ES2606627T3 - Anticuerpos específicos anti-CD160 para el tratamiento de trastornos oculares basados en la neoangiogénesis - Google Patents

Abstract

Anticuerpo anti-CD160 y anticuerpo anti-VEGF como una preparación combinada para la utilización simultánea, separada o secuencial para tratar y/o prevenir las enfermedades oculares neovasculares.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Anticuerpos especfficos anti-CD160 para el tratamiento de trastornos oculares basados en la neoangiogenesis.

La presente invencion se refiere a la utilizacion de por lo menos un anticuerpo anti-CD160, preferentemente un compuesto seleccionado de entre los anticuerpos monoclonales CL1-R2 (que pueden obtenerse mediante el hibridoma CNCM I-3204), fragmentos conservadores de los mismos y derivados conservadores de los mismos, para el tratamiento y/o prevencion de enfermedades oculares neovasculares.

La angiogenesis ocular, una causa principal de perdida de vision en todo el mundo, se produce en dos compartimientos principales del ojo: la retina y la cornea.

Las enfermedades retinianas que implican una neovasculatura anormal presentan una incidencia creciente, tanto en pafses ricos como pobres. En los pafses ricos, las retinopatfas diabeticas, la retinopatfa del prematuro y la degeneracion macular senil (DMAE) complicadas por neovasos anormales constituyen una enorme carga economica, asf como las dos causas principales de baja vision y ceguera legal en todo el mundo.

Las neovascularizaciones corneales anormales que complican las infecciones corneales o los injertos corneales (realizados en pacientes afectados por distrofias corneales hereditarias o por insultos ambientales) tambien constituyen una importante carga para la salud publica tanto en terminos de costes de tratamiento como en terminos de correcta integracion de los pacientes afectados en la fuerza laboral y en la red social normal. El tamano del mercado para la degeneracion macular senil y la retinopatfa diabetica es enorme. Aunque importante en terminos de mercado competitivo, con estudios de investigacion en constante desarrollo, las neovascularizaciones corneales patologicas tambien corresponden a un conjunto crucial de enfermedades que impiden el mantenimiento de un injerto corneal transparente o incluso eliminan la posibilidad de realizar un injerto corneal.

La patogenesis de la neovascularizacion retiniana es compleja y sigue sin entenderse por completo. La investigacion actualmente se centra en los efectos de la hipoxia, la inflamacion y la maduracion en enfermedades vasculares tales como la DMAE.

Dicha enfermedad esta marcada por un declive de la vision, una distorsion de la imagen y la incapacidad para leer debido a un escotoma. Se diagnostica en parte por la formacion de nuevos vasos sangufneos, que aparecen con independencia de la forma de la enfermedad (atrofica o humeda).

No existe tratamiento actualmente para la DMAE, curativo o preventivo, de forma atrofica. En los ultimos anos se ha utilizado ampliamente la terapia de anticuerpos monoclonales humanizados anti-VEGF (bevacizumab (Avastin®) o ranibizumab (Lucentis®)) para prevenir o inhibir la forma neovascular de la DMAE y las retinopatfas diabeticas edematosas. Sin embargo, la eficiencia esta limitada a la DMAE humeda y esta terapia no se ha utilizado todavfa para bloquear las diversas neovascularizaciones corneales patologicas. Ademas, debido a que el VEGF no es el unico factor proangiogenico, se preve que aparezcan resistencias.

Ademas, aparecen muchos efectos secundarios no deseables durante el tratamiento, en particular con el ranibizumab. El tratamiento con ranibizumab en efecto induce hemorragia conjuntival, dolor ocular, presion intraocular incrementada, inflamacion del iris o uveitis y vision borrosa. Aproximadamente el 10% de las formas de DMAE humeda no son receptivas (o lo son solo debilmente) a los tratamientos de Avastin® o Lucentis®. Con el fin de obtener un resultado estable en los numerosos pacientes afectados por la forma humeda de DMAE, estos pacientes pueden ser tratados con hasta 24 inyecciones intravftreas de Avastin® o Lucentis® durante 2 anos, incrementando el riesgo de efectos perjudiciales.

Por lo tanto, existe una necesidad de agentes terapeuticos eficaces en el tratamiento de las enfermedades oculares neovasculares que presenten menos efectos secundarios.

Los documentos siguientes se refieren a la inhibicion de la angiogenesis por algunos anticuerpos. P. Fons et al., Blood 108(8):2608-2615, 2006, da a conocer la inhibicion de la angiogenesis in vivo en un modelo de neovascularizacion corneal en el conejo e induce apoptosis de las celulas endoteliales mediante la union a CD160. El documento n° WO2006/015886A1 da a conocer que sHLA-G1 y mAb CL1-R2 se unen a CD160, inhiben la angiogenesis e inducen la apoptosis de las celulas endoteliales. El documento n° EP 2 186 529 A2 da a conocer la inhibicion de la neovascularizacion corneal y retiniana mediante una combinacion de bevacizumab y suramina.

Por lo tanto, la invencion se refiere a la utilizacion de por lo menos un anticuerpo anti-CD160, preferentemente un compuesto seleccionado de entre el anticuerpo monoclonal CL1-R2 (que puede obtenerse con el hibridoma CNCM I-3204), sus fragmentos conservadores y sus derivados conservadores y un anticuerpo anti-VEGF, para la preparacion de un farmaco destinado al tratamiento y/o prevencion de enfermedades oculares neovasculares.

La invencion se refiere a por lo menos un anticuerpo anti-CD160, preferentemente a por lo menos un anticuerpo anti-CD160 que induce la muerte celular de celulas endoteliales proliferantes activadas, para la utilizacion en el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

tratamiento y/o la prevencion de enfermedades oculares neovasculares.

La invencion se refiere ademas a un compuesto seleccionado de entre el anticuerpo monoclonal CL1-R2 (que puede obtenerse con el hibridoma CNCM I-3204), sus fragmentos conservadores y sus derivados conservadores, para la utilizacion en el tratamiento y/o prevencion de enfermedades oculares neovasculares.

Preferentemente, dicho anticuerpo o anticuerpos anti-CD160 induce la muerte celular de las celulas endoteliales proliferantes activadas.

Mas especfficamente, la invencion se refiere a un anticuerpo anti-CD160 y a un anticuerpo anti-VEGF en forma de una preparacion combinada para la utilizacion simultanea, separada o secuencial para el tratamiento y/o prevencion de enfermedades oculares neovasculares.

La combinacion de un anticuerpo anti-CD160 y un anticuerpo anti-VEGF mejora la probabilidad de exito de una estrategia terapeutica para el tratamiento las enfermedades oculares neovasculares ya que el anticuerpo anti-CD160 y los anticuerpos anti-VEGF actuan sobre dianas y rutas biologicas diferentes.

Asimismo, la invencion se refiere a por lo menos un anticuerpo anti-CD160 y a un anticuerpo anti-VEGF para la utilizacion en el tratamiento y/o prevencion de enfermedades oculares neovasculares en un sujeto que no responde al tratamiento anti-VEGF.

La presente invencion se refiere ademas a un metodo para el tratamiento de una enfermedad ocular neovascular en un sujeto, preferentemente un ser humano, en el que se administra en dicho sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD160, preferentemente CL1-R2, un fragmento conservador del mismo o un derivado conservador del mismo y de un anticuerpo anti-VEGF en dicho sujeto.

La expresion "anticuerpo de CD160" o "anticuerpo anti-CD160" se refiere a cualquier anticuerpo que se une a CD160 humana. De esta manera, esta expresion se refiere a moleculas de inmunoglobulina y a partes inmunitariamente activas de moleculas de inmunoglobulina dirigidas contra CD160, es decir, moleculas, incluyendo peptidos, que contienen un sitio de union a antfgeno que se une inmunoespecfficamente a CD160. De esta manera, el termino anticuerpo se refiere no solo a las moleculas de anticuerpo completas, sino tambien a fragmentos de anticuerpo, asf como a variantes (incluyendo derivados) de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. Para cumplir con el proposito de la invencion, varios anticuerpos anti-CD160, dirigidos contra epftopos diferentes de CD160, pueden utilizarse secuencial o simultaneamente. El anticuerpo anti-CD160 segun la invencion puede ser un compuesto seleccionado de entre anticuerpos monoclonales anti-CD160, sus fragmentos conservadores y sus derivados conservadores.

En el contexto de la presente invencion, dicho anticuerpo anti-CD160 induce la muerte celular de celulas endoteliales proliferantes activadas y no actua directamente sobre el VEGF. Dicho anticuerpo anti-CD160 puede seleccionarse de entre CL1-R2, sus fragmentos conservadores y sus derivados conservadores.

El anticuerpo monoclonal CL1-R2 puede obtenerse a partir de la lfnea de hibridoma depositada en el National Collection of Cultures of Microorganisms CNCM Institut Pasteur de acuerdo con el Tratado de Budapest de 28 de abril de 2004 (Institute Pasteur CNCM, 25 rue du Docteur Roux F-75724 Paris Cedex 15, Francia). El hibridoma depositado presenta el numero de deposito CNCM I-3204.

La CD160 pertenece a la familia de las inmunoglobulinas. El ADNc del CD160 humano corresponde a SEC ID n° 1 (1361 pb) descrito en el documento n° WO 98/21240 (Dana-Farber Cancer Institute).

El ARNm del CD160 humano se encuentra disponible de GenBank bajo el numero de acceso AF060981; el ARNm de CD160 murino se encuentra disponible de GenBank bajo el numero de acceso AF060982.

La secuencia de la protefna CD160 humana corresponde a SEC ID n° 2 descrita en el documento n° WO 98/21240 y se encuentra disponible bajo el numero de acceso en GenBank AAC72302 (181 aminoacidos).

La CD160 es una glucoprotefna de 27 kDa, que se encuentra presente particularmente en la superficie de las celulas endoteliales.

La diana de CL1-R2, es decir, el receptor de CD160, es expresado por celulas endoteliales proliferantes activadas, pero no por celulas endoteliales quiescentes. Las celulas endoteliales proliferantes activadas son responsables de la formacion de neovasos, y particularmente de los neovasos presentes en las enfermedades oculares.

El CL1-R2 presenta un mecanismo de accion diferente de Avastin® o Lucentis®: induce la muerte celular de las celulas endoteliales proliferantes activadas unicamente y no actua directamente sobre el VEGF. Tambien presenta una especificidad muy elevada para los neovasos angiogenicos. De esta manera, el anticuerpo inesperadamente ofrece un buen potencial terapeutico para los pacientes que no responden al tratamiento anti-VEGF. Por lo tanto, los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

inventores han satisfecho la necesidad de desarrollo de una estrategia altamente prometedora para el tratamiento de enfermedades oculares neovasculares en un sujeto que sufre de enfermedades oculares neovasculares que no pueden ser tratadas mediante el tratamiento anti-VEGF.

De esta manera, la invencion se refiere ademas a por lo menos un anticuerpo anti-CD160 y a un anticuerpo anti- VEGF para la utilizacion en el tratamiento y/o prevencion de enfermedades oculares neovasculares en un sujeto que no responde al tratamiento anti-VEGF.

Preferentemente, dicho anticuerpo anti-CD160 induce la muerte celular de las celulas endoteliales proliferantes activadas.

Preferentemente, dicho anticuerpo anti-CD160 se selecciona de entre el anticuerpo monoclonal CL1-R2 (que puede obtenerse con el hibridoma CNCM I-3204), sus fragmentos conservadores y sus derivados conservadores.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "sujeto que no responde al tratamiento anti-VEGF" se aplica a un sujeto que es no respondedor a dicho anticuerpo anti-VEGF. La expresion "no respondedor" se refiere a que el sujeto no recupera, mejora o estabiliza su condicion con el anticuerpo anti-VEGF. Por ejemplo, un sujeto que no responde al tratamiento anti-VEGF es un sujeto que ha sido tratado sin exito con el anticuerpo anti-VEGF o un sujeto que es conocido que no ha podido responder con exito a un tratamiento basado en el anticuerpo anti-VEGF. Mediante la provision de una nueva estrategia de tratamiento de un sujeto que sufre de una enfermedad ocular neovascular y que es que no responde al tratamiento anti-VEGF, la invencion satisface esta antigua necesidad.

Dicho anticuerpo tambien puede reconocer un epftopo que es comun a muchas especies, tales como el ser humano, el conejo, el raton y el mono macaco; ello permite la facil experimentacion animal.

Segun la invencion, CL1-R2 o un fragmento conservador del mismo o un derivado conservador del mismo puede utilizarse para tratar y/o prevenir enfermedades oculares neovasculares.

La expresion "enfermedades oculares neovasculares" o "enfermedad ocular neovascular" se refiere a todas las enfermedades oculares neovasculares, comprendiendo todas las enfermedades neovasculares de la cornea, la retina y el coroides. Entre estas enfermedades se incluyen:

- todas las formas de neovascularizacion corneal, con independencia de su causa, incluyendo las neovascularizaciones que se producen como complicaciones de injertos corneales y/o infecciones corneales o agresiones ambientales a la cornea, incluyendo infecciones por patogenos (tales como herpes) y quemaduras qufmicas,

- todas las formas de retinopatfa, incluyendo las formas isquemica y edematosa diabetica, la retinopatfa diabetica prematura, formas no proliferativas y proliferativas, edema quistoide macular, todas las formas de degeneracion macular relacionada (DMAE), todas las degeneraciones viteliformes maculares, incluyendo la enfermedad de Best, en los casos en que se presentan asociadas a neovasos retinianos y/o coroideos, angiomas oculares como la enfermedad de von Hippel-Lindau, la enfermedad de Eale o la enfermedad de Coats,

- la enfermedad de Norrie (vitreorretinopatfa exudativa congenita),

- todas las formas de neovascularizacion coroidea, vasculopatfas retinocoroideas polipoideas, con independencia de su presentacion clfnica; neovasos coroideos retrofoveolares asociados a miopia, distrofia de Sorsby que esta asociada practicamente en todos los casos a neovasos coroideos anormales,

- melanomas uveales, incluyendo los melanomas coroideos y sus metastasis, y

- rubeosis del iris y glaucoma neovascular.

Sin embargo, el alcance de las enfermedades oculares neovasculares que son la diana del anticuerpo monoclonal CL1-R2, sus fragmentos conservadores y sus derivados conservados puede ser mas amplio.

Preferentemente, las enfermedades neovasculares oculares (o las enfermedades oculares neovasculares) se seleccionan de entre el grupo que consiste de:

- todas las formas de neovascularizacion corneal, incluyendo las neovascularizaciones que se producen como complicaciones de los injertos corneales y/o de las infecciones corneales y/o de los insultos ambientales corneales seleccionados de entre infecciones por patogenos (tales como el herpes) y quemaduras qufmicas,

- todas las formas de retinopatfa, incluyendo las formas diabeticas isquemica y edematosa, la retinopatfa diabetica del prematuro, las formas no proliferativas y proliferativas, el edema macular quistoide, todas las

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

formas de degeneracion macular senil (DMAE), todas las degeneraciones maculares viteliformes, incluyendo la enfermedad de Best, angiomas oculares tales como la enfermedad de von Hippel-Lindau, la enfermedad de Eale y la enfermedad de Coats,

- la enfermedad de Norrie,

- todas las formas de neovascularizacion coroidea, las vasculopatfas retinocoroideas polipoideas, los neovasos coroideos retrofoveolares asociados a miopia, la distrofia de Sorsby,

- los melanomas uveales, incluyendo los melanomas coroideos y las metastasis de los mismos, y

- la rubeosis del iris y el glaucoma neovascular.

Preferentemente, la invencion se refiere a por lo menos un anticuerpo anti-CD160, preferentemente a un anticuerpo seleccionado de entre el anticuerpo monoclonal CL1-R2, sus fragmentos conservadores y sus derivados conservadores y un anticuerpo anti-VEGF, para el tratamiento y/o la prevencion de todas las formas de degeneracion macular senil (DMAE).

La expresion "prevencion de una enfermedad" se refiere a la aparicion de la enfermedad en un sujeto, en particular un ser humano, en el que todavfa no se ha declarado la enfermedad.

La expresion "tratamiento de una enfermedad" se refiere a la reduccion del desarrollo de la enfermedad o la inhibicion de la misma, es decir, la detencion de su desarrollo, la regresion o desaparicion de los sfntomas y consecuencias de la enfermedad, o el cese de las causas de la enfermedad.

Segun una preparacion combinada de la invencion, el anticuerpo monoclonal CL1-R2, aunque tambien sus derivados conservadores y sus fragmentos conservadores, pueden utilizarse para prevenir y/o tratar las enfermedades neovasculares oculares.

Las expresiones "fragmentos conservadores" y "derivados conservadores" de un anticuerpo anti-CD160, se refieren, respectivamente, a fragmentos y derivados que conservan la afinidad y especificidad de union de dicho anticuerpo, preferentemente CL1-R2, para CD160. Dichos fragmentos conservadores y derivados conservadores son equivalentes funcionales de dicho anticuerpo, preferentemente CL1-R2. Son "conservadores" porque se unen a sustancialmente el mismo epitopo que dicho anticuerpo, preferentemente CL1-R2 y/o pueden competir con dicho anticuerpo, preferentemente CL1-R2, para la union a CD160, y conservan la especificidad de union a CD160. Dicha especificidad de union resulta suficiente para que los fragmentos conservadores o los derivados conservadores no se unan a otros receptores de HLA aparte de CD160.

El termino "fragmento" de un anticuerpo anti-CD160, preferentemente CL1-R2, se refiere a una parte de dicho anticuerpo, tal como una cadena pesada, una cadena ligera, un VL, un VH, un Fab, un Fab', un F(ab)2, un F(ab')2 o dAb, pero tambien cualquier unidad minima que consiste de residuos aminoacidos que imitan la region hipervariable, tal como una RDC (RDC1H, RDC2H, RDC3H, RDC1L, RDC2L, RDC3L). Los fragmentos de un anticuerpo anti- CD160 de la invencion, preferentemente CD1-R2, son conservadores.

Solo una parte del anticuerpo, es decir, la region variable, participa en la union del anticuerpo a su epitopo. Las regiones constantes de los anticuerpos activan los efectores inmunologicos, fagocitos o celulas asesinas, asf como el complemento, y estas regiones constantes no participan en la union al antfgeno. Un anticuerpo en el que la region constante (Fc) ha sido cortada enzimaticamente de manera que se conserva la region bisagra se denomina fragmento F(ab')2 y conserva los dos sitios de union a antfgeno.

De manera similar, un anticuerpo en el que la region constante del mismo, incluyendo la region bisagra, ha sido cortada enzimaticamente, o que ha sido producido sin dicha region, se denomina fragmento Fab y conserva unicamente uno de los dos sitios de union a antfgeno. Los fragmentos Fab consisten de una cadena ligera que se encuentra unida covalentemente a una parte de la cadena pesada denominada Fd.

En la region variable existen regiones determinantes de la complementariedad (RDC, region determinante de complementariedad), tambien conocidas como regiones hipervariables, que interactuan directamente con el antfgeno. De esta manera, la modificacion de las RDC puede ayudar a modificar la afinidad de un anticuerpo. En la region variable existe un segundo tipo de region denominado region marco (RM, regiones marco), que mantienen la estructura terciaria de las RDC. Estas regiones marco son bastante especfficas de la especie en la que ha sido producido el anticuerpo. En el fragmento Fd de la cadena pesada y de la cadena ligera, existen cuatro regiones marco (RM1-4) separadas, respectivamente, por tres RDC (RDC 1 a 3).

Los fragmentos conservadores del anticuerpo anti-CD160 de la preparacion combinada de la invencion comprenden ademas dAbs. Los dAbs (anticuerpos de dominio unico) son anticuerpos que comprenden unicamente una cadena proteica que deriva de uno de los dos dominios de la estructura normal de un anticuerpo. En efecto, en

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

determinados casos, la mitad de un anticuerpo puede unirse a su antfgeno diana con una afinidad comparable a la afinidad del anticuerpo de tipo salvaje.

Los fragmentos conservadores de un anticuerpo anti-CD160, preferentemente CL1-R2, segun la invencion pueden producirse utilizando metodos bien conocidos de la tecnica anterior. Dichos fragmentos pueden obtenerse mediante metodos rutinarios, tales como una digestion proteolftica (por ejemplo la digestion con pepsina para generar F(ab')2; la digestion con papafna para generar Fab).

Preferentemente, los fragmentos conservadores de CL1-R2 se seleccionan de entre Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 y dAb de CL1-R2.

La expresion "derivado conservador" de CL1-R2 se refiere a un fragmento de CL1-R2, que preferentemente incluye por lo menos una RDC de CL1-R2, preferentemente por lo menos una RDC3 de CL1-R2, fusionada con por lo menos una secuencia diferente de la secuencia natural (por ejemplo una secuencia de conector de otra especie ...), presentando dicho derivado una afinidad de union para CD160 comparable a la de CL1-R2, y una especificidad de union a CD160 similar a la de CL1-R2.

Los derivados conservadores pueden obtenerse segun el conocimiento general que posee el experto en la materia, mediante sfntesis y/o ingenierfa genetica.

Un derivado conservador de la invencion puede ser monovalente (un unico sitio de union a CD160) o multivalente (por lo menos dos sitios de union a CD160). Entre los derivados multivalentes conservadores preferidos se incluyen derivados conservadores tetravalentes.

Entre los derivados conservadores se incluyen anticuerpos quimericos que pueden obtenerse mediante injerto de por lo menos un fragmento Fv de CL1-R2 o un fragmento Fc derivado de otro anticuerpo. El fragmento Fc preferentemente se selecciona para que resulte lo menos inmunorreactivo posible para el sujeto en el que se administra. Por ejemplo, en el caso de que el anticuerpo este destinado a la administracion en un ser humano, dicho fragmento Fc preferentemente es un fragmento Fc humano.

Entre los derivados conservadores de la invencion se incluyen ademas anticuerpos humanizados que pueden obtenerse mediante injerto de por lo menos un CL1-R2 o una parte del mismo en un fragmento marco humano (RM_h). Nuevamente, el objetivo es obtener los anticuerpos menos inmunogenos posibles en el cuerpo en el que se administran.

Entre los derivados conservadores para la utilizacion en la invencion se incluye ademas fragmentos variables de cadena sencilla Fv: se denominan scFv. Un fragmento variable de cadena sencilla, scFv, es una protefna de fusion que comprende las regiones variables de cadena ligera VL y de cadena pesada VH, conectadas mediante un conector corte de aproximadamente 25 aminoacidos. Los conectores apropiados son aquellos que permiten conformar estructuralmente los dominios VH y VL de la misma manera que la estructura original del anticuerpo CL1-R2 completo y mantener de esta manera la especificidad de union. Dichos conectores son conocidos por el experto en la materia, por ejemplo a partir de la solicitud n° WO 88/01649 (Genex Corp.). El scFv puede ser monovalente o multivalente.

Entre los derivados conservadores de la invencion se incluye ademas (scFv)2, que son dfmeros de scFv.

Entre los derivados conservadores de la invencion se incluyen ademas anticuerpos biespecfficos. Los anticuerpos biespecfficos comprenden dos sitios de union para dos antfgenos diferentes. Comprenden por lo menos los dominios VH y VL para un antfgeno y los dominios VH y VL para otro antfgeno.

Preferentemente, los anticuerpos biespecfficos segun la invencion comprenden un sitio de union a CD160 y un sitio de union a VEGF.

Entre los derivados conservadores de la invencion se incluyen ademas diacuerpos.

Los diacuerpos son una nueva clase de fragmentos pequenos de anticuerpo bivalente y biespecffico. Comprenden un dominio VH conectado a un dominio VL en la misma cadena polipeptfdica (VH-VL) conectada mediante un conector peptfdico que es excesivamente corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Esto fuerza el emparejamiento con los dominios complementarios de otra cadena y fomenta el ensamblaje de una molecula dimerica con dos sitios de union a antfgeno funcionales.

Para construir diacuerpos biespecfficos, los dominios VH del anticuerpo A y del anticuerpo B se fusionan para crear las dos cadenas VHA-VLB, vHB-VLA. Cada cadena es inactiva en la union a antfgeno, aunque recrea los sitios de union a antfgeno funcionales de los anticuerpos A y B con el apareamiento con la otra cadena.

Por ejemplo, un derivado conservador de CL1-R2 incluye un scFv que comprende por lo menos una region VH de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CL1-R2 unida a por lo menos una region VL de CL1-R2 mediante un conector peptfdico L; el scFv puede presentar una orientacion especffica VL-L-VH o VH-VL-L.

Otro derivado conservador de CL1-R2 comprende un multfmero de scFv derivado de CL1-R2 fusionado con un fragmento Fc.

Otro derivado conservador de CL1-R2 se obtiene mediante la adicion de uno o mas derivados Fab de CL1-R2 al extremo C-terminal de cada cadena pesada H de un CL1-R2 completo.

Otro derivado conservador de CL1-R2 se obtiene uniendo covalentemente anticuerpos CL1-R2 completos entre si para construir una forma agregada.

Otro derivado conservador de CL1-R2 se obtiene uniendo dos o mas Fab en orientacion cabeza-a-cola.

Un scFv multivalente de la invencion puede obtenerse mediante la union de por lo menos dos scFv (por ejemplo (scFv)2). La asociacion puede ser covalente o no covalente. A tftulo de ejemplo, pueden mencionarse los tetrameros de scFv (4 sitios de union a CD160). El interes de un scFv multivalente radica en la presencia de varios sitios de union a CD160, que incrementan la capacidad de union al antfgeno.

El scFv multimerico puede ser monoespecffico, es decir, todos los sitios de union del mismo presentan como diana CD160.

Alternativamente, el scFv multimerico puede comprender uno o mas sitios de union a CD160 y uno o mas sitios de union a otro antfgeno de CD160. Por ejemplo, dicho antfgeno puede ser VEGF.

Los metodos para producir scFv multimerico son conocidos en la tecnica, por ejemplo del documento n° WO 94/13806 (The Dow Chemical Company) o del documento n° WO 93/11161 (Enzon Inc.).

Preferentemente, los derivados conservadores de CL1-R2 segun la invencion se seleccionan de entre scFv, (scFv)2, los diacuerpos, scFv multimerico derivado de CL1-R2 y fusionado con un fragmento Fc, los anticuerpos CL1-R2 completos unidos entre sf para conseguir una forma agregada, y las formas de anticuerpo que comprenden por lo menos dos Fab unidos cabeza-a-cola.

El anticuerpo CL1-R2, uno de sus fragmentos conservadores o uno de sus derivados conservadores, puede encontrarse presentes en una composicion farmaceutica o farmaco. Dicha composicion farmaceutica comprende preferentemente un vehfculo farmaceuticamente aceptable. La expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a un material no toxico que es compatible con un sistema biologico, tal como una celula, un cultivo celular, un tejido o un organismo, y que no interfiere con la eficacia de la actividad biologica de otros principios activos de la composicion. Las caracterfsticas del vehfculo dependen del modo de administracion.

La composicion farmaceutica o farmaco puede encontrarse en cualquier forma administrable en el paciente e incluye soluciones, suspensiones, polvos liofilizados, capsulas y comprimidos.

La composicion farmaceutica o farmaco puede encontrarse en una forma consistente con una inyeccion, es decir, una inyeccion local, una administracion a traves de la mucosa, una inhalacion, una administracion oral y, mas generalmente, cualquier formulacion adecuada para el proposito pretendido. Preferentemente, la composicion farmaceutica o farmaco se presenta en una forma consistente con una administracion subconjuntival, subtenonal, intravftrea, subretiniana, intraorbital, intravenosa, intramuscular, subcutanea o intraocular.

Se describe ademas un metodo para tratar una enfermedad ocular neovascular en un sujeto, preferentemente un ser humano, en el que se administra en el sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de CL1-R2, un fragmento conservador del mismo o un derivado conservador del mismo. El anticuerpo CL1-R2, sus fragmentos conservadores o sus derivados conservadores, se administran en una cantidad terapeuticamente eficaz. Una cantidad terapeuticamente eficaz representa una cantidad suficiente para prevenir y/o tratar la enfermedad ocular neovascular diana. Dicha cantidad puede variar segun edad, sexo del sujeto y el estadio de la enfermedad y sera determinada por el experto en la materia. Una cantidad terapeuticamente eficaz puede variar entre 0,01 mg/kg y 50 mg/kg, preferentemente entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg y mas preferentemente entre 0,1 mg/kg y 2 mg/kg, preferentemente en una administracion al mes.

El modo de administracion puede ser mediante inyeccion o mediante infusion gradual. La inyeccion es preferentemente intravftrea.

Entre las preparaciones para la administracion intravftrea pueden incluirse suspensiones o emulsiones esteriles acuosas o no acuosas. Son ejemplos de solventes no acuosos, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva o esteres organicos inyectables tales como el oleato de etilo. Entre los vehfculos acuosos se incluyen agua, soluciones de alcohol/agua, emulsiones o suspensiones.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El CL1-R2, uno de sus fragmentos conservadores o uno de sus derivados conservadores de la invencion puede incluir ademas otro componente. Por ejemplo, CL1-R2, fragmentos conservadores del mismo o derivados conservadores del mismo pueden marcarse. Entre los ejemplos de marcadores se incluyen enzimas, isotopos radioactivos, compuestos fluorescentes, metales coloidales, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes. Los metodos para la union de un marcador a un anticuerpo son bien conocidos por el experto en la materia.

Otra tecnica de marcado consiste en acoplar los anticuerpos a haptenos de bajo peso molecular; estos haptenos pueden modificarse especfficamente mediante una segunda reaccion. Son ejemplos de haptenos, la biotina, que reacciona con la avidina, o el dinitrofenol, el piridoxal o la fluorescefna, que puede reaccionar con antihaptenos especfficos.

En una forma de realizacion preferida, los anticuerpos de la invencion pueden marcarse con una molecula o sustancia detectable, tal como una molecula fluorescente, una molecula radioactiva o cualesquiera otros marcajes conocidos de la tecnica. Se conocen en la tecnica marcados que proporcionan generalmente (directa o indirectamente) una senal.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "marcado" con respecto al anticuerpo pretende comprender el marcado directo del anticuerpo mediante acoplamiento (es decir, la union ffsica) de una sustancia detectable, tal como un agente radioactivo o un fluoroforo (por ejemplo isotiocianato de fluorescefna (FITC) o ficoeritritina (PE) o indocianina (Cy5)) al anticuerpo, asf como el marcaje indirecto del anticuerpo mediante reactividad con una sustancia detectable.

Los anticuerpos de la invencion pueden marcarse con una molecula radioactiva mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, entre las moleculas radioactivas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, un atomo

J 1 123 124 111 J186 188

radioactivo para estudios centellograficos tales como I , I , In , Re y Re . Los anticuerpos de la invencion tambien pueden marcarse con un marcado de espfn para la obtencion de imagenes mediante resonancia magnetica nuclear (RMN) (tambien conocida como imagenes por resonancia magnetica, IRM), tales como yodo-123, yodo-131, indio-111, fluor-19, carbono-13, nitrogeno-15, oxfgeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1: CL1-R2 inhibe la neoangiogenesis corneal en el conejo inducida por FCF2. Analisis cuantitativo de la neovascularizacion en corneas de control tratadas con IgG1 (control) y tratadas con CL1-R2. Los valores son de medias ± SEM obtenidas de cuatro experimentos separados, n=5 conejos por grupo para cada experimento. ***P<0,0001 (prueba de Mann-Whitney). Se evaluo la neovascularizacion 8 dfas despues del injerto corneal de implantes que contenfan FCF2. Se llevaron a cabo inyecciones subconjuntivales de CL1-R2 o IgG1 de control 24 y 72 h despues de la implantacion y se puntuo en una escala de 4 grados basada en la longitud de los vasos de nueva formacion entre el limbo y los implantes que contienen FCF2.

Figuras 2A y B: CL1-R2 reduce la neovascularizacion retiniana en un modelo murino de retinopatfa inducida por oxfgeno. Evaluacion cuantitativa de la vascularizacion retiniana (histologfa, recuentos en la seccion retiniana) de ratones expuestos a condiciones hiperoxicas sin inyeccion (tratamiento simulado="mock", n=6) o mediante inyeccion intravftrea con IgG1 de control (control, 5 pg, n=9) o CL1-R2 (5 pg, n=11). Numero medio de nucleos (A) de celulas endoteliales (CE) y luz del vaso (B). **P<0,001.

Figuras 3A y B: comparacion entre la capacidad respectiva de CL1-R2 y bevacizumab/Avastin® para reducir la neovascularizacion retiniana en un modelo murino de retinopatfa inducida por oxfgeno. Evaluacion cuantitativa de la vascularizacion retiniana. Se determino el numero medio de nucleos de celulas endotelial (A) y de luces de vaso (B) utilizando un modelo de regresion de Poisson para datos agrupados. Se muestran los intervalos de confianza al 95% del numero medio de estimaciones como barras de error. Los valores de P se corrigieron para comparaciones post-hoc entre grupos mediante el metodo de Bonferroni. *P<0,05, **P<0,001.

Figura 4: efecto sinergico de CL1-R2 y anticuerpo anti-VEGF sobre la inhibicion de la neovascularizacion.

Resultados obtenidos en varios grupos de conejos que se administraron con:

- IgG1 sola (inyecciones de 25 pg),

- Avastin® sola (dos inyecciones de 25 pg),

- CL1-R2 sola (2 inyecciones de 25, 50 o 100 pg),

- Avastin® combinado con IgG1, y

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

- Avastin® combinado con CL1-R2.

El grado corresponds a la longitud de los neovasos.

Figura 5: efecto de CL1-R2 en forma completa y CL1-R2 en forma de Fab'2.

La figura muestra el efecto de CL1-R2 en forma completa, los efectos de CL1-R2 en forma Fab'2 sobre la neovascularizacion corneal y los proporcionados por una IgG1 de control.

El grado corresponde a la longitud de los neovasos.

Figura 6: efectos de los mAb anti-CD160 de raton y quimerico en un modelo de raton de DMAE (NVC inducida por laser).

Los resultados obtenidos en varios grupos de ratones en los que se habfa administrado:

- IgG1 de isotipo de control de raton,

- Kenacort retard 40®,

- CMX46.3 (mAb de rata anti-CD160 de raton de cBioscience),

- Fab'2 de raton anti-CD160 humano,

- IgG1 de raton anti-CD160 humano, y

- IgG1 quimerico anti-CD160 humano.

Se estimo la superficie neovascular media.

Ejemplo 1:

Materiales y metodos

mAb CL1-R2 anti-CD160 murino. Se desarrollo e lmAb (IgG1) CL1-R2 anti-CD160 de raton en el laboratorio de los presentes inventores y se evaluo como mAb anti-CD160 durante el taller "7th Human Leukocyte Differentiation Antigen Workshop" (26). Los presentes inventores produjeron el mAb CL1-R2 a partir de una lfnea celular de hibridoma secretora especffica mediante la utilizacion del sistema de alta densidad celular CeLLine (Valdea Biosciences). Se desarrollo el anticuerpo monoclonal de isotipo de control IgG1 de raton He6 mediante la inmunizacion de ratones con antfgeno superficial de virus de la hepatitis B (HB). Ambos anticuerpos, CL1-R2 e IgG1 de isotipo de control, se purificaron de manera similar, mediante cromatograffa de afinidad en una columna de protefna G HiTrap™ (GE Healthcare) en un sistema purificador AKTA™, se dializaron frente a PBS, pH 7,0, se concentraron y se filtraron a traves de filtros de 0,22 pm.

Animales. Los presentes inventores utilizaron ratones BALB/c, C57BL/6J y NMRI-nu (nu/nu) (Janvier Laboratories). Los ratones eran de 7 a 10 semanas de edad, excepto por los utilizados para los experimentos de retinopatfa isquemica, que eran de siete dfas de edad. Los animales se alojaron en una sala convencional de temperatura controlada (21°C), se expusieron a un periodo diario de 12 horas de luz y oscuridad y se alimentaron ad libitum con una dieta equilibrada determinada por el laboratorio Jackson para la cepa de ratones C57BL6/J. Los presentes inventores utilizaron conejos albinos New Zealand macho del Institut National de la Recherche Agronomique (Castanet-Tolosan). Para los experimentos con retinas de raton, los animales fueron manipulados segun las directrices del comite institucional de cuidados animales, siguiendo protocolos aprobados por el Ethics Committee y la ARVO Statement for use of Animals in Ophtalmic and Vision Research. Todos los demas experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Union Europea, previa aprobacion por el comite etico local (Midi-Pyrenees, Francia).

Ensayo de angiogenesis corneal in vivo en el conejo. El ensayo de bolsillo corneal utilizado en el presente estudio ha sido descrito con anterioridad (28). Los presentes inventores realizaron una incision en la cara superior de la cornea, a 2 mm del limbo, en conejos anestesiados. Se insertaron en este bolsillo implantes tratados con FCF2 (500 ng, R&D Systems). Se administraron inyecciones subconjuntivales de mAb CL1-R2 o IgG1 de control (100 pg en 30 pl de PBS) en la cara superior del limbo 24 y 72 horas despues de la implantacion corneal. Se midio la neovascularizacion corneal 8 dfas despues de la implantacion y se puntuo en una escala de cuatro grados basada en la longitud de los vasos de nueva formacion desde el limbo hasta el implante que contenfa FCF2 (28).

Modelo murino de retinopatfa inducida por oxfgeno e inyecciones intravftreas. Se indujo neovascularizacion retiniana en crfas de raton C57BL/6J utilizando un modelo bien establecido y reproducible de retinopatfa inducida por oxfgeno

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(32). Brevemente, se introdujeron ratones (7 dfas de edad, P7) y sus madres lactantes en un incubador hermetico al aire y se expusieron a una atmosfera de 75 ± 2% de oxfgeno durante 5 dfas. Se realizo un seguimiento continuo del nivel de oxfgeno con un analizador de oxfgeno PROOX (modelo 110, BioSpherix). Se sacaron los ratones en P12 y se mantuvieron bajo condiciones normoxicas (aire ambiente) hasta P17. Los ratones recibieron una inyeccion intravftrea bajo un microscopio de diseccion. Con la excepcion del grupo no inyectado, cada crfa recibio una inyeccion intravftrea en el ojo izquierdo y en el ojo derecho en P12. Brevemente, se anestesiaron las crfas de raton con una inyeccion intramuscular de quetamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilazina (10 mg/kg de peso corporal). Se abrieron las fisuras palpebrales con microtijeras y se dilataron las pupilas con fenilefrina al 10% topica y tropicamida al 0,5%. Se atraveso la esclerotica con la punta de una aguja de acero de calibre 33 de 10 mm montada en una jeringa Hamilton de 5 pl, en posicion 1 mm posterior respecto al limbo esclero-corneal, hasta el interior del cuerpo vftreo. Se inyecto aproximadamente 1 pl de mAb CL1-R2 (5 pg/pl), bevacizumab (25 pg/pl, Roche) o mAb IgG1 de isotipo de control (5 pg/pl) en la cavidad vftrea.

Evaluacion cualitativa y cuantitativa de la neovascularizacion retiniana. Se sacrificaron los ratones en P17 para analizar la neovascularizacion mediante mediciones histologicas y cuantitativas. Algunos ratones fueron sometidos a angiograffa retiniana con fluorescefna-dextrano. Para dicha evaluacion cualitativa, los presentes inventores anestesiaron crfas de raton tal como se ha indicado anteriormente y se perfundio el corazon a traves del ventrfculo izquierdo con 1 ml de PBS que contenfa 50 mg/ml de dextrano marcado con fluorescefna (peso molecular medio: 2x106, Sigma) que habfa sido clarificada mediante centrifugacion durante 5 min. a 10.000 rpm. Se enuclearon los ojos y se fijaron en paraformaldehfdo al 4% durante 3 horas. Se extirparon la cornea y el cristalino y se disecciono la retina del globo ocular. Se corto la retina en cuatro cuadrantes y se montaron planas en Vectashield bajo un cubreobjetos para el examen mediante microscopfa de fluorescencia. Se examinaron por lo menos 12 ojos de cada tratamiento. Para el analisis histologico, se sacrificaron las crfas de raton, se enuclearon los ojos, se fijaron en paraformaldehfdo al 4% durante como mfnimo 16 horas a 4°C y se incluyeron en parafina. Los presentes inventores prepararon secciones sagitales de 5 pm con el microtomo HM355 Microm Microtec, se tineron las secciones con reactivo de acido peryodico de Schiff y se contratineron con H-E. Los presentes inventores contaron 5 a 8 secciones en cada lado del nervio optico. Dos investigadores capacitados contaron en ciego el numero de celulas endoteliales neovasculares y de luces de vasos en la muestra retiniana completa en cada seccion intacta a una magnificacion de x100. Se determinaron los numeros medios de nucleos de celulas endoteliales y los numeros de vasos utilizando un modelo de regresion de Poisson para datos agrupados; los intervalos de confianza al 95% de las estimaciones de numero medio se representan como barras de error. Los valores de P se corrigieron para las comparaciones post- hoc entre grupos mediante el metodo de Bonferroni.

Estadfsticas. Para los experimentos en modelo de raton y de conejo, se analizaron datos cuantitativos (presentados como medias ± SEM) con los programas GraphPad Prism 4 o Prism 5. Se determino un valor medio para cada variable vascular (microscopfa intravital y analisis histologico) para cada animal y estos valores se utilizaron para calcular la media global para todos los animales en cada grupo experimental. Antes de llevar a cabo las pruebas estadfsticas, los presentes inventores determinaron si los datos presentaban una distribucion normal y evaluaron la varianza de los mismos. A continuacion, los presentes inventores llevaron a cabo las pruebas apropiadas, tal como se indica. Para los experimentos de curso temporal in vivo, los presentes inventores utilizando el analisis de ANOVA a dos vfas o pruebas t de Student. Los presentes inventores proporcionan los datos de valores de P para cada prueba. Se considero que P<0,05 era estadfsticamente significativo. Para los recuentos retinianos, debido a la presencia de dos niveles anidados de dependencia entre secciones histologicas procedentes del mismo ojo y el mismo raton, se analizaron los recuentos de nucleos celulares y luces de vaso mediante un modelo mixto lineal generalizado de Poisson (59) con el proc GLIMMIX del paquete estadfstico SAS v9.1.3 (Sas Institute). Los presentes inventores consideraron los grupos experimentales de tratamiento como factores de efecto fijo y los ojos individuales como efectos aleatorios. En el lfmite superior, se calculo una varianza empfrica robusta de las estimaciones de efectos fijos (60) mediante la definicion de los ratones como grupos. Se considero que P<0,05 era estadfsticamente significativo.

Resultados

El mAb CL1-R2 inhibe la neovascularizacion ocular en cornea de conejo y en la retinopatfa inducida por oxfgeno en un modelo de raton. Se evaluaron las propiedades antiangiogenicas del mAb CL1-R2 in vivo mediante la utilizacion de dos modelos animales diferentes de neoangiogenesis ocular. El ojo de los vertebrados presenta una ventaja en estos estudios en que se considera un sitio inmunoprivilegiado (31), encontrandose de esta manera posiblemente libre de celulas inmunologicas que pudieren unirse a CL1-R2. En primer lugar los presentes inventores utilizando un ensayo de bolsillo corneal de conejo (28) para determinar si CL1-R2 inhibfa la neovascularizacion corneal inducida por el factor de crecimiento fibroblastico 2 (FCF2). La cornea normalmente se encuentra libre tanto de vasos sangufneos como de vasos linfaticos y mantiene activamente esta avascularidad (31). En este modelo, resultan atrafdos neovasos del limbo. Se evaluo la neovascularizacion ocho dfas despues del trasplante de implantes corneales que contenfan FCF2 y dos inyecciones subconjuntivales de 100 pg de CL1-R2 o IgG1 de control. El tratamiento con CL1-R2 redujo significativamente la neovascularizacion corneal en comparacion con los conejos tratados con IgG1 de control (figura 1). Estos resultados indican que el tratamiento de CL1-R2 inhibe la neovascularizacion corneal inducida por factor de crecimiento. A continuacion, se investigo el efecto de CL1-R2 en un modelo de raton de retinopatfa humana del prematuro mediante la exposicion de ratones neonatos prematuros

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(P7-P12) a niveles de oxfgeno elevados (32, 33). En 100% de estos animales el retorno a condiciones normoxicas indujo isquemia retiniana y vascularizacion prerretiniana dependiente del VEGF (32). En primer lugar se llevo a cabo una evaluacion cualitativa de la vasculatura retiniana en retinas completas montadas planas y perfundidas con FITC- dextrano tras inyecciones intravftreas de CL1-R2 o de IgG1 de control (datos no representados). Las retinas procedentes de animales no tratados normales mostraban una vascularizacion normal, es decir, capas vasculares tanto superficiales como profundas que se extendfan desde el nervio optico hasta la periferia. Los vasos formaban un patron de ramificacion radical en la capa retiniana superficial y un patron reticular poligonal en la capa retiniana profunda. Las retinas de los animales tratados con oxfgeno sin inyeccion intraocular ('tratados simuladamente'='Mock') o con inyeccion intraocular de IgG1 de control ('Ctrl') mostraban penachos neovasculares que liberaban fluorescefna y presentaban vasos radiales tortuosos y una zona avascular central, consistente con descripciones anteriores de este modelo (32, 33). Tras la inyeccion intraocular de CL1-R2, se redujo drasticamente el tamano de las areas avasculares y las retinas contenfan menos penachos neovasculares y menos vasos radiales tortuosos y dilatados (datos no mostrados), sugiriendo una mejor eficiencia de perfusion en los vasos centrales. Los ojos de los diversos animales no tratados o tratados con oxfgeno se analizaron adicionalmente a partir de la histologfa. Se tineron secciones en serie de tejido ocular con reactivo acido peryodico de Schiff para visualizar los nucleos de las celulas endoteliales (datos no representados). Al contrario que las retinas de los ratones en un ambiente normoxico (retina normal), las retinas de los ratones simuladamente tratados contenfan tfpicamente abundantes microvasos longitudinales y transversales aberrantes de diversos tamanos en el espacio vftreo y en la retina interna, asf como en los nucleos de las celulas endoteliales. Las retinas de los animales tratados con IgG de control mostraron una neovascularizacion similar, con abundantes microvasos y nucleos de celulas endoteliales aberrantes. En contraste, las retinas de los ratones en los que se habfa inyectado CL1-R2 presentaban significativamente menos vasos aberrantes, de tamano reducido en gran medida, especialmente en el espacio vftreo y dentro de la retina, y menos nucleos de celulas endoteliales. Con el fin de cuantificar la neovascularizacion retiniana, se contaron los nucleos de celulas endoteliales y las luces de neovasos en un gran numero de muestras antes y despues de la administracion de tratamientos antiangiogenicos o de control (figura 2, A y B). Estos son parametros cruciales para evaluar con precision cualquier efecto antiangiogenico. La inyeccion intravftrea de CL1-R2 redujo significativamente el numero medio de nucleos de celulas endoteliales en cada seccion tanto de capas de celulas ganglionares como de capas nucleares internas en comparacion con los animales inyectados con IgG1 de control (P<0,001, figura 2A). Ademas, la inyeccion intraocular de CL1-R2 redujo el numero medio de luces de vaso por seccion en ~50% y ~35% en comparacion con ratones tratados simuladamente (P<0,001) o de control tratados con IgG1 (P<0,001), respectivamente (figura 2B). A continuacion, se comparo el efecto del tratamiento de CL1-R2 con el del mAb ampliamente utilizado bevacizumab en el mismo modelo de raton con independencia de la controversia con respecto a la especificidad del bevacizumab en la neutralizacion de la VEGF-A murina (34). En efecto varios estudios han demostrado concluyentemente que el bevacizumab, a pesar de su debil afinidad para la VEGF-A producida por ratones, ratas, cobayas y conejos, resulta eficiente en el tratamiento de la neovascularizacion corneal inducida experimentalmente en estos animales (35-39). Ademas, un estudio reciente ha demostrado inequfvocamente que el bevacizumab presenta un efecto inhibidor muy significativo sobre la angiogenesis retiniana en el modelo de raton de retinopatfa inducida por oxfgeno (40). Estos ultimos resultados concuerdan totalmente con los de los presentes inventores. Tras la inyeccion intraocular de bevacizumab, se observo una vascularizacion retiniana normalizada en retinas montadas planas, comparable a la obtenida tras el tratamiento de CL1-R2 (datos no representados). El analisis cuantitativo indica que el numero medio de luces de vaso por seccion era inferior en los ratones inyectados con bevacizumab que en ratones de control tratados con IgG1 y no se observo diferencia significativa entre ratones tratados con CL1-R2 y ratones tratados con bevacizumab (figura 3, P=0,93).

Globalmente estos datos demuestran que la monoterapia de mAb CL1-R2 suprime eficazmente la angiogenesis patologica en corneas de conejo y en ratones con un modelo de retinopatfa del prematuro.

Ejemplo 2: efecto sinergico de CL1R2 y de anticuerpo anti-VEGF sobre la inhibicion de la neovascularizacion

Los inventores evaluaron las propiedades antiangiogenicas del mAb CL1-R2 in vivo en combinacion con un anticuerpo anti-VEGF (Avastin®) mediante la utilizacion de modelos de neoangiogenesis corneal con implantes tratados con FCF2 tal como en el ejemplo 1.

Con dicho proposito compararon los resultados obtenidos en varios grupos de conejos en los que se administro:

- IgG1 solo (inyecciones de 25 pg),

- Avastin® solo (dos inyecciones de 25 pg),

- CL1-R2 solo (2 inyecciones de 25, 50 o 100 pg),

- Avastin® en combinacion con IgG1, y

- Avastin® en combinacion con CL1-R2.

Cada grupo comprendfa 4 conejos. El grado corresponde a la longitud de los neovasos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Se muestran los resultados en la figura 4. Los inventores pusieron de manifiesto que la utilizacion de CL1-R2 conjuntamente con un anticuerpo anti-VEGF proporciona mejores resultados en la inhibicion de la neovascularizacion en un modelo de neoangiogenesis ocular.

Dicho resultado indica que CL1-R2 y anti-VEGF resultan muy utiles en combinacion en el tratamiento de las enfermedades oculares neovasculares, ya que su combinacion proporciona una inhibicion sinergica de la neovascularizacion.

Ejemplo 3: efecto de CL1-R2 en forma completa y CL1-R2 en forma Fab'2

Los inventores compararon los efectos de CL1-R2 en forma completa y los efectos de CL1-R2 en forma Fab'2 sobre la neovascularizacion corneal. Con este fin se utilizo una IgG1 de control.

Se dan a conocer los resultados en la figura 5. El grado corresponde a la longitud de los neovasos. Los inventores han demostrado que CL1-R2 en forma completa proporciona los mejores resultados en la inhibicion de la neovascularizacion en comparacion con el efecto proporcionado por la IgG1 de control.

Pusieron de manifiesto ademas que la forma Fab'2 esta altamente adaptada para la inhibicion de la neovascularizacion, ya que proporciona mejores resultados que CL1-R2 en forma completa y la IgG1 de control.

Ejemplo 4: efectos del mAb anti-CD160 de raton y quimerico en un modelo de raton de DMAE

El objetivo del presente estudio era evaluar la eficacia terapeutica del mAb anti-CD160 de raton y quimerico en la inhibicion de la neovascularizacion ocular patologica en un modelo de raton de neovascularizacion coroidea (NVC), reproduciendo muchas caracterfsticas de la DMAE. Se indujo la neoangiogenesis coroidea mediante la administracion de impactos de laser de kripton. Se evaluo la NVC cualitativamente mediante angiograffa in vivo y cuantitativamente mediante mediciones directas del area de NVC sobre coroides montadas planas.

Materiales y metodos

Animales

Se obtuvieron ratones C57Bl/6J macho (6 semanas de edad) de Janvier Laboratories (Lassalle, QC). Los animales se alojaron en una sala de temperatura controlada (21°C) convencional, con un periodo diario de 12 h de luz. Se alimentaron ad libitum con una dieta equilibrada para la cepa de raton C57BL6/J recomendada por Jackson Laboratories. Los animales se manipularon de acuerdo con las directrices del comite institucional de cuidado animal, siguiendo protocolos aprobados por la junta de revision institucional y de acuerdo con la ARVO Statement for use of Animals in Ophtalmic and Vision Research. Se realizo un seguimiento del estado general de los ratones, incluyendo su peso corporal, ingesta de alimentos y comportamiento, durante todo el experimento in vivo.

Modelo murino de NVC inducido por laser

Se genero NVC mediante ruptura inducida por laser de kripton de la membrana de Bruch, tal como se ha indicado anteriormente (Tobe et al., 1998; Edelman Jl, 2000; Montezuma S.R. et al., 2009). Los ratones fueron anestesiados mediante la inyeccion intramuscular de una mezcla de 100 mg/kg de quetamina (Ketamine 1000®, Virbac France, Carros, Francia) y 10 mg/kg de xilazina (Rompun 2%®, Bayer Pharma, Puteaux, Francia). Se anestesiaron corneas de raton con hidrocloruro de oxibuprocafna al 0,4% (Cebesine®, Chauvin Laboratory, Montpellier, Francia) y se dilataron las pupilas con gotas oculares de fenilefrina al 10% (Neosynephrine Faure 10%®, Pharmaster, Erstein, Francia) y tropicamida al 0,5% (Mydriaticum®, Farmila, Thea Farmaceutici, Settimo Milanese, Italia).

Se indujeron tres impactos inducidos por laser en un ojo de cada raton (habitualmente en las posiciones de las 9, las 12 y las 3 del reloj en torno al disco optico) con un laser de kripton calibrado cuidadosamente para provocar roturas de la membrana de Bruch y la neovascularizacion coroidea secundaria que brotaba a partir del choriocapillaris (tamano de punto: 50 pm; potencia: 400 mW; tiempo de exposicion: 100 ms, Ophthalas, Biophysics Medical, Clermont Ferrand, Francia) y una lente de contacto. En todos los ojos tratados incluidos en el estudio, se observo una burbuja traumatica reactiva en la superficie retiniana tras el tratamiento laser, demostrando que el enfoque era correcto y una indicacion de la ruptura de la membrana de Bruch.

Protocolo de inyeccion intravftrea

Todos los procedimientos se llevaron a cabo bajo un microscopio de diseccion y cada animal recibio una inyeccion intravftrea en el ojo un dfa despues de la administracion de laser de kripton.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Los ratones (de 6 semanas de edad) fueron asignados a 6 grupos:

Grupo 1: ratones tratados con mAb quimerico anti-CD160 humano (CL1-R2 quim., n=15),

Grupo 2: ratones tratados con mAb de raton anti-CD160 humano (CL1-R2, n=17),

Grupo 3: ratones tratados con mAb IgG1 de isotipo de control de raton (HE6, n=15),

Grupo 4: ratones tratados con mAb de rata anti-CD160 de raton (CNX46-3, n=14),

Grupo 5: fragmento Fab'2 de ratones tratados con mAb de raton anti-CD160 humano (Fab'2, n=15),

Grupo 6: ratones tratados con Kenacort retard 40® (Kenacort, n=15).

Los ratones fueron anestesiados mediante la inyeccion intramuscular de una mezcla de quetamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). Se dilataron las pupilas con fenilefrina al 10% y tropicamida al 0,5% topicos. Se atraveso la esclerotica con la punta de una aguja de acero de calibre 33 de 10 mm montada en una jeringa Hamilton de 5 pl, hasta una posicion 1 mm posterior respecto al limbo esclero-corneal, en el cuerpo vftreo. Se inyecto 1 pl de cada producto en la cavidad vftrea:

- mAb quimerico anti-CD160 humano (10 pg/pl, lote n° 29120-00, MAT Biopharma),

- mAb de raton anti-CD160 humano (10 pg/pl, lote n° 280910-00, MAT Biopharma),

- mAb IgG1 de isotipo de control de raton (10 pg/pl, lote n° 191110-00, MAT Biopharma),

- mAb de rata anti-CD160 de raton (10 pg/pl, eBioscience),

- Fragmento Fab'2 de mAb de raton anti-CD160 humano (10 pg/pl, lote n° 191110-00, MAT Biopharma),

- Kenacort retard 40® (40 mg/ml, Bristol Myers Squibb, Francia).

Evaluacion cualitativa y cuantitativa de la NVC

Catorce y veintiun dfas despues de la administracion de laser de kripton, los ratones fueron sometidos a angiograffa con fluorescefna para la evaluacion cualitativa de la neovascularizacion coroidea. Los ratones fueron sacrificados 21 dfas despues de la administracion del laser de kripton para el analisis cuantitativo de las muestras coroideas montadas planas.

Angiograffa in vivo. Se llevo a cabo una angiograffa con fluorescefna catorce y veintiun dfas despues de la induccion de impactos inducidos por laser. Los ratones fueron anestesiados tal como se ha indicado anteriormente y se realizaron fotograffas en serie del fondo (Canon CF-60UVi, Haag-Streit, Chambery, Francia) tras la inyeccion intraperitoneal de 0,5 ml de fluorescefna sodica al 10% (10% Faure®, Novartis Pharma, Rueil-Malmaison, Francia). La fuga de fluorescefna a partir de los vasos anormalmente permeables de nueva formacion condujo al desarrollo de puntos hiperfluorescentes en los sitios de las lesiones inducidas por impacto de laser de kripton, distinguiendose claramente de las vasculaturas retiniana y coroidea normales.

Preparaciones montadas planas de coroides. Veintiun dfas despues del tratamiento con laser, se llevo a cabo la perfusion cardiaca a traves del ventrfculo izquierdo con 300 pl de una solucion 50 mg/ml de dextrano marcado con fluorescefna en PBS (isotiocianato de fluorescefna-dextrano, peso molecular medio: 2x106, Sigma, Francia) clasificada mediante centrifugacion durante 5 minutos a 10.000 rpm (1.110xg). Los ojos tratados con laser se enuclearon y se fijaron inmediatamente mediante incubacion en paraformaldehfdo al 4% durante como mfnimo 16 horas a 4°C. Se extirparon la cornea y el cristalino y la retina completa se disecciono cuidadosamente del globo ocular. Se diseccionaron los globos de epitelio pigmentario retiniano-coroides-esclerotica mediante cuatro a cinco incisiones radiales, se montaron planos sobre un portaobjetos en Vectashield y se cubrieron con un cubreobjetos para microscopfa de fluorescencia con un objetivo x10 (Axioplan 2, Zeiss, Le Pecq, Francia). Tambien se obtuvo una imagen calibrada. El area afectada por la neovascularizacion coroidea (en pm2) se midio con el software Image J. Se calculo el promedio de las mediciones del area neovascular obtenido para multiples lesiones de ojos individuales y en animales individuales.

Analisis estadfstico

Se presentan los datos como medias ± errores estandar. Se llevo a cabo el analisis estadfstico utilizando pruebas parametricas (analisis de la varianza ANOVA y prueba de PLSD de Fisher - software Statview, version 5) para la deteccion de diferencias significativas entre grupos. Los valores de P<0,05 se consideraron estadfsticamente significativos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Resultados

Las tasas de mortalidad eran similares en los grupos durante el experimento: 3/17 (5,8%) en el grupo 2, 2/15 (13%) en el grupo 3, 1/14 (7,1%) en el grupo 4, 2/15 (13,3%) en el grupo 5 y ninguna muerta en los grupos 1 y 6. Las muertes se produjeron durante la anestesia o despues de la misma para fotocoagulacion laser o angiograffa in vivo.

Posteriormente no se observo ninguna diferencia significativa de ganancia de peso corporal entre los ratones de los 6 grupos.

Se cuantifico la eficiencia del tratamiento mediante la medicion directa del area que mostraba neovascularizacion coroidea en coroides montadas planas, tal como se ha indicado anteriormente (Edelman y Castro, 2000).

Se llevo a cabo el analisis de la superficie que mostraba NVC utilizando pruebas parametricas (analisis de la varianza ANOVA y prueba de PLSD de Fisher). Se muestran los resultados en la figura 6. Las areas de NVC eran significativamente menores en los ratones tratados con CL1-R2 (grupo 2, P<0,0001) y los tratados con Fab'2 (grupo 5, P=0,0001) que en ratones tratados con IgG1 de raton de isotipo de control (grupo 3). Los tratamientos de Kenacort® (grupo 6, P<0,0001), utilizado como control positivo) y de CNX46-3 (grupo 4, P<0,0001) mostraron efectos similares en comparacion con el grupo de control de isotipo. El tratamiento con anticuerpo quimerico CL1-R2 redujo significativamente las areas con NVC en comparacion con las medidas en ratones tratados con anticuerpo de raton de isotipo IgG1 (P<0,0001). Cabe indicar que se observo un efecto similar en los tratamientos de CL1-R2 y CL1-R2 quimerico (P=0,9888) y entre los tratamientos de Fab'2 y CL1-R2 o CL1-R2 quimerico (P=0,0951 y P=0,0925, respectivamente).

Las evaluaciones cuantitativas de la neovascularizacion sugirieron que los tratamientos de CL1-R2, CL1-R2 quimerico, Fab'2 y CNX46-3, i) reducen la superficie afectada por NVC en comparacion con el tratamiento con anticuerpo de raton de isotipo IgG1 de control, e ii) evitan la neovascularizacion coroidea en un modelo de raton bien establecido de NVC inducida por laser de kripton, asf como en el control positivo (Kenacort®).

Referencias

En la presente solicitud, las referencias citadas son:

1. Carmeliet P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 2005; 438(7070):932-936.

2. Sherris D. Ocular drug development-future directions. Angiogenesis. 2007; 10(2):71-76.

3. Buckanovich RJ, et al. Endothelin B receptor mediates the endothelial barrier to T cell homing to tumors and

disables immune therapy. Nat Med. 2008; 14(1):28-36.

4. Shojaei F,Ferrara N. Antiangiogenesis to treat cancer and intraocular neovascular disorders. Lab Invest. 2007;

87(3):227-230.

5. Cao Y. Tumor angiogenesis and molecular targets for therapy. Front Biosci. 2009; 14(3962-3973.

6. Folkman J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery? Nat Rev Drug Discov. 2007; 6(4):273-286.

7. Paez-Ribes M, et al. Antiangiogenic therapy elicits malignant progression of tumors to increased local invasion

and distant metastasis. Cancer Cell. 2009; 15(3):220-231.

8. Takeda A, et al. CCR3 is a target for age-related macular degeneration diagnosis and therapy. Nature. 2009;

460(7252):225-230.

9. Ma WW,Adjei AA. Novel agents on the horizon for cancer therapy. CA Cancer J Clin. 2009; 59(2): 111-137.

10. Rosenfeld PJ, et al. Ranibizumab for neovascular age-related macular degeneration. N Engl J Med. 2006; 355(14):1419-1431.

11. Fletcher EC,Chong NV. Looking beyond Lucentis on the management of macular degeneration. Eye. 2008; 22(6):742-750.

12. Duch S, Buchacra O, Milla E, Andreu D,Tellez J. Intracameral bevacizumab (Avastin) for neovascular glaucoma: a pilot study in 6 patients. J Glaucoma. 2009; 18(2):140-143.

13. Moraczewski AL, Lee RK, Palmberg PF, Rosenfeld PJ,Feuer WJ. Outcomes of treatment of neovascular glaucoma with intravitreal bevacizumab. Br J Ophthalmol. 2009; 93(5):589-593.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

14. Dastjerdi MH, et al. Topical bevacizumab in the treatment of corneal neovascularization: results of a prospective, open-label, noncomparative study. Arch Ophthalmol. 2009; 127(4):381-389.

15. Jacobs DS, Lim M, Carrasquillo KG,Rosenthal P. Bevacizumab for corneal neovascularization. Ophthalmology. 2009; 116(3):592-593; author reply 593-594.

16. Oh JY, Kim MK, Shin MS, Lee HJ, Lee JH,Wee WR. The anti-inflammatory effect of subconjunctival bevacizumab on chemically burned rat corneas. Curr Eye Res. 2009; 34(2):85-91.

17. Ueno S, et al. Prolonged blockade of VEGF family members does not cause identifiable damage to retinal neurons or vessels. J Cell Physiol. 2008; 217(1): 13-22.

18. Salgaller ML. Technology evaluation: bevacizumab, Genentech/Roche. Curr Opin Mol Ther. 2003; 5(6):657- 667.

19. Reichert JM,Valge-Archer VE. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2007; 6(5):349-356.

20. Gerber HP,Ferrara N. Pharmacology and pharmacodynamics of bevacizumab as monotherapy or in combination with cytotoxic therapy in preclinical studies. Cancer Res. 2005; 65(3):671-680.

21. Ellis LM,Hicklin DJ. VEGF-targeted therapy: mechanisms of anti-tumour activity. Nat Rev Cancer. 2008; 8(8):579-591.

22. Bergers G,Hanahan D. Modes of resistance to anti-angiogenic therapy. Nat Rev Cancer. 2008; 8(8):592-603.

23. Dorrell MI, Aguilar E, Scheppke L, Barnett FH,Friedlander M. Combination angiostatic therapy completely inhibits ocular and tumor angiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104(3):967-972.

24. Ratner M. Genentech discloses safety concerns over Avastin. Nat Biotechnol. 2004; 22( 10): 1198.

25. Chen HX,Cleck JN. Adverse effects of anticancer agents that target the VEGF pathway. Nat Rev Clin Oncol. 2009; 6(8):465-477.

26. Bensussan A. BY55 (CD160). Protein Rev. Web. 2000; 1(72-73.

27. Anumantha A, et al. Cloning of BY55, a novel Ig superfamily member expressed on NK cells, CTL, and intestinal intraepithelial lymphocytes. J. Immunol. 1998; 161(6):2780-2790.

28. Fons P, et al. Soluble HLA-G1 inhibits angiogenesis through an apoptotic pathway and by direct binding to CD160 receptor expressed by endothelial cells. Blood. 2006; 108(8):2608-2615.

29. Maeda M, et al. Murine CD160, Ig-like receptor on NK cells and NKT cells, recognizes classical and non classical MHC class I and regulates NK cell activation. J. Immunol. 2005; 175(4426-4432.

30. Giuriato S, et al. Development of a conditional bioluminescent transplant model for TPM3-ALKinduced tumorigenesis as a tool to validate ALK-dependent cancer targeted therapy. Cancer Biol Ther. 2007; 6(8): 13181323.

31. Cursiefen C. Immune privilege and angiogenic privilege of the cornea. Chem Immunol Allergy. 2007; 92(50-57.

32. Smith LE, et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1994; 35(1): 101-111.

33. Economopoulou M, et al. Inhibition of pathologic retinal neovascularization by alpha-defensins. Blood. 2005; 106(12):3831-3838.

34. Yu L, et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008; 49(2):522-527.

35. Bock F, et al. Bevacizumab as a potent inhibitor of inflammatory corneal angiogenesis and lymphangiogenesis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007; 48(6):2545-2552.

36. Habot-Wilner Z, Barequet IS, Ivanir Y, Moisseiev J,Rosner M. The inhibitory effect of different concentrations of topical bevacizumab on corneal neovascularization. Acta Ophthalmol. 2009.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

37. Hashemian MN, Moghimi S, Kiumehr S, Riazi M,Amoli FA. Prevention and Treatment of Corneal Neovascularization: Comparison of Different Doses of Subconjunctival Bevacizumab with Corticosteroid in Experimental Rats. Ophthalmic Res. 2009; 42(2):90-95.

38. Hurmeric V, Mumcuoglu T, Erdurman C, Kurt B, Dagli O,Durukan AH. Effect of subconjunctival bevacizumab (Avastin) on experimental corneal neovascularization in guinea pigs. Cornea. 2008; 27(3):357-362.

39. Manzano RP, et al. Inhibition of experimental corneal neovascularisation by bevacizumab (Avastin). Br J Ophthalmol. 2007; 91(6):804-807.

40. Zhang Q, et al. Suppression of retinal neovascularization by the iNOS inhibitor aminoguanidine in mice of oxygen-induced retinopathy. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2009; 247(7):919-927.

41. Passaniti A, et al. A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor. Lab Invest. 1992; 67(4):519-528.

42. Asselin-Paturel C, et al. Transfer of the murine interleukin-12 gene in vivo by a Semliki Forest virus vector induces B16 tumor regression through inhibition of tumor blood vessel formation monitored by Doppler ultrasonography. Gene Ther. 1999; 6(4):606-615.

43. Hamano Y, et al. Thrombospondin-1 associated with tumor microenvironment contributes to lowdose cyclophosphamide-mediated endothelial cell apoptosis and tumor growth suppression. Cancer Res. 2004; 64(5):1570-1574.

44. Jain RK. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 2005; 307(5706):58-62.

45. Jain RK, Munn LL,Fukumura D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2002; 2(4):266-276.

46. Koehl GE, Gaumann A,Geissler EK. Intravital microscopy of tumor angiogenesis and regression in the dorsal skin fold chamber: mechanistic insights and preclinical testing of therapeutic strategies. Clin Exp Metastasis. 2009; 26(4):329-344.

47. Heymans O, Fissette J, Vico P, Blacher S, Masset D,Brouers F. Is fractal geometry useful in medicine and biomedical sciences? Med Hypotheses. 2000; 54(3):360-366.

48. Hamzah J, et al. Vascular normalization in Rgs5-deficient tumours promotes immune destruction. Nature. 2008; 453(7193):410-414.

49. Man S, et al. Antitumor effects in mice of low-dose (metronomic) cyclophosphamide administered continuously through the drinking water. Cancer Res. 2002; 62(10):2731-2735.

50. Greenberg JI, et al. A role for VEGF as a negative regulator of pericyte function and vessel maturation. Nature. 2008; 456(7223):809-813.

51. Padera TP, Stoll BR, Tooredman JB, Capen D, di Tomaso E,Jain RK. Pathology: cancer cells compress intratumour vessels. Nature. 2004; 427(6976):695.

52. Lin MI,Sessa WC. Antiangiogenic therapy: creating a unique "window" of opportunity. Cancer Cell. 2004; 6(6):529-531.

53. Barakonyi A, et al. Cutting edge: engagement of CD160 by its HLA-C physiological ligand triggers a unique cytokine profile secretion in the cytotoxic peripheral blood NK cell subset. J Immunol. 2004; 173(9):5349-5354.

54. Le Bouteiller P, et al. Engagement of CD160 receptor by HLA-C is a triggering mechanism used by circulating natural killer (NK) cells to mediate cytotoxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99(16963-16968.

55. Ambati BK, et al. Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1. Nature. 2006; 443(7114):993-997.

56. Cao Y, Langer R. Optimizing the delivery of cancer drugs that block angiogenesis. Sci Transl Med. 2010; 2(15):15ps13.

57. Makale M. Intravital imaging and cell invasion. Methods Enzymol. 2007; 426(375-401.

58. Elie N, Kaliski A, Peronneau P, Opolon P, Roche A,Lassau N. Methodology for quantifying interactions between

perfusion evaluated by DCE-US and hypoxia throughout tumor growth. Ultrasound Med Biol. 2007; 33(4):549- 560.

59. Wolfinger R,O'Connell M. Generalized linear mixed models: a pseudo-likelihood

5 approach. J. Statist. Computation Stimul. 1993; 4(233-243.

60. Liang KY,Zeger SL. Longitudinal Data Analysis Using Generalized Linear Models. Biometrika. 1986; 73(13-22).

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Anticuerpo anti-CD160 y anticuerpo anti-VEGF como una preparacion combinada para la utilizacion simultanea, separada o secuencial para tratar y/o prevenir las enfermedades oculares neovasculares.
2. 2. Preparacion combinada para la utilizacion segun la reivindicacion 1, en la que dicho anticuerpo anti-CD160 induce la muerte celular de las celulas endoteliales proliferantes activadas.
3. 3. Preparacion combinada para la utilizacion segun la reivindicacion 1 o 2, en la que dicho anticuerpo anti-CD160 es un compuesto seleccionado de entre anticuerpos monoclonales anti-CD160, fragmentos conservadores seleccionados de entre un Fab, un Fab', un F(ab)2, F(ab')2 y dAb de CL1-R2 y derivados conservadores de CL1-R2 seleccionados de entre el scFv, el (scFv)2, los diacuerpos, el scFv multimerico derivado de CL1-R2 y fusionado con un fragmento Fc y los anticuerpos que contienen por lo menos dos Fab unidos cabeza con cola, en la que CL1-R2 es un anticuerpo que puede obtenerse a partir del hibridoma depositado como CNCM I-3204.
4. 4. Preparacion combinada para la utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho anticuerpo anti-CD160 es un compuesto seleccionado de entre el anticuerpo monoclonal CL1-R2, sus fragmentos conservadores seleccionados de entre un Fab, un Fab', un F(ab)2, un F(ab')2 y dAb de CL1-R2 y sus derivados conservadores seleccionados de entre el scFv, el (scFv)2, los diacuerpos, el scFv multimerico derivado de CL1-R2 y fusionado con un fragmento Fc, y los anticuerpos que contienen por lo menos dos Fab unidos cabeza-con-cola, en la que CL1-R2 es un anticuerpo que puede obtenerse a partir del hibridoma depositado como CNCM I-3204.
5. 5. Preparacion combinada para la utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que la enfermedad ocular neovascular se selecciona de entre:

   - todas las formas de neovascularizaciones corneales;

   - todas las formas de retinopatfas;

   - la enfermedad de Norrie;

   - todas las formas de neovascularizaciones coroideas, las vasculopatfas polipoideas retinocoroideas, los neovasos coroideos retrofoveolares asociados a miopia y la distrofia de Sorsby;

   - los melanomas uveales; y

   - la rubeosis del iris y el glaucoma neovascular.
6. 6. Preparacion combinada para la utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que la enfermedad ocular neovascular se selecciona de entre:

   - las neovascularizaciones que se producen como complicaciones de injertos corneales y/o infecciones corneales y/o agresiones ambientales corneales seleccionadas de entre infecciones por patogenos y quemaduras quimicas;

   - las retinopatfas diabeticas isquemicas y edematosas, la retinopatia diabetica del prematuro, las formas no proliferativas y proliferativas de las retinopatfas, el edema quistoide macular, todas las formas de degeneracion macular senil (AMD), todas las degeneraciones viteliformes maculares incluyendo la enfermedad de Best; los angiomas oculares como la enfermedad de Von Hippel-Lindau; la enfermedad de Eale; la enfermedad de Coats;

   - la enfermedad de Norrie;

   - todas las formas de neovascularizaciones coroideas, vasculopatfas polipoideas retinocoroideas, neovasos coroideos retrofoveolares asociados a miopia y la distrofia de Sorsby;

   - los melanomas coroideos y sus metastasis; y

   - la rubeosis del iris y el glaucoma neovascular.
7. 7. Preparacion combinada para la utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la utilizacion para el tratamiento y/o la prevencion de enfermedades oculares neovasculares en un sujeto que no responde al tratamiento anti-VEGF.
8. 8. Preparacion combinada para la utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la utilizacion para el tratamiento de la degeneracion macular senil (AMD).
9. 9. Preparacion combinada para la utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 3 a el compuesto es el anticuerpo monoclonal CL1-R2, en la que CL1-R2 es un anticuerpo que del hibridoma depositado como CNCM I-3204.

   5
10. 10. Preparacion combinada para la utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 3 a el derivado conservador es un scFv monovalente o multivalente.

    8, caracterizada por que puede obtenerse a partir

    8, caracterizada por que