KR20180104635A - 항체 및 이의 접합체 - Google Patents

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디. 빅터 페를로스
와 위엔 투
홍 리앙
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코디악 사이언시스 인코포레이티드
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Abstract

본 명세서에서는 항-VEGF-A 항체 및 이의 항체 접합체가 제공된다. 항체의 몇몇 실시형태는 HEMA-PC 중합체와 같은 모이어티에 접합될 수 있다. 항체 접합체의 몇몇 실시형태는 항체 활성도를 보유 또는 향상시킬 수 있다. 항체 및 이의 접합체는 당뇨병성 망막병증을 치료하는데 특히 유용할 수 있다. 또한 단백질, 예를 들어, 항체, 예컨대, IgG1에 중합체의 접합을 위한 방법이 제공된다.

Description

항체 및 이의 접합체
임의의 우선 출원에 대한 참조에 의한 편입
외국 또는 국내 우선권 주장이 본 출원과 함께 출원된 출원 데이터 시트에서 확인되는 임의의 모든 출원은 37 CFR §1.57 하에 참고로 본 명세서에 편입된다.
서열 목록
본 출원은 전자 형식을 서열 목록과 함께 출원되고 있다. 서열 목록은 2016년 12월 28일자로 작성된 KDIAK004.txt라는 명칭의 파일로서 제공되며, 크기는 18,231 바이트이다. 서열 목록의 전자 형식의 정보는 이의 전문이 참고로 본 명세서에 편입된다.
발명의 기술분야
본 발명은 항체 및 이의 접합체, 상기 항체, 이의 접합체 및 기타 단백질 접합체를 이용하는 방법 및 제조하는 방법에 관한 것이다.
당뇨병성 망막병증은 약 20세에서 64세의 사람들에게서 실명의 주요 원인이다[Engelgau M, Geiss L, Saaddine J, Boyle J, et al. 2004. The Evolving Diabetes Burden in the United States. Ann of Int Med. 140 (11): 945-951]. 미국에서, 당뇨병성 망막병증은 실명의 새로운 사례의 약 12%를 차지한다. 전형적으로 당뇨병성 망막병증의 경우에, 망막 혈관이 팽창하여 눈 뒤쪽으로 유체가 누설될 것이다. 고혈당은 기저막의 벽내 및 농축을 유발하여 누설성 또는 투과성 혈관을 초래한다.
당뇨병성 망막병증에서, 혈당 수준의 변화는 망막 혈관에 변화를 초래한다. 진성 당뇨병을 지니는 사람들은 모두 위험에 있다. 당뇨병이 길수록, 일부 안과적 문제가 발생할 확률이 더 높다. 당뇨병으로 진단된 미국인의 40 내지 45%는 당뇨병 성 망막증의 일부 단계에 있다[Causes and Risk Factors. Diabetic Retinopathy. United States National Library of Medicine. 15 September 2009].
당뇨병성 망막병증은 먼저 망막의 미세동맥류의 발달에 나타난다. 미세동맥류는 망막에 공급하는 모세혈관(매우 작은 혈관)의 부종이 있을 때 발생한다. 상대적으로 적은 수의 미세동맥류의 존재는 통상 시력에 문제를 일으키지 않을 것이다. 그러나 망막병증이 후기 단계로 진행되면, 시력 손실의 상당한 가능성이 있다. 이러한 초기 단계의 망막병증은 배경 당뇨성 망막증 또는 비증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR)이라 지칭된다. NPDR 환자는 일반적으로 무증상이지만, 망막병증의 조기 검출은 중요한데, 그 이유는 질환이 후기 단계로 진행되면 상당한 시력 상실이 될 가능성이 매우 높다.
당뇨병성 망막병증의 다음 단계에서, 혈관신생이 눈 뒤쪽에서 일어난다(증식성 당뇨병성 망막병증). 혈관신생은 누설성이고, 혈관이 터져서 출혈이 생기고 흐릿해 지거나 시야가 흐려지게 된다. 눈에 산소가 없기 때문에, 더욱더 혈관신생이 일어난다. 혈관은 망막과 함께 그리고 유리체액에서 성장한다. 이러한 혈관이 파열되면, 더 많은 출혈이 있고 망막이 심하게 손상되거나 파괴될 수 있다. 혈관 누출로 인한 황반에서의 유체 축적은 당뇨병성 황반부종이라 불린다. 당뇨병성 망막병증이 있는 많은 환자는 당뇨병성 황반부종을 발생할 것이다.
당뇨병성 망막병증 환자에게는 레이저 수술, 코르티코스테로이드 주입 및 항 VEGF제(예컨대, 아바스틴(AVASTIN)(등록상표)(베바시주맙), 루센티스(LUCENTIS)(등록상표)(라니비주맙) 및 아일리아(Eylea)(등록상표)(아플리베르셉트))의 세 가지 치료 경로가 일반적으로 있다. 레이저 수술은 일반적으로 당뇨병성 망막병증을 치료하는데 효과적이지만, 레이저에 의해 유발된 망막 손상은 빈번한 부작용이다. 트리암시놀론 아세토나이드와 같은 스테로이드 제제는 당뇨병성 망막병증을 치료하기 위해 유리체강내 주사를 통해 투여되었다. 그러나 당뇨병성 망막병증을 치료하기 위해서는 스테로이드 용액을 자주 투여해야 한다. 또한 스테로이드를 이용한 유리체강내 치료는 백내장, 스테로이드-유발 녹내장 및 안내염과 관련이 있었다.
당뇨병성 망막병증을 치료하는 또 다른 방법은 항-VEGF제의 유리체강내 주사이다. 이와 관련하여, 당뇨병성 황반부종 환자에서 루센티스(등록상표)(라니비주맙) 및 아일리아(등록상표)(아플리베르셉트)에 의한 당뇨병성 망막증 치료가 최근 승인되었다. VEGF-유도 요법은 당뇨병성 망막병증뿐만 아니라, 연령 관련 황반변성(Age-Related Macular Degeneration: AMD), 예컨대, 혈관신생(습윤) AMD에도 효과적이다.
본 명세서에서는 포스포릴콜린 함유 중합체에 항체의 가변 영역의 외측에 있는 시스테인에서 결합된 항-VEGF-A 항체의 항체 접합체가 제공되되, 여기서 상기 시스테인은 재조합 DNA 기술을 통해서 부가되었다. 선택적으로 항-VEGF-A 항체는 경쇄와 중쇄를 포함하고, 중쇄는 Fc 영역을 포함한다. 선택적으로, 항-VEGF-A 항체는 면역글로불린 G(IgG)이다. 선택적으로, 시스테인은 중쇄의 Fc 영역에 있다. 선택적으로, 항-VEGF-중쇄는 CDRH1: GYDFTHYGMN(서열번호 9), CDRH2:　WINTYTGEPTYAADFKR(서열번호 10) 및 CDRH3: YPYYYGTSHWYFDV(서열번호 11)을 포함하고, (서열번호 3에서와 같은 순차적인 계수를 통해서) 위치 221은 T이며, 항-VEGF-경쇄는 CDRL1: SASQDISNYLN(서열번호 12), CDRL2: FTSSLHS(서열번호 13) 및 CDRL3: QQYSTVPWT(서열번호 14)를 포함하고, 카바트 위치(Kabat position) 4는 L이다. 선택적으로, 항-VEGF-중쇄 아이소타입은 인간 IgG1이다.
선택적으로, 항-VEGF-A 항체 IgG1의 중쇄 불변 영역은 효과기 기능을 조절하기 위하여 IgG1 불변 영역에 대해서 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 돌연변이는 선택적으로 이하의 아미노산 위치(EU 넘버링(numbering)): E233X, L234X, L235X, G236X, G237X, A327X, A330X 및 P331X 중 하나 이상에 대한 것이며, 여기서 X는 임의의 천연 또는 비천연 아미노산이다. 선택적으로, 돌연변이는 E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S 및 P331S(EU 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 돌연변이는 L234A, L235A 및 G237A(EU 넘버링)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 효과기 기능이 감소된다. 몇몇 실시형태에 있어서, CDC, ADCC, 및/또는 ADCP는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 퍼센트, 또는 그 이상 감소된다. 몇몇 실시형태에 있어서, CDC는 C1q에 Fc 결합에 의해 매개되고, ADCC 및 ADCP는 각종 Fc 감마 수용체에 Fc 결합에 의해 매개되고, 이들 결합 상호작용의 각각은 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 퍼센트, 또는 그 이상 감소된다.
시스테인 잔기는 선택적으로 항-VEGF-중쇄에 있고 선택적으로 Q347C(EU 넘버링) 또는 L443C(EU 넘버링)이다. 선택적으로, 항-VEGF-중쇄는 서열번호 1이고, 항-VEGF-경쇄의 서열은 서열번호 2이다. 선택적으로, 시스테인은 L443C(EU 넘버링)이다.
선택적으로, 포스포릴콜린 함유 중합체는 이하에 제시된 바와 같은 2-(메타크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트(MPC) 단량체를 포함한다:
Figure pct00001
따라서 중합체는 이하의 반복 단위를 포함한다:
Figure pct00002
여기서 n은 1 내지 3000의 정수이고, 물결선은 중합체 중의 단량체 단위들 사이의 부착점을 나타낸다.
중합체 선택적으로 3개 이상의 팔(arm)을 갖거나, 또는 3개 이상의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성된다. 선택적으로, 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 팔을 갖거나, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성된다. 선택적으로, 중합체는 2, 3, 6, 또는 9개의 팔을 갖거나, 또는 2, 3, 6 또는 9개의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성된다. 선택적으로, 중합체는 9개의 팔을 갖거나, 또는 9개의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성된다.
선택적으로, 중합체는 크기 배제 크로마토그래피-다중각 광산란(size exclusion chromatography - multi angle light scattering)(이하 "SEC-MALS")에 의해 측정된 바 약 300,000 내지 약 1,750,000 Da의 분자량을 갖는다. 선택적으로, 중합체는 약 500,000 내지 약 1,000,000 Da의 분자량을 갖는다. 선택적으로, 중합체는 약 600,000 내지 약 800,000 Da의 분자량을 갖는다.
선택적으로, 항체 접합체는 정제되고 중합체는 다분산성이다. 선택적으로, 중합체는 1.2 미만의 다분산도 값(PDI)을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공된 접합체 용액 중 어느 하나는 1.8 이하, 예를 들어, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1 이하의 다분산지수(PDI)를 가질 수 있다.
선택적으로, 항체 접합체는 중합체에 결합된 항-VEGF-A 면역글로불린 G(IgG)를 포함하되, 중합체는 MPC 단량체를 포함하고, 항-VEGF-중쇄의 서열은 서열번호 1이고, 항-VEGF-경쇄의 서열은 서열번호 2이며, 항체는 중합체에 서열번호 1의 C449에서만 결합된다. 선택적으로, 중합체는 9개의 팔을 갖고; 중합체는 약 600,000 내지 약 800,000　Da의 분자량을 갖는다.
선택적으로, 항체 접합체는 중합체에 결합된 항-VEGF-A 면역글로불린 G(IgG)를 포함하되, 중합체는 MPC 단량체를 포함하고, 항-VEGF-중쇄의 서열은 서열번호 1이고, 항-VEGF-경쇄의 서열은 서열번호 2이며, 항체는 중합체에 C443(EU 넘버링)에서만 결합된다. 선택적으로, 중합체는 9개의 팔을 갖고; 중합체는 약 600,000 내지 약 800,000　Da의 분자량을 갖는다.
선택적으로, 항체 접합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00003
여기서: 항-VEGF-A 항체의 각각의 중쇄는 문자 H로 표기되고, 항-VEGF-A 항체의 각각의 경쇄는 문자 L로 표기되며; 중합체는 서열번호 1에서의 C449의 설피드릴을 통해서 항-VEGF-A 항체에 결합되고, 여기서 결합은 중쇄 중 하나 상에 묘사되며; PC는
Figure pct00004
이고, 곡선은 중합체의 나머지 부분에 대한 부착점을 나타내며; X는, a) OR (여기서 R=H, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필임), b) H, 또는 c) Br을 포함하는 임의의 할라이드이고; n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9의 합계가 2500 ± 15%이 되도록, 동일 또는 상이하다. 선택적으로, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는 독립적으로 0 내지 3000의 정수이다. 선택적으로, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는 독립적으로 0 내지 500의 정수이다. 몇몇 실시형태에 있어서, X=OR이되, 여기서 R은 당, 아미노알킬, 이하의 잔기의 단일 치환된, 다치환된 또는 비치환된 변형체: 포화 C1 -C24 알킬, 불포화 C2 -C24 알켄일 또는 C2 -C24 알킨일, 아실, 아실옥시, 알킬옥시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알콕시 카보닐, 알콕시 카보닐아실, 아미노, 아미노카보닐, 아미노카보일옥시, 나이트로, 아지도, 페닐, 하이드록시, 알킬티오, 아릴티오, 옥시설포닐, 카복시, 사이아노, 및 할로겐화 알킬(폴리할로겐화 알킬을 포함함), --CO--O--R7, 카보닐 --CCO--R7, --CO--NR8R9, --(CH2)n--COOR7, --CO--(CH) n--COOR7, --(CH2) n--NR8R9, 에스터, 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐이되, 여기서 n은 1 내지 6의 정수이고, 각각의 R7, R8 및 R9는 개별적으로 수소 원자, 할로겐 원자, 이하의 잔기의 단일 치환된, 다치환된 또는 비치환된 변형체: 포화 C1-C24 알킬, 불포화 C2-C24 알켄일 또는 C2-C24 알킨일, 아실, 아실옥시, 알킬옥시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알콕시 카보닐, 알콕시 카보닐아실, 아미노, 아미노카보닐, 아미노카보일옥시, 나이트로, 아지도, 페닐, 하이드록시, 알킬티오, 아릴티오, 옥시설포닐, 카복시, 사이아노, 및 폴리할로겐화 알킬을 포함하는 할로겐화 알킬, 5-원 고리, 및 6-원 고리로 이루어진 군으로부터 선택된다.
선택적으로, 항체 접합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00005
여기서: 항-VEGF-A 항체의 각각의 중쇄는 문자 H로 표기되고, 항-VEGF-A 항체의 각각의 경쇄는 문자 L로 표기되고; 중합체는 C443(EU 넘버링)의 설피드릴을 통해 항-VEGF-A 항체에 결합되며, 여기서 결합은 중쇄 중 하나 상에 묘사되며; PC는
Figure pct00006
이되, 여기서 곡선은 중합체의 나머지 부분에 대한 부착점을 나타내고; X는, a) OR(여기서 R=H, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필임), b) H, 또는 c) Br을 포함하는 임의의 할라이드이고; n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9의 합계가 2500 ± 15%가 되도록 동일 또는 상이하다. 선택적으로, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는 독립적으로 0 내지 3000의 정수이다. 선택적으로, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는 독립적으로 0 내지 500의 정수이다. 몇몇 실시형태에 있어서, X=OR이되, 여기서 R은 당, 아미노알킬, 이하의 잔기의 단일 치환된, 다치환된 또는 비치환된 변형체: 포화 C1-C24 알킬, 불포화 C2-C24 알켄일 또는 C2-C24 알킨일, 아실, 아실옥시, 알킬옥시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알콕시 카보닐, 알콕시 카보닐아실, 아미노, 아미노카보닐, 아미노카보일옥시, 나이트로, 아지도, 페닐, 하이드록시, 알킬티오, 아릴티오, 옥시설포닐, 카복시, 사이아노, 및 할로겐화 알킬(폴리할로겐화 알킬을 포함함), --CO--O--R7, 카보닐 --CCO--R7, --CO--NR8R9, --(CH2)n--COOR7, --CO--(CH) n--COOR7, --(CH2) n--NR8R9, 에스터, 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐이고, 여기서 n은 1 내지 6의 정수이며, 각각의 R7, R8 및 R9는 수소 원자, 할로겐 원자, 이하의 잔기의 단일 치환된, 다치환된 또는 비치환된 변형체: 포화 C1-C24 알킬, 불포화 C2-C24 알켄일 또는 C2-C24 알킨일, 아실, 아실옥시, 알킬옥시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알콕시 카보닐, 알콕시 카보닐아실, 아미노, 아미노카보닐, 아미노카보일옥시, 나이트로, 아지도, 페닐, 하이드록시, 알킬티오, 아릴티오, 옥시설포닐, 카복시, 사이아노, 및 할로겐화 알킬(폴리할로겐화 알킬을 포함함), 5-원 고리, 및 6-원 고리로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 액체 용액 중의 위에서 기재된 바와 같은 항체 접합체가 제공된다. 선택적으로, 액체 용액은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 갖는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 중쇄와 경쇄를 포함하는 항-VEGF-A 항체가 제공된다. 중쇄는 CDRH1: GYDFTHYGMN(서열번호 9), CDRH2: WINTYTGEPTYAADFKR(서열번호 10) 및 CDRH3: YPYYYGTSHWYFDV(서열번호 11)를 포함하고, (서열번호 3에서와 같은 순차적인 계수를 통해서) 위치 221은 T이며, 경쇄는 CDRL1: SASQDISNYLN(서열번호 12), CDRL2: FTSSLHS(서열번호 13) 및 CDRL3: QQYSTVPWT(서열번호 14)를 포함하고, 카바트 위치 4는 L이다. 선택적으로, 중쇄 아이소타입은 IgG1이고, IgG1 불변 영역은 효과기 기능을 조절하기 위하여 이하의 돌연변이(EU 넘버링): E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S 및 P331S 중 하나 이상을 포함한다. 선택적으로, 항체는 L234A, L235A 및 G237A(EU 넘버링)를 갖는다. 선택적으로, 항-VEGF-중쇄의 서열은 서열번호 1이고, 항-VEGF-경쇄의 서열은 서열번호 2이다.
몇몇 실시형태에 있어서 안질환(ocular disease)의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 상기 방법은 위에서 기재된 바와 같은 항체 접합체, 또는 위에서 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 안질환은 당뇨병성 망막병증, 맥락막 혈관신생(CNV), 연령관련 황반변성(AMD), 당뇨병성 황반부종(DME), 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병(von Hippel-Lindau disease), 눈의 히스토플라스마증, 중심성 망막 정맥 폐쇄(CRVO), 분지된 중심성 망막 정맥 폐쇄(BRVO), 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 미숙아 망막병증(ROP), 결막하 출혈 및 고혈압성 망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 질환은 당뇨병성 망막병증이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 포스포릴콜린 함유 중합체에 접합된 항-VEGF-A 항체를 포함하는 항체 접합체를 제조하는 방법이 제공된다. 해당 방법은 항-VEGF-A 항체를 포스포릴콜린 함유 중합체에 접합시키는 단계를 포함하되; 항-VEGF-A 항체는 재조합 DNA 기술을 통해서 부가된 시스테인 잔를 포함하고, 시스테인은 항체의 가변 영역의 외측에 있으며; 포스포릴콜린 함유 중합체는 말레이미드, 비닐설폰, 오쏘피리딜-다이설파이드 및 아이오도아세트아마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 설피드릴 특이적 반응기를 포함하고; 포스포릴콜린 함유 중합체 상의 설피드릴 특이적 반응기는 항-VEGF-A 항체 상의 시스테인 잔기와 반응하여 항체 접합체를 제조한다.
선택적으로, 항-VEGF-A　항체는 면역글로불린 G(IgG)이고, 시스테인은 항체의 Fc 영역에 있다. 선택적으로, 항-VEGF-A 항체는 경쇄와 중쇄를 포함하고, 여기서 항-VEGF-A 항체 중쇄는 CDRH1: GYDFTHYGMN(서열번호 9), CDRH2: WINTYTGEPTYAADFKR(서열번호 10) 및 CDRH3: YPYYYGTSHWYFDV(서열번호 11)를 포함하고, (서열번호 3에서와 같은 순차적인 계수를 통해서) 위치 221은 T이며, 항-VEGF-A 항체 경쇄는 CDRL1: SASQDISNYLN(서열번호 12), CDRL2: FTSSLHS(서열번호 13) 및 CDRL3: QQYSTVPWT(서열번호 14)를 포함하고, 카바트 위치 4는 L이다. 선택적으로, 항-VEGF-A 항체 중쇄 아이소타입은 IgG1이다.
선택적으로, IgG1 불변 영역은 효과기 기능을 조절하기 위하여 IgG1 불변 영역에 대하여 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 선택적으로, 돌연변이는 이하의 아미노산 위치(EU 넘버링): E233X, L234X, L235X, G236X, G237X, G236X, D270X, K322X, A327X, P329X, A330X, A330X, P331X 및 P331X 중 하나 이상에 대한 것이고, 여기서 X는 임의의 천연 또는 비천연 아미노산. 선택적으로, 돌연변이는 E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S 및 P331S(EU 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 돌연변이는 L234A, L235A 및 G237A(EU 넘버링)이다.
선택적으로, 재조합 DNA 기술에 의해 부가된 시스테인 잔기는 Q347C(EU 넘버링) 및 L443C(EU 넘버링)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 재조합 DNA 기술에 의해 부가된 시스테인 잔기는 L443C(EU 넘버링)이다. 선택적으로, 항-VEGF-중쇄의 서열은 서열번호 1이고, 항-VEGF-경쇄의 서열은 서열번호 2이다.
선택적으로, 포스포릴콜린 함유 중합체는 이하에 제시된 2-(메타크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트(MPC) 단량체를 포함한다:
Figure pct00007
.
따라서 중합체는 이하의 반복 단위를 포함한다:
Figure pct00008
;
여기서 n은 1 내지 3000의 정수이고, 물결선은 중합체 중의 단량체 단위들 간의 부착점을 나타낸다.
선택적으로, 중합체는 3개 이상의 팔을 갖는다. 선택적으로, 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 팔을 갖는다. 선택적으로, 중합체는 2, 3, 6, 또는 9개의 팔을 갖는다. 선택적으로, 중합체는 9개의 팔을 갖는다.
선택적으로, 중합체는 약 300,000 내지 1,750,000 Da의 분자량을 갖는다. 선택적으로, 중합체는 약 500,000 내지 1,000,000 Da의 분자량을 갖는다. 선택적으로, 중합체는 약 600,000 내지 800,000 Da의 분자량을 갖는다.
선택적으로, 상기 방법은 환원된 시스테인 설피드릴기를 생성하는 조건 하에서 항-VEGF-A 항체를 티올 환원제와 접촉시켜, 모든 시스테인 잔기가 환원되어 있는 환원된 항-VEGF-A 항체를 제공하는 단계를 포함하는 추가의 단계를 갖는다. 선택적으로, 티올 환원제는 트리스[2-카복시에틸]포스핀 염산염(TCEP), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 수소화붕소나트륨(NaBH4), 수소화사이아노붕소나트륨(NaCNBH3), β-머캅토에탄올(BME), 시스테인 염산염 및 시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 티올 환원제는 TCEP이다. 선택적으로, 티올 환원제는 항-VEGF-A 항체의 농도에 대해서 1 내지 100배 몰 과잉이다. 선택적으로, 티올 환원제는 항-VEGF-A 항체의 농도에 대해서 20 내지 50배 몰 과잉이다.
선택적으로, 상기 방법은 환원된 항-VEGF-A 항체로부터 티올 환원제를 제거하는 단계, 및 환원된 항-VEGF-A 항체를 산화제로 처리하는 단계를 더 포함한다. 선택적으로, 산화제는 공기, 수성 CuSO4, 또는 데하이드로아스코르브산(DHAA)이다. 선택적으로, 상기 방법은 항체 접합체를 정제시키는 단계를 더 포함한다.
선택적으로, 항체 접합체는 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 수법을 이용해서 정제된다. 선택적으로, 정제된 항체 접합체는 미접합 항-VEGF-A 항체에 대해서 적어도 20% 생물학적 활성도를 보유한다. 선택적으로, 정제된 항체 접합체는 미접합 항-VEGF-A 항체에 대해서 적어도 50% 생물학적 활성도를 보유한다. 선택적으로, 정제된 항체 접합체는 미접합 항-VEGF-A 항체에 대해서 적어도 90% 생물학적 활성도를 보유한다. 선택적으로, 정제된 항체 접합체는 미접합 항-VEGF-A 항체에 대해서 증가된 반감기를 갖는다. 선택적으로, 정제된 항체 접합체는 미접합 항-VEGF-A 항체에 대해서 적어도 1.5배의 반감기 증가를 갖는다.
선택적으로, 상기 방법은 중합 매질 중에서 유리 라디칼 중합성 포스포릴콜린 함유 단량체를 중합하여 포스포릴콜린 함유 중합체를 제공하는 단계를 더 포함하되, 여기서 매질은, 라디칼 중합성 포스포릴콜린 함유 단량체; 전이금속 촉매 Mt (q-1)+(여기서 Mt는 전이금속이고, q는 금속의 최대 산화 상태이며 q-1은 금속의 산화 상태이고, 금속은 촉매로서 작용할 수 있으며, 전이금속 촉매는 Mt(q-1)+X'( q-1) 형태의 염(여기서 X'은 반대 이온 또는 기임)으로서 공급되거나, 또는 전이금속 촉매는 전이금속을 산화된 비활성 상태로부터 환원된 활성 상태로 환원 가능한 환원제와 함께 비활성 금속염을 최고 산화 상태 Mt q +X'q에서 제공함으로써 동소(in situ)에서 공급됨); 리간드; 및 개시제를 포함한다.
선택적으로, 라디칼 중합성 포스포릴콜린 함유 단량체는
Figure pct00009
이다:
여기서 R1은 H 또는 C1-6 알킬이고; R2, R3, R4는 각각 메틸이며; X 및 Y는 각각 2이다.
선택적으로, Mt는 Cu, Fe, Ru, Cr, Mo, W, Mn, Rh, Re, Co, V, Zn, Au 및 Ag로 이루어진 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 금속 촉매는 Mt(q-1)+X'( q-1) 형태의 염으로서 공급된다. 선택적으로, Mt (q-1)+는 Cu1 +, Fe2 +, Ru2 +, Cr2 +, Mo2 +, W2+, Mn3 +, Rh3 +, Re2 +, Co+, V2+, Zn+, Au+ 및 Ag+로 이루어진 군으로부터 선택되고, X'은 할로겐, C1-6 알콕시, (SO4)1/2, (PO4)1/3, (R7PO4)1/2, (R72PO4), 트라이플레이트, 헥사플루오로포스페이트, 메탄설포네이트, 아릴설포네이트, CN 및 R7CO2로 이루어진 군으로부터 선택되되, R7은 H, 또는 할로겐으로 1 내지 5회 치환될 수 있는 직쇄형 또는 분지쇄형 C1-6 알킬기이다. 선택적으로, Mt (q-1)+는 Cu1 +이고 X'은 Br이다. 선택적으로, Mt (q-1)+는 동소에서 공급된다. 선택적으로, Mt q +Xq는 CuBr2이다.
선택적으로, 환원제는 무기 화합물이다. 선택적으로, 무기 화합물은 낮은 산화 수준의 황 화합물, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 금속 이온을 포함하는 무기염, 금속, 하이드라진 수화물, 및 이러한 화합물의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
선택적으로, 환원제는 금속이다. 선택적으로, 환원제는 Cu0이다.
선택적으로, 환원제는 유기 화합물이다. 선택적으로, 유기 화합물은 알킬티올, 머캅토에탄올, 또는 용이하게 에놀화될 수 있는 카보닐 화합물, 아스코르브산, 아세틸 아세토네이트, 캄포설폰산, 하이드록시 아세톤, 환원당, 단당류, 글루코스, 알데하이드, 및 이러한 유기 화합물의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
선택적으로, 리간드는 2,2'-바이피리딘, 4,4'-다이-5-노닐-2,2'-바이피리딘, 4,4-다이노닐-2,2'-다이피리딜, 4,4',4''-트리스(5-노닐)-2,2':6',2''-터피리딘, N,N,N',N',N''-펜타메틸다이에틸렌트라이아민, 1,1,4,7,10,10-헥사메틸트라이에틸렌테트라민, 트리스(2-다이메틸아미노에틸)아민, N,N-비스(2-피리딜메틸)옥타데실아민, N,N,N',N'-테트라[(2-피리달)메틸]에틸렌다이아민, 트리스[(2-피리딜)메틸]아민, 트리스(2-아미노에틸)아민, 트리스(2-비스(3-부톡시-3-옥소프로필)아미노에틸)아민, 트리스(2-비스(3-(2-에틸헥속시)-3-옥소프로필)아미노에틸)아민 및 트리스(2-비스(3-도데콕시-3-옥소프로필)아미노에틸)아민으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 리간드는 2,2'-바이피리딘이다.
선택적으로, 개시제는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00010
여기서 R1은 친핵성 반응성 기이고, R2는 링커를 포함하며, R3은 하기 구조를 갖는 중합체 합성 개시제 모이어티를 포함한다:
Figure pct00011
여기서 R4 및 R5는 동일하거나 또는 상이하고, 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌, 알콕시, 카복시알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 환식 알킬 에터, 알켄일, 알켄일렌, 알킨일, 알킨일렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴, 아릴렌, 아릴렌-옥시, 헤테로아릴, 아미노, 아미도, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; Z는 할로겐 또는 CN이고; s는 1 내지 20의 정수이다.
선택적으로, Z는 Br이고, R4 및 R5는 각각 메틸이다. 선택적으로, R1은 NH2-, OH- 및 SH-로 이루어진 군으로부터 선택된다. 선택적으로, R1은 NH2-이다. 선택적으로, R2는 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌, 알콕시, 카복시알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 환식 알킬 에터, 알켄일, 알켄일렌, 알킨일, 알킨일렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴, 아릴렌, 아릴렌-옥시, 헤테로아릴, 아미노, 아미도, 및 이들의 임의의 조합이다. 선택적으로, R2는
Figure pct00012
이다:
여기서 X 및 Y는 동일하거나 또는 상이하고, 1 내지 20의 정수이다.
선택적으로, X 및 Y는 각각 4이다. 선택적으로, R3은
Figure pct00013
를 더 포함한다:
여기서 R6, R7 및 R8은 동일하거나 또는 상이하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00014
,
Figure pct00015
및
Figure pct00016
여기서 Z는 NCS, F, Cl, Br 또는 I이다. 선택적으로, Z는 Br이다. 선택적으로, R6, R7 및 R8은 각각
Figure pct00017
이다.
선택적으로, 개시제는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00018
여기서 A 및 B는 동일 또는 상이하고 2 내지 12의 정수이며, Z는 임의의 할라이드, 예컨대, Br이다. 선택적으로, A 및 B는 각각 4이다.
선택적으로, 상기 방법은 중합체를 말레이미드 시약과 반응시켜 말단 말레이미드를 갖는 중합체를 제공하는 단계를 더 포함한다. 선택적으로, 말레이미드 화합물은
Figure pct00019
이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공된 선택지는 다른 방법 또는 치료 형태에 대한 하나 이상의 쟁점을 회피한다. 예를 들어, 이들은, 유리체강내 주사가 고통스러울 수 있고 임상 환경이 필요하기 때문에 월 1회 미만의 유리체강내 주사로 투여 빈도를 줄일 수 있다. 또한, 시력이 비교적 손상되지 않은 당뇨병성 망막병증 환자는 매월 유리체강내 주사에 내성이 있을 수 있으므로, 다른 형태의 치료법에서는 치료되지 않을 수도 있다. 따라서, 덜 빈번한 투약으로 당뇨병성 망막병증 치료에 대한 요구가 있다. 이러한 맥락에서, 당뇨병성 망막병증에 대한 치료는 질환의 진행을 예방하고 관련된 시력을 위협하는 사건을 예방하기 위해 초기에 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항체 접합체는 (1) 항-VEGF-A 항체 및 (2) 포스포릴콜린 함유 중합체를 포함한다. 중합체는 항체의 가변 영역의 외측에 있는 시스테인에서 항체에 공유 결합되고, 상기 시스테인은 재조합 DNA 기술을 통해서 부가되었다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-A 항체 중쇄는 CDRH1: GYDFTHYGMN(서열번호 9), CDRH2:　WINTYTGEPTYAADFKR(서열번호 10) 및 CDRH3: YPYYYGTSHWYFDV(서열번호 11)를 포함하고, 항-VEGF-경쇄는 CDRL1: SASQDISNYLN(서열번호 12), CDRL2: FTSSLHS(서열번호 13) 및 CDRL3: QQYSTVPWT(서열번호 14)을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항체에 접합되는 중합체는 크기 배제 크로마토그래피- 다중각 광산란(이하 "SEC-MALS")에 의해 측정된 바 약 300,000 내지 약 1,750,000 Da의 분자량을 갖는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-A 항체는 중쇄와 경쇄를 포함한다. 중쇄는 CDRH1: GYDFTHYGMN(서열번호 9), CDRH2: WINTYTGEPTYAADFKR(서열번호 10) 및 CDRH3: YPYYYGTSHWYFDV(서열번호 11)를 포함하고, 경쇄는 CDRL1: SASQDISNYLN(서열번호 12), CDRL2: FTSSLHS(서열번호 13) 및 CDRL3: QQYSTVPWT(서열번호 14)를 포함하며, 중쇄 아이소타입은 IgG1이다. IgG1 불변 영역은 효과기 기능을 저감시키는 이하의 돌연변이(EU 넘버링): E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S 및 P331S 중 하나 이상을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법 중 어느 하나는 경쇄와 중쇄를 포함하는 항-VEGF-A 항체를 이용할 수 있으며, 여기서 항-VEGF-A 항체 중쇄는 CDRH1: GYDFTHYGMN(서열번호 9), CDRH2: WINTYTGEPTYAADFKR(서열번호 10) 및 CDRH3: YPYYYGTSHWYFDV(서열번호 11)를 포함하고, 항-VEGF-A 항체 경쇄는 CDRL1: SASQDISNYLN(서열번호 12), CDRL2: FTSSLHS(서열번호 13) 및 CDRL3: QQYSTVPWT(서열번호 14)를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 서열번호 1을 포함하는 중쇄 아미노산 가변 영역과 서열번호 2를 포함하는 경쇄 아미노산 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 인간 IgG1이고, 중쇄 불변 영역은 면역-매개 효과기 기능을 저감시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 바이오접합체를 형성하도록 중합체에 더 접합되며, 여기서 바이오접합체는 약 450,000 내지 1,900,000 돌턴의 분자량을 갖는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 다분산지수(PDI)는 1.5 이하이다.
몇몇 실시형태에 있어서, VEGF-A에 결합하는 항체는 서열번호 1의 CDRH1인 상기 CDRH1; 서열번호 1의 CDRH2인 상기 CDRH2; 서열번호 1의 CDRH3인 상기 CDRH3; 서열번호 2의 CDRL1인 상기 CDRL1; 서열번호 2의 CDRL2인 상기 CDRL2; 서열번호 2의 CDRL3인 상기 CDRL3; 하기 돌연변이: L234A, L235A 및 G237A(EU 넘버링) 중 적어도 하나; 및 하기 돌연변이: Q347C(EU 넘버링) 또는 L443C(EU 넘버링) 중 적어도 하나를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 L234A, L235A 및 G237A의 3개 모두의 돌연변이(EU 넘버링)를 포함하고, 항체는 L443C(EU 넘버링)를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 접합된 단백질의 제조 방법은 단백질 내 1개 이상의 시스테인을 환원시켜 용액 중 캡 제거된(decapped) 단백질을 형성시키는 단계, 단백질 내 조작된 시스테인 잔기가 유리 티올 형태로 남아서 용액 중 재산화된 캡 제거된 단백질을 형성시키는 것을 확인하면서 캡 제거된 단백질을 재산화시켜 환원된 단백질 내 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 복원시키는 단계, 및 상기 용액에 적어도 1종의 부형제를 첨가하는 단계(여기서 부형제는중합체 유도 단백질 석출물을 환원시킴)를 포함한다. 상기 방법은 상기 용액에 중합체를 첨가하는 단계, 및 조작된 시스테인 잔기에서 재산화된 캡 제거된 단백질에 중합체를 접합시키는 단계를 더 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 단백질은 항체, 항체 단백질 융합체 또는 이의 결합 단편이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부형제는 산 또는 염기이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부형제는 세정제, 당 및 하전된 아미노산 중 적어도 하나로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체와 환원된 단백질과의 반응은 pH 6.0 내지 pH 8.5의 수성 조건 하에서 일어난다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환원된 단백질의 양은 중합체의 양보다 작다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 2 내지 37℃에서 단백질에 접합된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 접합된 단백질을 포함하는 용액을 이온교환 매질 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피 매질에 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이온교환 매질 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피 매질은 유리 중합체로부터 그리고 재산화된 캡 제거된 단백질로부터 접합된 단백질을 분리시킨다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 양쪽성 이온(zwitterion)을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 포스포릴콜린을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 말레이미드 작용기에 대한 중합체 분지점의 중심을 가교시키는 PEG 링커를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, VEGF 리간드와 VEGF-수용체의 상호작용의 적어도 90%를 차단 가능한 항-VEGF항체 접합체가 제공된다.
몇몇 실시형태에 있어서, VEGF 리간드와 VEGF-수용체의 상호작용의 적어도 95%를 차단하는 항-VEGF 항체 접합체가 제공된다.
몇몇 실시형태에 있어서, VEGF 리간드와 VEGF-수용체의 상호작용의 적어도 90%를 차단하는 항-VEGF 항체가 제공된다.
도 1은 화합물 L을 도시한다
도 2는 화합물 K를 도시한다.
도 3은 R3707로부터 OG1802의 합성을 도시한다.
도 4는 OG1786을 도시한다.
도 5는 OG1550로부터 OG1546의 합성을 도시한다.
도 6은 OG1546 및 OG1563로부터 OG1784의 합성을 도시한다.
도 7은 OG1784로부터 OG1405의 합성을 도시한다.
도 8은 OG1405로부터 OG1785의 합성을 도시한다.
도 9는 OG1785로부터 OG1786의 합성을 도시한다.
도 10은 OG1802를 도시한다.
도 11은 화합물 E를 도시한다.
도 12는 L443C(EU 넘버링, 서열번호 1의 위치 449에 있음) 및 소정의 효과기 기능 돌연변이를 갖는 항-VEGF-중쇄의 몇몇 실시형태를 도시한다.
도 13은 항-VEGF-경쇄(서열번호 2)의 몇몇 실시형태를 도시한다.
도 14는 베바시주맙 중쇄(서열번호 3)의 몇몇 실시형태를 도시한다.
도 15는 베바시주맙 경쇄(서열번호 4)의 몇몇 실시형태를 도시한다.
도 16은 라니비주맙 중쇄(서열번호 5)의 몇몇 실시형태를 도시한다.
도 17은 라니비주맙 경쇄(서열번호 6)의 몇몇 실시형태를 도시한다.
도 18은 항체 접합체의 제조 방법의 몇몇 실시형태를 도시한다.
도 19는 반응 A 내지 G의 이온교환기 분석(A280 흡광도)을 도시한다.
도 20은 판 결합된 VEGFR ECD-Fc 단백질에 대한 바이오틴-VEGF의 결합에 대한 각종 항-VEGF 분자의 효과 및 이들의 IC50값을 도시한다.
도 21은 바이아코어(BIAcore) 단일 단일 주기 반응속도론(single cycle kinetics)에 의해 측정된 VEGF에 대한 OG1950 결합 친화도를 도시한다
도 22는 Fc 감마 수용체 I에 대한 OG1950의 결합을 도시한다.
도 23은 Fc 감마 수용체 IIIa에 대한 OG1950의 결합을 도시한다.
도 24는 인간 보체 단백질 C1q에 대한 QG 1950의 결합을 도시한다.
도 25는 증식 검정의 결과(IC50값을 포함함)을 도시한다.
도 26은 항-VEGF제에 대한 VEGF 결합의 단일 주기 반응속도론의 결과를 도시한다.
도 27은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열의 몇몇 실시형태를 도시한다.
도 28은 2 내지 8℃에서 20시간 동안 중합체 용액(OG1802) 중에서의 (각종 부형제의) 각종 샘플의 항온처리(incubation) 후의 스크리닝 결과를 도시한다.
항-VEGF-A 항체가 본 명세서에서 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이러한 항체는 반감기 연장 모이어티에 접합될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 접합체는 당뇨병성 망막병증 및/또는 연령관련 황반변성과 같은 소정의 병태의 치료를 위하여 사용될 수 있다.
또한 (어느 하나의 유형의 항체의) 항체의 접합체 조성물을 제조하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이러한 방법은 목적하는 항체 접합체의 형성의 보다 높은 효율 또는 더 낮은 응집체 형성을 가능하게 한다.
이들 및 추가의 실시형태가 정의 부문에 이어서 이하에 제공된다.
정의
"혈관 질환"은 변경된, 조절 이상 또는 조절되지 않은 혈관형성을 특징으로 하는 장애 또는 질환이다. 혈관 질환의 예는 신생물 전환(예컨대, 암) 및 당뇨병성 망막병증 및 연령관련 황반변성을 비롯한 안(ocular) 혈관 질환을 포함한다.
"안 혈관신생" 장애는 환자의 눈에 변경된, 조절 이상 또는 조절되지 않은 혈관형성을 특징으로 하는 장애이다. 이러한 장애는 시신경 유두 신혈관형성, 홍채 신혈관형성, 망막 혈관신생, 맥락막 혈관신생, 각막 혈관신생, 초자체 신혈관형성(vitreal neovascularization), 녹내장, 판누스(pannus), 익상편, 황반부종, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반부종, 혈관 망막병증, 망막 변성, 포도막염, 망막의 염증성 질환, 및 증식성 유리체망막증을 포함한다.
용어 항체는 무손상 항체 및 이의 결합 단편을 포함한다. 결합 단편은 무손상 항체가 결합되는 항원과 결합하는 무손상 항체의 일부분을 포함하는 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 결합 단편의 예는 항체 단편으로부터 형성된 Fv, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예컨대, scFv); 및 다중 특이적 항체를 포함한다. scFv 항체는 문헌[Houston JS. 1991. Methods in Enzymol. 203:46-96]에 기재되어 있다. 또한, 항체 단편은, 작용성 항원 결합 부위에 대해서 즉 VL 도메인과 함께 조립될 수 있는 VH 도메인 또는 즉, VH 도메인과 함께 조립될 수 있는 VL 도메인의 특징을 갖고 이에 따라서 전장 항체의 항원 결합 특성을 제공하는 단쇄 폴리펩타이드를 포함한다.
항체의 이의 표적 항원(들)에 대한 특이적 결합은 적어도 106, 107, 108, 109, 또는 1010 M-1의 친화도를 의미한다. 특이적 결합은 크기가 검출 가능하게 더 높고 적어도 하나의 무관한 표적에 대해서 일어나는 비특이적 결합과 규별 가능하다. 특이적 결합은 특정 작용기 또는 특정 공간적 적합성(예컨대, 자물쇠 및 열쇠 유형) 간의 결합의 형성의 결과일 수 있는 한편 비특이적 결합은 통상 반 데로 발스힘의 결과이다. 그러나 특이적 결합은 반드시 항체 또는 융합 단백질이 오로지 하나의 표적하고만 결합하는 것을 의미하는 것은 아니다.
기본적 항체 구조 단위는 소단위의 사량체이다. 각 사량체는 폴리펩타이드 사슬의 두 동일한 쌍을 포함하는데, 각 쌍은 하나의 "경"쇄(약 25 kDa)와 하나의 "중"쇄(약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 이 가변 영역은 처음에 절단 가능한 신호 펩타이드에 연결되어 발견된다. 신호 펩타이드가 없는 가변 영역은 종종 성숙 가변 영역이라 지칭된다. 따라서, 예를 들어, 경쇄 성숙 가변 영역은 경쇄 신호 펩타이드가 없는 경쇄 가변 영역을 의미한다. 그러나, 가변 영역에 대한 언급은 신호 서열이 필연적으로 존재하고; 사실상 일단 항체가 발현되고 분비되었다면 신호 서열이 절단되는 것을 의미하지 않는다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 쌍은 항체의 결합 영역을 정의한다. 경쇄 및 중쇄의 카복시-말단 부분은 각각 경쇄 및 중쇄 불변 영역을 규정한다. 중쇄 불변 영역은 주로 효과기 기능을 담당한다. IgG 항체에서, 중쇄 불변 영역은 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역으로 분할된다. CH1 영역은 다이설파이드 및 비공유 결합에 의해 경쇄 불변 영역에 결합된다. 힌지 영역은 항체의 결합 영역과 효과기 영역 간에 유연성을 제공하고, 또한 사량체 소단위에서 2개의 중쇄 불변 영역 사이에 분자간 다이설파이드 결합을 위한 부위를 제공한다. CH2 및 CH3 영역은 효과기 기능 및 FcR 결합의 주된 부위이다.
경쇄는 카파 또는 람다 중 하나로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되고, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서의 항체의 아이소타입을 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 영역과 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 세그먼트에 의해 접합되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 세그먼트를 포함한다(See 일반적으로, 문헌[Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7] 참조)(모든 목적을 위하여 이의 전문이 참고로 편입됨).
각 경쇄/중쇄 쌍의 성숙 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 무손상 항체는 2개의 결합 부위를 가지며, 즉, 2가이다. 천연 항체에서, 결합 부위는 동일하다. 그러나, 이중 특이적 항체가 제조되는데, 여기서 2개의 결합 부위는 상이하다(예컨대, 문헌[Songsivilai S, Lachmann PC. 1990. Bispecific antibody: a tool for diagnosis and treatment of disease. Clin Exp Immunol. 79:315-321; Kostelny SA, Cole MS, Tso JY. 1992. Formation of bispecific antibody by the use of leucine zippers. J Immunol. 148: 1547-1553] 참조). 가변 영역은 모두 상보성 결정영역 또는 CDR이라고도 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 접합된 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반적인 구조를 나타낸다. 각 쌍의 두 사슬로부터의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 정렬되어, 특이적 에피토프에 결합을 가능하게 한다. N-말단에서부터 C-말단으로, 중쇄와 경쇄 둘 다가 도메인 FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 편의상, 가변 중쇄 CDR는 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로 지칭될 수 있고; 가변 경쇄 CDR은 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서 지칭될 수 있다. 각 도메인에 아미노산의 배정은 문헌[Kabat EA, et al. 1987 and 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD) 또는 Chothia C, Lesk AM. 1987. Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins. J Mol Biol 196:901-917; Chothia C, et al. 1989. Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions. Nature 342:877-883]의 정의에 따른다. 카바트는 또한 상이한 중쇄 가변 영역 사이의 또는 경쇄 가변 영역 사이의 대응하는 잔기가 동일 번호로 배정되는 널리 사용되는 넘버링 관례(카바트 넘버링)를 제공한다. 카바트 넘버링이 항체 불변 영역에 대해서 사용될 수 있지만, EU 넘버링이 본 출원에서의 경우처럼 더욱 통상적으로 사용된다. 특정 서열이 본 명세서에 개시된 예시적인 항체에 대해서 제공되지만, 단백질 사슬의 발현 후에 경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카복시 말단, 특히 중쇄 C-말단 라이신 잔기에서 1 내지 수개의 아미노산이 분자의 일부 또는 모두에서 결실될 수 있거나 유도체화될 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체 또는 세포외 포획 세그먼트가 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 단백질 상의 에피토프는 하나 이상의 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 인접한 아미노산 또는 인접하지 않은 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프(선형 에피토프라고도 알려짐)는 전형적으로 용매를 변성시키는 노출에 대해 유지되는 한편 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프(배좌(conformation) 에피토프라고도 알려짐)는 전형적으로 용매를 변성시키는 처리에 대해 손실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 배좌에서 적어도 3, 더욱 통상적으로, 적어도 5 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 배좌를 결정하는 방법은, 예를 들어, x-선 결정학 및 2-차원 핵자기공명을 포함한다. 예컨대, 문헌[Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)] 참조.
동일 또는 중첩된 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합과 경쟁하는 하나의 항체의 능력을 나타내는 단순한 면역검정에서 식별될 수 있다. 항체의 에피토프는 또한 접촉 잔기를 식별하기 위하여 그의 항원에 결합된 항체(또는 Fab 단편)의 X-선 결정학에 의해 규정될 수 있다.
대안적으로, 2개의 항체는 하나의 항체의 결합을 저감 또는 제거하는 항원 애 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 저감 또는 제거시킨다면 동일한 에피토프를 갖는다. 2개의 항체는 하나의 항체의 결합을 저감 또는 제거시키는 몇몇 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 저감 또는 제거시킨다면 중첩 에피토프를 갖는다.
항체들 간의 경쟁은, 시험 하의 항체가 공통 항원에 대한 기준 항원의 특이적 결합을 저해하는 검정에 의해 결정된다(예컨대, 문헌[Junghans et al., Cancer Res. 50: 1495, 1990] 참조). 시험 항체는 과잉량의 시험 항체(예컨대, 적어도 2배, 5배, 10배, 20배 또는 l00배)가 기준 항체의 결합을 적어도 50%만큼 저해한다면 기준 항체와 경쟁한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 시험 항체는 경쟁적 결합 검정에 의해 측정된 바 기준 항체의 결합을 75%, 90%, 또는 99%만틈 저해시킨다. 경쟁 검정에 의해 식별된 항체(경쟁 항체)는 기준 항체와 동일한 에피토프에 대한 항체 결합 및 입체 장애가 일어나는 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 이웃하는 에피토프에 대한 항체 결합을 포함한다.
용어 "환자"는 예방 또는 치료적 치료를 받는 인간 및 기타 포유류 대상체를 포함한다.
아미노산 치환을 보존적 또는 비보존적으로서 분류하는 목적을 위하여, 아미노산은 다음과 같이 그룹화된다: 그룹 I(소수성 곁사슬): met, ala, val, leu, ile; 그룹 II(중성 친수성 곁사슬): cys, ser, thr; 그룹 III(산성 곁사슬): asp, glu; 그룹 IV(염기성 곁사슬): asn, gin, his, lys, arg; 그룹 V(사슬 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI(방향족 곁사슬): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 부류 내의 아미노산 간의 치환을 수반한다. 비보존적 치환은 이들 부류의 하나의 구성원을 다른 구성원에 대해서 교환하는 것을 구성한다.
서열 동일성 백분율은 가변 영역에 대한 카바트 넘버링 방식 또는 불변 영역에 대한 EU 넘버링에 의해 최대로 정렬된 항체 서열로 결정된다. 정렬 후에, 대상 항체 영역(예컨대, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙 가변 영역)이 기준 항체의 동일 영역과 비교된다면, 대상 항체 영역과 기준 항체 영역 간의 서열 동일성 퍼센트가 대상 항체 영역과 기준 항체 영역 둘 다에서 동일한 아미노산에 의해 점유된 위치의 개수를 간극을 계수하지 않고 두 영역의 정렬된 위치의 총수로 나눈 것에 100을 곱하여 백분율로 전환시킨 것이다. 다른 서열의 서열 동일성은, 예컨대, 문헌[Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]에서의 BESTFIT, FASTA 및 TFASTA와 같은 알고리즘을 사용하여, 디폴트 갭 파라미터를 사용하여, 또는 검사 및 최상의 정렬(즉, 비교창에 걸쳐서 서열 유사성의 최고 백분율을 초래함)에 의해 서열을 정렬함으로써 결정될 수 있다. 서열 동일성의 백분율은 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교창 위에서 비교하고, 동일한 잔기가 두 서열에서 발생하여 정합된 위치의 수를 얻게 되는 위치의 수를 결정하고, 정합된 위치의 수를 비교창의 위치의 총 수(즉, 창의 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 계산된다.
하나 이상의 언급된 요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체를 포함하는 조성물은 항체를 단독으로 또는 다른 성분과 조합하여 함유할 수 있다.
용어 "항체-의존적 세포의 세포독성" 또는 ADCC는, 항체-코팅된 표적 세포(즉, 결합된 항체를 갖는 세포)와 용해 활성도를 지니는 면역 세포(효과기 세포라고도 지칭됨)와의 상호작용에 좌우되는 세포사를 유도하는 기작이다. 이러한 효과기 세포는 자연 살해 세포, 단핵구/대식세포 및 호중구를 포함한다. ADCC는 호중구, 대식세포 및 자연 살해 세포와 같은 면역 효과기 세포 사에서 세포에 결합된 항체의 Fc 영역과 Fcy 수용체, 특히 FcγRI 및 FcγRIII 간의 상호작용에 의해 촉발된다. 표적 세포는 매개 효과기 세포의 유형에 따라서 식세포 작용 또는 용해에 의해 제거된다. 항체-코팅된 표적 세포의 사멸은 효과기 세포 활성도의 결과로서 일어난다.
"항체-의존적 세포의 식세포 작용", 또는 ADCP라고도 알려진 용어 옵소닌작용은, 항체-코팅된 세포가 면역글로불린 Fc 영역에 결합하는 식세포성 면역 세포(예컨대, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포)에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 내재화되는 과정을 지칭한다.
용어 "보체-의존성 세포독성" 또는 CDC는 표적-결합된 항체의 Fc 효과기 도메인(들)이 일련의 효소 반응을 활성화시켜 궁극적으로 표적 세포막 내의 구멍의 형성에 도달하게 하는 세포사를 유도하는 기작을 지칭한다. 전형적으로, 항원-항체 복합체, 예컨대, 항체-코팅된 표적 세포 상의 것들이 보체 성분 Clq과 결합하여 이를 활성화시키고, 이어서 보체 캐스케이드를 활성화시켜 표적 세포사를 초래한다. 보체의 활성화는 또한 백혈구 상의 결합 보체 수용체(예컨대, CR3)에 의해 ADCC를 용이하게 하는 표적 세포 표면 상의 보체 성분의 침착을 초래할 수도 있다.
인간화 항체는 비-인간 "공여체" 항체로부터의 CDR이 인간 "수용체" 항체 서열에 그래프트된 유전자 조작된 항체이다(예컨대, Queen, US 5,530,101 및 5,585,089; Winter, US 5,225,539, Carter, US 6,407,213, Adair, US 5,859,205 6,881,557, Foote, US 6,881,557 참조). 수용체 항체 서열은, 예를 들어, 성숙 인간 항체 서열, 이러한 서열의 복합물, 인간 항체 서열의 공통 서열, 또는 생식세포 영역 서열일 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 전체적으로 또는 실질적으로 공여체 항체 및 가변 영역 프레임워크 서열 및 불변 영역으로부터, 만약 존재한다면, 전체적으로 또는 실질적으로 인간 항체 서열로부터 일부 또는 전부의 CDR을 갖는 항체이다. 유사하게는 인간화 중쇄는 전체적으로 또는 실질적으로 공여체 항체 중쇄, 및 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 중쇄 불변 영역으로부터, 만약 존재한다면, 실질적으로 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터 적어도 1개, 2개, 통상 모두 3개의 CDR을 갖는다. 유사하게는 인간화 경쇄는 전체적으로 또는 실질적으로 공여체 항체 경쇄, 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 경쇄 불변 영역으로부터, 만약 존재한다면, 실질적으로 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터 적어도 1개, 2개, 통상 모두 3개의 CDR을 갖는다. 나노바디 및 dAb 이외에, 인간화 항체는 인간화 중쇄 및 인간화 경쇄를 포함한다. 인간화 항체 내 CDR은 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%의 대응하는 잔기(카바트에 의해 정의됨)가 각각의 CDR 간에 동일한 경우 실질적으로 비-인간 항체 내 대응하는 CDR로부터 유래된다. 항체 사슬의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체 사슬의 불변 영역은 적어도 85, 90, 95 또는 100%의 카바트에 의해 정의된 대응하는 잔기가 동일한 경우 실질적으로 각각 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역으로부터 유래된다.
인간화 항체는 흔히 마우스 항체로부터 모두 6개의 CDR(카바트에 의해 정의된 바와 같을 수 있음)을 내포하지만, 이들은 또한 전체보다 적은 CDR(예컨대, 마우스 항체로부터 적어도 3, 4, 또는 5개의 CDR)로 이루어질 수도 있다(예컨대, 문헌[De Pascalis R, Iwahashi M, Tamura M, et al. 2002. Grafting "Abbreviated" Complementary-Determining Regions Containing Specificity-Determining Residues Essential for Ligand Contact to Engineer a Less Immunogenic Humanized Monoclonal Antibody. J Immunol. 169:3076-3084; Vajdos FF, Adams CW, Breece TN, Presta LG, de Vos AM, Sidhu, SS. 2002. Comprehensive functional maps of the antigen-binding site of an anti-ErbB2 antibody obtained with shotgun scanning mutagenesis. J Mol Biol. 320: 415-428; Iwahashi M, Milenic DE, Padlan EA, et al. 1999. CDR substitutions of a humanized monoclonal antibody (CC49): Contributions of individual CDRs to antigen binding and immunogenicity. Mol Immunol. 36:1079-1091; Tamura M, Milenic DE, Iwahashi M, et al. 2000. Structural correlates of an anticarcinoma antibody: Identification of specificity-determining regions (SDRs) and development of a minimally immunogenic antibody variant by retention of SDRs only. J Immunol. 164:1432-1441] 참조).
키메라 항체는 비-인간 항체(예컨대, 마우스)의 경쇄 및 중쇄의 성숙 가변 영역이 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 조합된 항체이다. 이러한 항체는 실질적으로 또는 전체적으로 마우스 항체의 결합 특이성을 유지하고 약 2/3의 인간 서열이다.
베니어 항체(veneered antibody)는 비-인간 항체의 비-인간 가변 영역 프레임워크 잔기의 일부와 CDR의 일부 및 통상 전부를 보유하지만 B- 또는 T-세포 에피토프에 기여할 수 있는 다른 가변 영역 프레임워크 잔기, 예를 들어, 인간 항체 서열의 대응하는 위치로부터의 잔기를 갖는 노출된 잔기를 대체하는 인간화 항체의 유형이다(Padlan EA. 1991. A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties. Mol Immunol. 28:489-98). 그 결과는 CDR이 전체적으로 또는 실질적으로 비-인간 항체로부터 유래되고 비-인간 항체의 가변 영역 프레임워크가 치환에 의해 더욱 인간-유사가 되게 만드는 항체이다. 인간 항체는 인간으로부터 단리될 수 있거나, 또는 다르게는 (예컨대, 트랜스제닉 마우스에서, 시험관 내에서 또는 파지 디스플레이에 의해) 인간 면역글로불린 유전자의 발현으로부터 기인될 수 있다. 인간 항체를 생산하는 방법은 문헌[Oestberg L, Pursch E. 1983. Human x (mouse x human) hybridomas stably producing human antibodies. Hybridoma 2:361-367; Oestberg, 미국 특허 제4,634,664호; 및 Engleman et al., 미국 특허 제4,634,666호]의 트라이오마 방법, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 트랜스제닉 마우스의 사용(예컨대, Lonberg et al., W093/12227 (1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) 참조) 및 파지 디스플레이 방법(예컨대, Dower et al., WO 91/17271 및 McCafferty et al., WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871,907, US 5,858,657, US 5,837,242, US 5,733,743 및 US 5,565,332 참조)을 포함한다.
"중합체"는 함께 연결된 일련의 단량체 기를 나타낸다. 중합체는 단일 단량체(단독중합체) 또는 상이한 단량체(이종중합체)의 다수의 단위로 구성된다. 고분자량 중합체는, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아마이드, 메타크릴아마이드, 스타이렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈, 및 비닐 아세테이트와 같은 비닐 에스터를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 단량체로부터 제조된다. 추가의 단량체가 본 발명의 고분자량 중합체에 유용하다. 2종의 상이한 단량체가 사용될 때, 2종의 단량체는 "공단량체"라 불리며, 이는 상이한 단량체가 단일 중합체를 형성하기 위해 공중합되는 것을 의미한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있다. 중합체가 분지형일 때, 각각의 중합체 사슬은 "중합체 팔(arm)"로서 지칭된다. 개시제 모이어티에 연결된 중합체 팔의 단부는 근위 단부이고, 중합체 팔의 성장하는-사슬 단부는 원위 단부이다. 중합체 팔의 성장하는 사슬-단부에서, 중합체 팔 말단기는 라디칼 포촉제(radical scavenger) 또는 다른 기일 수 있다.
"개시제"는 단량체 또는 공단량체를 사용하여 중합반응을 개시할 수 있는 화합물을 지칭한다 중합은 통상의 유리 라디칼 중합반응 또는 제어된/"리빙"(living) 라디칼 중합, 예컨대, 원자 이동 라디칼 중합(ATRP), 가역적 부가-단편화-종결(RAFT) 중합 또는 나이트록사이드 매개 중합(NMP)일 수 있다. 중합은 "의사(pseudo)" 제어된 중합, 예컨대, 퇴행성 이동일 수 있다. 개시제가 ATRP에 적합한 경우, 그것은 라디칼 중합을 개시할 수 있는 라디칼인 개시제 단편 I을 형성하도록 균질분해적으로 절단될 수 있는 불안정 결합(labile bond), 및 중합을 가역적으로 종결시키기 위하여 성장하는 중합체 사슬의 라디칼과 반응하는 라디칼 포촉제 I'을 함유한다. 라디칼 포촉제 I'은 전형적으로 할로겐이지만, 또한 유기 모이어티, 예컨대, 나이트릴일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 개시제는 ATRP를 통해서 중합을 위한 부위로서 1개 이상의 2-브로모아이소부티레이트기를 함유한다.
"화학적 링커"는 반감기 연장 모이어티 및 단백질와 같은 두 기를 함께 연결하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 링커는 절단 가능 또는 절단 불가능할 수 있다. 절단 가능한 링커는, 무엇보다도, 가수분해 가능, 효소적으로 절단 가능, pH 민감성, 광 분해성 또는 다이설파이드 링커일 수 있다. 기타 링커는 호모이작용성 링커 및 헤테로이작용성 링커를 포함한다. "연결기"는 생물활성제에 대한 1개 이상의 결합으로 이루어진 공유 결합을 형성 가능한 작용기이다. 비제한적인 예는 WO2013059137(참고로 편입됨)의 표 1에 예시된 것들을 포함한다.
용어 "반응성 기"는 다른 화학적 기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는, 즉, 적합한 반응 조건 하에 공유 반응성인 기를 지칭하며, 일반적으로 다른 물질에 대한 부착점을 나타낸다. 반응성 기는 말레이미드 또는 숙신이미딜에스터와 같은 모이어티이며, 상이한 모이어티 상의 작용기와 화학적으로 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있다. 반응성 기는 일반적으로 친핵체, 친전자체 및 광활성화 가능한 기를 포함한다.
"포스포릴콜린"("PC"로도 지칭됨)은 하기를 지칭한다:
Figure pct00020
여기서 *는 부착점을 나타낸다. 포스포릴콜린은 양쪽성 이온성 기이고, 염(예컨대, 내부염), 및 이의 양성자화된 형태 및 양성자화되지 않은 형태를 포함한다.
"포스포릴콜린 함유 중합체"는 포스포릴콜린을 함유하는 중합체이다. "양쪽성 이온 함유 중합체"는 양쪽성 이온을 함유하는 중합체를 지칭한다.
폴리(아크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린) 함유 중합체는 2-(아크릴로일옥시)에틸-2-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트(이하의 실시예 6에 나타낸 HEA-PC)를 단량체로서 함유하는 중합체를 지칭한다.
폴리(메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린) 함유 중합체는 2-(메타크릴로일옥시)에틸-2-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트(HEMA-PC 또는 MPC)를 단량체로서 함유하는 중합체를 지칭한다(하기 참조):
Figure pct00021
.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "MPC"와 "HEMA-PC"는 호환 가능하다.
중합체의 맥락에서 "분자량"은 수 평균 분자량, 또는 중량 평균 분자량 또는 피크 분자량 중 어느 하나로서 표현될 수 있다. 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에서의 분자량에 대한 모든 언급은 피크 분자량을 지칭한다. 이들 분자량 결정, 수 평균 분자량(Mn), 중량 평균 분자량(Mw) 및 피크 분자량(Mp)은, 크기 배제 크로마토그래피 또는 다른 액체 크로마토그래피 수법을 이용해서 측정될 수 있다. 분자량값을 측정하기 위한 다른 방법이 사용될 수 있으며, 예컨대, 수 평균 분자량을 결정하기 위해 말단-기 분석 또는 총괄성(예컨대 동결점 강하, 비등점 상승 또는 삼투압)의 측정의 사용, 또는 중량 평균 분자량을 측정하기 위해 광산란 수법, 한외여과 또는 점도계의 사용을 들 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 분자량은 SEC-MALS(크기 배제 크로마토그래피-다중각 광산란)에 의해 측정된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체성 시약은 전형적으로 다분산성이고(즉, 중합체의 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량이 동일하지 않고), 예를 들어, SEC-MALS 측정으로부터 유래된 PDI 값에 의해 판정된 바와 같은, 낮은 다분산도 값, 예를 들어, 약 1.5 미만을 지닐 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 다분산도(PDI)는 약 1.4 내지 약 1.2의 범위이다. 몇몇 실시형태에 있어서, PDI는 약 1.15, 1.10, 1.05, 또는 1.03 미만이다.
단수 표현의 형태는 하나 이상의 실체를 지칭하며; 예를 들어, 화합물은 1종 이상의 화합물 또는 적어도 1종의 화합물을 지칭한다. 그와 같이, 용어 "한"(또는 "하나"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용될 수 있다.
"약"은 상이한 기기, 샘플 및 샘플 제제 중에서 취한 측정치에서 볼 수 있는 변동치를 의미한다.
"보호된", "보호된 형태", "보호된 기" 및 "보호기"는 특정 반응 조건 하에서 분자의 특정한 화학적 반응성 작용기의 반응을 방지하거나 차단하는 기(즉, 보호기)의 존재를 지칭한다. 보호기는 사용될 반응 조건 및 존재한다면 분자의 추가의 반응성 또는 보호기의 존재뿐만 아니라 보호 중인 화학적 반응기의 유형에 따라 달라진다. 적합한 보호기는 Greene 등에 의한 논문["Protective Groups In Organic 합성," 3rd Edition, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999]에서 발견되는 바와 같은 것들을 포함한다.
"알킬"은 지정된 탄소 원자의 수를 갖는 직쇄 또는 분지쇄, 포화, 지방족 라디칼을 지칭한다. 예를 들어, C1-C6 알킬은, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 아이소펜틸, 헥실 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 기타 알킬기는 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 알킬은 임의의 수, 예컨대, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 3-4, 3-5, 3-6, 4-5, 4-6 및 5-6개의 탄소를 포함할 수 있다. 알킬기는 전형적으로 1가이지만, 알킬기가 2개의 모이어티를 함께 연결할 경우와 같이 2가일 수 있다.
유기 라디칼 또는 화합물과 관련하여 위에서 그리고 이하에서 지칭되는 용어 "저급"은 각각 최대 7개를 포함하거나 최대 4개를 포함하고, (미분지된 경우) 1개 또는 2개의 탄소 원자를 갖는 분지 또는 미분지될 수 있는 화합물 또는 라디칼을 규정한다.
"알킬렌"은 적어도 2개의 다른 기, 즉, 2가 탄화수소 라디칼을 연결하는, 위에서 정의된 바와 같은 알킬기를 지칭한다. 알킬기에 연결된 2개의 모이어티는 알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다. 예를 들어, 직쇄 알킬렌은 -(CH2)n의 2가 라디칼일 수 있으며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 알렌기는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 아이소프로필렌 부틸렌, 아이소부틸렌, sec-부틸렌, 펜틸렌 및 헥실렌을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
알킬 라디칼 및 헤테로알킬 라디칼(알킬렌, 알켄일, 헤테로알킬렌, 헤테로알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알켄일 및 헤테로사이클로알켄일로 종종 지칭되는 기들을 포함함)에 대한 치환기는 0 내지 (2m'+1)의 범위의 수의 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -CN 및 -NO2로부터 선택된 다양한 기일 수 있으며, 여기서 m'은 이러한 라디칼 내의 탄소 원자의 총 수이다. R', R" 및 R"'는 각각 독립적으로 수소, 비치환된 (C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 비치환된 아릴, 1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 아릴, 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴-(C1-C4)알킬기를 지칭한다. R' 및 R"이 동일한 질소 원자에 부착될 경우, 이들은 질소 원자와 배합되어 5-, 6-, 또는 7-원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"은 1-피롤리딘일 및 4-몰폴린일을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "알킬"은 할로알킬(예컨대, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(예컨대, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등)과 같은 기를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 치환된 알킬 및 헤테로알킬기는 1 내지 4개의 치환기를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 치환된 알킬 및 헤테로알킬기는 1, 2 또는 3개의 치환기를 갖는다. 예외는 퍼할로 알킬기(예컨대, 펜타플루오로에틸 등)들이다.
알킬 및 헤테로알킬 라디칼(알킬렌, 알켄일, 헤테로알킬렌, 헤테로알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알켄일, 및 헤테로사이클로알켄일로 종종 지칭되는 기들을 포함함)에 대한 치환기는 0 내지 (2m'+1)의 범위의 수의 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2로부터 선택되지만 이들로 제한되는 것은 아닌 다양한 기 중 하나 이상일 수 있으며, 여기서 여기서 m'은 이러한 라디칼 내의 탄소 원자의 총 수이다. R', R", R"' 및 R""은 각각 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 예컨대, 1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴알킬기를 지칭한다. 화합물이 하나보다 많은 R기를 포함할 경우, 예를 들어, R기의 각각은 독립적으로 이들 기의 하나 초과가 존재할 경우 각각의 R', R", R'" 및 R""기로서 선택된다. R' 및 R"이 동일한 동일한 질소 원자에 부착될 경우, 이들은 질소 원자와 배합되어 5-, 6-, 또는 7-원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"은 1-피롤리딘일 및 4-몰폴린일을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아님을 의미한다. 치환기의 상기 논의로부터, 당업자라면, 용어 "알킬"이 수소기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예컨대, 할로알킬(예컨대, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(예컨대, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등)을 포함하는 것을 의미하는 것임을 이해할 것이다.
알콕시"는 알콕시기를 부착점에 연결시키거나 알콕시기의 2개의 탄소에 연결된 산소 원자를 갖는 알킬기를 지칭한다 알콕시기는, 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 아이소-프로폭시, 부톡시, 2-부톡시, 아이소-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, pent옥시, 헥속시 등을 포함한다. 알콕시기는 본 명세서에 기재된 각종 치환기로 더 치환될 수 있다. 예를 들어, 알콕시기는 할로겐으로 치환되어 "할로-알콕시"기를 형성할 수 있다.
"카복시알킬"은 카복시기로 치환된 알킬기(본 명세서에 정의된 바와 같음)를 의미한다. 용어 "카복시사이클로알킬"은 카복시기로 치환된 사이클로알킬기(본 명세서에 정의된 바와 같음)를 의미한다. 용어 알콕시알킬은 알콕시기로 치환된 알킬기(본 명세서에 정의된 바와 같음)를 의미한다. 본 명세서에서 이용되는 용어 "카복시"는 카복실산 및 이의 에스터를 지칭한다.
수소 원자는 할로겐 원자로 치환된다. 할로겐(할로)은 클로로 또는 플루오로를 나타내지만, 또한 브로모 또는 아이오도일 수 있다. 예를 들어, 할로알킬은 트라이플루오로메틸, 플루오로메틸, 1,2,3,4,5-펜타플루오로-페닐 등을 포함한다. 용어 "퍼플루오로"는 모든 이용 가능한 수소가 플루오린으로 대체된 화합물 또는 라디칼을 규정한다. 예를 들어, 퍼플루오로페닐은 1,2,3,4,5-펜타플루오로페닐을 지칭하고, 퍼플루오로메틸은 1,1,1-트라이플루오로메틸을 지칭하며, 퍼플루오로메톡시는 1,1,1-트라이플루오로메톡시를 지칭한다.
"플루오로-치환된 알킬"은 1개, 일부 또는 전부의 수소 원자가 플루오린으로 대체된 알킬기를 지칭한다.
"사이토카인"은 면역 및 염증 반응에서 세포-세포 통신(cell-cell communication)에 관여할 수 있는 단백질 신호전달 분자의 군의 구성원이다. 사이토카인은 전형적으로 작고 수용성인 당단백질이며 약 8 내지 35 kDa의 질량을 갖는다.
"사이클로알킬"은 약 3 내지 12개, 3 내지 10개, 또는 3 내지 7개의 내향고리 탄소 원자를 함유하는 환식 탄화수소기를 지칭한다. 사이클로알킬기는 융합된, 가교된 그리고 스피로 고리 구조를 포함한다.
"내향고리"는 환식 고리 구조의 일부를 포함하는 원자 또는 원자의 군을 지칭한다.
"외향고리"는 환식 고리 구조를 규정하지 않지만 부착된 원자 또는 원자의 군을 지칭한다.
"환식 알킬 에터"는 3 또는 4개의 내향고리 탄소 원자 및 1 내향고리 산소 또는 황을 갖는 4 또는 5원 환식 알킬기(예컨대, 옥세탄, 티에탄, 테트라하이드로퓨란, 테트라하이드로티오펜); 또는 1 또는 2개의 내향고리 산소 또는 황 원자를 갖는 6 내지 7원 환식 알킬기(예컨대, 테트라하이드로피란, 1,3-다이옥산, 1,4-다이옥산, 테트라하이드로티오피란, 1,3-다이티안, 1,4-다이티안, 1,4-옥사티안)를 지칭한다.
"알켄일"은 적어도 1개의 이중 결합을 갖는 2 내지 6 탄소 원자의 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 지칭한다. 알켄일기의 예는, 비닐, 프로펜일, 아이소프로펜일, 1-부텐일, 2-부텐일, 아이소부텐일, 부타다이엔일, 1-펜텐일, 2-펜텐일, 아이소펜텐일, 1,3-펜타다이엔일, 1,4-펜타다이엔일, 1-헥센일, 2-헥센일, 3-헥센일, 1,3-헥사다이엔일, 1,4-헥사다이엔일, 1,5-헥사다이엔일, 2,4-헥사다이엔일, 또는 1,3,5-헥사트라이엔일을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 알켄일기는 또한 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6, 4 내지 5, 4 내지 6, 5 내지 6개의 탄소를 가질 수 있다. 알켄일기는 전형적으로 1가이지만, 예컨대, 알켄일기가 2개의 모이어티를 함께 연결할 경우에는 2가일 수 있다.
"알켄일렌"은, 적어도 2개의 다른 기, 즉, 2가 탄화수소 라디칼을 연결하는 위에서 정의된 바와 같은 알켄일기를 지칭한다. 알켄일렌에 연결된 2개의 모이어티는 알켄일렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다. 알켄일렌기는,에텐일렌, 프로펜일렌, 아이소프로펜일렌, 부텐일렌, 아이소부텐일렌, sec-부텐일렌, 펜텐일렌 및 헥센일렌을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
"알킨일"은 적어도 1개의 삼중 결합을 갖는 2 내지 6개의 탄소 원자의 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 지칭한다. 알킨일기의 예는, 아세틸렌일, 프로핀일, 1-부틴일, 2-부틴일, 아이소부틴일, sec-부틴일, 부타다이인일, 1-펜틴일, 2-펜틴일, 아이소펜틴일, 1,3-펜타다이인일, 1,4-펜타다이인일, 1-헥신일, 2-헥신일, 3-헥신일, 1,3-헥사다이인일, 1,4-헥사다이인일, 1,5-헥사다이인일, 2,4-헥사다이인일, 또는 1,3,5-헥사트리틴일을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 알킨일기는 또한 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6, 4 내지 5, 4 내지 6, 5 내지 6개의 탄소를 지닐 수 있다. 알킨일기는 전형적으로 1가이지만, 알킨일기가 2개의 모이어티를 함께 연결할 경우에는 2가일 수 있다.
"알킨일렌"은, 적어도 2개의 다른 기, 즉, 2가 탄화수소 라디칼을 연결하는 위에서 정의된 바와 같은 알킨일기를 지칭한다. 알킨일렌에 연결된 2개의 모이어티는 알킨일렌의 동일한 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다. 알킨일렌기는, 에틴일렌, 프로핀일렌, 부틴일렌, sec-부틴일렌, 펜틴일렌 및 헥신일렌을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
"사이클로알킬"은 3 내지 12개의 고리 원자, 또는 표시된 원자의 수를 함유하는 포화 또는 부분 불포화, 단환식, 융합된 이환식 또는 가교 다환식 고리 조립체를 지칭한다. 단환식 고리는, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 및 사이클로옥틸을 포함한다. 이환식 및 다환식 고리는, 예를 들어, 노보난, 데카하이드로나프탈렌 및 아다만탄을 포함한다. 예를 들어, C3- 8사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로옥틸, 및 노보난을 포함한다.
"사이클로알킬렌"은 적어도 2개의 다른 기, 즉, 2가 탄화수소 라디칼을 연결하는 위에서 정의된 바와 같은 사이클로알킬기를 지칭한다. 사이클로알킬렌에 연결된 2개의 모이어티는 사이클로알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결되랴. 사이클로알킬렌기는, 사이클로프로필렌 사이클로부틸렌, 사이클로펜틸렌, 사이클로헥실렌, 및 사이클로옥틸렌을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"헤테로사이클로알킬"은 3개의 고리 원 내지 약 20 고리 원, 1 내지 약 5개의 헤테로원자, 예컨대, N, O 및 S를 갖는 고리계를 지칭한다. B, Al, Si 및 P를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 추가의 헤테로원자가 또한 유용할 수 있다. 헤테로원자는 또한 -S(O)- 및 -S(O)2-(이들로 제한되지 않음)와 같이 산화될 수 있다. 예를 들어, 복소환은 테트라하이드로퓨란일, 테트라하이드로티오페닐, 몰폴리노, 피롤리딘일, 피롤린일, 이미다졸리딘일, 이미다졸린일, 피라졸리딘일, 피라졸린일, 피페라진일, 피페리딘일, 인돌린일, 퀴누클리딘일 및 1,4-다이옥사-8-아자-스피로[4.5]데크-8-일을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"헤테로사이클로알킬렌"은 적어도 2개의 다른 기를 연결하는 위에서 정의된 바와 같은헤테로사이클알킬기를 지칭한다. 헤테로사이클로알킬렌에 연결되는 2개의 모이어티는 헤테로사이클로알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다.
"아릴"은 6 내지 16개의 고리 탄소 원자를 함유하는 단환식, 또는 융합된 이환식, 삼환식 또는 그 이상, 방향족 고리 조립체를 지칭한다. 예를 들어, 아릴은 페닐, 벤질 또는 나프틸일 수 있다. "아릴렌"은 아릴기로부터 유래된 2가 라디칼을 의미한다. 아릴기는 알킬, 알콕시, 아릴, 하이드록시, 할로겐, 사이아노, 아미노, 아미노-알킬, 트라이플루오로메틸, 알킬렌다이옥시 및 옥시-C2-C3-알킬렌으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 라디칼로 단일-, 이- 또는 삼-치환될 수 있거나(이들은 모두 선택적으로 예를 들어 위에서 정의된 바와 같이 더욱 치환될 수 있음); 또는 1- 또는 2-페난트렌일이다. 알킬렌다이옥시는 페닐의 2개의 인접한 탄소 원자에 부착된 2가 치환기, 예컨대, 메틸렌다이옥시 또는 에틸렌다이옥시이다. 옥시-C2-C3-알킬렌은 또한 페닐의 2개의 인접한 탄소 원자에 부착된 2가 치환기, 예컨대, 옥시에틸렌 또는 옥시프로필렌이다. 옥시-C2-C3-알킬렌-페닐의 예는 2,3-다이하이드로벤조퓨란-5-일이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 아릴은, 알콕시, 페닐, 할로겐, 알킬 또는 트라이플루오로메틸에 의해 일치환된 또는 이치환된 나프틸, 페닐 또는 페닐, 특히, 페닐 또는 알콕시, 할로겐 또는 트라이플루오로메틸에 의해 모노- 또는 다이치환된 페닐, 특히 페닐이다.
R로서 치환된 페닐기의 예는, 예컨대, 복소환 고리에 선택적으로 치환된 4-클로로펜-1-일, 3,4-다이클로로펜-1-일, 4-메톡시펜-1-일, 4-메틸펜-1-일, 4-아미노메틸펜-1-일, 4-메톡시에틸아미노메틸펜-1-일, 4-하이드록시에틸아미노메틸펜-1-일, 4-하이드록시에틸-(메틸)-아미노메틸펜-1-일, 3-아미노메틸펜-1-일, 4-N-아세틸아미노메틸펜-1-일, 4-아미노펜-1-일, 3-아미노펜-1-일, 2-아미노펜-1-일, 4-페닐-펜-1-일, 4-(이미다졸-1-일)-페닐, 4-(이미다졸-1-일메틸)-펜-1-일, 4-(몰폴린-1-일)-펜-1-일, 4-(몰폴린-1-일메틸)-펜-1-일, 4-(2-메톡시에틸아미노메틸)-펜-1-일 및 4-(피롤리딘-1-일메틸)-펜-1-일, 4-(티오페닐)-펜-1-일, 4-(3-티오페닐)-펜-1-일, 4-(4-메틸피페라진-1-일)-펜-1-일, 및 4-(피페리딘일)-페닐 및 4-(피리딘일)-페닐이다.
"아릴렌"은 적어도 2개의 다른 기를 연결하는 위에서 정의된 바와 같은 아릴기를 지칭한다. 아릴렌에 연결된 2개의 모이어티는 아릴렌의 상이한 원자에 연결된다. 아릴렌기는 페닐렌을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
"아릴렌-옥시"는, 아릴렌에 연결된 모이어티 중 하나가 산소 원자를 통해서 연결된 위에서 정의된 바와 같은 아릴렌기를 지칭한다. 아릴렌-옥시기는 페닐렌-옥시를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
유사하게는, 아릴 및 헤테로아릴기에 대한 치환기는, 다양하고, 0 내지 방향족 고리계의 개방 원자가의 총수의 범위의 수로 -할로겐, -OR', -OC(O)R', -NR'R", -SR', -R', -CN, -NO2, -CO2R', -CONR'R", -C(O)R', -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR"C(O)2R', -NR'-C(O)NR"R"', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -N3, -CH(Ph)2, 퍼플루오로(C1-C4)알콕시, 및 퍼플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되며; R', R" 및 R"'은 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 비치환된 아릴 및 헤테로아릴, (비치환된 아릴)-(C1-C4)알킬, 및 (비치환된 아릴)옥시-(C1-C4)알킬로부터 선택된다.
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접하는 원자 상의 치환기 중 2개는 선택적으로 식 -T-C(O)-(CH2)q-U-의 치환기로 대체될 수 있으며, 여기서 T 및 U는 독립적으로 -NH-, -O-, -CH2- 또는 단일 결합이고, q는 0 내지 2의 정수이다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환기 중 2개는 선택적으로 식 -A-(CH2)r-B-의 치환기로 선택적으로 대체될 수 있고, 여기서 A 및 B는 독립적으로 -CH2-, -O-, -NH-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- 또는 단일 결합이고, r은 1 내지 3의 정수이다. 이와 같이 행성된 새로운 고리의 단일 결합 중 하나는 선택적으로 이중 결합으로 대체될 수 있다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환기 중 2개는 선택적으로 식 -(CH2)s-X-(CH2)t-의 치환기로 대체될 수 있으며, 여기서 s 및 t는 독립적으로 0 내지 3의 정수이고, X는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, 또는 -S(O)2NR'-이다. -NR'- 및 -S(O)2NR'- 내의 치환기 R'은 수소 또는 비치환된 (C1-C6)알킬로부터 선택된다.
"헤테로아릴"은 5 내지 16개의 고리 원자를 함유하고 여기서 고리 원자 중 1 내지 4개가 각각 N, O 또는 S의 헤테로원자인 단환식 또는 융합된 이환식 또는 삼환식 방향족 고리 조립체를 지칭한다. 예를 들어, 헤테로아릴은 피리딜, 인돌릴, 인다졸릴, 퀴녹살린일, 퀴놀린일, 아이소퀴놀린일, 벤조티엔일, 벤조퓨란일, 퓨란일, 피롤릴, 티아졸릴, 벤조티아졸릴, 옥사졸릴, 아이소옥사졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티엔일, 또는 치환된, 특히 예컨대, 알킬, 나이트로 또는 할로겐에 의해 특히 단일- 또는 이-치환된 임의의 기타 라디칼을 포함한다. 피리딜은 2-, 3- 또는 4-피리딜, 유리하게는 2- 또는 3-피리딜을 나타낸다. 티엔일은 2- 또는 3-티엔일을 나타낸다. 몇몇 실시형태에 있어서, 퀴놀린일은 2-, 3- 또는 4-퀴놀린일을 나타낸다. 몇몇 실시형태에 있어서, 아이소퀴놀린일은 1-, 3- 또는 4-아이소퀴놀린일을 나타낸다. 몇몇 실시형태에 있어서, 벤조피란일, 벤조티오피란일은 각각 3-벤조피란일 또는 3-벤조티오피란일을 나타낼 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 티아졸릴은 2- 또는 4-티아졸릴을 나타낼 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 트라이아졸릴은 1-, 2- 또는 5-(1,2,4-트라이아졸릴)일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 테트라졸릴은 5-테트라졸릴일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 헤테로아릴은 피리딜, 인돌릴, 퀴놀린일, 피롤릴, 티아졸릴, 아이소옥사졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티엔일, 퓨란일, 벤조티아졸릴, 벤조퓨란일, 아이소퀴놀린일, 벤조티엔일, 옥사졸릴, 인다졸릴, 또는 치환된, 특히 단일- 또는 이-치환된 임의의 라디칼이다.
용어 "헤테로알킬"은 N, O 및 S와 같은 1 내지 3개의 헤테로원자를 갖는 알킬기를 지칭한다. B, Al, Si 및 P를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 추가의 헤테로원자가 또한 유용할 수 있다. 헤테로원자는 또한 산화될 수 있고, 예컨대, 제한되지 않고 -S(O)- 및 -S(O)2-일 수 있다. 예를 들어, 헤테로알킬은 에터, 티오에터, 알킬-아민 및 알킬-티올을 포함할 수 있다.
용어 "헤테로알킬렌"은 적어도 2개의 다른 기를 연결하는 위에서 정의된 바와 같은 헤테로알킬기를 지칭한다. 헤테로알킬렌에 연결된 2개의 모이어티는 헤테로알킬렌의 동일한 원자 또는 상이한 원자에 연결될 수 있다.
"친전자체"는 이온 또는 원자 또는 원자의 집합체일 수 있고, 이는 친전자성 중심, 즉, 친핵체와 반응할 수 있는 전자를 찾는 중심을 갖는 이온성일 수 있다. 친전자체(또는 친전자성 시약)는 반응 파트너로부터 두 결합 전자를 받음으로써 그 반응 파트너(친핵체)에 대해서 결합을 형성하는 시약이다.
"친핵체"는 이온 또는 원자 또는 원자의 집합체일 수 있고, 이는 친핵성 중심, 즉, 친전자체와 반응할 수 있거나 또는 친전자성 중심을 찾는 중심을 갖는 이온성일 수 있다. 친핵체(또는 친핵성 시약)는 반응 파트너로부터 두 결합 전자를 받음으로써 그 반응 파트너(친전자체)에 대해서 결합을 형성하는 시약이다. "친핵성 기"는 반응성 기와 반응한 후의 친핵체를 지칭한다. 비제한적인 예는 아미노, 하이드록실, 알콕시, 할로알콕시 등을 포함한다.
"말레이미도"는 하기 구조를 갖는 피롤-2.5-다이온-1-일기를 지칭한다:
Figure pct00022
이는 설피드릴(예컨대, 티오 알킬)과 반응시 하기 구조를 갖는 -S-말레이미도기를 형성하며:
Figure pct00023
여기서 "
Figure pct00024
"은 말레이미도기에 대한 부착점을 나타내고 "
Figure pct00025
"는 원래의 설피드릴 보유기의 나머지에 대한 황 원자 티올의 부착점을 나타낸다.
본 개시내용의 목적을 위하여, 단백질 및 폴리펩타이드에서 발견되는 "천연형 아미노산"은 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루타민, L-글루탐산, L-글리신, L-히스티딘, L-아이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 또는 L-발린이다. 단백질에서 발견되는 "비천연형 아미노산"은 천연형 아미노산으로서 지칭되는 것 이외의 임의의 아미노산이다. 비천연형 아미노산은, 제한 없이, 천연형 아미노산의 D 이성질체, 및 천연형 아미노산의 D 이성질체와 L 이성질체의 혼합물을 포함한다. 천연형 단백질에서 발견되기는 하지만, N-알파-메틸 아미노산(예컨대, 사르코신), 4-하이드록시프롤린, 데스모신, 아이소데스모신, 5-하이드록시라이신, 엡실론-N-메틸라이신, 3-메틸히스티딘과 같은 기타 아미노산은, 이들이 일반적으로 mRNA의 리보솜 번역 이외의 수단에 의해서 도입되므로 본 개시내용의 목적을 위하여 단백질에서 발견된 비천연형 아미노산인 것으로 간주된다.
중합체의 기하, 구성 또는 전체 구조와 관련하여 "선형"은 단일 중합체 팔을 갖는 중합체를 지칭한다.
중합체의 기하, 구성 또는 전체 구조와 관련하여 "분지형"은 개시제 내에 포함된 코어 구조로부터 연장되는 2개 이상의 중합체 "팔"을 갖는 중합체를 지칭한다. 개시제는 원자 이동 라디칼 중합(ATRP) 반응에서 이용될 수 있다. 분지형 중합체는 2개의 중합체 사슬(팔), 3개의 중합체 팔, 4개의 중합체 팔, 5개의 중합체 팔, 6개의 중합체 팔, 7개의 중합체 팔, 8개의 중합체 팔, 9개 또는 그 이상의 중합체개의 팔을 지닐 수 있다. 각 중합체 팔은 중합체 개시 부위로부터 연장된다. 각 중합체 개시 부위는 단량체의 부가에 의해 중합체 사슬의 성장을 위한 부위인 것이 가능하다. 예를 들어, 제한이 아니라, ATRP를 사용해서, 개시제 상의 중합체 개시 부위는 전형적으로 제1구리 할라이드와 같은 전이금속 화합물에 의해 촉매되는 가역적 산화환원 공정을 거치는 유기 할라이드이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 할라이드는 브로민이다.
"약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 조성물에 포함될 수 있고 환자에 대한 유의한 부정적인 독성 효과를 유발하지 않으며 특히 인간에서 치료 용도를 위하여 FDA에 의해 승인되었거나 승인 가능한 부형제를 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제의 비제한적인 예는 물, NaCl, 생리 식염수 용액, 젖산 링거 수액, 노말 수크로스, 노말 글루코스 등을 포함한다.
치료적 단백질은 발병을 지연시키고, 중증도를 감소시키고, 추가의 악화를 저해시키고, 그리고/또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 징후를 개선시키는 용량, 투여 경로 및 투여 빈도를 의미하는 유효한 요법으로 투여된다. 환자가 이미 장애를 앓고 있다면, 요법은 치료적 유효 요법으로서 지칭될 수 있다. 환자가 일반적 모집단에 대해서 장애의 상승된 위험에 있지만 아직 증상을 경험하고 있지 않다면, 요법은 예방적 유효 요법이라 지칭될 수 있다. 몇몇 경우에, 치료적 또는 예방적 효능은 동일 환자에서 병력 통제 또는 과거 경험에 대해서 개별적인 환자에서 관찰될 수 있다. 다른 경우에, 치료적 또는 예방적 효능은 미치료 환자의 대조 모집단에 대해서 치료된 환자의 모집단에서의 전임상 또는 임상 시험에서 입증될 수 있다.
물질의 "생물학적 반감기"는 물질의 절반을 조직이나 물질의 도입 후에 조직 또는 유기체로부터 제거하는 데 필요한 시간을 특정하는 약동학적 파라미터이다.
"OG1786"은 도 30에 도시된 구조를 갖는 중합체 합성에 이용되는 9-팔 개시제이며, 해당 도면은 트라이플루오로아세트산을 갖는 OG1786의 그 염 형태를 도시한다. OG1786은 기타 염으로서 또는 유리 염기로서 사용될 수 있다.
"OG1801"은 단량체 HEMA-PC를 사용하는 ATRP 합성을 위한 개시제로서 OG1786을 사용해서 제조된 대략 (+/- 15%) 750 kD중합체(Mn 또는 Mp 중 하나)이다.
"OG1802"는 부가된 말레이미드 작용기를 갖는 OG1801이며 도 36에 도시되어 있고, 여기서 n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9의 각각은 중합체의 총 분자량이 (Mw) 750,000 ± 15% 돌턴이 되도록 하는 정수(양수)(0 내지 최대 약 3000)이다.
다중각 광산란(Multi-angle light scattering: MALS)은 레이저 광이 분자에 충돌하여, 광의 진동 전계가 그 내의 진동 쌍극자를 유도하는 거대분자를 분석하는 수법이다. 이 진동 쌍극자는 광을 재방사할 것이고 와이어트 미니다운(Wyatt miniDawn) TREOS와 같은 MALS 검출기를 사용하여 측정 할 수 있다. 방사된 광의 강도는 거대분자에서 유도된 쌍극자의 크기에 따라 좌우되며, 이는 이어서 거대분자의 분극능에 비례하며, 유도된 쌍극자가 클수록, 따라서 산란된 광의 강도가 커진다. 따라서, 이러한 거대분자의 용액으로부터 산란을 분석하기 위하여, 당업자라면 주변 매질(예컨대, 용매)에 대하여 자체의 분극능을 알아야 한다. 이것은, 와이어트 옵티랩(Wyatt Optilab) T-rEX 회절 굴절계를 이용해서 dn/dc (= Δn/Δc)값을 측정함으로써, 분자 농도의 변화 Δc와 함께 용액의 굴절률 n의 변화 Δn의 측정으로부터 결정될 수 있다. MALS 결정에 이용하는 두 몰 중량 파라미터는 수 평균 분자량(Mn) 및 중량 평균 분자량(Mw)인데, 여기서 다분산지수(PDI)는 Mw를 Mn으로 나눈 것과 동등하다. SEC는 또한 SEC에서 가장 높은 피크의 분자량으로 정의되는 피크 분자량 Mp의 또 다른 평균 분자량 결정을 허용한다.
PDI는 이산적 단백질(예컨대, OG1950)의 다분산성 생체고분자(예컨대, OG1802)에의 접합으로부터 유도되는 바이오접합체 및 중합체의 브로드니스비(broadness)의 척도로서 사용된다. 단백질 샘플에 대해서, 이의 다분산도는 용액 중 모든 단백질 분자가 거의 동일한 길이와 몰 질량을 갖는 것으로 예상되는 경우의 변형 제품이라는 사실로 인해 1.0에 가깝다. 이와 대조적으로, 중합체 사슬의 각종 길이가 중합 과정 동안 합성되는 생체고분자의 다분산 속성으로 인해서, 분자량의 좁은 분포에 기인하는 그의 품질 중 하나로서 샘플의 PDI를 결정하는 것이 매우 중요하다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 용액 중 분자들이 그들의 크기에 의해 분리되는 크로마토그래피 수법이다. 전형적으로 수성 용액이 각종 기공 크기의 수지로 채워진 칼럼을 통해 샘플을 수송하는데 적용된다. 수지는 칼럼을 통과할 때 피분석물에 대해서 불활성인 것으로 예상되며, 피분석물은 선택된 칼럼의 기공 크기 특징과 고유한 크기에 기초하여 서로 분리된다.
SEC와 MALS 또는 SEC/ MALS의 결합은 SEC 보정 표준 세트에 의존하는 것과는 반대로 몰 질량 및 크기(제곱 평균 제곱근 반경)의 정확한 분포를 제공한다. 이러한 유형의 배열은 전통적인 칼럼 보정 방법에 비해 많은 장점을 지닌다. 광 산란 및 농도가 각 용리 분획에 대해서 측정되므로, 몰 질량 및 크기는 용리 위치와는 독립적으로 결정될 수 있다. 이것은 생체고분자(OG1802) 또는 바이오접합체(OG1953)와 같은 비구형의 거대 분자를 갖는 종과 특히 관련되며; 이러한 종은 전형적으로 칼럼 보정 표준 세트에 의해 기술될 수 있는 방식으로 용리되지 않는다.
몇몇 실시형태에 있어서, SEC/MALS 분석은 알리안스(Alliance) 2695 용매 전달 모듈이 장착된 워터스(Waters) HPLC 시스템 및 쇼덱스(Shodex) SEC-HPLC 칼럼(7.8곱300㎜)가 장착된 워터스 2996 포토다이오드 어레이 검출기(Photodiole Array detector)를 포함한다. 이것은 와이어트 미니다운 TREOS 및 와이어트 옵티랩 T-rEX 회절 굴절계와 온라인으로 접속된다. 워터스사로부터의 엠파워 소프트웨어(Empower software)가 워터스 HPLC 시스템을 제어하는데 사용될 수 있고 와이어트사(Wyatt)로부터의 ASTRA V 6.1.7.16 소프트웨어가 와이어트 미니다운 TREOS로부터의 MALS 데이터, T-rEX 검출기로부터의 dn/dc 데이터 및 워터스 2996 포토다이오드 어레이 검출기로부터의 A280 흡광도 신호를 사용하는 질량 복구 데이터를 획득하는데 사용될 수 있다. SEC는 샘플 주입 시 1xPBS pH 7.4에서 1 ㎖/분에서 수행될 수 있고, MALS 및 RI 신호는 절대 몰질량(Mp, Mw, Mn) 및 다분산 지수(PDI)의 결정을 위하여 ASTRA 소프트웨어에 의해 분석될 수 있다. 게다가, 계산은 또한 중합체 및 단백질에 대해서 각각 0.142 및 0.183으로서 입력 dn/dc 값을 포함한다. OG1953 바이오접합체 dn/dc 값에 대해서, dn/dc는 중합체 및 단백질의 칭량된 MW에 기초하여 다음 식을 이용해서 약 0.148인 것으로 계산된다:
접합체 dn /dc = 0.142 x [MW중합체/(MW중합체+MW단백질)]+ 0.183 x [MW단백질 /(MW중합체+MW단백질)]
여기서 OG1802에 대한 MW중합체는 800 kDa이고, OG1950에 대한 MW단백질은 146 kDa이다.
일반
본 명세서에서는 항-VEGF 항체 및 이의 접합체가 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체 자체는 다른 항-VEGF제와는 상이하며, 다른 항-VEGF제에 비해서 우수한 결과를 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF 항체 접합체는 다른 항체 접합체의 활성도의 예상 및/또는 다른 항체에 비해서 놀라운 우수성을 나타낸다.
역사적으로, 분자를 단백질에 접합시키는 것은 흔히 이의 의도된 표적에 대한 단백질의 결합 상호작용의 감소를 초래하였다. 본 개시내용의 몇몇 실시형태에 있어서, 활성 부위 외측에 있는 위치에 접합시킬 경우, 예상되는 것과 같은 수준의 감소가 반드시 관찰되지 않는다. 본 명세서에서 제공된 증거는 예상될 수 있는 것에 대해서 반대의 효과를 나타낸다. 몇몇 실시형태에 있어서, 그리고 이론에 의해 제한하려는 의도는 없지만, 접합체는 항체 단독에 비해서 우수할 수 있다. 예를 들어, 리간드와 이의 특이적 수용체의 상호작용은 흔히 수용체 상의 친수성 아미노산과 리간드 상의 친수상 아미노산의 상호작용에 의해 유도되는 바와 같은, 수용체와 리간드의 입체특이적 상호작용을 통해서 기동되고, 물 분자는 이들 상호작용에서 가장 중요한 위치에 있다. 동시에, 이 친수성 입체특이성은 일반적으로 소수성-대-소수성 아미노산에 의해 매개/형성될 수 있는 비특이적 소수성 상호작용을 중시하지 않고/않거나 억제함으로써 더 증대된다.
몇몇 실시형태에 있어서, VEGF 리간드("VEGFL")와 EGF-수용체("VEGFR") 간의 상호작용의 적어도 90%를 차단 가능한 항-VEGF 항체 접합체가 제공된다. 예를 들어, 이것은 VEGFR과 VEGFL의 상호작용의 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 효과적으로 모두를 차단할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 언급된 차단은 포화 농도에서 일어난다. 몇몇 실시형태에 있어서, VEGF 리간드와 VEGF-수용체의 상호작용의 적어도 95%를 차단하는 항-VEGF 항체 접합체가 제공된다. 이러한 차단의 우수성의 일례로서, 루센티스(등록상표)(라니비주맙) 또는 아바스틴(등록상표)(베바시주맙) 또는 심지어 항체 OG1950(미접합)보다 더 높은 정도로 차단하는 OG1953(및 본 명세서에서 제공된 항체 접합체)에 관하여 도 20을 참조하면 된다. 실제로, 이 결과는, (항체 접합체를 형성하기 위하여) 항체에 중합체의 첨가가 항체의 결합/활성도에 일부 또는 전혀 유해한 영향을 지닐 것으로 예상될 수 있지만, 이 방법에서 항체의 차단 능력을 실제로 향상시킬 있었다는 것은 예기치 않다는 점에서 예기치 않은 것이었다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항체 또는 이의 접합체는 VEGFR와 VEGFL의 활성도 및/또는 상호작용을 적어도 70, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 저해시킨다. 몇몇 실시형태에 있어서, IC50값은 0.1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100nM 또는 또는 선행하는 값들 중 임의의 하나 미만일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, KD는 2×10-13, 1×10-13, 1×10-12, 1×10-11, 1×10-10M 또는 선행하는 값들 중 임의의 하나 미만이다. 몇몇 실시형태에 있어서, IC50값은 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, 또는 선행하는 값들 중 임의의 하나 미만일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, VEGF 리간드와 VEGF-수용체의 상호작용의 적어도 90%를 차단하는 항-VEGF 항체가 제공된다. 예를 들어, 이것은 VEGFR과 VEGFL의 상호작용의 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 효과적으로 모두를 차단할 수 있다. 이러한 차단의 우수성의 일례로서, 루센티스(등록상표)(라니비주맙) 또는 아바스틴(등록상표)(베바시주맙)보다 더 높은 정도로 차단하는 OG1950(및 본 명세서에서 제공된 항체)에 관하여 도 20을 참조하면 된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 기타 항체, 예컨대, 루센티스(등록상표)(라니비주맙) 또는 아바스틴(등록상표)(베바시주맙)은, 본 명세서에 기재된 방법 중 하나 이상에 의해 본 명세서에 기재된 바와 같은 중합체 중 하나 이상에 접합될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 임의의 항체, 또는 이의 단편은, 본 명세서에 기재된 방법 중 하나 이상에 의해 본 명세서에 기재된 바와 같은 중합체 중 하나 이상에 접합될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서 항체는 서열번호 1을 포함하는 중쇄 아미노산 가변 영역 및 서열번호 2를 포함하는 경쇄 아미노산 가변 영역을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 본 명세서에서 제공된 중합체 중 하나 이상에 접합된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 접합된 항체는 서열번호 1 및/또는 2에 대해서 적어도 90% 동일하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 L443C(EU 넘버링, 또는 서열번호 1에서의 449C)의 점돌연변이뿐만 아니라 서열번호 1 및 서열번호 2 내의 6개의 CDR을 함유한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 접합된 항체는 서열번호 1 및/또는 2에 대해서 적어도 90% 동일하고 하기 돌연변이: L234A, L235A 및 G237A(EU 넘버링), 및 하기 돌연변이 중 적어도 하나: Q347C(EU 넘버링) 또는 L443C(EU 넘버링)를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, VEGF-A에 결합되는 항체가 제공된다. 항체는 서열번호 1의 CDRH1인 상기 CDRH1; 서열번호 1의 CDRH2인 상기 CDRH2; 서열번호 1의 CDRH3인 상기 CDRH3; 서열번호 2의 CDRL1인 상기 CDRL1; 서열번호 2의 CDRL2인 상기 CDRL2; 서열번호 2의 CDRL3인 상기 CDRL3; 하기 돌연변이: L234A, L235A 및 G237A(EU 넘버링) 중 적어도 하나; 및 하기 돌연변이: Q347C(EU 넘버링) 또는 L443C(EU 넘버링) 중 적어도 하나를 포함한다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본 명세서를 감안하여, 본 명세서에서 제공된 항체 중 어느 하나는 본 명세서에서 제공된 중합체 중 어느 하나에 접합될 수 있고/있거나, 본 명세서에서 제공된 항체는 중합체에 부위 특이적 접합을 가능하게 하도록 부가된 시스테인을 가질 수 있다.
"VEGF" 또는 "혈관내피성장인자"(vascular endothelial growth factor)는 혈관형성 또는 혈관형성 과정에 영향을 미치는 인간 인간 혈관내피성장인자이다. 특히, 용어 VEGF는 (i) VGFR-1(Flt-1), VEGFR-2(KDR/Flk-1), 또는 VEGFR-3(FLT-4)과 같은 VEGF 수용체에 결합하고; (ii) VEGF 수용체와 연관된 티로신 키나제 활성도를 활성화시키고; 그리고 (iii) 이에 따라서 혈관형성 또는 혈관형성 과정에 영향을 미치는 성장인자의 부류의 임의의 구성원을 의미한다.
VEGF 계열의 인자는 5개의 관련된 당단백질 VEGF-A(VPE로도 알려짐), -B, -C, -D 및 PGF(태반 성장 인자)로 이루어져 있다. 이들 중에서, VEGF-A은 가장 잘 연구되어 있으며, 항-혈관형성 요법의 표적이다(Ferrara et al, (2003) Nat. Med. 9:669-676). VEGF-A는 교호 스플라이싱 및 단백질분해 둘 다에 의해 생성된 다수의 상이한 아이소타입으로서 존재한다: VEGF-A206, VEGF-A189, VEGF-A165, 및 VEGF-A121. 아이소폼은 뉴로필린이라 불리는 헤파린 및 비-신호전달 결합 단백질을 결합하는 능력이 상이하다. 아이소폼은 모두 다이머로서 생물학적으로 활성이다.
VEGF의 각종 효과는 수용체 티로신 키나제(RTK)에 VEGF, 예컨대, VEGF-A(P15692), -B (P49766), -C (P49767) 및 -D(Q43915)의 결합에 의해 매개된다. VEGF 계열 수용체는 V부류 RTK에 속하고, 각각은 세포외 도메인(ECD)에서 7개의 Ig-유사 도메인을 보유한다. 인간에서, VEGF는 3종의 RTK: VEGFR-1(Flt-1)(P17948), VEGFR-2(KDR, Flk-1)(P935968) 및 VEGFR-3(Flt-4)(P35916)에 결합한다. 본 맥락으로부터 달리 명백하지 않은 한, VEGF에 대한 언급은, 천연 형태에 대해서 적어도 90, 95, 98 또는 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 천연 아이소폼 또는 천연 변이체 또는 유도 변이체 중 어느 하나에서 VEGF-A, -B, -C, -D 및 PGF 중 어느 하나를 의미한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이러한 VEGF는 인간 VEGF이다. 마찬가지로 VEGFR에 대한 언급은 천연 서열에 대해서 적어도 90, 95, 98 또는 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 임의의 천연 아이소폼 또는 천연 변이체, 또는 유도 변이체를 포함하는 VEGR-1, R-2 또는 R-3 중 어느 하나를 의미한다.
VEGF 길항제 요법은 소정의 암 및 습성 AMD의 치료를 위하여 승인되어 있다. 베바시주맙(아바스틴, Genentech/Roche)은 인간 VEGF를 특히 VEGF-A의 모든 아이소폼에 그리고 VEGF-A의 생물활성 단백질 분해 단편에 결합하여 중성화시키는 인간화된 마우스 단클론성 항체이다. 예컨대, 문헌[Ferrara N, Hillan KJ, Gerber HP, Novotny W. 2004, Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3(5):391-400] 참조. 베바시주맙은 소정의 암의 치료를 위하여 승인되어 있다. 베바시주맙의 중쇄 및 경쇄의 단백질 서열(DrugBank DB00112)은 서열번호 3(중쇄) 및 서열번호 4(경쇄)에 제시된다.
베바시주맙 가변 경쇄 CDR은 CDRL1: SASQDISNYLN(서열번호 12), CDRL2: FTSSLHS(서열번호 13) 및 CDRL3: QQYSTVPWT(서열번호 14)이다. 베바시주맙 가변 중쇄 CDR은 CDRH1: GYTFTNYGMN, CDRH2: WINTYTGEPTYAADFKR(서열번호 10) 및 CDRH3: YPHYYGSSHWYFDV이다. CDR은 CDRH1이 복합 카바트/코티아(Kabat/Chothia) 정의를 사용하는 것을 제외하고 카바트에 의해 정의된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 시스테인은 베바시주맙 서열에 부가될 수 있고, 항체(및/또는 베바시주맙의 6개 CDR을 포함하는 변이체)는 본 명세서에서 제공된 중합체 중 임의의 하나 이상에 접합될 수 있다.
베바시주맙과 동일한 마우스 단클론성 항체로부터 유래된 또 다른 항-VEGF 분자는 습성 AMD에 대한 치료로서 승인되었다: 라니비주맙(루센티스(등록상표)(라니비주맙), Genentech/Roche). 라니비주맙은 항체 단편 또는 Fab이다. 라니비주맙은 베바시주맙의 가변 중쇄 및 경쇄의 친화도 성숙에 의해 생성되었다. 라니비주맙의 중쇄 및 경쇄의 서열(노바티스사(Novartis)에 의해 발행됨)은 각각 서열번호 5 및 6로 제시된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 시스테인은 라니비주맙 서열에 부가될 수 있고, 항체(및/또는 라니비주맙의 6개 CDR을 포함하는 변이체)는 본 명세서에서 제공된 중합체 중 임의의 하나 이상에 접합될 수 있다.
라니비주맙 CDR은, 개선점이 친화도 성숙 후에 부가된 것을 제외하고 베바시주맙과 동일하다: 라니비주맙 가변 경쇄 CDR은 CDRL1: SASQDISNYLN(서열번호 12), CDRL2: FTSSLHS(서열번호 13) 및 CDRL3: QQYSTVPWT(서열번호 14)이다. 라니비주맙 가변 중쇄 CDR은 CDRH1: GYDFTHYGMN(서열번호 9), CDRH2: WINTYTGEPTYAADFKR(서열번호 10) 및 CDRH3: YPYYYGTSHWYFDV(서열번호 11)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 포스포릴콜린 함유 중합체에 항체의 가변 영역의 외측에 있는 시스테인에서 결합된 항-VEGF-A 항체를 갖는 항체 접합체가 제시되되, 여기서 시스테인은 재조합 DNA 기술을 통해서 부가되었다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 단일의 시스테인에 결합된다. 몇몇 실시형태에 있어서, "재조합 DNA 기술에 의해 부가된"은 시스테인 잔기가 기지의 또는 기존의 항체에서 또는 공통 항체 서열에서 동일 위치에서 생기는 비-시스테인 아미노산을 대체하는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 항체는 IgG1이고, 중쇄는 EU 위치 443에서 류신을 갖는 경우, 류신은 재조합 DNA 기술을 통해서 시스테인으로 대체된다(L443C, EU 넘버링, 또는 서열번호 1에서의 449C). 이에 대응해서, EU 위치 347에서의 네이티브(native) IgG1은 Q(글루타민)이고, Q는 재조합 DNA 기술을 통해서 시스테인으로 대체되어 Q347C를 수득한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-A 항체는 경쇄와 중쇄를 포함하되, 중쇄는 Fc 영역을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 시스테인은 Fc 영역에 있고, 항-VEGF-A　항체는 면역글로불린 G(IgG)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-중쇄는 CDRH1: GYDFTHYGMN(서열번호 9), CDRH2:　WINTYTGEPTYAADFKR(서열번호 10) 및 CDRH3: YPYYYGTSHWYFDV(서열번호 11)를 구비하고, (서열번호 3에서와 같은 순차적인 계수를 통해서) 위치 221은 T이며, 항-VEGF-경쇄는 CDRL1: SASQDISNYLN(서열번호 12), CDRL2: FTSSLHS(서열번호 13) 및 CDRL3: QQYSTVPWT(서열번호 14)를 구비하고, 카바트 위치 4는 L이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-중쇄 아이소타입은 IgG1이다. 몇몇 실시형태에 있어서, IgG1 불변 영역은 효과기 기능을 조절하기 위하여 IgG1 불변 영역(예컨대, 서열번호 3의 불변 영역)에 대하여 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 효과기 기능 돌연변이는 E233X, L234X, L235X, G236X, G237X, A327X, A330X 및 P331X(EU 넘버링) 중 하나 이상이고, 여기서 X는 임의의 천연 또는 비천연 아미노산이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이는 E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S 및 P331S(EU 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체 접합체는 이하의 돌연변이(EU 넘버링): L234A, L235A 및 G237A를 갖는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 시스테인 잔기는 항-VEGF-중쇄 중에 있고, Q347C(EU 넘버링) 또는 L443C(EU 넘버링)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 시스테인 잔기는 L443C(EU 넘버링, 또는 서엷너호 1 중의 449C)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-중쇄의 서열은 서열번호 1이고 항-VEGF-경쇄의 서열은 서열번호 2이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 포스포릴콜린 함유 중합체는 이하에 제시된 바와 같은 2-(메타크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트(MPC) 단량체를 포함한다:
Figure pct00026
따라서, 중합체는 이하의 반복 구조를 포함한다:
Figure pct00027
여기서 n은 1 내지 3000의 정수이고, 물결선은 중합체 중의 단량체 단위들 간의 부착점을 나타낸다.
몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 3개 이상의 팔, 또는 3개 이상의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 팔, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성된다. 더 바람직하게는, 중합체는 3, 6, 또는 9개의 팔, 또는 3, 6, 또는 9개의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 9개의 팔, 또는 9개의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 부가되는 중합체는 약 300,000 내지 약 1,750,000 Da (SEC-MALs)의 분자량을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 약 500,000 내지 약 1,000,000 Da의 분자량을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 약 600,000 내지 약 900,000 Da의 분자량을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 약 750,000 내지 약 850,000 Da의 분자량을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 약 800,000 내지 약 850,000 Da의 분자량을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 약 750,000 내지 약 800,000 Da의 분자량을 갖는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 항체 중 어느 하나는 바이오접합체를 형성하기 위하여 중합체에 더 접합될 수 있다. 바이오접합체의 분자량(총합해서, SEC-MAL)은 약 350,000 내지 2,000,000 돌턴, 예를 들어, 약 450,000 내지 1,900,000 돌턴, 약 550,000 내지 1,800,000 돌턴, 약 650,000 내지 1,700,000 돌턴, 약 750,000 내지 1,600,000 돌턴, 약 850,000 내지 1,500,000 돌턴, 약 900,000 내지 1,400,000 돌턴, 약 950,000 내지 1,300,000 돌턴, 약 900,000 내지 1,000,000 돌턴, 약 1,000,000 내지 1,300,000 돌턴, 약 850,000 내지 1,300,000 돌턴, 약 850,000 내지 1,000,000 돌턴, 약 1,000,000 내지 1,200,000 돌턴일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항체 접합체는 정제된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 항체의 양상이고 접합체는 다분산성이고, 즉, 중합체 PDI는 1.0이 아니다. 몇몇 실시형태에 있어서, PDI는 1.5 미만이다. 몇몇 실시형태에 있어서, PDI는 1.4 미만이다. 몇몇 실시형태에 있어서, PDI는 1.3 미만이다. 몇몇 실시형태에 있어서 PDI는 1.2 미만이다. 몇몇 실시형태에 있어서 PDI는 1.1 미만이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항체 접합체는 중합체에 결합된 항-VEGF-A 면역글로불린 G(IgG)을 갖고, 여기서 중합체는 MPC 단량체를 포함하며, 항-VEGF-중쇄의 서열은 서열번호 1이고, 항-VEGF-경쇄의 서열은 서열번호 2이며, 항체는 중합체에 서열번호 1에서의 C449에서만 결합된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 9개의 팔을 갖고 약 600,000 내지 약 1,000,000　Da의 분자량을 갖는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항체 접합체는 중합체에 결합된 항-VEGF-A 면역글로불린 G(IgG)를 갖되, 중합체는 MPC 단량체를 포함하고, 항-VEGF-중쇄의 서열은 서열번호 1이고, 항-VEGF-경쇄의 서열은 서열번호 2이며, 항체는 C443(EU 넘버링, 또는 서열번호 1에서의 449C)에서만 중합체에 결합된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 9개의 팔을 갖고, 약 600,000 내지 약 1,000,000　Da의 분자량을 갖는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항체 접합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00028
여기서: 항-VEGF-A 항체의 각각의 중쇄는 문자 H로 표기되고, 항-VEGF-A 항체의 각각의 경쇄는 문자 L로 표기되며;
중합체는 서열번호 1의 C449의 설피드릴을 통해서 항-VEGF-A 항체에 결합되고, 결합은 중쇄 중 하나 상에 묘사되며; PC는
Figure pct00029
이되 곡선은 중합체의 나머지 부분에의 부착점을 나타내고; X는 a) OR(여기서 R=H, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필임), b) H, 또는 c) Br을 포함하는 임의의 할라이드이며, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n6, n7, n8 및 n9의 합계가 2500 ± 10%ㅇ가 되도록, 동일 또는 상이하다. 소정의 실시형태에 있어서, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는 동일하거나 또는 상이하고, 0 내지 3000의 정수이다. 소정의 실시형태에 있어서, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는 동일하거나 또는 상이하고, 0 내지 500의 정수이다. 몇몇 실시형태에 있어서, X는 OR이되, 여기서 R은 당, 아미노알킬, 이하의 잔기의 단일 치환된, 다치환된 또는 비치환된 변형체: 포화 C1 -C24 알킬, 불포화 C2 -C24 알켄일 또는 C2 -C24 알킨일, 아실, 아실옥시, 알킬옥시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알콕시 카보닐, 알콕시 카보닐아실, 아미노, 아미노카보닐, 아미노카보일옥시, 나이트로, 아지도, 페닐, 하이드록시, 알킬티오, 아릴티오, 옥시설포닐, 카복시, 사이아노, 및 폴리할로겐화 알킬을 포함하는 할로겐화 알킬, --CO--O--R7, 카보닐 --CCO--R7, --CO--NR8R9, --(CH2)n--COOR7, --CO--(CH) n--COOR7, --(CH2) n--NR8R9, 에스터, 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐이고, n은 1 내지 6의 정수이며, 각각의 R7, R8 및 R9는 개별적으로 수소 원자, 할로겐 원자, 이하의 잔기의 단일 치환된, 다치환된 또는 비치환된 변형체: 포화 C1-C24 알킬, 불포화 C2-C24 알켄일 또는 C2-C24 알킨일, 아실, 아실옥시, 알킬옥시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알콕시 카보닐, 알콕시 카보닐아실, 아미노, 아미노카보닐, 아미노카보일옥시, 나이트로, 아지도, 페닐, 하이드록시, 알킬티오, 아릴티오, 옥시설포닐, 카복시, 사이아노, 및 폴리할로겐화 알킬을 포함하는 할로겐화 알킬, 5-원 고리, 및 6-원 고리로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항체 접합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00030
여기서: 항-VEGF-A 항체의 각각의 중쇄는 문자 H로 표기되고, 항-VEGF-A 항체의 각각의 경쇄는 문자 L로 표기되며;
중합체는 C443(EU 넘버링, 또는 서열번호 1에서의 449C)의 설피드릴을 통해서 항-VEGF-A 항체에 결합되되, 결합은 중쇄 중 하나 상에 묘사되며; PC는
Figure pct00031
이고, 곡선은 중합체의 나머지 부분에 대한 부착점을 나타내고; X는 a) OR(여기서 R=H, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필임), b) H, 또는 c) Br을 포함하는 임의의 할라이드이고, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n6, n7, n8 및 n9의 합계가 2500 ± 10%가 되도록 동일 또는 상이하다. 소정의 실시형태에 있어서, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는 동일하거나 또는 상이하고, 0 내지 3000의 정수이다. 소정의 실시형태에 있어서, n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는 동일하거나 또는 상이하고, 0 내지 500의 정수이다. 몇몇 실시형태에 있어서, X=OR이되, 여기서 R은 당, 아미노알킬, 이하의 잔기의 단일 치환된, 다치환된 또는 비치환된 변형체: 포화 C1-C24 알킬, 불포화 C2-C24 알켄일 또는 C2-C24 알킨일, 아실, 아실옥시, 알킬옥시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알콕시 카보닐, 알콕시 카보닐아실, 아미노, 아미노카보닐, 아미노카보일옥시, 나이트로, 아지도, 페닐, 하이드록시, 알킬티오, 아릴티오, 옥시설포닐, 카복시, 사이아노, 및 할로겐화 알킬(폴리할로겐화 알킬을 포함함), --CO--O--R7, 카보닐 --CCO--R7, --CO--NR8R9, --(CH2)n--COOR7, --CO--(CH) n--COOR7, --(CH2) n--NR8R9, 에스터, 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐이며, n 은 1 내지 6의 정수이고, 각각의 R7, R8 및 R9는 개별적으로 수소 원자, 할로겐 원자, 이하의 잔기의 단일 치환된, 다치환된 또는 비치환된 변형체: 포화 C1-C24 알킬, 불포화 C2-C24 알켄일 또는 C2-C24 알킨일, 아실, 아실옥시, 알킬옥시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알콕시 카보닐, 알콕시 카보닐아실, 아미노, 아미노카보닐, 아미노카보일옥시, 나이트로, 아지도, 페닐, 하이드록시, 알킬티오, 아릴티오, 옥시설포닐, 카복시, 사이아노, 및 할로겐화 알킬(폴리할로겐화 알킬, 5-원 고리, 및 6-원 고리를 포함함)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항체 접합체는 액체 제형에 존재한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체 접합체는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-A 항체가 제시된다 항-VEGF-A 항체 중쇄는 적어도 하기 CDR 서열: CDRH1: GYDFTHYGMN(서열번호 9), CDRH2: WINTYTGEPTYAADFKR(서열번호 10) 및 CDRH3: YPYYYGTSHWYFDV(서열번호 11)를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-중쇄는 이들 CDR를 갖고, 부가적으로 (서열번호 3에서 순차적인 계수를 통해서) 위치 221에서 트레오닌(T)을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-경쇄 적어도 하기 CDR: CDRL1: SASQDISNYLN(서열번호 12), CDRL2: FTSSLHS(서열번호 13) 및 CDRL3: QQYSTVPWT(서열번호 14)를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-A 항체는이들 CDR를 갖고, 부가적으로 카바트 위치 4에서 류신(L)을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-A 항체 중쇄의 아이소타입은 IgG1이고 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 경쇄 아이소타입은 카파이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-A 항체의 IgG1 도메인은 효과기 기능을 조절하기 위하여 하나 이상의 돌연변이, 예컨대, ADCC, ADCP 및 CDC를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, IgG1 돌연변이는 효과기 기능을 저감시킨다. 몇몇 실시형태에 있어서 효과기 기능 돌연변이를 위하여 사용되는 아미노산은 E233X, L234X, L235X, G236X, G237X, G236X, D270X, K322X, A327X, P329X, A330X, A330X, P331X 및 P331X(EU 넘버링)를 포함함되, 여기서 X는 임의의 천연 또는 비천연 아미노산이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이는 E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S 및 P331S(EU 넘버링) 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-중쇄는 하기 돌연변이(EU 넘버링): L234A, L235A 및 G237A를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 천연 인간 IgG1 서열서열에 대해서 효과기 기능 돌연변이의 개수는 10개 이하이다. 몇몇 실시형태에 있어서 천연 인간 IgG1 서열에 대해서 효과기 기능 돌연변이의 개수는 5개 이하, 4, 3, 2 또는 1개이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체는 감소된 Fc 감마 결합 및/또는 보체 C1q 결합을 가지므로, 효과기 기능을 초래하는 항체의 능력은 감소된다. 이것은 안과적 징후/장애에 특히 유리하다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-A 항체는 하기 아미노산 돌연변이: L234A, L235A, G237A(EU 넘버링) 및 L443C(EU 넘버링, 또는 서열번호 1에서 449C) 중 하나 이상을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-A 항체는 인간 면역글로불린 G(IgG1)이거나 또는 이의 일부이다.
몇몇 실시형태에 있어서, VEGF-A 항체는 면역-매개 효과기 기능을 저감시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서 항-VEGF-A 항체가 제공된다. 항-VEGF-항체는 서열 GYDFTHYGMN(서열번호 9)을 포함하는 CDRH1, 서열　WINTYTGEPTYAADFKR(서열번호 10)을 포함하는 CDRH2, 서열 YPYYYGTSHWYFDV(서열번호 11)를 포함하는 CDRH3, 서열 SASQDISNYLN(서열번호 12)을 포함하는 CDRL1, 서열 FTSSLHS(서열번호 13)를 포함하는 CDRL2, 및 서열 QQYSTVPWT(서열번호 14)를 포함하는 CDRL3을 포함하는 중쇄를 포함한다.
대안적으로, IgG 도메인은 IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 불변 영역이 이들 아이소타입(예컨대, IgG2 또는 IgG4로부터의 CH1 영역, 힌지, IgG1로부터의 CH2 및 CH3 영역) 중 하나 초과로부터 형성되는 복합체일 수 있다. 이러한 도메인은 IgG1에 대해서 언급된 EU 위치의 하나 이상에서 효과기 기능을 저감 및/또는 조절하는 돌연변이를 함유할 수 있다. 인간 IgG2 및 IgG4는 인간 IgG1 및 IgG3에 대해서 저감된 효과기 기능을 갖는다.
항-VEGF-중쇄는 반감기 연장 모이어티를 접합시키는데 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술에 의해 돌연변이로서 부가된 시스테인 잔기를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이는 (EU 넘버링) Q347C(EU 넘버링) 및/또는 L443C(EU 넘버링, 또는 서열번호 1에서의 449C)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이는 L443C(EU 넘버링, 또는 서열번호 1에서의 449C)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체 대 중합체의 화학량론은 1:1이고; 즉, 접합체는 중합체의 하나의 분자에 접합된 항체의 하나의 분자를 갖는다.
항-VEGF-A 항체의 반감기는 "반-감기("반감기") 연장 모이어티" 또는 "반-감기("반감기") 연장기"의 부착에 의해 연장될 수 있다. 반감기 연장 모이어티는 하나 이상의 아미노산 곁사슬 또는 말단 작용기, 예컨대, -SH, -OH, -COOH, -CONH2, -NH2, 또는 하나 이상의 N- 및/또는 O-글리칸 구조에 부착 또는 접합될 수 있는 각종 중합체 및 쟁점의 생물학적 약물(또는 상황에 따라서 화학적으로 접합됨)과 프레임 내에서 발현될 수 있는 펩타이드 및 단백질을 포함한다. 반감기 연장 모이어티는 일반적으로 생물학적 약물의 생체내 순환 반감기를 증가시키도록 작용한다.
펩타이드/단백질 반감기 연장 모이어티의 예는 Fc 융합체(Capon DJ, Chamow SM, Mordenti J, et al. Designing CD4 immunoadhesions for AIDS therapy. Nature. 1989. 337:525-31), 인간 혈청 알부민(HAS) 융합체(Yeh P, Landais D, Lemaitre M, et al. Design of yeast-secreted albumin derivatives for human therapy: biological and antiviral properties of a serum albumin-CD4 genetic conjugate. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89:1904-08), 카복시 말단 펩타이드(CTP) 융합체(Fares FA, Suganuma N. Nishimori K, et al. Design of a long-acting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89:4304-08), XTEN(non-exact repeat peptide sequence) 융합체의 유전자 융합체(Schellenberger V, Wang CW, Geething NC, et al. A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat Biotechnol. 2009. 27:1186-90), 엘라스틴 유사 펩타이드 (ELPylation)(MCpherson DT, Morrow C, Minehan DS, et al. Production and purification of a recombinant elastomeric polypeptide, G(VPGVG19-VPGV, from Escheriachia coli. Biotechnol Prog. 1992. 8:347-52), 인간 트랜스페린 융합체 (Prior CP, Lai C-H, Sadehghi H et al. Modified transferrin fusion proteins. 특허 WO2004/020405. 2004), 프롤린-알라닌-세린(PASylation)(Skerra A, Theobald I, Schlapsky M. Biological active proteins having increased in vivo and/or vitro stability. Patent WO2008/155134 A1. 2008), 호모-아미노산 중합체(HAPylation)(Schlapschy M, Theobald I, Mack H, et al. Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life. Protein Eng Des Sel. 2007. 20:273-84) 및 젤라틴 유사 단백질(GLK) 융합체(Huang Y-S, Wen X-F, Zaro JL, et al. Engineering a pharmacologically superior form of granulocyte-colony-stimulating-factor by fusion with gelatin-like protein polymer. Eur J. Pharm Biopharm. 2010. 72:435-41)를 포함한다.
중합체 반감기 연장 모이어티의 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 분지형 PEG, PolyPEG(등록상표)(워익 이펙트 폴리머스사(Warwick Effect Polymers); 영국 코번트리 소재), 폴리시알산(PSA), 전분, 하이드록실에틸 전분(HES), 하이드록시알킬 전분(HAS), 탄수화물, 다당류, 풀루란, 키토산, 하이알루론산, 황산콘드로이틴, 황산데르마탄, 덱스트란, 카복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 폴리알킬렌 글리콜(PAG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일몰폴린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스타이렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포르말)(PHF), 양쪽성 이온성 중합체, 포스포릴콜린 함유 중합체 및 MPC를 포함하는 중합체, 폴리(Glyx-Sery), 하이알루론산(HA), 헤파로산 중합체(HEP), 플렉시머(Fleximer), 덱스트란, 및 폴리-시알산(PSA)을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 반감기 연장 모이어티는 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스터를 사용하여 단백질의 유리 아미노기를 통해서 항체에 접합될 수 있다. 아민기에 대한 접합을 표적화하는 시약은 라이신의 ε-아민기, N-말단 아미노산의 α-아민기 및 히스티딘의 δ-아민기에 무작위로 반응할 수 있다.
그러나, 본 명세서에 개시된 항-VEGF-A 항체는 중합체 접합에 대해서 이용 가능한 많은 아민기를 갖는다. 따라서 유리 아미노기에 중합체의 접합은 VEGF에 결합하는 항체 단백질의 능력에 부정적으로 영향을 미칠 수도 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 반감기 연장 모이어티는, 제한 없이, 말레이미드 화학, 또는 사전 산화 후에 항체의 탄수화물 모이어티에 중합체 하이드라자이드 또는 중합체 아민의 커플링을 비롯하여 임의의 적절한 티올-반응성 화학을 이용해서 1개 이상의 유리 SH기에 커플링된다. 몇몇 실시형태에 있어서 말레이미드 커플링이 이용된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 커플링은 유전자 조작을 통해서 도입되거나 또는 자연적으로 존재하는 시스테인에서 일어난다.
몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 부위 지향 돌연변이유발에 의해 항-VEGF-A 항체에 도입된 시스테인 잔기에 공유 부착된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 시스테인 잔기는 항체의 Fc 부분에 이용된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 시스테인 잔기를 Fc 영역에 도입하는 부위는 WO 2013/093809, US 7,521,541, WO 2008/020827, US 8,008,453, US 8,455,622 및 US2012/0213705에 제공되며, 이들은 모든 목적을 위하여 참고로 본 명세서에 편입된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 시스테인 돌연변이는 EU 넘버링에 의해 인간 IgG 중쇄를 지칭하는 Q347C(EU 넘버링) 및 L443C이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 반감기 연장제로서 기능하는 항체 및 고분자량 중합체의 접합체가 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 접합체는 양쪽성 이온성 중합체에 커플링되는 항체를 포함하며, 여기서 중합체가 1개 이상의 단량체 단위로부터 형성되며, 양쪽성 이온성기를 갖는 적어도 1개의 단량체 단위가 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 양쪽성 이온성 기는 포스포릴콜린이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 단량체 단위 중 하나는 HEMA-PC이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 HEMA-PC인 단일 단량체로부터 합성된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 몇몇 항체 접합체는 2, 3개 이상의 중합체 팔을 갖되, 여기서 단량체는 HEMA-PC이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 접합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 중합체 팔을 갖되, 여기서 단량체는 HEMA-PC이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 접합체는 3, 6 또는 9개의 팔을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 접합체는 9 팔을 갖는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 중합체-항체 접합체는 100,000 내지 1,500,000 Da의 분자량을 지니는 중합체 부분을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 접합체는 500,000 내지 1,000,000 Da의 분자량을 지니는 중합체 부분을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 접합체는 600,000 내지 800,000 Da의 분자량을 지니는 중합체 부분을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 접합체는 600,000 내지 850,000 Da의 분자량을 지니는 중합체 부분을 갖고, 9개의 팔을 갖는다. 분자량이 중합체에 접합된 항체에 대해서 부여된 경우, 그 분자량은, 이와 관련된 임의의 탄수화물 모이어티, 및 중합체의 분자량을 비롯하여 단백질의 분자량의 부가일 것이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 약 100 kDa 내지 1650 kDa의 Mw에 의해 측정된 분자량을 갖는 HEMA-PC 중합체를 갖는 항-VEGF-A 항체가 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, Mw에 의해 측정된 중합체의 분자량은 약 500 kDa 내지 1000 kDa이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체의 분자량은 약 600 kDa 내지 약 900 kDa이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체의 분자량은 750 kDa ± 15%이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 1개 이상의 중합체 개시 부위를 갖는 ATRP에 적합한 개시제로부터 제조된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체 개시 부위 has a 2-브로모아이소부티레이트 부위. 몇몇 실시형태에 있어서, 개시제는 3개 이상의 중합체 개시 부위를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 개시제는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 중합체 개시 부위를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 개시제는 3, 6 또는 9개의 중합체 개시 부위를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 개시제는는 9개의 중합체 개시 부위를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 개시제는 OG1786이다.
항-VEGF-A 항체는, (i) 유전자 조작에 의한 재조합 DNA의 생산, (ii) 예를 들어, 제한 없이, 형질주입, 전기천공 또는 미세주입에 의해 원핵 또는 진핵 세포 내로의 재조합 DNA의 도입, (iii) 형질전환된 세포의 배양, (iv) 항체를, 예컨대, 연속해서 또는 유도해서 발현 (v) (vi) 정제된 항체를 수득하기 위하여, 항체를 예컨대 배양 배지로부터 또는 형질전환된 세포를 수거함으로써 단리키는 것을 포함하는 재조합체 발현에 의해 생산될 수 있다.
항-VEGF-A 항체는 생리학적으로 허용 가능한 항체 분자를 생산하는 것을 특징으로 하는 적합한 원핵 또는 진핵 숙주 시스템에서의 발현에 의해 생산될 수 있다. 진핵 세포의 예는 포유류 세포, 예컨대, CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hip 및 HepG2이다. 기타 적합한 발현 시스템은 원핵 세포(예컨대, pET/BL21 발현 시스템을 갖는 이 콜라이(E. coli)), 효모 세포(사카로마이에스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 및/또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 시스템) 및 곤충 세포이다.
광범위한 벡터가 본 명세서에 개시된 항체의 제조에 사용될 수 있고, 진핵 및 원핵 발현 벡터로부터 선택된다. 원핵 발현용의 벡터의 예는 플라스미드, 그리고 예컨대, 제한 없이, 프리셋(preset), 페트(pet) 및 패드(pad)를 포함하며, 원핵 발현 벡터에서 사용되는 촉진제(promoter)는, 제한 없이, lac, trc, trp, recA, 또는 araBAD 중 하나 이상을 포함한다. 진핵 발현용의 벡터의 예는, (i) 효모에서의 발현을 위하여, 제한 없이, AOX1, GAP, GAL1, 또는 AUG1와 같은 촉진제를 이용하는, 제한 없이, pAO, pPIC, pYES, 또는 pMET와 같은 벡터; (ii) 곤충 세포에서의 발현을 위하여, 제한 없이 PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, 또는 polh와 같은 촉진제를 이용하는, 제한 없이, pMT, pAc5, pIB, pMIB, 또는 pBAC와 같은 벡터, 및 (iii) 포유류 세포에서의 발현을 위하여, 제한 없이, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, 또는 pBPV와 같은 벡터, 그리고 일 양상에 있어서, 제한 없이 CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, 및 베타-액틴과 같은 촉진제를 이용하는, 제한 없이, 우두 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 레트로바이러스로부터 유래된 벡터를 포함한다.
단백질을 중합체에 접합시키는 방법
몇몇 실시형태에 있어서, 재조합 DNA 기술을 통해서 부가된 시스테인 잔기를 갖는 치료적 단백질을 말레이미드, 비닐설폰, 오쏘피리딜-다이설파이드, 및 아이오도아세트아마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 설피드릴 특이적 반응기를 갖는 반감기 연장 모이어티에 접합시켜서 치료적 단백질-반감기 연장 모이어티 접합체를 제공하는 단계를 갖는 치료적 단백질-반감기 연장 모이어티 접합체를 제조하는 방법이 제시된다.
몇몇 실시형태에 있어서, OG1950으로부터 OG1953 항체 접합체를 제조하는 방법이 제공된다. 도 18에 도시된 바와 같이, 이 방법은 OG1950 단백질을 50배 몰 과잉의 TCEP 환원제로 환원시키는 단계를 포함한다(도 18). 환원 후에, 항체가 산화되어 캡 제거된 OG1950 항체를 생산하며, 여기서 항체에서 자연적으로 발생하는 사슬간- 및 사슬내- 경쇄 및 중쇄 다이설파이드 결합이 형성되지만, 중쇄 위치 L443C(EU 넘버링, 또는 서열번호 1에서의 449C) 상의 조작된 시스테인은 캡 제거된 채로 유지된다(도 18). 이어서, OG1950이 부형제를 첨가하고 5 내지 10배 몰 과잉의 말레이미드 생체고분자를 첨가함으로써 접합된다(도 18). 생체고분자는 공유 티올 에터 결합을 통해서 OG1950 항체에 연결된다(도 18). 접합 후에, OG19503 항체 접합체는 미접합 항체 및 중합체를 둘 다 제거하면서 정제된다(도 18).
위에서 기재된 단백질 및 방법은 또한 변화될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 접합된 단백질(항체 또는 항-VEGF 항체일 필요는 없음)의 제조 방법이 제공된다. 해당 방법은 용액 중에 캡 제거된 단백질을 형성하기 위하여 단백질 내에 하나 이상의 시스테인을 환원시키는 것을 포함한다. 하나 이상의 시스테인을 환원시킨 후, 캡 제거된 단백질이 재산화되어 환원된 단백질 중에 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 복구시키는 한편, 단백질 내 조작된 시스테인 잔기는 유리 티올 형태로 잔류하여 용액 중 재산화된 캡 제거된 단백질을 형성시킨다. 이어서 이 용액에 적어도 1종 부형제가 첨가된다. 부형제는 중합체 유도 단백질 석출을 저감시킨다. 부형제가 첨가된 후에, 이 용액에 중합체가 첨가되어 조작된 시스테인 잔기에서 재산화된 캡 제거된 단백질에 접합되어 접합된 단백질을 형성시킨다.
몇몇 실시형태에 있어서, 환원제의 몰 과잉은 작용하는 임의의 양으로 변경될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90배 몰 과잉의 환원제(모든 실시형태에서 TCEP일 필요는 없음)가 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 임의의 항체(치료제 또는 기타)가 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15배 몰 과잉의 말레이미드 생체고분자가 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체에 대해서 과잉의 캡 제거된 단백질이 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환원된 단백질의 양은 중합체의 양보다 적다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환원된 단백질의 양은 중합체의 양의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체보다 10 내지 15배 많은 양이 단백질로서 사용된다. 몇몇 실시형태에 있어서 환원된 항체의 양은 중합체의 양보다 많다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체의 양은 환원된 항체의 양보다 많다.
몇몇 실시형태에 있어서, 정제 단계는 선택적이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 방법은 항체 접합체를 제조하는 방법은 항-VEGF-A 항체를 포스포릴콜린 함유 중합체에 접합시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 항-VEGF-A 항체를 포스포릴콜린 함유 중합체에 접합시키는 단계를 포함한다. 항-VEGF-A 항체는 재조합 DNA 기술을 통해서 부가된 아미노 잔기를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부가된 아미노산 잔기는 시스테인 잔기이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 시스테인 잔기는 항체의 가변 영역의 외측에 부가된다. 시스테인 잔기는 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 한쪽에 부가될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 포스포릴콜린 함유 중합체를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 포스포릴콜린 함유 중합체는 말레이미드, 비닐설폰, 오쏘피리딜-다이설파이드 및 아이오도아세트아마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 설피드릴 특이적 반응기를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 포스포릴콜린 함유 중합체 상의 설피드릴 특이적 반응기는 항체 접합체를 제조하기 위하여 항-VEGF-A 항체 상의 시스테인 잔기와 반응한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 접합될 단백질은 항체, 항체 단백질 융합체, 또는 이의 결합 단편일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 단백질은 항체가 아니라, 효소, 리간드, 수용체, 또는 기타 단백질 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 네이티브 단백질은 적어도 1개의 다이설파이드 결합 및 적어도 하나의 비-네이티브 시스테인을 함유한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 부형제는 산 또는 염기일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부형제는 세정제, 당, 또는 하전된 아미노산. 몇몇 실시형태에 있어서, 부형제는 중합체에 접합 동안 용액 중에 단백질을 유지하는 것을 돕는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부형제는, 단백질을 함유하는 용액에 중합체의 부가 전에 단백질을 함유하는 용액에 첨가된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 반응은 약 pH 5 내지 약 pH 9의 수성 조건 하에서 일어난다. 몇몇 실시형태에 있어서, 반응은 6.0 내지 8.5, 6.5 내지 8.0 또는 7.0 내지 7.5에서 일어난다.
몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 2 내지 37℃에서 단백질에 접합된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 접합은 0 내지 40℃, 5 내지 35℃, 10 내지 30℃, 15 내지 25℃에서 일어난다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 접합된 단백질은 (미접합된 것으로부터 접합된 것을 제거하기 위하여) 정제용의 이온교환 매질 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피 매질과 접촉될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이온교환 매질, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및/또는 친화도 크로마토그래피 매질은 유리 중합체로부터 그리고 재산화된 캡 제거된 단백질로부터 접합된 단백질을 분리시킨다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재되고 도 18에 요약된 방법은 용해도 시스템을 용이하게 할 수 있고/있거나 유지할 수 있는 부형제를 내포한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 용액이 상호작용하는 것을 의미하는 두 성분의 용해도를 유지시키는 것을 허용한다. 이것은 단백질과 중합체의 용해도를 포함할 수 있고, 이어서 최종 접합체의 용해도 또한 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부형제 접근법 없이, 이 쟁점은 단백질이 가용성이면서, 생체고분자가 첨가된 경우, 용액(예컨대, 단백질)의 용해도가 하락되고, 용액으로부터 석출/붕괴되는 것을 가능하게 한다. 물론, 단백질이 붕괴되는 경우, 생체고분자와 효율적으로 접합시키는 것이 가능하지 않게 된다. 따라서, 부형제는 생체고분자의 존재 하에 단백질의 용해도를 유지시키는데 이용될 수 있으므로, 이들 둘이 단백질 접합체(또는 도 18에 도시된 바와 같이, 항체 접합체)를 형성하도록 결합될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 중합체는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 양쪽성 이온, 포스포릴콜린, 또는 말레이미드 작용기에 대한 중합체 분지점의 중심을 가교하는 PEG 링커. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공된 중합체 중 어느 하나는 본 명세서에서 제공된 방법을 통해서 단백질에 부가될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공된 단백질 중 어느 하나는 본 명세서에서 제공된 방법의 하나 이상을 통해서 본 명세서에서 제공된 중합체 중 어느 하나에 접합될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 단백질 및/또는 항체 접합체를 제조하고 정제시킨 보다 큰 규모의 가공처리를 가능하게 하는 방법(들)이 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이용된 용적은 적어도 1리터, 예를 들어, 1, 10, 100, 1,000, 5,000, 10,000 리터 또는 그 이상이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 생성된 및/또는 정제된 항체 접합체의 양은 0.1, 1, 10, 100, 1000 그램 또는 그 이상일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 치료적 단백질은 재조합 DNA 기술을 통해서 부가된 시스테인 잔기를 갖는 본 명세서에 기재된 항-VEGF-A 항체 중 어느 하나일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF 항체 중쇄는 이하의 CDR: CDRH1: GYDFTHYGMN(서열번호 9), CDRH2: WINTYTGEPTYAADFKR(서열번호 10) 및 CDRH3: YPYYYGTSHWYFDV(서열번호 11)를 갖는다. 중쇄는 또한 (서열번호 3에서와 같은 순차적인 계수를 통해서) 위치 221에서 트레오닌(T)을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF 경쇄는 이하의 CDR: CDRL1: SASQDISNYLN(서열번호 12), CDRL2: FTSSLHS(서열번호 13) 및 CDRL3: QQYSTVPWT(서열번호 14)를 갖는다. 항-VEGF-경쇄는 또한 카바트 위치 4에서 류신(L)을 가질 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-A 항체는 IgG1이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중쇄는 효과기 기능을 조절하기 위하여 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이는 이하의 아미노산 위치(EU 넘버링): E233, L234, L235, G236, G237, A327, A330 및 P331 중 하나 이상에 대한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이는 E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S 및 P331S(EU 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이는 L234A, L235A 및 G237A(EU 넘버링)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 재조합 DNA 기술을 통해서 치료적 단백질에 부가된 시스테인 잔기는 Cys-Cys 다이설파이드 결합 짝짓기에 관여해서는 안 된다. 이와 관련하여, 치료적 단백질은 이량체성일 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 무손상 항-VEGF-A 항체는 2개의 경쇄와 2개의 중쇄를 갖는다. Cys 잔기가 예를 들어 중쇄에 도입된다면, 무손상 항체는 동일한 위치에서 이러한 2개의 도입된 시스테인을 가질 것이고, 이들 시스테인 잔기가 사슬내 다이설파이드 결합을 형성할 것이라는 가능성이 존재한다. 도입된 시스테인 잔기가 Cys-Cys 다이설파이드 결합을 형성하거나 또는 그렇게 할 성향을 지닌다면, 그 도입된 Cys 잔기는 접합에 유용하지 않을 것이다. 사슬내 다이설파이드 짝짓기를 일으킬 중쇄 및 경쇄 내의 위치를 회피하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 미국 특허 제2015/0158952호 참조.
몇몇 실시형태에 있어서, 재조합 DNA 기술을 통해서 도입된 시스테인 잔기는 Q347C 및 L443C(EU 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 시스테인 잔기는 L443C(EU 넘버링, 또는 서열번호 1에서의 449C)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중쇄 항체는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 경쇄는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 설피드랄 특이적 반응기는 말레이미드이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 반감기 연장 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 분지형 PEG, PolyPEG(등록상표)(워익 이펙트 폴리머스사; 영국 코번트리 소재), 폴리시알산(PSA), 전분, 하이드록실에틸 전분(HES), 하이드록시알킬 전분(HAS), 탄수화물, 다당류, 풀루란, 키토산, 하이알루론산, 황산콘드로이틴, 황산데르마탄, 덱스트란, 카복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 폴리알킬렌 글리콜(PAG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일몰폴린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스타이렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포르말)(PHF), 양쪽성 이온성 중합체, 포스포릴콜린 함유 중합체 및 2-메타크릴로일옥시-2'-에틸트라이메틸암모늄포스페이트(MPC)를 포함하는 중합체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 반감기 연장 모이어티는 양쪽성 이온성 중합체이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 양쪽성 이온은 포스포릴콜린, 즉, 포스포릴콜린 함유 중합체이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 MPC 단위로 구성된다.
몇몇 실시형태에 있어서, MPC 중합체는 3개 이상개의 팔을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, MPC 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 팔을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, MPC 중합체는 3, 6, 또는 9개의 팔을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, MPC 중합체는 9개의 팔을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 이상의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성된다.
몇몇 실시형태에 있어서, MPC 중합체는 약 300,000 내지 1,750,000 Da의 분자량을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, MPC 중합체는 약 500,000 내지 1,000,000 Da 또는 약 600,000 내지 900,000 Da의 분자량을 갖는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 치료적 단백질-반감기 연장 모이어티 접합체를 제조하는 방법은 환원된 시스테인 설피드릴기를 생성하는 조건 하에서 치료적 단백질을 티올 환원제와 접촉시키는 추가의 단계를 갖는다. 위에서 논의된 바와 같이, 재조합 DNA 기술을 통해서 부가된 시스테인 잔기가 쌍을 이루지 않은, 즉, Cys-Cys 사슬내 다이설파이드 결합에 관여하지 않거나 또는 이러한 결합에 실질적으로 관여하지 않는 것이 바람직하다. 그러나, 이러한 Cys-Cys 다이설파이드 결합에 관여하지 않고 접합에 자유로운 Cys 잔기는 다이설파이드 부가체를 형성하기 위하여 배양 배지 중의 유리 시스템과 반응하는 것이 공지되어 있다. 예컨대, WO 2009/052249 참조. 그렇게 유도체화된 시스테인은 접합에 이용 가능하지 않을 것이다. 다이설파이드 부가체로부터 새롭게 부가된 시스테인을 유리시키기 위하여, 정제 후의 단백질은 환원제, 예컨대, 다이티오트레이톨로 처리된다. 그러나, 환원제에 의한 이러한 처리는, 네이티브 시스테인을 비롯하여, 치료적 단백질 내의 시스테인 잔기의 모두를 환원시킬 것이며, 이들 중 다수는 사슬간 및 사슬내 Cys-Cys 다이설파이드 결합에 관여된다. 네이티브 Cys-Cys 다이설파이드는 단백질 안정성 및 활성도에 일반적으로 중요하며, 이들은 개질되어야 한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 모든 네이티브(예컨대, 사슬내 및 사슬간) Cys-Cys 다이설파이드는 개질된다.
네이티브 사슬간 및 사슬내 다이설파이드 잔기를 개질시키기 위하여, 시스테인 다이설파이드 부가체를 제거하는 환원 후에, 치료적 단백질은 미리 정해진 시간 동안, 예컨대, 하룻밤 산화 조건 및/또는 산화제에 노출된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 하룻밤 주위 공기 노출이 네이티브 다이설파이드 결합의 개질을 달성하기 위하여 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 네이티브 다이설파이드를 복구하기 위하여 산화제가 이용된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 산화제는 수성 CuSO4 및 데하이드로아스코르브산(DHAA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 산화제는 DHAA이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 사용되는 DHAA의 범위는 5 내지 30 당량의 범위이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 그 범위는 10 내지 20 당량이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 그 범위는 15 당량이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 티올 환원제는 트리스[2-카복시에틸]포스핀 염산염(TCEP), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 수소화붕소나트륨(NaBH4), 수소화사이아노붕소나트륨(NaCNBH3), β-머캅토에탄올(BME), 시스테인 염산염 및 시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 티올 환원제는 TCEP이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 티올 환원제 농도는 치료적 단백질 농도에 대해서 1 내지 100배 몰 과잉이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 티올 환원제 농도 치료적 단백질 농도에 대해서 20 내지 50배 몰 과잉이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 티올 환원제는 치료적 단백질의 산화 전에 치료적 단백질에 의한 항온처리 후에 제거된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 치료적 단백질을 반감기 연장 모이어티에 접합시키기 위한 방법은 접합 후에 치료적 단백질 접합체를 정제시키는 추가의 단계를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 치료적 단백질 접합체는 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 친화도 크로마토그래피 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 수법을 이용해서 정제된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 치료적 단백질 접합체는 미접합 치료적 단백질에 비해서 적어도 20%의 생물학적 활성도를 보유한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 치료적 단백질 접합체는 미접합 치료적 단백질에 비해서 적어도 50% 생물학적 활성를 보유한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 치료적 단백질 접합체는 미접합 치료적 단백질에 비해서 적어도 90% 생물학적 활성도를 보유한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 치료적 단백질 접합체는 미접합 치료적 단백질에 비해서 증가된 반감기를 지닌다. 몇몇 실시형태에 있어서, 치료적 단백질 접합체는 미접합 치료적 단백질에 비해서 반감기의 적어도 1.5배 증가를 지닌다. 몇몇 실시형태에 있어서, 치료적 단백질 접합체는 미접합 치료적 단백질에 비해서 반감기의 적어도 5배 증가를 지닌다.
몇몇 실시형태에 있어서, 치료적 단백질을 반감기 연장 모이어티에 접합시키는 방법의 양쪽성 이온성 중합체는 양쪽성 이온성 기를 갖는 라디칼 중합성 단량체이고, 이 방법은 중합체를 제공하도록 중합 매질에서 유리 라디칼 중합성 양쪽성 이온성 단량체를 중합시키는 추가의 단계를 갖되, 매질은 라디칼 중합성 양쪽성 이온성 단량체; 전이금속 촉매 Mt (q-1)+(여기서 Mt는 전이금속이고, q는 금속의 보다 높은 상화 상태이며, q-1는 금속의 보다 낮은 산화 상태이고, 금속 촉매는 Mt(q-1)+X'( q-1) 형태(여기서 X'은 반대 이온 또는 기임)의 염으로서 공급되거나 또는 the 전이금속 촉매는 산화된 비활성 상태로부터 환원된 활성 상태로 환원 가능한 환원제와 함께 비활성 금속염을 보다 높은 산화 상태 Mt q +X'q로 제공함으로써 동소에서 공급됨); 리간드; 및 개시제를 포함한다.
ATRP 전이금속 촉매로서 역할하도록, 전이금속은 하나의 전자에 의해 분리된 적어도 2개의 용이하게 접근 가능한 산화 상태인 보다 높은 산화 상태 및 보다 낮은 산화 상태를 가져야만 한다. ATRP에서, 가역적 산화환원 반응은 보다 높은 산화 상태와 보다 낮은 산화 상태 사이에서 전이금속 촉매 순환을 초래하는 한편 중합체 사슬은 전파 사슬 말단과 휴면상태의 사슬 말단 사이에서 순환된다. 예컨대, 미국 특허 제7,893,173호 참조.
몇몇 실시형태에 있어서, 라디칼 중합성 양쪽성 이온성 단량체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00032
여기서 R1은 H 또는 C1-6 알킬이고, ZW는 양쪽성 이온이며, n은 1 내지 6의 정수이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 라디칼 중합성 단량체는
Figure pct00033
이다:
식 중, R1은 H 또는 C1 -6 알킬이고, R2, R3, R4는 동일하거나 또는 상이하고, H 또는 C1 - 4알킬이며, X 및 Y는 동일하거나 또는 상이하고, 1 내지 6의 정수이다. 몇몇 실시형태에 있어서, R1, R2, R3 및 R4는 각각 메틸이고, X 및 Y는 각각 2이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 라디칼 중합성 단량체는
Figure pct00034
이다:
식 중, R1은 H 또는 C1 - 6알킬이고, R2 및 R3은 동일하거나 또는 상이하며, H 또는 C1 - 4알킬이고, R4는 PO4-, SO3- 또는 CO2-이며, X 및 Y는 동일하거나 또는 상이하고, 1 내지 6의 정수이다. 몇몇 실시형태에 있어서, R1, R2 및 R3은 메틸이고, R4는 PO4-이며, X 및 Y는 각각 2이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 단량체는
Figure pct00035
이다:
식 중, R1은 H 또는 C1 - 6알킬이고, R2, R3 및 R4는 동일하거나 또는 상이하며, H 또는 C1 - 4알킬이고, R5는 PO4-, SO3- 또는 CO2-이며, X 및 Y는 동일하거나 또는 상이하고, 1 내지 6의 정수이다. 몇몇 실시형태에 있어서, R1, R2, R3 및 R4는 메틸이고, R5는 PO4-이며, X 및 Y는 2이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 전이금속 Mt는 Cu, Fe, Ru, Cr, Mo, W, Mn, Rh, Re, Co, V, Zn, Au 및 Ag로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 금속 촉매는 Mt(q-1)+X'(q-1) 형태의 염으로서 공급된다. Mt (q-1)+는 Cu1 +, Fe2 +, Ru2 +, Cr2 +, Mo2+, W2+, Mn3 +, Rh3 +, Re2 +, Co+, V2+, Zn+, Au+ 및 Ag+로 이루어진 군으로부터 선택되고, X'는 할로겐, C1-6 알콕시, (SO4)1/2, (PO4)1/3, (R7PO4)1/2, (R72PO4), 트라이플레이트, 헥사플루오로포스페이트, 메탄설포네이트, 아릴설포네이트, CN 및 R7CO2로 이루어진 군으로부터 선택되되, 여기서 R7은 H 또는 할로겐으로 1 내지 5회 치환될 수 있는 직쇄형 또는 분지쇄형 C1-6 알킬기이다. 몇몇 실시형태에 있어서, Mt (q-1)+는 Cu1 +이고, X'은 Br이다.
몇몇 실시형태에 있어서, Mt (q-1)+는 동소에서 공급된다. 몇몇 실시형태에 있어서, Mt q +Xq는 CuBr2이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환원제는 무기 화합물이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환원제는 낮은 산화 수준의 황 화합물, 아황산수소나트륨, 금속 이온을 포함하는 무기염, 금속, 하이드라진 수화물 및 이러한 화합물의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환원제는 금속이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환원제는 Cu0이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 환원제는 유기 화합물이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 유기 화합물은 알킬티올, 머캅토에탄올, 또는 용이하게 에놀화될 수 있는 카보닐 화합물, 아스코르브산, 아세틸 아세토네이트, 캄포설폰산, 하이드록시 아세톤, 환원당, 단당류, 글루코스, 알데하이드, 및 이러한 유기 화합물의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 리간드는 2,2'-바이피리딘, 4,4'-다이-5-노닐-2,2'-바이피리딘, 4,4-다이노닐-2,2'-다이피리딜, 4,4',4''-트리스(5-노닐)-2,2':6',2''-터피리딘, N,N,N',N',N''-펜타메틸다이에틸렌트라이아민, 1,1,4,7,10,10-헥사메틸트라이에틸렌테트라민, 트리스(2-다이메틸아미노에틸)아민, N,N-비스(2-피리딜메틸)옥타데실아민, N,N,N',N'-테트라[(2-피리달)메틸]에틸렌다이아민, 트리스[(2-피리딜)메틸]아민, 트리스(2-아미노에틸)아민, 트리스(2-비스(3-부톡시-3-옥소프로필)아미노에틸)아민, 트리스(2-비스(3-(2-에틸헥속시)-3-옥소프로필)아미노에틸)아민 및 트리스(2-비스(3-도데콕시-3-옥소프로필)아미노에틸)아민으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 리간드는 2,2'-바이피리딘이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 개시제는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00036
여기서 R1은 친핵성 반응성 기이고, R2는 링커를 포함하며, R3은 하기 구조를 갖는 중합체 합성 개시제 모이어티를 포함한다:
Figure pct00037
여기서 R4 및 R5는 동일하거나 또는 상이하고, 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌, 알콕시, 카복시알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 환식 알킬 에터, 알켄일, 알켄일렌, 알킨일, 알킨일렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴, 아릴렌, 아릴렌-옥시, 헤테로아릴, 아미노, 아미도 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; Z는 할로겐 또는 CN이고; 그리고 s는 1 내지 20의 정수이다.
몇몇 실시형태에 있어서, Z는 Br이고, R4 및 R5는 각각 메틸이다. 몇몇 실시형태에 있어서, R1은 NH2-, OH- 및 SH-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에 있어서 R2는 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌, 알콕시, 카복시알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 환식 알킬 에터, 알켄일, 알켄일렌, 알킨일, 알킨일렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴, 아릴렌, 아릴렌-옥시, 헤테로아릴, 아미노, 아미도 또는 이들의 임의의 조합이다. 몇몇 실시형태에 있어서, R2는
Figure pct00038
이다:
여기서 X 및 Y는 동일하거나 또는 상이하고, 1 내지 20의 정수이다. 몇몇 실시형태에 있어서, X 및 Y는 각각 4이다.
몇몇 실시형태에 있어서, R3은
Figure pct00039
이다:
여기서 R6, R7 및 R8은 동일하거나 또는 상이하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00040
,
Figure pct00041
및
Figure pct00042
여기서 Z는 NCS, F, Cl, Br 또는 I이다. 몇몇 실시형태에 있어서, Z는 Br이고 R6, R7 및 R8은 각각
Figure pct00043
이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 개시제는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00044
여기서 A 및 B는 동일 또는 상이하고 2 내지 12의 정수이며, Z는 임의의 할라이드, 예를 들어, Br이다. 몇몇 실시형태에 있어서, A 및 B는 각각 4이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 중합체를 말레이미드 시약과 반응시켜 말단 말레이미드를 갖는 중합체를 제공하는 단계를 더 구비한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 말레이미드 화합물은
Figure pct00045
이다.
치료 방법
몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF-A 항체(및 이의 접합체)로 이루어진 군으로부터 선택된 치료적 단백질을 투여하는 단계를 갖는, 안질환의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공된 항체 또는 항체 접합체 중 하나 이상은 안질환의 치료 및/또는 예방으로서 사용될 수 있다. 상기 방법은 본 명세서에서 제공된 항체 또는 항체 접합체 중 어느 하나 이상을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 안질환의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 상기 방법은 유효 용량의 본 명세서에 기재된 항체 및/또는 항체 접합체 중 어느 하나를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 질환은 연령관련 황반변성(AMD) 또는 당뇨병성 황반부종(DME)일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 질환은 습성 AMD일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 안질환은 당뇨병성 망막병증, 맥락막 혈관신생(CNV), 연령관련 황반변성(AMD), 당뇨병성 황반부종(DME), 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라스마증, 중심성 망막 정맥 폐쇄(CRVO), 분지된 중심성 망막 정맥 폐쇄(BRVO), 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 미숙아 망막병증(ROP), 결막하 출혈 및 고혈압성 망막병증으로 이루어진 군 중 하나 이상으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 안질환은 당뇨병성 망막병증이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항체 또는 항체 접합체는 월 1회보다 많지 않은 빈도로 투여된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체 또는 이의 접합체는 월 또는 주당 2회 투여된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항체 또는 이의 접합체는 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회, 6개월마다 1회, 7개월마다 1회, 8개월마다 1회, 9개월마다 1회, 10개월마다 1회, 11개월마다 1회, 또는 12개월마다 1회 투여된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 제공된 조성물 중 하나 이상은 습성(증식성) 형태의 연령 관련 황반변성(AMD)의 치료를 위하여 항-VEGF제의 유리체내 사용으로부터의 높은 치료 부담의 결과의 저감을 가능하게 할 수 있다. 임상 성과 배후의 AMD 침체를 지니는 환자에 대한 실세계 성과는, 덜 빈번하게 투여될 수 있는 더 긴 안구 체류 시간을 이용하고 따라서 더 많은 환자-내성 프로파일이 더 많은 환자에 대해서 제3상 임상 성과에 더 밀접한 실세계 성과를 가져올 수 있는 것이 루센티스(등록상표)(라니비주맙)에 의한 MARINA 및 ANCHOR 연구 및 아일리아(등록상표)(아플리베르셉트). 항-VEGF 치료제에 의한 VIEW 1 및 VIEW 2 연구와 같은 3상 임상 연구에서 증명되었다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 항체 접합체 및 항-VEGF-A 항체를 포함하는 화합물은 배경 또는 비증식성 당뇨병성 망막병증을 갖지만 시력 장애가 거의 또는 전혀 없는 환자를 치료하는데 사용된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이러한 환자는 유리체내 주사를 통해서 월 1회 미만으로 투약된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이러한 환자는 연 6회 투약된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이러한 환자는 연 4회 이하 투약된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환자는 연 3회 이하 투약된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환자는 연 2회 이하 투약된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환자는 연 1회 이하 투약된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 대상체는 유리체내 주사를 통해서 항체 또는 항체 접합체를 공급받는다.
본 명세서에 기재된 치료적 단백질(예컨대, 항체 및 항체 접합체 둘 다)은 환자에서 생체내 이러한 폴리펩타이드의 발현, 즉, 유전자 요법에 의해 이용될 수 있다.
핵산(선택적으로 벡터 내에 함유됨)을 환자의 세포 내에서 얻기 위한 주요 2가지 접근법이 존재한다: 생체내 및 생체외. 생체내 전달의 경우, 핵산을 통상적으로 치료적 단백질이 요구되는 부위, 즉 치료적 단백질의 생물학적 활성도가 필요한 부위에서 환자 내에 직접 주사한다. 생체외 치료의 경우, 환자의 세포를 제거하고, 핵산을 이러한 단리된 세포 내에 도입하고, 변형된 세포를 환자에게 직접 투여하거나, 또는 예를 들어, 다공성 막 내에 캡슐화하고 이것을 환자에게 이식한다(예를 들어, 미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호 참조). 핵산을 살아있는 세포 내에 도입하기 위한 사용 가능한 다양한 기술이 존재한다. 기술은 핵산이 시험관내에서 배양된 세포로 전달되는지, 또는 의도된 숙주의 세포 내로 생체내에서 전달되는지의 여부에 따라서 달라진다. 시험관내에서 핵산을 포유동물 세포에 전달하기에 적합한 기술은 리포솜, 전기천공, 미량 주사, 형질도입, 세포 융합체, DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트 석출 방법 등의 사용을 포함한다. 형질도입은 복제-결함, 재조합 바이러스(레트로바이러스 포함) 입자와 세포 수용체의 회합, 그 다음 입자에 의해서 함유된 핵산의 세포 내로의 도입을 포함한다. 유전자의 생체외 전달을 위해서 일반적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 생체내 핵산 전달 기술은 바이러스 또는 비바이러스 벡터(예컨대, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 단순 포진 I 바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스(AAV)) 및 지질계 시스템(유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어, DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임; 예컨대, 문헌[Tonkinison et al., Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996) 참조])을 사용한 형질주입을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서 유전자 요법에서 사용하기 위한 벡터는 아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스, 또는 레트로바이러스를 포함하는 바이러스이다. 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 벡터는 적어도 1종의 전사 프로모터/인핸서 또는 유전자좌-한정 요소(들), 또는 다른 수단, 예컨대 선택적 스플라이싱(alternate splicing), 핵 RNA 외수송, 또는 메신저의 번역후 변형에 의해서 유전자 발현을 제어하는 다른 요소를 포함한다. 또한, 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 벡터는 치료적 단백질을 암호화하는 유전자의 존재 하에서 전사되는 경우, 이에 작동 가능하게 연결되어, 번역 개시 서열로서 작용하는 핵산 분자를 포함한다. 이러한 벡터 작제물은 또한 패키징 신호, 긴 말단 반복부(LTR) 또는 이의 부분, 및 사용되는 바이러스에 적절한 양성 및 음성 가닥 프라이머 결합 부위(이것이 바이러스 벡터 내에 이미 존재하지 않는 경우)를 포함한다. 또한, 이러한 벡터는 전형적으로 그것이 존재하는 숙주 세포로부터 PRO 폴리펩타이드를 분비하기 위한 신호 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이러한 목적을 위한 신호 서열은 포유동물 신호 서열이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 신호는 치료적 단백질을 위한 네이티브 신호 서열이다. 선택적으로, 벡터 작제물은 또한 폴리아데닐화를 유도하는 신호, 뿐만 아니라 하나 이상의 제한 부위 및 번역 종결 서열을 포함할 수 있다. 예의 방식으로, 이러한 벡터는 전형적으로 5' LTR, tRNA 결합 부위, 패키징 서열, 제2-가닥 DNA 합성의 기원, 및 3" LTR 또는 이의 부분을 포함할 것이다. 비바이러스, 예컨대, 양이온성 지질, 폴리라이신, 및 덴드리머인 다른 벡터가 사용될 수 있다.
일부 상황에 있어서, 표적 세포를 표적으로 하는 작용제를 갖는 핵산 공급원, 예컨대, 세포-표면막 단백질 또는 표적 세포, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등에 특이적인 항체를 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜이 사용되는 경우, 예컨대, 특정 세포 유형에 대해서 지향성인 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 순환 시에 내재화를 겪는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국지화를 표적으로 하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질을 표적으로 하고/하거나 흡수를 가능하게 하기 위해서 엔도사이토시스(endocytosis)와 연관된 세포-표면막 단백질에 결합하는 단백질이 사용될 수 있다. 수용체-매개된 엔도사이토시스의 기술은 예를 들어, 문헌[Wu et al., J. Biol. Chem ., 262: 4429-4432 (1987)]; 및 [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414(1990)]에 기술되어 있다. 현재 공지된 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜의 검토에 대해서는, 문헌[Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992)]을 참고하기 바란다. 또한 국제 특허 제WO93/25673호 및 그것에 인용된 참고문헌을 참조하기 바란다.
레트로바이러스 입자 및 구조 단백질의 제조에 적합한 유전자 요법 및 방법은 예컨대, 미국 특허 제5,681,746호에서 찾아볼 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 포유동물에서 안질환의 치료 또는 예방 방법이 제시되며, 여기서 항-VEGF-A 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 치료적 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 투여된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 핵산은 도 27에 제시된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 중쇄는 서열번호 1에 제시된 것이고, 경쇄는 서열 번호 2에 제시된 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 생체외 유전자 요법을 통해서 투여된다.
치료적 단백질은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 갖는 약제학적 조성물 중에 혼입될 수 있다. 경구 투여를 위해서 개작된 약제학적 조성물은 개별 단위, 예컨대 캡슐로서, 용액, 시럽 또는 현탁액(수성 또는 비수성 액체 중에; 또는 식용 발포물(edible foam) 또는 휩(whip)으로서 또는 에멀션으로서)으로서 존재할 수 있다. 정제 또는 경질 젤라틴 캡슐에 적합한 부형제는 락토스, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 스테아르산 또는 이의 염을 포함한다. 연질 젤라틴 캡슐과 함께 사용하기에 적합한 부형제는 예를 들어, 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 또는 액체 폴리올 등을 포함한다. 용액 및 시럽의 제조를 위해서, 사용될 수 있는 부형제는 예를 들어, 물, 폴리올 및 당을 포함한다. 현탁액의 제조를 위해서, 오일(예컨대, 식물성 오일)을 사용하여 수-중-유 또는 유중수 현탁액을 제공할 수 있다.
약제학적 조성물은 비내 투여를 위해서 개작될 수 있는데, 여기서 부형제는 고체이고, 즉, 코에 가까이 유지된 분말의 용기로부터 비도(nasal passage)를 통해서 신속한 흡입에 의해서 스너프(snuff)가 소모되는 방식으로 투여되는 예를 들어, 20 내지 500마이크론 범위의 입자 크기를 갖는 거친 분말을 포함한다. 비내 스프레이 또는 비내 점적액으로서의 투여를 위한, 부형제가 액체인 적합한 조성물은 활성 성분의 수성 또는 유성 용액을 포함한다. 흡입에 의한 투여를 위해서 개작된 약제학적 조성물은 미세 입자 가루 또는 다양한 유형의 계량 투여 가압 에어로졸, 네블라이저 또는 취입기(insufflator)에 의해서 생성될 수 있는 미스트를 포함한다.
비경구 투여를 위해서 개작된 약제학적 조성물은 항산화제, 완충액, 박테리아 발육 정지제 및 의도된 수령인의 혈액과 실질적으로 등장성인 제형이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 주사 가능한 용액을 위해서 사용될 수 있는 부형제는 예를 들어, 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일을 포함한다. 조성물은 단위-용량 또는 다회-용량 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 바이알 내에 존재할 수 있고, 사용 직전에, 예를 들어, 주사를 위해서 유지된 멸균 액체의 첨가 만이 요구되는 동결-건조(동결건조) 조건 하에서 저장될 수 있다. 임시(extemporaneous) 주사 용액 및 현탁액이 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 실질적으로 등장성일 수 있고, 이는 약 250 내지 400mOsm/물 ㎏의 오스몰 농도를 의미한다.
약제학적 조성물은 보존제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미료, 착색제, 취기제, 염(물질 자체가 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로 제공될 수 있음), 완충액, 코팅제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 이것은 또한 상기 물질에 더하여 치료적 활성제를 함유할 수 있다. 약제학적 조성물은 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 부형제는 염수, 완충염수(예컨대, 포스페이트 완충 염수), 덱스트로스, 리포솜, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합물을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
항체 및 이를 함유하는 약제학적 조성물은 예를 들어, 경구, 유리체내, 정맥내, 피하, 근육내, 골내, 비내, 국소, 복강내 및 병변내 투여에 의한 투여를 비롯하여, 환자의 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 요법으로 투여될 수 있다. 비경구 주입은 특히 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여 또는 경로를 포함한다. 요법에서 또는 예방으로서, 활성 작용제는 개체에게 주사 가능한 조성물로서, 예를 들어, 멸균 수성 분산액으로서 투여될 수 있고, 몇몇 실시형태에 있어서 작용제는 등장성 또는 실질적으로 등장성이다.
포유동물, 특히 인간에 대한 투여를 위해서, 활성 작용제의 투여량은 0.01㎎/체중 ㎏, 전형적으로는 대략 1㎎/㎏인 것으로 예상된다. 의사는 개체의 연령, 체중, 성별 및 반응, 치료하고자 하는 질환 또는 장애 및 치료하고자 하는 개체의 연령 및 병태를 비롯한 인자에 좌우되는 개체에 가장 적합한 실제 투여량을 결정할 수 있다. 상기 투여량은 평균 경우의 예시이다. 물론, 예를 들어 더 많거나 더 적은 투여량이 상응할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 투여량은 0.5 내지 20㎎/눈, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19㎎일 수 있다.
이러한 투여량은 적절한 경우 자주 반복될 수 있다(예컨대, 매주, 격주, 매달, 2개월에 1회, 분기별로, 1년에 2회, 매년). 부작용이 발생한 경우 투여량의 양 및/또는 빈도는 일반적인 임상적 실시에 따라서 감소될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 약제학적 조성물은 1일 내지 30일마다 1회 투여될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 약제학적 조성물은 30일마다 2회 투여될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 약제학적 조성물은 주 1회 투여될 수 있다.
항체 및 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 화합물, 예컨대 치료적 화합물 또는 분자, 예를 들어, 항염증 약물, 진통제 또는 항생제와 함께 사용될 수 있다. 다른 화합물과 이의 투여는 동시에, 별개로 또는 순차적일 수 있다. 구성성분은 적절한 경우 지시서를 포함할 수 있는 키트의 형태로 제조될 수 있다.
본 명세서에 개시된 항체 및 약제학적 조성물은 질환, 특히 안질환 또는 본 명세서에 기재된 병태의 치료 또는 예방을 위해서 사용될 수 있다.
그렇게 사용되는 경우, 접합체는 눈, 안내 및/또는 유리체내 주사, 및/또는 공막주변(juxtascleral) 주사, 및/또는 망막하 주사 및/또는 테논낭하(subtenon) 주사, 및/또는 맥락막위(superchoroidal) 주사 및/또는 결막하 및/또는 안 점안액 및/또는 연고의 형태의 국소 투여를 위해서 전형적으로 제형화되고, 이들에 의해서 투여된다. 이러한 항체 및 조성물은 다양한 방법, 예를 들어, 참고 문헌, 예컨대 문헌[Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006)]에 기재된 것을 비롯한, 화합물을 유리체 내에 서서히 방출하는 것이 가능한 장치 및/또는 데포로서 유리체내로 전달될 수 있다. 일례에서, 장치는 미니펌프 및/또는 매트릭스 및/또는 능동 확산 시스템 및/또는 연장된 시간 기간 동안 화합물을 방출하는 캡슐화된 세포의 형태일 수 있다(Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006).
눈, 안내 또는 유리체내 투여를 위한 제형은 관련 기술 분야에 공지된 방법 및 성분을 사용하여 제조될 수 있다. 효율적인 치료를 위한 주요 요건은 눈을 통한 적절한 침투이다. 약물이 국소적으로 전달될 수 있는 눈 전방부의 질환과 달리, 망막 질환은 보다 부위-특이적 접근법을 요구한다. 점안액 및 연고는 눈의 후방부를 거의 침투하지 못하고, 혈액-눈 장벽이 전신 투여된 약물이 눈 조직으로 침투하는 것을 방해한다. 따라서, 통상적으로, 망막 질환, 예컨대, AMD 및 CNV를 치료하기 위한 약물 전달에 대한 선택 방법은 직접 유리체내 주사이다. 유리체강내 주사(intravitrial injection)는 통상적으로 환자의 상태 및 전달되는 약물의 특성 및 반감기에 따라서 간격을 두고 반복된다.
치료적 항체 및 관련 접합체는 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해서 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 바이알에 배치된다. 이러한 조성물은 또한 사전-충전된 주사기의 형태로 공급될 수 있다.
"안정적인" 제형은 단백질 또는 그 내에 다른 반감기 연장 모이어티의 중합체에 접합된 단백질이 저장 시 이의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성도를 유지하는 것이다. "안정적인"은 또한 응집 및/또는 탈아미드화를 비롯한 불안정성의 징후를 거의 또는 전혀 나타내지 않는 제형을 의미한다. 예를 들어, 제공된 제형은 5 내지 8℃의 온도에서 제시된 바와 같이 저장되는 경우 적어도 2년 동안 안정적으로 유지될 수 있다.
단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술이 관련 기술 분야에서 입수 가능하고, 예를 들어, 문헌[Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301 (Vincent Lee ed., New York, N.Y., 1991) 및 Jones, 1993 Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90]에서 검토되어 있다. 안정성은 선택된 시간 기간 동안 선택된 온도에서 측정될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서 제형의 저장은 적어도 6개월, 12개월, 12 내지 18개월 동안, 또는 2년 이상 동안 안정적이다.
단백질, 예컨대, 항체 또는 이의 단편은, 그것이 색상 및/또는 투명도의 육안 관찰 시 또는 UV 광 산란에 의해서 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 측정되는 경우 응집, 석출, 탈아미드화 및/또는 변성의 징후를 나타내지 않는다면 약제학적 제형 중에서 "이의 물리적 안정성을 유지한다".
단백질은, 주어진 시간에서 화학적 안정성이 단백질이 이의 생물학적 활성도를 여전히 유지한다고 간주되도록 하는 정도이면, 약제학적 제형 중에서 "이의 화학적 안정성을 유지한다". 화학적 안정성은 단백질의 화학적으로 변경된 형태를 검출 및 정량화함으로써 평가될 수 있다. 화학적 변경은 크기 변형(예컨대, 클리핑)을 포함할 수 있고, 이것은 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피, SDS-PAGE 및/또는 매트릭스-원조 레이저 탈착 이온화/비행 시간 질량 분석기(MALDI/TOF MS)를 사용하여 평가될 수 있다. 다른 유형의 화학적 변경은 전하 변경(예컨대, 탈아미드화의 결과로서 일어남)을 포함하고, 이것은 예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피에 의해서 평가될 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 검정으로 결정되는 경우 주어진 시간에서 항체의 생물학적 활성도가 약제학적 제형이 제조된 시간에서 나타낸 생물학적 활성도의 약 10% 이내(검정의 오차 내)인 경우 약제학적 제형에서 항체는 "이의 생물학적 활성도를 유지한다".
단백질-중합체 접합체는, 단백질과 중합체 간의 화학적 결합이 무손상으로 유지되고, 예컨대 그것은 가수분해되지 않거나 또는 달리 붕괴되지 않으면, "이의 화학적 안정성을 유지한다". 접합체의 단백질 부분은 위에서 기재된 바와 같은 그의 화학적 안정성을 유지한다.
"등장성"은 관심 제형이 인간 혈액 또는 유리체내 주사를 위한 유리체와 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는 것을 의미한다. 등장성 제형은 일반적으로 약 250 내지 400mOsm의 삼투압을 갖는다. 등장성은 예를 들어, 증기압 또는 얼음-동결 유형 삼투압계를 사용하여 측정될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "완충액"은 이의 산-염기 접합체 구성성분의 작용에 의해서 pH의 변화에 저항하는 완충 용액을 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 완충액은 약 3.0 내지 약 8.0; 예를 들어, 약 4.5 내지 8; 또는 약 pH 6 내지 약 7.5; 또는 약 6.0 내지 약 7.0, 또는 약 6.5 내지 7.0, 또는 약 pH 7.0 내지 약 7.5; 또는 약 7.1 내지 약 7.4의 pH를 갖는다. 상기 범위 사이에서의 임의의 지점의 pH가 또한 고려된다.
몇몇 실시형태에 있어서, "PBS" 포스페이트 완충 염수, 트리스계 완충액 및 히스티딘계 완충액이 사용된다.
몇몇 실시형태에 있어서, PBS 완충액은 적절한 pH를 제공하도록 조정된 적어도 Na2HPO4, KH2PO4 및 NaCl로 구성된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 완충액은 다른 약제학적 부형제, 예컨대, KCl 및 다른 염, 세정제 및/또는 안정적인 저장 용액을 제공하도록 보존제를 함유할 수 있다.
"보존제"는 예를 들어, 그 내에서 박테리아 작용을 본질적으로 감소시키기 위해서 제형 중에 포함되어, 다회-사용 제형의 생산을 가능하게 할 수 있는 화합물이다. 가능한 보존제의 예는 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드(알킬기가 장쇄 화합물인 알킬벤질다이메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 보존제의 다른 유형은 방향족 알코올, 예컨대, 페놀, 부틸 및 벤질 알코올, 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 사이클로헥산올, 3-펜탄올, 및 m-크레졸을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 인간 사용 또는 동물 시험을 위해서 안전할 제형은 충분히 낮은 수준의 내독소를 가져야 한다. "내독소"는 그램-음성 박테리아의 세포 구성원으로부터 유래된 지질다당류(LPS)이다. 내독소는 소수성 지질 모이어티(지질 A)에 공유 연결된 친수성 다당류 모이어티로 구성된다(Raetz CR, Ulevitch RJ, Wright SD, Sibley CH, Ding A, Nathan CF. 1991. Gram-negative endotoxin: an extraordinary lipid with profound effects on eukaryotic signal transduction. FASEB J. 5(12):2652-2660). 지질 A는 내독소의 생물학적 활성, 즉, 이의 독성의 대부분에 대한 책임이 있다. 내독소는 박테리아 세포사뿐만 아니라 성장 및 분화 시 많은 양으로 발산된다. 이것은 고도로 열 안정적이고, 보통 멸균 조건 하에서 파괴되지 않는다. 열 또는 pH, 예컨대, 180 내지 250℃ 및 0.1M 초과의 산 또는 염기를 갖는 극한적인 처리가 사용되어야 한다(Petsch D, Anspach F. 2000. Endotoxin removal from protein solutions. J Biotechnol. 76: 97-119). 이러한 과정의 조건은 생물학적 약물에 매우 해로울 것이다.
바이오테크 및 약제학적 산업에서, 생산 공정 동안 그리고 최종 산물에서 둘 모두에서 내독소를 발견하는 것이 가능하다. 박테리아가 물, 염수 및 완충액을 비롯한 영양 불량 배지에서 성장할 수 있기 때문에, 예방책 조치가 취해지지 않는 한 내독소는 일반적이다. 동물 또는 인간 내로의 내독소 주입은 내독소 충격, 조직 부상 및 심지어는 사망을 비롯한, 광범위한 병리생리학적 효과를 유발한다(Ogikubo Y, Ogikubo Y, Norimatsu M, Noda K, Takahashi J, Inotsume M, Tsuchiya M, Tamura Y. 2004. Evaluation of the bacterial endotoxin test for quantifications of endotoxin contamination of porcine vaccines. Biologics 32:88-93).
낮은 농도(1ng/㎖)에서 내독소의 정맥내 주입 시 포유동물에서 발열성 반응 및 쇼크가 유도된다(Fiske JM, Ross A, VanDerMeid RK, McMichael JC, Arumugham. 2001. Method for reducing endotoxin in Moraxella catarrhalis UspA2 protein preparations. J Chrom B. 753:269-278). 약제학적 및 생물학적 산물의 정맥내 적용을 위한 내독소의 최대 수준은 모든 약전에 의해서 5내독소 단위(EU)/체중 ㎏/시간으로 설정된다(Daneshiam M, Guenther A, Wendel A, Hartung T, Von Aulock S. 2006. In vitro pyrogen test for toxic or immunomodulatory drugs. J Immunol Method 313:169-175). EU는 내독소의 생물학적 활성도의 측정치이다. 예를 들어, 100pg의 표준 내독소 EC-5 및 120pg의 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) O111:B4로부터의 내독소는 1EU의 활성도를 갖는다(Hirayama C, Sakata M. 2002. Chromatographic removal of endotoxin from protein solutions by polymer particles. J Chrom B 781:419-432). 이러한 역치 수준에 대한 충족은 생물학적 연구 및 약제학적 연구에서의 도전이 되어 왔다(Berthold W, Walter J. 1994. Protein Purification: Aspects of Processes for Pharmaceutical Products. Biologicals 22:135-150; Petsch D, Anspach FB. 2000. Endotoxin removal from protein solutions. J Biotech 76:97-119).
유리체내 주사를 통해서 전달될 약물 중의 내독소의 존재는 특별한 문제가 된다. 약물(페니실린)의 유리체내 주사는 리크로프트(Rycroft)에 의해서 1945년에 처음으로 수행되었다(Rycroft BW. 1945. Penicillin and the control of deep intra-ocular infection. British J Ophthalmol 29 (2): 57-87). 유리체는 높은 수준의 약물이 비교적 긴 시간 기간 동안 도입되고, 유지되는 챔버이다. 유리체내 주사를 통해서 달성될 수 있는 약물의 농도는 국소 투여 또는 전신 투여(예컨대, 정맥내)에 의해서 생성될 수 있는 것을 상당히 초과한다.
유리체내 주사로부터 잠재적으로 일어나는 가장 위험한 합병증 중 하나는 내안구염이다. 내안구염은 두 부류: 전염성 및 멸균성에 속한다. 전염성 내안구염은 일반적으로 박테리아, 진균 또는 기생충에 의해서 유발된다. 전염성 내안구염의 증상은 심각한 통증, 시력 손실, 결막 및 하부 상공막의 발적을 포함한다. 전염성 내안구염은 긴급한 진단 및 치료를 요한다. 가능한 치료는 일부 경우에 항생제의 유리체내 주사 및 유리체 절제술(Pars plana vitrectomy)을 포함한다. 맹인 및 고통스러운 눈을 제거하기 위해서 적출술이 요구될 수 있다(예컨대, 문헌[Christy NE, Sommer A. 1979. Antibiotic prophylaxis of postoperative endophthalmitis. Ann Ophthalmol 11 (8): 1261-1265] 참조).
이에 반해서 멸균성 내안구염은 전염성 작용제를 포함하지 않고, 유리체내 항생제 및/또는 유리체망막 수술의 필요 없이 해결되는 유리체강의 급성 안내 염증으로서 정의될 수 있다. 유리체 미생물학적 연구가 수행된 경우, 멸균성 내안구염의 진단을 유지하기 위해서 증명된 음성 배양이 필요하다(Marticorena J, Romano V, Gomez-Ulla F. 2012 "Sterile Endophthalmitis after Intravitreal Injections" Med Inflam. 928123).
내독소로 오염된 생물학적 약물의 유리체내 주사가 멸균성 내안구염을 유발할 수 있다는 것이 발견되었다(마티코레나(Marticorena) 등). 베바시주맙(아바스틴)은 교모세포종 및 전이성 직장결장암, 진행성 비편평 비소세포 폐암 및 전이성 신장암의 치료를 위해서 식품 의약국에 의해서 승인되어 있다. 베바시주맙은 또한 습성 AMD를 위한 치료제로서 널리 사용되는 오프 라벨(off label)이다. 베바시주맙은 100㎎/4㎖로서 제조사로부터 제공된다. 이 용액은 유리체내 주사를 위해서 직접 사용될 수 없고, 약사에 의해서 조제되어야 한다. 멸균 내안구염의 클러스터가 관찰되고, 이것은 조제 약사에 의해서, 내독소에 의한 베바시주맙의 부주의한 오염에 의해서 유발된다는 이론이 제시된다.
내독소의 유리체내 주사의 직접적인 임상 결과를 고려하는 경우, 유리체내 투여를 통해서 환자에게 제공될 수 있는 내독소의 총량은 상당히 제한된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 5.0EU/㎖를 초과하지 않는 내독소 수준을 갖는 항체 또는 항체-접합체를 갖는 용액이 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 내독소 수준은 1.0EU/㎖를 초과하지 않는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 내독소 수준은 0.5EU/㎖를 초과하지 않는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 내독소 수준은 0.2EU/㎖를 초과하지 않는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 내독소 수준은 2, 1, 0.5, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02 또는 0.01EU/㎖를 초과하지 않는다.
내독소의 존재에 대해서 일반적으로 사용되는 2종의 FDA-승인된 시험은 리멀러스 아모에보다이트 라이세이트(Limulus Amoebodyte Lysate: LAL) 검정이다(Hoffman S, et al. 2005. International validation of novel pyrogen tests based on human monocytoid cells J. Immunol. Methods 298:161-173; Ding JL, Ho BA. 2001. New era in pyrogen testing. Biotech. 19:277-281). 토끼 발열원 시험이 1920년대에 개발되었고, 이것은 시험 용액이 주사된 토끼에서의 온도 증가를 모니터링하는 것을 포함한다. 그러나, 토끼 발열원 시험의 사용은 비용 및 긴 턴어라운드 시간으로 인해서 수년 간 상당히 감소되었다. LAL 시험이 훨씬 더 일반적이다. LAL은 내독소에 대한 노출 시 투구게(horseshoe crab)의 혈액 및 혈병으로부터 유래된다.
가장 단순한 LAL 검정 중 하나는 LAL 젤-클롯 검정이다. 본질적으로, LAL 응고 검정은 해당 샘플의 연속 희석과 조합된다. 젤의 형성은 샘플 중의 내독소의 양에 비례한다. 연속 희석물을 샘플로부터 제조하고, 각각의 희석물을 LAL 젤을 형성하는 이의 능력에 대해서 검정한다. 일부 지점에서 음성 반응을 포함시킨다. 본래 샘플 중의 내독소의 양을 희석 검정으로부터 추정할 수 있다.
탁도 LAL 검정(Ong KG, Lelan JM, Zeng KF, Barrett G, Aourob M, Grimes CA. 2006. A rapid highly-sensitive endotoxin detection system. Biosensors and Bioelectronics 21:2270-2274) 및 발색 LAL 검정(Haishima Y, Hasegawa C, Yagami T, Tsuchiya T, Matsuda R, Hayashi Y. 2003. Estimation of uncertainty in kinetic-colorimetric assay of bacterial endotoxins. J Pharm Biomed Analysis. 32:495-503)을 비롯한, 다른 LAL 시험이 또한 개발되었다. 탁도 검정 및 발색 검정은 단순 젤-클롯 희석 검정보다 훨씬 더 민감성이고 정량적이다.
몇몇 실시형태에 있어서 본 명세서에 개시된 항체를 갖는 조성물 중의 내독소의 양을 감소시키는 방법이 제공된다. 그 방법은 조성물을 항체에 결합하는 친화도 크로마토그래피 수지와 접촉시키는 단계; 항체를 친화도 크로마토그래피 수지로부터 용리시켜 길항제를 갖는 친화도 크로마토그래피 용리물을 형성하는 단계; 친화도 크로마토그래피 용리물을 항체에 결합하는 이온-교환 수지와 접촉시키는 단계; 및 항체를 이온-교환 수지로부터 용리시키는 단계를 갖고, 여기서 이온-교환 수지로부터 용리된 항체는 내독소가 실질적으로 존재하지 않는다.
내독소의 양을 감소시키는 상기 방법, 또는 본 명세서에 열거된 다른 방법 또는 공정은 상기 단계에 기술된 순서로 수행될 수 있거나 또는 그것은 단계의 순서를 변경하거나 또는 심지어는 단계 중 하나 이상을 반복시켜서 선택적으로 수행될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 조성물 중의 내독소의 양을 감소시키는 방법은 기술된 단계의 순서로 수행된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 친화도 크로마토그래피 수지 접촉, 세척 및 용리 단계는 친화도 크로마토그래피 용리물을 이온교환 수지와 접촉시키기 전에 1회 초과의 동일한 순서로 반복된다. 방법은 또한 예를 들어, 0.1마이크론, 0.22마이크론, 또는 0.44마이크론을 사용하는 여과 단계를 포함할 수 있는데, 이것은 각각의 수지 결합 단계 후에 제거되는 1종 이상의 용리물 중 어느 하나 상에서 수행될 수 있다.
소정의 경우에, 조성물을 친화도 크로마토그래피 수지와 접촉시키는 단계, 세척하는 단계, 항체를 친화도 크로마토그래피 수지로부터 용리시키는 단계는 제1 용리액을 이온-교환 수지와 접촉시키기 전에 1회를 초과하게 반복될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 친화도 크로마토그래피 수지는 재조합 단백질 A("rProteinA") 수지를 포함한다.
적합한 재조합 단백질 A 수지의 일례는 rProteinA 세파로스 FF(등록상표) 수지(아머샴사(Amersham), 뉴저지주 피스카타웨이 소재)이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 적합한 친화도 크로마토그래피 수지는 단백질 G 크로마토그래피 수지를 포함할 것이다. 다른 실시형태에 있어서, 적합한 친화도 크로마토그래피 수지는 혼합 단백질 A/단백질 G 수지를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 적합한 친화도 크로마토그래피 수지는 4-머캅토에틸피리딘 리간드, 예컨대, MEP 하이퍼셀(HyperCel)(등록상표) 수지(바이오세프라사(BioSepra), 프랑스 세인트 크리소토프 세르지 소재)를 포함하는 소수성 전하 유도 수지를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 이온교환 수지는 음이온-교환 수지를 포함한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지될 바와 같이, 이온교환제는 매트릭스뿐만 아니라 부착된 하전된 기와 관련하여 다양한 재료를 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, 하기 매트릭스가 사용될 수 있는데, 여기서 언급된 재료는 더 많이 또는 더 적게 가교연결될 수 있다: 마크로캡(MacroCap) Q(지이 헬쓰케어 바이오사이언시스사(GE Healthcare Biosciences), 뉴저지주 피스카타웨이 소재), 아가로스계(예컨대, 세파로스 CL-6B(등록상표), 세파로스 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow)(등록상표) 및 세파로스 하이 퍼포먼스(Sepharose High Performance)(등록상표)), 셀룰로스계(예컨대, DEAE 세파셀(Sephacel)(등록상표)), 덱스트란계(예컨대, 세파덱스(Sephadex)(등록상표)), 실리카계 및 합성 중합체계. 음이온교환 수지의 경우, 매트릭스에 공유 부착된 하전된 기는, 예를 들어, 다이에틸아미노에틸, 4차 아미노에틸, 및/또는 4차 암모늄일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서 음이온-교환 수지는 4차 아민기를 포함한다. 항-M-CSF 항체에 결합시키기 위한 4차 아민기를 갖는 예시적인 음이온-교환 수지는 Q 세파로스(등록상표) 수지(아머샴사, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)이다.
다른 양상에 있어서, 내독소 수준이 조성물을 상기 음이온-교환 크로마토그래피 단계에 적용한 후에 목적하는 것보다 더 높다면, 조성물은 대안적으로 양이온 교환 수지에 적용될 수도 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물 중의 임의의 내독소는 내독소로부터 단백질의 정제를 허용하기 위하여 당해 단백질보다는 이온-교환 수지에 차동 결합을 가져야만 한다. 이와 관련하여, 내독소는 음으로 하전되고 일반적으로 음이온교환 수지에 결합될 것이다. 단백질과 내독소가 둘 다 음이온교환 수지에 결합된다면, 다른 쪽으로부터 한쪽의 정제는 이들 둘을 상이한 분획으로 용리시키도록 염 구배를 이용해서 시행될 수 있다. 특정 수지에 단백질의 상대적 결합은 또한 단백질의 pI에 비해서 완충액의 pH를 변화시킴으로써 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 양이온-교환 크로마토그래피가 이용된 유일한 이온-교환 크로마토그래피이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 내독소 수준이 음이온교환 수지 이후에 너무 높다면, 조성물은, 예를 들어, 조성물을 양이온교환 수지와 접촉시키고 나서 세척 단계를 수행하고 이어서 이온-교환 수지로부터의 용리를 행하는 제2 이온-교환 단계가 더 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 양이온교환 수지는 결합을 위하여 설폰산기를 포함한다. 예시적인 양이온교환 수지는 SP 세파로스(Sepharose)(등록상표) 수지 FF(아머샴사, 뉴저지주 피스카타웨이 소재), 포로스 XS(Poros XS)(CEX)(라이프 테크놀로지사(Life Technology), 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 특정 수준의 내독소를 갖는 항체 단백질의 용액이 생성된 후에, 단백질의 최종 조제 전에 많은 단계가 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 반감기 연장 모이어티가 단백질에 접합된다. 이어서 접합체는 최종 약물 제형으로 조제되고 이 제형은 환자에게 주입된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 접합체는 재차 양이온-교환 수지일 수 있는 이온-교환 수지 상에서 정제된다. 다른 실시형태에 있어서, 단백질이 조제된다. 모든 경우에, 단백질 샘플 내로의 또는 단백질-중합체 접합체 내로의 내독소 오염물의 도입을 방지하기 위하여 통상의 실험실 절차가 이용되어야 한다.
실시예
실시예 1. OG1802의 합성 경로.
OG1802의 합성에 대한 제1 경로는 다음과 같아. 우선, 도 1에 도시된 구조를 갖는 TFA/아민염 개시제(화합물 L)은 다음과 같이 합성하였다.
먼저, 도 2에 도시된 구조를 갖는 화합물 K는 다음과 같이 합성하였다. 200㎖ 둥근 바닥 플라스크에 질소 하에 화합물 J(OG1563)(1.9g, 2.67 m㏖, 3.3 당량):
Figure pct00046
및 화합물 E(0.525g, 0.81 m㏖, 1.0 당량)(도 11 참조)를 넣고 나서 다이메틸폼아마이드(10㎖)에 이어서 다이아이소프로필에틸아민(2.5㎖, 14.6 m㏖, 18 당량)을 넣었다. 상기 플라스크를 빙욕을 이용해서 0℃로 냉각시켰다. 이것에 대략 6분에 걸쳐서 프로필포스폰산 무수물 용액(에틸 아세테이트 중 50 중량%, 2.5㎖, 4.04 m㏖, 5 당량)을 첨가하였다.
상기 반응물을 실온으로 가온시키고, 15분 동안 교반하였다. 이 반응물을, 물(20㎖), 포화 수성 중탄산나트륨(20㎖) 및 에틸 아세테이트(100㎖)를 첨가함으로써 반응 중지시켰다. 유기 층을 분리시키고, 수성 층을 에틸 아세테이트(75㎖)로 추출하였다. 합한 유기 층을 포화 수성 중탄산나트륨(30㎖), 0.5M 수성 시트르산(40㎖), 물(25㎖), 및 포화 수성 염화나트륨(40㎖)으로 세척하고, 이어서 건조시키고(황산나트륨), 여과 후 진공 하에 농축시켰다. 잔사는 추가의 정제 없이 사용되었으며, 결과적으로 2.0g(0.80 m㏖, 99%)의 화합물 K를 얻었다.
1H NMR (400 MHz DMSO-d6): δ = 1.36 (s, 9H, OCCH3), 1.90 (s, 54H, CC(CH3)2Br), 2.31 (t, J = 7.2 Hz, 6H, CCH2CH2NH), 2.98 (d, J = 5.6 Hz, 6H, CCH2NH), 3.04 (q, J = 6.0 Hz, 2H, OCH2CH2NH), 3.18 (s, 2H, OCH2C), 3.3-3.37 (m, 8H, CH2), 3.47-3.55 (m, 12H, CH2), 3.58 (s, 6H, OCH2C), 3.87 (s, 6H, O=CCH2O), 4.27 (s, 18H, CCH2OC=O), 6.74 (br t, 1H, CH2NHC=O), 7.69 (t, J = 6.8 Hz, 3H, CH2NHC=O), 7.84 (t, J = 6.0 Hz, 3H, CH2NHC=O).
LC-MS (ES, m/z): (C84H136Br9N7O33+2H-Boc)/2에 대한 [(M+2H-boc)/2]+ 계산치 = 1196.6; 확인치 1196.6.
다음에 화합물 L(도 1)은 다음과 같이 합성하였다: 100 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에 질소 하에 화합물 K(2.0g, 0.8 m㏖), 다이클로로메탄(10㎖)에 이어서 트라이플루오로아세트산(5㎖)을 첨가하였다. 이 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응물을 진공 하에 농축시켰다. 반응물을 다이클로로메탄(10㎖)을 이용해서 희석시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔사를 아세토나이트릴(10㎖)을 이용해서 용해시키고, 시린지 필터(syringe filter)(Acrodisc CR25, PN 4225T)를 통해서 여과시키고 분취식 HPLC 칼럼 상에 장입하고 수중 60% 아세토나이트릴(0.1% 트라이플루오로아세트산과 함께)에서 최대 98% 아세토나이트릴(0.1% 트라이플루오로아세트산과 함께)로 용리시켰다. 생성물을 함유하는 튜브를 혼주시키고 진공 하에 농축시키고, 동결시키고 동결건조기 상에 배치하였다. 그 결과 백색 분말로서 990㎎(0.4 m㏖, 2단계에 걸쳐서 50%)의 화합물 L을 얻었다.
1H NMR (400 MHz DMSO-d6): δ = 1.90 (s, 54H, CC(CH3)2Br), 2.31 (t, J = 7.2 Hz, 6H, CCH2CH2NH), 2.97-3.0 (m, 8H, CCH2NH 및 OCH2CH2NH), 3.17 (s, 2H, OCH2C), 3.3 (q, 6H, CH2CH2NHC=O), 3.4-3.59 (m, 20H, CH2), 3.87 (s, 6H, O=CCH2O), 4.27 (s, 18H, CCH2OC=O), 7.69-7.84 (m, 9H, CH2NHC=O 및 NH3+ 둘 다).
LC-MS (ES, m/z): (C84H136Br9N7O33+2H)/2에 대한 [(M+2H)/2]+ 계산치 = 1196.6; 확인치 1197.4.
다음에, 화합물 L은 MPC 중합체를 합성하기 위한 개시제로서 사용하였다. 개시제는 전형적으로 약 100 ㎎/㎖의 DMF 중 스톡 용액으로서 제조하였다. 개시제 및 리간드(2,2'-바이피리딜)는 쉬렝크 관(Schlenk tube)에 도입하였다. 얻어지는 용액을 드라이아이스/아세톤 혼합물을 이용해서 -78℃로 냉각시키고, 10분 동안 진공 하에 탈기시켰다. 튜브를 아르곤 하에 재충전하고, 아르곤 하에 유지된 촉매(달리 나타내지 않는 한 CuBr)를 쉬렝크 관에 도입하였다(개시제 상의 원자 브로민/촉매(CuBr)/리간드의 몰비가 1/1/2로 유지됨). 용액은 즉시 암갈색으로 되었다. 쉬렝크 관을 밀봉하고 즉시 짧은 주기 진공/아르곤을 인가함으로써 퍼지시켰다. HEMA-PC의 용액은 질소 하에 유지된 글러브박스에서 제조된 정해진 양의 단량체를 200 프루프(proof)의 탈기된 에탄올을 혼합함으로써 제조하였다. 단량체 용액은 (캐뉼러를 통해서) 쉬렝크 관에 적가하였다(그리고 가볍게 교반하면서 균질화시켰다. 온도는 -78℃에서 유지되었다. 용액으로부터의 기포가 사라질 때까지 철저한 진공이 반응 혼합물에 적어도 10 내지 15분 동안 적용되었다. 상기 관을 이어서 아르곤으로 재충전시키고 실온으로 가온시켰다. 상기 용액을 교반하였으며, 중합이 진행됨에 따라서, 용액은 점성으로 되었다. 3 내지 8시간 후에 또는 하룻밤 정치 전에, Cu(I)을 Cu(II)로 산화시키기 위하여 공기에 직접 노출시켜 반응을 중지시켰으며, 이 혼합물은 청록색으로 되었고, 구리 촉매를 제거하기 위하여 상기 혼합물을 실리카 칼럼을 통과시켰다. 수집된 용액은 회전 증발에 의해 농축되었고, 얻어진 혼합물은 테트라하이드로퓨란으로 석출되거나 또는 물에 대해서 투석시키고 나서 동결 건조시켜서 흐름이 없는 백색 분말을 수득하였다. 이하의 표 1.1은 개시제로서 화합물 L을 이용하는 중합체 대한 중합체 데이터를 제시한다.
표 1.1
Figure pct00047
다음에, 말레이미드 Mal-PEG4-PFP 에스터를 위에서 기재된 750 kD중합체에 (도 29에 제시된 바와 같이) 스냅핑하여 OG1802를 제공하였다. 20㎖ 바이알에 중합체 R3707을 넣고(750 kD중합체는 L을 개시제로서 사용해서 제조됨, 515㎎), 40분 동안 교반 후 에탄올(4.0㎖)을 이용해서 용해시켰다. 이것에 아세토나이트릴(22㎕) 중 4-메틸몰폴린의 1% 용액을 첨가하였다. 별도의 바이알에 아세토나이트릴(1.0㎖) 중 Mal-PEG4-PFP(1.97㎎)에 용해시키고, 이 용액을 상기 중합체 용액에 실온에서 대략 2분에 걸쳐서 첨가하고, 얻어진 용액을 하룻밤 교반하였다. 반응물을 0.1% 수성 트라이플루오로아세트산(2㎖)(pH 대략 5)에 이어서 물(대략 12㎖)로 희석시키고, 시린지 필터(Acrodisc Supor, PN 4612)를 ㅌ통해서 여과시키고, 3 Amicon 원심분리막 투석관(30,000 mwco)에 균일하게 넣었다. 이들 관을 물(각각 대략 5㎖)로 희석시키고 혼합하고, 25분 동안 원심분리기(rpm 3200)에 배치하였다. 여과액을 분석을 위하여 제거하고 잔류물을 물(~10 ㎖/관)로 희석시키고 혼합하였다. 원심분리 절차는 5회 초과로 반복하였으며, 그 후 잔류물을 제거하고 바이알에 넣었다. Amicon 막 관을 물(각 관마다 2 x ~2㎖)로 헹구고, 이것을 잔류물과 배합하였다. 잔류물 용액을 시린지 필터(Acrodisc Supor, PN 4612)를 통해 여과시키고, 동결시키고, 동결건조기에 배치하였다. 그 결과 백색 분말로서 485㎎이 수득되었다.
실시예 2. 개시제OG1786의 합성
OG1786은 OG1802의 합성에서 전구체로서 사용되는 중합체 합성을 위한 9-팔 개시제이다. 각 팔은 ATRP 하에 중합을 개시시킬 수 있는 2-브로모아이소부티레이트에 의해서 종결된다. OG1786은 도 30에 나타낸 바와 같은 트라이플루오로 아세트산(TFA)의 염이다. OG1786은 다음과 같이 제조된다. 우선, OG1550은 TFA(트라이플루오로 아세트산)와 반응하여 도 31에 묘사된 바와 같이 OG1546을 생성한다.
자기 교반바 및 추가의 깔때기가 장비된 1ℓ 둥근 바닥 플라스크에 OG1550(14.8g), 메틸 tert-부틸 에터(MTBE)(350㎖) 및 물(30㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 교반하여 OG1550을 용해시키고, 이어서 빙욕에서 냉각시켰다. 이 혼합물에 물(90㎖) 중 트라이플루오로아세트산(4.9㎖)의 용액을 90분에 걸쳐서 적가하였다. 첨가가 완료된 후에, 이 혼합물을 추가의 15분 동안 교반하고 나서 빙욕으로부터 제거하고 실온으로 가온시켰다. 혼합물을 (빙욕으로부터 제거한 후에) tlc가 대략 5%의 출발 물질이 남아 있고 수성 pH가 3 내지 4인 것((pH 시험지))을 나타낼 때까지 더욱 4 내지 5시간 동안 교반하였다.
상기 혼합물을 분별시켰다. MTBE층은 물(30㎖)로 세척하였다. 이어서 수성층을 합하고 수성층을 MTBE(150㎖)로 추출하였다. 이 두 번째 MTBE상을 물(30㎖)로 세척하였다. 합한 수성 층을 MTBE(100㎖)의 세 번째 부분으로 세척하였다. 이 세 번째 MBTE 상을 물(25㎖)로 세척하였다. 수성 층을 재차 합하였다(대략 250㎖, 시험지에 의해 pH 대략 4).
생성물을 동결건조에 의해 수집하였다. 11.5g의 백색 고체를 얻었다. 이 물질은 극히 흡습성이므로, 질소 하에 가장 잘 취급하였다. 생성물은 LCMS에 의해 확인되었다.
이어서 제조된 OG1546을 OG1563과 반응시켜 OG1784(도 32에 도시됨)를 제조하였다.
교반봉이 장비된 질소 하의 250㎖ 플라스크에 OG1546(흡습성, 9.0g)을 첨가하고 나서 N,N-다이메틸폼아마이드(110㎖)를 첨가하였다. 모든 OG1546이 용해될 때까지(약 15분) 혼합물을 실온에서 교반하고, 이어서 OG1563(29.9g)을 첨가하고, OG1563이 또한 용해될 때까지 혼합물을 더욱 3분 동안 교반하였다. 얻어진 용액을 빙욕에서 냉각시키고, N,N-다이아이소프로필에틸아민(37.6㎖)을 3분에 걸쳐서 첨가하고 나서 50% 에틸 아세테이트(34.5㎖) 중 프로필포스폰산 무수물(T3P)을 5분에 걸쳐서 적가하였다(T3P 첨가는 발열적이다). T3P 첨가가 완결된 후에, 플라스크를 냉각욕으로부터 제거하고, 실온에 도달하게 하였다. 이어서, 샘플을 LCMS 분석을 위하여 5분 간격으로 취하였다. 반응물은 매우 연한 황색/황갈색을 보였다.
20분 후에, 반응물을 빙욕에서 재차 냉각시키고 5㎖의 물을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 냉각욕으로부터 제거하고, 추가의 50㎖ 물 부분을 첨가하고 나서 50㎖의 0.5M 시트르산에 이어서 아이소프로필아세테이트(300㎖)를 첨가하였다. 이 혼합물은 분액되었다. 수성 상(~300㎖)은 추가의 아이소프로필 아세테이트(150㎖)로 추출하였다. 수성 상은 HPLC 시험에 대해서 AQ1이었다. 합한 유기물을 수성 시트르산(115㎖, 65mM, 15㎖의 0.5M 시트르산 + 100㎖의 물의 혼합물)으로 세척하자, 수성 상은 AQ2(pH 대략 3)였다. 유기상을 물/포화 염화나트륨(100㎖/25㎖)으로 세척하자, 수성 상은 AQ3(pH 대략 3)이었다. 유기상은 포화 염화나트륨(100㎖)으로 최종적으로 세척하자, 수성상은 AQ4였다. AQ 분획의 어느 것도 임의의 유의한 생성물을 함유하지 않았다(데이터는 제공되지 않음). 유기상은 LCMS를 통해서 생성물을 확인해준다. 생성물을 황산나트륨(80g) 위에서 건조시키고, 여과 후 아이소프로필 아세테이트(75㎖)로 헹구고, 회전증발기에서 황갈색 오일(33.2g)로 농축시켰다. 이 조질물은 질소 하에 하룻밤 저장되었다.
다음날, 조질물을 실온이 되게 하고, 이어서 아세토나이트릴/물(46㎖/12㎖)에 용해시키고, HPLC 필터 디스크(Cole-Parmer PTFE 0.2㎛, 제품 번호 02915-20)를 이용해서 여과시켰다. 여과액을 3개의 동등한 부분으로 나누고 3회 정제시켰다.
여과액을 50% 아세토나이트릴/물로 평형화된 RediSep Rf Gold C18 칼럼(275g, SN 69-2203-339, 로트 번호 24126-611Y)에 장입하였다. 이 물질을 이하의 구배(용매 A: 물, 용매 B: 아세토나이트릴)를 이용해서 100㎖/분에서 용리시켰다. 모든 관련된 분획은 HPLC에 의해 검사하였다. 충분히 순수하게 되도록 조정된 분획을 (모두 3회의 가동으로부터) 혼주시키고 회전증발기 상에서 농축시키고(욕 온도는 약 20℃로 유지됨), 이어서 다이클로로메탄(100㎖)과 물(5㎖)/포화 염화나트륨(25㎖) 간에 분배시켰다. 수성층은 다이클로로메탄(2 × 30㎖)으로 2회 이상 추출하였다. 합한 유기층을 황산나트륨(35g) 위에서 건조시키고, 여과 후, DCM(30㎖)으로 헹구고, 농축시켰다. 생성물 및 순도는 LCMS 방법에 의해 확인하였다. R5172 및 R5228 로트의 단리된 수율 및 순도는 표 2.1에 표시되어 있다.
표 2.1
Figure pct00048
다음에 OG1405는 도 33에 도시된 바와 같이 OG1784로부터 제조하였다. 자석 교반봉이 장착된 500㎖ 둥근 바닥 플라스크에 OG1784(20.9g)를 첨가하고 나서, 다이클로로메탄(50㎖), 이어서 트라이플루오로아세트산(20㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 교반한 바, HPLC 분석은 23분에 완전한 탈보호를 나타내었다. 혼합물을 회전 증발기 상에서 농축시키고, 다이클로로메탄(25㎖)에 재용해시키고, 재농축시키고, 이어서 아세토나이트릴(25㎖)에 재용해시키고 재농축시켰다. 생성물은 LCMS에 의해 확인되었다. 상기로부터의 물질(OG1405, 34.5g, 정량적 수율로서 21.0g이 가정됨)이 다음 단계에서 미가공 오일로서 사용되었다. 정제는 필요하지 않다.
다음에, OG1405를 OG1402와 반응시켜 도 34에 제시된 바와 같은 OG1785를 제조하였다. 교반봉이 장착된 질소 하의 500㎖ 플라스크에 OG1402(5.5g)를 넣고 나서, 아세토나이트릴(70㎖), 이어서 N,N-다이아이소프로필에틸아민(26.3㎖) 및 T3P 용액(상기 참조)(7.9㎖)을 넣었다. 이 용액을 실온에서 30분 동안 교반하고, 이어서 빙수욕에서 냉각시키고 아세토나이트릴(70㎖) 중 OG1405(위에서부터의 미가공 오일, 34.5g)의 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 20분 후에, 반응물을 빙수욕에서 냉각시키고, 물(5㎖)로 반응 중지시켰다. 이어서, 혼합물을 회전 증발기를 이용해서 진공 하에 절반 용적으로 농축시켰다. 샘플은 LCMS를 위하여 취하였다.
더욱 물(50㎖)에 이어서, 0.5M 시트르산(75㎖) 및 아이소프로필 아세테이트(175㎖)를 첨가하였다. 혼합물은 5분 내에 분배되었다. 수성층을 추가의 아이소프로필 아세테이트(50㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하여 수성 시트르산(0.13M, 30㎖, 10㎖의 0.5M 시트르산 및 20㎖의 물로 이루어짐)으로 세척하였다. 유기층을 포화 염화나트륨(25㎖)과 물(25㎖)의 혼합물로 세척하고, 이어서 최종적으로 포화 염화나트륨(25㎖)으로 세척하였다. 이어서 이들을 황산나트륨(124g) 위에서 건조시키고, 여과시키고, 아이소프로필 아세테이트(30㎖)로 헹구고, 회전증발기 하에서 황갈색 오일(27.3g)로 농축시켰다. 샘플은 LCMS를 위하여 취하였다.
오일을 아세토나이트릴/물(3:1, 15㎖/5㎖)에 용해시키고, HPLC 필터 디스크(Cole-Parmer PTFE 막 0.2㎛, 제품 번호 02915-20)을 통해서 여과시키고, 3개의 동등한 부분으로 나누었으며, 이들 각각은 개별적으로 다음과 같이 정제시켰다.
부분들을 50% 용매 B(아세토나이트릴)/50% 용매 A(물)에서 평형화된 Redi-Sep Gold C18 칼럼(275g, SN - 69-2203-339, 로트 241234-611W) 상에 장입하였다. 이 물질을 이어서 용매 A: 물/용매 B: 아세토나이트릴 구배를 이용하는 역상 HPLC에 의해 정제시켰다. 적절한 분획을 혼주시키고 다이클로로메탄(150㎖)과 물(5㎖)/포화 염화나트륨(25㎖) 간에 분액시켰다. 수성상을 다이클로로메탄(2 × 50㎖)으로 2회 추출하였다. 유기상을 황산나트륨(60g) 위에서 건조시키고, 여과 후 다이클로로메탄(40㎖)으로 헹구고 농축시켰다. 구조 및 순도는 LCMS를 포함하는 각종 분석 장치에 의해 확인하였다: OG1785는 포말 고체(R5329, 19.0g, 83% 수율, 95.1% 순도 (a/a 210㎚)로서 단리되었고, 질소 4℃에서 질소 하에 저장하였다.
다음에, OG1785에 대한 tert-부틸옥시카보닐 보호기를 트라이플루오로아세트산(TFA)을 이용해서 제거하여 도 35에 도시된 바와 같은 OG1786를 생성하였다.
실시예 3. 중합체 OG1801의 합성
중합체 OG1801은 먼저 개시제 OG1786으로부터 제조된다. OG1801은 중합체 합성 동안 (말레이미드보다) 더 안정적인 아민 작용기를 갖는다. 중합체 OG1801을 합성하기 위하여, (Cu(I))종이 금속 구리를 Cu(II)에 첨가함으로써 동소에서 생성되는 ATRP의 변형된 버전이 사용된다. 반응에 필요한 출발 물질 및 시약은 목표로 하는 분자량(MW)뿐만 아니라 단량체 (HEMA-PC) OG47의 회분식 투입에 기초하여 계산된다.
글러브 박스에 50g의 단량체 OG47을 칭량해넣고 200㎖의 탈기된 EtOH를 첨가하여 상기 단량체를 실온에서 용해시키고; 단량체 농도 시험을 위하여 샘플링하였다. 500㎖ 플라스크에 Cu(II), Bpy, Cu(0)를 칭량해넣고; 단량체 용액을 플라스크에 첨가하면서 아르곤으로 퍼지시키고; 플라스크를 마개로 밀봉하고 기포가 없어질 때까지 25분 동안 진공처리하였다. 반응물은 연녹색에서 암록색으로 점차로 변하였고, 이어서 연갈색으로 변하였으며; 글러브 박스에 대략 200㎎의 개시제 OG1786을 칭량해넣고 실온 하에 대략 2000㎕의 DMF에 용해시켜 100 ㎎/㎖의 스톡 용액을 제조하고; 개시제 농도 및 순도 시험을 위하여 샘플링하였으며; 이 개시제 용액을 아르곤 하에 플라스크에 첨가하였다. 반응 용액은 시간 경과에 따라서 암갈색으로 되었고 점조화되기 시작하였으며; 시스템을 밀봉하고 2일 동안 반응을 일으켰다.
이어서, OG1801을 말레이미드의 첨가에 의해 제조하고 촉매(구리)를 다음과 같이 제거하였다: 사전 패킹된 RediSep(등록상표) Rf 정상 실리카 칼럼을 이용해서 촉매를 제거한다. 칼럼의 크기는 반응 혼합물 중 구리의 양에 의거해서 선택한다. 예를 들어, 330g 칼럼(카탈로그 번호 69-2203-330, 칼럼 크기 330g, CV=443㎖)이 50g의 OG1801 배취를 위하여 사용되었다. EtOH가 용출 용매이므로 모든 접속을 위하여 테플론 튜빙이 사용된다.
구리 제거 후에, 모든 분획을 배취로 둥근 바닥 플라스크에 옮기고. 감압에서 45 내지 50℃에서 회전 증발기에 의해 EtOH를 건조 상태로 증발시켰다. 이 단계에서, 응축으로부터 수집된 EtOH 용적은 EtOH 제거가 90% 초과로 된 것을 확실하게 하기 위하여 모니터링하였다. 중합체를 250㎖의 WFI에 용해시키고, 0.2㎛ 필터를 이용해서 여과시켰다. 결과적으로 맑은 내지 연황색 중합체 용액이 대략 150 ㎎/㎖로 얻어졌다. 이 용액은 사용 전에 최대 3개월까지 2 내지 8℃에서 저장될 수 있었다.
실시예 4. 중합체 OG1802의 합성
반응에 필요한 출발 물질 및 시약은 OG1801의 배취 투입에 기초하여 계산한다. 링커는 3-말레이미도프로피온산, NHS 에스터이다. 30㎖의 0.5M 인산나트륨(WFI, pH 8)을 50g의 중합체 용액(대략 150 ㎎/㎖)에 첨가한다. 1분 동안 교반한 바; pH는 pH 시험지에 의해 8.0이었다. 204.8㎎의 링커를 칭량하고 DMF 4.1㎖에 용해시켜 50 ㎎/㎖ 스톡 용액을 제조하였다. 중합체 용액에 분당 815㎕로 링커 용액을 강하게 교반하면서 첨가하였다. 4095㎕의 링커 용액의 첨가에 5분이 소요되었다. 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 최종 pH 5를 달성하기 위하여 20㎖의 5% 아세트산으로 반응을 중지시켰다. 이 용액을 1L 진공 필터(0.2㎛)를 이용해서을 여과시켰다.
OG1802(도 36 참조)은 이어서 다음과 같이 정제시킨다: 밀리포어 크로스 플로 카세트(Milipore cross flow cassette)가 수성 시스템에서의 중합체 정제를 위하여 사용된다. 중합체 용액을 250㎖(~ 200 ㎎/㎖)로 농축함으로써 개시하였다. 저장용기로부터 신선한 WFI를 첨가하고, 투과물의 유량(대략 2㎖/분)과 같은 유량으로 새로운 WFI 공급물의 유량을 조절하였다. UF/DF는 2 내지 8℃에서 하룻밤 설정되었다. 전형적으로 2.5ℓ의 WFI가 이용되었다(중합체 용액에 대해서 10배 용적비). 잔류물의 샘플을 순도 시험을 위하여 수집하였다. 목적하는 순도는 98% 초과였다. 중합체 용액을 0.2μM 1L 필터 병에 의해 여과시켰다. 중합체 용액은 접합 전에 2 내지 8℃에서 최대 3개월 동안 저장될 수 있었다.
실시예 5. 대안적인 포스포릴콜린 중합체
HEA-PC 중합체는 이하에 기재된 바와 같이 합성하였다. 위에서 기재된 메타크릴레이트 HEMA-PC에 대해서 반대되는 아크릴레이트인 HEA-PC(2-(아크릴로일옥시)에틸-2-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트)는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00049
HEA-PC는 실시예 1에 나타낸 개시제에 화합물 L로서 중합되었다.
표 5.1
Figure pct00050
2.2㎎의 개시제를 11㎕의 건조 DMF에 용해시켜 200㎎/㎖의 개시제의 스톡 용액과, 23㎕의 건조 DMF 중 4.6㎎의 Me6TREN을 용해시킴으로써 200 ㎎/㎖의 리간드 용액을 제조하였다. 8.25㎕의 개시제의 스톡용액과 13.6㎕의 리간드를 튜브에 분배한다. -78℃에서 5분 동안 탈기시키고 나서 아르곤으로 재충전시키고 1.2㎎의 CuBr을 첨가한다. 탈기시키고 아르곤으로 재충전시킨다. -78℃에서 반응기 내부에서 상기 용액에 메탄올 중 HEA-PC의 스톡 용액(0.461g의 HEA-PC를 칭량하고 이것을 0.5㎖의 메탄올에 용해시킴)을 첨가한다. 이 바이알을 200㎕의 메탄올로 헹구고, 이것을 반응기 내부에 -78℃에서 첨가하고, 이어서 0.5㎖의 증류수, 이어서 또 다른 200㎕의 물을 첨가한다. 기포가 보이지 않고 모든 불균일물질이 사라질 때까지(고체 입상체를 용해시키거나 사라지게 함) 철저하게 탈기시킨다. Refill with 4 psi의 아르곤을 재충전시키고 실온에서 1시간 동안 반응을 진행시킨다. 반응물은 이미 점성으로 되었다. 반응을 약 1시간 진행시켰다. 메탄올 중 바이피리딘 용액(0.5㎕ 중 5㎎)을 첨가하였다. 또 다른 2 내지 3㎖의 메탄올을 첨가하고 촉매를 4℃에서 하룻밤 산화시켰다. 1H NMR에 의해 결정된 전환율은 94% 인 것으로 추정되었다.
다음날 중합체를 투석시키고 1 ㎖/분에서 1x PBS pH 7.4 중에서 쇼덱스 SB806M_HQ 칼럼(7.8x300mm)을 이용하는 SEC/MALS 분석을 시행하여, PDI 1.157, Mn 723.5 kDa, Mp 820.4 kDa 및 Mw 837.2 kDa(투석 전에 PDI = 1.12, Mn = 695 kDa, Mp = 778 kDa)을 부여하였다. 다음에, 말레이미드 작용기를 이 중합체에 첨가하여 단백질에 접합시킬 수 있었다.
다음에, 말레이미드 Mal-PEG4-PFP(상기 실시예 1 참조) 에스터는 실시예 1에 나타낸 바와 같은 HEA-PC 중합체에 스냅시켰다. 얻어진 말레이미드 작용화된 HEA-PC 중합체는 이어서 HEMA-PC 중합체에 대해서 본 명세서에서 논의된 바와 같이 설피드릴기에 접합될 수 있다.
아크릴아마이드 PC 중합체는 또한 하기 구조를 갖는 단량체 2-(아크릴아밀)에틸-2-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트(Am-PC)를 이용해서 제조하였다:
Figure pct00051
Am-PC는 하기 구조를 갖는 3 팔 개시제(TFA염)를 이용하는 중합에 사용되었다:
Figure pct00052
Am-PC 중합체의 합성은 다음과 같이 수행하였다:
표 5.2
Figure pct00053
200㎎/㎖에서의 리간드의 스톡 용액은 9㎎의 Me6TREN을 45㎕의 건조 DMF에 용해시킴으로써 제조하였다. 반응 용기에 19.7㎕의 스톡 용액을 첨가한다. 6.5㎎의 물질을 32.5㎕의 DMF에 용해시킴으로써 200㎎/㎖에서 개시제의 스톡 용액을 제조한다. 위에서부터의 리간드에 11㎕의 개시제 스톡 용액을 첨가한다. 5분 동안 탈기시킨다. 1㎎의 CuBr을 첨가한다. 4㎎의 CuBr2를 20㎕의 DMF에 용해시킴으로써 200㎎/㎖에서 CuBr2의 스톡 용액을 제조한다. Add 0.5g의 단량체(AmPC)를 1㎖의 메탄올(느린 용해/점성 용액)에 첨가하고 나서 1㎕의 CuBr2의 스톡 용액을 첨가한다. 상기 반응 혼합물에 단량체 용액을 적가한다. 1㎖의 물로 헹군다. 반응 혼합물을 철저하게 탈기시킨다(동결-해동). 반응은 24시간 동안 진행시킨다.
그 후 Am-PC 중합체는 투석될 수 있다. 상기 중합체의 분자량은 SEC/MALS에 의해 결정되었다: Mn은 215kDa이고, Mp: 250kDa, PDI는 1.17이다. 전환율은 1H NMR에 의해 94%인 것으로 추정되었다. 말레이미드 작용기는 HEMA-PC 및 HEA-PC에 대해서 위에서 논의된 바와 같이 Am-PC 중합체에 첨가될 수 있다. 말레이미드 작용화된 Am-PC 중합체는 위에서 기재된 바와 같은 단백질에 접합될 수 있다.
실시예 6. 화합물 내 유리 말레이미드를 계산하기 위한 역 엘만 검정(Reverse Ellman's Assay)
OG1802(상기 참조)를 형성시키기 위하여 중합체 OG1801에 말레이미드 작용기의 첨가 후에, 엘만 검정은 샘플 내 작용성 말레이미드(즉, 접합 가능한)의 양을 결정하는데 사용되었다. 티올은 엘만 시약(DTNB)을 TNB-로, 이어서 중성에서 물 및 알칼리 pH 중에서 TNB2-로 전환시켰고, 이것은 황색을 제공하였다(412㎚에서 측정됨). 표준 곡선은 시스테인으로 확립하였다. 말레이미드가 티올과 반응하므로, 이 검정은 실제로 티올(시스테인)이 남아 있는 것을 측정하였다. 저해는 (원래의 티올 - 말레이미드 중합체 첨가 후에 남은 티올)/(원래의 티올)로서 계산되었고, 백분율로서 표현된다.
검정에 이용된 시약: 표준 곡선은 62.5μM 내지 2μM의 시스테인을 사용해서 준비하였다. 중합체 스톡 용액은 1xPBS pH7.4(반응 완충액) 중에 분말을 용해시키고 철저하게 혼합함으로써 제조하였다. 등몰량의 중합체와 시스테인 용액을 혼합하고 27℃에서 30분 동안 반응시킬 수 있었다. 150μM의 DTNB 용액을 시스테인 표준에 첨가하고 중합체/시스테인 반응 및 색을 27℃에서 5분 동안 발색시켰다. 412㎚에서의 OD는 스펙트라맥스(Spectramax) 플레이트 판독기에서 판독하고 퍼센트 저해는 소프트맥스 프로 소프트웨어(Softmax Pro software) 및 시스테인 표준 곡선을 이용해서 계산하였다.
실시예 7. L443C(EU 넘버링, 또는 서열번호 1에서의 449C)돌연변이를 갖는 항-VEGF-A 항체 중쇄 및 항- VEGFA -항체 경쇄를 포함하는 항체(OG1950)의 단백질 서열
서열번호 1에 제시된 서열 세트(도 12)(중쇄)를 갖는 L443C(EU 넘버링) 돌연변이를 지니는 항-VEGF-A 항체를 클로닝하였다. 이하의 서열번호 2에 제시된 서열 세트(도 13)를 갖는 항-VEGF-A 항체 경쇄를 클로닝하였다.
실시예 8a. OG1950의 정제 및 캡 제거(decapping)
OG1950 중쇄 및 경쇄를 발현 플라스미드에 클로닝하고 CHO 세포에 형질감염시킬 수 있다. 이 세포를 적절한 배지에서 성장시키고 수확할 수 있다. OG1950은 위에서 기재된 수법을 이용해서 정제시킬 수 있다. 위치 443(L443C(EU 넘버링)) 잔기에서의 OG1950 시스테인은 전형적으로 세포 배양 배지에서 화학물질에 의해 "캐핑" 또는 산화되어, 접합에 이용될 수 없다. 이와 관련하여, 정제된 OG1950은 캡 제거(즉, 환원) 절차를 거쳐서 캡을 제거하고, 유리(즉, Cys-Cys 다이설파이드 결합에 관여되지 않은 것들) 시스테인 잔기가 중합체의 말레이미드 작용기에 접합 가능하게 할 수 있다. 캡 제거는 정제된 OG1950 단백질을 30배 몰 과잉의 환원제 TCEP(3,3',3''''-포스판트리틸트라이프로판산)와 1시간 동안 25℃에서 혼합함으로써 수행될 수 있다. TCEP에 의한 환원 반응은 SDS-PAGE에 의해 모니터링할 수 있다. 환원 후에, OG1950 단백질을, 20mM Tris pH7.5, 150mM NaCl, 0.5mM TCEP 완충액을 사용하는 펠리콘 XL 한외여과 카세트를 이용하는 UFdF에 의해 세척하여 캡을 제거하였다. 이어서, TCEP 시약을 20mM Tris pH7.5, 150mM NaCl를 사용하는 동일한 UFdF 장치에서 제거할 수 있다. 이어서, 환원된 OG1950은 공기(주위 산소)를 사용해서 재차 접을 수 있고 이것은 이어서 검정으로서 SDS-PAGE가 시행된다.
실시예 8b. 정제 및 OG1950의 캡 제거
OG1950 중쇄 및 경쇄를 발현 플라스미드에 클로닝하고 CHO 세포에 형질감염시킬 수 있다. 이 세포를 적절한 배지에서 성장시키고 수확할 수 있다. OG1950은 위에서 기재된 수법을 이용해서 정제시킬 수 있다. 위치 443(L443C(EU 넘버링)) 잔기에서의 OG1950 시스테인은 전형적으로 세포 배양 배지에서 화학물질에 의해 "캐핑" 또는 산화되어, 접합에 이용될 수 없다. 이와 관련하여, 정제된 OG1950은 캡 제거(즉, 환원) 절차를 거쳐서 캡을 제거하고, 유리(즉, Cys-Cys 다이설파이드 결합에 관여되지 않은 것들) 시스테인 잔기가 중합체의 말레이미드 작용기에 접합 가능하게 할 수 있다. 캡 제거는 정제된 OG1950 단백질을 30배 몰 과잉의 환원제 TCEP(3,3',3''''-포스판트리틸트라이프로판산)와 1시간 동안 25℃에서 혼합함으로써 수행될 수 있다. TCEP에 의한 환원 반응은 SDS-PAGE에 의해 모니터링할 수 있다. 환원 후에, OG1950 단백질을, 20mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 0.5mM TCEP 완충액을 사용하는 밀리포어사(Millipore)로부터의 30 kDa MWCO 막을 구비한 펠리콘(Pellicon) XL 한외여과 카세트를 이용하는 한외여과/정용여과(UF/DF) 시스템에 의해 세척하여 캡 및 과잉의 TCEP를 제거하였다. 이어서, 잔류 TCEP 시약은 20mM Tris pH7.5, 150mM NaCl을 사용하는 동일한 UF/DF 장치에서 제거할 수 있다. 이어서 환원된 OG1950은 주위 온도에서 1시간 동안 dHAA를 사용하여 재산화시키고, 이어서 UF/DF에 의해 dHAA의 제거하여 캡 제거된 OG1950을 형성할 수 있다. 캡 제거 상태는 SDS-PAGE 검정에 의해 모니터링한다.
실시예 9. MPC 중합체에 OG1950의 접합
캡 제거된 OG1950이 중합체 OG1802에 접합될 수 있다. 과잉의 OG1802가 사용된다(10 내지 20배 몰 과잉). 접합은 SDS-PAGE에 의해 모니터링될 수 있고, 거의 완성되도록 구동될 수 있다. OG1950 접합체는 양이온 교환기 크로마토그래피를 통해서 정제될 수 있고 UF/DF에 의해 조제 완충액으로 완충액 교환될 수 있다. 중합체-OG1950 접합체는 위에서 기재된 바와 같이 크로마토그래피 방식으로 정제될 수 있다.
실시예 10. OG1950 SPR 결합 반응속도
이 실시예는 단일 주기 반응속도론 바이아코어의 실험에서 VEGF-165에 대한 OG1950의 결합을 예시한다.
인간 VEGF-165에 대한 OG1950의 SPR 상호작용 분석은 단백질 A 칩(GE 헬쓰케어사)이 장비된 바이아코어의 T200 시스템(GE 헬쓰케어사) 상에서 수행되었다. 단일-주기 반응속도론 방법이 수행되었다. 항체는 10 ㎕/분의 유량에서 25초의 펄스로 HBS-EP+ 완충액(0.01M 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산, 0.15M 염화나트륨, 및 0.05% 폴리솔베이트(polysorbate) 20) 중 25 ㎍/㎖에서 포획되었다. 이어서, 재조합 인간 VEGF-165(R&D 시스템즈사(R&D Systems))는 30 ㎕/분의 유량에서 60초의 펄스 및 1000초의 최종 해리 시간에서 각종 농도에서 적용되었다. 실험은 25℃에서 수행되었다. 표면은 50㎕/분의 유량에서 1분 동안 10mM 글리신 pH 1.7로 재생되었다. 결합 반응속도 분석은 1:1 상호작용에 글로벌하게 적합화시키는 반응으로 바이아코어 T200 평가 소프트웨어를 이용해서 수행되었다. 결과는 표 10.1 및 도 21에 요약되어 있다.
표 10.1.
Figure pct00054
OG1950은 1:1 결합 적합화 모델에서 1 pM KD 미만을 나타낸다(기구 감도를 벗어남).
실시예 11 - 양이온 교환기 크로마토그래피를 이용하는 OG1953의 접합 및 정제
OG1950 단백질 발현 및 단백질 제조: OG1950 단백질은 포유류 GSCHOK1 발현 시스템에서 발현시키고 나서 단백질 A 친화도 칼럼을 이용해서 정제시켰다. 단백질 A 칼럼 정제된 OG1950의 순도는 크기 배제 크로마토그래피및 SDS-PAGE에 기초하여 90%를 넘었다. OG1950의 조작된 특이적 시스테인 잔기는 OG1802 생체고분자에 티올 접합을 위하여 이용 가능하였다. OG1802의 티올 반응 화학기는 반응하여 안정적인 공유 결합을 형성하였으며, 이것은 OG1953 바이오접합체를 형성한다. 이것을 달성하기 위하여, 1㎎의 OG1950을 트리스-(2-카복시에틸)포스핀, 염산염(TCEP) 환원제로 완전히 환원시키고 나서 30KDa 스핀 농축기를 이용해서 완충액 교환을 통해서 TCEP를 제거하였다. 이어서, 완전 환원된 OG1950 단백질은 재산화되어 조작된 시스테인 잔기를 제외하고 모든 예상된 단백질 다이설파이드 결합이 형성되었으며(캡 제거 OG1950), 티올 특이적 접합 화학을 통해서 생체고분자에 접합을 위하여 환원된 형태로 유지되었다.
접합 반응: 접합 반응은 Tris 완충액(20mM Tris, 100mM NaCl, pH 7.5) 중 2 ㎎/㎖에서 최종 단백질 농도로 15배 몰 과잉의 OG1802 생체고분자와 100ug의 캡 제거 OG1950을 혼합함으로써 수행되었다. 각종 첨가제가 접합 효율에 대한 이들의 영향을 비교하기 위하여 표 11.1에 나타낸 바와 같이 상이한 접합 반응에서 평가되었다. 모든 반응은 고정된 용적에서 설정되었고 4℃에서 20시간 동안 항온처리되었다. 표 11.1 및 도 19는 접합 반응 A 내지 G의 분별화 및 이온교환기 분석(A280 흡광도)을 나타낸다. 반응 A는 완충액을 단독으로 함유하였고; 반응 B는 OG1950 항체를 단독으로 함유하였으며; 반응 C는 OG1950 항체 + OG1802 중합체를 함유하였고; 반응 D는 OG1950 항체 + OG1802 중합체 + 수크로스를 함유하였으며; 반응 E는 OG1950 항체 + OG1802 중합체 + 트레할로스를 함유하였고; 반응 F는 OG1950 항체 + OG1802 중합체 + 글루탐산을 함유하였으며; 반응 G는 OG1950 항체 + OG1802 중합체 + 아스파르트산을 함유하였다. 반응 B 내지 G는 고정된 총 반응 용적으로 투입된 100ug OG1950 단백질로 시작되었다. 반응 완결 시, B 내지 G 반응의 각 용적이 IEX 분석을 위하여 주입되었다. 접합 효율 비교는 도 19에 도시되어 있다. 피크 1(P1)은 단백질에 접합되지 않고 이온교환기 칼럼에 결합될 수 없으며 따라서 각 반응에서 미결합 분획으로서 용리된 과잉의 생체고분자(OG1802)를 나타내고; 피크 2(P2)는 각 반응에서 항체 중합체 바이오접합체를 나타내며; 피크 3(P3)은 각 반응에서 중합체에 접합되지 않은 유리 항체를 나타낸다.
표 11.1
Figure pct00055
상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 각종 부형제는 유의하게 보다 높은 접합 효율을 가능하게 하였다. 이론에 의해 제한하려는 의도는 없지만, 성분들의 용해도를 유지함에 있어서 원조하는 이러한 부형제는 접합 효율을 돕는다.
OG1953 접합 반응의 양이온 교환기 분석: 접합 반응 완결 시, 5㎕의 각 반응 혼합물을 양이온 교환기 크로마토그래피(IEX) 분석 및 쇼덱스 SP-825 HPLC 칼럼을 이용한 분리를 위하여 칼럼 평형 완충액(20mM 아세트산나트륨 pH 5.5)으로 3배 희석하였다. IEX는 반응 혼합물을 먼저 접합체 및 미반응 단백질이 둘 다 칼럼에 결합되도록 염농도를 낮추도록 희석된 결합 및 평가 모드 하에 수행하고, 이어서 증가하는 NaCl 농도가 차동 전하 변동(differential charge variation)으로 인한 상이한 체류 시간에서 접합체(OG1953) 및 미접합된 유리 단백질(OG1950)의 용리를 초래하는 염 구배 용리를 수행하였다. IEX 분석 결과는, 도 19에 도시된 바와 같이, OG1953 접합체(피크 P2)가 피크 P1에 도시된 바와 같이 미반응 유리 중합체(OG1802) 그리고 P3에 도시된 바와 같이 미반응 유리 단백질(OG1950)로부터 매우 잘 분리된 것을 나타낸다.
활성도 분석을 위한 OG1953 접합체의 규모 확대 정제: 접합 반응 D 및 E를 혼주시키고 접합체 피크(P2) 용리 분획을 수집하고 활성도 분석을 위하여 농축시킨 IEX로 더 분리시켰다.
실시예 12 - ELISA를 이용한 VEGFR에의 바이오틴 - VEGF 결합에 대한 항- VEGF 분자의 효과.
바이오틴-VEGF-165가 VEGFR에 결합하는 것을 저해하는 OG1950, OG1953 및 기타 항-VEGF 분자의 능력은 ELISA 검정에 대해 시험하였다. 96 웰 ELISA 플레이트를 1ug/㎖ 재조합 VEGF R1-Fc 단백질(R&D 시스템즈사, part# 321-FL-050)로 코팅하였다. 플레이트를 실온(RT)에서 하룻밤(o/n) 항온처리하였다. 이어서 플레이트를 세척하고 블로킹 완충액(1x PBS 중 1% BSA, pH7.4)으로 온화하게 진탕하면서 90분 이상 동안 블로킹시켰다. 시험 샘플의 3배 희석 계열을 만들었다. 400nM 샘플에서 시작하여 바이오틴-VEGF(R&D 시스템즈사, part # custom06)와 혼합하였다. 바이오틴-VEGF의 최종 농도는 4ng/㎖(100pM)였다. 샘플 희석 계열의 상부 농도는 85ug/㎖였다. 희석이 이루어진 후에, 샘플을 30분 이상 실온에서 항온처리하고 이어서 3회 세척하였다. 세척 후, 100㎕의 샘플/바이오틴-VEGF 혼합물을 각 웰로 옮겼다. 플레이트를 온화하게 진탕시키면서 실온에서 90분 이상 항온처리하였다. 항온처리 후에, 100㎕의 1:1500 희석된 SA-HRP(R&D 시스템즈사, part# A7906)를 각 웰에 첨가하였다. 항온처리된 플레이트는 대략 20분 동안 광으로부터 보호하였다. 이어서 플레이트를 3회 세척하였다. 세척 후 100㎕의 TMB 기질(R&D 시스템즈사, part #DY998)을 첨가하였다. 플레이트를 항온처리하고 대략 30분 동안 광으로부터 보호하였다. 발색을 모니터링하였다. 발색은 50㎕의 정지 용액으로 정지되었다. 플레이트는 450㎚에서 판독하였다. 결과는 도 20에 도시되어 있다.
이들 결과는 OG1953 항체/접합체가 상업적으로 입수 가능한 VEGF 저해제인 루센티스(등록상표)(라니비주맙) 및아바스틴(등록상표)(베바시주맙)뿐만 아니라 OG1950(미접합 항체)과 비교할 때 VEGFR에 결합하는 바이오틴-VEGF의 보다 높은 최대 저해를 달성한 것을 나타낸다. 전형적인 VEGF 리간드 VEGF 수용체 결합 검정에서, OG1953의 첨가는, VEGF 수용체에 대한 VEGF 리간드 결합의 97 내지 98% 저해를 초래한다. 이것은 OG1950을 첨가하는 것과 비교되며, 결과적으로 75 내지 87%의 VEGF 리간드/수용체 결합의 저해를 초래하고, 루센티스(등록상표)(라니비주맙) 또는 아바스틴(등록상표)(베바시주맙)을 첨가하면, 각각은 VEGF 리간드/수용체 결합의 68 내지 78% 저해를 초래하였다. 또한 이전의 연구는, 400nM의 농도에서의 OG1950, 루센티스(등록상표)(라니비주맙), 또는 아바스틴(등록상표)(베바시주맙)이 VEGF 수용체에 대한 VEGF 리간드의 결합의 100% 저해를 초래하지 못하는 것을 나타낸다.
도 20은 또한 다른 항체 접합체 항-VEGF 바이오접합체(항-VEGF BC)가 항체 단독(항-VEGF)과 비교할 때 VEGF 수용체에 대한 VEGF의 결합의 보다 높은 최대 저해가 달성된 것을 나타낸다. 종합하면, 이들 결과는 (i) 현재 입수 가능한 VEGF 저해제와 비교할 때 OG1953 항체 접합체가 VEGF 수용체에 대한 VEGF 리간드 결합을 저해하는데 더욱 효과적이고, (ii) 활성 부위의 영역 바깥쪽 부위에서 VEGF 항체를 접합시키는 것이 VEGF 수용체에 대한 VEGF 리간드 결합의 증가된 저해를 초래할 수 있는 것을 나타낸다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-VEGF 항체 단독에 비해서 우수한(적어도 동등한) 수준의 차단 능력을 나타내는 항-VEGF 항체 접합체가 본 명세서에서 제공된다.
실시예 13 - OG1950의 Fc 감마 수용체 I 및 IIIa에의 결합을 결정하는 방법
결합 반응속도 실험은 바이아코어 T200을 이용해서 25℃에서 수행되었다. 항-his 항체를 CM5 칩 상에 고정시켰다. HBS-EP 완충액(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 트윈(Tween)-20) 중에 제조된 0.5㎍/㎖의 농도에서의 히스티딘-태그된 FcγRI 및 FcγRIIIa를 독립적으로 활성 흐름 세포 단독에서 5㎕/분의 유량을 이용해서 60초 동안 주입하였다. 항체 후보 및 양성 대조군으로서 사용된 아바스틴(등록상표)(베바시주맙)을 이어서 참조 및 활성 흐름 세포 위에 30㎕/㎖에서 60초 주사하고 단일-주기 반응속도론 방법을 적용하였다. 0.48 내지 300nM 범위의 항체 농도가 FcγRI에 대해서 사용되었고, FcγRIIIa에 대해서 7.8nM 내지 2000nM 사용되었다. 각각의 시행 후, 흐름 세포를 50μ/㎖의 유량을 이용해서 10mM 글리신 pH 1.7의 60초 주사로 재생시켰다. 데이터는 기준 흐름 세포 및 블랭크 사이클 둘 다의 차감을 이용해서 이중으로 참조되었다. 분석은 바이아이벨류에이션 소프트웨어(BiaEvaluation software)를 이용해서 수행하였다. 결과는 도 22 및 도 23에 도시되어 있다. 결과는 OG1950가 이 검정에서 감마 수용체 I 및 IIIa 중 어느 한쪽에 유의한 결합을 보이지 않은 것을 나타낸다.
실시예 14 - OG1950의 인간 보체 단백질 C1q에의 결합을 결정하는 방법
보체 연결 경향은 C1q ELISA 결합에 의해 평가되었다. 항체 패널을 4℃에서 하룻밤 코팅을 위하여 1xPBS 중 10 ㎍/㎖의 상부 농도로부터 1:2로 적정하였다. 플레이트를 이어서 차단하였다. 1% BSA 중 2시간 차단 단계 후에. 이어서, 정제된 인간 C1q를 실온에서 2시간 동안 1% BSA 중에서 5 ㎍/㎖로 가하고 나서 HRP-접합된 항-인간 C1q 항체 및 TMB 발달에 의한 검출을 행하였다. 그 결과는 도 24에 도시되어 있다. 결과는 C1q가 10 ㎍/㎖ 내지 0.625 ㎍/㎖의 항체 농도에서 OG1950에 비해서 아바스틴(등록상표)(베바시주맙)에 대해 더 많은 결합 친화도를 갖는 것을 나타낸다.
몇몇 실시형태에 있어서, OG1950은 아바스틴의 것의 결합의 10% 미만을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, OG1950은 아바스틴(등록상표)(베바시주맙)보다 C1q에 더 적은 결합을 갖는다.
실시예 15 - VEGF 시뮬레이션된 HRMVEC 증식에 대한 항-VEGF제의 효과
인간 망막 미세혈관 내피세포(HuRMVEC) 증식 검정은 다음과 같이 수행하였다: 세포를 2%의 컬처부스트(CultureBoost)(셀 시스템즈사, #4CB-500) 및 0.2%의 Bac-off(셀 시스템즈사, #4ZO-643)가 보충된 CSC 완전 배지(셀 시스템즈사(Cell Systems), #4Zo-500)에 유지고, 웰당 10,000개 세포의 밀도에서 검정용 배지(5% FBS를 갖는 혈청 무함유 배지(셀 시스템즈사, #4Z3-500-S))에서 96-웰 플레이트에 파종하였다. VEGF 저해제를 먼저 각 웰에 표시된 농도에서 첨가하였다. 30분 후에, VEGF 165(R&D 시스템즈사, #293-VE-500/CF)을 1.3nM의 최종 농도로 첨가하였다. 3일 후에, 세포를 WST-1 세포 증식 검정 시약과 함께 항온처리하고 OD450nM에서 판독하였다.
결과는 OG1953(OG1953A 및 OG1953B)의 두 독립적인 단계 둘 다 HuRNVEC 증식에 대한 강력한 저해를 나타낸 것을 입증하였다. OG1953의 최대 저해 및 IC50 둘 다는 이 검정에서 OG1950 단독에서의 항체의 것과 견줄만한 것이다. 또한 OG1953의 최대 저해는 아바스틴(등록상표)(베바시주맙) 및 아일리아(등록상표)(아플리베르셉트)의 것보다 상당히 더 양호하다. 결과(IC50값 및 이들과 루센티스(등록상표)(라니비주맙), 아일리아(등록상표)(아플리베르셉트) 및 아바스틴(등록상표)(베바시주맙)의 비교를 포함함)는 도 25에 도시되어 있다.
실시예 16 - 25℃에서의 단백질 A 침 상에 포획된 항-VEGF제에 대한 VEGF 결합의 단일 주기 반응속도론( SCK)
결합 반응속도는 아바스틴(등록상표)(베바시주맙), OG1950 및 OG1953 상에 바이아코어 T200을 사용해서 25℃에서 수행되었다. 간략하게는, 항-VEGF제는 단백질 A 칩(GE) 상에 포획되었다. 1㎍/㎖ OG1950 및 아바스틴(등록상표)(베바시주맙)은 2분 동안 25 ㎕/분에서 흐르게 하였다. 10 ㎍/㎖의 OG1953은 10분 동안 10 ㎕/분에서 흐르게 하였다. VEGF(재조합체; R&D 시스템즈사)는 단일 주기 반응속도 동안 0.56nM, 1.67nM, 5nM, 15nM 및 45nM에서 각각 240초 접촉 시간 동안 포획된 항체 상에서 흐르게 하였고 30분 동안 해리시켰다. 분석은 바이아이벨류에이션 소프트웨어(BiaEvaluation software)(GE)를 이용해서 수행되었다. 모든 센서그램은 1:1 랭뮈어(Langmuir) 결합 모델을 이용해서 이중 기준 차감되었고 적합화되었다. 이들 항-VEGF제의 오프-레이트(off-rate)는 항-VEGF제와 단백질 포획 간의 해리로 인해 이 실험에서 과소평가될 수 있었다.
결과는 계산된 KD, ka, 및 kd 값을 비롯하여 도 26에 제시되어 있다.
실시예 17 - OG1802 중합체 유도 IgG1 석출의 방지를 위한 부형제 스크리닝 실험
표준 접합 반응 과정 셋업을 이용해서, OG1950 접합 반응 혼합물은 혼합 시 바로 존재하는 석출물로 흐린 것으로 판명되었다. 추가의 조사는 석출물이 단백질 자체인 것을 밝혔으며, 이어서 이것은 단백질이 접합 반응에 관여하는 대신에 석출에 의해 소실됨에 따라서 SDS-PAGE 또는 이온교환기 분석 중 어느 하나를 통해서 관찰된 불량한 접합 효율을 초래하였다.
하기를 포함하는 초기에 수행된 문제해결 실험은 흐린 반응 용액으로 되지 않는 조건을 밝혔다: (1) 10 초과 내지 5 미만의 중합체 몰 과잉비의 감소; (2) 표준 중성 pH 범위(예컨대, pH 6.5-7.5)에서 더욱 산성(예컨대, pH 5) 또는 염기성(예컨대, pH 8.5)으로 사전 조절; (3) OG1950에 비해서 유사한 또는 상이한 등전점(pI)을 갖는 다른 IgG1 단백질 샘플의 시험; (4) 샘플 저장 완충액을 1xPBS pH 7.4 또는 20mM Tris 완충액 pH 7.4, 100mM NaCl로의 완충액 교환; 및 (5) OG1802 용액을 20mM Tris 완충액 pH 7.4로 사전 조절.
단백질은 수성 용액 중의 단백질 용해도를 돕는 알짜 표면 전하를 보유하는 것으로 알려져 있다. 아미노산은 아르기닌, 라이신, 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하는 친수성 아미노산으로서 지칭된다. 중성 pH 7에서, 이들 아미노산의 곁사슬은 아르기닌 및 라이신에 대해서 양전하를 보유하고, 아스파르트산 및 글루탐산에 대해서 음전하를 보유한다. 용액 pH를 변화시키는 것은 내재성 단백질 용해도를 조절할 수 있고, 따라서 (2) 이 접근법과 같이 위에서 언급된 몇몇 문제해결 실험에 있어서 적용되었다. 이론상, 수성 용액 중의 단백질 용해도는 표면의 소수성 또는 친수성 특성의 수준에 따라 다르다. 보다 큰 소수성 특성을 지니는 표면을 갖는 단백질은 용이하게 석출될 것이다. 이온(예컨대, NaCl 또는 기타 염)의 첨가는 물 입자와 단백 간의 일부 활성도를 무효화하는 전자 차단 효과를 생성하여, 단백질이 서로 결합하여 응집되기 시작함에 따라서 용해도를 저감시킨다. 현재의 상황에서, 생체고분자가 단백질 석출을 초래하는 분자간 소수성 상호작용을 촉진시키는 방식으로 단백질 표면 전하 및/또는 노출된 표면을 직접 또는 간접적으로 조절하는 것이 가정되었다.
단백질 용해도를 조절하도록 결정된 부형제는 이하의 카테고리를 포함한다: (i) 중성 세정제(예컨대, 0.1 내지 1% 폴리솔베이트20 또는 트윈20) 또는 하전된 세정제(예컨대, 0.1 내지 1% 도데실황산나트륨(SDS))를 포함하는 제정제; (ii) 당(예컨대, 6% 트레할로스 또는 6% 수크로스); (iii) 음으로 하전된 아미노산(예컨대, 0.03 내지 1mM 글루탐산 또는 0.03 내지 1mM 아스파르트산) 또는 양으로 하전된 아미노산(예컨대, 1 내지 100mM 라이신 또는 아르기닌); (iv) 카오트로픽제(chaotropic agent) 또는 변성제(예컨대, 1 내지 100mM 유레아, 구아니딘 염산염 유사체 또는 1 내지 100mM 아르기닌) (v) 폴리에틸렌 글리콜(예컨대, 0.03 내지 1mM PEG8000); 및 (vi) 유기 용매(예컨대, 20% 에탄올).
실험(DOE) 연구의 추가의 설계에 있어서, 위에서 언급된 각 카테고리로부터의 각종 부형제는 인간 주사액 사용을 위한 약제 제조에 대한 그들의 적합성에 근거하여 선택되었다. 또한 4에서의 극도의 산성 pH 및 9에서의 염기성 pH가 또한 이러한 평가에 포함되었다. 석출 관찰을 복잡하게 하는 그러한 짝짓지 않은 시스테인 잔기의 잠재적인 간섭을 최소화하기 위하여 조작된 시스테인을 함유하지 않은 표준 IgG1 단백질 샘플이 그러한 평가에 선택되었다. 표 17.1은 이러한 행렬을 나타내었다. 음영진 코드/열은 맑은 용액으로 되는 조건인 반면, 음영 없는 열은 다양한 정도의 흐림 또는 석출을 초래하는 것이다.
표 17.1
Figure pct00056
얻어진 석출된 용액(또는 석출되지 않은 용액)이 도 28에 도시되어 있다.
위에서 또는 아래에서 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 기타 간행물, 수탁 번호 등은, 마치 각각 개별적인 항목이 참고로 편입되도록 구체적으로 개별적으로 나타낸 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위하여 이들의 전문이 참고로 편입된다. 서열의 상이한 버전이 상이한 시간에 수탁 번호와 연관되어 있다면, 본 출원의 유효한 출원일에 수탁 번호와 연관된 버전을 의미한다. 유효한 출원일은 적용 가능하다면 수탁 번호를 지칭하는 우선 출원의 출원일 또는 실제 출원일 중 빠른 것을 의미한다. 마찬가지로 간행물, 웹사이트 등의 상이한 버전이 상이한 시기에 간행된 경우, 달리 표시되지 않는 한 본 출원의 유효 출원인에 가장 근접하게 간행된 버전을 의미한다. 본 명세서에 개시된 임의의 특성, 단계, 요소, 실시형태 또는 양상은 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태가 명료함과 이해를 목적으로 예시 및 실시예로써 일부 상세히 기술되었지만, 소정의 변화 및 수정이 첨부된 청구범위의 범주 내에서 실시될 수 있음은 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> KODIAK SCIENCES INC. <120> ANTIBODIES AND CONJUGATES THEREOF <130> WO/2017/117464 <140> PCT/US2016/069336 <141> 2016-12-29 <150> US62/273177 <151> 2015-12-30 <160> 14 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-VEGF-A heavy chain <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 225 230 235 240 Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Cys Ser Pro Gly Lys 450 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-VEGF-A light chain <400> 2 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen binding protein components <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen binding protein components <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 5 <211> 231 <212> PRT <213> 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Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Leu 225 230 <210> 6 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen binding protein components <400> 6 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 7 <211> 235 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain <400> 7 atgaaagctg tggtgctggc cgtggctctg gtcttcctga cagggagcca ggctgaggtg 60 cagctggtgg aatccggcgg aggcctggtc cagcctggcg gatccctgag actgtcctgt 120 gccgcctccg gctacgactt cacccattac ggcatgaact gggtccgaca ggcccctggc 180 aagggcctgg aatgggtcgg atggatcaac acctacaccg gcgagcccac ctacg 235 <210> 8 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain <400> 8 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtggcaacag ctacaggcgt gcactccgac 60 atccagctga cccagtcccc ctccagcctg tccgcctctg tgggcgacag agtgaccatc 120 acctgttccg ccagccagga catctccaac tacctgaact ggtatcagca gaagcccggc 180 aaggccccca aggtgctgat ctacttcacc tcctccctgc actccggcgt gccctccaga 240 ttctccggct ctggctccgg caccgacttt accctgacca tctccagcct gcagcccgag 300 gacttcgcca cctactactg ccagcagtac tccaccgtgc cctggacctt cggccagggc 360 accaaggtgg aaatcaagcg gaccgtggcc gctccctccg tgttcatctt cccaccctcc 420 gacgagcagc tgaagtccgg aaccgcctcc gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 480 cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agagcggcaa ctcccaggaa 540 tccgtcaccg agcaggactc caaggacagc acctactccc tgtccagcac cctgaccctg 600 tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctc 660 agctccccag tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgct ag 702 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen binding protein components <400> 9 Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen binding protein components <400> 10 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys 1 5 10 15 Arg <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen binding protein components <400> 11 Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen binding protein components <400> 12 Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen binding protein components <400> 13 Phe Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen binding protein components <400> 14 Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr 1 5

Claims (121)

  1. 항체 접합체로서,
    (1) 항-VEGF-A 항체 및 (2) 포스포릴콜린 함유 중합체를 포함하되, 상기 중합체는 상기 항체의 가변 영역의 외측에 있는 시스테인에서 항체에 공유 결합되고, 상기 시스테인은 재조합 DNA 기술을 통해서 부가된, 항체 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-VEGF-A 항체는 경쇄와 중쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 Fc 영역을 포함하는, 항체 접합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 시스테인은 상기 중쇄의 상기 Fc 영역에 있는, 항체 접합체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항-VEGF-A　항체는 면역글로불린 G(IgG)인, 항체 접합체.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 항-VEGF-A 항체 중쇄는 CDRH1: GYDFTHYGMN(서열번호 9), CDRH2:　WINTYTGEPTYAADFKR(서열번호 10) 및 CDRH3: YPYYYGTSHWYFDV(서열번호 11)를 포함하고, 항-VEGF-경쇄는 CDRL1: SASQDISNYLN(서열번호 12), CDRL2: FTSSLHS(서열번호 13) 및 CDRL3: QQYSTVPWT(서열번호 14)를 포함하는, 항체 접합체.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 항-VEGF-중쇄의 아이소타입은 인간 IgG1인, 항체 접합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항-VEGF-A 항체의 중쇄 불변 영역은 효과기 기능을 조절하기 위하여 인간 IgG1의 불변 영역에 대하여 하나 이상의 돌연변이를 갖는, 항체 접합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 돌연변이는 다음의 아미노산 위치(EU 넘버링): E233X, L234X, L235X, G236X, G237X, A327X, A330X 및 P331X 중 하나 이상에 대한 것이며, X는 임의의 천연 또는 비천연 아미노산인, 항체 접합체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 돌연변이는 E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S 및 P331S(EU 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 접합체.
  10. 제9항에 있어서, 다음의 돌연변이: L234A, L235A 및 G237A(EU 넘버링)를 포함하는, 항체 접합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 시스테인은 상기 항-VEGF-A 항체 중쇄 내에 있고, Q347C(EU 넘버링) 또는 L443C(EU 넘버링)인, 항체 접합체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항-VEGF-A 항체 중쇄의 서열은 서열번호 1이고, 항-VEGF-경쇄의 서열은 서열번호 2인, 항체 접합체.
  13. 제11항에 있어서, 상기 시스테인은 L443C(EU 넘버링)인, 항체 접합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스포릴콜린 함유 중합체는 이하에 제시된 바와 같은 2-(메타크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트(MPC) 단량체를 포함하는, 항체 접합체:
    Figure pct00057
    .
  15. 제14항에 있어서, 상기 중합체는 3개 이상의 팔(arm)을 갖거나, 또는 3개 이상의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성되는, 항체 접합체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 팔을 갖거나 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성되는, 항체 접합체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 중합체는 2, 3, 6, 또는 9개의 팔을 갖거나, 또는 2, 3, 6, 또는 9 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성되는, 항체 접합체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 중합체는 9개의 팔을 갖거나, 또는 9개의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성되는, 항체 접합체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 중합체는 크기 배제 크로마토그래피-다중각 광산란(size exclusion chromatography - multi angle light scattering)(이하 "SEC-MALS")에 의해 측정된 바 약 300,000 내지 약 1,750,000 Da의 분자량을 갖는, 항체 접합체.
  20. 제19항에 있어서, 상기중합체는 약 500,000 내지 약 1,000,000 Da의 분자량을 갖는, 항체 접합체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 중합체는 약 750,000 내지 약 850,000 Da의 분자량을 갖는, 항체 접합체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된, 항체 접합체.
  23. 제22항에 있어서, 상기 중합체에 다분산된, 항체 접합체.
  24. 제23항에 있어서, 상기 중합체는 약 1.2 미만의 다분산도 값(polydispersity value: PDI)을 갖는, 항체 접합체.
  25. 중합체에 결합된 항-VEGF-A 면역글로불린 G(IgG)를 포함하는 항체 접합체로서,
    상기 중합체는 MPC 단량체를 포함하며, 항-VEGF-A 항체 중쇄의 서열이 서열번호 1이고, 항-VEGF-A 항체 경쇄의 서열이 서열번호 2이며, 상기 항체는 상기 중합체에 서열번호 1의 C449에서 결합되는, 항체 접합체.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 중합체는 9개의 팔을 갖고;
    상기 중합체는 약 600,000 내지 약 900,000　Da의 분자량을 갖는, 항체 접합체.
  27. 제25항에 있어서, 하기 구조를 갖는, 항체 접합체:
    Figure pct00058

    상기 구조 중,
    상기 항-VEGF-A 항체의 각각의 중쇄는 문자 H로 표시되고, 상기 항-VEGF-A 항체의 각각의 경쇄는 문자 L로 표시되며;
    상기 중합체는 C443(EU 넘버링)의 설피드릴을 통해서 상기 항-VEGF-A 항체에 결합되되, 상기 결합은 상기 중쇄 중 하나에 묘사되고;
    PC는
    Figure pct00059
    이되, 곡선은 상기 중합체에 대한 부착점을 나타내고, X는 a) OR(R=H, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필), b) H, 또는 c) Br을 포함하는 임의의 할라이드이며;
    n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 및 n9는 n1, n2, n3, n4, n5, n6, n6, n7, n8 및 n9의 합계가 2500 ± 15%가 되도록 동일 또는 상이하다.
  28. 액체 용액 중에 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항체 접합체를 포함하는 약제학적 조성물.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항체 접합체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  30. 중쇄와 경쇄를 포함하는 항-VEGF-A 항체로서,
    상기 중쇄는 CDRH1: GYDFTHYGMN(서열번호 9), CDRH2: WINTYTGEPTYAADFKR(서열번호 10) 및 CDRH3: YPYYYGTSHWYFDV(서열번호 11)를 포함하고, 상기 경쇄는 CDRL1: SASQDISNYLN(서열번호 12), CDRL2: FTSSLHS(서열번호 13) 및 CDRL3: QQYSTVPWT(서열번호 14)를 포함하며;
    중쇄 아이소타입은 IgG1이되, IgG1 불변 영역은 효과기 기능을 조절하기 위하여 이하의 돌연변이(EU 넘버링): E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S 및 P331S 중 하나 이상을 포함하는, 항-VEGF-A 항체.
  31. 제30항에 있어서, 이하의 돌연변이(EU 넘버링): L234A, L235A 및 G237A를 포함하는 항-VEGF-A 항체.
  32. 제30항에 있어서, 상기 항-VEGF-중쇄이 서열이 서열번호 1이고, 상기 항-VEGF-경쇄의 서열이 서열번호 2인 항-VEGF-A 항체.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, IgG인 항-VEGF-A 항체.
  34. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 항체 접합체, 또는 제28항 또는 제29항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 안질환(ocular disease)의 치료 또는 예방 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 안질환은 당뇨병성 망막병증, 맥락막 혈관신생(CNV), 연령관련 황반변성(AMD), 당뇨병성 황반부종(DME), 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병(von Hippel-Lindau disease), 눈의 히스토플라스마증, 중심성 망막 정맥 폐쇄(CRVO), 분지된 중심성 망막 정맥 폐쇄(BRVO), 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 미숙아 망막병증(ROP), 결막하 출혈 및 고혈압성 망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 안질환의 치료 또는 예방 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 질환은 당뇨병성 망막병증인, 안질환의 치료 또는 예방 방법.
  37. 포스포릴콜린 함유 중합체에 접합된 항-VEGF-A 항체를 포함하는 항체 접합체의 제조 방법으로서,
    항-VEGF-A 항체를 포스포릴콜린 함유 중합체에 접합시키는 단계를 포함하되;
    상기 항-VEGF-A 항체는 재조합 DNA 기술을 통해서 부가된 시스테인 잔기를 포함하고, 상기 시스테인은 상기 항체의 가변 영역의 외측에 있으며;
    상기 포스포릴콜린 함유 중합체는 말레이미드, 비닐설폰, 오쏘피리딜-다이설파이드 및 아이오도아세트아마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 설피드릴 특이적 반응기를 포함하고;
    상기 포스포릴콜린 함유 중합체 상의 상기 설피드릴 특이적 반응기는 상기 항-VEGF-A 항체 상의 상기 시스테인 잔기와 반응하여 상기 항체 접합체를 형성시키는, 항체 접합체의 제조 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 항-VEGF-A　항체는 면역글로불린 G(IgG)이고, 상기 시스테인은 상기 항체의 상기 Fc 영역에 있는, 항체 접합체의 제조 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 항-VEGF-A 항체는 경쇄와 중쇄를 포함하되, 상기 항-VEGF-A 항체 중쇄는 CDRH1: GYDFTHYGMN(서열번호 9), CDRH2: WINTYTGEPTYAADFKR(서열번호 10) 및 CDRH3: YPYYYGTSHWYFDV(서열번호 11)를 포함하고, 상기 항-VEGF-A 항체 경쇄는 CDRL1: SASQDISNYLN(서열번호 12), CDRL2: FTSSLHS(서열번호 13) 및 CDRL3: QQYSTVPWT(서열번호 14)를 포함하는, 항체 접합체의 제조 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 항-VEGF-A 항체 중쇄 아이소타입은 IgG1인, 항체 접합체의 제조 방법.
  41. 제40항에 있어서, 항-VEGF-A 항체 불변 영역은 효과기 기능을 조절하기 위하여 IgG1 불변 영역에 대해서 하나 이상의 돌연변이를 갖는, 항체 접합체의 제조 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 돌연변이는 이하의 아미노산 위치(EU 넘버링): E233X, L234X, L235X, G236X, G237X, G236X, D270X, K322X, A327X, P329X, A330X, A330X, P331X 및 P331X 중 하나 이상에 대한 것이되, X는 임의의 천연 또는 비천연 아미노산인, 항체 접합체의 제조 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 돌연변이는 E233P, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S 및 P331S(EU 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 접합체의 제조 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 돌연변이는 L234A, L235A 및 G237A(EU 넘버링)인, 항체 접합체의 제조 방법.
  45. 제44항에 있어서, 재조합 DNA 기술에 의해 부가된 상기 시스테인 잔기는 Q347C(EU 넘버링) 및 L443C(EU 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 접합체의 제조 방법.
  46. 제45항에 있어서, 재조합 DNA 기술에 의해 부가된 상기 시스테인 잔기는 L443C(EU 넘버링)인, 항체 접합체의 제조 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 항-VEGF-A 항체 중쇄의 서열은 서열번호 1이고, 항-VEGF-A 항체 경쇄의 서열은 서열번호 2인, 항체 접합체의 제조 방법.
  48. 제37항에 있어서, 상기 설피드릴 특이적 반응기는 말레이미드인, 항체 접합체의 제조 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 포스포릴콜린 함유 중합체는 이하게 제시된 바와 같은 2-(메타크릴로일옥시에틸)-2'-(트라이메틸암모늄)에틸 포스페이트(MPC) 단량체를 포함하는, 항체 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00060
    .
  50. 제49항에 있어서, 상기 중합체는 3개 이상의 팔을 갖거나, 또는 3개의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성되는, 항체 접합체의 제조 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 중합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 팔을 갖거나, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성되는, 항체 접합체의 제조 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 중합체는 2, 3, 6 또는 9개의 팔을 갖거나, 또는 2, 3, 6 또는 9개의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성되는, 항체 접합체의 제조 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 중합체는 9개의 팔을 갖거나, 또는 9개의 중합체 개시 부위를 갖는 개시제로 합성되는, 항체 접합체의 제조 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 중합체는 약 300,000 내지 1,750,000 Da의 분자량을 갖는, 항체 접합체의 제조 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 중합체는 약 600,000 내지 1,000,000 Da의 분자량을 갖는, 항체 접합체의 제조 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 중합체는 약 600,000 내지 850,000 Da의 분자량을 갖는, 항체 접합체의 제조 방법.
  57. 제37항에 있어서, 환원된 시스테인 설피드릴기를 생성하는 조건 하에서 상기 항-VEGF-A 항체를 티올 환원제와 접촉시켜, 모든 시스테인 잔기가 환원되어 있는 환원된 항-VEGF-A 항체를 제공하는 단계를 더 포함하는, 항체 접합체의 제조 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 티올 환원제는 트리스[2-카복시에틸]포스핀 염산염(TCEP), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 수소화붕소나트륨(NaBH4), 수소화사이아노붕소나트륨(NaCNBH3), β-머캅토에탄올(BME), 시스테인 염산염 및 시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 접합체의 제조 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 티올 환원제는 TCEP인, 항체 접합체의 제조 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 티올 환원제의 농도는 상기 항-VEGF-A 항체의 농도에 비해서 1 내지 100배 몰 과잉인, 항체 접합체의 제조 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 티올 환원제의 농도는 상기 항-VEGF-A 항체의 농도에 비해서 20 내지 50배 몰 과잉인, 항체 접합체의 제조 방법.
  62. 제60항에 있어서, 환원된 항-VEGF-A 항체로부터 상기 티올 환원제를 제거하는 단계, 및 상기 환원된 항-VEGF-A 항체를 산화제로 처리하는 단계를 더 포함하는, 항체 접합체의 제조 방법.
  63. 제61항에 있어서, 상기 산화제는 공기, 수성 CuSO4, 또는 데하이드로아스코르브산(DHAA)인, 항체 접합체의 제조 방법.
  64. 제37항에 있어서, 상기 항체 접합체를 정제시키는 단계를 더 포함하는, 항체 접합체의 제조 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 항체 접합체는 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 수법을 이용해서 정제되는, 항체 접합체의 제조 방법.
  66. 제65항에 있어서, 정제된 항체 접합체는 미접합 항-VEGF-A 항체에 비해서 적어도 20%의 생물학적 활성도를 보유하는, 항체 접합체의 제조 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 정제된 항체 접합체는 미접합 항-VEGF-A 항체에 비해서 적어도 50%의 생물학적 활성도를 보유하는, 항체 접합체의 제조 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 정제된 항체 접합체는 미접합 항-VEGF-A 항체에 비해서 적어도 90%의 생물학적 활성도를 보유하는, 항체 접합체의 제조 방법.
  69. 제66항에 있어서, 상기 정제된 항체 접합체는 미접합 항-VEGF-A 항체에 비해서 증가된 반감기를 갖는, 항체 접합체의 제조 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 정제된 항체 접합체는 미접합 항-VEGF-A 항체에 비해서 적어도 1.5배의 반감기 증가를 갖는, 항체 접합체의 제조 방법.
  71. 제37항에 있어서, 상기 방법은 중합 매질 중에서 유리 라디칼 중합성 포스포릴콜린 함유 단량체를 중합시켜 포스포릴콜린 함유 중합체를 제공하는 단계를 더 포함하되, 상기 매질은,
    상기 라디칼 중합성 포스포릴콜린 함유 단량체;
    전이금속 촉매 Mt (q-1)+로서, Mt는 전이금속이고, q는 상기 금속의 최대 산화 상태이며 q-1은 상기 금속의 산화 상태이고, 상기 금속은 촉매로서 작용할 수 있으며, 상기 전이금속 촉매는 Mt(q-1)+X'( q-1) 형태의 염(X'은 반대 이온 또는 기임)으로서 공급되거나, 또는 상기 전이금속 촉매는 상기 전이금속을 산화된 비활성 상태로부터 환원된 활성 상태로 환원 가능한 환원제와 함께 비활성 금속염을 최고 산화 상태 Mt q+X'q에서 제공함으로써 동소(in situ)에서 공급되는, 상기 전이금속 촉매;
    리간드; 및
    개시제를 포함하는, 항체 접합체의 제조 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 라디칼 중합성 포스포릴콜린 함유 단량체는
    Figure pct00061
    이되,
    R1은 H 또는 C1-6 알킬이고;
    R2, R3, R4는 각각 메틸이며; 그리고
    X 및 Y는 각각 2인, 항체 접합체의 제조 방법.
  73. 제72항에 있어서, Mt는 Cu, Fe, Ru, Cr, Mo, W, Mn, Rh, Re, Co, V, Zn, Au 및 Ag로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 접합체의 제조 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 금속 촉매는 Mt(q-1)+X'( q-1) 형태의 염으로서 공급되는, 항체 접합체의 제조 방법.
  75. 제74항에 있어서, Mt (q-1)+는 Cu1 +, Fe2 +, Ru2 +, Cr2 +, Mo2 +, W2+, Mn3 +, Rh3 +, Re2 +, Co+, V2+, Zn+, Au+ 및 Ag+로 이루어진 군으로부터 선택되고, X'은 할로겐, C1-6 알콕시, (SO4)1/2, (PO4)1/3, (R7PO4)1/2, (R72PO4), 트라이플레이트, 헥사플루오로포스페이트, 메탄설포네이트, 아릴설포네이트, CN 및 R7CO2로 이루어진 군으로부터 선택되되, R7은 H, 또는 할로겐으로 1 내지 5회 치환될 수 있는 직쇄형 또는 분지쇄형 C1-6 알킬기인, 항체 접합체의 제조 방법.
  76. 제75항에 있어서, Mt (q-1)+는 Cu1 +이고, X'는 Br인, 항체 접합체의 제조 방법.
  77. 제72항에 있어서, Mt (q-1)+는 동소에서 공급되는, 항체 접합체의 제조 방법.
  78. 제77항에 있어서, Mt q +Xq는 CuBr2인, 항체 접합체의 제조 방법.
  79. 제72항에 있어서, 상기 환원제는 무기 화합물인, 항체 접합체의 제조 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 무기 화합물은 낮은 산화 수준의 황 화합물, 아황산수소나트륨, 금속 이온을 포함하는 무기염, 금속, 하이드라진 수화물, 및 이러한 화합물의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 접합체의 제조 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 환원제는 금속인, 항체 접합체의 제조 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 환원제는 Cu0인, 항체 접합체의 제조 방법.
  83. 제72항에 있어서, 상기 환원제는 화합물인, 항체 접합체의 제조 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 유기 화합물은 알킬티올, 머캅토에탄올, 또는 용이하게 에놀화될 수 있는 카보닐 화합물, 아스코르브산, 아세틸 아세토네이트, 캄포설폰산, 하이드록시 아세톤, 환원당, 단당류, 글루코스, 알데하이드, 및 이러한 유기 화합물의 유도체. 로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 접합체의 제조 방법.
  85. 제72항에 있어서, 상기 리간드는 2,2'-바이피리딘, 4,4'-다이-5-노닐-2,2'-바이피리딘, 4,4-다이노닐-2,2'-다이피리딜, 4,4',4''-트리스(5-노닐)-2,2':6',2''-터피리딘, N,N,N',N',N''-펜타메틸다이에틸렌트라이아민, 1,1,4,7,10,10-헥사메틸트라이에틸렌테트라민, 트리스(2-다이메틸아미노에틸)아민, N,N-비스(2-피리딜메틸)옥타데실아민, N,N,N',N'-테트라[(2-피리달)메틸]에틸렌다이아민, 트리스[(2-피리딜)메틸]아민, 트리스(2-아미노에틸)아민, 트리스(2-비스(3-부톡시-3-옥소프로필)아미노에틸)아민, 트리스(2-비스(3-(2-에틸헥속시)-3-옥소프로필)아미노에틸)아민 및 트리스(2-비스(3-도데콕시-3-옥소프로필)아미노에틸)아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 접합체의 제조 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 리간드는 2,2'-바이피리딘인, 항체 접합체의 제조 방법.
  87. 제72항에 있어서, 상기 개시제는 하기 구조를 갖는, 항체 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00062

    상기 구조 중, R1은 친핵성 반응성 기이고, R2는 링커를 포함하며, R3은 하기 구조를 갖는 중합체 합성 개시제 모이어티를 포함하고:
    Figure pct00063

    R4 및 R5는 동일하거나 또는 상이하고, 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌, 알콕시, 카복시알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 환식 알킬 에터, 알켄일, 알켄일렌, 알킨일, 알킨일렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴, 아릴렌, 아릴렌-옥시, 헤테로아릴, 아미노, 아미도, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    Z는 할로겐 또는 CN이고; 그리고 s는 1 내지 20의 정수이다.
  88. 제87항에 있어서, Z는 Br이고, R4 및 R5는 각각 메틸인, 항체 접합체의 제조 방법.
  89. 제88항에 있어서, R1은 NH2-, OH- 및 SH-로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 접합체의 제조 방법.
  90. 제89항에 있어서, R1은 NH2-인, 항체 접합체의 제조 방법.
  91. 제90항에 있어서, R2는 알킬, 치환된 알킬, 알킬렌, 알콕시, 카복시알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 환식 알킬 에터, 알켄일, 알켄일렌, 알킨일, 알킨일렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴, 아릴렌, 아릴렌-옥시, 헤테로아릴, 아미노, 아미도, 및 이들의 임의의 조합인, 항체 접합체의 제조 방법.
  92. 제91항에 있어서, R2는
    Figure pct00064
    이되,
    X 및 Y는 동일하거나 또는 상이하고, 1 내지 20의 정수인, 항체 접합체의 제조 방법.
  93. 제92항에 있어서, X 및 Y는 각각 4인, 항체 접합체의 제조 방법.
  94. 제93항에 있어서, R3은
    Figure pct00065
    를 더 포함하되,
    R6, R7 및 R8은 동일하거나 또는 상이하고,
    Figure pct00066

    Figure pct00067
    및
    Figure pct00068
    로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    Z는 NCS, F, Cl, Br 또는 I인, 항체 접합체의 제조 방법.
  95. 제94항에 있어서, Z는 Br인, 항체 접합체의 제조 방법.
  96. 제94항에 있어서, R6, R7 및 R8은 각각
    Figure pct00069
    인, 항체 접합체의 제조 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 개시제는 하기 구조를 갖는, 항체 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00070

    상기 구조 중, A 및 B는 동일 또는 상이하고 2 내지 12의 정수이며, Z는 Br이다.
  98. 제97항에 있어서, A 및 B는 각각 4인, 항체 접합체의 제조 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 중합체를 말레이미드 시약과 반응시켜 말단 말레이미드를 갖는 중합체를 제공하는 단계를 더 포함하는, 항체 접합체의 제조 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 말레이미드 화합물은
    Figure pct00071
    인, 항체 접합체의 제조 방법.
  101. 항체로서,
    서열번호 1을 포함하는 중쇄 아미노산 가변 영역; 및
    서열번호 2를 포함하는 경쇄 아미노산 가변 영역을 포함하는, 항체.
  102. 제101항에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG1이고, 중쇄 불변 영역은 면역-매개 효과기 기능을 저감시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 항체.
  103. 제101항에 있어서, 상기 항체는 중합체에 더 접합되어 바이오접합체를 형성하되, 상기 바이오접합체는 약 350,000 내지 1,900,000 돌턴의 분자량을 갖는, 항체.
  104. 제103항에 있어서, 다분산지수(PolyDispersity Index: PDI)가 1.5 이하인, 항체.
  105. VEGF-A에 결합하는 항체로서,
    서열번호 1의 CDRH1인 상기 CDRH1;
    서열번호 1의 CDRH2인 상기 CDRH2;
    서열번호 1의 CDRH3인 상기 CDRH3;
    서열번호 2의 CDRL1인 상기 CDRL1;
    서열번호 2의 CDRL2인 상기 CDRL2;
    서열번호 2의 CDRL3인 상기 CDRL3;
    하기 돌연변이(EU 넘버링): L234A, L235A 및 G237중 적어도 하나; 및
    하기 돌연변이(EU 넘버링): Q347C 또는 L443C 중 적어도 하나
    를 포함하는, 항체.
  106. 제105항에 있어서, 상기 항체는 L234A, L235A 및 G237A의 3개 모두의 돌연변이(EU 넘버링)를 포함하고, 상기 항체는 L443C(EU 넘버링)를 포함하는, 항체.
  107. 접합된 단백질의 제조 방법으로서,
    단백질 내 1개 이상의 시스테인을 환원시켜 용액 중 캡 제거된(decapped) 단백질을 형성시키는 단계;
    상기 단백질 내 조작된 시스테인 잔기가 유리 티올 형태로 남아서 용액 중 재산화된 캡 제거된 단백질을 형성시키는 것을 확인하면서 상기 캡 제거된 단백질을 재산화시켜 환원된 단백질 내 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 복원시키는 단계;
    상기 용액에 적어도 1종의 부형제를 첨가하는 단계로서, 상기 부형제는 중합체 유도 단백질 석출물을 환원시키는, 상기 부형제를 첨가하는 단계;
    상기 용액에 중합체를 첨가하는 단계; 및
    상기 조작된 시스테인 잔기에서 상기 재산화된 캡 제거된 단백질에 상기 중합체를 접합시키는 단계를 포함하는, 접합된 단백질의 제조 방법.
  108. 제107항에 있어서, 상기 단백질은 항체, 항체 단백질 융합체 또는 이의 결합 단편인, 접합된 단백질의 제조 방법.
  109. 제108항에 있어서, 상기 부형제는 산 또는 염기인, 접합된 단백질의 제조 방법.
  110. 제109항에 있어서, 상기 부형제는 세정제, 당 및 하전된 아미노산 중 적어도 1종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합된 단백질의 제조 방법.
  111. 제107항에 있어서, 중합체와 상기 환원된 단백질과의 반응은 pH 6.0 내지 pH 8.5의 수성 조건 하에서 일어나는, 접합된 단백질의 제조 방법.
  112. 제107항에 있어서, 상기 환원된 단백질의 양은 상기 중합체의 양보다 작은, 접합된 단백질의 제조 방법.
  113. 제107항에 있어서, 상기 중합체는 2 내지 37℃에서 상기 단백질에 접합되는, 접합된 단백질의 제조 방법.
  114. 제107항에 있어서, 상기 접합된 단백질을 포함하는 용액을 이온교환 매질 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피 매질에 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 접합된 단백질의 제조 방법.
  115. 제114항에 있어서, 상기 이온교환 매질 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피 매질은 상기 유리 중합체로부터 그리고 상기 재산화된 캡 제거된 단백질로부터 상기 접합된 단백질을 분리시키는, 접합된 단백질의 제조 방법.
  116. 제107항에 있어서, 상기 중합체는 양쪽성 이온(zwitterion)을 포함하는, 접합된 단백질의 제조 방법.
  117. 제107항에 있어서, 상기 중합체는 포스포릴콜린을 포함하는, 접합된 단백질의 제조 방법.
  118. 제107항에 있어서, 상기 중합체는 말레이미드 작용기에 대한 중합체 분지점의 중심을 가교시키는 PEG 링커를 포함하는, 접합된 단백질의 제조 방법.
  119. VEGF 리간드와 VEGF-수용체의 상호작용의 적어도 90%를 차단 가능한 항-VEGF 항체 접합체.
  120. VEGF 리간드와 VEGF-수용체의 상호작용의 적어도 95%를 차단하는 항-VEGF 항체.
  121. VEGF 리간드와 VEGF-수용체의 상호작용의 적어도 90%를 차단하는 항-VEGF 항체.
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