JP2014505556A - マイクロ流体アッセイ装置 - Google Patents
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Abstract
Description
カートリッジ内に前記流体試料を導入するためのサンプルポート、
内部に配置された1以上の微小流体流路(チャネル)(channel)を含み、及び試料内の任意の検体を結合させるチャネル内に配置された結合剤を含む基板、及び試料中に存在する検体量の検出用の標識、及び
検体と標識の結合が発生する領域であり、その領域から結合した検体が取り除かれ、任意の残存する未結合標識の測定により間接的に前記検体の濃度を決定することができる領域を、その範囲内または全体的に含む検出領域。
ン−アビジン結合)を介して常磁性体に結合される。磁気剤/粒子に結合する結合剤を含むよう機能化した磁気剤/粒子をカートリッジのチャネル内に単に堆積させ、試料をカートリッジに適用し、チャネル内に引き込まれる際に機能化した磁気剤/粒子を流体試料によって再懸濁して試料内の検体(分析対象物)と接触するようにしてもよい。
サンプル中に存在する任意の分析対象物が結合剤によって結合されることが可能となるように本発明のマイクロ流体カートリッジに試料を導入すること;及び
初期の参照/対照(reference/control)値を得るために、標識(検体への結合及び未結合の両方)の量(レベル)を検出すること;
結合検体を検出領域から取り除くこと;及び
カートリッジに存在する検体の結合後に残存する任意の未結合または未反応の検体を検出すること、または未結合または未反応の検体を結合できる標識を検出することを含む。
a)第一の態様による、常磁性粒子(またはそれらの好ましい具体例)を含むマイクロ流体カートリッジ;及び
b)リーダー装置
を含む。
リーダーのデバイスは、
i)リーダー内にカートリッジを導入するためのレシービングポート;
ii)カートリッジに磁力を適用し、カートリッジ内の検出領域から常磁性粒子を除去することが可能な磁石または磁力を発生する手段;
iii)カートリッジの検出領域から検体/結合剤複合体を除去する前と後の両方にて、カートリッジの検出領域内に存在する任意の標識を検出する検出手段
を含む。
常磁性粒子−検体−標識複合体が形成可能な一定時間後、磁石または磁場を利用して常時性粒子(検体と標識の複合常磁性粒子を含む)を検出領域から遠ざけ、検体濃度が増加するにつれて標識濃度が減少することによる検体濃度の測定を可能にする。この実施態様では、検出領域で検出される残存する標識は完全に形成された反応複合体の一部ではない(すなわち、常磁性粒子に結合されていない)任意の標識である。これは、検体に結合していない遊離した標識である場合もあり、または検体に結合した標識の場合もある。
1.サンプル量の減少:指先穿刺血液サンプルのような流体の毛管導入により、使用時の複雑さを軽減し、どのような環境でも検査を行うことができ(例えば、救急車、ケア(介護)の現場、医師の手術、戦場、家庭等)、またグルコース検査のように製品をどこにでも置くことができる。
2.室温安定性:既存のIVDテストの多くは、冷蔵貯蔵して移送することを要するが、この要件は、製品にかなりのコストがかかり、製品の使用と配布を制限することになる。試料カートリッジは初期状態で“乾燥している”ので、その安定性と貯蔵寿命の向上につながる。また、本特許に記載された特定のアッセイ法は、検出領域から特異的に結合した複合体の除去前の初期バックグラウンド測定を可能にする。この初期バックグラウンド測定は、補正のために使用することができる。
3.材料の低コストと簡便な製造工程により、売上原価(COGS)が低くなり、インビトロ診断(IVD)ストリップの販売により、実質的に利益が増加するようになる。従来の検査では、ストリップ材料費や全体的なアッセイ費用が高く複雑になる傾向にあったので、これは特に、免疫測定及び分子IVDの市場で望まれている。
4.リーダーの低コスト化。洗浄緩衝液は必要がないのでリーダー装置が簡素化される。電気化学的または単純な光学的測定などの簡単な検出方法を使用することにより、リーダー計測がシンプルになり、コストが低くなる。
1.カートリッジの信号測定
2.カートリッジの温度制御
3.常磁性粒子の操作
4.較正機構
1.GOD反応が妨害されず、GOD濃度が高感度に測定可能である。
2.GODは強固な安定性のある酵素であるので、血中グルコースをモニターする物質として使用される。例えば、HRPなどの他のラベルは安定性がないことが知られているが、本発明の実施態様では、HRPの不安定性は、酵素の過剰(大過剰)によって克服することができる。
3.GOD/HRP反応によって生成したフェリシアニドの濃度を測定するために電気化学的還元を行う。還元反応は血液中の電気化学的干渉の影響を著しく低減する。大多数の物質は酸化反応を妨げる。
4.過剰にできないHRP及びその他の酵素基質(アルカリホスファターゼなど)とは異なり、すべての成分が過剰(高溶解性で)なので、電気化学的測定に関する直線性(linearity)の問題は存在しない。
5.ほとんどのアッセイにおいてバックグラウンド測定は、較正時の信号振幅の測定によって決定される。このバックグラウンド測定は平均値であり、通常関連する大きな誤差を伴う。バックグラウンドは、堆積試薬濃度のばらつき、検出領域のばらつき、血液間の違いなどの要因によりかなり変動する。これによりほとんどのアッセイの感度が低下する。このシステムでは、バックグラウンドは各チャネルで磁石が適用され特定の信号測定が行われる前に測定される。このように各測定値は、個別にバックグラウンドの補正がされ、非常に感度の高い正確なアッセイ結果を得ることができる。
試薬類:
ニュートラアビジン:サーモサイエンティフィック(Thermo Scientific)社、カタログ番号 31000(ニュートラアビジン ビオチン結合タンパク質)
マレイミド−PEG2−ビオチン:サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 21901(EZ-リンクマレイミド−PEG2−ビオチン)
ラテックス粒子:インビトロジェン(Invitrogen)社、カタログ番号 C37259(CML ラテックス 4% W/V、10μm)
常磁性粒子:アデムテック(Ademtech)社、カタログ番号 03223(200nm Strep+ 常磁性粒子)
抗体1H12:ハイテスト(Hytest)社、カタログ番号 4P33 MAb 1H12(抗PSA、ヒト)
抗体5A6:ハイテスト社、カタログ番号 4P33 MAb 5A6(抗PSA、ヒト)
bGOD:ロックランド(Rockland)社、カタログ番号 B000-07(ビオチン化グルコースオキシターゼ)
PBS:サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28372(BupH リン酸緩衝生理食塩水パック)
BSA:シグマ(Sigma)社、カタログ番号 A4503-50G(ウシ血清由来アルブミン)
水:シグマ社、カタログ番号 W4502(分子生物学用の水)
酢酸アンモニウム:シグマ社、カタログ番号 1542-250G(酢酸アンモニウム)
MES:シグマ社、カタログ番号 M8250-25G(2-モルホリノエタンスルホン酸(MES hydrate))
フェロシアン化物(Ferrocyanide):シグマ社、カタログ番号 P3289-100G(フェロシアン化カリウム(potassium ferrocyanide))
グルコース:シグマ社、カタログ番号 G8270-1 KG(グルコース(D-(+)-Glucose))
塩酸(HCl):シグマ社、カタログ番号 H1758-100ML(塩酸(hydrochloric acid)、36.5-38%)
水酸化ナトリウム(NaOH):シグマ社、カタログ番号 72068(水酸化ナトリウム溶液(sodium hydroxide solution))
HRP(ペルオキシダーゼ):BBI Enzymes社、カタログ番号 HRP4C(西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horseradish Peroxidase))
2MEA:サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20408(2−メルカプトエタノールアミン塩酸塩)
PSA標準品(WHO 1st IRP(96/670)に従って較正済み):パーキンエルマー(Perkin Elmer)社、カタログ番号 A073-301(前立腺特異抗原測定キット(ProStatus PSA free/total kit)、Delfia(登録商標))
ビオチン定量化測定キット(Biotin quantification kit):サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28005(ピアース ビオチン標識効率測定キット(Pierce biotin quantification kit))
サイズ排除カラム:GEヘルスケア社、カタログ番号 17-0851-01(PD10カラム)
EDTA:シグマ社、カタログ番号 EDS-100G(エチレンジアミン四酢酸、無水)
トゥイーン(Tween):シグマ社、P7949-100ML(Tween-20)
DMSO:サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20684(ジメチルスルホキシド)
酢酸:シグマ社、カタログ番号 32,009-9(酢酸)
抗体のビオチン化
抗体のジスルフィド結合の還元;
抗体の1H12及び5A6を1mM EDTA、PBS中の2MEAを用いて、37℃で90分で還元する。還元された抗体をPD10カラムに通し、1mM EDTA、PBS中で収集し、タンパク質が含まれると判断される(UV分光光度計での280nmの測定によって)フラクション(画分)を収集する。還元抗体の濃度は、280nmで1mg/ml=1.4吸光度単位である抗体の吸光係数を用いて算出される。
マレイミド−PEG2−ビオチンを、効率的な結合が起こるようにモル過剰で還元された抗体に添加し、次いで室温で3時間インキュベートする。その後、それを1mM EDTA、PBS中、pH7.2で予め平衡化された別のPD10カラムに通す。500μlのフラクション(画分)を収集し、UV分光光度計を用いて280nmで測定する。相当量レベルのタンパク質を含む画分を選択し、混合する。この溶液の試料を吸光度により280nmで再度測定し、抗体の濃度は280nmで1mg/ml=1.4吸光度単位である抗体の吸光係数を用いて決定される。その後、抗体あたりの結合ビオチンの数は、製造元の指示に従って、ピアースビオチン定量キットを用いて決定される。
ニュートラアビジンの吸着
10μmのラテックスを、4℃で5分間、16100×gでの遠心分離を使用して、MES緩衝液(50mM MES、pH6.5)で洗浄し、粒子をペレット状にする。そのラテックスを、固形分濃度2%で再懸濁する。ニュートラアビジンは水中で400μg/mlの濃度に調製する。等量の2%のラテックスと400μg/mlのニュートラアビジンを一緒に加え、よく混合する。それらをロータリーミキサー(30RPM)で混合しながら室温で18時間インキュベートする。その後、その粒子を等量のPBS(pH7.2)で3回洗浄し(4℃、16100×gで5分間、遠心分離を使用)、固形分濃度2%で同様のPBS中で再懸濁する。
10μmのラテックスを、50mM、pH4.2の酢酸アンモニウムで洗浄し(4℃、16100×gで5分間、遠心分離を使用)、同様の酢酸アンモニウム中で固形分濃度1%で再懸濁する。ビオチン化されたGODは、50mM、pH4.2の酢酸アンモニウムで希釈し、濃度160μg/mlにする。ビオチン化された抗体5A6は、50mM、pH4.2の酢酸アンモニウムで希釈し濃度40μg/mlにする。その後等量の40μg/ml b5A6を、160μg/ml bGODに添加する。次いでこの混合物を1%ニュートラアビジンを被覆したラテックスと1:1の割合で混合する。この溶液を十分に混合し、ロータリーミキサー(30RPM)で振盪しながら、室温で30分間インキュベートする。
粒子への抗体の結合
200nmのストレプトアビジンを被覆した常磁性粒子を、0.1%tween、pH7.2、PBS中で洗浄し(磁気分離器を使用)、固形分濃度0.5%になるように同様のPBS中で再懸濁する。ビオチン化抗体1H12を0.1%tween、pH7.2、PBS中で希釈し、50μg/mlとする。等量の0.5%常磁性粒子と50μg/mlビオチン化抗体を合わせて混合し、ロータリーシェーカーを用いて30rpmで振盪しながら、室温で30分間インキュベートする。
アッセイ試薬を、以下に示す量と濃度でエッペンドルフ(登録商標)チューブに入れる:
1%常磁性粒子(b1H12を結合した):2μl
150mg/ml BSA、0.25%tweenのすべてをpH7.2、PBSに含む:4μl
1%ラテックス(bGOD及びb5A6を結合):2μl
PSAスタンダード:2μl
すべての試薬をエッペンドルフに別々に加え、チューブに内に保つ。
最終的にすべての試薬は、
反応緩衝液:10μl
(反応緩衝液は1M MES(pH6.0)、200mM グルコース、200mM フェロシアニド、2mg/ml HRPから成る。)
を添加して混合される。
4.5分間のインキュベーション後、ポテンシオスタットを開回路から−0.1Vへと変化させ、トランジェント(過渡電流;transient)を0.1秒ごとにデータに記録する。5分間のインキュベーション後、作用電極から常磁性粒子複合体を取り除くように磁石をカートリッジ(すなわち、電極の反対面上)に適用させる。結果として得られたトランジェントをさらに5分間記録する。作用電極での反応レート(反応率)は、−0.1Vまでの電位ステップの後、約200秒と300秒の間で取得されるデータから計算される。
このアッセイの機構では(図11参照)、試薬が混合されると直ちに、GODはグルコースをグルコノラクトンへ変換させ、同時に酸素は過酸化水素へと変換する。次に過酸化水素は、後にフェロシアニドをフェリシアニドに酸化するHRPの基質として作用する。従って生成されるフェリシアニドの濃度は、それ自体がGODの濃度に依存する生成過酸化水素濃度に依存する。フェリシアニドの濃度は、クロノアンペロメトリーにより測定される。この場合、2電極システムにおける作用電極及びカウンター/参照電極間の−0.1Vの電位で発生する電流を測定する。磁石が(作用電極から離れた反対側の面で、作用電極のすぐ上の位置に)適用されると、常磁性粒子は、作用電極近傍から離れ磁石に向かって移動する。PSA濃度に応じて、GODに被覆された複数の標識粒子は、それ自体がPSAを介して常磁性粒子への付着することによっても除去される。この場合、作用電極表面(測定される箇所)でのGOD濃度は、除去される標識粒子の数(これは試料中のPSA濃度に依存する)に応じて減少する。
図7に検査(テスト)カートリッジにて湿式試薬を用いて行った総PSA減算法アッセイ応答の実験結果を示す。検査は緩衝液基質中で0.7μlの量を使用し、合計10分間行った。0fMでのPSAの結果は、異なる日に行われた2つの標準偏差誤差のある4つの別々の測定値の平均を示している。他のすべてのデータの測定点は、単一の測定値を表す。x軸は総PSA濃度をfM(フェムトモーラー)で表し、y軸は反応レートをA/S(アンペア/秒)で表している。
試薬類:
マレイミド−PEG2−ビオチン:サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 21901(EZ-リンクマレイミド−PEG2−ビオチン)
ラテックス粒子:インビトロジェン(Invitrogen)社、カタログ番号 F8827(フルオスフェア(FluoSpheres)、カルボキシレート修飾マイクロスフェア、2μm、黄緑色蛍光)
常磁性粒子:アデムテック社、カタログ番号 03223(200nm Strep+ 常磁性粒子)
抗体8A6:ハイテスト社、カタログ番号 4P33 MAb 8A6(抗PSA、ヒト)
抗体5A6:ハイテスト社、カタログ番号 4P33のMAb 5A6(抗PSA、ヒト)
PBS:サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28372(BupH リン酸緩衝生理食塩水パック)
BSA:シグマ社、カタログ番号 A4503-50G(ウシ血清由来アルブミン)
水:シグマ社、カタログ番号 W4502(分子生物学用の水)
トレハロース:シグマ社、カタログ番号 T9531-25G(D-(+)-トレハロース二水和物(trehalose dehydrate))
MES:シグマ社、カタログ番号 M8250-25G (2-モルホリノエタンスルホン酸(MES hydrate))
塩酸(HCl) :シグマ社、カタログ番号 H1758-100ML (塩酸(hydrochloric acid)、36.5-38%)
水酸化ナトリウム(NaOH):シグマ社、カタログ番号 72068 (水酸化ナトリウム溶液(sodium hydroxide solution))
2MEA:サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20408(2−メルカプトエタノールアミン塩酸塩)
PSA標準品(WHO 1st IRP(96/670)に従い較正済み):
パーキンエルマー社、カタログ番号 A073-301(前立腺特異抗原測定キット(ProStatus PSA free/total kit)、Delfia(登録商標))
ビオチン定量定キット(Biotin quantification kit):
サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28005(ピアース ビオチン標識効率測定キット(Pierce biotin quantification kit))
サイズ排除カラム:GEヘルスケア社、カタログ番号 17-0851-01(PD10カラム)
EDTA:シグマ社、カタログ番号 EDS-100G(エチレンジアミン四酢酸、無水)
トゥイーン(Tween):シグマ社、P7949-100ML(Tween-20)
DMSO:サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20684(ジメチルスルホキシド)
酢酸:シグマ社、カタログ番号 32,009-9(酢酸)
抗体のビオチン化
抗体8A6のジスルフィド結合の還元
濃度2mg/mlから7mg/mlの希釈していない抗体8A6ストックを使用する。適量の抗体ストックを取り除き、1mgの抗体を得る。1mgの抗体に、適量の14.28mM EDTA、PBS中、pH7.2を添加し、EDTAの濃度を1mMにする。
マレイミド−PEG2−ビオチンを1mM EDTA、PBS中、pH7.2に溶解し、20mMの溶液を得る。この溶液の適量を還元された抗体に添加し、還元抗体の40倍モル過剰のマレイミド−PEG2−ビオチンを得る。次いでこれを混合し、室温で3時間インキュベートする。
抗体の吸着
2μmのラテックスを4℃で8分間、16100×gでの遠心分離を使用してMES緩衝液(50mM MES、pH6.5)で洗浄し、粒子をペレット状にする。ラテックスを、固形分濃度2%で再懸濁する。抗体5A6はMES緩衝液中で250μg/mlの濃度に調製する。等量の2%ラテックスと250μg/ml抗体を加え十分に混合する。それらをロータリーミキサー(30rpm)で混合しながら、室温で18時間インキュベートする。その後、その粒子を等量のPBS(pH7.2)で3回洗浄し(4℃、8分、16100×gでの遠心分離を使用)、同じ液中で固形分濃度2%に再懸濁する。
粒子への抗体の結合
200nmのストレプトアビジンを被覆した常磁性粒子を、0.1%Tween、PBS中、pH7.2で洗浄し(磁気分離器を使用)、固形分濃度0.5%になるように同じ液中で再懸濁する。ビオチン化抗体8A6を0.1%Tween、PBS中、pH7.2で希釈し、50μg/mlとする。等量の0.5%常磁性粒子と50μg/mlビオチン化抗体を組み合わせ混合し、ロータリーシェーカーを用いて30rpmで振盪しながら、室温で30分インキュベートする。
試薬類を希釈して混合し、以下のものを含む最終的な堆積溶液を得た。
抗体5A6、PBS中、pH7.2で機能化した0.02%ラテックス粒子
抗体8A6、PBS中、pH7.2で機能化した0.1%常磁性粒子
180mg/mlBSA、PBS中、pH7.2
1mg/mlトレハロース、PBS中、pH7.2
これを40℃で30分間乾燥させる。
2.5μlのPSA標準品をカートリッジに導入し4つのチャンネルに充満させ、乾燥試薬を再懸濁させた。
カートリッジは、結合反応が生じるように室温で8分間インキュベートした。
カートリッジは、パーキンエルマー社のVictor3 Vによりチャネル内で測定できるように特注のホルダーに設置した。
次にチャンネル内の蛍光シグナルを内蔵プログラム「フルオレセイン(485nm/535nm、0.1秒)」を用いて再測定した。このプログラムは、測定時間0.1秒で485nmでの励起及び535nmでの発光を利用している。このシグナルはフィン2(Fin 2)として記録される。
2つの信号(Fin1−Fin2)の差を算出し、その結果を、遊離型PSA濃度に対するグラフとし図8に示した。
図8に示すデータは、ゼロコントロールから58fMの遊離PSA濃度が検出可能であり、蛍光アッセイ形式が高感度であること示唆している。このデータは、ほとんどの場合総PSAレベルが増加するにつれて測定点間の微分係数(defferentiation)が減少する応答となる2桁程度(58−5000fM)の測定可能範囲を示している。
なお、このアッセイで使用されるPSAサンプルは総PSAの世界保健機関(WHO)1ST IRP(96/670)に従い較正がされていることに留意すべきである。
本明細書に記載の磁性粒子に結合した標識を検出領域から除去する減算アッセイ法において、標識グルコースオキシダーゼ(GOD)(または他の酵素標識)を測定する方法を開発した。すなわち、分析対象物(検体)の濃度を決定するために未結合のGOD標識を用い測定した。GOD標識の濃度は、検出領域から結合したGOD標識の磁気的な分離/除去の前に測定され、その後2つの測定が標識濃度の相対的な変化を計算し検体濃度を決定するために使用される。
試薬類:
PSA:ハイテスト社、カタログ番号 8P78(前立腺特異抗原)
ABTS:フルカ(Fluka)社製、カタログ番号 11557
サイズ排除カラム(Zeba size exclusion Columns):サーモフィッシャーサイエンティフィック(ThermoFisher Scientific)社、カタログ番号 89882
SPDP:ピアース社、カタログ番号 21857(N−スクシンイミジル 3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオネート)
GOD:BBI Enzymes社、Cat GO3B3(グルコースオキシターゼ)
マレイミド−PEG2−ビオチン:サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 21901(EZ-リンクマレイミド−PEG2−ビオチン)
ラテックス粒子:インビトロジェン(Invitrogen)社、カタログ番号 F8765(1μm)
常磁性粒子:アデムテック社、カタログ番号 03223(200nm Strep+ 常磁性粒子)
抗体1H12:ハイテスト社、カタログ番号 4P33 MAb 1H12(抗PSA、ヒト)
抗体5A6:ハイテスト社、カタログ番号 4P33 MAb 5A6(抗PSA、ヒト)
PBS:サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28372(BupH リン酸緩衝生理食塩水パック)
BSA:シグマ社、カタログ番号 A4503-50G(ウシ血清由来アルブミン)
水:シグマ社、カタログ番号 W4502(分子生物学用の水)
MES:シグマ社、カタログ番号 M8250-25G (2-モルホリノエタンスルホン酸(MES hydrate))
グルコース:シグマ社、カタログ番号 G8270-1 KG (グルコース(D-(+)-Glucose))
DTT:ピアース社、カタログ番号 20290(1,4−ジチオスレイトール)
塩酸(HCl):シグマ社、カタログ番号 H1758-100ML (塩酸(hydrochloric acid)、36.5-38%)
水酸化ナトリウム(NaOH):シグマ社、カタログ番号 72068 (水酸化ナトリウム溶液(sodium hydroxide solution))
HRP(ペルオキシダーゼ):BBI Enzymes社、カタログ番号 HRP4C(西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horseradish Peroxidase))
2MEA:サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20408(2−メルカプトエタノールアミン塩酸塩)
ビオチン定量化測定キット(Biotin quantification kit):サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28005(ピアースビオチン標識効率測定キット(Pierce biotin quantification kit))
サイズ排除カラム:GEヘルスケア社、カタログ番号 17-0851-01(PD10カラム)
EDTA:シグマ社、カタログ番号 EDS-100G(エチレンジアミン四酢酸、無水)
トゥイーン(Tween):シグマ社、P7949-100ML(Tween-20)
DMSO:サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20684(ジメチルスルホキシド)
抗体のビオチン化
抗体のジスルフィド結合の還元;
抗体1H12を1mM EDTA、PBS中の50mM 2MEAを用いて、37℃で90分で還元する。還元された抗体をPD10カラムに通し、1mM EDTA、PBS中で収集し、タンパク質が含まれると判断される(UV分光光度計での280nmの測定によって)フラクション(画分)を収集する。還元抗体の濃度は、280nmで1mg/ml=1.4吸光度単位である抗体の吸光係数を用いて算出される。
マレイミド−PEG2−ビオチンを、効率的な結合が起こるようにモル過剰で還元された抗体に添加し、次いで室温で3時間インキュベートする。その後、それを1mM EDTA、PBS中、pH7.2で予め平衡化した別のPD10カラムに通す。500μlのフラクション(画分)を収集し、UV分光光度計を用いて280nmで測定する。相当量レベルのタンパク質を含む画分を選択し、混合する。この溶液の試料を吸光度により280nmで再度測定し、抗体の濃度は280nmで1mg/ml=1.4吸光度単位である抗体の吸光係数を用いて決定される。その後、抗体あたりの結合ビオチンの数は、製造元の指示に従って、ピアースビオチン定量キットを用いて決定される。
SPDPによるラテックスのGOD/1H12への結合
ラテックス粒子を、固形分1%及び1mMのSPDPの濃度でPBS緩衝液中の1mMのEDTA中でSPDPに結合する。これを穏やかに振盪しながら、室温で暗所にて90分間インキュベートする。GOD/5A6複合体を、モル過剰のSPDP:GOD/1H12を用いてSPDPに結合し、室温で暗所にて90分間インキュベートする。90分後にGOD/5A6−SPDPの割合は、pH4.5でDTTを添加しさらに室温で暗所にて30分間インキュベートすることにより減少する。
抗体の粒子への結合
200nmのストレプトアビジンを被覆した常磁性粒子を、0.1%tween、pH7.2、PBS中で洗浄し(磁気分離器を使用)、ビオチン化抗体1H12に加え、室温で1時間10分穏やかに振盪しながらインキュベートし、ビオチン化抗体のビオチンをストレプトアビジン被覆常磁性粒子に結合させる。その後常磁性粒子を等量のPBS、pH7.2で4回洗浄し(磁気分離器を使用)、常磁性粒子濃度が固形分1%になるように同じ液中で再懸濁する。
アッセイ試薬を以下の量と濃度でエッペンドルフチューブに入れる:
1%常磁性粒子(b1H12を結合):1μl
1%ラテックス(bGOD及びb5A6を結合):1μl
PSA(300mg/ml BSA、PBS中、最終濃度10倍):1μl
反応緩衝液:7μl
(500mM MES、pH6.7、250mM グルコース、15mM ABTS、4mg/ml HRP、0.14%tweenを含む反応緩衝液)
試薬を混合すると直ちに結合と酵素反応が開始する。これはすべて検出領域で起こる。30秒後、350mVの負電位をストリップに240秒間印加する(トランジェント(過渡電流)に示すように)。240秒の過渡電流(トランジェント)の3秒の電流値が記録される(トランジェントの他の点を測定に使用することができる)。この値は、ストリップの検出領域(作用電極)での抗PSA抗体−GOD標識濃度の測定値を表す。これを「磁気分離前電流/測定」とする。210秒後、磁気をストリップに適用する。抗PSA抗体磁性粒子−PSA−抗PSA抗体−GOD標識複合体は、未結合の抗PSA抗体−GOD標識を残したまま、検出領域から取り除かれる。240秒後、−350mVの電位のスイッチを切り(磁気分離工程後)、OCP(開回路電位)に検出領域/ストリップを戻す。クロノアンペロメトリー測定の実行前に、ストリップをOCP(開回路電位)の状態に2分間保つ。その後、3秒の過渡電流から3秒の電流値を記録する。これを、「磁気分離後電流/測定」とする。測定したすべてのPSA濃度についてこの手順を繰り返した。
図20に、磁気分離後測定による未補正のPSA濃度を示す。PSA濃度が増加するにつれて電流が減少することが観察される。正確性はかなり良く、低PSA濃度ではPSA濃度の平均値は系統的であるが、誤差は大きい。
試薬類:
EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride):シグマ社、カタログ番号 03449
Sulfo−NHS(N-hydroxysulfosuccinimide):サーモサイエンティフィック社, カタログ番号 24510
ラテックス粒子:インビトロジェン社、カタログ番号 F8827 (2μm, COOH表面(surface))
抗体1H12:ハイテスト社、カタログ番号 4P33 MAb 1H12(抗PSA、ヒト)
抗体5A6:ハイテスト社、カタログ番号 4P33 MAb 5A6(抗PSA、ヒト)
GOD:BBI Enzymes社、Cat GO3B3(グルコースオキシターゼ)
常磁性粒子:ケミセル(Chemicell)社、500nm SiMag-Carbonyl
PBS:サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28372(BupH リン酸緩衝生理食塩水パック)
BSA:シグマ社、カタログ番号 A4503-50G(ウシ血清由来アルブミン)
水:シグマ社、カタログ番号 W4502(分子生物学用の水)
酢酸ナトリウム:シグマ社、カタログ番号 58750
MES:シグマ社、カタログ番号 M8250-25G (2-モルホリノエタンスルホン酸(MES hydrate))
トリス(Tris):シグマ社、カタログ番号 93362(トリス塩基(Trizma base))
フェロシアン化物(Ferrocyanide):シグマ社、カタログ番号 P3289-100G(フェロシアン化カリウム(potassium ferrocyanide))
グルコース:シグマ社、カタログ番号 G8270-1 KG (グルコース(D-(+)-Glucose))
塩酸(HCl):シグマ社、カタログ番号 H1758-100ML (塩酸(hydrochloric acid)、36.5-38%)
水酸化ナトリウム(NaOH):シグマ社、カタログ番号 72068 (水酸化ナトリウム溶液(sodium hydroxide solution))
HRP(ペルオキシダーゼ):BBI Enzymes社、カタログ番号 HRP4C(西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horseradish Peroxidase))
PSA:ハイテスト社、カタログ番号 8P78(前立腺特異抗原)
EDTA:シグマ社、カタログ番号 EDS-100G(エチレンジアミン四酢酸、無水)
トゥイーン(Tween):シグマ社、P7949-100ML(Tween-20)
DMSO:サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20684(ジメチルスルホキシド)
酢酸:シグマ社、カタログ番号 32,009-9(酢酸)
トレハロース:シグマ社、カタログ番号 T9531(D-(+)-トレハロース二水和物(trehalose dehydrate))
EDCを使用したラテックスのGOD及び5A6への結合
1%ラテックス粒子を20mg/mlEDC及び20mg/mlSulfo−NHSとともに50mM、pH6.0のMES緩衝液に入れ、室温で暗所にて20分間インキュベートする。50mM、pH4.6の酢酸ナトリウムで洗浄し、同液中にて固形分1%で再懸濁する。
1%常磁性粒子を20mg/mlEDC及び20mg/mlSulfo−NHSとともに50mM、pH6.0のMES緩衝液に入れ、室温で穏やかに振盪しながら20分間インキュベートする。PBSで洗浄し、同液中にて固形分1%で再懸濁する。
アッセイ試薬を以下の量と濃度でエッペンドルフチューブに入れる:
1%常磁性粒子(b1H12を結合):1μl
0.5%ラテックス(GOD及び5A6を結合):1μl
PSA(60mg/ml BSA、PBS中、最終濃度5倍):2μl
1M グルコース:1μl
反応緩衝液:5μl
(1M MES、pH6.0、2mg/ml トレハロース、120mg/ml BSA、4mg/ml HRP、200mMフェロシアニドを含む反応緩衝液)
磁気分離工程の前後における抗−PSA−GOD標識の測定に、パルス式電気化学的測定法を用いた。計8分間、1分毎にクロノアンペロメトリー測定を行った。特に−350mVで0.1秒クロノアンペロメトリー測定を行った。0.1秒での電流値は0.1秒過渡電流から記録した。ストリップにサンプルを適用した後、結合反応と酵素反応が同時に発生している。その後1分毎にパルス電気化学測定を行いデータを記録する。4分後に磁場をストリップに適用すると、抗−PSA磁性粒子が作用電極から除去される。除去された抗−PSA磁性粒子は、PSAを介して抗−PSA−GOD標識が結合した抗−PSA磁性粒子と、抗−PSA磁性粒子(標識が結合していない)の混合集団となる。5、6、7、8分のパルス電気化学的測定は、残りの未結合の抗−PSA−GOD標識の測定値となる。2、3、4分の電流値を、時間(分)に対して電流(アンペア)をプロットし回帰直線にフィットさせることによって傾きを算出するために用いた。この傾きは、磁気分離前の測定を表わす。
図26に示すように、磁気分離前の傾きを磁気分離後の傾きで徐した比を総PSA濃度(pM)に対してプロットした。高感度の系統的な線形応答が観察される。
Claims (26)
- 流体サンプル中の分析対象物(検体)を検出するための減算分析用(subtraction assay)のマイクロ流体分析カートリッジであって、
カートリッジに前記流体サンプルを導入するサンプルポート、
1以上のマイクロ流体チャネルが配設され、前記チャネル内の分析対象物(検体)に結合する結合剤(binding agent)とサンプル中に存在する分析対象物(検体)の量を検出する標識(label)とを含む基材、及び検体と標識の結合が起こる領域を含む、内部のまたは全体の検出領域であって、結合した検体が残留する結合していない標識の測定によって前記検体の濃度を測定できる領域を有する、マイクロ流体分析カートリッジ。 - サンプルがカートリッジに導入する前に、結合剤と標識が検出領域内に置かれている請求項1に記載のマイクロ流体分析カートリッジ。
- 1以上の他の試薬が存在し、及び/または上流に置かれ、及び/または検出領域の中に存在する請求項2に記載のマイクロ流体分析カートリッジ。
- 少なくとも2、4、6、8、10、12、14、16、18または20のように、1以上の分析を行うように作られた、先行するいずれかの請求項に記載のマイクロ流体分析カートリッジ。
- 1つのサンプルについて同一の分析測定を複数回行い、及び/または1つのサンプルについて異なる分析を行う請求項4に記載の分析カートリッジ。
- 結合剤が付着しているか、または常磁性粒子などの粒子に結合している先行するいずれかの請求項に記載の分析カートリッジ。
- 標識がグルコースオキシダーゼである先行するいずれかの請求項に記載の分析カートリッジ。
- さらに、作業電極(working electrode)とカウンター/参照電極またはカウンター及び参照電極を含み、作業電極がカートリッジの検出領域に存在する、電気化学分析に用いられる先行するいずれかの請求項に記載の分析カートリッジ。
- 別個のカウンター/参照電極、またはカウンター及び参照電極が、各々対応する作業電極用として設けられているか、または単一のカウンター/参照電極あるいは単一のカウンター及び参照電極が設けられて作業電極と共に働く請求項8に記載の分析カートリッジ。
- 前記1以上の他の試薬がグルコース、フェロシアナイド及びパーオキシダーゼである請求項3〜9のいずれかに記載の分析カートリッジ。
- 以下の工程を含むサンプルの分析を行う方法:
サンプル中に存在する検体がカートリッジに存在する検体結合剤に結合できるように、サンプルを先行する請求項のいずれかに記載のマイクロ流体にカートリッジに導入する工程;
検出領域(検体に複合化)する領域及び複合化しない領域の双方)に存在する標識の濃度(level of label)を検出し、第一の参照/対照値を得る工程;
検出領域から複合化した検体/標識を除去する工程;及び
検出領域内で、前記複合化した検体/標識の除去後に残存する複合化しない及び/または反応しない標識を検出する工程。 - サンプルのカートリッジへの導入により、結合剤及び標識の少なくとも一部が検出領域内で溶解し、または懸濁する請求項11に記載の方法。
- 検出が電気化学的に行われる請求項12に記載の方法。
- 酸化または還元電位が標識の濃度の測定に用いられる請求項13に記載の方法。
- 電位が、サンプルに存在するバックラウンド・シグナルを発生する電気化学的な妨害を除去するか、または最小化して、または結合インキュベーション段階で酵素により発生する電流を最小化してバックラウンド効果を減少させるために適用される請求項14に記載の方法。
- グルコースオキシダーゼが標識として用いられる請求項13〜15のいずれかに記載の方法。
- さらに、電気化学的に検出できる酸化型と還元型との間に変換できるパーオキシダーゼ(HRP:西洋ワサビパーオキシダーゼなど)及びメディエータ(フェロシアニドまたはABTSなど)を使用する請求項16に記載の方法。
- 結合剤が結合するか、またはサンプル中に存在する検体と複合化することができ、かつ検体と複合化するかまたは複合化しない時に適当な手段で検出領域から除去できる粒子に結合する請求項11〜17のいずれかに記載の方法。
- 粒子が常磁性粒子であり、前記適当な手段が磁石または電磁石である請求項18に記載の方法。
- サンプルが全血サンプルである請求項11〜19のいずれかに記載の方法。
- 検出がサンプルについて、供給される流体によって、分離、洗浄及び/またはサンプルの希釈なしに直接行われる請求項11〜20のいずれかに記載の方法。
- 検出領域からの結合した検体/標識の除去前後のシグナルの減少がサンプル中に存在する検体の量に比例して検出される請求項11〜21のいずれかに記載の方法。
- 以下の(a)及び(b)を有する流体サンプルの分析を行う分析システム:
(a)常磁性粒子を含む、請求項1〜10のいずれかに記載のマイクロ流体カートリッジ;及び(b)下記(i)〜(iii):
(i)カートリッジを読み取りデバイスに導くレシービングポート;
(ii)カートリッジに磁力を適用して、カートリッジ内の検出領域から常磁性粒子を除去することができる磁石または磁力発生手段;及び
(iii)カートリッジの検出領域から検体/結合剤複合体を除去する前及び後の双方において、検出領域内に存在する標識を検出する検知手段、を有する読み取りデバイス。 - 検出領域内で再構成された標識(reconstituted label)の検知後に検出される第一のシグナルから、検出領域内から検体/結合剤複合体を除去した後に検出される第二のシグナル迄の減少が、リーダーにより検出され、サンプル中に存在する検体のレベル(濃度)がリーダーによって計算される請求項23に記載の分析システム。
- シグナルが電気化学的に検出される請求項23に記載の分析システム。
- リーダーが、さらにユーザーがサンプル中に存在する検体濃度を確認するための手段、及び/または検体濃度を離隔関係者に伝えるシグナル送信手段を有する請求項23〜25のいずれかに記載の分析システム。
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