TWI717766B - 複合微珠體及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明係提供一種複合微珠體及其應用,係使用由磁珠、膠珠組成之複合微珠體檢測特定蛋白質,可用於生化、醫學、食安等多領域檢測需求,本發明以雙電極板量測複合微珠體之電阻抗,繪製出該複合微珠體之電化學阻抗頻譜,除可辨別特定蛋白質存在與否外,亦可對特定蛋白質型別進行分類,達到快速、準確檢驗與分類檢體之目標。
Description
本發明係與醫療檢測技術有關,特別係指一種可用於檢測待測蛋白質的複合微珠體及其應用。
傳統的生化檢測受限於儀器設備與技術,具有高成本、效率差、人為操作汙染等問題,現今透過微機電系統技術可將檢測儀器微小化於晶片上,不僅可降低檢測作業所需之經費、時間成本,對於先進檢測技術的普及化亦有相當貢獻。微流體裝置係將微量液體導入具有微流道之晶片元件中,以進行反應(檢測)。透過結合微機電系統技術與微流體裝置,可將生化檢測所需的取樣、混合、傳輸、前處理、分離、反應、檢測等功能結合在微流體晶片(微機電晶片)上,達到自動化分析之目的,且具有體積小、成本低、檢測效能高、靈敏度與專一性高、樣品與試劑消耗量低、低耗能、避免人為操作汙染等優點。
舉例而言,對於登革熱疑似病例,最常用的方式為試紙快速篩檢,具有成本低、迅速及不受場地限制等優勢,但試紙無法鑑定感染型別,需要抽血送交常規實驗室檢驗才可確定型別,然而送交實驗室檢驗曠日廢時且需專業人員與
設備,易形成防疫漏洞,為了防範於未然,快速鑑定感染型別的檢驗對於未來台灣本土的疾病防治有其必要性。生物晶片產品彈性較大,可提供比試紙快篩更多資訊,然而相關商品甚少,較值得一提者有新加坡公司「veredus laboratories」生產之生物晶片系統「VereTropTM」,然而已於2003年停產,現有類似商品僅丹麥新創公司「BluSense Diagnostics」於2017年推出之可攜式精準診斷系統「BluBox」,然而該商品之生物晶片載台皆需預先進行生物材料置入,保存時間較短、製造成本較高,且檢測時間較長。目前的登革熱快速診斷方式為試紙快篩,每次費用約需新台幣300元,無法鑑定感染型別,需要抽血送交常規實驗室檢驗才可確定型別,但送交實驗室檢驗曠日廢時且需專業人員與設備,易形成防疫漏洞,為了防範於未然,快速鑑定感染型別的檢驗對於未來台灣本土的疾病防治有其必要性。
中華民國I470224專利揭露一種微流道之檢測系統,係將待測之複合物以磁性元件固定於微流道內,再將檢體注入微流道與複合物產生反應以供檢測,該專利在檢測時可能在微流道內殘留有沒參與反應的多餘檢體或複合物,造成信號偏差而降低檢測準確度。
為解決先前技術之缺點,本發明係提供一種複合微珠體及其應用,係使用由磁珠、膠珠組成之複合微珠體檢測
特定蛋白質,可用於生化、醫學、食安等多領域檢測需求,本發明以雙電極板量測複合微珠體之電阻抗,繪製出該複合微珠體之電化學阻抗頻譜,除可辨別特定蛋白質存在與否外,亦可對特定蛋白質型別進行分類,達到快速、準確檢驗與分類檢體之目標。
本發明係提供一種複合微珠體,該複合微珠體係包括:一以上磁珠,該磁珠表面植有第一抗體,該第一抗體係用於捕捉一待測蛋白質;一以上膠珠,該膠珠表面植有第二抗體,該第二抗體係可與該第一抗體結合,使該磁珠與該膠珠結合成帶有該待測蛋白質之複合微珠體。
本發明係提供一種複合微珠體製備方法,其步驟包括:提供一定量之待測蛋白質;提供一以上磁珠,該磁珠表面植有可捕捉該待測蛋白質之第一抗體;將該待測蛋白質與該磁珠加入第一緩衝液中,使該磁珠捕捉該待測蛋白質;用磁力分離該磁珠與未被捕捉到的待測蛋白質,去除多餘之待測蛋白質;提供一以上膠珠,該膠珠表面植有可與該第一抗體結合之第二抗體;將該磁珠、該膠珠加入第二緩衝液中,使該第一抗體與第二抗體結合,進而使該磁珠與該膠珠結合形成複合微珠體;用磁力分離該複合微珠體與未結合之膠珠,去除多餘之膠珠。
本發明係提供一種複合微珠體檢測方法,其步驟包括:提供一定量之複合微珠體,將該複合微珠體加入一第三
緩衝液中,形成一複合微珠流體;將該複合微珠流體導入一組雙電極板間,一信號處理單元量測該複合微珠流體通過該雙電極板之間時、該二電極板之阻抗變化,該信號處理單元根據該阻抗變化繪製出該複合微珠體之電化學阻抗頻譜,藉以比對判斷該複合微珠體是否含有一待測蛋白質。
本發明之複合微珠體檢測方法實施例中,更包括以下步驟:預先建立該複合微珠體不含待測蛋白質時的電化學阻抗頻譜資料,以作為判斷待測蛋白質是否存在之比對依據。
本發明之一實施例中,去除多餘磁珠、膠珠的方法係以磷酸鹽水溶液或純水清洗。
本發明之一實施例中,該第一、第二與第三緩衝液係為磷酸鹽水溶液、或其他種類之緩衝溶液。
本發明之一實施例中,其中該磁珠之粒徑係不小於該膠珠,該磁珠與該膠珠之粒徑大小係為0.1~100μm。
本發明之一實施例中,其中該膠珠係以乳膠製成,亦可選用其他種類之人造或天然材質製成。
本發明之一實施例中,其中該雙電極板係指電化學系統中之雙電極系統架構,係可為平行板雙電極板、共平面雙電極板或其他種類的電化學雙電極系統。
本發明之一實施例中,其中該雙電極板係可選用由電化學雙電極系統衍生之四電極系統,該雙電極板可為四
電極端點測量技術中連接電壓表與電流表導線端點的二點。
以上之概述與接下來的詳細說明及附圖,皆是為了能進一步說明本發明達到預定目的所採取的方式、手段及功效。而有關本發明的其他目的及優點,將在後續的說明及圖示中加以闡述。
S01~S07‧‧‧複合微珠體製備方法步驟
10‧‧‧複合微珠體
11‧‧‧磁珠
12‧‧‧膠珠
13A、13B‧‧‧雙電極板
A1‧‧‧第一抗體
P‧‧‧待測蛋白質
A2‧‧‧第二抗體
S101~S111‧‧‧複合微珠體檢測方法另一實施例步驟
圖1係為本發明之複合微珠流體檢測方法步驟流程圖。
圖2係為本發明之複合微珠體及其檢測系統第一實施例結構
圖3係為本發明之複合微珠體檢測方法另一實施例流程圖。
圖4係為本發明實施例之測試阻抗樣本圖。
圖5係為本發明實施例之阻抗量測結果之鑑別率比較圖。
以下係藉由特定的具體實例說明本發明之實施方式,熟悉此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本發明之其他優點與功效。
本發明係使用磁珠(magnetic beads)與膠珠(latex beads)為載體,用以捕捉及放大待測蛋白質之訊號,本專利係於磁珠表層種植第一抗體,以捕捉具有不同型別之該待測蛋白質,並於膠珠表層種植具專一性之第二抗體,接著經由磁珠、待測蛋白質與膠珠三者間之鍵結,以形成三明治量測結構,可放大該待測蛋白質之電性訊號,以判別待測蛋白質之有
無、特徵型別,更可經由鍵結之數量,達成定量檢測(即檢測待測蛋白質之含量、比例等)之目的。
本發明說明書內容所述之「一待測蛋白質」係指本發明欲檢測的目標:一種特定蛋白質,其數量不固定、視實際檢測場合所能提供的樣本數而定,並非將該蛋白質的數量限定於一個,合先敘明。
圖1係為本發明之複合微珠體製備方法步驟流程圖,其步驟包括:提供一定量之待測蛋白質S01;提供一以上磁珠,該磁珠表面植有可捕捉該待測蛋白質之第一抗體S02;將該待測蛋白質與該磁珠加入第一緩衝液中,使該磁珠捕捉該待測蛋白質S03;用磁力分離該磁珠與未被捕捉到的待測蛋白質,去除多餘之待測蛋白質S04;提供一以上膠珠,該膠珠表面植有可與該第一抗體結合之第二抗體S05;將該磁珠、該膠珠加入第二緩衝液中,使該第一抗體與第二抗體結合,進而使該磁珠與該膠珠結合形成複合微珠體S06;用磁力分離該複合微珠體與未結合之膠珠,去除多餘之膠珠S07。
本發明之複合微珠體及其檢測系統第一實施例結構圖如圖2所示,用於簡單說明本發明之複合微珠體結構、與使用雙電極板產生之電場檢測該複合微珠體電阻抗之原理。如圖所示,該複合微珠體10係包括一以上磁珠11,該磁珠表面植有第一抗體A1,該第一抗體A1係用於捕捉一待測蛋白質P;一以上膠珠12,該膠珠12表面植有第二抗體A2,該第二
抗體A2係可與該第一抗體A1作生化鏈結、結合,使該磁珠11與該膠珠12結合成帶有該待測蛋白質P之複合微珠體10。本發明使用磁珠、膠珠結合成複合微珠體的目的在於增強待測物之阻抗,使其通過雙電極板13A、13B之間時,對該雙電極板13A、13B間流通的電場E產生更強大的電阻抗信號,再透過一信號處理單元(圖未示)根據該雙電極板間的阻抗變化,繪製出該複合微珠體之電化學阻抗頻譜,藉以比對判斷該複合微珠體是否含有該待測蛋白質P。
本發明之一實施例中,該第一抗體係用於捕捉該待測蛋白質、使其附著於該磁珠上,接著藉由第二抗體與第一抗體間的生物化學反應結合,使粒徑較小之微珠附著到粒徑較大的磁珠表面。該磁珠、膠珠可放大該待測蛋白質之電性訊號,且藉由分析該複合微珠體之電化學阻抗頻譜圖形,可進一步辨別該待測蛋白質的次種類型別,例如用於某種具有多個型別的疾病蛋白質檢測時,檢驗人員可辨別出檢體樣本是否具有某型疾病蛋白質、並辨別其屬於疾病A、B、C、D型哪一種,提供後續投藥治療過程更多的參考資訊。
本發明之一實施例中,進行該複合微珠體檢測前,可先建立該複合微珠體不含待測蛋白質時的電化學阻抗頻譜資料,以供實際檢測時比對用。進行檢測之雙電極板係可設置於一微流體感測晶片上,信號處理單元可一併設置於該微流體感測晶片上、亦可獨立於該晶片之外。雙電極板的型式
可以是平行板雙電極板、共平面雙電極板或其他種類之電化學雙電極系統架構,亦可為衍生自雙電極系統之四電極系統,其中平行板雙電極板、共平面雙電極板較適用印刷電路板量產製程,適合大量生產降低成本。本發明之一實施例中,亦可將該複合微珠體製備流程(磁珠、膠珠結合過程)與檢測程序合併製作於單一微流體晶片或其他感測裝置上,可更快速的完成待測蛋白質的檢驗。
本發明之複合微珠體檢測方法另一實施例流程圖如圖3所示,藉由分析電化學阻抗頻譜(Electrochemical Impedance Spectroscopy,EIS),判斷所含微珠之數量,進而推定抗原(待測蛋白質)之數量。該實施例步驟包括:對一微流體感測晶片注入第一樣本試劑(純緩衝液),並給予一個測試信號,藉由電化學阻抗頻譜之數據判斷此微流體感測晶片是否穩定S101;再對同一微流體感測晶片注入第二樣本試劑,此樣本試劑與第一樣本試劑具有類似之電化學阻抗頻譜特性,並包含表面鍵結第一抗體之磁性粒子(磁珠)S102;給予一測試信號,得到其電化學阻抗頻譜,將其記錄為第一測試數據S103;接著對同一微流體感測晶片注入目標樣本(含有待測蛋白質),使其與第二樣本試劑充分混和S104;外加磁場於同一微流體感測晶片,將磁性粒子固定住S105;注入第一樣本試劑(純緩衝液),使磁性粒子以外的物質離開該微流體感測晶片S106;接著加入第三樣本試劑於同一微流體感測晶片,此樣本
試劑包含表面鍵結第二抗體之乳膠粒子(膠珠)S107;使微流體晶片內之液體充分混和,再將磁性粒子固定住S108;注入第一樣本試劑(純緩衝液),使磁性粒子以外的物質離開微流體感測晶片S109;給予一測試信號,得到其電化學阻抗頻譜,將其記錄為第二測試數據S110;比較第一與第二測試數據,若排除雜訊因子的影響後仍出現明顯差異,顯示此微流體感測晶片含有乳膠粒子,可知目標樣本含有目標抗原(待測蛋白質)S111。
為進一步驗證本發明提出之複合微珠體及其檢測方法、生物晶片診斷程序及雙電極板微流體晶片之可行性,實驗分別使用不具待測蛋白質的複合微珠體(磁珠表層鍵結BSA(牛血清白蛋白)及第一抗體;膠珠表層鍵結BSA及第二抗體),以及具待測蛋白質之複合微珠體(磁珠表層鍵結BSA、第一抗體及待測蛋白質,膠珠表層鍵結BSA及第二抗體)進行量測,下表為本次測試使用之待測物濃度,其中微珠表層鍵結之待測蛋白質濃度為20μg/ml,而磁珠與膠珠之濃度,均係使用PBS混合調配而成,且調配方式係採用微珠與PBS體積比為1:1進行調製。另須說明的是,本次實驗之複合微珠體均係事先於微流體晶片外進行混合鍵結後再進行量測,且微珠表層鍵結待測蛋白質與兩微珠混合之時間各約20分鐘。
本發明之一實施例中,量測時所採用之晶片係利用PDMS翻模製作,其中該晶片之電極係由單芯銅導線組成,且微流道寬度與高度分別約為300μm與400μm,同時利用蠕動幫浦作為推動待測物之動力源。另本發明所使用之磁珠濃度為10mg/ml,且該磁珠表面已種植第一抗體,並使用BSA填補磁珠未鍵結抗體之缺洞。至於使用之膠珠濃度為1%,且該膠珠表面同樣鍵結第二抗體及BSA。
本發明使用表層同時鍵結第一抗體、BSA及待測蛋白質之磁珠與表層已有種植第二抗體及BSA之膠珠進行混合,其中磁珠與膠珠之濃度分別為10mg/ml及1%,且兩種液體之混合體積比為1:1。至於表層有鍵結第一抗體之磁珠,以及混合有鍵結待測蛋白質(NS1)的磁珠與第二抗體之
膠珠,兩者間之數值變化曲線,本發明實施例之測試阻抗樣本圖如圖4所示,橫軸為樣本筆數,左縱軸為阻抗標么值,右縱軸為阻抗偏移量,比較純磁珠與本發明複合微珠體之阻抗偏移量與阻抗標么值。由圖可知,兩條曲線最終趨於穩定,亦即偏移量絕對值小於0.2%,其中比較兩條曲線補償後之數值可知,鍵結第一抗體之磁珠校正後的阻抗標么值約為0.999標么,而混合有鍵結待測蛋白質的磁珠與第二抗體膠珠補償後之阻抗標么值約為0.994標么,兩者相差0.005標么,且阻抗偏移量約0.47%,遠大於0.2%,故經由本發明之檢測方法,則可正確判斷檢體是否含有待測蛋白質。
此外,為探討分析本發明於檢測待測蛋白質之鑑別率,本發明則分別進行2次有無待測蛋白質之混合磁珠(表層鍵結BSA、抗體及待測蛋白質)及膠珠(表層鍵結BSA及抗體)之量測,且量測結果之鑑別率比較圖如圖5所示,利用本發明之複合微珠體檢測方法進行2次測試,均可診斷出檢體含有待測蛋白質,鑑別率為100%。
藉此,本發明係提供一種複合微珠體及其應用,係使用由磁珠、膠珠組成之複合微珠體檢測特定蛋白質,本發明以雙電極板量測複合微珠體之電阻抗,繪製出該複合微珠體之電化學阻抗頻譜,除可辨別特定蛋白質存在與否外,亦可對特定蛋白質型別進行分類,達到快速、準確檢驗與分類檢體之目標。具雙電極板之微流體感測晶片可使用印刷電路板技
術大量生產,故本發明具有高生產效率與普及化之潛力,可用於生化、醫學、食安等多領域檢測需求。本發明之複合微珠體製備與檢測步驟可縮裝於單一微晶片上,具有快速檢驗、分型之功效,對於生技產品、疾病防治、醫藥領域、食品安全等生物化學檢驗技術具有相當助益。
上述之實施例僅為例示性說明本發明之特點及其功效,而非用於限制本發明之實質技術內容的範圍。任何熟習此技藝之人士均可在不違背本發明之精神及範疇下,對上述實施例進行修飾與變化。因此,本發明之權利保護範圍,應如後述之申請專利範圍所列。
10‧‧‧複合微珠體
11‧‧‧磁珠
12‧‧‧膠珠
13A、13B‧‧‧雙電極板
A1‧‧‧第一抗體
P‧‧‧待測蛋白質
A‧‧‧第二抗體
Claims (16)
- 一種複合微珠體,係包括:一以上磁珠,該磁珠表面植有第一抗體,該第一抗體係用於捕捉一待測蛋白質;一以上膠珠,該膠珠表面植有第二抗體,該第二抗體係可與該第一抗體結合,使該磁珠與該膠珠結合成帶有該待測蛋白質之複合微珠體。
- 如請求項1所述之複合微珠體,其中該磁珠之粒徑大於該膠珠。
- 如請求項1所述之複合微珠體,其中該磁珠與該膠珠之粒徑大小係為0.1~100μm。
- 如請求項1所述之複合微珠體,其中該膠珠係以乳膠製成。
- 一種複合微珠體製備方法,其步驟包括:提供一定量之待測蛋白質;提供一以上磁珠,該磁珠表面植有可捕捉該待測蛋白質之第一抗體;將該待測蛋白質與該磁珠加入第一緩衝液中,使該磁珠捕捉該待測蛋白質;用磁力分離該磁珠與未被捕捉到的待測蛋白質,去除多餘之待測蛋白質;提供一以上膠珠,該膠珠表面植有可與該第一抗體結合之第二抗體; 將該磁珠、該膠珠加入第二緩衝液中,使該第一抗體與第二抗體結合,進而使該磁珠與該膠珠結合形成複合微珠體;用磁力分離該複合微珠體與未結合之膠珠,去除多餘之膠珠。
- 如請求項5所述之複合微珠體製備方法,其中該第一緩衝液係為磷酸鹽水溶液、或其他種類之緩衝溶液。
- 如請求項5所述之複合微珠體製備方法,其中該第二緩衝液係為磷酸鹽水溶液、或其他種類之緩衝溶液。
- 如請求項5所述之複合微珠體製備方法,其中該磁珠之粒徑係不小於該膠珠。
- 如請求項5所述之複合微珠體製備方法,其中該磁珠與該膠珠之粒徑大小範圍係為0.1~100μm。
- 如請求項5所述之複合微珠體製備方法,其中該膠珠係以乳膠,或其他種類之人造、天然材質製成。
- 一種複合微珠體檢測方法,其步驟包括:提供一定量之複合微珠體,將該複合微珠體加入一第三緩衝液中,形成一複合微珠流體;將該複合微珠流體導入一組雙電極板間,一信號處理單元量測該複合微珠流體通過該雙電極板之間時、該雙電極板之阻抗變化,該信號處理單元根據該阻抗變化繪製出該複合微珠體之電化學阻抗頻譜,藉以比對判斷該複合微珠體是否含有一待測蛋白質;其中該複合微珠體之製備方法步驟係包括: 提供一定量之待測蛋白質;提供一以上磁珠,該磁珠表面植有可捕捉該待測蛋白質之第一抗體;將該待測蛋白質與該磁珠加入第一緩衝液中,使該磁珠捕捉該待測蛋白質;用磁力分離該磁珠與未被捕捉到的待測蛋白質,去除多餘之待測蛋白質;提供一以上膠珠,該膠珠表面植有可與該第一抗體結合之第二抗體;將該磁珠、該膠珠加入第二緩衝液中,使該第一抗體與第二抗體結合,進而使該磁珠與該膠珠結合形成複合微珠體;用磁力分離該複合微珠體與未結合之膠珠,去除多餘之膠珠。
- 如請求項11所述之複合微珠體檢測方法,其中更包括以下步驟:預先建立該複合微珠體不含待測蛋白質時的電化學阻抗頻譜資料,以作為判斷待測蛋白質是否存在之比對依據。
- 如請求項11所述之複合微珠體檢測方法,其中該第三緩衝液係為磷酸鹽水溶液,或其他種類之緩衝溶液。
- 如請求項11所述之複合微珠體檢測方法,其中該雙電極板係為電化學系統中之雙電極系統架構。
- 如請求項11所述之複合微珠體檢測方法,其中該雙電極板係為平行板雙電極板或共平面雙電極板。
- 如請求項11所述之複合微珠體檢測方法,其中該雙電極板係為四端點測量技術中連接電壓表與電流表導線端點的二點。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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TW108121914A TWI717766B (zh) | 2019-06-20 | 2019-06-20 | 複合微珠體及其應用 |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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TW108121914A TWI717766B (zh) | 2019-06-20 | 2019-06-20 | 複合微珠體及其應用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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TW202101003A TW202101003A (zh) | 2021-01-01 |
TWI717766B true TWI717766B (zh) | 2021-02-01 |
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ID=75234520
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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TW108121914A TWI717766B (zh) | 2019-06-20 | 2019-06-20 | 複合微珠體及其應用 |
Country Status (1)
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TW (1) | TWI717766B (zh) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI592423B (zh) * | 2014-10-03 | 2017-07-21 | 中央研究院 | 可辨識致病性tdp-43之抗體及其用途 |
-
2019
- 2019-06-20 TW TW108121914A patent/TWI717766B/zh active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI592423B (zh) * | 2014-10-03 | 2017-07-21 | 中央研究院 | 可辨識致病性tdp-43之抗體及其用途 |
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TW202101003A (zh) | 2021-01-01 |
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