WO2016035197A1 - 電気化学免疫センサ用カートリッジ及びそれを用いた測定装置 - Google Patents

電気化学免疫センサ用カートリッジ及びそれを用いた測定装置 Download PDF

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antibody
potential
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淳子 田中
釜堀　政男
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株式会社日立製作所
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    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/08—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a stream of discrete samples flowing along a tube system, e.g. flow injection analysis
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    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • Clinical examinations using biological samples such as blood and urine of humans and animals are important diagnostic materials for doctors and veterinarians to detect diseases and observe the progress of diseases.
  • clinical examinations are generally performed in a laboratory or examination center by a professional engineer using a large automatic analyzer.
  • POCT point-of-care testing
  • a virus antigen such as hepatitis virus, influenza virus, Chlamydia pneumoniae or an antibody against it is measured.
  • cardiac disease tests cardiac troponin I (cTnI), cardiac troponin T (cTnT), creatine kinase MB (CK-MB), N-terminal pro-BMP (NT-proBMP), etc. are released into the blood at the time of myocardial infarction or heart failure. Protein is measured.
  • CK-MB cardiac troponin T
  • NT-proBMP N-terminal pro-BMP
  • electrochemical measurement methods are used for small clinical testing devices for POCT. This is because the electrochemical measurement method is easier to miniaturize the apparatus than the absorptiometry. In addition, the absorptiometric method is easily affected by the color of blood, but the electrochemical measuring method has no effect.
  • electrochemical measurement methods an electric current measurement method and an electric potential measurement method
  • small clinical test apparatuses mainly for POCT of the electric current measurement method are prevalent in the market.
  • the current measurement method is a method in which a reagent is reacted with a sample containing an object to be measured, and the generated redox substance is measured as an electric current value with an electrode to obtain the concentration of the object to be measured (Japanese Patent Laid-Open No. 2009-150902). .
  • the current value follows the Cottrell equation (Equation 1). Since the current value depends on the production rate of the redox material, the rate method is used. [Formula 1] n: Number of electrons transferred in electrode reaction F: Faraday constant A: Electrode area C 0 : Bulk concentration of redox material D 0 : Diffusion coefficient of redox material t: Time
  • the potential measurement method is a method in which a reagent is reacted with a sample containing a measurement object, and the generated redox substance is measured as a potential difference between the measurement electrode and the reference electrode to obtain the concentration of the measurement object (WO 2010). / 052867 A1).
  • the potential value follows the Nernst equation (Equation 2).
  • equation 2 In the potential measurement method, both the rate method and the endpoint method are used because the potential value depends on the total amount of redox substances generated.
  • the current value depends on the electrode area in the current measurement method, it is necessary to manufacture the electrode area to be constant, but it is difficult to manufacture an immunological test cartridge with an electrode at a cost corresponding to POCT. Is a point.
  • the current measurement method it is necessary to generate a redox substance in the vicinity of the electrode. Therefore, the size of the field where the measurement object reacts with the antibody for capturing and detecting it is limited, and the usable antibody This makes it difficult to measure with high sensitivity.
  • the electrode area does not need to be strictly constant, and the manufacturing cost of the electrode can be reduced.
  • the object to be measured and its capture and detection are detected.
  • the size of the field to which the antibody reacts is limited, the amount of antibody that can be used is reduced, and the same problem remains that high-sensitivity measurement is difficult.
  • an object of the present invention is to achieve both high sensitivity and high measurement accuracy in a small clinical testing apparatus for POCT that is required to be manufactured at low cost.
  • a reaction unit larger than the detection unit is provided upstream of the detection unit for reaction. Combine the methods to do. At that time, the reaction becomes non-uniform in the reaction part larger than the conventional one, and the measurement accuracy is lowered. Therefore, it is desirable to perform stirring during the reaction. Furthermore, by increasing the distance between the reaction unit and the detection unit, an increase in background at the detection unit is suppressed due to diffusion of a reagent such as a substrate from the reaction unit.
  • a first flow path having a sample introduction port for introducing a sample, a reaction part in which an antibody connected to the first flow path and capturing the sample is disposed, and a reaction And a second flow path in which a potential measurement electrode for detecting a reaction product in the reaction part is arranged, and the potential measurement electrode is provided on the downstream side of the reaction part and away from the reaction part.
  • the bottom area of the part is an electrochemical immunosensor cartridge larger than the area of the potential measurement electrode.
  • the bottom area of the reaction part is typically 100 times or more the area of the potential measurement electrode.
  • the reaction part and the electrode for potential measurement are typically separated by 6.5 mm or more.
  • the reaction part preferably contains a stirring bead and / or a capture antibody-immobilized bead.
  • the biological sample including the measurement target introduced into the sample introduction port is captured by the capture antibody in which the measurement target is fixed in the reaction unit.
  • an enzyme-labeled detection antibody is added to the reaction portion and bound to the measurement target captured by the capture antibody, thereby forming a complex of capture antibody-measurement target-enzyme-labeled antibody.
  • An enzyme substrate is added and a substrate reaction product is generated by the complex enzyme. Each of the above reactions is uniformly performed in the reaction part by vibration.
  • the substrate reaction product is sent to the detection unit, and the amount of the substrate reaction product produced is measured as a potential difference from the reference electrode by the potential measurement electrode.
  • the POCT is obtained by uniformly reacting a measurement object with a sufficient amount of a reagent such as an antibody and a substrate in a reaction unit independent of the detection unit, and measuring the measurement object amount by a potential measurement method. It is possible to improve the sensitivity and measurement accuracy of a small clinical laboratory device. Specifically, since the analysis by the end point method can be performed by using the potential measurement method, it is not necessary to generate a redox substance in the vicinity of the electrode. Therefore, it is possible to provide a reaction part in which an amount of antibody corresponding to the concentration of the measurement object is fixed upstream of the detection part, and a sufficient measurement value can be obtained even if the concentration of the measurement object is low. Measurement is possible.
  • the electrode it is not necessary to manufacture the electrode by strictly controlling the size of the electrode by using the potential measurement method, and the manufacturing cost can be reduced. Furthermore, regarding the decrease in measurement accuracy due to the heterogeneity of the reaction which becomes a problem in a large reaction part, variation in measured values can be suppressed by performing antigen-antibody reaction uniformly by stirring in the reaction part. From the above, the sensitivity and measurement accuracy of the small clinical testing apparatus for POCT are improved.
  • Schematic shows an example of the measuring apparatus which has the mechanism for stirring the cartridge for electrochemical immunosensors, and a cartridge.
  • the schematic diagram which shows the example of the antibody fixing method in the reaction part of the cartridge for electrochemical immunosensors.
  • the schematic diagram which shows an example of the method of stirring the cartridge for electrochemical immunosensors.
  • the flowchart which shows an example of a measurement procedure.
  • the schematic diagram which shows an example of the cartridge for electrochemical immunosensors and a measuring apparatus which stir the reaction part using air bubbles instead of the bead for stirring. The figure which showed that measurement reproducibility improved by stirring of a reaction part.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an example of a cartridge for an electrochemical immunosensor having a detection unit downstream of the reaction unit.
  • 1A is a schematic perspective view showing the overall structure of the cartridge
  • FIG. 1B is a schematic plan view
  • FIGS. 1C to 1F are schematic cross-sectional views at positions CC, DD, EE, and FF in FIG. 1B, respectively. It is.
  • the cartridge 201 includes a substrate 213 and a flow path portion 214.
  • the substrate 213 has a measurement electrode 208 and a reference electrode 209.
  • the flow path 214 has a first flow path 202, a reaction section 205 connected to the downstream side of the first flow path, and a second flow path 207 connected to the downstream side of the reaction section.
  • a filter 215 separates between the one flow path 202 and the reaction section 205 and between the reaction section 205 and the second flow path 207.
  • the first channel 202 has a sample introduction port 203 and a reagent supply port 204, the reaction unit 205 has a stirring bead 206, and the second channel 207 has a waste liquid discharge port 210.
  • the filter 215 is for confining the stirring beads 206 in the reaction unit 205 so as not to flow into the first flow path 202 or the second flow path 207.
  • the measurement electrode 208 and the reference electrode 209 provided in the second flow path are connected to the terminals 211 and 212, respectively.
  • a pair of depressions are provided on both sides of the cartridge 201 as a handle 216 for facilitating gripping with a finger.
  • each positional relationship is described by following the flow path from the sample introduction port 203.
  • the waste liquid outlet 210 is provided in the flow path in this order.
  • the approximate size of the cartridge 201 is 50 mm ⁇ 20 mm
  • the first channel 202 and the second channel 207 are 1 mm wide ⁇ 0.25 mm high.
  • the approximate size of the reaction unit 205 is 10 mm wide ⁇ 10 mm long ⁇ 0.25 mm high
  • the approximate size of the measurement electrode 208 and the reference electrode 209 is 1 mm wide ⁇ 1 mm long.
  • the reaction unit 205 and the measurement electrode 208 are not close to each other and are separated from each other.
  • the redox material is potassium ferricyanide
  • its diffusion coefficient D is 0.65 ⁇ 10 ⁇ 9 m 2 / s (Electrochemical Methods, Fundamentals and Applications, 2nd ed, 2000, JOHN WILEY & SONS, INC.).
  • the diffusion coefficient D of ascorbic acid of the substrate reaction product is 5.8 ⁇ 10 ⁇ 10 m 2 / s.
  • the aminophenol of the substrate reaction product is aminophenol.
  • the diffusion coefficient D is 6.8 ⁇ 10 ⁇ 10 m 2 / s (J. Phys. Chem., 1990, 94, 1003-1005).
  • the diffusion coefficient D of the redox substance contained in the substrate solution and the low molecular weight compound as the substrate is approximately 5.0 ⁇ 10 ⁇ 10 m 2 / s, and 0.5 mm if the reaction time is 5 minutes, If it is 30 minutes, it will diffuse 1.3 mm. Therefore, when the concentration of the measurement target is low (concentration range; 0.1 to 10 ng / ml) as in the case of a heart disease marker, the substrate solution is reacted for about 30 minutes to sensitize, so the reaction unit 205 and the measurement electrode 208 If the distance between them is 6.5 mm, which corresponds to 5 times the distance L at which the substrate diffuses in 30 minutes, most of the measurement object can be measured without increasing the background signal.
  • the sample inlet 203 may include a filter.
  • the filter is made of aramid fiber, glass fiber, cellulose fiber, nylon fiber, vinylon fiber, polyester fiber, polyolefin fiber, or rayon fiber. Filter paper, non-woven fabric and porous fiber can be used. Alternatively, one or more pores can be used instead.
  • Filter paper, non-woven fabric and porous fiber can be used. Alternatively, one or more pores can be used instead.
  • activated carbon or hydrophobic resin with these materials, lipids or the like in the specimen that can be a factor of inhibition of the immune reaction system can be removed or reduced.
  • the inhibition of the immune reaction system can be removed or reduced by mixing a resin in which an antibody against a molecule other than the measurement target, which is present in a large amount in a biological sample such as serum albumin or globulin, is mixed.
  • these materials are desirably materials having low reactivity with respect to the measurement object in order to prevent an extreme decrease in the abundance of the measurement object.
  • a semiconductor substrate such as silicon, a circuit substrate such as glass epoxy, or a film substrate such as polyethylene terephthalate (PET), polypropylene (PP), polycarbonate (PC), or polyimide (PI) may be used. It can.
  • the flow path 214 is formed by laminating films such as polyethylene (PE), polyethylene terephthalate (PET), polypropylene (PP), polycarbonate (PC), polyimide (PI), and ethylene vinyl acetate copolymer (EVA).
  • a thermoplastic resin, an epoxy resin, or a silicone resin such as polydimethylsiloxane (PDMS) can be used.
  • the filter 215 can be made of aramid fiber, glass fiber, cellulose fiber, nylon fiber, vinylon fiber, polyester fiber, polyolefin fiber, rayon fiber filter paper, nonwoven fabric, or porous fiber.
  • the measurement electrode 208 is made of a noble metal such as gold or platinum, a carbon material such as graphite or carbon black, or a mixture of a carbon material and a noble metal, as a material capable of electrochemical measurement. Unlike current measurement, where the electrode area affects the measurement current, it is not necessary to precisely adjust the size of the electrode in potential measurement.
  • the reference electrode 209 may be an exposed silver-silver chloride electrode as long as it exhibits a constant potential, and may be an internal liquid-type silver chloride between the waste liquid discharge port on the apparatus side and the waste liquid reservoir, not in the cartridge. A silver reference electrode or an ion selective electrode may be provided.
  • FIG. 2 is a schematic view showing an example of the electrochemical immunosensor cartridge of the present invention and a measuring apparatus having a mechanism for stirring the cartridge.
  • the cartridge 201 is set on the shaker 106 of the measuring apparatus 101, and vibration is applied to the cartridge 201 during the antibody antigen reaction and the reaction with the substrate.
  • the reagent supply port 204 of the cartridge 201 is fluidly connected to the measuring apparatus 101, the cleaning solution is supplied from the container 111 by the pump 107, the antibody reagent solution is supplied from the container 112 by the pump 108, and the substrate solution is supplied from the container 113 by the pump 109. Is supplied.
  • the waste liquid discharge port 210 is fluidly connected to the measuring apparatus 101, and the waste liquid in the cartridge is discharged to the waste liquid reservoir 114 by the pump 110.
  • the waste liquid reservoir 114 has an air hole so that air is pushed out as much as the waste liquid is accumulated.
  • the terminals 211 and 212 of the cartridge 201 are electrically connected to the voltmeter 115 of the measuring apparatus 101.
  • the pumps 107 to 110 are controlled by the control unit 102, and the voltmeter 115 is controlled and measured by the measurement unit 103.
  • the measuring apparatus 101 includes a display unit 104 for displaying measurement results and messages, and an input unit 105 for a user to input an operation.
  • the pumps 107 to 110 may be peristaltic pumps, syringe pumps, or diaphragm pumps.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a method for producing a cartridge for an electrochemical immunosensor.
  • 3A-C show the parts of the cartridge to be stacked.
  • holes for a sample introduction port 203, a reagent supply port 204, and a waste liquid discharge port 210 are opened in a film 303 such as PET.
  • a hole such as a first flow path 202, a reaction section 205, and a second flow path 207 is formed in a film 302 such as PET, and the reaction between the first flow path 202 and the reaction section 205 is performed.
  • a polyester porous fiber is pasted between the portion 205 and the second flow path 207 to form a filter 215.
  • FIG. 3A-C show the parts of the cartridge to be stacked.
  • FIG. 3A holes for a sample introduction port 203, a reagent supply port 204, and a waste liquid discharge port 210 are opened in a film 303 such as PET.
  • the measurement electrode 208 and the reference electrode 209 are printed on a film 301 such as PET using a carbon paste or a silver-silver chloride paste.
  • the wirings connecting the terminals 211 and 212 and the measurement electrode 208 and the terminal 211 and the wiring connecting the reference electrode 209 and the terminal 212 are formed by printing.
  • these three layers 301, 302, and 303 are adhered by welding or an adhesive to form a cartridge.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of an antibody immobilization method in the reaction part of the electrochemical immunosensor cartridge.
  • a capture antibody 401 for recognizing and binding a measurement object may be fixed to the wall surface of the reaction unit 205, and the stirring beads 206 may be in the reaction unit 205.
  • the reaction unit 205 may contain beads 402 with the capture antibody 401 immobilized, and the capture antibody immobilized beads 402 may also serve as the stirring beads 206.
  • the capture antibody fixing beads 402 and the stirring beads 206 may be separately provided in the reaction unit 205, and the capture antibody fixing beads 402 and the stirring beads 206 are different in size and specific gravity. May be.
  • the stirring bead 206 may be a polymer such as polystyrene, agarose, or polyurethane, a magnetic bead containing ferrite at the center of the polymer, or a gold particle.
  • the capture antibody-immobilized beads 402 may be a polymer such as polystyrene, agarose, or polyurethane, a magnetic bead containing ferrite at the center of the polymer, or a gold particle.
  • the height and width of the reaction unit 205 are larger than the height and width of the second channel 207, and the diameters of the stirring beads 206 and the capture antibody-immobilized beads 402 are the first channel 202 and the second channel.
  • the capture antibody may be immobilized on the wall of the reaction unit 205 or the capture antibody-immobilized beads by physical adsorption or chemical binding. First, avidin is immobilized, and then the biotinylated antibody is bound to avidin-biotin. Alternatively, the antibody may be immobilized via avidin after the biotin-modified molecule is immobilized.
  • the bottom area of the reaction unit 205 is 100 times or more larger than the area of the measurement electrode 208.
  • the measurement sensitivity can be improved by about 10 times.
  • FIG. 4A when the capture antibody 401 is immobilized on the wall surface of the reaction unit 205 and when the capture antibody-immobilized beads 402 are contained in the reaction unit 205 as shown in FIG.
  • the capture probability of the measurement object is compared with the case where the capture antibody 401 is fixed only to the channel wall surface above the measurement electrode 208.
  • the approximate dimension of the measurement electrode 208 is 1 mm wide ⁇ 1 mm long, and the approximate dimension of the reaction part 205 is 10 mm wide ⁇ long so that the bottom area is 100 times larger than the area of the measurement electrode 208.
  • the approximate dimensions of the flow path are 1 mm width x 0.25 mm height.
  • the capture antibody-immobilized beads 402 are contained in the reaction unit 205, it is assumed that 200,000 spherical capture antibody-immobilization beads 402 having a diameter of 40 nm are contained, and the filling rate of the reaction unit 205 is 27%.
  • the fixation density of the capture antibody to the solid phase is 4.2 ng / mm 2 .
  • the concentration of the complex in the antigen-antibody reaction can be expressed by Formula 4 (Hiroo Katakura “Bioprocess System: Fundamentals and Applications for Efficient Utilization”, CMC Publishing, 2009, 79-88).
  • Formula 4 Hiroo Katakura “Bioprocess System: Fundamentals and Applications for Efficient Utilization”, CMC Publishing, 2009, 79-88).
  • the antibody concentration Ab can be expressed by Formula 5 using the antibody fixing density D, the reaction field volume V, and the antibody fixing area S in the reaction field.
  • D Antibody concentration
  • V Reaction field capacity
  • S Antibody immobilization area
  • the proportion of the measurement target contained in the sample captured by the capture antibody is 31 minutes when the capture antibody is fixed only on the flow channel wall above the measurement electrode 208 of the detection unit as in the past.
  • the capture antibody 401 is immobilized on the wall surface of the reaction unit 205 as shown in FIG. 4A, the ratio is 1/15, and as shown in FIG. If it is, it will be 1/3.
  • the amount of sample added to the reaction unit 205 is 25 ⁇ l even if the area where the capture antibody 401 can be immobilized is not significantly changed. As described above, this corresponds to 100 times the sample amount of 0.25 ⁇ l when the capture antibody is immobilized only on the flow channel wall surface above the measurement electrode 208 of the detection unit, and this is effective in improving measurement sensitivity.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing an example of a method for stirring the electrochemical immunosensor cartridge.
  • the cartridge may be agitated by the shaker 106 of the measuring apparatus 101. If the shaker is not provided in the measuring apparatus 101, the cartridge 201 is provided with a handle 216 and shaken by hand. Also good.
  • the direction of vibration is desirably a direction perpendicular to the flow direction of the second flow path as indicated by an arrow in FIG. 5 so that the substrate liquid does not flow from the reaction unit 205 to the measurement electrode 208.
  • magnetic beads are used for the stirring beads 206
  • magnetic field generators are provided on the upper and lower sides of the cartridge of the measuring apparatus 101 or on both sides of the cartridge, and the magnetic beads are alternately generated during the reaction to thereby generate the stirring beads.
  • the inside of the reaction unit 205 may be stirred.
  • FIG. 6 is a flowchart showing an example of a measurement procedure using the cartridge shown in FIG. 1 and the measurement apparatus shown in FIG.
  • a sample is added to the sample introduction port 203 provided on the flow path (S601).
  • the specimen is introduced into the first flow path 202 by capillary action.
  • the specimen may be a body fluid collected from a biological sample itself or a pretreatment such as centrifugation, filtration, or dilution as necessary.
  • the cartridge 201 is set in the measuring device 101.
  • the sample is transported to the reaction unit 205 using the pump 110 (S602).
  • the stirring beads 206 and / or the capture antibody-immobilized beads 402 move in the reaction unit 205, and the solution in the reaction unit 205 is agitated.
  • the measurement object inside is captured by the capture antibody.
  • the specimen is discarded from the waste liquid discharge port 210 to the waste liquid reservoir 114 using the pump 110 (S604).
  • the first flow path 202, the reaction section 205, and the second flow path 207 are washed with the cleaning liquid introduced from the reagent supply port 204 (S605), and the measurement object not captured by the capture antibody is removed.
  • the cleaning liquid used for cleaning is also discarded in the waste liquid reservoir 114.
  • a buffer solution such as Tris Buffered Saline (hereinafter referred to as TBS) or Phosphate Buffered Saline (hereinafter referred to as PBS) is used as the washing solution.
  • TBS Tris Buffered Saline
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • the antibody reagent solution is introduced into the reagent supply port 204 using the pump 108 (S606).
  • the antibody reagent solution a solution containing a detection antibody that recognizes and binds to the measurement target and labeled with alkaline phosphatase (labeled detection antibody) is used.
  • the labeled detection antibody in the antibody reagent solution binds to the measurement target captured by the capture antibody.
  • a cleaning solution is introduced from the reagent supply port 204, and the first channel 202, the reaction unit 205, and the second channel 207 are washed (S608), thereby detecting unbound label. Remove antibody.
  • the antibody reagent solution and the cleaning solution are discarded in the waste liquid reservoir 114.
  • the substrate solution is introduced into the reagent supply port 204 using the pump 109 (S609), and shaken for a certain time (S610).
  • a solution containing ascorbic acid phosphate, which is a substrate of alkaline phosphatase, and potassium ferricyanide, which is a mediator, is used as the substrate solution.
  • the ascorbic acid phosphate in the substrate solution is hydrolyzed by the alkaline phosphatase of the complex of the capturing antibody-measurement object-labeled detection antibody present in the capturing antibody of the reaction unit 205, and the generated ascorbic acid reacts with potassium ferricyanide. Potassium ferrocyanide is generated, and the potential of the measuring electrode 208 changes.
  • the amount of the captured measurement object is obtained.
  • a calibration curve is created to represent the relationship between the amount of the measurement object and the measurement potential using a sample with a known measurement object in a separately prepared cartridge. You may calculate the value of the sample whose quantity of an object is unknown.
  • the measurement object is a glycated protein such as HbA1c or GA in the diabetes test, a virus antigen such as hepatitis virus, influenza virus, Chlamydia pneumoniae or an antibody thereto in the infection test, and cTnI, cTnT, CK in the heart disease test.
  • -MB and NT-proBMP are proteins released into the blood during myocardial infarction and heart failure.
  • the viral antigen is used instead of the capture antibody 401 for the measurement target immobilized on the reaction unit 205.
  • the labeled detection antibody in the antibody reagent solution is an antibody corresponding to the type of antibody in the blood against the virus antigen. For example, if the antibody in the blood against the virus antigen is IgA, a labeled anti-IgA antibody is used.
  • the combination of antibody modifying enzyme for detection, its substrate and mediator is not limited to the combination of hydrolyzing enzyme such as alkaline phosphatase, ascorbic acid phosphate, potassium ferricyanide and mediator, mediator, but redox such as glucose oxidase and glucose, potassium ferricyanide
  • hydrolyzing enzyme such as alkaline phosphatase, ascorbic acid phosphate, potassium ferricyanide and mediator
  • mediator but redox such as glucose oxidase and glucose, potassium ferricyanide
  • concentration of the mediator is preferably lower than the substrate concentration, and the measurement sensitivity can be adjusted by the concentration ratio of the substrate to the mediator.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing an example of a cartridge and a measurement device in the case where stirring is performed using bubbles in place of stirring beads in the reaction part of the electrochemical immunosensor cartridge.
  • FIG. 7A is a schematic perspective view showing the overall structure of the cartridge 201. Since the reaction unit 205 does not include the stirring beads and it is not necessary to prevent the stirring beads from flowing out from the reaction unit 205, the reaction unit 205 and the second channel are provided between the first channel 202 and the reaction unit 205. There is no need to provide a filter between 207. Therefore, the cartridge is manufactured by using a film such as PET with holes in the sample introduction port 203, the reagent supply port 204 and the waste liquid discharge port 210, the first channel 202, the reaction unit 205, and the second channel 207.
  • a film such as PET with holes in the sample introduction port 203, the reagent supply port 204 and the waste liquid discharge port 210, the first channel 202, the reaction unit 205, and the second channel 207.
  • a film such as PET having a hole in a shape and a PET film on which the measurement electrode 208 and the reference electrode 209 are printed using a carbon paste or a silver-silver chloride paste are simply adhered by welding or an adhesive. Good. Therefore, compared with the case where the stirring beads shown in FIGS. 1 and 3 are used, when bubbles are used, the cartridge manufacturing process is simplified, and the manufacturing cost can be reduced.
  • FIG. 7B is a schematic diagram showing an example of a measuring apparatus when bubbles are introduced into the cartridge.
  • the reagent supply port 204 of the cartridge 201 is fluidly connected to the measuring apparatus 101, and a bubble generating device 701 is provided between the pumps 107, 108, 109 for supplying each reagent solution and the reagent supply port 204.
  • FIG. 7C is a schematic diagram showing details of the bubble generation device 701. When the three-way valve is in the direction shown in the left diagram of FIG. 7C, each reagent solution is supplied to the reagent supply port 204. The three-way valve is switched to the direction shown in the right diagram of FIG.
  • the reagent supply port 204 of the cartridge 201 is connected to the outside via the air hole 702, and the pump 110 is aspirated for a short time. Bubbles are introduced by returning. Air bubbles are introduced in each step of adding the specimen (S601), adding the cleaning solution (S605, S608), and adding the antibody reagent solution (S606) in FIG. After adding the sample and each reagent solution together with air bubbles to the reaction unit 205, it is shaken by the shaker 106 of the measuring apparatus 101 or shaken by hand using the handle 216 of the cartridge 201, so that there is no stirring bead. Even in this case, the inside of the reaction unit 205 can be agitated by the bubbles to allow a uniform reaction.
  • FIG. 8 is a diagram showing the measurement of the HbA1c / hemoglobin ratio in the sample as an example that the reproducibility of the concentration measurement of the measurement target contained in the sample is improved by the stirring of the reaction unit 205.
  • a sample derived from human blood having a known HbA1c / hemoglobin ratio and TBS containing a cationic surfactant were mixed to obtain a sample solution.
  • the concentration of human hemoglobin in the sample solution is equal to or higher than the concentration at which human hemoglobin can bind to all of the anti-hemoglobin antibodies immobilized on the reaction unit 205 wall surface.
  • a sample solution was introduced from the specimen introduction port 203, and in the reaction unit 205, human hemoglobin and HbA1c in the sample solution were reacted with the anti-hemoglobin antibody for a certain period of time.
  • Tween20-containing TBS 0.1% Tween20-containing TBS (hereinafter referred to as TBST) was added from the reagent supply port 204 to wash away human hemoglobin and HbA1c not captured by the anti-hemoglobin antibody.
  • Monoclonal anti-HbA1c antibody (detection antibody) modified with alkaline phosphatase was added from the reagent supply port 204, reacted with HbA1c captured by the anti-human hemoglobin antibody, and then washed with TBST.
  • the concentration of the detection antibody is about one-tenth of that of the capture antibody.
  • human hemoglobin is captured by all of the anti-human hemoglobin antibodies, which are capture antibodies, and thus is a detection antibody.
  • the concentration of the anti-HbA1c antibody is preferably higher than the concentration of the immobilized anti-human hemoglobin antibody depending on the antibody performance.
  • the concentration of potassium ferrocyanide produced using Equation 2 was calculated from the measured potential value.
  • FIG. 8A shows the relationship between the HbA1c / hemoglobin ratio of the human blood-derived sample and the potassium ferrocyanide concentration when the sample was not shaken when the substrate solution was reacted, and FIG. 8B was shaken when the substrate solution was reacted.
  • the relationship between the HbA1c / hemoglobin ratio and the produced potassium ferrocyanide concentration of the human blood-derived sample is shown.
  • the measurement reproducibility without shaking is CV 8% when the HbA1c / hemoglobin ratio is 5.61%, CV 14% when it is 7.71%, and CV 11% when it is 10.55%.
  • the measurement reproducibility when shaken is CV 3% when the HbA1c / hemoglobin ratio is 5.61%, CV 12% when it is 7.71%, and CV 5% when it is 10.55%. From the above, it can be seen that stirring the reaction unit 205 during the reaction improves the measurement reproducibility and improves the measurement accuracy.
  • this invention is not limited to the above-mentioned Example, Various modifications are included.
  • the above-described embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.

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Abstract

　低コストで製造することが求められるＰＯＣＴ向けの小型臨床検査装置において、高い感度と高い測定精度を両立させるために、電位計測法による検出と、検出部の上流に検出部よりも大きな反応部を配置して攪拌しながら反応を行う方式を組み合わせる。その際、大きな反応部では反応が不均一になり測定精度の低下を招くので、反応時に攪拌を行う。さらに、反応部と検出部を一定距離離すことにより、反応部からの基質等の試薬の拡散により検出部でのバックグランドの増加を抑制する。

Description

電気化学免疫センサ用カートリッジ及びそれを用いた測定装置
　医師や獣医が病気を発見したり、病気の進行状態を観察したりする上で、人や動物の血液や尿などの生体試料を用いた臨床検査は重要な診断材料となる。従来、臨床検査は検査室や検査センタにおいて、専門の技師が大型の自動分析装置を用いて行うのが一般的であった。しかし近年、患者のすぐそばで迅速・簡便に検査を行うポイント・オブ・ケア・テスティング（ＰＯＣＴ）の必要性が高まり、小型の臨床検査装置が開発されている。
　現在、ＰＯＣＴの中で大きな割合を占めている項目は、血糖値（グルコース）であり、他には感染症や心疾患のマーカがある。近年では、糖尿病検査において、血糖値だけでなく、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）やグリコアルブミン（ＧＡ）などの糖化タンパク質も測定される。これは、従来糖尿病の診断には血糖値の測定が用いられてきたものの、血糖値は食事や飲酒により変動するという課題があったため、より長期（数週間～数ヶ月）の血糖値を反映した安定した指標である糖化タンパク質の量を測定することで、糖尿病の診断及び治療のために行う血糖コントロールの成否を判定しやすくなるからである。感染症検査では、肝炎ウイルスやインフルエンザウイルス、クラミジアニューモニエなどウイルスの抗原又はそれに対する抗体が測定される。心疾患検査では、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）や心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ－ＭＢ）、Ｎ末端プロＢＭＰ（ＮＴ－ｐｒｏＢＭＰ）といった、心筋梗塞や心不全の時に血中に放出されるタンパク質が測定される。このように、近年では生化学検査で測定できる項目に加え、免疫検査が必要となる項目も測定されるようになっている。
　ＰＯＣＴ向けの小型臨床検査装置には、大型自動分析装置でよく用いられる吸光光度法に加え、電気化学計測法が用いられる。これは、吸光光度法に比べて電気化学計測法の方が装置の小型化が容易だからである。また、吸光光度法では血液の色影響を受けやすいが、電気化学計測法ではその影響がない。電気化学計測法には電流計測法と電位計測法の２種類があり、主に電流計測法のＰＯＣＴ向けの小型臨床検査装置が市場に普及している。電流計測法は、測定対象物を含む試料に試薬を反応させ、生成した酸化還元物質を電極により電流値として測定し、測定対象物の濃度を求める方法である（特開２００９－１５０９０２号公報）。電流値はコットレルの式に従う（式１）。電流値は酸化還元物質の生成速度に依存するため、レート法が用いられる。
［式１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　　　  ｎ：電極反応で授受される電子数
　　　　Ｆ：ファラデー定数
　　　　Ａ：電極面積
　　　　Ｃ0：酸化還元物質のバルク濃度
　　　　Ｄ0：酸化還元物質の拡散係数
　　　　ｔ：時間
　これに対し、電位計測法は測定対象物を含む試料に試薬を反応させ、生成した酸化還元物質を測定電極と参照電極により電位差として測定し、測定対象物の濃度を求める方法である（WO 2010/052867 A1）。電位値はネルンストの式に従う（式２）。電位計測法では、電位値が生成した酸化還元物質の総量に依存するため、レート法とエンドポイント法の両方が用いられる。
［式２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　　　　Ｅ0：標準電極電位
　　　　Ｒ：気体定数
　　　　Ｔ：絶対温度
　　　　ｎ：酸化還元物質の酸化型と還元型の電荷の差
　　　　Ｆ：ファラデー定数
　　　　ＣOx：酸化還元物質の酸化型の濃度
　　　　ＣRed：酸化還元物質の還元型の濃度
特開２００９－１５０９０２号公報 WO 2010/052867 A1
　高い感度と高い測定精度を兼ね備えた大型自動分析装置に対して、ＰＯＣＴ向け小型臨床検査装置は、高感度を必要としないグルコースのセンサのように高い測定精度を実現しているセンサはあるものの、高感度と高い測定精度を両立する装置はまだない。高い感度と高い測定精度が両立しない原因として以下の２点が考えられる。
　まず、電流計測法では電流値が電極面積に依存するため、電極面積が一定になるように製造する必要があるが、ＰＯＣＴに見合ったコストで電極付きの免疫検査用カートリッジを製造するのは難しい点である。次に、電流計測法では電極近傍で酸化還元物質が生成する必要があるため、測定対象物とそれを捕捉・検出するための抗体が反応する場の大きさが限られてしまい、使用できる抗体の量が少なくなり、高感度な測定が難しい点である。
　電位計測法では、電位が電極面積に依存しないため電極面積を厳密に一定にする必要がなく、電極の製造コストは低くできるが、高感度な測定に関しては、測定対象物とそれを捕捉・検出するための抗体が反応する場の大きさが限られてしまい、使用できる抗体の量が少なくなり、高感度な測定が難しいという同じ問題が残る。
　したがって、本発明の課題は、低コストで製造することが求められるＰＯＣＴ向けの小型臨床検査装置において、高い感度と高い測定精度を両立させることにある。
　上記の課題を解決するために、本発明では電極面積作製精度を必要とせず低コストの電極を使用できる電位計測法による検出と、検出部の上流に検出部よりも大きな反応部を設けて反応を行う方式を組み合わせる。その際、従来よりも大きな反応部では反応が不均一になり、測定精度の低下を招くので、望ましくは反応時に攪拌を行う。さらに、反応部と検出部を一定距離離すことにより、反応部からの基質等の試薬の拡散により検出部でのバックグランドの増加を抑制する。
　本発明の代表的な形態としては、検体を導入するための検体導入口を有する第一の流路と、第一の流路に接続され検体を捕捉する抗体が配置された反応部と、反応部に接続され反応部での反応産物を検出する電位測定用電極が配置された第二の流路とを備え、電位測定用電極は反応部の下流側に反応部から離して設けられ、反応部の底面積は電位測定用電極の面積より大きい電気化学免疫センサ用カートリッジである。反応部の底面積は典型的には、電位測定用電極の面積の１００倍以上である。また、反応部と電位測定用電極とは典型的には、６．５ｍｍ以上離れている。また、反応部は、好ましくは攪拌用ビーズ及び／又は捕捉抗体固定ビーズを含んでいる。
　検体導入口に導入された測定対象物を含む生体試料は、反応部において測定対象物が反応部内に固定された捕捉抗体により捕捉される。次に、反応部に酵素標識した検出抗体を添加し捕捉抗体により捕捉された測定対象物に結合させ、捕捉抗体―測定対象物―酵素標識抗体という複合体が作られる。酵素の基質を添加し、複合体の酵素により基質反応産物を生成させる。以上の各反応は、振動により反応部内で均一に行われる。この基質反応産物を検出部に送液し、基質反応産物の生成量を電位測定電極により参照電極との電位差として測定する。
　本発明の構成では、検出部と独立した反応部において測定対象物と十分量の抗体及び基質などの試薬とを攪拌により均一に反応させ、電位計測法により測定対象物量を測定することで、ＰＯＣＴ向け小型臨床検査装置の感度及び測定精度を向上させることができる。詳しくは、まず、電位計測法を用いることによりエンドポイント法による解析が可能となるため、電極近傍で酸化還元物質が生成する必要がなくなる。そのため、検出部の上流に測定対象物の濃度に応じた量の抗体を固定した反応部を設けることができ、測定対象物の濃度が低くても十分な測定値を得ることができ、高感度測定が可能となる。また、電位計測法を用いることにより電極の大きさを厳密に制御して製造する必要がなく、製造コストを低減できる。さらに、大きな反応部で問題となる反応の不均一性による測定精度の低下に関しては、反応部において攪拌により均一に抗原抗体反応を行うことで、測定値のばらつきが抑制できる。以上のことから、ＰＯＣＴ向け小型臨床検査装置の感度及び測定精度が向上する。
　上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
反応部の下流に検出部をもつ電気化学免疫センサ用カートリッジ一例を示す模式図。 電気化学免疫センサ用カートリッジとカートリッジを攪拌する機構をもつ測定装置の一例を示す概略図。 電気化学免疫センサ用カートリッジの作製方法の一例を示す図。 電気化学免疫センサ用カートリッジの反応部における抗体固定方法の例を示す模式図。 電気化学免疫センサ用カートリッジを攪拌する方法の一例を示す模式図。 測定手順の一例を示すフローチャート。 攪拌用ビーズの代わりに気泡を用いて反応部を攪拌する電気化学免疫センサ用カートリッジ及び測定装置の一例を示す模式図。 反応部の攪拌により測定再現性が向上することを示した図。
　以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
　図１は、反応部の下流に検出部をもつ電気化学免疫センサ用カートリッジの一例を示す模式図である。図１Ａはカートリッジの全体構造を示す斜視模式図、図１Ｂは平面模式図、図１Ｃ～１Ｆはそれぞれ図１ＢのＣ－Ｃ，Ｄ－Ｄ，Ｅ－Ｅ，Ｆ－Ｆの位置における断面模式図である。
　カートリッジ２０１は基板２１３及び流路部２１４から構成される。基板２１３は、測定電極２０８及び参照電極２０９を有する。流路部２１４は、第一の流路２０２、第一の流路の下流側に接続された反応部２０５、及び反応部の下流側に接続された第二の流路２０７を有し、第一の流路２０２と反応部２０５の間、反応部２０５と第二の流路２０７の間はフィルタ２１５で区切られている。第一の流路２０２は検体導入口２０３及び試薬供給口２０４を有し、反応部２０５は攪拌用ビーズ２０６を有し、第二の流路２０７は廃液排出口２１０を有する。フィルタ２１５は、攪拌用ビーズ２０６を反応部２０５内に閉じ込め、第一の流路２０２や第二の流路２０７に流れ込まないようにするためのものである。第二の流路内に設けられた測定電極２０８及び参照電極２０９は、端子２１１，２１２にそれぞれ接続されている。また、カートリッジ２０１には指を掛けて掴みやすくするための持ち手２１６として、一対の窪みが側面両側に設けられている。
　検体導入口２０３から流路をたどってそれぞれの位置関係を説明すると、検体導入口２０３から下流側に向かって試薬供給口２０４、攪拌用ビーズ２０６を有する反応部２０５、測定電極２０８、参照電極２０９、廃液排出口２１０の順に流路内部に設けられている。一例として、カートリッジ２０１の概寸は５０ｍｍ×２０ｍｍで、第一の流路２０２と第二の流路２０７は幅１ｍｍ×高さ０．２５ｍｍとした。また、一例として、反応部２０５の概寸は幅１０ｍｍ×長さ１０ｍｍ×高さ０．２５ｍｍであり、測定電極２０８及び参照電極２０９の概寸は幅１ｍｍ×長さ１ｍｍである。
　反応部２０５と測定電極２０８は近接しておらず、距離が離れている。物質の拡散距離Ｌは式３で表わされ、通常、拡散距離Ｌの３倍以上に相当する距離が離れていれば、反応部２０５にある基質液に含まれる基質や酸化還元物質の拡散の影響によるバックグラウンドの上昇は抑えられる。
［式３］
　　　Ｌ＝（２Ｄｔ）1/2
　　　　Ｌ：拡散距離
　　　　Ｄ：拡散係数
　　　　ｔ：拡散時間
　酸化還元物質がフェリシアン化カリウムの場合、その拡散係数Ｄは０．６５×１０-9ｍ2／ｓである（Electrochemical Methods, Fundamentals and Applications, 2nd ed, 2000, JOHN WILEY & SONS, INC.）。基質がアスコルビン酸リン酸の場合、基質反応産物のアスコルビン酸の拡散係数Ｄは５．８×１０-10ｍ2／ｓ、また、基質がアミノフェノールリン酸の場合、基質反応産物のアミノフェノールの拡散係数Ｄは６．８×１０-10ｍ2／ｓである（J. Phys. Chem., 1990, 94, 1003-1005）。すなわち、基質液に含まれる酸化還元物質や基質である低分子化合物の拡散係数Ｄは、おおよそ５．０×１０-10ｍ2／ｓであり、反応時間が５分間であれば０．５ｍｍ、３０分間であれば１．３ｍｍ拡散する。したがって、心疾患マーカのように測定対象物濃度が低い場合（濃度範囲；０．１～１０ｎｇ／ｍｌ）は基質液を３０分間程度反応させて増感するので、反応部２０５と測定電極２０８の間の距離を基質が３０分間で拡散する距離Ｌの５倍に相当する６．５ｍｍ離しておけば、大部分の測定対象物をバックグラウンドシグナルが高くなることなく測定できる。
　検体導入口２０３はフィルタを備えていてもよく、その場合フィルタには、アラミド繊維製、ガラス繊維製、セルロース繊維製、ナイロン繊維製、ビニロン繊維製、ポリエステル繊維製、ポリオレフィン繊維製、レーヨン繊維製のろ紙や不織布や多孔質繊維を用いることができる。他には、一つや複数の細孔を代わりに用いることもできる。これらの材料を用いることで、検体導入口２０３でカートリッジ流路の詰まりの原因となり得る検体中の物質を除去もしくは低減することができる。また、これらの材料に活性炭や疎水性樹脂を混合することで、免疫反応系の阻害の要因と成り得る検体中の脂質などを除去もしくは低減することができる。さらに、血清アルブミンやグロブリンといった生体試料中に存在量が多い、測定対象物以外の分子に対する抗体を固定した樹脂を混合することで、免疫反応系の阻害を除去もしくは低減することができる。このとき、これらの材料は測定対象物の存在量の極度な減少を防ぐため、測定対象物に対する反応性の低い材料であることが望ましい。
　基板２１３には、シリコンなどの半導体基板や、ガラスエポキシなどの回路用基板や、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリイミド（ＰＩ）などのフィルム状基板を用いることができる。流路部２１４には、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリイミド（ＰＩ）などのフィルムを積層したものや、エチレン酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡ）などの熱可塑性樹脂や、エポキシ樹脂や、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのシリコーン樹脂を用いることができる。フィルタ２１５には、アラミド繊維製、ガラス繊維製、セルロース繊維製、ナイロン繊維製、ビニロン繊維製、ポリエステル繊維製、ポリオレフィン繊維製、レーヨン繊維製のろ紙や不織布や多孔質繊維を用いることができる。
　測定電極２０８には電気化学計測が可能なものとして、金、白金などの貴金属、グラファイト、カーボンブラックなどのカーボン素材のもの、カーボン素材と貴金属を混合したものを用いる。電極面積が測定電流に影響を与える電流計測と違い、電位計測では電極の大きさを厳密に調整する必要はない。参照電極２０９は一定の電位を示すものであれば、むき出しの銀塩化銀電極であってもよいし、カートリッジ内でなく、装置側の廃液排出口と廃液溜めの間に内部液型の銀塩化銀参照電極やイオン選択電極を設けてもよい。
　図２は、本発明の電気化学免疫センサ用カートリッジとカートリッジを攪拌する機構をもつ測定装置の一例を示す概略図である。カートリッジ２０１は測定装置１０１の振盪機１０６にセットされ、抗体抗原反応及び基質との反応の際にカートリッジ２０１に振動が加えられる。カートリッジ２０１の試薬供給口２０４は測定装置１０１と流体的に接続され、ポンプ１０７によって容器１１１から洗浄液が供給され、ポンプ１０８によって容器１１２から抗体試薬液が供給され、ポンプ１０９によって容器１１３から基質液が供給される。試薬供給口は１から３箇所で、１つの試薬供給口に１つ又は複数種類の試薬が供給されるようにしてもよい。廃液排出口２１０は測定装置１０１と流体的に接続され、ポンプ１１０によって廃液溜め１１４にカートリッジ内の廃液が排出される。廃液溜め１１４は空気穴をもち、廃液が溜まる分空気が押し出されるようになっている。カートリッジ２０１の端子２１１，２１２は測定装置１０１の電圧計１１５に電気的に接続される。ポンプ１０７～１１０の制御は制御部１０２によって行われ、電圧計１１５の制御と計測は計測部１０３によって行われる。測定装置１０１は測定結果やメッセージを表示するための表示部１０４、ユーザが操作を入力する入力部１０５を有する。ポンプ１０７～１１０は、ペリスタポンプであっても、シリンジポンプであっても、ダイアフラムポンプであってもよい。
　図３は、電気化学免疫センサ用カートリッジの作製方法の一例を示す図である。図３Ａ～Ｃは積層するカートリッジのパーツを示している。図３Ａに示すように、ＰＥＴなどのフィルム３０３に検体導入口２０３、試薬供給口２０４及び廃液排出口２１０の穴を開ける。図３Ｂに示すようにＰＥＴなどのフィルム３０２に第一の流路２０２、反応部２０５、第二の流路２０７の形の穴を開け、第一の流路２０２と反応部２０５の間、反応部２０５と第二の流路２０７の間にポリエステルの多孔質繊維を貼り、フィルタ２１５とする。図３Ｃに示すように、ＰＥＴなどのフィルム３０１上にカーボンペーストや銀塩化銀ペーストを用いて測定電極２０８及び参照電極２０９を印刷する。同様にして、端子２１１，２１２及び測定電極２０８と端子２１１を接続する配線、及び参照電極２０９と端子２１２を接続する配線を印刷によって形成する。最後に、これら３層３０１，３０２，３０３を溶着又は接着剤により接着し、カートリッジとする。
　図４は、電気化学免疫センサ用カートリッジの反応部における抗体固定方法の例を示す模式図である。図４Ａに示すように、反応部２０５の壁面に測定対象物を認識・結合する捕捉抗体４０１が固定され、攪拌用ビーズ２０６が反応部２０５にあってもよい。図４Ｂのように、反応部２０５に捕捉抗体４０１が固定されたビーズ４０２が入っていて、捕捉抗体固定ビーズ４０２が攪拌用ビーズ２０６を兼ねていてもよい。また、図４Ｃのように、反応部２０５に捕捉抗体固定ビーズ４０２と攪拌用ビーズ２０６が別々にあってもよく、さらに捕捉抗体固定ビーズ４０２と攪拌用ビーズ２０６は大きさや比重が異なるものであってもよい。攪拌用ビーズ２０６は、ポリスチレンやアガロース、ポリウレタンのようなポリマーでもよいし、ポリマー中心にフェライトを含む磁性ビーズでもよいし、金粒子でもよい。捕捉抗体固定ビーズ４０２は、ポリスチレンやアガロース、ポリウレタンのようなポリマーでもよいし、ポリマー中心にフェライトを含む磁性ビーズでもよいし、金粒子でもよい。反応部２０５の高さ及び幅が第二の流路２０７の高さ及び幅よりも大きく、かつ、攪拌用ビーズ２０６及び捕捉抗体固定ビーズ４０２の直径が第一の流路２０２及び第二の流路２０７の高さ又は幅よりも大きい場合は、第一の流路２０２と反応部２０５の間、反応部２０５と第二の流路２０７の間をフィルタで区切らなくてもよい。反応部２０５の壁面又は捕捉抗体固定ビーズへの捕捉抗体の固定化方法は、物理吸着であっても、化学結合であってもよく、まずアビジンを固定化した後にビオチン化抗体をアビジン－ビオチン結合により固定化してもよく、ビオチン修飾した分子を固定化した後にアビジンを介して抗体を固定化してもよい。
　反応部２０５の底面積は測定電極２０８の面積に対して１００倍以上大きく、捕捉抗体固定ビーズ４０２を充填することで、測定感度を約１０倍向上させることができる。図４Ａのように反応部２０５の壁面に捕捉抗体４０１が固定されている場合と、図４Ｂのように反応部２０５に捕捉抗体固定ビーズ４０２が入っている場合について、従来のように検出部の測定電極２０８上部の流路壁面にのみ捕捉抗体４０１が固定されている場合との測定対象物の捕捉確率を比較する。計算の前提条件として、測定電極２０８の概寸は幅１ｍｍ×長さ１ｍｍであり、反応部２０５の概寸は底面積が測定電極２０８の面積に対して１００倍大きくなるように幅１０ｍｍ×長さ１０ｍｍ×高さ０．２５ｍｍとし、流路の概寸は幅１ｍｍ×高さ０．２５ｍｍとする。反応部２０５に捕捉抗体固定ビーズ４０２が入っている場合、直径４０ｎｍの球状の捕捉抗体固定ビーズ４０２が２０万個入って、反応部２０５の充填率は２７％であるとする。また、捕捉抗体の固相（捕捉抗体固定ビーズ４０２、又は反応部２０５及び流路壁面）への固定密度は４．２ｎｇ／ｍｍ2とする。抗原抗体反応における複合体の濃度は式４で表せる（片倉啓雄「バイオプロセスシステム：効率よく利用するための基礎と応用」シーエムシー出版、２００９、７９－８８）。
［式４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　　　　Ａｂ：抗体濃度
　　　　Ａｇ：抗原濃度
　　　　Ｘb：複合体濃度
　　　　ｋon：結合定数
　　　　ｋoff：解離定数
　　　　ｔb：結合時間
　　　　ｔw：洗浄時間
　例えば、Ａｂ＝１０-8（Ｍ）、ｋon＝１０5（Ｍ-1ｓ-1）、ｋoff＝１０-4（ｓ-1）、ｔb＝１０（ｍｉｎ）、ｔw＝１（ｍｉｎ）とすると、Ａｇ＝１０-6（Ｍ）の場合はＸb＝９．９３×１０-9（Ｍ）、Ａｇ＝１０-5（Ｍ）の場合はＸb＝９．９４×１０-9（Ｍ）となる。ここで抗体濃度Ａｂは、抗体の固定密度Ｄ、反応場の容量Ｖ、反応場における抗体固定面積Ｓを用いて式５で表せる。
［式５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　　　　Ａｂ：抗体濃度
　　　　Ｄ：抗体固定密度
　　　　Ｖ：反応場容量
　　　　Ｓ：抗体固定面積　
　式５より、容量が１００μｌ、抗体固定面積が１５４ｍｍ2の反応場において、抗ヒトアルブミン抗体を固定密度６．５×１０-9ｍｏｌ／ｍ2で固定した条件は抗体濃度１０-8Ｍに相当する。
　式４及び式５を用いると、ｋon＝１０3（Ｍ-1ｓ-1）、ｋoff＝１０-4（ｓ-1）、ｔb＝５（ｍｉｎ）、ｔw＝１（ｍｉｎ）の場合、検体に含まれる測定対象物のうち捕捉抗体で捕捉される割合は、従来のように検出部の測定電極２０８上部の流路壁面にのみ捕捉抗体が固定されている場合では３１分の１になるのに対し、図４Ａのように反応部２０５の壁面に捕捉抗体４０１が固定されている場合は１５分の１になり、図４Ｂのように反応部２０５に捕捉抗体固定ビーズ４０２が入っている場合では３分の１になる。この結果より、図４Ｂのように捕捉抗体固定ビーズ４０２を用いて、反応部２０５の体積あたりの捕捉抗体４０１を固定する面積を増やすことは測定感度を約１０倍向上し、大きく効果がある。さらに、図４Ａのように反応部２０５の壁面に捕捉抗体４０１を固定する場合でも、捕捉抗体４０１を固定できる面積は大きく変わらなくとも、反応部２０５に加えられる検体量は２５μｌであり、従来のように検出部の測定電極２０８上部の流路壁面にのみ捕捉抗体が固定されている場合の検体量０．２５μｌの１００倍に相当することから、測定感度の向上に効果がある。
　図５は、電気化学免疫センサ用カートリッジを攪拌する方法の一例を示す模式図である。カートリッジの攪拌は、測定装置１０１の振盪機１０６で振盪させてもよいし、また、振盪機が測定装置１０１に設けられていなければ、カートリッジ２０１単体に持ち手２１６を設け、手で振盪させてもよい。振動させる方向は、反応部２０５から測定電極２０８に基質液が流れ込まないようにするため、図５に矢印で示すように第二の流路の流れ方向に垂直な方向であることが望ましい。さらに、攪拌用ビーズ２０６に磁性ビーズを用いれば、測定装置１０１のカートリッジ上部側と下部側、又はカートリッジの側面の両面に磁界発生部を設け、反応時に交互に磁界を発生させることにより攪拌用ビーズ２０６を移動させることで、反応部２０５内を攪拌してもよい。
　図６は、図１に示したカートリッジと図２に示した測定装置を用いた測定手順の一例を示すフローチャートである。流路上に設けられた検体導入口２０３に検体を添加する（Ｓ６０１）。検体は毛細管現象により第一の流路２０２内に導入される。検体としては、生体試料から採取した体液等そのものや、必要に応じて遠心分離やろ過、希釈等の前処理をしたものであってもかまわない。カートリッジ２０１は測定装置１０１にセットされる。ポンプ１１０を用いて検体を反応部２０５に搬送する（Ｓ６０２）。振盪機１０６を駆動して一定時間振盪する（Ｓ６０３）と、攪拌用ビーズ２０６及び／又は捕捉抗体固定ビーズ４０２が反応部２０５の中で移動し、反応部２０５内の溶液を攪拌して、検体中の測定対象物が捕捉抗体に捕捉される。ポンプ１１０を用いて検体を廃液排出口２１０から廃液溜め１１４に廃棄する（Ｓ６０４）。
　次に、試薬供給口２０４から導入した洗浄液で第一の流路２０２、反応部２０５、第二の流路２０７を洗浄し（Ｓ６０５）、捕捉抗体に捕捉されていない測定対象物を除去する。洗浄に用いた洗浄液も廃液溜め１１４に廃棄される。洗浄液は、Tris Buffered Saline（以下、ＴＢＳという）やPhosphate Buffered Saline（以下、ＰＢＳという）などの緩衝液を用いる。ポンプ１０８を用いて試薬供給口２０４に抗体試薬液を導入する（Ｓ６０６）。抗体試薬液には測定対象物を認識・結合する検出抗体をアルカリホスファターゼ標識したもの（標識検出抗体）などを含む液を用いる。抗体試薬液中の標識検出抗体は捕捉抗体に捕捉された測定対象物に結合する。一定時間振盪した（Ｓ６０７）後、試薬供給口２０４から洗浄液を導入し、第一の流路２０２、反応部２０５、第二の流路２０７を洗浄する（Ｓ６０８）ことで、未結合の標識検出抗体を除去する。抗体試薬液や洗浄液は廃液溜め１１４に廃棄される。
　次に、ポンプ１０９を用いて試薬供給口２０４に基質液を導入し（Ｓ６０９）、一定時間振盪する（Ｓ６１０）。基質液には、アルカリホスファターゼの基質であるアスコルビン酸リン酸とメディエータであるフェリシアン化カリウムを含む液などを用いる。反応部２０５の捕捉抗体に存在する捕捉抗体－測定対象物－標識検出抗体の複合体のアルカリホスファターゼにより基質液中のアスコルビン酸リン酸が加水分解され、生成したアスコルビン酸がフェリシアン化カリウムと反応してフェロシアン化カリウムを生成し、測定電極２０８の電位が変化する。そのため、電圧計１１５で測定電極２０８と参照電極２０９の間の電位差を測定する（Ｓ６１１）ことで、捕捉された測定対象物量が求まる。より精度よく測定対象物の量を求めるために、別に用意したカートリッジにおいて測定対象物の量が既知の試料を用いて測定対象物の量と測定電位の関係を表す検量線を作成し、測定対象物の量が未知の試料の値を計算してもよい。
　測定対象物は、糖尿病検査ではＨｂＡ１ｃやＧＡなどの糖化タンパク質であり、感染症検査では肝炎ウイルスやインフルエンザウイルス、クラミジアニューモニエなどウイルスの抗原又はそれに対する抗体であり、心疾患検査ではｃＴｎＩやｃＴｎＴ、ＣＫ－ＭＢ、ＮＴ－ｐｒｏＢＭＰといった心筋梗塞や心不全の時に血中に放出されるタンパク質である。感染症検査でウイルス抗原に対する血液中の抗体を測定する場合は、反応部２０５に固定する測定対象物に対する捕捉抗体４０１の代わりにウイルス抗原が用いられる。また、その場合、抗体試薬液中の標識検出抗体はウイルス抗原に対する血液中の抗体のタイプに応じた抗体となり、例えばウイルス抗原に対する血液中の抗体がＩｇＡであれば標識抗ＩｇＡ抗体が用いられる。
　検出のための抗体の修飾酵素、その基質及びメディエータの組み合わせはアルカリホスファターゼとアスコルビン酸リン酸、フェリシアン化カリウムといった加水分解酵素と基質、メディエータの組み合わせに限らず、グルコースオキシダーゼとグルコース、フェリシアン化カリウムといった酸化還元酵素と基質、酸化還元物質の組み合わせでもよい。メディエータの濃度は基質濃度よりも低いことが望ましく、基質とメディエータの濃度比により測定感度を調節できる。
　図７は、電気化学免疫センサ用カートリッジの反応部において攪拌用ビーズの代わりに気泡を用いて攪拌する場合のカートリッジ及び測定装置の一例を示す模式図である。
　図７Ａは、カートリッジ２０１の全体構造を示す斜視模式図である。反応部２０５は攪拌用ビーズを含まず、攪拌用ビーズの反応部２０５からの流出を防ぐ必要がないため、第一の流路２０２と反応部２０５の間、反応部２０５と第二の流路２０７の間にフィルタを設ける必要もない。そのため、カートリッジの作製は、検体導入口２０３、試薬供給口２０４及び廃液排出口２１０の穴を開けたＰＥＴなどのフィルムと、第一の流路２０２、反応部２０５、第二の流路２０７の形の穴を開けたＰＥＴなどのフィルムと、カーボンペーストや銀塩化銀ペーストを用いて測定電極２０８及び参照電極２０９を印刷したＰＥＴなどのフィルムの３層を、溶着又は接着剤により接着するだけでよい。それゆえ、図１及び図３の攪拌用ビーズを用いる場合に比べ、気泡を用いる場合はカートリッジ作製工程が簡便になり、製造コストを低く抑えることができる。
　図７Ｂは、カートリッジに気泡を導入する場合の測定装置の一例を示す模式図である。カートリッジ２０１の試薬供給口２０４は測定装置１０１と流体的に接続され、各試薬液を供給するポンプ１０７、１０８、１０９と試薬供給口２０４の間には気泡発生装置７０１が設けられている。図７Ｃは、気泡発生装置７０１の詳細を示した模式図である。三方弁が図７Ｃの左図の向きであるときは試薬供給口２０４に各試薬液が供給される。三方弁を図７Ｃの右図の向きに切り替えて空気穴７０２を介してカートリッジ２０１の試薬供給口２０４を外部とつなげ、ポンプ１１０で短時間吸引し、三方弁を図７Ｃの左図の向きに戻すことで気泡が導入される。図６の検体の添加（Ｓ６０１）、洗浄液の添加（Ｓ６０５、Ｓ６０８）、抗体試薬液の添加（Ｓ６０６）の各工程において気泡を導入する。反応部２０５に気泡とともに検体及び各試薬液を添加後、測定装置１０１の振盪機１０６で振盪させたり、カートリッジ２０１の持ち手２１６を用いて手で振盪させたりすることで、攪拌用ビーズがなくても気泡により反応部２０５内を攪拌して均一に反応させることができる。
　図８は、反応部２０５の攪拌によって検体に含まれる測定対象物の濃度測定の再現性が向上することを、検体中のＨｂＡ１ｃ／ヘモグロビン比の測定を例にして示す図である。
　従来、ＰＯＣＴ向け小型臨床検査装置において、高感度化するために反応部の大きさを大きくすると、反応部内の反応が不均一になって測定精度が低下するため、高感度と高い測定精度を両立することはできなかった。反応部攪拌が測定再現性を向上させることを実証する詳細な実験手順を以下に示す。反応部２０５の壁面にストレプトアビジンを物理吸着させ、ここにビオチン化したモノクローナル抗ヘモグロビン抗体（捕捉抗体）を加え、ストレプトアビジンを介して反応部２０５の壁面に固定する。ＨｂＡ１ｃ／ヘモグロビン比が既知のヒト血液由来試料とカチオン性界面活性剤を含むＴＢＳを混合して、試料溶液とした。このとき、試料溶液中のヒトヘモグロビン濃度は反応部２０５壁面に固定した抗ヘモグロビン抗体のすべてにヒトヘモグロビンが結合し得る濃度以上であることが望ましい。検体導入口２０３から試料溶液を導入し、反応部２０５において、試料溶液中のヒトヘモグロビン及びＨｂＡ１ｃを抗ヘモグロビン抗体と一定時間反応させた。試薬供給口２０４から０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ（以下、ＴＢＳＴという）を加え、抗ヘモグロビン抗体に捕捉されていないヒトヘモグロビン及びＨｂＡ１ｃを洗浄した。試薬供給口２０４からアルカリホスファターゼ修飾したモノクローナル抗ＨｂＡ１ｃ抗体（検出抗体）を加え、抗ヒトヘモグロビン抗体に捕捉されているＨｂＡ１ｃに反応させた後、ＴＢＳＴで洗浄した。一般的な抗原抗体反応では検出抗体の濃度は捕捉抗体の１０分の１程度だが、本実施例では捕捉抗体である抗ヒトヘモグロビン抗体のすべてにヒトヘモグロビンが捕捉されているため、検出抗体である抗ＨｂＡ１ｃ抗体の濃度は抗体の性能にもよるが固定した抗ヒトヘモグロビン抗体の濃度より高いことが望ましい。試薬供給口２０４から、アルカリホスファターゼの基質であるアスコルビン酸リン酸とメディエータであるフェリシアン化カリウムを含む基質液を加え、一定時間振盪した後の電位を測定電極２０８及び参照電極２０９を用いて測定した。測定された電位値から式２を用いて生成したフェロシアン化カリウム濃度を算出した。
　図８Ａは基質液を反応させている際に振盪しなかった場合のヒト血液由来試料のＨｂＡ１ｃ／ヘモグロビン比と生成フェロシアン化カリウム濃度の関係を示し、図８Ｂは基質液を反応させている際に振盪した場合のヒト血液由来試料のＨｂＡ１ｃ／ヘモグロビン比と生成フェロシアン化カリウム濃度の関係を示している。振盪しなかった場合の測定再現性は、ＨｂＡ１ｃ／ヘモグロビン比が５．６１％のときはＣＶ８％、７．７１％のときはＣＶ１４％、１０．５５％のときはＣＶ１１％である。一方、振盪した場合の測定再現性は、ＨｂＡ１ｃ／ヘモグロビン比が５．６１％のときはＣＶ３％、７．７１％のときはＣＶ１２％、１０．５５％のときはＣＶ５％である。以上のことから、反応中に反応部２０５を攪拌することは測定再現性を向上し、測定精度の向上に効果があることが分かる。
　なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
１０１　測定装置
１０２　制御部
１０３　計測部
１０４　表示部
１０５　入力部
１０６　振盪機
１０７～１１０　ポンプ
１１４　廃液溜め
１１５　電圧計
２０１　カートリッジ
２０２　第一の流路
２０３　検体導入口
２０４　試薬供給口
２０５　反応部
２０６　攪拌用ビーズ
２０７　第二の流路
２０８　測定電極
２０９　参照電極
２１０　廃液排出口
２１１，２１２　端子
２１３　基板
２１４　流路部
２１５　フィルタ
２１６　持ち手
４０１　捕捉抗体
４０２　捕捉抗体固定ビーズ
７０１　気泡発生装置

Claims (8)

  1. 　検体を導入するための検体導入口を有する第一の流路と、
    　前記第一の流路に接続され前記検体を捕捉する抗体が配置された反応部と、
    　前記反応部に接続され前記反応部での反応産物を検出する電位測定用電極が配置された第二の流路とを備え、
    　前記電位測定用電極は前記反応部の下流側に前記反応部から離して設けられ、前記反応部の底面積は前記電位測定用電極の面積より大きいことを特徴とする電気化学免疫センサ用カートリッジ。
  2. 　請求項１記載の電気化学免疫センサ用カートリッジにおいて、
    　前記反応部の底面積は前記電位測定用電極の面積の１００倍以上であることを特徴とする電気化学免疫センサ用カートリッジ。
  3. 　請求項１記載の電気化学免疫センサ用カートリッジにおいて、
    　前記反応部での反応に使用される基質の拡散係数をＤ、前記基質を酵素標識検出抗体と振盪しながら反応させる時間をｔとするとき、前記反応部と前記電極とはＬ＝（２Ｄｔ）1/2で与えられる前記基質の拡散距離Ｌの３倍以上離れていることを特徴とする電気化学免疫センサ用カートリッジ。
  4. 　請求項１記載の電気化学免疫センサ用カートリッジにおいて、
    　前記反応部と前記電位測定用電極とは６．５ｍｍ以上離れていることを特徴とする電気化学免疫センサ用カートリッジ。
  5. 　請求項１記載の電気化学免疫センサ用カートリッジにおいて、
    　前記反応部は、攪拌用ビーズ及び／又は捕捉抗体固定ビーズを有することを特徴とする電気化学免疫センサ用カートリッジ。
  6. 　請求項１記載の電気化学免疫センサ用カートリッジにおいて、
    　掴みやすくするための持ち手を有することを特徴とする電気化学免疫センサ用カートリッジ。
  7. 　請求項１記載の電気化学免疫センサ用カートリッジを装着して免疫測定を行う測定装置であって、
    　前記カートリッジの前記試薬供給口に酵素標識検出抗体と、前記酵素の基質を供給する手段と、
    　前記カートリッジの電位測定用電極の電位を測定する電圧計と、
    　前記カートリッジを前記第二の流路の流れ方向に垂直な方向に振動させる振盪機と、
    を有することを特徴とする測定装置。
  8. 　請求項１記載の電気化学免疫センサ用カートリッジを装着して免疫測定を行う測定装置であって、
    　前記カートリッジの試薬供給口に酵素標識検出抗体と、前記酵素の基質を供給する手段と、
    　前記カートリッジの電位測定用電極の電位を測定する電圧計と、
    　気泡を発生させて前記カートリッジの前記試薬供給口に気泡を導入するための気泡発生装置と、
    を有することを特徴とする測定装置。
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