NO20110895A1

NO20110895A1 - Kompetitive S100A9 immunoanalyser

Info

Publication number: NO20110895A1
Application number: NO20110895A
Authority: NO
Inventors: Magne Fagerhol
Original assignee: Magne Fagerhol
Priority date: 2011-06-21
Filing date: 2011-06-21
Publication date: 2012-12-24
Also published as: WO2012175616A1; EP2724159A1; US20140227725A1

Abstract

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for bestemmelse av konsentrasjonen av kalprotektin i en prøve. E lateralt flow-test sett og testelementer som benytter nevnte fremgangsmåte blir også tileiebrakt.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører en kompetitiv Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) og kompetitive Lateral Flow rapid Tests (LFT) for påvisning av proteinene S100A9 og kalprotektin.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Kalprotektin tilhører S100-familien av proteiner. Navnet stammer fra det faktumet at de er resistente mot presipitering med ammoniumsulfat slik at de er løselige til og med i 100 prosent mettet (dermed 100S) løsning. Det er antatt at de har blitt utviklet ved et stort antall punktmutasjoner, men mange aminosyresekvenshomologier er tilbake. Av denne grunnen kan noen antistoffer binde til epitoper som er felles for mange eller i det minste flere S100-proteiner. Et felles trekk for disse proteinene er at de kan binde kalsium og sink og derved bli resistente overfor enzymatisk nedbrytning, og detter spesifikt tilfellet for kalprotektin. I nærværet av kalsium vil kalprotektin danne dimerer, mens S100A12 (Al2) vil danne oligomerer, for det meste dimerer, tetramerer og heksamerer. Kalprotektin er en heterotrimer bestående av to subenheter kalt S100A9 (A9) og én kalt S100A8 (A8). Det har blitt funnet at hver av disse subenhetene kan binde to kalsiummolekyler, dvs., totalt seks per kalprotektinmolekyl.

Subenhetene og deres gener ble fullstendig sekvensert sent på 1980-tallet og er slik velkjente på fagområdet (Odink et al., "Two calcium-binding proteins in infiltrate macrophages of rheumatoid arthritis", Nature, 1987 Nov 5-11; 330 (6143): 80-2 Lagasse et al., "cloning and expression of two human genes encoding calcium-binding proteins that are regulated during myeloid differentiation," Mol. Cell Biol. 1988 Jun; 8(6): 2402-10, Andersson et al., "The leucocyte LI Protein: identity with the cystic fibrosis antigen and the calcium-binding MRP-8 and MRP-14 macrophage components, " Scand. J. Immunol., Aug; 28(2): 241-5 (1988). Krystallstrukturen for subenhetene har også blitt bestemt, (Itou et al., "The crystal structure of human MRP14 (S100A9), a Ca(2+)-dependent regulator protein in inflammatory process." J Mol. Biol. 2002 Feb 15; 316(2):265-76, Itou et al., "Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of human calcium-binding protein MRP14 (S100A9)". Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2001 Aug; 57(pt 8): 1174-6, Moncrief et al., "Evolution of EF-hand calcium-modulated protein. I. Relationship based on amino acid sequence," J. Mol. Evol., June; 30(6): 522-62 (1990), Raftery et al., "Overexpression, oxidative refolding, and zinc binding of recombinant forms of the murine Sl00 protein MRP14 (S100A9)," Protein Expr. Purif. 1999 Mar; 15(2): 228-35, Raftery et al., "Isolation of the murine S100 protein MRP14 (14 kDa migration-inhbitory-factor-related protein) from activated spleen cells: characterization of post-translation modifications and zinc binding," Biochem. J., May 15; 316 (Ptl): 285-93 (1996), Loomans et al., "Histidine-based zinc-binding sequence and the antimicrobial activity of calprotectin," J. Infect. Dis. Mar; 177(3): 812-4 (1998), Rety et al., "Structural basis of the Ca(2+)-dependent association between S100C (S100A11) and its targets, the N-terminal part of annexin I," Structure Fold. Des. 2000 Feb 15; 8(2): 175-84.

Både kalprotektin og S100A12 er rikt forekommende i nøytrofile granulocytter og monocytter og blir frigjort fra disse cellene under inflammasjon, celleskade eller celledød. De er derfor funnet i økt konsentrasjon i blod, andre kroppsvæsker, utskillinger og ekskresjoner under inflammasjon, for hvilken de kan være nyttige markører.

Kalprotektin kan bli benyttet som en markør for et antall sykdommer der høye nivåer av kalprotektinaktivitet kjennetegner sykdommen. Slike sykdommer inkluderer, men er ikke begrenset til, inflammatorisk tarmsykdom, reumatoid artritt, cystisk fibrose, inflammatorisk dermatose, leversykdom, nevrodegenerative sykdommer, Alzheimers sykdom, demens, multippel sklerose og kreft.

En viktig forutsetning for kvantitative immunanalyser er at analyttkalibratorene bør ha den samme molekylære konfigurasjonen som den i testprøven. Kalprotektin, som er et vanlig forekommende protein i cytosol i nøytrofile granulocytter, er en heterodimer av én S100A8- og to Sl00A9-subenheter. Strukturen på dette proteinet i leukocyttekstrakter har blitt bestemt ved elektroforese, isoelektrisk fokusering, ionebytterkromatografi, gelfiltrering, sirkulær dikroisme, likevektsdialyse og analytisk ultrasentrifugering (Fagerhol et al., 1980, Dale et al., 1983, Næss-Andersen et al., 1995, Berntzen & Fagerhol, 1990, Berntzen et al., 1988 og oppsummert i bokkapittelet av Fagerhol et al., 1990). I nærvær av kalsium i relativt lave konsentrasjoner, for eksempel 2 med mer, blir en dimer form bestående av to trimerer generert. Ved immunisering av dyr, for eksempel kaniner, så vil antistoffer mot flere epitoper på S100A8 og S100A9 bli generert. Selv om testantistoffene kun reagerer med én epitop på hver av de to subenhetene så vil signalet i immunanalyser, for eksempel ELISA, være sterkere (teoretisk doblet) dersom kalprotektin er til stede som en dobbel heterotrimer sammenlignet med den enkle heterotrimeren i fraværet av kalsium. Da en analyse for kalprotektin i avføringsprøver ble utviklet (Røseth et al., 1992) ble det funnet at anvendelse av en enkel ekstraheringsbuffer, for eksempel fosfatbufret saltløsning, pH 7,4, så ble kun omtrent 15 prosent av det totale kalprotektinet funnet i ekstraktet, og prøven måtte ekstraheres på nytt flere ganger for å oppnå nært opp til 100 % utbytte. Når ekstrakter ble kjørt på gelfiltrering (gelpermeasjonskromatografi) ble omtrent 90 % av anti-kalprotektinaktiviteten funnet 100 til 1000 kDa-regionen, noe som tyder på at kalprotektin i avføringsprøver stort sett foreligger i høymolekylærstørrelseskomplekser. Ved anvendelse av en forbedret avføringsekstraheringsbuffer (Ton et al., Improved Assay for Fecal Calprotectin, Clin. Chem. Acta 292:41-54 (2000)) økte utbyttet av kalprotektin signifikant 41- 70 100 %, med et gjennomsnitt på omtrent 78 %. Ved å kjøre et ekstrakt som var fremskaffet ved denne fremgangsmåten på en gelfiltreringskolonne og benytte en buffer med kalsium ble kalprotektinaktivitet for det meste funnet i 60 til 80 kDa-fraksjonene tilsvarende størrelsen på en dobbel heterotrimer, se figur 1. I prøver med lavere utbytter ble reaktivitet også funnet i mye høyere molekylære størrelsesfraksjoner. Åpenbart er det store forskjeller mellom det native kalprotektinet som er renset fra leukocytter og det som foreligger i avføringsekstrakter og til og med mellom ekstrakter fra ulike individer. En annen viktig forskjell har blitt funnet, nemlig at kalprotektin i avføringsprøver ikke reagerer med et spesifikt, monoklonalt antistoff mot S100A8-subenheten, i motsetning til sterkere reaksjoner mot nativt i tillegg til rekombinant kalprotektin. Dette bør teoretisk gi falskt lave verdier når avføringsekstrakter kjøres i immunanalyser, for eksempel ELISA, når det benyttes antistoffer som reagerer med både S100A8 og S100A9 og nativt kalprotektin i kalibratorene. Dette har blitt underbygget ved omfattende eksperimenter der antistoffer, både monoklonale antistoffer og polyklonale antistoffer, har blitt forsøkt. En ytterligere kilde for feil i estimatene er at noen epitoper på kalprotektin kan være endret eller gjemt i de store kompleksene som det er referert til ovenfor.

En annen feilkilde i målingen av analytter slik som kalprotektin i immunanalyser slik som sandwich-immunanalyser er høydose-hook-effekten. Høydose-hook-effekten refererer til målte nivåer av antigen som oppviser en signifikant lavere absorbans enn det faktiske nivået som er til stede i en prøve. Dette skjer når en "enkeltrinns"-ELISA-analyse blir benyttet, dvs., standardene/prøvene blir inkubert sammen med det enzymkonjugerte antistoffet. Ved en svært høy konsentrasjon av prøveantigen vil de fleste antigenbindingssetene på konjugatet være okkupert, for derved å forhindre dannelsen av "sandwichen" som er utsatt for påvisning i immunanalysen. "Sandwichen" består av antigen bundet til to antistoffmolekyler, og typisk er ett av disse antistoffmolekylene umerket og bundet til en fast bærer, mens det andre antistoffmolekylet er merket med et påvisbart merke. De antigenmettede påvisningsantistoffene i løsning vil bli vasket av og gi falskt lave signaler. En "hook" blir observert ved at standardkurven faller av ved antigenkonsentrasjoner over et visst nivå, for eksempel 10 000 ng/ml, når data blir plottet som et signal versus antigenkonsentrasjon. Den mulige eksistensen av en høydose-hook-effekt er svært signifikant med hensyn på anvendelsen av kalprotektinkonsentrasjoner til diagnostiseringen eller overvåkningen av inflammatorisk tarmsykdom, som i tilfellet der en kalprotektinkonsentrasjon i en avføringsprøve er høy nok til å utløse høydose-hook-effekten så vil den bli ukorrekt målt som en lav konsentrasjon av kalprotektin. Risikoen for en hook-effekt i enkeltrinns-ELISA eller raskt test for kalprotektin er høyere enn for mange andre markører fordi nivåene i avføring kan være så høy som 90 000 ug/l, noe som er nesten 2000 ganger den øvre, normale grensen. Feil forårsaket av en hook-effekt vil forårsake at en riktig diagnostisering av inflammatorisk tarmsykdom misslykkes. Den kliniske konsekvensen av denne feilen er signifikant fordi slike pasienter da vil bli antatt å ikke være rammet av inflammatorisk tarmsykdom, men heller en mindre alvorlig tilstand slik som irritert tarmsyndrom. De vil da bli gitt feil behandling og deres inflammatoriske tarmsykdom vil forbli ubehandlet og føre til komplikasjoner som til og med kan kreve kirurgi.

Kalprotektin er anerkjent som den mest praktiske og spesifikke biomarkøren for diagnostiseringen, påvisningen eller overvåkningen av inflammatorisk tarmsykdom. Selv om et antall analyser for kalprotektin er kjent er det et behov for en forbedret analyse for kalprotektin som er spesifikk for kalprotektin og har et bredt dynamisk område, slik at den ikke er utsatt for interferens som kan forekomme. I tillegg er det et behov for en forbedret analyse for kalprotektin som er svært spesifikk for kalprotektin og som kan skille kalprotektin fra andre nært beslektede Sl 00-proteiner. Videre er det et behov for en forbedret kalprotektinanalyse som kan gi resultater mye raskere enn de som per i dag er tilgjengelige på markedet, og kan unngå en høydose-hook-effekt.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser tilstedeværelsen av kalprotektinreaktivitet i serum og i et avføringsekstrakt som er kjørt på en kolonne for gelpermeasjonskromatografi (GPC) som er i stand til å separere proteiner i overensstemmelse med deres molekylstørrelse. I serum eluerte kalprotektin tilsvarende 60 til 80 kDa, dvs., nært albumin. Noen kalprotektinmolekyler eluerer likevel ved omtrent 100 kDa. I andre avføringsekstrakter eluerte kalprotektin i høymolekylærstørrelsesfraksjoner tilsvarende 100 til 1000 kDa eller høyere, noe som tyder på signifikant heterogenitet for kalprotektin i avføring. Figur 2 viser en standardkurve som er oppnådd når det er benyttet et enkelt, spesifikt, monoklonalt S100A9-antistoff til belegning av brønner og et polyklonalt antistoff-enzym-konjugat. Figur 3 viser korrelasjonen mellom estimater for avføringsekstrakter ved å benytte rekombinant kalprotektin eller S100A9 som standard. Figur 4a viser et lateralt flow-test oppsett. Oppsettet består av en nitrocelluloseremse (1) festet til en rigid, inert plastikkmembran (2). En løsning med S100A9 blir påført som en linje på tvers av remsen i posisjon (3). En linje med esel-IgG blir påført i posisjon (4). Når testen blir utført blir den første enden av remsen satt i vertikal posisjon i en mikrobrønn inneholdende en blanding av prøve og kolloid gullmerkede antistoffer mot S100A9 for testlinjen (3) og merkede antistoffer mot esel-IgG for kontrollinjen (4). Etter noen få minutter har prøven og antistoffene diffundert oppover inn i remsen, og binding av merkede antistoffer vil generere farget linje på posisjon (3) for kalprotektin/S100A9 og på posisjon (4) for kontrollen. (6) er en pute med absorberende materiale, for eksempel vannabsorberende papir. Figur 4b viser et alternativt lateralt flow-test oppsett der en ytterligere "prøvepute" (5) som inneholder tørkede, merkede antistoffer blir festet til den første enden av remsen, på hvilke prøver kan bli påsatt mens remsen holdes horisontalt. Figur 5 viser test- og kontrollinjen på remser tilsatt S100A9 i ulike mengder sammen med merket anti-S100A9 og merket anti-esel-IgG. Fargingsintensiteten på testlinjen minsker med økende konsentrasjon av S100A9 mens fargen på kontrollinjen øker med økende konsentrasjon av S100A9. Figur 6 viser en sammenligning av fekale kalprotektinverdier oppnådd med de kompetitive S100A9-fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse og den opprinnelige ELISA-testen.

Figur 7 viser en kompetitiv lateral flow-test for kalprotektin.

Figur 8 er en standardkurve for kompetitiv lateral flow rapid-test med kalprotektin.

Oppsummering av oppfinnelsen

Oppfinnelsen beskriver kompetitiv immunanalyse for påvisning og kvantifisering av det leukocyttavledede proteinet kalprotektin og dets subenhet S100A9 i humane prøver eller dyreprøver. Fremgangsmåtene har brede analysegrenser, gir resultater i løpet av ti til 40 minutter, unngår hook-effekter og krever et enkelt monoklonalt antistoff. Det siste har blitt nøye selektert for å reagere med en antigen epitop som foreligger på kalprotektin i avføringsekstrakter.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Overraskende har det blitt funnet at noen av problemene som er nevnt ovenfor kan bli løst ved å benytte antistoffer mot kun S100A9. En enda mer streng S100A9/anti-S100A9-metodikk kan bli basert på en kompetitiv immunanalyse, for eksempel ELISA, der S100A9 heller enn antistoffer blir benyttet til innfanging, for eksempel til belegning av mikrobrønner.

Tilfredsstillende ga en slik kompetitiv analyse en fin standardkurve, verdier i avføringsekstrakter som var sammenlignbare med de som er oppnådd når den opprinnelige kalprotektin-ELISA-testen benyttes (Røseth et al., 1992) og eliminerte problemet med hook-effekt (antigenoverskudd) som er typisk for andre "enkeltrinns- eller inkuberingsfremgangsmåter". Videre har systemet basert på ideene som er nevnt ovenfor også andre fortrinn: analysen tar kun omtrent 30 minutter sammenlignet med omtrent tre timer for standard-ELISA-tester, forbruket av reagenser er lavt, rekombinant S100A9 kan bli benyttet til innfanging (for eksempel til belegning av brønner), rekombinant kalprotektin eller S100A9, begge i stor tilførsel, kan bli benyttet som kalibratorer, og selekterte monoklonale antistoffer er også rikt tilgjengelige. De monoklonale antistoffene må bli selektert ved tester som viser ikke-reaktivitet mot S100A8 og S100A12, men god reaktivitet mot et panel av avføringsekstrakter fra et stort antall IBD-pasienter. Antistoffer som reagerer med normalt kalprotektin og S100A9 men ikke med kalprotektinmolekyler fra avføring som mangler noen S100A9-epitoper i avføringsekstrakter må bli unngått. Et ytterligere fortrinn ved systemet er at forsinket tilsetning av prøver/kalibratorer til noen brønner vil ha mindre effekt på verdiene sammenlignet med vanlig benyttede sandwich-ELISA-tester. I disse er brønner belagt med antistoffer og kalibratorer/prøver blir inkubert først, etterfulgt av vasking og en andre inkubering med et enzymmerket antistoff, men det vil ta flere minutter å tilsette prøver til alle 96 brønnene på platen, slik at de som er tilsatt sent vil ha kortere inkuberingsperiode og derfor gi falskt lave resultater.

Uventet har det blitt funnet at en forbedret immunanalyse for kalprotektin som er effektiv i bestemmelse av konsentrasjonen av kalprotektin i avføringsprøver, slik som vil bli benyttet i klinisk praksis, og at som ikke er utsatt for høydose-hook-effekten som kan påvirke sandwich-immunanalyser, som benytter prinsippet med en kompetitiv immunanalyse ved å benytte immobilisert S100A9 og merket anti-S100A9-antistoff.

I en slik kompetitiv immunanalyse konkurrerer S100A9-subenheten på kalprotektin i prøven med det immobiliserte S100A9 i brønnene om binding til en begrenset mengde av det merkede anti-S100A9-antistoffet som er tilsatt. Fordi kun merket anti-S100A9-antistoff bundet til det immobiliserte S100A9 til slutt blir påvist i en slik kompetitiv immunanalyse er det slik at jo høyere konsentrasjonen av kalprotektin er i prøven jo mindre merket antistoff vil være bundet til den faste bæreren. En standardkurve kan da bli konstruert ved å benytte passende kalibratorer, og standardkurven vil gjenspeile egenskapene til en kompetitiv immunanalyse der et lavere signal som påvises indikerer en høyere konsentrasjon av analytt slik som S100A9.

Den kompetitive immunanalysen for kalprotektin benytter immobilisert S100A9 på en fast bærer. Selv om S100A9 kan bli isolert og renset fra kalprotektin i leukocyttekstrakter er dette teknisk krevende og krever rensefremgangsmåter som ikke er standard (Berntzen, H.B. & Fagerhol, M.K., LI, a major granulocyte protein; isolation of high quantities of its subunits, Scand. J. Clin. Invest, 1990:50(7):769-74), og anvendelsen av rekombinant S100A9 har som beskrevet nedenfor mange fortrinn. Videre kan som et alternativ peptider med en aminosyresekvens identisk med den for den antigene epitopen på S100A9 bli syntetisert og benyttet til immobilisering på den faste bæreren. Ved dannelse av mange ulike monoklonale antistoffer kan et monoklonalt antistoff bli valgt som vil reagere med humant S100A9 i tillegg til dyre-S100A9 fordi det er mange aminosyresekvenshomologier mellom arter.

I den kompetitive immunanalysen for kalprotektin kan antistoffet som spesifikt binder S100A9 være et polyklonalt antistoff eller et monoklonalt antistoff. Som beskrevet nedenfor er likevel monoklonale antistoffer foretrukket fordi di er mye mer uniforme og tilgjengelige i store mengder og muliggjør bedre standardisering av kommersielle sett. Det er foretrukket å benytte et monoklonalt antistoff som spesifikt binder S100A9, dvs., uten kryssreaksjon med beslektede proteiner slik som S100A8 eller S100A12, og som spesielt binder til en epitop som er til stede på kalprotektin i avføringsprøver.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan ulike formater bli benyttet i utøvelsen av analysen. I ett format blir en plattform tilsvarende den som typisk blir benyttet for ELISA-analyser benyttet, som her blir betegnet "fastfase-plattform", der S100A9 er bundet til den faste bæreren og deretter blir prøve og merket antistoff tilsatt sammen med den faste bæreren etter et vasketrinn. Det immobiliserte S100A9 og alt eventuelt fritt S100A9 i prøven blir deretter tillatt å reagere og konkurrere om den begrensede mengden med merket antistoff som er tilsatt. Etter at alt eventuelt S100A9 i prøven har blitt tillatt å reagere og konkurrere om binding av det merkede anti-S100A9-antistoffet med det immobiliserte S100A9 bundet til den faste bæreren så blir et vasketrinn utført for å fjerne ubundet antistoff. Merket antistoff bundet til den faste bæreren blir deretter påvist. Alternativer for dette analyseformatet er beskrevet nedenfor.

I et annet format kan en lateral-flow-plattform eller flow-through-plattform bli benyttet slik det generelt er kjent på fagområdet, der det alternative lateral-flow-plattformen her er designet som "lateral flow-test (LFT)", og strømmen gjennom blir betegnet FTT. I lateral-flow-plattform formatet blir immobilisert S100A9 bundet i en definert påvisningssone i én del av en testremse som er permeabel for prøve og for mobilt. Merket antistoff. Prøven og det mobile, merkede antistoffet blir deretter påført testremsen og tillatt å migrere gjennom testremsen slik at ethvert S100A9 ti stede i kalprotektin i prøven konkurrerer om binding til anti-S100A9-antistoffet immobilisert i påvisningssonen på testremsen. Ulike alternativer for påsetting av prøven og det mobile, merkede antistoffet er kjent på fagområdet. Mengden av merket antistoff bundet til påvisningssonen blir deretter bestemt for å tilveiebringe en indikasjon på mengden av kalprotektin i prøven. I FTT-alternativet er S100A9 festet og immobilisert på en permeabel membran, for eksempel nitrocellulose, med porer med en størrelse som er stor nok for å tillate reagenser, inkludert antistoffer, å strømme gjennom under prosedyren. En blanding av merket anti-S100A9 og prøve blir påsatt på membranen og S100A9 eller kalprotektin i prøven eller standarden og det immobiliserte S100A9 vil konkurrere om binding til det merkede antistoffet. Ved å velge en passende mengde med slikt antistoff vil mengden som binder til membranen være inverst proporsjonal med mengden S100A9eller kalprotektin i prøven. Merket på antistoffet kan være kolloide gullpartikler, kolloide sølvpartikler, fargede partikler av ethvert materiale, for eksempel, men ikke begrenset til, lateks, magnetiske partikler eller partikler som kan bli stimulert, for eksempel ved eksponering overfor UV-lys, for å sende ut lyspartikler som kan bli registrert med et instrument. I tilfellet at gull, sølv eller fargede partikler blir benyttet kan fargeintensiteten på påvisningssonen bli registrert med et spektrofotometer. En standardkurve for fargeintensitetene gitt når kalibrator med ulike S100A9-konsentrasjoner blir testet kan bli generert og benyttet i en datamaskin slik at konsentrasjoner av S100A9 eller kalprotektin i prøver kan bli estimert basert på fargingsintensiteten på påvisningssonen sammenlignet med de for kalibratorene ved hjelp av en passende datamaskin og dataprogram.

Selv om renset S100A9 fra nøytrofile granulocytter kan bli benyttet som det immobiliserte S100A9 er det generelt foretrukket å benytte rekombinant S100A9. Et rekombinant S100A9 kan bli produsert med fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet, og typisk kan en DNA-sekvens som tilsvarer genet for S100A9 bli syntetisert og klonet inn i celler, typisk en mikrobe, som kan bli dyrket og som produserer S100A9. Både aminosyresekvensen og DNA-sekvensen til S100A9 er som nevnt før velkjent for fagmannen og fritt tilgjengelig fra genbanker på internett.

Slikt fremstilt og renset rekombinant S100A9 kan bli benyttet i fremstillingen av monoklonale og polyklonale antistoffer ved standardteknikker som er velkjente på fagområdet.

I ett aspekt av oppfinnelsen blir et monoklonalt antistoff mot rekombinant S100A9 tilveiebrakt ved anvendelse av fremgangsmåter dom generelt er kjent på fagområdet.

Selv om isolert og renset S100A9-polypeptid kan bli benyttet som antigen er det generelt foretrukket å benytte rekombinant S100A9-polypeptid. Et passende rekombinant S100A9-protein har sekvensen

Den genomiske DNA-sekvensen som koder for S100A9 er

Sekvensen ifølge SEKV. ID. NR:2 er avledet fra mRNA og ekskluderer derfor introns som eventuelt er til stede i den genomiske sekvensen. En DNA-sekvens som koder for A9 som er passende for uttrykking i Escherichia coli er

i E. coli.

Når det velges en sekvens for den rekombinante fremstillingen av eller syntesen av peptid/peptider så må peptidet reagere med et monoklonalt anti-S100A9. Nevnte monoklonale antistoff må også reagere med kalprotektin / kalprotektinkomp lekser i prøver, for eksempel fekalekstrakter.

Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for bestemmelse av konsentrasjonen av kalprotektin i en prøve som omfatter de følgende trinn:

i) belegge et renset S100A9 på en fast fase,

ii) reagere S100A9 som er belagt på den faste fasen i trinn i) med a) en prøve inneholdende kalprotektin og b) et merket anti-S100A9-antistoff,

iii) vaske den faste fasen etter reaksjonen for å fjerne ikke-bundet kalprotektin, fritt merket anti-S100A9- og kalprotektinmerket anti-S100A9-antistoffkomplekser,

iv) bestemme mengden av merket anti-S100A9-antistoff bundet til den faste fasen og bestemme konsentrasjonen av kalprotektin i prøven,

der mengden S100A9 som er belagt på den faste fasen og mengden av merket anti-S100A9-antistoff er valgt slik at S100A9 som er belagt på den faste fasen og eventuelt kalprotektin i prøven konkurrerer om det merkede anti-S100A9-antistoffet slik at mengden med merket anti-Sl00A9-antistoff bundet til den faste bæreren er inverst relatert til konsentrasjonen av kalprotektin i prøven.

Merket på det merkede anti-S100A9-antistoffet kan være ethvert konvensjonelt merke slik dette er kjent på fagområdet. Når analysen blir utført ved å benytte fastfase-plattformen som beskrevet ovenfor blir generelt et enzymmerke benyttet. Når et enzymmerke benyttes omfatter trinnet med bestemmelse av mengden av merket anti-S100A9-antistoff bundet til den faste fasen trinnet med å inkubere den faste fasen med et substrat for enzymet på det enzymmerkede anti-SlOO-antistoffet.

Et antall passende enzymer er kjent på fagområdet for anvendelse i disse analysene. Disse enzymene inkluderer, men er ikke begrenset til, alkalisk fosfatase, pepperotperoksidase, glukose-6-fosfatdehydrogenase og P-galaktosidase. Andre enzymmerker er også kjent på fagområdet. Slike ytterligere enzymer inkluderer, men er ikke nødvendigvis begrenset til, acetatkinase, P-laktamase, glukoseoksidase, ildflue-luciferase, Renilla-luciferase og xantinoksidase. Enzymmerkede antistoffer kan bli fremstilt med fremgangsmåter som er kjent på fagområdet slik som kovalente koblingsprosedyrer.

I mange tilfeller produserer enzymet på det enzymmerkede antistoffet et produkt som blir påvist og/eller kvantifisert fotometrisk, slik som ved spektroskopi. I noen alternativer produserer likevel enzymene et produkt som blir overvåket og/eller kvantifisert på andre måter, slik som påvisning og/eller kvantifisering med fluorescens, bioluminiscens eller kjemoluminiscens.

Typisk involverer trinnet med belegning av den faste bæreren, for eksempel det indre av mikrobrønner benyttet til ELISA, med S100A9 løst i trisbufret saltløsning med fra omtrent 0,2 mM til 2 mM til stede, slik som kalsiumklorid. Fortrinnsvis er kalsiumkonsentrasjonen fra omtrent 0,5 mM til omtrent 1,5 mM, mer foretrukket er kalsiumkonsentrasjonen omtrent 1 mM. Typisk blir S100A9 inkubert med den faste bæreren ved en konsentrasjon på fra 0,4 ug/ml til omtrent 2 ug/ml, fortrinnsvis en konsentrasjon fra 0,6 ug/ml til omtrent 2 ug/ml, mer foretrukket en konsentrasjon på omtrent 0,8 ug/ml.

Til inkuberingen av den faste bæreren med S100A9 for å binde S100A9 til den faste bæreren så blir fortrinnsvis den faste bæreren tildekket med damptett klebende plastikk og lagret ved en temperatur på omtrent 0 °C til omtrent 10 °C, fortrinnsvis omtrent 5 °C, i en inkuberingsperiode på fra omtrent 6 timer til flere uker. Fortrinnsvis er inkuberingsperioden omtrent 18 timer.

I én utførelsesform av oppfinnelsen, etter trinnet med binding av S100A9-polypeptidet til den faste bæreren, så blir den faste bæreren vasket med trisbufret saltløsning med fra omtrent 0,2 mM til 2 mM kalsium til stede, slik som kalsiumklorid. Fortrinnsvis er kalsiumkonsentrasjonen fra omtrent 0,5 mM til omtrent 1,5 mM, mer foretrukket omtrent 1 mM.

I denne utførelsesform en, etter vasketrinnet, så blir et kondisjoneringstrinn typisk utført på den faste bæreren. I kondisjoneringstrinnet blir den faste bæreren inkubert med en løsning av sukrose og bovint serumalbumin inneholdende en fosfatbuffer, som her refereres til som "SBP-buffer". Typisk er konsentrasjonen av sukrose i SBP-bufferen fra omtrent 1,5 % til omtrent 3,5 %, fortrinnsvis fra omtrent 2,0 % til omtrent 3 %, mer foretrukket omtrent 2,5 %. Typisk er konsentrasjonen av bovint serumalbumin i SBP-bufferen fra omtrent 0,5 % til omtrent 1,5 %, fortrinnsvis fra omtrent 0,75 % til omtrent 1,25 %, mer foretrukket omtrent 1,0 %. Typisk er konsentrasjonen av fosfatbuffer i SBP-bufferen fra omtrent 5 mM til omtrent 15 mM, fortrinnsvis fra omtrent 7,5 mM til omtrent 12,5 mM, mer foretrukket omtrent 10 mM. Typisk er pH i fosfatbufferen fra omtrent 7,5 til omtrent 8,5, fortrinnsvis fra omtrent 7,8 til omtrent 8,2, mer foretrukket omtrent 8,0. I kondisjoneringstrinnet blir typisk den faste bæreren inkubert med SBP-buffer ved romtemperatur (20-25 °C) i omtrent 15 minutter til omtrent 45 minutter, fortrinnsvis omtrent 30 minutter.

Etter kondisjoneringstrinnet blir den faste bæreren vasket med en buffer som her refereres til som "vaskebuffer". Vaskebufferen inneholder Tris, natriumklorid, magnesiumklorid og et kompatibelt biocid slik som Kathon®. Typisk inneholder vaskebufferen fra omtrent 25 mM til omtrent 75 mM Tris, fortrinnsvis fra omtrent 37,5 mM til omtrent 62,5 mM Tris, mer foretrukket omtrent 50 mM Tris. Typisk inneholder vaskebufferen fra omtrent 100 mM til omtrent 200 mM natriumklorid, fortrinnsvis fra omtrent 125 mM til omtrent 175 mM med natriumklorid, mer foretrukket omtrent 150 mM natriumklorid. Typisk inneholder vaskebufferen fra omtrent 0,25 mM til omtrent 0,75 mM magnesiumklorid, fortrinnsvis fra omtrent 0,375 mM til omtrent 0,625 mM magnesiumklorid, mer foretrukket omtrent 0,50 mM magnesiumklorid. Typisk inneholder vaskebufferen fra omtrent 0,5 % til omtrent 1,5 % med kompatibelt biocid slik som Kathon®, fortrinnsvis fra omtrent 0,75 % til omtrent 1,25 % med et kompatibelt biocid slik som Kathon®, mer foretrukket omtrent 1.0 % av et biokompatibelt biocid slik som Kathon®. Typisk er pH i vaskebufferen omtrent 7,5 til omtrent 8,5, fortrinnsvis fra omtrent 7,8 til omtrent 8,2, mer foretrukket omtrent 8,0.

Typisk blir en standardkurve konstruert og konsentrasjonen av kalprotektin blir bestemt ved sammenligning med standardkurven. I ett alternativ er standardkurven konstruert ved å benytte et flertall av konsentrasjoner med renset kalprotektin. I et annet alternativ er standardkurven konstruert ved å benytte et flertall av konsentrasjoner med renset S100A9 slik som det rekombinante S100A9 som er beskrevet ovenfor.

Etter at prøvene og standardene er tilsatt den faste bæreren blir det merkede antistoffet tilsatt til den faste bæreren, og fordi dette er en kompetitiv analyse så er det merkede antistoffet og prøven til stede samtidig og er i kontakt med den faste bæreren på hvilken renset S100A9-polypeptid tidligere har blitt bundet. Etter at det merkede antistoffet er tilsatt blir den faste bæreren, slik som brønnene i en konvensjonell multivegg-ELISA-plate, tildekket med passende dekke, slik som plastikkark eller film, tape eller et lokk og inkubert ved en passende temperatur, slik som romtemperatur (20-25 °C) i omtrent 10 minutter til omtrent 20 minutter, fortrinnsvis i omtrent 15 minutter. Typisk blir inkuberingen utført med horisontal risting ved omtrent 500 rpm. Andre passende inkuberingsbetingelser kan bli benyttet slik dette er kjent på fagområdet.

Deretter blir den faste bæreren vasket. Typisk blir den faste bæreren vasket tre ganger med en vaskebuffer. Dersom det merkede antistoffet er merket med et enzym som produserer et påvisbart produkt blir deretter et substrat for enzymet tilsatt, og dersom enzymet krever kofaktorer blir slike kofaktorer også tilsatt på dette tidspunktet. Passende enzymer inkluderer, men er ikke begrenset til, alkalisk fosfatase, pepperotperoksidase, glukose-6-fosfatdegydrogenase og P-galaktosidase. Substrater i tillegg til enhver påkrevd kofaktor for disse enzymene er velkjent på fagområdet.

Reaksjonen for enzymet med substratet og enhver påkrevd kofaktor blir tillatt å pågå i en periode som er tilstrekkelig for å tillate fremkomsten av en tilstrekkelig mengde med påvisbart produkt av den enzymatiske reaksjonen for å påvise eller bestemme mengden av kalprotektin i prøven. Den passende reaksjonsperioden kan bli bestemt av fagfolk på området basert på faktorer slik som konsentrasjonene av enzym og substrat, maksimal omsetning for enzymet og egenskapene til det fotometriske avlesnings instrumentet som er benyttet.

På slutten av reaksjonsperioden blir den enzymatiske reaksjonen stoppet, typisk ved tilsetning av en syre eller en løsning av natriumhydroksid, avhengig av enzymet som benyttes.

Passende bølgelengder for absorbansbestemmelse for de spesifikke substratene benyttet med kombinasjoner av enzymer og substrater er kjent på fagområdet.

Når analysen som er beskrevet ovenfor blir utført på en konvensjonell ELISA-mikrobrønnplate kan absorbansen bli bestemt ve å benytte en konvensjonell mikrobrønn-ELISA-avleser. Absorbansbestemmelser kan likevel bli utført med andre fremgangsmåter som er kjent på fagområdet og er ikke begrenset til anvendelsen av en konvensjonell ELISA-mikrobrønnavleser.

Analyseprosedyren beskrevet ovenfor er en prosedyre som benytter et enzymmerke. Analyseprosedyren ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til en analyse som benytter et enzymmerke. For eksempel kan et direkte merke slik som et kolloidalt gull- eller søvmerke, fargede partikler, for eksempel laget av lateks eller magnetiske partikler bli benyttet som beskrevet ovenfor. I slike alternativer kan mengden av direkte merke bundet til den faste bæreren bli evaluert med instrumentering som er kjent på fagområdet. Likeledes, dersom merket er et fluorescerende, kjemoluminiscerende eller bioluminiscerende merke så kan mengden av merket bundet til den faste bæreren bli evaluert ved passende optisk instrumentering for påvisningen av fluorescens, kjemoluminiscens eller bioluminiscens.

Analyser ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet til påvisningen og kvantifiseringen av kalprotektin i humane, biologiske materialprøver slik som en fekalprøve, en gastrointestinaltraktusprøve, en blodprøve, for eksempel en serum-eller plasmaprøve, en ryggmargsvæskeprøve, en synovialvæskeprøve, en spyttprøve, en krevikulær tannvæskeprøve, en respiratorietraktus- eller genitaltraktusslimprøve eller en urinprøve. Prøver av dyreopphav kan også bli testet dersom kalprotektin eller S100A9 i dyret kryssreagerer med de humane proteinene når det merkede antistoffet benyttes. Ut fra erfaring kryssreagerer noen antistoffer mot humant kalprotektin med kalprotektin fra primater, hunder og katter. For formålet av testing for kalprotektin eller S100A9 i prøver fra dyr kan rekombinant S100A9 eller peptider derav tilsvarende genene for dyre-kalprotektin bli produsert. Antistoffer kan bli frembrakt og merket som beskrevet ovenfor for det humane proteinet, og de rekombinante proteinene eller peptidene kan bli benyttet til immobilisering på en fast bærer og kalibratorer for kompetitive immunanalyser som beskrevet ovenfor for de humane proteinene.

Når prøven er en fekalprøve eller gastrointestinaltraktusprøve kan prøven bli ekstrahert før utførelse av analysen ifølge prosedyren som er beskrevet i US patent nr. 6,225,072. Denne ekstraheringsprosedyren omfatter: (1) blanding av en liten mengde med prøve (fortrinnsvis 10 til 500 mg og mer foretrukket 20-150 mg, eventuelt forhåndsveid) med en overskuddsmengde av vandig ekstraheringsbuffer (fortrinnsvis i området av et 50 ganger overskudd (volum/volum)), som omfatter minst ett dissosierende, disaggregerende og/eller chelaterende middel, (2) homogenisere prøven (fortrinnsvis ved vortexing) i et lukket rør, (3) separere det faste og flytende materialet i dispersjonen som er resultatet av homogenisering av prøven (fortrinnsvis ved sentrifugering og ytterliggere eller eventuelt ved filtrering), og (4) gjenvinne det så å si klare væskeekstraktet som er resultatet av separasjonen, som inneholder kalprotektin i tillegg til andre proteiner. En passende buffer er en sitratbuffer med en pH på fra omtrent pH 5 til omtrent pH 10. Sitratbufferen kan være den samme sitratbufferen som beskrevet ovenfor. I tillegg til eller istedenfor sitrat kan andre chelatorer bli benyttet. Det dissosierende middelet kan være et middel slik som natriumdodecylsulfat (SDS) eller urea, og ureakonsentrasjon opp til 1 M er spesielt hensiktsmessig. I tillegg kan bufferen inneholde 0,5 % til 2 % bovint serumalbumin (BSA), eventuelt i saltløsning. En alternativ prosedyre for fremstilling av avføringsekstrakter omfatter en innretning utviklet av Roche Company, Tyskland. Den består av et 10 ml plastikkrør i hvilket det er plassert en 1 cm bred og 1,5 cm lang stålspiral. Den siste vil bidra til rask og effektiv oppbrytning av faste partikler i avføringsprøven under vortexing av prøve ved 1000 rpm i minst tre minutter med en passende ekstraheringsbuffer. Ekstraktene som er klargjort slik kan bli benyttet uten sentrifugering.

I analysene ifølge foreliggende oppfinnelse kan generelt enten renset kalprotektin eller renset S100A9-protein (for eksempel rekombinant S100A9) bli benyttet som standard. Ofte er det foretrukket å benytte renset S100A9-protein, spesielt rekombinant S100A9-protein, som kalibrator.

Den oppfunnede, kompetitive immunanalysen har flere fordeler sammenlignet med vanlig benyttede sandwich-ELISA-tester på markedet. 1) De er mye raskere og gir resultater etter omtrent 30 minutter, noe som tillater rask repetert testing dersom det er nødvendig på grunn av tekniske problemer eller feil. 2) Tidsforsinkelse mellom tilsetting av prøve til den første og siste mikrobrønnen har mindre effekt på resultatet sammenlignet med sandwich-ELISA-tester.

3) De har ikke risiko for en hook-effekt.

4) Analyseområdet er større slik at svært få prøver med høy konsentrasjon av kalprotektin trenger å bli testet på nytt i høyere fortynning. 5) Kun ett monoklonalt antistoff selektert for riktig reaktivitet mot kalprotektin i avføringsekstrakter. 6) Begge nøkkelreagenser, nemlig S100A9-proteinet og det monoklonale antistoffet, kan bli tilveiebrakt i store mengder, noe som vil spare tid og kostnader for validering og testing av nye ladninger med disse reagensene. Dette vil føre til store økonomiske besparelser.

I et aspekt av oppfinnelsen blir et lateralt flow-test sett tilveiebrakt. Settet omfatter en testlinje med S100A9 og en kontrollinje med merkede antistoffer mot IgG. I én utførelsesform er den laterale flow-test remsen inneholdt i en beholder.

Også tilveiebrakt ved foreliggende oppfinnelse er et analyttestelement for bestemmelse av konsentrasjonen av kalprotektin i en fysiologisk prøve. Testelementet omfatter merkede, immobiliserte, monoklonale antistoffer mot S100A9 der kalprotektinkonsentrasj onene blir bestemt ved intensiteten på et signal tilveiebrakt ved merket på de merkede, immobiliserte, monoklonale antistoffene mor S100A9 bundet til kalprotektin fra prøven. Den fysiologiske prøven som benyttes kan være en fekalprøve, en gastrointestinaltraktusprøve, en blodprøve, en serumprøve, en plasmaprøve eller en ryggmargsfluidprøve.

Oppfinnelsen blir ytterligere illustrert ved de følgende ikke-begrensende eksemplene og spesifikke utførelsesformene av oppfinnelsen.

Eksempel 1:

Mikrobrønner i standard 96 brønners mikroplateformat fra Costar, USA ble tilført 150 pl av en løsning med rekombinant S100A9 (levert fra Aldevron Inc., Fargo, ND, USA), 0,8 ug/ml i tris-bufret saltløsning med 1 mM kalsiumklorid (TBS-Ca). Brønnene ble tildekt med plastikktape og hensatt ved +5 °C i minst 18 timer. Før anvendelse ble brønnene vasket én gang med 250 ul per brønn med TBS-Ca, til hver brønn ble det deretter tilsatt 250 ul av en løsning inneholdende 1 % BSA, 2.5 % sukrose i 10 mM kaliumfosfatbuffer pH 8 og hensatt ved romtemperatur (22 °C) i 30 minutter. Brønnene ble deretter vasket tre ganger med en buffer inneholdende 50 mM tris, 150 mM magnesiumklorid, 1 % Kathon og 0,5 ml/l Tween-20, pH 8.

I ulike brønner ble det tilsatt 50 ul med kalibratorer og prøver etterfulgt av 50 pl av et HRP-konjugert, monoklonalt anti-S100A9. Brønnene ble tildekt med plastikkfilm og inkubert med risting, 500 rpm, i 15 minutter. Deretter blir alle brønner vasket tre ganger og deretter tilsatt 100 pl HRP-TMP-substrat. Etter 20 minutter ble 100 pl stoppløsning, 0,2 M svovelsyre tilsatt til hver brønn og fargeintensiteten avlest ved 450 nm i en mikrobrønn-ELISA-avleser.

I figur 2 er standardkurven oppnådd med denne prosedyren vist.

Eksempel 2:

En forutsetning for alternative kalprotektinimmunanalyser er at resultatene som oppnås tilsvarer de fra den opprinnelige ELISA-testen når avføringsekstrakter ble testet. På figur 3 er det vist at en tilfredsstillende korrelasjon mellom de to ble funnet.

Eksempel 3:

En lateral flow-test ble satt opp som vist på figur 4a og 4b. Ifølge standardmetodikk som er velkjent for fagfolk på området. Kort forklart består den av en remse med nitrocellulose, 6 cm lang og 0,5 cm bred (markert 1 på tegningen) festet til en rigid, inert plastikkmembran (markert 2). Tvers over remsen ble en løsning med 1600 pg/ml S100A9 i PBS påført som en linje i posisjon 3. Tilsvarende ble det i posisjon 4 påsatt en stripe med esel-IgG, 1200 pg/ml i PBS. Etter inkubering ved romtemperatur i én time ble remsen vasket én gang i PBS og deretter nedsenket i PBS med 1 % BSA i én time. Til slutt ble remen vasket tre ganger i PBS og tørket. Remser må bli holdt tørre under lagring. Testen ble utført ved å sette den første enden av remsen i vertikal posisjon inn i en mikrobrønn inneholdende en blanding av 50 pl prøve og 50 pl kolloid gullmerkede antistoffer mot S100A9 for testlinjen og merkede antistoffer mot esel-IgG for kontrollinjen. I løpet av et par minutter vil prøven og antistoffene diffundere oppover inn i remsen, og bindingen av merkede antistoffer vil generere farget linje på posisjon 3 for kalprotektin/S100A9 og på posisjon 4 for kontrollen. Eventuelt kan en "prøvepute" inneholdende tørkede, merkede antistoffer bli festet til den første enden av remsen, se figur 4b, på hvilken prøve kan bli påsatt mens remsen holds horisontalt.

Fargingen av de fargede linjene vil øke i løpet av 30 til 90 minutter og kan bli bestemt ved fotoelektrisk skanning og en datamaskin med et passende program, likevel kan fargeintensiteter være tilstrekkelige for avlesning etter en kortere periode, for eksempel fem til 10 minutter.

Figur 5 viser test- og kontrollinjene på remser tilsatt S100A9 i ulike mengder sammen med merket anti-S100A9 og merket anti-esel-IgG. Fargingsintensiteten på testlinjen minsker med økende konsentrasjoner av S100A9 mens fargen på kontrollinjen øker med økende konsentrasjon av S10A9.

I andre formater av LFT kan remsen bli satt i et hus med ett eller flere vinduer for påføring av prøver og avlesning av fargingsintensiteter på linjer. Huset kan inneholde to eller flere remser for samtidig testing av flere prøver eller remser ment for simultan testing av andre proteiner, for eksempel C-reaktivt protein. Huset kan bli tilveiebrakt med separate lokk eller lokk som er hengslet til huset.

Claims

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av konsentrasjonen av kalprotektin i en prøve som omfatter de følgende trinnene: i) belegge et renset S100A9-protein eller et peptid derav på en fast fase, ii) reagere S100A9-proteinet eller peptidet belagt på den faste fasen i trinn i) med a) en prøve inneholdende kalprotektin og b) et merket anti-S100A9-antistoff, iii) vaske den faste fasen etter reaksjonen med ethvert kalprotektin i prøven og det merkede anti-S100A9-antistoffet for å fjerne ikke-bundet anti-S100A9-antistoff fra den faste fasen, iv) bestemme mengden av merket anti-S100A9-antistoff bundet til den faste fasen for å bestemme konsentrasjonen av kalprotektin i prøven, der mengden S100A9-polypeptid belagt på den faste fasen og mengden merket anti-S100A9-antistoff blir valgt slik at S100A9-proteinet eller peptid derav belagt på den faste fasen og ethvert kalprotektin i prøven konkurrerer om et merkede anti-S100A9-antistoffet slik at mengden med merket anti-S100A9-antistoff bundet til den faste bæreren er relatert inverst med konsentrasjonen av kalprotektin i prøven.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der anti-S100A9-antistoffet er et monoklonalt antistoff.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der anti-S100A9-atistoffet er et polyklonalt antistoff.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der antistoffet for S100A9-polypeptid blir produsert ved å benytte et rekombinant S100A9-polypeptid som antigen.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der merket på det merkede anti-S100A9-antistoffet er et enzymmerke.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, der enzymmerket på det enzymmerkede, polyklonale antistoffet er valgt fra gruppen som består av alkalisk fosfatase, pepperotperoksidase, glukose-6-fosfatdehydrogenase og P-galaktosidase.

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, der prøven er en fekalprøve, en gastrointestialtraktusprøve, en blodprøve, en serumprøve, en plasmaprøve eller en ryggmargsvæskeprøve.

8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, der antigenet er et pattedyr-S100A9-protein og det merkede antistoffet er et antistoff mot et pattedyrS 100A9-protein.

9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, der prøven som skal testes er fra et pattedyr.

10. Lateral flow-test sett som omfatter en testlinje med S100A9 og en kontrollinje med merkede antistoffer mot IgG.

11. Sett ifølge krav 10, der den laterale flow-test remsen er inneholdt i en beholder.

12. Analyttestelement for bestemmelse av konsentrasjonen av kalprotektin i en fysiologisk prøve som omfatter merkede, immobiliserte, monoklonale antistoffer mot S100A9 der kalprotektinkonsentrasjonen blir bestemt ved intensiteten på et signal som tilveiebringes av merket på de merkede, immobiliserte, monoklonale antistoffet mot S100A9 bundet il kalprotektin fra prøven.

13. Testelement ifølge krav 12, der den fysiologiske prøven er en fekalprøve, en gastrointestinaltraktusprøve, en blodprøve, en serumprøve, en plasmaprøve eller en ryggmargsvæskeprøve.