TW201606306A - 生醫檢測晶片及以之進行檢測之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明所揭一種生醫檢測晶片，其包含有一基材，具有一板形本體，複數個凸部，彼此相互交錯地設於該本體之一面，至少一限位空間，被彼此相鄰之三凸部所圍繞；一導電層，具有各該凸部之一面；數個奈米粒子，散設於具有該導電層之各該凸部表面；至少一生物辨識體，用以與一外部目標分子結合，設於該奈米粒子之表面。藉此，本發明所揭生醫檢測晶片係能使該外部目標分子係受各該凸部之拘束而受限制於該限位空間中，且得與同時與至少一凸部上之該生物辨識體接合。

Description

生醫檢測晶片及以之進行檢測之方法
本發明係有關於一種生物晶片，特別係指一種生醫檢測晶片及以之進行檢測之方法。
按，免疫酵素分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)係藉由抗原抗體結合之特性，為目前檢測檢體中小分子物質之方法，而最常用於偵測血液中病毒之抗原，或是為對抗病毒所產生之抗體，用以作為評斷個體是否受到病毒感染之指標。而為能便於醫療院所或研究人員使用，目前更將免疫酵素分析法結合生物晶片而形成一檢測套組，藉由將如受體、蛋白質、接受器等探針設置於基材上，而得與檢體中之目標物進行結合。惟，由於目前所使用之基材係為平面，當該待測目標物非為片段結構時，則會無法與探針間具有堅固之結合，因而檢測過程中之沖洗步驟會使非片段結構之該待測目標隨之脫離探針，導致檢測效果及準確率皆不佳。舉例來說，登革熱病毒係呈球狀，各探針僅能與病毒外表面之單點結合，因此，兩者間之結合力較弱，導致病毒亦受外力而脫離該探針。
為能避免上述缺失，台灣專利公開第201114680號專利「高靈敏度半球形奈米生醫感測晶片結構及製造方法」，其係包含有一基板，複數個半球狀之凸部結構，設於該基板上，並且分別於其表面濺鍍薄膜電極， 複數個電泳沈積奈米顆粒，設於各該凸部結構薄膜電極之表面上。雖然該專利前案所揭技術特徵能用以增加基板之表面積，惟，該專利前案仍具有下列缺失：其一、該生醫感測晶片無法與特定分子結合，導致專一性不足；其二、各該凸部結構彼此交界處所形成之凹槽，其空隙過大，無法改善小分子物質脫離該晶片之缺失。
據此，為能改善習知技術之缺失，並且提昇晶片敏感性及專一性，以增進公共利益與國民健康，開發出一種新型生醫檢測晶片乃為目前最重要之課題。
因此，本發明之主要目的係在於提供一種生醫檢測晶片，其係提供一種新穎晶片結構，透過將複數個凸部彼此交錯地排列，並且相鄰之三凸部係於基材上形成之一限位空間，得將大小介於50~100μm之小分子物質拘束於該限位空間內，避免小分子物質任意脫離晶片，以達到增加晶片敏感度以及提昇檢測準確度之功效。
本發明之另一目的係在於提供一種使用生醫檢測晶片進行檢測之方法，其係使用本發明所揭生醫檢測晶片分析待測樣品中是否含有特定小分子物質，進而應用於疾病檢測、藥物篩選、疫苗開發等生物醫學領域，達到有效篩選樣品以及節省成本之功效。
為能達成上述目的，本發明所揭一種生醫檢測晶片，其包含有一基材，具有一板形本體，複數個凸部，彼此相互交錯地設於該本體之一面，至少一限位空間，被彼此相鄰之三凸部所圍繞；一導電層，具有各該凸部之一面；數個奈米粒子，散設於具有該導電層之各該凸部表面；至 少一生物辨識體，用以與一外部目標分子結合，設於該奈米粒子之表面。藉此，本發明所揭生醫檢測晶片係能使該外部目標分子係受各該凸部之拘束而受限制於該限位空間中，且得與同時與至少一凸部上之該生物辨識體接合。
較佳地，各該凸部係呈半球形，其中，各該凸部之直徑於30~300奈米為較佳。
較佳地，該奈米粒子係為金屬粒子，舉例來說，該奈米粒子係為金奈米粒子。
較佳地，該生物辨識體係為病毒受體、蛋白質、抗體、核酸分子、病毒、醣脂(glycolipid)、聚醣(glycan)或上述至少二之組合，舉例來說，當該病毒辨識體為登革熱病毒受體時，該生醫檢測晶片得用於檢測登革熱病毒是否存在於檢體內。
較佳地，各該奈米粒子之直徑約為2~10奈米。
較佳地，各該凸部彼此間相距約5~30奈米。
較佳地，該導電層之厚度約為10~50奈米。
藉由上述生醫檢測晶片，本發明更進一步揭露一種使用生醫檢測晶片進行檢測之方法，包含下列步驟：(a)取上述生醫檢測晶片，並且以一電測試儀器測定其電阻，獲得一第一電阻值；(b)取一待測樣品，並且將該待測樣品置於該生醫檢測晶片中，以該電測試儀器測定其電阻，獲得一第二電阻值；(c)比較該第一電阻值與該第二電阻值，當該第二電阻值較第一電阻值高時，表示該待測樣品內含有得以與該晶片之生物辨識體結合之小分子。
較佳地，該電測試儀器係包含一導線及一阻抗分析儀。
較佳地，本發明所揭生醫檢測晶片進行檢測之方法更包含一步驟d，位於該步驟c之後，第二電阻值高於第一電阻值時，將該第一電阻值與該第二電阻值之差值帶入一以統計上之迴歸分析所得之預定方程式中，用以估算出該待測樣品內之小分子濃度。
(10)‧‧‧生醫檢測晶片
(20)‧‧‧基材
(21)‧‧‧本體
(22)‧‧‧凸部
(23)‧‧‧限位空間
(30)‧‧‧導電層
(40)‧‧‧金奈米粒子
(50)‧‧‧生物辨識體
(60)‧‧‧小分子物質
第一圖A係為本發明較佳實施例之立體示意圖。
第一圖B係為第一圖A之頂視圖。
第一圖C係為第一圖A之側視圖。
第一圖C係為沿著第一圖A中D-D方向之剖視圖。
第二圖A係為本發明較佳實施例之使用示意圖。
第二圖B係為第二圖A之局部放大圖。
第三圖A係為本發明所揭生醫檢測晶片未濺散金奈米粒子前於電子顯微鏡下之攝影圖。
第三圖B係為本發明所揭具金奈米粒子之生醫檢測晶片於電子顯微鏡下之攝影圖。
第四圖係為表現本發明所揭生醫檢測晶片與登革熱病毒培養前後之轉移電阻變化之奈奎斯特圖(Nyquist plot)。
第五圖係為等效電路模型。
第六圖係表示各該組之生醫檢測晶片與登革熱病毒作用前後之電阻差值。
第七圖係為檢測並分析具有不同探針之生醫檢測晶片於不同病毒濃度作用前後之電阻差值的結果。
除非另外定義，本發明中所揭科學詞彙及技術詞彙乃依據所屬技術領域且具通常知識者所能明瞭之相同意義。本發明中所揭術語於其他明示下，其所代表之意義如下所示。
所謂「小分子物質」係包含有，但不限於，病毒、細菌、醣類、蛋白質、化合物。
所謂「導電層」係以該發明所屬技術且具通常知識者具備之技術，將如金、銀、鈦等材料進行濺鍍程序所形成者。
所謂「DC-SIGN(dendritic-cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin)」，又名為CLEC4L，其與登革熱套膜蛋白上之醣具有堅固之連結，因而通常被作為正控制組，用以證實正常配體與受體間之作用。
所謂「專一性結合」係指透過專一性探針(specific probe)與目標物結合後之訊號強度係至少較控制組探針(control probe)之訊號強度高30%。
所謂「Dectin-2」，又名為CLEC6A，其係一種與相似IgG之構造，能辨識真菌細胞壁上之α甘露醣，常作為同型對照組(iso-type control)，用以消除相似IgG之構造的任何影響。
所謂「hIgG1」係為人類IgG1，作為負向控制組，用以展現實例之背景訊號。
以下，為能更進一步說明本發明，將茲舉之若干較佳實施例並搭配圖式作詳細說明，惟，該等實施例係為用以解說之例示，其中所使用之任何詞彙並不限制本發明說明書及申請專利範圍之範圍及意義。
請參閱第一圖A至D，本發明之較佳實施例所揭生醫檢測晶片(10)係由一基材(20)、一導電層(30)、複數個金奈米粒子(40)及至少一生物辨識體(50)所組成者，其中：該基材(20)係得由該發明所屬技術領域且具通常知識者利用光學、化學、物理等製程所得，具有一板形本體(21)，複數個半球形凸部(22)，其直徑約為30~300奈米，如30、40、50、75、100、150、200、250、300奈米，並且，各列半球形凸部(22)係相互交錯地設於該本體(21)之一面上而彼此間相距約5~30奈米，複數個限位空間(23)係分別位於彼此相鄰之三凸部(22)之間，用以使一預定大小之小分子物質被該限位空間(23)拘束而受限制於該限位空間(23)中。
該導電層(30)以一預定厚度均勻鍍設於該基材(20)具有各該凸部(22)之一面，其中，該預定厚度介於10~50奈米，又以10~20奈米為較佳。
該金奈米粒子(40)係均勻散設於已鍍有該導電層(30)之各該凸部(22)之表面，而其散設密度係介於0.0025~0.00625nm-2間。
各該生物辨識體(50)係得設於各該金奈米粒子(40)之表面，例如：抗體、受體、重組蛋白、醣脂、凝聚素(lectin)或聚醣等，用以與相應之小分子物質專一性結合。
藉由上述元件之組合，請參閱第二圖A及B，以本發明所揭 生醫檢測晶片(10)與一待測樣品作用，該待測樣品內之小分子物質(60)，如病毒，係得被該限位空間(23)所拘束而被限制於該限位空間(23)內，同時，設於該限位空間(23)周側之該三奈米金離子(40)上之該生物辨識體(50)係得分別結合該小分子物質(60)。而後，當於該生醫檢測晶片(10)上進行如沖洗、震盪等程序時，由於該小分子物質(60)已被定位於該限位空間(23)，俾使該小分子物質(60)無法輕易地脫離該基材(20)，並且同時該小分子物質(60)已與複數個生物辨識體(50)結合，提昇該小分子物質(60)與該生物辨識體(50)間之結合力。據此，相較於習知技術中僅以單一生物辨識體結合目標物之方式，本發明所揭生醫檢測晶片係透過限位結構及多點結合之技術特徵，避免小分子物質因外力干擾而脫離該基材之功效，達到增加檢測準確率及敏感性之功效。
更進一步來說，透過本發明所揭生醫檢測晶片進行檢測之方法係包含下列步驟：
(a)取本發明所揭生醫檢測晶片，以電測試儀器測定其電阻，獲得一第一電阻值。
(b)取一待測樣品，並且使該待測樣品與該生醫檢測晶片相互作用後，以電測試儀器測定其電阻，獲得一第二電阻值。
(c)比較該第一電阻值與該第二電阻值，當該第二電阻值較第一電阻值高時，表示該待測樣品內含有得以與該晶片之生物辨識體結合之目標分子。
(d)當第二電阻值高於第一電阻值時，將該第一電阻值與該第二電阻值之差值帶入一以迴歸分析法所得之預定方程式中，用以估算 出該待測樣品內之小分子濃度。
藉由本發明所揭進行檢測之方法，當該生醫檢測晶片表面上之該生物辨識體相應之目標分子結合時，使該生醫檢測晶片所測得之阻抗值產生變化，而能得知該待測樣品中是否含有得以與該生物辨識體結合之目標分子。再者，當該待測樣品中含有目標分子時，透過由統計迴歸分析所得之方程式，得進一步估算出該待測樣品中所含有之目標分子之濃度。由此可知，藉由本發明所揭生醫檢測晶片進行檢測，能大幅簡化檢測流程，達到提高檢測效率之功效。
為能說明本發明之功效，將茲舉之若干較佳實例作進一步驗證，惟，該等實例係為用以解說本發明實施例之例示，其中所使用之任何樣本或實驗流程並不限制本發明說明書及申請專利範圍之範圍及意義。
實例一：製造生醫檢測晶片
首先，進行傳統陽極氧化流程(Tsai et al.Int.J.Nanomedicine 6：1201-1208)，再以氯化銅鹽酸溶液去除於該陽極氧化鋁薄膜層下方之未氧化之鋁，獲得一陽極氧化鋁(anodic aluminum oxide)薄膜層，並且以環氧樹脂或矽膠等密封材料將薄膜層設置於一玻片上，用以作為基材，其中，氯化銅鹽酸溶液由13.45公克之氯化銅粉末溶於100毫升、重量百分比35%之鹽酸溶液所配製而成。該薄膜層表面係交錯排列地設置複數個直徑約200nm之半球形凸部，而進一步被重量百分比30%之磷酸修飾30分鐘，如第三圖A所示。而後，藉由0.5mM四氯金酸溶液，並且施加-0.7伏特DC電壓約3分鐘，使直徑小於10nm之金奈米顆粒均勻地濺散於具有凸部之該薄膜層表面，用以作為帶有正電之電極。依據上述步驟所製之生醫 檢測晶片係如第三圖B所示。
而為避免電化學阻抗分析之緩衝液洩漏或干擾該生醫檢測晶片，取一具有6毫米孔之塑料石蠟薄膜(PARAFILMR)黏合於該陽極氧化鋁薄膜層上方，並且以矽膠密封。
實例二：製備病毒
於C6/36細胞中進行培養登革熱病毒(DV2/PL046)。以BHK-21細胞藉由病毒斑分析法(plaque-forming-assays)定量病毒。
實例三：固定探針於生醫檢測晶片
該發明所屬技術領域且具通常知識者係以SAM(self-assembling monolayer)技術用於將探針固定於生醫檢測晶片表面。詳言之，首先，將實例一所完成之該生醫檢測晶片置於20μL、濃度10mM之11-MUA(11-mercaptoundecanoic acid)溶液中約10分鐘，再與相同體積之由50mM之NHS(N-hydroxysuccinimide)及100mM之EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)所組成之混合液共同作用後，與15μL之探針反應約30分鐘，其中，hIgG1探針濃度為0.02μg/μL；其餘探針，如CLEC5A、DC-SIGN、Dectin-2之濃度為0.012μg/μL。經由上述步驟，即可完成帶有不同種類探針之生醫檢測晶片。
實例四：電化學阻抗分析偵測及定量
根據實例三，製備具有CLEC5A探針之生醫檢測晶片，置放於培養基約45分鐘後，將該生醫檢測晶片與登革熱病毒進行培養30分鐘，其中，登革熱病毒力價(titer)為9.5X107pfu/mL。並且，藉由SP-150恆電位儀(Bio-Logic,USA)測量具有CLEC5A探針之生醫檢測晶片與登革熱病 毒培養前後之轉移電阻的變化，結果係如第四圖所示。所有測量係於具有一磷酸鹽緩衝溶液及一混合溶液之環境下進行，其中，該混合溶液為5mM之Fe(CN)64-及5mM之Fe(CN)63-。輔助電極、參考電極、工作電極分別為白金膜、銀/氯化銀及奈米結構之凸部。所有實驗結果會被設置於如第五圖所示之等效電路模型，並且，透過該等效電路模型係得計算出該生醫檢測晶片與登革熱病毒培養前後轉移電阻之變化，其中，該等效電路模型係被分為串連之三電極元件，分別表示為電解液之電阻(R1)，探針之電容(Q2)及電阻(R2)，以及陽極氧化鋁薄膜層之電容(Q3)及電阻(R3)。
由第四圖之結果可知，具有CLEC5A探針之生醫檢測晶片與登革熱病毒培養前後之電阻確實具有變化，顯示CLEC5A探針與登革熱病毒間有作用。
實例五：偵測CLEC5A探針與登革熱病毒之相互作用
依據實例三所述，分別製備具有hIgG1探針、CLEC5A探針、DC-SIGN探針、Dectin-2探針之生醫檢測晶片。依據不同探針而將該等生醫檢測晶片分組，而將各該組之生醫檢測晶片放於培養基約45分鐘後，再分別與登革熱病毒進行培養30分鐘，而登革熱病毒力價(titer)為9.5X107pfu/mL，其中，第一組係為具有hIgG1探針之生醫檢測晶片，為負控制組，樣本數為7；第二組係為具有DC-SIGN探針之生醫檢測晶片，為正控制組，樣本數為6；第三組係為具有Dectin-2探針之生醫檢測晶片，樣本數為5；第四組係為具有CLEC5A探針之生醫檢測晶片，樣本數為7。以電化學阻抗分析檢測各該組之生醫檢測晶片與登革熱病毒培養前後之電阻值，並且，以生醫檢測晶片與登革熱病毒作用後所測得之電阻值扣除其未 與登革熱病毒作用所測得之電阻值，計算出各該組之生醫檢測晶片與登革熱病毒作用前後之電阻差值，結果如第六圖所示。
由第六圖之結果可知，第一組與第四組間具有顯著增加，第二組與第四組間具有較特殊差異(specific difference)，而第三組及第四組間不存在特殊差異。再者，CLEC5A探針與登革熱病毒間之結合力較弱，因而由過去文獻中可知CLEC5A探針與登革熱病毒間之結合幾乎無法藉由ELISA檢測到，惟，由第六圖之結果明確地證實本發明所揭生醫檢測晶片可以檢測到CLEC5A探針與登革熱病毒間之結合。由此可知，本發明所揭生醫檢測晶片的確可以改善習知技術之缺失，於探針與病毒結合較弱之情形下，仍可以有效地檢測到兩者之交互作用，具有較佳敏感性及專一性，而達到提昇準確率之功效。
實例六：不同病毒濃度與生醫檢測晶片之相互作用
將登革熱病毒進行稀釋，從力價9.5X107 pfu/mL至9.5X104pfu/mL，並且分別與具有hIgG1探針之生醫檢測晶片以及具有CLEC5A探針之生醫檢測晶片進行反應，樣本數分別為3，其中，反應流程與測量電阻值之步驟係如實例五中所述，故於此不加以贅述。分別將所得之平均電阻差值與病毒濃度之對數值以統計軟體進行分析，結果如第七圖所示。
由第七圖之結果可知，相較於具有hIgG1探針之生醫檢測晶片，具有CLEC5A探針之生醫檢測晶片於病毒力價於9.5X107pfu/mL至9.5X105pfu/mL間具有顯著增加，並且，於病毒力價於108至106間具有一趨勢線(R2=0.9868)，而得於電阻差值於169~224kΩ間估算出病毒力價，換言之，透過測量並分析本發明所揭生醫檢測晶片之電阻值，可以推算出 待測樣本中目標分子之含量，而達到快速且簡便定量之功效。
再者，基於第七圖之結果顯示，本發明所揭生醫檢測晶片能於多種病毒濃度測得其電阻值之變化，因此可知，本發明所揭生醫檢測晶片不僅能夠作為一種良好病毒力價測量之指示工具，並且亦具有高度敏感性而能提高檢測之準確率。
藉由上述實例之結果，本發明所揭生醫檢測晶片及以之進行檢測之方法確實能夠改善習知技術敏感度及檢測率不佳之缺失，如ELISA，並且，即便於分子間結合較弱之情形下，透過本發明所揭生醫檢測晶片仍具有良好檢測率，如CLEC5A探針與登革熱病毒，腸病毒71(EV 71)與P-選擇素醣蛋白配體-1(P-selectin glycoprotein ligand-1)或腫瘤移轉相關蛋白質-醣類作用，具體來說，過去文獻指出，ELISA須於病毒力價為5X106pfu/mL及探針濃度為1μg/well時，始能檢測出兩者間之作用(Chen ST et al.,Nature,2008)，相較於此，本發明所揭生醫檢測晶片係能於病毒力價為9.5X105pfu/mL時，檢測到CLEC5A探針與登革熱病毒間之作用，換言之，本發明所揭生醫檢測晶片之靈敏度係較ELISA增加至少5倍。再者，相較於習知技術，如ELISA、SPR等，本發明所揭生醫檢測晶片及以之進行檢測之方法更具有操作簡單、成本低廉、應用性更廣、誤差低等優點，具體來說，本發明所揭生醫檢測晶片係能依據待測目標物而搭配適合之探針，而能達到檢測不同目標物之功效，例如腸病毒、日本腦炎病毒等，或是應用於不同目的之研究，例如藥物研發或篩選、檢測腫瘤細胞進程等。此外，透過本發明所揭檢測方法係能透過統計結果，簡易快速地推算出待測樣本內目標物之含量，將有助於節省檢測成本，若應用於疾病篩檢上，可作為 提供患者治療方法之基礎。據此可知，本發明所揭生醫檢測晶片及以之進行檢測之方法係提供未來檢測醣類較弱相互作用或是篩選蛋白質-醣類共軛結合點之極佳工具。
以上僅是藉由各該實例詳細說明本發明，熟知該技術領域者於不脫離本發明精神下，而對於說明書中之實施例所做的任何簡單修改或是變化，均應為本案申請專利範圍所得涵攝者。
(10)‧‧‧生醫檢測晶片
(20)‧‧‧基材
(21)‧‧‧本體
(22)‧‧‧凸部
(23)‧‧‧限位空間
(40)‧‧‧金奈米粒子

Claims (12)

  1. 一種生醫檢測晶片，其包含有：一基材，具有一板形本體，複數個凸部，係彼此間相互交錯地設於該本體之一面；一導電層，設於該基材具有各該凸部之一面；複數個奈米粒子，散設於具有該導電層之各該凸部表面；至少一生物辨識體，設於該奈米粒子之表面，用以與一相應之外部目標分子結合；其特徵係在於：該基材更包含至少一限位空間，係位於彼此相鄰之三凸部之間；藉此，該外部目標分子係受各該凸部之拘束而受限制於該限位空間中，且得與同時與至少一凸部上之該生物辨識體接合。
  2. 依據申請專利範圍第1項所述生醫檢測晶片，其中，該凸部係呈半球形。
  3. 依據申請專利範圍第1項所述生醫檢測晶片，其中，該奈米粒子係為金屬粒子。
  4. 依據申請專利範圍第3項所述生醫檢測晶片，其中，該奈米粒子之材質為金。
  5. 依據申請專利範圍第1項所述生醫檢測晶片，其中，該生物辨識體係選自於由病毒受體、蛋白質、抗體、核酸分子、病毒、醣脂(glycolipid)、聚醣(glycan)及上述至少二之組合所組成之群。
  6. 依據申請專利範圍第2項所述生醫檢測晶片，其中，各該凸部之直 徑約為30~300奈米。
  7. 依據申請專利範圍第1項所述生醫檢測晶片，其中，各該奈米粒子之直徑約為2~10奈米。
  8. 依據申請專利範圍第1項所述生醫檢測晶片，其中，各該凸部彼此間相距約5~30奈米。
  9. 依據申請專利範圍第1項所述生醫檢測晶片，其中，該導電層之厚度約為10~50奈米。
  10. 一種使用生醫檢測晶片進行檢測之方法，包含下列步驟：步驟a：取一如申請專利範圍第1至9項中任一項所述生醫檢測晶片，以一電測試儀器測定其電阻，獲得一第一電阻值；步驟b：取一待測樣品，並且將該待測樣品置於該生醫檢測晶片中，以該電測試儀器測定其電阻，獲得一第二電阻值；步驟c：比較該第一電阻值與該第二電阻值，當該第二電阻值較第一電阻值高時，表示該待測樣品內含有得以與該晶片之生物辨識體結合之小分子。
  11. 依據申請專利範圍第10項所述使用生醫檢測晶片進行檢測之方法，其中，該電測試儀器係包含一導線及一阻抗分析儀。
  12. 依據申請專利範圍第10項所述使用生醫檢測晶片進行檢測之方法，其更包含一步驟d，位於該步驟c之後，當第二電阻值高於第一電阻值時，將該第一電阻值與該第二電阻值之差值帶入一以統計上之迴歸分析所得之預定方程式中，用以估算出該待測樣品內之小分子濃度。
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