ES2312494T3 - Produccion de anticuerpos completos en celulas procariotas. - Google Patents
Produccion de anticuerpos completos en celulas procariotas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2312494T3 ES2312494T3 ES01993297T ES01993297T ES2312494T3 ES 2312494 T3 ES2312494 T3 ES 2312494T3 ES 01993297 T ES01993297 T ES 01993297T ES 01993297 T ES01993297 T ES 01993297T ES 2312494 T3 ES2312494 T3 ES 2312494T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- antibody
- tir
- expression
- promoter
- cistron
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
- C07K16/2845—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
- C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Molécula polinucleotídica que codifica una inmunoglobulina, dicha molécula polinucleotídica comprende (1) un primer promotor y un primer cistrón que forma una primera pareja promotor-cistrón y (2) un segundo promotor y un segundo cistrón que forman una segunda pareja de promotor-cistrón, en donde el primer cistrón de la mencionada primera pareja promotor-cistrón comprende una primera región de iniciación de la traducción (TIR-L) unida operativamente con una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, y el segundo cistrón de la mencionada segunda pareja promotor-cistrón comprende un segunda región de inicio de la traducción (TIR- H) operativamente unida a una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina, en donde tras la expresión del mencionado polinucleótido en una célula huésped procariota, las cadenas ligera y pesada se pliegan y ensamblan para formar una inmunoglobulina activa biológicamente.
Description
Producción de anticuerpos completos en células
procariotas.
La presente invención trata de temas de Biología
Molecular y Tecnología de Proteínas. Más concretamente, esta
invención concierne a anticuerpos producidos de forma recombinante y
a su ulterior utilización.
Durante los últimos años se ha producido un
aumento de las expectativas de utilización de los anticuerpos como
agentes diagnósticos y terapéuticos en el tratamiento de diversos
trastornos y enfermedades. Pero su empleo en aplicaciones de
investigación y de clínica, requiere una gran cantidad de
anticuerpos funcionales, una producción a gran escala, así como
disponer de sistemas económicos de producción. Particularmente útil
resulta la producción de formas recombinantes de anticuerpos
mediante una amplia gama de posibilidades de expresión en
huéspedes, procariotas como E. coli o B. subtilis,
levaduras, plantas, células de insectos y células de mamíferos,
Kipriyanov y Littel (1999) Mol. Biotech.
12:173-201.
En comparación con otros sistemas de producción
de anticuerpos, las bacterias, particularmente E. coli,
proporcionan ventajas únicas. Las materias primas que se utilizan
(como por ejemplo las mismas células bacterianas) no representan un
gran gasto, su crecimiento es sencillo y por tanto se reduce el
coste de los productos. Por el tiempo de generación corto y su
facilidad de amplificación, la fermentación bacteriana es un medio
práctico para la producción a gran escala. Por otro lado, la
estructura genómica y la actividad biológica de muchas especies
bacterianas, como E. coli, ha sido ampliamente estudiada y se
encuentran disponibles una amplia gama de vectores de expresión por
lo que las bacterias se convierten en la opción más conveniente
para la expresión de un anticuerpo de interés. En comparación con
los eucariotas, en el proceso de producción están implicados unos
pocos pasos, incluida la manipulación de genes recombinantes, la
transformación estable de múltiples copias en el huésped y la
expresión, inducción y caracterización de los productos Pluckthun
and Pack Immunotech 3:83-105 (1997). Además E.
coli permite un acceso único a enfoques aleatorios. Debido a la
eficiencia sin parangón de su transformación con plásmidos o
transfección con fagos, los sistemas de E. coli pueden
utilizarse en la construcción de librerías de fagos de variantes de
anticuerpos que resultan particularmente importantes en estudios de
genómica funcional.
Los sistemas bacterianos se utilizan
corrientemente para producir fragmentos de anticuerpo. Como en el
caso de otras proteínas heterólogas, los fragmentos de anticuerpo se
producen en E. coli por el plegamiento de los cuerpos de
inclusión que se expresan en el citoplasma o a través de la
expresión, seguida de secreción, de la proteína, al periplasma
bacteriano. La selección de uno u otro sistema está condicionada por
algunas consideraciones. En cualquier caso, la secreción resulta
ser el sistema más rápido y la estrategia utilizada de forma más
común.
Opper y colaboradores, según la Patente
americana U.S. 6.008.023 describen un sistema de expresión
citoplasmática en E. coli, donde los fragmentos de anticuerpo
(por ejemplo Fabs) están fusionados con un enzima que se utiliza en
la terapia tumoral dirigida. Zemel-Dreasen y
colaboradores, Gene 27: 315-322 (1984) describen la
secreción y el procesado de una cadena ligera de anticuerpo en E.
coli. Lo y colaboradores, en una publicación de patente
internacional WO 93/07896 (1984), describen la producción en E.
coli de un anticuerpo tetramérico sin la región CH2 de su
cadena pesada. En este trabajo, los genes que codifican para la
cadena ligera y la cadena pesada sin la región CH2, se situaron en
el mismo vector de expresión, bajo el control de un promotor único.
Sin embargo, los autores reconocen que el sistema de expresión no
está optimizado y el nivel de expresión resulta moderado. Un
sistema similar policistrónico, donde las dos unidades de expresión
(cistrones) se encuentran bajo el control de un promotor, se utilizó
en Carter y colaboradores, en la Patente americana U.S. 5.648.237,
para la producción de fragmentos de anticuerpo en
E. coli.
E. coli.
En contraste con el amplio uso de sistemas
bacterianos para la expresión de fragmentos de anticuerpo, se han
hecho pocos intentos para expresar, en gran cantidad, anticuerpos
funcionales intactos en E. coli. Los anticuerpos intactos
son complejos y de gran tamaño por lo que a menudo es dificultoso
conseguir el plegamiento adecuado y el ensamblado de la cadena
ligera con la cadena pesada, y por tanto se recupera poco anticuerpo
tetramérico reconstituido. Además, como los anticuerpos producidos
en procariotas no están glicosilados, por tanto presentan
disminución de sus funciones efectoras, se ha sugerido que
E.coli no es un sistema adecuado para la producción de
anticuerpos intactos. Pluckthun y Pack (1997) Immunotech
3:83-105; Kipriyanov y Little Mol. Biotech.
12:173-201 (1999); Pluckthum y colaboradores (1996)
en INGENIERÍA DE ANTICUERPOS: UN ENFOQUE PRÁCTICO, páginas
203-252 (Oxford Press); Pluckthun (1994) en MANUAL
DE FARMACOLOGÍA EXPERIMENTAL volumen 3: La Farmacología de los
Anticuerpos Monoclonales, páginas 269-315 (editorial
M. Rosenberg y G.P. Moore; Springer-Verlag,
Berlín).
Los recientes avances en investigación y en
estudios clínicos sugieren que de alguna forma, son preferibles los
anticuerpos intactos que los fragmentos de anticuerpos. Un
anticuerpo intacto que contiene la región Fc tiende a ser más
resistente contra la degradación y el aclarado in vivo, por
eso tiene una mayor vida media en la circulación. Esta
característica es particularmente deseable cuando el anticuerpo se
utiliza como agente terapéutico en enfermedades que requieren
terapias sostenidas.
Además, de alguna forma, los anticuerpos
intactos aunque deficientes en sus funciones efectoras, tienen más
interés para algunos usos terapéuticos. Friend y colaboradores,
Transplantation 68:1632-1637 (1999) describen
efectos tóxicos de anticuerpos monoclonales CD3 glicosilados, como
síndromes severos de liberación de citocinas, cuando se utilizan en
humanos para el tratamiento de episodios de rechazo agudo de órganos
transplantados. Los anticuerpos monoclonales CD3 causan la
activación de células T y la liberación de citocinas por
entrecruzamiento del complejo receptor de células T y por la unión
de FcR. La Patente de U.S.A. Número 5,585.097 describe la
producción de anticuerpos CD3 no glicosilados por mutación de
ciertos lugares de glicosilación en anticuerpos CD3 nativos. Armour
y colaboradores, Eur. J. Immunol. 29:2613-2624
(1999) describen la utilización de anticuerpos no dañinos (por
pérdida de sus funciones efectoras) específicos para plaquetas
HPA-1a-positivas en aplicaciones
terapéuticas en las que no se desea una disminución de células
(plaquetas) portadoras de antígeno. Thompson y colaboradores, J.
Immunol Meth 227:17-29 muestran que las funciones
efectoras de un anticuerpo completo contra TGF\beta2 no son
necesarias para su utilización en la terapia de enfermedades
fibróticas mediadas por TGF\beta2. Reddy y colaboradores, J.
Immunol. 164:1925-1933 (2000) describen la
desventaja de la unión fuerte del anticuerpo contra el receptor de
-Fc\gamma en el tratamiento de enfermedades autoinmunes; Isaacs y
colaboratores, Clin. Exp. Inmmunol. 106:427-433
(1996)) sugieren que cuando es necesario, in vivo, el
bloqueo de un efecto, una buena opción para prevenir la unión del
receptor de Fc, es una variante de anticuerpo monoclonal no
glicosilado o un mutante obtenido por ingeniería
genética.
genética.
Los intentos para eliminar o reducir las
funciones efectoras de un anticuerpo normalmente se dirigen al
isotipo IgG4, que no afecta a las células a las que se dirige, o a
la producción de variantes de Fc en las que se muta alguno de los
residuos de la región crítica para las funciones efectoras. Véase
por ejemplo la Patente de U.S.A. Número 5,585.097. Sin embargo, los
dos enfoques tienen limitaciones. Por ejemplo respecto al isotipo
IgG4 se ha demostrado que éste puede retener cierto nivel de sus
funciones efectoras, tal como describe Isaacs y colaboradores,
(1996) supra, y Thompon y colaboradores, (1999) supra.
También, Reddy y colaboradores (2000), supra, describieron
que era necesario un mayor número de alteraciones en el IgG4 mAb
contra CD4 para eliminar las funciones efectoras del Fc. Los
mutantes en el Fc pueden evitar la respuesta inmune no deseada
gracias a los cambios ocasionados en los residuos de su secuencia
primaria.
La presente invención se aplica a la necesidad
de producción de anticuerpos intactos en organismos procariotas. En
una de sus aplicaciones, la invención proporciona el proceso para
producir una inmunoglobulina en una célula huésped procariota e
incluye la utilización de un único vector de expresión de cistrones
independientes. El vector de expresión de cistrones independientes,
en la presente invención, incluye, un casete de expresión de
polinucleótidos con una primera pareja de
promotor-cistrón para la expresión de una
inmunoglobulina de cadena ligera y una segunda de
promotor-cistrón para la expresión de una cadena
pesada de inmunoglobulina. La expresión de la cadena ligera y la
cadena pesada se regula de forma independiente por promotores
separados. Cada cistrón comprende una región de iniciación de la
traducción (TIR, del inglés Translation initiation region)
unida funcionalmente con la secuencia de ácidos nucleicos que
codifica la cadena ligera o pesada del anticuerpo completo. En
algunas aplicaciones, las secuencias TIR, en el vector de expresión
de la invención, están manipuladas para proporcionar diferentes
longitudes traducidas de cadena ligera y pesada. Para la aplicación
de la presente invención son adecuados como huéspedes de los
vectores de expresión diversos organismos procariotas.
Preferentemente, el huésped es una bacteria gram negativa. Más
preferentemente, el huésped es E. coli. En una de sus
aplicaciones, la célula huésped es una cepa de E. coli
genéticamente modificada y adecuada para la producción a gran
escala de proteínas heterólogas. Además, pueden utilizarse en la
presente invención, diferentes promotores. Un promotor preferente
es el promotor PhoA de
E. coli.
E. coli.
Figura 1 es una representación esquemática de la
construcción que incluye un vector de expresión de anticuerpos de
longitud secuencia completa, pxTFPV, derivada del vector de
expresión de Fab ya existente, pAK19.
Figura 2 muestra la expresión en E.coli
de los anticuerpos de longitud completa utilizando dos vectores de
expresión de longitud completa policistrónicos. Los extractos
celulares totales se analizaron en geles de
SDS-PAGE e inmunotransferencias, después de la
inducción. El carril 1 es el control negativo, el carril 2 es
pxTFPV (anticuerpo anti-TF); y el carril 3 es
pY0317.Fab-CH3 (anticuerpo
anti-VEGF). La flecha indica las bandas que
corresponden a los anticuerpos de longitud completa.
Figura 3 representa construcciones
policistrónicas con varias combinaciones de intensidad traduccional,
TIR, para las cadenas ligera y pesada.
Figuras 4A y 4B muestra la expresión en E.
coli de la cadena completa de un anticuerpo IgG1
anti-TF mediante vectores policistrónicos con
varias combinaciones de TIR para las cadenas ligeras (L) y pesadas
(H). Los extractos celulares totales se analizaron en geles de
SDS-PAGE e inmunotransferencias después de la
inducción. (4A) muestras reducidas. (4B) muestras no reducidas. La
lista de las intensidades de traducción TIR para la cadena ligera
("L") y la cadena pesada ("H") se muestran arriba.
"neg": células inducidas que llevan únicamente el vector de
control
pBR322.
pBR322.
Figura 5 es una representación esquemática de
las construcciones para la expresión individual de cadenas ligeras
y pesadas con diferentes fuerzas traduccionales TIR.
Figura 6A y 6B son resultados de geles teñidos
con azul de Comassie de lisados de células totales reducidos para
diferentes plásmidos donde se muestra el efecto de la fuerza
relativa de TIR en la secreción de cantidades de cadena ligera (6A)
o cadena pesada (6B).
Figura 7 ilustra de forma esquemática la
construcción del vector de expresión de cistrones independientes
para la secuencia completa de un anticuerpo (pxTF2AP77) por
combinación de los vectores de cadena ligera y pesada con
determinadas fuerzas TIR.
Figura 8 muestra la tinción de Coomassie de un
lisado reducido de células transformadas con el vector de cistrón
independiente pxTF2AP77.
Figura 9 ilustra construcciones de cistrón
independiente con varias combinaciones de intensidad TIR para
cadenas pesadas y ligeras.
Figura 10A y 10B muestra la expresión en E.
coli de la secuencia completa de un IgG1 anti-TF
utilizando una construcción con cistrones independientes con varias
combinaciones de intensidad TIR para las cadenas ligera (L) y
pesada (H). Los lisados celulares totales se analizaron mediante
SDS-PAGE e inmunotransferencia después de la
inducción.
Figura 11 es una comparación de las expresiones
del anticuerpo de longitud completa utilizando el sistema
policistrónico versus el sistema de cistrones independientes.
Los lisados celulares totales no-reducidos se
analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia
después de la inducción. Se indican varias combinaciones de
intensidad TIR para las cadenas ligera (L) y pesada (H).
Figura 12 es un gel teñido con Coomassie de
comparación del vector policistrónico derivado de
pAK-19 con el vector de cistrones independientes
para el anticuerpo anti-TF. El carril 1 es el
control negativo; el carril 2 es pxTFPV (derivado de pAk 19
policistrónico), y el carril 3 es paTF50 (de cistrones
independientes). La flecha indica la posición de la banda que
corresponde a los anticuerpos de longitud completa.
Figura 13 es una comparación de la expresión del
anticuerpo anti-TF de longitud completa con el
vector policistrónico derivado de pAK19 respecto a un vector de
cistrones independientes. Los lisados totales no reducidos se
analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia
después de la inducción. El carril 1 es el control negativo; el
carril 2 es pxTFPV (vector policistrónico derivado de
pAK-19); y el carril 3 es paTF50 (de cistrón
independiente). La flecha indica la banda que corresponde a los
anticuerpos de longitud completa.
Figura 14 es una comparación de la expresión del
anticuerpo de longitud completa anti-VEGF con un
vector policistrónico derivado de pAK19 respecto a un vector de
cistrones independientes. Los lisados celulares totales no reducidos
se analizaron mediante SDS-PAGE e
inmunotransferencia después de la inducción. El carril 1 es un
control negativo: el carril 2 es pY0317.Fab-CH3
(vector policistrónico derivado de pAK-19); y el
carril 3 es pxVG2AP11 (de cistrón independiente). La flecha indica
la banda que corresponde a los anticuerpos de longitud completa
anti-
VEGF.
VEGF.
Figura 15 representa la unión del antígeno (TF)
al anticuerpo anti-TF de longitud completa
producido por un vector de cistrones independientes paTG50 en
E.coli (IgG1). Se utilizaron como controles dos anticuerpos
anti-TF producidos en CHO (IgG2 y IgG4).
Figura 16 representa la unión de C1q al
anticuerpo IgG1 anti-TF de longitud completa
producido por paTF50 en E. coli. Para comparación, se
utilizó otro anticuerpo,
I-1095-1-Rituximab.
Figura 17 representa la unión de Fc\gammaR1
alfa al anticuerpo anti-TF de longitud completa
producido por paTF50 en E. coli. Dos anticuerpos IgE,
producidos en células CHO, se utilizaron como controles.
Figura 18 representa la unión de FcRn al
anticuerpo IgG1 anti-TF de longitud completa
producido por paTF50 en E. coli (32604-74
E. coli IgG1) en comparación con otros cinco anticuerpos
control.
Figura 19 representa los cambios de
concentración (\mug/mL) plasmática del anticuerpo
anti-TF (ATF-D3H44) a lo largo del
tiempo en chimpancés a los que se ha administrado una única dosis IV
del la IgG1 de longitud completa producida por paTF50 en E.
coli (E. coli IgG1), de IgG2 producida en CHO (CHO IgG2)
o de IgG4 producida en CHO (CHO IgG4b).
Figuras 20a-20c muestran las
secuencias del casete de expresión del vector de cistrones
independientes paTF50.
Figuras 21a-21c muestran las
secuencias del casete de expresión del vector de cistrones
independientes
pxVG2AP11.
pxVG2AP11.
Figura 22 muestra la expresión de varios
anticuerpos de longitud completa con un sistema de cistrones
independientes. Los lisados celulares totales se analizaron
mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia, después de
la inducción.
El término "vector" tal como se emplea
aquí, hace referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de
transportar a otro ácido nucleico al que se encuentra unido. Un tipo
de vector es un "plásmido", o cadena de ADN doble y circular
al que se han ligado segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de
vector es un vector fago. Otro tipo de vector es un vector viral,
en éste los segmentos de ADN adicionales se han ligado al genoma
viral. Ciertos vectores son capaces de replicarse de forma autónoma
en la célula huésped en la que se han introducido (por ejemplo
vectores bacterianos con origen de replicación bacteriano y los
vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplos
vectores no-episomales de mamíferos) pueden
integrarse en el genoma de una célula huésped y por tanto se
replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores
son capaces de dirigir la expresión de genes con los que están
unidos funcionalmente. A estos vectores nos referimos aquí como
"vectores de expresión recombinante" (o simplemente "vectores
recombinantes"). En general, los vectores de expresión de
utilidad en técnicas del ADN recombinante están en forma de
plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y
"vector" se utilizan de forma intercambiable aunque plásmido es
la forma más común de vector.
El término "cistrón", tal como se emplea
aquí, se refiere a un elemento genético equivalente a una unidad
traduccional y comprende la secuencia de nucleótido que codifica
para una cadena de polipéptido y sus regiones de control
adyacentes. Las "regiones adyacentes de control" incluyen, por
ejemplo, la regiones de iniciación de la traducción (TIR; tal como
se ha definido arriba) y una región de terminación.
Un vector de expresión policistrónico se refiere
a un vector único que contiene y expresa cistrones múltiples bajo
el control de un único promotor. Un ejemplo común de vector
policistrónico es un vector "dicistrónico"\cdot que contiene
y expresa dos polipéptidos diferentes bajo el control de un promotor
único. Bajo la expresión de un vector dicistrónico o
policistrónico, se transcriben múltiples genes en una única unidad
transcripcional y a continuación, se traducen
independientemente.
Las "regiones de iniciación de la
traducción" o TIR, como se emplea aquí, se refieren a una región
de ácido nucleico donde se inicia la traducción de un gen de
interés. En general, una TIR de un cistrón particular incluye un
lugar de unión al ribosoma (RBS) y las secuencias 5' y 3' del RBS.
Un RBS mínimo contiene la región Shine-Dalgarno y
el codón de iniciación (AUG). Así, una TIR, incluye también al menos
una porción de la secuencia del aminoácido que se va a traducir.
Preferentemente, la TIR de la presenten invención, incluye así
mismo, una secuencia señal de secreción que codifica un péptido
señal que precede a la secuencia codificante para la cadena ligera
y pesada del cistrón. Una variante de TIR contiene secuencias
variantes (especialmente substituciones) en el interior de la
región TIR que alteran sus propiedades, como fuerza de traducción,
como se define más abajo. Preferentemente, una variante TIR de la
invención, contiene substituciones en la secuencia de los 2 a 14
primeros codones, preferentemente entre los codones 4 a 12 y más
preferentemente los 6 codones de la secuencia señal de secreción
que precede a la secuencia que codifica la cadena pesada o ligera en
el cistrón.
El término "intensidad de traducción" se
utiliza aquí referido a la cuantificación de un polipéptido
secretado en un sistema de control, en donde se utilizan una o más
variantes de TIR para dirigir la secreción de un polipéptido y los
resultados se comparan con la TIR de tipo silvestre u otra TIR
control en el mismo cultivo y en las condiciones de ensayo. Sin
limitarse a ninguna teoría en particular, la "intensidad de
traducción", tal como se utiliza aquí, puede incluir por
ejemplo, una medida de la estabilidad del mRNA, eficiencia de unión
al sitio de unión al ribosoma y la forma de translocación a través
de la membrana.
La "secuencia señal de secreción" o
"secuencia señal" se refiere a una secuencia de ácido nucleico
que codifica un péptido señal corto. El péptido señal se utiliza
para dirigir una proteína de interés sintetizada de nuevo, a través
de la membrana celular, normalmente a la membrana interna o a ambas,
la interna o externa de los procariotas. Las proteínas de interés,
como el polipéptido de cadenas ligeras o pesadas de las
inmunoglobulinas, se secretan al periplasma de las células
huéspedes procariotas o al medio de cultivo. El péptido señal está
codificado por una secuencia señal de secreción que puede ser
endógena, de las células huéspedes, o también puede ser exógena. La
secuencia señal de secreción generalmente se encuentra en el extremo
amino de un polipéptido al expresarse y se extrae enzimáticamente
entre la biosíntesis y la secreción del polipéptido desde el
citoplasma. En consecuencia, el péptido señal, generalmente no se
encuentra presente en un producto proteico maduro.
El término "células huéspedes" (o
"células huéspedes recombinantes") tal como se utiliza aquí, se
refiere a una célula que ha sido alterada genéticamente, o es capaz
de alteración genética por la introducción de un polinucleótido
exógeno, como un vector o plásmido recombinante. Este término se
refiere no sólo a una célula particular sino también a su progenie.
Puede ocurrir, sin embargo, que en generaciones sucesivas y según
ciertas modificaciones como mutaciones o a la influencia del
ambiente, que la progenie no sea idéntica a la célula parental,
pero igualmente queda incluida en el término "células
huéspedes" tal como se utiliza aquí.
El término "anticuerpo" e
"inmunoglobulina" se utiliza intercambiablemente en sentido
amplio e incluye anticuerpos monoclonales (de longitud completa o
anticuerpos monoclonales intactos), anticuerpos policlonales,
anticuerpos multivalentes, y anticuerpos multiespecíficos (por
ejemplo anticuerpos biespecíficos tan largos como requiera la
actividad biológica deseada). Un anticuerpo natural comprende cuatro
cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas idénticas (H) y dos
cadenas ligeras idénticas (L) interconectadas por puentes bisulfuro.
Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada
(V_{H}) y una región constante de cadena pesada. La región
constante de la cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y
CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable ligera
(V_{L}) y una región constante. La región constante de la cadena
ligera comprende un dominio C_{L}. Las regiones V_{H} y V_{L}
pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad, o regiones
que determinan la complementariedad (CDR), entremezcladas con
regiones que están más conservadas o regiones de entramado
(FR).Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs ordenadas
desde el extremo amino-terminal al
carboxilo-terminal en el siguiente orden: FR1,
CDFR1, FR2, CDR2, FR34, CDR3, FR4.
Las cadenas ligeras de los anticuerpos de
cualquier especie de vertebrado puede asignarse a uno de los dos
tipos distintos denominados kappa (\kappa) y lamba (\lambda),
según las secuencia de aminoácido de sus dominios constantes.
Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de
los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos
(inmunoglobulinas) pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco
clases mayores de inmunoglobulinas; IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y
algunos de ellos pueden dividirse a su vez en subclases (isotipos),
IgG-1, IgG-2,
IgA-1, IgA-2. Los dominios
constantes de la cadena pesada que corresponden a diferentes clases
de inmunoglobulinas se denominan \alpha, \delta, \varepsilon,
\gamma, y \mu respectivamente. Las estructuras de las
subunidades y de tres configuraciones tridimensionales de diferentes
clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y están descritas por
ejemplo en Abbas et al. Immunología Celular y Molecular, 4ª
edición (2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de
fusión mayor, formada por la asociación covalente o no covalente de
anticuerpo con una o más proteínas o péptidos.
Los términos "anticuerpo de longitud
completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo"
se utilizan aquí de forma intercambiable, para referirse a un
anticuerpo en su forma intacta. Los términos se refieren a un
anticuerpo con cadenas pesadas que contienen la región Fc. Un
anticuerpo de longitud completa puede ser una secuencia nativa de
anticuerpo o una variante del anticuerpo. Un anticuerpo de longitud
completa puede ser humano, humanizado, y/o madurado por
afinidad.
Por "fragmentos de anticuerpo" se incluye
sólo a una porción de anticuerpo intacta que en general, incluye el
lugar de unión al antígeno del anticuerpo intacto y por tanto retine
la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Ejemplos de
fragmentos de anticuerpo que están incluidos en la presente
definición son: (i) el fragmento Fab, con los dominios VL, CL, VH y
CH1, (ii) el fragmento Fab', que es un fragmento Fab que contiene
uno o más residuos de cisteína en el extremo
C-terminal del dominio CH1; (iii) el fragmento Fd
que tiene los dominios VH y CH1; (iv) el fragmento Fd' que tiene los
dominios VH y CH1 y uno o más de los residuos cisteína en el
extremo C-terminal del dominio CH1; (v) el fragmento
Fv que contiene los dominios VL y VH de un único brazo de
anticuerpo; (vi) el fragmento dAb que consiste en el dominio VH;
(vii) regiones CDR aisladas; (viii) fragmentos F(ab')_{2},
un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab' unidos por
puente bisulfuro en la región de bisagra; (ix) moléculas de
anticuerpo de cadena simple (por ejemplo cadenas únicas Fv; scFv);
(x) "diacuerpos" con dos lugares de unión al antígeno, que
comprenden el dominio variable de la cadena pesada (VH) conectada a
un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de
polipéptido; (xi) "anticuerpos lineares" que comprenden un par
de segmentos en tandem Fd
(VH-CH1-VH-CH1) que
junto con la cadena de polipéptidos ligera complementaria forma un
par de regiones de unión al antígeno.
Una inmunoglobulina "biológicamente activa"
o "funcional" es aquella capaz de ejercer una o más de sus
actividades naturales en eventos estructurales, reguladores,
bioquímicos o biofísicos. Por ejemplo, un anticuerpo biológicamente
activo tiene la capacidad de unirse específicamente al antígeno y
ésta unión a su vez, provocar cambios a nivel celular o molecular
tal como la activación de la transducción de señal o de la
actividad enzimática. Un anticuerpo biológicamente activo también
bloquea la activación por unión del ligando al receptor o actúa
como un agonista del anticuerpo. La capacidad de un anticuerpo de
longitud completa para ejercer una o más de sus actividades
naturales depende de diferentes factores, incluyendo su propio
plegamiento y ensamblaje de las cadenas de polipéptidos. Las
inmunoglobulinas biológicamente activas, obtenidas por los
procedimientos descritos aquí, son heterotetraméricas con dos
cadenas idénticas L y dos cadenas idénticas H, unidas por múltiples
puentes bisulfuro y plegadas
adecuadamente.
adecuadamente.
El término "anticuerpo monoclonal", tal
como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una
población de anticuerpos substancialmente homogénea. Se entiende que
los anticuerpos individuales que comprende esta población son
idénticos a excepción de mutaciones que hayan podido surgir de forma
natural y que puedan estar presentes en mayor o menor cantidad. Los
anticuerpos monoclonales son altamente específicos ya que se
obtienen contra un único antígeno. Las preparaciones de anticuerpos
policlonales incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra
diferentes determinantes (epítopos), en contraste con los
anticuerpos monoclonales que se dirigen cada uno contra un único
determinante antigénico.
Los anticuerpos monoclonales aquí, incluyen
anticuerpos "quimera" en los que una porción de la cadena
pesada y/o cadena ligera es idéntica u homóloga a las secuencias de
anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a
una clase o subclase, mientras las cadenas restantes son idénticas
con u homólogas a las secuencias que corresponden a otros
anticuerpos derivados o que corresponden a otras especies, clases o
subclases, así como a los fragmentos de estos anticuerpos, según
exija la actividad biológica deseada. Patente americana U.S.
4.816.567 y Morrison y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:6851-6855 (1984)).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos
no-humanos (por ejemplo murinos) son anticuerpos
quiméricos que contienen secuencias mínimas derivadas de
inmunoglobulinas no-humanas. Gran parte del
anticuerpo humanizado corresponde a la inmunoglobulina humana
(anticuerpo receptor) en el que los residuos de la región
hipervariable se reemplazan por residuos de una región
hipervariable de una especie no-humana (anticuerpo
donante) como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen
una especificidad, afinidad y capacidad deseabas. Los residuos de
la región FR de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los
residuos correspondientes no-humanos. Los
anticuerpos humanizados pueden incluir residuos que no se encuentran
ni en el anticuerpo receptor ni en un anticuerpo donante. Estas
modificaciones se hacen para mejorar la realización del anticuerpo.
En general, el anticuerpo humanizado comprende substancialmente
todos o al menos uno y típicamente dos, dominios variables, en
donde todos los fragmentos hipervariables corresponden a las
inmunoglobulinas no humanas y todos los FRs son secuencias de
inmunoglobulinas humanas. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado
incluye al menos una porción de una región constate de las
inmunoglobulinas (Fc), normalmente de inmunoglobulina humana. Para
más detalles, véase Jones y colaboradores, Nature
321:522-525 (1986); Riechmann y colaboradores,
Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op.
Struct. Biol. 2:293-596 (1992). Véase también los
siguientes artículos de revisión y las referencias citadas en
éstos: Vaswani and Hamitol, Ann. Allergia, Asma e Immunologia
1:105-115 (1998).; Harris, Biochem. Soc.
Transacciones 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross,
Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
Un "anticuerpo humano" es aquel que posee
una secuencia de aminoácidos que corresponde con un anticuerpo
producido en un humano o/y se ha obtenido con cualquier técnica
descrita aquí para la producción de anticuerpos.
Esta definición de anticuerpo humano excluye
específicamente a los anticuerpos humanizados con residuos de unión
a antígenos no-humanos.
Un anticuerpo "madurado por afinidad" es
aquel con una o más alteraciones de una o más CDRs. De esta forma
resulta un anticuerpo con mayor afinidad por el antígeno en
comparación con el anticuerpo parental que no posee estas
alteraciones. Los anticuerpos maduros por afinidad preferentes,
tienen afinidades del orden de nanomolar o incluso picomolar por el
antígeno diana.
Los anticuerpos maduros por afinidad se producen
por procedimientos conocidos en la materia. Marks y colaboradores,
Bio/Technology 10:779-783 (1992) describen la
maduración por afinidad para los dominios VH y VL. La mutagénesis
al azar de la CDR y/o de los residuos de la FR se describen en
Barbas et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA
91:3809-3813 (1994); Schier y colaboradoes, Gene
169:147-155 (1995); Yelton y colaboradores, J.
Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson y
colaboradores, J. Immunol. 154 (7):3310-9 (1995); y
Hawkins y colaboradores, J. Mol. Biol. 226:889-896
(1992).
El término "región Fc" se utiliza para
definir la región C-terminal de una cadena pesada de
inmunoglobulina que puede generarse por digestión de un anticuerpo
intacto con papaína. La región Fc puede ser de una secuencia nativa
o de una región Fc variante. Aunque las uniones de la región Fc de
una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la cadena
pesada de la región Fc de una IgG humana normalmente se define por
extenderse desde un residuo aminoacídico en aproximadamente la
posición Cys 226, o de la posición Pro230 al extremo
C-carboxilo terminal de la región Fc. La región Fc
de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios
constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3 y, opcionalmente,
comprende un dominio CH4. La "región Fc de la cadena" tal como
se entiende aquí, significa una de las dos cadenas polipéptídicas de
la región Fc.
"Citotoxicidad celular dependiente del
anticuerpo" y "ADCC" se refiere a una reacción mediada por
la célula en la que las células, no específicamente citotóxicas,
que expresan los receptores de Fc (FcRs)(por ejemplo las células
supresoras naturales (NK, del inglés natural killer,
neutrófilos y macrófagos) reconocen al anticuerpo unido a una
célula diana y causan la lisis subsiguiente de la célula diana. Las
células que causan primariamente ADCC, células NK, expresan sólo
Fc\gammaRIII, mientras que los monocitos expresan Fc\gammaRI,
Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII. La expresión de FcR en células
hematopoyéticas está resumida en la Tabla 3 en la página 464 de
Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol.9:457-92 (1991).
Para determinar la actividad ADCC de la molécula de interés se
puede realizar un ensayo in vitro ADCC, tal como el que se
describe en la Patente de U.S.A. Número 5,500.362 o 5,821.337.
Normalmente las células efectoras en estos ensayos son células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células Natural Killer
(NK). Alternativamente o adicionalmente, la actividad ADCC de la
molécula de interés puede determinarse in vivo, por ejemplo
en un modelo animal tal como el descrito en Clynes y colaboradores.,
PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
Los términos "receptor de Fc" y "FcR"
se utilizan para describir un receptor que se une a la región Fc de
un anticuerpo. El FcR preferente es una secuencia humana nativa de
FcR. Más preferentemente, el FcR es una secuencia que se une a un
anticuerpo IgG (un receptor gamma)e incluye receptores de las
subclases Fc\gammaR, Rc\gammaRII y Fc\gammaRIII, incluyendo
las variantes alélicas y las formas de "ayuste" alternativo de
estos receptores. En los receptores de tipo Fc\gammaRII se
incluyen Fc\gammaRIIA (un "receptor activador") y
Fc\gammaRIIB (un "receptor inhibidor") con secuencias de
aminoácidos similares pero que difieren en sus dominios
citoplasmáticos. Un receptor activador Fc\gammaRIIA contiene un
inmunoreceptor de tirosina en su dominio citoplasmático basado en
un motivo de activación (ITAM). Un receptor inhibidor FC\gammaRIIB
contiene un inmunoreceptor de tirosina basado en su dominio
citoplasmático un motivo de inhibición (ITIM) (una revisión puede
encontrarse en Daeron, Annu. Rev. Immunol.
15:203-234 (1997). Para revisar los FcRs puede
consultarse Ravetch y Kinet, Anny Rev. Immunol
9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods
4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab.
Clin. Metd 126:330-41 (1995). Otros FcRs, así como
los que se identificarán en el futuro, quedan incluidos en el
término "FcR" tal como se describe aquí. El término también
incluye al receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la
transferencia materna de IgGs al feto (Guyer y colaboradores, J.
Immunol. 2117:587 (1986); y Kim y colaboradores, J. Immunol.
245:249 (1994)).
La "citotoxicidad dependiente del
complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de determinada
diana en presencia del complemento. La activación del complemento
se inicia por la unión de un primer componente del sistema del
complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo a un anticuerpo) que
está unida a un antígeno. Para determinar la capacidad de
activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC como
el que describieron Gazzano-Santoro y
colaboradores., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).
La "unión por afinidad" se refiere a la
fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un
sitio único de unión de una molécula (por ejemplo un anticuerpo) y
su complementario de unión (por ejemplo el antígeno o un receptor
FcRn). La afinidad de una molécula X por su complementario Y se
representa por la constante de disociación (Kd), que es la
concentración de Y requerida para ocupar los sitios de combinación
de la mitad de las moléculas de X presentes en la solución. Los
anticuerpos con baja afinidad por unión al antígeno (o al receptor
FcRn) en realidad tienden a disociarse débilmente, mientras los
anticuerpos con alta afinidad se unen fuertemente al antígeno (o al
receptor FcRn) y permanecen unidos por más tiempo.
El término "agente citotóxico" se utiliza
aquí en referencia a una sustancia que inhibe o previene la función
de las células y/o causa la destrucción de éstas. El término incluye
a los isótopos radioactivos (por ejemplo At^{211}, I^{131},
I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212},
P^{32} y los isótopos radioactivos de Lu), agentes
quimioterapéuticos y toxinas como pequeñas moléculas de toxina o
toxinas activas enzimáticamente de bacterias, hongos, plantas o de
origen animal, incluidos los fragmentos y/o las variantes de
éstos.
Un "agente quimioterapéutico" es un
compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de
agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes como tiotepa
y ciclofosfamida (CYTOXAN); alquil sufonatos como busulfan,
improsulfan y piposulfan; aziridinas como benzodopa, carbocone,
meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas como
altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida,
trietilenetiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas
(especialmente bullatacin y bullatacinona); campotecina (incluyendo
el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina;
CC-1065 (incluyendo los análogos sintéticos
adozelesin, carzelesin, y bizelesin); criptoficinas
(particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina;
duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos,
KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobin;
pancratistatina; sarcodictyin; spongistatina; mostazas nitrogenadas
como clorambucilo, clornafazina, colofosfamina, estramustina,
ifosfamida, mecloretamina, óxido de mecloretamina hidroclórica,
melfalán, novembicin, fenesterine, prednimustine, trofosfamida,
mostaza de uracilo; nitrosureas como carmustina, clorozotocin,
fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como
enediyna (por ejemplo caliquemicina, especialemnte caliqueamicin
y_{1}^{l} y caliqueamicina \theta_{1}^{l} véase por
ejemplo en Agnew. Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186
(1994); dinemicina, incluyendo dinemicina A; y esperamicina; así
como el cromóforo neocarzinostatina y antibióticos cromóforos
relacionados con el enediyne), aclacinomicinas, actinomicina,
autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina,
carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina,
daunorubicina, detorubicina,
6-diazo-5-oxo-L-norleucina,
doxorubicina (incluyendo morfolino-doxorubicina,
cianomorfolino-doxorubicina,
2-pirrolino-doxorubicina y
deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina,
marcellomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina,
olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina,
rodoruvicina, streptonigrina, estreptocina, tubercidina, ubenimex,
zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos como
metotrexate y 5-fluorouracilo
(5-FU); análogos del ácido fólico como denopterina,
metotexate, pteropterina, trimetrexate; análogos de la purina como
fludarabine, 6-mercaptopurina, tiamiprine,
tioguanina; análogos de la pirimidina como la ancitabina,
azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabine,
dideoxiuridina, doxifluoridina, enocitabina, floxuridina,
5-FU; andrógenos como calusterona, propionato de
dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona;
anti-adrenales como aminoglutetimide, mitotano,
trilostano; abastecedores de ácido fólico como ácido frolínico;
aceglatona; aldofosfamida, gicósido; ácido aminolevulínico;
amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxate; defofamina;
demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinium;
epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan;
lonidamina; maitansinoides como el ácido maitansínico y
ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina;
pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido de podofilino;
2-etil hidracina; procarbacina; PSK, razoxano;
rizoxina; sizofiran; spirogermanium; ácido tenuazónico;
triazicuona; 2,2',2''-tricloroetrietilamina;
tricotecenos (especialmente toxina T-2,
verracurina A, roridina A y anguidina); uretan; vindesina;
dacarbacine; manomustina; mitobrinol; mitolactol; pibobroman;
tgacitosina; arabinosa ("Ara-C");
ciclofosfamina; tiotepa; taxoids, e.g. paclitaxel (TAXOL,
Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) and
doxetaxel (TAXOTERE, Rone-Poulenc Rorer, Antony,
France); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina;
mercaptopurina; metotrexate; análogos del platino como el
cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido
(VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona;
vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposido;
daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato;
CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000;
difluoroetilornitina (DMFO); ácido retinoidco; capecitabine; y
sales aceptables farmacológicamente de ácidos o derivados de
cualquiera de los anteriores. También se incluyen en la definición
los agentes antihormonales que actúan en la regulación o la
inhibición de la acción hormonal en tumores como anti estrógenos
como portamoxifeno, raloxifeno,
4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa,
trioxifeno, keoxifeno, LY117018; onapristona, y toremifene
(Fareston); anti-andrógenos como flutamide,
nilutamide, bicalutamide, leuprolide, y goserelina; y las sales
aceptables farmacéuticamente así como ácidos o derivados de los
anteriores.
Un anticuerpo "bloqueante" o un anticuerpo
"antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad
biológica del antígeno al que se une. Aunque el bloqueo puede darse
de diferente forma, frecuentemente se consigue por interferencia
con el ligando al que se une el receptor, con la consiguiente
formación del complejo ligando-receptor y
activación de la tirosín-quinasa del receptor y/o
fosforilación de los residuos tirosín-quinasa en o
por el receptor. Por ejemplo un antagonista del anticuerpo de VEGF
se une a VEGF e inhibe la capacidad de VEGF para inducir la
proliferación vascular endotelial. Los anticuerpos bloqueantes o los
anticuerpos antagonistas preferentemente, causan la inhibición
completa de la actividad biológica del antígeno.
Un "anticuerpo agonista" es el anticuerpo
que se une y activa al antígeno o al receptor. Generalmente la
capacidad de activación del receptor por parte del anticuerpo
agonista es al menos similar cualitativamente (y puede ser
cuantitativamente) al ligando nativo del receptor.
Un anticuerpo de la invención "que se une al
antígeno esencialmente de forma tan efectiva como "el anticuerpo
correspondiente producido en un sistema células de mamífero, es
aquel capaz de unirse al antígeno con una afinidad o avidez del
orden de 10 veces, preferentemente de 5 veces, o más preferentemente
de 2 veces, que la afinidad de unión de un anticuerpo expresado por
una célula de mamífero como las células de Ovario de Hámster
Chino
(CHO).
(CHO).
Por "trastorno" se entiende cualquier
entidad susceptible de recibir un beneficio con el tratamiento con
el anticuerpo. Se incluyen en esta definición los trastornos
crónicos o agudos o enfermedades entre las que se encuentran
aquellas entidades patológicas que predisponen a los mamíferos al
trastorno en cuestión. Entre los ejemplos de trastornos que pueden
ser susceptibles de tratamiento, se incluyen aquí, sin limitación,
los tumores malignos o benignos; los procesos malignos linfoides y
las no-leucemias,; desórdenes neuronales, gliales,
astrocitales, hipotalámicos y otros desórdenes glandulares,
macrofagales, epiteliales, estromales y blastocoélicos; así como
otros desórdenes inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos.
Por una "enfermedad autoinmune" se entiende
aquí las enfermedades no malignas o trastorno dirigidos contra los
propios tejidos de un individuo. Las enfermedades autoinmunes,
excluyen las enfermedades o condiciones malignas o cancerosas, como
el linfoma de célula B, la leucemia aguda linfoblástica (ALL), la
leucemia crónica linfocítica (CLL), la leucemia de Hairy y la
leucemia mieloblástica crónica. Entre los ejemplos de trastornos o
enfermedades autoinmunes, se incluyen aquí, sin limitación, las
respuestas inflamatorias como las enfermedades inflamatorias de la
piel, psoriasis y dermatitis (por ejemplos la dermatitis ectópica),
escleroderma sistémico y esclerosis; la respuesta asociada a las
enfermedades inflamatorias del intestino (como la enfermedad de
Chron y la colitis ulcerosa); síndrome de insuficiencia respiratoria
aguda (que incluye la insuficiencia respiratoria en el adulto;
ARDS); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveitis; colitis;
glomerulonefritis; condiciones alérgicas como el eczema y el asma y
otras condiciones que implican la infiltración de células T y
respuestas inflamatorias crónicas; aterosclerosis; deficiencia de
adhesión leucocitarias; artritis reumatoide; lupus eritematoso
sistémico (SLE); diabetes mellitus (por ejemplo la diabetes mellitus
Tipo I o la diabetes mellitus dependiente de insulina); la
esclerosis multiple; el síndrome de Reynaud; la tiroiditis
autoinmune; encefalomeielitis alérgica; síndrome de Sjorgen;
diabetes juvenil, y la respuesta inmune asociada con
hipersensibilidad aguda o retardada mediada por citocinas y
linfocitos T normalmente asociadas a la tuberculosis, sarcoidosis,
polimiositis, granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa
(enfermedad de Addison); enfermedades que incluyen la dispedesis
leucocitaria; trastorno inflamatorio del sistema nervioso central
(CNS); síndrome de daño multiórganico, anemia hemolítica (que
incluye, pero no se limita a, la crioglobinemia o anemia positiva de
Coombs); la miastemia grave, la enfermedad mediada por los
complejos antígeno-anticuerpo; la enfermedad anti -
membrana basal del glomérulo; el síndrome antifosfolípídico; la
neuritis alérgica; la enfermedad de Graves; el síndrome miasténico
de Lamber-Baton; el bulbo pemfigoide; el pemfigo;
poliendocrinopatías autoinmunes; enfermedad de Reiter; síndrome de
Staff Man (síndrome de las personas rígidas); enfermedad de Bechet;
arteritis de células gigantes; nefritis de complejo inmune;
nefropatía ligada a la IgA; polineuropatías ligadas a los IgM;
púrpura tromocitopénica inmune (ITP) o trombocitopenia
autoinmune.
Los términos "cáncer" y "canceroso"
se refieren a o describen una condición fisiológica en mamíferos
que normalmente se caracteriza por la desregulación del crecimiento
celular. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a,
carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Otros ejemplos de
cáncer incluyen el cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón de
célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña,
adenocarcinoma de pulmón al carcinoma escamoso, cáncer de
peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointerstinal, cáncer
de páncreas, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer
de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer
colorectal, cáncer endometrial o uterino, cáncer de hígado, cáncer
de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer
colorectal, cáncer endometrial o carcinoma uterino, carcinoma de
glándulas salivares, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de
próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, cáncer hepático y
varios tipos cáncer de cuello y cabeza.
Tal como se utiliza aquí, el término
"tratamiento" se refiere a la intervención clínica en un
intento por alterar el curso natural de una célula individual
tratada, y puede realizarse de forma profiláctica o durante el
curso de una patología clínica. Los efectos deseables del
tratamiento incluyen la prevención de la ocurrencia o recurrencia
de la enfermedad, la suavización de los síntomas o la disminución
de las consecuencias patológicas directas o indirectas de la
enfermedad, la prevención de las metástasis, la disminución de la
velocidad de progresión de la enfermedad y la mejoría o paliación
del estado de enfermedad, la remisión y la mejora de la
prognosis.
Una "cantidad efectiva" se refiere a la
cantidad efectiva, dosis y períodos de tiempo necesarios para
conseguir un efecto terapéutico deseado o un resultado profiláctico.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de anticuerpo puede
variar de acuerdo con factores tales como el estado de la
enfermedad, edad, sexo y peso del individuo. Una cantidad
terapéuticamente efectiva es también aquella en la que cualquier
efecto tóxico o adverso del anticuerpo resulta menor que los
efectos terapéuticos beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente
efectiva" se refiere a la cantidad efectiva, a la dosis y a los
períodos de tiempo necesario, para conseguir el deseado resultado
profiláctico. Normalmente, y puesto que la dosis profiláctica se usa
en los sujetos antes que, o en los estadíos tempranos de la
enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva es menor que la
cantidad terapéuticamente efectiva.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención comprende la producción
recombinante de inmunoglobulinas en un sistema procariota. La
invención está basada en el diseño de un vector de expresión donde
la expresión de una cadena de inmunoglublina ligera y una cadena de
inmunoglobulina pesada están moduladas de forma independiente (es
decir, sistema de cistrón independiente). Tal como se ilustra en
algunos de los ejemplo proporcionados aquí, los sistemas procariotas
existentes para la producción de anticuerpos, en los que la
transcripción de los genes de cadena ligera y pesada están bajo el
control de un único promotor (sistemas policistrónicos), presentan
diversos problemas. Por ejemplo, estos sistemas, tienden a
presentar un desequilibrio entre los niveles de expresión de las dos
cadenas de inmunoglobulinas. Cuando los dos genes se expresan se
encuentran formando parte de una única unidad de traducción y el
primer gen normalmente está expresado a unos niveles más elevados
que el segundo gen. Este efecto resulta de la dependencia
traduccional del segundo y de factores tales como la eficiencia del
ensamblado ribosomal entre los dos genes. Por ello, el sistema
policistrónico produce un exceso de cadena ligera respecto de
cadena pesada. Ahora bien, este problema particular, en teoría
podría solucionarse ajustando experimentalmente el ensamblado
traduccional. Sin embargo, aunque puede conseguirse un acoplamiento
traduccional eficiente entre ambas cadenas, el sistema
policistrónico crea un obstáculo adicional que complica la obtención
de una proporción adecuada entre la cadena ligera preferente
respecto a la cadena pesada. Como las dos cadenas están juntas en
el mismo mensajero, la manipulación de la traducción del primer gen
(cadena ligera) afecta a la traducción del segundo gen (cadena
pesada). Por ello, se requeriría un considerable tiempo y esfuerzo
para conseguir la proporción deseable de expresión de la cadena
pesada.
Se ha descubierto ahora, sorprendentemente, que
el problema asociado con el sistema policistrónico puede
solucionarse si se utiliza un sistema con cistrones independiente,
donde cada cistrón para los genes de cadena ligera y cadena pesada
se sitúan bajo el control de promotores separados que permiten la
separación e independencia tanto de la transcripción como de la
traducción de ambos genes. Aunque generalmente se desea la
obtención de niveles elevados de expresión para cada cadena
individual de anticuerpo, todavía es más importante para la
maximización de la producción de anticuerpos biológicamente activos,
correctamente plegados y de longitud completa, la obtención de una
expresión de cadenas ligera y pesada en las proporciones
deseables.
La presente invención es aplicable a anticuerpos
con cualquier especificidad de unión antigénica. Preferentemente,
a anticuerpos específicos para antígenos que son polipéptidos de
importancia biológica. Más preferentemente, anticuerpos útiles para
terapia o diagnóstico de enfermedades o trastornos en los mamíferos.
Los anticuerpos no-aglicosilados de longitud
completa, generados de acuerdo con la presente invención, son
útiles particularmente como anticuerpos terapéuticos, bien como
anticuerpos bloqueantes, anticuerpos agonistas o anticuerpos
conjugados. Como ejemplos de anticuerpos terapéuticos, sin
limitación, son los anticuerpos anti-VEGF,
anti-IgE, anti-CD11,
anti-CD18, anti-CD40,
anti-factor tisular (TF), anti-HER2
y anti-TrkC. Se contemplan así mismo los
anticuerpos dirigidos contra antígenos no polipéptidos (tales como
loa antígenos glicolipídicos asociados a tumores).
Cuando el antígeno es un polipéptido, puede ser
una molécula transmembrana (por ejemplo un receptor) o un ligando,
como un factor de crecimiento. Los ejemplos de antígenos incluyen
moléculas como la renina; una hormona del crecimiento, la hormona
humana del crecimiento y la hormona bovina del crecimiento; el
factor liberador de la hormona de crecimiento; paratormona; hormona
estimuladores de la tiroides; lipoproteínas;
alfa-1-antitripsina; cadena A de la
insulina; cadena B de la insulina; proinsulina; hormona estimuladora
folicular; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de
la coagulación como el factor VIIIC, factor IX, factor tisular
(TF), y el factor von Willebrand; factores anti coagulantes como la
Proteína C; el factor atrial natriurético; surfantantes pulmonares;
activador del plasminógeno, como la uroquinasa o la orina humana o
activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA);
bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoiético,; factor
de necrosis tumoral alfa y vbeta; encefalinasa; RANTES (regulado en
la activación normal de células T y expresado y secretado);
proteína inflamatoria humana de los macrófagos
(MIP-1 alfa); albúmina sérica tal como la
seroalbúmina; substancia inhibitoria de Müeller; cadena A de la
relaxina; cadena B de la relaxina; prorelaxina; péptido asociado a
la gonadotropina de ratón; proteína microbiana; tal como la beta
lactamasa; ADNasa; IgE; antígeno citotóxico asociado a los
lifnocitos T (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina;
activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF);
receptores para las hormonas de factores de crecimiento; proteína A
o D; factores reumatoides, factores neurotróficos como el factor
neurotrófico derivado del hueso (BDNF),
neurotrofina-3 y neurotrofina 4, 5, o 6
(NT-3, NT-4, NT-5,
NT-6) o factor de crecimiento nervioso como
NGF-\beta; factor de crecimiento plaquetario
(PDGF); factor de crecimiento de los fibroblastos como aFGF o bFGF;
factor de crecimiento epidermal (EGF); factor de crecimiento
transformante (TGF) como TGF-alfa y
TGF-beta, incluyendo TGF-\beta,
TGF-\beta, TGF-\beta3,
TGF-\beta4 o TGF-\beta5; factor
de crecimiento similar a la insulina tipo I y II
(IGF-I y IGF-II);
des(1-3)-IGF-I
(IGF-I de cerebro); proteínas de unión de los
factores similares a la insulina; CD proteínas como CD3, CD4, CD8,
CD19, CD20 y CD40; eritropoietina; factores osteoinductores;
inmunotoxinas; proteína morfogenética del hueso (BMP); interferón
tal como interferón -alfa, -beta y -gamma, factores formadores de
colonias (CSFs); por ejemplo M-CSF,
GM-CSF, y G-CSF; interleucinas
(ILs), por ejemplo de IL-1 y IL-10,
superóxido dismutasa, receptores de las células T; proteínas de
superficie de la membrana; como el inhibidor DAF; antígenos
virales como de la cubierta del AIDS; proteínas de transporte;
receptores tipo "homing"; adresinas; proteínas reguladoras;
integrinas como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, y ICAM,
VLA-4 y VCAM; antígenos asociados a tumores como
HER2, HER3 y HER4 receptor; y también los fragmentos de los
polipéptidos citados.
Los antígenos preferidos para los anticuerpos
que comprende la presente invención, son las proteínas CD como CD3,
CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 y CD46; los miembros de la familia del
receptor ErbB como el receptor de EGF, HER2, HER3 Y HER4; las
molécula de adhesión celular como LF1-1, Mac1,
P150.95, VLA-4, ICAM-1,
ICAM-1, VCAM-1, integrina
\alpha4/\beta7, e integrina \alphav/\beta7 incluyendo tanto
las subunidades \alpha o \beta de éstas (los anticuerpos
anti-CD-1 Ia,
anti-CD18 o anti-CD11b); los
factores de crecimiento como VEGF; factor tisular (TF);
TGF-\beta; interferón alfa
(\alpha-IFN); interleucina, como
IL-8; IgE, antígenos del grupo sanguíneo, ApoA,
receptor de muerte, receptor flk2/flt3, receptor de obsesidad (OB),
receptor mpl; CTLA-4; proteína C,. Además las
dianas preferentes son VEGF, TF, CD20, CD40, TGF-b,
CD11a, CD18, Apo2 y C24.
Los antígenos solubles o los fragmentos de éstos
o conjugados con otras moléculas, se utilizan como inmunógenos para
generar anticuerpos. En el caso de moléculas transmembrana, como los
receptores, y los fragmentos de éstas (como el dominio extracelular
del receptor) pueden utilizarse como inmunógenos. De forma
alternativa, las mismas células que expresan la molécula
transmembrana se utilizan como inmunógeno. Con este fin, se utilizan
células que derivan de fuentes naturales (como las líneas celulares
tumorales) o células que han sido transformadas por técnicas
recombinantes para conseguir la expresión de la molécula
transmembrana. Otros antígenos y formas de éstos útiles para la
preparación de anticuerpos resultan obvios para los expertos en la
materia.
Los anticuerpos producidos pueden ser
monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o multiespecíficos.
Los antígenos multiespecíficos son específicos para diferentes
epítopos de una molécula única o pueden ser específicos para
epítodos de diferentes moléculas. Los procedimientos para el diseño
y la producción de anticuerpos multiespecíficos son conocidos en la
materia. Véase por ejemplo Millstein y colaboradores (1983) Nature
305:537-539; Kostelny et al. (1992) J.
Immunol. 148:1547-1553; WO 93/17715.
Las secuencias de polinucleótidos que codifican
las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas pueden
obtenerse por técnicas recombinantes estándares. Las secuencias
polinucleotídicas deseadas se sintetizan en un sintetizador de
nucleótidos o por técnicas de PCR. Una vez obtenidas las secuencias
que codifican las cadenas ligera y pesada se insertan en un vector
recombinante capaz de replicarse y de expresar los polinucleótidos
heterólogos en el huésped procariota. Se conocen bastantes vectores
disponibles que pueden utilizarse para el propósito de la presente
invención. La selección de un vector apropiado dependerá del tamaño
de los ácidos nucleicos insertados en el vector y del huésped
particular que se va a transformar con éste. Cada vector contiene
varios componentes, dependiendo de su función (amplificación o
expresión de un polinucleótido heterólogo o ambas) y su
compatibilidad con la célula huésped en que resida. Los componentes
del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, un origen
de replicación, un gen marcador que permite la selección, un
promotor, un lugar de unión del ribosoma/RBS), una secuencia señal,
un lugar de inserción del ácido nucleico heterólogo y una secuencia
terminadora de la transcripción.
En general, los vectores plasmídicos contienen
un replicón y unas secuencias control que derivan de especies
compatibles con la célula huésped. El vector contiene un sitio de
replicación así como secuencias capaces de permitir la selección
por fenotipo en células transformadas. Por ejemplo, E. coli
se transforma con pBR322, un plásmido derivado de las especies de
E. coli. PBR322 contiene genes que codifican para la
resistencia a la ampicilina (amp) y la tetraciclina (Tet)
resistencia y por tanto proporciona al sistema un medio para
identificar las células transformadas. PBR322, y sus derivados, u
otros plásmidos microbianos o bacteriófagos pueden también
contener, o ser modificados para que contengan, promotores que se
utilizan en los organismos microbianos para la expresión de
proteínas endógenas. Los derivados de pBR322 utilizados para la
expresión particular de anticuerpos, se describen en Carter y
colaboradores, Patente americana U.S. 5.648.237 y en la sección de
"Ejemplos" de la presente invención.
También los vectores fago que contienen replicón
y secuencias control y que son compatibles con los microorganismos
huéspedes pueden utilizarse como vectores transformantes en conexión
con el huésped. Como ejemplo los bacteriófagos cono
\lambdaGEM.TM.-11 se utilizan como vectores recombinantes que
transforman células huéspedes susceptibles como E. coli
LE392.
La expresión del vector de la invención
comprende al menos a dos promotores-cistrones, uno
para la cadena ligera de la inmunoglobulina y el otro para la
cadena pesada de la inmunoglobulina. El promotor es una secuencia
reguladora de la expresión que no se traduce y que se encuentra
localizada en el extremo 5' del cistrón. Los promotores de
procariotas pertenecen a dos clases, inducibles y constitutivos. Un
promotor inducible es un promotor que inicia el aumento de la
transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a cambios de
las condiciones del cultivo, por ejemplo en presencia o ausencia de
un determinado nutriente o de un cambio de temperatura.
Aunque tanto los promotores constitutivos como
los inducibles pueden utilizarse en la presente invención, los
promotores inducibles bajo regulación se prefieren en la expresión
de vectores descritos en la presente invención. Por otro lado se
conocen un gran número de promotores reconocidos para una variedad
de células huéspedes potenciales. El promotor seleccionado se
extrae de la fuente de ADN mediante digestión con enzimas de
restricción y una vez aislado se inserta en el vector de la
invención en donde queda unido de forma operativa con el ADN del
cistrón que codifica la cadena ligera o pesada. La secuencia nativa
del promotor y algunos promotores heterólogos pueden utilizarse
para la amplificación directa y/o expresión de los genes de interés.
Sin embargo, se prefieren los promotores heterólogos ya que
permiten una mayor transcripción y niveles de expresión del gen de
interés si se comparan con el promotor nativo del polipéptido de
interés.
Los promotores adecuados para su uso con
huéspedes procariotas incluyen el promotor PhoA, los sistemas
promotores de la B-galactamasa y la lactosa, el
sistema promotor del triptófano (trp) y promotores híbridos
como tac o el promotor trc. También son adecuados
otros promotores funcionales conocidos de las bacterias o fagos.
Sus secuencias nucleotídicas han sido publicadas y por tanto
permiten a los expertos en la materia, la ligación de forma
operativa de cistrones que codifican las cadenas ligeras y pesadas
(Siebenlist y colaboradores (1980) Cell 20:269) utilizando
adaptadores para cualquier diana de restricción que se requiera. El
promotor preferido para su uso en esta invención es el promotor
PhoA.
En un aspecto de la presente invención, cada
cistrón en el vector recombinante comprende una secuencia señal de
secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados
a través de la membrana. La secuencia señal puede ser un componente
del vector o puede se parte del ADN del polipéptido de interés que
se inserta en el vector. La secuencia señal seleccionada para el
propósito de la presente invención, es una secuencia que puede ser
reconocida y procesada (por ejemplo por una señal de peptidasa) por
la célula huésped. En células huéspedes procariotas que no
reconocen y procesan las secuencias señal nativas en el caso de
polipéptidos heterólogos, la secuencia señal se substituye por
secuencias seleccionadas de señales de procariotas, por ejemplo,
del grupo formado por la fosfatas alcalina, penicilinasa, Ipp, o
secuencia de la enterotoxina II (STII) termoestable, LmB, PhoE,
PelB, OmpA y MBP. En una aplicación preferente de la invención, las
secuencias señal utilizadas en ambos cistrones del sistema de
expresión son secuencias señal STII o variantes de éstas.
En otro aspecto, la producción de
inmunoglobulinas, de acuerdo con la invención, pueden ocurrir en el
citoplasma de las células huésped y por tanto no requiere la
presencia de secuencias de señal de secreción en el cistrón. Desde
este modo, las cadenas de inmunoglobulina ligera y pesada se
expresan, se plegan y se ensamblan formando inmunoglulinas
funcionales en el citoplasma. Ciertas cepas de huésped (por ejemplo
la cepa E.coli trxB) proporcionan unas condiciones
citoplasmáticas que son favorables para la formación de puentes
bisulfuro, por tanto permiten el plegamiento y el ensamblado
adecuado de las subunidades proteicas expresadas. Proba y
Pluckthun. Gene, 159:203 (1995).
La presente invención requiere un sistema de
expresión en que se module la proporción cuantitativa de cadenas
ligeras y pesadas expresadas para maximizar la cantidad secretada de
cadena completa de anticuerpo ensamblada adecuadamente. Esta
modulación se acompaña por la modulación traduccional simultánea de
la longitud de las cadenas ligera y pesada.
La técnica para la modulación de la intensidad
de traducción está descrita en Simmons y colaboradores en la
Patente americana U.S. 5.840.523. En ella se utilizan variantes de
de la región de inicio de la traducción (TIR) en el cistrón. Para
una TIR determinada, se pueden obtener diferentes variantes de una
secuencia de aminoácidos o de variantes de ácidos nucleicos en un
rango de intensidad de traducción con el fin de conseguir ajustar
el nivel de expresión deseado de una cadena específica. Las
variantes de TIR pueden generarse por técnicas de mutagénesis
convencional que resultan en cambios de codón que alteran la
secuencia de aminoácidos, aunque se prefieren los cambios
silenciosos en la secuencia de nucleótidos. Las alteraciones de TIR
pueden incluir alteraciones en en número de secuencias de
Shine-Dalgarno, así como alteraciones de la
secuencia señal. Un procedimiento preferente para generar
secuencias señal mutadas es la creación de un "banco de
codones" en el inicio de la secuencia de codificación que no
cambie la secuencia de aminoácidos de la secuencia señal (cambios
silenciosos). Esto se consigue cambiando el tercer nucleótido de
cada codón; además algunos aminoácidos como leucina, serina, y
arginina, tienen múltiples posibilidades en las primeras y segundas
posiciones que pueden ayudar en la complejidad de crear el banco.
Este procedimiento de mutagénesis se describe en detalle en Yansura
y colaboradores (1992). METHODS: A companion to methods in
enzymology. 4:151-158.
En la presente invención, se genera
preferentemente, un grupo de vectores en un intervalo de intensidad
de TIR para cada cistrón. Este grupo limitado proporciona una
comparación de los niveles de expresión de cada cadena así como del
rendimiento de los productos de longitud completa en varias
combinaciones de intensidad TIR. Las intensidades TIR pueden
determinarse por la cuantificación del nivel de expresión de un gen
marcador tal como se describe en detalle en Simmons y colaboradores
en la Patente americana U.S. 5.840.523. Para el propósito de la
presente invención, la combinación de intensidad de traducción para
un particular par de TIRs en el vector, se representa por
(N-ligera, M-pesada), donde N es la
intensidad de TIR relativa de la cadena ligera y M es la intensidad
TIR relativa de la cadena pesada. Por ejemplo
(3-ligera, 7-pesada) significa que
el vector proporciona una intensidad TIR relativa de 3 para la
expresión de la cadena ligera y una intensidad de TIR relativa de 7
para la expresión de la cadena pesada. Según esta comparación de la
intensidad de traducción, en la invención, se selecciona una TIR
individual deseada para combinarse con la construcción diseñada del
vector de expresión.
Las células procariotas huéspedes adecuadas para
la expresión de anticuerpos de longitud completa de la invención,
incluyen Archaebacteria y Eubacteria, organismos
Gram-negativos y Gram-positivos. Los
ejemplos de bacterias adecuadas incluyen a Escherichia (por ejemplo
E. coli), Bacilli (por ejemplo B.subtilis),
diferentes especies de Enterobacteria y Pseudomonas, Salmonella
typhimurium, Serratia marcescans, Kebsiella, Proteus, Shigella,
Rhizobia, Vitreoscilla, o Paracoccus. Preferentemente, se utilizan
las células Gram-negativas. Más preferentemente, en
la presente invención se utilizan como huéspedes las células de
E. coli. La cepa preferente es la cepa E. coli W3110
(Bachmann, Biología Celular y Molecular, vol 2 (Washignton, D.C.:
Sociedad Americana de Microbiología, 1987), páginas
1190-1219; Depósito de la ATCC Número 27.325) y los
derivados de éstas, que incluyen la cepa 33D3 que tiene el genotipo
W3110 .fhuA(.etonA)ptr3 lac Iq
LacL8.ompT.(nmpc-fepE)degP41 kan^{R}
(Patente americana U.S. 5.639.635). Se encuentran también
disponibles otras cepas y derivados de éstas como E. coli
294 (ATCC 31.446), E coli B, E. coli_{\lambda} 1776
(ATCC 31.537) y E. coli RV308 (ATCC 31.608). Estos ejemplos
son ilustrativos pero no
limitantes.
limitantes.
Los procedimientos para la construcción de
derivados de las bacterias arriba mencionadas con genotipos
definidos son conocidos en la materia y están descritos en, por
ejemplo, Bass y colaboradores, Proteínas, 8:309-314
(1990). Es necesario, desde luego, seleccionar la bacteria apropiada
tomando en consideración la replicabilidad del replicón en las
células de una bacteria. Por ejemplo las especies E. coli,
Serratia o Salmonella, son adecuadas como huéspedes cuando se
utiliza como suministradores del replicón los plásmidos conocidos
pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410. Preferentemente la célula huésped
debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticos y se
incorporan además inhibidores de proteasas al cultivo celular.
Las células huésped se transforman con los
vectores de expresión arriba descritos y se cultivan en medios
convencionales con nutrientes modificados según sea necesario para
la inducción de promotores, selección de transformantes o
amplificación de genes que codifican para las secuencias
deseadas.
La transformación significa la introducción de
ADN en un huésped procariota en el que el ADN pueda replicarse,
como un elemento exrtracromosomal o integrado en el cromosoma.
Dependiendo de la célula huésped, la transformación se realiza
mediante técnicas estándares apropiadas para cada célula. El
procedimiento general para células bacterianas que poseen pared
celular es el tratamiento con cloruro de calcio. Otros
procedimientos de transformación emplean polietilen glicol/DMSO.
Así mismo, entre otras técnicas, se utiliza la electroporación.
Las células procariotas utilizadas para la
producción de los polipéptidos de la invención se crecen en medio
conocido en la materia y adecuados para el cultivo de las células
huéspedes seleccionadas. Los ejemplos de medios adecuados incluyen
el caldo de Luria (LB) más los suplementos de nutrientes necesarios.
En las realizaciones preferidas, el medio también contiene agentes
de selección, escogidos según la construcción realizada en el
vector de expresión, para permitir el crecimiento selectivo de las
células procariotas que contienen el vector de expresión. Por
ejemplo la ampicilina se añade al medio para el crecimiento de
células resistentes que expresan el gen de resistencia a la
ampicilina.
Los suplementos necesarios como carbón,
nitrógeno y fuentes de fosfatos inorgánicos, se incluyen a las
concentraciones apropiadas sólos o como una mezcla de otros
suplementos o medios con una fuente compleja de nitrógeno. De forma
opcional el medio de cultivo contiene uno o más agentes reductores
seleccionados de un grupo formado por glutatión, cisteína,
cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditriotreitol.
Las células huéspedes procariotas se cultivan a
temperaturas adecuadas. Para el crecimiento de E. coli, por
ejemplo, los intervalos de temperatura van de 20ºC a 39ºC, más
preferentemente de 25ºC a 37º e incluso más preferentemente
alrededor de 30ºC. Para E. coli el pH es preferentemente de
6,8 a 7,4 y más preferentemente de 7.0.
Si un promotor inducible se utiliza en la
expresión del vector de la presente invención, la expresión de la
proteína se induce en las condiciones adecuadas para la activación
del promotor. En un aspecto de la invención, dos promotores PhoA se
usan para controlar la transcripción de las cadenas ligeras y
pesadas. Así, las células huéspedes transformadas se cultivan en un
medio fosfato limitante para su inducción. Preferentemente el medio
fosfato limitante es el medio C.R.A.P descrito en detalle en el
Ejemplo 2. Además se pueden utilizar una variedad de otros
inductores, de acuerdo con la construcción realizada en el vector,
tal como es conocido en la materia.
Los polipéptidos expresados de cadena ligera y
pesada, de la presente invención, se secretan y se recuperan del
periplasma de las células huéspedes. La recuperación de las
proteínas implica normalmente la disrupción del microorganismo,
generalmente por choque osmótico, sonicación o lisis. Los restos
celulares, o toda la célula al completo, se extraen por
centrifugación o filtración. Las proteínas pueden purificarse, por
ejemplo, por cromatografía con una resina de afinidad. De forma
alternativa, las proteínas pueden transportarse en el medio de
cultivo y aislarse de éste. Las células se extraen del cultivo y los
sobrenadantes se filtran y concentran para una mayor purificación
de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados se aíslan
y se identifican con procedimientos conocidos comunes, como los
geles de poliacrilaminda (PAGE) y los ensayos de transferencia de
Western.
En un aspecto de la presente invención, la
producción de anticuerpos a gran escala, se realiza según un
proceso de fermentación. Son varios los procesos de fermentación a
gran escalada que se encuentran disponibles para la producción de
proteínas recombinantes. Se considera que las fermentaciones a gran
escala tienen al menos una capacidad de 1000 litros, pero
preferentemente de 1.000 o 100.000 litros. Estos fermentadores
utilizan agitadores a propulsión para la distribución del oxígeno
y los nutrientes, especialmente glucosa (la fuente de carbón y de
energía preferente). Cuando se habla de fermentación a pequeña
escala, generalmente se refiere a la fermentación en un fermentador
que no tiene más de 100 litros de capacidad volumétrica y abarca de
1 a 100 litros.
En un proceso de fermentación, la inducción de
la expresión proteica se inicia normalmente una vez que las células
crecidas en las condiciones deseadas han llegado a una densidad
adecuada, por ejemplo una OD_{550} entre 180-220,
normalmente a un nivel de fase estacionaria temprana. Se pueden
utilizar una variedad de inductores, según la construcción del
vector que se emplee, como es conocido en la materia y así se
describe más arriba. Las células se crecen durante períodos cortos
antes de la inducción durante 12-50 horas, aunque
también se utilizan inducciones durante períodos más cortos o más
largos.
Para aumentar la producción de la cantidad y la
calidad de los polipéptidos de la invención, se modifican las
condiciones de fermentación. Por ejemplo, para aumentar el
ensamblado y plegamiento de la secuencia polipétidica de anticuerpo
secretada, se incluyen vectores adicionales que sobreexpresan
proteínas de cubierta, como las proteinas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC,
DsbD y DsbG) o FkpA (una peptidil-propil cis,
trans-isomerasa con actividad de cubierta), que se
cotransforman en el huésped procariota. Las proteínas de cubierta
facilitan el plegamiento adecuado y la solubilidad de las proteínas
heterólogas producidas en las células huéspedes bacterianas. Chen y
colaboradores (1999) J. Biol. Chem. 274:
19601-19605; Georgiou y colaboradores según la
Patente de U.S.A. Número 6,083.715; Georgiu y colaboradores según
la Patente americana U.S. 6.027.888; Bothmann y Pluckthun (2000) J.
Biol. Chem. 275; 17100-17105; Ramm y Pluckthum
(2000); J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie y
colaboradores (201) Mol. Nicrobiol. 39:199-210.
Para el plegamiento de anticuerpos divalentes de longitud completa,
que tienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, es
particularmente importante la presencia de suficientes puentes
bisulfuro.
Para minimizar la proteolisis de las proteínas
heterólogas expresadas (especialmente aquellas que son sensibles
proteolíticamente), se utilizan, en la presente invención, ciertas
cepas huéspedes deficientes para enzimas proteolíticos. Por
ejemplo, cepas de células huéspedes modificadas por efecto de
mutaciones genéticas en genes codificadores de proteasas
bacterianas como Proteas III, OmpT, DegP, Tsp, Proetasa I, Proteasa
Mi, Proteasa V, Proteasa VI y las combinaciones de éstas. Algunas
cepas deficientes en proteasas de E. coli se encuentran
disponibles y descritas por ejemplo en Joly y colaboradores (1998)
supra; Georgiou y colaboradores en la Patente americana U.S.
5.264.365; Georgiuou y colaboradores en la Patente americana U.S.
5.508.192; Hara y colaboradores, Microbial Drug Resistance,
2:63-72 (1996).
En una aplicación preferente de la presente
invención, se transforman cepas de E. coli deficientes en
enzimas proteolíticos con plásmidos que sobreexpresan una o más
proteínas de la cubierta. Algunas de estas cepas se describen con
más detalle en la sección de Ejemplos de más abajo.
En una realización preferida, la proteína
producida aquí, se purifica además para obtener preparaciones que
sean substancialmente homogéneas para análisis y usos posteriores.
En este sentido, pueden utilizarse los procedimientos estándares de
purificación de proteínas conocidos en la materia. Los
procedimientos siguientes son un ejemplo de procedimientos de
purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de intercambio
iónico o inmunoafinidad, precipitación por etanol, HPLC de fase
inversa, cromatografía en silice o en resina de intercambio
catiónico como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE,
precipitación en sulfato amónico, y filtración en gel mediante, por
ejemplo, Sephadex G-75.
En un aspecto de la invención, la proteína A
inmovilizada en la fase sólida se usa para purificación por
inmunoanfinidad de los productos de anticuerpo de longitud completa.
La proteína A es una proteína de pared celular de 41 Kda de
Staphylococcus aureas que se une con la región de alta
afinidad Fc de los anticuerpos. Lindmark y colaboradores (1983) J.
Immunol. Meth. 62:1-13. La fase sólida en la que la
Proteína A está inmovilizada preferentemente es una columna que
comprende un superficie de vidrio o sílice, mas preferentemente una
columna de vidrio de poro controlado o una columna de ácido
silícico. En algunas aplicaciones, la columna se recubre con un
reactivo, como el glicerol, en un intento de prevenir la adherencia
inespecífica de contaminantes.
Como primer paso de la purificación, la
preparación derivada del cultivo celular, tal como se describe más
arriba, se aplica a la proteína inmovilizada en la fase sólida para
permitir la unión específica del anticuerpo de longitud completa la
Proteína A. A continuación, la fase sólida se lava para extraer los
contaminantes unidos inespecíficamente. Finalmente el anticuerpo de
longitud completa se recupera de la fase sólida por elución.
El anticuerpo de longitud completa no
glicosilado de la presente invención, puede caracterizarse según
sus propiedades físico/químicas y funciones biológicas mediante
varios ensayos conocidos en la materia. En un aspecto de la
invención, es importante la comparación del anticuerpo producido en
células huéspedes procariotas en la invención, con anticuerpos
similares producidos en otros sistemas de expresión, tales como
otros diseños de vectores de expresión o sistemas celulares.
Particularmente, la cantidad de anticuerpo de longitud completa
expresado por un vector de cistrones independientes, de la presente
invención, puede comparase con la que expresan vectores
policistrónicos. Los procedimientos para cuantificación de las
proteínas son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, las
proteínas expresadas pueden compararse según sus intensidades
cuantitativas mediante SDS-PAGE teñido con con
Coomassie. De forma alternativa, las bandas específicas de interés
(como las bandas de longitud completa) se detectan por ejemplo
mediante análisis del gen por transferencia de western y/o en un
ensayo AME5-RP.
El anticuerpo de longitud completa purificado
puede además caracterizarse en una serie de ensayos que incluyen,
pero no se limitan a, la secuenciación N-terminal,
el análisis de aminoácidos, la exclusión por tamaño en
cromatografía líquida de alta presión (HLPC) no desnaturalizante,
espectrometría de masas, cromatografía de intercambio iónico y
digestión con papaína.
En ciertas realizaciones de la invención, el
anticuerpo de longitud completa producido aquí, se analiza según su
actividad biológica. Preferentemente, el anticuerpo se analiza según
su unión al antígeno. Los ensayos de unión al antígeno que se
conocen en la materia pueden utilizarse aquí e incluyen, sin
limitación, cualquier ensayo directo o competitivo utilizando
técnicas como transferencia de western, radioinmmunoensayo, ELISA
(ensayo de unión immunoabsorbente), inmunoensayos de tipo sandwich,
ensayos de inmunoprecipitción, ensayos de fluorescencia, ensayos de
proteína A. Un ensayo de unión al antígeno, como ejemplo, se
proporciona más abajo en la sección de Ejemplos.
Se describe en la presente invención, el
anticuerpo de longitud completa no glicosilado. Las características
únicas del anticuerpo (por ejemplo que tenga intacta la región Fc,
que carezca de funciones efectoras) lo convierten en el candidato
idóneno para muchas aplicaciones en las que la vida media del
anticuerpo in vivo es importante pero sus funciones
efectoras (complento y ADCC) son innecesarias o incluso
perjudiciales. En ciertos casos, las actividades de Fc del
producto de anticuerpo de longitud completa cuantifican para
asegurar que sólo las propiedades deseables se mantengan. Por
ejemplo, se realizan ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para
asegurarse que el anticuerpo ha perdido la unión a Fc\gammaR1 (ya
que supone la pérdida de toxicidad ADCC) pero continúa reteniendo
la capacidad de unión a FcRn. También se realizan ensayos de unión
C1q para confirmar que el anticuerpo es capaz de unirse a C1q y por
tanto carece de actividad CDC. Así mismo se realizan ensayos de
citotoxicidad in vitro e in vivo para confirmar la
disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Las técnicas para la
realización de estos ensayos son conocidas en la materia. Los
procedimientos en detalle se proporcionan en los ejemplos de la
sección de Ejemplos.
La presente invención comprende la producción de
anticuerpos humanizados. Los diversos procedimientos para
humanización de anticuerpos no humanos son conocidos en la materia.
Preferentemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos
de aminoácidos de una fuente no humana. Para referirse a estos
residuos de aminoácidos no humanos, frecuentemente, se utiliza el
término residuos "importados" que se toman de un dominio
variable de "importación". La humanización, esencialmente, se
realiza según el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y
colaboradores (1986) Nature 321:522-525; Riechmann y
colaboradores (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen
y colaboradores (1988) Science 239: 1534-1536)
mediante sustitución de secuencias de la región hipervariable de un
anticuerpo humano por las correspondientes de otra especie. Según
esto, los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quimera
(según la Patente americana U.S. 4.816.567) donde substancialmente
se ha substituido menos de un dominio variable intacto humano por
la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la
práctica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos humanos en los
que los residuos de la región hipervariables y posiblemente algunos
residuos de FR son substituidos por residuos análogos de anticuerpos
de roedores.
Para la reducción de la antigenicidad, es muy
importante la elección de los dominios variables humanos, tanto
para la cadena ligera como pesada. De acuerdo con el procedimiento
denominado "mejor ajuste", se utiliza la secuencia de dominio
variable de anticuerpo de roedor para el cribado de una librería
completa humana de secuencias de dominio variable conocidas. La
secuencia humana más semejante a la del roedor es la aceptada como
la región de entramado para los anticuerpos humanizados (Sims y
colaboradores (1993)) J. Immunol. 151: 2296; Chothia y
colaboradores (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Otro procedimiento que
utiliza una región de entramado particular deriva de la secuencia
consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo de cadena
ligera y pesada. La misma región de entramado puede utilizarse para
diferentes anticuerpos humanizados según (Carter y colaboradores
(1992) Proc. Natl. Acxad. Sci. USA, 89:4285; Presta y colaboradores
(1993) J. Immunol., 151:2623.
Además, es importante que los anticuerpos se
humanicen reteniendo su alta afinidad por el antígeno y otras
propiedades biológicas favorables. Para conseguirlo, de acuerdo con
un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan
según un proceso de análisis de la secuencia parental y varios
productos humanizados conceptuales mediante modelos tridimensiones
de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de
inmunoglobulinas tridimensiones están disponibles y resultan
familiares a los entendidos en la materia. También se encuentran
disponibles los programas informáticos que ilustran y representan
estructuras conformacionales tridimensionales probables de
secuencias de las inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. El
estudio de estas representaciones permite el análisis del papel de
los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina
candidata, es decir el análisis de residuos que influencian la
capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse al antígeno.
En este sentido, es posible seleccionar y combinar los residuos FR
del receptor, e importar las secuencias para que el anticuerpo
presente las características deseadas, como el aumento de la
afinidad por el antígeno de interés. En general los residuos de la
región hipervariable están directamentemente y substancialmente
implicados en la unión al antígeno.
También se contemplan aquí las modificaciones de
las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos descritos. Por
ejemplo, si se desea un incremento de la afinidad de unión y/o
otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la
secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante la
introducción de cambios apropiados en el ácido nucleico que
codifica el anticuerpo o mediante la síntesis directa del péptido.
Estas modificaciones, incluyen por ejemplo, deleciones, inserciones
y sustituciones de residuos en la secuencia de aminoácidos del
anticuerpo. La combinación de delecciones, inserciones y
sustituciones permite llegar a una construcción final que
proporciona las características deseadas. Las alteraciones de
aminoácidos pueden ser introducidas en la secuencia de aminoácidos
del anticuerpo de interés al mismo tiempo que se genera la
secuencia.
Un procedimiento útil para identificar ciertos
residuos o regiones en el anticuerpo con localizaciones preferidas
para la mutagénesis se denomina "mutagénesis por cribado de
alanina" tal como se describe en Cunningham y Wells (1989)
Science, 244; 1081-1085. En éste, un residuo de un
grupo (por ejemplo residuos cargados como arg, asp, his, lys y glu)
se detectan y son reemplazados por un aminoácido neutro o cargado
negativamente (preferentemente alanina o polialanina) resultando,
por ello, afectada la interacción del aminoácido con el antígeno.
Estas localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad
funcional mediante sustitución, después, se refinan introduciendo
más variantes en esos lugares. Por tanto, mientras el lugar para la
introducción de variaciones en la secuencia de aminoácidos se
predetermina, la naturaleza de la mutación per se no
necesita estarlo. Por ejemplo, para analizar la introducción de una
mutación en un lugar dado, la técnica de mutagénesis mediante
cribado de alanina o la mutagénesis aleatoria se realizan en el
codón o región de interés y se analiza la actividad deseada de los
anticuerpos de longitud completa expresados.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos
incluyen fusiones en los extremos amino y/o carboxilo terminales en
un intervalo de longitud desde un residuo hasta polipéptidos con
cientos o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de uno
o múltiples residuos aminoacídicos. Como ejemplos de inserciones
terminales se incluyen anticuerpos con residuos metionil en el
extremo N-terminal o el anticuerpo fusionado con un
polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula
de anticuerpo incluyen las fusiones en los extremos N- o C-
terminales del anticuerpo con un enzima (como ADEPT) o un
polipéptido que aumente la vida media del anticuerpo en el
suero.
Otro tipo de variante es una variante por
sustitución de un aminoácido. Estas variantes tienen al menos un
residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo que ha sido
reemplazada por otro residuo. Los lugares con un mayor interés para
las mutaciones por sustitución incluyen las regiones hipervariables,
pero también se contemplan las alteraciones en FR. Las
sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el título
de "sustituciones preferidas". En tales sustituciones resulta
un cambio en la actividad biológica, también pueden introducirse
otros cambios substanciales posteriores, denominados
"sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe
más abajo en referencia a las clases de aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Las modificaciones substanciales en las
propiedades biológicas de un anticuerpo se consiguen por selección
de las sustituciones que difieren significativamente en su efecto
(a) de mantenimiento de la estructura del esqueleto polipeptídico
en el área de su sustitución, por ejemplo, su conformación en hoja o
hélice, (b) de carga o hidrofobicidad de la molécula en el lugar
diana, o (c) en el conjunto de la cadena lateral. Los residuos de
aminoácidos se dividen en grupos según las propiedades comunes de su
cadena lateral.
(1) hidrofóbico; norlecuina, met, ala, val, leu
ile;
(2) hidrofílico neutro; cys; ser; thr;
(3) acídico; asp, glu,
(4) básico; asn, gln, his, lys, arg;
(5) residuos que influencian la orientación en
cadena: gly, pro; y
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sustituciones no conservadoras suponen el
intercambio de un miembro de una de estas clases por uno de otra
clase.
Cualquier residuo de cisteína no implicado en el
mantenimiento de la conformación propia del anticuerpo también
puede sustituirse, generalmente por serina, para aumentar la
estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir algún
entrecruzamiento aberrante. A la inversa, la inclusión de puentes de
cisteína en el anticuerpo aumenta su estabilidad.
Un tipo particularmente preferido de variante
por sustitución implica la sustitución de uno o más residuos en la
región hipervariable del anticuerpo parental (por ejemplo un
anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, las variantes
resultantes seleccionadas para su desarrollo posterior presentan un
aumento de sus propiedades en relación con el anticuerpo parental
del cual proceden. Una forma conveniente para la generación de
variantes por sustitución implica la maduración por afinidad
mediante la expresión en fagos. Brevemente, algunos lugares de la
región hipervariable (6-7 lugares) se mutan para
generar todas las substituciones posibles de aminoácidos para cada
lugar. Los anticuerpos de longitud completa generados se disponen en
las partículas filamentosas del fago como fusiones con el producto
del gen III del M13 empaquetado en cada partícula. Las variantes de
la expresión en fagos se seleccionan según su actividad biológica
(por ejemplo según su afinidad de unión) tal como se explica aquí.
En relación a la identificación de los lugares candidatos para su
modificación de la región hipervariable, se realiza la mutagénesis
mediante cribado por alaninas para identificar los residuos de la
región hipervariable que contribuyan más significativamente a la
unión con el antígeno. De forma alternativa, o adicional, puede se
beneficioso analizar la estructura cristalina de un complejo de
antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de
contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Los residuos en contacto
y los residuos vecinos son candidatos para las sustituciones, de
acuerdo con las técnicas elaboradas aquí. Una vez se han generado
las variantes, el panel de variantes se somete a cribado y los
anticuerpos con mejores propiedades en uno o más ensayos relevantes
pueden seleccionarse para su ulterior desarrollo.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican
las variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se
preparan mediante diversos procedimientos conocidos en la materia.
Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento
de una fuente natural (en el caso de una variante de secuencia de
aminoácido que ocurre de forma natural) o por preparación mediada
por oligonucleótido (o mutagénesis dirigida, mutagénesis por PCR y
mutagénesis de una variante temprana preparada o de una versión no
variante de un anticuerpo).
Es aconsejable introducir una o más
modificaciones de aminoácidos en la región Fc del anticuerpo de
longitud completa de la invención, por tanto generando una región
variante de Fc. La región variante de Fc comprende una secuencia de
la región humana de Fc (por ejemplo una región Fc de IgG1, IgGG2,
IgG3 o IgG4 humanas) con una modificación aminoacídica (por ejemplo
una sustitución) en una o más posiciones aminoacídicas.
La región variante de Fc puede presentar una
alteración en la afinidad de unión por el receptor neonatal de Fc
(FcRn). Esta variante de la región Fc comprende modificaciones de
aminoácidos en una o más de las posiciones 238, 252, 253, 254, 255,
256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340,
356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 4245,
433, 434, 435, 436, 439 o 447 de la región Fc, con un número de
residuos de la región Fc determinado según el índice EU de Kabat.
Las variantes de la región Fc, pueden de forma alternativa,
presentar un aumento de la unión al FcRn y comprenden una
modificación de aminoácido en una o más de las posiciones
aminoacídicas 238, 256, 265, 272, 286, 303, 307, 311, 312, 317, 340,
356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434 de la región Fc,
con un número de residuos de la región Fc determinado según el
índice EU de Kabat.
La variante de la región Fc con unión reducida a
un Fc\gammaR comprende modificaciones de aminoácidos en una o
más de las posiciones 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269,
270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 322,
3245, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414,
416, 419, 434, 435, 437, 438 y 439 de la región Fc, con el número
de residuos de la región Fc determinado según el índice de EU de
Kabat.
La región variante de Fc puede presentar una
unión reducida a un Fc\gammaRI y comprende modificaciones de
aminoácidos en una o más de las posiciones aminoacídicas 238, 265,
269, 270, 327 o 329 de la región Fc, con el número de residuos de
la región Fc determinado según el índice de EU de Kabat.
La región variante Fc puede presentar una unión
reducida a un FcgRII y comprende modificaciones de aminoácido en
uno o más de la posiciones aminoacídicas 238, 239, 248, 249, 252,
254, 265, 268, 270, 272, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322,
327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 o 437 de
la región Fc con el número de residuos de la región Fc determinado
según el índice de EU de Kabat.
Las variantes de la región Fc con unión alterada
(aumentada o disminuída) al C1q y/o Citotoxicidad Dependiente del
Complemento (CDC) están descritas en la patente internacional
WO99/51642.
Estas variantes comprenden sustituciones de
aminoácidos en una o más de las posiciones aminoacídicas 270, 322,
326, 327, 329, 331 o 334 de la región Fc. Véase también Duncan &
Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente americana
U.S. 5.648.260; Patente americana U.S. 5.624.821; y patente
internacional WO94/29351 concernientes a las variantes de la región
FC.
Se describen también aquí, los inmunoconjugados
que comprenden anticuerpos conjugados con un agente citotóxico como
un agente quimioterapeútico (tal como se definen y describen más
arriba), toxina (por ejemplo una molécula pequeña de toxina o una
toxina enzimáticamente activa de bacteria, hongo o planta de origen
animal, incluidos los fragmentos y/o variantes de éstos) o un
isótopo radioactivo (por ejemplo un radioconjugado).
Se contemplan también aquí, los conjugados de un
anticuerpo y una o más pequeñas moléculas de toxina, como
caliqueamicina, o una maitansina (Patente americana U.s. 5.208.020),
un tricoteno, y CC1065.
El anticuerpo se conjuga con una o más moléculas
de maitansina (de 1 a 10 moléculas de maitansina por molécula de
anticuerpo). La maitansina puede, por ejemplo, convertirse en
May-SS-Me que se reduce a
May-SH3 y reaccionar con un anticuerpo modificado
(Chari y colaboradores, Cancer Research 52: 127-131
(1992)) para generar un inmunoconjugado maitansinoide.
Otro inmunoconjugado de interés comprende un
anticuerpo conjugado a uno o más moléculas de caliqueamicina. La
familia de los antibióticos de la caliqueamicina es capaz de
producir roturas en la doble cadena de ADN en concentraciones
sub-picomolares. Los análogos estructurales de
caliqueamicina que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan
a, \gamma_{1}^{l}, \alpha_{1}^{l}, \alpha_{3}^{l},
N-acetil-\gamma_{1}^{l}, PSAG
y \theta_{1}^{l}, (Hinman y col., Cancer Reserch
53:3336-3342 (1993) y Lode y col., Cancer Research
58:2925-2928 (1998)). Véanse también las Patentes
americanas U.S. 5.714.586; 5.712.374; 5.264.586 y 5.773.001.
Las toxinas activas enzimáticamente y los
fragmentos de éstas que pueden utilizarse incluyen la cadena A de
la difteria, fragmentos activos de no unión de la toxina de la
difteria, cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas
aeruginosa), cadena A de la ricina, cadena A de la abrina,
cadena A de la modequiina, sarcina alfa, proteínas de Aleurites
fordii, proteínas de la diantina, proteínas de la Phytolaca
americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de
la Monordica carantia, curcina, crotina, inhibidor de la
Sapaonaria officinalis , gelonina, mitogelina,
restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos. Véase por
ejemplo la patente internacional WO 93/21232 publicada el 28 de
Octubre de 1993.
Además se contempla la formación de un
inmunoconjugado formado entre el anticuerpo y un compuesto con
actividad nucleolítica (por ejemplo una ribonucleasa o una
endonucleasa de ADN como una desoxiribonucleasa; ADNasa).
Una variedad de isótopos radioactivos se
encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos
radioconjugados. Entre los ejemplos se incluyen At^{211},
I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153},
Bi^{212}, P^{32} y los isótopos radioactivos de Lu.
Los conjugados del anticuerpo y agente
citotóxico pueden obtenerse utilizando una variedad de proteínas
bifuncionales unidas a agentes como el
N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato
(SPDP),
succinimidil-4-N-maleimidometil)
ciclohexano-1-carboxilato,
iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como
dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (como disuccinimidil
suberato), aldehidos (como glutaraldehido), compuesto
bis-azido (como bis
(p-azidobenzoico) hexanodiamina, derivados de
bis-diazonio (como
bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenediamina),
diisocianatos (como tolieno 2,6-diisocianato) y
compuesto bis-activo de fluorina (como
1,5-difloro-2.
4-dinitrobenceno). Por ejemplo una inmunotoxina de
ricina puede prepararse tal como describieron Vitetta y col.,
Science, 238: 1098 (1987). El ácido triaminopentaacético
1-isotiocianatobenzilo-3-metildietileno
marcado con Carbono 14 (MX-DTPA) es un agente
quelante eficaz para la conjugación de radionucleótidos con el
anticuerpo. Véase la patente internacional W094/11026. Se pueden
utilizar elementos conectores del tipo "conector rompible" que
facilitan la liberación del compuesto citotóxico en la célula. Por
ejemplo, conectores ácido-lábiles, conectores
sensibles a las peptidasas, o que contengan dimetilos o disulfuros
(Chari y col., Cancer Research 52: 127-131
(1992)).
Se pueden obtener proteínas de fusión que
incluyan el anticuerpo y un agente citotóxico por técnicas
recombinantes o síntesis de péptidos.
El anticuerpo puede conjugarse con un
"receptor" (como la estreptavidina) para su utilización en
ensayos de pre-direccionamiento tumoral. En estos
ensayos el conjugado del anticuerpo-receptor se
administra al paciente, seguido por la extracción del conjugado
libre de la circulación con un agente quelante y la administración
posterior de un "ligando" (como la avidina) que esté conjugado
con un agente citotóxico (como un radionucleótido).
Además, los anticuerpos y las variantes de los
anticuerpos pueden modificarse para que contengan mitades no
proteicas conocidas en la materia y que son disponibles.
Preferentemente, las mitades adecuadas para la derivatización de
anticuerpos son polímeros solubles en agua. Los ejemplos no
limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se
limitan a, polietilen glicol (PEG), copolímeros o glicol
etilen/propil glicol, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinil
alcohol, polivinil pirrolidona, poli-1,
3-dioxolano,
poli-1,3,6-trioxano,
etileno(maleico anhídrido copolímero, poliaminoácidos (tanto
homopolímeros como copolímeros al azar), y dextran o
poli(n-vinil pirrolidona)polietilen
glicol, propropileno glicol, homopolímeros, copolímeros de óxido de
polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (glicerol),
polivinil alcohol, y mezclas de éstos. El propionaldehido de
polietilen glicol tiene ventajas en su manufactura debido a su
estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso
molecular, y puede estar ramificado o no. El número de polímeros
unidos al anticuerpo puede variar, y puede tratarse de varias
unidades de la misma molécula o de diferentes moléculas. En
general, el número y el tipo de polímero utilizado para la
derivatización puede determinarse en base a consideraciones que
incluyen, pero no se limitan a, las propiedades particulares o
funciones del anticuerpo a mejorar. El derivado del anticuerpo se
utilizará terapéuticamente en condiciones definidas.
En general, el anticuerpo de longitud completa
producido en un sistema de expresión procariota descrito aquí está
no glicosilado y carece de las actividades efectoras de la región
Fc. En ciertas circunstancias, puede ser deseable, al menos
parcialmente, recuperar una o más funciones efectoras del anticuerpo
nativo de longitud completa. En relación con ésto, se contempla un
procedimiento para la recuperación de las funciones efectoras por
unión de las porciones adecuadas a lugares de residuos identificados
en la región Fc de un anticuerpo de longitud completa no
glicosilado. Para este propósito una porción preferida es el PEG,
aunque también se pueden utilizar otros polímeros de carbohidratos.
La unión de PEG se lleva a cabo mediante cualquier reacción
específica de unión de PEG conocida en la materia. Véase por
ejemplo, la patente europea EP0401384; patente europea EP 0154316;
patente internacional WO 98/48837. Primero, se sustituyen los
residuos de cisteína en posiciones identificadas del anticuerpo,
como en las posiciones donde el anticuerpo o las variantes de
anticuerpo estén normalmente glicosilados o aquellas posiciones en
la superficie del anticuerpo. Preferentemente, los residuos de
cisteína se sustituyen en alguna de las posiciones 297, 298, 299,
264, 265 y 239 (numerados según el índice EU determinado según
Kabat). Después de la expresión, la variante del anticuerpo con el
residuo de cisteína sustituido puede tener varias formas de PEG (o
carbohidrato presintetizado) químicamente unido a los residuos
libres de la cisteína.
Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo de
longitud completa se prepararon para el almacenamiento mediante
mezclado del anticuerpo con el grado deseado de pureza con
vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables fisiológicamente
opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol,
A. Ed. (19980)), en la forma de soluciones acuosas, liofilizadas u
otras formulaciones secadas. Los vehículos, excipientes o
estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores a las
dosis y concentraciones utilizadas e incluyen tampones como el
fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes
que incluyen el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (como
el cloruro de amonio octadecildimetilbencil; el cloruro de
hexametonio; el cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio;
fenol, butil o bencil alcohol; alquil parabenos,como el metil o
propil paraben; el catecol; resorcinol; ciclohexanol;
3-pentanol; y m-cresol);
polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a 10 residuos);
proteínas como la seroalbúmina, la gelatina o las inmunoglobulinas;
polímeros hidrofílicos como los disacáridos, y otros carbohidratos
incluyendo la glucosa, manosa, o las dextrinas; agentes quelantes
como el EDTA; azúcares como la sacarosa, manitol, trehalosa o
sorbitol; iones formadores de sales como el sodio; complejos
metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o
tensoactivos no iónicos como el TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM}, o
el polietilén glicol (PEG).
La formulación también puede contener más de un
compuesto activo según sea necesario para la indicación particular
a tratar, preferentemente aquellos con actividades complementarias
que no se afecten adversamente unos con otros. Dichas moléculas se
hallan adecuadamente presentes en combinación con cantidades que son
efectivas para el propósito pretendido.
Los ingredientes activos también pueden estar
atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por
ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y
microcápsulas de poli-(metil-metacrilato),
respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales
(por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones,
nano-partículas y nanocápsulas) o en macroe-
mulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980).
mulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980).
Las formulaciones a utilizar para la
administración in vivo deben ser estériles. Ello se logra
fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración
estériles.
Es posible preparar preparaciones de liberación
sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación
sostenida incluyen las matrices semipermeables de polímeros
hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo de longitud
completa, cuyas matrices tienen formas determinadas, por ejemplo,
películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación
sostenida incluyen los poliestéres, hidrogeles (por ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato),
o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente americana U.S.
3.773.919), copolímeros del ácido L-glutámico y
\gammaetil-L-glutamato, acetato de
etileno no degradable, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico
como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de
copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de
leuprolide), y ácido
poli-D-(-)-3-hidrocibutírico.
Mientras que los polímeros como el etilen-vinil
acetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten una liberación
de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan
proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los
anticuerpos se encapsulan permanecen en el cuerpo durante largo
tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la
exposición a la humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de
actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Es
posible concebir estrategias racionales para la estabilización
dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo
de agregación resulta ser la formación de un enlace
S-S intermolecular a través de un intercambio
tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse
mediante modificación de residuos sulfidrilos, liofilizando las
soluciones acídicas, controlando el contenido de humedad, utilizando
aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices
poliméricas.
Un anticuerpo puede utilizarse, por ejemplo,
para purificar, detectar y reconocer un polipéptido específico,
incluyendo procedimientos diagnósticos y terapéuticos tanto in
vitro como in vivo.
En un aspecto, un anticuerpo puede utilizarse en
inmunoensayos para la cuantificación cualitativa y cuantitativa de
antígenos específicos en muestras biológicas. Los procedimientos
convencionales para la detección de la unión
antígeno-anticuerpo incluyen, por ejemplo, un ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), un radioinmunoensayo
(RIA) o la inmunhistoquímica de tejidos. Muchos procedimientos
pueden utilizar un marcaje unido al anticuerpo para los propósitos
de detección. El marcaje utilizado con el anticuerpo es cualquier
funcionalidad detectable que no interfiera con su unión con el
anticuerpo. Se conocen numerosos marcajes, incluyendo los
radioisótopos P32, S32, C14, I125, H3 e I131, fluoróforos como los
quelatos térreos raros o la fluoresceína y sus derivados, rodamina
y sus derivados, dansil, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, la
luciferasa de la luciérnaga y la luciferasa bacteriana (patente
americana U.S. 4.737.456), luciferina,
2,3-dihidroftalazinedionas, peroxidasas de rábano
(HRP), fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa,
glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, la
glucosa oxidasa, la galactosa oxidasa y la
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
las oxidasas heterocíclicas como la uricasa y la oxidasa de xantina,
lactoperoxidasa, biotina/avidina, marcadores spin, marcadreos de
bacteriófagos, radicales libres estables, radionúclidos para
análisis por la imagen (como el Tecnecio) y similares.
Procedimientos convencionales están disponibles
para unir estos marcajes de forma covalente a los polipéptidos de
anticuerpo. Por ejemplo, agentes acoplantes como los dialdehidos,
carbodiimidas, dimaleimidas, bis-imidatos,
bis-diazotizado bencindina, y similares, pueden
utilizarse para etiquetar los anticuerpos con el fluorescente,
quimioluminiscente y marcajes enzimáticos descritos anteriormente.
Véase por ejemplo, la patente americana U.S. 3.90.475
(fluorimetría) y la patente americana U.S. 3.645.090 (enzimas);
Hunter y col., Nature 144: 945 (1962); David y col., Biochemistry
13:1014-1021 (1974; Pain y col., Immunol. Methods
40:219-230 (1981); y Nygren Histochem. And
Cytochem. 30:407-412 (1982). Los marcajes preferidos
aquí son los enzimáticos como la peroxidasa de rábano y la
fosfatasa alcalina. La conjugación de dicho marcaje, incluyendo las
enzimas, con el polipéptido del anticuerpo es un proceso de
manipulación estándar para un experto en técnicas de inmunoensayo.
Véase por ejemplo, O'Sullivan y col., "Methods for the preparation
of enzyme-antibody conjugates for uses in enzyme
immunoassay", en Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone y H. Van
Vunakid, vol 73 (Academic Press, New York, N.Y., 1981), pp.
147-166. Dichos procedimientos de unión son
adecuados para utilizar con los polipéptidos de anticuerpo de la
presente invención.
Un procedimiento alternativo al marcaje del
anticuerpo consiste en analizar el antígeno en fluidos biológicos
mediante un inmunoensayo de competición con un antígeno estándar
competidor marcado con una sustancia detectable y un anticuerpo no
marcado. En este ensayo, la muestra biológica, los estándares de
antígeno marcados y el anticuerpo se combinan y se determina la
cantidad de antígeno estándar marcado unido al anticuerpo no
marcado. La cantidad del antígeno analizado en la muestra biológica
es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno estándar
unido al anticuerpo.
En un aspecto, el anticuerpo de longitud
completa no glicosilado es de especial utilidad para detectar y
determinar los patrones de expresión de antígenos de superficie
específicos in vitro o in vivo. Tal como se describió
anteriormente, el anticuerpo de longitud completa no glicosilado no
ejerce funciones efectoras (es decir, actividad ADCC o CDC). En
consecuencia, cuando el anticuerpo se une a una superficie celular,
no se iniciarán eventos citotóxicos no deseables. El antígeno de
superficie puede ser específico para una célula o tipo tisular
determinado, y por ello puede utilizarse como un marcador de la
célula o tipo de tejido. Preferiblemente, el marcador de antígeno
de superficie se expresa diferencialmente en estadios diversos de
diferenciación de células o tipos de tejidos particulares. El
anticuerpo de longitud completa dirigido contra dicho antígeno de
superficie puede utilizarse para el cribado y aislamiento de células
madres como las células madre embrionarias, las células madre
hematopoyéticas y las células madres mesenquimáticas. El anticuerpo
puede utilizarse para detectar células tumorales que expresan
antígenos de superficie asociados con el tumor como los receptores
HER2, HER3 o HER4.
Un anticuerpo de longitud completa puede
utilizarse como un agente de purificación por afinidad. En este
proceso, el anticuerpo de longitud completa se inmoviliza sobre una
fase sólida como una resina de Sephadex o un papel de filtro,
utilizando procedimientos bien conocidos en la materia. El
anticuerpo inmovilizado se contacta con una muestra que contiene el
antígeno a purificar, y a continuación se lava el soporte con un
solvente adecuado que eliminará todo el material en la muestra
excepto el antígeno a purificar, que estará unido al anticuerpo de
longitud completa inmovilizado. Por último, el soporte se lava con
otro solvente adecuado, como el tampón glicina, pH 5,0, que
liberará el antígeno del anticuerpo de longitud completa.
Los anticuerpos pueden utilizarse como un
antagonista para bloquear parcial o totalmente la actividad de
antígeno específica tanto in vitro como in vivo.
Además, al menos algunos anticuerpos pueden neutralizar la
actividad del antígeno de otras especies. De acuerdo con ello, los
anticuerpos pueden utilizarse para inhibir una actividad de
antígeno específica, por ejemplo, en un cultivo celular de otras
especies. Según ello, los anticuerpos pueden utilizarse para
inhibir el antígeno con el cual reacciona de forma cruzada un
anticuerpo (por ejemplo chimpancés, babunes, marmoset, cinomolgus y
rhesus, cerdos o ratones). En otra realización, el anticuerpo puede
utilizarse para inhibir las actividades antigénicas mediante
contacto del anticuerpo con el antígeno de modo que se inhibe la
actividad antigénica. Preferiblemente, el antígeno es una molécula
proteica humana.
Un anticuerpo puede utilizarse en un
procedimiento para inhibir un antígeno en un individuo que padece
un trastorno en el cual el antígeno es perjudicial. Dicho
procedimiento comprende la administración al individuo de un
anticuerpo de la invención de modo que se inhibe la actividad
antigénica en el sujeto. Preferiblemente, el antígeno es una
molécula proteica humana y el sujeto es un humano. Alternativamente,
el sujeto puede ser un mamífero que expresa el antígeno con el que
se une un anticuerpo de la invención. Además, el sujeto puede ser
un mamífero en el que se ha introducido el antígeno (por ejemplo,
mediante la administración del antígeno o mediante la expresión de
un transgén del antígeno). Un anticuerpo puede administrarse a un
individuo humano con propósitos terapéuticos. Además, un anticuerpo
puede administrarse a un mamífero no humano que expresa un antígeno
con el que reaccionar de forma cruzada el anticuerpo (por ejemplo un
primate, cerdo o ratón) con propósitos de índole veterinaria o como
un modelo animal de enfermedad humana. Respecto a lo último, dichos
modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia
terapéutica de anticuerpos (por ejemplo, evaluando las
dosificaciones y tiempos de administración). Los anticuerpos
bloqueantes que son de utilidad terapéutica incluyen, por ejemplo
aunque no por ello se limitan a los mismos,
anti-VEGF, anti-IgE,
anti-CD 11 y anticuerpos
anti-factor tisular. Los anticuerpos pueden
utilizarse para diagnosticar, tratar, inhibir o prevenir
enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con la expresión
anormal y o la actividad de una o más moléculas de antígeno,
incluyendo pero sin limitarse a tumores benignos y malignos, tumores
no leucémicos o linfomas, trastornos neuronales, gliales,
astrocitales, hipotalámicos y otros glandulares, macrofagales,
epiteliales, estromales y blastocelíacos y trastornos
inflamatorios, angiogénicos e inmunogénicos.
En un aspecto, el anticuerpo bloqueante es
específico de un antígeno del ligando, e inhibe la actividad
antigénica mediante bloqueo o interferencia con la interacción
ligando-receptor implicando el antígeno del
ligando, e inhibiendo por ello la vía de señalización
correspondiente y otros eventos moleculares o celulares. Se
describen también los anticuerpos específicos de receptor que no
impiden necesariamente la unión del ligando pero interfieren con la
activación del receptor, con lo que inhiben cualquier respuesta que
normalmente se iniciaría por la unión del ligando. Los anticuerpos
que se unen preferible o exclusivamente con los complejos
ligando-receptor se describen aquí. El anticuerpo
también puede actuar como un agonista o un receptor del antígeno, y
en consecuencia potenciando, incrementando o activando de forma
parcial o total las actividades de la activación del receptor
mediada por ligando.
Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo
conjugado con un agente citotóxico puede administrarse al paciente.
Preferentemente, el inmunoconjugado y/o el antígeno al cual se une
se internaliza por la célula, lo que resulta en un aumento de la
eficacia terapéutica del inmunoconjugado para eliminar la célula
diana a la cual se une. El agente citotóxico puede estar dirigido o
interferir con el ácido nucleico en la célula diana. Ejemplos de
dichos agentes citotóxicos incluyen cualquiera de los agentes
quimioterapéuticos citados aquí (como un maytansinoide o una
caliqueamicina), un isótopo radioactivo, o una ribonucleasa o una
endonucleasa de ADN.
Los anticuerpos pueden utilizarse sólos o en
combinación con otras composiciones en una terapia. Por ejemplo, el
anticuerpo puede co-administrarse con otro
anticuerpo, agente(s) quimioterapéutico(s) (incluyendo
cócteles de agentes quimioterapéuticos), otros agente(s)
citotóxico(s), agente(s)
anti-angiogénico(s), citoquinas, y/o agentes
inhibidores del crecimiento. Si el anticuerpo de longitud completa
inhibe el crecimiento tumoral, puede ser deseable combinar el
anticuerpo de longitud completa con uno o más agente(s)
terapéutico(s) que también inhiben el crecimiento tumoral.
Por ejemplo, los anticuerpos anti-VEGF que bloquean
las actividades VEGF pueden combinarse con anticuerpos
anti-ErbB (por ejemplo, anticuerpo
anti-HER2 HERCEPTIN®) en un tratamiento del cáncer
de mama metastático. Alternativamente, o adicionalmente, el paciente
puede recibir terapia de radiación combinada (por ejemplo,
irradiación de rayo externo o terapia con un agente marcado
radioactivamente, como un anticuerpo). Dichas terapias combinadas
citadas anteriormente incluyen la administración por separado, en
cuyo caso, la administración del anticuerpo de longitud completa
puede tener lugar antes de, y/o a continuación, de la
administración de la terapia o terapias adjuntas.
El anticuerpo de longitud completa (y el agente
terapéutico adjunto) se administra por vías adecuadas, incluyendo
la parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e
intranasal, y si se desea para el tratamiento local, por
administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen
la administración por vía intramuscular, intravenosa,
intraarterial, intraperitoneal o subucutánea. Además, el anticuerpo
de longitud completa se administra de forma adecuada por infusión
de pulsos, en particular con dosis decrecientes del anticuerpo.
Preferiblemente, la dosis se proporciona mediante inyecciones, más
preferiblemente mediante inyecciones intravenosas o subcutáneas,
dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.
La composición del anticuerpo de longitud
completa se formulará, dosificará y administrará de forma
consistente con la buena práctica médica. Los factores para
considerar en este contexto incluyen el trastorno particular a
tratar, el mamífero particular a tratar, la condición clínica del
paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de liberación
del agente, el procedimiento de administración, el programa de
administración y otros factores conocidos por los clínicos. El
anticuerpo de longitud completa no necesita ser formulado, aunque
opcionalmente sí lo sea, junto con uno o más agentes normalmente
utilizados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La
cantidad efectiva de dichos otros agentes depende de la cantidad del
anticuerpo de longitud completa presente en la formulación, del
tipo de trastorno o tratamiento, y de otros factores citados
anteriormente. Estos son generalmente utilizados en las mismas dosis
y por las mismas vías de administración que las utilizadas aquí o
aproximadamente del 1 al 99% de las dosis utilizadas hasta este
momento.
Para la prevención o el tratamiento de la
enfermedad, la dosificación adecuada del anticuerpo de longitud
completa (cuando se utiliza sólo o en combinación con otros agentes
como los agentes quimioterapéuticos) dependerá del tipo de
enfermedad a tratar, del tipo de anticuerpo, de la gravedad y de la
evolución de la enfermedad, si el anticuerpo de longitud completa
se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia
previa, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al
anticuerpo de longitud completa, así como del criterio del médico
responsable. Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad,
aproximadamente 1 \mug/kg a 5 mg/Kg (por ejemplo, 0,1
mg/Kg-10 mg/Kg) de anticuerpo es una dosis candidata
inicial para la administración al paciente, si, por ejemplo,
mediante uno o más administraciones separadas, o mediante infusión
continua. Una dosis diaria inicial puede hallarse en el intervalo
de aproximadamente 1 \mug/Kg a 100 mg/Kg o más, dependiendo de
los factores mencionados anteriormente. Para administraciones
repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición,
el tratamiento se prolonga hasta que ocurra una supresión deseada de
los síntomas de la enfermedad. La dosis preferida del anticuerpo se
hallará en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/Kg a 10 mg/Kg.
Por ello, uno o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/Kg, 2,0 mg/Kg,
4,0 mg/Kg o 10 mg/Kg (o cualquier combinación de lo mismo) puede
administrarse al paciente. Dichas dosis pueden administrarse
intermitentemente, por ejemplo, cada semana o incluso cada tres
semanas (por ejemplo, de manera que el paciente reciba de 2 a 20
dosis, por ejemplo 6 dosis del anticuerpo). Puede administrarse una
dosis de carga elevada inicial, seguida de una o más dosis
inferiores. Un ejemplo de régimen de dosificación comprende la
administración de una dosis de carga inicial de aproximadamente 4
mg/Kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de
aproximadamente 2 mg/Kg del anticuerpo. Sin embargo, otros
regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta
terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos
convencionales.
Se proporciona un artículo de fabricación que
contiene los materiales útiles para el tratamiento de los
trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación
comprende un recipiente y una etiqueta o un prospecto incluido en
el paquete sobre o asociada con el contenido. Recipientes adecuados
incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los
recipientes pueden estar formados de diversos materiales como el
vidrio o el plástico. El recipiente contiene una composición que es
eficaz para el tratamiento de la condición y puede tener un puerto
de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de
solución intravenosa o un vial que tenga un tapón agujereable por
una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en
la composición es un anticuerpo de longitud completa de la
invención. La etiqueta o el prospecto indican que la composición se
utilice para el tratamiento de la condición de elección como por
ejemplo el cáncer. Además, el artículo de fabricación puede
comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida
en éste, en donde la composición comprende un anticuerpo de longitud
completa; y (b) un segundo recipiente con una composición en su
interior, en donde la composición comprende otro agente citotóxico.
El artículo de fabricación puede además comprender un prospecto en
el paquete que indique que las composiciones del primer y segundo
anticuerpo pueden utilizarse para tratar el cáncer. Alternativa o
adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además
un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón
farmacéuticamente aceptable, como el agua bacteriostática para
inyección (BWF), tampón fosfato salino, solución de Ringer y
solución de dextrosa. Pueden estar incluidos otros materiales
deseables desde un punto de vista comercial o del usuario,
incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos siguientes son únicamente para
ilustrar la práctica de la presente invención y no con ánimo de
limitación.
Diversos vectores de expresión se generaron para
la expresión de anticuerpos específicos contra el factor tisular
(anticuerpo anti-TF) y anticuerpos específicos
contra el factor de crecimiento celular endotelial vascular
(anticuerpo anti-VEGF). Para cada construcción de
vector, se clonó un casete de expresión en la misma pauta de
lectura del plásmido pBR322 de E. coli en la diana de
restricción EcoRI. Sutcliffe (1978) Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol. 43:77-90. Cada casete de expresión contiene al
menos los siguientes componentes: (1) un promotor phoA para el
control de transcripción; (2) una secuencia de
Shine-Dalgarno del gen trp de E. coli o del
gen de la enterotoxina II estable al calor (STII), o una combinación
de ambos, para el inicio de traducción; y (3) un terminador
\lambdat0 para finalizar la transcripción. Los componentes básicos
de los casetes de expresión bacterianos son conocidos en la materia
y se han descrito por ejemplo en Kikuchi y col., Nucleic Acids
Res. 9(21):567-5678 (1981) (para el promotor
phoA); Schltissek y Grosse, Nucleic Acids Res. 15:3185 (1987) (para
el terminador \lambdat0); Yanofsky y col., Nucleic Acids Res.
9:6647-6668 (1981) (pra trp); Picken y col.,
Infect. Immun. 42:269-275 (1983) para STII); y Chang
y col., Gene 55:189-196 (1987) (para la utilización
combinada de trp y la secuencia de Shine-Dalgarno de
STII). Adicionalmente, las secuencia señal de STII o las variantes
de codón silente de lo mismo preceden la secuencia codificante para
la cadena ligera o la pesada y dirigen la secreción del polipéptido
en el periplasma. Picken y col., Infect. Immun.
42:269-275 (1983); Simmons y Yansura, Nature
Biotechnology 14:629-634 (1996).
Con el fin de ilustrar las propiedades
aumentadas de los sistemas de cistrones independientes de la
presente invención, diversos vectores policistrónicos para
anticuerpos de longitud completa se construyeron para su
comparación. En un vector policistrónico, los dos cistrones para los
genes de cadena ligera y pesada se hallan bajo el control
transcripcional de un solo promotor Phoa.
El vector policistrónico inicial para la
expresión del anticuerpo anti-TF, pxTFPV, se
construyó utilizando el casete de expresión de un vector publicado
con anterioridad, pAK19, que era para la expresión de un fragmento
Fab' de anticuerpo. Carter y col., (1992) Bio/Technology
10:12-16. La estructura del pAK19 original y la
construcción de la versión completa pxTFPV se muestran en la Figura
1. El casete de expresión contiene, desde el extremo 5' al 3', un
promotor PhoA, el cistrón para la cadena ligera, el cistrón para la
cadena pesada y un terminador de la transcripción \lambdat0. La
distancia entre el codón de parada de la cadena ligera y el de
inicio de la secuencia señal de STII precediendo la cadena pesada
es de 81 pares de bases. Para construir un vector policistrónico
anti-VEGF, las secuencias señal para las cadenas
ligera y pesada de anti-VEGF se sustituyeron por
las secuencias codificantes de las cadenas ligera y pesada de
anti-TF en pxTFPV. El casete de expresión
anti-VEGF se modificó posteriormente mediante
deleción del fragmento HindIII de ^{\sim}50 pb cadena arriba del
promotor PhoA y los cambios de varios nucleótidos también se
hicieron en la región no traducida cadena arriba de la secuencia de
Shine-Dalgarno de la cadena pesada. El vector
policistrónico resultante para anti-VEGF se
denominó pY0317.Fab_CH3.
Diversas construcciones anti-TF
policistrónicas adicionales, paTF20, paTF30, paTF40, paTF90,
paTF110,
paTF100, paTF120, se realizaron de forma similar. Las secuencias del casete de expresión de estos plásmidos policistrónicos difieren de los de pxTFV principalmente en la región 5' no traducida y en la región precedente a la secuencia señal para la cadena pesada. Adicionalmente, y dependiendo de la construcción, también existen diferencias de los codones silentes en la secuencia señal STII entre pxTFV y algunos de los plásmidos policistrónicos adicionales. Simmons y Yansura, Nature Biotechnology, 14:629-634 (1996).
paTF100, paTF120, se realizaron de forma similar. Las secuencias del casete de expresión de estos plásmidos policistrónicos difieren de los de pxTFV principalmente en la región 5' no traducida y en la región precedente a la secuencia señal para la cadena pesada. Adicionalmente, y dependiendo de la construcción, también existen diferencias de los codones silentes en la secuencia señal STII entre pxTFV y algunos de los plásmidos policistrónicos adicionales. Simmons y Yansura, Nature Biotechnology, 14:629-634 (1996).
Para la práctica de la presente invención, se
diseñaron vectores con cistrones independientes para proporcionar
una expresión independiente de los genes de cadena ligera y pesada
de inmunoglobulinas. En dichos vectores, la unidad de cistrón para
cada cadena se halla bajo el control de su propio promotor PhoA y se
prosigue de un terminador \lambdat0. Además, cada unidad de
cistrón comprende una TIR cadena arriba de la secuencia codificante
para la cadena ligera o pesada. La construcción de un vector de
cistrones independientes se ilustra en la Figura 7. El casete de
expresión comprende, desde el extremo 5' al 3', un primer promotro
PhoA seguido del cistrón para la cadena ligera
(TIR-L+cadena ligera) y el terminador \lambdat0, y
un segundo promotor PhoA seguido del cistrón para la cadena pesada
(TIR-H+cadena pesada) y el segundo terminador
\lambdat0. Tanto TIR-L como TIR-H
contienen una señal de secreción STII o su variante. Las secuencias
del casete de expresión de paTF50 (para anti-TF;
SEC ID NO:1) y pxVG2AP11 (para anti-VEGF: SEC ID
NO:2) se proporcionan en las Figuras 20 y 21, respectivamente.
Vectores de cistrones independientes adicionales para
anti-TF, paTF70, paTF60, paTF80, paTF140 y
pxTF2AP77 representan diversas combinaciones de intensidad TIR para
las traducciones de cadena ligera y pesada y difieren de un paTF50
respecto a los cambios de los codones silentes en la secuencia
señal STII, tal como se describió anteriormente. Simmons y Yansura,
Nature Biotechnology, 14:629-634 (1996).
Los anticuerpos de longitud completa se
generaron en primer lugar con vectores policistrónicos derivados de
un vector publicado, pAK19, de acuerdo con los procedimientos
descritos en el Ejemplo 1. En primer lugar se realizaron
inducciones a pequeña escala para comparar y evaluar los niveles de
expresión con las diversas construcciones.
Para la expresión a pequeña escala de cada
construcción, la cepa de E. coli 33D3
(W3110.fhuA(.tonA)ptr3 lac lq
lacL8.ompT.(nmpc-fepE)degP41 kanR) se
utilizó como célula huésped. Después de la transformación, se
inocularon transformantes seleccionados en 5 ml de medio
Luria-Bertani suplementado con carbenicilina (50
\mug/ml) y se crecieron a 30ºC en un cultivo en agitación durante
toda la noche. Cada cultivo se diluyó a continuación (1:50 o 1:100)
en un medio limitante de fosfato C.R.A.P. (3,57 g (NH4)2SO4,
0,71 g de NaCitrato-2H2O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de
Extracto de levadura (certidicado), 5,36
Hycasse-Sheffield, ajustado a pH con KOH de 7,3, y
se añadieron 872 ml de H2O SQ y se autoclavó; se enfrió a 55ºC y se
suplementó con 110 ml de MOPS pH 7,3, 11 ml de glucosa al 50%, 7 ml
de 1M MgSO4). A continuación se añadió la carbenicilina al cultivo
de inducción a una concentración de 50 \mug/ml y se creció
durante aproximadamente 24 horas a 30ºC en un cultivo giratorio.
Salvo que se indique lo contrario, todas las inducciones del frasco
de agitación se realizaron en un volumen de 2 ml.
Se prepararon lisados celulares de células
completas no reducidos de cultivos inducidos de la manera
siguiente: (1) se centrifugaron los sedimentos a DO_{600} de 1 en
un tubo de microcentrifugación; (2) cada sedimento se resuspendió
en 90 ml de TE (10 mM Tris pH 7,6, 1 mM EDTA); (3) 10 \mul de
ácido yodoacético 100 mM (Sigam I-12512) se
añadieron a cada muestra para bloquear cualquier cisteína libre y
prevenir el arrastre de disulfuros; (4) se añadieron 20 \mul de
SDS al 10% a cada muestra. Las muestras se mezclaron por agitación,
se calentaron a aproximadamente 90ºC durante 3 minutos y luego se
volvieron a mezclar por agitación. Después de enfriar las muestras
a temperatura ambiente, se añadieron
^{\sim}750-1000 \mul de acetona al precipitado
de proteína. Las muestras se mezclaron por agitación y se dejaron a
temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos. Después de
la centrifugación durante 5 minutos en una microcentrífuga, se
aspiró el sobrenadante de cada muestra se resuspendió el sedimento
de cada proteína en 50 \mul de dH2O + 50 \mul de tampón de
muestra NOVEX. Las muestras se calentaron durante unos
3-5 minutos a 90ºC, se mezclaron bien por agitación
y se enfriaron a temperatura ambiente. Se realizó una última
centrifugación de 5 minutos y los sobrenadantes se transfirieron a
tubos limpios.
Las muestras reducidas se prepararon mediante
las etapas similares siguientes descritas más arriba para muestras
no reducidas, excepto que se añadieron 10 \mul de 1M DTT a la
solución de resuspensión celular en el paso (2) y se omitió la
adición de IAA en el (3). El agente reductor se añadió también a una
concentración de 100 mM cuando el precipitado proteico se
resuspendió en tampón de muestra 2X +H2O.
Después de la preparación, se cargaron de
5-10 \mul de cada muestra en un pocillo de 10, 1,0
mm NOVEX fabricado al 12% con Tris-Glicina
SDS-PAG y se realizó una electroforesis a
aproximadamente 120 V durante 1,5-2 horas. Los
geles resultantes se tiñeron con azul de Coomassie o se utilizaron
para análisis por transferencia de western.
Para el análisis de transferencia de western,
los geles de SDS-PAGE se electrotransfirieron en una
membrana de nitrocelulosa (NOVEX). La membrana se bloqueó a
continuación con una solución de 1XNET (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50
mM Tris pH 7,4, 0,05% de Triton-X100) + gelatina la
5% durante aproximadamente 30 min. Se agitaron mediante rotación
durante 1 h a temperatura ambiente. Después de la etapa bloqueante,
la membrana se colocó en una solución de 1X NET + gelatina al 0,5%
+ anticuerpo anti-FAb (fracción de IgG de cabra
conjugada con peroxidasa contra IgG Fab humana; CAPPEL #55223). La
dilución del anticuerpo anti-Fab se halló en el
intervalo de 1:50.000 a 1:1.000.000 dependiendo del lote del
anticuerpo. La membrana se dejó en la solución del anticuerpo toda
la noche a temperatura ambiente en agitación rotatoria. A la mañana
siguiente, la membrana se lavó un mínimo de 3x10 minuto en 1XNET +
gelatina al 0,5% y luego durante 1x15 minutos en TBS (20 mM Tris pH
7,5, 500 mM NaCl). Las bandas de proteína unidas por el anticuerpo
anti-Fab se visualizaron utilizando la detección
con ECL de Amersham Pharmacia Biotech y exposición de la membrana a
una película de rayos X.
Algunas de las bandas de proteína expresadas se
sometieron posteriormente al análisis de secuencia
N-terminal en el cual, después de una electroforesis
SDS-PAGE, las muestras de los cultivos inducidos se
electrotransfirieron a una membrana de PVDF (Matsudaira, J. Biol.
Chem. 262:10035-10038 (1987)). Se secuenciaron las
bandas de PVDF adecuadas con un secuenciador de Applied Biosystems
(Foster City, CA) 494HT o 494cLC conectado a un analizador PTH
(Henzel y col., Methods: A Companion to Methods Enzymol.
6:239-247 (1994)).
Los plásmidos policistrónicos para el anticuerpo
anti-TF (pxTFPV) y el anticuerpo
anti-VEGF (pY0317.Fab_CH3) se construyeron, se
transformaron en la cepa 33D3 y se indujeron tal como se describió
en el Ejemplo 1 y en los Materiales y Métodos. Las muestras de
lisado celular completo no reducidas se prepararon y analizaron
mediante transferencia de western. Los resultados se muestran en la
Figura 2. Tal como indica la flecha, una pequeña cantidad del
anticuerpo plegado correctamente y de longitud completa se observó
para el anticuerpo anti-TF (carril 2), y
esencialmente no se detectó ninguna banda de longitud completa en la
muestra de anticuerpo anti-VEGF (carril 3). Las
muestras reducidas se prepararon a continuación, separadas por
SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF.
Las bandas de proteína para los anticuerpos anti-TF
y anti-VEGF se cortaron y sometieron a un análisis
aminoacídico N-terminal. Los resultados demostraron
una mezcla de proteína madura procesada y proteína precursora no
procesada (en la que la secuencia señal de secreción no se cortó)
para ambas construcciones. Por consiguiente, los vectores
policistrónicos pcTFPV y pY0317.Fab_CH3 no pudieron dirigir una
secreción significativa y ensamblar los anticuerpos
anti-TF y anti-VEGF de longitud
completa.
Para dirigir el problema de la secreción
ineficiente, se generaron vectores policistrónicos adicionales con
combinaciones de intensidad TIR moduladas para la cadena ligera y
pesada, tal como se ilustra en la Figura 3. El propósito de este
experimento fue determinar los niveles de traducción que podrían
lograr una mejor secreción de las cadenas ligera y pesada. Las
combinaciones distintas de fuerzas TIR también podrían ser
utilizadas para determinar el cociente de expresión preferida de
cadena ligera respecto a pesada para una acumulación máxima de
anticuerpo de longitud completa. Todas las construcciones se
diseñaron y construyeron de acuerdo con las enseñanzas del Ejemplo
1. Las siguientes construcciones se realizaron con combinaciones de
intensidad TIR diversas: paTF20 (1-cadena ligera,
1-cadena pesada), paTF30 (3- ligera,
1-pesada), paTF40 (1-ligera,
3-pesada), paTF90 (3-ligera,
3-pesada), paTF100 (3-ligera,
7-pesada), paTF110 (7-ligera,
3-pesada), paTF120(7-ligera,
7-pesada). Los números en los paréntesis representan
la fuerza relativa TIR para la cadena pesada y ligera, tal como se
describe en Simmons y col., Nature Biotechnol.
14:629-634 (1996), y en la patente americana U.S.
5.840.530.
Los resultados de la transferencia de western de
los productos de expresión con vectores policistrónicos con
diversas combinaciones de intensidad TIR se muestran en la Figura 4.
En la Fig. 4A se muestran las muestras en condiciones reducidas en
las cuales las cadenas ligeras y pesadas estás separadas. Y en 4B,
se muestran las muestras en condiciones no reducidas en las que los
enlaces disulfuro permanecen intactos. Las muestras reducidas
muestran claramente un amplio exceso de cadena ligera sobre cadena
pesada en todas las combinaciones de TIR, incluso considerando que
la cadena ligera es más fácilmente detectable que la cadena pesada
utilizando este anticuerpo anti-Fab (Figura 4A). En
la combinación de intensidad TIR mayor (paTF120
(7-ligera, 7-pesada)), una cantidad
pequeña de cadena ligera no procesada se empezó a acumular, lo que
indicaba que la secreción se bloqueara. La transferencia de western
no reducido muestra la acumulación del anticuerpo de longitud
completa junto con formas intermedias (Figura 4B). El nivel máximo
de anticuerpo de longitud completa se logró con paTF40
(1-ligera, 3-pesada) seguido por
paTF100 (3-ligera, 7-pesada). Ambas
construcciones tienen unos cocientes de expresión de cadena ligera
respecto a pesada relativamente inferiores tal como se muestra en la
Figura 4A, lo que sugiere que el nivel del anticuerpo de longitud
completa se correlaciona con los niveles de expresión relativos de
cadenas ligera y pesada.
\vskip1.000000\baselineskip
Para construir los vectores de cistrones
independientes con combinaciones TIR moduladas, una intensidad TIR
preferida para la secreción de cada cadena individual se determinó
en primer lugar en una serie de plásmidos de un sólo cistrón
construidos para expresar únicamente la cadena ligera o la pesada
(Figura 5). Una serie de plásmidos de un sólo cistrón con TIRs
diversos se construyó para la expresión individual de las cadenas
ligera y pesada anti-TF. Los materiales y métodos
utilizados para la construcción del vector y la expresión de la
proteína fueron similares a los utilizados por las expresiones de
vectores policistrónicos, que se habían descrito en los Ejemplos 1
y 2 anteriores.
El rango de fuerzas TIR analizadas se extendió
desde una fuerza relativa de 1 a una máxima de 13. Los lisados de
células completas reducidos de los cultivos reducidos transformados
con estos plásmidos construidos se analizaron mediante
SDS-PAGE y los resultados se muestran en la Fig. 6.
Los niveles de proteína secretada, tanto para la cadena ligera como
la pesada, disminuyeron cuando la fuerza relativa TIR fue de 13.
Cuando se utilizó una fuerza relativa TIR de 13 para la expresión
de cadena ligera, el nivel de proteína madura permaneció constante;
sin embargo, el material precursor empezó a acumularse utilizando
esta construcción. Este resultado sugirió que para la expresión
individual de la cadena ligera como de la pesada, la TIR más
preferido es de 7. Mediante análisis aminoacídico
N-terminal se confirmó que utilizando una TIR de 7
las bandas de proteína de cadena ligera y pesada producidas
correspondían con la forma proteica de la proteína madura y
procesada.
Una vez determinados los TIR más preferidos para
cada cadena de anticuerpo individual, la siguiente etapa implicó
reunir los dos cistrones en un plásmido. Las dos construcciones con
la TIR de 7 se combinaron de modo que la expresión de cada gen se
mantuvo bajo el control de su propio promotor PhoA (Fig. 7). Después
de la transformación y la inducción, el lisado celular de células
completas reducido a partir de la expresión del plásmido
(pxTF2AP77) se preparó y analizó mediante SDS-PAGE
(Fig. 8). Se detectaron 4 bandas relacionadas con el anticuerpo
mediante tinción de Coomassie. Mediante análisis aminoacídico
N-terminal, se demostró que estas bandas de
proteína demostraron correspondían con la forma precursora y la
madura de ambas cadenas, la ligera y la pesada. En consecuencia,
aunque la intensidad TIR preferida puede haberse determinado para
cada cadena individual, cuando dos cistrones, mantenidos bajo el
control de promotores separados, se combinaron en un en una sola
construcción, la co-expresión simultánea de ambas
cadenas resultó en una secreción de proteína insuficiente. Este
resultado sugirió que la combinación TIR más preferida debería
determinarse simultáneamente alterando los TIRs individuales para
las cadenas ligera y pesada en el contexto de una construcción de
cistrones independientes.
Se prepararon construcciones nuevas para
determinar las combinaciones de intensidad TIR para la cadena
ligera y la pesada en el contexto de un sistema de cistrones
independientes. Las series TIR se muestran en la Figura 9 paralelas
a las series policistrónicas e incluyen paTF50
(1-ligera, 1-pesada), paTF70
(3-ligera, 1-pesada),
paTF60(1-ligera, 3-pesad),
paTF80 (3-ligera, 3-pesada), paTF
(7-ligera, 3-pesada), paTF140
(3-ligera, 7-pesada), y pxTF2AP77
(7-ligera, 7-pesada). Todas las
inducciones de expresión (2 ml) se llevaron a cabo en la cepa 33D3.
Se tomaron muestras para su separación por SDS-PAGE
y los resultados de la transferencia de Western se muestran en la
Figura 10. Las muestras reducidas (Figura 10A) muestran incluso una
mejor distribución de cadenas ligera y pesada comparadas con los
resultados de los vectores policistrónicos. Con paTF80
(3-ligera, 3-pesada) y paTF140
(3-ligera, 7-pesada) se acumula un
nivel menor de precursor de cadena ligera, mientras que cantidades
significativas de precursor de cadena ligera y pesada son obvias
para paTF130 (7-ligera, 3-pesada) y
pxTF2AP77 (7-ligera, 7-pesada). Las
muestras no reducidas revelaron niveles de anticuerpo de longitud
completa junto con especies determinadas (Figura 10B). La
acumulación de anticuerpo de longitud completa junto con especies
intermedias (Figura 10 B). La acumulación mayor del anticuerpo de
longitud completa tiene lugar con paTF50 (1-ligera,
1-pesada), y como los niveles de traducción aumentan
lentamente hasta paTF80(3-ligera,
3-pesada), los niveles de especies intermedias
suben drásticamente. Las dos construcciones con cantidades grandes
de cadena ligera y pesada no procesada (paTF130 y pxTF2AP77)
muestran un aumento agudo en los niveles de anticuerpo de longitud
completa así como de especies intermedias. En consecuencia, los
resultados sugieren que para el anticuerpo de longitud completa
anti-TF, la combinación TIR más preferida es
(1-ligera, 1-pesada), tal como se
representó por el plásmido TF50.
Con el fin de representar el rendimiento elevado
del anticuerpo de longitud completa por el sistema de cistrones
independientes, las expresiones que utilizan las construcciones
policistrónicas (paTF20 (1-ligra,
1-pesada), paTF-30
(3-ligara, 1-pesada) y un paTF40
(1-ligera, 3-pesada)) y las
construcciones de cistrones independientes (paTF50
(1-pesada, 1-ligera), paTF60
(1-ligera, 3-pesada), paTF70
(3-ligera, 1-pesada) y
paRF80(3-ligera, 3-pesada))
se compararon una con otra. Las muestras no reducidas mostraron
claramente un nivel mayor de producción del anticuerpo de longitud
completa y de especies intermedias con el sistema de cistrones
independientes (Figura 11). Tal como se muestran el gel, las
mejores construcciones policistrónicas,
paTF40(1-ligera, 3-pesada),
todavía es inferior a cada una de las construcciones de cistrones
independientes que se muestran.
Una comparación similar entre los plásmidos
policistrónicos derivados de pAK19 y los plásmidos de cistrones
independientes ilustra además las ventajas de esta nueva tecnología
para la expresión de los anticuerpos de longitud completa en E.
coli. El análisis incluyó plásmidos de expresión para
anticuerpos tanto anti-factor tisular como
anti-VEGF. Respecto a la expresión del factor
tisular, el plásmido policistrónico pxTFPV y el plásmido de
cistrones independientes paTF50 (1-ligera,
1-pesada) se transformaron en la cadena 33D3 y se
indujeron en medio limitante en fosfato. Las muestras no reducidas
se prepararon (tratadas IAA) y se analizaron mediante
SDS-PAGE y tinción de Coomassie (Fig. 12).
Utilizando únicamente tinción de Coomassie azul como procedimiento
de detección, se observó una banda de proteína de anticuerpo de
longitud completa de la muestra de cistrones independientes (carril
3). A continuación se analizó esta banda de proteína mediante
análisis de secuencia aminoacídica N-terminal y
demostró contener cadenas ligera y pesada de anticuerpo
anti-factor tisular tal como se esperaba. Dicha
banda proteica no es evidente por tinción de Coomassie con el
plásmido policistrónico (carril 2). Las muestras se analizaron
mediante transferencia de western con un anticuerpo Fab
anti-humano de cabra (Fig. 13). Aplicando este
procedimiento sensible de detección, una pequeña cantidad de
anticuerpo de longitud completa puede observarse con el plásmido
policistrónico (carril 2), sin embargo, el nivel de expresión
aumenta dramáticamente con el plásmido de cistrones independientes
(carril 3).
También se realizó un experimento similar que
compara la expresión del anticuerpo anti-VEGF con un
vector policistrónico (pY0317.Fab_CH3) y un vector de cistrones
independientes, pcVG2AP11 (1-ligera,
1-pesada). Los plásmidos se transformaron en la
cepa 33D3 y se indujeron en medio limitante de fosfato. Las muestras
no reducidas (tratadas IAA) se prepararon y analizaron mediante
transferencia de western con un anticuerpo Fab
anti-humano de cabra policlonal (Fig. 14).
Virtualmente, ningún anticuerpo de longitud completa es evidente
con el vector policistrónico. La mayor parte de la muestra aparece
como un barrido indiscreto (carril 2), un patrón que parece
correlacionarse con un exceso muy elevado de expresión de cadena
ligera. Por el contrario, cuando el sistema de cistrones
independientes se utilizó, se observó una banda de proteína de
anticuerpo de longitud completa (flecha: carril 3). Por ello, para
la expresión del anti-VEGF de longitud completa, el
vector de cistrones independientes de la invención aumenta el nivel
de expresión desde un anticuerpo de longitud completa no detectable
a un nivel fácilmente detectable por transferencia de western.
Los anticuerpos anti-TF y
anti-VEGF de longitud completa también se produjeron
a gran escala, utilizando procesos de fermentación. Los organismos
utilizados para esta fermentación incluyen: 59A7 W3110 \DeltafhuA
(\DeltatonaA) phoA\DeltaE15
\Delta(argF-lac)169 deoC degP41
Kan^{s} ilvG^{+}\Delta prc::kanR prc supresos; 43H1 W3110
\DeltafhuA(\DeltatonA)
phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 ptr3 degP41 Kan^{s} \DeltaompT\Delta (nmpc-fepE) ilvG+ prc::kanR prc supresor, 33D3 W3110.fhuA (.tonA)ptr3 lac Lq lacL8.ompT.(nmpc-fepE) degP41 kan^{R}; y 58H7 W31130 \DeltafhuA(\DeltatonA) ptr3 ompT degP lac Lq \DeltalacY.
phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 ptr3 degP41 Kan^{s} \DeltaompT\Delta (nmpc-fepE) ilvG+ prc::kanR prc supresor, 33D3 W3110.fhuA (.tonA)ptr3 lac Lq lacL8.ompT.(nmpc-fepE) degP41 kan^{R}; y 58H7 W31130 \DeltafhuA(\DeltatonA) ptr3 ompT degP lac Lq \DeltalacY.
Para cada 10 l de fermentación, se descongelaron
0,5 mlj de cultivo madre congelado (que contenía DMSO al
10-15%) y se utilizaron para inocular un frasco de 2
l con 500 nml de LB suplementado con 0,5 ml de solución de
tetraciclina (5 mg/ml) o 10 ml de solución de ampicilina (2 mg/ml) y
2,5 ml de una solución de fosfato sódico 1 M. Este cultivo inóculo
se creció durante aproximadamente 16 horas a 30ºC con agitación y se
utilizó para inocular el fermentador de 10 l.
El fermentador contenía inicialmente unos 7,0
litros de medio con 1,1 g de glucosa, 100 ml de sulfato magnésico 1
M, 10 ml de una solución de elementos traza (100 ml de ácido
clorhídrico, 27 g de cloruro férrico hexahidrato, 8 g de sulfato de
zinc heptahidrato, 7 g de cloruro de cobalto hexahidrato, 7 g de
molibdato sódico dihidrato, 8 g de sulfato cúprico pentahidrato, 2
g de ácido bórico, 5 g de sulfato de manganeso monohidrato en un
volumen final de 1 litro), 20 ml de una solución de tetraciclina (5
mg/ml en etanol) o 250 ml de una solución de ampicilina (2 mg/ml),
1 bolsa de sales HCD (37,5 g de sulfato amónico, 19,5 g de fosfato
potásico dibásico, 9,75 g de fosfato sódico monobásico dihidrato,
7,5 g de citrato sódico dihidrato, 11,3 g de fosfato potásico
monobásico), 200 g de NZ amino A (hidrolizado proteico) y 100 g de
Extracto de Levadura. Las fermentaciones se realizaron a 30ºC con
20 slpm de flujo de aire y se controlaron a un pH de 7,0+0,2 (aunque
pueden ocurrir variaciones en este intervalo de pH en algunos
casos). La contrapresión del fermentador se mantuvo a 1 bar y la
agitación a 650 rpm. La contrapresión del fermentador y la velocidad
de agitación también se variaron para manipular la tasa de
transferencia de oxígeno en el fermentador y, consecuentemente,
controlar la tasa de respiración celular.
Después de la inoculación del fermentador con el
medio que contenía células del frasco de cultivo de agitación, el
cultivo se creció en el fermentador a densidades celulares elevadas
con un algoritmo informático para proporcionar una solución de
glucosa concentrada al fermentador. También se añadieron una
solución de hidróxido amónico (solución al 58%) y ácido sulfúrico
(solución al 24%) al fermentador en cantidades necesarias para
mantener el pH. También se utilizaron adiciones de
L-61 (un antiespumante, aunque pueden utilizarse
otros) en algunos casos para controlar la formación de espuma.
Cuando el cultivo alcanzó una densidad celular de aproximadamente
40 DO_{550}, se añadieron 100 ml de sulfato magnésico 1 M al
fermentador. Adicionalmente, se añadió un concentrado de sales
(sulfato de amonio 12,5 g, 32,5 de fosfato potásico dibásico, 16,25
de fosfato sódico monobásico dihidrato, 2,5 g de citrato sódico
dihidrato, 18,75 g de fosfato potásico monobásico, 10 ml de cloruro
férrico al 2,7% y 10 ml de elementos traza en un volumen final de
1250 ml) al fermentador y comenzó a una velocidad de 2,5 ml/min
cuando el cultivo alcanzó aproximadamente 20 DO_{550} y se
continuó hasta añadir aproximadamente 1250 ml al fermentador. Las
fermentaciones se continuaron aproximadamente durante
70-80 horas. Durante la fermentación, una vez que se
alcanzó el punto de ajuste para el oxígeno disuelto, se añadió la
solución de glucosa concentrada según la señal de la sonda de
oxígeno disuelto con el fin de controlar la concentración de
oxígeno disuelto en el punto de ajuste. Consecuentemente, en este
esquema de control, las manipulaciones de los parámetros de
operación del fermentador como la velocidad de agitación o la
contrapresión que afectan la capacidad de transferencia del oxígeno
en la fermentación correspondiente también manipuló la tasa de
incorporación de oxígeno o la tasa metabólica de las células. Un
espectrómetro de masas se utilizó para monitorizar la composición
de la salida de gases de la fermentación y permitió calcular la
incorporación de oxígeno y las tasas de evolución de dióxido de
carbono en las fermentaciones.
Las muestras solubles no reducidas se prepararon
de la manera siguiente: se descongelaron muestras de 1 ml del
cultivo completo durante el curso de la fermentación a temperatura
ambiente. Cien microlitros del descongelado se añadieron a 500
\mul de tampón de extracción. (Tampón de extracción: Tris 10 mM,
pH 6,8, EDTA 5 mM, añadido extemporáneamente 0,mg/ml de lisozima de
huevo, y ácido yodoacético preparado extemporáneamente a una
concentración final de 5-10 mM). Las muestras de
medio completo más el tampón de extracción se incubaron en hielo
durante 5-10 minutos, luego se sonicaron 2x10
pulsos, luego se centrifugaron a 4ºC y 14.000 rpm durante
15-20 minutos. Los sobrenadantes se recogieron como
la fracción soluble. Para el análisis por SDS-PAGE e
inmunotransferencias, la fracción soluble se diluyó 1:4 en tampón
de muestra Tricina 2XNovex 1:4 con agente reductor. Diez microlitros
de esta preparación se cargaron en un gel NuPage
Bis-Tris al 4-12% Novex de 15
pocillos a 200 V con tampón MOPS. El gel se utilizó para una
inmunotransferencia o se tiñó con azul de Coomassie.
Las muestras de las fracciones solubles se
sometieron al análisis de un ensayo AME5RP. Este ensayo es una
columna HPLC en donde la primera columna es una columna de afinidad
que captura la cadena ligera y la segunda columna es una columna de
fase inversa. Un Integral Workstastion se configuró en el modo de
columna dual. Los reservorios de solvente fueron: Solvente 1A,
tampón de carga de afinidad, Solvente 1B, tampón acuoso de fase
inversa y tampón de elución por afinidad, TFA al 0,1% en agua;
Solvente 2A, agua; Solvente 2B, tampón de elución orgánico de fase
inversa, 0,09% TFA/80% acetonitrilo. La primera columna fue una
columna de afinidad (30x2,1 mm) que contenía un anticuerpo Fab
anti-cadena ligera (kappa) inmovilizado (AME5) sobre
vidrio de poros determinados. Todos los procesos que implicaban la
columna de afinidad se realizaron a temperatura ambiente. La
segunda columna fue una columna de fase inversa que contenía el
polímero derivado de material de empaquetamiento POROS R220 (30x2,1
mm). La temperatura de la columna de fase inversa se mantuvo a
60ºC.
La columna de afinidad se equilibró con tampón
de carga al 30% (5 ml) y se cargó una muestra de 50 \mul a una
velocidad de flujo de 0,1 ml/min. El flujo a través de dirigió a
sobrantes. Después de cargar la muestra, se lavó la columna de
afinidad con tampón de carga al 30% (2 ml) seguido de tampón de
carga al 100% (5 ml) para reducir los componentes unidos
inespecíficamente. La columna se preparó con un lavado final con
agua para la elución (3 ml). La columna de afinidad se conectó a la
columna de fase inversa (mediante encendido de la válvula) y se
eluyó con tampón de elución (2 ml) a una tasa de flujo de 2 ml/min
para transferir los componentes capturados por la afinidad a la
columna de fase inversa. Durante esta etapa de transferencia el
detector de UV Integral se localizó después de la columna de
afinidad y antes de la columna de fase inversa y por tanto se
controla la elución de la columna de afinidad (que empieza a cargar
a la columna de fase inversa). Además de este detector, se añadió
un segundo detector después de la columna de fase inversa para
controlar su flujo a través y confirmar que todos los componentes
eluidos de la columna de afinidad se hallaban de hecho capturados
por la columna de fase inversa.
El equilibrado de la columna de afinidad se
realizó con el tampón de carga (4 ml) después de eliminar su
conexión a la columna de fase inversa.
La columna de fase inversa cargada se lavó con
solución acuosa de TFA al 0,1% (2 ml). La tasa de flujo se ajustó a
1 ml/min y se hizo pasar un gradiente rápido (1 mon) con el solvente
2B al 35% (TFA al 0,1%/acetonitrilo al 80%) seguido de un gradiente
superficial al 50% del solvente 2B durante 14 min. La elución se
completó mediante un gradiente al 90% del solvente 2B durante 4
min. La columna de fase inversa se retornó a las condiciones
iniciales durante 1 min y se re-equilibró durante 3
min a 2 ml/min. El eluido de la columna se monitorizó a 280 y 214
nm. La cuantificación se realizó mediante comparación de las áreas
de picos integradas con los estándares de concentraciones
conocidas.
Las fracciones se recogieron a través del perfil
de gradiente, se agruparon adecuadamente y se liofilizaron. Las
fracciones de los picos se caracterizaron parcialmente con procesos
usuales utilizados en el análisis de secuencia
N-terminal, y el análisis de
SDS-PAGE. También se analizaron mediante
cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS). El análisis
de secuencia terminal, LC/MS y SDS_PAGE demostró que el Pico 5 en el
cromatograma contenía predominantemente anticuerpos de longitud
completas en la forma tetramérica (es decir, dos cadenas ligeras y
dos cadenas pesadas).
La producción de anticuerpos
anti-TF de longitud completa utilizando el plásmido
policistrónico paTF20 (1-ligera,
1-pesada) o paTF40 (1-ligera,
3-pesada) se comparó con la utilización del vector
de cistrones independientes paTF50 (1-ligera,
1-pesada) en la cepa E. coli 43H1. Las
fermentaciones también se han realizado en las cepas 33D3 y 59A7
transformadas con el plásmido paTF50. El análisis de las muestras de
la fermentación por el ensayo AMER5-RP obtuvo el
siguiente Pico 5 del ensayo AME5-RP que se muestra
en la Tabla 2.
Por ello, tal como indican los resultados de
AME5-RP, el vector de cistrones independientes
paTF50 produce significativamente rendimientos superiores de
anticuerpos anti-TF, comparado con los vectores
policistrónicos.
Los productos de fermentación se purificaron de
la manera siguiente: se diluyó la pasta bacteriana 1:5 (p/v) en
fosfato sódico 20 mM pH 7,4, NaCl 0,14 M y luego se lisó con un
microfluidizador M110Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). La
solución que contenía las células lisadas se clarificó mediante
centrifugación (4300xg, 30 min) para eliminar los restos celulares.
Se añadió polietilén imina (BASF Corp., Rensselaer, NY) al
sobrenadante a una concentración final del 0,2%, seguido de una
centrifugación (4300 xg, 30 min). El sobrenadante se filtró (0,2
\mum) y se aplicó a una resina de afinidad de Proteína A, Prosep A
(Millipore Corp., Bedford, MA). La IgG1 derivada de E. coli
se eluyó con ácido acético 0,1 M a pH 2,9. El agrupado de proteína A
se condicionó mediante adición de urea a una concentración final de
2M, se ajustó a pH 5,5, se diluyó con agua purificada y se aplicó a
una SP de Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotehc Uppasala,
Suecia). La columna SP Sepharose FF se lavó con MES 20 mM a pH 5,5,
seguido de una elución de IgG1 con un gradiente lineal de 0 a 0,25 M
de NaCl en MES 20 mM a pH 5,5. Las fracciones de SP Sepharose FF se
analizaron mediante SDS-PAGE y se agruparon. El
agrupado de SP Sepharose FF se ajustó a pH 8,0 y se aplicó a una
columna Q Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala,
Suecia). La columna Q Sepharose FF se lavó con Tris 25 mM a pH 8,0,
NaCl 50 mM, seguido de una elución de IgG1 con Tris 25 mM a pH 8,0,
NaCl 150 mM. El agrupado de QSP Sepharose FF se formuló mediante
ultrafiltración con una membrana de celulosa regenerada (Millipore
Corp., Bedford, MA) seguido de una diafiltración en acetato sódico
20 mM, pH 5,5 y NaCl 0,14 M.
Para confirmar que los anticuerpos de longitud
completa en células huésped E. coli de la presente invención
poseen las propiedades deseadas, los productos de anticuerpo
anti-TF preparados mediante fermentación y
purificados de acuerdo con los procedimientos del Ejemplo 4 se
caracterizaron además mediante una serie de ensayos que incluyen la
Espectrometría de masas, cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía por exclusión de tamaño, análisis de aminoácidos y
secuenciación N-terminal.
El análisis
MALDI-TOF-MS se realizó en un
Voyager DE Bioespectrometría WorkStation (Perseptive Biosystems,
Framingham, MA), equipado con extracción retardada. Se utilizó un
láser de nitrógeno para irradiar las muestras con luz ultravioleta
(337 nm) y se realizó una media de 240 escáneres. El instrumento
operó en configuración lineal (vía de vuelo de 1,2 m), y un voltaje
de aceleración de 20 kV se utilizó para propeler los iones a través
del tubo de vuelo después de 60 ns de retraso. Las muestras (1,0
\mul) se mezclaron con 1 \mul de matriz y 1 \mul de esta
mezcla se añadió a la diana y se secó al vacío (50x10^{-3} Torr).
Los estándares se utilizaron para lograr una calibración externa en
los dos puntos para asignar la masa de los iones. Se utilizó una
matriz de ácido 4-hidroxicinnámico en el análisis
de los anticuerpos anti-TF de longitud completa.
La cromatografía de intercambio iónico se llevó
a cabo en un instrumento HP-1100 con una columna
Baker Bond CSX (4,6x250 mm). La columna se equilibró durante 20 min
con tampón A (acetato sódico 25 mM, pH 4,8) a una tasa de flujo de
1 ml/min. Las muestras se diluyeron a aproximadamente 1 mg/ml en
tampón A y se inyectaron aproximadamente 50 \mug. La temperatura
de la columna se mantuvo a 40ºC. Un gradiente lineal se aplicó
durante 40 in al tampón B al 60% (tampón A + NaCl 500 mM) y se
mantuvo en tampón B al 60% durante 5 min. El efluente de la columna
se controló a 280 nm.
Se utilizó una columna TSK
G3000SW-XL (7,8x300 mM; TosoHass) de cromatografía
de exclusión por tamaño en un instrumento HP1100. La columna se
equilibró con tampón fosfato potásico 100 mM a pH 6,3 que contenía
cloruro sódico 250 mM a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Las
muestras se diluyeron a 1 mg/ml con el tampón de elución y se
inyectaron aproximadamente 100 \mug a la columna. El tiempo de
migración fue de 30 min. Las muestras de los estándares de la
filtración en gel (Bio-Rad) también se inyectaron
después de diluirlos 5 veces con tampón de elución.
La muestra se intercambió mediante diálisis en
ácido acético al 0,1%. Una alícuota que contenía 83 \mug se cargó
para el análisis de secuencia N-terminal mediante el
procedimiento de degradación de Edman con un secuenciador de
proteínas automatizado de Applied Biosystems 477A/120A. La
comparación de la altura de los picos con un estándar externo se
utilizó para cuantificar los aminoácidos PTH.
Las alícuotas que contenían 15 \mug de las
muestras desaladas se secaron en ampollas de hidrólisis mediante
evaporación en una Speed-Vac Savant. Después de
adición de HCl 6 N (Pierce), las ampollas se sellaron a presión
reducida y se incubaron durante 24 o 72 horas a 110ºC. Las alícuotas
adicionales se sometieron a oxidación con ácido fórmico mediante
incubación durante 4 horas a 0-5ºC con una solución
preparada una hora antes que contenía peróxido de hidrógeno al 10%
y ácido fórmico al 90%. El ácido perfórmico se eliminó mediante
evaporación en una Speed-Vac Savant, después de lo
cual las muestras se sometieron a una hidrólisis de 24 h en HCl 6N
tal como se describió anteriormente. Para las determinaciones de
Trp, se secaron alícuotas triplicadas que contenían 25 \mug de
cada lote en ampollas y se secaron e incubaron a 110ºC durante 24
horas en atmósfera de nitrógeno en solución de ácido mercaptoetanol
al 7% (Baker)/NCl 6N al 93% (Pierce) en presión reducida. Después
de la hidrólisis, todas las muestras se secaron mediante evaporación
una SpeedVac Savant.
Los resultados obtenidos de diversos ensayos
descritos anteriormente confirmaron que los anticuerpos de longitud
completa producidos en E. coli con los vectores de expresión
de la presente invención compartían estructuras similares a los
anticuerpos anti-TF producidos en huéspedes células
eucariotas, como por ejemplo las células CHO.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos producidos y purificados en
E. coli de acuerdo con los ejemplos anteriores son de
longitud completa y no están glicosilados. Los experimentos
siguientes se realizaron para ilustrar que los anticuerpos: 1)
presentan capacidad fuerte de unión con el antígeno bivalente; 2)
carecen de la capacidad de unión de C1q y en consecuencia la
función CDC está reducida; 3) carecen de la capacidad de unión a
Fc\gammaR1 y en consecuencia las funciones ADCC están
disminuidas; y 4) muestran una unión fuerte con FcRn, para una mejor
resistencia al aclaramiento y en consecuencia facilitan una vida
media más prolongada in vivo.
Los anticuerpos anti-TF de
longitud completa se evaluaron por su unión con el antígeno mediante
ensayo ELISA. Placas de micropocillos MaxiSorp-de
96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) se recubrieron con factor
tisular (TF) a 1 \mug/ml que comprendía los residuos
1-219 (Genentech) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,5,
a 4ºC durante toda la noche. Las placas se bloquearon con PBS,
albúmina sérica bovina al 0,5%, Proclin 10 ppm (Supelco,
Bellefonte, PA), pH 7,2 a temperatura ambiente durante 1 hora.
Diluciones seriadas de tres veces de los anticuerpos
(0,27-200 ng/ml) en PBS, albúmina sérica bovina al
0,5%, polisorbato 20 al 0,05%, CHAPS al 0,25%, \gammaglobulinas
albúmina sérica bovina al 0,2% (Sigma, St Louis, MO), pH 7,2 (tampón
de ensayo) se añadieron a las placas y éstas se incubaron durante 2
horas. La IgG unida se detectó mediante adición de anticuerpo
F(ab')2 anti-humano de cabra conjugado con
peroxidasa (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) en tampón de
ensayo, se incubaron las placas durante 1 hora y se añadió
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (Kirkegaard &
Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) como sustrato. Las placas se
lavaron entre cada etapa con PBS, polisorbato 20 al 0,05%, pH 7,2.
La absorbancia se leyó a 450 nm en un lector apilador (ICN, Costa
Mesa, CA). Las curvas de titulación se ajustaron con un programa de
ajuste de curvas de regresión no lineal de cuatro parámetros
(KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA).
Los resultados del ensayo ELISA de unión al
antígeno TF se muestran en la Figura 15. Los anticuerpos
anti-TF de longitud completa producidos en E.
coli (IgG1) se compararon con los anticuerpos
anti-TF de isotipos distintos que se produjeron en
células CHO. El anticuerpo IgG1 producido en E. coli muestra
actividades de unión que son al menos comparables con los otros
anticuerpos anti-TF producidos en sistemas celulares
de CHO.
La unión de C1q humano al anticuerpo
anti-TF producido en E. coli se determinó
mediante un ensayo de unión ELISA tal como se describió Idusogie y
col., (2000) J. Immuno 164:4178-4184. En resumen, se
recubrieron placas de 96 pocillos durante toda la noche a 4ºC con
concentraciones diversas de anticuerpos en tampón de recubrimiento
(carbonato sódico 0,05M), pH 9. Las placas se lavaron con
3xPBS/TWEEN 20 al 0,05%, pH 7,4 y se bloquearon con 200 \mul de
diluyente del ELISA sin timerosal (NaPO4 0,1M/NaCl 0,1M/gelatina al
0,1%/TWEEN 20 al 0,05%/ProClin300 al 0,05%) durante 1 hora a
temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con tampón de
lavado, una alícuota de 100 \mul de C1q a 2 \mug/ml (Quidel, San
Diego, CA) se añadió a cada pocillo y se incubó durante 2 horas a
temperatura ambiente. La placa se lavó entonces 6x con tampón de
lavado. Se añadieron 100 \mul de una dilución 1:1000 de
anticuerpo conjugado con peroxidasa anti-C1q humano
(Biodesign) a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a
temperatura ambiente. La placa se lavó de nuevo 6X con tampón y 100
\mul de tampón de sustrato (PBS/H2O2 al 0,012%) que contenía OPD
(O-fenilendiamina dihidrocloruro (Sigma)) a cada
pocillo. La reacción de oxidación, observada por la aparición de un
color amarillo, se dejó 30 minutos y se paró con adición de 100
\mul de H2SO4 4,5 N. La absorbancia se leyó a
(492-405 nm) utilizando un lector de microplacas
(SPECTRA MAX 250^{TM}, Molecular Devices Corp). Los controles
adecuados se migraron en paralelo (es decir, el ELISA se realizó
sin C1q para cada concentración de los anticuerpos utilizados y
también el ELISA se realizó sin el anticuerpo). Para cada muestra,
la unión de C1q se cuantificó representando la absorbancia
(492-405 nm) respecto a la concentración en
\mug/ml, con un programa de ajuste de curva de
4-parámetros (KALEIDAGRAPH^{TM}) y comparando los
valores EC50. Los resultados de este ensayo se muestran en la
Figura 16. Un anticuerpo expresado en células CHO,
I-1095-1-Rituximab,
se utilizó como control positivo. No se detectó unión a C1q del
anticuerpo anti-TF de longitud completa producido en
E. coli, incluso a concentraciones elevadas.
La unión de Fc\gammaR al anticuerpo
anti-TF purificado se determinó utilizando un ensayo
de unión ELISA. La fusión de Fc\gammaR subunidad
\alpha-GST se puso de recubrimiento en placas
maxisorb Nunc F96 (cat. 439454) mediante adición de 100 \mul de
la fusión del receptor-GST a 1 \mug/ml en PBS y se
incubó durante 48 horas a 4ºC. Antes del ensayo, las placas se
lavaron 3x con 250 \mul de tampón de lavado (PBS pH 7,4, que
contenía TWEEN 20 al 0,05%, albúmina sérica bovina grado RIA al
0,5%) y se bloquearon con 250 \mul de tampón de ensayo (tampón
salino Tris 50 mM, TEEN 20 al 0,05%, albúmina sérica bovina grado
RIA al 0,5% (Sigma A7888) y EDTA 2 mM pH 7,4). Las muestras se
diluyeron a 10 \mug/ml en 1 ml de tampón de ensayo y se añadieron
a las placas recubiertas con subunidad \alpha de Fc\gammaR y se
incubaron durante 120 minutos a 25ºC en un agitador orbital. Las
placas se lavaron 5x con tampón de lavado para eliminar los
complejos no unidos y la unión a IgG se detectó mediante adición de
100 \mul de anticuerpo de cabra anti-IgG (y)
humana específico conjugado con peroxidasa de rábano (HRP)
(Boehringer Mannheim 1814249) a 1:10.000 en tampón de ensayo y se
incubó durante 90 min a 25ºC en un agitador orbital. Las placas se
lavaron 5x con tampón de lavado para eliminar el anticuerpo
anti-IgG humana de cabra conjugado a HRp no unido y
el unido se detectó mediante adición de 100 \mul de solución de
sustrato (o-fenilendiamina dihidrocloruro a 0,4
mg/ml, Sigma P6912, H2O2 6 mM (Sigma P6912) en PBS) y se incubaron
durante 8 min a 25ºC. La reacción enzimática se paró mediante
adición de 100 \mul de H_{2}SO_{4} 4,5 N y el producto
colorimétrico se cuantificó a 490 nm con un densitómetro de placas
de 96 pocillos (Molecular Devices). Los resultados de este ensayo se
muestran en la Figura 17. Los controles positivos, anticuerpos
expresados en células 293 de mamífero, se unieron al receptor, pero
no se detectó unión a Fc\gammaR1 para el anticuerpo
anti-TF producido en E. coli.
La unión de anticuerpos anti-TF
purificados con FcRn se analizó mediante un ensayo de unión ELISA.
Las placas de ELISA se recubrieron con factor tisular y se
bloquearon tal como se describió más arriba. Dos diluciones
seriadas de anticuerpos anti-TF
(1,6-200 ng/ml) en PBS, albúmina sérica bovina al
0,5%, polisorbato 20 al 0,05%, pH 6,0 (tampón de muestra) se
añadieron a las placas y éstas se incubaron durante dos horas a
temperatura ambiente. A las placas, se añadió FcR biotinilado
(preparado con biotina-X-NHS de
Research Organics, Cleveland, OH) a 3,6 \mug/ml en tampón de
muestra. Al cabo de una hora de incubación, se detectó FcRn unido
mediante adición de estreptavidina marcada con peroxidasa (Amdex,
Copnehagen, Denmark) en tampón de muestra, incubando las placas
durante 1 hora y añadiendo 3,3',5,5'-tetrametil
benzidina (Kirkegaard & Perry Laboraotories) como sustrato. Las
placas se lavaron entre cada etapa con PBS, BSA al 0,05%,
polisorbato 20 al 0,05%, pH 6,0. La absorbancia se leyó a 450 nm en
un lector de placas Thermomax (Molecular Devices, Menlo ParK, CA).
Las curvas de titulación se ajustaron tal como se describió
anteriormente. La Figura 18 muestra que la actividad de unión FcRn
del anticuerpo anti-TF de longitud completa generado
en E. coli es comparable con otros anticuerpos
anti-TF (IgG4, IgG4b, IgG2) generados en células
huésped de mamífero.
\vskip1.000000\baselineskip
El anticuerpo anti-TF de
longitud completa generado en E. coli (IgG1 E. coli)
se sometió a un estudio de farmacocinética (PK) en chimpancés con
una dosis única de bolo IV, junto con dos otros anticuerpos
anti-TF en células CHO) IgG2 CHO e IgG4 CHO) como
controles. Estos chimpancés fueron negativos para la presencia de
anticuerpos anti-TF. Cada animal recibió una sola
dosis IV de bolo de anticuerpo anti-TF (IgG1 E.
coli, IgG2 CHO o IgG4 CHO) a 0,10 mg/Kg. Las muestras de plasma
se recogieron hasta 28 días post-dosis de acuerdo
con el siguiente esquema: 30 y 15 minutos predosis; 2, 15, 30
minutos: 1, 2, 3, 4, 6, 12 horas; 1,2,4,7,21 y 28 días
post-dosis bolo IV. Las muestras de plasma se
analizaron para el contenido de anticuerpo anti-TF
(ATF) mediante ELISA, con TF como una cubierta y un anticuerpo
monoclonal anti-Fc como un anticuerpo de detección.
El límite de cuantificación fue de 0,102 \mug/ml en el plasma de
chimpancé.
Los resultados del ELISA se muestran en la
Figura 19 en la forma de concentración ATF plasmática versus curvas
de tiempo. Los resultados se ajustaron a un perfil de eliminación en
un compartimento en Win Nonlin 3.0. El parámetro PK que estima el
aclaramiento (CL), la vida media de eliminación (T_{1/2}) y el
volumen (V) se indican en la Tabla 3. Según este experimento en
tres chimpancés individuales, no se observaron diferencias obvias
en el parámetro PK entre el anticuerpo generado en E. coli y
los que generados en CHO.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores de cistrones independientes se
construyeron también para la expresión de los anticuerpos de
longitud completa: anti-VEGF (VNERK), una variante
de afinidad superior del anticuerpo humanizado descrito en Presta y
col., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997); un anticuerpo
anti-IgE humanizado descrito en Presta y col.,
Cancer Res 60:3225-3231 (2000);
anti-HEr2 (versiones 4D5 y 2C4; Carter y col., Proc
Natl Acad Sci USA 89:4285-4289 (1992) y Fendly y
col., Cancer Res. 50:1550-1558 (1990); y un
anti-CD18 humanizado (Eigenbrot y col., Proteins:
Structure, Function and Genetics 18:49-62
(1994)).
Para la construcción de plásmidos de cistrones
independientes, las regiones VL y VH de paTF50
(TZR1-ligera,
TIR-1-pesada; véase el Ejemplo 1) se
reemplazaron con VL y VH de cada uno de los anticuerpos listados. La
inducción de la expresión se llevó a cabo en la cepa 33D3, tal como
se describió en el Ejemplo 3. Las muestras se recogieron de la
separación SDS-PAGE y ser realizó una
inmunotransferencia en condiciones no reductoras. Tal como se
muestra en la Figura 22, las versiones de longitud completa de los
anticuerpos anti-VEGF, anti-IgGE,
ant-CD40, 4D5, 2C4 y anti-CD18 se
expresaron sucesivamente en E. coli con vectores de cistrones
independientes. Este resultado ilustra que el sistema de expresión
de cistrones independientes es una aproximación aplicable para la
expresión del anticuerpo en E. coli.
Para ilustrar mejor la utilidad del sistema de
expresión de cistrones independientes aquí, los diversos plásmidos
descritos más arriba que expresan los diversos anticuerpos listados
se utilizaron en producciones a gran escala (procesos de
fermentación).
Los organismos utilizados para estas
fermentaciones incluyen: 33D3 W3110 \DeltafhuA (\DeltatonA)
ptr3 lac Lq lacL8 \DeltaompT\Delta (nmpc-fepE)
deg41 kanR; 61D6 W3110 \DeltafhuA (\DeltatonA) ptr3 lac
Lq lacL8 \DeltaompT\Delta (nmpc-fepE)
degP41; y 62ª7 W3310 \DeltafhuA (\DeltatonA) ptr3 lac Lq
lacL8 \DeltaompT\Delta (nmpc-fepE) degP41
ilvG reparado.
Las fermentaciones de los anticuerpos listados
se generaron a una escala de 10 litros y se prepararon las muestras
solubles y se sometieron a un ensayo de AME5-RP tal
como se describió en el Ejemplo 4. Los títulos del ensayo
AME5-RP del pico 5 que contenían los anticuerpos de
longitud completa predominantemente en la forma tetramérica (dos
cadenas L y dos cadenas H), se muestran en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando el sistema de cistrones
independientes de la invención, los anticuerpos completos
anti-TF también se coexpresaron con una o más
proteínas Dsb que son capaces de facilitar el propio plegamiento y
ensamblaje de los anticuerpos.
Los organismos utilizados para estas
fermentaciones incluyen: 58H7 W3110 \DeltafhuA (\DeltatonA)
ptr3 \DeltaompT\Delta\DeltadegP lac lq \DeltalacY; y
61D6 W3110 \DeltafhuA (\DeltatonA) ptr3 lac lq lacL8
\DeltapmpT\Delta (nmpc-fepE) degP41.
El plásmido que codifica el
anti-TF paTF50 o pxTF2AP22 (una variante de paTF50
con TIRs de 2 para cada cadena ligera y pesada) se utilizó para
transformar las células competentes de los organismos anteriores.
Los plásmidos que codifican dsbC (pJJ141), dsbA (pJJ142), o dsbA/C
(pJJ247) se cotransformaron con el plásmido
anti-TF50 o pxTF2AP22.
Para construir el plásmido dsbC pJJ141, el
plásmido resistente a la kanamicina pACYC177 se digirió con AatII e
HincII lo que interrumpió la resistencia a la ampicilina. El
plásmido tac-dsdbC pJJ40, descrito en la patente
americana US 5.639.635, se digirió con ClaI y luego se rellenaron
sus extremos mediante reacción con Klenow y desoxinucleótidos.
Después de una extracción con fenol y cloroformo y precipitación, el
vector linearizado se digirió con AatII y se purificó el fragmento
de 1,6 Kb de un gel de agarosa y se ligó con el pACYC177 digerido
ocn AatII/HincII. El plásmido final pJJ141 codifica
tac-dsbC y confiere resistencia a la kanamicina. De
forma similar, se construyó el plásmido de dsbA pJJ142 con el mismo
vector parental cortado con AatII/HincII ligado con el fragmento
AatII/ClaI (con el extremo ClaI relleno) a partir de pJJ37, que
codifica dsbA y también se describe en la patente americana
5.639.635.
5.639.635.
Para construir pJJ247, el plásmido que codifica
dsbA y dsbC, pJJ142, se digirió con KpnI y ScaI. DsbC se amplificó
por PCR a partir del plásmido pJJ141 con los cebadores
siguientes:
tacdsbCf1: | CATACTGGTACCAGGATCTAGAGGGAAGATTTATG | (SEC ID NO:3) |
tacdsbCr2: | CTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTG | (SEC ID NO:4) |
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores contenían dianas de restricción
(KpnI, ScaI) que se han subrayado. Después de la amplificación, el
fragmento se purificó por electroforesis en gel de agarosa y se
digirió con las enzimas adecuadas y se ligó a pJJ142 digerido con
KpnI/ScaI. El plásmido resultante pJJ247 codifica un promotor tac
que dirige la expresión de dsbA y dsbC con dsbA en primer lugar en
las series. El plásmido se secuenció desde la mitad del gen dsbA
hasta el extremo 3' del gen dsbC.
En algunos casos, se construyeron plásmidos
individuales que codificaban anti-TF con una TIR de
1 para la cadena ligera como la pesada y DsbC (pJJ241) o DsbA
(pJJ237) para transformar células huésped competentes.
Para construir el plásmido pJJ237 que
co-expresaba anti-TF y dsbA, el
plásmido anti-TF pAT50 se digirió con AatII y HpaI
y se ligó a un fragmento AatII/HpaI de pJJ223. Este último fragmento
contiene araC, el promotor pBAD, dsbA, resistencia a kanamicina, un
origen de replicación co1E1 y el gen de la
\beta-lactamasa. El producto de la de ligación
contiene: cadenas H y L anti-TF en promotores phoA
independientes, un promotor inducible por arabinósido (pBAD) que
dirige la expresión de dsbA con el plásmido que confiere resistencia
a la kanamicina y ampicilina. Este plásmido se denominó pJG9. Para
generar pJJ237, se cambió el regulador de arabinósido por el
promotor de tac mediante amplificación por PCR. Para ello, se
utilizaron los cebadores siguientes:
dsbAf11: | TGCACGGTTAACATGCTGTGGTGTCATGGTCGG | (SEC ID NO:5) |
dsbAr12: | TTTACCGTTAACAAACATCGCCGGAAC | (SEC ID NO:6) |
\vskip1.000000\baselineskip
Las dianas subrayadas corresponden a dianas
HpaI. Después de la amplificación con pJJ142 como molde (contiene
tac-dsbA), el fragmento se purificó en gel y se
digirió con HpaI. El vector pJG9 se digirió con HpaI y NaeI
eliminando así la región pBAD-dsbA. El vector
cortado con HpaI-NaeI se purificó en gel y se ligó
a un fragmento de PCR tac-dsbA cortado con HpaI. El
plásmido resultante, denominado pJJ237, contiene los promotores
phoA independientes que dirigen la expresión de las cadenas H y L de
\alphaTF y el promotor tac que dirige la expresión de dsbA.
Para construir el plásmido pJJ241 con
anti-TF y dsbC coexpresados, pJG9 se digirió con
HpaI y NgoMIV. NgoMIV corta en la misma diana que NaeI pero deja
extremos cohesivos en su lugar. DsbC se amplificó por PCR a partir
de pJJ141 como molde con el mismo cebador de sentido 5' que dsbA
(dsbAf11; SEC ID NO:5) y el cebador inverso siguiente:
dsbCr12: | TACGCTGCCGGCGTCCGATGCGAATTATTTACCG | (SEC ID NO:7) |
\vskip1.000000\baselineskip
La diana subrayada es una diana NgoMIV. El
fragmento amplificado se purificó en gel y se digirió con NgoMIV y
HpaI y se ligó a pJG9. El plásmido resultante contiene los
promotores phoA independientes que dirigen la expresión de las
cadenas H y L de anti-TF y el promotor Tac que
dirige la expresión de dsbC.
Cuando un plásmido que codifica
anti-TF y un plásmido que codifica una o más
proteínas Dsb se utilizan juntos para transformar células
competentes, los transformantes se plaquean en placas de LB agar con
50 \mug/ml de carbonicilina y de kanamicina. En aquellos casos en
donde un sólo plásmido exprese tanto el anti-TF como
las proteínas Dsb seleccionadas (dsbA o dsbC), los transformantes
se seleccionan de las placas de LB agar con 50 \mug/ml de
kanamicina.
kanamicina.
Las fermentaciones se realizaron a escala de 10
litros tal como se describió en el Ejemplo 4, con la adición de 50
ml de una solución de 200 mM de isorpropil
\beta-D-tiogalactósidopiranósido
(IPTG) al cultivo de fermentación cuando la DO550 alcance
150-200. Las adiciones de IPTG pueden realizarse a
tiempos distintos a los descritos y en cantidades distintas a las
descritas. Las muestras solubles se prepararon y sometieron a un
ensayo AME5-RP tal como se describió en el Ejemplo
4. Las cepas de los diversos huéspedes y plásmidos utilizados y los
títulos resultantes del pico 5 se resumen en la tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos de longitud completa
anti-TF se coexpresaron también con Fkpa, un
peptidilprolil cis-trans-isomerasa
con actividad de chaperona.
Los organismos utilizados para estas
fermentaciones incluyen: 58H7 (genotipo W3110 \DeltafhuA
(\DeltatonA) ptr3\DeltaompT\Delta\DeltadegP lac lq
\DeltalacY; y 59A7 (genotipo W3110 \DeltafhuA
(\DeltatonA) phoA\DeltaE15
\Delta(argF-lac) 169 deoC degP41 kan^{s}
ilvG+ \Deltaprc::KanR prc supresor).
Un plásmido independiente que codifica fkpa bajo
el control del promotor tacII (pJVG2) se
co-transformó con el plásmido
anti-TF paTF50. Para crear el plásmido pJVG2, el
plásmido pJJ222fkpA se digirió con NheI e NgoMIV para generar un
fragmento de 0,8 Kb que contenía fkpA. Este fragmento se purificó
mediante electroforesis y extracción con
fenol-cloroformo y precipitación. El plásmido pJJ239
que contiene tac-Dsb en un vector pACYC177 análogo
a pJJ142, se digirió con XbaI y NgoMIV para generar un fragmento de
3,9 Kb que contenía un promotor tac inducible y una resistencia a
kanamicina. Este fragmento se purificó mediante electroforesis y
extracción fenol-cloroformo y precipitación. Estos
dos fragmentos se ligaron para crear pJVG2 que contenía un promotor
tac inducible, fkpA y resistencia a kanamicina. Este plásmido es
similar a pJJ141 y pJJ142 en que es un plásmido compatible pACYC177
que puede utilizarse para coexpresar fkpA con plásmidos derivados de
pBR322.
Además, un solo plásmido que codifica ambas
cadenas anti-TF bajo el control de promotores
independientes phoA y fkpA bajo el control del promotor de
arabinosa (pJG9fkpAB3) se utilizó para transformar células
competentes de los organismos anteriores. Para crear p7G9fkpAB3, el
plásmido pJJ222fkpA se digirió con HpaI y NdeI para crear un
fragmento de 4,1 Kb que contenía araC, el promotor inducible pBAD,
fkpA y la resistencia a la kanamicina. Fkpa se había amplificado
originalmente por PCR a partir del cromosoma de E. coli y
clonado detrás del promotor pBAD en el vector comercial pBAD18. El
fragmento se purificó mediante electroforesis y extracción con
fenol-cloroformo y precipitación. El plásmido pJG9
se digirió con HpaI y NdeI para crear un fragmento de 5,1 Kb que
contenía la resistencia a la ampicilina, los cistrones separados
para ambas cadenas H y L del anticuerpo \alphaTF. Dicho plásmido
se purificó por electroforesis y extracción con
fenol-cloroformo y precipitación. Los dos fragmentos
se ligaron para crear pJGfkpAB3, que contenía los promotores
independientes que dirigían la expresión de las cadenas de
anticuerpo anti-TF, araC, el promotor pBAD que
dirigía la expresión de únicamente fkpA, la resistencia a la
kanamicina, un origen de replicación colE1 y la resistencia a la
ampicilina.
Cuando se utilizaron juntos el plásmido con el
anti-TF paTF50 y el plásmido conde fkpA, pJVG2, para
transformar las células competentes, los transformantes se
plaquearon en placas de LB agar que contenían 50 \mug/ml de
carbenicilina y kanamicina. Cuando las células se transformaron con
el plásmido solo pJGfkpAB3, los transformantes se seleccionaron
sobre placas de LB agar que contenía 50 \mug/ml de kanamicina.
Las fermentaciones se realizaron a escala de 10
litros tal como se describió en el Ejemplo 4 con las modificaciones
siguientes. A las Las fermentaciones utilizando las células
transformadas con el plásmido pJGfkpAB3 se les añadió 200 ml de una
solución de arabinosa al 40% a aproximadamente un DO550 de
150-200. Antes de la adición de arabinosa, la tasa
del alimentador de glucosa se recortó de modo que el cultivo estuvo
en condiciones limitantes de glucosa. Después de la adición de
arabinosa y de su consumo, la tasa del alimentador de glucosa se
aumentó para permitir una incorporación máxima de glucosa por el
cultivo. A las fermentaciones con las células cotransformadas con
los plásmidos paTF50 y pJVG2 se les añadió 50 ml de una solución 200
mM de isopropil
\beta-D-galactopiranósido (IPTG)
en el cultivo del fermentador cuando se alcanzó una DO550 de
150-200. Las adiciones de IPTG pueden realizarse a
tiempos distintos a los descritos y con diferentes cantidades de
IPTG que las descritas. Las muestras solubles se prepararon y
sometieron a un ensayo AME5-RP tal como se describe
en el Ejemplo 4.
La fermentación del huésped transformado 59A7
con paTF50 proporcionó un título AME5-RP de
aproximadamente 156 mg/l, comparado con los 247 mg/l para el
huésped transformado 59A7 con el plásmido pJG9fkpAB3. De igual
manera, la fermentación del huésped transformado 59H7 con paTF50
proporcionó un título AME5-RP de aproximadamente
100 mg/l, comparado con los 180 mg/l del huésped transformado 5H7
con el plásmido pTF50 y pJVG2.
Aunque lo anterior se refiere a realizaciones
determinadas, se entenderá que la presente invención no está por
ello limitada. Se sobreentiende que para un experto en la materia,
es posible realizar diversas modificaciones a las realizaciones
aquí descritas sin desviarse del concepto global de la invención.
Todas estas modificaciones se hallan dentro del ámbito de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
\bullet US 6008023 A, Opper [0005]
\bullet WO 9307896 A [0005]
\bullet US 5648237 A, Carter [0005] [0054]
\bullet US 5585097 A [0008] [0009]
\bullet US 4816567 A [0027] [0084]
\bullet US 5500362 A [0032]
\bullet US 5821337 A [0032]
\bullet WO 9317715 A [0052]
\bullet US 5840523 A [0062] [0063] [0149]
\bullet US 5639635 A [0064] [0195] [0195]
\bullet US 6083715 A, Georgiou [0074]
\bullet US 6027888 A, Georgiou [0074]
\bullet US 5264365 A, Georgiou [0075]
\bullet US 5508192 A, Georgiou [0075]
\bullet WO 9951642 A [0102]
\bullet US 5648260 A [0102]
\bullet US 5624821 A [0102]
\bullet WO 9429351 A [0102]
\bullet US 5208020 A [0104]
\bullet US 5714586 A [0106]
\bullet US 5712374 A [0106]
\bullet US 5264586 A [0106]
\bullet US 5773001 A [0106]
\bullet WO 9321232 A [0107]
\bullet WO 9411026 A [0110]
\bullet EP 0401384 A [0114]
\bullet EP 0154316 A [0114]
\bullet WO 9848837 A [0114]
\bullet US 3773919 A [0119]
\bullet US 4737456 A [0121]
\bullet US 3940475 A [0122]
\bullet US 3645090 A [0122]
\bulletKIPRIYANOV; LITTLE.
Mol. Biotech., 1999, vol. 12, 173-201
[0002]
\bulletPLUCKTHUN; PACK.
Immunotech, 1997, vol. 3, 83-105
[0003] [0006]
\bulletZEMEL-DREASEN et al. Gene, 1984, vol. 27, 315-322
[0005]
\bulletKIPRIYANOV. Little Mol.
Biotech., 1999, vol. 12, 173-201
[0006]
\bulletPLUCKTHUN et al.
ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH. Oxford Press,
1996, 203-252 [0006]
\bulletPLUCKTHUN. HANDBOOK OF EXP.
PHARMCOL vol 3: The Pharmcol. of Monoclonal Antibodies.
Springer-Verlag, 1994, vol. 3,
269-315 [0006]
\bulletFRIEND et al.
Transplantation, 1999, vol. 68, 1632-1637
[0008]
\bulletARMOUR et al. Eur. J.
Immunol., 1999, vol. 29, 2613-2624
[0008]
\bulletTHOMPSON et al. J. Immunol
Meth, 1999, vol. 227, 17-29 [0008]
\bulletREDDY et al. J. Immunol,
2000, vol. 164, 1925-1933 [0008]
\bulletISAACS et al. Clin. Exp.
Immunol., 1996, vol. 106, 427-433
[0008]
\bulletABBAS et al. Cellular and
Mol. Immunology. 2000 [0022]
\bulletMORRISON et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 6851-6855
[0027]
\bulletJONES et al. Nature,
1986, vol. 321, 522-525 [0028] [0084]
\bulletRIECHMANN et al. Nature,
1988, vol. 332, 323-329 [0028]
\bulletPRESTA. Curr. Op. Struct.
Biol., 1992, vol. 2, 593-596 [0028]
\bulletVASWANI; HAMILTON.
Ann. Allergy, Asthma & Immunol., 1998, vol. 1,
105-115 [0028]
\bulletHARRIS. Biochem. Soc.
Transactions, 1995, vol. 23, 1035-1038
[0028]
\bulletHURLE; GROSS. Curr.
Op. Biotech., 1994, vol. 5, 428-433
[0028]
\bulletMARKS et al.
Bio/Technology, 1992, vol. 10, 779-783
[0030]
\bulletBARBAS et al. Proc Nat.
Acad. Sci, USA, 1994, vol. 91, 3809-3813
[0030]
\bulletSCHIER et al. Gene,
1995, vol. 169, 147-155 [0030]
\bulletYELTON et al. J.
Immunol., 1995, vol. 155, 1994-2004
[0030]
\bulletJACKSON et al. J.
Immunol., 1995, vol. 154 (7), 3310-9
[0030]
\bulletHAWKINS et al. J. Mol.
Biol., 1992, vol. 226, 889-896 [0030]
\bulletAnnu. Rev. Immunol,
1991, vol. 9, 457-92 [0032]
\bulletCLYNES et al. PNAS
(USA), 1998, vol. 95, 652-656 [0032]
\bulletDAËRON. Annu. Rev.
Immunol., 1997, vol. 15, 203-234
[0033]
\bulletRAVETCH; KINET. Annu.
Rev. Immunol, 1991, vol. 9, 457-92
[0033]
\bulletCAPEL et al.
Immunomethods, 1994, vol. 4, 25-34
[0033]
\bulletHAAS et al. J. Lab. Clin.
Med., 1995, vol. 126, 330-41 [0033]
\bulletGUYER et al. J.
Immunol., 1976, vol. 117, 587 [0033]
\bulletKIM et al. J. Immunol.,
1994, vol. 24, 249 [0033]
\bulletGAZZANO-SANTORO et al. J. Immunol. Methods, 1996, vol. 202, 163
[0034]
\bulletAgnew Chem Intl. Ed. Engl.,
1994, vol. 33, 183-186 [0037]
\bulletMILLSTEIN et al. Nature,
1983, vol. 305, 537-539 [0052]
\bulletKOSTELNY et al. J.
Immunol., 1992, vol. 148, 1547-1553
[0052]
\bulletSIEBENLIST et al. Cell,
1980, vol. 20, 269 [0058]
\bulletPROBA; PLUCKTHUN.
Gene, 1995, vol. 159, 203 [0061]
\bulletYANSURA et al. METHODS:
A Companion to Methods in Enzymol., 1992, vol. 4,
151-158 [0062]
\bulletBACHMANN. Cellular and
Molecular Biology. American Society for Microbiology, 1987,
vol. 2, 1190-1219 [0074]
\bulletBASS et al. Proteins,
1990, vol. 8, 309-314 [0064]
\bulletCHEN et al. J Bio Chem,
1999, vol. 274, 19601-19605 [0074]
\bulletBOTHMANN; PLUCKTHUN.
J. Biol. Chem., 2000, vol. 275,
17100-17105 [0074]
\bulletRAMM; PLUCKTHUN. J.
Biol. Chem., 2000, vol. 275, 17106-17113
[0074]
\bulletARIE et al. Mol.
Microbiol., 2001, vol. 39, 199-210
[0074]
\bulletHARA et al. Microbial Drug
Resistance, 1996, vol. 2, 63-72
[0075]
\bulletLINDMARK et al. J. Immunol.
Meth., 1983, vol. 62, 1-13 [0078]
\bulletRIECHMANN et al. Nature,
1988, vol. 332, 323-327 [0084]
\bulletVERHOEYEN et al.
Science, 1988, vol. 239, 1534-1536
[0084]
\bulletSIMS et al. J. Immunol.,
1993, vol. 151, 2296 [0085]
\bulletCHOTHIA et al. J. Mol.
Biol., 1987, vol. 196, 901 [0085]
\bulletCARTER et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 4285 [0085]
\bulletPRESTA et al. J.
Immunol., 1993, vol. 151, 2623 [0085]
\bulletCUNNINGHAM; WELLS.
Science, 1989, vol. 244, 1081-1085
[0088]
\bulletDUNCAN; WINTER.
Nature, 1988, vol. 322, 738-40
[0102]
\bulletCHARI et al. Cancer
Research, 1992, vol. 52, 127-131 [0105]
[0110]
\bulletHINMAN et al. Cancer
Research, 1993, vol. 53, 3336-3342
[0106]
\bulletLODE et al. Cancer
Research, 1998, vol. 58, 2925-2928
[0106]
\bulletVITETTA et al. Science,
1987, vol. 238, 1098 [0110]
\bulletRemington's Pharmaceutical
Sciences. 1980 [0115] [0117]
\bulletHUNTER et al. Nature,
1962, vol. 144, 945 [0122]
\bulletDAVID et al.
Biochemistry, 1974, vol. 13, 1014-1021
[0122]
\bulletPAIN et al. J. Immunol.
Methods, 1981, vol. 40, 219-230
[0122]
\bulletNYGREN. Histochem. and
Cytochem, 1982, vol. 30, 407-412
[0122]
\bullet Methods for the Preparation of
Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme
Immunoassay. O'SULLIVAN et al. Methods in Enzymology.
Academic Press, 1981, vol. 73, 147-166
[0122]
\bulletSUTCLIFFE. Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol., 1978, vol. 43,
77-90 [0136]
\bulletKIKUCHI et al. Nucleic Acids
Res., 1981, vol. 9 (21), 5671-5678
[0136]
\bulletSCHOLTISSEK; GROSSE.
Nucleic Acids Res., 1987, vol. 15, 3185 [0136]
\bulletYANOFSKY et al. Nucleic
Acids Res., 1981, vol. 9, 6647-6668
[0136]
\bulletPICKEN et al. Infect.
Immun., 1983, vol. 42, 269-275 [0136]
[0136]
\bulletCHANG et al. Gene,
1987, vol. 55, 189-196 [0136]
\bulletSIMMONS; YANSURA.
Nature Biotechnology, 1996, vol. 14,
629-634 [0136] [0139] [0140]
\bulletCARTER et al.
Bio/Technology, 1992, vol. 10, 12-16
[0138]
\bulletMATSUDAIRA. J. Biol.
Chem., 1987, vol. 262, 10035-10038
[0147]
\bulletHENZEL et al. Methods: A
Companion to Methods Enzymol., 1994, vol. 6,
239-247 [0147]
\bulletSIMMONS et al. Nature
Biotechnol., 1996, vol. 14, 629-634
[0149]
\bulletIDUSOGIE et al. J.
Immuno, 2000, vol. 164, 4178-4184
[0182]
\bulletPRESTA et al. Cancer
Res., 1997, vol. 57, 4593-4599 [0187]
\bulletPRESTA et al. J.
Immunol., 1993, vol. 151, 2623-2632
[0187]
\bulletFRANCISCO et al. Cancer
Res., 2000, vol. 60, 3225-3231 [0187]
\bulletCARTER et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 4285-4289
[0187]
\bulletFENDLY et al. Cancer
Res., 1990, vol. 50, 1550-1558 [0187]
\bulletEIGENBROT et al.
Proteins: Structure, Function, and Genetics, 1994, vol. 18,
49-62 [0187]
Claims (41)
1. Molécula polinucleotídica que codifica una
inmunoglobulina, dicha molécula polinucleotídica comprende (1) un
primer promotor y un primer cistrón que forma una primera pareja
promotor-cistrón y (2) un segundo promotor y un
segundo cistrón que forman una segunda pareja de
promotor-cistrón, en donde el primer cistrón de la
mencionada primera pareja promotor-cistrón
comprende una primera región de iniciación de la traducción
(TIR-L) unida operativamente con una secuencia de
ácido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, y
el segundo cistrón de la mencionada segunda pareja
promotor-cistrón comprende un segunda región de
inicio de la traducción (TIR-H) operativamente
unida a una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena
pesada de inmunoglobulina, en donde tras la expresión del
mencionado polinucleótido en una célula huésped procariota, las
cadenas ligera y pesada se pliegan y ensamblan para formar una
inmunoglobulina activa biológicamente.
2. Molécula polinucleotídica según la
reivindicación 1, en donde el primer y segundo promotor son
promotores procariotas seleccionados a partir del grupo que
consiste en los promotores phoA, tac, Lpp, lac-Lpp,
laca, ara, trp, trc y T7.
3. Molécula polinucleotídica según la
reivindicación 21, en donde ambos promotores son promotores
phoA.
4. Molécula polinucleotídica según la
reivindicación 1, en donde cada TIR-H y
TIR-L comprende una secuencia señal de secreción o
variante de lo mismo.
5. Molécula polinucleotídica según la
reivindicación 41, en donde la secuencia señal procariota se
selecciona a partir del grupo que consiste en STII, OmpA, PhoE,
LamB, MBP, y secuencias señal de secreción de PhoA.
6. Molécula polinucleotídica según la
reivindicación 1, en donde TIR-H y
TIR-L proporciona aproximadamente intensidades de
traducción similares.
7. Molécula polinucleotídica según la
reivindicación 61, en donde la combinación de intensidad de
traducción relativa se aproximadamente
1-TIR-L y
1-TIR-H.
8. Vector recombinante para la expresión de un
inmunoglobulina en una célula huésped procariota, dicho vector
comprende la molécula polinucleotídica de la reivindicación 1.
9. Célula huésped procariota que comprende el
vector recombinante de la reivindicación 8.
10. Célula huésped procariota según la
reivindicación 9, la cual es una célula de bacteria
gram-negativa.
11. Célula huésped según la reivindicación 10
que es E. coli.
12. Célula huésped según la reivindicación 11,
que además comprende un polinucleótido que codifica al menos un
polipéptido procariota seleccionado a partir del grupo que consiste
en DsbA, DsbC, DsbG y FkpA.
13. Célula huésped según la reivindicación 12,
en donde el polinucleótido codifica tanto DsbA como DsbC.
14. Célula huésped según la reivindicación 11,
en donde E. coli es una cepa deficiente en actividad proteasa
endógena.
15. Célula huésped según la reivindicación 14,
en donde el genotipo de la cepa E. coli carece de los genes
degP y prc y porta un gen spr mutante.
16. Proceso para la producción de un anticuerpo
intacto activo biológicamente en una célula huésped procariota,
dicho proceso comprende la expresión en la célula huésped de un
polinucleótido que comprende
- (1)
- un primer promotor y un primer cistrón que forman una primera pareja promotor-cistrón y (2) un segundo promotor y un segundo cistrón que forman una segunda pareja promotor-cistrón que comprende una primera región de inicio de la traducción (TIR-L) unido operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina y el segundo cistrón de la mencionada segunda pareja promotor-cistrón comprende una segunda región de inicio de la traducción (TIR-H) operativamente unida a una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina, en donde tras la expresión del mencionado polinucleótido, la cadena ligera de inmunoglobulina y la cadena ligera de inmunoglobulina se secretan, se pliegan y se ensamblan para formar el anticuerpo intacto biológicamente activo; y
la recuperación del mencionado anticuerpo
biológicamente activo.
17. Proceso según la reivindicación 16, en donde
el primer y segundo promotor son promotores procariotas
seleccionados de entre el grupo consistente en los promotores phoA,
tac, lpp, lac-lpp, lac, ar, trp, trc y T7.
18. Proceso según la reivindicación 17, en donde
el primer y el segundo promotor son promotores PhoA.
19. Proceso según la reivindicación 16, en donde
cada TIR-H y TIR-L comprende una
secuencia señal de secreción procariota o variante de lo mismo.
20. Proceso según la reivindicación 19, en donde
la secuencia señal de secreción procariota se selecciona a partir
del grupo que consiste en las secuencias señal de STII, OmpA, PhoE,
LamB, MBP y PhoA.
21. Proceso según la reivindicación 16, en donde
TIR-L y TIR-H proporcionan
aproximadamente intensidades de traducción similares.
22. Proceso según la reivindicación 21, en donde
la combinación de intensidad traduccional relativa es de
aproximadamente 1-TIR-L,
1-TIR-H.
23. Proceso según la reivindicación 19, en donde
la célula huésped procariota es E. coli.
24. Proceso según la reivindicación 16, que
además comprende la expresión en la célula huésped procariota de un
polinucleótido que codifica al menos un polipéptido señal procariota
seleccionado a partir del grupo que consiste en DsbA, DSbC, DsbG y
FkpA.
25. Proceso según la reivindicación 24, en donde
el polinucleótido codifica tanto DsbA como DsbC.
26. Proceso según la reivindicación 23, en donde
E. coli es una cepa deficiente en la actividad proteasa
endógena.
27. Proceso según la reivindicación 26, en donde
el genotipo de E. coli carece de los genes degP y prc y porta
un gen mutante spr.
28. Procedimiento para la producción
independiente de una cadena ligera y una pesada de inmunoglobulina
en una célula huésped procariota que comprende:
La expresión en la célula huésped de uno o más
polinucleótidos que comprenden:
- 1)
- un primer promotor y un primer cistrón que comprenden una primera región de inicio de traducción (TIR-L) unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina; y
- 2)
- un segundo promotor y un segundo cistrón que comprenden una segunda región de inicio de traducción (TIR-H) unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina, en donde el primer y segundo promotor proporcionan la expresión independiente de la cadena pesada y de la cadena ligera de inmunoglobulina de modo que la proporción de la cadena ligera y de la cadena pesada producidas pueda variar para formar un anticuerpo biológicamente activo.
29. Proceso según la reivindicación 28,en donde
el primer y segundo promotor son promotores procariotas
seleccionados a partir del grupo que consiste en los promotores
phoA, tac, lpp, laca-lpp, lac, ara, trp y T7.
30. Proceso según la reivindicación 29, en donde
el primer y segundo promotor son PhoA.
31. Proceso según la reivindicación 28, en donde
cada TIR-L y TIR-H comprende una
secuencia señal procariota o una variante de lo mismo.
32. Proceso según la reivindicación 31, en donde
la secuencia señal procariota se selecciona a partir del grupo
consistente en las secuencias señal STII, OmpA, PhoE, LamB, MBP y
PhoA.
33. Proceso según la reivindicación 28, en donde
TIR-L y TIR-H proporcionan
aproximadamente intensidades de traducción similares.
34. Proceso según la reivindicación 33, en donde
la combinación de intensidad de traducción relativa es de
aproximadamente 1-TIR-L,
1-TIR-H.
35. Proceso según la reivindicación 28, en donde
la célula huésped procariota es E. coli.
36. Proceso según la reivindicación 28, que
además comprende la expresión en la célula huésped procariota de un
polinucleótido que codifica al menos un polipéptido señal procariota
seleccionado a partir del grupo que consiste en DsbA, DSbC, DsbG y
FkpA.
37. Proceso según la reivindicación 36, en donde
el polinucleótido codifica tanto DsbA como DsbC.
38. Proceso según la reivindicación 37, en donde
E. coli es una cepa deficiente en la actividad proteasa
endógena.
39. Proceso según la reivindicación 38, en donde
el genotipo de E. coli carece de los genes degP y
prc y porta un gen mutante spr.
40. Procedimiento según la reivindicación 28, en
donde TIR-L proporciona la producción de
aproximadamente la misma cantidad de cadena ligera que la cantidad
de cadena pesada.
41. Procedimiento según la reivindicación 28,
que además comprende la recuperación del anticuerpo biológicamente
activo de la célula huésped.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US25616400P | 2000-12-14 | 2000-12-14 | |
US256164P | 2000-12-14 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2312494T3 true ES2312494T3 (es) | 2009-03-01 |
Family
ID=22971295
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES01993297T Expired - Lifetime ES2312494T3 (es) | 2000-12-14 | 2001-12-13 | Produccion de anticuerpos completos en celulas procariotas. |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1356052B1 (es) |
JP (1) | JP4309656B2 (es) |
KR (1) | KR100879194B1 (es) |
AT (1) | ATE405650T1 (es) |
AU (1) | AU2002245142B2 (es) |
CA (1) | CA2430182C (es) |
DE (1) | DE60135498D1 (es) |
DK (1) | DK1356052T3 (es) |
ES (1) | ES2312494T3 (es) |
MX (1) | MXPA03005273A (es) |
WO (1) | WO2002061090A2 (es) |
Families Citing this family (66)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MXPA04001566A (es) * | 2001-08-27 | 2004-05-17 | Genentech Inc | Un sistema para expresion y ensamblado de anticuerpos. |
EP1908769A1 (en) * | 2001-08-27 | 2008-04-09 | Genentech, Inc. | A system for antibody expression and assembly |
US20050123925A1 (en) * | 2002-11-15 | 2005-06-09 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
US8188231B2 (en) | 2002-09-27 | 2012-05-29 | Xencor, Inc. | Optimized FC variants |
US8093357B2 (en) | 2002-03-01 | 2012-01-10 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants and methods for their generation |
US7317091B2 (en) | 2002-03-01 | 2008-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
US20040132101A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Xencor | Optimized Fc variants and methods for their generation |
EP1513554B9 (en) | 2002-05-30 | 2011-11-09 | Macrogenics, Inc. | Cd16a binding proteins and use for the treatment of immune disorders |
EP1539798B1 (en) | 2002-09-06 | 2010-11-24 | Genentech, Inc. | Process for protein extraction |
US9453251B2 (en) | 2002-10-08 | 2016-09-27 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
MXPA05004677A (es) | 2002-10-31 | 2005-11-17 | Genentech Inc | Metodos y composiciones para aumentar la produccion de anticuerpos. |
WO2004065417A2 (en) * | 2003-01-23 | 2004-08-05 | Genentech, Inc. | Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture |
US20090010920A1 (en) | 2003-03-03 | 2009-01-08 | Xencor, Inc. | Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb |
US8084582B2 (en) | 2003-03-03 | 2011-12-27 | Xencor, Inc. | Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants |
US8388955B2 (en) | 2003-03-03 | 2013-03-05 | Xencor, Inc. | Fc variants |
US9051373B2 (en) | 2003-05-02 | 2015-06-09 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
NZ545776A (en) | 2003-08-22 | 2009-05-31 | Biogen Idec Inc | Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same |
US9714282B2 (en) | 2003-09-26 | 2017-07-25 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants and methods for their generation |
US8101720B2 (en) | 2004-10-21 | 2012-01-24 | Xencor, Inc. | Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions |
JP2005241389A (ja) * | 2004-02-25 | 2005-09-08 | Ochiyanomizu Jiyoshi Univ | 蛍光標識糖鎖の特異的固定化試薬および固定化方法 |
US20150010550A1 (en) | 2004-07-15 | 2015-01-08 | Xencor, Inc. | OPTIMIZED Fc VARIANTS |
JP2008507294A (ja) | 2004-07-26 | 2008-03-13 | ダウ グローバル テクノロジーズ インコーポレイティド | 菌株遺伝子操作による改善されたタンパク質発現のための方法 |
US8546543B2 (en) | 2004-11-12 | 2013-10-01 | Xencor, Inc. | Fc variants that extend antibody half-life |
KR101027427B1 (ko) | 2004-11-12 | 2011-04-11 | 젠코어 인코포레이티드 | FcRn에 대하여 증가된 결합력을 갖는 Fc 변이체 |
US8367805B2 (en) | 2004-11-12 | 2013-02-05 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
US8802820B2 (en) | 2004-11-12 | 2014-08-12 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
WO2007041635A2 (en) | 2005-10-03 | 2007-04-12 | Xencor, Inc. | Fc variants with optimized fc receptor binding properties |
JP4860703B2 (ja) | 2005-10-06 | 2012-01-25 | ゼンコー・インコーポレイテッド | 最適化された抗cd30抗体 |
PT2059536E (pt) | 2006-08-14 | 2014-04-14 | Xencor Inc | Anticorpos otimizados que visam cd19 |
WO2008036688A2 (en) | 2006-09-18 | 2008-03-27 | Xencor, Inc. | Optimized antibodies that target hm1.24 |
EP1905839B2 (de) * | 2006-09-22 | 2019-07-10 | Wacker Chemie AG | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Proteinen |
DE502006009060D1 (de) * | 2006-09-22 | 2011-04-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Antikörpern |
DK1903105T3 (da) * | 2006-09-22 | 2010-06-28 | Wacker Chemie Ag | Fremgangsmåde til fermentativ fremstilling af proteiner |
US9580719B2 (en) | 2007-04-27 | 2017-02-28 | Pfenex, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
AU2008245696B2 (en) | 2007-04-27 | 2013-11-07 | Pelican Technology Holdings, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
WO2009021548A1 (en) * | 2007-08-10 | 2009-02-19 | Wacker Chemie Ag | Expression of full length igg and secretion into the culture medium of prokaryotic cells |
SI2235059T1 (sl) | 2007-12-26 | 2015-06-30 | Xencor, Inc. | Fc variante s spremenjeno vezjo na fcrn |
UA104626C2 (ru) | 2009-06-17 | 2014-02-25 | Эббви Биотерапеутикс Инк. | Анти-vegf антитело и его применение |
WO2011028952A1 (en) | 2009-09-02 | 2011-03-10 | Xencor, Inc. | Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens |
IN2012DN02401A (es) | 2009-09-24 | 2015-08-21 | Ucb Pharma Sa | |
KR101968766B1 (ko) * | 2009-11-05 | 2019-04-12 | 제넨테크, 인크. | 이종 폴리펩티드의 분비를 위한 방법 및 조성물 |
GB201000591D0 (en) | 2010-01-14 | 2010-03-03 | Ucb Pharma Sa | Bacterial hoist strain |
GB201000587D0 (en) | 2010-01-14 | 2010-03-03 | Ucb Pharma Sa | Bacterial hoist strain |
GB201000588D0 (en) * | 2010-01-14 | 2010-03-03 | Ucb Pharma Sa | Bacterial host strain |
GB201000590D0 (en) | 2010-01-14 | 2010-03-03 | Ucb Pharma Sa | Bacterial host strain |
WO2011091078A2 (en) | 2010-01-19 | 2011-07-28 | Xencor, Inc. | Antibody fc variants with enhanced complement activity |
GB201012599D0 (en) | 2010-07-27 | 2010-09-08 | Ucb Pharma Sa | Process for purifying proteins |
BR112013032871B1 (pt) | 2011-07-13 | 2022-09-27 | Ucb Pharma S.A. | Cepa hospedeira bacteriana que expressa dsbc recombinante e método para produzir anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste que se liga especificamente a cd154 |
GB201208367D0 (en) | 2012-05-14 | 2012-06-27 | Ucb Pharma Sa | Biological product |
EP2861068A4 (en) * | 2012-06-01 | 2016-04-13 | Momenta Pharmaceuticals Inc | METHODS ASSOCIATED WITH BEVACIZUMAB |
EP2856159A4 (en) | 2012-06-01 | 2016-04-13 | Momenta Pharmaceuticals Inc | METHODS RELATING TO DENOSUMAB |
US20150353940A1 (en) | 2013-08-05 | 2015-12-10 | Absci, Llc | Vectors for use in an inducible coexpression system |
US20140154255A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Abbvie Biotherapeutics Inc. | Anti-vegf antibodies and their uses |
US10435694B2 (en) | 2014-03-14 | 2019-10-08 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides |
EP3122900A1 (en) | 2014-03-24 | 2017-02-01 | F. Hoffmann-La Roche AG | Cancer treatment with c-met antagonists and correlation of the latter with hgf expression |
RU2732148C2 (ru) * | 2014-07-09 | 2020-09-11 | Люпин Лимитед | Двухцистронная бактериальная система экспрессии |
KR20170075793A (ko) * | 2014-11-05 | 2017-07-03 | 제넨테크, 인크. | 박테리아 내 2쇄 단백질을 생산하는 방법 |
KR102544705B1 (ko) | 2014-11-05 | 2023-06-15 | 제넨테크, 인크. | 박테리아 내 2쇄 단백질을 생산하는 방법 |
AR103852A1 (es) | 2015-03-06 | 2017-06-07 | Genentech Inc | DsbA Y DsbC ULTRAPURIFICADOS Y SUS MÉTODOS DE PREPARACIÓN Y USO |
JP7091238B2 (ja) * | 2015-08-20 | 2022-06-27 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | Fkpaの精製、及び組換えポリペプチドの産生のためのその使用 |
MX2018014047A (es) | 2016-05-17 | 2019-06-20 | Genentech Inc | Firmas de genes estromales para el diagnóstico y uso en inmunoterapia. |
AR108800A1 (es) | 2016-06-17 | 2018-09-26 | Genentech Inc | Purificación de anticuerpos multiespecíficos |
GB201617270D0 (en) * | 2016-10-11 | 2016-11-23 | Argen-X N V And Fairjourney Biologics | Triple vector for expressing antibody molecules in full therapeutic format |
CA3083472A1 (en) | 2017-11-27 | 2019-05-31 | 4D Molecular Therapeutics Inc. | Adeno-associated virus variant capsids and use for inhibiting angiogenesis |
CN110283248B (zh) * | 2018-01-05 | 2020-07-28 | 百奥泰生物制药股份有限公司 | 一种长效低毒的重组抗vegf人源化单克隆抗体及其生产方法 |
AU2019375413A1 (en) | 2018-11-05 | 2021-05-27 | Genentech, Inc. | Methods of producing two chain proteins in prokaryotic host cells |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1341235C (en) * | 1987-07-24 | 2001-05-22 | Randy R. Robinson | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
WO1993008300A1 (en) * | 1991-10-18 | 1993-04-29 | The University Of Calgary | Expression-secretion vectors for the production of biologically active fv fragments |
US20020037558A1 (en) * | 1991-10-23 | 2002-03-28 | Kin-Ming Lo | E.coli produced immunoglobulin constructs |
GB9206422D0 (en) * | 1992-03-24 | 1992-05-06 | Bolt Sarah L | Antibody preparation |
US5747662A (en) * | 1995-03-01 | 1998-05-05 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides |
US5840523A (en) * | 1995-03-01 | 1998-11-24 | Genetech, Inc. | Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides |
DE19802139C1 (de) * | 1998-01-22 | 1999-09-23 | Centeon Pharma Gmbh | Monoklonaler Antikörper spezifisch für aktivierten Gerinnungsfaktor VII und seine Verwendung |
-
2001
- 2001-12-13 KR KR1020037007845A patent/KR100879194B1/ko active IP Right Grant
- 2001-12-13 AU AU2002245142A patent/AU2002245142B2/en not_active Ceased
- 2001-12-13 CA CA2430182A patent/CA2430182C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-13 WO PCT/US2001/048691 patent/WO2002061090A2/en active IP Right Grant
- 2001-12-13 DE DE60135498T patent/DE60135498D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-13 AT AT01993297T patent/ATE405650T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-12-13 ES ES01993297T patent/ES2312494T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-13 JP JP2002561645A patent/JP4309656B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-12-13 MX MXPA03005273A patent/MXPA03005273A/es active IP Right Grant
- 2001-12-13 DK DK01993297T patent/DK1356052T3/da active
- 2001-12-13 EP EP01993297A patent/EP1356052B1/en not_active Revoked
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1356052A2 (en) | 2003-10-29 |
DE60135498D1 (de) | 2008-10-02 |
ATE405650T1 (de) | 2008-09-15 |
WO2002061090A3 (en) | 2003-08-21 |
CA2430182A1 (en) | 2002-08-08 |
WO2002061090A2 (en) | 2002-08-08 |
KR100879194B1 (ko) | 2009-01-16 |
CA2430182C (en) | 2011-01-25 |
KR20030074654A (ko) | 2003-09-19 |
JP4309656B2 (ja) | 2009-08-05 |
JP2004530419A (ja) | 2004-10-07 |
EP1356052B1 (en) | 2008-08-20 |
MXPA03005273A (es) | 2003-09-25 |
AU2002245142B2 (en) | 2007-07-05 |
DK1356052T3 (da) | 2008-12-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2312494T3 (es) | Produccion de anticuerpos completos en celulas procariotas. | |
US6979556B2 (en) | Separate-cistron contructs for secretion of aglycosylated antibodies from prokaryotes | |
US7608429B2 (en) | Methods and compositions for increasing antibody production | |
JP4461210B2 (ja) | 抗体発現系とその構築法 | |
AU2002245142A1 (en) | Prokaryotically produced antibodies and uses thereof | |
JP6173690B2 (ja) | 異種ポリペプチドの分泌のための方法及び組成物 | |
EP1908769A1 (en) | A system for antibody expression and assembly | |
AU2008202185B2 (en) | A System for antibody expression and assembly | |
AU2002327540A1 (en) | A system for antibody expression and assembly |