CN103348245B - 基于微流体的分析装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种消减校正分析装置和方法，其中，将疾病所需的结合试剂和标记检测试剂先定位于检测区域内。通过使用顺磁颗粒利用磁场，从检测区域中选择性地除去结合的标记。在检测区域内施加磁场之前和施加磁场之后所测得的标记浓度之间的关系被用于精确测量样品中分析物的浓度。

Description

基于微流体的分析装置
技术领域
本发明涉及一种基于微流体的分析系统，包括一次性分析盒和相关的读数装置，以及它们各自的组件。本发明还涉及使用本发明的分析盒和装置进行分析的方法以及用于进行分析的试剂盒。
背景技术
IVD行业内一直都有性能改进的需求。性能改进可以包括准确度、精度、成本、使用次数、总测试时间等。本申请中描述的新的消减校正分析装置和方法旨在提供这样的改进。新的消减校正分析装置和方法包括单次使用的一次性试剂条（strip）和可重复使用的读数器。虽然也可以使用其他检测方法，但优选的实施方式主要为电化学检测。
在现有技术中有很多的实例，通过磁场将产生可检测的变化的磁性颗粒和相关的结合试剂引入检测区域。通常，未结合的标记保留在检测区域之外，而在检测区域内累积已结合的标记并诱导可检测的变化。
US2009/0130771A1描述了使用磁性颗粒捕捉分析物并将它们累积在检测区域内，从而测量检测区域内分析物浓度的增加，该文献的全部内容以引用的方式纳入本文。US2009/0130771A1还使用了单独的参照区域进行各种背景校正。这仅适用于校正样品本身的背景，而不适用于标记或其他试剂浓度的各种变化，因为两个区域是不同的，因此在两个不同的区域内悬浮试剂的浓度和测量的可重复性就会存在差异，例如参照区域和检测区域的尺寸、不透明度等。US2009/0130771A1确实提及了使用检测区域进行背景测量的可能性，但是这仅能适用于当“检测区域内基本不存在GOD[标计]颗粒”时，因此不能用于校正标记浓度的波动性。
本发明的目的之一是提供一种廉价和可靠的分析系统来进行IVD测试。
本发明的目的之一是提供一种分析盒设计平台和读数器，所述分析盒设计平台和读数器成本低廉、容易制造并且能够配置成进行指定的一种或多种分析。
本发明的目的之一是提供一种分析盒，所述分析盒可以很容易地被调整用于进行多种不同的指定的分析。
本发明的目的之一是提供一种分析系统，所述分析系统包括读数器，所述读数器可优选地用于或很容易被调整用于执行多种不同的分析。
发明内容
本发明是基于一种新的消减分析装置（subtractiveassaydevice）及方法的开发，其中，所有的试剂最初均位于检测区域内。该分析体系结构可以用于很准确、灵敏的测量，其中未结合的标记的浓度用于测量分析物的浓度。
在第一方面，本发明提供了一种用于检测液体样品的分析物的消减分析中的微流体分析盒，该分析盒包括：
样品口（sampleport），所述样品口用于将所述液体样品引入分析盒中，
基片，所述基片包括一个或多个设置在其中的微流体通道，并包括设置在所述通道内用于结合样品内的任何所述分析物的结合试剂，以及用于检测存在于样品中的分析物的量的标记；以及
检测区域，所述检测区域内或所述检测区域整体上包括分析物与标记发生结合所在的区域，从所述检测区域内除去结合的分析物时，允许通过测量任何剩余的未结合标记而间接测定了所述分析物的浓度。
所述检测区域含有试剂，该试剂为加入样品使得试剂再水化（rehydration）时同时发生结合反应和酶促反应所需的试剂。在具体的实施方式中，特别是抗分析物磁性颗粒，抗-分析物葡萄糖氧化酶（GOD）标记以及介质系统都位于检测区域内。在检测区域的上游沉积有葡萄糖，以使分析盒被样品填充时，葡萄糖发生水化并将样品运送至检测区域。（含葡萄糖的）样品使结合试剂和酶促试剂再水化。两个反应（结合复合物的形成和基片的酶促转化）立刻开始。然后进行酶转化的参照测量，并考虑分析中的一些波动性（抗-分析物-GOD标记浓度、介质浓度、工作电极的尺寸等）。该参考测量主要由抗-分析物-GOD标记浓度决定。在下文中，这被称为磁分离前测量。
在一段确定的时间（例如4min）后，将磁场施加到试剂条上。结果，顺磁颗粒-分析物复合物和顺磁颗粒-分析物-标记复合物被选择性地从检测区域除去至磁场源，在检测区域中留下未结合的GOD标记。在一段确定的时间（例如2min）后，测量检测区域内的剩余的未结合GOD标记的浓度。在磁分离步骤之前和之后的标记浓度之间的关系被用于确定样品内分析物的浓度。
对磁分离之前和之后的标记浓度进行测量的消减校正分析有很多优点。一次性IVD试剂条的波动性和不准确性的重要来源是沉积在分析盒中的试剂量/浓度。消减校正分析方法校正了波动性和不准确性，因为每种试剂沉积在检测区域内，这允许标记浓度的测定，从而能够校正标记浓度的差异。这一点特别适合于消减方法，因为只测量工作电极的事件（即测量工作电极上的标记浓度，然后通过磁场除去结合的标记后，再次测量工作电极上的未结合的标记浓度）。在累积分析中，当可检测的个体被带到电极上时，即使每种试剂都位于检测区域中，也不存在校正的机会；结合的个体仍然会被带到工作电极（因此无法校正试剂条其他地方的标记浓度的波动性）。这种情况不会出现在本发明的校正消减分析中，因此，本发明的方法可以非常精确地校正标记浓度（以及前述其他波动性的来源）的波动性，从而提高精度、灵敏度、准确性和整体分析性能（校正能力对于分析性能而言是非常重要的，这一点将在具体实施方式中进行进一步的描述）。
消减校正方法的另外一个主要优点是试剂条体积的独立性。在分析方法中，标记通过磁性颗粒被带到检测区域，测量容易受到通道中试剂条的体积变化（宽度、高度等）的影响（即可用于结合的分析物的量随试剂条尺寸的变化而变化）。在消减校正方法中，试剂条的体积被归一化（normalised）。这是由磁分离前测量导致的，其中，仅测量工作电极表面的个体。因此，这种测量可以用于校正试剂条的体积，因为只测量了工作电极处的样品体积，因此，试剂条通道高度、试剂条宽度，试剂条体积，电极尺寸和试剂浓度的波动性都可被校正，由此产生了高度精确的结果。
使用积累的顺磁颗粒将结合标记带到检测区域的分析还会面临下述困难：收集所有（或可重复数目）的顺磁颗粒，并将它们以可重复的方式（例如顺磁颗粒珠带尺寸（paramagneticparticlebeadbanddimensions））送递至检测器，以确保结果的准确性。消减方法则不会面临这样的困难，因为顺磁颗粒和已结合的个体会从检测区域中被除去。
由于检测方法非常简单，因此很容易制造能够多次测量的分析盒的形式。这使得可以对许多不同的分析物进行测量或对相同的分析物进行多次测量。此外，由于分析方法的简便，使得可以设计出非常容易制造的和成本低廉的分析盒，可以仅使用很小的样品体积，因此适用于许多产品的应用。
本发明的分析盒的设计可以很容易地经过调整而进行多种不同的分析，因此可以被视为用于多种分析的分析平台。所述分析盒和设置在其中的通道可以以任何本领域技术人员已知的方法形成，所述方法可以包括光刻法、湿法化学蚀刻、激光烧蚀、注塑成型、压花和印刷技术。然而，在优选的实施方式中，所述分析盒以及设置在其中的通道和其他部件由三个独立的基片的夹层（sandwich）形成—顶部基片、中间基片和底部基片。
所述分析盒可以由任何合适的材料形成，例如聚碳酸酯、聚酯、聚苯乙烯、PMMA等，并且所述/每个基片可以由单一或多种的材料形成。在包括三个基片的实施方式中，中间基片包括穿过基片与所述分析盒的某些部件（例如通道、样品引入口等）相对应的图案。通过应用和夹层适当切割的顶部基片和底部基片（例如通过热封、胶粘、装订等），将中间基片夹在顶部基片和底部基片之间，可以提供分析盒，其中设置有通道和其他部件。顶部和/或底部基片的开口或部件可以被设计成允许空气从分析盒中排出，以促使样品进入，或与读数装置上的部件位于一处（如下文所述），这可能有利于将所述分析盒放置在读数器中的正确位置。
在使用时，将样品例如通过毛细作用经样品引入口加入所述分析盒中。在优选的实施方式中，样品引入口为所述分析盒的一侧或一面上的开孔。有利的是，所述分析盒总体形式为薄的平面装置，包括顶面和底面及四个边缘。在这种设置中，样品引入口可在所述分析盒的一个边缘上形成，这样使用者只需要使样品接触边缘上形成的开孔，就可以使样品被吸收至所述分析盒中。在某些实施方式中，在使用时，使用者使液体样品接触所述端口/开孔，由于所述分析盒内通道的尺寸使得液体通过毛细作用被吸入至所述分析盒中。样品口/开孔的尺寸可以小于或大于所述通道的尺寸。
分析盒中的所述通道还可以包括一个或多个液体停止部件，其设计目的是为了防止样品和/或其他液体仅凭借毛细作用而通过所述停止部件。优选的停止部件是疏水性材料（例如可印刷的导电或不导电的油墨）或改变通道表面的表面特性由此产生亲水/疏水差异的方法或材料（例如，通过激光烧蚀、表面刻痕、表面材料去除、蒸发的金属材料等），其设计目的是产生壁部件，或涂覆在通道壁上或在通道中产生空气间隙（例如盖中的孔和/或贯穿所述通道的基料）。在通过三个基片夹在一起从而形成通道的实施方式中，可以在顶部和/或底部基片上施用疏水性材料，从而使得当三个基片被夹在一起时，疏水停止材料形成所述通道的顶部和/或底部表面上的部件。
除了微流体通道，本发明的分析盒可以包括一个或多个与通道相接触的电极部件，因此样品被一次引入所述分析盒。所述电极被设计成与读数器内的电触头相接触，使得在适当情况下能够获得各种读数。例如，在所述分析盒中的一个或多个电极可以被设计为用于检测所述分析盒的正确加样，并且所述读数器可以向使用者发送信号：a）所述分析盒是否被正确插入至所述读数器和/或样品是否被正确地装载到所述分析盒中。电极也可以对样品本身进行一个或多个的电测量。例如，当所述样品为全血样品时，电极可以进行样品的血细胞比容测量（hematocritmeasurement），这可能对于确定待检测的分析物的准确浓度是重要的。可以根据待测样品来确定导电性和/或阻抗测量。分析物检测中使用的标记可以是电化学标记（或电化学反应中涉及的标记），因此，这些电极可以用于测量标记浓度，因此测得分析物浓度。因此，本发明的分析盒可以对样品使用电测量，以实现例如填充检测（filldetection）、血细胞比容测量和分析物测量等功能。
可以使用任何导电材料形成电极。例如，可以通过多种手段（例如丝网印刷、溅射法、喷墨印刷等）将丝网印刷碳油墨、银/氯化银油墨、金、铂、铜等施用于基片上，或通过多种手段（包括化学蚀刻、激光烧蚀等）从基片上部分除去电极材料。
待加入至所述分析盒中的样品可以是任何合适的液体样品。例如，它可能是从受试者处获得的液体样品，如全血、血浆、唾液、精液、汗液、血清、经血、羊水、泪液、组织拭液、尿液、脑脊髓液、粘液（mucous）等。但是应当理解的是，本发明的分析系统可应用于人类健康领域，包括巨大的和不断增长的IVD市场（例如癌症、心脏病、糖尿病和传染病）。所述分析也可以用于测试药物和药物作用。然而，所述系统在需要时也可以应用于环境检测，例如毒剂或传染性病原体（如细菌或病毒）。因此，也可以使用从河流或湖泊或从固体表面拭取的样品，以获得供给于所述分析盒的液体样品。所述分析系统也可用于实验室、医疗点或现场测试的兽医用途。从本质上讲，本发明可以用于任何能够以液体形式提供样品的分析中。
所述样品可以例如包括从来源直接获得的材料（如全血样品）以及经过预处理（例如过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、浓缩、干扰剂的灭活等）的材料。这些步骤可以在样品被引入至所述分析盒中之前进行，也可以由分析盒本身进行。
可以在将所述分析盒插入读数器之前或所述分析盒被插入读数器之后引入所述样品。所述分析盒可以被设计为通过毛细作用引入样品。
待测分析物可以是任何所需的分析物，并且可以包括蛋白质、肽、抗体、核酸、微生物（如细菌和病毒）、化学制剂、毒素、药物、代谢物、细胞部分等。例如，本发明的系统可以经过调整用于检测能够与合适的结合试剂结合的任何类型的分析物。所述结合试剂可以是能够与待测分析物特异性结合的任何合适的试剂。例如，如果分析物是蛋白质或肽，结合试剂可以是能够特异性结合所述蛋白质/肽的受体或抗体。反过来说，抗体也可以被该抗体设计时所特异性针对的蛋白质/肽结合。核酸可以被能够与分析物核酸特异性杂交的其他核酸结合。微生物可以被能够特异性结合所述微生物表面上的蛋白的抗体结合。化学制剂、毒素、药物、代谢物可以被能够通过适当的键合反应或亲和力而与上述化学分析物反应或结合的化学部分（chemicalmoieties）结合。许多类型的结合技术是本领域技术人员所公知的。
此外，所述结合试剂可以是酶或酶底物。例如，分析物例如葡萄糖可以通过公知的酶促方法来检测，例如，可以通过本领域技术人员已知的电化学或光学检测技术来检测酶与葡萄糖反应后形成的反应产物。这样的测量可以作为独立的测量或与样品中的其它待测分析物组合进行测量。
将结合试剂与磁性试剂如顺磁颗粒通过包括物理吸附、共价化学偶联、非共价化学键合（例如生物素-亲和素）或它们的任何组合的方法进行连接。在优选的实施方式中，所述结合试剂是通过非共价化学键合（例如生物素-亲和素联合）与所述顺磁颗粒结合的。可以将功能化以使其包括与之结合的结合试剂的顺磁试剂/颗粒简单地沉积在所述分析盒的通道内，这样当样品被加入至所述分析盒并被吸入所述通道时，功能化的顺磁试剂/颗粒被液体样品重悬，由此与样品中的任何分析物接触。
如上文所述，除了结合试剂，所述分析盒可以包括沉积在所述微流体通道中的一种或多种另外的试剂，所述试剂可以有利于被捕获的分析物的检测。例如，所述一种或多种试剂可以包括标记，所述标记被设计为与被捕获的分析物特异性结合，从而有利于其检测。这些试剂可以分别沉积或与其他试剂（如功能化的顺磁颗粒）一起沉积。
沉积在所述微流体通道中的其他试剂可以具有的功能包括但不限于：改善其他试剂的稳定性、改善/控制试剂的重悬、防止血液样品的凝固、为酶促反应或化学反应提供所需的底物或辅因子、在样品加入分析盒后控制pH值或离子条件、增强提供标记诱导的反应将产物转化为被读数器检测的个体的标记和酶所产生的信号。
结合的分析物可以被间接检测的前提是结合的分析物能够产生可检测的信号，从而当从所述检测区域除去结合的分析物时将导致信号的下降，或者在分析物结合时会发生反应，从而产生反应产物，并且在从所述检测区域除去结合的分析物后，可以检测到未反应的分析物的减少的量。然而，在优选的实施方式中，结合的分析物与能够与结合的分析物相结合的标记接触，随后从所述检测区域中除去标记/结合试剂/分析物复合物，并检测剩余的游离的未结合的标记。通常，所述标记能够结合到与第一结合试剂结合的分析物的不同部分，或者能够与结合试剂/分析物复合物的区域结合，该区域仅在产生所述复合物时形成。
有利地，所述结合试剂和任何检测试剂/标记被沉积在所述分析盒的通道内时为干燥状态。
当需要捕获试剂和标记（被设计为便于捕获和分析物的检测）时，它们可以被沉积在一起或分开沉积从而仅在加入样品而再水化时才彼此接触。分析所需的其他任何试剂都可以与所述捕获和/或标记一起沉积或与这些试剂中的一种或两种分开沉积。这样，试剂的再水化可以是有序的。
每个分析盒可以被设计用于进行单个分析物的检测或多个分析物的检测。此外，每个分析盒可以包括一个以上的微流体通道系统，从而可以用一个分析盒进行一种以上的分析。
有利地，所述分析盒可以很容易地大规模生产。
在所述分析盒中装载样品后，可以通过合适的读数器来间接检测任何被捕获的分析物。本发明提供了这样的读数器，并且本发明的一个重要方面是：除了样品以外，不需要在所述分析盒中加入缓冲液或额外的液体。这样的一个好处是：所述分析盒本身最初可以是“干”的，即在加入样品之前，所述分析盒中不含或仅含有少量液体。这不仅简化了所述分析盒本身的制造，还提高了储存寿命，并有利于很多本发明的分析盒在室温下保存，而在使用前所述分析盒内的化学成分或生物成分很少降解。
在另一方面，本发明提供了一种对样品进行分析的方法，该方法包括：
将样品引入本发明的微流体分析盒，使得样品中存在的任何分析物能够被结合试剂结合；和
检测标记（包括与分析物结合的和未与分析物结合的）的水平，以获得第一参考值/对照值；
除去检测区域中结合的分析物；以及
检测在与分析盒中存在的分析物结合之后剩余的任何未结合或未反应的分析物，或检测能够与未结合或未反应的分析物结合的标记。
通常，分析物/结合试剂复合物和分析物/结合试剂/标记复合物能够被除去或运送到分析盒中的另一位置，以使未结合和/或未反应的分析物与未结合的标记可以被检测。
在另一方面，本发明提供了一种用于对液体样品进行分析的分析系统，该分析系统包括：
a）根据第一方面并含有顺磁颗粒的微流体分析盒（或其优选的实施方式）；以及
b）读数装置，所述读数装置包括：
i）接收端口，所述接收端口用于将分析盒引入读数器；
ii）磁铁或磁力产生工具，所述磁铁或磁力产生工具能够对分析盒施加磁力，从而能够从分析盒的检测区域中除去顺磁颗粒；以及
iii）检测工具，所述检测工具用于在从分析盒的检测区域中除去分析物/结合试剂复合物之前和之后，检测分析盒的检测区域内存在的任何标记。
与其他系统不同的是，本发明是基于从检测区域除去特异性结合的复合物。可以在所述标记和/或结合试剂重溶后检测第一信号。所述标记可以是过量存在的，所以其初始信号是最高水平或接近最高水平的。然而，当复合物形成并例如通过施加磁力（例如，如果使用功能化的顺磁颗粒做为捕获相）从所述检测区域中除去标记/分析物/结合试剂复合物时，可以检测到信号的下降，这与样品中存在的能够与标记和结合试剂相结合的分析物的量成反比。
所述读数器包括接收端口，所述分析盒被插入接收端口中。可以对所述读数器进行调整以确保所述分析盒的正确插入，这可以采取各种形式。例如，可以先将所述分析盒放置在能够进入所述读数器的载体机构（carriermechanism）上，例如在计算机中用于装载CD等的机构。或者，可以对接收端口的尺寸进行设计，使得可以接收分析盒，并且在所述读数器内设置内部阻挡部件，当所述分析盒被正确插入时与所述分析盒邻接（abut）。另外地或附加地，所述分析盒上存在的或其表面切割出的部件可以被设计为与读数器内部的部件共置（co-locate），且仅当所述分析盒在所述读数器内被正确定位时才能对所述分析盒进行读数。
在另一方面，所述分析盒被预装入所述读数器中，并可以被锁定，形成组合的单次使用的分析盒与读数器。在该方面，读数仪（meter）和分析盒是不可分离的，因此所述读数仪和分析盒只能作为单个完整的一次性装置被一次性使用。
在结合试剂与磁性试剂（例如顺磁珠）的表面相结合的实施方式中，可以理解的是，读数器应包括永磁铁或电磁铁，其目的是施加磁场或带到所施加的磁场附近，从而将所述顺磁颗粒保留在分析盒的所述微流体通道的特定区域内。此区域可以与所述检测区域在空间上分离。将顺磁颗粒集中到检测区域之外的特定区域可以有利于促进通过测量未结合的标记或未结合的分析物而进行的任何分析物的检测和/或提高检测的灵敏度。可以例如通过将永磁铁移近或远离所述分析盒，或通过增强或减弱所施加的磁场的强度，来减弱或增强永磁场或电磁场。
在使用中，可以使用磁铁或磁场来将所述顺磁颗粒移出检测区域。
在一个实施方式中，顺磁颗粒用于捕获分析物，并使用标记进行检测。在经过一段时间以使顺磁颗粒-分析物-标记复合物形成后，可以使用磁铁或磁场将所述顺磁颗粒（包括与分析物和标记复合的顺磁颗粒）移出检测区域，促使随分析物浓度增加的标记的浓度下降，从而测量分析物浓度。在本实施方式中，在检测区域中被检测到的剩余的标记为没有完全形成反应复合物（即未与顺磁颗粒相结合）部分的任何标记。这可能是未结合的游离标记或与分析物结合的标记。
用于检测分析物的标记按照下述方式沉积：当分析盒被加入的样品填充再水化时，所述标记（以及其他反应组分）遍布整个检测区域。因此，由所述标记产生的初始信号与分析物的浓度无关，并且在除去通过特异性分析物结合而结合在捕获相试剂（例如功能化的磁性颗粒）上的标记之后，再进行特定的测量时，所述初始信号可以作为重要的基线。
本发明的读数器还包括检测手段，用于检测样品分析盒内任何捕获的分析物。根据具体的分析，所述检测手段可以是任何合适的手段。例如，检测手段可以是稳压器（potentiostat），它可用于检测由带标记的或不带标记的结合的分析物或反应产物产生的电化学信号。结合的分析物/反应产物可以具有内在的电化学性质并可通过以下方式测量，例如通过施加适当的电位后产生的电流来测量，或者可以使用其他标记来分别结合已结合的分析物和用电化学手段检测的标记。其它可采用的标记和相应适用的检测手段包括：荧光标记、放射性标记、磷光标记、胶体金属颗粒、生物发光标记、比色标记等。此外，如上所述，可以使用例如拉曼光谱等技术等来直接检测结合的分析物或放射性产物。此外，也可以对样品中天然存在的成分、或由化学反应或酶促反应产生的个体或标记的吸光度进行测量。
当所述读数器使用电化学检测时，所述信号的测量方法包括但不限于：计时计（chronoamperometric）、电位计、阻抗、线性扫描、电荷转移、电位溶出（potentiometricstripping）、检流计、电量分析（voltametricanalysis）（差分脉冲、方波、样品DC、正常脉冲、AC伏安法、AC二次谐波、差分正常脉冲）等。
所述可检测的标记可以单独使用，或与微粒或微球组合使用，例如金属氧化物、多糖或乳胶颗粒。许多类型的乳胶和其它颗粒在本领域中都是已知的。
所述读数器可以包括其它部件，如有利于在特定温度下进行分析的加热装置，以及有利于所述读数器进行编程来进行一种或多种分析的适当的电路和软件。
本发明的包括分析盒和读数器的平台系统提供了许多明显的优势：
1.减少了样品体积：用毛细管引入液体，例如指采血血液样品，减少了对使用者的复杂性，并使得测试可以在任何环境下（如救护车上，医疗点、医生手术室、战场、家庭等）进行，与葡萄糖测试类似，使得产品可以被放置在任何地方。
2.常温稳定性：许多现有的IVD测试需要冷藏储存和运输，这种要求显著增加了产品成本，而且还限制了产品的使用和分配。样品分析盒最初的“干”的性质有利于它们的稳定性和储存寿命。此外，在本专利中描述的具体的分析方法可以在从检测区域中除去特异性结合的复合物之前进行初始背景测量。这种初始背景测量可用于校正目的。
3.材料成本低和制造过程简单，使得商品成本低（COGS），使得IVD试剂条的销售产生的利润大幅增加。这在免疫分析和分子IVD市场尤其需要，因为传统的测试往往很复杂，使得试剂条材料的成本高，从而使得检测的整体成本也较高。
4.读数器的成本低。不再需要洗涤缓冲液，这简化了读数机制。使用简单的检测方法（例如电化学法或简单的光学测量法）使得读数装置变得简单，因此成本也低。
附图说明
现在通过实施例并参照附图对本发明作进一步的描述。
图1示出了根据本发明的样品分析盒的示意图；
图2是如何形成本发明的分析盒的示意图；
图3和图4是根据本发明的分析盒的图片，示出了各个部件；
图5是根据本发明的读数装置的示意图；
图6示出了读数器内部机构的示意图；
图7示出了反应在根据本发明的测试分析盒中利用湿试剂进行总PSA消减分析的实验结果图；
图8示出了反应在根据本发明的测试分析盒中利用干试剂和荧光检测进行游离PSA分析的实验结果图；
图9示出了根据本发明的仪器的功能性框图；
图10显示了根据本发明的示例性均一免疫分析原理的示意图；
图11示出了本发明的有利实施方式的反应机理。
图12示出了根据本发明的包括20个测量通道的一次性分析盒的示意图；
图13示出了根据本发明的包括20个测量通道的一次性分析盒的物理实施方式的示意图；
图14示出了根据本发明的包括单一公用反电极的一次性分析盒的示意图；
图15示出了根据本发明的包括4个测量通道的一次性分析盒的物理实施方式的图片；
图16示出了绘制的典型GOD滴定曲线，其中，绘出的电流值取自在GOD与底物系统反应2min后、由3秒计时瞬时电流计（chronoamperometrictransient）在3秒时间点时的数据；
图17示出了绘制的GOD滴定曲线，其中，绘出的电流值取自240秒瞬时电流计在3秒时间点时的数据；
图18示出了绘制的GOD滴定曲线，所述曲线在施加-350mV电位下，反应2min并温育4min后在-350V下测得；
图19示出了正常的2minGOD滴定和在施加-350mV的电位4min后再进行的2min滴定的GOD滴定曲线图的比较图；
图20示出了根据本发明的PSA浓度的磁分离后测量的未校正的图；
图21示出了针对所有PSA浓度进行根据本发明的磁分离后电流（postmagneticseparationcurrent）和磁分离前电流（premagneticseparationcurrent）之间的差异列表；
图22示出了针对所有PSA浓度进行根据本发明的磁分离后电流和磁分离前电流之间的差异图；
图23示出了根据本发明的磁分离后电流与磁分离前电流的比值列表；
图24示出了根据本发明的磁分离后电流与磁分离前电流的比值图；
图25示出了根据本发明的磁分离前电流与磁分离后电流的平均值之间的差异图；以及
图26示出了根据本发明，通过用磁分离前的测量斜率除以磁分离后测量斜率得到的PSA浓度的图。
具体实施方式
在根据本发明的实施方式中的样品分析盒（14）如图1所示。将例如血液的液体施加到样品引入口（13）（通过例如指血或静脉血）。在这个具体实施方式中，这一个样品引入口（13）连接四个通道（4、5、6、7）。不应被理解为限制，进一步的描述提及的样品为全血。
将血液加到样品施加口（13），最初的单一通道分成4个独立的通道。每个通道都可以进行测量，这样对同一分析物可以测量4次，得到对单一分析物的平行结果，或者可以在每个通道中测量不同的分析物。图1中所示的是4通道形式的试剂条。20通道的试剂条（105）示于图12，具有15通道的试剂条（106）的物理实施方式的图片示于图13。在图12中，一组紧密电极配置示出了反电极（107）、工作电极（108）和均匀沉积的相关试剂（109），这样，检测区域（108）位于通道区域内，在通道处发生分析物与特异性试剂的结合。图14所示的另一实施方式示出了试剂条设计（110），其中，应用公用反电极（111），而不是对应每一工作电极都有单独的反电极。这种公用反电极使得读数器中的电子设备得以简化，并且还减小了一次性分析盒的尺寸，因为一次性分析盒的宽度会受到电极总数的影响。如果每个工作电极都有单独的反电极，能够对20个工作电极进行测量的分析盒的电极总数为40；而对于使用公用反电极的分析盒，电极总数则减少到21个。
根据填充的通道的数量，总的样品施加量可以小到小于1μl，因此当使用者施加样品时，例如，一滴血就可以在毛细作用力下填充所有通道（4、5、6、7）。这个过程非常快，并且与一些免疫分析平台的冗长血液分离填充相比，更适于血糖试剂条的填充。在四个通道（4、5、6、7）中沉积有用抗体功能化的顺磁颗粒和用抗体功能化的标记和带标记的酶，以及抗嗜异性试剂、稳定剂、电化学介质和抗凝剂（8、9、10、11）。在样品引入口（12）沉积有酶的底物，它可被带标记的酶（13）转化为可被电化学测量的个体，从而产生被读数器检测的可测量信号。
在每个通道（1、2、3）中存在的电极被用于进行电化学测量，然而，在其他实例中也可以进行光学测量或其他检测测量方法。电极也被用于告诉使用者已经有足够血液施加到分析盒内。
如图2所示，当分析盒（14）是由三个基片（20、21和22）形成时，所述通道通过从粘胶层（24）上除去材料而形成，所述粘胶层（24）夹在带有印刷电极（23）的基层（20）和盖层（22）之间。在图2中，盖层（22）比粘胶层（24）中形成的通道短，这样当所述分析盒被组装时，盖层的边缘（25）与通道（24）接触（meet），从而形成通气孔。这使得所述分析盒可以通过毛细作用力被填充，并形成了液体停止部件。图15示出了这种试剂条设计（112）的物理实施方式的图片。在这个具体实施方式中，在顶盖上切出圆形开孔（circularaperature）（113），有利于通过向该圆形区域内施加一滴足够体积的样品而填充装置。
当将所述分析盒（14）插入读数器中时，可以启动分析盒加热机构，将所述分析盒加热到预设的恒温并在测试期间持续。
在所述分析盒上的四个样品通道（4、5、6、7）的每一个中都可以设置有电极（图1中的1、2、3）。通过由所述读数器检查电极之间的电连续性，读数者将能够确认所述通道（4、5、6、7）已成功地被样品填充。这可以通过简单的电导测量来进行。对于具体的通道，如果电极（1、2）已成功地被血液润湿（也就是说通道（4）已被完全被样品填充），那么电流就可以从一个电极经过血液样品传导到其他电极。否则，如果不存在血液样品或血液样品仅部分填充所述通道，那么至少一个电极将不被润湿，意味着电流不能从一个电极传导到另一个电极。可以在每个通道内添加附加电极，用于更精确地确定装置的填充（以确保样品完全覆盖分析物检测中所使用的电极）。在每个通道中的其它电极的下游（相对样品被加入至所述分析盒后的流动方向而言）设置附加电极能够满足这一要求。在不同的通道中的这些附加电极之间的电流流动就能够表明这些通道均被充满，或者如果没有电流流动则表明这些通道中的一个或两个未被样品充满。
本发明的分析盒/分析系统将可以用于测量血液样品的血细胞比容。
图3示出了单通道分析盒（41）的图片，其中所通道被液体（33）填充直至通道末端，所述通道由盖（37）的边缘限定并产生通气孔（32），它使得所述装置可以通过毛细作用力被填充并形成液体停止部件。
所述通道的内表面需要具有某些亲水特性以促进通过毛细作用力被填充。在一个实施方式中，使用了两个亲水性表面，但是也可以使用亲水性/疏水性的表面作为替代组合，以便通过毛细作用填充所述试剂条。
在图3中，样品已被施加到样品引入口（33）并填充由粘胶层（31）形成的通道，粘胶层（31）带有具有印刷电极（39、40）的基层和盖层（34）之间的所示通道边缘（36）。由于粘胶层的末端比所述装置的末端（38）和盖层（37）的末端更加靠前，因此所述电极（39、40）暴露在外面。这使得电极可以与读数器连接。这在图4中可以看得更清楚，图4显示了与图3相同的单通道装置的直角侧视图。在图4中，带有印刷电极（56）的基层（52）部分地被粘胶层（51）覆盖，其中可以清楚地看到边缘（54）。粘胶层（51）被盖层（50）部分覆盖，其中也可以看到边缘（53）。
随着血液填充样品通道（33）（见图3），预先沉积的干燥试剂被血液重悬，从而促使结合存在的任何分析物。干燥试剂的可能定位示于图1（8、9、10、11、12）。血液填充到通道（33）的停止部件（37），见图3。功能化的捕获试剂和检测试剂被重悬后，可以将血液样品温育一段规定的时间（温育时间），并由所述读数器的软件和程序适当地加以控制。由于它们的高流动性和功能性（依赖于其尺寸即扩散系数等），可以选择顺磁颗粒作为捕获相，并选择颗粒（例如乳胶看来）或缀合物作为标记或检测相，以减少扩散距离和最终的温育时间。这种类型的反应在结合血液样品中的分析物方面是非常有效的和可重复的。在捕获和检测相结合分析物时，可以通过电极（39、40）进行血细胞比容测量。血细胞比容值可被读数器用于计算最终的分析物浓度值，可以作为临床分析仪进行血浆测量的参考值。由于红细胞与血浆的比例会有差异，给定体积的样品中存在的分析物浓度也会存在差异，因此血细胞比容测量可能需要对此进行校正。因此，全血测量可以通过血细胞比容测量的方式而校正上述差异，使结果与血浆样品相关的结果保持一致。
在捕获相和检测相试剂与血液中的任何分析物结合后，可以使用永磁铁或电磁场来使顺磁颗粒（包括顺磁颗粒-分析物-标记复合物）从工作电极附近被除去（在图3中，39和40代表反电极/参照电极和工作电极，这两个电极可以通过读数器来配置不同功能）。在这种情况下，可以在工作电极处通过电化学手段检测剩余的标记（直接检测或通过标记催化的反应或标记介导的反应）。
应当理解的是，前面参照图1的描述是关于四通道分析盒的，参照图3和图4的描述是关于单通道分析盒的，但本发明还涉及多通道分析盒例如6通道、7通道或8通道等的分析盒，图12、13和14中显示的是20通道分析盒的实例。每个通道可以进行相同的以实现重复性/精度为目的的反应，或者也可以被设计为用于进行不同的分析—通过这种方式，每个分析盒可能能够进行“多重”反应。
最终，由读数器（例如通过电化学）使用电学、光学或其他适用于待测标记的检测手段来进行测量。例如，如果所述标记是能够催化反应而产生电化学活性产物的酶，则所述检测手段可以是通过所述分析盒内的电极进行的电学手段，见图3（39、40）。图5和图6显示了根据本发明的手持读数器的示意图。读数器（70）包括用于容纳和固定本发明的分析盒（61）的平台（72）。还提供了合适的检测手段；包括与所述分析盒（104）连接的连接器的PCB（103），电路以及用于控制所述读数器和进行分析的计算机芯片和软件。此外，由于所描述的系统具有使用顺磁颗粒执行检测的灵活性，所述仪器能够通过所述分析盒附近的马达（motor）（102）移动永磁铁（101）。例如，可以根据需要朝所述分析盒和远离所述分析盒，或向任何其他方向移动，以操纵所述顺磁颗粒。
在所述平台（72）含有能够导热的材料的情况下，所述读数器还可以通过主动加热的方式来控制加到所述分析盒中的样品的温度。
图5示出了设想的仪器的物理实施方式，其中，可以在所述读数器的屏幕（62）上显示结果。
所述读数器的主要功能如图9中所示，所述读数器的功能性框图如下：
1.分析盒信号测量
2.分析盒温度控制
3.顺磁颗粒操纵
4.校准机构
分析盒信号测量：读数器应该能使每个单独的测试通道产生单独的精确的电信号，以便启动、维持和控制所需的在所述分析盒的某一特定测试通道内进行的电化学反应。这样的电信号的实例为从一个电压电位或开路状态到另一个电压电位状态的步骤；在确定的时间内从一个电位到另一个电位的线性扫描；或产生特定频率或电压幅度的非线性波形，例如正弦波。所述读数器可以使用模拟开关多路复用器，以便在不同的测量通道之间切换。
所述仪器应能够分别从每个测试通道测量电/电化学响应。所述测试分析盒待测量的信号的实例为直流或交流或电压。所述读数器可以使用模拟开关多路复用器，以便在不同的测量通道之间切换。
所述读数器应当具有与所述测试分析盒上的印刷电极物理接触的连接器，以确保所述分析盒传递电信号。此连接器可以直接安装到所述读数器的PCB上。
由于所提出的系统包括能够执行多重测量的分析盒和读数器（例如，在单次加入的测试样品上进行20个单独的测量），因此所述系统是能够利用这些多次测量来产生准确性和可靠性方面更好的结果。在所述测试系统用来对同一分析物进行多个单独的测量的实例中，该系统将能够对所得到的20个结果进行平均值或修剪平均值分析（truncatedmeananalysis）。对于修剪平均值分析，这将涉及所述仪器软件对20个结果在数量级上进行整理，除去几个最高和最低的结果（例如5个），并对剩余的（如10个）结果取平均值。修剪平均值与标准平均值相比的优势在于可以在取平均值之前从数据集中除去统计学（或实际的）离群值。这消除了异常结果使所得的平均值远高于或低于预期结果的风险。
在低成本检测系统的情况下，这种方法带来的具体改进包括能够消除由于各种因素（例如不正确的测试样品体积、不正确的试剂沉积体积、不正确的试剂配方、以及对测试样品通道或相关试剂的物理损伤或环境损伤）引起的异常高或低的结果。在本专利中讨论的系统特别适合于这种修剪平均值分析，因为在所述测试分析盒中的每个样品通道都是真正独立的，包括独立的试剂沉积、独立的检测手段（例如工作电极和反电极）和单独的样品通道。
该系统可以被配置为对多种分析物进行多重测量，从而提高对单一样品中多种分析物的测试结果的准确性。
分析盒温度控制：所述读数器应能够控制所述测试分析盒的温度。所述读数器的机械设计应使得仪器PCB与所述测试分析盒相接触。这样就可以将热源（例如高瓦数的低值电阻，MOSFET晶体管或薄膜柔性印刷电路板加热元件）产生的热量通过仪器PCB偶联到所述分析盒中。这可以通过下述方式实现：在PCB上具有裸铜区域，其一点与所述测试分析盒接触，而另一点与热源接触。
或者，所述读数器的设计可以包括单独的加热模块来将热量传递到所述测试分析盒，所述加热模块由合适的材料例如铝制成。这种单独的加热模块可以置于所述读数器中以使其与所述测试分析盒直接接触。
可以通过在与所述测试分析盒直接接触的表面上放置一个或多个接触式温度传感器，来实现对所述测试分析盒的加热控制。这样，所述读数器可以监测所述测试分析盒所暴露的温度，并通过控制热源而相应调整被转移到所述分析盒的热量。（例如减小或加大通过MOSFET的电流）。
顺磁颗粒操纵：所述读数器应能够将所述测试分析盒的测试通道内含有的顺磁颗粒集中到预定的位置。例如，所述读数器可以将顺磁颗粒集中到测试通道工作电极对面的分析盒的表面上，或者它可以将顺磁颗粒集中到与检测区域在空间上分离的测试通道上的另一位置。实现这一目的的方法之一是使用永久的钕磁铁收集顺磁颗粒。可以安装这样的机构，其中，磁铁可以在单一平面内作物理运动，从而使得在所述机构运动的一个点上所述磁铁与所述分析盒物理接触，这意味着顺磁颗粒由所述磁铁收集，而在另一点上所述磁铁与所述测试分析盒之间物理分离，这意味着所述顺磁颗粒不受到磁铁产生磁场的影响。
所述磁铁在一个平面内的物理移动可以通过下述方式来实现：例如通过使用线性致动器、或通过带有齿轮系统的旋转电机、或通过发条机构、或通过机械弹簧机构、或通过手动机构，以使仪器的使用者启动和控制所述磁铁的运动。
在不同的实施方式中，所述永磁铁可以被替换为电磁铁，在这种情况下，可以通过对所述电磁铁的通电和断电来实现对顺磁颗粒的控制。或者，所述读数器可以在收集顺磁珠的固定位置安装固定的永磁铁。
使用上述不同的方法，读数器可以按照将顺磁珠从先前散布的状态收集至所述分析盒的特定位置的方式影响所述顺磁珠。此位置可能会导致所述顺磁珠在从所述分析盒的一个表面上被移动到另一个表面，或沿所述分析盒的表面移动，或在分析盒的各表面之间移动，或上述运动方式的任意组合。
校准机构：由于在制造所述一次性分析测试盒的过程中存在波动性，通常需要对每一批次的分析盒进行表征，并将特定的校准值输入所述读数器中，以使得所述读数器在报告最终结果之前可以对测试分析盒产生的测试分析应答进行标准化。为了克服此问题，所述读数器可以在其内存中预加载不同的校准参数系列。对于特定的分析盒，读数器可以根据表面安装的电阻值而获知使用哪一系列的校准参数，所述表面安装的电阻可以安装在测试试剂条本身上或安装在单独的基片上，所述基片可以被插入至仪器中，所述仪器与测试试剂条处于独立而不同的位置。然后所述仪器可以测量表面安装的电阻的值，该值与特定的预加载校准参数系列相关联。电阻的系列条带可以与校准代码相关联。或者，所述电阻可以由电容代替，且读数器可以将电容的不同级别与校准代码相关联。或者，所述电阻可以由电感（inductor）代替，且读数器可以将电感的不同级别与校准代码相关联。或者，可以使用电阻、电容和电感的任意组合。
分析显色的物理特征是环境温度可以影响反应的大小。在本发明中，这一温度效应是通过温度对扩散的影响来驱动的，其中，温度上升可以促使顺磁珠与目标分析物、以及标记和目标分析物之间的结合效率的提高。在使用酶的分析中，温度对酶活性的影响对于分析应答而言也很重要。本系统可以被用于例如医生的办公室和家庭中，因此系统可能接触到的温度范围会比较宽，可能为10℃至40℃。消除这种温度影响的一种方法是将测试试剂条加热到预定的温度，例如40℃。这将消除由于温度影响引起的任何分析的波动性。加热所述分析盒也有助于减少任何由于粘度差异产生的血液对血液的影响。因此，所述读数器也可以包括温度控制装置，例如上文所述的加热器。
在一个具体实施方式中，所述样品分析盒和相关读数器被设计为用于进行免疫分析，其中待检测的分析物是抗原，所述结合试剂是抗体。所述顺磁颗粒可以通过连接针对游离抗原或游离和复合抗原的抗体而被功能化。
不应被解释为限制，进一步的描述将涉及到的样品为全血样品，标记检测为酶驱动的电化学检测，且顺磁颗粒作为捕获相。
随着血液填充所述分析盒的样品通道，在初始通道（12）中预先沉积的试剂见图1，且以干试剂形式沉积在每个通道（8、9、10、11）中的试剂被血液重悬并开始结合分析物。在每个通道（8、9、10、11）中沉积的试剂包括被抗-分析物抗体功能化的顺磁颗粒、标记（例如，抗-分析物抗体-酶缀合物）、电化学介质、抗凝血剂、抗嗜异性试剂和稳定剂。与之相对应地，在初始进料通道（12）中沉积的试剂含有酶的底物。
随着血液填充试剂条，干燥的酶底物被重悬，并被血液运输到4个测量通道（其中酶底物是过量的）中。每个通道中的其他试剂随着血液填充各通道而被重悬。抗-分析物抗体-酶复合物立即开始转化底物并与电化学介质反应。电化学介质由还原型转化为氧化型。同时，分析物与免疫分析结合试剂（被抗-分析物抗体和抗-分析物抗体-酶缀合物（标记）功能化的顺磁颗粒）相结合。经过一段预定的时间（结合时间，例如2-4min），使得整个通道中发生的这些反应能够均匀发生。上述过程和下述过程可以在所有4个通道内进行，可以用于相同的分析物，或也可以通过在每个通道改变抗体配对而用于不同的分析物。
电化学分析是在确定的时间开始的；这可以是在结合时间结束时、在结合过程中或在试剂条被填充时立即开始。进行计时电流计测量，以测量介质电化学还原电位下的电流（电化学介质被标记（游离的和结合的）转化为氧化型）。在这一点上，由计时瞬时电流计计算出的所有分析物的浓度将具有相同的速率（每秒的电流）。
在确定结合时间后，将磁铁（永磁铁或电磁铁）施加到与电极表面相对的盖表面上。顺磁颗粒被磁铁的吸引力拉到盖的内表面上。工作电极仅测量紧贴其上方的样品，因此，当顺磁颗粒被拉到与电极相对的盖的内表面时，它们将包括混合的顺磁颗粒群。所述顺磁颗粒群将被分为：没有分析物结合的顺磁颗粒、与分析物结合的顺磁颗粒、以及与分析物和标记结合的顺磁颗粒（完全形成的夹心免疫复合物）。
所形成的夹心免疫复合物的量将与血液样品中的分析物的浓度成比例。血液样品中的分析物浓度越高，形成并在磁收集的过程中被从工作电极附近除去的免疫分析复合物就越多。因此，这一过程改变了在工作电极上的酶标记浓度，并以分析物浓度依赖的方式发生。实时测量这一过程；从而由计时瞬时电流计计算出的速率与酶浓度是成比例的，而酶浓度与分析物浓度成比例。因此，分析物浓度越高（结合的酶越多，形成的免疫分析复合物越多），该速率会越低。因此，分析模式并不是常规的异质分析模式，而更接近是同质分析模式。该分析模式总结在图10中，特别针对使用电化学检测的酶标记。
图10是同质免疫分析模式的示意图，其中各图（A和B）示意性地表示分析盒种通道的横截面，显示了通道顶部（84）和底部（85），并示出了施加磁场之前（图10A）和之后（图10B）的工作电极（81）。在A中，标记颗粒（82）和顺磁颗粒（83）被样品（87）再水化。样品也再水化酶底物和电化学介质，从而使酶标记与所述底物和介质在再水化开始时发生反应。在A中，顺磁颗粒、分析物和标记之间也发生结合反应，并完全形成所示的免疫复合物（86）。虽然只示出了工作电极上方和周围的区域，但是这一过程发生在整个通道中。在A中，在确定的一段结合时间后开始电化学测量；如B所示，将磁铁（80）施加到与电极表面（84）相反的上表面（84）上。不论是否形成免疫复合物，收集所有顺磁颗粒。由顺磁颗粒累积的酶标记的量依赖于形成的免疫复合物的量，而形成的免疫复合物的量与分析物浓度成比例。由于使用了磁铁，顺磁颗粒和完全形成的免疫复合物被从工作电极附近除去，在分析物浓度增加时，电化学测量速率/响应降低。尽管在这个实例中磁力是施加到与工作电极相对的表面，但是可以在样品通道的任何地方施加磁力，从而使顺磁颗粒从所述检测区域中被除去。
在本发明有利的实施方式中，顺磁颗粒和标记被用于通过捕获分析物而形成免疫分析夹心，通过捕获和标记抗体识别不同的抗原表位。在本发明有利的实施方式中，分析模式是使用葡萄糖氧化酶（GOD）作为标记酶。GOD已被广泛用于测量血糖。具体而言，过量的GOD和电化学介质在试剂条中干燥，GOD的血液中所含的葡萄糖发生反应，使电化学介质由氧化型转化为还原型，然后在电极处电化学测量该还原型。此系统效果良好，由于所有的反应组分都过量而使葡萄糖浓度成为速率决定因素。GOD已被用作ELISA测量的酶标记，但是在电化学免疫分析中，GOD已经被认为是相当不敏感的酶标记。这是由于使用了直接偶联的电化学介质。氧气是GOD反应的真正受体，但使用铁氰化物（ferricyanide）作为人工受体来进行电化学偶联反应，所以可以进行电化学测量。与氧气相比，铁氰化物和GOD之间的反应很不利，需要的铁氰化物浓度非常高。在葡萄糖传感器中也可以克服这一问题，因为GOD本身是过量的，所以效率低变得并不重要。在基于酶的免疫分析中，测量酶的浓度，因此，GOD与铁氰化物的不利的相互作用会产生灵敏度问题。本发明的有利实施方式通过使用图11中概括的进一步的偶联反应克服了上述问题：GOD将葡萄糖和氧气分别转化为葡萄糖酸内酯和过氧化氢（使用FAD作为GOD的辅助因子）。存在大量过量的辣根过氧化物酶（HRP）和亚铁氰化物（与葡萄糖相同），因此，任何产生的过氧化氢将立即被HRP利用，以将亚铁氰化物转化为铁氰化物，然后在电极处通过电化学还原反应测量铁氰化物（然后，从电极获得电子，使得铁氰化物又被电化学还原为亚铁氰化物）。GOD的灵敏度大大提高，这是因为它是作为酶标记而不再被迫人为地与铁氰化物反应，它对葡萄糖的转化不再受到阻碍，因此可以测量低浓度的GOD。对于所有的酶标记而言都是这样；自然反应的酶速率大于任何在酶反应中发生测量事件的人为偶联系统。使用的酶级联反应可以避免这个问题，因为在次级反应中酶和介质都是过量的，也都不受速率限制。
采用上述方案具有多种优势：
1.GOD反应不受阻碍，使得可以对GOD浓度进行灵敏的测量。
2.GOD是一种众所周知的可靠而稳定的酶，因此可用于血糖监测产品中。其他标记（如HRP）是已知不稳定的，在本发明实施方式中HRP的不稳定性可以通过酶过量（大大过量）来克服。
3.进行电化学还原反应来测量由GOD/HRP反应生成的铁氰化物的浓度。还原反应将显着降低血液中的电化学干扰物的影响。大多数干扰物都会干扰氧化反应。
4.不存在电化学测量的线性问题，因为的所有组分都大大过量（由于高溶解度），不像一些其他的HRP和其他酶底物（如碱性磷酸酶）难以实现过量。
5.在大多数分析中，背景测量是在校准期间由信号幅度测量确定的。这种背景测量是平均值，通常具有较大的相关错误。背景可以随下述波动性而产生显著变化：所沉积的试剂浓度的波动性、检测区域的波动性、血液与血液的差异等。这降低了大多数分析的灵敏度。在本系统中，背景可以在每个通道中于施加磁场和进行特定的信号测量之前进行测量。在这种方式中，各个测量可以进行单独的背景校正，这有利于获得非常灵敏而精确的分析结果。
由于所述分析盒能够具有多个通道，这极大地拓展了分析物测量的范围。例如，典型的免疫分析的剂量反应曲线是反曲型（sigmoidal）的。这是由试剂饱和导致（不足量的试剂以维持线性结合）的，或由标记/检测方法的饱和导致（即检测方法变得饱和，不能再以线性方式测量标记）的。然而，如果需要，本发明的平台可以在整个测量范围内实现完全线性的响应，这可以通过在不同的通道中设置不同的试剂或试剂浓度来实现。例如，读数器可以测量一个通道中标记的浓度，该通道中的试剂被设计和制造为具有非常高的灵敏度，但是范围有限。在另一个通道中的试剂可以被设计和制造为针对相同分析物具有较低灵敏度，但具有更大的范围。因此，如果在第一通道中获得的信号超过阈值（即在校准过程中超出了分析设置的可测量范围，表示分析物浓度高），则可以使用来自另一通道的信号，反之亦然，如果从所述第二通道获得的信号低于其阈值（即在校准过程中低于设置的可测量范围，表示分析物浓度低），则可以使用于来自第一通道的信号以确定分析物浓度。本发明的平台有利于以不同的方式实现整个可测量范围内的线性响应，这将有利于进行更准确的校准，获得更好的样品内精度和样品间精度，产生更好的ATE。如果在从所述检测区域除去顺磁颗粒复合物之前进行测量，就得到背景测量结果，该结果可以用于对结果进行标准化，从而对任何波动性进行校正，所述波动性可能存在于例如标记浓度或暴露的检测区域等。
多通道还提供了在同一分析盒内组合不同测试的功能，其中一个通道可以含有被设计用于测量例如肌酸激酶（CK）的试剂，另一个通道可以含有被设计用于测量例如天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的试剂，另一个通道被设计为用于测量例如血细胞比容（Hct）。这样的组合测试在兽医领域具有很大的潜力，可用于分析例如来自马的血液样品。对于上述分析物，可以使用如图10中描述的方案通过夹心免疫分析法来测量CK和AST。CK和/或AST也可以通过酶联反应利用其产生可检测反应产物的酶活性而被检测。这些测试可以与通过测量两个电极之间的血液样品的电导率来测量血细胞比容的分析盒相组合。也可以在通道内检测不同的分析物。例如，可以针对不同分析物分别对具有不同发射波长（emissions）的荧光标记进行功能化，并针对所有阅读器中的待测分析物对磁性颗粒进行功能化，所述阅读器具有从所有不同的标记发射波长处读取产生的信号的检测能力。
下述实验数据来自本发明的具体实施方式。用市售的恒电位仪代替读数器来进行信号的电化学检测。
总PSA的电化学分析（I）
材料
中性链亲和素（Neutravidin）：ThermoScientific，产品目录号31000（中性链亲和素生物素结合蛋白）。
马来酰亚胺-PEG2-生物素：ThermoScientific，产品目录号21901（EZ连接的马来酰亚胺-PEG2-生物素）。
乳胶颗粒：Invitrogen，产品目录号C37259（CML乳胶，4%w/v，10μm）
顺磁颗粒：Ademtech，产品目录号03223（200nm链霉抗生物素蛋白（Strep）+顺磁颗粒）
抗体1H12：Hytest，产品目录号4P33MAb1H12（抗-PSA，人）
抗体5A6：Hytest，产品目录号4P33MAb5A6（抗-PSA，人）
bGOD：Rockland，产品目录号B000-07（生物素化的葡萄糖氧化酶）
PBS：ThermoScientific，产品目录号28372（BupH磷酸缓冲盐溶液包）
BSA：Sigma，产品目录号A4503-50G（白蛋白，来自牛血清）
水：Sigma，产品目录号W4502（分子生物学用水）
乙酸铵：Sigma，产品目录号A1542-250G（乙酸铵）
MES：Sigma，产品目录号M8250-25G（MES水合物）
亚铁氰化物：Sigma，产品目录号P3289-100G（亚铁氰化钾）
葡萄糖：Sigma，产品目录号G8270-1KG（D-（+）-葡萄糖）
HCl：Sigma，产品目录号H1758-100ML（盐酸，36.5-38%）
NaOH：Sigma，产品目录号72068（氢氧化钠溶液）
HRP：BBI酶，产品目录号HRP4C（辣根过氧化物酶）
2MEA：ThermoScientific，产品目录号20408（2-巯基乙醇胺盐酸盐）
PSA标准品（根据WHO1stIRP（96/670）校准）：PerkinElmer，产品目录号A073-301（预状态PSA游离（ProStatusPSAfree）/总PSA试剂盒，Delfia）
生物素定量试剂盒：ThermoScientific，产品目录号28005（Pierce生物素定量试剂盒）
尺寸排阻色谱柱：GEHealthcare，产品目录号17-0851-01（PD10柱）
EDTA：Sigma，产品目录号EDS-100G（无水乙二胺四乙酸）
Tween：Sigma，产品目录号P7949-100ML（吐温-20）
DMSO：ThermoScientific，产品目录号20684（二甲亚砜）
乙酸：Sigma，产品目录号32,009-9（乙酸）
试剂的制备
抗体生物素化
抗体二硫键还原
在含1mMEDTA的PBS中，使用2MEA还原抗体1H12和5A6，在37℃下反应90min。还原的抗体通过PD10柱并收集于含1mMEDTA的PBS中，发现级分含有汇集的蛋白质（通过紫外分光光度计在280nm下测量）。还原抗体的浓度用280nm下抗体的消光系数1mg/ml=1.4吸光度单位来进行计算。
马来酰亚胺-PEG2-生物素与抗体的结合
将摩尔过量的马来酰亚胺-PEG2-生物素加入至还原的抗体中，以使发生有效的结合，在室温下温育3小时。然后使其通过另一个已预先用含1mMEDTA的PBS（pH7.2）平衡的PD10柱。收集500μL的级分，并用紫外分光光度计在280nm下测量。选择并合并含有显著蛋白水平的级分。再次测量此溶液中的样品在280nm下的吸光度，并用280nm下抗体的消光系数1mg/ml=1.4吸光度单位来确定抗体的浓度。然后根据制造商的说明书，使用Pierce生物素定量试剂盒确定每个抗体上结合的生物素的量。
乳胶
中性链亲和素吸附
在MES缓冲液（50mMMES，pH6.5）中洗涤10μm的乳胶，用16100×g在4℃下离心5min以沉淀颗粒。以2%固体的浓度重悬乳胶。以400μg/ml的浓度在水中制备中性链亲和素。将2%的乳胶和400μg/ml的中性链亲和素等体积充分混合。在室温下于旋转混合器（30rpm）中温育18小时。然后在等体积的PBS（pH7.2）中洗涤颗粒3次（使用16100×g在4℃下离心5min），并在相同的溶液中以2%固体浓度重悬。
生物素化的GOD和生物素化的抗体5A6与乳胶的结合
在50mM乙酸铵（pH4.2）中洗涤10μm的乳胶（使用16100×g在4℃下离心5min），再在相同的溶液中以1%固体的浓度重悬。将生物素化的GOD用50mM乙酸铵（pH4.2）稀释到浓度为160μg/ml。将生物素化的抗体5A6用50mM乙酸铵（pH4.2）稀释到浓度为40μg/ml。将40μg/mlB5A6与160μg/ml的bGOD等体积混合。将混合物与1%的中性链亲和素包被的乳胶以1:1混合。将此溶液充分混合后在旋转混合器（30rpm）上于室温下振荡温育30min。
然后将颗粒用等体积的pH7.2的PBS洗涤4次（使用16100×g在4℃下离心5min），以除去任何未结合的生物素化的GOD和生物素化的抗体，并在pH7.2的PBS中重悬，以获得1%固体的乳胶浓度。
顺磁颗粒
抗体与颗粒的结合
将200nm的链霉抗生物素蛋白包被的顺磁颗粒（使用磁力分离器）在含0.1%Tween、pH7.2的PBS中洗涤并在相同溶液中重悬，得到0.5%固体的浓度。将生物素化的抗体1H12在含0.1%Tween、pH7.2的PBS中稀释至50μg/ml。将0.5%的顺磁颗粒和50μg/ml的生物素化的抗体等体积混合，并在旋转混合器（30rpm）上于室温下振荡温育30min。
然后将顺磁颗粒在等体积的含0.1%Tween、pH7.2的PBS中洗涤4次（使用磁力分离器），并重悬于相同的溶液中，以得到1%固体的顺磁颗粒浓度。
分析过程
在eppendorf管中按下述体积和浓度混合各分析试剂：
所有试剂分别加入eppendorf管中，并保持分离。直到加入10μl反应缓冲液后再进行最后的混合（反应缓冲液含有1MMES，pH6.0，200mM葡萄糖，200mM亚铁氰化物，2mg/mlHRP）。
将上述试剂充分混合后取0.7μl加入分析盒中，所述分析盒与恒电位仪（AutolabPGSTAT12）相连接。所述分析盒由单一通道组成，通道两端有2个丝网印刷的碳电极（一个工作电极和一个反电极/参考电极），如图3和图4所示。测量通过如下所述的消减方法进行。
消减分析
温育4.5min后，将恒电位仪从开路状态调节至-0.1V，每0.1秒记录一次瞬时值的数据点。温育5min后，将磁铁以从工作电极处除去顺磁颗粒复合物（即移至与电极相对的表面上）的方式施加至所述分析盒。继续记录随后5min的瞬时值结果。用电位变为-0.1V之后200秒和300秒附近获得的数据来计算工作电极上的反应速率。
分析机构的概述
在该分析机构（如图11所概述）中，试剂混合后，GOD立即将葡萄糖转化为葡萄糖酸内酯，同时将氧气转化为过氧化氢。然后，过氧化氢作为HRP的底物，使得亚铁氰化物被氧化为铁氰化物。因此，产生的铁氰化物的浓度依赖于产生的过氧化氢的浓度，而产生的过氧化氢的浓度依赖于GOD的浓度。铁氰化物的浓度由计时电流法测得，在该情况下，在双电极系统中测量-0.1V电位下工作电极和反电极/参考电极之间产生的电流。当施加磁铁时（在工作电极的正上方且远离工作电极的相对表面上），顺磁颗粒将朝磁铁移动而远离工作电极的附近区域。依赖于PSA浓度，一些包被在GOD中的标记颗粒通过PSA与顺磁颗粒相连接而被除去。在这种情况下，（被测量的）工作电极表面的GOD浓度将下降，下降的方式依赖于被除去的标记颗粒的量，而被除去的标记颗粒的量依赖于样品中的PSA浓度。
结果与讨论
图7示出了反应使用湿试剂分析盒进行的总PSA消减分析的实验结果。分析在缓冲液基质中进行，使用0.7μl的样品体积，总分析时间为10min。0fM的PSA结果显示了不同日期进行的4个独立测量的平均值和2倍标准差的误差。所有其他数据点代表单次测量结果。X轴代表以fM为单位的总PSA浓度。y轴代表A/s为单位的反应速率。
图7所示数据表明这种分析模式得到了非常高的灵敏度，从零水平的对照到水平远低于10fM的总PSA浓度范围内都可以很容易地被检测。数据表明，可测量的范围大约为2个数量级（1.57-155fM），在总PSA水平升高时，应答曲线反应总体上在各数据点之间的差异降低。
在消减分析中，由于磁铁将通过PSA与电化学标记复合的顺磁颗粒从工作电极附近被除去，因此反应速率随着总PSA浓度的升高而降低。由于反应速率与电化学标记的浓度成比例，这一下降应与被除去的总PSA水平的升高相对应。应注意的是，本次分析中使用的PSA样品已根据世界卫生组织（WHO）1stIRP（96/670）对总PSA进行了校准。
这一分析的灵敏度和可测量的范围可以通过以下手段进行调节，例如优化试剂的组成和浓度、以及结合时间和测量时间。
这一分析的测量方式没有对背景信号的波动性（由试剂体积、工作电极面积等引起的电位波动性）进行校正。然而可以设想的是，在对每个通道中的每个样品进行具体测量之前，可以对测量进行微调以使得可以进行准确的背景测量。例如，这可以通过更早地开始在-0.1V的电化学测量（例如，在温育2min而不是4.5min之后），并使其在向试剂条施加磁场之前达到稳定的速率。在施加磁场后，该速率会发生变化，而速率的变化与PSA浓度成比例，那么初始速率即为背景测量值。
下述实验数据来自本发明的具体实施方式。用市售的荧光板读数器（PerkinElmerVictor3V）代替读数器来进行信号的荧光检测。
游离PSA的荧光干法分析
材料：
马来酰亚胺-PEG2-生物素：ThermoScientific，产品目录号21901（EZ交联的马来酰亚胺-PEG2-生物素）。
乳胶颗粒：Invitrogen，产品目录号F8827（FluoSpheres，羧酸改性微球，2μm，黄绿色荧光）
顺磁颗粒：Ademtech，产品目录号03223（200nm，链霉抗生物素蛋白+磁性颗粒）
抗体8A6：Hytest，产品目录号4P33MAb8A6（抗-PSA，人）
抗体5A6：Hytest，产品目录号4P33MAb5A6（抗-PSA，人）
PBS：ThermoScientific，产品目录号28372（BupH磷酸缓冲盐溶液包）
BSA：Sigma，产品目录号A4503-50G（白蛋白，来自牛血清）
水：产品目录号W4502（分子生物学用水）
海藻糖：Sigma，产品目录号T9531-25G（无水D-（+）-海藻糖）
MES：Sigma，产品目录号M8250-25G（MES水合物）
HCl：Sigma，产品目录号H1758-100ML（盐酸，36.5-38%）
NaOH：Sigma，产品目录号72068（氢氧化钠溶液）
2MEA：ThermoScientific，产品目录号20408（2-巯基乙醇胺盐酸盐）
PSA标准品（根据WHO1StIRP（96/670）校准）：PerkinElmer，产品目录号A073-301（预状态PSA游离/总试剂盒，Delfia）
生物素定量试剂盒：ThermoScientific，产品目录号28005（Pierce生物素定量试剂盒）
尺寸排阻色谱柱：GEHealthcare，产品目录号17-0851-01（PD10柱）
EDTA：Sigma，产品目录号EDS-100G（无水乙二胺四乙酸）
Tween：Sigma，产品目录号P7949-100ML（吐温-20）
DMSO：ThermoScientific，产品目录号20684（二甲亚砜）
乙酸：Sigma，产品目录号32,009-9（乙酸）
试剂的制备
抗体生物素化
抗体8A6的二硫键还原
所用的未稀释抗体8A6储液的浓度为2-7mg/ml。取出适当体积含1mg抗体的储液。用合适体积的含14.28mMEDTA的PBS（pH7.2）添加至1mg抗体，使EDTA的浓度为1mM。
将6mg的2MEA溶解于100μl的pH7.2、含1mMEDTA的PBS中。每10μl抗体溶液加入1μl这样的2MEA溶液。混合所得溶液，并在37℃水浴中温育90min。
然后将该溶液通过PD10柱（用pH7.2、含1mMEDTA的PBS中预平衡），并收集500μl的级分。从每一级分中取样并用紫外分光光度计测量280nm下的吸光度，以定量测量各级分中存在的蛋白质。选择并合并含有显著蛋白质浓度的级分，并在紫外分光光度计上重新测量。这种测量方法用于采用280nm下的抗体的消光系数1mg/ml=1.4吸光度单位来确定抗体浓度。
马来酰亚胺-PEG2-生物素与抗体的结合
将马来酰亚胺-PEG2-生物素溶于pH7.2、含1mMEDTA的PBS中，得到20mM的溶液。将适当体积的该溶液加入还原的抗体中，使得马来酰亚胺-PEG2-生物素的摩尔量超过还原抗体的摩尔量40倍。然后混合并在室温下温育3小时。
然后使该混合物通过另一个已预先用含1mMEDTA的PBS（pH7.2）平衡的PD10柱。收集500μL的级分，并用紫外分光光度计在280nm下测量。选择并合并含有显著蛋白水平的级分。再次测量此溶液中的样品在280nm下的吸光度，并用280nm下抗体的消光系数1mg/ml=1.4吸光度单位来确定抗体的浓度。然后根据制造商的说明书，使用Pierce生物素定量试剂盒确定每个抗体上结合的生物素的量。
乳胶
抗体吸附
在MES缓冲液（50mMMES，pH6.5）中洗涤2μm的乳胶，并用16100×g在4℃下离心8min以沉淀颗粒。以2%固体的浓度重悬乳胶。以250μg/ml的浓度在MES缓冲液中制备抗体5A6。将2%的乳胶和250μg/ml的抗体等体积充分混合。在室温下于旋转混合器（30rpm）中温育18小时。然后在等体积的PBS（pH7.2）中洗涤颗粒3次（使用16100×g在4℃下离心8min），并在相同的溶液中以2%固体浓度重悬。
顺磁颗粒
抗体与颗粒的结合
将200nm的链霉抗生物素蛋白包被的顺磁颗粒（使用磁力分离器）在含0.1%Tween、pH7.2的PBS中洗涤并在相同溶液中重悬，得到0.5%固体的浓度。将生物素化的抗体8A6在含0.1%Tween、pH7.2的PBS中稀释至50μg/ml。将0.5%的顺磁颗粒和50μg/ml的生物素化抗体等体积混合，并在旋转混合器（30rpm）上于室温下振荡温育30min。
然后将顺磁颗粒在等体积的含0.1%Tween、pH7.2的PBS中洗涤4次（使用磁力分离器），并重悬于相同的溶液中，以得到1%固体的顺磁颗粒浓度。
试剂沉积
将试剂稀释并合并，以得到最终含有以下组分的沉积溶液：
0.02%的经抗体5A6功能化的乳胶颗粒，于pH7.2的PBS中，
0.1%的经抗体8A6功能化的顺磁颗粒，于pH7.2的PBS中，
180mg/mlBSA，于pH7.2的PBS中，
1mg/ml的海藻糖，于pH7.2的PBS中，
用于干法分析的分析盒如图2所示，只是在基片（23）上没有电极。基层（20）和粘胶层（21）合并，并施加均匀的压力使这些层密封在一起，以形成半组装分析盒。
将0.5μl的沉积溶液用移液管沉积至所述半组装分析盒的通道（24）内。
置于40℃下干燥30min。
然后把盖（22）置于所述半组装分析盒上，并施加均匀的压力使完全形成的分析盒密封，干燥通道内的试剂而完成沉积。
分析过程
将2.5μl的PSA标准品加到所述分析盒内，以填充4个通道并使干燥的试剂重悬。
将所述分析盒置于室温下温育8min，以促使结合反应发生。
将所述分析盒置于定制的托架上，用PerkinElmerVictor3V在通道内进行测量。
使用内置的程序‘Fluorescein（485nm/535nm，0.1s）’测量通道内的荧光信号。这个程序使用的激发波长（excitation）为485nm，发射波长为535nm，测量时间0.1秒。此信号被记录为Fin1。
然后将磁铁施加到分析盒上，以便将顺磁颗粒（以及任何顺磁颗粒结合的组分）从通道中除去。
使用内置的程序‘Fluorescein（485nm/535nm，0.1s）’再次测量通道内的荧光信号。此信号被记录为Fin2。
计算这两个信号的差值（Fin1-Fin2），将结果对游离PSA浓度作图，如图8所示。
结果与讨论
图8所示的数据表明这种荧光分析模式得到了非常高的灵敏度，从零水平的对照到58fM的游离PSA浓度范围内都可被检测。数据表明，可测量的范围大约为2个数量级（58-5000fM），在总PSA水平升高时，应答曲线反应总体上在各数据点之间的差异降低。
在该消减分析中，Fin1的信号与PSA浓度无关，而由于磁铁将通过PSA与荧光标记复合的顺磁颗粒从通道中除去，Fin2的信号随着游离PSA浓度的升高而降低。因此，两个信号之间的差值随着PSA浓度的增加而增加。
应注意的是，本次分析中使用的PSA样品已根据世界卫生组织（WHO）1stIRP（96/670）对总PSA进行了校准。
这一分析的灵敏度和可测量的范围可以通过以下手段进行调节，例如优化试剂的组成和浓度、以及结合时间和激发与发射波长。
这一分析的方式和本文中描述的其他分析的方式是通过使用两个测量值之间的差异来对背景的波动性（由试剂体积、工作电极面积等引起的电位波动性）的信号进行校正。这有利于进行更灵敏和准确的测量。
以下更多的实验数据用于说明本发明的具体实施方式的优势。
方法研究
开发了另一种方法，用于在所描述的消减分析方法（即从检测区域中除去结合标记的磁性颗粒的方法）中测量标记的葡萄糖氧化酶（GOD）（或其它的酶标记物）。因此，测量未结合的GOD标记并用于确定分析物的浓度。在磁分离之前/从检测区域除去结合的GOD标记之后测量GOD标记的浓度。然后用这两个测量值计算标记浓度的相对变化，并确定分析物的浓度。
在分析结合时间里，同时发生酶反应（所有反应均在检测区域内发生）。示例性GOD检测级联反应示于图11，其中通过利用过氧化氢的过氧化物酶将亚铁氰化物转化为铁氰化物。在本节和下文所讨论的例子中，在GOD检测级联反应中，使用ABTS代替亚铁氰化物，ABTS被利用过氧化氢的过氧化物酶转化为氧化的ABTS。因此，在这一实例中，在分析结合时间内（例如4min），GOD检测级联反应产生氧化的ABTS。因此，用磁场从检测区域内去除GOD标记-磁性颗粒分析复合物后，在更大的背景电流条件下测量GOD标记浓度的变化。在前面的例子中，我们已经使用了速率测量，以进行高度准确的GOD浓度结果，并由此获得分析物浓度。我们已经开发了另一种电化学法，也可以对GOD浓度实现非常精确的测量。
典型的GOD滴定曲线示于图16，其中绘制的电流值取自3秒瞬时值的3秒时间点，在进行计时计测量之前，使GOD与底物系统反应2min。观察到了线性应答。对于上述测量使用了4个通道的试剂条（如图15所示）。
因此，在酶促反应2min后，确定的GOD浓度会产生某一电流。如果我们使酶促反应再进行两分钟，确定的GOD浓度所产生的电流将更大。因此，在磁分离后，将在大背景电流的条件下确定未结合的GOD标记的浓度（在4min分析结合过程中发生4min的酶促反应）。因此，我们开发了以下技术来克服这个问题。
为了防止由GOD产生大量氧化的ABTS，在分析结合时间（例如4min）内在电极上施加电化学电位。在这个实例中，施加-350mV的电位，然而，对于任何酶/介质系统，也可以使用适当的电位。在4min时间内，向试剂条施加-350mV的电位以促使两个基本过程的发生。首先，它可以测量GOD标记浓度，其次它显著降低了4min的检测结合时间所产生的氧化ABTS的量（由此测量了GOD标记浓度下的电流幅度）。
GOD滴定应答示于图17，其中绘制的电流值取自240秒瞬时值的3秒时间点。因此这种应答可用于分析GOD浓度，或在免疫分析过程中用于作为磁分离前（即除去GOD结合的磁性颗粒之前）的GOD标记浓度的测量。这一GOD浓度可以与最终的未结合的GOD标记浓度结合使用，以校正GOD标记浓度的波动性。
虽然从产生的240秒瞬时值中使用了3秒的时间点测量，但是在这一瞬时值中可以采用任何时间点来确定GOD浓度。在240秒后，关闭-350mV的电位，试剂条返回到开路电位（OCP）。在这个实例中所描述的GOD反应进行2min（OCP，未施加电位），然后进行3秒的计时计测量。然后用从3秒瞬时值产生的3秒电流值对GOD浓度作图（见图18）。观察到线性的、非常准确的应答。这一测量代表磁分离后未结合的GOD标记浓度的测量。可以将该磁分离后GOD标记浓度和磁分离前GOD浓度一起使用，以确定分析物浓度。
图19显示了正常的2minGOD滴定曲线和在施加-350mV电位4min（240秒）后的GOD滴定曲线。应答非常相似。应答间的小偏移是由在施加-350mV电位240秒过程中累积的少量氧化ABTS和背景电流间的差异所引起的。如果未施加240秒的-350mV电位，应比较6min总GOD转化率相对2minGOD反应。在本分析方案的条件下，将测量磁分离后GOD浓度和在分析结合时间的磁分离前阶段产生的4min电流。
然后将这种测量方法应用到总PSA的免疫分析测量中，以证明测量的可用性。试验中将结合实验试剂的变化，以显示PSA分析的动态范围的增加。
下面是本发明的具体实施方式产生的实验数据。使用市售的恒电位仪代替读数器进行信号的电化学检测。
总PSA的电化学分析（Ⅱ）
材料：
PSA：Hytest，产品目录号8P78（前列腺特异性抗原）
ABTS：Fluka，产品目录号11557
Zeba尺寸排阻色谱柱：ThermoFisherScientific，产品目录号89882
SPDP：Pierce，产品目录号21857
GOD：BBIEnzymes，产品目录号GO3B3（葡萄糖氧化酶）
马来酰亚胺-PEG2-生物素：ThermoScientific，产品目录号21901（EZ-交联马来酰亚胺-PEG2-生物素）。
乳胶颗粒：Invitrogen，产品目录号F8765（1μm）
顺磁颗粒：Ademtech，产品目录号03223（200nm链霉抗生物素蛋白+顺磁颗粒）
抗体1H12：Hytest，产品目录号4P33MAb1H12（抗-PSA，人）
抗体5A6：Hytest，产品目录号4P33MAb5A6（抗-PSA，人）
PBS：ThermoScientific，产品目录号28372（BupH磷酸缓冲盐溶液包）
BSA：Sigma，产品目录号A4503-50G（白蛋白，来自牛血清）
水：产品目录号W4502（分子生物学用水）
MES：Sigma，产品目录号M8250-25G（MES水合物）
葡萄糖：Sigma，产品目录号G8270-1KG（D-（+）-葡萄糖）
DTT：Pierce，产品目录号20290
HCl：Sigma，产品目录号H1758-100ML（盐酸，36.5-38%）
NaOH：Sigma，产品目录号72068（氢氧化钠溶液）
HRP：BBIEnzymes，产品目录号HRP4C（辣根过氧化物酶）
2MEA：ThermoScientific，产品目录号20408（2-巯基乙醇胺盐酸盐）
生物素定量试剂盒：ThermoScientific，产品目录号28005（Pierce生物素定量试剂盒）
尺寸排阻色谱柱：GEHealthcare，产品目录号17-0851-01（PD10柱）
EDTA：Sigma，产品目录号EDS-100G（无水乙二胺四乙酸）
Tween：Sigma，产品目录号P7949-100ML（吐温-20）
DMSO：ThermoScientific，产品目录号20684（二甲亚砜）
试剂的制备
抗体生物素化
抗体二硫键还原
在含1mMEDTA的PBS中，使用50mM2MEA还原抗体1H12，在37℃下反应90min。还原的抗体通过PD10柱并收集于含1mmEDTA的PBS中，发现级分含有汇集的蛋白质（通过紫外分光光度计在280nm下测量）。用280nm下抗体的消光系数1mg/ml=1.4吸光度单位来计算还原的抗体的浓度。
马来酰亚胺-PEG2-生物素与抗体的结合
将摩尔过量的马来酰亚胺-PEG2-生物素加入至还原的抗体中，以使发生有效的结合，在室温下温育3小时。然后使其通过另一个已预先用含1mMEDTA的PBS（pH7.2）平衡的PD10柱。收集500μL的级分，并用紫外分光光度计在280nm下测量。选择并合并含有显著蛋白水平的级分。再次测量此溶液中的样品在280nm下的吸光度，并用280nm下抗体的消光系数1mg/ml=1.4吸光度单位来确定抗体的浓度。然后根据制造商的说明书，使用Pierce生物素定量试剂盒确定每个抗体上结合的生物素的量。
乳胶
GOD/1H12通过SPDP与乳胶的结合
在含1mM的EDTA的PBS缓冲液中，使乳胶颗粒以1%固体的浓度与1mM的SPDP结合。将混合物在室温和黑暗条件下温和振荡温育90min。使用摩尔过量的SPDP:GOD/1H12，使GOD/5A6缀合物与SPDP结合并在室温和黑暗条件下温育90min。90min后，在pH4.5下向一部分GOD/5A6-SPDP中加入DTT，再在室温和黑暗条件下温育30min，以使GOD/5A6-SPDP还原。在指定的结合时间后，将乳胶颗粒以1%固体的浓度用含1mMEDTA的PBS缓冲液洗涤（分别使用离心和超声处理进行沉淀和重悬）。使GOD/5A6-SPDP反应物经过Zeba脱盐柱并在用1mM的EDTA的PBS收集。然后混合乳胶-SPDP和GOD/5A6-SPDP，使得GOD/5A6-SPDP相对于乳胶-SPDP的结合位点过量。将该结合反应物在室温和黑暗条件下温和振荡温育19小时。然后用含0.1%吐温的PBS洗涤该结合反应物，并以1%固体浓度重悬，并在4℃下避光储存备用。
顺磁颗粒
抗体与颗粒的结合
将200nm的链霉抗生物素蛋白包被的顺磁颗粒（使用磁力分离器）在含0.1%Tween、pH7.2的PBS中洗涤，并加入生物素化的抗体1H12中，以使生物素化的抗体与链霉抗生物素蛋白包被的顺磁颗粒相结合，在室温下温和振荡温育1h10min。然后将顺磁颗粒在等体积的pH7.2的PBS中洗涤4次（使用磁力分离器），并重悬于相同的溶液中，以得到1%固体的顺磁颗粒浓度，并在4℃下储存备用。
分析过程
在eppendorf管中按下述体积和浓度加入各分析试剂：
1%的顺磁颗粒（与b1H12结合）：1μl
1%的乳胶（与bGOD和b5A6结合）：1μl
PSA（10×终浓度，溶于含300mg/mlBSA的PBS中）：1μl
所有试剂分别加入eppendorf管中，并保持分离。直到加入7μl反应缓冲液后再进行最后的混合（反应缓冲液含有500mMMES，pH6.7，250mM葡萄糖，15mMABTS，4mg/mlHRP，0.14%Tween）。
将上述试剂充分混合后取4μl加入分析盒中，所述分析盒与恒电位仪（AutolabPGSTAT12）相连接。免疫分析反应物包括结合反应的所有试剂（抗-PSA抗体磁性颗粒、PSA分析物、抗-PSA抗体-GOD标记）和酶促反应的所有试剂（葡萄糖、HRP、ABTS），所述分析盒由4个通道组成，其中3个通道中两端均有2个丝网印刷的碳电极（一个工作电极和一个反电极/参考电极），另一个通道两端有2个丝网印刷的银/氯化银电极，如图1和图15所示。在这个实验中，使用含有丝网印刷的碳电极的3个通道进行测量，具体如下：
实验方法
在试剂混合后结合反应和酶促反应立即开始。这些反应都发生在检测区域内。在30秒后，将-350mV的电位施加到试剂条上240秒（显示为瞬时值）。记录来自240秒的瞬时值的3秒电流值（也可以使用瞬时值的其他点）。该值表示试剂条的检测区域（工作电极）上的抗-PSA抗体-GOD标记的浓度测量值，并被称为磁分离前电流/测量值。在210秒后向试剂条施加磁场。抗-PSA抗体的磁性颗粒-PSA-抗-PSA抗体-GOD标记复合物被从检测区域除去，留下未结合的抗-PSA抗体-GOD标记。在240秒后（磁分离步骤后）关闭-350mV的电位，检测区域/试剂条回到OCP状态。使试剂条保持OCP状态2min后进行计时计测量。然后记录3秒瞬时值的3秒电流值；这被称为磁分离后电流/测量值。重复该过程以进行所有的PSA浓度分析。
结果与讨论
未经校正的磁分离后PSA浓度测量值示于图20。观察到随着PSA浓度增加，电流值呈系统性下降。然而在低PSA浓度范围内精确度很高，虽然平均值与PSA浓度呈系统性相关的误差较大。
PSA分析结果的波动性是由磁分离前电流/测量值的波动性所引起的。如下面的分析所示。对于所有浓度和重复试验，磁分离后电流和磁分离前电流之间的差异示于图21。该数据以图形方式示于图22。
与未经校正的磁分离后电流相比，PSA分析性能有所改善，表现为灵敏度和整体精确度的增强。当考虑到磁分离后的电流和磁分离前的电流之间的变化的比例时，可以进一步改进PSA分析。磁分离后电流与磁分离前电流的比例示于图23，该数据以图形方式示于图24。PSA性能的进一步改进表现在灵敏度和精确度方面。虽然对于磁分离前电流的讨论主要是基于抗-PSA抗体-GOD标记的影响，但我们充分也认识到，用于标准化的磁分离前应答/电流其实是所有输入因子（抗-PSA抗体-GOD标记、工作电极的尺寸、介质浓度、槽深度（cellheight）、HCT等）相互作用的结果，因此，可以用于校正多种来源的检测波动性。
试剂条的形式（4通道、20通道等）有利于对相同的待测分析物进行多次测量或对相同的分析物进行多重测量。即使是粗略校正，即用磁分离后（试剂条内的三个测量值）的平均电流减去磁分离前（试剂条内的三个测量值）的平均电流，也可以改进分析性能（见图25）。在这种情况下，虽然进行（在一个试剂条内）测量分析物3次的分析，可以用平均应答值来确定样品的分析物/PSA浓度。由于每次测量的精确度都有所改进，因此可以观察到对分析物剂量的非常精确的测量结果（这在本文其他地方有所讨论）。然而，即使在使用平均值粗略校正的方法中，磁分离前电流的测量也是非常有利的。
下面为本发明的具体实施方式产生的实验数据。用市售的恒电位仪代替读数器进行信号的电化学检测。
总PSA的电化学分析（III）
材料：
EDC：Sigma，产品目录号03449
磺基-NHS：ThermoFisherScientific，产品目录号24510
乳胶颗粒：Invitrogen，产品目录号F8827（2μm，羧基表面）
抗体1H12：Hytest，产品目录号4P33MAb1H12（抗-PSA，人）
抗体5A6：Hytest，产品目录号4P33MAb5A6（抗-PSA，人）
GOD：BBIEnzymes，产品目录号GO3B3（葡萄糖氧化酶）
顺磁颗粒：Chemicell，500nm，SiMag-羰基
PBS：ThermoScientific，产品目录号28372（BupH磷酸缓冲盐溶液包）
BSA：Sigma，产品目录号A4503-50G（白蛋白，来自牛血清）
水：产品目录号W4502（分子生物学用水）
乙酸钠：Sigma，产品目录号58750
MES：Sigma，产品目录号M8250-25G（MES水合物）
Tris：Sigma，产品目录号93362（Trizma碱）
亚铁氰化物：Sigma，产品目录号P3289-100G（亚铁氰化钾）
葡萄糖：Sigma，产品目录号G8270-1KG（D-（+）-葡萄糖）
HCl：Sigma，产品目录号H1758-100ML（盐酸，36.5-38%）
NaOH：Sigma，产品目录号72068（氢氧化钠溶液）
HRP：BBIEnzymes，产品目录号HRP4C（辣根过氧化物酶）
PSA：Hytest，产品目录号8P78（前列腺特异性抗原）
EDTA：Sigma，产品目录号EDS-100G（无水乙二胺四乙酸）
Tween：Sigma，产品目录号P7949-100ML（吐温-20）
DMSO：ThermoScientific，产品目录号20684（二甲亚砜）
乙酸：Sigma，产品目录号32,009-9（乙酸）
海藻糖：Sigma，产品目录号T9531（二水合D-（+）-海藻糖）
试剂的制备
使用EDC将乳胶与GOD和5A6结合
将1%的乳胶颗粒与溶于50mM、pH6.0的MES缓冲液的20mg/mlEDC和20mg/ml磺基-NHS在室温和黑暗条件下温育20min。用50mM、pH4.6的乙酸钠洗涤乳胶颗粒，并用相同的溶液以1%固体的浓度重悬。
使乳胶-EDC与GOD和5A6抗体在50mM、pH4.6的乙酸钠中混合，使其终浓度为0.5%的乳胶、1.5mg/ml的GOD和0.5mg/ml的5A6。在室温下温和振荡温育3小时10分钟。
用50mM、pH7.1的Tris缓冲液洗涤乳胶颗粒，并在4℃下温育过夜。在含0.1%吐温的PBS中洗涤乳胶颗粒，并以0.5%固体的浓度重悬于相同的溶液中。在4℃下避光储存备用。
使用EDC使顺磁颗粒与抗体1H12的结合
将1%的顺磁颗粒与溶于50mM、pH6.0的MES缓冲液中的20mg/mlEDC和20mg/ml磺基-NHS在室温下温和振荡温育20min。用PBS洗涤并以1%固体的浓度重悬。
在室温下，将0.5%的顺磁颗粒-EDC与0.5mg/ml的1H12在pH7.2的PBS中温育2小时15分钟。
用含0.1%吐温的50mM、pH7.1的Tris缓冲液洗涤，并在4℃下温育过夜。用含0.1%吐温的PBS洗涤并重悬，使其浓度为0.5%固体。在4℃下储存备用。
分析过程
在eppendorf管中按下述体积和浓度加入各分析试剂：
所有试剂分别加入到eppendorf管中，并保持分离。直到加入5μl反应缓冲液后再进行最后的混合（反应缓冲液含有1MMES，pH6.0，2mg/ml海藻糖，120mg/mlBSA，4mg/mlHRP，200mM亚铁氰化物）。
将上述试剂充分混合后取0.8μl加入分析盒中，所述分析盒与恒电位仪（AutolabPGSTAT12）相连接。所述分析盒由单一通道组成，通道两端有2个丝网印刷的碳电极（一个工作电极和一个反电极/参考电极），如图3和图4所示。按下述方法进行测量：
实验方法
使用脉冲电化学法来测量磁分离步骤之前和之后的抗-PSA-GOD标记。在总的8min的时间里，每分钟进行一次计时计测量。具体而言，在-350mV下进行0.1秒计时计测量，根据0.1秒瞬时值记录0.1秒的电流值。向试剂条施加样品后，结合反应和酶促反应同时发生。每分钟进行一次脉冲电化学测量并记录数据。4min后，向所述试剂条施加磁场，从工作电极处除去抗-PSA磁性颗粒。被除去的抗-PSA磁性颗粒将是通过PSA与抗-PSA-GOD标记结合的抗-PSA磁性颗粒和（无标记结合）的抗-PSA磁性颗粒的混合群。在第5、6、7和8min进行的脉冲电化学测量构成剩余的未结合的抗-PSA-GOD标记的测量值。用第2、3和4min的电流值作图，通过绘制时间（min）vs.电流（安培）的曲线并用线性回归拟合来计算斜率。该斜率表示磁分离前的测量值。
将第5、6、7和8min的数据用同样的方法作图。所得的斜率表示磁分离后的测量值，是未结合的抗-PSA-GOD标记的量度。
结果与讨论
用磁分离前的斜率的除以磁分离后的斜率，所得的比值对总PSA浓度（pM）进行作图，如图26所示。观察到高灵敏度的系统性的线性应答。

Claims (42)

1.一种用于检测液体样品的分析物的消减分析中的微流体分析盒，该分析盒包括：
样品口，所述样品口用于将所述液体样品引入分析盒中；
基片，所述基片包括一个或多个设置在其中的微流体通道，并包括设置在所述通道内用于结合样品内的任何所述分析物的结合试剂，以及用于检测存在于样品中的分析物的量的标记；以及
检测区域，所述检测区域内包括分析物与标记发生结合所在的区域，所述结合试剂和标记在样品被引入分析盒之前设置在检测区域内，从所述检测区域内除去结合的分析物时，随着结合的分析物的除去允许通过测量任何剩余的未结合标记而间接测定了所述分析物的浓度。
2.根据权利要求1所述的微流体分析盒，其中，在检测区域上游和/或内部存在和/或设置有一种或多种另外的试剂。
3.根据权利要求1或2所述的微流体分析盒，其中，所述微流体分析盒经过调整适于进行1项以上的分析。
4.根据权利要求3所述的微流体分析盒，其中，所述微流体分析盒经过调整适于进行至少2项分析。
5.根据权利要求3所述的微流体分析盒，其中，所述微流体分析盒经过调整适于进行至少4项分析。
6.根据权利要求3所述的微流体分析盒，其中，所述微流体分析盒经过调整适于进行至少6项分析。
7.根据权利要求3所述的微流体分析盒，其中，所述微流体分析盒经过调整适于进行至少8项分析。
8.根据权利要求3所述的微流体分析盒，其中，所述微流体分析盒经过调整适于进行至少10项分析。
9.根据权利要求3所述的微流体分析盒，其中，所述微流体分析盒经过调整适于进行至少12项分析。
10.根据权利要求3所述的微流体分析盒，其中，所述微流体分析盒经过调整适于进行至少14项分析。
11.根据权利要求3所述的微流体分析盒，其中，所述微流体分析盒经过调整适于进行至少16项分析。
12.根据权利要求3所述的微流体分析盒，其中，所述微流体分析盒经过调整适于进行至少18项分析。
13.根据权利要求3所述的微流体分析盒，其中，所述微流体分析盒经过调整适于进行至少20项分析。
14.根据权利要求1或2所述的微流体分析盒，其中，所述微流体分析盒用于对单一样品进行多次相同的分析测量和/或对单一样品进行不同的分析测量。
15.根据权利要求1所述的微流体分析盒，其中，所述结合试剂与颗粒连接或以其他方式结合。
16.根据权利要求15所述的微流体分析盒，其中，所述颗粒为顺磁颗粒。
17.根据权利要求1所述的微流体分析盒，其中，所述标记为葡萄糖氧化酶。
18.根据权利要求1所述的微流体分析盒，其中，所述分析盒用于电化学分析，所述分析盒还包括工作电极和反电极/参考电极或反电极和参考电极，其中，所述工作电极存在于分析盒的检测区域中。
19.根据权利要求18所述的微流体分析盒，其中，对每一相应的工作电极提供有分离的反电极/参考电极或反电极和参考电极，或者提供有单一的反电极/参考电极或单一的反电极和参考电极，以与多个工作电极协同工作。
20.根据权利要求2所述的微流体分析盒，其中，所述一种或多种另外的试剂为葡萄糖、亚铁氰化物和过氧化物酶。
21.一种对样品进行分析的方法，该方法包括：
将样品引入根据前述权利要求中任意一项所述的微流体分析盒，使得样品中存在的任何分析物能够被分析盒中存在的分析物结合试剂结合；和
检测在检测区域中存在的标记的水平，以获得第一参考值，所述标记为与分析物复合的和未复合的标记；
除去检测区域中复合的分析物/标记；以及
在除去所述复合的分析物/标记后，检测在检测区域中剩余的任何未复合的标记。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，将样品向分析盒中的引入在检测区域内导致了至少部分结合试剂和标记进入溶液或悬浮液。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，通过电化学法进行检测。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，利用氧化电位或还原电位来测量标记的水平。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，施加电位来降低任何背景影响，或施加电位来减少在结合温育阶段由酶产生的电流。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，施加电位来消除或最小化样品中可能存在的可能产生背景信号的任何电化学干扰物的任何影响。
27.根据权利要求23-26中任意一项所述的方法，其中，使用葡萄糖氧化酶作为标记。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，该方法还包括使用过氧化物酶和介质，它们能够在氧化态和还原态之间转换并且可以通过电化学法检测到。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述过氧化物酶为HRP。
30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述介质为亚铁氰化物或ABTS。
31.根据权利要求21-26和28-30中任意一项所述的方法，其中，所述结合试剂与颗粒偶联或以其他方式结合，所述颗粒能够与样品中存在的分析物复合，并且在与检测区域中的分析物复合或未复合时，所述颗粒能够通过合适的手段被除去。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述颗粒为顺磁颗粒，且所述合适的手段为磁铁。
33.根据权利要求31所述的方法，其中，所述颗粒为顺磁颗粒，且所述合适的手段为电磁铁。
34.根据权利要求21-26和28-30中任意一项所述的方法，其中，所述样品为全血样品。
35.根据权利要求21-26和28-30中任意一项所述的方法，其中，直接在样品上进行检测，不进行任何的分离、洗涤和/或用其他液体稀释样品的步骤。
36.根据权利要求21-26和28-30中任意一项所述的方法，其中，检测在从检测区域除去结合的分析物/标记之前和之后信号的下降，信号的下降与样品中存在的分析物的量成比例。
37.一种用于对液体样品进行分析的分析系统，该分析系统包括：
a)微流体分析盒，所述微流体分析盒为根据权利要求1-20中任意一项所述的微流体分析盒且含有顺磁颗粒；以及
b)读数装置，所述读数装置包括：
i)接收端口，所述接收端口用于将分析盒引入读数装置；和
ii)磁力产生工具，所述磁力产生工具能够对分析盒施加磁力，从而能够从分析盒的检测区域中除去顺磁颗粒；以及
iii)检测工具，所述检测工具用于在从分析盒的检测区域中除去分析物/结合试剂复合物之前和之后，检测分析盒的检测区域内存在的任何标记。
38.根据权利要求37所述的分析系统，其中，所述磁力产生工具为磁铁。
39.根据权利要求37或38所述的分析系统，其中，根据分析盒的检测区域中除去分析物/结合试剂复合物之前和之后所测得的标记的量的下降，由读数装置计算样品中存在的分析物的水平。
40.根据权利要求39所述的分析系统，其中，通过电化学法检测分析盒的检测区域中除去分析物/结合试剂复合物之前和之后所测得的标记的量。
41.根据权利要求37或38所述的分析系统，其中，所述读数装置还包括用于使系统的使用者识别样品中存在的分析物的水平的工具；和/或信号工具，以将分析物的水平传送至远程的地点/从业者。
42.根据权利要求41所述的分析系统，其中，用于使系统的使用者识别样品中存在的分析物的水平的工具为显示装置或打印装置。
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