JP2010509581A - 飽和アッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
a.限定量の標識分析物結合試薬に対する該分析物と未標識分析物アナログとの競合的結合ステップと、
b.分析物アナログに結合した標識分析物結合試薬の画分を、結合していない標識分析物結合試薬の遊離画分から分離するステップと、
c.分析物結合試薬の該遊離画分を固定化および濃縮するステップと、
d.固定化および濃縮した標識分析物結合試薬の遊離画分を検出するステップと
を含むイムノアッセイである。
a.限定量の未標識分析物結合試薬に対する該分析物と標識分析物アナログとの競合的結合ステップと、
b.該分析物結合試薬に結合した標識分析物アナログの画分を、結合していない標識分析物アナログの遊離画分からの分離するステップと、
c.標識分析物アナログの遊離画分を固定化および濃縮するステップと、
d.固定化および濃縮した標識分析物アナログの遊離画分を検出するステップと
を含む。
a.限定量の標識分析物結合試薬に対する該分析物と未標識多価分析物アナログとの競合的結合ステップと、
b.標識分析物結合試薬の凝集画分と非凝集画分とを分離するステップと、
c.標識分析物結合試薬の該非凝集画分を固定化および濃縮するステップと、
d.固定化および濃縮した標識分析物結合試薬を検出するステップと
を含む凝集アッセイである。
a.限定量の未標識分析物結合試薬に対する該分析物と標識多価分析物アナログとの競合的結合ステップと、
b.標識多価分析物アナログの凝集画分と非凝集画分とを分離するステップと、
c.標識多価分析物アナログの該非凝集画分の固定化および濃縮するステップと、
d.固定化および濃縮した標識多価分析物アナログの非凝集画分の検出するステップと
を含む。
a.競合的結合ステップの結合画分と未結合画分とを分離するための手段と、
b.第2捕獲ゾーンと
を含むキットを提供する。
a.好ましくは複数の分析物アナログ成分が結合しているハブを含む多価分析物アナログと、
b.該分析物アナログ成分に結合できる複数の標識分析物結合試薬と
をさらに含む。
a.2つ以上の分析物結合試薬が結合しているハブと、
b.該分析物結合試薬に結合できる複数の標識分析物アナログ成分と
をさらに含む。
a.結合画分を排除する手段を含む第1捕獲ゾーンと、
b.標識試薬を排除する手段を含む第2捕獲ゾーンと
を含むデバイスをさらに提供する。
1. 100μLの200nm青色ポリスチレン微粒子(10%固体)(「ラテックス」)(Polymer Laboratories社、英国シュロプシャー)、200μLの無水エタノール、43μLのヒツジFITC抗血清(Micropharm社、英国カーマーゼンシャー)および657μLの10mMリン酸緩衝液(pH7.4)を混合する。
2. 抗体を吸着させるために、穏やかに攪拌しながら室温で2時間にわたりインキュベートする。
3. 10mMリン酸緩衝液(pH7.4)中の200μLの6% BSAを加え、1時間にわたり攪拌しながらインキュベーションを持続する。
4. 軟質ラテックスペレットを形成するために、20分間にわたり4,000gで、その後に8,000gで5分間、吸着混合物を遠心分離させる。
5. 上清を取り除き、1mLのラテックス希釈緩衝液(Omega Diagnostics社、英国アルバ)と置換する。ペレットを静かに再懸濁させる。
6. ステップ5に記載したように遠心分離によってラテックスペレットを収集し、洗浄する。
7. ステップ6をさらに2回繰り返し、最後にラテックスペレットを900μLラテックス希釈緩衝液中へ再懸濁させる。
8. ラテックス固体は標準連続希釈液との比較によって1(w/v)%へ調整し、690nmでの光線吸光度によって評価する。
9. 2μLの1%固体の抗FITCラテックスを、10mMリン酸緩衝食塩液(pH7.4)中の1μLのFITC−デキストラン10〜300ng/μL(Sigma−Aldrich社、FD2000S)と混合するスライド凝集アッセイによって抗体吸着を確認する。
1. 100μLの200nm青色ポリスチレン微粒子(10%固体)(「ラテックス」)(Polymer Laboratories社、英国シュロプシャー)、200μLの無水エタノール、10mMリン酸緩衝食塩液(pH7.4)中の750μgのマウスIgG(Sigma社、15381)、10mMリン酸緩衝食塩液(pH7.4)中の110μgの抗hCG(Medix Biochemica社、フィンランド国カウニアイネン、クローン番号5006)を混合する。10mMリン酸緩衝液(pH7.4)を用いて量を1mLへ調整する。
2. 抗体を吸着させるために、穏やかに攪拌しながら室温で2時間にわたりインキュベートする。
3. 10mMリン酸緩衝液(pH7.4)中の200μLの6% BSAを加え、1時間にわたり攪拌しながらインキュベーションを持続する。
4. 軟質ラテックスペレットを形成するために、10分間にわたり3,500gで、吸着混合物を遠心分離させる。
5. 上清を取り除き、1mLのラテックス希釈緩衝液(Omega Diagnostics社、英国アルバ)と置換する。ペレットを静かに再懸濁させる。
6. ステップ5に記載したように8,000gで20分間にわたる遠心分離によってラテックスペレットを収集し、ペレットを洗浄する。
7. ステップ6をさらに2回繰り返し、最後にラテックスペレットを500μLラテックス希釈緩衝液中へ再懸濁させる。
8. ラテックス固体は標準連続希釈系列との比較によって1(w/v)%へ調整し、690nmでの光線吸光度によって評価する。
9. ここで調製した2.5μLの1%固体の「試験」ラテックスを、適切な抗体「サンドイッチパートナー」(上記と同一法を使用して調製およびバリデートした)が被覆された等量の「対照」ラテックスと、さらに「合成」尿(すなわち、約4.5g/LのKCI、7.5g/LのNaCl、4.8g/Lのリン酸ナトリウム(一塩基性)、18.2g/Lの尿素、2g/Lのクレアチニン、50mg/LのHAS)中の5μLのhCG溶液(0〜250IU/mL)(4th I.S.,NIBSCに対して指定されたhCG濃度値)を加えてと混合するスライド凝集アッセイによって抗体吸着を確認する。
1. 1.6×15cmのG25M Sephadexカラムを使用して、該抗hCG(αサブユニット)を0.1Mリン酸(pH7.5)緩衝液中へ脱塩させ、濃度および収率を決定する。
2. 8モル等量のNHS−PEG−MALを用いて、該抗hCG抗体を活性化する。該反応混合液を2時間にわたり20℃でインキュベートする。100モル等量のグリシンを用いて該反応をクエンチさせ、1.6×15cmのG50F Sephadexカラムの2ショットダウンを用いて5mMのEDTA、PBS(pH7.3)緩衝液中へマレイミド活性化抗hCGを脱塩させる。活性化抗体の濃度および収率を決定する。
3. 1000モル等量の2−イミノチオラン(2−IT)を用いて500kDaアミノデキストランを活性化する。該反応混合液を110分間にわたり20℃でインキュベートする。G25M Sephadex培地を用いて5mMのEDTA、PBS(pH7.3)内へ該チオール活性化アミノデキストランを脱塩させる。Ellmanアッセイを使用してチオール:アミノデキストランの取り込み比を決定する。
4. 25モル等量のマレイミド活性化抗hCG抗体をチオール活性化アミノデキストランへ加え、この反応混合液を16時間にわたり15℃でインキュベートする。1,000倍等量のN−エチルマレイミドを用いて該反応混合物をクエンチする。溶離剤として50mM PBS(pH7.2)を用いて2.6×50cmのSuperdex 200PGカラム上でコンジュゲートを精製する。コンジュゲートの濃度および収率を決定し、次に0.2μmのMinisartフィルターに通して濾過する。
5. 最後に、70μLの抗hCGアミノデキストランコンジュゲート(21.6ng/μL)を「合成尿」(すなわち、約4.5g/LのKCI、7.5g/LのNaCl、4.8g/Lのリン酸ナトリウム(一塩基性)、18.2g/Lの尿素、2g/Lのクレアチニン、50mg/LのHAS)中の30μLのhCG溶液(178.5IU/mL)を結合することによってhCGを用いて該抗hCGアミノデキストランコンジュゲートを「予備飽和」させ、4℃で30分間インキュベートする。
膜材料は、以下のサイズに切断した:
1. ウイック、例えばコンジュゲートリリースパッド8964(Ahlstrom社)、20mm×50mm。
2. 第1凝集捕獲膜、例えばFusion 5(Whatman社)、4mm×50mm。
3. 中間膜、例えばコンジュゲートリリースパッド8964(Ahlstrom社)、10mm×50mm。
4. 遊離画分濃縮膜、例えば、Z−bind PES膜0.2μm(PALL社)、3mm×50mm。
5. 吸収シンク、例えば、吸収パッド222(Ahlstrom社)、50mm×50mm。
6. 粘着性プラスチック(×2)、例えばD/C親水性PSAを備える0.04’’の透明ポリエスエル(G&L社) 70mm×100mm。
膜材料は、以下のサイズに切断した:
1. ウイック/分離膜、例えばコンジュゲートリリースパッド8964(Ahlstrom社)、100mm×50mm。
2. 遊離画分濃縮膜、例えば、Z−bind PES膜0.2μm(PALL社)、4mm×50mm。
3. 吸収シンク、例えば、吸収パッド222(Ahlstrom社)、10mm×50mm。
4. 粘着性プラスチック(×2)、例えばD/C親水性PSAを備える0.04’’の透明ポリエスエル(G&L社)70mm×120mm。
1. 2μLの1(w/v)%固体の抗FITCラテックス(実施例1に記載したように社内で調製した)を1μLのフルオレセイン溶液と混合し、室温で10分間インキュベートした。
2. リン酸緩衝食塩液(pH7.4)中の1μLの30ng/μLのFITC−デキストラン「ハブ」を上記の混合液に加え、さらに5分間インキュベートした。
3. 上記の反応混合液を次に第1凝集捕獲膜(実施例4に記載したように組み立てた)を備える試験ストリップの近位「ウイック」端に適用し、次に約300μLのラテックス希釈緩衝液(Omega Diagnostics社、英国アルバ)を、100μLずつ3ショットで適用した。
試験は、クロマトグラフィー凝集物分離膜(実施例5に記載したように調製した)を備える試験ストリップを使用して、実施例6に記載したように実施した。
1. ヒツジFITC抗血清は、(下記に示すように)正常ヒツジ血清(Micropharm社、英国カーマーゼンシャー)中で希釈した。
2. 1μLの各希釈抗血清を1μLのFITC−デキストラン「ハブ」(リン酸緩衝食塩液(pH7.4)中の10ng/μL)と混合し、室温で10分間にわたりインキュベートした。
3. 2μLの1(w/v)%固体の抗FITCラテックス(実施例1に記載したように社内で調製した)を上記の混合液に加え、さらに5分間インキュベートした。
4. 上記の反応混合液を次に第1凝集物捕獲膜(実施例4に記載したように組み立てた)を備える試験ストリップの近位「ウイック」端に適用し、次に約300μLのリン酸緩衝食塩液(pH7.4)を、100μLずつ3ショットで適用した。
1. ヒツジFITC抗血清は、(下記に示すように)正常ヒツジ血清(Micropharm社、英国カーマーゼンシャー)中で希釈した。
2. 1μLのFITC−デキストラン「ハブ」(リン酸緩衝食塩液(pH7.4)中の30ng/μL)を1μLの1:100のFITC抗血清と混合し、室温で10分間にわたりプレインキュベートした。
3. 1μLの各希釈抗血清を2μLのプレインキュベートしたFITC−デキストラン「ハブ」(上記)へ加え、室温で10分間にわたりインキュベートした。
4. 2μLの1(w/v)%固体の抗FITCラテックス(実施例1に記載したように社内で調製した)を上記の混合液に加え、さらに5分間インキュベートした。
5. 上記の反応混合液を次に第1凝集物捕獲膜(実施例4に記載したように組み立てた)を備える試験ストリップの近位「ウイック」端に適用し、次に約300μLのリン酸緩衝食塩液(pH7.4)を、100μLずつ3ショットで適用した。
1. 抗hCGラテックス(2μL)(実施例2に記載したように調製した)を、hCG(「サンプル」)を含有する2μLの合成尿(実施例3を参照されたい)と混合し、室温で10分間にわたりインキュベートした。
2. 予備飽和させたhCGハブ試薬(4μL)(実施例3に記載したように調製した)を上記の混合液と結合し、2〜5分間反応させた。
3. 上記の反応混合液を次に該第1凝集物捕獲膜(第1凝集物捕獲膜のサイズを3mm×50mmに縮小したことを除けば、実施例4に記載したように組み立てた)を備える試験ストリップの該近位「ウイック」端に適用し、次に約300μLのラテックス希釈緩衝液(上記参照)を、100μLずつの3ショットで適用した。
Claims (38)
- サンプル中の分析物を検出するための飽和アッセイを実施する方法であって、競合的結合事象の結果として生じる標識試薬の遊離画分または未結合画分が、指定された捕獲ゾーンで濃縮されるステップを含むことを特徴とする、方法。
- 前記飽和アッセイは、
a.標識分析物結合試薬に対する前記分析物と未標識分析物アナログとの競合的結合ステップと、
b.分析物アナログに結合した標識分析物結合試薬の画分を、結合していない標識分析物結合試薬の遊離画分から分離するステップと、
c.標識分析物結合試薬の前記遊離画分を固定化および濃縮するステップと、
d.固定化および濃縮した標識分析物結合試薬の遊離画分を検出するステップと
を含むイムノアッセイである、請求項1に記載の方法。 - 前記飽和アッセイは、
a.標識分析物結合試薬に対する前記分析物と未標識多価分析物アナログとの競合的結合ステップと、
b.標識分析物結合試薬の凝集画分と非凝集画分とを分離するステップと、
c.標識分析物結合試薬の前記非凝集画分の固定化および濃縮するステップと、
d.固定化および濃縮した標識分析物結合試薬を検出するステップと
を含む凝集アッセイである、請求項1または2に記載の方法。 - 前記飽和イムノアッセイは、
a.未標識分析物結合試薬に対する前記分析物と標識分析物アナログとの競合的結合ステップと、
b.分析物結合試薬に結合した標識分析物アナログの画分を、結合していない標識分析物アナログの遊離画分から分離するステップと、
c.標識分析物アナログの前記遊離画分の固定化および濃縮するステップと、
d.固定化および濃縮した標識分析物アナログの遊離画分を検出するステップと
を含むイムノアッセイである、請求項1に記載の方法。 - 前記飽和イムノアッセイは、
a.未標識分析物結合試薬に対する前記分析物と標識多価分析物アナログとの競合的結合ステップと、
b.標識多価分析物アナログの凝集画分と非凝集画分とを分離するステップと、
c.標識多価分析物アナログの前記非凝集画分を固定化および濃縮するステップと、
d.固定化および濃縮した標識多価分析物アナログの非凝集画分を検出するステップと
を含む凝集アッセイである、請求項1または4に記載の方法。 - 凝集画分と非凝集画分とが、前記凝集画分が固定化される手段によって分離される、請求項3または5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記凝集画分は、前記凝集画分を排除する孔径の毛細管膜を含む第1捕獲ゾーンによって固定化される、請求項6に記載の方法。
- 前記結合画分または凝集画分は、固定化された分析物結合試薬または他のリガンドによって固定化される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記凝集画分と非凝集画分とが、多孔性膜を通る溶媒流によるクロマトグラフィーにより分離される、請求項6に記載の方法。
- 前記標識分析物結合試薬の未凝集画分または未結合遊離画分は、前記標識試薬を排除孔径の毛細管膜を含む第2捕獲ゾーンによって固定化および濃縮される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標識試薬は、検出可能な成分を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記標識試薬の未凝集画分または未結合遊離画分は、固定化された分析物結合試薬もしくはリガンドまたは他の同族結合パートナーを含む第2捕獲ゾーンによって固定化および濃縮される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 第2捕獲ゾーンによって固定化および濃縮された前記標識分析物結合試薬の未凝集画分または未結合遊離画分は、視覚的に検出可能な指標である、請求項12に記載の方法。
- 前記検出可能な分析物は抗体であり、前記分析物結合試薬は抗原、抗原アナログ、ハプテン、ハプテンアナログまたは測定対象の抗体に対する特異性を備える2次抗体からなるリストから選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- サンプル中の分析物を検出するために飽和アッセイを実施するためのキットであって、a.競合的結合ステップの結合生成物と未結合生成物とを分離するための手段と、
b.第2捕獲ゾーンと
を含むキット。 - 多孔性担体をさらに含む、請求項15に記載のキット。
- 競合的結合ステップの結合生成物と未結合生成物とを分離するための前記手段は、第1捕獲ゾーンを含む、請求項15または16のいずれか一項に記載のキット。
- 生物学的または非生物学的である検出可能な成分を含む、請求項15〜17のいずれか一項に記載のキット。
- 前記検出可能な成分は、微生物、細胞、高分子、金属ゾル粒子、ビーズ、木炭、カオリナイト、ベントナイト、またはラテックスビーズを含む、請求項18に記載のキット。
- 前記検出可能な成分は、金コロイドを含む、請求項19に記載のキット。
- 前記飽和アッセイは凝集イムノアッセイであり、前記第1捕獲ゾーンは凝集画分を固定化するための手段を含む、請求項15〜20のいずれか一項に記載のキット。
- 前記検出可能な成分は、凝集可能である、請求項15〜21のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1捕獲ゾーンは、前記凝集画分を排除する孔径の毛細管膜を含む、請求項21または22のいずれか一項に記載のキット。
- 競合的結合ステップの結合画分と未結合画分とを分離するための前記手段は、粒径に基づいて結合生成物と未結合生成物とをクロマトグラフィー分離できる孔径の毛細管膜を含む、請求項15〜23のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第2捕獲ゾーンは、標識分析物結合試薬の遊離画分を固定化および濃縮するための手段を含む、請求項15〜24のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第2捕獲ゾーンは、非凝集画分を排除する孔径の毛細管膜を含む、請求項25に記載のキット。
- 前記第2捕獲ゾーンは、固定化した分析物結合試薬もしくはリガンドまたは他の同族結合パートナーを含む、請求項26に記載のキット。
- a.複数の分析物アナログ成分が結合しているハブと、
b.前記分析物アナログ成分に結合できる複数の分析物結合試薬と
をさらに含む、請求項15〜27のいずれか一項に記載のキット。 - a.複数の分析物結合試薬が結合しているハブと、
b.前記分析物結合試薬に結合できる複数の分析物アナログ成分を含むシグナル粒子と
をさらに含む、請求項15〜28のいずれか一項に記載のキット。 - 緩衝液、適用手段、取扱説明書、チャート、乾燥剤、対照サンプル、色素、バッテリーおよび/またはシグナル処理/ディスプレイ手段をさらに含む、請求項15〜29のいずれか一項に記載のキット。
- 前記多孔性担体は、固体マトリックスであり、好ましくは繊維性である、請求項15〜30のいずれか一項に記載のキット。
- 前記多孔性担体は、繊維性である、請求項31に記載のキット。
- 前記第1捕獲ゾーンの上流の孔径は、ハブ、標識試薬、サンプルおよび任意の凝集物の自由な移動を許容するために十分な大きさである、請求項28〜32のいずれか一項に記載のキット。
- サンプル中の分析物を検出するために飽和凝集アッセイを実施するためのデバイスであって、前記デバイスは担体を含み、前記担体はサンプルを受け入れるための近位端と、前記サンプルが前記担体に従って移動できる方向にある遠位端とを含み、このとき前記担体は、
a.凝集画分を排除する手段を含む第1捕獲ゾーンと、
b.標識試薬を排除する手段を含む第2捕獲ゾーンと
を含むデバイス。 - 前記担体は、多孔性である、請求項34に記載のデバイス。
- 前記第1および/または第2捕獲ゾーンは、凝集画分もしくは標識試薬を各々排除する孔径の毛細管膜を含む、請求項35に記載のデバイス。
- 外箱または容器内に収容される、請求項34、35または36のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、手持ち型である、請求項37に記載のデバイス。
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