ES2312494T3 - Produccion de anticuerpos completos en celulas procariotas. - Google Patents

Abstract

Molécula polinucleotídica que codifica una inmunoglobulina, dicha molécula polinucleotídica comprende (1) un primer promotor y un primer cistrón que forma una primera pareja promotor-cistrón y (2) un segundo promotor y un segundo cistrón que forman una segunda pareja de promotor-cistrón, en donde el primer cistrón de la mencionada primera pareja promotor-cistrón comprende una primera región de iniciación de la traducción (TIR-L) unida operativamente con una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, y el segundo cistrón de la mencionada segunda pareja promotor-cistrón comprende un segunda región de inicio de la traducción (TIR- H) operativamente unida a una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina, en donde tras la expresión del mencionado polinucleótido en una célula huésped procariota, las cadenas ligera y pesada se pliegan y ensamblan para formar una inmunoglobulina activa biológicamente.

Description

Producción de anticuerpos completos en células procariotas.

Campo de la invención

La presente invención trata de temas de Biología Molecular y Tecnología de Proteínas. Más concretamente, esta invención concierne a anticuerpos producidos de forma recombinante y a su ulterior utilización.

Antecedentes de la invención

Durante los últimos años se ha producido un aumento de las expectativas de utilización de los anticuerpos como agentes diagnósticos y terapéuticos en el tratamiento de diversos trastornos y enfermedades. Pero su empleo en aplicaciones de investigación y de clínica, requiere una gran cantidad de anticuerpos funcionales, una producción a gran escala, así como disponer de sistemas económicos de producción. Particularmente útil resulta la producción de formas recombinantes de anticuerpos mediante una amplia gama de posibilidades de expresión en huéspedes, procariotas como E. coli o B. subtilis, levaduras, plantas, células de insectos y células de mamíferos, Kipriyanov y Littel (1999) Mol. Biotech. 12:173-201.

En comparación con otros sistemas de producción de anticuerpos, las bacterias, particularmente E. coli, proporcionan ventajas únicas. Las materias primas que se utilizan (como por ejemplo las mismas células bacterianas) no representan un gran gasto, su crecimiento es sencillo y por tanto se reduce el coste de los productos. Por el tiempo de generación corto y su facilidad de amplificación, la fermentación bacteriana es un medio práctico para la producción a gran escala. Por otro lado, la estructura genómica y la actividad biológica de muchas especies bacterianas, como E. coli, ha sido ampliamente estudiada y se encuentran disponibles una amplia gama de vectores de expresión por lo que las bacterias se convierten en la opción más conveniente para la expresión de un anticuerpo de interés. En comparación con los eucariotas, en el proceso de producción están implicados unos pocos pasos, incluida la manipulación de genes recombinantes, la transformación estable de múltiples copias en el huésped y la expresión, inducción y caracterización de los productos Pluckthun and Pack Immunotech 3:83-105 (1997). Además E. coli permite un acceso único a enfoques aleatorios. Debido a la eficiencia sin parangón de su transformación con plásmidos o transfección con fagos, los sistemas de E. coli pueden utilizarse en la construcción de librerías de fagos de variantes de anticuerpos que resultan particularmente importantes en estudios de genómica funcional.

Los sistemas bacterianos se utilizan corrientemente para producir fragmentos de anticuerpo. Como en el caso de otras proteínas heterólogas, los fragmentos de anticuerpo se producen en E. coli por el plegamiento de los cuerpos de inclusión que se expresan en el citoplasma o a través de la expresión, seguida de secreción, de la proteína, al periplasma bacteriano. La selección de uno u otro sistema está condicionada por algunas consideraciones. En cualquier caso, la secreción resulta ser el sistema más rápido y la estrategia utilizada de forma más común.

Opper y colaboradores, según la Patente americana U.S. 6.008.023 describen un sistema de expresión citoplasmática en E. coli, donde los fragmentos de anticuerpo (por ejemplo Fabs) están fusionados con un enzima que se utiliza en la terapia tumoral dirigida. Zemel-Dreasen y colaboradores, Gene 27: 315-322 (1984) describen la secreción y el procesado de una cadena ligera de anticuerpo en E. coli. Lo y colaboradores, en una publicación de patente internacional WO 93/07896 (1984), describen la producción en E. coli de un anticuerpo tetramérico sin la región CH2 de su cadena pesada. En este trabajo, los genes que codifican para la cadena ligera y la cadena pesada sin la región CH2, se situaron en el mismo vector de expresión, bajo el control de un promotor único. Sin embargo, los autores reconocen que el sistema de expresión no está optimizado y el nivel de expresión resulta moderado. Un sistema similar policistrónico, donde las dos unidades de expresión (cistrones) se encuentran bajo el control de un promotor, se utilizó en Carter y colaboradores, en la Patente americana U.S. 5.648.237, para la producción de fragmentos de anticuerpo en
E. coli.

En contraste con el amplio uso de sistemas bacterianos para la expresión de fragmentos de anticuerpo, se han hecho pocos intentos para expresar, en gran cantidad, anticuerpos funcionales intactos en E. coli. Los anticuerpos intactos son complejos y de gran tamaño por lo que a menudo es dificultoso conseguir el plegamiento adecuado y el ensamblado de la cadena ligera con la cadena pesada, y por tanto se recupera poco anticuerpo tetramérico reconstituido. Además, como los anticuerpos producidos en procariotas no están glicosilados, por tanto presentan disminución de sus funciones efectoras, se ha sugerido que E.coli no es un sistema adecuado para la producción de anticuerpos intactos. Pluckthun y Pack (1997) Immunotech 3:83-105; Kipriyanov y Little Mol. Biotech. 12:173-201 (1999); Pluckthum y colaboradores (1996) en INGENIERÍA DE ANTICUERPOS: UN ENFOQUE PRÁCTICO, páginas 203-252 (Oxford Press); Pluckthun (1994) en MANUAL DE FARMACOLOGÍA EXPERIMENTAL volumen 3: La Farmacología de los Anticuerpos Monoclonales, páginas 269-315 (editorial M. Rosenberg y G.P. Moore; Springer-Verlag, Berlín).

Los recientes avances en investigación y en estudios clínicos sugieren que de alguna forma, son preferibles los anticuerpos intactos que los fragmentos de anticuerpos. Un anticuerpo intacto que contiene la región Fc tiende a ser más resistente contra la degradación y el aclarado in vivo, por eso tiene una mayor vida media en la circulación. Esta característica es particularmente deseable cuando el anticuerpo se utiliza como agente terapéutico en enfermedades que requieren terapias sostenidas.

Además, de alguna forma, los anticuerpos intactos aunque deficientes en sus funciones efectoras, tienen más interés para algunos usos terapéuticos. Friend y colaboradores, Transplantation 68:1632-1637 (1999) describen efectos tóxicos de anticuerpos monoclonales CD3 glicosilados, como síndromes severos de liberación de citocinas, cuando se utilizan en humanos para el tratamiento de episodios de rechazo agudo de órganos transplantados. Los anticuerpos monoclonales CD3 causan la activación de células T y la liberación de citocinas por entrecruzamiento del complejo receptor de células T y por la unión de FcR. La Patente de U.S.A. Número 5,585.097 describe la producción de anticuerpos CD3 no glicosilados por mutación de ciertos lugares de glicosilación en anticuerpos CD3 nativos. Armour y colaboradores, Eur. J. Immunol. 29:2613-2624 (1999) describen la utilización de anticuerpos no dañinos (por pérdida de sus funciones efectoras) específicos para plaquetas HPA-1a-positivas en aplicaciones terapéuticas en las que no se desea una disminución de células (plaquetas) portadoras de antígeno. Thompson y colaboradores, J. Immunol Meth 227:17-29 muestran que las funciones efectoras de un anticuerpo completo contra TGF\beta2 no son necesarias para su utilización en la terapia de enfermedades fibróticas mediadas por TGF\beta2. Reddy y colaboradores, J. Immunol. 164:1925-1933 (2000) describen la desventaja de la unión fuerte del anticuerpo contra el receptor de -Fc\gamma en el tratamiento de enfermedades autoinmunes; Isaacs y colaboratores, Clin. Exp. Inmmunol. 106:427-433 (1996)) sugieren que cuando es necesario, in vivo, el bloqueo de un efecto, una buena opción para prevenir la unión del receptor de Fc, es una variante de anticuerpo monoclonal no glicosilado o un mutante obtenido por ingeniería
genética.

Los intentos para eliminar o reducir las funciones efectoras de un anticuerpo normalmente se dirigen al isotipo IgG4, que no afecta a las células a las que se dirige, o a la producción de variantes de Fc en las que se muta alguno de los residuos de la región crítica para las funciones efectoras. Véase por ejemplo la Patente de U.S.A. Número 5,585.097. Sin embargo, los dos enfoques tienen limitaciones. Por ejemplo respecto al isotipo IgG4 se ha demostrado que éste puede retener cierto nivel de sus funciones efectoras, tal como describe Isaacs y colaboradores, (1996) supra, y Thompon y colaboradores, (1999) supra. También, Reddy y colaboradores (2000), supra, describieron que era necesario un mayor número de alteraciones en el IgG4 mAb contra CD4 para eliminar las funciones efectoras del Fc. Los mutantes en el Fc pueden evitar la respuesta inmune no deseada gracias a los cambios ocasionados en los residuos de su secuencia primaria.

Resumen de la invención

La presente invención se aplica a la necesidad de producción de anticuerpos intactos en organismos procariotas. En una de sus aplicaciones, la invención proporciona el proceso para producir una inmunoglobulina en una célula huésped procariota e incluye la utilización de un único vector de expresión de cistrones independientes. El vector de expresión de cistrones independientes, en la presente invención, incluye, un casete de expresión de polinucleótidos con una primera pareja de promotor-cistrón para la expresión de una inmunoglobulina de cadena ligera y una segunda de promotor-cistrón para la expresión de una cadena pesada de inmunoglobulina. La expresión de la cadena ligera y la cadena pesada se regula de forma independiente por promotores separados. Cada cistrón comprende una región de iniciación de la traducción (TIR, del inglés Translation initiation region) unida funcionalmente con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena ligera o pesada del anticuerpo completo. En algunas aplicaciones, las secuencias TIR, en el vector de expresión de la invención, están manipuladas para proporcionar diferentes longitudes traducidas de cadena ligera y pesada. Para la aplicación de la presente invención son adecuados como huéspedes de los vectores de expresión diversos organismos procariotas. Preferentemente, el huésped es una bacteria gram negativa. Más preferentemente, el huésped es E. coli. En una de sus aplicaciones, la célula huésped es una cepa de E. coli genéticamente modificada y adecuada para la producción a gran escala de proteínas heterólogas. Además, pueden utilizarse en la presente invención, diferentes promotores. Un promotor preferente es el promotor PhoA de
E. coli.

Breve descripción de las construcciones

Figura 1 es una representación esquemática de la construcción que incluye un vector de expresión de anticuerpos de longitud secuencia completa, pxTFPV, derivada del vector de expresión de Fab ya existente, pAK19.

Figura 2 muestra la expresión en E.coli de los anticuerpos de longitud completa utilizando dos vectores de expresión de longitud completa policistrónicos. Los extractos celulares totales se analizaron en geles de SDS-PAGE e inmunotransferencias, después de la inducción. El carril 1 es el control negativo, el carril 2 es pxTFPV (anticuerpo anti-TF); y el carril 3 es pY0317.Fab-CH3 (anticuerpo anti-VEGF). La flecha indica las bandas que corresponden a los anticuerpos de longitud completa.

Figura 3 representa construcciones policistrónicas con varias combinaciones de intensidad traduccional, TIR, para las cadenas ligera y pesada.

Figuras 4A y 4B muestra la expresión en E. coli de la cadena completa de un anticuerpo IgG1 anti-TF mediante vectores policistrónicos con varias combinaciones de TIR para las cadenas ligeras (L) y pesadas (H). Los extractos celulares totales se analizaron en geles de SDS-PAGE e inmunotransferencias después de la inducción. (4A) muestras reducidas. (4B) muestras no reducidas. La lista de las intensidades de traducción TIR para la cadena ligera ("L") y la cadena pesada ("H") se muestran arriba. "neg": células inducidas que llevan únicamente el vector de control
pBR322.

Figura 5 es una representación esquemática de las construcciones para la expresión individual de cadenas ligeras y pesadas con diferentes fuerzas traduccionales TIR.

Figura 6A y 6B son resultados de geles teñidos con azul de Comassie de lisados de células totales reducidos para diferentes plásmidos donde se muestra el efecto de la fuerza relativa de TIR en la secreción de cantidades de cadena ligera (6A) o cadena pesada (6B).

Figura 7 ilustra de forma esquemática la construcción del vector de expresión de cistrones independientes para la secuencia completa de un anticuerpo (pxTF2AP77) por combinación de los vectores de cadena ligera y pesada con determinadas fuerzas TIR.

Figura 8 muestra la tinción de Coomassie de un lisado reducido de células transformadas con el vector de cistrón independiente pxTF2AP77.

Figura 9 ilustra construcciones de cistrón independiente con varias combinaciones de intensidad TIR para cadenas pesadas y ligeras.

Figura 10A y 10B muestra la expresión en E. coli de la secuencia completa de un IgG1 anti-TF utilizando una construcción con cistrones independientes con varias combinaciones de intensidad TIR para las cadenas ligera (L) y pesada (H). Los lisados celulares totales se analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia después de la inducción.

Figura 11 es una comparación de las expresiones del anticuerpo de longitud completa utilizando el sistema policistrónico versus el sistema de cistrones independientes. Los lisados celulares totales no-reducidos se analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia después de la inducción. Se indican varias combinaciones de intensidad TIR para las cadenas ligera (L) y pesada (H).

Figura 12 es un gel teñido con Coomassie de comparación del vector policistrónico derivado de pAK-19 con el vector de cistrones independientes para el anticuerpo anti-TF. El carril 1 es el control negativo; el carril 2 es pxTFPV (derivado de pAk 19 policistrónico), y el carril 3 es paTF50 (de cistrones independientes). La flecha indica la posición de la banda que corresponde a los anticuerpos de longitud completa.

Figura 13 es una comparación de la expresión del anticuerpo anti-TF de longitud completa con el vector policistrónico derivado de pAK19 respecto a un vector de cistrones independientes. Los lisados totales no reducidos se analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia después de la inducción. El carril 1 es el control negativo; el carril 2 es pxTFPV (vector policistrónico derivado de pAK-19); y el carril 3 es paTF50 (de cistrón independiente). La flecha indica la banda que corresponde a los anticuerpos de longitud completa.

Figura 14 es una comparación de la expresión del anticuerpo de longitud completa anti-VEGF con un vector policistrónico derivado de pAK19 respecto a un vector de cistrones independientes. Los lisados celulares totales no reducidos se analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia después de la inducción. El carril 1 es un control negativo: el carril 2 es pY0317.Fab-CH3 (vector policistrónico derivado de pAK-19); y el carril 3 es pxVG2AP11 (de cistrón independiente). La flecha indica la banda que corresponde a los anticuerpos de longitud completa anti-
VEGF.

Figura 15 representa la unión del antígeno (TF) al anticuerpo anti-TF de longitud completa producido por un vector de cistrones independientes paTG50 en E.coli (IgG1). Se utilizaron como controles dos anticuerpos anti-TF producidos en CHO (IgG2 y IgG4).

Figura 16 representa la unión de C1q al anticuerpo IgG1 anti-TF de longitud completa producido por paTF50 en E. coli. Para comparación, se utilizó otro anticuerpo, I-1095-1-Rituximab.

Figura 17 representa la unión de Fc\gammaR1 alfa al anticuerpo anti-TF de longitud completa producido por paTF50 en E. coli. Dos anticuerpos IgE, producidos en células CHO, se utilizaron como controles.

Figura 18 representa la unión de FcRn al anticuerpo IgG1 anti-TF de longitud completa producido por paTF50 en E. coli (32604-74 E. coli IgG1) en comparación con otros cinco anticuerpos control.

Figura 19 representa los cambios de concentración (\mug/mL) plasmática del anticuerpo anti-TF (ATF-D3H44) a lo largo del tiempo en chimpancés a los que se ha administrado una única dosis IV del la IgG1 de longitud completa producida por paTF50 en E. coli (E. coli IgG1), de IgG2 producida en CHO (CHO IgG2) o de IgG4 producida en CHO (CHO IgG4b).

Figuras 20a-20c muestran las secuencias del casete de expresión del vector de cistrones independientes paTF50.

Figuras 21a-21c muestran las secuencias del casete de expresión del vector de cistrones independientes
pxVG2AP11.

Figura 22 muestra la expresión de varios anticuerpos de longitud completa con un sistema de cistrones independientes. Los lisados celulares totales se analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia, después de la inducción.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

El término "vector" tal como se emplea aquí, hace referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar a otro ácido nucleico al que se encuentra unido. Un tipo de vector es un "plásmido", o cadena de ADN doble y circular al que se han ligado segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en éste los segmentos de ADN adicionales se han ligado al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en la célula huésped en la que se han introducido (por ejemplo vectores bacterianos con origen de replicación bacteriano y los vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplos vectores no-episomales de mamíferos) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped y por tanto se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes con los que están unidos funcionalmente. A estos vectores nos referimos aquí como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente "vectores recombinantes"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas del ADN recombinante están en forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se utilizan de forma intercambiable aunque plásmido es la forma más común de vector.

El término "cistrón", tal como se emplea aquí, se refiere a un elemento genético equivalente a una unidad traduccional y comprende la secuencia de nucleótido que codifica para una cadena de polipéptido y sus regiones de control adyacentes. Las "regiones adyacentes de control" incluyen, por ejemplo, la regiones de iniciación de la traducción (TIR; tal como se ha definido arriba) y una región de terminación.

Un vector de expresión policistrónico se refiere a un vector único que contiene y expresa cistrones múltiples bajo el control de un único promotor. Un ejemplo común de vector policistrónico es un vector "dicistrónico"\cdot que contiene y expresa dos polipéptidos diferentes bajo el control de un promotor único. Bajo la expresión de un vector dicistrónico o policistrónico, se transcriben múltiples genes en una única unidad transcripcional y a continuación, se traducen independientemente.

Las "regiones de iniciación de la traducción" o TIR, como se emplea aquí, se refieren a una región de ácido nucleico donde se inicia la traducción de un gen de interés. En general, una TIR de un cistrón particular incluye un lugar de unión al ribosoma (RBS) y las secuencias 5' y 3' del RBS. Un RBS mínimo contiene la región Shine-Dalgarno y el codón de iniciación (AUG). Así, una TIR, incluye también al menos una porción de la secuencia del aminoácido que se va a traducir. Preferentemente, la TIR de la presenten invención, incluye así mismo, una secuencia señal de secreción que codifica un péptido señal que precede a la secuencia codificante para la cadena ligera y pesada del cistrón. Una variante de TIR contiene secuencias variantes (especialmente substituciones) en el interior de la región TIR que alteran sus propiedades, como fuerza de traducción, como se define más abajo. Preferentemente, una variante TIR de la invención, contiene substituciones en la secuencia de los 2 a 14 primeros codones, preferentemente entre los codones 4 a 12 y más preferentemente los 6 codones de la secuencia señal de secreción que precede a la secuencia que codifica la cadena pesada o ligera en el cistrón.

El término "intensidad de traducción" se utiliza aquí referido a la cuantificación de un polipéptido secretado en un sistema de control, en donde se utilizan una o más variantes de TIR para dirigir la secreción de un polipéptido y los resultados se comparan con la TIR de tipo silvestre u otra TIR control en el mismo cultivo y en las condiciones de ensayo. Sin limitarse a ninguna teoría en particular, la "intensidad de traducción", tal como se utiliza aquí, puede incluir por ejemplo, una medida de la estabilidad del mRNA, eficiencia de unión al sitio de unión al ribosoma y la forma de translocación a través de la membrana.

La "secuencia señal de secreción" o "secuencia señal" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal corto. El péptido señal se utiliza para dirigir una proteína de interés sintetizada de nuevo, a través de la membrana celular, normalmente a la membrana interna o a ambas, la interna o externa de los procariotas. Las proteínas de interés, como el polipéptido de cadenas ligeras o pesadas de las inmunoglobulinas, se secretan al periplasma de las células huéspedes procariotas o al medio de cultivo. El péptido señal está codificado por una secuencia señal de secreción que puede ser endógena, de las células huéspedes, o también puede ser exógena. La secuencia señal de secreción generalmente se encuentra en el extremo amino de un polipéptido al expresarse y se extrae enzimáticamente entre la biosíntesis y la secreción del polipéptido desde el citoplasma. En consecuencia, el péptido señal, generalmente no se encuentra presente en un producto proteico maduro.

El término "células huéspedes" (o "células huéspedes recombinantes") tal como se utiliza aquí, se refiere a una célula que ha sido alterada genéticamente, o es capaz de alteración genética por la introducción de un polinucleótido exógeno, como un vector o plásmido recombinante. Este término se refiere no sólo a una célula particular sino también a su progenie. Puede ocurrir, sin embargo, que en generaciones sucesivas y según ciertas modificaciones como mutaciones o a la influencia del ambiente, que la progenie no sea idéntica a la célula parental, pero igualmente queda incluida en el término "células huéspedes" tal como se utiliza aquí.

El término "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se utiliza intercambiablemente en sentido amplio e incluye anticuerpos monoclonales (de longitud completa o anticuerpos monoclonales intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, y anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos tan largos como requiera la actividad biológica deseada). Un anticuerpo natural comprende cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas idénticas (H) y dos cadenas ligeras idénticas (L) interconectadas por puentes bisulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (V_{H}) y una región constante de cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable ligera (V_{L}) y una región constante. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio C_{L}. Las regiones V_{H} y V_{L} pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad, o regiones que determinan la complementariedad (CDR), entremezcladas con regiones que están más conservadas o regiones de entramado (FR).Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs ordenadas desde el extremo amino-terminal al carboxilo-terminal en el siguiente orden: FR1, CDFR1, FR2, CDR2, FR34, CDR3, FR4.

Las cadenas ligeras de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado puede asignarse a uno de los dos tipos distintos denominados kappa (\kappa) y lamba (\lambda), según las secuencia de aminoácido de sus dominios constantes.

Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases mayores de inmunoglobulinas; IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y algunos de ellos pueden dividirse a su vez en subclases (isotipos), IgG-1, IgG-2, IgA-1, IgA-2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma, y \mu respectivamente. Las estructuras de las subunidades y de tres configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y están descritas por ejemplo en Abbas et al. Immunología Celular y Molecular, 4ª edición (2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión mayor, formada por la asociación covalente o no covalente de anticuerpo con una o más proteínas o péptidos.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se utilizan aquí de forma intercambiable, para referirse a un anticuerpo en su forma intacta. Los términos se refieren a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen la región Fc. Un anticuerpo de longitud completa puede ser una secuencia nativa de anticuerpo o una variante del anticuerpo. Un anticuerpo de longitud completa puede ser humano, humanizado, y/o madurado por afinidad.

Por "fragmentos de anticuerpo" se incluye sólo a una porción de anticuerpo intacta que en general, incluye el lugar de unión al antígeno del anticuerpo intacto y por tanto retine la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo que están incluidos en la presente definición son: (i) el fragmento Fab, con los dominios VL, CL, VH y CH1, (ii) el fragmento Fab', que es un fragmento Fab que contiene uno o más residuos de cisteína en el extremo C-terminal del dominio CH1; (iii) el fragmento Fd que tiene los dominios VH y CH1; (iv) el fragmento Fd' que tiene los dominios VH y CH1 y uno o más de los residuos cisteína en el extremo C-terminal del dominio CH1; (v) el fragmento Fv que contiene los dominios VL y VH de un único brazo de anticuerpo; (vi) el fragmento dAb que consiste en el dominio VH; (vii) regiones CDR aisladas; (viii) fragmentos F(ab')_{2}, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab' unidos por puente bisulfuro en la región de bisagra; (ix) moléculas de anticuerpo de cadena simple (por ejemplo cadenas únicas Fv; scFv); (x) "diacuerpos" con dos lugares de unión al antígeno, que comprenden el dominio variable de la cadena pesada (VH) conectada a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido; (xi) "anticuerpos lineares" que comprenden un par de segmentos en tandem Fd (VH-CH1-VH-CH1) que junto con la cadena de polipéptidos ligera complementaria forma un par de regiones de unión al antígeno.

Una inmunoglobulina "biológicamente activa" o "funcional" es aquella capaz de ejercer una o más de sus actividades naturales en eventos estructurales, reguladores, bioquímicos o biofísicos. Por ejemplo, un anticuerpo biológicamente activo tiene la capacidad de unirse específicamente al antígeno y ésta unión a su vez, provocar cambios a nivel celular o molecular tal como la activación de la transducción de señal o de la actividad enzimática. Un anticuerpo biológicamente activo también bloquea la activación por unión del ligando al receptor o actúa como un agonista del anticuerpo. La capacidad de un anticuerpo de longitud completa para ejercer una o más de sus actividades naturales depende de diferentes factores, incluyendo su propio plegamiento y ensamblaje de las cadenas de polipéptidos. Las inmunoglobulinas biológicamente activas, obtenidas por los procedimientos descritos aquí, son heterotetraméricas con dos cadenas idénticas L y dos cadenas idénticas H, unidas por múltiples puentes bisulfuro y plegadas
adecuadamente.

El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogénea. Se entiende que los anticuerpos individuales que comprende esta población son idénticos a excepción de mutaciones que hayan podido surgir de forma natural y que puedan estar presentes en mayor o menor cantidad. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos ya que se obtienen contra un único antígeno. Las preparaciones de anticuerpos policlonales incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), en contraste con los anticuerpos monoclonales que se dirigen cada uno contra un único determinante antigénico.

Los anticuerpos monoclonales aquí, incluyen anticuerpos "quimera" en los que una porción de la cadena pesada y/o cadena ligera es idéntica u homóloga a las secuencias de anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase, mientras las cadenas restantes son idénticas con u homólogas a las secuencias que corresponden a otros anticuerpos derivados o que corresponden a otras especies, clases o subclases, así como a los fragmentos de estos anticuerpos, según exija la actividad biológica deseada. Patente americana U.S. 4.816.567 y Morrison y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no-humanos (por ejemplo murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulinas no-humanas. Gran parte del anticuerpo humanizado corresponde a la inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en el que los residuos de la región hipervariable se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no-humana (anticuerpo donante) como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen una especificidad, afinidad y capacidad deseabas. Los residuos de la región FR de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos correspondientes no-humanos. Los anticuerpos humanizados pueden incluir residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en un anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para mejorar la realización del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprende substancialmente todos o al menos uno y típicamente dos, dominios variables, en donde todos los fragmentos hipervariables corresponden a las inmunoglobulinas no humanas y todos los FRs son secuencias de inmunoglobulinas humanas. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado incluye al menos una porción de una región constate de las inmunoglobulinas (Fc), normalmente de inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones y colaboradores, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y colaboradores, Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:293-596 (1992). Véase también los siguientes artículos de revisión y las referencias citadas en éstos: Vaswani and Hamitol, Ann. Allergia, Asma e Immunologia 1:105-115 (1998).; Harris, Biochem. Soc. Transacciones 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde con un anticuerpo producido en un humano o/y se ha obtenido con cualquier técnica descrita aquí para la producción de anticuerpos.

Esta definición de anticuerpo humano excluye específicamente a los anticuerpos humanizados con residuos de unión a antígenos no-humanos.

Un anticuerpo "madurado por afinidad" es aquel con una o más alteraciones de una o más CDRs. De esta forma resulta un anticuerpo con mayor afinidad por el antígeno en comparación con el anticuerpo parental que no posee estas alteraciones. Los anticuerpos maduros por afinidad preferentes, tienen afinidades del orden de nanomolar o incluso picomolar por el antígeno diana.

Los anticuerpos maduros por afinidad se producen por procedimientos conocidos en la materia. Marks y colaboradores, Bio/Technology 10:779-783 (1992) describen la maduración por afinidad para los dominios VH y VL. La mutagénesis al azar de la CDR y/o de los residuos de la FR se describen en Barbas et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier y colaboradoes, Gene 169:147-155 (1995); Yelton y colaboradores, J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson y colaboradores, J. Immunol. 154 (7):3310-9 (1995); y Hawkins y colaboradores, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

El término "región Fc" se utiliza para definir la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que puede generarse por digestión de un anticuerpo intacto con papaína. La región Fc puede ser de una secuencia nativa o de una región Fc variante. Aunque las uniones de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la cadena pesada de la región Fc de una IgG humana normalmente se define por extenderse desde un residuo aminoacídico en aproximadamente la posición Cys 226, o de la posición Pro230 al extremo C-carboxilo terminal de la región Fc. La región Fc de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3 y, opcionalmente, comprende un dominio CH4. La "región Fc de la cadena" tal como se entiende aquí, significa una de las dos cadenas polipéptídicas de la región Fc.

"Citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo" y "ADCC" se refiere a una reacción mediada por la célula en la que las células, no específicamente citotóxicas, que expresan los receptores de Fc (FcRs)(por ejemplo las células supresoras naturales (NK, del inglés natural killer, neutrófilos y macrófagos) reconocen al anticuerpo unido a una célula diana y causan la lisis subsiguiente de la célula diana. Las células que causan primariamente ADCC, células NK, expresan sólo Fc\gammaRIII, mientras que los monocitos expresan Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas está resumida en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol.9:457-92 (1991). Para determinar la actividad ADCC de la molécula de interés se puede realizar un ensayo in vitro ADCC, tal como el que se describe en la Patente de U.S.A. Número 5,500.362 o 5,821.337. Normalmente las células efectoras en estos ensayos son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células Natural Killer (NK). Alternativamente o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede determinarse in vivo, por ejemplo en un modelo animal tal como el descrito en Clynes y colaboradores., PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

Los términos "receptor de Fc" y "FcR" se utilizan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferente es una secuencia humana nativa de FcR. Más preferentemente, el FcR es una secuencia que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma)e incluye receptores de las subclases Fc\gammaR, Rc\gammaRII y Fc\gammaRIII, incluyendo las variantes alélicas y las formas de "ayuste" alternativo de estos receptores. En los receptores de tipo Fc\gammaRII se incluyen Fc\gammaRIIA (un "receptor activador") y Fc\gammaRIIB (un "receptor inhibidor") con secuencias de aminoácidos similares pero que difieren en sus dominios citoplasmáticos. Un receptor activador Fc\gammaRIIA contiene un inmunoreceptor de tirosina en su dominio citoplasmático basado en un motivo de activación (ITAM). Un receptor inhibidor FC\gammaRIIB contiene un inmunoreceptor de tirosina basado en su dominio citoplasmático un motivo de inhibición (ITIM) (una revisión puede encontrarse en Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997). Para revisar los FcRs puede consultarse Ravetch y Kinet, Anny Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Metd 126:330-41 (1995). Otros FcRs, así como los que se identificarán en el futuro, quedan incluidos en el término "FcR" tal como se describe aquí. El término también incluye al receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia materna de IgGs al feto (Guyer y colaboradores, J. Immunol. 2117:587 (1986); y Kim y colaboradores, J. Immunol. 245:249 (1994)).

La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de determinada diana en presencia del complemento. La activación del complemento se inicia por la unión de un primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo a un anticuerpo) que está unida a un antígeno. Para determinar la capacidad de activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC como el que describieron Gazzano-Santoro y colaboradores., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

La "unión por afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un sitio único de unión de una molécula (por ejemplo un anticuerpo) y su complementario de unión (por ejemplo el antígeno o un receptor FcRn). La afinidad de una molécula X por su complementario Y se representa por la constante de disociación (Kd), que es la concentración de Y requerida para ocupar los sitios de combinación de la mitad de las moléculas de X presentes en la solución. Los anticuerpos con baja afinidad por unión al antígeno (o al receptor FcRn) en realidad tienden a disociarse débilmente, mientras los anticuerpos con alta afinidad se unen fuertemente al antígeno (o al receptor FcRn) y permanecen unidos por más tiempo.

El término "agente citotóxico" se utiliza aquí en referencia a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de éstas. El término incluye a los isótopos radioactivos (por ejemplo At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32} y los isótopos radioactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos y toxinas como pequeñas moléculas de toxina o toxinas activas enzimáticamente de bacterias, hongos, plantas o de origen animal, incluidos los fragmentos y/o las variantes de éstos.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN); alquil sufonatos como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas como benzodopa, carbocone, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas como altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacin y bullatacinona); campotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo los análogos sintéticos adozelesin, carzelesin, y bizelesin); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobin; pancratistatina; sarcodictyin; spongistatina; mostazas nitrogenadas como clorambucilo, clornafazina, colofosfamina, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, óxido de mecloretamina hidroclórica, melfalán, novembicin, fenesterine, prednimustine, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas como carmustina, clorozotocin, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como enediyna (por ejemplo caliquemicina, especialemnte caliqueamicin y_{1}^{l} y caliqueamicina \theta_{1}^{l} véase por ejemplo en Agnew. Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994); dinemicina, incluyendo dinemicina A; y esperamicina; así como el cromóforo neocarzinostatina y antibióticos cromóforos relacionados con el enediyne), aclacinomicinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcellomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodoruvicina, streptonigrina, estreptocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos como metotrexate y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico como denopterina, metotexate, pteropterina, trimetrexate; análogos de la purina como fludarabine, 6-mercaptopurina, tiamiprine, tioguanina; análogos de la pirimidina como la ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabine, dideoxiuridina, doxifluoridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales como aminoglutetimide, mitotano, trilostano; abastecedores de ácido fólico como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida, gicósido; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxate; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinium; epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; maitansinoides como el ácido maitansínico y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido de podofilino; 2-etil hidracina; procarbacina; PSK, razoxano; rizoxina; sizofiran; spirogermanium; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2''-tricloroetrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretan; vindesina; dacarbacine; manomustina; mitobrinol; mitolactol; pibobroman; tgacitosina; arabinosa ("Ara-C"); ciclofosfamina; tiotepa; taxoids, e.g. paclitaxel (TAXOL, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) and doxetaxel (TAXOTERE, Rone-Poulenc Rorer, Antony, France); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexate; análogos del platino como el cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluoroetilornitina (DMFO); ácido retinoidco; capecitabine; y sales aceptables farmacológicamente de ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en la definición los agentes antihormonales que actúan en la regulación o la inhibición de la acción hormonal en tumores como anti estrógenos como portamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, trioxifeno, keoxifeno, LY117018; onapristona, y toremifene (Fareston); anti-andrógenos como flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide, y goserelina; y las sales aceptables farmacéuticamente así como ácidos o derivados de los anteriores.

Un anticuerpo "bloqueante" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Aunque el bloqueo puede darse de diferente forma, frecuentemente se consigue por interferencia con el ligando al que se une el receptor, con la consiguiente formación del complejo ligando-receptor y activación de la tirosín-quinasa del receptor y/o fosforilación de los residuos tirosín-quinasa en o por el receptor. Por ejemplo un antagonista del anticuerpo de VEGF se une a VEGF e inhibe la capacidad de VEGF para inducir la proliferación vascular endotelial. Los anticuerpos bloqueantes o los anticuerpos antagonistas preferentemente, causan la inhibición completa de la actividad biológica del antígeno.

Un "anticuerpo agonista" es el anticuerpo que se une y activa al antígeno o al receptor. Generalmente la capacidad de activación del receptor por parte del anticuerpo agonista es al menos similar cualitativamente (y puede ser cuantitativamente) al ligando nativo del receptor.

Un anticuerpo de la invención "que se une al antígeno esencialmente de forma tan efectiva como "el anticuerpo correspondiente producido en un sistema células de mamífero, es aquel capaz de unirse al antígeno con una afinidad o avidez del orden de 10 veces, preferentemente de 5 veces, o más preferentemente de 2 veces, que la afinidad de unión de un anticuerpo expresado por una célula de mamífero como las células de Ovario de Hámster Chino
(CHO).

Por "trastorno" se entiende cualquier entidad susceptible de recibir un beneficio con el tratamiento con el anticuerpo. Se incluyen en esta definición los trastornos crónicos o agudos o enfermedades entre las que se encuentran aquellas entidades patológicas que predisponen a los mamíferos al trastorno en cuestión. Entre los ejemplos de trastornos que pueden ser susceptibles de tratamiento, se incluyen aquí, sin limitación, los tumores malignos o benignos; los procesos malignos linfoides y las no-leucemias,; desórdenes neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros desórdenes glandulares, macrofagales, epiteliales, estromales y blastocoélicos; así como otros desórdenes inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos.

Por una "enfermedad autoinmune" se entiende aquí las enfermedades no malignas o trastorno dirigidos contra los propios tejidos de un individuo. Las enfermedades autoinmunes, excluyen las enfermedades o condiciones malignas o cancerosas, como el linfoma de célula B, la leucemia aguda linfoblástica (ALL), la leucemia crónica linfocítica (CLL), la leucemia de Hairy y la leucemia mieloblástica crónica. Entre los ejemplos de trastornos o enfermedades autoinmunes, se incluyen aquí, sin limitación, las respuestas inflamatorias como las enfermedades inflamatorias de la piel, psoriasis y dermatitis (por ejemplos la dermatitis ectópica), escleroderma sistémico y esclerosis; la respuesta asociada a las enfermedades inflamatorias del intestino (como la enfermedad de Chron y la colitis ulcerosa); síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (que incluye la insuficiencia respiratoria en el adulto; ARDS); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveitis; colitis; glomerulonefritis; condiciones alérgicas como el eczema y el asma y otras condiciones que implican la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas; aterosclerosis; deficiencia de adhesión leucocitarias; artritis reumatoide; lupus eritematoso sistémico (SLE); diabetes mellitus (por ejemplo la diabetes mellitus Tipo I o la diabetes mellitus dependiente de insulina); la esclerosis multiple; el síndrome de Reynaud; la tiroiditis autoinmune; encefalomeielitis alérgica; síndrome de Sjorgen; diabetes juvenil, y la respuesta inmune asociada con hipersensibilidad aguda o retardada mediada por citocinas y linfocitos T normalmente asociadas a la tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis, granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison); enfermedades que incluyen la dispedesis leucocitaria; trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (CNS); síndrome de daño multiórganico, anemia hemolítica (que incluye, pero no se limita a, la crioglobinemia o anemia positiva de Coombs); la miastemia grave, la enfermedad mediada por los complejos antígeno-anticuerpo; la enfermedad anti - membrana basal del glomérulo; el síndrome antifosfolípídico; la neuritis alérgica; la enfermedad de Graves; el síndrome miasténico de Lamber-Baton; el bulbo pemfigoide; el pemfigo; poliendocrinopatías autoinmunes; enfermedad de Reiter; síndrome de Staff Man (síndrome de las personas rígidas); enfermedad de Bechet; arteritis de células gigantes; nefritis de complejo inmune; nefropatía ligada a la IgA; polineuropatías ligadas a los IgM; púrpura tromocitopénica inmune (ITP) o trombocitopenia autoinmune.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen una condición fisiológica en mamíferos que normalmente se caracteriza por la desregulación del crecimiento celular. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Otros ejemplos de cáncer incluyen el cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma de pulmón al carcinoma escamoso, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointerstinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer endometrial o uterino, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer endometrial o carcinoma uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, cáncer hepático y varios tipos cáncer de cuello y cabeza.

Tal como se utiliza aquí, el término "tratamiento" se refiere a la intervención clínica en un intento por alterar el curso natural de una célula individual tratada, y puede realizarse de forma profiláctica o durante el curso de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la prevención de la ocurrencia o recurrencia de la enfermedad, la suavización de los síntomas o la disminución de las consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, la prevención de las metástasis, la disminución de la velocidad de progresión de la enfermedad y la mejoría o paliación del estado de enfermedad, la remisión y la mejora de la prognosis.

Una "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad efectiva, dosis y períodos de tiempo necesarios para conseguir un efecto terapéutico deseado o un resultado profiláctico. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también aquella en la que cualquier efecto tóxico o adverso del anticuerpo resulta menor que los efectos terapéuticos beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a la cantidad efectiva, a la dosis y a los períodos de tiempo necesario, para conseguir el deseado resultado profiláctico. Normalmente, y puesto que la dosis profiláctica se usa en los sujetos antes que, o en los estadíos tempranos de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva es menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.

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II. Modelos para realizar la intervención

La presente invención comprende la producción recombinante de inmunoglobulinas en un sistema procariota. La invención está basada en el diseño de un vector de expresión donde la expresión de una cadena de inmunoglublina ligera y una cadena de inmunoglobulina pesada están moduladas de forma independiente (es decir, sistema de cistrón independiente). Tal como se ilustra en algunos de los ejemplo proporcionados aquí, los sistemas procariotas existentes para la producción de anticuerpos, en los que la transcripción de los genes de cadena ligera y pesada están bajo el control de un único promotor (sistemas policistrónicos), presentan diversos problemas. Por ejemplo, estos sistemas, tienden a presentar un desequilibrio entre los niveles de expresión de las dos cadenas de inmunoglobulinas. Cuando los dos genes se expresan se encuentran formando parte de una única unidad de traducción y el primer gen normalmente está expresado a unos niveles más elevados que el segundo gen. Este efecto resulta de la dependencia traduccional del segundo y de factores tales como la eficiencia del ensamblado ribosomal entre los dos genes. Por ello, el sistema policistrónico produce un exceso de cadena ligera respecto de cadena pesada. Ahora bien, este problema particular, en teoría podría solucionarse ajustando experimentalmente el ensamblado traduccional. Sin embargo, aunque puede conseguirse un acoplamiento traduccional eficiente entre ambas cadenas, el sistema policistrónico crea un obstáculo adicional que complica la obtención de una proporción adecuada entre la cadena ligera preferente respecto a la cadena pesada. Como las dos cadenas están juntas en el mismo mensajero, la manipulación de la traducción del primer gen (cadena ligera) afecta a la traducción del segundo gen (cadena pesada). Por ello, se requeriría un considerable tiempo y esfuerzo para conseguir la proporción deseable de expresión de la cadena pesada.

Se ha descubierto ahora, sorprendentemente, que el problema asociado con el sistema policistrónico puede solucionarse si se utiliza un sistema con cistrones independiente, donde cada cistrón para los genes de cadena ligera y cadena pesada se sitúan bajo el control de promotores separados que permiten la separación e independencia tanto de la transcripción como de la traducción de ambos genes. Aunque generalmente se desea la obtención de niveles elevados de expresión para cada cadena individual de anticuerpo, todavía es más importante para la maximización de la producción de anticuerpos biológicamente activos, correctamente plegados y de longitud completa, la obtención de una expresión de cadenas ligera y pesada en las proporciones deseables.

Especificidad del Antígeno

La presente invención es aplicable a anticuerpos con cualquier especificidad de unión antigénica. Preferentemente, a anticuerpos específicos para antígenos que son polipéptidos de importancia biológica. Más preferentemente, anticuerpos útiles para terapia o diagnóstico de enfermedades o trastornos en los mamíferos. Los anticuerpos no-aglicosilados de longitud completa, generados de acuerdo con la presente invención, son útiles particularmente como anticuerpos terapéuticos, bien como anticuerpos bloqueantes, anticuerpos agonistas o anticuerpos conjugados. Como ejemplos de anticuerpos terapéuticos, sin limitación, son los anticuerpos anti-VEGF, anti-IgE, anti-CD11, anti-CD18, anti-CD40, anti-factor tisular (TF), anti-HER2 y anti-TrkC. Se contemplan así mismo los anticuerpos dirigidos contra antígenos no polipéptidos (tales como loa antígenos glicolipídicos asociados a tumores).

Cuando el antígeno es un polipéptido, puede ser una molécula transmembrana (por ejemplo un receptor) o un ligando, como un factor de crecimiento. Los ejemplos de antígenos incluyen moléculas como la renina; una hormona del crecimiento, la hormona humana del crecimiento y la hormona bovina del crecimiento; el factor liberador de la hormona de crecimiento; paratormona; hormona estimuladores de la tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de la insulina; cadena B de la insulina; proinsulina; hormona estimuladora folicular; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de la coagulación como el factor VIIIC, factor IX, factor tisular (TF), y el factor von Willebrand; factores anti coagulantes como la Proteína C; el factor atrial natriurético; surfantantes pulmonares; activador del plasminógeno, como la uroquinasa o la orina humana o activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoiético,; factor de necrosis tumoral alfa y vbeta; encefalinasa; RANTES (regulado en la activación normal de células T y expresado y secretado); proteína inflamatoria humana de los macrófagos (MIP-1 alfa); albúmina sérica tal como la seroalbúmina; substancia inhibitoria de Müeller; cadena A de la relaxina; cadena B de la relaxina; prorelaxina; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; proteína microbiana; tal como la beta lactamasa; ADNasa; IgE; antígeno citotóxico asociado a los lifnocitos T (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para las hormonas de factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides, factores neurotróficos como el factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF), neurotrofina-3 y neurotrofina 4, 5, o 6 (NT-3, NT-4, NT-5, NT-6) o factor de crecimiento nervioso como NGF-\beta; factor de crecimiento plaquetario (PDGF); factor de crecimiento de los fibroblastos como aFGF o bFGF; factor de crecimiento epidermal (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-\beta, TGF-\beta, TGF-\beta3, TGF-\beta4 o TGF-\beta5; factor de crecimiento similar a la insulina tipo I y II (IGF-I y IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro); proteínas de unión de los factores similares a la insulina; CD proteínas como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 y CD40; eritropoietina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; proteína morfogenética del hueso (BMP); interferón tal como interferón -alfa, -beta y -gamma, factores formadores de colonias (CSFs); por ejemplo M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; interleucinas (ILs), por ejemplo de IL-1 y IL-10, superóxido dismutasa, receptores de las células T; proteínas de superficie de la membrana; como el inhibidor DAF; antígenos virales como de la cubierta del AIDS; proteínas de transporte; receptores tipo "homing"; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, y ICAM, VLA-4 y VCAM; antígenos asociados a tumores como HER2, HER3 y HER4 receptor; y también los fragmentos de los polipéptidos citados.

Los antígenos preferidos para los anticuerpos que comprende la presente invención, son las proteínas CD como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 y CD46; los miembros de la familia del receptor ErbB como el receptor de EGF, HER2, HER3 Y HER4; las molécula de adhesión celular como LF1-1, Mac1, P150.95, VLA-4, ICAM-1, ICAM-1, VCAM-1, integrina \alpha4/\beta7, e integrina \alphav/\beta7 incluyendo tanto las subunidades \alpha o \beta de éstas (los anticuerpos anti-CD-1 Ia, anti-CD18 o anti-CD11b); los factores de crecimiento como VEGF; factor tisular (TF); TGF-\beta; interferón alfa (\alpha-IFN); interleucina, como IL-8; IgE, antígenos del grupo sanguíneo, ApoA, receptor de muerte, receptor flk2/flt3, receptor de obsesidad (OB), receptor mpl; CTLA-4; proteína C,. Además las dianas preferentes son VEGF, TF, CD20, CD40, TGF-b, CD11a, CD18, Apo2 y C24.

Los antígenos solubles o los fragmentos de éstos o conjugados con otras moléculas, se utilizan como inmunógenos para generar anticuerpos. En el caso de moléculas transmembrana, como los receptores, y los fragmentos de éstas (como el dominio extracelular del receptor) pueden utilizarse como inmunógenos. De forma alternativa, las mismas células que expresan la molécula transmembrana se utilizan como inmunógeno. Con este fin, se utilizan células que derivan de fuentes naturales (como las líneas celulares tumorales) o células que han sido transformadas por técnicas recombinantes para conseguir la expresión de la molécula transmembrana. Otros antígenos y formas de éstos útiles para la preparación de anticuerpos resultan obvios para los expertos en la materia.

Los anticuerpos producidos pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o multiespecíficos. Los antígenos multiespecíficos son específicos para diferentes epítopos de una molécula única o pueden ser específicos para epítodos de diferentes moléculas. Los procedimientos para el diseño y la producción de anticuerpos multiespecíficos son conocidos en la materia. Véase por ejemplo Millstein y colaboradores (1983) Nature 305:537-539; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553; WO 93/17715.

Construcción del vector

Las secuencias de polinucleótidos que codifican las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas pueden obtenerse por técnicas recombinantes estándares. Las secuencias polinucleotídicas deseadas se sintetizan en un sintetizador de nucleótidos o por técnicas de PCR. Una vez obtenidas las secuencias que codifican las cadenas ligera y pesada se insertan en un vector recombinante capaz de replicarse y de expresar los polinucleótidos heterólogos en el huésped procariota. Se conocen bastantes vectores disponibles que pueden utilizarse para el propósito de la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá del tamaño de los ácidos nucleicos insertados en el vector y del huésped particular que se va a transformar con éste. Cada vector contiene varios componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión de un polinucleótido heterólogo o ambas) y su compatibilidad con la célula huésped en que resida. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, un origen de replicación, un gen marcador que permite la selección, un promotor, un lugar de unión del ribosoma/RBS), una secuencia señal, un lugar de inserción del ácido nucleico heterólogo y una secuencia terminadora de la transcripción.

En general, los vectores plasmídicos contienen un replicón y unas secuencias control que derivan de especies compatibles con la célula huésped. El vector contiene un sitio de replicación así como secuencias capaces de permitir la selección por fenotipo en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma con pBR322, un plásmido derivado de las especies de E. coli. PBR322 contiene genes que codifican para la resistencia a la ampicilina (amp) y la tetraciclina (Tet) resistencia y por tanto proporciona al sistema un medio para identificar las células transformadas. PBR322, y sus derivados, u otros plásmidos microbianos o bacteriófagos pueden también contener, o ser modificados para que contengan, promotores que se utilizan en los organismos microbianos para la expresión de proteínas endógenas. Los derivados de pBR322 utilizados para la expresión particular de anticuerpos, se describen en Carter y colaboradores, Patente americana U.S. 5.648.237 y en la sección de "Ejemplos" de la presente invención.

También los vectores fago que contienen replicón y secuencias control y que son compatibles con los microorganismos huéspedes pueden utilizarse como vectores transformantes en conexión con el huésped. Como ejemplo los bacteriófagos cono \lambdaGEM.TM.-11 se utilizan como vectores recombinantes que transforman células huéspedes susceptibles como E. coli LE392.

La expresión del vector de la invención comprende al menos a dos promotores-cistrones, uno para la cadena ligera de la inmunoglobulina y el otro para la cadena pesada de la inmunoglobulina. El promotor es una secuencia reguladora de la expresión que no se traduce y que se encuentra localizada en el extremo 5' del cistrón. Los promotores de procariotas pertenecen a dos clases, inducibles y constitutivos. Un promotor inducible es un promotor que inicia el aumento de la transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a cambios de las condiciones del cultivo, por ejemplo en presencia o ausencia de un determinado nutriente o de un cambio de temperatura.

Aunque tanto los promotores constitutivos como los inducibles pueden utilizarse en la presente invención, los promotores inducibles bajo regulación se prefieren en la expresión de vectores descritos en la presente invención. Por otro lado se conocen un gran número de promotores reconocidos para una variedad de células huéspedes potenciales. El promotor seleccionado se extrae de la fuente de ADN mediante digestión con enzimas de restricción y una vez aislado se inserta en el vector de la invención en donde queda unido de forma operativa con el ADN del cistrón que codifica la cadena ligera o pesada. La secuencia nativa del promotor y algunos promotores heterólogos pueden utilizarse para la amplificación directa y/o expresión de los genes de interés. Sin embargo, se prefieren los promotores heterólogos ya que permiten una mayor transcripción y niveles de expresión del gen de interés si se comparan con el promotor nativo del polipéptido de interés.

Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen el promotor PhoA, los sistemas promotores de la B-galactamasa y la lactosa, el sistema promotor del triptófano (trp) y promotores híbridos como tac o el promotor trc. También son adecuados otros promotores funcionales conocidos de las bacterias o fagos. Sus secuencias nucleotídicas han sido publicadas y por tanto permiten a los expertos en la materia, la ligación de forma operativa de cistrones que codifican las cadenas ligeras y pesadas (Siebenlist y colaboradores (1980) Cell 20:269) utilizando adaptadores para cualquier diana de restricción que se requiera. El promotor preferido para su uso en esta invención es el promotor PhoA.

En un aspecto de la presente invención, cada cistrón en el vector recombinante comprende una secuencia señal de secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados a través de la membrana. La secuencia señal puede ser un componente del vector o puede se parte del ADN del polipéptido de interés que se inserta en el vector. La secuencia señal seleccionada para el propósito de la presente invención, es una secuencia que puede ser reconocida y procesada (por ejemplo por una señal de peptidasa) por la célula huésped. En células huéspedes procariotas que no reconocen y procesan las secuencias señal nativas en el caso de polipéptidos heterólogos, la secuencia señal se substituye por secuencias seleccionadas de señales de procariotas, por ejemplo, del grupo formado por la fosfatas alcalina, penicilinasa, Ipp, o secuencia de la enterotoxina II (STII) termoestable, LmB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. En una aplicación preferente de la invención, las secuencias señal utilizadas en ambos cistrones del sistema de expresión son secuencias señal STII o variantes de éstas.

En otro aspecto, la producción de inmunoglobulinas, de acuerdo con la invención, pueden ocurrir en el citoplasma de las células huésped y por tanto no requiere la presencia de secuencias de señal de secreción en el cistrón. Desde este modo, las cadenas de inmunoglobulina ligera y pesada se expresan, se plegan y se ensamblan formando inmunoglulinas funcionales en el citoplasma. Ciertas cepas de huésped (por ejemplo la cepa E.coli trxB) proporcionan unas condiciones citoplasmáticas que son favorables para la formación de puentes bisulfuro, por tanto permiten el plegamiento y el ensamblado adecuado de las subunidades proteicas expresadas. Proba y Pluckthun. Gene, 159:203 (1995).

La presente invención requiere un sistema de expresión en que se module la proporción cuantitativa de cadenas ligeras y pesadas expresadas para maximizar la cantidad secretada de cadena completa de anticuerpo ensamblada adecuadamente. Esta modulación se acompaña por la modulación traduccional simultánea de la longitud de las cadenas ligera y pesada.

La técnica para la modulación de la intensidad de traducción está descrita en Simmons y colaboradores en la Patente americana U.S. 5.840.523. En ella se utilizan variantes de de la región de inicio de la traducción (TIR) en el cistrón. Para una TIR determinada, se pueden obtener diferentes variantes de una secuencia de aminoácidos o de variantes de ácidos nucleicos en un rango de intensidad de traducción con el fin de conseguir ajustar el nivel de expresión deseado de una cadena específica. Las variantes de TIR pueden generarse por técnicas de mutagénesis convencional que resultan en cambios de codón que alteran la secuencia de aminoácidos, aunque se prefieren los cambios silenciosos en la secuencia de nucleótidos. Las alteraciones de TIR pueden incluir alteraciones en en número de secuencias de Shine-Dalgarno, así como alteraciones de la secuencia señal. Un procedimiento preferente para generar secuencias señal mutadas es la creación de un "banco de codones" en el inicio de la secuencia de codificación que no cambie la secuencia de aminoácidos de la secuencia señal (cambios silenciosos). Esto se consigue cambiando el tercer nucleótido de cada codón; además algunos aminoácidos como leucina, serina, y arginina, tienen múltiples posibilidades en las primeras y segundas posiciones que pueden ayudar en la complejidad de crear el banco. Este procedimiento de mutagénesis se describe en detalle en Yansura y colaboradores (1992). METHODS: A companion to methods in enzymology. 4:151-158.

En la presente invención, se genera preferentemente, un grupo de vectores en un intervalo de intensidad de TIR para cada cistrón. Este grupo limitado proporciona una comparación de los niveles de expresión de cada cadena así como del rendimiento de los productos de longitud completa en varias combinaciones de intensidad TIR. Las intensidades TIR pueden determinarse por la cuantificación del nivel de expresión de un gen marcador tal como se describe en detalle en Simmons y colaboradores en la Patente americana U.S. 5.840.523. Para el propósito de la presente invención, la combinación de intensidad de traducción para un particular par de TIRs en el vector, se representa por (N-ligera, M-pesada), donde N es la intensidad de TIR relativa de la cadena ligera y M es la intensidad TIR relativa de la cadena pesada. Por ejemplo (3-ligera, 7-pesada) significa que el vector proporciona una intensidad TIR relativa de 3 para la expresión de la cadena ligera y una intensidad de TIR relativa de 7 para la expresión de la cadena pesada. Según esta comparación de la intensidad de traducción, en la invención, se selecciona una TIR individual deseada para combinarse con la construcción diseñada del vector de expresión.

Las células procariotas huéspedes adecuadas para la expresión de anticuerpos de longitud completa de la invención, incluyen Archaebacteria y Eubacteria, organismos Gram-negativos y Gram-positivos. Los ejemplos de bacterias adecuadas incluyen a Escherichia (por ejemplo E. coli), Bacilli (por ejemplo B.subtilis), diferentes especies de Enterobacteria y Pseudomonas, Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Kebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, o Paracoccus. Preferentemente, se utilizan las células Gram-negativas. Más preferentemente, en la presente invención se utilizan como huéspedes las células de E. coli. La cepa preferente es la cepa E. coli W3110 (Bachmann, Biología Celular y Molecular, vol 2 (Washignton, D.C.: Sociedad Americana de Microbiología, 1987), páginas 1190-1219; Depósito de la ATCC Número 27.325) y los derivados de éstas, que incluyen la cepa 33D3 que tiene el genotipo W3110 .fhuA(.etonA)ptr3 lac Iq LacL8.ompT.(nmpc-fepE)degP41 kan^{R} (Patente americana U.S. 5.639.635). Se encuentran también disponibles otras cepas y derivados de éstas como E. coli 294 (ATCC 31.446), E coli B, E. coli_{\lambda} 1776 (ATCC 31.537) y E. coli RV308 (ATCC 31.608). Estos ejemplos son ilustrativos pero no
limitantes.

Los procedimientos para la construcción de derivados de las bacterias arriba mencionadas con genotipos definidos son conocidos en la materia y están descritos en, por ejemplo, Bass y colaboradores, Proteínas, 8:309-314 (1990). Es necesario, desde luego, seleccionar la bacteria apropiada tomando en consideración la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo las especies E. coli, Serratia o Salmonella, son adecuadas como huéspedes cuando se utiliza como suministradores del replicón los plásmidos conocidos pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410. Preferentemente la célula huésped debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticos y se incorporan además inhibidores de proteasas al cultivo celular.

Producción de Anticuerpos

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión arriba descritos y se cultivan en medios convencionales con nutrientes modificados según sea necesario para la inducción de promotores, selección de transformantes o amplificación de genes que codifican para las secuencias deseadas.

La transformación significa la introducción de ADN en un huésped procariota en el que el ADN pueda replicarse, como un elemento exrtracromosomal o integrado en el cromosoma. Dependiendo de la célula huésped, la transformación se realiza mediante técnicas estándares apropiadas para cada célula. El procedimiento general para células bacterianas que poseen pared celular es el tratamiento con cloruro de calcio. Otros procedimientos de transformación emplean polietilen glicol/DMSO. Así mismo, entre otras técnicas, se utiliza la electroporación.

Las células procariotas utilizadas para la producción de los polipéptidos de la invención se crecen en medio conocido en la materia y adecuados para el cultivo de las células huéspedes seleccionadas. Los ejemplos de medios adecuados incluyen el caldo de Luria (LB) más los suplementos de nutrientes necesarios. En las realizaciones preferidas, el medio también contiene agentes de selección, escogidos según la construcción realizada en el vector de expresión, para permitir el crecimiento selectivo de las células procariotas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo la ampicilina se añade al medio para el crecimiento de células resistentes que expresan el gen de resistencia a la ampicilina.

Los suplementos necesarios como carbón, nitrógeno y fuentes de fosfatos inorgánicos, se incluyen a las concentraciones apropiadas sólos o como una mezcla de otros suplementos o medios con una fuente compleja de nitrógeno. De forma opcional el medio de cultivo contiene uno o más agentes reductores seleccionados de un grupo formado por glutatión, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditriotreitol.

Las células huéspedes procariotas se cultivan a temperaturas adecuadas. Para el crecimiento de E. coli, por ejemplo, los intervalos de temperatura van de 20ºC a 39ºC, más preferentemente de 25ºC a 37º e incluso más preferentemente alrededor de 30ºC. Para E. coli el pH es preferentemente de 6,8 a 7,4 y más preferentemente de 7.0.

Si un promotor inducible se utiliza en la expresión del vector de la presente invención, la expresión de la proteína se induce en las condiciones adecuadas para la activación del promotor. En un aspecto de la invención, dos promotores PhoA se usan para controlar la transcripción de las cadenas ligeras y pesadas. Así, las células huéspedes transformadas se cultivan en un medio fosfato limitante para su inducción. Preferentemente el medio fosfato limitante es el medio C.R.A.P descrito en detalle en el Ejemplo 2. Además se pueden utilizar una variedad de otros inductores, de acuerdo con la construcción realizada en el vector, tal como es conocido en la materia.

Los polipéptidos expresados de cadena ligera y pesada, de la presente invención, se secretan y se recuperan del periplasma de las células huéspedes. La recuperación de las proteínas implica normalmente la disrupción del microorganismo, generalmente por choque osmótico, sonicación o lisis. Los restos celulares, o toda la célula al completo, se extraen por centrifugación o filtración. Las proteínas pueden purificarse, por ejemplo, por cromatografía con una resina de afinidad. De forma alternativa, las proteínas pueden transportarse en el medio de cultivo y aislarse de éste. Las células se extraen del cultivo y los sobrenadantes se filtran y concentran para una mayor purificación de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados se aíslan y se identifican con procedimientos conocidos comunes, como los geles de poliacrilaminda (PAGE) y los ensayos de transferencia de Western.

En un aspecto de la presente invención, la producción de anticuerpos a gran escala, se realiza según un proceso de fermentación. Son varios los procesos de fermentación a gran escalada que se encuentran disponibles para la producción de proteínas recombinantes. Se considera que las fermentaciones a gran escala tienen al menos una capacidad de 1000 litros, pero preferentemente de 1.000 o 100.000 litros. Estos fermentadores utilizan agitadores a propulsión para la distribución del oxígeno y los nutrientes, especialmente glucosa (la fuente de carbón y de energía preferente). Cuando se habla de fermentación a pequeña escala, generalmente se refiere a la fermentación en un fermentador que no tiene más de 100 litros de capacidad volumétrica y abarca de 1 a 100 litros.

En un proceso de fermentación, la inducción de la expresión proteica se inicia normalmente una vez que las células crecidas en las condiciones deseadas han llegado a una densidad adecuada, por ejemplo una OD_{550} entre 180-220, normalmente a un nivel de fase estacionaria temprana. Se pueden utilizar una variedad de inductores, según la construcción del vector que se emplee, como es conocido en la materia y así se describe más arriba. Las células se crecen durante períodos cortos antes de la inducción durante 12-50 horas, aunque también se utilizan inducciones durante períodos más cortos o más largos.

Para aumentar la producción de la cantidad y la calidad de los polipéptidos de la invención, se modifican las condiciones de fermentación. Por ejemplo, para aumentar el ensamblado y plegamiento de la secuencia polipétidica de anticuerpo secretada, se incluyen vectores adicionales que sobreexpresan proteínas de cubierta, como las proteinas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD y DsbG) o FkpA (una peptidil-propil cis, trans-isomerasa con actividad de cubierta), que se cotransforman en el huésped procariota. Las proteínas de cubierta facilitan el plegamiento adecuado y la solubilidad de las proteínas heterólogas producidas en las células huéspedes bacterianas. Chen y colaboradores (1999) J. Biol. Chem. 274: 19601-19605; Georgiou y colaboradores según la Patente de U.S.A. Número 6,083.715; Georgiu y colaboradores según la Patente americana U.S. 6.027.888; Bothmann y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275; 17100-17105; Ramm y Pluckthum (2000); J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie y colaboradores (201) Mol. Nicrobiol. 39:199-210. Para el plegamiento de anticuerpos divalentes de longitud completa, que tienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, es particularmente importante la presencia de suficientes puentes bisulfuro.

Para minimizar la proteolisis de las proteínas heterólogas expresadas (especialmente aquellas que son sensibles proteolíticamente), se utilizan, en la presente invención, ciertas cepas huéspedes deficientes para enzimas proteolíticos. Por ejemplo, cepas de células huéspedes modificadas por efecto de mutaciones genéticas en genes codificadores de proteasas bacterianas como Proteas III, OmpT, DegP, Tsp, Proetasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y las combinaciones de éstas. Algunas cepas deficientes en proteasas de E. coli se encuentran disponibles y descritas por ejemplo en Joly y colaboradores (1998) supra; Georgiou y colaboradores en la Patente americana U.S. 5.264.365; Georgiuou y colaboradores en la Patente americana U.S. 5.508.192; Hara y colaboradores, Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

En una aplicación preferente de la presente invención, se transforman cepas de E. coli deficientes en enzimas proteolíticos con plásmidos que sobreexpresan una o más proteínas de la cubierta. Algunas de estas cepas se describen con más detalle en la sección de Ejemplos de más abajo.

Purificación de Anticuerpos

En una realización preferida, la proteína producida aquí, se purifica además para obtener preparaciones que sean substancialmente homogéneas para análisis y usos posteriores. En este sentido, pueden utilizarse los procedimientos estándares de purificación de proteínas conocidos en la materia. Los procedimientos siguientes son un ejemplo de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de intercambio iónico o inmunoafinidad, precipitación por etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en silice o en resina de intercambio catiónico como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación en sulfato amónico, y filtración en gel mediante, por ejemplo, Sephadex G-75.

En un aspecto de la invención, la proteína A inmovilizada en la fase sólida se usa para purificación por inmunoanfinidad de los productos de anticuerpo de longitud completa. La proteína A es una proteína de pared celular de 41 Kda de Staphylococcus aureas que se une con la región de alta afinidad Fc de los anticuerpos. Lindmark y colaboradores (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. La fase sólida en la que la Proteína A está inmovilizada preferentemente es una columna que comprende un superficie de vidrio o sílice, mas preferentemente una columna de vidrio de poro controlado o una columna de ácido silícico. En algunas aplicaciones, la columna se recubre con un reactivo, como el glicerol, en un intento de prevenir la adherencia inespecífica de contaminantes.

Como primer paso de la purificación, la preparación derivada del cultivo celular, tal como se describe más arriba, se aplica a la proteína inmovilizada en la fase sólida para permitir la unión específica del anticuerpo de longitud completa la Proteína A. A continuación, la fase sólida se lava para extraer los contaminantes unidos inespecíficamente. Finalmente el anticuerpo de longitud completa se recupera de la fase sólida por elución.

Ensayos de actividad

El anticuerpo de longitud completa no glicosilado de la presente invención, puede caracterizarse según sus propiedades físico/químicas y funciones biológicas mediante varios ensayos conocidos en la materia. En un aspecto de la invención, es importante la comparación del anticuerpo producido en células huéspedes procariotas en la invención, con anticuerpos similares producidos en otros sistemas de expresión, tales como otros diseños de vectores de expresión o sistemas celulares. Particularmente, la cantidad de anticuerpo de longitud completa expresado por un vector de cistrones independientes, de la presente invención, puede comparase con la que expresan vectores policistrónicos. Los procedimientos para cuantificación de las proteínas son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, las proteínas expresadas pueden compararse según sus intensidades cuantitativas mediante SDS-PAGE teñido con con Coomassie. De forma alternativa, las bandas específicas de interés (como las bandas de longitud completa) se detectan por ejemplo mediante análisis del gen por transferencia de western y/o en un ensayo AME5-RP.

El anticuerpo de longitud completa purificado puede además caracterizarse en una serie de ensayos que incluyen, pero no se limitan a, la secuenciación N-terminal, el análisis de aminoácidos, la exclusión por tamaño en cromatografía líquida de alta presión (HLPC) no desnaturalizante, espectrometría de masas, cromatografía de intercambio iónico y digestión con papaína.

En ciertas realizaciones de la invención, el anticuerpo de longitud completa producido aquí, se analiza según su actividad biológica. Preferentemente, el anticuerpo se analiza según su unión al antígeno. Los ensayos de unión al antígeno que se conocen en la materia pueden utilizarse aquí e incluyen, sin limitación, cualquier ensayo directo o competitivo utilizando técnicas como transferencia de western, radioinmmunoensayo, ELISA (ensayo de unión immunoabsorbente), inmunoensayos de tipo sandwich, ensayos de inmunoprecipitción, ensayos de fluorescencia, ensayos de proteína A. Un ensayo de unión al antígeno, como ejemplo, se proporciona más abajo en la sección de Ejemplos.

Se describe en la presente invención, el anticuerpo de longitud completa no glicosilado. Las características únicas del anticuerpo (por ejemplo que tenga intacta la región Fc, que carezca de funciones efectoras) lo convierten en el candidato idóneno para muchas aplicaciones en las que la vida media del anticuerpo in vivo es importante pero sus funciones efectoras (complento y ADCC) son innecesarias o incluso perjudiciales. En ciertos casos, las actividades de Fc del producto de anticuerpo de longitud completa cuantifican para asegurar que sólo las propiedades deseables se mantengan. Por ejemplo, se realizan ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para asegurarse que el anticuerpo ha perdido la unión a Fc\gammaR1 (ya que supone la pérdida de toxicidad ADCC) pero continúa reteniendo la capacidad de unión a FcRn. También se realizan ensayos de unión C1q para confirmar que el anticuerpo es capaz de unirse a C1q y por tanto carece de actividad CDC. Así mismo se realizan ensayos de citotoxicidad in vitro e in vivo para confirmar la disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Las técnicas para la realización de estos ensayos son conocidas en la materia. Los procedimientos en detalle se proporcionan en los ejemplos de la sección de Ejemplos.

Anticuerpos humanizados

La presente invención comprende la producción de anticuerpos humanizados. Los diversos procedimientos para humanización de anticuerpos no humanos son conocidos en la materia. Preferentemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos de una fuente no humana. Para referirse a estos residuos de aminoácidos no humanos, frecuentemente, se utiliza el término residuos "importados" que se toman de un dominio variable de "importación". La humanización, esencialmente, se realiza según el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y colaboradores (1986) Nature 321:522-525; Riechmann y colaboradores (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen y colaboradores (1988) Science 239: 1534-1536) mediante sustitución de secuencias de la región hipervariable de un anticuerpo humano por las correspondientes de otra especie. Según esto, los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quimera (según la Patente americana U.S. 4.816.567) donde substancialmente se ha substituido menos de un dominio variable intacto humano por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos humanos en los que los residuos de la región hipervariables y posiblemente algunos residuos de FR son substituidos por residuos análogos de anticuerpos de roedores.

Para la reducción de la antigenicidad, es muy importante la elección de los dominios variables humanos, tanto para la cadena ligera como pesada. De acuerdo con el procedimiento denominado "mejor ajuste", se utiliza la secuencia de dominio variable de anticuerpo de roedor para el cribado de una librería completa humana de secuencias de dominio variable conocidas. La secuencia humana más semejante a la del roedor es la aceptada como la región de entramado para los anticuerpos humanizados (Sims y colaboradores (1993)) J. Immunol. 151: 2296; Chothia y colaboradores (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Otro procedimiento que utiliza una región de entramado particular deriva de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo de cadena ligera y pesada. La misma región de entramado puede utilizarse para diferentes anticuerpos humanizados según (Carter y colaboradores (1992) Proc. Natl. Acxad. Sci. USA, 89:4285; Presta y colaboradores (1993) J. Immunol., 151:2623.

Además, es importante que los anticuerpos se humanicen reteniendo su alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguirlo, de acuerdo con un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan según un proceso de análisis de la secuencia parental y varios productos humanizados conceptuales mediante modelos tridimensiones de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulinas tridimensiones están disponibles y resultan familiares a los entendidos en la materia. También se encuentran disponibles los programas informáticos que ilustran y representan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de las inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. El estudio de estas representaciones permite el análisis del papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse al antígeno. En este sentido, es posible seleccionar y combinar los residuos FR del receptor, e importar las secuencias para que el anticuerpo presente las características deseadas, como el aumento de la afinidad por el antígeno de interés. En general los residuos de la región hipervariable están directamentemente y substancialmente implicados en la unión al antígeno.

Variantes del anticuerpo

También se contemplan aquí las modificaciones de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos descritos. Por ejemplo, si se desea un incremento de la afinidad de unión y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante la introducción de cambios apropiados en el ácido nucleico que codifica el anticuerpo o mediante la síntesis directa del péptido. Estas modificaciones, incluyen por ejemplo, deleciones, inserciones y sustituciones de residuos en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. La combinación de delecciones, inserciones y sustituciones permite llegar a una construcción final que proporciona las características deseadas. Las alteraciones de aminoácidos pueden ser introducidas en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de interés al mismo tiempo que se genera la secuencia.

Un procedimiento útil para identificar ciertos residuos o regiones en el anticuerpo con localizaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis por cribado de alanina" tal como se describe en Cunningham y Wells (1989) Science, 244; 1081-1085. En éste, un residuo de un grupo (por ejemplo residuos cargados como arg, asp, his, lys y glu) se detectan y son reemplazados por un aminoácido neutro o cargado negativamente (preferentemente alanina o polialanina) resultando, por ello, afectada la interacción del aminoácido con el antígeno. Estas localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional mediante sustitución, después, se refinan introduciendo más variantes en esos lugares. Por tanto, mientras el lugar para la introducción de variaciones en la secuencia de aminoácidos se predetermina, la naturaleza de la mutación per se no necesita estarlo. Por ejemplo, para analizar la introducción de una mutación en un lugar dado, la técnica de mutagénesis mediante cribado de alanina o la mutagénesis aleatoria se realizan en el codón o región de interés y se analiza la actividad deseada de los anticuerpos de longitud completa expresados.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en los extremos amino y/o carboxilo terminales en un intervalo de longitud desde un residuo hasta polipéptidos con cientos o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de uno o múltiples residuos aminoacídicos. Como ejemplos de inserciones terminales se incluyen anticuerpos con residuos metionil en el extremo N-terminal o el anticuerpo fusionado con un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen las fusiones en los extremos N- o C- terminales del anticuerpo con un enzima (como ADEPT) o un polipéptido que aumente la vida media del anticuerpo en el suero.

Otro tipo de variante es una variante por sustitución de un aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo que ha sido reemplazada por otro residuo. Los lugares con un mayor interés para las mutaciones por sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan las alteraciones en FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el título de "sustituciones preferidas". En tales sustituciones resulta un cambio en la actividad biológica, también pueden introducirse otros cambios substanciales posteriores, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe más abajo en referencia a las clases de aminoácidos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 1

1

Las modificaciones substanciales en las propiedades biológicas de un anticuerpo se consiguen por selección de las sustituciones que difieren significativamente en su efecto (a) de mantenimiento de la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de su sustitución, por ejemplo, su conformación en hoja o hélice, (b) de carga o hidrofobicidad de la molécula en el lugar diana, o (c) en el conjunto de la cadena lateral. Los residuos de aminoácidos se dividen en grupos según las propiedades comunes de su cadena lateral.

(1) hidrofóbico; norlecuina, met, ala, val, leu ile;

(2) hidrofílico neutro; cys; ser; thr;

(3) acídico; asp, glu,

(4) básico; asn, gln, his, lys, arg;

(5) residuos que influencian la orientación en cadena: gly, pro; y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

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Las sustituciones no conservadoras suponen el intercambio de un miembro de una de estas clases por uno de otra clase.

Cualquier residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación propia del anticuerpo también puede sustituirse, generalmente por serina, para aumentar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir algún entrecruzamiento aberrante. A la inversa, la inclusión de puentes de cisteína en el anticuerpo aumenta su estabilidad.

Un tipo particularmente preferido de variante por sustitución implica la sustitución de uno o más residuos en la región hipervariable del anticuerpo parental (por ejemplo un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, las variantes resultantes seleccionadas para su desarrollo posterior presentan un aumento de sus propiedades en relación con el anticuerpo parental del cual proceden. Una forma conveniente para la generación de variantes por sustitución implica la maduración por afinidad mediante la expresión en fagos. Brevemente, algunos lugares de la región hipervariable (6-7 lugares) se mutan para generar todas las substituciones posibles de aminoácidos para cada lugar. Los anticuerpos de longitud completa generados se disponen en las partículas filamentosas del fago como fusiones con el producto del gen III del M13 empaquetado en cada partícula. Las variantes de la expresión en fagos se seleccionan según su actividad biológica (por ejemplo según su afinidad de unión) tal como se explica aquí. En relación a la identificación de los lugares candidatos para su modificación de la región hipervariable, se realiza la mutagénesis mediante cribado por alaninas para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyan más significativamente a la unión con el antígeno. De forma alternativa, o adicional, puede se beneficioso analizar la estructura cristalina de un complejo de antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Los residuos en contacto y los residuos vecinos son candidatos para las sustituciones, de acuerdo con las técnicas elaboradas aquí. Una vez se han generado las variantes, el panel de variantes se somete a cribado y los anticuerpos con mejores propiedades en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para su ulterior desarrollo.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante diversos procedimientos conocidos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de una variante de secuencia de aminoácido que ocurre de forma natural) o por preparación mediada por oligonucleótido (o mutagénesis dirigida, mutagénesis por PCR y mutagénesis de una variante temprana preparada o de una versión no variante de un anticuerpo).

Es aconsejable introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc del anticuerpo de longitud completa de la invención, por tanto generando una región variante de Fc. La región variante de Fc comprende una secuencia de la región humana de Fc (por ejemplo una región Fc de IgG1, IgGG2, IgG3 o IgG4 humanas) con una modificación aminoacídica (por ejemplo una sustitución) en una o más posiciones aminoacídicas.

La región variante de Fc puede presentar una alteración en la afinidad de unión por el receptor neonatal de Fc (FcRn). Esta variante de la región Fc comprende modificaciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 4245, 433, 434, 435, 436, 439 o 447 de la región Fc, con un número de residuos de la región Fc determinado según el índice EU de Kabat. Las variantes de la región Fc, pueden de forma alternativa, presentar un aumento de la unión al FcRn y comprenden una modificación de aminoácido en una o más de las posiciones aminoacídicas 238, 256, 265, 272, 286, 303, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434 de la región Fc, con un número de residuos de la región Fc determinado según el índice EU de Kabat.

La variante de la región Fc con unión reducida a un Fc\gammaR comprende modificaciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 322, 3245, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 y 439 de la región Fc, con el número de residuos de la región Fc determinado según el índice de EU de Kabat.

La región variante de Fc puede presentar una unión reducida a un Fc\gammaRI y comprende modificaciones de aminoácidos en una o más de las posiciones aminoacídicas 238, 265, 269, 270, 327 o 329 de la región Fc, con el número de residuos de la región Fc determinado según el índice de EU de Kabat.

La región variante Fc puede presentar una unión reducida a un FcgRII y comprende modificaciones de aminoácido en uno o más de la posiciones aminoacídicas 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 270, 272, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 o 437 de la región Fc con el número de residuos de la región Fc determinado según el índice de EU de Kabat.

Las variantes de la región Fc con unión alterada (aumentada o disminuída) al C1q y/o Citotoxicidad Dependiente del Complemento (CDC) están descritas en la patente internacional WO99/51642.

Estas variantes comprenden sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones aminoacídicas 270, 322, 326, 327, 329, 331 o 334 de la región Fc. Véase también Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente americana U.S. 5.648.260; Patente americana U.S. 5.624.821; y patente internacional WO94/29351 concernientes a las variantes de la región FC.

Inmunoconjugados

Se describen también aquí, los inmunoconjugados que comprenden anticuerpos conjugados con un agente citotóxico como un agente quimioterapeútico (tal como se definen y describen más arriba), toxina (por ejemplo una molécula pequeña de toxina o una toxina enzimáticamente activa de bacteria, hongo o planta de origen animal, incluidos los fragmentos y/o variantes de éstos) o un isótopo radioactivo (por ejemplo un radioconjugado).

Se contemplan también aquí, los conjugados de un anticuerpo y una o más pequeñas moléculas de toxina, como caliqueamicina, o una maitansina (Patente americana U.s. 5.208.020), un tricoteno, y CC1065.

El anticuerpo se conjuga con una o más moléculas de maitansina (de 1 a 10 moléculas de maitansina por molécula de anticuerpo). La maitansina puede, por ejemplo, convertirse en May-SS-Me que se reduce a May-SH3 y reaccionar con un anticuerpo modificado (Chari y colaboradores, Cancer Research 52: 127-131 (1992)) para generar un inmunoconjugado maitansinoide.

Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo conjugado a uno o más moléculas de caliqueamicina. La familia de los antibióticos de la caliqueamicina es capaz de producir roturas en la doble cadena de ADN en concentraciones sub-picomolares. Los análogos estructurales de caliqueamicina que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, \gamma_{1}^{l}, \alpha_{1}^{l}, \alpha_{3}^{l}, N-acetil-\gamma_{1}^{l}, PSAG y \theta_{1}^{l}, (Hinman y col., Cancer Reserch 53:3336-3342 (1993) y Lode y col., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)). Véanse también las Patentes americanas U.S. 5.714.586; 5.712.374; 5.264.586 y 5.773.001.

Las toxinas activas enzimáticamente y los fragmentos de éstas que pueden utilizarse incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos de no unión de la toxina de la difteria, cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de la ricina, cadena A de la abrina, cadena A de la modequiina, sarcina alfa, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de la diantina, proteínas de la Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de la Monordica carantia, curcina, crotina, inhibidor de la Sapaonaria officinalis , gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos. Véase por ejemplo la patente internacional WO 93/21232 publicada el 28 de Octubre de 1993.

Además se contempla la formación de un inmunoconjugado formado entre el anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN como una desoxiribonucleasa; ADNasa).

Una variedad de isótopos radioactivos se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos radioconjugados. Entre los ejemplos se incluyen At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32} y los isótopos radioactivos de Lu.

Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico pueden obtenerse utilizando una variedad de proteínas bifuncionales unidas a agentes como el N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), succinimidil-4-N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (como disuccinimidil suberato), aldehidos (como glutaraldehido), compuesto bis-azido (como bis (p-azidobenzoico) hexanodiamina, derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (como tolieno 2,6-diisocianato) y compuesto bis-activo de fluorina (como 1,5-difloro-2. 4-dinitrobenceno). Por ejemplo una inmunotoxina de ricina puede prepararse tal como describieron Vitetta y col., Science, 238: 1098 (1987). El ácido triaminopentaacético 1-isotiocianatobenzilo-3-metildietileno marcado con Carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante eficaz para la conjugación de radionucleótidos con el anticuerpo. Véase la patente internacional W094/11026. Se pueden utilizar elementos conectores del tipo "conector rompible" que facilitan la liberación del compuesto citotóxico en la célula. Por ejemplo, conectores ácido-lábiles, conectores sensibles a las peptidasas, o que contengan dimetilos o disulfuros (Chari y col., Cancer Research 52: 127-131 (1992)).

Se pueden obtener proteínas de fusión que incluyan el anticuerpo y un agente citotóxico por técnicas recombinantes o síntesis de péptidos.

El anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (como la estreptavidina) para su utilización en ensayos de pre-direccionamiento tumoral. En estos ensayos el conjugado del anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por la extracción del conjugado libre de la circulación con un agente quelante y la administración posterior de un "ligando" (como la avidina) que esté conjugado con un agente citotóxico (como un radionucleótido).

Derivados de anticuerpos

Además, los anticuerpos y las variantes de los anticuerpos pueden modificarse para que contengan mitades no proteicas conocidas en la materia y que son disponibles. Preferentemente, las mitades adecuadas para la derivatización de anticuerpos son polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilen glicol (PEG), copolímeros o glicol etilen/propil glicol, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinil alcohol, polivinil pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, etileno(maleico anhídrido copolímero, poliaminoácidos (tanto homopolímeros como copolímeros al azar), y dextran o poli(n-vinil pirrolidona)polietilen glicol, propropileno glicol, homopolímeros, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (glicerol), polivinil alcohol, y mezclas de éstos. El propionaldehido de polietilen glicol tiene ventajas en su manufactura debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede estar ramificado o no. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y puede tratarse de varias unidades de la misma molécula o de diferentes moléculas. En general, el número y el tipo de polímero utilizado para la derivatización puede determinarse en base a consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades particulares o funciones del anticuerpo a mejorar. El derivado del anticuerpo se utilizará terapéuticamente en condiciones definidas.

En general, el anticuerpo de longitud completa producido en un sistema de expresión procariota descrito aquí está no glicosilado y carece de las actividades efectoras de la región Fc. En ciertas circunstancias, puede ser deseable, al menos parcialmente, recuperar una o más funciones efectoras del anticuerpo nativo de longitud completa. En relación con ésto, se contempla un procedimiento para la recuperación de las funciones efectoras por unión de las porciones adecuadas a lugares de residuos identificados en la región Fc de un anticuerpo de longitud completa no glicosilado. Para este propósito una porción preferida es el PEG, aunque también se pueden utilizar otros polímeros de carbohidratos. La unión de PEG se lleva a cabo mediante cualquier reacción específica de unión de PEG conocida en la materia. Véase por ejemplo, la patente europea EP0401384; patente europea EP 0154316; patente internacional WO 98/48837. Primero, se sustituyen los residuos de cisteína en posiciones identificadas del anticuerpo, como en las posiciones donde el anticuerpo o las variantes de anticuerpo estén normalmente glicosilados o aquellas posiciones en la superficie del anticuerpo. Preferentemente, los residuos de cisteína se sustituyen en alguna de las posiciones 297, 298, 299, 264, 265 y 239 (numerados según el índice EU determinado según Kabat). Después de la expresión, la variante del anticuerpo con el residuo de cisteína sustituido puede tener varias formas de PEG (o carbohidrato presintetizado) químicamente unido a los residuos libres de la cisteína.

Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo de longitud completa se prepararon para el almacenamiento mediante mezclado del anticuerpo con el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables fisiológicamente opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (19980)), en la forma de soluciones acuosas, liofilizadas u otras formulaciones secadas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas e incluyen tampones como el fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (como el cloruro de amonio octadecildimetilbencil; el cloruro de hexametonio; el cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, butil o bencil alcohol; alquil parabenos,como el metil o propil paraben; el catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a 10 residuos); proteínas como la seroalbúmina, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como los disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, manosa, o las dextrinas; agentes quelantes como el EDTA; azúcares como la sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; iones formadores de sales como el sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensoactivos no iónicos como el TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM}, o el polietilén glicol (PEG).

La formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular a tratar, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten adversamente unos con otros. Dichas moléculas se hallan adecuadamente presentes en combinación con cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos también pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metil-metacrilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroe-
mulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980).

Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Ello se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Es posible preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo de longitud completa, cuyas matrices tienen formas determinadas, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen los poliestéres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente americana U.S. 3.773.919), copolímeros del ácido L-glutámico y \gammaetil-L-glutamato, acetato de etileno no degradable, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide), y ácido poli-D-(-)-3-hidrocibutírico. Mientras que los polímeros como el etilen-vinil acetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten una liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos se encapsulan permanecen en el cuerpo durante largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Es posible concebir estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación resulta ser la formación de un enlace S-S intermolecular a través de un intercambio tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse mediante modificación de residuos sulfidrilos, liofilizando las soluciones acídicas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices poliméricas.

Utilizaciones

Un anticuerpo puede utilizarse, por ejemplo, para purificar, detectar y reconocer un polipéptido específico, incluyendo procedimientos diagnósticos y terapéuticos tanto in vitro como in vivo.

En un aspecto, un anticuerpo puede utilizarse en inmunoensayos para la cuantificación cualitativa y cuantitativa de antígenos específicos en muestras biológicas. Los procedimientos convencionales para la detección de la unión antígeno-anticuerpo incluyen, por ejemplo, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o la inmunhistoquímica de tejidos. Muchos procedimientos pueden utilizar un marcaje unido al anticuerpo para los propósitos de detección. El marcaje utilizado con el anticuerpo es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con su unión con el anticuerpo. Se conocen numerosos marcajes, incluyendo los radioisótopos P32, S32, C14, I125, H3 e I131, fluoróforos como los quelatos térreos raros o la fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, la luciferasa de la luciérnaga y la luciferasa bacteriana (patente americana U.S. 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinedionas, peroxidasas de rábano (HRP), fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, la glucosa oxidasa, la galactosa oxidasa y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, las oxidasas heterocíclicas como la uricasa y la oxidasa de xantina, lactoperoxidasa, biotina/avidina, marcadores spin, marcadreos de bacteriófagos, radicales libres estables, radionúclidos para análisis por la imagen (como el Tecnecio) y similares.

Procedimientos convencionales están disponibles para unir estos marcajes de forma covalente a los polipéptidos de anticuerpo. Por ejemplo, agentes acoplantes como los dialdehidos, carbodiimidas, dimaleimidas, bis-imidatos, bis-diazotizado bencindina, y similares, pueden utilizarse para etiquetar los anticuerpos con el fluorescente, quimioluminiscente y marcajes enzimáticos descritos anteriormente. Véase por ejemplo, la patente americana U.S. 3.90.475 (fluorimetría) y la patente americana U.S. 3.645.090 (enzimas); Hunter y col., Nature 144: 945 (1962); David y col., Biochemistry 13:1014-1021 (1974; Pain y col., Immunol. Methods 40:219-230 (1981); y Nygren Histochem. And Cytochem. 30:407-412 (1982). Los marcajes preferidos aquí son los enzimáticos como la peroxidasa de rábano y la fosfatasa alcalina. La conjugación de dicho marcaje, incluyendo las enzimas, con el polipéptido del anticuerpo es un proceso de manipulación estándar para un experto en técnicas de inmunoensayo. Véase por ejemplo, O'Sullivan y col., "Methods for the preparation of enzyme-antibody conjugates for uses in enzyme immunoassay", en Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone y H. Van Vunakid, vol 73 (Academic Press, New York, N.Y., 1981), pp. 147-166. Dichos procedimientos de unión son adecuados para utilizar con los polipéptidos de anticuerpo de la presente invención.

Un procedimiento alternativo al marcaje del anticuerpo consiste en analizar el antígeno en fluidos biológicos mediante un inmunoensayo de competición con un antígeno estándar competidor marcado con una sustancia detectable y un anticuerpo no marcado. En este ensayo, la muestra biológica, los estándares de antígeno marcados y el anticuerpo se combinan y se determina la cantidad de antígeno estándar marcado unido al anticuerpo no marcado. La cantidad del antígeno analizado en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno estándar unido al anticuerpo.

En un aspecto, el anticuerpo de longitud completa no glicosilado es de especial utilidad para detectar y determinar los patrones de expresión de antígenos de superficie específicos in vitro o in vivo. Tal como se describió anteriormente, el anticuerpo de longitud completa no glicosilado no ejerce funciones efectoras (es decir, actividad ADCC o CDC). En consecuencia, cuando el anticuerpo se une a una superficie celular, no se iniciarán eventos citotóxicos no deseables. El antígeno de superficie puede ser específico para una célula o tipo tisular determinado, y por ello puede utilizarse como un marcador de la célula o tipo de tejido. Preferiblemente, el marcador de antígeno de superficie se expresa diferencialmente en estadios diversos de diferenciación de células o tipos de tejidos particulares. El anticuerpo de longitud completa dirigido contra dicho antígeno de superficie puede utilizarse para el cribado y aislamiento de células madres como las células madre embrionarias, las células madre hematopoyéticas y las células madres mesenquimáticas. El anticuerpo puede utilizarse para detectar células tumorales que expresan antígenos de superficie asociados con el tumor como los receptores HER2, HER3 o HER4.

Un anticuerpo de longitud completa puede utilizarse como un agente de purificación por afinidad. En este proceso, el anticuerpo de longitud completa se inmoviliza sobre una fase sólida como una resina de Sephadex o un papel de filtro, utilizando procedimientos bien conocidos en la materia. El anticuerpo inmovilizado se contacta con una muestra que contiene el antígeno a purificar, y a continuación se lava el soporte con un solvente adecuado que eliminará todo el material en la muestra excepto el antígeno a purificar, que estará unido al anticuerpo de longitud completa inmovilizado. Por último, el soporte se lava con otro solvente adecuado, como el tampón glicina, pH 5,0, que liberará el antígeno del anticuerpo de longitud completa.

Los anticuerpos pueden utilizarse como un antagonista para bloquear parcial o totalmente la actividad de antígeno específica tanto in vitro como in vivo. Además, al menos algunos anticuerpos pueden neutralizar la actividad del antígeno de otras especies. De acuerdo con ello, los anticuerpos pueden utilizarse para inhibir una actividad de antígeno específica, por ejemplo, en un cultivo celular de otras especies. Según ello, los anticuerpos pueden utilizarse para inhibir el antígeno con el cual reacciona de forma cruzada un anticuerpo (por ejemplo chimpancés, babunes, marmoset, cinomolgus y rhesus, cerdos o ratones). En otra realización, el anticuerpo puede utilizarse para inhibir las actividades antigénicas mediante contacto del anticuerpo con el antígeno de modo que se inhibe la actividad antigénica. Preferiblemente, el antígeno es una molécula proteica humana.

Un anticuerpo puede utilizarse en un procedimiento para inhibir un antígeno en un individuo que padece un trastorno en el cual el antígeno es perjudicial. Dicho procedimiento comprende la administración al individuo de un anticuerpo de la invención de modo que se inhibe la actividad antigénica en el sujeto. Preferiblemente, el antígeno es una molécula proteica humana y el sujeto es un humano. Alternativamente, el sujeto puede ser un mamífero que expresa el antígeno con el que se une un anticuerpo de la invención. Además, el sujeto puede ser un mamífero en el que se ha introducido el antígeno (por ejemplo, mediante la administración del antígeno o mediante la expresión de un transgén del antígeno). Un anticuerpo puede administrarse a un individuo humano con propósitos terapéuticos. Además, un anticuerpo puede administrarse a un mamífero no humano que expresa un antígeno con el que reaccionar de forma cruzada el anticuerpo (por ejemplo un primate, cerdo o ratón) con propósitos de índole veterinaria o como un modelo animal de enfermedad humana. Respecto a lo último, dichos modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de anticuerpos (por ejemplo, evaluando las dosificaciones y tiempos de administración). Los anticuerpos bloqueantes que son de utilidad terapéutica incluyen, por ejemplo aunque no por ello se limitan a los mismos, anti-VEGF, anti-IgE, anti-CD 11 y anticuerpos anti-factor tisular. Los anticuerpos pueden utilizarse para diagnosticar, tratar, inhibir o prevenir enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con la expresión anormal y o la actividad de una o más moléculas de antígeno, incluyendo pero sin limitarse a tumores benignos y malignos, tumores no leucémicos o linfomas, trastornos neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros glandulares, macrofagales, epiteliales, estromales y blastocelíacos y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunogénicos.

En un aspecto, el anticuerpo bloqueante es específico de un antígeno del ligando, e inhibe la actividad antigénica mediante bloqueo o interferencia con la interacción ligando-receptor implicando el antígeno del ligando, e inhibiendo por ello la vía de señalización correspondiente y otros eventos moleculares o celulares. Se describen también los anticuerpos específicos de receptor que no impiden necesariamente la unión del ligando pero interfieren con la activación del receptor, con lo que inhiben cualquier respuesta que normalmente se iniciaría por la unión del ligando. Los anticuerpos que se unen preferible o exclusivamente con los complejos ligando-receptor se describen aquí. El anticuerpo también puede actuar como un agonista o un receptor del antígeno, y en consecuencia potenciando, incrementando o activando de forma parcial o total las actividades de la activación del receptor mediada por ligando.

Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo conjugado con un agente citotóxico puede administrarse al paciente. Preferentemente, el inmunoconjugado y/o el antígeno al cual se une se internaliza por la célula, lo que resulta en un aumento de la eficacia terapéutica del inmunoconjugado para eliminar la célula diana a la cual se une. El agente citotóxico puede estar dirigido o interferir con el ácido nucleico en la célula diana. Ejemplos de dichos agentes citotóxicos incluyen cualquiera de los agentes quimioterapéuticos citados aquí (como un maytansinoide o una caliqueamicina), un isótopo radioactivo, o una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN.

Los anticuerpos pueden utilizarse sólos o en combinación con otras composiciones en una terapia. Por ejemplo, el anticuerpo puede co-administrarse con otro anticuerpo, agente(s) quimioterapéutico(s) (incluyendo cócteles de agentes quimioterapéuticos), otros agente(s) citotóxico(s), agente(s) anti-angiogénico(s), citoquinas, y/o agentes inhibidores del crecimiento. Si el anticuerpo de longitud completa inhibe el crecimiento tumoral, puede ser deseable combinar el anticuerpo de longitud completa con uno o más agente(s) terapéutico(s) que también inhiben el crecimiento tumoral. Por ejemplo, los anticuerpos anti-VEGF que bloquean las actividades VEGF pueden combinarse con anticuerpos anti-ErbB (por ejemplo, anticuerpo anti-HER2 HERCEPTIN®) en un tratamiento del cáncer de mama metastático. Alternativamente, o adicionalmente, el paciente puede recibir terapia de radiación combinada (por ejemplo, irradiación de rayo externo o terapia con un agente marcado radioactivamente, como un anticuerpo). Dichas terapias combinadas citadas anteriormente incluyen la administración por separado, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de longitud completa puede tener lugar antes de, y/o a continuación, de la administración de la terapia o terapias adjuntas.

El anticuerpo de longitud completa (y el agente terapéutico adjunto) se administra por vías adecuadas, incluyendo la parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y si se desea para el tratamiento local, por administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración por vía intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subucutánea. Además, el anticuerpo de longitud completa se administra de forma adecuada por infusión de pulsos, en particular con dosis decrecientes del anticuerpo. Preferiblemente, la dosis se proporciona mediante inyecciones, más preferiblemente mediante inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.

La composición del anticuerpo de longitud completa se formulará, dosificará y administrará de forma consistente con la buena práctica médica. Los factores para considerar en este contexto incluyen el trastorno particular a tratar, el mamífero particular a tratar, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de liberación del agente, el procedimiento de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por los clínicos. El anticuerpo de longitud completa no necesita ser formulado, aunque opcionalmente sí lo sea, junto con uno o más agentes normalmente utilizados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de dichos otros agentes depende de la cantidad del anticuerpo de longitud completa presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento, y de otros factores citados anteriormente. Estos son generalmente utilizados en las mismas dosis y por las mismas vías de administración que las utilizadas aquí o aproximadamente del 1 al 99% de las dosis utilizadas hasta este momento.

Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosificación adecuada del anticuerpo de longitud completa (cuando se utiliza sólo o en combinación con otros agentes como los agentes quimioterapéuticos) dependerá del tipo de enfermedad a tratar, del tipo de anticuerpo, de la gravedad y de la evolución de la enfermedad, si el anticuerpo de longitud completa se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al anticuerpo de longitud completa, así como del criterio del médico responsable. Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 \mug/kg a 5 mg/Kg (por ejemplo, 0,1 mg/Kg-10 mg/Kg) de anticuerpo es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, si, por ejemplo, mediante uno o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria inicial puede hallarse en el intervalo de aproximadamente 1 \mug/Kg a 100 mg/Kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se prolonga hasta que ocurra una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. La dosis preferida del anticuerpo se hallará en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/Kg a 10 mg/Kg. Por ello, uno o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/Kg, 2,0 mg/Kg, 4,0 mg/Kg o 10 mg/Kg (o cualquier combinación de lo mismo) puede administrarse al paciente. Dichas dosis pueden administrarse intermitentemente, por ejemplo, cada semana o incluso cada tres semanas (por ejemplo, de manera que el paciente reciba de 2 a 20 dosis, por ejemplo 6 dosis del anticuerpo). Puede administrarse una dosis de carga elevada inicial, seguida de una o más dosis inferiores. Un ejemplo de régimen de dosificación comprende la administración de una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/Kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/Kg del anticuerpo. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

Se proporciona un artículo de fabricación que contiene los materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o un prospecto incluido en el paquete sobre o asociada con el contenido. Recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar formados de diversos materiales como el vidrio o el plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para el tratamiento de la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de longitud completa de la invención. La etiqueta o el prospecto indican que la composición se utilice para el tratamiento de la condición de elección como por ejemplo el cáncer. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en éste, en donde la composición comprende un anticuerpo de longitud completa; y (b) un segundo recipiente con una composición en su interior, en donde la composición comprende otro agente citotóxico. El artículo de fabricación puede además comprender un prospecto en el paquete que indique que las composiciones del primer y segundo anticuerpo pueden utilizarse para tratar el cáncer. Alternativa o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, como el agua bacteriostática para inyección (BWF), tampón fosfato salino, solución de Ringer y solución de dextrosa. Pueden estar incluidos otros materiales deseables desde un punto de vista comercial o del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

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Los ejemplos siguientes son únicamente para ilustrar la práctica de la presente invención y no con ánimo de limitación.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de los vectores de expresión

Diversos vectores de expresión se generaron para la expresión de anticuerpos específicos contra el factor tisular (anticuerpo anti-TF) y anticuerpos específicos contra el factor de crecimiento celular endotelial vascular (anticuerpo anti-VEGF). Para cada construcción de vector, se clonó un casete de expresión en la misma pauta de lectura del plásmido pBR322 de E. coli en la diana de restricción EcoRI. Sutcliffe (1978) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:77-90. Cada casete de expresión contiene al menos los siguientes componentes: (1) un promotor phoA para el control de transcripción; (2) una secuencia de Shine-Dalgarno del gen trp de E. coli o del gen de la enterotoxina II estable al calor (STII), o una combinación de ambos, para el inicio de traducción; y (3) un terminador \lambdat0 para finalizar la transcripción. Los componentes básicos de los casetes de expresión bacterianos son conocidos en la materia y se han descrito por ejemplo en Kikuchi y col., Nucleic Acids Res. 9(21):567-5678 (1981) (para el promotor phoA); Schltissek y Grosse, Nucleic Acids Res. 15:3185 (1987) (para el terminador \lambdat0); Yanofsky y col., Nucleic Acids Res. 9:6647-6668 (1981) (pra trp); Picken y col., Infect. Immun. 42:269-275 (1983) para STII); y Chang y col., Gene 55:189-196 (1987) (para la utilización combinada de trp y la secuencia de Shine-Dalgarno de STII). Adicionalmente, las secuencia señal de STII o las variantes de codón silente de lo mismo preceden la secuencia codificante para la cadena ligera o la pesada y dirigen la secreción del polipéptido en el periplasma. Picken y col., Infect. Immun. 42:269-275 (1983); Simmons y Yansura, Nature Biotechnology 14:629-634 (1996).

Vectores policistrónicos

Con el fin de ilustrar las propiedades aumentadas de los sistemas de cistrones independientes de la presente invención, diversos vectores policistrónicos para anticuerpos de longitud completa se construyeron para su comparación. En un vector policistrónico, los dos cistrones para los genes de cadena ligera y pesada se hallan bajo el control transcripcional de un solo promotor Phoa.

El vector policistrónico inicial para la expresión del anticuerpo anti-TF, pxTFPV, se construyó utilizando el casete de expresión de un vector publicado con anterioridad, pAK19, que era para la expresión de un fragmento Fab' de anticuerpo. Carter y col., (1992) Bio/Technology 10:12-16. La estructura del pAK19 original y la construcción de la versión completa pxTFPV se muestran en la Figura 1. El casete de expresión contiene, desde el extremo 5' al 3', un promotor PhoA, el cistrón para la cadena ligera, el cistrón para la cadena pesada y un terminador de la transcripción \lambdat0. La distancia entre el codón de parada de la cadena ligera y el de inicio de la secuencia señal de STII precediendo la cadena pesada es de 81 pares de bases. Para construir un vector policistrónico anti-VEGF, las secuencias señal para las cadenas ligera y pesada de anti-VEGF se sustituyeron por las secuencias codificantes de las cadenas ligera y pesada de anti-TF en pxTFPV. El casete de expresión anti-VEGF se modificó posteriormente mediante deleción del fragmento HindIII de ^{\sim}50 pb cadena arriba del promotor PhoA y los cambios de varios nucleótidos también se hicieron en la región no traducida cadena arriba de la secuencia de Shine-Dalgarno de la cadena pesada. El vector policistrónico resultante para anti-VEGF se denominó pY0317.Fab_CH3.

Diversas construcciones anti-TF policistrónicas adicionales, paTF20, paTF30, paTF40, paTF90, paTF110,
paTF100, paTF120, se realizaron de forma similar. Las secuencias del casete de expresión de estos plásmidos policistrónicos difieren de los de pxTFV principalmente en la región 5' no traducida y en la región precedente a la secuencia señal para la cadena pesada. Adicionalmente, y dependiendo de la construcción, también existen diferencias de los codones silentes en la secuencia señal STII entre pxTFV y algunos de los plásmidos policistrónicos adicionales. Simmons y Yansura, Nature Biotechnology, 14:629-634 (1996).

Vectores de cistrones independientes

Para la práctica de la presente invención, se diseñaron vectores con cistrones independientes para proporcionar una expresión independiente de los genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulinas. En dichos vectores, la unidad de cistrón para cada cadena se halla bajo el control de su propio promotor PhoA y se prosigue de un terminador \lambdat0. Además, cada unidad de cistrón comprende una TIR cadena arriba de la secuencia codificante para la cadena ligera o pesada. La construcción de un vector de cistrones independientes se ilustra en la Figura 7. El casete de expresión comprende, desde el extremo 5' al 3', un primer promotro PhoA seguido del cistrón para la cadena ligera (TIR-L+cadena ligera) y el terminador \lambdat0, y un segundo promotor PhoA seguido del cistrón para la cadena pesada (TIR-H+cadena pesada) y el segundo terminador \lambdat0. Tanto TIR-L como TIR-H contienen una señal de secreción STII o su variante. Las secuencias del casete de expresión de paTF50 (para anti-TF; SEC ID NO:1) y pxVG2AP11 (para anti-VEGF: SEC ID NO:2) se proporcionan en las Figuras 20 y 21, respectivamente. Vectores de cistrones independientes adicionales para anti-TF, paTF70, paTF60, paTF80, paTF140 y pxTF2AP77 representan diversas combinaciones de intensidad TIR para las traducciones de cadena ligera y pesada y difieren de un paTF50 respecto a los cambios de los codones silentes en la secuencia señal STII, tal como se describió anteriormente. Simmons y Yansura, Nature Biotechnology, 14:629-634 (1996).

Ejemplo 2 Expresión en E. coli de anticuerpos de longitud completa mediante la utilización de vectores policistrónicos

Los anticuerpos de longitud completa se generaron en primer lugar con vectores policistrónicos derivados de un vector publicado, pAK19, de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 1. En primer lugar se realizaron inducciones a pequeña escala para comparar y evaluar los niveles de expresión con las diversas construcciones.

Materiales y métodos

Para la expresión a pequeña escala de cada construcción, la cepa de E. coli 33D3 (W3110.fhuA(.tonA)ptr3 lac lq lacL8.ompT.(nmpc-fepE)degP41 kanR) se utilizó como célula huésped. Después de la transformación, se inocularon transformantes seleccionados en 5 ml de medio Luria-Bertani suplementado con carbenicilina (50 \mug/ml) y se crecieron a 30ºC en un cultivo en agitación durante toda la noche. Cada cultivo se diluyó a continuación (1:50 o 1:100) en un medio limitante de fosfato C.R.A.P. (3,57 g (NH4)2SO4, 0,71 g de NaCitrato-2H2O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de Extracto de levadura (certidicado), 5,36 Hycasse-Sheffield, ajustado a pH con KOH de 7,3, y se añadieron 872 ml de H2O SQ y se autoclavó; se enfrió a 55ºC y se suplementó con 110 ml de MOPS pH 7,3, 11 ml de glucosa al 50%, 7 ml de 1M MgSO4). A continuación se añadió la carbenicilina al cultivo de inducción a una concentración de 50 \mug/ml y se creció durante aproximadamente 24 horas a 30ºC en un cultivo giratorio. Salvo que se indique lo contrario, todas las inducciones del frasco de agitación se realizaron en un volumen de 2 ml.

Se prepararon lisados celulares de células completas no reducidos de cultivos inducidos de la manera siguiente: (1) se centrifugaron los sedimentos a DO_{600} de 1 en un tubo de microcentrifugación; (2) cada sedimento se resuspendió en 90 ml de TE (10 mM Tris pH 7,6, 1 mM EDTA); (3) 10 \mul de ácido yodoacético 100 mM (Sigam I-12512) se añadieron a cada muestra para bloquear cualquier cisteína libre y prevenir el arrastre de disulfuros; (4) se añadieron 20 \mul de SDS al 10% a cada muestra. Las muestras se mezclaron por agitación, se calentaron a aproximadamente 90ºC durante 3 minutos y luego se volvieron a mezclar por agitación. Después de enfriar las muestras a temperatura ambiente, se añadieron ^{\sim}750-1000 \mul de acetona al precipitado de proteína. Las muestras se mezclaron por agitación y se dejaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos. Después de la centrifugación durante 5 minutos en una microcentrífuga, se aspiró el sobrenadante de cada muestra se resuspendió el sedimento de cada proteína en 50 \mul de dH2O + 50 \mul de tampón de muestra NOVEX. Las muestras se calentaron durante unos 3-5 minutos a 90ºC, se mezclaron bien por agitación y se enfriaron a temperatura ambiente. Se realizó una última centrifugación de 5 minutos y los sobrenadantes se transfirieron a tubos limpios.

Las muestras reducidas se prepararon mediante las etapas similares siguientes descritas más arriba para muestras no reducidas, excepto que se añadieron 10 \mul de 1M DTT a la solución de resuspensión celular en el paso (2) y se omitió la adición de IAA en el (3). El agente reductor se añadió también a una concentración de 100 mM cuando el precipitado proteico se resuspendió en tampón de muestra 2X +H2O.

Después de la preparación, se cargaron de 5-10 \mul de cada muestra en un pocillo de 10, 1,0 mm NOVEX fabricado al 12% con Tris-Glicina SDS-PAG y se realizó una electroforesis a aproximadamente 120 V durante 1,5-2 horas. Los geles resultantes se tiñeron con azul de Coomassie o se utilizaron para análisis por transferencia de western.

Para el análisis de transferencia de western, los geles de SDS-PAGE se electrotransfirieron en una membrana de nitrocelulosa (NOVEX). La membrana se bloqueó a continuación con una solución de 1XNET (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7,4, 0,05% de Triton-X100) + gelatina la 5% durante aproximadamente 30 min. Se agitaron mediante rotación durante 1 h a temperatura ambiente. Después de la etapa bloqueante, la membrana se colocó en una solución de 1X NET + gelatina al 0,5% + anticuerpo anti-FAb (fracción de IgG de cabra conjugada con peroxidasa contra IgG Fab humana; CAPPEL #55223). La dilución del anticuerpo anti-Fab se halló en el intervalo de 1:50.000 a 1:1.000.000 dependiendo del lote del anticuerpo. La membrana se dejó en la solución del anticuerpo toda la noche a temperatura ambiente en agitación rotatoria. A la mañana siguiente, la membrana se lavó un mínimo de 3x10 minuto en 1XNET + gelatina al 0,5% y luego durante 1x15 minutos en TBS (20 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl). Las bandas de proteína unidas por el anticuerpo anti-Fab se visualizaron utilizando la detección con ECL de Amersham Pharmacia Biotech y exposición de la membrana a una película de rayos X.

Algunas de las bandas de proteína expresadas se sometieron posteriormente al análisis de secuencia N-terminal en el cual, después de una electroforesis SDS-PAGE, las muestras de los cultivos inducidos se electrotransfirieron a una membrana de PVDF (Matsudaira, J. Biol. Chem. 262:10035-10038 (1987)). Se secuenciaron las bandas de PVDF adecuadas con un secuenciador de Applied Biosystems (Foster City, CA) 494HT o 494cLC conectado a un analizador PTH (Henzel y col., Methods: A Companion to Methods Enzymol. 6:239-247 (1994)).

Resultados Cantidades limitadas de vectores policistrónicos producidos de los anticuerpos de longitud completa

Los plásmidos policistrónicos para el anticuerpo anti-TF (pxTFPV) y el anticuerpo anti-VEGF (pY0317.Fab_CH3) se construyeron, se transformaron en la cepa 33D3 y se indujeron tal como se describió en el Ejemplo 1 y en los Materiales y Métodos. Las muestras de lisado celular completo no reducidas se prepararon y analizaron mediante transferencia de western. Los resultados se muestran en la Figura 2. Tal como indica la flecha, una pequeña cantidad del anticuerpo plegado correctamente y de longitud completa se observó para el anticuerpo anti-TF (carril 2), y esencialmente no se detectó ninguna banda de longitud completa en la muestra de anticuerpo anti-VEGF (carril 3). Las muestras reducidas se prepararon a continuación, separadas por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. Las bandas de proteína para los anticuerpos anti-TF y anti-VEGF se cortaron y sometieron a un análisis aminoacídico N-terminal. Los resultados demostraron una mezcla de proteína madura procesada y proteína precursora no procesada (en la que la secuencia señal de secreción no se cortó) para ambas construcciones. Por consiguiente, los vectores policistrónicos pcTFPV y pY0317.Fab_CH3 no pudieron dirigir una secreción significativa y ensamblar los anticuerpos anti-TF y anti-VEGF de longitud completa.

Para dirigir el problema de la secreción ineficiente, se generaron vectores policistrónicos adicionales con combinaciones de intensidad TIR moduladas para la cadena ligera y pesada, tal como se ilustra en la Figura 3. El propósito de este experimento fue determinar los niveles de traducción que podrían lograr una mejor secreción de las cadenas ligera y pesada. Las combinaciones distintas de fuerzas TIR también podrían ser utilizadas para determinar el cociente de expresión preferida de cadena ligera respecto a pesada para una acumulación máxima de anticuerpo de longitud completa. Todas las construcciones se diseñaron y construyeron de acuerdo con las enseñanzas del Ejemplo 1. Las siguientes construcciones se realizaron con combinaciones de intensidad TIR diversas: paTF20 (1-cadena ligera, 1-cadena pesada), paTF30 (3- ligera, 1-pesada), paTF40 (1-ligera, 3-pesada), paTF90 (3-ligera, 3-pesada), paTF100 (3-ligera, 7-pesada), paTF110 (7-ligera, 3-pesada), paTF120(7-ligera, 7-pesada). Los números en los paréntesis representan la fuerza relativa TIR para la cadena pesada y ligera, tal como se describe en Simmons y col., Nature Biotechnol. 14:629-634 (1996), y en la patente americana U.S. 5.840.530.

Los resultados de la transferencia de western de los productos de expresión con vectores policistrónicos con diversas combinaciones de intensidad TIR se muestran en la Figura 4. En la Fig. 4A se muestran las muestras en condiciones reducidas en las cuales las cadenas ligeras y pesadas estás separadas. Y en 4B, se muestran las muestras en condiciones no reducidas en las que los enlaces disulfuro permanecen intactos. Las muestras reducidas muestran claramente un amplio exceso de cadena ligera sobre cadena pesada en todas las combinaciones de TIR, incluso considerando que la cadena ligera es más fácilmente detectable que la cadena pesada utilizando este anticuerpo anti-Fab (Figura 4A). En la combinación de intensidad TIR mayor (paTF120 (7-ligera, 7-pesada)), una cantidad pequeña de cadena ligera no procesada se empezó a acumular, lo que indicaba que la secreción se bloqueara. La transferencia de western no reducido muestra la acumulación del anticuerpo de longitud completa junto con formas intermedias (Figura 4B). El nivel máximo de anticuerpo de longitud completa se logró con paTF40 (1-ligera, 3-pesada) seguido por paTF100 (3-ligera, 7-pesada). Ambas construcciones tienen unos cocientes de expresión de cadena ligera respecto a pesada relativamente inferiores tal como se muestra en la Figura 4A, lo que sugiere que el nivel del anticuerpo de longitud completa se correlaciona con los niveles de expresión relativos de cadenas ligera y pesada.

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Ejemplo 3 Expresión de anticuerpos de longitud completa en E. coli con vectores de cistrones independientes

Para construir los vectores de cistrones independientes con combinaciones TIR moduladas, una intensidad TIR preferida para la secreción de cada cadena individual se determinó en primer lugar en una serie de plásmidos de un sólo cistrón construidos para expresar únicamente la cadena ligera o la pesada (Figura 5). Una serie de plásmidos de un sólo cistrón con TIRs diversos se construyó para la expresión individual de las cadenas ligera y pesada anti-TF. Los materiales y métodos utilizados para la construcción del vector y la expresión de la proteína fueron similares a los utilizados por las expresiones de vectores policistrónicos, que se habían descrito en los Ejemplos 1 y 2 anteriores.

El rango de fuerzas TIR analizadas se extendió desde una fuerza relativa de 1 a una máxima de 13. Los lisados de células completas reducidos de los cultivos reducidos transformados con estos plásmidos construidos se analizaron mediante SDS-PAGE y los resultados se muestran en la Fig. 6. Los niveles de proteína secretada, tanto para la cadena ligera como la pesada, disminuyeron cuando la fuerza relativa TIR fue de 13. Cuando se utilizó una fuerza relativa TIR de 13 para la expresión de cadena ligera, el nivel de proteína madura permaneció constante; sin embargo, el material precursor empezó a acumularse utilizando esta construcción. Este resultado sugirió que para la expresión individual de la cadena ligera como de la pesada, la TIR más preferido es de 7. Mediante análisis aminoacídico N-terminal se confirmó que utilizando una TIR de 7 las bandas de proteína de cadena ligera y pesada producidas correspondían con la forma proteica de la proteína madura y procesada.

Una vez determinados los TIR más preferidos para cada cadena de anticuerpo individual, la siguiente etapa implicó reunir los dos cistrones en un plásmido. Las dos construcciones con la TIR de 7 se combinaron de modo que la expresión de cada gen se mantuvo bajo el control de su propio promotor PhoA (Fig. 7). Después de la transformación y la inducción, el lisado celular de células completas reducido a partir de la expresión del plásmido (pxTF2AP77) se preparó y analizó mediante SDS-PAGE (Fig. 8). Se detectaron 4 bandas relacionadas con el anticuerpo mediante tinción de Coomassie. Mediante análisis aminoacídico N-terminal, se demostró que estas bandas de proteína demostraron correspondían con la forma precursora y la madura de ambas cadenas, la ligera y la pesada. En consecuencia, aunque la intensidad TIR preferida puede haberse determinado para cada cadena individual, cuando dos cistrones, mantenidos bajo el control de promotores separados, se combinaron en un en una sola construcción, la co-expresión simultánea de ambas cadenas resultó en una secreción de proteína insuficiente. Este resultado sugirió que la combinación TIR más preferida debería determinarse simultáneamente alterando los TIRs individuales para las cadenas ligera y pesada en el contexto de una construcción de cistrones independientes.

Se prepararon construcciones nuevas para determinar las combinaciones de intensidad TIR para la cadena ligera y la pesada en el contexto de un sistema de cistrones independientes. Las series TIR se muestran en la Figura 9 paralelas a las series policistrónicas e incluyen paTF50 (1-ligera, 1-pesada), paTF70 (3-ligera, 1-pesada), paTF60(1-ligera, 3-pesad), paTF80 (3-ligera, 3-pesada), paTF (7-ligera, 3-pesada), paTF140 (3-ligera, 7-pesada), y pxTF2AP77 (7-ligera, 7-pesada). Todas las inducciones de expresión (2 ml) se llevaron a cabo en la cepa 33D3. Se tomaron muestras para su separación por SDS-PAGE y los resultados de la transferencia de Western se muestran en la Figura 10. Las muestras reducidas (Figura 10A) muestran incluso una mejor distribución de cadenas ligera y pesada comparadas con los resultados de los vectores policistrónicos. Con paTF80 (3-ligera, 3-pesada) y paTF140 (3-ligera, 7-pesada) se acumula un nivel menor de precursor de cadena ligera, mientras que cantidades significativas de precursor de cadena ligera y pesada son obvias para paTF130 (7-ligera, 3-pesada) y pxTF2AP77 (7-ligera, 7-pesada). Las muestras no reducidas revelaron niveles de anticuerpo de longitud completa junto con especies determinadas (Figura 10B). La acumulación de anticuerpo de longitud completa junto con especies intermedias (Figura 10 B). La acumulación mayor del anticuerpo de longitud completa tiene lugar con paTF50 (1-ligera, 1-pesada), y como los niveles de traducción aumentan lentamente hasta paTF80(3-ligera, 3-pesada), los niveles de especies intermedias suben drásticamente. Las dos construcciones con cantidades grandes de cadena ligera y pesada no procesada (paTF130 y pxTF2AP77) muestran un aumento agudo en los niveles de anticuerpo de longitud completa así como de especies intermedias. En consecuencia, los resultados sugieren que para el anticuerpo de longitud completa anti-TF, la combinación TIR más preferida es (1-ligera, 1-pesada), tal como se representó por el plásmido TF50.

Con el fin de representar el rendimiento elevado del anticuerpo de longitud completa por el sistema de cistrones independientes, las expresiones que utilizan las construcciones policistrónicas (paTF20 (1-ligra, 1-pesada), paTF-30 (3-ligara, 1-pesada) y un paTF40 (1-ligera, 3-pesada)) y las construcciones de cistrones independientes (paTF50 (1-pesada, 1-ligera), paTF60 (1-ligera, 3-pesada), paTF70 (3-ligera, 1-pesada) y paRF80(3-ligera, 3-pesada)) se compararon una con otra. Las muestras no reducidas mostraron claramente un nivel mayor de producción del anticuerpo de longitud completa y de especies intermedias con el sistema de cistrones independientes (Figura 11). Tal como se muestran el gel, las mejores construcciones policistrónicas, paTF40(1-ligera, 3-pesada), todavía es inferior a cada una de las construcciones de cistrones independientes que se muestran.

Una comparación similar entre los plásmidos policistrónicos derivados de pAK19 y los plásmidos de cistrones independientes ilustra además las ventajas de esta nueva tecnología para la expresión de los anticuerpos de longitud completa en E. coli. El análisis incluyó plásmidos de expresión para anticuerpos tanto anti-factor tisular como anti-VEGF. Respecto a la expresión del factor tisular, el plásmido policistrónico pxTFPV y el plásmido de cistrones independientes paTF50 (1-ligera, 1-pesada) se transformaron en la cadena 33D3 y se indujeron en medio limitante en fosfato. Las muestras no reducidas se prepararon (tratadas IAA) y se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción de Coomassie (Fig. 12). Utilizando únicamente tinción de Coomassie azul como procedimiento de detección, se observó una banda de proteína de anticuerpo de longitud completa de la muestra de cistrones independientes (carril 3). A continuación se analizó esta banda de proteína mediante análisis de secuencia aminoacídica N-terminal y demostró contener cadenas ligera y pesada de anticuerpo anti-factor tisular tal como se esperaba. Dicha banda proteica no es evidente por tinción de Coomassie con el plásmido policistrónico (carril 2). Las muestras se analizaron mediante transferencia de western con un anticuerpo Fab anti-humano de cabra (Fig. 13). Aplicando este procedimiento sensible de detección, una pequeña cantidad de anticuerpo de longitud completa puede observarse con el plásmido policistrónico (carril 2), sin embargo, el nivel de expresión aumenta dramáticamente con el plásmido de cistrones independientes (carril 3).

También se realizó un experimento similar que compara la expresión del anticuerpo anti-VEGF con un vector policistrónico (pY0317.Fab_CH3) y un vector de cistrones independientes, pcVG2AP11 (1-ligera, 1-pesada). Los plásmidos se transformaron en la cepa 33D3 y se indujeron en medio limitante de fosfato. Las muestras no reducidas (tratadas IAA) se prepararon y analizaron mediante transferencia de western con un anticuerpo Fab anti-humano de cabra policlonal (Fig. 14). Virtualmente, ningún anticuerpo de longitud completa es evidente con el vector policistrónico. La mayor parte de la muestra aparece como un barrido indiscreto (carril 2), un patrón que parece correlacionarse con un exceso muy elevado de expresión de cadena ligera. Por el contrario, cuando el sistema de cistrones independientes se utilizó, se observó una banda de proteína de anticuerpo de longitud completa (flecha: carril 3). Por ello, para la expresión del anti-VEGF de longitud completa, el vector de cistrones independientes de la invención aumenta el nivel de expresión desde un anticuerpo de longitud completa no detectable a un nivel fácilmente detectable por transferencia de western.

Ejemplo 4 Producción a gran escala (Fermentación) y purificación de anticuerpos de longitud completa expresados en E. coli

Los anticuerpos anti-TF y anti-VEGF de longitud completa también se produjeron a gran escala, utilizando procesos de fermentación. Los organismos utilizados para esta fermentación incluyen: 59A7 W3110 \DeltafhuA (\DeltatonaA) phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 deoC degP41 Kan^{s} ilvG^{+}\Delta prc::kanR prc supresos; 43H1 W3110 \DeltafhuA(\DeltatonA)
phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 ptr3 degP41 Kan^{s} \DeltaompT\Delta (nmpc-fepE) ilvG+ prc::kanR prc supresor, 33D3 W3110.fhuA (.tonA)ptr3 lac Lq lacL8.ompT.(nmpc-fepE) degP41 kan^{R}; y 58H7 W31130 \DeltafhuA(\DeltatonA) ptr3 ompT degP lac Lq \DeltalacY.

Para cada 10 l de fermentación, se descongelaron 0,5 mlj de cultivo madre congelado (que contenía DMSO al 10-15%) y se utilizaron para inocular un frasco de 2 l con 500 nml de LB suplementado con 0,5 ml de solución de tetraciclina (5 mg/ml) o 10 ml de solución de ampicilina (2 mg/ml) y 2,5 ml de una solución de fosfato sódico 1 M. Este cultivo inóculo se creció durante aproximadamente 16 horas a 30ºC con agitación y se utilizó para inocular el fermentador de 10 l.

El fermentador contenía inicialmente unos 7,0 litros de medio con 1,1 g de glucosa, 100 ml de sulfato magnésico 1 M, 10 ml de una solución de elementos traza (100 ml de ácido clorhídrico, 27 g de cloruro férrico hexahidrato, 8 g de sulfato de zinc heptahidrato, 7 g de cloruro de cobalto hexahidrato, 7 g de molibdato sódico dihidrato, 8 g de sulfato cúprico pentahidrato, 2 g de ácido bórico, 5 g de sulfato de manganeso monohidrato en un volumen final de 1 litro), 20 ml de una solución de tetraciclina (5 mg/ml en etanol) o 250 ml de una solución de ampicilina (2 mg/ml), 1 bolsa de sales HCD (37,5 g de sulfato amónico, 19,5 g de fosfato potásico dibásico, 9,75 g de fosfato sódico monobásico dihidrato, 7,5 g de citrato sódico dihidrato, 11,3 g de fosfato potásico monobásico), 200 g de NZ amino A (hidrolizado proteico) y 100 g de Extracto de Levadura. Las fermentaciones se realizaron a 30ºC con 20 slpm de flujo de aire y se controlaron a un pH de 7,0+0,2 (aunque pueden ocurrir variaciones en este intervalo de pH en algunos casos). La contrapresión del fermentador se mantuvo a 1 bar y la agitación a 650 rpm. La contrapresión del fermentador y la velocidad de agitación también se variaron para manipular la tasa de transferencia de oxígeno en el fermentador y, consecuentemente, controlar la tasa de respiración celular.

Después de la inoculación del fermentador con el medio que contenía células del frasco de cultivo de agitación, el cultivo se creció en el fermentador a densidades celulares elevadas con un algoritmo informático para proporcionar una solución de glucosa concentrada al fermentador. También se añadieron una solución de hidróxido amónico (solución al 58%) y ácido sulfúrico (solución al 24%) al fermentador en cantidades necesarias para mantener el pH. También se utilizaron adiciones de L-61 (un antiespumante, aunque pueden utilizarse otros) en algunos casos para controlar la formación de espuma. Cuando el cultivo alcanzó una densidad celular de aproximadamente 40 DO_{550}, se añadieron 100 ml de sulfato magnésico 1 M al fermentador. Adicionalmente, se añadió un concentrado de sales (sulfato de amonio 12,5 g, 32,5 de fosfato potásico dibásico, 16,25 de fosfato sódico monobásico dihidrato, 2,5 g de citrato sódico dihidrato, 18,75 g de fosfato potásico monobásico, 10 ml de cloruro férrico al 2,7% y 10 ml de elementos traza en un volumen final de 1250 ml) al fermentador y comenzó a una velocidad de 2,5 ml/min cuando el cultivo alcanzó aproximadamente 20 DO_{550} y se continuó hasta añadir aproximadamente 1250 ml al fermentador. Las fermentaciones se continuaron aproximadamente durante 70-80 horas. Durante la fermentación, una vez que se alcanzó el punto de ajuste para el oxígeno disuelto, se añadió la solución de glucosa concentrada según la señal de la sonda de oxígeno disuelto con el fin de controlar la concentración de oxígeno disuelto en el punto de ajuste. Consecuentemente, en este esquema de control, las manipulaciones de los parámetros de operación del fermentador como la velocidad de agitación o la contrapresión que afectan la capacidad de transferencia del oxígeno en la fermentación correspondiente también manipuló la tasa de incorporación de oxígeno o la tasa metabólica de las células. Un espectrómetro de masas se utilizó para monitorizar la composición de la salida de gases de la fermentación y permitió calcular la incorporación de oxígeno y las tasas de evolución de dióxido de carbono en las fermentaciones.

Las muestras solubles no reducidas se prepararon de la manera siguiente: se descongelaron muestras de 1 ml del cultivo completo durante el curso de la fermentación a temperatura ambiente. Cien microlitros del descongelado se añadieron a 500 \mul de tampón de extracción. (Tampón de extracción: Tris 10 mM, pH 6,8, EDTA 5 mM, añadido extemporáneamente 0,mg/ml de lisozima de huevo, y ácido yodoacético preparado extemporáneamente a una concentración final de 5-10 mM). Las muestras de medio completo más el tampón de extracción se incubaron en hielo durante 5-10 minutos, luego se sonicaron 2x10 pulsos, luego se centrifugaron a 4ºC y 14.000 rpm durante 15-20 minutos. Los sobrenadantes se recogieron como la fracción soluble. Para el análisis por SDS-PAGE e inmunotransferencias, la fracción soluble se diluyó 1:4 en tampón de muestra Tricina 2XNovex 1:4 con agente reductor. Diez microlitros de esta preparación se cargaron en un gel NuPage Bis-Tris al 4-12% Novex de 15 pocillos a 200 V con tampón MOPS. El gel se utilizó para una inmunotransferencia o se tiñó con azul de Coomassie.

Las muestras de las fracciones solubles se sometieron al análisis de un ensayo AME5RP. Este ensayo es una columna HPLC en donde la primera columna es una columna de afinidad que captura la cadena ligera y la segunda columna es una columna de fase inversa. Un Integral Workstastion se configuró en el modo de columna dual. Los reservorios de solvente fueron: Solvente 1A, tampón de carga de afinidad, Solvente 1B, tampón acuoso de fase inversa y tampón de elución por afinidad, TFA al 0,1% en agua; Solvente 2A, agua; Solvente 2B, tampón de elución orgánico de fase inversa, 0,09% TFA/80% acetonitrilo. La primera columna fue una columna de afinidad (30x2,1 mm) que contenía un anticuerpo Fab anti-cadena ligera (kappa) inmovilizado (AME5) sobre vidrio de poros determinados. Todos los procesos que implicaban la columna de afinidad se realizaron a temperatura ambiente. La segunda columna fue una columna de fase inversa que contenía el polímero derivado de material de empaquetamiento POROS R220 (30x2,1 mm). La temperatura de la columna de fase inversa se mantuvo a 60ºC.

La columna de afinidad se equilibró con tampón de carga al 30% (5 ml) y se cargó una muestra de 50 \mul a una velocidad de flujo de 0,1 ml/min. El flujo a través de dirigió a sobrantes. Después de cargar la muestra, se lavó la columna de afinidad con tampón de carga al 30% (2 ml) seguido de tampón de carga al 100% (5 ml) para reducir los componentes unidos inespecíficamente. La columna se preparó con un lavado final con agua para la elución (3 ml). La columna de afinidad se conectó a la columna de fase inversa (mediante encendido de la válvula) y se eluyó con tampón de elución (2 ml) a una tasa de flujo de 2 ml/min para transferir los componentes capturados por la afinidad a la columna de fase inversa. Durante esta etapa de transferencia el detector de UV Integral se localizó después de la columna de afinidad y antes de la columna de fase inversa y por tanto se controla la elución de la columna de afinidad (que empieza a cargar a la columna de fase inversa). Además de este detector, se añadió un segundo detector después de la columna de fase inversa para controlar su flujo a través y confirmar que todos los componentes eluidos de la columna de afinidad se hallaban de hecho capturados por la columna de fase inversa.

El equilibrado de la columna de afinidad se realizó con el tampón de carga (4 ml) después de eliminar su conexión a la columna de fase inversa.

La columna de fase inversa cargada se lavó con solución acuosa de TFA al 0,1% (2 ml). La tasa de flujo se ajustó a 1 ml/min y se hizo pasar un gradiente rápido (1 mon) con el solvente 2B al 35% (TFA al 0,1%/acetonitrilo al 80%) seguido de un gradiente superficial al 50% del solvente 2B durante 14 min. La elución se completó mediante un gradiente al 90% del solvente 2B durante 4 min. La columna de fase inversa se retornó a las condiciones iniciales durante 1 min y se re-equilibró durante 3 min a 2 ml/min. El eluido de la columna se monitorizó a 280 y 214 nm. La cuantificación se realizó mediante comparación de las áreas de picos integradas con los estándares de concentraciones conocidas.

Las fracciones se recogieron a través del perfil de gradiente, se agruparon adecuadamente y se liofilizaron. Las fracciones de los picos se caracterizaron parcialmente con procesos usuales utilizados en el análisis de secuencia N-terminal, y el análisis de SDS-PAGE. También se analizaron mediante cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS). El análisis de secuencia terminal, LC/MS y SDS_PAGE demostró que el Pico 5 en el cromatograma contenía predominantemente anticuerpos de longitud completas en la forma tetramérica (es decir, dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas).

La producción de anticuerpos anti-TF de longitud completa utilizando el plásmido policistrónico paTF20 (1-ligera, 1-pesada) o paTF40 (1-ligera, 3-pesada) se comparó con la utilización del vector de cistrones independientes paTF50 (1-ligera, 1-pesada) en la cepa E. coli 43H1. Las fermentaciones también se han realizado en las cepas 33D3 y 59A7 transformadas con el plásmido paTF50. El análisis de las muestras de la fermentación por el ensayo AMER5-RP obtuvo el siguiente Pico 5 del ensayo AME5-RP que se muestra en la Tabla 2.

TABLA 2

3

Por ello, tal como indican los resultados de AME5-RP, el vector de cistrones independientes paTF50 produce significativamente rendimientos superiores de anticuerpos anti-TF, comparado con los vectores policistrónicos.

Los productos de fermentación se purificaron de la manera siguiente: se diluyó la pasta bacteriana 1:5 (p/v) en fosfato sódico 20 mM pH 7,4, NaCl 0,14 M y luego se lisó con un microfluidizador M110Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). La solución que contenía las células lisadas se clarificó mediante centrifugación (4300xg, 30 min) para eliminar los restos celulares. Se añadió polietilén imina (BASF Corp., Rensselaer, NY) al sobrenadante a una concentración final del 0,2%, seguido de una centrifugación (4300 xg, 30 min). El sobrenadante se filtró (0,2 \mum) y se aplicó a una resina de afinidad de Proteína A, Prosep A (Millipore Corp., Bedford, MA). La IgG1 derivada de E. coli se eluyó con ácido acético 0,1 M a pH 2,9. El agrupado de proteína A se condicionó mediante adición de urea a una concentración final de 2M, se ajustó a pH 5,5, se diluyó con agua purificada y se aplicó a una SP de Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotehc Uppasala, Suecia). La columna SP Sepharose FF se lavó con MES 20 mM a pH 5,5, seguido de una elución de IgG1 con un gradiente lineal de 0 a 0,25 M de NaCl en MES 20 mM a pH 5,5. Las fracciones de SP Sepharose FF se analizaron mediante SDS-PAGE y se agruparon. El agrupado de SP Sepharose FF se ajustó a pH 8,0 y se aplicó a una columna Q Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). La columna Q Sepharose FF se lavó con Tris 25 mM a pH 8,0, NaCl 50 mM, seguido de una elución de IgG1 con Tris 25 mM a pH 8,0, NaCl 150 mM. El agrupado de QSP Sepharose FF se formuló mediante ultrafiltración con una membrana de celulosa regenerada (Millipore Corp., Bedford, MA) seguido de una diafiltración en acetato sódico 20 mM, pH 5,5 y NaCl 0,14 M.

Ejemplo 5 Caracterización de anticuerpos de longitud completa producidos en E. coli

Para confirmar que los anticuerpos de longitud completa en células huésped E. coli de la presente invención poseen las propiedades deseadas, los productos de anticuerpo anti-TF preparados mediante fermentación y purificados de acuerdo con los procedimientos del Ejemplo 4 se caracterizaron además mediante una serie de ensayos que incluyen la Espectrometría de masas, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por exclusión de tamaño, análisis de aminoácidos y secuenciación N-terminal.

Análisis por MALDI-TOF-MS

El análisis MALDI-TOF-MS se realizó en un Voyager DE Bioespectrometría WorkStation (Perseptive Biosystems, Framingham, MA), equipado con extracción retardada. Se utilizó un láser de nitrógeno para irradiar las muestras con luz ultravioleta (337 nm) y se realizó una media de 240 escáneres. El instrumento operó en configuración lineal (vía de vuelo de 1,2 m), y un voltaje de aceleración de 20 kV se utilizó para propeler los iones a través del tubo de vuelo después de 60 ns de retraso. Las muestras (1,0 \mul) se mezclaron con 1 \mul de matriz y 1 \mul de esta mezcla se añadió a la diana y se secó al vacío (50x10^{-3} Torr). Los estándares se utilizaron para lograr una calibración externa en los dos puntos para asignar la masa de los iones. Se utilizó una matriz de ácido 4-hidroxicinnámico en el análisis de los anticuerpos anti-TF de longitud completa.

Cromatografía de intercambio iónico

La cromatografía de intercambio iónico se llevó a cabo en un instrumento HP-1100 con una columna Baker Bond CSX (4,6x250 mm). La columna se equilibró durante 20 min con tampón A (acetato sódico 25 mM, pH 4,8) a una tasa de flujo de 1 ml/min. Las muestras se diluyeron a aproximadamente 1 mg/ml en tampón A y se inyectaron aproximadamente 50 \mug. La temperatura de la columna se mantuvo a 40ºC. Un gradiente lineal se aplicó durante 40 in al tampón B al 60% (tampón A + NaCl 500 mM) y se mantuvo en tampón B al 60% durante 5 min. El efluente de la columna se controló a 280 nm.

Cromatografía de exclusión por tamaño

Se utilizó una columna TSK G3000SW-XL (7,8x300 mM; TosoHass) de cromatografía de exclusión por tamaño en un instrumento HP1100. La columna se equilibró con tampón fosfato potásico 100 mM a pH 6,3 que contenía cloruro sódico 250 mM a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Las muestras se diluyeron a 1 mg/ml con el tampón de elución y se inyectaron aproximadamente 100 \mug a la columna. El tiempo de migración fue de 30 min. Las muestras de los estándares de la filtración en gel (Bio-Rad) también se inyectaron después de diluirlos 5 veces con tampón de elución.

Análisis de secuencia amino-terminal

La muestra se intercambió mediante diálisis en ácido acético al 0,1%. Una alícuota que contenía 83 \mug se cargó para el análisis de secuencia N-terminal mediante el procedimiento de degradación de Edman con un secuenciador de proteínas automatizado de Applied Biosystems 477A/120A. La comparación de la altura de los picos con un estándar externo se utilizó para cuantificar los aminoácidos PTH.

Análisis de aminoácidos

Las alícuotas que contenían 15 \mug de las muestras desaladas se secaron en ampollas de hidrólisis mediante evaporación en una Speed-Vac Savant. Después de adición de HCl 6 N (Pierce), las ampollas se sellaron a presión reducida y se incubaron durante 24 o 72 horas a 110ºC. Las alícuotas adicionales se sometieron a oxidación con ácido fórmico mediante incubación durante 4 horas a 0-5ºC con una solución preparada una hora antes que contenía peróxido de hidrógeno al 10% y ácido fórmico al 90%. El ácido perfórmico se eliminó mediante evaporación en una Speed-Vac Savant, después de lo cual las muestras se sometieron a una hidrólisis de 24 h en HCl 6N tal como se describió anteriormente. Para las determinaciones de Trp, se secaron alícuotas triplicadas que contenían 25 \mug de cada lote en ampollas y se secaron e incubaron a 110ºC durante 24 horas en atmósfera de nitrógeno en solución de ácido mercaptoetanol al 7% (Baker)/NCl 6N al 93% (Pierce) en presión reducida. Después de la hidrólisis, todas las muestras se secaron mediante evaporación una SpeedVac Savant.

Los resultados obtenidos de diversos ensayos descritos anteriormente confirmaron que los anticuerpos de longitud completa producidos en E. coli con los vectores de expresión de la presente invención compartían estructuras similares a los anticuerpos anti-TF producidos en huéspedes células eucariotas, como por ejemplo las células CHO.

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Ejemplo 6 Análisis funcional de los anticuerpos de longitud completa producidos en E. coli

Los anticuerpos producidos y purificados en E. coli de acuerdo con los ejemplos anteriores son de longitud completa y no están glicosilados. Los experimentos siguientes se realizaron para ilustrar que los anticuerpos: 1) presentan capacidad fuerte de unión con el antígeno bivalente; 2) carecen de la capacidad de unión de C1q y en consecuencia la función CDC está reducida; 3) carecen de la capacidad de unión a Fc\gammaR1 y en consecuencia las funciones ADCC están disminuidas; y 4) muestran una unión fuerte con FcRn, para una mejor resistencia al aclaramiento y en consecuencia facilitan una vida media más prolongada in vivo.

Unión al antígeno de TF

Los anticuerpos anti-TF de longitud completa se evaluaron por su unión con el antígeno mediante ensayo ELISA. Placas de micropocillos MaxiSorp-de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) se recubrieron con factor tisular (TF) a 1 \mug/ml que comprendía los residuos 1-219 (Genentech) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,5, a 4ºC durante toda la noche. Las placas se bloquearon con PBS, albúmina sérica bovina al 0,5%, Proclin 10 ppm (Supelco, Bellefonte, PA), pH 7,2 a temperatura ambiente durante 1 hora. Diluciones seriadas de tres veces de los anticuerpos (0,27-200 ng/ml) en PBS, albúmina sérica bovina al 0,5%, polisorbato 20 al 0,05%, CHAPS al 0,25%, \gammaglobulinas albúmina sérica bovina al 0,2% (Sigma, St Louis, MO), pH 7,2 (tampón de ensayo) se añadieron a las placas y éstas se incubaron durante 2 horas. La IgG unida se detectó mediante adición de anticuerpo F(ab')2 anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) en tampón de ensayo, se incubaron las placas durante 1 hora y se añadió 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) como sustrato. Las placas se lavaron entre cada etapa con PBS, polisorbato 20 al 0,05%, pH 7,2. La absorbancia se leyó a 450 nm en un lector apilador (ICN, Costa Mesa, CA). Las curvas de titulación se ajustaron con un programa de ajuste de curvas de regresión no lineal de cuatro parámetros (KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA).

Los resultados del ensayo ELISA de unión al antígeno TF se muestran en la Figura 15. Los anticuerpos anti-TF de longitud completa producidos en E. coli (IgG1) se compararon con los anticuerpos anti-TF de isotipos distintos que se produjeron en células CHO. El anticuerpo IgG1 producido en E. coli muestra actividades de unión que son al menos comparables con los otros anticuerpos anti-TF producidos en sistemas celulares de CHO.

Unión a C1q

La unión de C1q humano al anticuerpo anti-TF producido en E. coli se determinó mediante un ensayo de unión ELISA tal como se describió Idusogie y col., (2000) J. Immuno 164:4178-4184. En resumen, se recubrieron placas de 96 pocillos durante toda la noche a 4ºC con concentraciones diversas de anticuerpos en tampón de recubrimiento (carbonato sódico 0,05M), pH 9. Las placas se lavaron con 3xPBS/TWEEN 20 al 0,05%, pH 7,4 y se bloquearon con 200 \mul de diluyente del ELISA sin timerosal (NaPO4 0,1M/NaCl 0,1M/gelatina al 0,1%/TWEEN 20 al 0,05%/ProClin300 al 0,05%) durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con tampón de lavado, una alícuota de 100 \mul de C1q a 2 \mug/ml (Quidel, San Diego, CA) se añadió a cada pocillo y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. La placa se lavó entonces 6x con tampón de lavado. Se añadieron 100 \mul de una dilución 1:1000 de anticuerpo conjugado con peroxidasa anti-C1q humano (Biodesign) a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó de nuevo 6X con tampón y 100 \mul de tampón de sustrato (PBS/H2O2 al 0,012%) que contenía OPD (O-fenilendiamina dihidrocloruro (Sigma)) a cada pocillo. La reacción de oxidación, observada por la aparición de un color amarillo, se dejó 30 minutos y se paró con adición de 100 \mul de H2SO4 4,5 N. La absorbancia se leyó a (492-405 nm) utilizando un lector de microplacas (SPECTRA MAX 250^{TM}, Molecular Devices Corp). Los controles adecuados se migraron en paralelo (es decir, el ELISA se realizó sin C1q para cada concentración de los anticuerpos utilizados y también el ELISA se realizó sin el anticuerpo). Para cada muestra, la unión de C1q se cuantificó representando la absorbancia (492-405 nm) respecto a la concentración en \mug/ml, con un programa de ajuste de curva de 4-parámetros (KALEIDAGRAPH^{TM}) y comparando los valores EC50. Los resultados de este ensayo se muestran en la Figura 16. Un anticuerpo expresado en células CHO, I-1095-1-Rituximab, se utilizó como control positivo. No se detectó unión a C1q del anticuerpo anti-TF de longitud completa producido en E. coli, incluso a concentraciones elevadas.

Unión al receptor Fc\gamma

La unión de Fc\gammaR al anticuerpo anti-TF purificado se determinó utilizando un ensayo de unión ELISA. La fusión de Fc\gammaR subunidad \alpha-GST se puso de recubrimiento en placas maxisorb Nunc F96 (cat. 439454) mediante adición de 100 \mul de la fusión del receptor-GST a 1 \mug/ml en PBS y se incubó durante 48 horas a 4ºC. Antes del ensayo, las placas se lavaron 3x con 250 \mul de tampón de lavado (PBS pH 7,4, que contenía TWEEN 20 al 0,05%, albúmina sérica bovina grado RIA al 0,5%) y se bloquearon con 250 \mul de tampón de ensayo (tampón salino Tris 50 mM, TEEN 20 al 0,05%, albúmina sérica bovina grado RIA al 0,5% (Sigma A7888) y EDTA 2 mM pH 7,4). Las muestras se diluyeron a 10 \mug/ml en 1 ml de tampón de ensayo y se añadieron a las placas recubiertas con subunidad \alpha de Fc\gammaR y se incubaron durante 120 minutos a 25ºC en un agitador orbital. Las placas se lavaron 5x con tampón de lavado para eliminar los complejos no unidos y la unión a IgG se detectó mediante adición de 100 \mul de anticuerpo de cabra anti-IgG (y) humana específico conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) (Boehringer Mannheim 1814249) a 1:10.000 en tampón de ensayo y se incubó durante 90 min a 25ºC en un agitador orbital. Las placas se lavaron 5x con tampón de lavado para eliminar el anticuerpo anti-IgG humana de cabra conjugado a HRp no unido y el unido se detectó mediante adición de 100 \mul de solución de sustrato (o-fenilendiamina dihidrocloruro a 0,4 mg/ml, Sigma P6912, H2O2 6 mM (Sigma P6912) en PBS) y se incubaron durante 8 min a 25ºC. La reacción enzimática se paró mediante adición de 100 \mul de H_{2}SO_{4} 4,5 N y el producto colorimétrico se cuantificó a 490 nm con un densitómetro de placas de 96 pocillos (Molecular Devices). Los resultados de este ensayo se muestran en la Figura 17. Los controles positivos, anticuerpos expresados en células 293 de mamífero, se unieron al receptor, pero no se detectó unión a Fc\gammaR1 para el anticuerpo anti-TF producido en E. coli.

Unión a FcRn

La unión de anticuerpos anti-TF purificados con FcRn se analizó mediante un ensayo de unión ELISA. Las placas de ELISA se recubrieron con factor tisular y se bloquearon tal como se describió más arriba. Dos diluciones seriadas de anticuerpos anti-TF (1,6-200 ng/ml) en PBS, albúmina sérica bovina al 0,5%, polisorbato 20 al 0,05%, pH 6,0 (tampón de muestra) se añadieron a las placas y éstas se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. A las placas, se añadió FcR biotinilado (preparado con biotina-X-NHS de Research Organics, Cleveland, OH) a 3,6 \mug/ml en tampón de muestra. Al cabo de una hora de incubación, se detectó FcRn unido mediante adición de estreptavidina marcada con peroxidasa (Amdex, Copnehagen, Denmark) en tampón de muestra, incubando las placas durante 1 hora y añadiendo 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (Kirkegaard & Perry Laboraotories) como sustrato. Las placas se lavaron entre cada etapa con PBS, BSA al 0,05%, polisorbato 20 al 0,05%, pH 6,0. La absorbancia se leyó a 450 nm en un lector de placas Thermomax (Molecular Devices, Menlo ParK, CA). Las curvas de titulación se ajustaron tal como se describió anteriormente. La Figura 18 muestra que la actividad de unión FcRn del anticuerpo anti-TF de longitud completa generado en E. coli es comparable con otros anticuerpos anti-TF (IgG4, IgG4b, IgG2) generados en células huésped de mamífero.

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Ejemplo 7 Estudio farmacocinético de anticuerpos anti-TF de longitud completa generados en E. coli

El anticuerpo anti-TF de longitud completa generado en E. coli (IgG1 E. coli) se sometió a un estudio de farmacocinética (PK) en chimpancés con una dosis única de bolo IV, junto con dos otros anticuerpos anti-TF en células CHO) IgG2 CHO e IgG4 CHO) como controles. Estos chimpancés fueron negativos para la presencia de anticuerpos anti-TF. Cada animal recibió una sola dosis IV de bolo de anticuerpo anti-TF (IgG1 E. coli, IgG2 CHO o IgG4 CHO) a 0,10 mg/Kg. Las muestras de plasma se recogieron hasta 28 días post-dosis de acuerdo con el siguiente esquema: 30 y 15 minutos predosis; 2, 15, 30 minutos: 1, 2, 3, 4, 6, 12 horas; 1,2,4,7,21 y 28 días post-dosis bolo IV. Las muestras de plasma se analizaron para el contenido de anticuerpo anti-TF (ATF) mediante ELISA, con TF como una cubierta y un anticuerpo monoclonal anti-Fc como un anticuerpo de detección. El límite de cuantificación fue de 0,102 \mug/ml en el plasma de chimpancé.

Los resultados del ELISA se muestran en la Figura 19 en la forma de concentración ATF plasmática versus curvas de tiempo. Los resultados se ajustaron a un perfil de eliminación en un compartimento en Win Nonlin 3.0. El parámetro PK que estima el aclaramiento (CL), la vida media de eliminación (T_{1/2}) y el volumen (V) se indican en la Tabla 3. Según este experimento en tres chimpancés individuales, no se observaron diferencias obvias en el parámetro PK entre el anticuerpo generado en E. coli y los que generados en CHO.

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TABLA 3

4

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Ejemplo 8 Expresión y fermentación de diversos anticuerpos de longitud completa con vectores de cistrones independientes

Los vectores de cistrones independientes se construyeron también para la expresión de los anticuerpos de longitud completa: anti-VEGF (VNERK), una variante de afinidad superior del anticuerpo humanizado descrito en Presta y col., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997); un anticuerpo anti-IgE humanizado descrito en Presta y col., Cancer Res 60:3225-3231 (2000); anti-HEr2 (versiones 4D5 y 2C4; Carter y col., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289 (1992) y Fendly y col., Cancer Res. 50:1550-1558 (1990); y un anti-CD18 humanizado (Eigenbrot y col., Proteins: Structure, Function and Genetics 18:49-62 (1994)).

Para la construcción de plásmidos de cistrones independientes, las regiones VL y VH de paTF50 (TZR1-ligera, TIR-1-pesada; véase el Ejemplo 1) se reemplazaron con VL y VH de cada uno de los anticuerpos listados. La inducción de la expresión se llevó a cabo en la cepa 33D3, tal como se describió en el Ejemplo 3. Las muestras se recogieron de la separación SDS-PAGE y ser realizó una inmunotransferencia en condiciones no reductoras. Tal como se muestra en la Figura 22, las versiones de longitud completa de los anticuerpos anti-VEGF, anti-IgGE, ant-CD40, 4D5, 2C4 y anti-CD18 se expresaron sucesivamente en E. coli con vectores de cistrones independientes. Este resultado ilustra que el sistema de expresión de cistrones independientes es una aproximación aplicable para la expresión del anticuerpo en E. coli.

Para ilustrar mejor la utilidad del sistema de expresión de cistrones independientes aquí, los diversos plásmidos descritos más arriba que expresan los diversos anticuerpos listados se utilizaron en producciones a gran escala (procesos de fermentación).

Los organismos utilizados para estas fermentaciones incluyen: 33D3 W3110 \DeltafhuA (\DeltatonA) ptr3 lac Lq lacL8 \DeltaompT\Delta (nmpc-fepE) deg41 kanR; 61D6 W3110 \DeltafhuA (\DeltatonA) ptr3 lac Lq lacL8 \DeltaompT\Delta (nmpc-fepE) degP41; y 62ª7 W3310 \DeltafhuA (\DeltatonA) ptr3 lac Lq lacL8 \DeltaompT\Delta (nmpc-fepE) degP41 ilvG reparado.

Las fermentaciones de los anticuerpos listados se generaron a una escala de 10 litros y se prepararon las muestras solubles y se sometieron a un ensayo de AME5-RP tal como se describió en el Ejemplo 4. Los títulos del ensayo AME5-RP del pico 5 que contenían los anticuerpos de longitud completa predominantemente en la forma tetramérica (dos cadenas L y dos cadenas H), se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4

5

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Ejemplo 9 Coexpresión de proteínas Dsb y anticuerpos completos en E. coli

Utilizando el sistema de cistrones independientes de la invención, los anticuerpos completos anti-TF también se coexpresaron con una o más proteínas Dsb que son capaces de facilitar el propio plegamiento y ensamblaje de los anticuerpos.

Los organismos utilizados para estas fermentaciones incluyen: 58H7 W3110 \DeltafhuA (\DeltatonA) ptr3 \DeltaompT\Delta\DeltadegP lac lq \DeltalacY; y 61D6 W3110 \DeltafhuA (\DeltatonA) ptr3 lac lq lacL8 \DeltapmpT\Delta (nmpc-fepE) degP41.

El plásmido que codifica el anti-TF paTF50 o pxTF2AP22 (una variante de paTF50 con TIRs de 2 para cada cadena ligera y pesada) se utilizó para transformar las células competentes de los organismos anteriores. Los plásmidos que codifican dsbC (pJJ141), dsbA (pJJ142), o dsbA/C (pJJ247) se cotransformaron con el plásmido anti-TF50 o pxTF2AP22.

Para construir el plásmido dsbC pJJ141, el plásmido resistente a la kanamicina pACYC177 se digirió con AatII e HincII lo que interrumpió la resistencia a la ampicilina. El plásmido tac-dsdbC pJJ40, descrito en la patente americana US 5.639.635, se digirió con ClaI y luego se rellenaron sus extremos mediante reacción con Klenow y desoxinucleótidos. Después de una extracción con fenol y cloroformo y precipitación, el vector linearizado se digirió con AatII y se purificó el fragmento de 1,6 Kb de un gel de agarosa y se ligó con el pACYC177 digerido ocn AatII/HincII. El plásmido final pJJ141 codifica tac-dsbC y confiere resistencia a la kanamicina. De forma similar, se construyó el plásmido de dsbA pJJ142 con el mismo vector parental cortado con AatII/HincII ligado con el fragmento AatII/ClaI (con el extremo ClaI relleno) a partir de pJJ37, que codifica dsbA y también se describe en la patente americana
5.639.635.

Para construir pJJ247, el plásmido que codifica dsbA y dsbC, pJJ142, se digirió con KpnI y ScaI. DsbC se amplificó por PCR a partir del plásmido pJJ141 con los cebadores siguientes:

tacdsbCf1:	CATACTGGTACCAGGATCTAGAGGGAAGATTTATG	(SEC ID NO:3)
tacdsbCr2:	CTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTG	(SEC ID NO:4)

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Los cebadores contenían dianas de restricción (KpnI, ScaI) que se han subrayado. Después de la amplificación, el fragmento se purificó por electroforesis en gel de agarosa y se digirió con las enzimas adecuadas y se ligó a pJJ142 digerido con KpnI/ScaI. El plásmido resultante pJJ247 codifica un promotor tac que dirige la expresión de dsbA y dsbC con dsbA en primer lugar en las series. El plásmido se secuenció desde la mitad del gen dsbA hasta el extremo 3' del gen dsbC.

En algunos casos, se construyeron plásmidos individuales que codificaban anti-TF con una TIR de 1 para la cadena ligera como la pesada y DsbC (pJJ241) o DsbA (pJJ237) para transformar células huésped competentes.

Para construir el plásmido pJJ237 que co-expresaba anti-TF y dsbA, el plásmido anti-TF pAT50 se digirió con AatII y HpaI y se ligó a un fragmento AatII/HpaI de pJJ223. Este último fragmento contiene araC, el promotor pBAD, dsbA, resistencia a kanamicina, un origen de replicación co1E1 y el gen de la \beta-lactamasa. El producto de la de ligación contiene: cadenas H y L anti-TF en promotores phoA independientes, un promotor inducible por arabinósido (pBAD) que dirige la expresión de dsbA con el plásmido que confiere resistencia a la kanamicina y ampicilina. Este plásmido se denominó pJG9. Para generar pJJ237, se cambió el regulador de arabinósido por el promotor de tac mediante amplificación por PCR. Para ello, se utilizaron los cebadores siguientes:

dsbAf11:	TGCACGGTTAACATGCTGTGGTGTCATGGTCGG	(SEC ID NO:5)
dsbAr12:	TTTACCGTTAACAAACATCGCCGGAAC	(SEC ID NO:6)

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Las dianas subrayadas corresponden a dianas HpaI. Después de la amplificación con pJJ142 como molde (contiene tac-dsbA), el fragmento se purificó en gel y se digirió con HpaI. El vector pJG9 se digirió con HpaI y NaeI eliminando así la región pBAD-dsbA. El vector cortado con HpaI-NaeI se purificó en gel y se ligó a un fragmento de PCR tac-dsbA cortado con HpaI. El plásmido resultante, denominado pJJ237, contiene los promotores phoA independientes que dirigen la expresión de las cadenas H y L de \alphaTF y el promotor tac que dirige la expresión de dsbA.

Para construir el plásmido pJJ241 con anti-TF y dsbC coexpresados, pJG9 se digirió con HpaI y NgoMIV. NgoMIV corta en la misma diana que NaeI pero deja extremos cohesivos en su lugar. DsbC se amplificó por PCR a partir de pJJ141 como molde con el mismo cebador de sentido 5' que dsbA (dsbAf11; SEC ID NO:5) y el cebador inverso siguiente:

dsbCr12:

TACGCTGCCGGCGTCCGATGCGAATTATTTACCG

(SEC ID NO:7)

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La diana subrayada es una diana NgoMIV. El fragmento amplificado se purificó en gel y se digirió con NgoMIV y HpaI y se ligó a pJG9. El plásmido resultante contiene los promotores phoA independientes que dirigen la expresión de las cadenas H y L de anti-TF y el promotor Tac que dirige la expresión de dsbC.

Cuando un plásmido que codifica anti-TF y un plásmido que codifica una o más proteínas Dsb se utilizan juntos para transformar células competentes, los transformantes se plaquean en placas de LB agar con 50 \mug/ml de carbonicilina y de kanamicina. En aquellos casos en donde un sólo plásmido exprese tanto el anti-TF como las proteínas Dsb seleccionadas (dsbA o dsbC), los transformantes se seleccionan de las placas de LB agar con 50 \mug/ml de
kanamicina.

Las fermentaciones se realizaron a escala de 10 litros tal como se describió en el Ejemplo 4, con la adición de 50 ml de una solución de 200 mM de isorpropil \beta-D-tiogalactósidopiranósido (IPTG) al cultivo de fermentación cuando la DO550 alcance 150-200. Las adiciones de IPTG pueden realizarse a tiempos distintos a los descritos y en cantidades distintas a las descritas. Las muestras solubles se prepararon y sometieron a un ensayo AME5-RP tal como se describió en el Ejemplo 4. Las cepas de los diversos huéspedes y plásmidos utilizados y los títulos resultantes del pico 5 se resumen en la tabla 5.

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TABLA 5

7

8

Ejemplo 10 Co-expresión de Fkpa y anticuerpos de longitud completa en E. coli

Los anticuerpos de longitud completa anti-TF se coexpresaron también con Fkpa, un peptidilprolil cis-trans-isomerasa con actividad de chaperona.

Los organismos utilizados para estas fermentaciones incluyen: 58H7 (genotipo W3110 \DeltafhuA (\DeltatonA) ptr3\DeltaompT\Delta\DeltadegP lac lq \DeltalacY; y 59A7 (genotipo W3110 \DeltafhuA (\DeltatonA) phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac) 169 deoC degP41 kan^{s} ilvG+ \Deltaprc::KanR prc supresor).

Un plásmido independiente que codifica fkpa bajo el control del promotor tacII (pJVG2) se co-transformó con el plásmido anti-TF paTF50. Para crear el plásmido pJVG2, el plásmido pJJ222fkpA se digirió con NheI e NgoMIV para generar un fragmento de 0,8 Kb que contenía fkpA. Este fragmento se purificó mediante electroforesis y extracción con fenol-cloroformo y precipitación. El plásmido pJJ239 que contiene tac-Dsb en un vector pACYC177 análogo a pJJ142, se digirió con XbaI y NgoMIV para generar un fragmento de 3,9 Kb que contenía un promotor tac inducible y una resistencia a kanamicina. Este fragmento se purificó mediante electroforesis y extracción fenol-cloroformo y precipitación. Estos dos fragmentos se ligaron para crear pJVG2 que contenía un promotor tac inducible, fkpA y resistencia a kanamicina. Este plásmido es similar a pJJ141 y pJJ142 en que es un plásmido compatible pACYC177 que puede utilizarse para coexpresar fkpA con plásmidos derivados de pBR322.

Además, un solo plásmido que codifica ambas cadenas anti-TF bajo el control de promotores independientes phoA y fkpA bajo el control del promotor de arabinosa (pJG9fkpAB3) se utilizó para transformar células competentes de los organismos anteriores. Para crear p7G9fkpAB3, el plásmido pJJ222fkpA se digirió con HpaI y NdeI para crear un fragmento de 4,1 Kb que contenía araC, el promotor inducible pBAD, fkpA y la resistencia a la kanamicina. Fkpa se había amplificado originalmente por PCR a partir del cromosoma de E. coli y clonado detrás del promotor pBAD en el vector comercial pBAD18. El fragmento se purificó mediante electroforesis y extracción con fenol-cloroformo y precipitación. El plásmido pJG9 se digirió con HpaI y NdeI para crear un fragmento de 5,1 Kb que contenía la resistencia a la ampicilina, los cistrones separados para ambas cadenas H y L del anticuerpo \alphaTF. Dicho plásmido se purificó por electroforesis y extracción con fenol-cloroformo y precipitación. Los dos fragmentos se ligaron para crear pJGfkpAB3, que contenía los promotores independientes que dirigían la expresión de las cadenas de anticuerpo anti-TF, araC, el promotor pBAD que dirigía la expresión de únicamente fkpA, la resistencia a la kanamicina, un origen de replicación colE1 y la resistencia a la ampicilina.

Cuando se utilizaron juntos el plásmido con el anti-TF paTF50 y el plásmido conde fkpA, pJVG2, para transformar las células competentes, los transformantes se plaquearon en placas de LB agar que contenían 50 \mug/ml de carbenicilina y kanamicina. Cuando las células se transformaron con el plásmido solo pJGfkpAB3, los transformantes se seleccionaron sobre placas de LB agar que contenía 50 \mug/ml de kanamicina.

Las fermentaciones se realizaron a escala de 10 litros tal como se describió en el Ejemplo 4 con las modificaciones siguientes. A las Las fermentaciones utilizando las células transformadas con el plásmido pJGfkpAB3 se les añadió 200 ml de una solución de arabinosa al 40% a aproximadamente un DO550 de 150-200. Antes de la adición de arabinosa, la tasa del alimentador de glucosa se recortó de modo que el cultivo estuvo en condiciones limitantes de glucosa. Después de la adición de arabinosa y de su consumo, la tasa del alimentador de glucosa se aumentó para permitir una incorporación máxima de glucosa por el cultivo. A las fermentaciones con las células cotransformadas con los plásmidos paTF50 y pJVG2 se les añadió 50 ml de una solución 200 mM de isopropil \beta-D-galactopiranósido (IPTG) en el cultivo del fermentador cuando se alcanzó una DO550 de 150-200. Las adiciones de IPTG pueden realizarse a tiempos distintos a los descritos y con diferentes cantidades de IPTG que las descritas. Las muestras solubles se prepararon y sometieron a un ensayo AME5-RP tal como se describe en el Ejemplo 4.

La fermentación del huésped transformado 59A7 con paTF50 proporcionó un título AME5-RP de aproximadamente 156 mg/l, comparado con los 247 mg/l para el huésped transformado 59A7 con el plásmido pJG9fkpAB3. De igual manera, la fermentación del huésped transformado 59H7 con paTF50 proporcionó un título AME5-RP de aproximadamente 100 mg/l, comparado con los 180 mg/l del huésped transformado 5H7 con el plásmido pTF50 y pJVG2.

Aunque lo anterior se refiere a realizaciones determinadas, se entenderá que la presente invención no está por ello limitada. Se sobreentiende que para un experto en la materia, es posible realizar diversas modificaciones a las realizaciones aquí descritas sin desviarse del concepto global de la invención. Todas estas modificaciones se hallan dentro del ámbito de la invención.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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\bullet US 5264365 A, Georgiou [0075]

\bullet US 5508192 A, Georgiou [0075]

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\bullet US 5264586 A [0106]

\bullet US 5773001 A [0106]

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\bullet EP 0401384 A [0114]

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\bulletCARTER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 4285-4289 [0187]

\bulletFENDLY et al. Cancer Res., 1990, vol. 50, 1550-1558 [0187]

\bulletEIGENBROT et al. Proteins: Structure, Function, and Genetics, 1994, vol. 18, 49-62 [0187]

Claims (41)

1. Molécula polinucleotídica que codifica una inmunoglobulina, dicha molécula polinucleotídica comprende (1) un primer promotor y un primer cistrón que forma una primera pareja promotor-cistrón y (2) un segundo promotor y un segundo cistrón que forman una segunda pareja de promotor-cistrón, en donde el primer cistrón de la mencionada primera pareja promotor-cistrón comprende una primera región de iniciación de la traducción (TIR-L) unida operativamente con una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, y el segundo cistrón de la mencionada segunda pareja promotor-cistrón comprende un segunda región de inicio de la traducción (TIR-H) operativamente unida a una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina, en donde tras la expresión del mencionado polinucleótido en una célula huésped procariota, las cadenas ligera y pesada se pliegan y ensamblan para formar una inmunoglobulina activa biológicamente.

2. Molécula polinucleotídica según la reivindicación 1, en donde el primer y segundo promotor son promotores procariotas seleccionados a partir del grupo que consiste en los promotores phoA, tac, Lpp, lac-Lpp, laca, ara, trp, trc y T7.

3. Molécula polinucleotídica según la reivindicación 21, en donde ambos promotores son promotores phoA.

4. Molécula polinucleotídica según la reivindicación 1, en donde cada TIR-H y TIR-L comprende una secuencia señal de secreción o variante de lo mismo.

5. Molécula polinucleotídica según la reivindicación 41, en donde la secuencia señal procariota se selecciona a partir del grupo que consiste en STII, OmpA, PhoE, LamB, MBP, y secuencias señal de secreción de PhoA.

6. Molécula polinucleotídica según la reivindicación 1, en donde TIR-H y TIR-L proporciona aproximadamente intensidades de traducción similares.

7. Molécula polinucleotídica según la reivindicación 61, en donde la combinación de intensidad de traducción relativa se aproximadamente 1-TIR-L y 1-TIR-H.

8. Vector recombinante para la expresión de un inmunoglobulina en una célula huésped procariota, dicho vector comprende la molécula polinucleotídica de la reivindicación 1.

9. Célula huésped procariota que comprende el vector recombinante de la reivindicación 8.

10. Célula huésped procariota según la reivindicación 9, la cual es una célula de bacteria gram-negativa.

11. Célula huésped según la reivindicación 10 que es E. coli.

12. Célula huésped según la reivindicación 11, que además comprende un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido procariota seleccionado a partir del grupo que consiste en DsbA, DsbC, DsbG y FkpA.

13. Célula huésped según la reivindicación 12, en donde el polinucleótido codifica tanto DsbA como DsbC.

14. Célula huésped según la reivindicación 11, en donde E. coli es una cepa deficiente en actividad proteasa endógena.

15. Célula huésped según la reivindicación 14, en donde el genotipo de la cepa E. coli carece de los genes degP y prc y porta un gen spr mutante.

16. Proceso para la producción de un anticuerpo intacto activo biológicamente en una célula huésped procariota, dicho proceso comprende la expresión en la célula huésped de un polinucleótido que comprende

(1)

un primer promotor y un primer cistrón que forman una primera pareja promotor-cistrón y (2) un segundo promotor y un segundo cistrón que forman una segunda pareja promotor-cistrón que comprende una primera región de inicio de la traducción (TIR-L) unido operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina y el segundo cistrón de la mencionada segunda pareja promotor-cistrón comprende una segunda región de inicio de la traducción (TIR-H) operativamente unida a una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina, en donde tras la expresión del mencionado polinucleótido, la cadena ligera de inmunoglobulina y la cadena ligera de inmunoglobulina se secretan, se pliegan y se ensamblan para formar el anticuerpo intacto biológicamente activo; y

la recuperación del mencionado anticuerpo biológicamente activo.

17. Proceso según la reivindicación 16, en donde el primer y segundo promotor son promotores procariotas seleccionados de entre el grupo consistente en los promotores phoA, tac, lpp, lac-lpp, lac, ar, trp, trc y T7.

18. Proceso según la reivindicación 17, en donde el primer y el segundo promotor son promotores PhoA.

19. Proceso según la reivindicación 16, en donde cada TIR-H y TIR-L comprende una secuencia señal de secreción procariota o variante de lo mismo.

20. Proceso según la reivindicación 19, en donde la secuencia señal de secreción procariota se selecciona a partir del grupo que consiste en las secuencias señal de STII, OmpA, PhoE, LamB, MBP y PhoA.

21. Proceso según la reivindicación 16, en donde TIR-L y TIR-H proporcionan aproximadamente intensidades de traducción similares.

22. Proceso según la reivindicación 21, en donde la combinación de intensidad traduccional relativa es de aproximadamente 1-TIR-L, 1-TIR-H.

23. Proceso según la reivindicación 19, en donde la célula huésped procariota es E. coli.

24. Proceso según la reivindicación 16, que además comprende la expresión en la célula huésped procariota de un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido señal procariota seleccionado a partir del grupo que consiste en DsbA, DSbC, DsbG y FkpA.

25. Proceso según la reivindicación 24, en donde el polinucleótido codifica tanto DsbA como DsbC.

26. Proceso según la reivindicación 23, en donde E. coli es una cepa deficiente en la actividad proteasa endógena.

27. Proceso según la reivindicación 26, en donde el genotipo de E. coli carece de los genes degP y prc y porta un gen mutante spr.

28. Procedimiento para la producción independiente de una cadena ligera y una pesada de inmunoglobulina en una célula huésped procariota que comprende:

La expresión en la célula huésped de uno o más polinucleótidos que comprenden:

1)

un primer promotor y un primer cistrón que comprenden una primera región de inicio de traducción (TIR-L) unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina; y

2)

un segundo promotor y un segundo cistrón que comprenden una segunda región de inicio de traducción (TIR-H) unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina, en donde el primer y segundo promotor proporcionan la expresión independiente de la cadena pesada y de la cadena ligera de inmunoglobulina de modo que la proporción de la cadena ligera y de la cadena pesada producidas pueda variar para formar un anticuerpo biológicamente activo.

29. Proceso según la reivindicación 28,en donde el primer y segundo promotor son promotores procariotas seleccionados a partir del grupo que consiste en los promotores phoA, tac, lpp, laca-lpp, lac, ara, trp y T7.

30. Proceso según la reivindicación 29, en donde el primer y segundo promotor son PhoA.

31. Proceso según la reivindicación 28, en donde cada TIR-L y TIR-H comprende una secuencia señal procariota o una variante de lo mismo.

32. Proceso según la reivindicación 31, en donde la secuencia señal procariota se selecciona a partir del grupo consistente en las secuencias señal STII, OmpA, PhoE, LamB, MBP y PhoA.

33. Proceso según la reivindicación 28, en donde TIR-L y TIR-H proporcionan aproximadamente intensidades de traducción similares.

34. Proceso según la reivindicación 33, en donde la combinación de intensidad de traducción relativa es de aproximadamente 1-TIR-L, 1-TIR-H.

35. Proceso según la reivindicación 28, en donde la célula huésped procariota es E. coli.

36. Proceso según la reivindicación 28, que además comprende la expresión en la célula huésped procariota de un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido señal procariota seleccionado a partir del grupo que consiste en DsbA, DSbC, DsbG y FkpA.

37. Proceso según la reivindicación 36, en donde el polinucleótido codifica tanto DsbA como DsbC.

38. Proceso según la reivindicación 37, en donde E. coli es una cepa deficiente en la actividad proteasa endógena.

39. Proceso según la reivindicación 38, en donde el genotipo de E. coli carece de los genes degP y prc y porta un gen mutante spr.

40. Procedimiento según la reivindicación 28, en donde TIR-L proporciona la producción de aproximadamente la misma cantidad de cadena ligera que la cantidad de cadena pesada.

41. Procedimiento según la reivindicación 28, que además comprende la recuperación del anticuerpo biológicamente activo de la célula huésped.