CN106999579A - 可辨识致病性tdp‑43的抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本揭示内容是关于新颖的致病性TDP‑43、可结合至该致病性TDP‑43的单克隆抗体及该抗体的用途。该新颖的致病性TDP‑43为直径约为2至400纳米的颗粒。

Description

可辨识致病性TDP-43的抗体及其用途

技术领域

本揭示内容是有关于新颖的分子量为43kDa的致病性转活化反应-脱氧核糖核酸-结合蛋白(transactivation responsive-DNA-binding protein,43kDa,TDP-43)、可结合至该致病性TDP-43的抗体及该抗体的用途。

先前技术

神经退化性疾病已成为现代社会不可忽视的健康议题。依据世界卫生组织报告，截至2025年，全球将会有超过75％的老年人口患有各式神经退化性疾病。额颞叶退化症(Frontotemporal lobar degeneration,FTLD)是美国年龄小于65岁的人口中第二常见的失智症；已知TDP-43是造成FTLD及肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateralsclerosis,ALS)的主因之一。然而，针对该些疾病，目前尚无有效的治疗方法，故各式研究仍致力于探讨参与调控致病性TDP-43形成的分子及相关机制。

有鉴于此，相关领域亟需确认参与调控致病性TDP-43的分子，藉此制备可用以预防或治疗由致病性TDP-43所造成的神经退化性疾病的药物。

发明内容

本发明是基于发现分子量为43kDa的转活化反应-脱氧核糖核酸-结合蛋白(transactivation responsive-DNA-binding protein,43kDa,TDP-43)寡聚体存在于病人脑中，此寡聚体于活体内外皆具有神经毒性，并会交联至阿尔茨海默症的淀粉样蛋白-β(Alzheimer’s amyloid-β,Aβ)而使Aβ形成淀粉样蛋白寡聚体。因此，一种能结合至TDP-43寡聚体的分子(例如，抗体)将可用以抑制TDP-43蛋白病变(proteinopathies)，并藉以制备出可诊断、预防或治疗由致病性TDP-43所造成的神经退化性疾病的药物(例如，疫苗及被动式免疫法)。

据此，本揭示内容旨在提供一种可专一结合至TDP-43寡聚体的抗体或其片段。该抗体包含一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3的氨基酸序列，而该轻链可变区则包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQID NO：7的氨基酸序列。

TDP-43寡聚体为一直径约2至400纳米(nanometer,nm)的颗粒。较佳的情况是，TDP-43寡聚体为一直径约40至60纳米的球型颗粒。

依据某些较佳的实施方式，本发明抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，而其轻链可变区则具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

在一实施方式中，本发明抗体是由一杂交瘤细胞株所制备，而该杂交瘤细胞株已寄存于生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)，寄存编号为BCRC 960494。

在另一实施方式中，本发明抗体是由一杂交瘤细胞株所制备，而该杂交瘤细胞株已寄存于生物资源保存及研究中心，寄存编号为BCRC 960495。

在再另一实施方式中，本发明抗体是由一杂交瘤细胞株所制备，而该杂交瘤细胞株已寄存于生物资源保存及研究中心，寄存编号为BCRC 960496。

在另一实施方式中，本发明抗体是由一杂交瘤细胞株所制备，而该杂交瘤细胞株已寄存于生物资源保存及研究中心，寄存编号为BCRC 960497。

在另一实施方式中，本发明抗体是由一杂交瘤细胞株所制备，而该杂交瘤细胞株已寄存于生物资源保存及研究中心，寄存编号为BCRC 960498。

因此，本揭示内容的第二方面提供了该抗体的用途，即，用以制备一种用以预防或治疗与TDP-43寡聚体相关疾病的药物或医药组合物。该药物或医药组合物包含一有效量的上述抗体及一药学上可接受的赋形剂。

依据本揭示内容较佳的实施方式，本发明抗体包含一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3的氨基酸序列，而该轻链可变区则包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7的氨基酸序列。在一特定实施例中，该重链可变区具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，而该轻链可变区则具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

依据本揭示内容其余较佳的实施方式，该抗体是由一杂交瘤细胞株所制备，而该杂交瘤细胞株已寄存于生物资源保存及研究中心，寄存编号为BCRC 960494、BCRC 960495、BCRC 960496、BCRC 960497或BCRC 960498。

本发明抗体的重量约占医药组合物总重量的0.1％至99％。在一实施方式中，本发明抗体的重量至少占医药组合物总重量的1％。在另一实施方式中，本发明抗体的重量至少占医药组合物总重量的5％。在再另一实施方式中，本发明抗体的重量至少占医药组合物总重量的10％。在另一实施方式中，本发明抗体的重量至少占医药组合物总重量的25％。

本揭示内容的药物或医药组合物可用以治疗与TDP-43寡聚体相关的疾病，该疾病可以是阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease)、嗜银颗粒性认知症(argyrophilic graindisease)、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、关岛肌肉萎缩性脊髓侧索硬化-帕金森氏失智症(ALS-parkinsonism dementia complex of Guam)、血管性失智症(vascular dementia)、额颞叶失智症(frontotemporal dementia)、语意失智症(semantic dementia)、雷维体失智(dementia with Lewy bodies)、亨汀顿氏舞蹈症(Huntington’s disease)、小脑萎缩症(Spinocerebellar ataxia)、包涵体肌病(inclusion body myopathy)、包涵体肌炎(inclusion body myositis)或帕金森氏症(Parkinson’s disease)。

因此，本揭示内容的第三方面提供了一种用以预防或治疗一个体的与TDP-43寡聚体相关疾病的方法。该方法包含投予该个体一治疗有效量的本发明抗体，藉以抑制TDP-43蛋白病变。

依据某些较佳的实施方式，本发明抗体包含一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3的氨基酸序列，而该轻链可变区则包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7的氨基酸序列。在一特定实施例中，该重链可变区具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，而该轻链可变区则具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

依据本揭示内容其余较佳的实施方式，该抗体是由一杂交瘤细胞株所制备，而该杂交瘤细胞株已寄存于生物资源保存及研究中心，寄存编号为BCRC 960494、BCRC 960495、BCRC 960496、BCRC 960497或BCRC 960498。

本揭示内容的方法可用以治疗与TDP-43寡聚体相关的疾病，该疾病可以是阿尔茨海默症、嗜银颗粒性认知症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、关岛肌肉萎缩性脊髓侧索硬化-帕金森氏失智症、血管性失智症、额颞叶失智症、语意失智症、雷维体失智、亨汀顿氏舞蹈症、小脑萎缩症、包涵体肌病、包涵体肌炎或帕金森氏症。

本揭示内容的第四方面提供了一种用以诊断一个体是否罹患与TDP-43寡聚体相关的疾病的方法。该方法包含由该个体取得一生物样品；将该生物样品与本发明抗体接触，以决定该生物样品中TDP-43寡聚物的含量；以及将该生物样品中TDP-43寡聚物的含量与取自一健康个体的对照样品的TDP-43寡聚物含量进行比对；其中，若该生物样品中TDP-43寡聚物的含量显著高于或低该对照样品的TDP-43寡聚物含量，即代表该个体患有与神经退化性疾病。

依据本揭示内容较佳的实施方式，该生物样品可以是脑部切片样品、脑脊液样品、全血样品、血清样品、血浆样品、尿液样品或黏液样品。

依据某些较佳的实施方式，本发明抗体包含一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3的氨基酸序列，而该轻链可变区则包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7的氨基酸序列。在一特定实施例中，该重链可变区具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，而该轻链可变区则具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

依据其余较佳的实施方式，该抗体是由一杂交瘤细胞株所制备，而该杂交瘤细胞株已寄存于生物资源保存及研究中心，寄存编号为BCRC 960494、BCRC 960495、BCRC960496、BCRC 960497或BCRC 960498。

因此，本揭示内容的第五方面提供了一种用以侦测一生物样品的致病性TDP-43表达的试剂盒。侦测的结果可用以评估该个体是否患有与TDP-43寡聚体相关的疾病。该试剂盒至少包含一容器及用以侦测TDP-43寡聚体的试剂，其中该试剂包含本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体及一附于容器内的说明书，该说明书用以告知利用本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体来侦测致病性TDP-43(即上述的TDP-43寡聚体)的方法。该说明书可以是书册、磁带、CD、VCD或DVD。该试剂盒可另包含一用以对照指出TDP-43寡聚体于健康个体的正常含量的对照组。

在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。

附图说明

为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：

图1、全长TDP-43会形成与淀粉样蛋白相似的寡聚体。图1A：全长TDP-43的分析式粒径筛析层析(analytical size-exclusion chromatography,SEC)结果，其中由大肠杆菌纯化的TDP-43是以光波波长为280纳米时的吸光值进行侦测(实线)，而由人类HEK293细胞纯化的TDP-43则是由隙缝印迹法(slot blotting)的强度进行定量(虚线)；图中所示的停留时间为分子量标准组的停留时间。图1B：TDP-43的斑点杂交法(Dot blotting)结果，其利用抗-淀粉样蛋白寡聚体的抗体A11来进行侦测；以A11分别对新鲜纯化且未经粒径筛析层析处理的TDP-43(预载TDP-43)、经粒径筛析层析处理的TDP-43(冲提体积，TDP-43寡聚体)及缓冲液进行免疫染色。图1C：将新鲜纯化的TDP-43分别沾点于缓冲液、包含9M尿素的缓冲液、包含7.2M盐酸胍(guanidine hydrochloride,GdnHCl)的缓冲液或包含2％十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)的缓冲液中，并以90℃加热或不加热1小时；该试验重复三次，并分别以A11抗体、抗-TDP-43的N端(残基1-260)的抗体及抗-TDP-43的C端(残基250-414)的抗体来进行侦测。图1D：以穿透式电子显微镜(transmission electronmicroscope,TEM)来检测TDP-43寡聚体(比例尺为500纳米)，左上方为单一寡聚体的放大图(比例尺为50纳米)。图1E：原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)来检测TDP-43寡聚体(比例尺为500纳米)，左上方为单一寡聚体的放大图(比例尺为50纳米)。图1F及图1G：为经粒径筛析层析处理后，TDP-43寡聚体的动态光散射(dynamic light scattering,DLS)分析结果；其中粒径可以散射光强度及颗粒数量来表示。

图2、DP-43的结构、硫代黄素T(Thioflavin T,ThT)荧光及DNA结合特性图2A：全长TDP-43(实线)及短式TDP-43(虚线)的远紫外光旋光仪光谱(Far-UV CD spectra)；波长范围为250至190纳米。图2B：全长TDP-43(实线)及短式TDP-43(虚线)的Bis-ANS荧光光谱；缓冲液讯号标示为点线。图2C：TDP-43及Aβ纤维与硫代黄素T的结合光谱；全长TDP-43的硫代黄素T荧光发散波长以实线连接的■表示，短式TDP-43的硫代黄素T荧光发散波长以虚线连接的●表示，而Aβ纤维的硫代黄素T荧光发散波长则以点线连接的▲表示；仅Aβ纤维具有与硫代黄素T结合的讯号。图2D：利用荧光滴定来检测TDP-43与TAR DNA的结合；以单股TARDNA-A位(实心)及-B位(空心)分别滴定全长TDP-43(方形)及短式TDP-43(圆形)；利波长为280纳米的光波进行激发时，于350纳米波长可侦测到TDP-43或TDP-43s的最大发散量；该些结果是以起始点为基准进行标准化，且连接线为最适线。

图3、TDP-43与Aβ的交联图3A：在不含或含有0.4至4％的TDP-43时，Aβ纤维化的硫代黄素T试验结果；该浓度是以TDP-43的摩尔百分比来表示。图3B：时间点为0，不含或含有TDP-43的光致交联(Photo-induced cross-linking,PICUP)试验结果，其中TDP-43的浓度是以摩尔百分比来表示。图3C：不含或含有4％TDP-43的Aβ终点产物的穿透式电子显微镜结果(比例尺为100纳米)。

图4TDP-43寡聚体会于活体外及活体内引发神经轴突退化及毒性TDP-43对人类BE(2)-C细胞的细胞毒性可藉由溴化噻唑蓝四氮唑(MTT,3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)(图4A)及乳酸去氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)LDH试验来分析(图4B)(数量为3，平均值±平均标准偏差)。图4C：利用MTT试验来分析TDP-43对初代神经元培养的细胞毒性；在该试验中，细胞存活率是以缓冲液对照组做为基准进行标准化(数量为3，平均值±标准偏差).图4A及图4C是以单因子变异数分析(one way-ANOVA)及Tukey事后测定(Tukey post test)进行统计，图4B则是以单因子变异数分析及双尾、不成对的Student’s t-test(two tailed,unpaired Student’s t-test)进行分析(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。图4D：以对照组或0.44μM的TDP-43处理的初代神经元的免疫细胞化学染色结果；样品分别以MAP-2、GFAP及DAPI进行荧光染色。图4E：将TDP-43注射至小鼠海马回，会造成海马回的CA区的神经元减少；分别将缓冲液对照组及TDP-43注入海马回中(每组只数为3只)后，以神经元特定标志NeuN及核特定染剂DAPI进行免疫组织化学染色；箭头所指处为神经元减少的位置(比例尺为50微米)。

图5、TDP-O抗体可专一地辨识TDP-43寡聚体图5A：将新鲜纯化的TDP-43分别溶于原缓冲液、包含9M尿素的缓冲液、包含7.2M盐酸胍的缓冲液或包含2％十二烷基硫酸钠的缓冲液中，并于90℃加热或不加热1小时后，以多克隆抗体TDP-O来进行斑点杂交法分析，其中该多克隆抗体TDP-O是以TDP-43寡聚体为免疫原所制备的抗体；TDP-O与TDP-43所产生的免疫反应相似于图1C所示的A11结果。图5B：分别以A11及TDP-O抗体对Aβ寡聚体进行斑点杂交法分析；结果显示A11可辨识Aβ寡聚体，TDP-O则不会。图5C：原倍TDP-43(点线)及3倍浓缩的TDP-43(实线)的粒径筛析层析结果，其中TDP-43寡聚体的冲提体积为★，TDP-43单体的冲提体积为☆，数字则为分子量标准组。图5D：收集1ml的粒径筛析层析分液，以TDP-O(上图)及N_1-260抗体(下图)进行斑点杂交法分析。图5E：以酵素免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)分析由粒径筛析层析纯化的TDP-43寡聚体及单体；将TDP-43样品依浓度涂布于ELISA盘后，分别以TDP-O(■)及N_1-260(□)抗体侦测TDP-43寡聚体，而分别以TDP-O(●)及N_1-260(○)抗体侦测TDP-43单体；TDP-O抗体对TDP-43寡聚体具有显著较高的专一性。

图6、FTLD-TDP转基因鼠的TDP-43寡聚体表达量会随着年龄增加而增加图6A：将取自于野生型、6个月或12个月大的TDP-43转基因鼠(TDP-43Tg^+/+transgenic mice)脑部的切片进行免疫荧光染色，藉以侦测人类TDP-43及TDP-43寡聚体的表达；以抗-TDP寡聚体、TDP-43及DAPI染色细胞(比例尺为100微米)；框选区域进一步以更高倍率显示于最右栏(比例尺为25微米)。图6B：定量结果指出具有TDP-O及TDP-43沉淀的细胞比例与年龄相关(每组3只，其中各小鼠随机取5视野进行定量，数据以平均值±平均标准偏差表示；结果是以单因子变异数分析及Tukey事后测定进行统计分析；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。

图7、FTLD-TDP病患会表达TDP-43寡聚体共有三名FTLD-TDP病患、三名神经及病理分析上皆为正常的同龄健康个体，以及三名罹患阿尔茨海默症而无TDP-43包涵体的病患(做为神经退化疾病对照)接受本研究分析；该些个体的脑部切片代表图分列于图7中，其中(A)、(C)及(E)为利用TDP-O抗体对FTLD-TDP病患的海马回(C)及前额叶皮质部位(A,E)进行TDP-43免疫组织化学染色图；TDP-O可辨识深染、卵圆形或不规则形的位于细胞质内的包涵体(箭号)及神经纤维网(neuropil，为营养不良的轴突)中逗号形式的包涵体(箭头)；在某些如(E)图所示的皮质区域中，神经元细胞质会呈现粗颗粒状的免疫反应；如(B)、(D)及(F)所示，对照个体的脑部切片并不会产生任何TDP-O的免疫染色反应；相较于针对TDP-43单体的抗体，TDP-O抗体不会染到细胞核，证实该抗体可专一地结合至不正常折叠的TDP-43；各图中的比例尺皆为20微米。

图8、由病人海马回免疫沉淀萃取的TDP-43寡聚体会被TDP-O抗体以免疫金标定法标定萃取FTLD-TDP病患的海马回组织，并以TDP-O抗体进行免疫沉淀；将萃取物以N端TDP-43抗体及免疫金标记后，利用电子显微镜(electron microscopy,EM)分析观察(比例尺为50纳米)。图8A：FTLD-TDP病患的TDP-43寡聚体(比例尺为100纳米)。图8B：TDP-43寡聚体的放大图(比例尺为50纳米)。

图9、TDP-O单克隆抗体对TDP-43寡聚体具有高度专一性分别将TDP-O-3、-5、-8、-9及-10杂交瘤细胞株所产生的TDP-O单克隆抗体，以不同浓度(每毫升1-2x10^-5微克)进行ELISA试验分析，藉以侦测以十二烷基硫酸钠解构变性或未解构变性的TDP-43。

图10、TDP-O单克隆抗体对纯化的TDP-43寡聚体具有高度专一性利用TDP-O杂交瘤细胞株的条件培养液对以粒径筛析层析纯化过的TDP-43寡聚体及单体进行ELISA试验分析。图10A：以Superdex 200 10/300GL管柱分离并收集TDP-43寡聚体及单体。图10B：在ELISA试验中，利用TDP-O-3、-5、-8、-9及-10杂交瘤细胞株的条件培养液来侦测TDP-43寡聚体及单体。

图11、5株TDP-O单克隆抗体的重链可变区及轻链可变区具有一致性的氨基酸序列X表任何的氨基酸残基，而CDR则是互补性决定区(complementarity determining region)的缩写。

图12、TDP-O单克隆抗体可减少由TDP-43寡聚体所产生的细胞毒杀反应利用MTT试验来检测BE(2)-C细胞的存活率。将数据表示为平均值±标准偏差。以单因子变异数分析，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。该些结果显示投予TDP-O抗体可显著减少由TDP-43寡聚体所引发的毒性。

具体实施方式

为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

I.定义

“TDP-43蛋白病变”(TDP-43 proteinopathy)一词在本文中是指与分子量为43kDa的转活化反应-脱氧核糖核酸-结合蛋白(transactivation responsive-DNA-bindingprotein,43kDa,TDP-43)相关的疾病。TDP-43为一种疾病蛋白，其与具有泛素包涵体(ubiquitin-positive inclusion,FTLD-U)表现的额颞叶退化症及肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症相关。TDP-43蛋白病变包含，但不限于，阿尔茨海默症、嗜银颗粒性认知症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、关岛肌肉萎缩性脊髓侧索硬化-帕金森氏失智症、血管性失智症、额颞叶失智症、语意失智症、雷维体失智、亨汀顿氏舞蹈症、小脑萎缩症、包涵体肌病、包涵体肌炎或帕金森氏症。

“有效量”(effective amount)一词于本说明书中是指对与TDP-43寡聚体相关的疾病达到理想治疗结果的有效剂量及治疗时间周期。

“药学上可接受的”(pharmaceutically acceptable)一词是指当投予至人体后，通常被视为安全的分子或组合物，例如该些具有生理兼容性及不会产生过敏或类似不当反应的分子或组合物。较佳的情况是，“药学上可接受的”(pharmaceutically acceptable)一词在本说明书中是指经由美国联邦或州政府的管理机构认可且可应用于动物或人类的分子或组合物。

“投予”(administered、administering或administration)在本说明书中为可互换的词汇，且指直接给予本发明的专一性抗体或组合物的方法。

“个体”(subject)或“病患”(patient)是指包含人类的动物，其是可接受本发明的组合物及/或方法的治疗。除非特定指出单一性别，否则“个体”(subject)或“病患”(patient)同时意指雄性及雌性。因此，“个体”(subject)或“病患”(patient)包含任何可接受治疗的哺乳类动物。“个体”(subject)或“病患”(patient)包含，但不限于，人类、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、猪、羊、牛、马、狗、猫、鸟及家禽。在本发明实施例中，病患为人类。

“治疗”(treat或treatment)在本说明书是指产生一药学及/或生理的效果，例如侦测致病性TDP-43的表现、预防或治疗器官萎缩，或是抑制失智症、肌肉无力及僵直。该效果可以是预防性的，即完全或部分预防一疾病或其病征；及/或是治疗性的，即部分或完全治愈一疾病及/或其所造成的不适。“治疗”(Treatment)在本说明书包含预防、治疗或减缓一哺乳类动物(特别是人类)的疾病；该治疗包含：(1)预防、治疗或减缓一个体罹患一疾病(例如神经退化性疾病)，其中该个体为罹患该疾病的高风险族群，或是已罹患该疾病而尚未确诊断定；(2)抑制一疾病(例如抑制其发生)；或(3)减轻一疾病(例如减轻与该疾病相关的征状)。

“抗体”(antibody或antibodies)在本说明书中采广义定义，包含具有生物活性的单克隆抗体、多克隆抗体、多专一性抗体(例如双专一性抗体)及上述任一抗体片段；该生物活性是指在包含他种蛋白及/或分子的混合物中，能辨识标的蛋白并专一结合至抗原的特性。依据本揭示内容的一实施方式，本发明抗体为一多克隆抗体，其可专一地辨识TDP-43寡聚体。

“单克隆抗体”(monoclonal antibody)一词在本说明书是指一抗体，其由一群具有相同构型的抗体分离出来，且不需经过特定方法加以建构。相较于多克隆抗体，其包含可分别辨识不同抗原决定位置(epitope)的多种抗体，单克隆抗体仅能专一辨识一抗原的单一抗原决定位置。本揭示内容的单克隆抗体可以藉由融合方法或重组DNA方法来制备。本说明书的单克隆抗体可包含“嵌合型”(chimeric)或“重组型”(recombinant)抗体，其中该抗体重链及/或轻链的部分区域是与一源自一特定物种的抗体或一分属一特定抗体型或亚型的抗体，具有相同或同源的对应序列；而重链及轻链的其他区域则是与源自其他物种或分属其他抗体型或亚型的另一抗体，或是抗体片段(只要该片段具有相关的生物活性)，具有相同或同源的对应序列。依据本揭示内容的一特定实施方式，本发明抗体为一单克隆抗体，其可专一地辨识TDP-43寡聚体。

非人类(例如小鼠)抗体的“人源化”(humanized)抗体是指一种包含源自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合型抗体。人源化抗体为人类的免疫球蛋白，其可变区的残基由源自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔子或其他具有所需专一性或亲合性的非人类灵长类)的可变区残基所取代。在某些情况下，人类免疫球蛋白的Fv骨架区域(Fv frameworkregion,FR)残基是由相对应的非人类残基所取代。一般来说，人源化抗体大致包含至少一个(通常为二个)可可变区，其中全部或多数FR区域为人类免疫球蛋白的序列。人源化抗体可以选择性地包含一免疫球蛋白(通常为一人类免疫球蛋白)的恒定区的部分序列。

本说明书所用的单数名词“一”(a或an)及“该”(the)涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。

II.发明说明

已知分子量为43kDa的转活化反应-脱氧核糖核酸-结合蛋白(transactivationresponsive-DNA-binding protein,43kDa,TDP-43)为一种致病性蛋白，其与具有泛素包涵体(ubiquitin-positive inclusion,FTLD-U)表现的额颞叶退化症及肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症相关。本申请案发明人发现全长的TDP-43会形成结构稳定且具神经毒性的球形寡聚体，该寡聚体会交联至阿尔茨海默症的淀粉样蛋白-β(Alzheimer’s amyloid-β,Aβ)并导致Aβ形成淀粉样蛋白寡聚体；因此，一能与TDP-43寡聚体结合的药剂(例如抗体)将可用以抑制TDP-43蛋白病变；据此，该药剂可用以制备一种药物(例如疫苗或被动式免疫法)，藉以预防或治疗由致病性TDP-43所造成的神经退化性疾病。

因此，本揭示内容的第一方面提供了一种抗体，更具体来说，该抗体为一种能辨识TDP-43寡聚体的抗体，并藉此抑制一蛋白(特别是TDP-43)的聚集，其中该聚集现象与一疾病相关。一般来说，蛋白聚集是一种自传播反应(self-propagating manner)，一旦开始，聚集反应将会接连自动地发生，并引发构型改变及/或更多蛋白分子的聚合，最终形成无法被蛋白酶分解的有毒产物。经此形成的蛋白寡聚体被认为是造成神经退化性疾病的近因的一，该些神经退化性疾病包含阿尔茨海默症、嗜银颗粒性认知症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、关岛肌肉萎缩性脊髓侧索硬化-帕金森氏失智症、血管性失智症、额颞叶失智症、语意失智症、雷维体失智、亨汀顿氏舞蹈症、小脑萎缩症、包涵体肌病、包涵体肌炎及帕金森氏症。

依据本揭示内容较佳的实施方式，TDP-43寡聚体为粒径约2至400纳米的颗粒。较佳的情况是，TDP-43寡聚体为粒径约2至400纳米的颗粒，例如20至30纳米、30至40纳米、40至50纳米、50至60纳米、60至70纳米、70至80纳米、80至90纳米、90至100纳米、100至120纳米、120至140纳米、140至160纳米、160至180纳米、180至200纳米、200至220纳米、220至240纳米、240至260纳米、260至280纳米、280至300纳米、300至320纳米、320至340纳米、340至360纳米、360至380纳米及380至400纳米。更佳的情况是，TDP-43寡聚体为粒径约40至60纳米的球形或环状颗粒。

本揭示内容的抗体可专一地结合至上述TDP-43寡聚体、其抗原决定位置、其不同构型及各构型的抗原决定位置。在较佳实施方式中，本抗体可优先结合至致病性TDP-43，更具体来说，该致病性TDP-43为一全长的TDP-43寡聚体颗粒，其粒径大小约为2至400纳米。

为制备所述的单克隆抗体，先将适量的TDP-43寡聚体注入诸如小鼠、大鼠或兔子等动物体内，使其产生免疫反应。一般来说，佐剂会先与TDP-43寡聚体溶液混合，再将其注入动物体内。适用于本发明的佐剂包含弗氏完全佐剂(Freund＇s complete adjuvant,FCA)、弗氏不完全佐剂(Freund＇s incomplete adjuvant,FIA)及氢氧化铝佐剂。抗体的注射可以血管、皮下、腹腔或肌肉等方式给予。抗原注射的时间间隔并无特定限定。抗原注射的间隔时间可为数天至数周，较佳的方法是，2至3周，共1至10次(较佳为2至5次)。注射后，一旦抗体的效价到达2或更高的吸光值，则停止后续注射，并继续饲养该动物1个月。接着，至少再注射一次。于最后一剂注射数天后(较佳约3至5天)，取出该动物的脾脏细胞及区域淋巴结。采取血液样品并将之离心处理以分离血清。可利用任何适合的方法来检测所得血清中的抗体效价，例如酵素免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、酵素免疫分析(enzyme immunoassay,EIA)或放射免疫分析(radio immunoassay,RIA)。在一较佳的实施例中，是利用ELISA来测定抗体的效价。

由分离的脾脏细胞及区域淋巴结制备可产生抗体的细胞。在制备可产生抗体的细胞时，宜先尽可能移出组织残渣及红血球。在此步骤可使用商业购买的红血球去除剂。或者是，可以使用包含氯化铵及三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane(Tris))的缓冲液。立即将可产生抗体的细胞与永生细胞(例如骨髓瘤细胞)进行融合，以制得杂交瘤细胞；杂交瘤细胞为一种可持续生长繁殖，并产生抗体的半永生细胞。可以使用由动物(例如小鼠)取得的常用的细胞株。较适用于本发明的细胞株为可有效融合、持续产生高量抗体、对次黄嘌呤-胺蝶呤-胸腺核苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine,HAT)培养液具有敏感性，且唯有在与可产生抗体的细胞融合后方可存活的细胞株。适合的骨髓瘤细胞包含，但不限于，小鼠骨髓瘤细胞株(例如骨髓瘤FO细胞)及人类骨髓瘤细胞株(例如Karpas 707H)。

细胞融合通常是将脾脏细胞或淋巴结细胞与商业取得的骨髓瘤细胞在一促进细胞融合因子的作用下，进行融合反应，例如平均分子量约为200至20,000kDa的聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)或其他类似物。或者是，细胞融合可以利用商业细胞融合仪，藉由电刺激(例如电融合)来进行融合反应。融合后，将所得细胞稀释并培养于HAT培养液中。

由该些融合细胞中挑选出适合的杂交瘤细胞。于HAT培养液中存活的融合细胞会形成聚集群落。收集各培养液的上清液，且以TDP-43寡聚体检测是否具有抗体效价。如上所述，可以使用酵素免疫吸附法、酵素免疫分析或放射免疫分析来进行检测，其将TDP-43寡聚体或寡聚体解构后形成TDP-43的单体涂布于盘中，并由此进行筛选。一旦确认可产生抗体的孔洞，即可将其中的细胞转移至不含胺蝶呤的次黄嘌呤-胸腺核苷(hypoxanthine-thymidine,HT)培养液中培养。经过培养，再次确认培养上清液中的抗体效价。由最终筛选出的细胞中，分离出单一颗细胞。待单一颗细胞生长繁殖成一聚集群落后，筛选对TDP-43寡聚体具有高度专一性的聚集群落，并使其持续生长繁殖以制成杂交瘤细胞株。

依据本揭示内容较佳的实施方式，共筛选出5株杂交瘤细胞株：TDP-O-3、TDP-O-5、TDP-O-8、TDP-O-9及TDP-O-10，单克隆抗体可由该些杂交瘤细胞株以任何方式进行分离或制备。举例来说，可以将杂交瘤细胞株培养于低血清浓度的培养液中，再由该培养上清液制备抗体。或者是，将杂交瘤细胞株注入动物的腹腔，由腹水来制备抗体。抗体可以任何方式进行纯化，该方式包含亲和性管柱、胶滤层析、离子交换层析或相关技术。可以使用任何相关领域的本领域技术人员所熟知的方法或其组合。

依据特定的实施方式，本揭示内容的单克隆抗体分别由杂交瘤细胞株TDP-O-3、TDP-O-5、TDP-O-8、TDP-O-9及TDP-O-10制备，该些杂交瘤细胞株已寄存于台湾新竹的食品工业发展及研究中心(Development and Research Institute,FIDRI)的生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)，其寄存编号分别为BCRC 960494、BCRC 960495、BCRC 960496、BCRC 960497及BCRC 960498。

依据较佳实施方式，本单克隆抗体的重链及轻链可变区分别包含一致性的氨基酸序列(consensus sequence)。据此，本单克隆抗体分别包含一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3的氨基酸序列，而该轻链可变区则包含SEQ ID NO：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7的氨基酸序列。较佳的实施方式为，人源化单克隆抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，而其轻链可变区则具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在本揭示内容所述的氨基酸序列中(特别是SEQ IDNO：1到SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8)，Xaa表示任何已知的氨基酸残基的L-或D-形式。在一实施例中，Xaa是一酸性氨基酸残基(例如天门冬氨酸(aspartate)或谷氨酸(glutamate))。在另一实施例中，Xaa是一碱性氨基酸残基(例如赖氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)或组氨酸(histidine))。在再另一实施例中，Xaa是一非极性氨基酸残基(例如丙氨酸(alanine)、缬氨酸(valine)、亮氨酸(leucine)、异亮氨酸(isoleucine)、脯氨酸(proline)、苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)或色氨酸(tryptophan))。在另一实施例中，Xaa是一不带电的极性氨基酸残基(例如甘氨酸(glycine)、天冬酰氨酸(asparagine)、谷胺酰胺(glutamine)、半胱氨酸(cysteine)、丝氨酸(serine)、苏氨酸(threonine)或酪氨酸(tyrosine))。

或者是，抗-TDP-43寡聚体的单克隆抗体可以由DNA基因克隆来制备。将用以编码抗-TDP-43寡聚体单克隆抗体的DNA分离出来后，再用传统步骤进行测序，例如可专一结合至用以编码单克隆抗体的重链及轻链基因的寡核苷酸探针。较佳的DNA来源是利用该些杂交瘤细胞株(例如TDP-O-3、TDP-O-5、TDP-O-8、TDP-O-9或TDP-O-10杂交瘤细胞株)。一旦分离后，可将DNA建构至表达载体，再将表达载体转染至宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猿猴细胞COS、中国仓鼠卵巢细胞CHO或不会产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，藉此于重组宿主细胞中制备出单克隆抗体。

所制得的单克隆抗体及用以编码该些单克隆抗体的DNA可用以制备嵌合型抗体(例如双专一性抗体)、人源化抗体及/或其中的抗体片段。

非人类来源的单克隆抗体因具有免疫抗原性(immunogenicity)而会造成过敏反应。单克隆抗体多是源自小鼠，其注射至人体后往往会引起严重的免疫反应。为降低本发明抗-TDP-43寡聚体单克隆抗体的免疫抗原性，将小鼠抗-TDP-43寡聚体单克隆抗体的重链及轻链可变区与抗体的恒定区接合，藉此制备人源化抗体。

为制备人源化的抗-TDP-43寡聚体抗体，先将该些用以编码抗体的DNA分离并测序，再据以进行人源化建构。

依据本揭示内容较佳的实施方式，对互补性决定区(complementary determiningregion,CDR)进行转接(grafting)，其将抗体的VH及VL基因中的CDR置换为特定的CDR编码片段(例如该些抗-TDP-43寡聚体抗体中，用以编码与TDP-43寡聚体结合的氨基酸片段的DNA片段)。由此制备出的抗体仅有CDRs源自于小鼠的抗体，而VH及VL基因中其他的骨架区，以及恒定区的基因(即CK或CH1-H-CH2-CH3)则是人类的IgG。

在较佳的实施方式中，人源化抗-TDP-43寡聚体单克隆抗体包含一重链可变区及一轻链可变区。所制成的人源化抗-TDP-43寡聚体单克隆抗体可依据相关领域中的标准步骤来进行纯化，包含扫流过滤(cross-flow filtration)、亲和性管柱层析(affinitycolumn chromatography)或胶体过虑(gel filtration)等方法。须知，人源化抗体的作用应与小鼠抗-TDP-43寡聚体抗体的作用相同或大致相似。较佳的情况是，相较于老鼠抗体，人源化抗-TDP-43寡聚体抗体(不论是Fab或全长IgG的形式)在施用至人类个体时，应会产生较佳的作用。在某些实施方式中，人源化抗-TDP-43寡聚体抗体可用以制备本揭示内容的双专一性抗体。

可利用任何活体外或活体内的TDP-43蛋白病变模式来确认本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体。本领域技术人员应知，可利用动物模式(例如实施例7所述的动物模式)来确认本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体。或者是，可利用实施例8所述的相关病人样品来确认本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体。

依据本揭示内容一实施例所述的活体外试验数据，本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体可抑制由TDP-43寡聚体所引发的细胞毒性。依据一实施例，足以抑制由-TDP-43寡聚体所引发的细胞毒性的抗-TDP-43寡聚体抗体浓度约为每毫升0.001-5.0毫克；举例来说，每毫升0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0毫克。较佳的浓度约为每毫升0.01-1.0毫克。更佳的浓度约为每毫升0.02-0.08毫克。

本领域技术人员应知，TDP-43蛋白病变的实验模式可做为预防性测试或治疗性测试。在预防性测试中，在动物产生TDP-43蛋白病变或其征症前，即先投予药物，藉以测试本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体对TDP-43蛋白病变或其征症的预防、减缓或延缓的功效。在治疗性测试中，药物是在动物产生TDP-43蛋白病变或其征症后方进行投予，藉以测试本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体对TDP-43蛋白病变或其征症的治疗、减轻或舒缓的功效。TDP-43蛋白病变的征状包含，但不限于，致病性TDP-43于测试个体的脑部、脊髓、脑脊液或血清的数量变化。

据此，本揭示内容提供一种医药组合物或一药物，其可用以治疗一种与Aβ堆积相关的神经退化性疾病。该医药组合物包含一有效量的本发明抗-TDP-43寡聚体抗体及一药学上可接受的赋形剂。该种可利用本揭示内容的医药组合物或药物进行治疗的TDP-43寡聚体相关疾病包含，但不限于，阿尔茨海默症、嗜银颗粒性认知症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、关岛肌肉萎缩性脊髓侧索硬化-帕金森氏失智症、血管性失智症、额颞叶失智症、语意失智症、雷维体失智、亨汀顿氏舞蹈症、小脑萎缩症、包涵体肌病、包涵体肌炎及帕金森氏症。

一般来说，本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体的重量约占医药组合物总重量的0.1％至99％。在一实施方式中，本发明抗-TDP-43寡聚体抗体的重量至少占医药组合物总重量的1％。在另一实施方式中，本发明抗-TDP-43寡聚体抗体的重量至少占医药组合物总重量的5％。在再另一实施方式中，本发明抗-TDP-43寡聚体抗体的重量至少占医药组合物总重量的10％。在另一实施方式中，本发明抗-TDP-43寡聚体抗体的重量至少占医药组合物总重量的25％。

在某些实施方式中，本发明医药组合物或药物更可包含一药剂，该药剂为一已知可用以改善一神经退化性疾病的征状的药剂；例如乙酰胆碱酵素抑制剂(acetylcholinesterase inhibitor,AChEI)、Aβ抑制剂或毒蕈碱受器(muscarinicreceptor)拮抗剂及其类似物。

本发明医药组合物或药物依照可接受的药物制作方法来进行制备，例如于Remington＇s Pharmaceutical Sciences,17^th edition,ed.Alfonoso R.Gennaro,MackPublishing Company,Easton,Pa(1985)所述的方法。药学上可接受的赋形剂为该些与剂型中其他成分兼容且可为生物体接受的物质。

本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体可单独或与药学上可接受的赋形剂一起以口服、腹腔注射、颅内注射、脊内注射、肌肉注射、静脉注射、皮肤吸收、肠内注射或吸入投予等方式投予至个体。在一较佳的实施方式中，本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体以静脉注射的方式投予至个体。在另一较佳实施方式中，本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体是以脊内注射的方式投予至个体。

可使用的固体赋形剂可以包含一或多种物质，该物质可以是调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填充剂、助流剂、压缩助剂、粘合剂、片剂崩解剂或包覆性材料。若以粉末形式存在，该赋形剂为一可与细碎活性成分混合的细碎的固体。若以片剂方式存在，活性成分是与一具有压缩特性的赋形剂，以适当比例压缩为所需的形状及大小。粉末及片剂最好包含高达99％的活性成分。适用于本发明的固体赋形剂可以是磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮或其类似物。

本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体亦可配制为无菌溶液或悬浮液形式的液体医药组合物，其可以静脉、肌肉、皮下、脊内、腹腔或颅内等方式注射至个体。口服投予可以是液体或固体形式。

为因应以黏膜方式投予，本发明的药物或医药组合物可以配制为各式剂量形式，例如若要经由口腔黏膜吸收，本发明的药物或医药组合物可以颊及/或舌下药物剂量单位进行配制。各式药学上可接受的具有生物降解性的聚合赋形剂亦可使用于本发明，该类赋形剂不但提供适度的生物附着及药物释放特性，更可与颊及/或舌下药物剂量单位中的活性试剂及其他成分兼容。一般来说，聚合赋形剂包含可附着于口腔黏膜的湿润表面的亲水性聚合物。适用于本发明的聚合赋形剂包含，但不限于，丙烯酸聚合物及共聚物、水解聚乙烯醇、聚乙烯氧化物、聚丙烯酸酯、乙烯聚合物及共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚葡萄糖、瓜尔胶、果胶、淀粉及纤维素聚合物。

因此，本发明亦提供一种治疗哺乳类动物(特别是人类)的与TDP-43寡聚体相关的疾病的方法，该方法包含投予本发明包含抗-TDP-43寡聚体抗体的药物及医药组合物至该个体。该药物或医药组合物可以任何能将组合物活性成分有效传递至哺乳类动物(特别是人类)的特定位置的方式投予，例如透过口、鼻、肺、皮肤(例如被动或离子电渗传递)或非口服(例如直肠、脂肪、皮下、静脉、脊内、肌肉、鼻腔、小脑内、眼液或软膏)来投予。此外，本发明组合物的投予可以与其他活性成分同时投予。

在某些实施方式中，投予至个体的有效剂量约为每公斤个体体重的1至100毫克，例如每公斤个体体重的10、20、30、40、50、60、70、80、90或100毫克；较佳的是每公斤个体体重的50至70毫克，例如每公斤个体体重的50、60或70毫克；最佳的是每公斤个体体重的50毫克。该些剂量可以是单一次投予剂量，或是分成多次投予。

依据本揭示内容可选择的实施方式，该方法更可包含投予该个体一乙酰胆碱酵素抑制剂、Aβ抑制剂或毒蕈碱受器拮抗剂，其中该抑制剂/拮抗剂可与本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体同时或先后投予。

在某些实施方式中，该乙酰胆碱酵素抑制剂可以是阿兰他敏(alantamine)、星斯林(cymserine)、多奈派剂(donepezil)、ER 127528、加兰他敏(galantamine)、甘斯替敏(ganstigmine)、石杉碱甲(huperzine A)、苯羟基丙氨酸(phenserine)、苯乙基正星斯林(phenethylnorcymserine)、卡巴拉汀(rivastigmine)、RS 1259、SPH 1371、他克林(tacrine)、噻星斯林(thiacymserine)或兰奈派齐(zanapezil)。在其他实施方式中，该Aβ抑制物可以是巴比留主(bapineuzumab)、PTB2、鲨肌醇(scyllo-inositol)、PPI 1019、RS0406、SP 233、EGCG、Exberyl-1或SEN 606。而该毒蕈碱受器拮抗剂可以是氧化震颤素(oxotremorine)或占诺美林(xanomeline)。

本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体可做为一种用以侦测或诊断一个体是否罹患与TDP-43寡聚体相关的疾病的工具。因此，本发明提供一种用以侦测或诊断一个体罹患或疑似患有TDP-43寡聚体相关疾病的方法。该方法包含下述步骤：由该个体取得一生物样品；将该生物样品与本发明的抗体接触，藉以决定该生物样品中TDP-43寡聚物的含量；以及将该生物样品中TDP-43寡聚物的含量与取自一健康个体的对照样品的TDP-43寡聚物含量进行比对；其中，若该生物样品中TDP-43寡聚物的含量显著高于或低于该对照样品的TDP-43寡聚物含量时，即代表该个体患有与神经退化性疾病。

上述生物样品包含，但不限于，脑部切片样品、脑脊液样品、全血样品、血清样品、血浆样品、尿液样品、黏液样品及该些样品的纯化或过滤产物。

可利用任何相关领域的本领域技术人员所熟知的方法来检测抗体的结合，例如酵素免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、三明治免疫分析法(sandwich immunoassay)、原位免分析法(in situ immunoassays，例如利用胶态金、酵素或同位素标的)、Western Blot法、凝集分析法(agglutination assay，例如胶体凝集分析法、血球凝集分析法等)、补体结合分析法(complement fixation assay)、免疫荧光染色法(immunofluorescence assay)及免疫电泳法(immunoelectrophoresis assay)等。在一实施方式中，是利用ELISA来测定抗体的结合。在某些实施方式中，可利用体液(例如脑脊液、全血、血清、血浆、黏液及该些体液的纯化或过滤产物)来检测自体抗体。在一较佳的实施方式中，是利用脑脊液样品来侦测抗体。在其他实施方式中，是利用脑部切片样品来侦测抗体。

为确保相关领域的本领域技术人员可有效利用本发明，本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体可组装为试剂盒形式，便于诊断、侦测或确认一神经退化性疾病。在较佳的实施方式中，是利用能与本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体反应的致病性TDP-43来诊断一个体是否罹患神经退化性疾病。举例来说，相较于对照组(取自一健康个体的样品)，若在一生物样品中发现较高量或较低量的可与本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体反应的致病性TDP-43，表示该个体罹患与TDP-43寡聚体相关的疾病。该数据可用以进行后续相关治疗。举例来说，若一个体发现具有致病性TDP-43，即可开始进行TDP-43寡聚体相关疾病(例如AD、ALS及PD)的治疗，早期的治疗往往具有较佳的疗效。

在一实施方式中，本发明利用抗-TDP-43寡聚体抗体提供一种用以诊断TDP-43寡聚体相关疾病的试剂盒。试剂盒的成分包含：一容器、用以侦测生物样品中TDP-43寡聚体的试剂及一附于容器内的说明书，其中该试剂包含利用本揭示内容任一实施例揭示方法所制备的抗-TDP-43寡聚体抗体，而该说明书是用以告知利用本发明的抗-TDP-43寡聚体抗体来侦测致病性TDP-43(即上述的TDP-43寡聚体)的方法。该说明书可以是书册、磁带、CD、VCD或DVD。该试剂盒可另包含一用以对照指出TDP-43寡聚体于健康个体的正常含量的负对照。

下文提出多个实验例来说明本发明的某些方面，以利本发明所属技术领域中具有通常知识者实作本发明。不应将这些实施例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。

实施例

材料及方法

材料由HEK细胞所分离的人类TDP-43取自于OriGene Technologies,Inc.(Rockville,MD,USA)。由产品数据可知，将一TrueORF殖株(即RC210639)转染至人类HEK293细胞后，可制得一重组TDP-43蛋白；该重组TDP-43蛋白的C端具有一Myc-DDK标志(tag)，故可利用抗-DDK亲和性管柱进行纯化。短式TDP-43(残基101-285)则是依照Kuo等人所述的步骤(Nucleic Acids Res(2009)37,1799-1808)来制备。用于Western Blot法的抗-N端残基1-260的TDP-43抗体(标记为N_1-260)及用于免疫组织化学染色的抗-TDP-43抗体皆是购买自Abcam(Cambridge,UK)。抗-C端残基350-414的TDP-43抗体(标记为C_350-414)是购买自Novus(Littleton,CO,USA)，而抗-淀粉样蛋白寡聚体的抗体A11则是购买自BioSource(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。抗DDK单克隆抗体是购自Origene Technologies,Inc。Aβ肽是由中央研究院基因体中心的肽合成实验室所合成。其余化学药剂则皆是购自SigmaAldrich(St.Louis,MO,USA)或Amresco(Solon,OH,USA)。除非另有所指，否则所有细胞培养试剂皆是购自Gibco(Invitrogen)。

纯化TDP-43先由包含一用以编码全长TDP-43的cDNA的载体pCMV-Taq2B克隆出TDP-43片段。再将该克隆产物以限制酶XhoI/BamHI亚克隆至载体pET14b(Novagen,MerckKGaA,Darmstadt,Germany)，以产生N端组氨酸标志(His-Tag)。将所得的N端具有一组氨酸标志的TDP-43转殖至大肠杆菌株Rosetta 2(Novagen,Merck KGaA,Darmstadt,Germany)进行表达。收集细胞，将细胞悬浮于30mM Tris-HCl(pH 8)缓冲液后置于冰上，以微流仪(microfluidizer)打破细胞，其中该缓冲液包含500mM NaCl、10％甘油、1mM DTT、2％RNaseA、2％DNase I及蛋白酶抑制剂(完全，不含EDTA，购买自Roche Applied Science,Mannheim,Germany)。于4℃，以27,000×g离心该溶菌产物。先以包含30mM Tris(pH 8)、500mM NaCl、1mM DTT、20mM咪唑(imidazole)及10％甘油的缓冲液平衡一Ni-NTA亲合性管柱(GE healthcare Bio-Sciences AB,Uppsala,Sweden)后，将所得的上清液注入该管柱。将咪唑溶于上述缓冲液后，利用不同浓度的咪唑来冲提蛋白产物。约200mM的咪唑可冲提出TDP-43蛋白。利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)及古玛西蓝(Coomassie blue)来确认所纯化的组氨酸标志TDP-43蛋白。纯化的TDP-43包含N端残基MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMLE。估算的分子约为47,147Da。再进一步将该蛋白产物进行透析。依据Nick Pace(Pace etal.,(1995)Protein Sci 4,2411-2423)所述的公式，扣除于280纳米时的吸光背景值，以消光系数为44,920cm^-1M^-1计算蛋白浓度。在计算短式TDP-43的浓度时，消光系数则为15,470cm^-1M^-1。

粒径筛析层析(Size exclusion chromatography,SEC)先以分子量标记组来标准化Superdex-200 10/300GL分析式凝胶过滤管柱(GE healthcare Bio-Sciences AB,Uppsala,Sweden)，其中该分子量标记组是分别将铁蛋白(ferritin,440kDa)、β-淀粉酶(β-amylase,200kDa)、胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin,66kDa)及细胞色素C(cytochrome C,12.4kDa)溶于包含30mM Tris(pH 7.4)及150mM NaCl的缓冲液中。流速为每分钟0.5毫升。由大肠杆菌制备的重组TDP-43先以0.2微米的过滤膜过滤，再将体积为300微升的过滤液注入Superdex-200管柱。利用分液收集器(fraction collector)自动收集分液，其中每管分液为1毫升。收集预载样品及包含寡聚体的分液，并利用斑点杂交法以A11抗体(1:1000)在不同的曝光时间下进行分析。藉由动态光散射来确认各寡聚体分液。由HEK细胞制得、体积为100微升，而浓度为2微摩尔的TDP-43亦同时以相同步骤进行检测。进一步利用斑点杂交法来分析各分液。

隙缝印迹法(slot blotting)由于浓度过低，故利用斑点杂交法来分析由HEK293细胞分离，且经粒径筛析层析处理的TDP-43。自每管1毫升的分液中，取200微升注入先以内部真空系统平衡的Bio-Dot SF微过滤仪(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)。侦测时，一级抗体为抗-DDK单克隆抗体(OriGene Technologies,Inc.,Rockville,MD,USA)。讯号强度是利用Image J 1.42(National Institutes of Health,MD,USA)来进行定量。

斑点杂交法(dot blotting)以10mM Tris-HCl缓冲液在有或无变性剂的情况下，10倍稀释纯化的TDP-43。不同浓度的样品分别包含无变性剂、含9M尿素、含7.2M盐酸胍或含2％十二烷基硫酸钠的缓冲液。最终TDP-43的浓度为0.4μM。分别将样品置于室温或90℃处理1小时。将各TDP-43样品，以2微升的体积点渍于硝化纤维膜上进行斑点杂交法。简单来说，经阻断及以Tris为缓冲基底且包含0.002％吐温20(Tween 20)的生理食盐水(即TBST)洗涤后，将膜分别与抗-N端残基1-260的TDP-43抗体(1:2,000)、抗-C端残基350-414的TDP-43抗体(1:2,000)及抗-类淀法蛋白寡聚体的抗体A11(1:1,000)进行反应，其中，该些抗体皆溶于包含5％牛奶的TBST缓冲液中；之后再以与辣根过氧化酶(horseradishperoxidase,HRP)接合的二级抗体抗-兔子或抗-小鼠IgG(1:5,000,Millipore,Billerica,Massachusetts,USA)侦测之。最终利用ECL化学冷光试剂(ECL chemiluminescencereagent,Millipore)分析表达。

穿透式电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)于4℃的环境下，将新鲜纯化的TDP-43置于包含10mM Tris(pH 8)的缓冲液进行透析反应至隔日。再将样品置于4℃，以17,000×g离心30分钟去除沉淀物后，取上清液定量并进行穿透式电子显微镜分析。先将TDP-43样品置于辉光-放电(glow-discharged)、400-筛孔福尔瓦碳包覆的铜栅(Formvar carbon-coated copper grids 400-mesh Formvar carbon-coated coppergrids,EMS Inc.,Hatfield,PA,USA)5分钟，清洗后再以2％醋酸铀酰(uranyl acetate)进行负染。以Tecnai G2Spirit TWIN TEM(FEI,Hillsboro,OR,USA)或Hitachi H-7000 TEM(Hitachi Inc.,Japan)在75kV加压的环境下，检测各样品。

原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)于4℃的环境下，将新鲜纯化的TDP-43置于包含10mM Tris(pH 8)的缓冲液进行透析反应至隔日。再将样品置于4℃，以17,000×g离心30分钟去除沉淀物后，取上清液定量并进行原子力显微镜分析。将10微升的TDP-43滴于云母片(Ted Pella,Redding,CA,U.S.A.)上，静置5分钟以使细胞贴附。以1毫升的二次水洗涤样品，并将样品由云母片上小心取下。将样品置于室温直至干燥，再以轻敲模式(tapping mode)进行原子力显微镜分析(Nanonics,Jerusalem,Israel)。本实验是使用弹性常数为1.6N/m的PPP-ZEILR(Nanosensors,Neuchatel,Switzerland)，且尖端半径<10纳米的原子力显微尖端来进行。

动态光散射(dynamic light scattering,DLS)将该些由粒径筛析层析冲提的寡聚体分液进行动态光散射分析。首先，将样品溶于包含30mM Tris(pH 7.4)及150mM NaCl的缓冲液中。以50mW后纤维平衡Zetasizer Nano ZS动态光散射仪(Malvern Instruments,Worcestershire,UK)后，进行样品分析。依据各溶液设定适当的黏度及折射率，温度则固定为25℃。

旋光仪(circular dichroism,CD)于4℃的环境下，将新鲜纯化的TDP-43置于包含10mM Tris(pH 8)的缓冲液进行透析反应至隔日。再将样品置于4℃，以17,000×g离心30分钟去除沉淀物后，取上清液定量并进行旋光仪分析。在一圆形的石英电池(Hellma,ForestHills,NY,USA)中，以设定1毫米路径长度及室温条件的Jasco J-815分光光谱仪(JascoInc.,Easton,MD,USA)来测量远紫外光旋光仪光谱。收集250至190毫米的光谱，并以缓冲液背景值校正。

内源性及Bis-ANS荧光显微镜(intrinsic and Bis-ANS fluorescencespectroscopy)于4℃的环境下，将新鲜纯化的TDP-43置于包含10mM Tris(pH 8)的缓冲液进行透析反应至隔日。再将样品置于4℃，以17,000×g离心30分钟去除沉淀物后，取上清液定量并进行定量。以波长为280或295纳米的光源激发，收集1.5μM的TDP-43在波长为305至400纳米之间的内源性荧光。以波长为400纳米的光源激发，收集TDP-43、TDP-43s及缓冲液对照组在波长为450至600纳米之间的Bis-ANS光谱。该些样品包含0.8μM的TDP-43及5μM的Bis-ANS。所有实验皆是于温度为25℃的循环式水浴槽，以FluoroMax-3光谱荧光计(HoribaJobin Yvon,Kyoto,Japan)完成。

硫代黄素T(Thioflavin T,ThT)结合于4℃的环境下，将新鲜纯化的TDP-43置于包含10mM Tris(pH 8)的缓冲液进行透析反应至隔日。再将样品置于4℃，以17,000×g离心30分钟去除沉淀物后，取上清液定量并进行定量。以TDP-43样品及Aβ40纤维进行硫代黄素T结合检测。先将1μM的样品与相同摩尔浓度的硫代黄素T混合，以波长为442纳米的光源激发后，收集波长为455至505纳米的发散光谱。依照前述方法来制备浓度为25μM的Aβ40纤维原液(Chen and Glabe,J.Biol.Chem.(2006)281,24414-24422)。简单来说，将合成的Aβ溶于6M的盐酸胍(GdnHCl)中，再于10mM的磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)重新折叠。再来，将25μM的Aβ于25℃的环境下，静置超过10天。在进行实验前，须先将成熟的纤维稀释至1μM。将所得光谱扣除缓冲背景值。

刚果红光谱(Congo Red spectroscopy)加入10μM的刚果红，并以紫光/可见光谱仪DU800(Beckman Coulter,CA)测量0.5μM的经透析的TDP-43及成熟的Aβ纤维于400至600纳米的吸光值。

以OC抗体进行斑点杂交法将经透析的TDP-43及Aβ纤维(2微升，0.5μM)点渍于硝化纤维膜上，并利用标准斑点杂交法实验步骤进行后续分析。其中，实验所使用的抗体分别为OC抗体(Millipore,1:10,000)及HRP接合的抗-兔子IgG(1:10,000)。

以荧光滴定(Fluorescence titration)来侦测DNA结合使用荧光滴定来侦测DNA结合所造成的蛋白构型改变。以单股TAR DNA来滴定新鲜纯化且经透析、浓度为1.5μM的全长TDP-43及短式TDP-43(残基101-285)，其中该单股TAR DNA包含TAR DNA A-位置(SEQ IDNO：9)及B-位置(SEQ ID NO：10)。以波长为280纳米的光源激发内源性蛋白荧光，并观察TDP-43构型的改变。以FluoroMax-3光谱荧光计(Horiba Jobin Yvon,NJ,USA)收集发散光谱。收集全长或短式TDP-43于350纳米的发散光，扣除DNA对照组的数值后，以稀释倍数校正之。之后，以起始强度标准化所得数值，再代入单一蛋白与配体(ligand)的结合公式(Chenet al.,Protein Sci(2004)13,2196-2206)：

r＝(2Pt)^-1*[(Kd+Lt+Pt)-((Kd+Lt+Pt)²-4PtLt)^1/2]

其中，γ为所观察的讯号改变，其是代表结合蛋白；P_t为总TDP-43浓度；L_t为总配体浓度；而Kd则为解离常数。依照DNA及TDP-43的比例来绘制结果。

聚合物交联及硫代黄素T试验依照先前流程来制备Aβ(Chen et al.,J.Biol.Chem.(2011)286,9646-9656；Ni et al.,FASEB(2011)25,1390-1401)。将Aβ40溶于包含8M盐酸胍的缓冲液A(10mM磷酸钠，pH 7.4)中，进行再折叠，并以280纳米的吸光值进行定量(ε＝1,280cm^-1M^-1)。以10mM的Tris-HCl(pH 8)及150mM的NaCl配制包含25μM的Aβ、50μM的硫代黄素T及不同浓度且经透析的TDP-43(浓度为0到1μM，即0-4％)的实验样品。将该些样品静置于ELISA的96-孔盘，并以透明薄膜密封，利用微盘分析仪(SpectraMax M5,Molecule Devices)于25℃、不同时间点下进行测量。硫代黄素T是以442纳米激发，而以485纳米测量其发散光谱。

光致交联(Photo-induced cross-linking,PICUP)本实验依前述的步骤流程进行(Bitan et al.,J.Biol.Chem.(2001)276,35176-35184)。简单来说，以包含8M尿素及10mM磷酸钠的缓冲液来制备Aβ原液，以利后续SDS-PAGE分析。以包含10mM Tris-HCl(pH 8)及150mM NaCl的缓冲液，在包含或不包含不同浓度的TDP-43的情况下，配制浓度为25μM的Aβ样品。立即进行光致交联试验分析。将90％的Aβ溶液与各5％的3mM Ru(Bpy)及20mM APS均匀混合。之后，将样品置于一封闭的空间，以手动曝露于蓝光发光二极管30秒。加入SDS-PAGE的样品缓冲液可中止光致交联反应，再以16％的Tris-tricine SDS-PAGE分析该样品。所有的反应皆需立即性处理。利用可辨识Aβ残基1-17的抗-Aβ抗体6E10(Chemicon Inc.,Billerica,MA)及抗-N端TDP-43(残基1-260)的抗体，以Western Blot法来分析凝胶。

TDP-43对于人类神经母细胞瘤的细胞毒性分别利用溴化噻唑蓝四氮唑(MTT,3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)及乳酸去氢酶(lactate dehydrogenase,LDH,Promega,Madison,WI,United States)试验来检测TDP-43对人类神经母细胞瘤BE(2)-C细胞株(美国菌种保存中心编号CRL-2268)的细胞毒性。将细胞培养于包含10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,Biological Industry)之RPMI生长培养液(Gibco)中，并置于37℃、5％CO₂的潮湿环境中生长。将60,000细胞种植于透明的96-孔洞ELISA盘(Corning,NY,USA)中，并静置至隔夜。洗涤细胞后，将培养液置换为40微升的无血清的RPMI培养液，接着加入10微升的以透析缓冲液连续稀释的TDP-43样品，该TDP-43样品为新鲜透析及离心的样品。收取上清液，并以透析缓冲液做为一缓冲液对照组。将细胞静置24小时，再利用MTT试验依照标准程进行分析。简言之，将7微升的浓度为每毫升5微克的MTT加入各孔洞，静置3小时。去除培养液后，加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解细胞，直到结晶紫染剂完全溶出。以ELISA盘分析仪(SpectraMax M5,MoleculeDevices,USA)测量570到690纳米的吸光值，再将690纳米的读值讯号减去570纳米的读值讯号。平均五次实验结果，并以不含细胞的背景值予以校正。细胞存活率是将投予缓冲液的细胞读值设为100％后，进行标准化的计算结果。LDH试验则是依照说明书指示步骤进行。简单来说，将20,000细胞种植于生长培养液中，静置24小时。细胞的处理方法如MTT试验所述。将LDH受质与试剂缓冲液均匀混合后，放置于室温。将细胞冷却至室温30分钟，再加入受质反应。避光1小时，以560纳米激发受质荧光，并以ELISA盘分析仪读取590纳米的发散值。取三次实验结果平均，并以不含细胞的背景值予以校正。MTT及LDH试验的p-值皆是以不成对的Student＇s t-test计算。

TDP-43对小鼠初代皮质神经元的毒性由实验动物中心(NLAC，台湾)购买怀孕的C57BL/6JNarl小鼠，相关动物实验皆是经过台湾台北阳明大学的实验动物照护及使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)许可后进行。自第19天的小鼠胚胎取出初代皮质神经元，以每孔洞2x10⁵细胞的细胞量种植于96-孔盘，并培养于包含2μM的FdU的神经基底培养液(21103049,GIBCO,USA)中。于活体外生长8天后，投予初代皮质神经元新鲜透析的TDP-43，静置24小时，再加入每毫升0.5毫克的MTT，静置3小时。透析缓冲液为本实验的缓冲液对照组。加入与MTT试剂等量的包含10％十二烷基硫酸钠及20mM HCl的溶解缓冲液，静置至隔日，使MTT的结晶紫染剂可以完全溶解。以ELISA盘分析仪(TECAN,Switzerland)测量各孔洞570纳米的吸光值。取三次实验结果平均，并以不含细胞的背景值予以校正。MTT试验的p-值是以不成对的Student＇s t-test计算。

免疫细胞化学染色(Immunocytochemistry)将初代神经元细胞培养于一置于24-孔盘且以聚-D-离氨酸(poly-D-lysine)涂布的12毫米盖玻片上(每孔洞含3×10⁵细胞)。于37℃、5％CO₂的潮湿环境，以TDP-43(0.6μM)或缓冲液对照处理细胞24小时后，以4％的三聚甲醛(paraformaldehyde)于室温固定细胞20分钟。之后，以PBS洗涤细胞3次，每次10分钟，再以包含0.3％采酮x-100(triton x-100)及10％胎牛血清的阻断缓冲液于室温处理1小时。接着，以抗-微管相关蛋白-2(microtubule associated protein-2,MAP-2,MAB378,Millipore,USA)抗体及兔子抗-胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP,Z0334,DAKO,Glostrup,Denmark)抗体于室温处理2小时，再以接有得克萨斯红(Texas-Red)的山羊抗-小鼠IgG二级抗体(AbD Serotec,UK)或接有荧光异硫氰酸盐(Fluorescein isothiocyanate,FITC)的山羊抗-小鼠IgG二级抗体(Millipore,USA)于室温侦测1小时。最后，以包含DAPI的包埋胶(+DAPI,H-1200,VectorLab.)包埋细胞，再利用Olympus荧光显(BX-61,Olympus)微镜观察染色结果。

将TDP-43注入至海马回组织由台湾台南成功大学购入并于该校饲养C57/BL6J小鼠，在该校的实验动物照护及使用委员会规范下，将不同药剂投予至2个月大的C57/BL6J小鼠的海马回中。首先由鼻管投予小鼠异氟烷吸入性麻醉剂(氧气的1.2％)。将重组全长的TDP-43投予至各小鼠双侧的海马回组织中。相对于前囟(bregma)的立体定向坐标为前后侧(anteroposterior,AP)-2mm、中侧(mediolateral,ML)±1mm及背侧(dorsoventral,DV)-2mm。将注射针头缓慢地刺入特定深度后，以带有一微量注射器(Hamilton Company,NV,USA)的不锈钢注射针将2微升的TDP-43(2.2μM)以每分钟1微升的速度注入。注射完后将针头放置5分钟后再抽出，以防包含TDP-43的注射液渗出。

小鼠脑部的免疫荧光染色将20周大的雄性野生型小鼠，以及6及12个月大的TDP-43转基因小鼠(TDP-43Tg^+/+)进行免疫荧光染色。所有的小鼠皆饲养于成功大学，且实验流程依照该校实验动物照护及使用委员会的规范来进行。在投予TDP-43两周后，将小鼠深层麻醉，再以溶于0.01M的PBS(pH 7.4)的4％三聚甲醛由心脏进行灌流。取出脑组织并将其置于30％蔗糖/4％PFA溶液至隔日。将脑组织细切成厚度为10微米的薄片，再以阻断缓冲液于室温作用1小时，该阻断缓冲液是将0.2％采酮x-10及5％正常驴血清溶于0.01M PBS调配而成。在进行海马回组织注射实验时，将脑组织置于小鼠单克隆抗-NeuN的抗体(1:300,Millipore,Temecula,CA)中，于4℃放置至隔日；再以与Alexa Fluor 555荧光染剂接合的驴抗-小鼠抗体(1:300,Chemicon,Temecula,CA)于室温作用1小时。最后以DAPI复染该脑组织，并以包含荧光包埋介质(DAKO,Glostrup,Denmark)进行包埋。利用正立荧光显微镜(BX51,Olympus,Tokyo,Japan)来检测各脑组织的染色结果。在进行转基因鼠的共存研究时，将脑组织切片分别置于抗-TDP-43抗体(1:1000,Abcam,ab104223)、TDPO(1:1000,LTKBioLaboratories,Taiwan)、与Alexa Fluor 488荧光染剂接合的山羊抗-兔子抗体及与Alex Fluor 555荧光染剂接合的驴抗-小鼠抗体(1:300,Invitrogen)中。将该脑组织置于DAPI染剂中，最后以包含荧光包埋介质(DAKO,Glostrup,Denmark)封片。利用雷射扫描共焦显微镜来(Nikon TE2000EPFS-C1-Si)检测各脑组织的染色结果。

制备并确认对TDP-43寡聚体具有专一性的多克隆抗体在4℃的环境下，以10mMTris-HCl(pH 8.0)透析经纯化的全长TDP-43，并将所得产物进行离心，以制备最终浓度约为每毫升0.2毫克的免疫原蛋白。以该免疫原蛋白免疫注射纽西兰白兔，并以标准制备流程(台湾LTK BioLaboratories)来制备多克隆抗体。简单来说，免疫原蛋白是以2周的间隔时间，每次以0.5毫升的体积注入至白兔体内。经6次注射后，牺牲白兔，取出其血清。为以斑点杂交法及ELISA分析确认TDP-O，将全长的TDP-43注入粒径筛析层析(Superdex-200 10/300GL,GE healthcare Bio-Sciences AB,Uppsala,Sweden)处理，其中该缓冲液包含30mM的Tris-HCl(pH 8.0)及150mM的NaCl，流速则为每分钟0.3毫升。以1毫升为单位体积收集冲提液，将利用TDP-O及N_1-260抗体进行斑点杂交法分析。另外以微BCA^TM蛋白分析试剂盒(Micro BCA^TM Protein Assay Kit,Thermo Scientific,Rockford,IL)定量TDP-43寡聚体及单体后，将其以连续稀释法涂布于ELISA盘。利用标准流程来进行ELISA分析。简言之，将涂布的样品置于4℃至隔日，再于室温以包含10％脱脂牛奶的TBST处理2小时。洗涤ELISA盘后，利用TDP-O(以1:12,500的比例溶于包含3％脱脂牛奶的TBST中)或抗-N端残基1-260的TDP-43抗体(以1:1,000的比例溶于包含3％脱脂牛奶的TBST中)于室温侦测2小时。洗涤后，再以与HRP接合的抗-兔子抗体(1:1,000,Merck Millipore,Billerica,Massachusetts,USA)于室温侦测2小时，经再次洗涤后，以100毫升的3,3,5,5-四甲基联苯苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB,Merck Millipore,Billerica,Massachusetts,USA)呈色反应。以100毫升的250mM HCl中止反应，再利用SpectraMax M5(Molecular Device,Sunnyvale,CA)于450纳米的波长下读取样品的吸光值。

制备β5纤维利用化学方法(MDBio,Inc.,USA)来合成位于TDP-43片段的RRM2区的β5肽。将该肽溶于乙腈后，以PBS缓冲液(pH 7.4)将起始浓度为每毫升5毫克的肽进行十倍稀释。以17,000×g的转速离心30分钟，收取上清液并利用0.2微米的过滤膜(Pall,USA)过滤。之后，将样品静置于室温7天。利用穿透式电子显微镜观察形成的β5纤维。依前述方法以TDP-O抗体进行斑点杂交法来分析各样品。

FTLD-TDP病患的脑组织的TDP-O染色以二甲苯洗涤以石腊包埋的脑组织切片三次进行脱腊。利用不同浓度的酒精水合该脑组织切片后，以1倍TBS洗涤5分钟。将切片组织置于柠檬酸钠(pH 6)以全火力(1,500瓦)微波15分钟，以恢复抗原表现。将组织置于包含3％过氧化氢的1倍TBS，作用20分钟，藉以阻断内源性过氧化酶的活性；接着再以1倍TBS洗涤5分钟。将组织置于10％正常山羊血清(Invitrogen)，于室温下作用1小时以阻断非专一性结合。加入以1:1000比例稀释于抗体缓冲液(包含5％胎牛血清白蛋白及0.5％吐温-20的1倍TBS)的一级抗体，并于4℃作用至隔日。以洗涤缓冲液(包含0.5％吐温-20的1倍TBS)洗涤样品3次。将带有生物素标记的二级抗体以1:500的比例稀释于抗体缓冲液后，加入样品，于室温作用1小时。以洗涤液洗涤样品三次，再将样品置于Vectastain ABC过氧化酶试剂(Vectastain ABC peroxidase reagent,Vector Labs,PK-6100)30分钟后，以1倍TBS洗涤一次。加入DAB过氧化酶受质试剂(DAB peroxidase substrate reagent,Vector Labs,SK-4100)2-10分钟，以达到最佳的染色效果。以梅尔氏苏木精溶液(Mayers HematoxylinSolution,Sigma Aldrich)进行复染，再以不同浓度的酒精及二甲苯进行脱水反应。以Permount(Sigma Aldrich)包埋脱水后的组织切片。由加州戴维斯分校的阿尔茨海默中心所提供的取自3组对照、3位罹患FTLD-TDP病患及3位罹患阿尔茨海默症病患的脑部样品亦同步进行分析。本实验是经机构审查委员会的认证许可，且取得各病患的知情同意书。

FTLD-TDP脑部的TDP-43寡聚体的免疫沉淀及免疫标记以每毫升约0.05克的溶解缓冲液溶解取自2对照及1罹患FTLD-TDP病患的冷冻脑组织，该溶解缓冲液包含50mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl、0.5％吐温X-100及蛋白酶抑制剂(Calbiochem,Merck Millipore)。以组织研磨仪(Wheaton,NJ,USA)于冰上均质化溶解的样品。之后，以17,000xg的转速于4℃离心10分钟，收集可溶部分进行免疫沉淀分析。在进行组织分层前，依照使用说明书将TDP-O抗体交联至免疫沉淀微珠(bead)。简单来说，将40微克的TDP-O抗体加入包含10微升蛋白A-及10微升蛋白G-Mag Sepharose^TM Xtra(GE healthcare)的结合缓冲液(50mM Tris,pH7.5,150mM NaCl)，于室温静置1小时。在抗体结合至微珠后，加入包含50mM的庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐(dimethyl pimelimidate dihydrochloride)及200mM的三乙醇胺(triethanlamine,pH 8.9)的交联试剂，于室温作用1小时，以进行交联反应；加入100mM的乙醇胺(pH 8.9)于室温作用30分钟以中止反应。接着，将海马回组织的可溶部分及与TDP-O抗体交联的免疫沉淀微珠于室温反应1小时。以结合缓冲液至少洗涤6次反应物，藉以移除未结合的蛋白成份。以缓和抗原/抗体冲提缓冲液(Gentle Ag/Ab Elution Buffer,Thermo,pH 6.6)冲提标的蛋白，再利用电子显微镜及免疫金标记来分析冲提产物。在进行免疫金标记时，将10微升的冲提产物置于400-筛孔福尔瓦碳包覆的铜栅(400-meshFormvar carbon-coated copper grids,EMS Inc.,Hatfield,PA,USA)5分钟，以PBS洗涤后，加入包含1％BSA的PBS，于室温作用1小时。之后，以包含0.1％BSA及N_1-260抗体(1:5,000,ab57105,Abcam)的PBS于室温反应1小时，以标记该铜栅；接着以包含50mM的Tris(pH 7.5)、500mM的NaCl及0.1％的Tween-20的高盐吐温缓冲液(high salt tween buffer,HSTbuffer)及PBS洗涤该铜栅。而后将该铜栅置于6纳米、以金接合的二级抗-小鼠IgG抗体(1:40,Jackson ImmunoResearch)，并于室温反应1小时。以HST及PBS洗涤铜栅以移除未结合的抗体。利用包含1％戊二醛的PBS于室温作用10分钟以固定该铜栅后，以二次水洗涤6次。最后，加入2％醋酸铀酰(uranyl acetate)进行负染色(negatively stained)后，利用穿透式电子显微镜(FEI Tecnai G2F20S-TWIN TEM)观察染色结果。

纯化单克隆TDP-O抗体单克隆TDP-O抗体利用蛋白G琼脂糖试剂盒(protein Gagarose kit,KPL)依照使用说明书进行纯化。简单来说，将混合于20％乙醇的蛋白G琼脂糖(1.5毫升)注入一可抛弃式管柱。以10毫升的包含0.1M磷酸钠(pH 7.4)及0.15M氯化钠的洗涤缓冲液洗涤管柱中的树脂。利用结合缓冲液(5毫升)稀释取自TDP-O杂交瘤细胞的条件培养液(5毫升)后，将该混合液注入管柱，并倒置管柱使混合液均匀混合。之后，以5毫升洗涤缓冲液洗涤管柱4次，直到OD₂₈₀区近于0。加入1毫升的包含0.2M甘氨酸(pH 2.85)的冲提缓冲液，缓慢地冲提抗体，并收集于含有240微升的5倍洗涤液的收集管中。浓缩收集的抗体，利用Amicon Ultra-4 30kDa cutoff(Millipore)将缓冲液置换为洗涤缓冲液。利用抗体于280纳米的吸光值来定量抗体浓度(1毫克抗体的吸光值为1.34)。

间接ELISA将20纳克(nanogram,ng)的全长TDP-43寡聚体蛋白溶于200微升的包含50mM Tris(pH 7.4)及150mM NaCl的TBS溶液后，涂布于ELISA 96-孔洞盘(NuncMaxiSorp)，并置放于4℃至隔日。移除涂布溶液，分别加入有或无包含0.2％的十二烷基硫酸钠的TBS缓冲液，置于室温1小时。以十二烷基硫酸钠处理的TDP-43寡聚体将会变性，而以不含十二烷基硫酸钠的缓冲液处理的TDP-43寡体则会维持原寡聚体的构型。处理后，移除缓冲液，并加入200微升的包含10％脱脂牛奶的TBST缓冲液(20mM Tris,pH 7.6,137mMNaCl,0.001％Tween 20)，于室温作用2小时。利用PBST(每孔洞300微升)洗涤孔洞3次，再加入100微升的以包含5％脱脂牛奶的TBST稀释的mTDP-O抗体(稀释浓度由每毫升0.00001至2微克)，置于室温1小时。以300微升的PBS洗涤2次后，藉由100微升的与HRP接合的抗-小鼠抗体侦测结合抗体的表现，其中该抗体是以1:1,000的比例稀释于包含5％脱脂牛奶的TBST溶液。室温作用1小时后，以300微升的PBS洗涤2次，再加入100微升的3,3,5,5-四甲基联苯苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB,KPL SureBlue)，于室温反应10分钟。加入100微升的250mM的HCl来中止反应，并以SpectraMax M5(Molecular Devices)读取波长450纳米时的光密度(optical density,OD)。

制备TDP-43寡聚体及单体以进行间接ELISA试验以Amicon Ultra-4 30kDacutoff将每毫升180微克的TDP-43蛋白进行3倍浓缩(由3毫升浓缩至1毫升)。将500微升的浓缩TDP-43蛋白液注入Superdex 200 10/300GL管柱，并以包含30mM Tris(pH 8.0)及50mMNaCl的冲提缓冲液以每分钟0.3毫升的流速进行冲提。以500微升为单位，分别收集包含TDP-43寡聚体及单体的冲提液。利用微BCA蛋白分析试剂盒(Thermo)定量蛋白浓度。取300奈克的TDP-43单体或寡聚体，将其涂布于ELISA的96-孔洞盘(Nunc MaxiSorp)。依上述的间接ELISA试验，以100微升的取自TDP-O融合细胞的调件培养液(稀释比例为1:1,000)来侦测TDP-43寡聚体的表达。

确认抗体的同型(Isotypes)藉由一用于ELISA试验的小鼠单克隆抗体同型试剂盒(Thermo)来确认mTDP-O的同型。在该试验中，分别将抗-小鼠重链的捕捉抗体(captureantibody，抗-IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgA及IgM)或抗-小鼠轻链的捕捉抗体(κ或λ)涂布于ELISA盘。简言之，将取自TDP-O的调件培养液以50倍比例稀释于TBS溶液中，将稀释好的样品加入ELISA盘。之后，加入50微升的以HRP接合的抗-小鼠IgG+IgA+IgM抗体，于室温反应1小时。经3次洗涤后，每孔洞加入75微升的TMB受质，于室温避光反应10分钟。接着，加入75微升的0.18M硫酸以中止反应。藉由SpectraMax M5(Molecular Devices)读取各孔洞于波长450纳米时的吸光值。

将Ig可变区基因进行克隆及测序以GeneJET RNA纯化试剂盒(GeneJET RNApurification kit,Thermo)萃取2×10⁶杂交瘤细胞的RNA。利用极大第一股cDNA合成试剂盒(Maxima First Strand cDNA synthesis kit,Thermo)合成cDNA。之后，藉由小鼠Ig-引物组(Ig-Primer Sets,Novagen)及G2绿色扩增反应混合剂(G2Green Master Mix,Promega)来放大Ig重链及κ基因。将所得的放大产物以TA试剂盒(Invitrogen)进行转殖。最终产物的DNA序列是以Mission Biotech进行测序。

细胞毒性试验利用MTT试验来检测单克隆TDP-O抗体对由TDP-43寡聚体所引发的细胞毒性的抑制功效。将人类神经母细胞瘤BE(2)-C细胞(ATCC#CRL-2268)培养于包含10％胎牛血清的RPMI细胞培养液中，并放置于37℃、5％CO₂环境培养。将细胞以每孔洞40,000个细胞的密度种植于96孔盘后，培养24小时。以Dulbecco的磷酸盐缓冲液以0倍、2倍或4倍稀释单克隆抗体TDP-O-3(每毫升5毫克)。移除细胞培养液后，以不含胎牛血清的RPMI细胞培养液洗涤一次。每孔洞加入40微升的RPMI细胞培养液，之后加入20微升的1.5μM TDP-43寡聚体及1微升的每毫升5、2.5或1.25毫克的TDP-O抗体溶液。培养细胞24小时后，加入7微升的每毫升5毫克的MTT溶液，放置3小时。移除细胞培养液，利用DMSO分解结晶体。以ELISA微盘读数器SpectraMax M5(Molecular Devices)检测570及690纳米波长下的吸光值。重复三次实验，减去不含细胞的背景值后，计算平均介于570及690纳米之间吸光值差异。以缓冲液对照组标准化各组数据。利用单因子变异数进行统计分析。

实施例1 全长TDP-43易于形成寡聚体

在本实施例中，将探讨TDP-43的病理机制。依照“材料及方法”所述的步骤，分别由大肠杆菌及HEK293细胞纯化出重组的全长人类TDP-43(其N端带有一组氨酸标志，分子量为MW 47,145Da)及TDP-43蛋白。将所得的TDP-43蛋白进行粒径筛析层析分析。如图1A所示，冲提体积包含至少86％的冲提TDP-43，而隙缝印迹法则证实两种来源的重组全长TDP-43蛋白皆易于形成寡聚体。有鉴于TDP蛋白病变与包涵体(inclusion body,IB)的形成相关，而重组全长TDP-43会形成高分子量寡聚体，故推测TDP-43可能会形成与淀粉样变性病(amyloidosis)的淀粉样寡聚体相似的寡聚体。因此，利用一种针对Aβ寡聚体拟态所制备，且与构型相关的抗-淀粉样专一抗体(即A11)来检测TDP-43寡聚体；结果显示两种TDP-43蛋白样品皆能与A11产生免疫反应，而其相对应的缓冲液则不会(图1B)。包含稀释TDP-43的寡聚体分液具有较弱的讯号强度。

为确认该抗体及抗原间的辨识是与构型相关，在利用A11、抗-N端的TDP-43抗体及抗-C端的TDP-43抗体进行斑点杂交法分析前，先以不同变性方法来破坏TDP-43寡聚体的构型(图1C)。将蛋白培养于不同的缓冲液，即，有或无9M尿素、7.2M盐酸胍或2％十二烷基硫酸钠的缓冲液，再置于90℃处理1小时。发现在侦测A11的表达时，加热与否并不会显著地影响原缓冲液的讯号量。然而，加入高浓度的尿素或盐酸胍会减少侦测的讯号量，再加热处理则会大幅减少讯号量。不论加热与否，加入2％十二烷基硫酸钠皆无法侦测到任何讯号。相对地，抗-N端的抗体不论在何处理下，皆能辨识TDP-43的表达；此结果亦印证了点渍于膜上的蛋白为等量。加入尿素并加热处理或加入盐酸胍(不论加热与否)皆会部份或完全减少抗-C端抗体对于抗原的辨识。该些结果指出，抗-C端的TDP-43抗体对于抗体的辨识度会随着不同变型条件而改变。

整体来说，上述结果指出重组的全长TDP-43易于形成高分子量蛋白；该些高分子蛋白与淀粉样寡聚体具有共同的抗原决定位置。该些高分子蛋白对十二烷基硫酸钠以外的化学变型处理皆相当稳定。

实施例2 全长TDP-43会形成非均质的球形寡聚体

在本实施例中，利用穿透式电子显微镜(transmission electron microscope，TEM，图1D)及原子力显微镜(atomic force microscope，AFM，图1E)来观察寡聚体的形态。穿透式电子显微镜显示该些非均质的球形蛋白具有数个球形及环形的结构特征，而原子力显微镜则显示多数球形蛋白呈现球形结构特征，仅有极少数具有环形的结构特征(图1E的插图)。利用穿透式电子显微镜来计算颗粒大小分布。多数的球形颗粒具有约40到60纳米的粒径(结果未显示)。经原子力显微镜分析，环形寡聚体的高度约为6纳米(结果未显示)。此外，经动态光散射(dynamic light scattering,DLS)分析显示，由粒径筛析层析所得的寡聚体蛋白呈现一非均质的分布，其颗粒的粒径大小约为40到400纳米(图1F)。大多数的颗粒粒径约为50到60纳米(图1G)，穿透式电子显微镜亦呈现相同的分析结果。若结合影像及粒径分布结果可知，全长TDP-43会形成具有球形超结构的非均质颗粒。该些结果符合之前的研究观察，即野生型TDP-43及与肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症相关的TDP-43突变皆会形成寡聚体(Johnson et al.,J.Biol.Chem(2009)284,20329-20339)。整体而言，本研究结果指出，TDP-43蛋白不论是在结构上或是免疫分析上，皆与球形淀粉样寡聚体相似，而该球形淀粉样寡聚体具有神经毒性，且会表达于不同的神经退化性疾病。

实施例3 TDP-43寡聚体具有明确的构型及功能

为进一步检测TDP-43寡聚体的构型，利用远紫外光旋光仪光谱来分析TDP-43寡聚体的二级结构，结果显示于图2A。分别于接近210及222纳米出现可能为α-螺旋结构的二个极小值。该光谱分析与短式小鼠TDP-43(残基101-265，图中简记为TDP-43s)的光谱分析不同，其中该短式小鼠TDP-43在晶体结构上包含二个多为β-股的RRM(Kuo et al.,NucleicAcids Res(2009)37,1799-1808)。由内源性芳香族残基激发所得的荧光光谱显示，在光波约为340纳米时可侦测到发散最大值，该结果指出TDP-43的酪氨酸及色氨酸残基为溶剂暴露残基(结果未显示)。此外，亦利用外源性荧光染剂Bis-ANS来侦测该些暴露的疏水性蛋白表面，其中荧光染剂Bis-ANS为一种常用以侦测蛋白折叠时部分尚未折叠的中间产物的染剂。如图2B所示，相较于短式TDP-43，全长TDP-43会与荧光染剂Bis-ANS反应而产生更高的荧光量，显示全长TDP-43寡聚体具有与短式TDP-43不一样的疏水性暴露表面。

另外，亦使用传统淀粉样染剂硫代黄素T(thioflavin T,ThT)来检测全长TDP-43是否会与硫代黄素T结合，结果显示于图2C。不论是全长或短式TDP-43，皆侦测不到硫代黄素T结合所发散的荧光发散波峰。相较之下，相同浓度的Aβ纤维(1μM)则具有显著的荧光发散(图2C)，此结果与以硫代黄素T分析的病理检验结果相符合。相似地，TDP-43寡聚体亦不会与刚果红及抗-纤维抗体OC结合反应(结果未显示)。该些结果指出，TDP-43寡聚体应无与β褶板(βsheet)交联的结构。然而，关于原子能阶的结构尚需进一步研究确认。

有鉴于正常且具有功能性的TDP-43会与一特殊的核酸序列结合，接下来将探讨TDP-43寡聚体是否会干扰DNA的结合能力。利用荧光滴定来观察蛋白与DNA结合后的构型改变，结果显示于图2D。简单来说，以单股TAR DNA-A位或-B位滴定分析TDP-43寡聚体，并将所得结果与短式TDP-43的滴定分析结果比较，已知短式TDP-43会以亚微摩尔(submicromolar)的亲和度与单股DNA结合(Kuo et al.,Nucleic Acids Res(2009)37,1799-1808)。如图2D所示，在低单股DNA浓度时，TAR DNA-A位及-B位皆会减少短式TDP-43的荧光量，而加入全长TDP-43则会显著地降低该反应。该结果符合“材料与方法”所述的单一抗体与配体的结合公式，并指出TDP-43及单股DNA的化学计量为1:1。由该公式可得出全长TDP-43与TAR-A、全长TDP-43与TAR-B、短式TDP-43与TAR-A及短式TDP-43与TAR-B的解离常数(dissociation constant,Kd)分别为7.05±0.82、6.27±0.68、0.20±0.09及0.38±0.10μM。该些结果指出，单股DNA与短式TDP-43的结合强度约为与全长TDP-43结合强度的15倍，其中TAR-A及-B位对于全长TDP-43具有相似的亲和力。该些发现显示，全长TDP-43寡聚体的RRMs可能具有不正常的构型，因而造成与DNA结合能力的下降，或是与DNA结合的区域受到遮蔽而无法与DNA结合。全长TDP-43的发散值的改变有可能是因样品中存有少量的TDP-43单体所致。总结来说，该些结果证实TDP-43寡聚体具有与短式TDP-43不同的生物物理及生物化学特性，亦即，二者的构型不相同。

实施例4 TDP-43寡聚体将Aβ转换为淀粉样蛋白寡聚体

在本实施例中，将以交联实验来探讨TDP-43是否会影响Aβ纤维化反应。

首先，利用硫代黄素T试验来检测在有或无0.4到4％的TDP-43寡聚体时，Aβ40的纤维化反应，结果显示于图3A。分析指出，TDP-43可有效抑制Aβ的纤维化反应，且该抑制效果会随着TDP-43浓度的增加而增加(图3A)。在将近180小时的实验观察期中，4％的TDP-43可完全抑制Aβ的纤维化反应。再利用光致交联反应(Photo-induced cross-linking,PICUP)来检验在实验初始时，短暂出现的Aβ蛋白；结果指出在交联后，Aβ主要会形成单体、双聚体、三聚体及四聚体，而TDP-43寡聚体会造成具有更高分子量的Aβ蛋白产生(图3B)。加入TDP-43可观察到Aβ五聚体，且表达量与TDP-43加入的量呈正常相关。另外，亦观察到二个具有较大分子量的组合，分别位于～55kDa及分布于～105至>210kDa之间。除了对十二烷基硫酸钠不具抗性的TDP-43单体，亦发现一分子量约～55kDa蛋白及数个分布于～80至>210kDa的蛋白。若进一步利用穿透式电子显微镜分析可发现，在加入4％的TDP-43后，Aβ并不会形成纤维，而是会变性为一具有<10纳米粒径的球形寡聚体；该Aβ在不含TDP-43仍会形成成熟的淀粉样纤维(图3C)。TDP-43寡聚体交联具有>50纳米的粒径，该粒径大于Aβ寡聚体的粒径大小(数据未显示)。该些数据显示TDP-43寡聚体可以引发Aβ寡聚体的形成，且TDP-43与淀粉样蛋白具有共同的特性。

实施例5 TDP-43寡聚体引发轴突退化及毒性

在本实施例中，将进一步探讨TDP-43寡聚体是否会造成神经毒性及轴突的退化。

简单来说，以连续稀释的主要包含寡聚体的TDP-43样品来处理人类神经母细胞瘤BE(2)-C细胞，再以MTT及LDH试验来检测所产生的细胞毒性；结果显示于图4A到图4C。MTT试验指出，相较于缓冲液对照组，加入0.44μM的TDP-43会减少约20％的细胞存活率(图4A)。有鉴于重组TDP-43的低溶解度，无法以更高浓度的TDP-43进行该毒性试验。LDH试验亦呈现类似的结果，加入0.44μM的TDP-43会显著地引发细胞死亡(图4B)。TDP-43亦会于小鼠的初代皮质神经元产生与剂量呈正相关的神经毒性，其中，投予0.6μM的TDP-43会减少约20％的细胞存活率(图4C)。

此外，该些小鼠皮肤神经元的免疫组织化学染色法显示，0.6μM的TDP-43会造成轴突的萎缩，并减少神经元的密度及数量(图4D)。为进一步测试TDP-43寡聚体于活体内的神经毒性，将2微升的2.2μM的TDP-43注射至小鼠的海马回组织，再利用免疫荧光染色分析神经元的存活。以神经元特定标志NeuN及核特定染剂DAPI进行免疫组织化学染色可发现，相较于以缓冲液处理的小鼠，接受TDP-43注射的小鼠的CA1层中具有较少量的神经元(图4E)。该结果指出，注射全长的TDP-43寡聚体至海马回会引起细胞毒性。

实施例6 制备及确认对TDP-43寡聚体具有专一性的多克隆抗体

有鉴于抗-淀粉样蛋白寡聚体抗体A11会交联至不同的淀粉样蛋白，依照“材料及方法”所述的方法，利用重组TDP-43寡聚体做为免疫原后，免疫刺激兔子以产生一多克隆抗体TDP-O，藉以了解TDP-43寡聚体是否会影响疾病的产生。

依照“材料及方法”所述的方法，在不同的变性调件下，利用斑点杂交法来分析TDP-O抗体对全长TDP-43寡聚体构型的专一性；结果显示于图5A。不论加热(90℃，1小时)与否，以1:125,000比例稀释于原缓冲液的TDP-O皆可与全长TDP-43反应；然而，2％十二烷基硫酸钠会破坏抗体与TDP-43寡聚体间的反应，而不论是否予以加热处理。另外，加入7.2M的盐酸胍或9M的尿素，并于室温作用超过1小时，并不会影响全长TDP-43的反应，该结果指出在高浓度化学变性剂的处理下，蛋白依旧相当稳定；然而，额外予以加热处理则会减少反应讯号量，亦即，TDP-O为一构型相关的抗体。总结上述，TDP-O的斑点杂交法定性分析结果与A11一致(图5A与图1C)。

利用A11及/或TDP-O抗体来检测抗体对Aβ寡聚体的专一性，以了解TDP-O是否为一对TDP-43具有专一性的抗体，而非如A11为一对淀粉样寡聚体具有广用性的抗体。如图5B所示，TDP-O无法辨识Aβ寡聚体，证明了该抗体为对TDP-43寡聚体具有专一性的抗体。亦利用ELISA来定量分析TDP-O抗体与TDP-43寡聚体及单体间的反应；在这个部份，会辨识N端残基1-260(N1-260)的TDP-43抗体亦同时进行试验分析，做为比对之用。将约1μM的全长TDP-43或3倍浓缩的TDP-43样品进行粒径筛析层析，并收集1毫升冲提液，藉此制备全长TDP-43的寡聚体及单体(图5C)。取第1至18分液中的浓缩TDP-43，以TDP-O或N_1-260抗体进行斑点杂交法分析，结果绘示于图5D。该结果显示，TDP-O对于第5至7分液中的浓缩TDP-43具有较强的反应，该些样品乃对应于冲提至冲提体积中的TDP-43寡聚体。相较之下，N_1-260则是对于第6分液及第15至18分液中的浓缩TDP-43具有较强的反应；亦即，该抗体可辨识TDP-43的寡聚体及单体。

此外，利用ELISA来定量TDP-43寡聚体与TDP-O的专一性，N_1-260抗体在此做为对照组。在以微BCA试验定量后，将连续稀释的包含TDP-43寡聚体及单体的分液分别涂布至ELISA盘。依ELISA的标准操作流程，利用TDP-O及N_1-260抗体进行侦测。图5E的结果显示，相较于TDP-43单体，TDP-O抗体对TDP-43寡聚体具有较高的反应度(EC50<每毫升0.5微克)；而N_1-260抗体则对TDP-43寡聚体或单体具有相似的反应度(图5E)。另外，亦将由TDP-43的RRM2区第5β-股所制备的β5纤维点渍于膜上，以确认TDP-O仅会辨识TDP-43寡聚体，而非如先前技术所述的纤维(Wang et al.,J Biol Chem(2013)288,9049-9057)(结果未显示)；结果清楚地指出TDP-O仅能辨识TDP-43寡聚体，而不会辨识β5纤维。故，本发明的多克隆抗体TDP-O可专一性地辨识TDP-43寡聚体的构型，而不会交联至Aβ蛋白。

实施例7 TDP-43寡聚体存在于转基因鼠的脑部

将取自6及12周的野生型小鼠及FTLD-TDP-43转基因鼠的脑部切片进行免疫组织化学染色，以检测TDP-43寡聚体是否存在于活体体内；结果显示于图6A及图6B。已知会于前脑表达全长TDP-43的FTLD-TDP-43转基因鼠具有与FTLD-TDP病患相似的病状(Tsai etal.,J Exp Med(2010)207,1661-1673)。随着年龄增长，该TDP-43转基因鼠的学习/记忆力及运动能力会逐渐下降。脑部切片以抗-TDP-43及TDP-O进行免疫荧光染色，并以DAPI进行复染。可预期地，在野生型小鼠脑部切片中，TDP-43主要表达于细胞核内。相较之下，FTLD-TDP转基因鼠的脑部切片则显示，TDP-43主要表达于细胞质中，且可侦测到TDP-O的讯号。在细胞中可发现大量共存的TDP-43及TDP-O讯号，且具有双染的细胞量会随着年龄的增加而增加。该些共存讯号指出，与淀粉样相似的TDP-43寡聚体会存在于FTLD-TDP转基因鼠脑部，且表达量会随着年纪的增长而增加。

实施例8 TDP-43寡聚体会表达于FTLD-TDP病患的脑部

为评估TDP-43寡聚体在人类疾病所扮演的角色，进一步利用带有TDP-43免疫反应包涵体的FTLD病患来研究寡聚体于FTLD-TDP病患的表达。利用TDP-O多克隆抗体来对病患的海马回及前皮质区进行免疫染色，其中该病患包含3名经病理确认的FTLD-TDP病患、3名年龄相仿而不具失智病征的对照个体，以及3名经病理确认已罹患阿尔茨海默症却不具TDP-43病征的病患(做为疾病对照个体)。TDP-O抗体可辨识不同的神经元细胞质包涵体(图7的A及C)及在FTLD-TDP病患脑部中与TDP-43包涵体相似的营养不良的轴突(图7的A)。在某些区域，神经元细胞质会深染为粗颗粒状(图7的E)。相较之下，除了神经元脂褐质(lipofuscin)所产生的非专一性反应，TDP-O并不会对对照个体的脑部(图7的图B、D及F)及罹患阿尔茨海默症却不具TDP-43病征的病患的脑部(结果未显示)产生显著的免疫反应。TDP-O多克隆抗体及TDP-43单克隆抗体皆无法染到正常组织的细胞核。此外，为了解可被TDP-O多克隆抗体辨识的TDP-43形态，利用TDP-O对对照个体及病患的海马回组织进行免疫沉淀分析试验(immunoprecipitation,IP)。将海马回的采酮(triton)可溶分液与光交联的TDP-O多克隆抗体进行免疫沉淀分析试验。再将冲提产物以N端TDP-43抗体(N_1-260)免疫标记后，进行电子显微镜分析(图8A及图8B)。结果指出，于病患样品可观察到粒径约为50纳米的圆球形TDP-43寡聚体，在对照个体的样品则无；该些寡聚体可被N_1-260抗体辨识，亦即，该些寡聚体并非N端截断蛋白。整体来说，利用本发明的TDP-O多克隆抗体可证实TDP-43寡聚体会存在于FTLD-TDP病患的脑部。

实施例9 制备及确认对TDP-43寡聚体具有专一性的单克隆抗体

在本实施例中，利用ELISA试验来检测由TDP-O-3、-5、-8、-9及-10杂交瘤细胞所制备的单克隆抗体，在有或无十二烷基硫酸钠处理时，对TDP-43寡聚体的专一性。如图9所示，相较于变性的TDP-43蛋白，由5株杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体对未变性的TDP-43寡聚体具有较高的结合活性。该些数据指出，该些单克隆抗体对于TDP-43寡聚体具有专一性，是为构型相关的抗体。

为确认各单克隆抗体的结合专一性，先以胶体过滤来纯化TDP-43寡聚体及单体(图10A)，再分别将各产物涂布于ELISA盘以确认各单克隆抗体的专一性。图10B的结果指出，由TDP-O-3、-5、-8、-9及-10杂交瘤细胞所制备的单克隆抗体可具专一性地辨识TDP-43寡聚体。

亦利用ELISA小鼠单克隆抗体同型试剂盒(Thermo)来决定各TDP-O单克隆体的同型。结果总结于表1。

表1 TDP-O单克隆抗体的亚型

OD 450nm	TDP-O-3	TDP-O-5	TDP-O-8	TDP-O-9	TDP-O-10
						IgG1	0.2101	0.2261	0.1271	0.1717	0.2299
IgG2a	1.0523	1.2430	0.9270	1.0333	1.1781
						IgG2b	0.0565	0.0520	0.0509	0.0564	0.0755
IgG3	0.0581	0.0539	0.0509	0.0556	0.0757
						IgA	0.0563	0.0498	0.0533	0.0533	0.0680
IgM	0.0565	0.0502	0.0490	0.0519	0.0710
						Kappa	2.1870	2.6605	2.2863	1.9313	2.3966
Lamda	0.0574	0.0603	0.0513	0.0572	0.0801

依据表1的结果，由TDP-O-3、-5、-8、-9及-10杂交瘤细胞所制备的单克隆抗体对于IgG2a及κ轻链具有较高的反应性。因此，该些单克隆抗体为IgG2a及κ轻链亚型。

将5株单克隆抗体进行测序分析，以决定一致性的序列；结果表述于图11。

实施例10 对TDP-43寡聚体具有专一性的单克隆抗体可抑制由TDP-43寡聚体所引发的细胞毒杀反应

为检测TDP-O抗体是否可抑制由TDP-43寡聚体所引发的细胞毒杀反应，如本揭示内容的“材料及方法”所述，分别对人类神经母细胞瘤BE(2)-C细胞投予或不投予单克隆TDP-O抗体(即TDP-O-3)处理。之后利用MTT试验来分析细胞的存活率。结果指出，TDP-43寡聚体会显著引发BE(2)-C细胞死亡，而投予TDP-O抗体可成功抑制该毒杀现象(图12)。

总结上述，本揭示内容意外地发现致病性TDP-43，其会与Aβ交联形成淀粉样蛋白寡聚体，进而导致神经退化性疾病。据此，本揭示内容提供一种可用以抑制TDP-43蛋白病变的抗体。本发明实验结果证实，本发明抗-TDP-43抗体可专一结合至致病性TDP-43，并抑制由TDP-43所引发的细胞毒杀反应；因此，本发明抗体可用以预防及/或治疗与TDP-43相关的神经退化性疾病。

当可理解上述实施方式与实施例仅为例示，且本领域技术人员可对齐进行各种修饰。上文提出的说明书、实施例与数据的目的在于使本说明书的结构完备，并做为实作本发明的例示。虽然本揭示内容已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本揭示内容，任何本领域技术人员，在不脱离本揭示内容的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本揭示内容的保护范围当视后附的权利要求范围所界定者为准。

序列表

<110> 中央研究院

<120> 可辨识致病性TDP-43的抗体及其用途

<130> 172344PWCN

<160> 10

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH region-CDR1

<220>

<221> 变异

<222> 3,5,6

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 1

Gly Tyr Xaa Phe Xaa Xaa Tyr Trp

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH region-CDR2

<220>

<221> 变异

<222> 4,6,7,8

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 2

Ile Asn Pro Xaa Thr Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH region-CDR3

<220>

<221> 变异

<222> 1,7

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 3

Xaa Arg Gly Gly Lys Tyr Xaa Gly Gly Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH region

<220>

<221> 变异

<222> 18,23,24,25,28,30,31,37,54,56,57,58,60,63,67,69,74,77,81,84,95,97,103

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Xaa Lys Met Ser Cys Xaa Xaa Xaa Gly Tyr Xaa Phe Xaa Xaa Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Xaa Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Asn Gln Xaa Phe

50 55 60

Lys Asp Xaa Ala Xaa Leu Thr Ala Asp Xaa Ser Ser Xaa Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Xaa Gln Leu Xaa Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Xaa Cys

85 90 95

Xaa Arg Gly Gly Lys Tyr Xaa Gly Gly Ala Met Asp Tyr

100 105

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL region-CDR1

<220>

<221> 变异

<222> 4

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 5

Ser Ser Val Xaa Tyr

1 5

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL region-CDR-2

<220>

<221> 变异

<222> 1

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 6

Xaa Thr Ser

1

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL region-CDR-3

<400> 7

Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 8

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL region

<220>

<221> 变异

<222> 6,9,10,11,18,21,26,30,35,36,48,49,74,80

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 8

Gln Ile Val Leu Thr Xaa Ser Pro Xaa Xaa Xaa Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Xaa Val Thr Xaa Thr Cys Ser Ala Xaa Ser Ser Val Xaa Tyr Met

20 25 30

His Trp Xaa Xaa Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Xaa

35 40 45

Xaa Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Xaa Ser Arg Met Glu Ala Xaa

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

<210> 9

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAR DNA A-site

<400> 9

ctttttgcct gt 12

<210> 10

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAR DNA B-site

<400> 10

tgggtctctc tg 12

Claims (11)

1.一种抗体或其片段，其可专一地结合至一分子量为43kDa的转活化反应-脱氧核糖核酸-结合蛋白，该种抗体或其片段包含：

一重链可变区，其包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3的氨基酸序列；以及

一轻链可变区，其包含：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的抗体，其中该重链可变区具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，且该轻链可变区具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的抗体，其中该TDP-43寡聚物为一直径约为2至400纳米的球型颗粒。

4.如权利要求3所述的抗体，其中该TDP-43寡聚物为一直径约为40至60纳米的颗粒。

5.一种用以预防或治疗与TDP-43寡聚物相关疾病的医药组合物，包含一有效量的权利要求1的抗体及一药学上可接受的载体。

6.如权利要求5所述的医药组合物，其中该种与TDP-43寡聚物相关的疾病可以是阿尔茨海默症、嗜银颗粒性认知症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、关岛肌肉萎缩性脊髓侧索硬化-帕金森氏失智症、血管性失智症、额颞叶失智症、语意失智症、雷维体失智、亨汀顿氏舞蹈症、小脑萎缩症、包涵体肌病、包涵体肌炎或帕金森氏症。

7.如权利要求5所述的医药组合物，其中该重链可变区具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，且该轻链可变区具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

8.一种由一个体的生物样品来诊断一与TDP-43寡聚物相关疾病的方法，包含：

将该生物样品与一有效量的权利要求1的抗体接触，以决定该生物样品中TDP-43寡聚物的含量；以及

将该生物样品中TDP-43寡聚物的含量与取自一健康个体的对照样品的TDP-43寡聚物含量进行比对；

其中，若该生物样品中TDP-43寡聚物的含量显著高于或低于该对照样品的TDP-43寡聚物含量，即代表该个体患有与TDP-43寡聚物相关的疾病。

9.如权利要求8所述的方法，其中该种与TDP-43寡聚物相关的疾病可以是阿尔茨海默症、嗜银颗粒性认知症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、关岛肌肉萎缩性脊髓侧索硬化-帕金森氏失智症、血管性失智症、额颞叶失智症、语意失智症、雷维体失智、亨汀顿氏舞蹈症、小脑萎缩症、包涵体肌病、包涵体肌炎或帕金森氏症。

10.如权利要求8所述的方法，其中该生物样品可以是一脑部切片样品、一脑脊液样品、一全血样品、一血清样品、一血浆样品、一尿液样品或一黏液样品。

11.如权利要求8所述的方法，其中该重链可变区具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，且该轻链可变区具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。