞源にかかわらず、野生型キャプシドと比べて導入遺伝子の発現の有意な改善を提供することが明らかとなる。 図１１Ａ～１１Ｆは、新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４ＡキャプシドおよびＣＡＧプロモーターの制御下にあるＧＦＰ導入遺伝子を含む組換えＡＡＶウイルスによる、ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞のインビトロでの形質導入に関するデータを提供する。ヒト胚性幹細胞株（図１１Ａおよび１１Ｃ）またはヒト線維芽細胞由来誘導多能性幹細胞（ＦＢ－ｉＰＳＣ）（図１１Ｂおよび１１Ｄ）からＲＰＥ細胞に分化した細胞を、新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＡＧ．ＧＦＰまたは野生型対照ＡＡＶ２．ＣＡＧ．ＧＦＰに感染させた。図１１Ａおよび１１Ｂ：５００の感染効率での感染から７日後の細胞培養物の免疫蛍光撮像により、新規のＡＡＶ変異体キャプシド（左パネル）が野生型ＡＡＶ２キャプシド（右パネル）よりも良好にＲＰＥ細胞を形質導入することが実証される。図１１Ｃおよび図１１Ｄ：フローサイトメトリーによる各培養物中のＧＦＰ陽性ＲＰＥ細胞のパーセントの定量化により、新規のＡＡＶ変異体キャプシドが、細胞源にかかわらず、野生型ＡＡＶ２キャプシドと比べて形質導入された細胞数の有意な用量依存的改善を提供することが明らかとなる。図１１Ｅおよび図１１Ｆ：ウエスタンブロットによる各培養物中のＧＦＰの量の定量化により、新規のＡＡＶ変異体が、細胞源にかかわらず、野生型キャプシドと比べて導入遺伝子の発現の有意な改善を提供することが明らかとなる。 図１１Ａ～１１Ｆは、新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４ＡキャプシドおよびＣＡＧプロモーターの制御下にあるＧＦＰ導入遺伝子を含む組換えＡＡＶウイルスによる、ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞のインビトロでの形質導入に関するデータを提供する。ヒト胚性幹細胞株（図１１Ａおよび１１Ｃ）またはヒト線維芽細胞由来誘導多能性幹細胞（ＦＢ－ｉＰＳＣ）（図１１Ｂおよび１１Ｄ）からＲＰＥ細胞に分化した細胞を、新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＡＧ．ＧＦＰまたは野生型対照ＡＡＶ２．ＣＡＧ．ＧＦＰに感染させた。図１１Ａおよび１１Ｂ：５００の感染効率での感染から７日後の細胞培養物の免疫蛍光撮像により、新規のＡＡＶ変異体キャプシド（左パネル）が野生型ＡＡＶ２キャプシド（右パネル）よりも良好にＲＰＥ細胞を形質導入することが実証される。図１１Ｃおよび図１１Ｄ：フローサイトメトリーによる各培養物中のＧＦＰ陽性ＲＰＥ細胞のパーセントの定量化により、新規のＡＡＶ変異体キャプシドが、細胞源にかかわらず、野生型ＡＡＶ２キャプシドと比べて形質導入された細胞数の有意な用量依存的改善を提供することが明らかとなる。図１１Ｅおよび図１１Ｆ：ウエスタンブロットによる各培養物中のＧＦＰの量の定量化により、新規のＡＡＶ変異体が、細胞源にかかわらず、野生型キャプシドと比べて導入遺伝子の発現の有意な改善を提供することが明らかとなる。 図１１Ａ～１１Ｆは、新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４ＡキャプシドおよびＣＡＧプロモーターの制御下にあるＧＦＰ導入遺伝子を含む組換えＡＡＶウイルスによる、ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞のインビトロでの形質導入に関するデータを提供する。ヒト胚性幹細胞株（図１１Ａおよび１１Ｃ）またはヒト線維芽細胞由来誘導多能性幹細胞（ＦＢ－ｉＰＳＣ）（図１１Ｂおよび１１Ｄ）からＲＰＥ細胞に分化した細胞を、新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＡＧ．ＧＦＰまたは野生型対照ＡＡＶ２．ＣＡＧ．ＧＦＰに感染させた。図１１Ａおよび１１Ｂ：５００の感染効率での感染から７日後の細胞培養物の免疫蛍光撮像により、新規のＡＡＶ変異体キャプシド（左パネル）が野生型ＡＡＶ２キャプシド（右パネル）よりも良好にＲＰＥ細胞を形質導入することが実証される。図１１Ｃおよび図１１Ｄ：フローサイトメトリーによる各培養物中のＧＦＰ陽性ＲＰＥ細胞のパーセントの定量化により、新規のＡＡＶ変異体キャプシドが、細胞源にかかわらず、野生型ＡＡＶ２キャプシドと比べて形質導入された細胞数の有意な用量依存的改善を提供することが明らかとなる。図１１Ｅおよび図１１Ｆ：ウエスタンブロットによる各培養物中のＧＦＰの量の定量化により、新規のＡＡＶ変異体が、細胞源にかかわらず、野生型キャプシドと比べて導入遺伝子の発現の有意な改善を提供することが明らかとなる。 図１１Ａ～１１Ｆは、新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４ＡキャプシドおよびＣＡＧプロモーターの制御下にあるＧＦＰ導入遺伝子を含む組換えＡＡＶウイルスによる、ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞のインビトロでの形質導入に関するデータを提供する。ヒト胚性幹細胞株（図１１Ａおよび１１Ｃ）またはヒト線維芽細胞由来誘導多能性幹細胞（ＦＢ－ｉＰＳＣ）（図１１Ｂおよび１１Ｄ）からＲＰＥ細胞に分化した細胞を、新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＡＧ．ＧＦＰまたは野生型対照ＡＡＶ２．ＣＡＧ．ＧＦＰに感染させた。図１１Ａおよび１１Ｂ：５００の感染効率での感染から７日後の細胞培養物の免疫蛍光撮像により、新規のＡＡＶ変異体キャプシド（左パネル）が野生型ＡＡＶ２キャプシド（右パネル）よりも良好にＲＰＥ細胞を形質導入することが実証される。図１１Ｃおよび図１１Ｄ：フローサイトメトリーによる各培養物中のＧＦＰ陽性ＲＰＥ細胞のパーセントの定量化により、新規のＡＡＶ変異体キャプシドが、細胞源にかかわらず、野生型ＡＡＶ２キャプシドと比べて形質導入された細胞数の有意な用量依存的改善を提供することが明らかとなる。図１１Ｅおよび図１１Ｆ：ウエスタンブロットによる各培養物中のＧＦＰの量の定量化により、新規のＡＡＶ変異体が、細胞源にかかわらず、野生型キャプシドと比べて導入遺伝子の発現の有意な改善を提供することが明らかとなる。 図１２Ａ～図１２Ｆは、抗ＶＥＧＦタンパク質の実施形態を示す。図１２Ａは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した、ヒトＦｌｔ１シグナルペプチド、ＶＥＧＦＲ１ドメイン２、およびＶＥＧＦＲ２ドメイン３からなる、アフリベルセプト設計を示す。図１２Ｂ～Ｃは、二本鎖抗原結合断片（Ｆａｂ）を一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）に変換するための可撓性タンパク質リンカーを含む、ラニビズマブ設計を示す。図１２Ｂは、可撓性ペプチドによって連結されたラニビズマブの、ヒトＩｇカッパ軽鎖シグナルペプチド、可変軽、定常軽、可変重、定常重１ドメインからなる、軽重（ＬＨ）形態を示す。図１２Ｃは、シグナルペプチドがヒトＩｇＧ重鎖に由来し、重ドメインおよび軽ドメインがＬＨ形態と比較してリンカーの反対側にあることを除いて類似している、重軽（ＨＬ）形態を示す。図１２Ｄは、可撓性ペプチドによって連結された可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含む、ブロルシズマブ設計を示す。図１２Ｅは、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ－Ｆｃ設計が、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したｓｃＦａｂ ＬＨ形態からなることを示す。図１２Ｆは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したブロルシズマブからなる、ブロルシズマブ－Ｆｃ設計を示す。赤色のストライプは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を表す。遺伝子を、ヒト細胞からの改善した発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔまたはＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成し、ＣＡＧプロモーターとＳＶ４０ポリＡシグナルとの間のｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＳＶ４０ ｐＡベクターに挿入した。 図１２Ａ～図１２Ｆは、抗ＶＥＧＦタンパク質の実施形態を示す。図１２Ａは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した、ヒトＦｌｔ１シグナルペプチド、ＶＥＧＦＲ１ドメイン２、およびＶＥＧＦＲ２ドメイン３からなる、アフリベルセプト設計を示す。図１２Ｂ～Ｃは、二本鎖抗原結合断片（Ｆａｂ）を一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）に変換するための可撓性タンパク質リンカーを含む、ラニビズマブ設計を示す。図１２Ｂは、可撓性ペプチドによって連結されたラニビズマブの、ヒトＩｇカッパ軽鎖シグナルペプチド、可変軽、定常軽、可変重、定常重１ドメインからなる、軽重（ＬＨ）形態を示す。図１２Ｃは、シグナルペプチドがヒトＩｇＧ重鎖に由来し、重ドメインおよび軽ドメインがＬＨ形態と比較してリンカーの反対側にあることを除いて類似している、重軽（ＨＬ）形態を示す。図１２Ｄは、可撓性ペプチドによって連結された可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含む、ブロルシズマブ設計を示す。図１２Ｅは、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ－Ｆｃ設計が、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したｓｃＦａｂ ＬＨ形態からなることを示す。図１２Ｆは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したブロルシズマブからなる、ブロルシズマブ－Ｆｃ設計を示す。赤色のストライプは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を表す。遺伝子を、ヒト細胞からの改善した発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔまたはＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成し、ＣＡＧプロモーターとＳＶ４０ポリＡシグナルとの間のｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＳＶ４０ ｐＡベクターに挿入した。 図１２Ａ～図１２Ｆは、抗ＶＥＧＦタンパク質の実施形態を示す。図１２Ａは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した、ヒトＦｌｔ１シグナルペプチド、ＶＥＧＦＲ１ドメイン２、およびＶＥＧＦＲ２ドメイン３からなる、アフリベルセプト設計を示す。図１２Ｂ～Ｃは、二本鎖抗原結合断片（Ｆａｂ）を一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）に変換するための可撓性タンパク質リンカーを含む、ラニビズマブ設計を示す。図１２Ｂは、可撓性ペプチドによって連結されたラニビズマブの、ヒトＩｇカッパ軽鎖シグナルペプチド、可変軽、定常軽、可変重、定常重１ドメインからなる、軽重（ＬＨ）形態を示す。図１２Ｃは、シグナルペプチドがヒトＩｇＧ重鎖に由来し、重ドメインおよび軽ドメインがＬＨ形態と比較してリンカーの反対側にあることを除いて類似している、重軽（ＨＬ）形態を示す。図１２Ｄは、可撓性ペプチドによって連結された可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含む、ブロルシズマブ設計を示す。図１２Ｅは、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ－Ｆｃ設計が、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したｓｃＦａｂ ＬＨ形態からなることを示す。図１２Ｆは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したブロルシズマブからなる、ブロルシズマブ－Ｆｃ設計を示す。赤色のストライプは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を表す。遺伝子を、ヒト細胞からの改善した発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔまたはＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成し、ＣＡＧプロモーターとＳＶ４０ポリＡシグナルとの間のｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＳＶ４０ ｐＡベクターに挿入した。 図１２Ａ～図１２Ｆは、抗ＶＥＧＦタンパク質の実施形態を示す。図１２Ａは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した、ヒトＦｌｔ１シグナルペプチド、ＶＥＧＦＲ１ドメイン２、およびＶＥＧＦＲ２ドメイン３からなる、アフリベルセプト設計を示す。図１２Ｂ～Ｃは、二本鎖抗原結合断片（Ｆａｂ）を一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）に変換するための可撓性タンパク質リンカーを含む、ラニビズマブ設計を示す。図１２Ｂは、可撓性ペプチドによって連結されたラニビズマブの、ヒトＩｇカッパ軽鎖シグナルペプチド、可変軽、定常軽、可変重、定常重１ドメインからなる、軽重（ＬＨ）形態を示す。図１２Ｃは、シグナルペプチドがヒトＩｇＧ重鎖に由来し、重ドメインおよび軽ドメインがＬＨ形態と比較してリンカーの反対側にあることを除いて類似している、重軽（ＨＬ）形態を示す。図１２Ｄは、可撓性ペプチドによって連結された可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含む、ブロルシズマブ設計を示す。図１２Ｅは、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ－Ｆｃ設計が、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したｓｃＦａｂ ＬＨ形態からなることを示す。図１２Ｆは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したブロルシズマブからなる、ブロルシズマブ－Ｆｃ設計を示す。赤色のストライプは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を表す。遺伝子を、ヒト細胞からの改善した発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔまたはＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成し、ＣＡＧプロモーターとＳＶ４０ポリＡシグナルとの間のｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＳＶ４０ ｐＡベクターに挿入した。 図１２Ａ～図１２Ｆは、抗ＶＥＧＦタンパク質の実施形態を示す。図１２Ａは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した、ヒトＦｌｔ１シグナルペプチド、ＶＥＧＦＲ１ドメイン２、およびＶＥＧＦＲ２ドメイン３からなる、アフリベルセプト設計を示す。図１２Ｂ～Ｃは、二本鎖抗原結合断片（Ｆａｂ）を一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）に変換するための可撓性タンパク質リンカーを含む、ラニビズマブ設計を示す。図１２Ｂは、可撓性ペプチドによって連結されたラニビズマブの、ヒトＩｇカッパ軽鎖シグナルペプチド、可変軽、定常軽、可変重、定常重１ドメインからなる、軽重（ＬＨ）形態を示す。図１２Ｃは、シグナルペプチドがヒトＩｇＧ重鎖に由来し、重ドメインおよび軽ドメインがＬＨ形態と比較してリンカーの反対側にあることを除いて類似している、重軽（ＨＬ）形態を示す。図１２Ｄは、可撓性ペプチドによって連結された可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含む、ブロルシズマブ設計を示す。図１２Ｅは、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ－Ｆｃ設計が、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したｓｃＦａｂ ＬＨ形態からなることを示す。図１２Ｆは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したブロルシズマブからなる、ブロルシズマブ－Ｆｃ設計を示す。赤色のストライプは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を表す。遺伝子を、ヒト細胞からの改善した発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔまたはＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成し、ＣＡＧプロモーターとＳＶ４０ポリＡシグナルとの間のｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＳＶ４０ ｐＡベクターに挿入した。 図１２Ａ～図１２Ｆは、抗ＶＥＧＦタンパク質の実施形態を示す。図１２Ａは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した、ヒトＦｌｔ１シグナルペプチド、ＶＥＧＦＲ１ドメイン２、およびＶＥＧＦＲ２ドメイン３からなる、アフリベルセプト設計を示す。図１２Ｂ～Ｃは、二本鎖抗原結合断片（Ｆａｂ）を一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）に変換するための可撓性タンパク質リンカーを含む、ラニビズマブ設計を示す。図１２Ｂは、可撓性ペプチドによって連結されたラニビズマブの、ヒトＩｇカッパ軽鎖シグナルペプチド、可変軽、定常軽、可変重、定常重１ドメインからなる、軽重（ＬＨ）形態を示す。図１２Ｃは、シグナルペプチドがヒトＩｇＧ重鎖に由来し、重ドメインおよび軽ドメインがＬＨ形態と比較してリンカーの反対側にあることを除いて類似している、重軽（ＨＬ）形態を示す。図１２Ｄは、可撓性ペプチドによって連結された可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含む、ブロルシズマブ設計を示す。図１２Ｅは、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ－Ｆｃ設計が、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したｓｃＦａｂ ＬＨ形態からなることを示す。図１２Ｆは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したブロルシズマブからなる、ブロルシズマブ－Ｆｃ設計を示す。赤色のストライプは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を表す。遺伝子を、ヒト細胞からの改善した発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔまたはＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成し、ＣＡＧプロモーターとＳＶ４０ポリＡシグナルとの間のｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＳＶ４０ ｐＡベクターに挿入した。 図１３Ａおよび図１３Ｂは、ＶＥＧＦに結合するタンパク質を検出するためのＥＬＩＳＡの結果を示す。図１３Ａは、ＶＥＧＦ結合活性が、アフリベルセプト（配列番号６５）または一本鎖（ｓｃ）ラニビズマブ（配列番号６７、６９、および７０）発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地では検出されたが、ＧＦＰ発現ベクターで模擬トランスフェクトまたはトランスフェクトしたものからは検出されなかったことを示す。図１３Ｂは、ＶＥＧＦ結合活性が、アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ１（配列番号６９）、またはブロルシズマブ（配列番号７４）発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地では検出されたが、ＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトしたものからは検出されなかったことを示す。ブロルシズマブによるシグナルは非常に低く、これは検出抗体による認識不良に起因する可能性が高い。誤差バーは、四連のトランスフェクションウェルの標準偏差を表す。 図１３Ａおよび図１３Ｂは、ＶＥＧＦに結合するタンパク質を検出するためのＥＬＩＳＡの結果を示す。図１３Ａは、ＶＥＧＦ結合活性が、アフリベルセプト（配列番号６５）または一本鎖（ｓｃ）ラニビズマブ（配列番号６７、６９、および７０）発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地では検出されたが、ＧＦＰ発現ベクターで模擬トランスフェクトまたはトランスフェクトしたものからは検出されなかったことを示す。図１３Ｂは、ＶＥＧＦ結合活性が、アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ１（配列番号６９）、またはブロルシズマブ（配列番号７４）発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地では検出されたが、ＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトしたものからは検出されなかったことを示す。ブロルシズマブによるシグナルは非常に低く、これは検出抗体による認識不良に起因する可能性が高い。誤差バーは、四連のトランスフェクションウェルの標準偏差を表す。 図１４Ａおよび図１４Ｂは、抗ＶＥＧＦ構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地の代表的なウエスタンブロットを提供する。図１４Ａは、アフリベルセプト（配列番号６５）またはｓｃ－ラニビズマブ（配列番号６７、６９、および７０）発現プラスミドを示す。臨床Ｅｙｌｅａおよびアフリベルセプト試料の両方を還元して、５８ｋＤの見かけ上の分子質量（グリコシル化を含む）の二量体の半分を分離する。臨床Ｌｕｃｅｎｔｉｓは２４ｋＤの別個の軽鎖および重鎖に還元されるが、ｓｃ－ラニビズマブタンパク質は分離されず、約４８ｋＤで移行する。ＥＬＩＳＡを通して得られるタンパク質定量化と一貫して、タンパク質のＨＬ形態と比較して、より多くの量のタンパク質のＬＨ形態が存在する。図１４Ｂは、アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ１（配列番号６９）、またはブロルシズマブ（配列番号７４）発現プラスミドを示す。ブロルシズマブによるシグナルは低く、これは検出抗体による認識不良に起因する可能性が高い。タンパク質は、２６ｋＤの正しい分子量で移行する。模擬トランスフェクションまたはＧＦＰ陰性対照試料のいずれにも、シグナルは存在しなかった。 図１４Ａおよび図１４Ｂは、抗ＶＥＧＦ構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地の代表的なウエスタンブロットを提供する。図１４Ａは、アフリベルセプト（配列番号６５）またはｓｃ－ラニビズマブ（配列番号６７、６９、および７０）発現プラスミドを示す。臨床Ｅｙｌｅａおよびアフリベルセプト試料の両方を還元して、５８ｋＤの見かけ上の分子質量（グリコシル化を含む）の二量体の半分を分離する。臨床Ｌｕｃｅｎｔｉｓは２４ｋＤの別個の軽鎖および重鎖に還元されるが、ｓｃ－ラニビズマブタンパク質は分離されず、約４８ｋＤで移行する。ＥＬＩＳＡを通して得られるタンパク質定量化と一貫して、タンパク質のＨＬ形態と比較して、より多くの量のタンパク質のＬＨ形態が存在する。図１４Ｂは、アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ１（配列番号６９）、またはブロルシズマブ（配列番号７４）発現プラスミドを示す。ブロルシズマブによるシグナルは低く、これは検出抗体による認識不良に起因する可能性が高い。タンパク質は、２６ｋＤの正しい分子量で移行する。模擬トランスフェクションまたはＧＦＰ陰性対照試料のいずれにも、シグナルは存在しなかった。 図１５Ａおよび図１５Ｂは、抗ＶＥＧＦ構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地とともにインキュベートした後に遊離ＶＥＧＦを検出する、競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。図１５Ａは、アフリベルセプト（配列番号６５）またはｓｃ－ラニビズマブ（配列番号６７、６９、および７０）発現プラスミドを示す。トランスフェクトした試料由来の４つの抗ＶＥＧＦタンパク質の阻害曲線は、臨床比較タンパク質ＥｙｌｅａおよびＬｕｃｅｎｔｉｓと非常に類似していた。ｓｃ－ラニビズマブ変異体およびＬｕｃｅｎｔｉｓよりも、アフリベルセプトおよびＥｙｌｅａがＶＥＧＦに対してより強く競合した。ｓｃ－ラニビズマブの３つの形態は全て、ほぼ同一であった。図１５Ｂは、アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ１（配列番号６９）、またはブロルシズマブ（配列番号７４）発現プラスミドを示す。ＧＦＰ陰性対照試料からは、競合活性はなかった。誤差バーは、二連のトランスフェクションウェルの標準偏差を表す。 図１５Ａおよび図１５Ｂは、抗ＶＥＧＦ構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地とともにインキュベートした後に遊離ＶＥＧＦを検出する、競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。図１５Ａは、アフリベルセプト（配列番号６５）またはｓｃ－ラニビズマブ（配列番号６７、６９、および７０）発現プラスミドを示す。トランスフェクトした試料由来の４つの抗ＶＥＧＦタンパク質の阻害曲線は、臨床比較タンパク質ＥｙｌｅａおよびＬｕｃｅｎｔｉｓと非常に類似していた。ｓｃ－ラニビズマブ変異体およびＬｕｃｅｎｔｉｓよりも、アフリベルセプトおよびＥｙｌｅａがＶＥＧＦに対してより強く競合した。ｓｃ－ラニビズマブの３つの形態は全て、ほぼ同一であった。図１５Ｂは、アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ１（配列番号６９）、またはブロルシズマブ（配列番号７４）発現プラスミドを示す。ＧＦＰ陰性対照試料からは、競合活性はなかった。誤差バーは、二連のトランスフェクションウェルの標準偏差を表す。 細胞ＶＥＧＦ中和アッセイの結果を示す。アッセイは、ＶＥＧＦ結合時に活性ベータ－ガラクトシダーゼを産生する、ＶＥＧＦ受容体／ベータ－ガラクトシダーゼ融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞を使用する。細胞を、ＶＥＧＦと、アフリベルセプト（配列番号６５）またはｓｃ－ラニビズマブ（配列番号６９）発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の様々な希釈度の培地との混合物とともにインキュベートする。トランスフェクトした試料由来の抗ＶＥＧＦタンパク質の阻害曲線は、抗ＶＥＧＦタンパク質が臨床比較タンパク質と同等のレベルでＶＥＧＦ活性を中和することを実証している。誤差バーは、二連のアッセイウェルの標準偏差を表す。 図１７Ａおよび図１７Ｂは、抗ＶＥＧＦプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の等体積の培地で行った、細胞ＶＥＧＦ中和アッセイの結果を示す。図１７Ａは、ＧＦＰ、アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブＨＬ（配列番号６７）、またはｓｃ－ラニビズマブＬＨ１（配列番号６９）発現プラスミドを示す。評価した全ての抗ＶＥＧＦ構築物が、ＶＥＧＦを中和した。図１７Ｂは、ＧＦＰ、アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ１（配列番号６９）、およびはブロルシズマブ（配列番号７４）発現プラスミドを示す。評価した全ての抗ＶＥＧＦ構築物が、ＶＥＧＦを中和した。アッセイした希釈度において、ＧＦＰ対照試料からわずかなマトリックス効果が存在した。誤差バーは、二連のトランスフェクションウェルの標準偏差を表す。 図１７Ａおよび図１７Ｂは、抗ＶＥＧＦプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の等体積の培地で行った、細胞ＶＥＧＦ中和アッセイの結果を示す。図１７Ａは、ＧＦＰ、アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブＨＬ（配列番号６７）、またはｓｃ－ラニビズマブＬＨ１（配列番号６９）発現プラスミドを示す。評価した全ての抗ＶＥＧＦ構築物が、ＶＥＧＦを中和した。図１７Ｂは、ＧＦＰ、アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ１（配列番号６９）、およびはブロルシズマブ（配列番号７４）発現プラスミドを示す。評価した全ての抗ＶＥＧＦ構築物が、ＶＥＧＦを中和した。アッセイした希釈度において、ＧＦＰ対照試料からわずかなマトリックス効果が存在した。誤差バーは、二連のトランスフェクションウェルの標準偏差を表す。 アフリベルセプト（配列番号６５）またはｓｃ－ラニビズマブ（配列番号６７、６９、および７０）発現プラスミドでトランスフェクトしたＲＰＥ細胞由来の培地中のＶＥＧＦを検出するためのＥＬＩＳＡの結果を示す。アフリベルセプト発現およびｓｃ－ラニビズマブ発現の両方によるＶＥＧＦレベルの低下が観察された。３つ全てのｓｃ－ラニビズマブ形態によるＶＥＧＦレベルへの影響は、類似していた。誤差バーは、四連のトランスフェクションウェルの標準偏差を表す。 アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブ（配列番号６７および６９）、またはブロルシズマブ（配列番号７４）導入遺伝子を発現するＲ１００キャプシド（配列番号４２として示されるアミノ酸配列を有する）で形質導入してから６または１０日後にＲＰＥ細胞から採取した培地中のＶＥＧＦを検出するためのＥＬＩＳＡの結果を示す。ＧＦＰ対照ベクターで形質導入された細胞によって示されるＶＥＧＦの内因性レベルは、４，５００～８，３００ｐｇ／ｍｌであった。抗ＶＥＧＦベクターの全てによる形質導入は、検出不能なレベルの培地中のＶＥＧＦをもたらした。誤差バーは、四連の形質導入ウェルの標準偏差を表す。 抗ＶＥＧＦ導入遺伝子を発現するＲ１００キャプシド（配列番号４２として示されるアミノ酸配列を有する）で形質導入してから６または１０日後にＲＰＥ細胞から採取した培地中のＶＥＧＦに結合するタンパク質を検出するためのＥＬＩＳＡの結果を示す。ＶＥＧＦ結合活性が、アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブ（配列番号６７および６９）、またはブロルシズマブ（配列番号７４）発現ベクターで形質導入された細胞由来の培地では検出されたが、ＧＦＰ発現ベクターで形質導入されたものからは検出されなかった。ブロルシズマブによるシグナルは非常に低く、これは検出抗体による認識不良に起因する可能性が高い。誤差バーは、四連の形質導入ウェルの標準偏差を表す。 抗ＶＥＧＦ導入遺伝子を発現するＲ１００キャプシド（配列番号４２として示されるアミノ酸配列を有する）で形質導入してから６または１０日後にＲＰＥ細胞から採取した培地の代表的なウエスタンブロットを提供する。臨床Ｅｙｌｅａおよびアフリベルセプト（配列番号６５）試料の両方を還元して、黒色の矢印によって示されるように、６０ｋＤの見かけ上の分子量（グリコシル化を含む）の二量体の半分を分離する。ＧＦＰ陰性対照試料中には、正しい移動度のバンドは存在しなかった。臨床Ｌｕｃｅｎｔｉｓは２４ｋＤの別個の軽鎖および重鎖に還元されるが、ｓｃ－ラニビズマブＨＬおよびＬＨ（配列番号６７および６９）は分離されず、灰色の矢印によって示されるように、５８ｋＤの見かけ上の分子質量で移行する。ブロルシズマブ（配列番号７４）によるシグナルは低く、これは検出抗体による認識不良に起因する可能性が高い。タンパク質は、点線矢印によって示されるように、２６ｋＤの正しい分子質量で移行する。 抗ＶＥＧＦ導入遺伝子を発現するＲ１００キャプシド（配列番号４２として示されるアミノ酸配列を有する）で形質導入してから６または１０日後にＲＰＥ細胞から採取した培地とともにインキュベートした後に遊離ＶＥＧＦを検出するための競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。全ての抗ＶＥＧＦ構築物が、ＶＥＧＦについて競合した。ＧＦＰ陰性対照試料からは、競合活性はなかった。遊離ＶＥＧＦレベルは、これはＲＰＥ細胞によって産生される内因性ＶＥＧＦに起因して、最低の希釈度においてより高い。誤差バーは、二連のアッセイウェルの標準偏差を表す。 抗ＶＥＧＦ導入遺伝子を発現するＲ１００キャプシド（配列番号４２として示されるアミノ酸配列を有する）で形質導入してから６日後にＲＰＥ細胞から採取した培地で行った、細胞ＶＥＧＦ中和アッセイの結果を示す。評価した全ての抗ＶＥＧＦ構築物が、ＶＥＧＦを中和した。ＧＦＰ対照形質導入由来の培地では、ＶＥＧＦ中和は観察されなかった。誤差バーは、二連のアッセイウェルの標準偏差を表す。
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学用語および技術用語は、この技術が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
アデノ随伴ウイルスは、エンベロープを有しない２０面体キャプシド内の４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムからなる非病原性パルボウイルスである。このゲノムは、複製およびパッケージングシグナルのウイルス起源として機能する逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する３つの翻訳領域（ＯＲＦ）を含む。ｒｅｐ ＯＲＦは、ウイルス複製、転写調節、部位特異的組み込み、およびビリオン組み立てにおいて役割を果たす４つの非構造タンパク質をコードする。ｃａｐ ＯＲＦは、６０量体のウイルスキャプシドを形成するように組み立てられる３つの構造タンパク質（ＶＰ１～３）をコードする。最後に、ｃａｐ遺伝子内の代替読み枠として存在するＯＲＦは、ＡＡＶキャプシドタンパク質を核小体に局在させ、キャプシド組み立てプロセスにおいて機能するウイルスタンパク質である、組み立て活性化タンパク質（ＡＡＰ）を産生する。
いくつかの天然に存在する（「野生型」）血清型、および１００個以上のＡＡＶの既知の変異体が存在し、その各々が、特にキャプシドタンパク質の超可変領域内のアミノ酸配列、したがってその遺伝子送達特性において異なる。ＡＡＶはいずれのヒト疾患にも関連していないため、組換えＡＡＶは臨床用途にとって魅力的である。
本明細書の開示の目的のために、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの略称であり、ウイルス自体およびその誘導体を含むが、これらに限定されない。別途示されない限り、この用語は、全てのサブタイプまたは血清型ならびに複製可能形態および組換え形態の両方を指す。「ＡＡＶ」という用語には、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ－１またはＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ－２またはＡＡＶ２）、３Ａ型ＡＡＶ（ＡＡＶ－３ＡまたはＡＡＶ３Ａ）、３Ｂ型ＡＡＶ（ＡＡＶ－３ＢまたはＡＡＶ３Ｂ）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ－４またはＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ－５またはＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ－６またはＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ－７またはＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ－８またはＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ－９またはＡＡＶ９）、１０型ＡＡＶ（ＡＡＶ－１０またはＡＡＶ１０またはＡＡＶｒｈ１０）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶが含まれるが、これらに限定されない。「霊長類ＡＡＶ」は霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」はウシ哺乳動物に感染するＡＡＶを指す。
ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、ならびに天然末端反復配列（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当該技術分野で既知である。そのような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースに見出すことができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７．１（ＡＡＶ１）、ＡＦ０６３４９７．１（ＡＡＶ１）、ＮＣ＿００１４０１．２（ＡＡＶ２）、ＡＦ０４３３０３．１（ＡＡＶ２）、Ｊ０１９０１．１（ＡＡＶ２）、Ｕ４８７０４．１（ＡＡＶ３Ａ）、ＮＣ＿００１７２９．１（ＡＡＶ３Ａ）、ＡＦ０２８７０５．１（ＡＡＶ３Ｂ）、ＮＣ＿００１８２９．１（ＡＡＶ４）、Ｕ８９７９０．１（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２．１（ＡＡ５）、ＡＦ０８５７１６．１（ＡＡＶ－５）、ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ＿００６２６０．１（ＡＡＶ７）、ＡＦ５１３８５１．１（ＡＡＶ７）、ＡＦ５１３８５２．１（ＡＡＶ８）ＮＣ＿００６２６１．１（ＡＡＶ－８）、ＡＹ５３０５７９．１（ＡＡＶ９）、ＡＡＴ４６３３７（ＡＡＶ１０）、およびＡＡＯ８８２０８（ＡＡＶｒｈ１０）を参照されたい。これらの開示は、ＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列の教示について、参照により本明細書に組み込まれる。また、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４５：５５５、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７１：６８２３、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ ｅｔ． ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１１８５４、Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３３：３７５－３８３、国際特許公開第ＷＯ００／２８０６１号、同第ＷＯ９９／６１６０１号、同第ＷＯ９８／１１２４４号、および米国特許第６，１５６，３０３号を参照されたい。
ＡＡＶ血清型に関連する天然に存在するｃａｐ（キャプシド）タンパク質の配列は、当該技術分野で既知であり、ＡＡＶ１（配列番号１）、ＡＡＶ２（配列番号２）、ＡＡＶ３Ａ（配列番号３）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番号４）、ＡＡＶ４（配列番号５）、ＡＡＶ５（配列番号６）、ＡＡＶ６（配列番号７）、ＡＡＶ７（配列番号８）、ＡＡＶ８（配列番号９）、ＡＡＶ９（配列番号１０）、ＡＡＶ１０（配列番号１１）、およびＡＡＶｒｈ１０（配列番号１２）として本明細書に開示されるものを含む。「変異ＡＡＶキャプシドタンパク質」または「ＡＡＶ変異体」という用語は、天然に存在するまたは「野生型」ＡＡＶキャプシドタンパク質配列、例えば、本明細書において配列番号１～１２に示されるものに対して、少なくとも１つの修飾または置換（欠失、挿入、点変異などを含む）を含むアミノ酸配列を含む、ＡＡＶキャプシドタンパク質を指す。変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して約８０％の同一性、例えば、野生型キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、または９５％以上の同一性、例えば、野生型キャプシドタンパク質に対して９８％または９９％の同一性を有し得る。変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型キャプシドタンパク質ではない場合がある。
本明細書の開示の目的のために、「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質およびキャプシド形成したＡＡＶポリヌクレオチドからなる、ウイルス粒子を指す。
本明細書の開示の目的のために、「ｒＡＡＶ」という用語は、組換えアデノ随伴ウイルスを指す略称である。ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限、またはライゲーションステップ、および天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の様々な組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。これらの用語は、それぞれ、元のポリヌクレオチド構築物の複製物および元のウイルス構築物の子孫を含む。
「ｒＡＡＶベクター」という用語は、定義上ｒＡＡＶポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶビリオン（すなわち、ｒＡＡＶウイルス粒子）（例えば、感染性ｒＡＡＶビリオン）を包含し、また、ｒＡＡＶをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｒＡＡＶをコードする一本鎖ポリヌクレオチド（ｓｓ－ｒＡＡＶ）、ｒＡＡＶをコードする二本鎖ポリヌクレオチド（ｄｓ－ｒＡＡＶ）、例えばｒＡＡＶをコードするプラスミドなど）も包含する。
ＡＡＶビリオンは、異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、標的細胞に送達される導入遺伝子、標的細胞に送達されるＲＮＡｉ剤またはＣＲＩＳＰＲ剤など）を含む場合、典型的には、「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオン」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」と称される。一般に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、一般には２つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。
「パッケージング」という用語は、ＡＡＶ粒子の組み立ておよびキャプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製およびキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書ではＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称される。
ＡＡＶに関する「ヘルパーウイルス」という用語は、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）の哺乳動物細胞による複製およびパッケージングを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス（ワクシニアなど）を含む、ＡＡＶに関するそのような多様なヘルパーウイルスが、当該技術分野で既知である。サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用されるが、アデノウイルスはいくつかの異なるサブグループを包含する。ヒト、非ヒト哺乳動物、およびトリ由来の多数のアデノウイルスが知られており、ＡＴＣＣなどの預託機関から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が含まれ、これらもＡＴＣＣなどの預託機関から入手可能である。
「ヘルパーウイルス機能（複数可）」という用語は、（本明細書に記載の複製およびパッケージングのための他の要件と併せて）ＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする、ヘルパーウイルスゲノムにコードされた機能（複数可）を指す。本明細書に記載されるように、「ヘルパーウイルス機能」は、トランスの産生細胞に、ヘルパーウイルスを提供すること、または例えば、必要な機能（複数可）をコードするポリヌクレオチド配列を提供することを含む、いくつかの方法で提供され得る。例えば、１つ以上のアデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたは他の発現ベクターを、ｒＡＡＶベクターとともに産生細胞にトランスフェクトする。
「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子という用語は、コンピテントに組み立てられたキャプシドを含み、かつそのウイルス種が向性である細胞にポリヌクレオチド構成成分を送達することができるものである。この用語は、ウイルスの任意の複製能力を必ずしも意味するものではない。感染性ウイルス粒子を計数するためのアッセイは、本開示の他箇所および当該技術分野において説明されている。ウイルス感染性は、感染性ウイルス粒子対全ウイルス粒子の比として表すことができる。感染性ウイルス粒子対全ウイルス粒子の比を決定する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｇｒａｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：Ｓ３３７（ＴＣＩＤ５０感染性価アッセイを説明する）、およびＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９７３を参照されたい。実施例も参照されたい。
本明細書で使用される場合、「向性」という用語は、特定の宿主種の細胞または宿主種内の特定の細胞型のウイルス（例えば、ＡＡＶ）による優先的な標的化を指す。例えば、心臓、肺、肝臓、および筋肉の細胞に感染することができるウイルスは、肺細胞および筋肉細胞のみに感染することができるウイルスと比較して、より広範な（すなわち、増加した）向性を有する。向性はまた、宿主の特定の種類の細胞表面分子に対するウイルスの依存性を含み得る。例えば、いくつかのウイルスは、表面グリコサミノグリカンを有する細胞のみに感染することができる一方、他のウイルスは、シアル酸を有する細胞のみに感染することができる（そのような依存性は、ウイルス感染の潜在的な宿主細胞として特定のクラスの分子を欠く様々な細胞株を使用して試験することができる）。いくつかの事例では、ウイルスの向性は、ウイルスの相対的選好を説明する。例えば、第１のウイルスは、全ての細胞型に感染することができる可能性があるが、表面グリコサミノグリカンを有する細胞を感染させる上ではるかに大きな成功を収める。第２のウイルスも同じ特徴を選好する場合（例えば、第２のウイルスも、表面グリコサミノグリカンを有する細胞を感染させる上でより大きな成功を収める場合）、絶対的形質導入効率は類似していないとしても、第２のウイルスは、第１のウイルスと類似の（または同一の）向性を有するとみなすことができる。例えば、第２のウイルスは、試験した全ての所定の細胞型を感染させる上で、第１のウイルスよりも効率的である可能性があるが、相対的選好が類似している（または同一である）場合、第２のウイルスは、依然として第１のウイルスと類似の（または同一の）向性を有するとみなすことができる。いくつかの実施形態では、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むビリオンの向性は、天然に存在するビリオンと比較して、改変されていない。いくつかの実施形態では、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むビリオンの向性は、天然に存在するビリオンと比較して、拡大されている（すなわち、広範になっている）。いくつかの実施形態では、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むビリオンの向性は、天然に存在するビリオンと比較して、低下している。
「複製コンピテントな」ウイルス（例えば、複製コンピテントなＡＡＶ）という用語は、感染性であり、また感染した細胞内で（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で）複製されることができる、表現型的に野生型のウイルスを指す。ＡＡＶの場合、複製コンピテンスは一般に、機能的ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。一般に、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子の欠如のために、哺乳動物細胞（特にヒト細胞）内で複製不能である。典型的には、そのようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング遺伝子と移入されるｒＡＡＶベクターとの間の組換えによって複製コンピテントなＡＡＶが生成される可能性を最小化するために、一切のＡＡＶパッケージング遺伝子配列を欠如している。多くの実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター調製物は、あったとしてもわずかな複製コンピテントなＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ、ＲＣＡとも称される）をほとんど含まないものである（例えば、ｒＡＡＶ粒子１０２個当たり約１個未満のｒｃＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子１０４個当たり約１個未満のｒｃＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子１０個当たり約１個未満のｒｃＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子１０１２個当たり約１個未満のｒｃＡＡＶ、またはｒｃＡＡＶなし）。
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはその類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドの多量体形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチドを含んでもよく、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書で使用される場合、二本鎖および一本鎖分子を同義に指す。別途特定されない限り、または必要とされない限り、ポリヌクレオチドを含む本明細書の任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態を構成することが既知であるかまたは予測される２つの相補的一本鎖形態の各々の両方を包含する。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定の「配列同一性」パーセントを有し、これは、整列したときに、これらの２つの配列を比較すると、塩基またはアミノ酸のパーセンテージが同じであることを意味する。配列類似性は、いくつかの異なる様式で決定することができる。配列同一性を決定するために、配列は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／のウェブ上で入手可能なＢＬＡＳＴを含む方法およびコンピュータープログラムを使用して整列させることができる。他のアラインメントアルゴリズムは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．の完全所有子会社であるＭａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージで利用可能なＦＡＳＴＡである。アラインメントのための他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｈａｒｃｏｕｒｔ
Ｂｒａｃｅ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡの一部門）に記載されている。特に興味深いのは、配列内のギャップを許容するアライメントプログラムである。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アライメントにおけるギャップを許容するアルゴリズムの一種である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３－１８７（１９９７）を参照されたい。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアラインメント法を使用したＧＡＰプログラムを利用して、配列を整列させることができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３（１９７０）を参照されたい。
「遺伝子」という用語は、細胞内で何らかの機能を果たすポリヌクレオチドを指す。例えば、遺伝子は、遺伝子産物をコードすることができる翻訳領域を含み得る。遺伝子産物の一例は、遺伝子から転写され翻訳されるタンパク質である。遺伝子産物の別の例は、転写されているが翻訳されていないＲＮＡ、例えば、機能的ＲＮＡ産物、例えば、アプタマー、干渉ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ヌクレアーゼのためのガイドＲＮＡなどである。
「遺伝子発現産物」または「遺伝子産物」という用語は、上記に定義した特定の遺伝子の発現から生じる分子である。遺伝子発現産物には、例えば、ポリペプチド、アプタマー、干渉ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）などが含まれる。
「ｓｉＲＮＡ剤」（「低分子干渉」もしくは「短鎖干渉ＲＮＡ」（またはｓｉＲＮＡ））は、遺伝子目的（「標的遺伝子」）に標的化されるヌクレオチドのＲＮＡ二重鎖である。「ＲＮＡ二重鎖」は、ＲＮＡ分子の２つの領域間の相補的対形成によって形成され、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の領域を形成する構造を指す。ｓｉＲＮＡの二重鎖部分のヌクレオチド配列が標的化遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるという点で、ｓｉＲＮＡは遺伝子に「標的化」される。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖の長さは、３０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、二重鎖は、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖の長さは、１９～２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子標的化は、ＤＮＡ構築物を利用して動物細胞の内因性ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を活性化する遺伝子サイレンシング技術である、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）の使用によって達成される。そのようなＤＮＡ構築物は、処理されると、標的遺伝子（複数可）のサイレンシングを引き起こす、自己相補的な二本鎖ＲＮＡ、典型的には短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するように設計される。内因性ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡを含むいずれのＲＮＡも、所望のｍＲＮＡ標的に相補的な二本鎖ＲＮＡを発現する構築物を設計することによってサイレンシングされ得る。したがって、ｓｉＲＮＡ剤のＲＮＡ二本鎖部分は、ｓｈＲＮＡと称される短鎖ヘアピン構造の一部であり得る。二重鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二本鎖を形成する２つの配列の間に位置するループ部分を含んでもよい。ループの長さは、変化し得る。いくつかの実施形態では、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３ヌクレオチド長である。ヘアピン構造は、３’突出部分または５’突出部分も含み得る。いくつかの実施形態では、突出部分は、０、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長の３’または５’突出である。一般に、標的遺伝子の発現産物（例えば、ｍＲＮＡ、ポリペプチドなど）のレベルは、５’非翻訳（ＵＴ）領域、ＯＲＦ、または３’ＵＴ領域を含む、標的遺伝子転写産物の少なくとも１９～２５ヌクレオチド長のセグメント（例えば、２０～２１ヌクレオチド配列）に相補的である特定の二本鎖ヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）によって低下する。いくつかの実施形態では、短鎖干渉ＲＮＡは、約１９～２５ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡ技術の説明については、例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／８９３０４、ＷＯ０２／１６６２０、およびＷＯ０２／２９８５８、ならびに米国特許出願公開第２００４／００２３３９０号を参照されたい。ｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡは、核酸配列によってコードされてもよく、この核酸配列はまた、プロモーターを含んでもよい。核酸配列はまた、ポリアデニル化シグナルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、合成最小ポリアデニル化シグナルである。
「アンチセンスＲＮＡ」という用語は、遺伝子発現産物に相補的なＲＮＡを包含する。例えば、特定のｍＲＮＡに標的化されるアンチセンスＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡのｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションがｍＲＮＡの発現を改変する（例えば、ＲＮＡの安定性を改変すること、ＲＮＡの翻訳を改変することなどを介して）、ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡベースの作用物質である（か、または修飾ＲＮＡであり得る）。「アンチセンスＲＮＡ」には、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸も含まれる。
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９剤」に関して、「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用して、侵入してくる核酸のサイレンシングをガイドすることにより、ウイルスおよびプラスミドに対する適応免疫を細菌および古細菌に提供するように進化した、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムを包含する。Ｃａｓ９タンパク質（またはその機能的等価物および／もしくは変異体、すなわち、Ｃａｓ９様タンパク質）は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる２つの天然に存在するかまたは合成のＲＮＡ分子（ガイドＲＮＡとも呼ばれる）とのタンパク質の会合に依存する、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を天然に含む。いくつかの事例では、２つの分子が共有結合して、単一分子（単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）とも呼ばれる）を形成する。したがって、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質を活性化し、タンパク質を標的核酸配列にガイドする、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（この用語は、二分子ガイドＲＮＡ構成および単一分子ガイドＲＮＡ構成の両方を包含する）と会合する。
Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質がその天然の酵素機能を保持する場合、それは、標的ＤＮＡを切断して、ゲノムの改変（すなわち、編集：欠失、挿入（ドナーポリヌクレオチドが存在する場合）、置換など）をもたらすことができる二本鎖破断を創出し、それによって遺伝子発現を改変する。Ｃａｓ９のいくつかの変異体（この変異体は、Ｃａｓ９様という用語によって包含される）は、ＤＮＡ切断活性が低下するように改変されている（いくつかの事例では、それらは、標的ＤＮＡの両方の鎖の代わりに単一の鎖を切断するが、他の事例では、それらは、ＤＮＡ切断活性がなくなるまで著しく縮小している）。ＤＮＡ切断活性が減少した（さらにはＤＮＡ切断活性がない）Ｃａｓ９様タンパク質は、それでも標的ＤＮＡにガイドされて、ＲＮＡポリメラーゼ活性を阻止し得る。あるいは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、ＶＰ６４転写活性化ドメインをＣａｓ９タンパク質に融合させ、融合タンパク質をテトラループおよびステムループでＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１ヘルパータンパク質およびＭＳ２ ＲＮＡアプタマーを含む単一ガイドＲＮＡとともに共同輸送して、転写を活性化する細胞内に相乗活性化メディエーター（Ｃａｓ９－ＳＡＭ）複合体を形成させることによって、修飾されてもよい。したがって、酵素的に不活性なＣａｓ９様タンパク質は、標的ＤＮＡの転写を阻止または活性化するために、ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって標的ＤＮＡ中の特定の位置を標的化することができる。本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９剤」という用語は、上記のような、または当該技術分野で既知であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の全ての形態を包含する。
ＣＲＩＳＰＲ剤に関する詳細な情報は、例えば、（ａ）Ｊｉｎｅｋ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２Ａｕｇ１７；３３７（６０９６）：８１６－２１：”Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ”、（ｂ）Ｑｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３Ｆｅｂ２８；１５２（５）：１１７３－８３：”Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”、ならびに（ｃ）米国特許出願第１３／８４２，８５９号およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３２５８９に見出すことができ、これらの全ての全体が、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ剤」という用語は、Ｃａｓ９系システム（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質；ＤＮＡ標的化ＲＮＡの任意の構成成分、例えば、ｃｒＲＮＡ様ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ様ＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡなど；ドナーポリヌクレオチドなど）において使用することができる、天然に存在する配列および／または合成配列を含む、任意の作用物質（またはそのような作用物質をコードする核酸）を包含する。
「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼを意味する。ＺＦＮは、所望のＤＮＡ配列を標的化するように操作することができ、これによりジンクフィンガーヌクレアーゼが固有の標的配列を切断することが可能になる。細胞に導入された場合、ＺＦＮを使用して、二本鎖破断を誘導することにより、細胞（例えば、細胞のゲノム）内の標的ＤＮＡを編集することができる。ＺＦＮの使用に関するさらなる詳細については、例えば、Ａｓｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１２Ｆｅｂ；２０（２）：３２９－３８、Ｂｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３Ｍａｙ２；３００（５６２０）：７６４、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１１Ｊｕｌ１５；３３３（６０４０）：３０７、Ｏｃｈｉａｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２０１０Ａｕｇ；１５（８）：８７５－８５、Ｔａｋａｓｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１０Ｏｃｔ；４０（１０）：７５９－６５、Ｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ２００８Ｓｕｍｍｅｒ；５（２）：１２１－３、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１Ａｐｒ２６；１０８（１７）：７０５２－７、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１０Ｍａｒ５；１４０（５）：６７８－９１、Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９Ｊｕｌ２４；３２５（５９３９）：４３３、Ｆｌｉｓｉｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（６）：ｅ２１０４５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２１０４５．Ｅｐｕｂ２０１１Ｊｕｎ１３、Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１Ｊｕｌ１９；１０８（２９）：１２０１３－７、およびＹｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１１Ｎｏｖ；２１（ｌ１）：１６３８－４０を参照されたい。これらの全ては、ＺＦＮに関連するそれらの教示について、参照により本明細書に組み込まれる。「ＺＦＮ剤」という用語は、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよび／またはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」または「ＴＡＬＥＮ」剤という用語は、ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって生成される人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を指す。ＴＡＬＥＮは、事実上いずれの所望のＤＮＡ配列にも結合するように迅速に操作することができ、細胞に導入された場合、ＴＡＬＥＮを使用して、二本鎖破断を誘導することによって細胞内の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集することができる。ＴＡＬＥＮの使用に関するさらなる情報については、例えば、Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１Ｊｕｌ７；２９（８）：７３１－４、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１１Ｊｕｌ１５；３３３（６０４０）：３０７、Ｔｅｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１Ａｕｇ５；２９（８）：６９５－６、およびＨｕａｎｇ
ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１Ａｕｇ５；２９（８）：６９９－７００を参照されたい。これらの全ては、ＴＡＬＥＮに関連するそれらの教示について、参照により本明細書に組み込まれる。「ＴＡＬＥＮ剤」という用語は、ＴＡＬＥＮおよび／またはＴＡＬＥＮをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
「制御要素」または「制御配列」という用語は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列を指す。この調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を及ぼす可能性があり、性質が増強性または阻害性である可能性がある。当該技術分野で既知の制御要素には、例えば、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列が含まれる。プロモーターは、ある特定の条件下では、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、通常はプロモーターの下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。プロモーターは、普遍的作用性、すなわち、多くの細胞型において活性、例えば、ＣＡＧまたはＣＭＶプロモーターであってもよく、または組織もしくは細胞特異性、例えば、桿体で活性なｒｈｏプロモーター、または錐体で活性なオプシンプロモーターであってもよい。
「作動的に連結された」または「作動可能に連結された」という用語は、遺伝要素の並置を指し、要素は、それらが予想される様式で作動することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を助ける場合、プロモーターはコード領域に作動可能に連結されている。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在残基が存在してもよい。
「発現ベクター」という用語は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド領域を含むベクターを包含し、意図された標的細胞内でのタンパク質の発現をもたらすために使用される。発現ベクターはまた、標的中のタンパク質の発現を促進するために、コード領域に作動可能に連結された制御要素を含んでもよい。制御要素と、それらが発現のために作動可能に連結されている遺伝子（複数可）との組み合わせは、「発現カセット」と呼ばれることもあり、その多くは、当該技術分野で既知かつ入手可能であるか、または当該技術分野で入手可能な構成要素から容易に構築することができる。
「異種」という用語は、それが比較されている残りの実体とは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子操作技術によって異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。天然コード配列から除去され、天然には結合していないコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸配列を含むｒＡＡＶは、天然に存在する野生型ＡＡＶに通常は含まれないポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶであり、コードされた異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型ＡＡＶによって通常はコードされない遺伝子産物である。
「遺伝子改変」および「遺伝子修飾」（ならびにその文法上の変化形）は、遺伝要素（例えば、ポリヌクレオチド）が有糸分裂または減数分裂以外によって細胞に導入されるプロセスを指すように本明細書では同義に使用される。要素は、細胞に対して異種であってもよく、またはそれは、細胞に既に存在する要素の追加のコピーまたは改善バージョンであってもよい。遺伝子改変は、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、またはポリヌクレオチド－リポソーム複合体との接触などの、当該技術分野で既知である任意のプロセスによって、細胞を組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることによってもたらすことができる。遺伝子改変はまた、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスまたはウイルスベクターを用いた形質導入または感染によってもたらすことができる。一般に、遺伝要素は、細胞内の染色体またはミニ染色体に導入されるが、この用語には、細胞およびその子孫の表現型および／または遺伝子型を変化させる任意の改変が含まれる。
細胞修飾に関して、外因性ＤＮＡによって（例えば、組換えウイルスを介して）「遺伝子修飾された」または「形質転換された」または「トランスフェクトされた」または「形質導入された」という用語は、そのようなＤＮＡが細胞の内部に導入される場合を指す。外因性ＤＮＡの存在により、永続的または一時的な遺伝子変化がもたらされる。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれる（共有結合している）場合もそうでない場合もある。「クローン」は、有糸分裂によって単一細胞または共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」は、多くの世代にわたってインビトロで安定して増殖することができる初代細胞のクローンである。
本明細書で使用される場合、配列がインビトロでの延長した細胞培養中および／またはインビボで長期間その機能を果たすために利用可能である場合、細胞は遺伝子配列によって「安定して」改変、形質導入、遺伝子修飾、または形質転換されると言われる。一般に、そのような細胞は、改変された細胞の子孫によっても継承可能である遺伝子改変が導入されるという点で、「遺伝的に」改変（遺伝子修飾）される。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すように本明細書では同義に使用される。これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、または標識化成分との抱合も包含する。哺乳動物対象に遺伝子産物を送達する観点から考察される場合、抗血管新生ポリペプチド、神経保護ポリペプチドなどのポリペプチド、およびそのための組成物は、それぞれのインタクトなポリペプチド、またはインタクトなタンパク質の所望の生化学的機能を保持するその任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体を指す。同様に、抗血管新生ポリペプチドをコードする核酸、神経保護ポリペプチドをコードする核酸、および哺乳動物対象への遺伝子産物の送達に使用するための他のそのような核酸（レシピエント細胞に送達されることになる「導入遺伝子」と称されることもある）への言及は、インタクトなポリペプチドまたは所望の生化学的機能を保有する任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、「単離された」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞、タンパク質、または他の物質は、物質または類似の物質が天然に存在するか、または最初に調製される、存在し得る他の構成成分の少なくともいくつかが欠如した物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、精製技術を使用して、それを源混合物から富化することによって調製されてもよい。濃縮は、溶液の体積当たりの重量などの絶対的な基準で測定することができ、または源混合物中に存在する干渉する可能性のある第２の物質との関連で測定することができる。本開示の実施形態のますますの濃縮は、ますますのさらなる単離である。単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞、または他の物質は、いくつかの実施形態では、例えば、約８０％～約９０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋、または少なくとも約９９％以上純粋に精製される。
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。この効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防する観点で予防的であり得、かつ／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用の部分的または完全な治癒の観点で治療的であり得る。本明細書で使用される場合、「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を網羅し、これには、（ａ）疾患（および／または疾患によって引き起こされる症状）が、疾患にかかりやすいかまたは疾患に罹患する危険性があるが、それを有するとまだ診断されていない対象において発生するのを予防すること、（ｂ）疾患（および／または疾患によって引き起こされる症状）を阻害すること、すなわち、その発症を停止させること、ならびに（ｃ）疾患（および／または疾患によって引き起こされる症状）を軽減すること、すなわち、疾患（および／または疾患によって引き起こされる症状）の退行を引き起こすこと、すなわち、疾患および／または疾患の１つ以上の症状を緩和することが含まれる。例えば、主題の組成物および方法は、網膜疾患の治療を対象とし得る。網膜疾患およびその治療を評価するための非限定的な例には、網膜の機能およびその変化、例えば、視力（例えば、最良矯正視力［ＢＣＶＡ］、歩行、ナビゲーション、物体検知、および識別）の変化、視野（例えば、静的および動的視野計測）の変化、臨床検査（例えば、前眼部および後眼部の細隙灯検査）、明暗の全波長に対する電気生理学的応答（例えば、あらゆる形態の網膜電図写真（ＥＲＧ）［全視野、多焦点、およびパターン］、あらゆる形態の視覚誘発電位（ＶＥＰ）、電気眼球図記録（ＥＯＧ）、色覚、暗順応、および／または対比感度）の測定；解剖学的測定および／または写真による測定、例えば、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）、眼底撮影、補償光学走査レーザー検眼鏡、蛍光法、および／または自己蛍光法を使用する生体構造または健康の変化の測定；眼球運動および眼の動き（例えば、眼振、凝視、選択、および安定性）の測定、報告された結果（患者報告による視覚および非視覚誘導挙動および活動の変化、患者報告結果［ＰＲＯ］、生活の質のアンケート評価、日常活動の測定、ならびに神経機能の測定（例えば、機能的磁気共鳴画像法（ＭＲＩ））が含まれる。
「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書では同義に使用され、ヒト；サルを含む非ヒト霊長類；哺乳動物の競技動物（例えば、ウマ）；哺乳動物の家畜（例えば、ヒツジ、ヤギなど）；哺乳動物の愛玩動物（イヌ、ネコなど）、および齧歯動物（例えば、マウス、ラットなど）を含むがこれらに限定されない、哺乳動物を指す。
いくつかの実施形態では、個体は、以前に自然にＡＡＶに曝露されており、その結果、抗ＡＡＶ抗体（すなわち、ＡＡＶ中和抗体）を保有するヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、以前にＡＡＶベクターを投与されており（その結果、抗ＡＡＶ抗体を保有し得る）、異なる病態の治療または同じ病態のさらなる治療のためにベクターの再投与を必要とするヒトである。このビヒクルに対する中和抗体によって影響される全ての組織、例えば、肝臓、筋肉、および網膜へのＡＡＶ遺伝子送達を伴う臨床試験における陽性結果に基づいて、そのような治療的用途／疾患標的が多数存在する。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与することができる。本開示の目的のために、有効量の化合物（例えば、感染性ｒＡＡＶビリオン）は、特定の病状（例えば、網膜疾患）（および／またはその病状と関連付けられる症状）の進行を、軽減、緩和、安定化、逆転、予防、減速、または遅延するのに十分な量である。したがって、有効量の感染性ｒＡＡＶビリオンは、異種核酸を個体の標的細胞（複数可）に効果的に送達することができる感染性ｒＡＡＶビリオンの量である。有効量は、当該技術分野において十分に理解されている技術、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、蛍光法、または他のレポーター読み出しなどを使用して、異種核酸配列によってコードされる遺伝子産物（ＲＮＡ、タンパク質）を細胞内または組織中で検出することによって、前臨床的に決定することができる。有効量は、本明細書に記載されているようにまたは当該技術分野で既知であるように、当該技術分野で既知の方法、例えば、眼底自発蛍光、フルオレセイン血管造影法、ＯＣＴ、微小視野計測、補償光学などを使用して、疾患の発症または進行の変化を検出することによって臨床的に決定されてもよい。
「網膜細胞」という用語は、本明細書では、網膜を構成する細胞型、例えば、非限定的に、網膜神経節（ＲＧ）細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、光受容細胞、ミュラーグリア細胞、ミクログリア細胞、および網膜色素上皮（ＲＰＥ）などのいずれかを指す。「光受容細胞」という用語は、本明細書では、非限定的に、桿体細胞または「桿体」および錐体細胞または「錐体」を指す。「ミュラー細胞」または「ミュラーグリア」という用語は、脊椎動物網膜のニューロンを支持するグリア細胞を指す。
「定向進化」という用語は、遺伝的多様化および選択プロセスの反復ラウンドを通して自然進化を模倣し、それによって生体分子の機能を漸進的に改善する有益な突然変異を蓄積する、インビトロおよび／またはインビボでのキャプシド操作方法論を指す。定向進化は、変異体が目的の細胞または組織型のより効率的なレベルの感染性を保有するライブラリからＡＡＶ変異体を選択するための「バイオパニング」と称されるインビボ法を伴うことが多い。
（詳細な説明）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、エンベロープを有しないキャプシドの内部に含まれる４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを有するパルボウイルスのファミリーである。天然に存在するＡＡＶのウイルスゲノムは、２つの主要な翻訳領域（ＯＲＦ）であるｒｅｐ（ウイルス複製、転写制御、部位特異的組み込み、およびビリオン組み立てにおいて機能を果たすコードタンパク質）ならびにｃａｐに隣接する、複製およびパッケージングシグナルのウイルス起源として機能する２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を有する。ｃａｐ ＯＲＦは、６０量体のウイルスキャプシドを形成するように組み立てられる３つの構造タンパク質をコードする。多くの天然に存在するＡＡＶ変異体および血清型が単離されており、いずれもヒト疾患に関連付けられていない。
ＡＡＶの組換え型は遺伝子送達ベクターとして使用することができ、この場合、目的のマーカー遺伝子または治療用遺伝子をｒｅｐおよびｃａｐの代わりにＩＴＲの間に挿入する。これらのベクターは、インビトロおよびインビボで分裂細胞および非分裂細胞の両方に形質導入することが示されており、有糸分裂後の組織内で何年も安定した導入遺伝子発現をもたらすことができる。例えば、Ｋｎｉｐｅ ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ ＰＭ．Ｆｉｅｌｄｓ’Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ，２００７、Ｇａｏ Ｇ－Ｐ，Ａｌｖｉｒａ ＭＲ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ Ｊ，Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ．Ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ２００２；９９：１１８５４－９、Ａｔｃｈｉｓｏｎ ＲＷ，Ｃａｓｔｏ ＢＣ，Ｈａｍｍｏｎ ＷＭ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ｖｉｒｕｓ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９６５；１４９：７５４－６、Ｈｏｇｇａｎ ＭＤ，Ｂｌａｃｋｌｏｗ ＮＲ，Ｒｏｗｅ ＷＰ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：ｐｈｙｓｉｃａｌ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１９６６；５５：１４６７－７４、Ｂｌａｃｋｌｏｗ ＮＲ，Ｈｏｇｇａｎ ＭＤ，Ｒｏｗｅ ＷＰ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｍａｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１９６７；５８：１４１０－５、Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ Ｕ，ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ Ｈ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｏｆ ａ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ
ｇｅｎｉｔａｌ ｓｉｔｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９８４；１３４：５２－６３、Ｍａｙｏｒ ＨＤ，Ｍｅｌｎｉｃｋ ＪＬ．Ｓｍａｌｌ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｖｉｒｕｓｅｓ（ｐｉｃｏｄｎａｖｉｒｕｓ ｇｒｏｕｐ）．Ｎａｔｕｒｅ１９６６；２１０：３３１－２、Ｍｏｒｉ Ｓ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｔ，Ｋａｎｄａ Ｔ．Ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ：ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２００４；３３０：３７５－８３、Ｆｌｏｔｔｅ ＴＲ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｒＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ２００４；１１：８０５－１０を参照されたい。
組換えＡＡＶ（本明細書では単に「ＡＡＶ」と称する）は、益々増えている臨床試験数において有望な結果をもたらしている。しかし、抗キャプシド免疫応答、ある特定の組織の形質導入の低下、特定の細胞型への標的送達不能、および比較的低い運搬能など、ＡＡＶの有用性を制限し得る遺伝子送達の障害が存在する。多くの状況において、ＡＡＶを改善する能力を有する合理的設計を効果的に力づけるためには、機構的知識が十分ではない。代替として、定向進化が、特定の生物医学的ニーズを満たす新規のＡＡＶ変異体を創出する戦略として出現している。定向進化戦略は、生物分子の機能を漸進的に改善する有益な突然変異の蓄積を可能にする遺伝的多様化および選択プロセスを利用する。このプロセスでは、野生型ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をいくつかのアプローチによって多様化して、ウイルス粒子のライブラリを生成するようにパッケージングされている大きな遺伝子ライブラリを創出し、次いで選択圧を適用して、遺伝子送達障壁を克服することができる新規の変異体を単離する。重要なことに、機能の定向進化のために、遺伝子送達問題の根底にある基本機構は既知である必要はないため、増強されたベクターの開発を加速することができる。
典型的には、本明細書に開示される変異体は、ＡＡＶライブラリ（複数可）の使用によって生成された。そのようなＡＡＶライブラリ（複数可）は、ＡＡＶキャプシドの構造タンパク質をコードする遺伝子であるｃａｐ遺伝子を、ウイルスゲノム操作の分野における当業者にとって既知かつ容易に利用可能である様々な定向進化技術によって突然変異させることによって生成される。例えば、Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎｅ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒ．１５ｔｈ Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．２０，Ｓ１４０（２０１２）、Ｂｏｗｌｅｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７，４２３－４３２（２００３）、Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８，５７０－５７８（２０１０）、Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２，５８８７－５９１１、Ｋｏｅｒｂｅｒ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６，１７０３－１７０９（２００８）、Ｌｉ Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６，１２５２－１２６０（２００８）、Ｋｏｅｒｂｅｒ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３４，１６１－１７０（２００８）、Ｋｏｅｒｂｅｒ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８，３６７－３７８（２００７）、およびＫｏｅｒｂｅｒ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７，２０８８－２０９５（２００９）を参照されたい。そのような技術は、非限定的に、以下の通りである：ｉ）ランダム点突然変異をＡＡＶ ｃａｐ翻訳領域（ＯＲＦ）に所定の変更可能な速度で導入するためのエラープローンＰＣＲ、ｉｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子のランダムキメラを生成して、複数のＡＡＶ血清型を有する遺伝子ライブラリを得るためのインビトロまたはインビボウイルス組換えまたは「ＤＮＡシャッフリング」、ｉｉｉ）ｃａｐ ＯＲＦ中の縮重オリゴヌクレオチドのライゲーションによるキャプシドの定義された部位におけるランダムペプチド挿入、ｉｖ）トランスポゾン突然変異誘発を使用したＡＡＶ ｃａｐ ＯＲＦのランダムな位置へのペプチドコード配列の定義された挿入、ｖ）「ループスワップ」ライブラリを生成するための天然のＡＡＶ血清型および変異体における各アミノ酸位置の保存レベルに基づくバイオインフォマティクスによって設計されたペプチド配列のライブラリによるＡＡＶキャプシドの表面ループの代置、ｖｉ）祖先変異体のライブラリを生成するためのＡＡＶ血清型間の縮重の位置におけるランダムなアミノ酸置換（Ｓａｎｔｉａｇｏ－Ｏｒｔｉｚら、２０１５）、ならびにそれらのそのような技術の組み合わせ。
ＤＮＡシャフリングは、親の特性を、固有かつ多くの場合に有益な方法で組み合わせるキメラを生成するが、パッケージングすることができないものもあり、これは事実上、ライブラリの多様性を低下させる。ライブラリの多様性の集中は、非限定的に、上記のｉｉｉ）～ｉｖ）などのペプチド挿入技術によって達成される。ライブラリの多様性もまた、上記のｖ）などの技術に集中しており、そのような集中は、ＡＡＶキャプシドの表面が露出したループ上にある複数の超可変領域を対象とする。多くの技術が、キャプシドの小さな領域のみが変異した変異キャプシドを生成するが、これらの技術は、完全なキャプシドを修飾するための追加の突然変異誘発戦略と対形成させることができる。
ＡＡＶライブラリ（複数可）が生成されると、各ＡＡＶ粒子がそのキャプシドをコードするｃａｐ遺伝子を囲む突然変異キャプシドで構成され、精製されるように、次いでウイルスがパッケージングされる。次いで、ライブラリの変異体は、ＡＡＶの分野の当業者にとって既知かつ容易に利用可能であるインビトロおよび／またはインビボの選択圧技術に供される。例えば、Ｍａｈｅｓｈｒｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４，１９８－２０４（２００６）、Ｄａｌｋａｒａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，１８９ｒａ７６（２０１３）、Ｌｉｓｏｗｓｋｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．５０６，３８２－２８６（２０１３）、Ｙａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ．１０６，３９４６－３９５１（２００９）、Ｇａｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３，７７－８７（２００６）、およびＢｅｌｌ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．２２，９８５－９９７（２０１１）を参照されたい。例えば、非限定的に、ＡＡＶ変異体は、ｉ）異なる画分の溶出が変更された結合特性を有する変異体をもたらす親和性カラム、ｉｉ）効率および／または組織特異性が増加したＡＡＶ変異体をもたらす、ヒト体内の細胞の挙動を模倣する組織試料または不死化細胞株から単離される初代細胞、ｉｉｉ）標的組織の感染に成功したＡＡＶ変異体をもたらす、臨床的遺伝子療法環境を模倣する動物モデル、ｉｖ）感染した移植ヒト細胞を有するＡＡＶ変異体をもたらすヒト異種移植モデル、ならびに／またはそれらの選択技術の組み合わせを使用して選択され得る。
ウイルスが選択されると、それらは、非限定的に、アデノウイルス媒介性複製、ＰＣＲ増幅、次世代シークエンシングおよびクローニングなどの既知の技術によって回収され得る。次いで、ウイルスクローンを選択技術の反復ラウンドにより濃縮し、ＡＡＶ ＤＮＡを単離して、目的の選択された変異ｃａｐ遺伝子を回収する。そのような選択された変異体は、さらなる修飾または突然変異に供され得るため、ＡＡＶウイルス適合性を反復的に増加させるさらなる選択ステップのための新たな出発点として機能する。しかしながら、ある特定の事例では、追加の突然変異なしにキャプシドの生成が成功している。
本明細書に開示されるＡＡＶ変異体は、少なくとも部分的に、硝子体内投与後の霊長類網膜スクリーンの使用を伴う、上記の技術などのインビボ定向進化方法論の使用によって生成された。したがって、本明細書に開示されるＡＡＶ変異キャプシドは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質よりも効率的な霊長類網膜細胞の形質導入を付与するアミノ酸配列内の１つ以上の修飾を含む。本明細書で使用される場合、「対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質」は、対象の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質と同じ野生型または変異ＡＡＶ血清型であるが、対象の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質の１つ以上のアミノ酸配列修飾を含まない、ＡＡＶキャプシドタンパク質を指す。
いくつかの実施形態では、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対して、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶに共有結合によって挿入された約５アミノ酸～約２０アミノ酸の異種ペプチドを含む。ＡＡＶキャプシドタンパク質の「ＧＨループ」またはループＩＶは、当該技術分野では、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶと称される溶媒露出部分を意味する。ＡＡＶキャプシドのＧＨループ／ループＩＶについては、例えば、ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：８０９、Ｐａｄｒｏｎ
ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７、およびＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１９５５を参照されたい。したがって、例えば、挿入部位は、ＡＡＶ ＶＰ１キャプシドタンパク質のおよそアミノ酸４１１～６５０内にあり得る。例えば、挿入部位は、ＡＡＶ１ ＶＰ１のアミノ酸５７１～６１２、ＡＡＶ２ ＶＰ１のアミノ酸５７０～６１１、ＡＡＶ３Ａ ＶＰ１のアミノ酸内５７１～６１２、ＡＡＶ３Ｂ ＶＰ１のアミノ酸５７１～６１２内、ＡＡＶ４ ＶＰ１のアミノ酸５６９～６１０内、ＡＡＶ５ ＶＰ１のアミノ酸５６０～６０１内、ＡＡＶ６ ＶＰ１のアミノ酸５７１～６１２内、ＡＡＶ７ ＶＰ１のアミノ酸５７２～６１３内、ＡＡＶ８ ＶＰ１のアミノ酸５７３～６１４内、ＡＡＶ９ ＶＰ１のアミノ酸５７１～６１２内、もしくはＡＡＶ１０ ＶＰ１のアミノ酸５７３～６１４内、またはそれらの任意の変異体の対応するアミノ酸内にあり得る。当業者は、様々なＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づいて、「ＡＡＶ２のアミノ酸に対応する」挿入部位が任意の所与のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質に存在することを理解するであろう。野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４－１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を提供する野生型ＡＡＶ配列番号１～１１のアラインメントについては、図６も参照されたい。
ある特定の実施形態では、挿入部位は、任意の野生型ＡＡＶ血清型またはＡＡＶ変異体のＶＰ１のアミノ酸５７０～６１４の間に位置する２つの隣接アミノ酸間の単一の挿入部位であり、例えば、挿入部位は、任意のＡＡＶ血清型または変異体のＶＰ１のアミノ酸５７０～６１０、アミノ酸５８０～６００、アミノ酸５７０～５７５、アミノ酸５７５～５８０、アミノ酸５８０～５８５、アミノ酸５８５～５９０、アミノ酸５９０～６００、またはアミノ酸６００～６１４に位置する２つの隣接アミノ酸間にある。例えば、挿入部位は、アミノ酸５８０と５８１、アミノ酸５８１と５８２、アミノ酸５８３と５８４、アミノ酸５８４と５８５、アミノ酸５８５と５８６、アミノ酸５８６と５８７、アミノ酸５８７と５８８、アミノ酸５８８と５８９、またはアミノ酸５８９と５９０との間にあり得る。挿入部位は、アミノ酸５７５と５７６、アミノ酸５７６と５７７、アミノ酸５７７と５７８、アミノ酸５７８と５７９、またはアミノ酸５７９と５８０との間にあり得る。挿入部位は、アミノ酸５９０と５９１、アミノ酸５９１と５９２、アミノ酸５９２と５９３、アミノ酸５９３と５９４、アミノ酸５９４と５９５、アミノ酸５９５と５９６、アミノ酸５９６と５９７、アミノ酸５９７と５９８、アミノ酸５９８と５９９、またはアミノ酸５９９と６００との間にあり得る。例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７と５８８との間、ＡＡＶ１のアミノ酸５９０と５９１との間、ＡＡＶ３Ａのアミノ酸５８８と５８９との間、ＡＡＶ３Ｂのアミノ酸５８８と５８９との間、ＡＡＶ４のアミノ酸５８４と５８５との間、ＡＡＶ５のアミノ酸５７５と５７６との間、ＡＡＶ６のアミノ酸５９０と５９１との間、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９と５９０との間、ＡＡＶ８のアミノ酸５９０と５９１との間、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８と５８９との間、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５８８と５８９との間にあり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるペプチド挿入は、長さが、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸である。別の実施形態では、本明細書に開示されるペプチド挿入は、本明細書に開示されるペプチド挿入のうちのいずれか１つのアミノ末端（Ｎ末端）および／またはカルボキシル末端（Ｃ末端）に１～４個のスペーサーアミノ酸を含む。例示的なスペーサーアミノ酸には、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、およびプロリン（Ｐ）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、ペプチド挿入は、Ｎ末端に２個のスペーサーアミノ酸を含み、Ｃ末端に２個のスペーサーアミノ酸を含む。他の実施形態では、ペプチド挿入は、Ｎ末端に２個のスペーサーアミノ酸を含み、Ｃ末端に１個のスペーサーアミノ酸を含む。
本明細書に開示されるペプチド挿入は、以前に説明されておらず、かつ／またはＡＡＶキャプシドに挿入されていない。理論によって拘束されることを意図するものではないが、開示されるペプチド挿入のうちのいずれかの存在は、霊長類網膜の前面の細胞外マトリックスへの結合を低下させる可能性のあるヘパリン硫酸に対する変異キャプシドの親和性を低下させるように作用し得る。加えて、本明細書に開示されるペプチド挿入モチーフは、細胞表面受容体結合ドメインの添加による霊長類網膜細胞の形質導入の増強を付与し得る。
いくつかの好ましい実施形態では、挿入ペプチドは、以下の式のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、挿入ペプチドは、式１ａの７～１０アミノ酸長のペプチドであり得、
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｙ３
式中、Ｙ１～Ｙ３の各々は、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから選択され、
Ｘ１は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、およびＡｌａから選択され、
Ｘ２は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、およびＰｒｏから選択され、
Ｘ３は、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、およびＡｓｎから選択され、
Ｘ４は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、およびＡｌａから選択され、
Ｘ５は、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、およびＡｓｎから選択され、
Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、およびＧｌｕから選択され、
Ｘ７は、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、およびＡｌａから選択される。
ある特定の実施形態では、式１ａの挿入ペプチドは、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、およびＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の態様では、挿入ペプチドは、式１ｂの７～１０アミノ酸長のペプチドであり得、
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｙ３
式中、Ｙ１～Ｙ３の各々は、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから選択され、
Ｘ１は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、およびＩｌｅから選択され、
Ｘ２は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、およびＳｅｒから選択され、
Ｘ３は、ＡｓｐおよびＩｌｅから選択され、
Ｘ４は、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＧｌｎから選択され、
Ｘ５は、ＴｈｒおよびＬｙｓから選択され、
Ｘ６は、ＬｙｓおよびＡｓｎから選択され、
Ｘ７は、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、およびＨｉｓから選択される。
ある特定の実施形態では、式１ｂの挿入ペプチドは、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、およびＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の態様では、挿入ペプチドは、式１ｃの７～１０アミノ酸長のペプチドであり得、
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２ＡｓｐＸ３ＴｈｒＬｙｓＸ４Ｙ３
式中、Ｙ１～Ｙ３の各々は、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから選択され、
Ｘ１は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、およびＩｌｅから選択され、
Ｘ２は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、およびＳｅｒから選択され、
Ｘ３は、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＧｌｎから選択され、
Ｘ４は、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、およびＨｉｓから選択される。
ある特定の実施形態では、式１ｃの挿入ペプチドは、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、およびＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の態様では、挿入ペプチドは、式１ｄの７～１０アミノ酸長のペプチドであり得、
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２ＡｓｐＸ３ＴｈｒＴｈｒＸ４Ｙ３
式中、Ｙ１～Ｙ３の各々は、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから選択され、
Ｘ１は、ＧｌｎおよびＩｌｅから選択され、
Ｘ２は、ＡｌａおよびＳｅｒから選択され、
Ｘ３は、ＴｈｒおよびＧｌｎから選択され、
Ｘ４は、ＡｓｎおよびＨｉｓから選択される。
ある特定の実施形態では、式１ｄの挿入ペプチドは、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）およびＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の態様では、挿入ペプチドは、式Ｉｅの７～１１アミノ酸長のペプチドであり得、
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２ＡｓｎＸ３ＡｓｎＧｌｕＸ４Ｙ３
式中、Ｙ１～Ｙ３の各々は、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから選択され、
Ｘ１は、ＧｌｎおよびＩｌｅから選択され、
Ｘ２は、ＡｌａおよびＳｅｒから選択され、
Ｘ３は、ＧｌｕおよびＡｌａから選択され、
Ｘ４は、ＡｓｎおよびＨｉｓから選択される。
他の実施形態では、式１ｅの挿入ペプチドは、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）およびＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）から選択されるアミノ酸配列を含む。
さらに別の実施形態では、挿入ペプチドは、式ＩＩａの７～１１アミノ酸長のペプチドであり得、
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２ＤＸ３ＴＫＸ４Ｙ３
式中、Ｙ１～Ｙ３の各々は、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから選択され、
Ｘ１は、Ｑ、Ｎ、Ａ、Ｈ、およびＩから選択され、
Ｘ２は、Ｑ、Ａ、Ｐ、およびＳから選択され、
Ｘ３は、Ｔ、Ｙ、Ｓ、およびＱから選択され、
Ｘ４は、Ｔ、Ｎ、Ａ、およびＨから選択される。
式Ｘ１Ｘ２ＤＸ３ＴＫＸ４のアミノ酸配列のペプチド挿入のさらなる実施形態では、ペプチド挿入は、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、およびＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）からなる群から選択される。
いくつかのそのような実施形態では、挿入ペプチドは、式ＩＩｂの７～１１アミノ酸長のペプチドであり得、
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２ＤＸ３ＴＫＸ４Ｙ３
式中、Ｙ１～Ｙ３の各々は、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから選択され、
Ｘ１は、Ｎ、Ａ、およびＨから選択され、
Ｘ２は、Ｑ、Ｐ、およびＳから選択され、
Ｘ３は、Ｔ、Ｙ、およびＳから選択され、
Ｘ４は、Ｔ、Ｎ、およびＡから選択される。
式Ｘ１Ｘ２ＤＸ３ＴＫＸ４のアミノ酸配列のペプチド挿入のさらなる実施形態では、ペプチド挿入は、ＡＳＤＳＴＫＡ、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、およびＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）からなる群から選択される。
他の実施形態では、挿入ペプチドは、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、およびＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、挿入ペプチドは、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、およびＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の好ましい実施形態では、挿入ペプチドは、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、およびＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）から選択されるアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に１～３個のスペーサーアミノ酸（Ｙ１～Ｙ３）を有する。ある特定のそのような実施形態では、挿入ペプチドは、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＧＨループまたはループＩＶにおける約５アミノ酸～約２０アミノ酸のペプチド挿入以外、いずれの他のアミノ酸配列修飾も含まない。例えば、いくつかの実施形態では、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド挿入を含み、いずれの他のアミノ酸置換、挿入、または欠失も含まない（すなわち、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、該挿入部を含み、他の点では対応するＡＡＶキャプシドタンパク質と同一である）。換言すれば、該挿入を含む変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、他の点では、ペプチドが挿入された親ＡＡＶキャプシドタンパク質と同一である。別の例として、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド挿入を含み、ペプチド挿入は、ＡＡＶ２キャプシドのＶＰ１のアミノ酸５８７と５８８との間または別の親ＡＡＶのＶＰ１の対応するアミノ酸間、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９のＶＰ１のアミノ酸５８８と５８９との間、ＡＡＶ４のＶＰ１のアミノ酸５８６と５８７との間、ＡＡＶ５のＶＰ１のアミノ酸５７７と５７８との間、ＡＡＶ７のＶＰ１のアミノ酸５８９と５９０との間、ＡＡＶ８またはＡＡＶ１０のＶＰ１のアミノ酸５９０と５９１との間などに位置し、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質配列は、他の点では、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質配列、例えば、配列番号１～１２のうちのいずれかと同一である。
他の実施形態では、本明細書に開示されているかまたは当該技術分野で既知であるように、ペプチド挿入をＧＨループに含むことに加えて、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、親ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して、約１～約１００個のアミノ酸置換または欠失、例えば、１～約５、約２～約４、約２～約５、約５～約１０、約１０～約１５、約１５～約２０、約２０～約２５、約２５～５０、約５０～１００個のアミノ酸置換または欠失を含む。したがって、いくつかの実施形態では、主題の変異キャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシド、例えば、配列番号１～１２に示される野生型キャプシドタンパク質に対して、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上、例えばまたは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、ペプチドの挿入前の付番により、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸残基（複数可）１、１５、３４、５７、６６、８１、１０１、１０９、１４４、１６４、１７６、１８８、１９６、２２６、２３６、２４０、２５０、３１２、３６３、３６８、４４９、４５６、４６３、４７２、４８４、５２４、５３５、５５１、５９３、６９８、７０８、７１９、７２１、および／もしくは７３５、または別のＡＡＶキャプシドタンパク質の対応するアミノ酸残基（複数可）にある。いくつかのそのような実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、ペプチドの挿入前の付番により、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質のＭ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、およびＬ７３５Ｑ、または別のＡＡＶキャプシドタンパク質の対応するアミノ酸残基（複数可）からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、およびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、Ｍ１Ｌ＋Ｌ１５Ｐ＋Ｐ５３５Ｓ、Ｐ３４Ａ、Ｐ３４Ａ＋Ｓ７２１Ｌ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｑ１６４Ｋ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｎ３１２Ｋ、Ｎ３１２Ｋ＋Ｎ４４９Ｄ＋Ｄ４７２Ｎ＋Ｎ５５１Ｓ＋Ｉ６９８Ｖ＋Ｌ７３５Ｑ、Ｐ３６３Ｌ、Ｒ４８４Ｃ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｔ４５６Ｋ、およびＶ７０８Ｉからなる群から選択される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。
特に好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）を含むか、またはＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７と５８８との間もしくは別のＡＡＶキャプシドの対応するアミノ酸間のアミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）もしくはＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）を含むか、本質的にそれらからなるか、もしくはそれらからなる、ペプチド挿入物を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）に対する残基３４または別のＡＡＶキャプシドの対応する残基にＰ３４Ａアミノ酸置換をさらに含む。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列または対応する親ＡＡＶキャプシドの全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。特に好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000001
別の特に好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸５８７と５８８との間、もしくは別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）もしくはＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２キャプシド（配列番号２）のアミノ酸配列と比較したＮ３１２Ｋアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換を含み、任意選択で、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＮ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、および／またはＬ７３５Ｑアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換をさらに含む。別の特に好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間、もしくは別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質における対応する位置のアミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）またはＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれらからなる、ペプチド挿入物を含み、ＡＡＶ２キャプシド（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した、Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、およびＬ７３５Ｑアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型の対応する残基における置換を含む。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。特に好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000002
別の実施形態では、ａ）ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９のＶＰ１のアミノ酸５８８と５８９、ＡＡＶ４のアミノ酸５８６と５８７、ＡＡＶ５のアミノ酸５７７と５７８、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９と５９０、またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸５９０と５９１との間に位置し、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、およびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ３ＡまたはＡＡＶ３Ｂのアミノ酸７０９におけるバリンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６の７０９位におけるアラニンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ４のアミノ酸７０７またはＡＡＶ９のアミノ酸７０９におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ７のアミノ酸７１０またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸７１１におけるトレオニンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ５のアミノ酸６９７におけるグルタミンからイソロイシンへの置換とを含み、任意選択で、他の点では、配列番号１および３～１２のうちのいずれか１つと同一である、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）もしくはＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入物と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８におけるバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換とを含み、変異キャプシドタンパク質は、２～５個、５～１０個、または１０～１５個のアミノ酸置換を含む。
さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）もしくはＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入物と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８におけるバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換とを含み、他の点では、配列番号２のアミノ酸配列と同一である。
さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）もしくはＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入物を含み、他の点では、配列番号２のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000003
好ましい実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）およびＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせ（好ましくはＳ１０９Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ａ５２４Ｔ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、および／もしくはＶ７１９Ｍから選択される）のうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。ペプチド挿入部位は、好ましくは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。特に好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間、もしくは別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸配列ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＩ６９８Ｖアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換を含み、置換されたアミノ酸（複数可）は対応する位置において天然に存在しない。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、対応するアミノ酸置換は、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶ９キャプシドのアミノ酸配列と比較したＩ６９９Ｖアミノ酸置換、ＡＡＶ５キャプシドのアミノ酸配列と比較したＩ６８７Ｖ置換、ＡＡＶ７のアミノ酸配列と比較したＩ７００Ｖ置換、ＡＡＶ８またはＡＡＶ１０のアミノ酸配列と比較したＩ７０１Ｖ置換である。特に好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000004
他の好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間、もしくは別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸配列ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＶ７１９Ｍアミノ酸置換および任意選択のＶ７０８Ｉ置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換を含み、置換されたアミノ酸（複数可）は対応する位置において天然に存在しない。
別の実施形態では、ａ）ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９のＶＰ１のアミノ酸５８８と５８９、ＡＡＶ４のアミノ酸５８６と５８７、ＡＡＶ５のアミノ酸５７７と５７８、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９と５９０、またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸５９０と５９１との間に位置し、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）およびＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ３ＡまたはＡＡＶ３Ｂのアミノ酸７０９におけるバリンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６の７０９位におけるアラニンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ４のアミノ酸７０７またはＡＡＶ９のアミノ酸７０９におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ７のアミノ酸７１０またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸７１１におけるトレオニンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ５のアミノ酸６９７におけるグルタミンからイソロイシンへの置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。別の実施形態では、ａ）ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９のＶＰ１のアミノ酸５８８と５８９、ＡＡＶ４のアミノ酸５８６と５８７、ＡＡＶ５のアミノ酸５７７と５７８、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９と５９０、またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸５９０と５９１との間に位置し、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）およびＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸配列と比較して１０９位における、またはＡＡＶ５もしくはＡＡＶ６のアミノ酸配列と比較して１０８位におけるセリンからトレオニンへのアミノ酸置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシド質は、アミノ酸配列ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入物を含み、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較した、アミノ酸１０９におけるセリンからトレオニンへの置換（Ｓ１０９Ｔ）またはアミノ酸７０８におけるバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換（Ｖ７０８Ｉ）を含み、変異キャプシドタンパク質は、１～５個、５～１０個、または１０～１５個のアミノ酸置換を含み、好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上アミノ酸配列同一性である。他の好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間、もしくは別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸配列ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸１０９でのセリンからトレオニンへの置換およびアミノ酸７０８でのバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換を含む。
さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、アミノ酸配列ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入と、ｂ）少なくとも１つのアミノ酸置換とを含み、変異キャプシドのアミノ酸配列は、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８でのバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換を含まず、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸１０９でのセリンからトレオニンへの置換を含まない。
さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２のアミノ酸配列と同一である。
別の好ましい実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＩＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号６０）、およびＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｒ３８９Ｓ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が対応する位置において天然に存在しない、置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ３８９Ｓ、Ａ５９３Ｅ、および／またはＶ７０８Ｉから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。好ましい一実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＩＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号６０）またはＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＳ１０９Ｔアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換を含む。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。
さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）を含むか、またはアミノ酸配列ＩＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号６０）もしくはＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000005
他の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ペプチド挿入と、ｂ）少なくとも１つのアミノ酸置換とを含み、変異キャプシドのアミノ酸配列は、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８でのバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換を含まない。さらに他の実施形態では、変異キャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号６１）を含むか、またはアミノ酸配列ＩＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号６０）もしくはＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＶ７０８Ｉとを含む。他の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ペプチド挿入と、ｂ）２つ以上のアミノ酸置換とを含み、変異キャプシドのアミノ酸配列は、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８でのバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換を含む。
別の好ましい実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）およびＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、Ｓ１０９Ｔ、Ｓ１０９Ｔ＋Ｓ４６３Ｙ、Ｄ３６８Ｈ、およびＶ７０８Ｉから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。好ましい一実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＶ７０８Ｉアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換を含む。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000006
他の実施形態では、変異キャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入と、ｂ）配列番号２の配列と比較したＳ１０９Ｔアミノ酸置換、および任意選択のＳ４６３Ｙアミノ酸置換とを含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長と、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％同一である。関連する実施形態では、変異キャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入と、ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と比較したＳ１０９Ｔアミノ酸置換とを含み、他の点では、配列番号２のアミノ酸配列と同一である。
別の実施形態では、ａ）ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９のＶＰ１のアミノ酸５８８と５８９、ＡＡＶ４のアミノ酸５８６と５８７、ＡＡＶ５のアミノ酸５７７と５７８、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９と５９０、またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸５９０と５９１との間に位置し、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）およびＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ１またはＡＡＶ６のアミノ酸配列と比較した３１３位もしくはＡＡＶ９のアミノ酸配列と比較した３１４位におけるアスパラギンからリジンへのアミノ酸置換、あるいはＡＡＶ３ＡもしくはＡＡＶ３Ｂの３１２位またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０の３１５位におけるセリンからリジンへの置換、あるいはＡＡＶ４もしくはＡＡＶ５の３０３位またはＡＡＶ７の３１４位におけるアルギニンからリジンへの置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ペプチド挿入物と、ｂ）Ｎ３１２Ｋアミノ酸置換とを含み、変異キャプシドタンパク質は、１～５個、５～１０個、または１０～１５個のアミノ酸置換を含む。
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）およびＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。好ましい一実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＶ７０８Ｉアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換を含む。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000007
別の好ましい実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号６２）およびＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。好ましい一実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号６２）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＮ４４９Ｄアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換を含む。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号６２）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000008
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）およびＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。関連する実施形態では、ａ）ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９のＶＰ１のアミノ酸５８８と５８９、ＡＡＶ４のアミノ酸５８６と５８７、ＡＡＶ５のアミノ酸５７７と５７８、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９と５９０、またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸５９０と５９１との間に位置し、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）およびＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ３ＡまたはＡＡＶ３Ｂのアミノ酸７０９におけるバリンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６の７０９位におけるアラニンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ４のアミノ酸７０７またはＡＡＶ９のアミノ酸７０９におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ７のアミノ酸７１０またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸７１１におけるトレオニンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ５のアミノ酸６９７におけるグルタミンからイソロイシンへの置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ペプチド挿入物と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８におけるバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換とを含み、変異キャプシドタンパク質は、１～５個、５～１０個、または１０～１５個のアミノ酸置換を含む。さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）を含むペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８におけるバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換とを含む。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。
さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000009
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）およびＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に位置するペプチド挿入を含み、他の点では配列番号２のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ペプチド挿入物を含み、かつ少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000010
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）およびＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000011
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）およびＬＡＫＤＲＡＰＴＳＡ（配列番号４１）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＫＤＲＡＰＴＳＡ（配列番号４１）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000012
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）およびＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が対応する位置のうちの１つ以上において天然に存在しない、置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000013
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）およびＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が対応する位置のうちの１つ以上において天然に存在しない、置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000014
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）およびＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000015
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）およびＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
Figure 2024015194000016
いくつかの態様では、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対して１つ以上のアミノ酸置換を含む変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供され、本変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したＰ３４Ａアミノ酸置換、またはＡＡＶ５キャプシドのアミノ酸配列（配列番号６）と比較したＰ３３Ａアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２または配列番号６に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、それぞれＡＡＶ２またはＡＡＶ５キャプシドのアミノ酸配列と比較したＰ３４ＡまたはＰ３３Ａアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と比較したＰ３４Ａアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、他の点では配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と比較したＰ３４Ａアミノ酸置換を含み、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、１～５個、５～１０個、または１０～１５個のアミノ酸置換を含む。
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１６４、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在しない。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１６４におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、もしくはＡＡＶ６のアミノ酸配列と比較したアミノ酸１６４、またはＡＡＶ７、ＡＡＶ８、もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸配列と比較したアミノ酸１６５におけるグルタミンからリジンへのアミノ酸置換を含むか、あるいはＡＡＶ５のアミノ酸１６０におけるセリンからリジンへの置換を含むか、あるいはＡＡＶ９のアミノ酸１６４におけるアラニンからリジンへの置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１６４におけるアミノ酸置換（例えば、Ｑ１６４Ｋ）を含み、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、１～５個、５～１０個、または１０～１５個のアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と比較したＱ１６４Ｋアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、他の点では配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したＱ１６４ＫおよびＶ７０８Ｉアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）中の対応する置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性である。
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸６９８、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在しない。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸６９８におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸６９８、またはＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、もしくはＡＡＶ９のアミノ酸配列と比較したアミノ酸６９９、またはＡＡＶ５のアミノ酸６８７、またはＡＡＶ７のアミノ酸７００、またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸７０１における、イソロイシンからバリンへのアミノ酸置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸６９９におけるアミノ酸置換（例えば、Ｉ６９８Ｖ）を含み、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、１～５個、５～１０個、または１０～１５個のアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と比較したＩ６９８Ｖアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、他の点では配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１０９、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１０９におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸配列と比較した１０９位、またはＡＡＶ５もしくはＡＡＶ６のアミノ酸配列と比較した１０８位における、セリンからトレオニンへのアミノ酸置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、アミノ酸配列ＡＡＶ２と比較したＳ１０９Ｔアミノ酸置換を含み、変異キャプシドタンパク質は、１～５個、５～１０個、または１０～１５個のアミノ酸置換を含む。他の関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＳ１０９Ｔアミノ酸置換およびＡ５９３Ｅアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したＳ１０９ＴおよびＡ４９３Ｖならびに任意選択のＡ５９３Ｅおよび／もしくはＶ７０８Ｉアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）中の対応する置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したＳ１０９Ｔ、Ａ４９３Ｖ、Ａ５９３Ｅ、およびＶ７０８Ｉアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）中の対応する置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性である。他の好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＳ１０９ＴおよびＶ７０８Ｉアミノ酸置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し、他の点では、配列番号２のアミノ酸配列と同一である。
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸５９３、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸５９３におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ６、もしくはＡＡＶ９のアミノ酸配列と比較したアミノ酸５９４、またはＡＡＶ５のアミノ酸５８３、またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸５９６におけるグリシンからグルタミン酸塩へのアミノ酸置換、あるいはＡＡＶ３Ｂのアミノ酸５９４におけるアルギニンからグルタミン酸塩へのアミノ酸置換、あるいはＡＡＶ４のアミノ酸５９２におけるアスパラギン酸塩からグルタミン酸塩へのアミノ酸置換、あるいはＡＡＶ７の５９５位におけるグルタミンからグルタミン酸塩へのアミノ酸置換を含む。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＡ５９３Ｅアミノ酸置換を含み、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上を含まない：Ｉ１９Ｖ、Ｖ３６９Ａ、Ｋ２６Ｒ、Ｎ２１５Ｄ、Ｇ３５５Ｓ、Ｖ４６Ａ、およびＳ１９６Ｐ。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＡ５９３ＥおよびＮ５９６Ｄアミノ酸置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する。他の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＡ５９３ＥおよびＮ５９６Ｄアミノ酸置換を含み、他の点では、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＡ５９３ＥおよびＶ７０８Ｉアミノ酸置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する。他の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＡ５９３ＥおよびＶ７０８Ｉアミノ酸置換を含み、他の点では、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と同一である。
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸７０８、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在しない。好ましくは、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ２と比較したアミノ酸２５０、または別のＡＡＶ親血清型中の対応するアミノ酸におけるプロリンからセリンへの置換を含まない。いくつかの実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸７０８におけるアミノ酸置換を含む。好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８におけるバリンからイソロイシン（Ｖ７０８Ｉ）への置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するか、あるいは配列番号２のアミノ酸配列と同一であり、Ｐ２５０Ｓアミノ酸置換を含まない。いくつかの実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ３ＡまたはＡＡＶ３Ｂのアミノ酸７０９におけるバリンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６の７０９位におけるアラニンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ４のアミノ酸７０７またはＡＡＶ９のアミノ酸７０９におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ７のアミノ酸７１０またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸７１１におけるトレオニンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ５のアミノ酸６９７におけるグルタミンからイソロイシンへの置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＶ７０８Ｉアミノ酸置換を含み、変異キャプシドタンパク質は、２～５個、５～１０個、または１０～１５個のアミノ酸置換を含み、Ｐ２５０Ｓアミノ酸置換を含まない。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、Ｖ７０８Ｉアミノ酸置換を含み、またＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＡ５９３Ｅおよび／またはＳ１０９Ｔアミノ酸置換も含む。他の関連する実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＶ７０８ＩおよびＡ５９３Ｅアミノ酸置換を含み、他の点では、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と同一である。他の関連する実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＶ７０８ＩおよびＳ１０９Ｔアミノ酸置換を含み、他の点では、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＶ７０８ＩおよびＶ７１９Ｍアミノ酸置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するか、あるいは配列番号２のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＶ７０８ＩおよびＲ７３３Ｃアミノ酸置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するか、あるいは配列番号２のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＶ７０８ＩおよびＧ７２７Ｄアミノ酸置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するか、あるいは配列番号２のアミノ酸配列と同一である。
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１９６、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在せず、任意選択で、プロリン以外である。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１９６におけるアミノ酸置換を含み、任意選択で、Ｓ１９６Ｐ置換以外である。好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２もしくはＡＡＶ９のアミノ酸１９６、またはＡＡＶ７、ＡＡＶ８、もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸１９７、またはＡＡＶ５のアミノ酸１８６におけるセリンからチロシンへのアミノ酸置換、あるいはＡＡＶ１またはＡＡＶ６のアミノ酸１９６におけるアラニンからチロシンへの置換、あるいはＡＡＶ４のアミノ酸１９１におけるメチオニンからチロシンへの置換、あるいはＡＡＶ３ＡまたはＡＡＶ３Ｂのアミノ酸１９６におけるトレオニンからチロシンへの置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と比較したＳ１９６Ｙアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、他の点では配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したＳ１９６Ｐ置換以外のアミノ酸１９６におけるアミノ酸置換を含み（例えば、Ｓ１９６Ｙ置換を含み）、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、１～５個、５～１０個、または１０～１５個のアミノ酸置換を含む。
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１７５、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在しない。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１７５におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異キャプシドは、配列番号２に示されるＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＱ１７５Ｈアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型の対応する位置におけるグルタミンからヒスチジンへの置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１７５におけるアミノ酸置換（例えば、Ｑ１７５Ｈ）を含み、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、１～５個、５～１０個、または１０～１５個のアミノ酸置換を含む。
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸６４、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在しない。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸６４におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、配列番号２に示されるＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＰ６４Ｓアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型の対応する位置におけるプロリンからセリンへの置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸６４におけるアミノ酸置換（例えば、Ｐ６４Ｓ）を含み、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、１～５個、５～１０個、または１０～１５個のアミノ酸置換を含む。
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、および１２からなる群から選択される野生型ＡＡＶキャプシド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含み、かつｉ）Ｐ３４Ａ、Ｓ１０９Ｔ＋Ｖ７０８Ｉ、Ａ５９３Ｅ＋Ｎ５９６Ｄ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｖ７１９Ｍ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｇ７２７Ｄ、Ｓ１０９Ｔ＋Ａ４９３Ｖ＋Ａ５９３Ｅ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｒ７３３Ｃ、Ｑ１６４Ｋ、およびＩ６９８Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換、ならびに／または（ｉｉ）ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７））、ＰＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号６３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＰＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号６４）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、ＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、およびＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）からなる群から選択されるペプチド挿入も含む。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、特定の１つ以上のアミノ酸置換および／またはペプチド挿入を含み、他の点では配列番号１～１２からなる群から選択される配列と同一である。
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、祖先キャプシドタンパク質である。先祖キャプシドタンパク質は、今日天然に見出されるキャプシドタンパク質の進化的祖先、例えば、今日天然に見出されるＡＡＶキャプシドタンパク質間の縮重の位置におけるランダムなアミノ酸置換によってインシリコで生成される、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３を意味する。祖先キャプシドの１つの非限定的な例が以下に提供され、縮重の位置（残基２６４、２６６、２６８、４４８、４５９、４６０、４６７、４７０、４７１、４７４、４９５、５１６、５３３、５４７、５５１、５５５、５５７、５６１、５６３、５７７、５８３、５９３、５９６、６６１、６６２、６６４、６６５、７１０、７１７、７１８、７１９、７２３）が「Ｘ」としてマークされる：
Figure 2024015194000017
いくつかの実施形態では、祖先キャプシドタンパク質は、配列番号５８に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、祖先キャプシドタンパク質は、例えば配列番号２に示されるＡＡＶ２のアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、祖先キャプシドタンパク質は、配列番号５８または配列番号２に開示される祖先配列のアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２６４のアラニン（Ａ）、２６６のアラニン（Ａ）、２６８のセリン（Ｓ）、４４８のアラニン（Ａ）、４５９のトレオニン（Ｔ）、４６０のアルギニン（Ｒ）、４６７のアラニン（Ａ）、４７０のセリン（Ｓ）、４７１のアスパラギン（Ｎ）、４７４のアラニン（Ａ）、４９５のセリン（Ｓ）、５１６のアスパラギン（Ｄ）、５３３のアスパラギン（Ｄ）、５４７のグルタミン（Ｑ）、５５１のアラニン（Ａ）、５５５のアラニネト（Ａｌａｎｉｎｅｔ）（Ａ）、５５７のグルタミン酸（Ｅ）、５６１のメチオニン（Ｍ）、５６３のセリン（Ｓ）、５７７のグルタミン（Ｑ）、５８３のセリン（Ｓ）、５９３のバリン（Ｖ）、５９６のトレオニン（Ｔ）、６６１のアラニン（Ａ）、６６２のバリン（Ｖ）、６６４のトレオニン（Ｔ）、６６５のプロリン（Ｐ）、７１０のトレオニン（Ｔ）、７１７のアスパラギン酸（Ｄ）、７１８のアスパラギン（Ｎ）、７１９のグルタミン酸（Ｅ）、および７２３のセリン（Ｓ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、以下のアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上、いくつかの事例では、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み、２６４のアラニン（Ａ）、２６６のアラニン（Ａ）、２６８のセリン（Ｓ）、４４８のアラニン（Ａ）、４５９のトレオニン（Ｔ）、４６０のアルギニン（Ｒ）、４６７のアラニン（Ａ）、４７０のセリン（Ｓ）、４７１のアスパラギン（Ｎ）、４７４のアラニン（Ａ）、４９５のセリン（Ｓ）、５１６のアスパラギン（Ｄ）、５３３のアスパラギン（Ｄ）、５４７のグルタミン（Ｑ）、５５１のアラニン（Ａ）、５５５のアラニン（Ａ）、５５７のグルタミン酸（Ｅ）、５６１のメチオニン（Ｍ）、５６３のセリン（Ｓ）、５７７のグルタミン（Ｑ）、５８３のセリン（Ｓ）、５９３のバリン（Ｖ）、５９６のトレオニン（Ｔ）、６６１のアラニン（Ａ）、６６２のバリン（Ｖ）、６６４のトレオニン（Ｔ）、６６５のプロリン（Ｐ）、７１０のトレオニン（Ｔ）、７１７のアスパラギン酸（Ｄ）、７１８のアスパラギン（Ｎ）、７１９のグルタミン酸（Ｅ）、および７２３のセリン（Ｓ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基を含む。
Figure 2024015194000018
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号５８として本明細書に開示される先祖変異体からなる群から選択される野生型ＡＡＶキャプシド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含み、２６４のアラニン（Ａ）、２６６のアラニン（Ａ）、２６８のセリン（Ｓ）、４４８のアラニン（Ａ）、４５９のトレオニン（Ｔ）、４６０のアルギニン（Ｒ）、４６７のアラニン（Ａ）、４７０のセリン（Ｓ）、４７１のアスパラギン（Ｎ）、４７４のアラニン（Ａ）、４９５のセリン（Ｓ）、５１６のアスパラギン（Ｄ）、５３３のアスパラギン（Ｄ）、５４７のグルタミン（Ｑ）、５５１のアラニン（Ａ）、５５５のアラニン（Ａ）、５５７のグルタミン酸（Ｅ）、５６１のメチオニン（Ｍ）、５６３のセリン（Ｓ）、５７７のグルタミン（Ｑ）、５８３のセリン（Ｓ）、５９３のバリン（Ｖ）、５９６のトレオニン（Ｔ）、６６１のアラニン（Ａ）、６６２のバリン（Ｖ）、６６４のトレオニン（Ｔ）、６６５のプロリン（Ｐ）、７１０のトレオニン（Ｔ）、７１７のアスパラギン酸（Ｄ）、７１８のアスパラギン（Ｎ）、７１９のグルタミン酸（Ｅ）、および７２３のセリン（Ｓ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基を含み、かつｉ）Ｐ３４Ａ、Ｓ１０９Ｔ＋Ｖ７０８Ｉ、Ａ５９３Ｅ＋Ｎ５９６Ｄ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｖ７１９Ｍ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｇ７２７Ｄ、Ｓ１０９Ｔ＋Ａ４９３Ｖ＋Ａ５９３Ｅ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｒ７３３Ｃ、Ｑ１６４Ｋ、およびＩ６９８Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換、ならびに／または（ｉｉ）ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＰＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号６３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＰＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号６４）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、ＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、およびＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）からなる群から選択されるペプチド挿入も含む。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、特定の１つ以上のアミノ酸置換および／またはペプチド挿入を含み、他の点では配列番号５９と同一である。
本明細書に開示されるＡＡＶ変異体は、硝子体内投与後の霊長類網膜スクリーンの使用を伴う、インビボの定向進化の使用によって生成された。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在する場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質または野生型ＡＡＶを含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の形質導入と比較して、網膜細胞の形質導入の増加を付与する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在する場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質または野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンよりも効率的な霊長類網膜細胞の形質導入を付与し、例えば、網膜細胞は、親ＡＡＶキャプシドタンパク質または野生型ＡＡＶを含むＡＡＶビリオンよりも多い、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンを取り込む。いくつかのそのような実施形態では、ＡＡＶ変異ビリオンまたは変異ｒＡＡＶは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む野生型ＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶによる網膜細胞の形質導入と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した網膜細胞の形質導入を示す。ある特定のそのような実施形態では、本明細書に開示される変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在する場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質または野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンよりも広範な霊長類網膜細胞の形質導入を付与する。換言すれば、変異ＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むビリオンによって形質導入されない細胞型、したがって、対応する親ＡＡＶビリオンよりも網膜内のより多くの細胞型を形質導入する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ変異ビリオンは、網膜細胞を優先的に形質導入し、例えば、主題のｒＡＡＶビリオンは、網膜細胞を、別の網膜細胞または非網膜細胞、例えば、眼の外側の細胞と比較して、２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍超の特異性で感染させる。いくつかの実施形態では、形質導入された網膜細胞は、光受容細胞（例えば、桿体、錐体）である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、網膜上皮細胞（ＲＰＥ細胞）である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、ミュラーグリア細胞である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、ミクログリア細胞である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、アマクリン細胞である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、双極細胞である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、水平細胞である。網膜細胞の形質導入の増加、例えば、形質導入の効率の増加、より広範な形質導入、より優先的な形質導入などは、遺伝子発現を測定するための当該技術分野における任意の数の方法によってインビトロまたはインビボで容易に評価され得る。例えば、ＡＡＶは、普遍的または組織特異的プロモーターの制御下で、レポーター遺伝子、例えば、蛍光タンパク質を含む発現カセットを含むゲノムとともにパッケージングされてもよく、形質導入の程度は、例えば、蛍光顕微鏡法によって蛍光タンパク質を検出することによって評価される。別の例として、ＡＡＶは、バーコード核酸配列を含むゲノムとともにパッケージングされてもよく、形質導入の程度は、例えば、ＰＣＲによって核酸配列を検出することによって評価される。別の例として、ＡＡＶは、網膜疾患の治療のための治療遺伝子を含む発現カセットを含むゲノムとともにパッケージングされてもよく、形質導入の程度は、ＡＡＶを投与した罹患患者における網膜疾患の治療を検出することによって評価される。
本明細書に開示される変異ｒＡＡＶベクターもしくはビリオンおよび／または方法を使用して治療することができる眼疾患には、単一遺伝子疾患、複雑な遺伝性疾患、後天性疾患、および外傷性損傷が含まれるが、これらに限定されない。単一遺伝子疾患の例には、バルデー・ビードル症候群；バッテン病；ビエッティ結晶状ジストロフィー；全脈絡膜萎縮；網脈絡膜萎縮；網脈絡膜変性；錐体または錐体桿体ジストロフィー（常染色体優性、常染色体劣性、およびＸ連鎖）；先天性停止性夜盲（常染色体優性、常染色体劣性、およびＸ連鎖）；色覚異常（ＡＣＨＭ２、ＡＣＨＭ３、ＡＣＨＭ４、およびＡＣＨＭ５を含む）、第一色覚異常、第二色覚異常、および第三色覚異常を含む色覚の障害；フリードライヒ運動失調症；ＬＣＡ１、ＬＣＡ２、ＬＣＡ３、ＬＣＡ４、ＬＣＡ６、ＬＣＡ７、ＬＣＡ８、ＬＣＡ１２、およびＬＣＡ１５を非限定的に含む、レーバー先天性黒内障（常染色体優性および常染色体劣性）；レーバー遺伝性視神経症；急性黄斑変性、ベスト卵黄様黄斑変性、パターンジストロフィー、ノースカロライナ黄斑変性、遺伝性ドルーゼン、ソースビー眼底変性、マラッティア・レベンティネース（Ｍａｌａｔｔｉａ Ｌｅｖａｎｔａｎｅｓｅ）、および遺伝的に決定される未熟児網膜症を非限定的に含む、黄斑変性（常染色体優性および常染色体劣性）；眼網膜発達障害；眼白子症；視神経萎縮（常染色体優性、常染色体劣性、およびＸ連鎖）；網膜色素変性（常染色体優性、常染色体劣性、Ｘ連鎖、およびミトコンドリア遺伝性形質）（その例には、ＲＰ１、ＲＰ２、ＲＰ３、ＲＰ１０、ＲＰ２０、ＲＰ３８、ＲＰ４０、およびＲＰ４３；Ｘ連鎖網膜分離症が含まれる）；シュタルガルト病；ならびにＵＳＨ１Ｂ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｄ、ＵＳＨ１Ｆ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ２Ｃ、ＵＳＨ２Ｄ、およびＵＳＨ３を非限定的に含む、アッシャー症候群が含まれるが、これらに限定されない。複雑な遺伝性疾患の例には、緑内障（開放隅角、閉塞隅角、低眼圧、正常眼圧、先天性、血管新生、色素性、偽落屑）；急性黄斑変性、卵黄様黄斑変性などの、滲出性および非滲出性（常染色体優性および常染色体劣性）両方の加齢性および他の形態の黄斑変性；未熟児網膜症；ならびにフォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群が含まれるが、これらに限定されない。後天性疾患の例には、急性黄斑視神経網膜症；前部虚血性視神経症および後部虚血性視神経症；ベーチェット病；膜静脈分枝閉塞；脈絡膜血管新生；増殖性糖尿病性網膜症および関連する合併症を含む、糖尿病性網膜症；糖尿病性ぶどう膜炎；黄斑浮腫、類嚢胞黄斑浮腫、および糖尿病性黄斑浮腫などの浮腫；網膜上膜疾患；黄斑毛細血管拡張症；多巣性脈絡膜炎；非網膜症糖尿病性網膜機能障害；眼腫瘍；視神経萎縮；網膜剥離；網膜中心静脈閉塞、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈および静脈の閉塞性疾患、血管閉塞、ぶどう膜網膜疾患などの網膜障害；ぶどう膜滲出；網膜感染症および浸潤性疾患；後天性視神経萎縮などの視神経疾患が含まれるが、これらに限定されない。外傷性損傷の例には、ヒストプラスマ症；視神経外傷；後眼部位または位置に影響を及ぼす眼の外傷；網膜外傷；眼のウイルス感染；視神経のウイルス感染；眼科用レーザー治療によって引き起こされるか、またはその影響を受ける後眼病態；光線力学療法によって引き起こされるか、またはその影響を受ける後眼病態；光凝固、放射線網膜症；および交感性眼炎が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、本明細書に開示される変異キャプシドは、遺伝子産物、例えば、非限定的に、干渉ＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、短鎖非コードＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、ポリペプチド、分泌型抗体、一本鎖抗体、ＶＨＨドメイン、可溶性受容体、アフィボディ、ノッチン、ＤＡＲＰｉｎ、センチュリン、シャペロン、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的ヌクレアーゼ、または転写の遺伝子特異的活性化を提供する修飾された部位特異的ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
本明細書に開示されるｒＡＡＶ変異ビリオンは、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、干渉ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、長鎖非コードＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、短鎖非コードＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、アンチセンスＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、アプタマーである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、分泌型抗体である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、一本鎖抗体である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＶＨＨドメインである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、可溶性受容体である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、アフィボディである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ノッチンである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＤＡＲＰｉｎである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、センチュリンである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、シャペロンである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的ヌクレアーゼである。
遺伝子産物の使用には、細胞内の因子のレベルの増強、因子の分泌による隣接細胞内の因子のレベルの増強、細胞内の因子のレベルの減少、または因子の分泌による隣接細胞内の因子のレベルの減少が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子産物は、欠損遺伝子産物の欠損のレベルの補充、欠損遺伝子産物の欠損のレベルの減少、新たな支持遺伝子産物の導入、支持遺伝子産物のレベルの補充、妨害遺伝子産物のレベルの減少、または妨害遺伝子産物のレベルの減少および支持遺伝子産物のレベルの補充の両方を行うように設計され得る。
主題のＡＡＶ変異体によって送達される遺伝子産物を使用して、網膜疾患および外傷に直接的または間接的に関連する遺伝子産物または遺伝子産物活性のレベルを改変することができる。遺伝子産物が遺伝性疾患に直接または間接的に関連する遺伝子には、例えば、ＡＤＰ－リボシル化因子様６（ＡＲＬ６）、ＢＢＳｏｍｅ相互作用タンパク質１（ＢＢＩＰ１）、ＢＢＳｏｍｅタンパク質１（ＢＢＳ１）、ＢＢＳｏｍｅタンパク質２（ＢＢＳ２）、ＢＢＳｏｍｅタンパク質４（ＢＢＳ４）、ＢＢＳｏｍｅタンパク質５（ＢＢＳ５）、ＢＢＳｏｍｅタンパク質７（ＢＢＳ７）、ＢＢＳｏｍｅタンパク質９（ＢＢＳ９）、ＢＢＳｏｍｅタンパク質１０（ＢＢＳ１０）、ＢＢＳｏｍｅタンパク質１２（ＢＢＳ１２）、中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）、鞭毛内輸送タンパク質１７２（ＩＦＴ１７２）、鞭毛内輸送タンパク質２７（ＩＦＴ２７）、イノシトールポリリン酸－５－ホスファターゼＥ（ＩＮＰＰ５Ｅ）、内向き整流性カリウムチャネルサブファミリーＪメンバー１３（ＫＣＮＪ１３）、ロイシンジッパー転写因子様－１（ＬＺＴＦＬ１）、マキュージック・カウフマン症候群タンパク質（ＭＫＫＳ）、メッケル症候群１型タンパク質（ＭＫＳ１）、ネフロン癆３タンパク質（ＮＰＨＰ１）、血清学的に定義された結腸がん抗原８（ＳＤＣＣＡＧ８）、三要素モチーフ含有タンパク質３２（ＴＲＩＭ３２）、テトラトリコペプチド反復配列ドメイン８（ＴＴＣ８）、バッテン病タンパク質（ＣＬＮ３）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＣＨＭ）、（Ｐｒｄｍ１３）、（ＲＧＲ、（ＴＥＡＤ１）、アリール炭化水素相互作用受容体タンパク質様１（ａｉｐｌ１）；錐体杆体ｏｔｘ様光受容体ホメオボックス転写因子（ＣＲＸ）、グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質１ａ（ＧＵＣＡ１Ａ）、網膜特異的グアニル酸トシクラーゼ（ＧＵＣＹ２Ｄ）、ホスファチジルイノシトールトランスファー膜関連ファミリーメンバー３（ＰＩＴＰＮＭ３）、プロミニン１（ＰＲＯＭ１）、ペリフェリン（ＰＲＰＨ）、ペリフェリン２（ＰＲＰＨ２）、制御シナプス膜エキソサイトーシスタンパク質１（ＲＩＭＳ１）、セマホリン４Ａ（ＳＥＭＡ４Ａ）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｕｎｃ１１９タンパク質のヒト相同体（ＵＮＣ１１９）、ＡＴＰ結合カセット輸送体－網膜（ＡＢＣＡ４）、ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン９（ＡＤＡＭ９）、活性化転写因子６（ＡＴＦ６）、染色体２１翻訳領域２（Ｃ２１ｏｒｆ２）、染色体８翻訳領域３７（Ｃ８ｏｒｆ３７）、カルシウムチャネル、電圧依存性、アルファ２／デルタサブユニット４（ＣＡＣＮＡ２Ｄ４）、カドヘリン関連ファミリーメンバー１（プロトカドヘリン２１）（ＣＤＨＲ１）、セラミドキナーゼ様タンパク質（ＣＥＲＫＬ）、錐体光受容体ｃＧＭＰゲート付きカチオンチャネルアルファサブユニット（ＣＮＧＡ３）、錐体環状ヌクレオチドゲート付きカチオンチャネルベータ３サブユニット（ＣＮＧＢ３）、サイクリンＭ４（ＣＮＮＭ４）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、アルファ形質導入活性ポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）、カリウムチャネルサブファミリーＶメンバー２（ＫＣＮＶ２）、ホスホジエステラーゼ６Ｃ（ＰＤＥ６Ｃ）、ホスホジエステラーゼ６Ｈ（ＰＤＥ６Ｈ））、中心子１中心子タンパク質Ｂのプロテオーム（ＰＯＣ１Ｂ）、ＲＡＳがん遺伝子ファミリーのＲＡＢ２８メンバー（ＲＡＢ２８）、網膜および前部神経折畳みホメオボックス２転写因子（ＲＡＸ２）、１１シスレチノールデヒドロゲナーゼ５（ＲＤＨ５）、ＲＰ ＧＴＰアーゼ制御相互作用タンパク質１（ＲＰＧＲＩＰ１）、チューブリンチロシンリガーゼ様ファミリーメンバー５（ＴＴＬＬ５）、Ｌ型電圧ゲート付きカルシウムチャネルアルファ－１サブユニット（ＣＡＣＮＡ１Ｆ）、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、（ＧＮＡＴ１）、（ＰＤＥ６Ｂ）、（ＲＨＯ）、ＣＡＢＰ４）、ＧＰＲ１７９）、（ＧＲＫ１）、ＧＲＭ６）、ＬＲＩＴ３）、ＳＬＣ２４Ａ１）、ＴＲＰＭ１）、ＮＹＸ）、ＯＰＮ１ＬＷ）、ＯＰＮ１ＭＷ）、青錐体オプシン（ＯＰＮ１ＳＷ）、フラタキシン（ＦＸＮ）、（ＩＭＰＤＨ１）、（ＯＴＸ２）、ＣＲＢ１）、ＤＴＨＤ１ＧＤＦ６）、ＩＦＴ１４０）、ＩＱＣＢ１）、ＬＣＡ５）、ＬＲＡＴ）、ＮＭＮＡＴ１）、ＲＤ３）、ＲＤＨ１２）、ＲＰＥ６５）、ＳＰＡＴＡ７）、ＴＵＬＰ１）、ミトコンドリア遺伝子（ＫＳＳ、ＬＨＯＮ、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＭＴ－ＴＨ、ＭＴ－ＴＬ１、ＭＴ－ＴＰ、ＭＴ－ＴＳ２、ミトコンドリアにコードされたＮＡＤＨ脱水素酵素［ＭＴ－ＮＤ］）、（ＢＥＳＴ１）、Ｃ１ＱＴＮＦ５ＥＦＥＭＰ１）、ＥＬＯＶＬ４）、ＦＳＣＮ２）、ＧＵＣＡ１Ｂ）、ＨＭＣＮ１）、ＩＭＰＧ１）、ＲＰ１Ｌ１）、ＴＩＭＰ３）、ＤＲＡＭ２）、ＭＦＮ２）、ＮＲ２Ｆ１）、視神経萎縮１（ＯＰＡ１）、ＴＭＥＭ１２６Ａ）、ＴＩＭＭ８Ａ）、ＣＡ４）、ＨＫ１）、ＫＬＨＬ７）、ＮＲ２Ｅ３）、ＮＲＬ）、ＯＲ２Ｗ３）、ＰＲＰＦ３）、ＰＲＰＦ４）、ＰＲＰＦ６）、ＰＲＰＦ８）、ＰＲＰＦ３１）、ＲＯＭ１）、網膜色素変性タンパク質１（ＲＰ１）、ＲＰ９）、ＳＮＲＮＰ２００）、ＳＰＰ２）、ＴＯＰＯＲＳ）、ＡＲＬ２ＢＰ）、Ｃ２ｏｒｆ７１）、ＣＬＲＮ１）、ＣＮＧＡ１）、ＣＮＧＢ１）、ＣＹＰ４Ｖ２）、ＤＨＤＤＳ）、ＤＨＸ３８）、ＥＭＣ１）、ＥＹＳ）、ＦＡＭ１６１Ａ）、ＧＰＲ１２５）、ＨＧＳＮＡＴ）、ＩＤＨ３Ｂ）、ＩＭＰＧ２）、ＫＩＡＡ１５４９）、ＫＩＺ）、ＭＡＫ）、ＭＥＲＴＫ）、ＭＶＫ）、ＮＥＫ２）、ＮＥＵＲＯＤ１）、ＰＤＥ６Ａ）、ＰＤＥ６Ｇ）、ＰＲＣＤ）、ＲＢＰ３）、ＲＬＢＰ１）、ＳＬＣ７Ａ１４）、ＵＳＨ２Ａ）、ＺＮＦ４０８）、ＺＮＦ５１３）、ＯＦＤ１）、ＲＰ２）、レチノスキシン（ＲＳ１）、ＡＢＨＤ１２）、ＣＤＨ２３）、ＣＥＰ２５０）、ＣＩＢ２）、ＤＦＮＢ３１）、ＧＰＲ９８）、ＨＡＲＳ）、ＭＹＯ７Ａ）、ＰＣＤＨ１５）、ＵＳＨ１Ｃ）、ＵＳＨ１Ｇ）、ＮＤＰ）、ＰＧＫ１）、ＣＡＰＮ５）、ＦＺＤ４）、ＩＴＭ２Ｂ）、ＬＲＰ５）、ＭＩＲ２０４）、ＲＢ１）、ＴＳＰＡＮ１２）、Ｃ１２ｏｒｆ６５）、ＣＤＨ３）、ＭＦＲＰ）、ＯＡＴ）、ＰＬＡ２Ｇ５）、ＲＢＰ４）、ＲＧＳ９）、ＲＧＳ９ＢＰ）、ＡＲＭＳ２、ＥＲＣＣ６）、ＦＢＬＮ５）、ＨＴＲＡ１）、ＴＬＲ３）、およびＴＬＲ４）が含まれる。
遺伝子産物がアポトーシスを誘導または促進する遺伝子は、本明細書では「アポトーシス促進遺伝子」と称され、これらの遺伝子の産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）は、「アポトーシス促進遺伝子産物」と称される。アポトーシス促進標的には、例えば、Ｂａｘ遺伝子産物、Ｂｉｄ遺伝子産物、Ｂａｋ遺伝子産物、Ｂａｄ遺伝子産物、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－Ｘ１が含まれる。抗アポトーシス遺伝子産物には、アポトーシスのＸ連鎖阻害剤が含まれる。
遺伝子産物が血管新生を誘導または促進する遺伝子は、本明細書では「血管新生促進遺伝子」と称され、これらの遺伝子の産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）は、「血管新生促進遺伝子産物」と称される。血管新生促進標的には、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦａ、ＶＥＧＦｂ、ＶＥＧＦｃ、ＶＥＧＦｄ）、血管内皮成長因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（Ｆｌｔ１）、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン、ソニックヘッジホッグが含まれる。遺伝子産物が血管新生を阻害する遺伝子は、本明細書では「抗血管新生遺伝子」と称され、これらの遺伝子の産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）は、「抗血管新生遺伝子産物」と称される。抗血管新生遺伝子産物には、エンドスタチン；タムスタチン；アンジオスタチン；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、ならびに血管新生促進標的および／またはそれらの受容体に特異的な融合タンパク質または抗体、例えば、抗ＶＥＧＦ融合タンパク質ｓＦＬＴ１またはＥｙｌｅａ、ＶＥＧＦ特異的抗体Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）、およびＡｖａｓｔｉｎ（商標）などが含まれる。
いくつかの実施形態では、主題のＡＡＶ変異体によって送達される遺伝子産物（複数可）は、血管新生を阻害するように作用する。ある特定の好ましい実施形態では、主題のＡＡＶ変異体によって送達される遺伝子産物（複数可）は、ＶＥＧＦａ、ＶＥＧＦｂ、ＶＥＧＦｃ、ＶＥＧＦｄ、およびＰＧＦからなる群から選択される１つ以上の哺乳動物ＶＥＧＦタンパク質の活性を阻害するように作用する。特に好ましい実施形態では、主題のＡＡＶ変異体によって送達される遺伝子産物（複数可）は、ＶＥＧＦａの活性を阻害する。ＶＥＧＦａは、代替スプライシングによって生成される９つのアイソフォームを有し、その中で最も生理学的に関連するのは、ＶＥＧＦ１６５である。ＶＥＧＦａレベルは、滲出性加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、および網膜静脈閉塞を有する患者の硝子体内で上昇することが見出されている。眼内でのＶＥＧＦａの活性を阻害し、したがって硝子体ＶＥＧＦａが上昇している患者の治療に有効な遺伝子産物には、アフリベルセプト、ラニビズマブ、ブロルシズマブ、ベバシズマブ、および可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦＬＴ１）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０１１３４）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、（ｉ）本明細書に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質、および（ｉｉ）各々が異なるＶＥＧＦａ阻害剤をコードする複数の配列を含む異種核酸を含む、感染性組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンが提供される。
好ましい一実施形態では、遺伝子産物は、アフリベルセプトである。アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合したヒトＶＥＧＦ受容体１および２の細胞外ドメインを含む、組換え融合タンパク質である。アフリベルセプトは、天然受容体よりも大きな親和性でＶＥＧＦａおよびＰＧＦに結合する可溶性デコイ受容体として機能する。硝子体内アフリベルセプト注射の承認用量は、２．０ｍｇであり、この投薬量は、適応症に応じて変化する。アフリベルセプトは、新生血管（滲出性）加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、および糖尿病性網膜症の治療に適応される。特に好ましい実施形態では、アフリベルセプトをコードする新規のコドン最適化核酸配列（図１２Ａに対応する）が提供され、これは、以下を含むか、または以下からなる。
Figure 2024015194000019
いくつかの実施形態では、アフリベルセプトをコードする核酸配列が提供され、これは、配列番号６５に示される核酸配列の全長に対して、または配列番号６５のヌクレオチド７９～１３７７（Ｆｌｔ１シグナル配列をコードする下線付きヌクレオチドを含まない）に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上の核酸同一性を有する核酸配列を含む。関連する実施形態では、主題のＡＡＶ変異体（複数可）によって送達される遺伝子産物（複数可）は、配列番号６５の核酸配列、またはそれと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一の核酸からなるか、またはそれを含む核酸配列によってコードされる。他の関連する実施形態では、主題のＡＡＶ変異体によって送達される遺伝子産物（複数可）は、以下のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列を含む：
Figure 2024015194000020
他の関連する実施形態では、ＡＡＶ変異体（複数可）は、配列番号６６のアミノ酸２７～４５８と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列（下線付きシグナルペプチド配列を含まない、アフリベルセプトのアミノ酸配列に対応する）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
別の好ましい実施形態では、遺伝子産物は、ラニビズマブの一本鎖バージョン（ｓｃ－ラニビズマブ）である。ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））は、ＶＥＧＦａの全てのアイソフォームに結合し、それを遮断する、モノクローナルＩｇＧ１抗体断片（Ｆａｂ）である。ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）は、定常軽（ＣＬ）ドメインと定常重１（ＣＨ１）ドメインとの間のジスルフィド結合によって接合された２つの別個の鎖（軽鎖および重鎖）として細菌内で発現する。硝子体内ラニビズマブの承認用量は、適応症に応じて０．０５ｍＬ中０．３または０．５ｍｇのいずれかである。ラニビズマブは、滲出性加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、および糖尿病性網膜症の治療に承認されている。特に好ましい実施形態では、図１２Ｃに対応するラニビズマブの一本鎖重軽（ＨＬ）形態（ｓｃ－ラニビズマブＨＬ）をコードする新規のコドン最適化核酸配列が提供され、核酸配列は、以下を含むか、またはそれからなる：
Figure 2024015194000021
いくつかの実施形態では、ｓｃ－ラニビズマブＨＬをコードする核酸配列が提供され、これは、配列番号６７に示される核酸配列の全長に対して、または配列番号６７のヌクレオチド５８～１５７５（ヒトＩＧＨＶ７－８シグナル配列をコードする下線付きヌクレオチドを含まない）に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上の核酸同一性を有する核酸配列を含む。関連する実施形態では、主題のＡＡＶ変異体（複数可）によって送達される遺伝子産物（複数可）は、配列番号６７の核酸配列、またはそれと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一の核酸からなるか、またはそれを含む核酸配列によってコードされる。他の関連する実施形態では、主題のＡＡＶ変異体（複数可）によって送達される遺伝子産物（複数可）は、以下のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列を含む：
Figure 2024015194000022
他の関連する実施形態では、ＡＡＶ変異体（複数可）は、配列番号６８のアミノ酸２０～５２４と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列（下線付きシグナルペプチド配列を含まない、ｓｃ－ラニビズマブＨＬのアミノ酸配列に対応する）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
別の特に好ましい実施形態では、図１２Ｂに対応するラニビズマブの一本鎖軽重（ＬＨ）形態（ｓｃ－ラニビズマブＬＨ）をコードする新規のコドン最適化核酸配列が提供され、核酸配列は、以下を含むか、またはそれからなる：
Figure 2024015194000023
別の特に好ましい実施形態では、図１２Ｂに対応するラニビズマブの一本鎖軽重（ＬＨ）形態（ｓｃ－ラニビズマブＬＨ）をコードする新規のコドン最適化核酸配列が提供され、核酸配列は、以下を含むか、またはそれからなる：
Figure 2024015194000024
いくつかの実施形態では、ｓｃ－ラニビズマブＬＨをコードする核酸配列が提供され、これは、配列番号６９もしくは配列番号７０に示される核酸配列の全長に対して、または配列番号６９もしくは配列番号７０のヌクレオチド６１～１５７８（Ｉｇカッパシグナル配列をコードする下線付きヌクレオチドを含まない）に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上の核酸同一性を有する核酸配列を含む。関連する実施形態では、主題のＡＡＶ変異体（複数可）によって送達される遺伝子産物（複数可）は、配列番号６９もしくは配列番号７０の核酸配列、またはそれと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一の核酸からなるか、またはそれを含む核酸配列によってコードされる。他の関連する実施形態では、主題のＡＡＶ変異体（複数可）によって送達される遺伝子産物（複数可）は、以下のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列を含む：
Figure 2024015194000025
他の関連する実施形態では、ＡＡＶ変異体（複数可）は、配列番号７１のアミノ酸２１～５２５と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列（下線付きシグナルペプチド配列を含まない、ｓｃ－ラニビズマブＬＨのアミノ酸配列に対応する）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
別の好ましい実施形態では、図１２Ｅに対応するヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したラニビズマブの一本鎖軽重（ＬＨ）形態（ｓｃ－ラニビズマブ－Ｆｃ）をコードする新規の核酸配列が提供され、核酸配列は、以下を含むか、またはそれからなる：
Figure 2024015194000026
Figure 2024015194000027
いくつかの実施形態では、ｓｃ－ラニビズマブＦｃをコードする核酸配列が提供され、これは、配列番号７２に示される核酸配列の全長に対して、または配列番号７２のヌクレオチド６１～２２７７（Ｉｇカッパシグナル配列をコードする下線付きヌクレオチドを含まない）に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上の核酸同一性を有する核酸配列を含む。関連する実施形態では、主題のＡＡＶ変異体によって送達される遺伝子産物（複数可）は、配列番号７２の核酸配列、またはそれと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一の核酸からなるか、またはそれを含む核酸配列によってコードされる。他の関連する実施形態では、主題のＡＡＶ変異体（複数可）によって送達される遺伝子産物（複数可）は、以下のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列を含む：
Figure 2024015194000028
他の関連する実施形態では、ＡＡＶ変異体（複数可）は、配列番号７３のアミノ酸２１～７５２と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列（下線付きシグナルペプチド配列を含まない、ｓｃ－ラニビズマブ－Ｆｃのアミノ酸配列に対応する）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
別の好ましい実施形態では、遺伝子産物は、ブロルシズマブである。ブロルシズマブ（ＲＴＨ２５８）は、ＶＥＧＦａの全てのアイソフォームに結合し、それを遮断する、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ブロルシズマブは現在、滲出性加齢黄斑変性の治療のための３ｍｇおよび６ｍｇの用量を評価する第ＩＩＩ相臨床研究中である。特に好ましい実施形態では、ブロルシズマブをコードする新規のコドン最適化核酸配列（図１２Ｄに対応する）が提供され、核酸配列は、以下を含むか、または以下からなる。
Figure 2024015194000029
いくつかの実施形態では、ブロルシズマブをコードする核酸配列が提供され、これは、配列番号７４に示される核酸配列の全長に対して、または配列番号７４のヌクレオチド６１～８１６（Ｉｇカッパシグナル配列をコードする下線付きヌクレオチドを含まない）に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上の核酸同一性を有する核酸配列を含む。関連する実施形態では、主題のＡＡＶ変異体によって送達される遺伝子産物（複数可）は、配列番号７４の核酸配列、またはそれと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一の核酸からなるか、またはそれを含む核酸配列によってコードされる。他の関連する実施形態では、主題のＡＡＶ変異体によって送達される遺伝子産物（複数可）は、以下のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列を含む：
Figure 2024015194000030
他の関連する実施形態では、ＡＡＶ変異体（複数可）は、配列番号７５のアミノ酸２１～２７１と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列（下線付きシグナルペプチド配列を含まない、ブロルシズマブのアミノ酸配列に対応する）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
別の好ましい実施形態では、図１２Ｆに対応するヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したブロルシズマブ（ブロルシズマブ－Ｆｃ）をコードする新規の核酸配列が提供され、核酸配列は、以下を含むか、またはそれからなる：
Figure 2024015194000031
いくつかの実施形態では、ブロルシズマブ－Ｆｃをコードする核酸配列が提供され、これは、配列番号７６に示される核酸配列の全長に対して、または配列番号７６のヌクレオチド６１～１５３０（Ｉｇカッパシグナル配列をコードする下線付きヌクレオチドを含まない）に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上の核酸同一性を有する核酸配列を含む。関連する実施形態では、主題のＡＡＶ変異体によって送達される遺伝子産物（複数可）は、配列番号７６の核酸配列、またはそれと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一の核酸からなるか、またはそれを含む核酸配列によってコードされる。他の関連する実施形態では、主題のＡＡＶ変異体によって送達される遺伝子産物（複数可）は、以下のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列を含む：
Figure 2024015194000032
他の関連する実施形態では、ＡＡＶ変異体（複数可）は、配列番号７７のアミノ酸２１～４９８と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列（下線付きシグナルペプチド配列を含まない、ブロルシズマブ－Ｆｃのアミノ酸配列に対応する）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
特に好ましい実施形態では、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してキャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入を含む変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む、感染性組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンが提供され、ペプチド挿入は、アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）またはＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、およびＶＥＧＦ、好ましくはＶＥＧＦａの活性を阻害するポリペプチドをコードする異種核酸を含み、変異キャプシドタンパク質は、網膜細胞に対する対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。いくつかの実施形態では、挿入部位は、ＡＡＶ２（配列番号２）のＶＰ１のアミノ酸５８７および５８８に対応するアミノ酸の間、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質中の対応する位置にある。好ましくは、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２（配列番号２）のＶＰ１キャプシドに対するＰ３４Ａアミノ酸置換、または別のＡＡＶ血清型における対応する置換も含む。
いくつかの実施形態では、（ｉ）ＡＡＶ２（配列番号２）のＶＰ１のアミノ酸５８７および５８８に対応するアミノ酸の間、または対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してキャプシドタンパク質の別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質中の対応する位置におけるペプチド挿入、ならびに（ｉｉ）ＡＡＶ２（配列番号２）のＶＰ１キャプシドに対するＰ３４Ａアミノ酸置換、または別のＡＡＶ血清型における対応する置換、ならびにアフリベルセプトをコードする配列を含む異種核酸を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンが提供される。好ましい実施形態では、アフリベルセプトをコードする核酸配列は、配列番号６５の核酸配列、またはそれと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一の核酸からなるか、またはそれを含む。特に好ましい実施形態では、配列番号４２として示される配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する変異ＡＡＶキャプシドタンパク質、および配列番号６５の核酸配列を含む異種核酸を含む、ｒＡＡＶビリオンが提供され、変異キャプシドタンパク質は、網膜細胞に対する対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。他の関連する実施形態では、異種核酸は、好ましくはラニビズマブ、ｓｃ－ラニビズマブＨＬ、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ、ｓｃ－ラニビズマブ－Ｆｃ、ブロルシズマブ、およびブロルシズマブ－Ｆｃから選択される追加のＶＥＧＦａ阻害剤を各々コードする、１つ以上の配列をさらに含む。関連する実施形態では、そのようなｒＡＡＶを含む薬学的組成物が提供される。他の関連する実施形態では、ＶＥＧＦａ関連眼疾患を治療するための方法が提供され、この方法は、有効量のｒＡＡＶビリオンを、ＶＥＧＦａ関連眼疾患の治療を必要とする対象に投与することを含み、このｒＡＡＶビリオンは、配列番号４２として示される配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する変異ＡＡＶキャプシドタンパク質、および配列番号６５の核酸配列を含む異種核酸、および任意選択で、各々が異なるＶＥＧＦａ阻害剤をコードする１つ以上の追加の核酸配列を含む。ｒＡＡＶは、網膜下、脈絡膜上、局所、前房内、または硝子体内注射によって投与され得るが、好ましくは硝子体内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦａ関連眼疾患は、滲出型（新生血管、滲出性）加齢黄斑変性；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；網膜静脈閉塞に起因する網膜血管新生；糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症（非増殖性糖尿病性網膜症および増殖性糖尿病性網膜症の全段階を含む）、近視性黄斑変性、網膜静脈分枝閉塞、半網膜静脈閉塞、および網膜中心静脈閉塞；未熟児網膜症；特発性脈絡膜新生血管；近視黄斑変性ならびに続発性網膜および脈絡膜新生血管；網膜毛細血管拡張症；血管新生緑内障；硝子体出血；ぶどう膜炎（ｕｖｅｔｉｓ）、外傷、網膜変性障害、遺伝性網膜および／または脈絡膜疾患、眼腫瘍、角膜および虹彩血管新生を含むがこれらに限定されない、網膜疾患に続発する網膜および脈絡膜新生血管から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、ＶＥＧＦａ関連眼疾患は、滲出型（新生血管、滲出性）加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、および近視性脈絡膜血管新生から選択される。
いくつかの実施形態では、（ｉ）ＡＡＶ２（配列番号２）のＶＰ１のアミノ酸５８７および５８８に対応するアミノ酸の間、または対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してキャプシドタンパク質の別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質中の対応する位置におけるペプチド挿入、ならびに（ｉｉ）ＡＡＶ２（配列番号２）のＶＰ１キャプシドに対するＰ３４Ａアミノ酸置換、または別のＡＡＶ血清型における対応する置換、ならびにラニビズマブ、ｓｃ－ラニビズマブＨＬ、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ、またはｓｃ－ラニビズマブ－Ｆｃをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンが提供される。好ましい実施形態では、ｓｃ－ラニビズマブをコードする核酸配列は、配列番号６７、６９、７０、および７２のうちのいずれか１つに示される核酸配列からなるか、もしくはそれを含むか、またはそれと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一である。特に好ましい実施形態では、配列番号４２として示される配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する変異ＡＡＶキャプシドタンパク質、ならびに配列番号６７、６９、７０、および７２のうちのいずれか１つの核酸配列を含む異種核酸を含む、ｒＡＡＶビリオンが提供され、変異キャプシドタンパク質は、網膜細胞に対する対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。他の関連する実施形態では、異種核酸は、好ましくはアフリベルセプト、ブロルシズマブ、およびブロルシズマブ－Ｆｃから選択される異なるＶＥＧＦａ阻害剤を各々コードする、１つ以上の追加の核酸配列をさらに含む。関連する実施形態では、そのようなｒＡＡＶを含む薬学的組成物が提供される。他の関連する実施形態では、眼内ＶＥＧＦａの上昇に関連する眼疾患を治療するための方法が提供され、この方法は、有効量のｒＡＡＶビリオンを、眼内ＶＥＧＦａの上昇に関連する眼疾患の治療を必要とする対象に投与することを含み、このｒＡＡＶビリオンは、配列番号４２として示される配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する変異ＡＡＶキャプシドタンパク質、ならびに配列番号６７、６９、７０、および７２のうちのいずれか１つの核酸配列を含む異種核酸配列を含む。好ましくは、ｒＡＡＶは、硝子体内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦａ関連眼疾患は、滲出型（新生血管、滲出性）加齢黄斑変性；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；網膜静脈閉塞に起因する網膜血管新生；糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症（非増殖性糖尿病性網膜症および増殖性糖尿病性網膜症の全段階を含む）、近視性黄斑変性、網膜静脈分枝閉塞、半網膜静脈閉塞、および網膜中心静脈閉塞；未熟児網膜症；特発性脈絡膜新生血管；近視黄斑変性ならびに続発性網膜および脈絡膜新生血管；網膜毛細血管拡張症；血管新生緑内障；硝子体出血；ぶどう膜炎、外傷、網膜変性障害、遺伝性網膜および／または脈絡膜疾患、眼腫瘍、角膜および虹彩血管新生を含むがこれらに限定されない、網膜疾患に続発する網膜および脈絡膜新生血管から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、ＶＥＧＦａ関連眼疾患は、滲出型（新生血管、滲出性）加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、および近視性脈絡膜血管新生から選択される。
いくつかの実施形態では、（ｉ）ＡＡＶ２（配列番号２）のＶＰ１のアミノ酸５８７および５８８に対応するアミノ酸の間、または対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してキャプシドタンパク質の別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質中の対応する位置におけるペプチド挿入、ならびに（ｉｉ）ＡＡＶ２（配列番号２）のＶＰ１キャプシドに対するＰ３４Ａアミノ酸置換、または別のＡＡＶ血清型における対応する置換、ならびにブロルシズマブまたはブロルシズマブ－Ｆｃをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンが提供される。好ましい実施形態では、ブロルシズマブまたはブロルシズマブ－Ｆｃをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７４または配列番号７６に示される核酸配列からなるか、もしくはそれを含むか、またはそれと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一である。特に好ましい実施形態では、配列番号４２として示される配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する変異ＡＡＶキャプシドタンパク質、および配列番号７４または配列番号７６の核酸配列を含む異種核酸を含む、ｒＡＡＶビリオンが提供され、変異キャプシドタンパク質は、網膜細胞に対する対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。他の関連する実施形態では、異種核酸は、好ましくはアフリベルセプト、ラニビズマブ、ｓｃ－ラニビズマブＨＬ、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ、およびｓｃ－ラニビズマブ－Ｆｃから選択される異なるＶＥＧＦａ阻害剤を各々コードする、１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含む。関連する実施形態では、そのようなｒＡＡＶを含む薬学的組成物が提供される。他の関連する実施形態では、眼内ＶＥＧＦａの上昇に関連する眼疾患を治療するための方法が提供され、この方法は、有効量のｒＡＡＶビリオンを、眼内ＶＥＧＦａの上昇に関連する眼疾患の治療を必要とする対象に投与することを含み、このｒＡＡＶビリオンは、配列番号４２として示される配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する変異ＡＡＶキャプシドタンパク質、および配列番号７４または配列番号７６の核酸配列を含む異種核酸配列を含む。好ましくは、ｒＡＡＶは、硝子体内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦａ関連眼疾患は、滲出型（新生血管、滲出性）加齢黄斑変性；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；網膜静脈閉塞に起因する網膜血管新生；糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症（非増殖性糖尿病性網膜症および増殖性糖尿病性網膜症の全段階を含む）、近視性黄斑変性、網膜静脈分枝閉塞、半網膜静脈閉塞、および網膜中心静脈閉塞；未熟児網膜症；特発性脈絡膜新生血管；近視黄斑変性ならびに続発性網膜および脈絡膜新生血管；網膜毛細血管拡張症；血管新生緑内障；硝子体出血；ぶどう膜炎、外傷、網膜変性障害、遺伝性網膜および／または脈絡膜疾患、眼腫瘍、角膜および虹彩血管新生を含むがこれらに限定されない、網膜疾患に続発する網膜および脈絡膜新生血管から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、ＶＥＧＦａ関連眼疾患は、滲出型（新生血管、滲出性）加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、および近視性脈絡膜血管新生から選択される。
遺伝子産物が免疫調節因子、例えば、補体因子、Ｔｏｌｌ様受容体として機能する遺伝子は、「免疫調節遺伝子」と称される。例示的な免疫調節遺伝子には、サイトカイン、ケモカイン、ならびにそれらおよび／またはそれらの受容体に特異的な融合タンパク質または抗体、例えば、抗ＩＬ－６融合タンパク質Ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ（商標）、補体因子Ｈ特異的抗体ランパミズマブなどが含まれる。遺伝子産物が神経保護因子、例えば、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ニュールツリン（ＮＴＮ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、表皮成長因子として機能する遺伝子。遺伝子産物が光応答性オプシン、例えば、オプシン、ロドプシン、チャネルロドプシン、ハロロドプシンとして機能する遺伝子。
いくつかの事例では、目的の遺伝子産物は、例えば、エンドヌクレアーゼが網膜疾患に関連する対立遺伝子をノックアウトする場合、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的エンドヌクレアーゼである。例えば、優性対立遺伝子が、野生型の場合に網膜構造タンパク質であり、かつ／または正常な網膜機能を提供する遺伝子の欠損コピーをコードする場合、部位特異的エンドヌクレアーゼは、欠損対立遺伝子を標的化し、欠損対立遺伝子をノックアウトすることができる。
欠損対立遺伝子をノックアウトすることに加えて、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、欠損対立遺伝子によってコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするドナーＤＮＡによる相同的組換えを刺激することもできる。したがって、例えば、主題のｒＡＡＶビリオンを使用して、欠損対立遺伝子をノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼの両方を送達することができ、またそれを使用して、欠損対立遺伝子の機能的コピーを送達し、欠損対立遺伝子の修復をもたらし、それによって機能的網膜タンパク質（例えば、機能的レチノスキシン、機能的ＲＰＥ６５、機能的ペリフェリンなど）の産生をもたらすことができる。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ４７５：２１７を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオンは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする異種ヌクレオチド配列、および機能的コピーが機能的網膜タンパク質をコードする場合、欠損対立遺伝子の機能的コピーをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。機能的網膜タンパク質には、例えば、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＧＰＲ）相互作用タンパク質－１、ペリフェリン、ペリフェリン－２などが含まれる。
使用に好適な部位特異的エンドヌクレアーゼには、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびそのような部位特異的エンドヌクレアーゼが天然に存在せず、特定の遺伝子を標的化するように修飾されている場合には、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）が含まれる。そのような部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の位置を切断するように操作することができ、次いで非相同末端接合により、いくつかのヌクレオチドを挿入または欠失させながら破断を修復することができる。そのような部位特異的エンドヌクレアーゼ（「ＩＮＤＥＬ」とも称される）は、次いでタンパク質を枠外に投げ出し、効果的に遺伝子をノックアウトする。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。
本明細書に開示される変異ｒＡＡＶベクターのいくつかの実施形態では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結される。好適な構成的プロモーターには、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）（Ｓｔｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５５（２）：４３１－４４１）、ＣＭＶ早期エンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター／ウサギβ－グロビンイントロン（ＣＡＧ）（Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ７９（２）：２６９－２７７、ＣＢＳＢ（Ｊａｃｏｂｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ１３（６）：１０７４－１０８４）、ヒト伸長因子１αプロモーター（ＥＦ１α）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ９１（２）：２１７－２２３）、ヒトホスホグリセレートキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）（Ｓｉｎｇｅｒ－Ｓａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｇｅｎｅ３２（３）：４０９－４１７、ミトコンドリア重鎖プロモーター（Ｌｏｄｅｒｉｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＮＡＳ１０９（１７）：６５１３－６５１８）、ユビキチンプロモーター（Ｗｕｌｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ２６１：１０１－１０５）が含まれる。他の実施形態では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの事例では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、組織特異的または細胞型特異的制御要素に作動可能に連結される。例えば、いくつかの事例では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、光受容体特異的制御要素（例えば、光受容体特異的プロモーター）、例えば、光受容細胞内の作動可能に連結された遺伝子の選択的発現を付与する制御要素に作動可能に連結される。好適な光受容体特異的制御要素には、例えば、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）、ベータホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９：１０１５）、網膜色素変性遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄら（２００７）（上記））、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄら（２００７）（上記））、ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５５：２２５）、オプシン遺伝子プロモーター（Ｔｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＰＮＡＳ９１：２６１１－２６１５）、レチノスキシン遺伝子プロモーター（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１６（７）：９１６－９２６）、ＣＲＸホメオドメインタンパク質遺伝子プロモーター（Ｆｕｒｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ２２（５）：１６４０－１６４７）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質アルファ形質導入活性ポリペプチド１（ＧＮＡＴ１）遺伝子プロモーター（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１７：１３９０－１３９９）、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）遺伝子プロモーター（Ａｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＰＮＡＳ１０３（１０）：３８９０－３８９５）、ヒト錐体アレスチン（ｈＣＡＲ）プロモーター（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ４３：１３７５－１３８３）、ならびにＰＲ２．１、ＰＲ１．７、ＰＲ１．５、およびＰＲ１．１プロモーター（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ２７（１）：７２－８２））が含まれる。いくつかの事例では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞特異的制御要素（例えば、ＲＰＥ特異的プロモーター）、例えば、ＲＰＥ細胞内の作動可能に連結された遺伝子の選択的発現を付与する制御要素に作動可能に連結される。好適なＲＰＥ特異的制御要素には、例えば、ＲＰＥ６５遺伝子プロモーター（Ｍｅｕｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１４：２９２－３０３）、細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）遺伝子プロモーター（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７３：５５９１－５５９８）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ、別名セルピンＦ１）遺伝子プロモーター（Ｋｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９３（１－２）：６３－６９）、および卵黄様黄斑変性（ＶＭＤ２）プロモーター（Ｅｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７９（１８）：１９０６４－１９０７３）が含まれる。いくつかの事例では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、ミュラーグリア細胞特異的制御要素（例えば、グリア特異的プロモーター）、例えば、網膜グリア細胞内の作動可能に連結された遺伝子の選択的発現を付与する制御要素に作動可能に連結される。好適なグリア特異的制御要素には、例えば、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（Ｂｅｓｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６６（２８）：１８８７７－１８８８３）が含まれる。いくつかの事例では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、双極細胞特異的制御要素（例えば、双極特異的プロモーター）、例えば、双極細胞内の作動可能に連結された遺伝子の選択的発現を付与する制御要素に作動可能に連結される。好適な双極特異的制御要素には、例えば、ＧＲＭ６プロモーター（Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＥＭＢＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ６（９）：１１７５－１１９０）が含まれる。
本発明の目的のために、本明細書の開示は、上記の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。単離された核酸は、ＡＡＶベクター、例えば、組換えＡＡＶベクターであり得る。
本明細書の開示はまた、網膜疾患を治療する方法を提供し、この方法は、上記かつ本明細書に開示される目的の導入遺伝子を含む有効量のｒＡＡＶ変異ビリオンを、網膜疾患の治療を必要とする個体に投与することを含む。当業者は、主題のｒＡＡＶビリオンの有効量と、１つ以上の機能的または解剖学的パラメータ、例えば、視力、視野、明暗に対する電気生理学的応答、色覚、対照感受性、生体構造、網膜の健康および脈管構造、眼球運動、凝視選択、ならびに安定性における変化について試験することによって疾患が治療されたこととを容易に決定することができる。
網膜機能およびその変化を評価するための非限定的な方法には、視力（例えば、最良矯正視力［ＢＣＶＡ］、歩行、ナビゲーション、物体検知、および識別）の評価、視野（例えば、静的および動的視野計測）の評価、臨床検査（例えば、前眼部および後眼部の細隙灯検査）の実施、明暗の全波長に対する電気生理学的応答（例えば、あらゆる形態の網膜電図写真（ＥＲＧ）［全視野、多焦点、およびパターン］、あらゆる形態の視覚誘発電位（ＶＥＰ）、電気眼球図記録（ＥＯＧ）、色覚、暗順応、および／または対比感度）の評価が含まれる。生体構造および網膜の健康ならびにその変化を評価するための非限定的な方法には、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）、眼底撮影、補償光学走査レーザー検眼鏡（ＡＯ－ＳＬＯ）、蛍光法、および／または自己蛍光法を使用する生体構造または健康の変化の測定；眼球運動および眼の動き（例えば、眼振、凝視、選択、および安定性）の測定、報告された結果（患者報告による視覚および非視覚誘導挙動および活動の変化、患者報告結果［ＰＲＯ］、生活の質のアンケート評価、日常活動の測定、ならびに神経機能の測定（例えば、機能的磁気共鳴画像法（ＭＲＩ））が含まれる。
いくつかの実施形態では、有効量の主題のｒＡＡＶビリオンにより、網膜機能、解剖学的一体性、または網膜の健康の喪失率の減少、例えば、２倍、３倍、４倍、または５倍以上の喪失率の減少、およびそれに従う疾患の進行の減少、例えば、喪失率の１０倍以上の減少、およびそれに従う疾患の進行の減少がもたらされる。いくつかの実施形態では、有効量の主題のｒＡＡＶビリオンにより、視覚機能、網膜機能の増大、網膜の生体構造もしくは健康の改善、ならびに／または眼球運動の改善および／もしくは神経機能の改善、例えば、２倍、３倍、４倍、または５倍以上の網膜機能、網膜の生体構造もしくは健康の改善、および／または眼球運動の改善、例えば、１０倍以上の網膜機能、網膜の生体構造もしくは健康の改善、および／または眼球運動の改善がもたらされる。当業者によって容易に理解されるように、所望の治療効果を達成するのに必要な用量は、典型的には、１×１０８～約１×１０１５の範囲内の組換えビリオンであり、これは、典型的には、当業者によって１×１０８～約１×１０１５「ベクターゲノム」と称される。
主題のｒＡＡＶビリオンは、眼内注射、例えば、硝子体内注射、網膜下注射、脈絡膜上注射、またはｒＡＡＶビリオンの眼への送達をもたらす任意の他の簡便な投与様式または投与経路によって、投与することができる。他の簡便な投与マンセストード（ｍａｎｃｅｓｔｏｄｅ）または投与経路には、非限定的に、静脈内、動脈内、眼周囲、前房内、結膜下およびテノン下（ｓｕｂ－ｔｅｎｏｎｓ）の注射、ならびに局所投与および鼻腔内が含まれる。硝子体内注射によって投与される場合、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体を通過して移動し、内境界膜（本明細書では内部境界膜、または「ＩＬＭ」とも称され、これは、星状細胞とミュラー細胞のエンドフィートとによって形成される、網膜と硝子体との間の境界を形成する網膜の表面にある薄く透明な無細胞性の膜である）を横断し、かつ／または対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンの能力と比較して、より効率的に網膜の層を通過して移動する。
本明細書に開示される変異キャプシドタンパク質は、単離、例えば、精製される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶベクターまたは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンに含まれる。他の実施形態では、そのようなＡＡＶ変異体ベクターおよび／またはＡＡＶ変異体ビリオンは、霊長類網膜内の眼疾患を治療するインビボまたはエクスビボの方法において使用される。
本明細書の開示は、宿主細胞、例えば、非限定的に、主題の核酸を含む単離された（遺伝子修飾された）宿主細胞をさらに提供する。本明細書に開示される本発明に従う宿主細胞は、インビトロ細胞培養物由来の細胞などの単離された細胞であり得る。そのような宿主細胞は、本明細書に記載のように、主題のｒＡＡＶ変異ビリオンを産生するために有用である。一実施形態では、そのような宿主細胞は、核酸によって安定的に遺伝子修飾される。他の実施形態では、宿主細胞は、核酸によって一過性に遺伝子修飾される。そのような核酸は、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介性トランスフェクションなどを含むがこれらに限定されない確立された技術を使用して、宿主細胞に安定的にまたは一過性に導入される。安定した形質転換のために、核酸は一般に、選択マーカー、例えば、ネオマイシン耐性などのいくつかの周知の選択可能マーカーのいずれかをさらに含む。そのような宿主細胞は、多様な細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞および霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）を含む）のいずれかに核酸を導入することによって生成される。例示的な哺乳動物細胞には、初代細胞および細胞株が含まれるが、これらに限定されず、例示的な細胞株には、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞などが含まれるが、これらに限定されない。例示的な宿主細胞には、非限定的に、ＨｅＬａ細胞（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ－２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞などが含まれる。宿主細胞は、ＡＡＶを産生するＳｆ９細胞などの昆虫細胞に感染させるためにバキュロウイルスを使用して作製することもできる（例えば、米国特許第７，２７１，００２号、米国特許出願第１２／２９７，９５８号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾された宿主細胞は、上記の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、１つ以上のＡＡＶ ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の実施形態では、宿主細胞は、ｒＡＡＶ変異ベクターをさらに含む。そのような宿主細胞を使用して、ｒＡＡＶ変異ビリオンを生成することができる。ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９２２号および米国特許出願公開第２００９／０２０２４９０号に記載されている。
本明細書の開示は、ａ）上記かつ本明細書に開示されるｒＡＡＶ変異ビリオンと、ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤とを含む、薬学的組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤は、ヒトまたは非ヒト患者における使用に好適である。そのような賦形剤、担体、希釈剤、および緩衝剤には、過度の毒性を伴わずに投与することができる任意の医薬品が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩が含まれてもよい。加えて、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などが、そのようなビヒクル中に存在してもよい。多種多様な薬学的に許容される賦形剤が当該技術分野で既知であり、本明細書で詳細に考察する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，”２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，７ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄ ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃを含む、多様な刊行物に十分に記載されている。本発明のいくつかの態様では、本発明は、約１×１０８～約１×１０１５の組換えウイルスまたは１×１０８～約１×１０１５のベクターゲノムを含む薬学的組成物を提供し、該組換えウイルスの各々は、１つ以上の遺伝子産物をコードするゲノムを含む。
本発明のいくつかの実施形態は、以下の項目１～３６に例示されている：
１．変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してキャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入を含み、ペプチド挿入が、アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）を含み、変異キャプシドタンパク質が、網膜細胞に対する対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する、変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質。
２．ペプチド挿入が、アミノ酸配列Ｙ１Ｙ２ＩＳＤＱＴＫＨＹ３を含み、Ｙ１～Ｙ３の各々が独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＰｒｏから選択される、項目１に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
３．ペプチド挿入が、アミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）を含む、項目２に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
４．挿入部位が、ＡＡＶ２（配列番号２）のＶＰ１のアミノ酸５８７および５８８に対応するアミノ酸の間、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質中の対応する位置にある、項目１～３のいずれか１項に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
５．キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２（配列番号２）のＶＰ１キャプシドに対する１つ以上のアミノ酸置換、または別のＡＡＶ血清型における１つ以上の対応する置換を含む、項目１～４のいずれか１項に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
６．キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２（配列番号２）のＶＰ１キャプシドに対するＰ３４Ａアミノ酸置換、または別のＡＡＶ血清型における対応する置換を含む、項目１～５のいずれか１項に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
７．キャプシドタンパク質が、（ｉ）アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）および（ｉｉ）Ｐ３４Ａアミノ酸置換を含み、かつ配列番号４２として示される配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９９％同一である、項目１～６のいずれか１項に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
８．キャプシドタンパク質が、配列番号４２として示されるアミノ酸配列から本質的になる、項目７に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
９．項目１～８のいずれか１項に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質、および遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオン。
１０．遺伝子産物が、ポリペプチドである、項目９に記載のｒＡＡＶ。
１１．異種核酸が、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の活性を阻害するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、項目１０に記載のｒＡＡＡＶ。
１２．ヌクレオチド配列が、融合タンパク質をコードする、項目１１に記載のｒＡＡＶ。
１３．ヌクレオチド配列が、アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ）をコードする、項目１２に記載のｒＡＡＶ。
１４．ヌクレオチド配列が、配列番号６５として示される核酸配列または配列番号６５のヌクレオチド７９～１３７７と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９９％同一であり、かつ好ましくは配列番号６６として示されるアミノ酸配列または配列番号６６のアミノ酸２７～４５８をコードする、項目１３に記載のｒＡＡＶ。
１５．ヌクレオチド配列が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする、項目１１に記載のｒＡＡＶ。
１６．ヌクレオチド配列が、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）をコードする、項目１５に記載のｒＡＡＶ。
１７．ヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号６７の配列（ｓｃ－ラニビズマブＨＬ）もしくは配列番号６７のヌクレオチド５８～１５７５と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含み、かつ配列番号６８として示されるアミノ酸配列をコードするか、または（ｉｉ）配列番号６８のアミノ酸２０～５２４のアミノ酸配列をコードする、項目１５に記載のｒＡＡＶ。
１８．ヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号６９（ｓｃ－ラニビズマブＬＨ１）もしくは配列番号７０（ｓｃ－ラニビズマブＬＨ２）の配列、または配列番号６９もしくは配列番号７０のヌクレオチド６１～１５７８と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９９％同一の配列を有し、かつ配列番号７１として示されるアミノ酸配列をコードするか、あるいは（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸２１～５２５のアミノ酸配列をコードする、項目１５に記載のｒＡＡＶ。
１９．ヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号７２の配列（ｓｃ－ラニビズマブ－Ｆｃ）もしくは配列番号７２のヌクレオチド６１～２２７７と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、もしくは少なくとも９９％同一の配列を有し、かつ配列番号７３として記載されるアミノ酸配列をコードするか、または（ｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列２１～７５２をコードする、項目１５に記載のｒＡＡＶ。
２０．ヌクレオチド配列が、ブロルシズマブをコードする、項目１５に記載のｒＡＡＶ。
２１．ヌクレオチド配列が、配列番号７４として示される核酸配列または配列番号７４のヌクレオチド６１～８１６と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９９％同一の配列を有し、かつ好ましくは配列番号７５として示されるアミノ酸配列または配列番号７５のアミノ酸２１～２７１のアミノ酸配列をコードする、項目２０に記載のｒＡＡＶ。
２２．ヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号７６の配列（ブロルシズマブ－Ｆｃ）もしくは配列番号７６のヌクレオチド６１～１５３０と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、もしくは少なくとも９９％同一の配列を有し、かつ配列番号７７として示されるアミノ酸配列をコードするか、または（ｉｉ）配列番号７７のアミノ酸２１～４９８のアミノ酸配列をコードする、項目１５に記載のｒＡＡＶ。
２３．異種核酸が、（ｉ）アフリベルセプトをコードする配列であって、好ましくは配列番号６５として示される核酸配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９９％同一であり、かつ配列番号６６として示されるアミノ酸配列をコードする、アフリベルセプトをコードする配列と、（ｉｉ）ブロルシズマブをコードする配列であって、好ましくは配列番号７４または配列番号７６として示される核酸配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９９％同一であり、かつ好ましくは配列番号７５または配列番号７７として示されるアミノ酸配列をコードする、ブロルシズマブをコードする配列とを含む、項目１１に記載のｒＡＡＶ。
２４．遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列が、発現制御配列に作動可能に連結される、項目９～２３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
２５．項目１１～２４のいずれかに記載のｒＡＡＶおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
２６．対象の網膜細胞、脈絡膜細胞、レンズ細胞、毛様細胞、虹彩細胞、視神経細胞、および／または角膜細胞にＶＥＧＦ阻害剤を送達するための方法であって、項目１１～２４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオンまたは項目２４に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法。
２７．ｒＡＡＶビリオンまたは薬学的組成物が、対象に硝子体内投与される、項目２６に記載の方法。
２８．有効量の項目１１～２４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶまたは有効量の項目２５に記載の組成物を対象に投与することによる、ＶＥＧＦａ関連眼疾患の治療を必要とする対象における、滲出型（新生血管、滲出性）加齢黄斑変性；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；網膜静脈閉塞に起因する網膜血管新生；糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症（非増殖性糖尿病性網膜症および増殖性糖尿病性網膜症の全段階を含む）；近視性黄斑変性；網膜静脈分枝閉塞、半網膜静脈閉塞、および網膜中心静脈閉塞；未熟児網膜症；特発性脈絡膜新生血管；近視黄斑変性ならびに続発性網膜および脈絡膜新生血管；網膜毛細血管拡張症；血管新生緑内障；硝子体出血；ぶどう膜炎、外傷、網膜変性障害、遺伝性網膜および／または脈絡膜疾患、眼腫瘍、角膜および虹彩血管新生を含むがこれらに限定されない、網膜疾患に続発する網膜および脈絡膜新生血管から選択される、ＶＥＧＦａ関連眼疾患を治療するための方法。
２９．ＶＥＧＦａ関連眼疾患が、滲出型（新生血管、滲出性）加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、および近視性脈絡膜血管新生から選択される、項目２８に記載の方法。
３０．ｒＡＡＶが、配列番号４２として示されるアミノ酸配列から本質的になるキャプシドタンパク質、およびアフリベルセプトをコードする配列を含む異種核酸を含み、好ましくはアフリベルセプトをコードする配列が、配列番号６５に示される配列を有する、項目２６～２９のいずれか１項に記載の方法。
３１．ｒＡＡＶが、配列番号４２として示されるアミノ酸配列から本質的になるキャプシドタンパク質、およびラニビズマブ、ｓｃ－ラニビズマブＨＬ、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ、またはｓｃ－ラニビズマブ－Ｆｃをコードする配列を含む異種核酸を含み、好ましくはｓｃ－ラニビズマブＨＬ、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ、またはｓｃ－ラニビズマブ－Ｆｃをコードする配列が、配列番号６７、６９、７０、および７２のうちのいずれか１つに示される配列を有する、項目２６～２９のいずれか１項に記載の方法。
３２．ｒＡＡＶが、配列番号４２として示されるアミノ酸配列から本質的になるキャプシドタンパク質、およびブロリシズマブまたはブロリシズマブ－Ｆｃをコードする配列を含む異種核酸を含み、好ましくはブロリシズマブまたはブロリシズマブ－Ｆｃをコードする配列が、配列番号７４または配列番号７６に示される配列を有する、項目２６～２９のいずれか１項に記載の方法。
３３．ｒＡＡＶまたは薬学的組成物が、対象に硝子体内投与される、項目２８～３２のいずれか１項に記載の方法。
３４．対象が、ヒトである、項目２６～３３のいずれか１項に記載の方法。
３５．項目１～８のいずれか１項に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
３６．項目３５に記載の核酸を含む、単離され、遺伝子修飾された宿主細胞。
以下の実施例は、本発明を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、発明者が発明と見なすものの範囲を制限することを意図するものではなく、以下の実験が行われた全てまたは唯一の実験であると表すことを意図するものでもない。使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、いくつかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別途示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
分子生化学および細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ１９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ１９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ１９９７）、およびＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９８）などの標準的な教本に見出すことができ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示で言及される遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＣｌｏｎＴｅｃｈなどの商用供給業者から入手可能である。
実施例１
硝子体内注射および組織採取。４～１０歳で体重が少なくとも４ｋｇの単体の雄のカニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に、強膜を介した（ヒトでの使用に好適な手順および送達デバイスを使用して輪部の約３ｍｍ後ろの）硝子体内注射によって投薬した。動物を麻酔し、局所麻酔剤を与えた。１００μＬのライブラリを各眼に投与した。
１４日目±３日に１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムの静脈内注射を使用して、訓練された獣医スタッフによって安楽死を行った。眼を核形成させ、解剖まで４℃で保存した。
組織解剖。眼をメスで鋸状縁に沿って切断し、前部を除去した。網膜の平らな取付けを可能にするために、中心窩周囲の網膜にレリーフカットを作製し、硝子体を除去した。図２に示されるように、各四半部（上側、下側、鼻側、および側頭側）から網膜の６つの試料を採取し、ＲＰＥ細胞、光受容体、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、および／または神経節細胞に対応する細胞物質を単離した。
定向進化。定向進化プロセスを図１Ａ～１Ｅに示す。端的には、ＤＮＡ突然変異技術とｃａｐ遺伝子との２０以上の独自の組み合わせを含むウイルスキャプシドライブラリを創出する（図１Ａ）。次いで、各粒子がそのキャプシドをコードするｃａｐ遺伝子を囲む突然変異キャプシドで構成され、精製されるように、ウイルスをパッケージングする（図１Ｂ）。キャプシドライブラリをインビボの選択圧下に置く。目的の組織または細胞物質を採取し、その標的の感染に成功したＡＡＶ変異体の単離し、成功したウイルスを回収する。成功したクローンを反復選択により富化する（段階Ｉ－図１Ｄ）。次いで、選択されたｃａｐ遺伝子に独自の再多様化を行い、さらなる選択ステップによって富化して、反復的にウイルスの適合度を反復的に増加させる（段階２－図１Ｄ）。ベクター選択段階１および２中に同定された変異体は、霊長類網膜細胞を形質導入する能力を実証する（図１Ｅ）。
ＡＡＶキャプシドゲノムの回収の成功：ラウンド１～６。各選択ラウンドから回収されたキャプシドを使用して、注入されたライブラリをパッケージングして、その後の選択ラウンドを開始した。組織からのキャプシド遺伝子の回収は、目的の組織へのライブラリベクターの内在化に成功したことを表す。ラウンド４の後、ラウンド５のライブラリパッケージングおよび注入の前に、ライブラリの追加の再多様化を組み込んだ。代表的な選択ラウンドからのＲＰＥ、ＰＲ、内顆粒層（ＩＮＬ）、および神経節細胞層（ＧＣＬ）網膜組織由来のウイルスゲノムの回収を図３に示す。ボックス内のバンドは、ウイルスゲノムの回収に成功したことを表す。
シークエンシング分析：ラウンド３～６。ラウンド３～６では、ライブラリ内の個々のクローンについてシークエンシングを行って、集団内の変異体の頻度を決定した。変異体を、シークエンシングデータ内のモチーフの存在について評価した。変異体を、複数の配列で生じた統一的変異（例えば、キャプシド内の一貫した位置における特定の点突然変異または特異的なペプチド挿入配列）の存在に基づいてモチーフに分類した。２回以上の選択ラウンドでシークエンシングした集団の少なくとも５％、または１回以上の選択ラウンドでシークエンシングした集団の少なくとも１０％を表すモチーフを、図４Ａ（ラウンド３シークエンシング分析）、４Ｂ（ラウンド４シークエンシング分析）、４Ｃ（ラウンド５シークエンシング分析）、および４Ｄ（ラウンド６シークエンシング分析）に表す。
網膜細胞の増加した感染性を付与すると同定されたいくつかの代表的なクローンを、以下の表１に列挙する（各クローンは、同定された置換（複数可）および／またはペプチド挿入を含み、他の点では配列番号２と同一であり、各クローンについて、選択ラウンド、配列番号、および頻度（括弧内）を列挙する）。
Figure 2024015194000033
Figure 2024015194000034
Figure 2024015194000035
Figure 2024015194000036
１つ以上の網膜細胞の増加した感染性を有するキャプシドとして、以下の祖先ＶＰ１キャプシド配列を有するクローンも同定した：
Figure 2024015194000037
この祖先のキャプシド変異体は、祖先キャプシド配列番号５８から進化しており、ここでは、縮重の位置（残基２６４、２６６、２６８、４４８、４５９、４６０、４６７、４７０、４７１、４７４、４９５、５１６、５３３、５４７、５５１、５５５、５５７、５６１、５６３、５７７、５８３、５９３、５９６、６６１、６６２、６６４、６６５、７１０、７１７、７１８、７１９、７２３）が、２６４でアラニン（Ａ）、２６６でアラニン（Ａ）、２６８でセリン（Ｓ）、４４８でアラニン（Ａ）、４５９でトレオニン（Ｔ）、４６０でアルギニン（Ｒ）、４６７でアラニン（Ａ）、４７０でセリン（Ｓ）、４７１でアスパラギン（Ｎ）、４７４でアラニン（Ａ）、４９５でセリン（Ｓ）、５１６でアスパラギン（Ｄ）、５３３でアスパラギン（Ｄ）、５４７でグルタミン（Ｑ）、５５１でアラニン（Ａ）、５５５でアラニネト（Ａ）、５５７でグルタミン酸（Ｅ）、５６１でメチオニン（Ｍ）、５６３でセリン（Ｓ）、５７７でグルタミン（Ｑ）、５８３でセリン（Ｓ）、５９３でバリン（Ｖ）、５９６でトレオニン（Ｔ）、６６１でアラニン（Ａ）、６６２でバリン（Ｖ）、６６４でトレオニン（Ｔ）、６６５でプロリン（Ｐ）、７１０でトレオニン（Ｔ）、７１７でアスパラギン酸（Ｄ）、７１８でアスパラギン（Ｎ）、７１９でグルタミン酸（Ｅ）、および７２３でセリン（Ｓ）を含むように進化した。
本明細書に開示されるＡＡＶ変異ビリオンは、ＡＡＶウイルスベクター操作の技術分野の当業者には容易に明らかである、妥当な合理的設計パラメータ、特徴、修正、利点、および変形を組み込み得る。
実施例２
定向進化を用いて、ヒトの眼への他の遺伝子送達方法（実施例１）よりも有意な利点を有する投与経路である硝子体内（ＩＶＴ）投与後の、網膜細胞への優れた遺伝子送達を有する新規のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）変異体を発見した。Ｐ３４Ａ置換およびアミノ酸５８８に挿入されたペプチドＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）を含む新規のＡＡＶ変異体（ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ、配列番号４２）の硝子体内投与後の細胞向性を、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）含有ＡＡＶ変異体が網膜細胞を形質導入する能力の代表例として、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）においてインビボで評価した。
ＡＡＶ２キャプシドまたは新規の変異キャプシドＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａのいずれか、およびＣＭＶプロモーター（それぞれ、ＡＡＶ２．ＣＭＶ．ＧＦＰおよびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＭＶ．ＧＦＰ）またはＣＡＧプロモーター（それぞれ、ＡＡＶ２．ＣＡＧ．ＥＧＦＰおよびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＡＧ．ＥＧＦＰ）に作動可能に連結された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）導入遺伝子を含むゲノムを含む組換えＡＡＶビリオンを、標準的な方法を使用して製造した。アフリカミドリザル（図７、８）またはカニクイザル（図９）に、１眼当たり４×１０１０ｖｇ～１×１０１２ｖｇの範囲の様々な用量のベクターを硝子体内注射し（詳細については図の凡例を参照されたい）、網膜細胞の形質導入を、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ（商標）を用いた眼底蛍光撮像により生存中に評価した。
新規の変異ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ（配列番号４２）を含むＡＡＶの硝子体内送達により、ＡＡＶ２と比べてより広範かつより強固なＮＨＰ網膜にわたる導入遺伝子発現がもたらされた（図７～９）。画像により、新規のＡＡＶ変異キャプシドが、注射後２週間の早さで、中心窩の中央（錐体が豊富な領域）、傍中心窩リング（網膜神経節細胞が豊富な領域）、および末梢部（桿体、ミュラーグリア、アマクリン細胞、双極細胞を含む多くの細胞型が豊富な領域）において強固な発現を提供することが明らかとなる。対照的に、また他者によって報告された結果と一致して、野生型ＡＡＶ２は、主に傍中心窩リングで起き、後の時点でしか検出することができないより弱い発現を提供する。注射の３週間後に行った網膜の様々な領域の免疫組織化学分析により、網膜色素上皮細胞、桿体および錐体光受容体、ならびに網膜神経節細胞を含む多くの網膜細胞型が、網膜全体にわたる形質導入に成功したことが確認された（図１０Ａ～１０Ｅ）。
この研究により、臨床的に関連するＡＡＶ２と比較して、臨床的に好ましい投与経路の後のＩＳＤＱＴＫＨ含有変異体による優れた遺伝子送達が図示される。類似の効力は、このペプチド挿入モチーフを含む他の変異体で達成可能である。同様に、同じ定向進化アプローチを使用して同定された本明細書に開示される他の変異体でも、類似の効力が達成可能である。
実施例３
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および光受容体（ＰＲ）細胞に対する新規のＡＡＶ変異ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ（配列番号４２）の細胞向性を、線維芽細胞由来ヒト誘導多能性幹細胞（ＦＢ－ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）から生成したＲＰＥ細胞およびＰＲ細胞を使用してインビトロで評価した。
ＡＡＶ２キャプシドまたは新規の変異キャプシドＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ（配列番号４２）のいずれか、ならびにＣＡＧプロモーター（それぞれ、ＡＡＶ２．ＣＡＧ．ＥＧＦＰおよびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＡＧ．ＥＧＦＰ）に作動可能に連結された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）導入遺伝子を含むゲノムを含む組換えＡＡＶビリオンを、標準的な方法を使用して製造した。４５日間の分化プロトコルを使用して、ヒト胚性幹細胞株ＥＳＩ－０１７またはヒト線維芽細胞由来誘導多能性幹細胞（ＦＢ－ｉＰＳＣ）からヒトＲＰＥ細胞培養物を生成した。ＲＰＥ細胞への成熟は、ＲＰＥ６５およびＢＥＳＴ１を含む成熟ＲＰＥマーカーの発現、ＶＥＧＦおよびＰＥＤＦの合成、ならびに桿体の外側部を貪食する能力を検出することによって確認した。ＰＲ培養物は、複数ステップの眼杯形成パラダイムによって生成し、培養の１７９日後にリカバリンおよびＳオプシンの発現を検出することによってＰＲを含むことが確認された。
ＡＡＶ２と比較して、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ（配列番号４２）は、免疫蛍光法（図１１Ａ～Ｂ）、フローサイトメトリー（２．７倍の増加、図１１Ｃ～Ｄ）、およびウエスタンブロット分析（図１１Ｅ～Ｆ）によって決定して、感染後７日のヒトＲＰＥ培養物の有意により高い形質導入効率およびヒトＲＰＥ培養物中の導入遺伝子発現を提供した。ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＡＧ．ＥＧＦＰを使用した強固な形質導入および発現が、感染後３２日までにヒトＰＲ培養物中で同様に達成された。この研究により、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）含有変異体が網膜細胞に遺伝子を送達する優れた能力が図示される。
実施例４
抗ＶＥＧＦ発現ベクターの設計および構築アフリベルセプトのアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した、ヒトＦｌｔ１シグナルペプチド、ＶＥＧＦＲ１ドメイン２、およびＶＥＧＦＲ２ドメイン３からなる（図１２Ａ、配列番号６６）。ラニビズマブの軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を可撓性タンパク質リンカーによって接合して、二本鎖抗原結合断片（Ｆａｂ）を一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）に変換した。軽重（ＬＨ）形態は、可撓性ペプチドによって連結されたラニビズマブのヒトＩｇカッパ軽鎖シグナルペプチド、可変軽、定常軽、可変重、および定常重１ドメインからなる（図１２Ｂ、配列番号７１）。重軽（ＨＬ）形態は、シグナルペプチドがヒトＩｇＧ重鎖に由来し、重ドメインおよび軽ドメインがＬＨ形態と比較してリンカーの反対側にあることを除いて類似している（図１２Ｃ、配列番号６８）。ブロルシズマブ設計は、可撓性ペプチドによって連結された可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含み、ヒトＩｇカッパ軽鎖シグナルペプチドは、哺乳動物細胞から分泌される（図１２Ｄ、配列番号７５）。翻訳領域を、ヒト細胞からの改善した発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔまたはＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成し、標準的なプラスミドクローニングベクターに提供した。目的のＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩおよびＢｇｌＩＩでこのプラスミドから切除し、ＣＡＧプロモーターとＳＶ ４０ポリＡシグナルとの間のｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＳＶ４０ ｐＡプラスミドに挿入した。ｓｃ－ラニビズマブ－Ｆｃ設計は、アフリベルセプト設計由来のヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したｓｃ－ラニビズマブのＬＨ形態からなる（図１２Ｅ、配列番号７３）。ブロルシズマブ－Ｆｃ設計は、アフリベルセプト設計由来のヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したブロルシズマブからなる（図１２Ｆ、配列番号７７）。ｓｃ－ラニビズマブＬＨ、ブロルシズマブ、およびＦｃ領域を、３’末端（ｓｃ－ラニビズマブＬＨおよびブロルシズマブ）または５’末端（Ｆｃ）にＴｙｐｅＩＩＳ制限酵素ＢｓｍＢＩの部位を含む延長を有する初期クローニングベクターから、ＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＰｓｔＩおよびＢｓｍＢＩ（ｓｃ－ラニビズマブＬＨおよびブロルシズマブ）またはＢｓｍＢＩおよびＢｇｌＩＩ（Ｆｃ）で消化し、ＣＡＧプロモーターとＳＶ４０ポリＡシグナルとの間のｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＳＶ４０ ｐＡプラスミドに挿入した。ライゲーション反応を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し、制限消化によって陽性クローンを同定した。次いで、クローンをより大きな規模で成長させ、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ－Ｆｒｅｅ ＭａｘｉｐｒｅｐキットでプラスミドＤＮＡを精製した。プラスミドの同一性を、制限消化およびシークエンシングによって検証した。ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＳＶ４０ポリＡプラスミドは、抗ＶＥＧＦ配列をＡＡＶキャプシド内部にパッケージングし、硝子体内投与を介して網膜内の目的の細胞に送達することを可能にする、ＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２つの別個の実験において、ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬を使用して、ＣＡＧプロモーターの制御下にある、ＧＦＰまたは抗ＶＥＧＦ導入遺伝子（ｓｃ－ＲＮＢＺ ＨＬ（配列番号６７）、ｓｃ－ＲＮＢＺ ＬＨ１（配列番号６９）、およびｓｃ－ＲＮＢＺ－ＬＨ２（配列番号７０）、ＡＦＬＢ（配列番号６５）、ＢＲＯ（配列番号７４））のいずれかを含むプラスミドで模擬トランスフェクトまたはトランスフェクトした。培地をトランスフェクションの４８時間後に採取し、アフリベルセプトＥＬＩＳＡキット（Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｇｕｉｄｅ ＩＧ－ＡＡ１１５）でアッセイした。抗ＶＥＧＦタンパク質を、キット（模擬、ＧＦＰ、およびＡＦＬＢ）またはＨＲＰ抗ＩｇＧ Ｈ＋Ｌ（ｓｃ－ＲＮＢＺ ＨＬ、ｓｃ－ＲＮＢＺ ＬＨ１、およびｓｃ－ＲＮＢＺ ＬＨ２）内の試薬として提供されるＨＲＰ－抗ＩｇＧ Ｆｃによって検出した。臨床Ｅｙｌｅａ（模擬、ＧＦＰ、およびＡＦＬＢ）またはＬｕｃｅｎｔｉｓ（ｓｃ－ＲＮＢＺ ＨＬ、ｓｃ－ＲＮＢＺ ＬＨ１、ｓｃ－ＲＮＢＺ ＬＨ２、およびＢＲＯ）に対する濃度を計算した。２つの実験のうちの第１の実験では、アフリベルセプト発現は約１５ｕｇ／ｍｌであり、ｓｃ－ラニビズマブ発現は１．６～２．８ｕｇ／ｍｌの範囲であり、ＬＨ形態は類似の濃度を発現し、ＨＬ形態は約２倍より低い濃度を発現した（図１３Ａ）。第２の実験では、アフリベルセプト発現は約５０ｕｇ／ｍｌであり、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ１発現は約４．０ｕｇ／ｍｌであった（図１３Ｂ）。ブロルシズマブによるシグナルは非常に低く、これは検出抗体による認識不良に起因する可能性が高い。模擬またはＧＦＰトランスフェクション由来の培地中では、ＶＥＧＦ結合活性は検出されなかった。
実施例５
抗ＶＥＧＦタンパク質を直接可視化し、タンパク質のサイズを確認するために、ＧＦＰ、アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブ（配列番号６７、６９、および７０）、またはブロルシズマブ（配列番号７４）発現プラスミドでトランスフェクトした細胞由来の培地のウエスタンブロット分析を行った（図１４）。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地を、Ｂｏｌｔ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＮＷ０４１２２ＢＯＸ）で実行し、分離したタンパク質をｉＢｌｏｔ２デバイスでニトロセルロースに移した。ブロットを、ｉＢｉｎｄ Ｆｌｅｘデバイスを使用して、ＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号３１４１３、左パネル）またはヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号３１４８２、右パネル）でプローブし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号３４０７６）で可視化した。画像を、ｉＢｒｉｇｈｔ ＦＬ１０００撮像装置で撮像した。
アフリベルセプト試料は、臨床比較タンパク質Ｅｙｌｅａと同様に見える。陰性対照試料中にシグナルはなかった。臨床比較タンパク質Ｌｕｃｅｎｔｉｓは、２４ｋＤの別個の軽鎖および重鎖に還元された一方、ｓｃ－ラニビズマブタンパク質は、軽鎖および重鎖を単一タンパク質に結合するポリペプチドリンカーの存在に起因して、約４８ｋＤで実行される。ＥＬＩＳＡを通して得られるタンパク質定量化と一貫して、タンパク質のＨＬ形態と比較して、より多くの量のタンパク質のＬＨ形態が存在する（図１３Ａ）。ブロルシズマブシグナルは低く、これは検出抗体による認識不良に起因する可能性が高い。タンパク質は、２４ｋＤの正しい分子量で移行する。
実施例６
ＶＥＧＦ結合活性を決定するための追加の方法として、ＶＥＧＦ競合ＥＬＩＳＡを行った（図１５）。臨床比較タンパク質ＥｙｌｅａまたはＬｕｃｅｎｔｉｓ、およびトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地を、室温で１３ｐＭのＶＥＧＦとともに一晩インキュベートした。試料を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＤＶＥ００）を使用して、遊離ＶＥＧＦについてアッセイした。２つの実験のうちの第１の実験では、トランスフェクトした試料由来の４つの抗ＶＥＧＦタンパク質の阻害曲線は、臨床ＥｙｌｅａおよびＬｕｃｅｎｔｉｓと非常に類似していた。ｓｃ－ラニビズマブ変異体およびＬｕｃｅｎｔｉｓよりも、アフリベルセプトおよびＥｙｌｅａがＶＥＧＦに対してより強く競合した（図１５Ａ）。ｓｃ－ラニビズマブの３つの形態（配列番号６７、６９、および７０）は全て、ほぼ同一であった。第２の実験では、全ての抗ＶＥＧＦ構築物が、ＶＥＧＦについて競合した（図１５Ｂ）。ＧＦＰ陰性対照試料からは、競合活性はなかった。
実施例７
トランスフェクトした細胞から発現する抗ＶＥＧＦタンパク質が、ＶＥＧＦのその受容体への結合、したがってその機能を遮断することを確認するために、等濃度の臨床比較タンパク質およびトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培地を、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと混合し、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ ＫＤＲ細胞上に置いた（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ ９３－０９９６Ｙ１）。これらの細胞は、ＶＥＧＦ結合時に活性ベータ－ガラクトシダーゼを産生する、ＶＥＧＦ受容体／ベータ－ガラクトシダーゼ融合タンパク質を発現する。細胞を２２時間後に溶解し、ベータ－ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。トランスフェクトした試料由来の抗ＶＥＧＦタンパク質の阻害曲線は、臨床比較タンパク質と等しく、発現タンパク質が細胞ベースのアッセイにおいてＶＥＧＦ機能を遮断することを実証する（図１６）。その後の２つの実験では、抗ＶＥＧＦ構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の等体積の培地でも、細胞ＶＥＧＦ中和アッセイを行った。これらの実験の第１の実験では、ＧＦＰ、アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブＨＬ（配列番号６７）、またはｓｃ－ラニビズマブＬＨ１（配列番号６９）発現プラスミドを評価した。評価した全ての抗ＶＥＧＦ構築物が、ＶＥＧＦを中和した（図１７Ａ）。ｓｃ－ラニビズマブＬＨ形態は、ｓｃ－ラニビズマブＨＬ形態よりも強くＶＥＧＦを中和した。第２の実験では、ＧＦＰ、アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブＬＨ１（配列番号６９）、またはブロルシズマブ（配列番号７４）発現プラスミドを、８ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと混合し、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ ＫＤＲ細胞上に置いた（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ ９３－０９９６Ｙ１）。細胞を１８時間後に溶解し、ベータ－ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。再び、評価した全ての抗ＶＥＧＦ構築物が、ＶＥＧＦを中和した（図１７Ｂ）。アッセイした希釈度において、ＧＦＰ対照試料からわずかなマトリックス効果が存在した。
実施例８
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を、ＦｕＧｅｎｅＨＤトランスフェクション試薬を使用して、ＣＡＧプロモーターの制御下にある、ＧＦＰまたは抗ＶＥＧＦ導入遺伝子のいずれかを含むプラスミドで模擬トランスフェクトまたはトランスフェクトした。培地をトランスフェクションの４８時間後に採取した。ＲＰＥ細胞のトランスフェクション効率は、ＧＦＰ発現細胞の数（データ示さず）によって証明されるように非常に低く、したがってこれらのトランスフェクション由来の培地中ではＶＥＧＦ結合活性は検出不能であった。培地中のＶＥＧＦの総濃度を評価して、低濃度の抗ＶＥＧＦ剤がＶＥＧＦのＲＰＥ分泌を低下させることができるかどうかを決定した。培地をトランスフェクションの４８時間後に採取し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＤＶＥ００）でアッセイした。アフリベルセプト（配列番号６５）発現後にＶＥＧＦレベルの大幅な低下、ならびにｓｃ－ラニビズマブ（配列番号６７、６９、および７０）発現後にＶＥＧＦレベルのわずかな低下が観察された（図１８）。３つ全てのｓｃ－ラニビズマブ形態によるＶＥＧＦレベルへの影響は、類似していた。より効率的なＡＡＶ形質導入によって送達されると、抗ＶＥＧＦ導入遺伝子は、より高濃度の抗ＶＥＧＦタンパク質の産生をもたらし、これをアフリベルセプトＥＬＩＳＡキットによって定量化した。
実施例９
アフリベルセプト（配列番号６５）、ｓｃ－ラニビズマブ（配列番号６７および６９）、またはブロルシズマブ（配列番号７４）の遺伝子を担持するＡＡＶ発現プラスミドを使用して、Ｒ１００変異キャプシド（配列番号４２として示されるアミノ酸配列を有する）中にウイルスＤＮＡをパッケージングした。成熟ＲＰＥ細胞を、１．０ｍｌの体積のＸ－Ｖｉｖｏ１０培地中のこれらのベクターを用いて、１２ウェルプレート中に感染効率５，０００で播種した３０日後に形質導入した。形質導入してから３日後に培地を変更し、形質導入してから６日後に採取および交換し、形質導入してから１０日後に再び採取および交換した。
培地中のＶＥＧＦの総濃度を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＤＶＥ００）でアッセイして、ＲＰＥ細胞によって培地中に分泌される検出可能な遊離内因性ＶＥＧＦのレベルに対する抗ＶＥＧＦベクターでの形質導入の効果を決定した（図１９）。ＧＦＰ対照ベクターで形質導入された細胞によって示されるＶＥＧＦの内因性レベルは、６日目の試料中で４，５００ｐｇ／ｍｌ、および１０日目の試料中で８，３００ｐｇ／ｍｌであった。抗ＶＥＧＦベクターの全てによる形質導入は、検出可能なＶＥＧＦを培地中にほとんどまたは全くもたらさなかった。ＲＰＥ細胞によって分泌されるＶＥＧＦの量は変化しておらず、むしろ培地中のＶＥＧＦが抗ＶＥＧＦタンパク質によって結合され、それがＥＬＩＳＡによって検出不能であった可能性が高い。ウエスタンブロットを含む追加の実験を行って、結合および未結合のＶＥＧＦの総量を決定することができる。
ＲＰＥ形質導入由来の培地も、アフリベルセプトＥＬＩＳＡキット（Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、 Ｉｍｍｕｎｏｇｕｉｄｅ ＩＧ－ＡＡ１１５）でアッセイした。抗ＶＥＧＦタンパク質を、ＨＲＰ－抗ＩｇＧ Ｈ＋Ｌ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号３１４１０）で検出した。臨床Ｅｙｌｅａ（ＡＦＬＢおよびＧＦＰ）またはＬｕｃｅｎｔｉｓ（ｓｃ－ＲＮＢＺ ＨＬ、ｓｃ－ＲＮＢＺ ＬＨ１、およびＢＲＯ）に対する濃度を計算した。アフリベルセプト（配列番号６５）発現は、６日目の試料中で約１，８００ｎｇ／ｍｌ、１０日目の試料中で２，８００ｎｇ／ｍｌであった。ｓｃ－ラニビズマブ発現は、ＨＬ（配列番号６７）の６日目の試料の７００ｎｇ／ｍｌから、ＬＨ（配列番号６９）の１０日目の試料の１，７００ｎｇ／ｍｌまでの範囲であった（図２０）。ブロルシズマブ（配列番号７４）によるシグナルは非常に低く、これは検出抗体による認識不良に起因する可能性が高い。ＧＦＰ形質導入由来の培地中では、ＶＥＧＦ結合活性は検出されなかった。
実施例１０
抗ＶＥＧＦタンパク質を直接可視化し、タンパク質のサイズを確認するために、形質導入されたＲＰＥ細胞由来の培地のウエスタンブロット分析を行った（図２１）。等体積の６日目および１０日目の培地を、Ｂｏｌｔ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＮＷ０４１２２ＢＯＸ）で実行し、分離したタンパク質をｉＢｌｏｔ２デバイスでニトロセルロースに移した。ブロットを、ｉＢｉｎｄ Ｆｌｅｘデバイスを使用して、ＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号３１４１３、左パネル）またはヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号３１４８２、右パネル）でプローブし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号３４０７６）で可視化した。画像を、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ撮像装置で撮像した。
アフリベルセプト（配列番号６５）試料は、臨床比較タンパク質Ｅｙｌｅａ（黒色の矢印）と同様に見える。ＧＦＰ陰性対照試料中には、正しい移動度のバンドは存在しなかった。臨床Ｌｕｃｅｎｔｉｓは２４ｋＤの別個の軽鎖および重鎖に還元されるが、ｓｃ－ラニビズマブＨＬ（配列番号６７）およびＬＨ（配列番号６９）は分離されず、灰色の矢印によって示されるように、５８ｋＤの見かけ上の分子質量で移行する。ブロルシズマブ（配列番号７４）によるシグナルは低く、これは検出抗体による認識不良に起因する可能性が高い。タンパク質は、点線矢印によって示されるように、２６ｋＤの正しい分子質量で移行する。タンパク質レベルは、６日目および１０日目の試料中でかなり類似している。
実施例１１
ＶＥＧＦ結合活性を決定するための追加の方法として、ＶＥＧＦ競合ＥＬＩＳＡを行った（図２２）。形質導入されたＲＰＥ細胞由来の等体積の培地を、室温で１３ｐＭのＶＥＧＦとともに１晩インキュベートした。試料を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＤＶＥ００）を使用して、遊離ＶＥＧＦについてアッセイした。全ての抗ＶＥＧＦ構築物で形質導入された細胞由来の培地が、ＶＥＧＦについて競合した。６日目および１０日目の試料中では、結果が類似していた。ＧＦＰ陰性対照試料からは、競合活性はなかった。遊離ＶＥＧＦレベルは、これはＲＰＥ細胞によって産生される内因性ＶＥＧＦに起因して、最低の希釈度においてより高い。
実施例１２
ウイルスベクター由来のＲＰＥ細胞中で発現する抗ＶＥＧＦタンパク質のＶＥＧＦ中和活性を比較するために、形質導入されたＲＰＥ細胞由来の等体積の培地を、８ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと混合し、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ ＫＤＲ細胞上に置いた（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ ９３－０９９６Ｙ１）（図２３）。細胞を１８時間後に溶解し、ベータ－ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。全ての抗ＶＥＧＦ構築物で形質導入された細胞由来の培地が、ＶＥＧＦを中和した。ＧＦＰ対照形質導入由来の培地では、ＶＥＧＦ中和は観察されなかった。
上記は、本発明の原理を例示するものでしかない。当業者であれば、本明細書に明示的に記載または示されていないが、本発明の原理を具体化し、その趣旨および範囲内に含まれる様々な構成を考案することができることが理解されよう。さらに、本明細書に列挙されている全ての例および条件付き言語は、主として、本発明の原理および当該技術の促進のために発明者らにより寄与される概念を理解する上で読者を助けることを意図するものであり、そのような具体的に列挙される例および条件に限定されないことが解釈されるべきである。
さらに、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにそれらの具体例を列挙する本明細書における全ての記述は、その構造的等価物および機能的等価物の両方を包含することが意図される。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および今後開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすいずれの開発される要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲が、本明細書に示され記載される例示的な実施形態に限定されることは意図されない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の発明。
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