JP2018004615A - 溶液成分分析キット、溶液成分分析方法、及び溶液成分分析装置 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、半導体製造技術の利用により基板上に電極が形成された小型の溶液成分センサが特許文献1に開示されている。
まず、本実施形態の溶液成分分析キット1の例について、溶液成分分析キット1を備えた溶液成分分析システム100とともに、図面を参照して説明する。図1は、本実施形態の溶液成分分析システムの全体図である。
図1に示す本実施形態の溶液成分分析システム100は、分析対象物を含む液体(以下、被検体液という)中の分析対象物の濃度を測定し、被検体液の構成成分を分析するシステムである。
また、基板3はアルカリに対する耐性を有していることが好ましい。これにより、後述する電極対4及び配線部8の形成を好適に行うことができる。
また、電極対4は、基板3に対する密着性が高い材料であることが好ましい。
また、電極対4において陽極となる電極の材料と陰極となる電極の材料とが互いに異なっている構成とすることもできる。
具体例としては、例えば、電極対4は、基板3側にクロムからなる下層を有し、下層上が金からなる上層に被覆された二層構造を有する層状の導体であってもよい。これにより、クロムからなる下層がガラスからなる基板3に密着し、基板3に対する電極対4の密着性が高められ、且つ電極対4の電気抵抗を下げることができる。
例えば電極対4がクロムの単層構造である場合には、配線部8は、下地として当該クロムの単層構造を有し、下地の上に金等の良導体が積層された構造となっていてもよい。これにより、配線部8の電気抵抗を下げることができる。
また、配線部8は、電極対4とは異なる形成方法によって形成されてもよい。
なお、ウェル7の壁部7Aは、液性試薬16に対するメニスカスを相殺して液性試薬16の液面高さを一定にするように内面が傾斜していてもよい。
本実施形態では、吸着材11が収容されたウェル7が液性試薬16によって満たされた状態で使用される場合と、後述する吸着材11に液性試薬16が染み込んだ状態で吸着材11がウェル7内に収容される場合とがありうる。
溶液成分センサ2の製造方法としては、まず、互いに対向する一組の電極4A,4Bと、一組の電極4A,4Bの各々を測定系装置101に接続するための配線部8とを基板3上に形成する。
一組の電極4A,4Bと配線部8とは、例えばスパッタリング等の成膜方法を用いて製造したり、エッチングによってパターン形成したりすることによって形成することができる。また、一組の電極4A,4Bは、金属粒子を含有するペーストの印刷によりパターン形成されその後焼成されることによって形成されてもよい。
以上が溶液成分センサ2の製造工程である。
以下では、一例として、セルロース繊維からなるシート状の吸着材11について説明する。
また、被検体液中の特定物質を選択的に検出する機能を付与するために、表面を化学修飾した吸着材11を使用することも可能である。この場合上記吸着材11に、イオン交換性の官能基、イオノフォア類、酵素、タンパク、抗体、抗原等の認識物質を、化学吸着あるいは有機合成手法により共有結合で結合させて用いることができる。
図4に示すように、液性試薬16は、吸着材11とともにウェル7に収容されて使用される液性の試薬である。液性試薬16は、感応物質12に含まれる酵素13の存在下で酸化還元反応を生じさせる基質を含む。
感応物質12の化学反応部位と反応基質の組み合わせの例としては、ペルオキシダーゼと過酸化水素/o−フェニルジアミンや過酸化水素/フェリシアン化鉄、アルカリフォスファターゼとo−ニトロフェニルリン酸等が挙げられる。これらの場合には、液性試薬16に含まれる基質の濃度は、少なくとも最終濃度において感応物質12と適切に反応できる濃度範囲にあることが好ましい。
図11に示すように、測定系装置101は、溶液成分センサ2の配線部8に電気的に接続される機器であり、測定系回路102と、コンピュータ108とを備える。
図12に示すように、電圧計測部103は、溶液成分センサ2の電極対4に対して所定の電圧Vccを印加し、溶液成分センサ2の電極対4上に配されたウェル7内に吸着材11及び液性試薬16が収容された状態で測定された抵抗値Rsに基づいた検出電圧Voutを出力する。本実施形態では、ウェル7内における酸化還元反応によって電極対4と液性試薬16との間での電子の授受が活発となれば抵抗値Rsは低い値となる。
また、電圧計測部103は、センサ感度調節用可変抵抗105を有する。センサ感度調節用可変抵抗105の抵抗値R1の大きさは、溶液成分センサ2における抵抗値Rsが既知である校正用デバイスを用いて予め設定されることが好ましい。これにより、溶液成分センサ2における抵抗値Rsの変化のレンジに最適化された出力電圧Voutのレンジを設定することができる。
電流計測部106は、測定系回路102における電流の大きさを検出する。
コンピュータ108は、電源部107に対して、出力する電圧及び電流の大きさを制御し、また、電圧計測部103及び電流計測部106において測定された値の入力を受け付ける。コンピュータ108は、インターフェースを介して測定系回路102から取り込んだ値を用いて被検体液中の所望の成分の濃度を算出するプログラムを有している。
たとえば、本実施形態のコンピュータ108が有するプログラムは、電流変化又は電圧変化に基づいて被検体液中の分析対象物の濃度を算出する算出部としてコンピュータ108を動作させるプログラムである。
本実施形態の溶液成分分析方法は、分析対象物を含む液体(被検体液)中の分析対象物の濃度を測定し、被検体液の構成成分を分析する方法である。
本実施形態の溶液成分分析方法は、分析対象物に適した温度条件下(たとえば、室温、37℃、あるいは4℃など)で行われることが好ましい。
図13は、本実施形態の溶液成分分析方法を示すフローチャートである。
ステップS1では、吸着材11が被検体液に浸漬される。ステップS1において被検体液に吸着材11が浸漬されると、被検体液に含まれる分析対象物が吸着材11に物理的に吸着される。吸着材11を被検体液に浸漬している間に、吸着材11が入った被検体液の撹拌や振とうが行われてもよい。なお、ステップS1では、吸着材11を被検体液に浸漬することに代えて、被検体液を吸着材11に塗布したり被検体液を吸着材11に滴下したりすることで被検体液を吸着材11に接触させてもよい。
これでステップS1は終了し、ステップS2へ進む。
上記のステップS1では、吸着材11の表面に様々な物質が吸着されているので、吸着材11の表面に吸着された分析対象物に対して特異的な感応物質12を使用したとしても、分析対象物以外の物質に対して感応物質12が非特異的に結合する場合がある。このような非特異的な結合は濃度測定の精度及び再現性を悪化させる可能性がある。このため、ステップS2において、吸着材11の表面に吸着された物質に対する感応物質12の非特異的な結合を減らす目的で、吸着材11がブロッキングされる。
ブロッキング液中におけるブロッキング剤の濃度は、感応物質12と吸着材11との非特異的結合のしやすさを考慮して決定される。また、ブロッキング剤の濃度の決定のために分析対象物の組成が考慮されていてもよい。
これでステップS2は終了し、ステップS3へ進む。
ステップS3では、感応物質12を含んだ液体に吸着材11が浸漬される。感応物質12を含んだ液体に吸着材11が浸漬されることにより、感応物質12は分析対象物に特異的に結合する(図7参照)。その結果、ステップS3では、吸着材11に吸着された分析対象物の数に対応する数の感応物質12が、分析対象物を介して吸着材11に結合する。なお、ステップS3において、吸着材11に感応物質12が添加されるものであれば、感応物質12を含んだ液体に吸着材11を浸漬することに代えて、感応物質12を含んだ液体を吸着材11に塗布したり、感応物質12を含んだ液体を吸着材11に滴下したりしてもよい。
これでステップS3は終了し、ステップS4へ進む。
ステップS4では、上記のステップS3において感応物質12を分析対象物に結合させた吸着材11が、溶液成分センサ2のウェル7に配置される。ステップS4における吸着材11の配置は、たとえばピンセットを用いて手作業で行うことができる。ステップS4では、電極対4を構成する各電極に吸着材11が接触するように、吸着材11が電極対4上に載置される。その後、ウェル7内に所定量の液性試薬16が添加される。液性試薬16の添加後、ウェル7内では、酸化還元反応(本実施形態ではフェントン反応を含む)により電極対4との間での電子の授受が生じ得る状態となる。フェントン反応の速度は、吸着材11に結合している感応物質12の数と正の相関を有する。
これでステップS4は終了し、ステップS5へ進む。
ステップS5では、ウェル7に液性試薬16が添加され(反応工程)、その後、測定系装置101が電極対4を用いてウェル7内における電圧変化を検知する(計測工程)。なおステップS5のウェル7に液性試薬16を添加した後に、ステップS4の吸着材11をウェル7内に配置してもよい。またステップS3で感応物質12を接触させた吸着材11に、液性試薬16を浸透、塗布、滴下などの方法で接触させたものを、ステップS4でウェル7に配置することでステップS5における液性試薬16の接触を省略することも可能である。
ステップS5において、電極対4と液性試薬16との間での電子の授受が活発であれば抵抗値Rsは低い値となるので、電圧計測部103において測定される電圧(検出電圧Vout)は高値となる。ステップS5において、検出電圧Voutは、電極対4と液性試薬16との間での電子の授受の頻度、すなわち、酸化還元反応の速度を反映している。言い換えると、ステップS5において、検出電圧Voutは、ウェル7内にある感応物質12の量を反映している。ウェル7内の感応物質12の量は吸着材11に吸着された分析対象物の量を反映しているから、ステップS5において測定される検出電圧Voutは、ウェル7内にある分析対象物の量を反映している。
これでステップS5は終了し、ステップS6へ進む。
ステップS6において、コンピュータ108は、溶液成分センサ2に配された5つのウェル7を用いて取得された5つの検出電圧Voutの値(実測データ)を用いて、センサ電圧を算出する。本明細書における「センサ電圧」は、取得された5つの検出電圧Voutに基づく検出電圧値(検出値)のうち、最高値及び最低値を除いた他の3つの値の平均値である。コンピュータ108は、センサ電圧を、表示部109に表示させたり、記録部110に記録したりする。
ステップS6において、分析対象物の濃度をセンサ電圧から算出する場合には、コンピュータ108は、参照用データとして記憶されたセンサ電圧と実測データに基づいて算出されたセンサ電圧との比較によって、被検体液に含まれる分析対象物の濃度を算出する。コンピュータ108は、分析対象物の濃度を、表示部109に表示させたり、記録部110に記録したりする。
吸着材11が多孔質である場合には、吸着材11の体積に比して表面積が大きくなるように吸着材11が構成されているので、単位時間当たりに吸着材11に吸着可能な分析対象物の量を、吸着材11が多孔質でない場合と比較して高めることができる。さらに、吸着材11が多孔質である場合には、少量の感応物質12及び少量の液性試薬16を吸着材11表面に素早く浸透させることができるので、素早い濃度測定が可能である。
本実施形態の溶液成分分析キット1は、複数の電極対4が互いに離間した位置に配され、複数の電極対4に対して個別にウェル7を構成する絶縁膜9が基板3上に形成されている。このため、本実施形態の溶液成分分析キット1における電極対4において、ウェル7内に露出する部分の面積は、複数のウェル7において実質的に互いに等しい。また、貫通孔部を有する絶縁膜9によりウェル7が形成されているので、ウェル7の形状も実質的に互いに等しい。このため、溶液成分センサ2を用いた濃度測定時に吸着材11と液性試薬16の接触状態を複数のウェル7で互いに同等とすることができる。すなわち、液性試薬16と吸着材11との接触面積や、ウェル7内における吸着材11の位置などが、複数のウェル7において略同等となっている状態で、複数のウェル7に対して電圧変化(あるいは電流変化)の検出をすることができる。また、本実施形態の溶液成分分析キット1によれば、測定者の操作によって吸着材11と液性試薬16との位置関係がずれることが起こりにくい。これらの結果、本実施形態の溶液成分分析キット1によれば、測定の精度が高く、測定の再現性が高い。
なお、電極対4の数が4つであっても、最大値、最小値を省いた平均値を算出することができる。また、電極対4の数が3つの場合には、最大値、最小値を省いた残りの値は、上記の測定誤差の少ない値であって分析対象物の濃度を正しく反映していると考えられる。
電極対4の数は、溶液成分センサ2の寸法を考慮して、5組以上であってもよい。電極対4の数が多い方が、最大値、最小値を省いた平均値の信頼性が高いと言える。
さらに、本実施形態の溶液成分分析キット1によれば、液性試薬16との反応によって、検出電圧あるいは電流が増幅されるので、微量な分析対象物の測定再現性と精度を向上させることができる。
まず、本発明の溶液成分分析キット及び溶液成分分析方法において使用される吸着材の特性について説明する。
バックグラウンドの測定及び以下の実施例では、セルロースシートからなる吸着材が使用される。具体的には、吸着材として、直径3mmに裁断された無蛍光不溶性紙(王子製紙製)が使用される。
溶液成分センサの製造方法及び構成について説明する。まず、ガラス基板(15×45mm、1mm厚)に1000Å厚のクロムがスパッタリング法により成膜され、フォトリソグラフィー、エッチングを用いて所定の形状の電極対及び配線部がパターニング加工される。電極対は1基板上に5ヶ×2箇所とされている。次に、各電極対の上部に直径3mmの開口を有するように絶縁膜がパターニング加工されることによって、各電極対の位置にウェルが形成される。
まず、500μLのコーティングバッファーに吸着材である5枚のセルロースシートが浸漬される。コーティングバッファーに浸漬されたセルロースシートは、37℃で15分間インキュベート(静置)される。インキュベートの後、セルロースシートがコーティングバッファーから取り出される。コーティングバッファーから取り出されたセルロースシートは、蒸留水で数回すすぎ洗いされる。
複数のマイクロチューブに、HRP標識化抗BSA抗体を結合させる工程まで終了したセルロースシートが1枚づつ収容される。これらのセルロースシートがマイクロチューブに収容された後、マイクロチューブに150μLの発色液が添加される。発色液が添加された後のマイクロチューブは、室温(20℃)で10分間インキュベートされる。このインキュベートの間に、発色反応が生じる。インキュベート後、複数のマイクロチューブ内の発色液のうち100μLが、公知の96穴マイクロプレートの各1ウェルに分注される。発色液が分注された96穴マイクロプレートにおいて呈色した溶液の吸光度が、マイクロプレートリーダーによって測定される。
図14は、吸光度測定の結果について、独立した2試行の結果か並べて示されている。
図14に示すように、コーティングバッファーに吸着材が浸漬された場合には、吸光度は0.07である。なお、上記のマイクロプレートリーダー(TECAN製)における検出限界は0.04であるので、吸光度0.07は、検出対象物の濃度が検出限界の下限にほぼ等しいことを示している。
まず、携帯型センサ電圧測定器の子機に溶液成分センサが取り付けられる。続いて、HRP標識化抗BSA抗体を結合させる工程が行われたセルロースシート(本例では上記の吸光度の測定が終了した後に蒸留水に5分間浸漬されたセルロースシートである)が、溶液成分センサの各ウェルに1つずつ収容される。HRP標識化抗BSA抗体を含む液体に浸漬される工程を経た5つのセルロースシートが、同時に測定される5つのウェルに1つずつ収容される。
まず、5つの電極対から得られた10秒間の検出電圧Voutの平均値が、コンピュータ108によって、検出電圧値(検出値)としてそれぞれ算出される。続いて、5つの電極対から得られた5つの検出電圧値の中から最大値、最小値を示した電極対のデータを除き、残り3つの電極対における検出電圧値の平均値をセンサ電圧とする。
図15は、センサ電圧の測定結果について、独立した2試行の結果か並べて示されている。
図15に示すように、コーティングバッファーに吸着材が浸漬された場合には、センサ電圧は約2250mVである。
本実施例は、吸着材に対する分析対象物の吸着能及び分析対象物に対する感応物質の結合能を示すための実施例である。本実施例では、感応物質の存在下で発色反応を生じる反応系を使用する。
以下の各実施例及び比較例において、メーカーの指定のない試薬は、全て和光純薬製である。
まず、吸着材にBSA又はHSAを吸着させる操作手順について説明する。
BSAを含む被検体液に第一の吸着材が浸漬され、また、HSAを含む被検体液に第二の吸着材が浸漬される。具体的には、一条件あたり5枚のセルロースシートが、500μLの被検体液に浸漬される。本実施例では、2種の抗原(BSA又はHSA)について、感応物質の濃度が異なる3例を示すので、計6条件で30枚のセルロースシートが使用される。被検体液に浸漬されたセルロースシートは、37℃で15分間インキュベート(静置)される。インキュベートの後、セルロースシートが被検体液から取り出される。被検体液から取り出されたセルロースシートは、蒸留水で数回すすぎ洗いされる。これにより、BSA又はHSAは、吸着材であるセルロースシート上に物理吸着によって保持される。
複数のマイクロチューブに、標識済みシートが1枚づつ収容される。マイクロチューブに標識済みシートが収容された後、マイクロチューブに150μLの発色液が添加される。標識済みシートが収容されているとともに発色液が添加されたマイクロチューブは、室温(20℃)で10分間インキュベートされる。このインキュベートの間に、発色反応が生じる。インキュベート後、複数のマイクロチューブ内の発色液のうち100μLが、公知の96穴マイクロプレートの各1ウェルに分注される。本実施例では、発色液が分注された96穴マイクロプレートにおいて呈色した溶液の吸光度が、マイクロプレートリーダーによって測定された。
本実施例では、上記の実施例1と比較して、感応物質を含んだ液体へのセルロースシートの浸漬時間が異なっている。本実施例では、感応物質を含んだ液体へのセルロースシートの浸漬時間は30分である。
本実施例及び上記の実施例1によれば、感応物質を含んだ液体へのセルロースシートの浸漬時間は、15分であってもよいし、30分であってもよい。すなわち、感応物質を含んだ液体へのセルロースシートの浸漬時間が15分であっても30分であっても、同様の結果を得ることができる。
本実施例では、上記の実施例1と比較して、被検体液へのセルロースシートの浸漬時間、ブロッキング液へのセルロースシートの浸漬時間、及び感応物質を含んだ液体へのセルロースシートの浸漬時間が異なっている。本実施例では、被検体液へのセルロースシートの浸漬時間、ブロッキング液へのセルロースシートの浸漬時間、及び感応物質を含んだ液体へのセルロースシートの浸漬時間は、それぞれ60分である。
本実施例では、上記の実施例3と比較して、被検体液へのセルロースシートの浸漬時間が異なっている。本実施例における被検体液へのセルロースシートの浸漬時間は、30分若しくは15分である。ブロッキング液へのセルロースシートの浸漬時間及び感応物質を含んだ液体へのセルロースシートの浸漬時間は、それぞれ60分である。なお、本実施例では、BSAを含む被検体液を使用した例のみ開示される。
本実施例では、上記の実施例4と比較して、感応物質を含んだ液体へのセルロースシートの浸漬時間が異なっている。本実施例における感応物質を含んだ液体へのセルロースシートの浸漬時間は、30分若しくは15分である。被検体液へのセルロースシートの浸漬時間は15分であり、ブロッキング液へのセルロースシートの浸漬時間は60分である。
本実施例では、BSA又はHSAを含む被検体液に代えて、HRP標識化抗BSA抗体を含む被検体液が使用される。すなわち、本実施例では、感応物質を吸着材に直接吸着させる。HRP標識化抗BSA抗体を含む被検体液へのセルロースシートの浸漬時間は60分である。なお、本実施例では、被検体液に含まれるHRP標識化抗BSA抗体が感応物質そのものであるので、上記の実施形態におけるブロッキング液への浸漬及びそれに引き続くHRP標識化抗BSA抗体を含む溶液への浸漬は行われず、HRP標識化抗BSA抗体を含む被検体液へのセルロースシートの浸漬時間の経過後に発色反応が行われる。
HRP標識化抗BSA抗体を吸着材に直接吸着させた場合の吸光度は、HRP標識化抗BSA抗体の濃度が5ng/ml以上250ng/ml以下である範囲において、HRP標識化抗BSA抗体の濃度に正の相関を有する。HRP標識化抗BSA抗体が吸着された吸着材に関する1次近似式の相関係数は0.95であり、高い濃度相関性が確認された。
本実施例では、上記実施形態に開示された溶液成分センサと上記実施形態に開示された吸着材を使用して、電圧変化の検出を利用した分析対象物の濃度測定を行った例が示される。
本実施例では、上記の実施例1から実施例6までとは異なり、発色液ではなく、上記の実施形態に開示された液性試薬が使用される。具体的には、液性試薬は、フェリシアン化カリウム(K3[Fe(III)(CN)6])水溶液(1×10−3mol/L)に過酸化水素水(0.3%)を1:1で希釈したものである。
まず、携帯型センサ電圧測定器の子機に溶液成分センサが取り付けられる。続いて、HRP標識化抗BSA抗体の吸着が行われたセルロースシートが、溶液成分センサの各ウェルに1つずつ収容される。本実施例では、HRP標識化抗BSA抗体を含む液体に浸漬される工程を経た5つのセルロースシートが、同時に測定される5つのウェルに1つずつ収容される。
まず、5つの電極対から得られた10秒間の検出電圧Voutの平均値が、コンピュータによって検出電圧値としてそれぞれ算出される。続いて、5つの電極対から得られた5つの検出電圧値の中から、最大値、最小値を示した電極対のデータを除き、残り3つの電極対における検出電圧値の平均値がセンサ電圧として算出される。
本実施例では、上記の実施例7においてセンサ電圧の測定に使用されたセルロースシートを用いて、上記の実施例6と同様の方法で吸光度が測定された。
上記の実施例7及び本実施例によれば、吸着材にHRP標識化抗BSA抗体を吸着させた場合におけるHRP標識化抗BSA抗体の濃度に関して、センサ電圧と吸光度とは互いに同様の傾向を示すことが確認された。
本実施例では、上記の実施例7におけるセンサ電圧の測定と同様の方法によって、上記の実施例1に記載の標識済みシートを用いてセンサ電圧の測定が行われる。
本実施例では、上記の実施例9において使用された標識済みシートを使用して、上記の実施例1と同じ方法で吸光度が測定された。
また、実施例9において使用された標識済みシートを使用した吸光度の測定結果(実施例10)も、上記実施形態に開示された溶液成分センサ及び吸着材によって分析対象物に対して特異性の高い濃度測定をすることが可能であることを示している。
吸光度測定において、陽性試験における吸光度と陰性試験における吸光度の差が、吸光度測定における特異性と定義される。図33は、吸光度測定における特異性を、感応物質の濃度毎に示したものである。
センサ電圧の測定において、BSAを含む被検体液に浸漬された標識済みシートを用いた測定(陽性試験)におけるセンサ電圧と、HSAを含む被検体液に浸漬された標識済みシートを用いた測定(陰性試験)におけるセンサ電圧の差が、センサ電圧測定における特異性と定義される。図34は、センサ電圧測定における特異性を、感応物質の濃度毎に示したものである。
一方、吸光度測定では、抗体(感応物質)の濃度が増加するほど陽性試験と陰性試験における吸光度の差(特異性)が大きくなる傾向があることが分かる(図33参照)。
本実施例では、上記の実施例1と比較して、被検体液中のBSA又はHSAの濃度が異なっている。また、本実施例では、感応物質であるHRP標識化抗BSA抗体の濃度は500ng/mlで一定である。
BSA及びHSAは、コーティングバッファーによって5ng/ml、50ng/ml、又は250ng/mlに希釈された状態で、被検体液として使用される。
本実施例では、上記の実施例1と同様に吸光度の測定が行われる。
本実施例では、BSA又はHSAの濃度と吸光度及びセンサ電圧の関係が示される。
本実施例では、上記の実施例1と同様の方法によって標識済みシートが作製される。本実施例では、BSA又はHSAの濃度が低い群(0.25ng/ml、0.5ng/ml、5ng/ml)、BSA又はHSAの濃度が中程度の群(5ng/ml、50ng/ml、250ng/ml)、BSA又はHSAの濃度が高い群(500ng/ml、50,000ng/ml、500,000ng/ml)の三群に分けて、吸光度測定及びセンサ電圧の測定が行われる。
本実施例では、上記の全ての群において、HRP標識化抗BSA抗体(感応物質)の濃度は500ng/mlである。
図37は、実施例12において低濃度のBSAを吸着材に吸着させた場合の吸光度を示すグラフである。図37における横軸は、BSAの濃度を示す。図37における縦軸は、吸光度の大きさを示す。図38は、実施例12において低濃度のHSAを吸着材に吸着させた場合の吸光度を示すグラフである。図38における横軸は、HSAの濃度を示す。図38における縦軸は、吸光度の大きさを示す。
BSA又はHSAの濃度が低い群では、BSAの場合とHSAの場合との間における吸光度の差が小さく、吸光度測定による特異的な濃度測定が困難となる。
BSA又はHSAの濃度が中程度の群では、BSAの場合にHSAの場合よりも吸光度が高い。BSAの濃度が中程度の群におけるBSA濃度に対する吸光度の相関係数はR2=0.95である。すなわち、BSAの濃度が中程度の場合には、吸光度測定によって精度の高い測定結果が得られた。
図41は、実施例12において低濃度のBSAを吸着材に吸着させた場合のセンサ電圧を示すグラフである。図41における横軸は、BSAの濃度を示す。図41における縦軸は、センサ電圧の大きさを示す。図42は、実施例12において低濃度のHSAを吸着材に吸着させた場合のセンサ電圧を示すグラフである。図42における横軸は、HSAの濃度を示す。図42における縦軸は、センサ電圧の大きさを示す。
BSA又はHSAの濃度が低い群では、BSAの場合とHSAの場合との間におけるセンサ電圧に有意な差が見られる。本実施例における吸光度測定の結果と比較すると、本実施例におけるセンサ電圧測定は、吸光度測定よりも検出感度に優れている。
BSA又はHSAの濃度が中程度の群では、BSAの場合にHSAの場合よりもセンサ電圧が高い。
本実施例では、コンピュータが取得した検出電圧Voutの値に基づいて、コンピュータがセンサ電圧を算出する例が示される。
まず、溶液成分センサが電極対を1組だけ有している場合、あるいは溶液成分センサの電極対を1組だけ利用する場合には、コンピュータは、検出電圧値(10秒間の検出電圧Voutの平均値)をセンサ電圧として出力する。また、溶液成分センサが電極対を2組以上有している場合、あるいは溶液成分センサの電極対を2組以上利用する場合には、コンピュータは、複数の検出電圧値の平均値をセンサ電圧として出力する。
図50は、本実施例におけるセンサ電圧の算出条件と相関係数とを示す表である。図50におけるウェル番号は、図49におけるウェル番号と対応している。
図50に示すように、利用可能なウェル(電極対)が多い方が、BSA濃度に対するセンサ電圧の相関係数が高まる傾向がある。
また、4つ以上の検出電圧値を用いる場合には、コンピュータは、検出電圧値の最大値と最小値を除外して残りの検出電圧値の平均値をセンサ電圧として出力する。
本実施例では、吸着材に吸着させる分析対象物としてHSAが使用され、HSAを使用する例に対応する対照実験としてBSAが使用される点で上記の実施例1と異なっている。さらに、本実施例では、感応物質の組成が上記の実施例1と異なっている。
BSA又はHSAを含む被検体液は、炭酸水素ナトリウム/リン酸緩衝液(上記のコーティングバッファーである)を用いて上記のBSA又はHSAを希釈した溶液からなる。
BSA及びHSAは、コーティングバッファーによって0.25ng/ml、0.5ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、又は250ng/mlに希釈された状態で、被検体液として使用される。
HSAを含む被検体液1mLが第一の吸着材(セルロースシート)に滴下され、BSAを含む被検体液1mLが第二の吸着材(セルロースシート)に滴下される。これにより、被検体液に各セルロースシートが浸漬される。被検体液に浸漬されたセルロースシートは、37℃で15分間インキュベート(静置)される。これにより、BSA又はHSAは、吸着材であるセルロースシート上に物理吸着によって保持される。
図66は、実施例14においてHSAを吸着材に吸着させた場合のセンサ電圧を示すグラフである。図66における横軸は、HSAの濃度を示す。図66における縦軸は、センサ電圧の大きさを示す。図67は、実施例14においてBSAを吸着材に吸着させた場合のセンサ電圧を示すグラフである。図67における横軸は、BSAの濃度を示す。図67における縦軸は、センサ電圧の大きさを示す。
すなわち、本実施例の2段階吸着法では、実施例1に示す1段階吸着法によって調製されたセルロースシートを用いた実施例12の測定結果と比較して、分析対象物に対して高い特異性を有して濃度測定をすることができる。
本比較例では、上記実施形態の吸着材を使用せずに分析対象物の濃度を測定する例が示される。図51は、比較例1におけるBSAの濃度と吸光度との関係を示すグラフである。図51における横軸はBSAの濃度を示す。図51における縦軸は吸光度の大きさを示す。図52は、比較例1におけるHSAの濃度と吸光度との関係を示すグラフである。図52における横軸はHSAの濃度を示す。図52における縦軸は吸光度の大きさを示す。
なお、ブロッキング液、発色剤ならびに各々の希釈液は実施例1と同じものである。
まず、マイクロプレートの各ウェルに抗原溶液が150μLづつ分注される。抗原溶液が分注されたマイクロプレートは、37℃で60分間インキュベートされる。インキュベートの終了後、マイクロプレート内の液体が廃棄され、さらに、マイクロプレートの各ウェルはPBSTによって数回すすぎ洗いされる。
本比較例では、上記の実施例3と比較して、ブロッキング工程を省いた点が異なっている。被検体液に吸着材を浸漬する時間及び感応物質を含んだ液体に吸着材を浸漬する時間は、ともに60分間である。図53は、比較例2におけるBSAの濃度と吸光度との関係を示すグラフである。図53における横軸は感応物質であるHRP標識化抗BSA抗体の濃度を示す。図53における縦軸は吸光度の大きさを示す。図54は、比較例2におけるHSAの濃度と吸光度との関係を示すグラフである。図54における横軸は感応物質であるHRP標識化抗BSA抗体の濃度を示す。図54における縦軸は吸光度の大きさを示す。
本比較例では、吸着材であるセルロースシートの表面が、アミノシランカップリング法で化学修飾されている。本比較例では、アミノシランカップリング法で化学修飾されたセルロースからなる吸着材を用いて、上記の実施例6と同様の操作を行った。図55は、比較例3における感応物質の濃度と吸光度との関係を示すグラフである。図55における横軸は感応物質であるHRP標識化抗BSA抗体の濃度を示す。図55における縦軸は吸光度の大きさを示す。
その結果、本比較例では、1次近似式の相関係数は0.90であり、上記の実施例6における相関係数よりもわずかに小さい。これは、正電荷を持つアミノ基とBSAの静電的な反発のため、結果としてBSAの吸着現象が阻害されたと推察される。
本比較例では、上記の実施例7と同様の方法で、液性試薬に含まれるK3[Fe(III)(CN)6]水溶液の濃度を、1×10−3mol/Lから1×10−2mol/Lへと10倍増加させた。図56は、比較例4における感応物質の濃度とセンサ電圧との関係を示すグラフである。図56における横軸は感応物質であるHRP標識化抗BSA抗体の濃度を示す。図56における縦軸はセンサ電圧の大きさを示す。
本比較例では、上記の実施例9と比較して、液性試薬に代えて蒸留水を溶液成分センサのウェルに添加した点が異なっている。図57は、比較例5においてBSAが吸着材に吸着された場合における感応物質の濃度とセンサ電圧との関係を示すグラフである。図57における横軸は感応物質であるHRP標識化抗BSA抗体の濃度を示す。図57における縦軸はセンサ電圧の大きさを示す。図58は、比較例5においてHSAが吸着材に吸着された場合における感応物質の濃度とセンサ電圧との関係を示すグラフである。図58における横軸は感応物質であるHRP標識化抗BSA抗体の濃度を示す。図58における縦軸はセンサ電圧の大きさを示す。
本比較例では、上記の比較例3と同様の方法で市販の96穴プラスチック製プレートに抗原(BSA又はHSA)を物理吸着で保持し、これに酵素標識化抗体を反応させた後、発色液で溶液を呈色させた。この溶液をマイクロプレートリーダーで吸光度測定し、検量線を得た。本比較例が上記の比較例3と異なる点は、本比較例では、上記の実施例11と同様に、抗原(BSA又はHSA)の濃度に関して複数の濃度(5ng/ml、50ng/ml、250ng/ml)のそれぞれについて吸光度の測定が行われている点である。また、本比較例では、上記の実施例11と同様に、HRP標識化抗BSA抗体の濃度は500ng/mlである。
2 溶液成分センサ
3 基板
4 電極対
4A 電極
4Ax 辺部
4B 電極
4Bx 辺部
7 ウェル
7A 壁部
8 配線部
9 絶縁膜
10 流動体保持空間
11 吸着材
12 感応物質
13 酵素
14 一次抗体
15 酵素標識二次抗体
16 液性試薬
100 溶液成分分析システム
101 測定系装置(溶液成分分析装置)
102 測定系回路
103 電圧計測部
104 差動増幅回路
105 センサ感度調節用可変抵抗
106 電流計測部
107 電源部
108 コンピュータ
109 表示部
110 記録部
Claims (8)
- 基板、前記基板の外面に所定距離だけ離間して対向配置された一組の電極、及び前記一組の電極の各々において外部に露出された部分を囲む絶縁性の流動体保持部を備えた溶液成分センサと、
前記基板の厚さ方向から見たときに前記流動体保持部によって囲まれる領域に配置可能であり分析対象物を物理吸着可能な吸着材と、
前記分析対象物に結合する酵素を含む感応物質と、
前記感応物質と酸化還元反応可能な基質を含む液性試薬と、
を備えることを特徴とする溶液成分分析キット。 - 前記溶液成分センサは、前記電極を3組以上有し、
前記電極は、溶液成分を独立して分析できるように互いに離間した位置に配されている、
請求項1に記載の溶液成分分析キット。 - 前記溶液成分センサは、前記電極を4組以上有している、
請求項2に記載の溶液成分分析キット。 - 前記吸着材は、多孔質膜であることを特徴とする請求項1から請求項3のいずれか一項に記載の溶液成分分析キット。
- 前記吸着材は、セルロース繊維からなることを特徴とする請求項4に記載の溶液成分分析キット。
- 請求項1から請求項5のいずれか一項に記載の溶液成分分析キットを用いた溶液成分分析方法であって、
前記分析対象物を含む溶液に前記吸着材を接触させる吸着工程と、
前記吸着工程の後に前記領域に前記感応物質を添加する添加工程と、
前記添加工程の後に前記吸着材を前記領域内に配置する配置工程と、
前記領域内に配置された前記吸着材と前記液性試薬とを反応させる反応工程と、
前記反応工程における酸化還元反応を電流変化又は電圧変化として前記電極を用いて計測する計測工程と、
前記計測工程において計測された電流変化又は電圧変化に基づいて前記溶液中の前記分析対象物の濃度を算出する算出工程と、
を備えることを特徴とする溶液成分分析方法。 - 請求項2または請求項3に記載の溶液成分分析キットを用いた溶液成分分析方法であって、
前記分析対象物を含む溶液に前記吸着材を接触させる吸着工程と、
前記吸着工程の後に前記吸着材に前記感応物質を添加する添加工程と、
前記添加工程の後に前記吸着材を前記領域内に配置する配置工程と、
前記領域内に配置された前記吸着材と前記液性試薬とを反応させる反応工程と、
前記反応工程における酸化還元反応を電流変化又は電圧変化として前記電極を用いて計測する計測工程と、
前記計測工程において計測された電流変化又は電圧変化に基づいて前記溶液中の前記分析対象物の濃度を算出する算出工程と、
を備え、
前記算出工程は、前記電流変化又は前記電圧変化に基づいて算出された複数の検出値のうち、最高値及び最低値を除いた他の値の平均値を採用し、前記平均値に基づいて前記分析対象物の濃度を算出する、
ことを特徴とする溶液成分分析方法。 - 請求項2または請求項3に記載の溶液成分分析キットと共に使用される溶液成分分析装置であって、
前記電極と電気的に接続可能であり電流変化又は電圧変化を計測可能な計測部と、
前記計測部と接続され、前記電流変化又は前記電圧変化に基づいて前記溶液中の前記分析対象物の濃度を算出する算出部と、
を備え、
前記算出部は、複数の前記電極を用いて計測され算出された複数の検出値の値のうち、最高値及び最低値を除いた他の値の平均値を前記溶液中の前記分析対象物の濃度測定に利用する、
ことを特徴とする溶液成分分析装置。
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