NO20110896A1 - ELISA for kalprotektin - Google Patents
ELISA for kalprotektin Download PDFInfo
- Publication number
- NO20110896A1 NO20110896A1 NO20110896A NO20110896A NO20110896A1 NO 20110896 A1 NO20110896 A1 NO 20110896A1 NO 20110896 A NO20110896 A NO 20110896A NO 20110896 A NO20110896 A NO 20110896A NO 20110896 A1 NO20110896 A1 NO 20110896A1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- calprotectin
- sample
- enzyme
- antibodies
- polyclonal antibody
- Prior art date
Links
- 102000001109 Leukocyte L1 Antigen Complex Human genes 0.000 title claims abstract description 80
- 108010069316 Leukocyte L1 Antigen Complex Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 title claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 34
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 25
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 25
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 17
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 11
- 102000018755 Calgranulin B Human genes 0.000 claims description 10
- 108010052495 Calgranulin B Proteins 0.000 claims description 10
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 3
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 2
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 claims description 2
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108010052500 Calgranulin A Proteins 0.000 description 12
- 102100032442 Protein S100-A8 Human genes 0.000 description 12
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 12
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102100029812 Protein S100-A12 Human genes 0.000 description 5
- 108700016890 S100A12 Proteins 0.000 description 5
- 101150097337 S100A12 gene Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 3
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 3
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092060 Acetate kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004145 Annexin A1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000663 Annexin A1 Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 206010048768 Dermatosis Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102100020743 Dipeptidase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 208000014540 Functional gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 101100476483 Homo sapiens S100A9 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 1
- 102000013674 S-100 Human genes 0.000 description 1
- 108700021018 S100 Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003736 gastrointestinal content Anatomy 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000011344 liquid material Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4727—Calcium binding proteins, e.g. calmodulin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forbedret fremgangsmåte for påvisningen og kvantifiseringen av kalprotektin i en prøve.
Description
Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse vedrører en forbedret Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for påvisning av et protein eller polypeptid, spesielt kalprotektin, i fremgangsmåter som tillater seleksjon av passende antistoffer.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Kalprotektin tilhører S100-familien av proteiner. Navnet stammer fra det faktumet at de er resistente mot presipitering med ammoniumsulfat slik at de er løselige til og med i 100 prosent mettet (dermed 100S) løsning av ammoniumsulfat. Det er antatt at de har blitt utviklet ved et stort antall punktmutasjoner, men mange aminosyresekvenshomologier er tilbake. Av denne grunnen kan noen antistoffer binde til epitoper som er felles for mange eller i det minste flere S100-proteiner. Et felles trekk for disse proteinene er at de kan binde kalsium og sink og derved bli resistente overfor enzymatisk nedbrytning, og detter spesifikt tilfellet for kalprotektin. I nærværet av kalsium vil kalprotektin danne dimerer, mens S100A12 (heretter kalt A12) vil danne oligomerer, for det meste dimerer, tetramerer og heksamerer. Kalprotektin er en heterotrimer bestående av to subenheter kalt S100A9 (A9) og én kalt S100A8 (A8). Det har blitt funnet at hver av disse subenhetene kan binde to kalsiummolekyler, dvs., totalt seks per kalprotektinmolekyl.
Subenhetene og deres gener ble fullstendig sekvensert sent på 1980-tallet og er slik velkjente på fagområdet (Odink et al., "Two calcium-binding proteins in infiltrate macrophages of rheumatoid arthritis", Nature, 1987 Nov 5-11; 330 (6143): 80-2 Lagasse et al., "cloning and expression of two human genes encoding calcium-binding proteins that are regulated during myeloid differentiation," Mol. Cell Biol. 1988 Jun; 8(6): 2402-10, Andersson et al., "The leucocyte LI Protein: identity with the cystic fibrosis antigen and the calcium-binding MRP-8 and MRP-14 macrophage components, " Scand. J. Immunol., Aug; 28(2): 241-5 (1988). Krystallstrukturen for subenhetene har også blitt bestemt, (Itou et al., "The crystal structure of human MRP14 (S100A9), a Ca(2+)-dependent regulator protein in inflammatory process." J Mol. Biol. 2002 Feb 15; 316(2):265-76, Itou et al., "Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of human calcium-binding protein MRP14 (S100A9)". Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2001 Aug; 57(pt 8): 1174-6, Moncrief et al., "Evolution of EF-hand calcium-modulated protein. I. Relationship based on amino acid sequence," J. Mol. Evol., June; 30(6): 522-62 (1990), Raftery et al., "Overexpression, oxidative refolding, and zinc binding of recombinant forms of the murine Sl00 protein MRP14 (S100A9)," Protein Expr. Purif. 1999 Mar; 15(2): 228-35, Raftery et al., "Isolation of the murine S100 protein MRP14 (14 kDa migration-inhbitory-factor-related protein) from activated spleen cells: characterization of post-translation modifications and zinc binding," Biochem. J., May 15; 316 (Ptl): 285-93 (1996), Loomans etal., "Histidine-based zinc-binding sequence and the antimicrobial activity of calprotectin," J. Infect. Dis. Mar; 177(3): 812-4 (1998), Rety et al., "Structural basis of the Ca(2+)-dependent association between S100C (S100A11) and its targets, the N-terminal part of annexin I," Structure Fold. Des. 2000 Feb 15; 8(2): 175-84.
Både kalprotektin og S100A12 er rikt forekommende i nøytrofile granulocytter og monocytter og blir frigjort fra disse cellene under inflammasjon, celleskade eller celledød. De er derfor funnet i økt konsentrasjon i blod, andre kroppsvæsker, utskillinger og ekskresjoner under inflammasjon, for hvilken de kan være nyttige markører.
Kalprotektin kan bli benyttet som en markør for et antall sykdommer der høye nivåer av kalprotektinaktivitet kjennetegner sykdommen. Slike sykdommer inkluderer, men er ikke begrenset til, inflammatorisk tarmsykdom, reumatoid artritt, cystisk fibrose, inflammatorisk dermatose, leversykdom, nevrodegenerative sykdommer, Alzheimers sykdom, demens, multippel sklerose og kreft.
Kalprotektin har ofte blitt benyttet som en markør for å skille mellom organisk og funksjonell gastrointestinalsykdom og for tidlig diagnostisering av inflammatorisk tarmsykdom. Den har vært en nyttig markør for screening av inflammatorisk tarmsykdom, for undersøkelse av sykdomsaktivitet og respons på behandling og for å bestemme prognosen for inflammatorisk tarmsykdom hos pasienter som allerede er diagnostisert med denne forstyrrelsen. Normalisering av fekalt kalprotektin kan enkelt bli benyttet for å bestemme at slimhinneheling, som er det ultimate målet for behandling, har blitt oppnådd. Dermed er den mest praktiske og spesifikke biomarkøren for diagnostiseringen, påvisningen, eller overvåkningen av inflammatorisk tarmsykdom kalprotektin. Et antall analyser for kalprotektinpåvisning og kvantifisering er allerede kjent, men det er likevel behov for en forbedret analyse for kalprotektin som er spesifikk for kalprotektin og som har et bredt dynamisk område. Strukturelle forskjeller mellom kalprotektin i avføringsekstrakter og kalibratorene kan føre til falske resultater, og spesifikt vil falskt lave verdier bli funnet i immunanalyser dersom kalprotektin i avføringsekstrakter mangler epitoper som er godt uttrykt på kalibratorene. Foreliggende oppfinnelse presenterer også en fremgangsmåte for seleksjon av antistoffer for å unngå dette problemet.
Oppsummering av oppfinnelsen
Ved å benytte S100A9 som kalibratorer og høyt selekterte anti-S100A9-antistoffer, ett monoklonalt og ett kanin-polyklonalt, så kan reproduserbare og nøyaktige estimater for kalprotektin bli oppnådd. Antistoffene er valgt på basis at de utelukkende reagerer med S100A9-epitoper som foreligger på kalprotektin i avføringsekstrakter. Oppfinnelsen inkluderer også anvendelsen av sitratbuffer som belegningsbuffer på en fast bærer, for eksempel mikroplatebrønner i et ELISA-format. Det monoklonale antistoffet blir benyttet til belegning mens det polyklonale antistoffet blir benyttet som et konjugat for påvisning av kalprotektin bundet til belegningen. For konjugering kan ulike stoffer eller partikler bli benyttet, men typisk er et enzym slik som alkalisk fosfatase eller pepperotperoksidase foretrukket. ELISA-prosedyren omfatter 1) tilveiebringe et passende monoklonalt anti-S100A9, 2) belegge det monoklonale antistoffet på mikrobrønner, 3) inkubere kalibratorer/prøve i en separat brønn for å tillate kalprotektin å binde det monoklonale antistoffet i belegningen, 4) vaske ut ikke-bundet stoff, 5) inkubere i brønnene med antistoffkonjugatet, 6) vaske ut ikke-bundne antistoffer, 7) inkubere med et substrat for enzymet i konjugatet, 8) avlese signalet, dvs., fargeintensitet som skyldes konvertering av substratet, som er proporsjonal med konsentrasjonen av kalprotektin i prøven.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1 er en standardkurve for spesifikk S100A8 ELISA ved å benytte monoklonale antistoffer. Figur 2 viser en standardkurve som er oppnådd ved anvendelse av et enkelt, spesifikt S100A9 monoklonalt antistoff til belegning av brønner og et polyklonalt antistoff-enzym-konjugat. Figur 3 er en standardkurve for en ELISA ved å benytte ett monoklonalt antistoff til både belegning av brønner og som enzymkonjugat.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse involverer en forbedret ELISA for påvisningen og kvantifiseringen av kalprotektin i en biologisk prøve, og et diagnostisk sett som anvender fremgangsmåten.
Både kalprotektin og S100A12 er riklig forekommende i nøytrofile granulocytter og monocytter, og blir frigjort fra disse cellene under inflammasjon, celleskade eller celledød. De blir derfor funnet i økt konsentrasjon i blod, andre kroppsvæsker, utskillinger og ekskresjoner under inflammasjon, for hvilken de kan være nyttige markører. Dersom én av dem av en eller annen grunn ikke er forhøyet kan den andre fremdeles være det. Det kan derfor være fordelaktig å benytte begge markører samtidig, eller velge antistoffer som reagerer med konserverte aminosyresekvenser som er felles for de to proteinene. Av tretten monoklonale antistoffer generert ved immunisering av mus med kalprotektin viste to en sterk kryssreaksjon med S100A12. Blant 10 kaniner immunisert med kalprotektin produserte fire antistoffer som kryssreagerte med Sl00Al2.
Det er antatt at kalsiumbinding fører til en konformasjonsendring for kalprotektin slik at i hovedsak hydrofobe deler av molekylet vil bli funnet på dets overflate. Dette kan ha minst to konsekvenser for immunanalyser av kalprotektin: a) hydrofile epitoper er ikke nødvendigvis tilgjengelige for binding til enkelte antistoffer, b) de hydrofobe delene kan binde til andre hydrofobe stoffer i tarmkanalen for å danne komplekser der kalprotektinepitoper kan være skjult eller endret.
Den opprinnelige kalprotektin-ELISA ble utviklet av Magne Fagerhol, MD på Ullevål Universitetssykehus, Oslo (forkortet her til UUH). Antistoffer ble frembrakt ved immunisering av kaniner med nativt kalprotektin renset fra ekstrakter av nøytrofile granulocytter. Kaninene ble ikke valgt på noe annen måte enn at de var av standardtypen benyttet av forsøksdyravdelingen på sykehuset. IgG-fraksjoner ble isolert fra blandinger av sera fra 10 kaniner ved å benytte ammoniumsulfatpresipitering og DEAE-ionebytterkromatografi. Deretter ble anti-kalprotektin renset med immunaffinitetskromatografi ved å benytte en kolonne med 30 mg kalprotektin kovalent bundet til sefarosekuler. Da forsøksdyravdelingen ble stengt ble det lett etter en annen kilde. Først ble en kilde i Sverige forsøkt. Deres kaniner produserte antistoffer (heretter forkortet PAbS) som ga svært gode resultater ved at formen på standardkurvene og analysebredden var mye bedre, og som ga en øvre grense som var åtte ganger større enn originalen.
Når avføringsekstrakter ble testet på originalen og den nye ELISA ga likevel den siste kun 25 til 50 prosent av den første. Ut av dette oppsto ideen om at antallet og strukturen på epitoper på kalprotektin i standarden og ekstraktene kan være vesentlig forskjellig, og at noen antisera kan inneholde antistoffer som reagerer bedre med den første. Resonneringen var delvis basert på tidligere resultater fra kjøring av avføringsekstrakter på gelpermeasjonskromatografi (GPC) som viste at kalprotektin ble eluert i høye molekylvekt (MW) - fraksjoner tilsvarende 100 til 1000 kDa eller høyere mens nativt kalprotektin har en MW på 36 til 72 kDa. På tidspunktet da ekstrakter ble klargjort ved homogenisering av små avføringsprøver i fosfatbufret saltløsning, ved gjentatt ekstrahering av samme del, ble det funnet at utbyttet kun var omtrent 15 % i det første ekstraktet. Da en ny ekstraheringsprosedyre som inkluderte mer sofistikert ekstraheringsbuffer ble utviklet økte utbyttet til omtrent 50 %, når slike ekstrakter ble kjørt på GPC eluerte en vesentlig, men variabel andel av kalprotektinet i fraksjoner tilsvarende MW for nativt protein. Det ble fremsatt en hypotese om at viktige antigene epitoper på kalprotektin i avføringsekstrakter kan være skjulte i komplekser eller ha en endret struktur som en konsekvens av endret molekylær konformasjon for kalprotektin forårsaket av faktorer i tarminnholdet. Den siste vil være mer sannsynlig å forekomme i konformasjonsmessige heller enn lineære epitoper.
Epitopene på protein- eller polypeptidantigener er delt i to kategorier, konformasjonsmessige epitoper og lineære epitoper. Delingen er basert på deres struktur og interaksjon med delen av antistoffet som gjenkjenner antigenet, dvs., paratopen. En konformasjonsmessig epitop er sammensatt av usammenhengende seksjoner på antigenets primære aminosyresekvens som er brakt nært hverandre på grunn av den sekundære eller tertiære strukturen til antigenet. Konformasjonsmessige epitoper interagerer med paratopen basert på rommessig form eller tertiærstruktur for antigenet.
På den annen side interagerer lineære epitoper med paratopen basert på deres primære struktur, dvs. en kontinuerlig sekvens av aminosyrer fra antigenet.
Ett aspekt her vedrører prinsippet for kvantitative immunanalyser; for å oppnå et korrekt resultat bør analytten i prøven ha den samme strukturen og molekylære konfigurasjonen som den i prøven. Dette er åpenbart svært vanskelig å oppnå når kalprotektin i avføringsprøver er så heterogent.
For å teste hypotesen som er nevnt ovenfor ble rekombinante kalprotektinsubenheter fremstilt, dvs., S100A8 (forkortet A8) og S100A9 (forkortet A9) som spontant danner heterodimerer (her kalt rekombinant kalprotektin) når subenhetene blir inkubert med lave konsentrasjoner, typisk 2 mM, med kalsiumklorid. Disse proteinene, i tillegg til S100A12 som er et nært beslektet protein, ble belagt i mikrobrønner som tillot testing av ulike antisera og rensede antistoffer for å bestemme deres reaksjonsspektra, Videre ble immunaffinitetskolonner klargjort bed å koble S100A8, S100A9 og rekombinant kalprotektin i tillegg til den native kalprotektinkolonnen slik at bindende og ikke-bindende antistoffer kunne bli testet.
Det ble funnet at det opprinnelige antistoffet fra UUH kun reagerte med kalprotektin, rekombinant kalprotektin og S100A9. I motsetning til dette reagerte PAbS også med S100A8. En del av denne reaktiviteten var fremdeles igjen selv om antistoffene ble renset på en S100A9-affinitetskolonne, noe som tyder på at noen antistoffer reagerte med epitoper som er felles for S100A9 og S100A8. Dersom epitoper på S100A8 er mindre tilgjengelige på kalprotektin i avføringsekstrakter enn i standarden, og dersom anti-S100A8 bidrar til signal i ELISA-testen så må falskt lave konsentrasjoner i prøvene bli forventet. For å teste denne hypotesen ble en spesifikk S100A8-ELISA som benyttet monoklonale antistoffer etablert, som gir standardkurven som er vist på figur 1.
Tretten avføringsekstrakter med kalprotektinkonsentrasjon mellom 21 og 817 ng/ml ble testet på denne ELISA-testen, men alle ga et signal som åpenbart lå under det for den lavere standarden. Dette underbygger at antistoffer som reagerer med S100A8 bør bli unngått i analyser for kalprotektin i avføringsekstrakter.
Det ble derfor fremsatt en hypotese om at dette problemet kunne bli løst ved anvendelsen av kun S100A9 som standard. Dette vil være i overensstemmelse med prinsippet om at for kvantitative immunanalyser så bør analytten i prøven og standardene foreligge i samme molekylære konformasjon, dvs., dersom S100A8 mangler i ekstraktene så bør det heller ikke foreligge i standardene. Per i dag kan dette kun bli oppnådd ved å benytte rekombinant S100A9.
I tillegg til de polyklonale kaninantistoffene ble en serie monoklonale museantistoffer (Mab) testet slik som de forrige. Fordi falske verdier i avføringsekstrakter begynte å fremkomme når antisera inneholdende S100A8-epitoper ble prøvd ble det valgt å starte å arbeide med Mab'er som kun reagerer med S100A9.
En annen faktor for ELISA-nettoresultatet er antistoffet som ble benyttet til fremstilling av antistoff-enzym-konjugatene. Den ideelle kombinasjonen av belegning og konjugat bør gi det korrekte resultatet i avførings ekstrakt når det sammenlignes med den opprinnelige UUH-fremgangsmåten. Et stort antall ulike kombinasjoner av monoklonale antistoffer og affinitetsrensede, polyklonale antistoffer ble derfor testet til belegning eller enzymkonjugering.
Overraskende ble utmerkede resultater oppnådd når ett spesielt, monoklonalt antistoff ble benyttet til belegning utilsiktet i sitratbuffer heller enn standardkarbonatbufferen, sammen med et alkalisk fosfataseimmunaffinitetsrenset polyklonalt antistoff, dvs., det polyklonale antistoffet hadde blitt affinitetsrenset på en nativ kalprotektinkolonne. For første gang ble tilsvarende verdier i avføringsprøver som de som ble oppnådd i den opprinnelige ELISA-testen funnet.
I ett aspekt av oppfinnelsen blir et monoklonalt antistoff som reagerer med S100A9 benyttet. Nevnte monoklonale antistoff blir fremstilt ved anvendelse av fremgangsmåter som generelt er kjent på fagområdet og der antigenet benyttet er S100A9, fortrinnsvis rekombinant S100A9.
I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse sandwich-immunanalyser for S100A9 som omfatter følgende trinn: 1) klargjøre en overflate på en fast bærer på hvilken en kjent mengde monoklonale antistoffer mot nevnte rekombinante S100A9 blir bundet, 2) tilsette en prøve inneholdende kalprotektin på den faste bæreren klargjort i trinn 1) for å binde kalprotektin som er til stede i prøven til de monoklonale antistoffene som er bundet til bæreren,
3) vaske den faste bæreren,
4) tilsette et polyklonalt antistoff mot S100A9, på hvilket en passende markør, for eksempel et enzym, har blitt bundet, slik at det merkede polyklonale antistoffet mot S100A9 vil binde til kalprotektinet som er bundet til de monoklonale antistoffene på den faste bæreren,
5) vaske den faste bæreren,
6) benytte en fremgangsmåte som kan bestemme mengden av merke bundet til den faste bæreren, for eksempel et stoff som blir konvertert til en påvisbar enhet av merke-enzymet, og 7) måle den påvisbare enheten for å bestemme tilstedeværelsen og mengden av kalprotektin.
Passende markører som skal benyttes i fremgangsmåten kan være, men er ikke begrenset til, enzymer, gullpartikler, fargede latekspartikler eller magnetiske partikler.
Når markøren er et enzym konverterer enzymmerket polyklonalt antistoff dets substrat til en påvisbar enhet som for eksempel kan være et farge-, fluorescens- eller elektrokjemisk signal. Absorbans-, fluorescens- eller det elektrokjemiske signalet (for eksempel strøm) for den påvisbare enheten blir målt med fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet, og tilstedeværelsen og mengden av kalprotektin kan bli bestemt fra intensiteten på det målte signalet.
En rekombinant S100A9-subenhet for anvendelse som et antigen kan bli produsert ved uttrykking av en tilsvarende DNA-sekvens ved fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet i et passende ekspresjonssystem. Både aminosyresekvens og DNA-sekvens for S100A9 er som nevnt før velkjent for fagfolk på området.
S100A9-peptidet kan også bli syntetisert ved å benytte alle de kjente fremgangsmåtene for kjemisk syntese, men spesielt nyttig er fastfase-metodikken til Merrifield som benytter an automatisert peptidsyntetiserer (J.Am.Chem.Soc, 85:2149 (1964)). Peptidet kan også bli syntetisert ved
løsningspeptidsyntesefremgangsmåter som er kjent på fagområdet, enten på en trinnvis måte fra karboksylenden og/eller ved benyttelsen av
segmentkondenserings- eller ligeringsfremgangsmåter, ved å benytte omfattende eller minimale beskyttelsesstrategier. Kombinerte løsning-fastfase-segmentkondenseringstilnærminger kan også bli benyttet.
Slikt fremstilt og renset rekombinant S100A9 eller syntetisert S100A9-peptid blir deretter benyttet i fremstillingen av monoklonale og polyklonale antistoffer ved standardteknikker som er velkjente på fagområdet.
ELISA-analysen ifølge oppfinnelsen er en form for sandwhich-ELISA, og for å fremme separasjonen av den bundne, merkede reaktanten fra overskudd av ikke-bundet, merket reaktant blir det ikke-merkede monoklonale antistoffet mot S100A9 festet til overflaten av den faste bæreren. Den faste bæreren kan være, men er ikke begrenset til, mikrotiterbrønner, magnetiske kuler eller plastikkuler.
Flere enzymer er kjent på fagområdet som er passende for anvendelse som enzymmerke i en ELISA-analyse. Slike enzymer inkluderer, men er ikke begrenset til, alkalisk fosfatase, pepperotperoksidase, glukose-6-fosfatdehydrogenase og P-galaktosidase. Ytterligere enzymmerker er også kjent på fagområdet. Slike merker inkluderer, men er ikke begrenset til, acetatkinase, P-laktamase, glukoseoksidase, ildflue-luciferase, laccase, Renilla-luciferase og xantinoksidase. Alkalisk fosfatase og pepperotperoksidase blir vanligvis foretrukket. Fremstillingen av enzymmerkede antistoffer kan bli utført med fremgangsmåter som er kjent på fagområdet.
Enzymet på det enzymmerkede antistoffet konverterer generelt sitt substrat til et produkt som er påvisbart og/eller kvantifiserbart fotometrisk, slik som ved spektroskopi, eller påvisbart og/eller kvantifiserbart ved fluorescens-, bioluminiscens- eller elektrokjemisk signalisering.
I en spesifikk utførelsesform av oppfinnelsen blir ELISA-sandwhichanalysen utført der bufferen som benyttes til å belegge den faste bæreren med det monoklonale antistoffet er sitratbuffer. Typisk foreligger sitratbufferen ved en konsentrasjon på fra omtrent 50 mM til omtrent 150 mM, fortrinnsvis er sitratbufferkonsentrasjonen fra 75 mM til omtrent 125 mM, og mer foretrukket er konsentrasjonen på sitratbufferen omtrent 100 mM. pH-verdien i sitratbufferen er typisk fra omtrent pH 5 til omtrent pH 7, fortrinnsvis er pH-verdien fra omtrent 5,5 til omtrent 6,5, mer foretrukket er pH-verdien omtrent 6,0. En spesielt foretrukket buffer er 0,1 M natriumacetat, pH 6,0.
ELISA-sandwhichanalysen ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet til påvisningen og kvantifiseringen av kalprotektin i humane, biologiske materialer slik som en fekalprøve, en prøve fra gastrointestinaltraktus, en blodprøve, for eksempel en serum- eller plasmaprøve, en spyttprøve, en urin. Eller ryggmargsvæskeprøve. Den kan også bli benyttet på biologiske prøver fra ikke-humane arter, for eksempel primater eller husdyr der kalprotektin deler epitop med den som er av humant opphav. Når prøven er en fekalprøve eller en gastrointestinaltraktusprøve kan prøven bli ekstrahert før utførelse av analysen i overensstemmelse med prosedyren som er beskrevet i US patent nr. 6,225,072 eller ved enhver annen passende ekstraheringsbuffer og/eller prosedyre. Denne ekstraheringsprosedyren omfatter: (1) blanding av en liten mengde prøve (fortrinnsvis 10 til 500 mg og mer foretrukket 20-15 Omg, eventuelt forhåndsveid) med et overskudd av vandig ekstraheringsbuffer (fortrinnsvis i området med et overskudd på 50 ganger (volum/volum)), som omfatter minst ett dissosierende, disaggregerende og/eller chelaterende middel, (2) homogenisere prøven (fortrinnsvis ved vortexing), i et lukket rør, (3) separere det faste og flytende materialet i dispersjonen som er resultatet av homogeniseringen av prøven (fortrinnsvis ved sentrifugering og ytterligere eller eventuelt ved filtrering), og (4) gjenvinne det så å si klare væskeekstraktet som er resultatet av separasjonen, som inneholder kalprotektin i tillegg til andre proteiner. En passende buffer er en sitratbuffer med en pH på fra omtrent pH 5 til omtrent pH 10. Sitratbufferen kan være den samme sitratbufferen som er beskrevet ovenfor. I tillegg til eller i stedet for sitrat kan andre chelatorer bli benyttet. Det dissosierende middelet kan være et middel slik som polyoksyetylensorbitanmonolaurat (Tween) eller urea, og ureakonsentrasjon opp til 1 M er spesielt passende. Bufferen kan ytterligere inneholde 0,5 % til 2 % bovint serumalbumin (BSA), eventuelt i saltløsning.
Ved å benytte ekstraheringsrør inneholdende en metallkveil vil dispergeringen og løseliggjøringen av kalprotektin i avføringsprøven være tilstrekkelig etter vortexing i 3-5 minutter, og i dette tilfellet kan sentrifugering bli utelatt.
I et annet aspekt av oppfinnelsen blir en fremgangsmåte tilveiebrakt for seleksjonen av antistoffer som reagerer adekvat med kalprotektin i avføringsekstrakter. I nevnte fremgangsmåte blir antistoffer screenet mot et panel av avføringsekstrakter fra et stort antall pasienter med aktiv, inflammatorisk tarmsykdom og resultatene blir sammenlignet med de som er oppnådd ved å anvende den opprinnelige ELISA-analysen for kalprotektin, der de valgte antistoffene må gi de samme resultatene som i nevnte opprinnelige ELISA.
I analysen ifølge foreliggende oppfinnelse kan generelt enten renset kalprotektin eller renset S100A9-protein (for eksempel rekombinant S100A9) bli benyttet som standarden. Ofte er det foretrukket å benytte renset S100A9-protein, spesielt rekombinant S100A9-protein, som standarden fordi rensing av kalprotektin fra leukocytter er arbeidskrevende, komplekst, og gir variable utbytter og ofte ustabilt protein. Oppfinnelsen blir ytterligere illustrert ved de følgende, ikke-begrensende eksemplene og spesifikke utførelsesformene ifølge oppfinnelsen.
Eksempler:
Eksempel 1
Belegning av mikrobrønner: 96 brønners mikroplater med høy proteinbindingskapasitet, for eksempel MaxiSorp, Nunc, Thermo Fischer Scientific International, kan bli benyttet. For belegning blir hver brønn tilsatt 100 til 200 ul, fortrinnsvis 150 ul, av det høyt selekterte, monoklonale antistoffet (Mab), for eksempel Calpro-Mab CAL1-4H1/2/2, i en passende konsentrasjon, for eksempel 1 til 4 ug/ml, fortrinnsvis 2 ug/ml, i 0,1 M natriumsitrat pH 6. Brønnene blir dekket med damptett, klebende plastikk og lagret ved +4 grader Celsius i en passende tidsperiode, f.eks. seks timer til flere uker, fortrinnsvis 18 timer. Antistoffbelegningen kan bli stabilisert ved vasking av brønnene én gang i PBS etterfulgt av tilsetting av 200 ul/brønn med en passende stabiliseringsløsning, for eksempel StabilCoat fra Surmodics in Vitro Diagnostic Products, Eden Prairie, MN, USA, i en passende tidsperiode, f.eks. 1-2 timer. For forlenget lagring og/eller frakt av mikroplaten kan brønnene bli vasket 2-3 ganger med PBS, brønnen blir tømt og tørket etterfulgt av dekking av platen med en klebende folie, pakke den inn i en vanndamptett folie inneholdende et vannabsorberingsmiddel, for eksempel silikapartikler. Før anvendelse blir overskudd av antistoffer fjernet ved vasking av hver brønn tre til fire ganger med en passende vaskebuffer, for eksempel 50 mM tris, 150 mM NaCl, 0,5 mM MgCl2, 2,5 mM KC1, 0,1 g/l timerosal, 0,5 ml Tween-20 per liter, pH 8,0. Til ulike celler blir det tilsatt 50 til 150 ul, fortrinnsvis 100 ul, standarder med kjente konsentrasjoner av kalprotektin eller S100A9 og prøver i en passende prøvefortynningsbuffer, for eksempel vasking av hver brønn tre til fire ganger med en passende vaskebuffer, for eksempel 50 mM tris, 150 mM NaCl, 0,5 mM MgCb, 2,5 mM KC1, 0,1 g/l timerosal, 1 % bovint serumalbumin, 0,5 ml Tween-20 per liter, pH 8,0, Og fortynning. Brønnene blir dekt med tape eller et lokk og inkubert ved en passende temperatur, for eksempel romtemperatur i 10 til 60 minutter, fortrinnsvis 40 minutter med horisontal risting ved omtrent 1000 rpm. Brønnene blir vasket igjen som ovenfor, og til hver brønn blir det tilsatt 50 til 150 ul, fortrinnsvis 100 ul, med et enzymkonjugert, høyt selektert, immunaffinitetsrenset, polyklonalt antistoff i en passende bufferfortynning, for eksempel prøvefortynningsbufferen som er beskrevet ovenfor, og platen blir inkubert igjen som ovenfor. Enzymet som blir benyttet til konjugering kan være av enhver type som er passende for immunanalyser, for eksempel alkalisk fosfatase. Etter vasking igjen som ovenfor blir 50 til 200 ul, fortrinnsvis 100 ul, av en passende substratløsning, for eksempel para-nitrofenylfosfat, tilsatt til hver brønn. Platen blir hensatt ved romtemperatur i 10 til 60 minutter, fortrinnsvis 30 minutter, og etter dette blir fargeintensiteten i hver brønn målt med en ELISA-avleser. Konsentrasjonen av kalprotektin i prøvene blir bestemt ved sammenligning av fargeintensitetene i de respektive brønnene med intensitetene i standarden ved å ta prøvefortynningsfaktoren med i beregningen.
Figur 2 viser en typisk standardkurve fra en slik ELISA, og viser standardkurven oppnådd når det benyttes en enkelt spesifikk S100A9-Mab til belegning av brønner og et PAbS-enzymkonjugat.
Forskjellen mellom resultater når åtte avføringsprøver ble testet på kalprotektin-ELISA-testen i figurene 2 og 3 er vist i tabell I
Åpenbart ga den nye ELISA-testen som benytter en kombinasjon av monoklonale og polyklonale antistoffer høyere verdier. Forskjellene var enda høyere for prøver med konsentrasjoner på 500 ng/ml og høyere.
Når det ble testet prøver med relativt lave eller normale nivåer av kalprotektin ga de to fremgangsmåtene tilsvarende resultater, selv om det var en tendens at den rent monoklonale ELISA-testen ga høyere verdier. Disse resultatene viser at pålitelige estimater av kalprotektin i avføringsekstrakter krever omstendlig selekterte antistoffer. Selv om de monokonale antistoffene reagerte med Sl00A9-epitoper så var noen av dem sannsynligvis mindre tilgjengelig eller fraværende på kalprotektin i ekstraktene.
Eksempel 2:
For å sjekke muligheten for at S100A9 kunne bli benyttet som en standard i stedet for kalprotektin ble en serie avføringsekstrakter testet på den samme ELISA-testen som beskrevet ovenfor, se figur 2.
Som vist på figur 4 ble en utmerket korrelasjon funnet, der r2 var 0,9936.
Claims (12)
1. Fremgangsmåte for påvisningen og kvantifiseringen av kalprotektin i en prøve som omfatter trinnene: 1) klargjøre en overflate på en fast bærer på hvilken en kjent mengde monoklonale antistoffer mot rekombinant S100A9 er bundet, 2) sette på en prøve som inneholder kalprotektin på den faste bæreren som er klargjort i trinn 1) for å binde kalprotektin som er til stede i prøven til de monoklonale antistoffene som er bundet til bæreren, 3) vaske den faste bæreren, 4) sette på et merket, polyklonalt antistoff mot S100A9 som binder det merkede, polyklonale antistoffet mot S100A9 til kalprotektinet bundet til de monoklonale antistoffene på den faste bæreren, 5) vaske den faste bæreren, 6) sette på et stoff som blir konvertert til en påvisbar enhet ved merke-enzymet, og 7) måle den påvisbare enheten for å bestemme tilstedeværelsen og mengden av kalprotektin.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der merket på det polyklonale antistoffet er valgt fra gruppen som består av enzymer, gullpartikler, fargede partikler og magnetiske partikler, fortrinnsvis et enzym.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, der trinn 6 omfatter inkuberingen av den faste bæreren med et substrat for enzymet på det enzymmerkede, polyklonale antistoffet, der substratet blir enzymatisk konvertert til en påvisbar enhet.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, der den påvisbare enheten blir påvist og/eller kvantifisert fotometrisk.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, der enzymkonvertert produkt blir påvist og/eller kvantifisert med en teknikk som er valgt fra gruppen som består av fluorescens, bioluminiscens.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 3, der den påvisbare enheten blir påvist og/eller kvantifisert elektrokjemisk.
7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, der enzymet på det enzymmerkede, polyklonale antistoffet er valgt fra gruppen som består av alkalisk fosfatase, pepperotperoksidase, glukose-6-fosfatdehydrogenase og P-galaktosidase.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der en buffer blir benyttet i klargjøringen av den faste bæreren med monoklonale antistoffer og nevnte buffer er en sitratbuffer.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, der konsentrasjonen av sitratbufferen er fra omtrent 50 mM til omtrent 150 mM, fortrinnsvis fra 75 mM til omtrent 125 mM, mer foretrukket omtrent 100 mM, og
der pH i sitratbufferen er fra omtrent pH 5 til omtrent pH 7, fortrinnsvis fra omtrent 5,5 til omtrent 6,5, mer foretrukket omtrent 6,0.
10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, der størrelsen på prøven er fra omtrent 50 ul til omtrent 150 ul per analyse eller standard som skal utføres, fortrinnsvis er prøvestørrelsen omtrent 100 ul per analyse eller standard som skal bli utført.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, der prøven er en fekalprøve, en gastrointestinaltraktusprøve, en blodprøve, en serumprøve, en plasmaprøve, en spyttprøve, en urinprøve, en ryggmargsvæskeprøve eller en biologisk prøve fra et dyr der kalprotektin deler epitoper med det humane proteinet.
12. Fremgangsmåte for seleksjon av antistoffer som reagerer adekvat med kalprotektin i avføringsekstrakter, der nevnte antistoffer blir screenet mot et panel av avføringsekstrakter fra et stort antall pasienter med aktiv inflammatorisk tarmsykdom og sammenligne resultatene med de som er oppnådd ved anvendelse av den opprinnelige ELISA-testen for kalprotektin, der det selekterte antistoffet må gi de samme resultatene som nevnte opprinnelige ELISA-test.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO20110896A NO336551B1 (no) | 2011-06-21 | 2011-06-21 | Forbedret ELISA for kalprotektin i fekalprøve eller gastrointestinaltraktsprøve |
| PCT/EP2012/061948 WO2012175602A2 (en) | 2011-06-21 | 2012-06-21 | Elisa for calprotectin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO20110896A NO336551B1 (no) | 2011-06-21 | 2011-06-21 | Forbedret ELISA for kalprotektin i fekalprøve eller gastrointestinaltraktsprøve |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20110896A1 true NO20110896A1 (no) | 2012-12-24 |
| NO336551B1 NO336551B1 (no) | 2015-09-28 |
Family
ID=46331308
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20110896A NO336551B1 (no) | 2011-06-21 | 2011-06-21 | Forbedret ELISA for kalprotektin i fekalprøve eller gastrointestinaltraktsprøve |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| NO (1) | NO336551B1 (no) |
| WO (1) | WO2012175602A2 (no) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114891103A (zh) * | 2022-06-11 | 2022-08-12 | 巴迪泰(青岛)生物科技有限公司 | 一种钙卫蛋白单克隆抗体及试剂盒 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013132347A2 (en) * | 2012-03-06 | 2013-09-12 | Calpro As | Improved elisa immunoassay for calprotectin |
| US20180017576A1 (en) * | 2015-01-23 | 2018-01-18 | Westfaelische Wilhelms-Universitaet Muenster | Compounds and methods for the detection of calprotectin |
| CN108290058B (zh) | 2015-09-17 | 2023-05-16 | 美国安进公司 | 使用il23途径生物标志物预测il23拮抗剂的临床应答 |
| AU2016379157A1 (en) | 2015-12-22 | 2018-06-21 | Amgen Inc. | CCL20 as a predictor of clinical response to IL23-antagonists |
| US11267854B2 (en) | 2016-07-20 | 2022-03-08 | Westfaelische Wilhelms-Universitaet Muenster | Complex-specific standardization of immunological methods for the quantification of S100A12 |
| CN110609143A (zh) * | 2019-10-31 | 2019-12-24 | 苏州普瑞森基因科技有限公司 | 一种钙卫蛋白异二聚体检测试剂盒及其应用 |
| CN117607461A (zh) * | 2023-12-06 | 2024-02-27 | 陕西省动物研究所 | 一种s100a8蛋白的检测方法及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2268926A1 (en) | 1996-11-01 | 1998-05-14 | Nycomed Pharma A/S | Process for the extraction of proteins |
| EP1390058A2 (en) * | 2001-04-30 | 2004-02-25 | Switch Biotech Aktiengesellschaft | Mrp8/mrp14 heterodimer, or its individual components in combination, for treating and/or preventing skin diseases, wounds and/or wound-healing disturbances |
-
2011
- 2011-06-21 NO NO20110896A patent/NO336551B1/no not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-06-21 WO PCT/EP2012/061948 patent/WO2012175602A2/en active Application Filing
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114891103A (zh) * | 2022-06-11 | 2022-08-12 | 巴迪泰(青岛)生物科技有限公司 | 一种钙卫蛋白单克隆抗体及试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2012175602A2 (en) | 2012-12-27 |
| NO336551B1 (no) | 2015-09-28 |
| WO2012175602A3 (en) | 2013-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO20110896A1 (no) | ELISA for kalprotektin | |
| JP2010525362A (ja) | 免疫調節剤のスクリーニング方法 | |
| NO20110895A1 (no) | Kompetitive S100A9 immunoanalyser | |
| US20240018223A1 (en) | Rep protein as protein antigen for use in diagnostic assays | |
| WO2013132347A2 (en) | Improved elisa immunoassay for calprotectin | |
| EP2754672B1 (en) | Antibody capable of binding to specific region of periostin, and method of measuring periostin using the same | |
| US10907141B2 (en) | Rep protein for use in a diagnostic assay | |
| US20120129187A1 (en) | Diagnostical use of peroxiredoxin 4 | |
| AU2020223867A1 (en) | Use of BMMF1 Rep protein as a biomarker for prostate cancer | |
| WO2007055340A1 (ja) | Ｐｔｘ３高感度測定法 | |
| EP1190259B1 (en) | Diagnostic assay for human matrix gla-protein and its use as a biomarker | |
| US9915667B2 (en) | Methods and means for diagnosing vasculitis | |
| WO2020169796A1 (en) | Use of bmmf1 rep protein as a biomarker for breast cancer | |
| EP3732486A1 (en) | Methods of quantifying cftr protein expression | |
| WO2023061388A1 (zh) | 半乳糖凝集素-3的免疫测定 | |
| JP4856381B2 (ja) | ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の測定法 | |
| WO2008012941A1 (fr) | Méthode de diagnostic d'une insuffisance cardiaque | |
| JP2024070581A (ja) | Ａｌｓ検査用バイオマーカー及び検査方法 | |
| JP5626681B2 (ja) | 癌の検出方法 | |
| JP2010285416A (ja) | Ａｄｍ抗体エピトープペプチドおよびその利用 | |
| JPH02173569A (ja) | ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター複合体の測定方法及び測定キット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |