MX2013000971A - Anticuerpo anti-beta-amiloide humanizado seguro y funcional. - Google Patents

Anticuerpo anti-beta-amiloide humanizado seguro y funcional.

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Abstract

La presente revelación es concerniente con anticuerpos anti-beta humanizados seguros y funcionales para el uso terapéutico y de diagnóstico en el tratamiento de amiloidosis, un grupo de alteraciones y anormalidades asociadas con proteína amiloide, tal como enfermedad de Alzheimer.

Description

ANTICUERPO ANTI-BETA-AMILOIDE HUMANIZADO SEGURO Y FUNCIONAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con los métodos y composiciones mejorados para el tratamiento seguro y funcional de amiloidosis , un grupo de alteraciones y anormalidades asociadas, con la proteína amiloide, tal como enfermedad de Alzheimer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La amiloidosis no es solo una entidad de enfermedad sino más bien un grupo diverso de procesos de enfermedad progresivas caracterizadas por depósitos de tejido extracelular de una proteína semejante a almidón serosa llamada amiloide, que se acumula en uno o más órganos o sistemas de cuerpo. A medida que los depósitos de amiloide se acumulan, comienzan a interferir con la función normal en el órgano corporal. Hay por lo menos quince tipos diferentes de amiloidosis. Las formas principales son amiloidosis primaria sin antecedentes conocidos, amiloidosis secundaria enseguida de alguna otra condición y amiloidosis hereditaria.
La amiloidosis secundaria ocurre durante la infección crónica o enfermedad inflamatoria, tal como tuberculosis una infección bacteriana llamada fiebre del Mediterráneo, infecciones del hueso (osteomielitis) , artritis reumatoide, inflamación del intestino delgado (ileitis granulomatosa) , enfermedad de Hodgkin y lepra.
Los depósitos amiloides incluyen el componente de amiloide P (pentagonal) (AP) , una glicoproteína relacionada con amiloide P en el suero normal (SAP) y glucosaminoglicanas sulfatadas (GAG) , carbohidratos complejos del tejido conectivo. Las fibrilas de proteína amiloides, que cuentan alrededor de 90% del material amiloide, comprenden uno de varios tipos diferentes de proteínas. Estas proteínas son aptas de plegarse a las llamadas fibrilas de hoja "beta-plegadas" una configuración de proteína única que exhibe sitios de enlace para rojo de Congo dando como resultado propiedades de teñido únicas de la proteína amiloide.
Muchas enfermedades del enriquecimiento están basadas o asociadas con proteínas semejantes a amiloides y están caracterizadas en parte por la acumulación de depósitos extra celulares de amiloides o material semejante a amiloide que contribuyen a la patogénesis, también como el avance de la enfermedad. Estas enfermedades incluyen pero no están limitadas a alteraciones neurológicas tales como enfermedad de Alzheimer (AD) , demencia de cuerpo de Lewis, Síndrome de Down , hemorragia cerebral hereditaria como amiloidosis (tipo holandés) ; el complejo de Parkinson-demencia de Guam. Otras enfermedades que están basadas en o asociadas con proteínas semejantes a amiloides son perlesía supra nuclear progresiva, esclerosis múltiples; enfermedad de Creutzfeld Jacob, enfermedad de Parkinson, demencia VIH-relacionada, ALS (esclerosis lateral amiotropica) , diabetes de inicio adulto; amiloidosis cardiaca senil; tumores endocrinos y otros, incluyen alteraciones oculares tales como degeneración macular.
Aunque la patogénesis de estas enfermedades pueden ser diversas, sus depósitos característicos f ecuentemente contienen usos constituyentes moleculares compartidos . A un grado significativo, esto puede ser atribuible a la activación local de rutas pro-inflamatorias conduciendo mediante esto al depósito concurrente de componente de complemento activados, residuos de fase aguda, moduladores inmunes y otros mediadores inflamatorios (McGeer et al., 1994) .
La enfermedad de Alzheimer (AD) es una alteración neurológica que se considera principalmente provocada por placas amiloides, una acumulación del depósito anormal de proteínas en el cerebro. El tipo más frecuente de amiloide encontrado en el cerebro de individuos afectados está compuesto principalmente de fibrilas ?ß . La evidencia científica demuestra que un incremento en la producción de acumulación de proteína ß-amiloide en placas conduce a muerte de células del nervio, lo que contribuye al desarrollo y avance de AD. La pérdida de células de nervio en áreas del cerebro estratégicas, a su vez, provoca reducción en los neurotransmisores y deterioro de la memoria. Las proteínas principalmente responsables por la acumulación de placa incluyen proteínas precursora amiloide (APP) y dos presenilinas (presenilina I y presenilina II) . La escisión secuencial de la proteína precursora amiloide (APP) , que es constitutivamente expresada y catabolizada en la mayoría de las células por encimas ß y ? secretasa, conduce a la liberación de un péptido ?ß de 39 a 43 araino ácidos. La degradación de APP probablemente incrementa su propensión a agregarse en placas. Es especialmente el fragmento ?ß (1-42) que tiene alta propensión de acumular agregado debido a dos residuos de amino ácido hidrofóbicos en su término C. por consiguiente, se cree que el fragmento ?ß (1-42) esta principalmente involucrado en y es responsable por el inicio de formación de placa neurítica en AD y por consigüiente tiene alto potencial patológico.
Por consiguiente, hay necesidad de agentes terapéuticos que impidan la formación de placas amiloides y/o difundan placas existentes en pacientes con AD. En particular lo que se necesitan son agentes aptos de contrarrestar las manifestaciones fisiológicas de la enfermedad tal como la formación de placas asociadas con la agregación de fibras del amiloide o péptido a semejante a amiloide.
La inmunización pasiva contra beta-amiloide se ha convertido en una estrategia incrementadamente deseable como un tratamiento terapéutico para AD. La efectividad de la inmunización pasiva ha sido demostrada en modelos de animales transgénicos de AD, en donde se ha demostrado que terapia anti-AD reduce la carga de placa e invierten déficit conductuales . A pesar de la hiper-activación abrumante de células T cito tóxicas, un riesgo de inmunización activa con Ab, inmunización pasiva todavía porta el riesgo de sobre-activación moderada por el receptor de Fg de células microglia y activación de complemento lo que puede contribuir a una respuesta pro-inflamatoria inapropiada y edema vaso génico.
Anticuerpos beta anti-amiloides han sido descritos, por ejemplo en WO 2007/068412 publicada el 21 de Junio de 2007; WO 2008/060364 publicada el 22 de Mayo de 2008; WO 2007/068412 publicada el 21 de Junio de 2007; WO 2007/068412 publicada el 21 de Junio de 2007; WO 2007/068412 publicada el 21 de Junio de 2007; WO 2007/068412 publicada el 21 de Junio de 2007; WO 2008/156621 publicada el 24 de Diciembre de 2008; WO 2008/156621 publicada el 24 de Diciembre de 2008 (véase, también Tabla 2) .
Efectos secundarios observados durante el tratamiento de pacientes tienen amiloidosis tales como AD con anticuerpos anti-beta amiloide incluyen efectos secundarios inflamatorias, tales como meningitis y meningoencefalitis y acumulación de fluido en el cerebro (edema cerebral) . Terapias que reducen o eliminan las complicaciones asociadas con una amiloidosis son necesarias.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA, INVENCIÓN Las nuevas composiciones y métodos de la invención proveen una alternativa terapéutica más segura para inmunoterapia pasiva para amiloidosis tal como enfermedad de Alzheimer (AD) . La invención está basada, en parte en el descubrimiento de que un anticuerpo anti-?ß que posee una capacidad neutralizante efectiva también como una función efectora reducida, reduce la toxicidad ?ß mientras que evite efectos secundarios peligrosos en comparación con el terapéuticos de anticuerpo monoclonal ?ß conocidos (mAb) en particular, el inventor descubrió que un anticuerpo monoclonal anti-?ß humanizado (mAb) de un isotipo de IgG4, conocido como MABT, se encontró que reduce la sobre-activación moderada por receptor de Fcy de microglia y se evita la activación de complemento. MABT se enlaza con alta afinidad a múltiples formas de ?ß1-42 y ?ß1-40, protegido contra citotoxicidad inducida por el oligómero de ?ß1-42, absorción moderada de ?ß neuropeptico por microglia tanto in vitro como in vivo. Cuando se compara con una subclase tipo silvestre de IgGl humano que contiene los mismos dominios variables de enlace de antígeno y con igual avidez de enlace de ?ß, MABT mostró activación reducida de la cinasa de proteina activada por nitrógeno de p38 estrés-activada (p38MPAK) en microglia e indujo menos liberación de mediadores pro- inflamatorios .
La presente invención también está basada en parte en el papel inesperado de la activación de cinasa de p38MAP en células de microglia para la neuro protección moderada por anticuerpo anti-?ß en AD. La actividad de cinasa de p38MAP se considera en general ser pro-inflamatoria y así se había considerado que contribuye al estado inflamatorio patogénico de amiloidosis, tal como AD. Sin embargo, sorprendentemente, la activación de cinasa de p38MAP intermediaria en células de microglia contribuye a la neuro protección moderada por anti-?ß sin generación de un estado inflamatorio patogénico.
Se proveen en la presente métodos, y composiciones para el tratamiento seguro y/o prevención de una amiloidosis, incluyendo pero no limitado a enfermedad de Alzheimer. La amiloidosis incluye pero no está limitada a alteraciones neurológicas tales como enfermedad de Alzheimer (AD) , demencia de cuerpo de Lewy, Síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo holandés) , el complejo de Parkinson-demencia de Guam, . también como otras enfermedades que están basadas en o asociadas con proteínas semejantes a amiloides tales como perlesía supra nuclear progresiva, esclerosis múltiple, enfermedad de Creutzfeld Jacob, enfermedad de Parkinson, demencia VIH-relacionada, ALS (esclerosis lateral amiotropica) , diabetes de inicio adulto, amiloidosis cardiaca senil, tumores endocrinos y otros, incluyendo alteraciones oculares tales como degeneración macular, déficit visuales corticales, glaucoma, drusen del nervio óptico, neuropatía óptica, neuritis óptica, cataratas, amiloidosis ocular y distrofia reticular.
En particular, se proveen en la presente anticuerpos anti-?ß con regiones efectoras que han sido seleccionadas o modificadas para disparar una activación intermedia de la cinasa de p38MAP en células de microglia. Se proveen además en la presente, métodos para el tratamiento y prevención de una amiloidosis incluyendo pero no limitado a enfermedad de Alzheimer, en donde la dosis y/o régimen de administración son seleccionados de tal manera que la cinasa de p38MAP es activada a nivel intermedio en células de microglia. El modalidades específicas, un anticuerpo anti-?ß seguro y funcional tiene la región efectora de un anticuerpo IgG4. En ciertas modalidades más específicas, un anticuerpo anti-?ß seguro y funcional tiene la región de CH2 de un anticuerpo de IgG4. En ciertas modalidades específicas, un nivel intermedio de la activación de cinasa de p38 AP es un nivel por encima del nivel de activación de cinasa de p38MAP por oligomeros ß-amiloides tóxicos solos pero menor que el nivel de activación de la cinasa de p38MAP por un anticuerpo anti-?ß de IgGl en conjunción con los oligómeros ß-amiloides tóxicos. En ciertas modalidades, la región efectora del anticuerpo anti-?ß es modificada de tal manera que su función efectora es reducida. En ciertas modalidades, la modificación puede ser cualquier alteración genética que dé como resultado una sustitución de aminoácido y/o cancelación de aminoácido.
Se proveen además métodos para mejorar la seguridad de un anticuerpo anti-?ß. En una modalidad, se proveen los métodos para la mejora de la seguridad de un anticuerpo anti-?ß sin IgG4 que comprende reemplazar la región constante de dicho anticuerpo anti-?ß si IgG4 con una región constante derivada de un anticuerpo IgG4. En otra modalidad, se provee un método para mejorar la seguridad de un anticuerpo anti-?ß sin IgG4 que comprende reemplazar la región constante de dicho anticuerpo sin IgG4 por una región constante derivada de un anticuerpo sin IgGl . En una modalidad específica, el método para mejorar la seguridad de un anticuerpo anti-?ß-amiloide sin IgG4 es para mejorar la seguridad de un anticuerpo anti-?ß de IgGl.
Se proveen además en la presente un sistema de análisis a base de cultivo celular para probar anticuerpos anti-?ß en cuanto a su seguridad y funcionalidad para tratar y/o impedir una amiloidosis, incluyendo pero no limitado a enfermedad de Alzheimer. En ciertas modalidades, células de microglia son incubadas con oligómeros ß-amiloides tóxicos y el anticuerpo anti-?ß de prueba. La absorción moderada por anticuerpo anti-?ß de ß-amiloide a las células de microglia demuestra la funcionalidad de anticuerpo, por ejemplo para moderar el despeje de ß amiloide. La activación de cinasa de p38MAP moderada por anticuerpo an i-?ß a niveles intermedios en células de microglia indica tanto que el anticuerpo funcional como seguro. En ciertas modalidades, un nivel intermedio de activación de cinasa p38MAP es un nivel por encima del nivel de activación de p38MAP por oligómeros ß-amiloides. Tóxicos solos pero menor del nivel de activación de cinasa de p38MAP por un anticuerpo anti-?ß de IgGl qué tiene el nivel de función efectora del tipo silvestre (esto es, región constante de IgGl sin modificar) . Este sistema de análisis a base de cultivo celular puede ser usado para probar anticuerpos anti-?ß en cuanto su habilidad para proteger neuronas de los efectos neuropepticos de ?ß. Además, este sistema de análisis a base de cultivo celular puede ser usado para probar anticuerpos anti-?ß en cuanto a su habilidad para disparar la . activación de cinasa de p38MAP a niveles intermedios .
En ciertas modalidades, el sistema de análisis a base de cultivo celular incluye además neuronas . La proporción de supervivencia de las neuronas después de co-incubación con oligómeros ß-amiloides tóxicos, el anticuerpo anti-?ß de prueba y células de microglia demuestra la funcionalidad del anticuerpo anti-?ß de prueba.
En ciertas modalidades, el sistema de análisis a base de cultivo celular es un cultivo celular cortical primario. El cultivo celular cortical primario es incubado con oligómeros ß-amiloides tóxicos y el anticuerpo anti-?ß de prueba. La absorción moderada por anticuerpo anti-?ß de ß-amiloide a las células de microglia indica funcionalidad del anticuerpo, por ejemplo en moderar el despeje de ß-amiloide. La activación de cinasa de p38 AP moderada por anticuerpo anti-?ß a niveles intermedios en células de microglia demuestra tanto la funcionalidad como seguridad del anticuerpo.
Se proveen además en la presente anticuerpos seguros y funcionales para el tratamiento y/o prevención de una amiloidosis, incluyendo pero no limitado a enfermedad de Alzheimer. En ciertas modalidades, la región variable de un anticuerpo humanizado sin IgG4 que se enlaza a ?ß es combinada con la región constante de un anticuerpo IgG4 humano. En otras modalidades, la región variable de un anticuerpo humanizado IgGl que se enlaza a ?ß es combinada con la región constante de un anticuerpo de IgG4 humano. En ciertas modalidades, el dominio de CH2 de un anticuerpo humanizado sin IgG4 que se enlaza a ?ß es reemplazado cuando el dominio de CH2 de un anticuerpo de IgG4 humano. En otras modalidades, el dominio de CH2 de un anticuerpo humanizado de IgGl que se enlaza a ?ß es reemplazado con el dominio de CH2 de un anticuerpo de IgG4 humano. En ciertas modalidades, la región constante de la región constante es derivada de un anticuerpo IgGl en donde la región constante de IgGl es modificada de tal manera que la región constante modificada tiene función efectora reducida o eliminada.
En otras modalidades, se proveen métodos para el tratamiento y/o prevención de una amiloidosis, incluyendo1 pero no limitado a enfermedad de Alzheimer, en donde un anticuerpo anti-?ß de IgGl es administrado en combinación con un agente anti-inflamatorio de tal manera que la cinasa de p38MAP es activada a un nivel intermedio en células de microglia. En ciertas modalidades específicas, los niveles intermedio de la activación de cinasa de p38MAP son niveles por encima de los niveles de la activación de cinasa de p38MAP por oligómeros ß-amiloides tóxicos solos pero menores que los niveles de cinasa de p38MAP por un anticuerpo anti-?ß de IgGl que tienen niveles normales de función efectora en presencia de oligómeros solos sin el agente anti-inflamatorio . 3.1. Terminología Los términos "polipéptido" , "péptido" y "proteína" , como se usan en la presente, son intercambiables y son definidos para dar a entender una bio molécula compuesta de aminoácidos enlazados por un enlace de péptido.
Los términos "uno" , "un" y "el" cómo se usan en la presente, son definidos para dar a entender "uno o más" e incluyen el plural, a no ser que el contexto sea inapropiado.
El término "amiloidosis" se refiere a un grupo de enfermedades y alteraciones provocadas por o asociadas con amiloide o proteínas semejantes a amiloide e incluyen pero no están limitados a enfermedades y alteraciones provocadas por la preséncia o actividad de proteínas amiloide-semejantes en estado monomérico, de fibrila o polimérica o cualquier combinación de las tres, incluyendo por placas amiloides. Tales enfermedades incluyen pero no están limitadas a amiloidosis secundaria y amiloidosis relacionada con la edad tales como enfermedades que incluyen pero no están limitadas a alteraciones neurológicas tales como enfermedad de Alzheimer (AD) , enfermedades o condiciones caracterizadas por una pérdida de capacidad de memoria cognoscitiva tal como por ejemplo deterioro cognoscitivo suave (MCI) , demencia de cuerpo Lewy, Síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo holandés), el complejo de Parkinson-demencia de Guam y otras enfermedades que están basadas en o asociadas con proteínas amiloides-semejantes tales como perlesía supra nuclear progresiva, esclerosis múltiple, enfermedad de Creutzfeld Jacob, enfermedad de Parkinson, demencia VIH-relacionada, ALS (esclerosis lateral amiotropica) , miositis de cuerpo de inclusión (IBM) , diabetes de inicio adulto, tumor endocrino y amiloidosis cardiaca senil y varias enfermedades de los ojos tales como degeneración macular, neuropatía óptica drusen-relacionada y cataratas debido a deposición beta-amiloide .
Los términos "detectar" o "detectado" como se usan en la presente significa usar técnicas conocidas para detección de moléculas biológicas tales como métodos inmuno químicos o histológicos y se refieren a determinar cualita o cuantitativamente la presencia o concentración de la bio molécula bajo investigación. "ß amiloide", "beta amiloide", "?ß", "ß-amiloide" o "beta-amiloide" es un término reconocido en el arte y se refiere a proteínas y péptidos beta amiloides, también como modificaciones, fragmentos o cualesquier equivalentes funcionales de los mismos, que pueden ser producidos mediante la escisión proteolítica de proteína precursora amiloide (APP) e incluyen aquellos fragmentos de APP que están involucrados en o asociados con las patologías amiloides incluyendo pero no limitados a ?ß1-38, ?ß1-39, ?ß1-40, ?ß?-41, ?ß1-42 y ?ß1-43.
La estructura y secuencias de los péptidos ß amiloides mencionados anteriormente son bien conocidas para aquel de habilidad ordinaria en arte y métodos para producir dichos péptidos o para extraerlos del cerebro y otros tejidos son descritos por ejemplo en Glenner y Wong, Biochem Biophys Res Comm 129, 885-890 (1984) . Además, los péptidos ß amiloides están también disponibles comercialmente en varias formas.
El término "aislado" significa una molécula biológica libre de por lo menos algunos de los componentes de los cuales se presentan naturalmente .
Los términos "anticuerpo" o "anticuerpos" como se usa en la presente son términos reconocidos en el arte y se entiende que se refieren a moléculas o fragmentos activos de moléculas que se enlazan a antígenos conocidos y son usados intercambiablemente con los términos "inmunoglobulina" , "moléculas de inmunoglobulina" y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina esto es, porciones de una inmunoglobulina que contienen un sitio de enlace que se enlaza específicamente a un antígeno. Una inmunoglobulina es una proteína que comprende uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por los genes de región constante kappa y lambda, alfa, gama, delta, épsilon y mu de inmunoglobulina, también como una miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras son clasificadas ya sea como kappa o lambda. Las cadenas pesadas son clasificadas como gama, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. También subclases de la cadena pesada son conocidas, por ejemplo, las cadenas pesadas de IgG en humanos pueden ser de las subclases IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4.
Como se usa en la presente "se enlaza específicamente" en referencia a un anticuerpo significa que el anticuerpo se enlaza a su antígeno objetivo con mayor afinidad que lo hace a un (os) antígeno (s) estructuralmente diferente (s) .
Una unidad estructural de inmunoglobulina típica se sabe que comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, cada par tiene una cadena "ligera" (de alrededor de 25 kd) y una cadena "pesada" (alrededor de 50-70 kd) . El termino N de cada cadena define una región variable de alrededor de 100 a 110 o más amino ácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígeno. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a aquellas porciones de las cadenas ligera y pesada, respectivamente.
Los anticuerpos existen como anticuerpos intactos de plena longitud o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos mediante digestión con varias peptidasas o compuestos químicos. Así, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo debajo de los enlaces de disulfuro y la región de bisagra para producir F(ab' )2/ un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CH1 por un enlace de disulfuro. El F(ab')2 puede ser reducido bajo condiciones suaves para romper el enlace de disulfuro en la región de bisagra convirtiendo mediante esto el dímero de F(ab' )2 a- un monómero de Fab' . El monómero de Fab' es esencialmente un fragmento de Fab con parte de la región de bisagra1 (véase, Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpo. Mientras que varios fragmentos de anticuerpo son definidos en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, aquel de habilidad ordinaria en el arte, apreciara que cualquiera de una variedad de fragmentos de anticuerpo pueden ser sintetizados de novo ya sea químicamente o al utilizar tecnología de ADN recombinante . Así, el termino anticuerpo como se usa en la presente también incluye fragmentos de anticuerpo ya sea producidos por la modificación de anticuerpos enteros o sintetizados de novo o anticuerpos y fragmentos obtenidos al usar metodologías de ADN recombinantes .
El término "anticuerpos" incluyen anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos quiméricos, de una sola cadena, bis específicos, simianizados , humanos o humanizados, también como fragmentos activos de ios mismos. Ejemplos de fragmentos activos de moléculas que se enlazan a antígenos conocidos incluyen cadenas ligeras y pesadas separadas, fragmentos de Fab, Fab/c, Fv, Fab' y F(ab' )2/ incluyendo los productos de una biblioteca de expresión de inmunoglobulina de Fab y fragmentos de enlace de epítope de cualquiera de los anticuerpos y fragmentos mencionados anteriormente. Estos fragmentos activos pueden ser derivados mediante un número de técnicas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden ser escindidos con una enzima, tal como pepsina y sometidos a filtración de gel de HPLC. La fracción apropiada que contiene los fragmentos de Fab pueden luego ser recolectada y concentrada mediante filtración de membrana y los semejantes. Para una descripción adicional de técnicas generales para el aislamiento de fragmentos activos de anticuerpos, véase por ejemplo, Khaw, B. A. et al., J. Nucí. Med. 23:1011-1019 (1982); Rosseaux et al., Methods Enzymology, 121; '663-69, Academic Press, 1986.
Anticuerpos elaborados recombinantemente pueden ser anticuerpos de plena longitud convencionales, fragmentos de anticuerpo activos conocidos de digestión proteolítica, fragmentos de anticuerpo únicos tales como Fv o Fv de una sola cadena (scFv) , anticuerpos de dominio cancelado y los semejantes. Un anticuerpo de Fv es de alrededor de 50 Kd de tamaño y comprende las regiones variables de la cadena ligera y pesada. Un polipéptido de Fv de una sola cadena ("scFv") es un heterodímero de VH:VL enlazado covalentemente que puede ser expresado de un ácido nucleico que incluye secuencias de codificación de VH y VL unidas ya sea directamente o unidas mediante un enlazador de codificación de péptido. Véase Houston, et al., (1988) Proc . Nat. Acad. Sci. USA, 85;5879-5883. Un numero de estructuras para convertir las cadenas de polipéptido ligeras y pesadas naturalmente agregadas, pero separadas químicamente de la región V de un anticuerpo a una molécula de scFv que se plegara a una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de enlace de antígeno. Véase, por ejemplo Patente Estadounidense 5,091,513; 5,132,405 y 4,956,778.
El sitio de combinación se refiere a la parte de una molécula de anticuerpo que participa en el enlace de antígeno. El sitio de enlace de antígeno es formado por residuos de aminoácido de las regiones variables N-terminales ("V") de las cadenas pesadas ("H") y ligeras ("L"). Las regiones variables de anticuerpo comprenden tres estiramientos altamente divergentes denominados como "regiones hipervariables" o "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) que son interpuestas entre estiramientos más conservados que flanquean conocidas como "regiones de estructura" (FR) . En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) son dispuestas entre sí en un espacio tridimensional para formar una superficie o cavidad de enlace de antígeno. El sitio de combinación de anticuerpo representa por consiguiente los aminos ácidos que componente las CDR de un anticuerpo y cualesquier residuos de estructuras que componen la cavidad del sitio de enlace.
La identidad de los residuos de aminoácidos en un anticuerpo particular que componen el sitio de combinación puede ser determinada utilizando métodos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, CDR de anticuerpo pueden ser identificadas como las regiones hipervariables definidas originalmente por abat et al (véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" , E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services; Johnson, G y Wu, TT (2001) Kabat Datábase and its applications : future directions. Nucleic Acids Research, 29:205-206; http : //immuno . bme . nwa . edu) . Las posiciones de las CDR pueden también ser identificadas como las estructuras de bucles estructurales descritas originalmente por Chothia y otros (véase Chothia y Lesk, J. Mol. Biol 196, 901 (1987). Chothia et al., Nature 342, 877 (1989) y Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215, 175 (1990)). Otros métodos incluyen la "definición de AbM" que es una solución intermedia entre Kabat y Chothia y es derivada utilizando los elementos de programación de modelo ' de anticuerpo de AbM de Oxford Molecular (ahora Accelrys) o la "definición de contacto" de CDR por Macallum et al., ( "Antibody-antigen interactions : contact analysis and binding site topography" , J. Mol. Biol. Octubre de 1996, 11 : 262 (5) : 732-45) .
Los anticuerpos quiméricos son aquellos en los cuales una o más regiones de los anticuerpos son de un anticuerpo ' derivado de una primera especie y una o más regiones del anticuerpo son de un anticuerpo derivado de una segunda especie diferente. En una modalidad, un anticuerpo quimérico es uno que incluye regiones de una inmunoglobulina de primate. Un anticuerpo quimérico para uso clínico humano se entiende comúnmente que tiene regiones variables de un animal no humano, por ejemplo un roedor, con las regiones constantes de un anticuerpo humano. En ,contraste, un anticuerpo humanizado usa CDR del anticuerpo no humano con la mayoría o todas las regiones de estructura variables y de todas las regiones constantes de un anticuerpo humano. Un anticuerpo quimérico humano se entiende comúnmente que tiene las regiones variables de un anticuerpo de roedor. Un anticuerpo quimérico humano típico tiene regiones constantes de cadenas pesadas humanas y regiones constantes de cadena ligera humanas con las regiones variables tanto de las cadenas pesadas como ligeras derivadas de un anticuerpo de roedor. Un anticuerpo quimérico puede incluir algunos cambios a una secuencia de amino ácidos natural de las regiones constantes humanas y la secuencia de región variable de roedor natural . Anticuerpos quiméricos humanizados pueden ser preparados mediante métodos bien conocidos en el arte, incluyendo procedimientos de injertación de CDR (véase, por ejemplo Patentes Estádounidenses 5,843,708; 6,180,370; 5,693,762; 5,585,089; 5,530,101), estrategias de entre mezcla de cadena (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense 5,565,332; Rader et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1998) 95:8910-8915), estrategias de modelado molecular (Patente Estadounidense 5,639,641) y los semejantes.
Un "anticuerpo humanizado" como se usa en la presente en el caso de un anticuerpo de dos cadenas o mayor es uno en donde por lo menos una cadena es humanizada. Una cadena de anticuerpo humanizada tiene una región variable en donde una o más de las regiones de estructura son humanas . Un anticuerpo humanizado que es de una sola cadena es uno en donde la cadena tiene una región variable en donde una o más de las regiones de estructura son humanas. Las porciones no humanas de la región variable de la cadena de anticuerpo humanizada o fragmentos de la misma son derivadas de una fuente no humana, particularmente un anticuerpo no humano, comúnmente de origen de roedor. La contribución no humana al anticuerpo humanizado es provista comúnmente en forma de por lo menos una región de CDR que es intercalada entre regiones de estructura derivadas de una (o más) inmunoglobulina (s) humana (s) . Además de residuos de soporte de estructura pueden ser alterados para conservar la afinidad de enlace .
Un "anticuerpo humanizado" puede comprender además regiones constantes (por ejemplo, por lo menos una región constante o porción de la misma, en el caso de una cadena ligera y en algunas modalidades tres regiones constantes en el caso de una cadena pesada) . Las regiones constantes de un anticuerpo humanizado, si están presentes, comúnmente son de origen humano. Métodos para obtener anticuerpos humanizados son bien conocidos para aquellos de habilidad ordinaria en el arte (véase, por ejemplo Queen et al., Proc. Nati Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)). Un anticuerpo humanizado puede también ser obtenido mediante un procedimiento de ingeniería genética novedoso que permite la producción de anticuerpos policlonales humanos-semej antes madurados por afinidad en animales grandes, tales como por ejemplo conejos y ratones. Véase, por ejemplo Patente Estadounidense 6,632,976.
El término "región constante" o "CR" como se usa en la presente, se refiere a genes de regiones constantes de la inmunoglobulina. Los genes de región constante codifican la porción de la molécula de anticuerpo que confiere funciones efectoras. Los anticuerpos humanos quiméricos y anticuerpos humanizados, comúnmente no humanos (por ejemplo murino) , regiones constantes son sustituidas por regiones constantes humanas. Las regiones constantes de los anticuerpos quiméricos o humanizados sujetos son derivadas comúnmente de inmunoglobulina humanas. La región constante de cadena pesada puede ser seleccionada de cualquiera de los cinco isotipos : alfa, delta, épsilon, gama o mu. Además, las cadenas pesadas de varias subclases (tales como las subclases de IgG de cadena pesada) son responsables por diferentes funciones efectoras y así, al escoger la región constante de cadena pesada deseada, anticuerpos con función efectora deseada pueden ser producidos. Las regiones constantes que pueden ser usadas en el alcance de esta invención son gama I (IgGl) , particularmente una región Fe del isotipo de gama I (IgGl), gama 3 (IgG3) y especialmente gama 4 (IgG4) . La región constante de cadena ligera puede ser del tipo kappa o lambda, preferiblemente del tipo kappa. En una modalidad, la región constante de cadena ligera es la cadena constante kappa humana (Heiter et al., (1980) Cell 22:197-297) y la cadena constante pesada es la cadena constante de IgG4 humana.
El . "anticuerpo monoclonal" es también bien conocido en el arte y se. refiere a un anticuerpo que es el producto de una célula que produce anticuerpo clonada. Los anticuerpos monoclonales son elaborados comúnmente mediante fusión de una célula B que produce anticuerpo normalmente de corta vida a una célula que crece rápido, tal como una célula de cáncer (algunas veces denominada como una célula "inmortal"). La célula híbrida resultante o hibridoma, se multiplica rápidamente, creando un clon que produce el anticuerpo.
Por el propósito de la presente invención, "anticuerpo monoclonal" se entenderá también que comprende anticuerpos que son producidos por un clon madre que todavía no ha alcanzado plena monoclonalidad .
El anticuerpo de acuerdo con la invención puede ser una inmunoglobulina o anticuerpo, que se entiende que tiene cada uno de sus sitios de enlace idénticos (si es multivalente) o en alternativa, puede ser un anticuerpo bis específico o un anticuerpo multiespecífico.
Un "bis especifico" o "anticuerpo bifuncional" es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de enlace diferentes. Anticuerpos bis específicos pueden ser producidos mediante una variedad de métodos incluyendo fusión de hibridomas o enlace de fragmentos de Fab' . Véase, por e emplo Songsivilai & Lachmann, . Clin, Exp, Immunol, 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol, 148, 1547-1553 (1992). Un anticuerpo "multiespecífico"o "anticuerpo multifuncional" es un anticuerpo híbrido artificial que tiene más de dos pares de cadena pesada/cadena ligera diferentes y más de dos sitios de enlace diferentes. Anticuerpos multiespecíficos pueden ser producidos utilizando la misma variedad de métodos como los anticuerpos biespecíficos .
El término "fragmento" se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos residuos de aminoácido que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos pueden ser obtenidos vía tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacta o completa. Los fragmentos pueden también ser obtenidos por medios recombinantes . Fragmentos ejemplares incluyen fragmentos de Fab, Fab' , F(ab' )2, Fabc y/o Fv. El término "fragmento de enlace de antígeno" se refiere a un fragmento de polipéptido de una inmunoglobulina o anticuerpo que se enlaza al antígeno o compite con el anticuerpo intacto (esto es, con el anticuerpo intacto del cual fueron derivados) por el enlace de antígeno (esto es, enlace especifico) . Los fragmentos de enlace pueden ser producidos mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. Los fragmentos de enlace incluyen Fab, Fab', F(ab')2/ Fabc y/o Fv, cadenas individuales y anticuerpos de una sola cadena.
"Fragmento" también se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de amino ácidos de por lo menos residuos de amino ácidos contiguos, por lo menos 10 residuos de amino ácidos contiguos, por lo menos 15 residuos de amino contiguos, por lo menos 20 residuos de amino contiguos, por lo menos 40 residuos de amino contiguos, por lo menos 15 residuos de amino contiguos, por lo menos 50 residuos de amino contiguos, por lo menos 60 residuos de amino contiguos, por lo menos 70 residuos de amino contiguos, por lo menos 80 residuos de amino contiguos, por lo menos 90 residuos de amino contiguos, por lo menos 100 residuos de amino contiguos, por lo menos 125 residuos de amino contiguos, por lo menos 150 residuos de amino contiguos, por lo menos 175 residuos de amino contiguos, por lo menos 200 residuos de amino contiguos, por lo menos 250 residuos de amino contiguo de la secuencia de amino ácidos de otro polipéptido. En una modalidad específica, un fragmento de un polipéptido retiene por lo menos una función del polipéptido.
El término "antígeno" se refiere a una entidad o fragmento de la misma que se puede enlazar a un anticuerpo. Un inmunogeno se refiere a un antígeno que puede producir una respuesta inmune en un organismo, particularmente en un animal, más en particular un mamífero incluyendo un humano. El termino antígeno incluye regiones conocidas como determinantes antigénicas o epítopes que se refieren a una porción del antígeno (que son puestas en contacto o que juegan un papel significativo en soportar un residuo de contacto en el antígeno) responsable por la antigenicidad .
Como se usa en la presente, el término "soluble" se refiere a la habilidad para disolverse parcial o completamente en una solución acuosa.
También como se usa en la presente, el término "inmunogénico" se refiere a sustancias que producen anticuerpos, células T y otras células inmunes reactivas dirigidas contra un antígeno del inmunogeno.
El término "inmunogenicidad" como se usa en la presente se refiere a una medida de la habilidad de un antígeno para producir una respuesta inmune (humoral o celular) cuando es administrada a un receptor. Una respuesta inmune ocurre cuando un individuo produce anticuerpos suficientes, células T y otras células inmunes reactivas contra composiciones inmunogénicas administradas de la presente invención para moderar o aliviar la alteración a ser tratada.
Un cuerpo humanizado que tiene "inmunogenicidad reducida" se refiere a un anticuerpo humanizado que exhibe inmunogenicidad reducida en relación con el anticuerpo padre, por ejemplo el anticuerpo murino .
Un anticuerpo humanizado "que retiene sustancialmente las propiedades de enlace del anticuerpo padre" se refiere a un anticuerpo humanizado que retiene la habilidad para enlazarse específicamente al antígeno reconocido por el anticuerpo padre usado para producir tal anticuerpo humanizado. En algunas modalidades, el anticuerpo humanizado producirá la misma o sustancialmente la misma afinidad de enlace de antígeno y avidez como el anticuerpo padre. En ciertas modalidades, la afinidad del anticuerpo no será menor de 10% de la afinidad del anticuerpo padre, no menor de alrededor de 30% de la afinidad del anticuerpo padre o no menor del 50% de la afinidad del anticuerpo padre. Métodos para analizar la afinidad de enlace de antígeno son bien conocidos en el arte e incluyen análisis de enlace media-máxima, análisis de competencia y análisis de Scatchard. Análisis de enlace de antígeno apropiados son descritos en esta solicitud.
Como se usa en la presente, un "cambio conservador" se refiere a alteraciones que son sustancialmente conformacionales o antigénicamente neutras, que producen cambios mínimos en la estructura terciaria de los polipéptidos imitantes o que producen cambios mínimos en los determinantes antígenos de los polipéptidos mutantes, respectivamente, en comparación con la proteína natural. Cuando se refieren a los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención, un cambio conservador significa que una sustitución de aminoácido no vuelve al anticuerpo incapaz de enlace al receptor sujeto. Aquellos de habilidad ordinaria en el arte serán aptos de predecir cuales sustituciones de amino ácidos se pueden hacer mientras que se mantiene una alta probabilidad de ser conformacional y antigénicamente neutras. Tal guía es provista por ejemplo en Berzofsky, (1985) Science 229:932 940 y Bowie et al., (1990) Science 247:1306 1310. Factores a ser considerados que afectan la probabilidad de mantener neutralidad conformacional y antigénica incluyen pero no están limitados a: (a) sustitución de amino ácidos hidrofóbicos es menos probable que afecten la antigenicidad debido a que los residuos hidrofóbicos son más probables de estar ubicados en el interior de la proteína; (b) sustitución de amino ácidos físico químicamente similares es menos probable que afecten la conformación debido a que el aminoácido sustituido imita estructuralmente el aminoácido natural y (c) la alteración de secuencias conservadas evolutivamente es probable que afecte adversamente la conformación ya que tal conservación sugiere que las secuencias de aminoácido pueden tener importancia funcional. Aquel de habilidad ordinaria en el arte será apto de determinar alteraciones en conformación de proteína utilizando análisis bien conocidos, tales como pero no limitados a métodos de fijación de micro complementos (Wasserman et al., (1961) J. Immunol, 87:290 295; Levine et al, (1967) Meth. Enzymol, 11:928 936) y estudios de enlace que utilizan anticuerpos monoclonales dependientes de conformación (Lewis et al., (1983) Biochem, 22:948 954).
El término "cantidad terapéuticamente funcional "se refiere a una cantidad del anticuerpo que cuando es administrada a un humano o animal es suficiente para dar como resultado un efecto terapéutico en dicho humano o animal . La cantidad funcional es determinada, fácilmente por aquel de habilidad ordinaria en el arte siguiendo procedimientos de rutina.
Como se usa en la presente, los términos "tratar", "impedir", "que impide" o "prevención" se refiere a la prevención de la recurrencia o inicio de uno o más síntomas de una alteración en un sujeto resultante de la administración de un agente profiláctico o terapéutico.
El término "cantidad segura y funcional" en el contexto de un anticuerpo amiloide anti-beta se refiere a aquella cantidad del anticuerpo anti-beta amiloide que, cuando es administrada a un paciente con enfermedad de Alzheimer reduce o impide la formación de nuevas placas amiloides en el paciente, reduce la carga de placa amiloide en el paciente y/o reduce o impide el deterioro de o mejora las habilidades cognoscitivas del paciente y en donde ningún efecto secundario, tales como efectos secundarios inflamatorios, por ejemplo meningitis y meningoencefalitis y acumulación de fluido en el cerebro (edema cerebral) son observados o en donde cualesquier efectos secundarios no son tan severos para el tratamiento del paciente tenga que ser interrumpido . En ciertas modalidades, la formación de nuevas placas amiloides es reducida por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% en relación con un testigo sin tratar. En ciertas modalidades, la carga de placa amiloide es reducida por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% en relación con un testigo sin tratar. En ciertas modalidades, el deterioro de las habilidades cognoscitivas del paciente reducidos por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% O 100% en relación con un testigo sin tratar. En ciertas modalidades, las habilidades cognoscitivas del paciente son mejoradas por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% en relación con un testigo sin tratar.
El- término "anticuerpo sin IgGl", se refiere a un anticuerpo con cualquier región constante de uno de los siguientes isotipos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM excepto que el anticuerpo sin IgGl no tiene una región constante de IgGl que retiene su función efectora tipo silvestre. En modalidades específicas, el anticuerpo sin IgGl es un anticuerpo IgG4. En otras modalidades especificas, el anticuerpo sin IgGl tiene una región constante derivada de un anticuerpo de IgGl que ha sido mutado de tal manera que la función efectora del anticuerpo resultante es reducid o eliminada en relación con el anticuerpo de IgGl tipo silvestre.
El término "niveles intermedios" en el contexto de activación de cinas de p38MAP se refiere a niveles de activación de cinasa de p38MAP por encima del nivel de activación de cinasa de p38MAP en ausencia de un anticuerpo anti-beta amiloide sin IgGl humanizado pero por debajo del nivel dé la activación de cinasa de p38MAP en presencia de la misma concentración de un anticuerpo anti-beta amiloide de IgGl que se enlaza a beta amiloide con la misma kd como el anticuerpo anti-beta amiloide sin IgGl humanizado.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La patente o solicitud de patente contiene por lo menos un dibujo ejecutado a color. Copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con dibujos a color serán provistas por la oficina a petición y el pago del derecho necesario.
La Figura 1 (que comprende de las figuras 1A a la figura 1F) provee gráficas e imágenes inmunohistoquímicas correspondientes a los experimentos descritos en el Ejemplo 6.1 y 6.2. El anticuerpo monoclonal de MABT anti-?ß enlazado con alta afinidad a diferentes péptidos de ?ß y tiene propiedades anti-agregación. Se usó un análisis de ELISA de ?ß para comparar el enlace de mMABT (A) y MABT (B) a ?ß1-42 humano y murino ?ß1-40 humano. El MABT fue también probado en cuanto a enlace a diferentes estados de ensamble o estados de montaje de ?ß1-42 (C) . El MABT se enlaza a placas de ?ß presentes en secciones de cerebro de ratones APP transgénicos (paneles superiores D) y secciones neo corticales temporales de AD humanas (paneles inferiores). Se demostró la funcionalidad in vitro por la habilidad de MABT para impedir la agregación de ?ß1-42 y para desensamblar o desmontar los agregados de ?ß1-42 pre formados. La inhibición de la agregación de ?ß1-42 y la desagregación de agregados de ?ß?-42 pre formados fue demostrada utilizando una. proporción molar de 10:1 (?ß1-42) a anticuerpo monoclonal en un análisis a base de ThT (E) . Como testigo, se usó un anticuerpo monoclonal de IgG anti-?ß con un epítope N-terminal. Los resultados muestran la media (±SD) de tres experimentos independientes. *P<0.05, **P<0.01. El MABT fue también probado en un análisis de auto-ensamble o auto-montaje de ?ß1-42 y no depende de la fluorescencia de ThT en enlace a ensamble o conjuntos de ?ß multimericos, como se describe en Métodos (F) . Se muestra la media (+SEM) de dos análisis.
La Figura 2 (que comprende de las figuras 2A a la figura 2C) provee gráficas e imágenes inmunohistoquímicas correspondientes a los experimentos descritos en el Ejemplo 6.3. MABT inhibe la citotoxicidad de oligómeros de ?ß1-42 en cultivos corticales mezclados primarios. Células corticales mezcladas de ratas Pl fueron tratadas con oligómeros ?ß1-42 a una concentración de 2.5 o 5 µ M con o sin 100 g/ml de MABT o un anticuerpo monoclonal testigo de IgG (A) . Se usó un análisis de MTT para determinar la viabilidad celular como se describe en la sección de Métodos. Se muestran las medias (+SEM) de cinco experimentos independientes. *P<0.05, **P<0.01. En un análisis comparable pero que mide la producción de ATP como marcador de actividad metabólica, las células fueron tratadas con una concentración 10 µ?? de oligómeros ?ß1-42 con o sin 200 m/ml de MABT (B) . Los resultados muestran la media (+SEM) de dos análisis independientes. La neurotoxicidad enseguida del tratamiento con el oligómero de ?ß1-42 prolongado fue probada mediante análisis morfológico (C) . Las células como antes fueron tratadas por 4 días con una concentración 10 µ?? de oligóraeros ?ß1-42 con o sin 50 pg/ml de MABT y luego teñidas con Tujl y DAPI .
La Figura 3 (que comprende de la figura 3A a la figura 3F) provee gráficas e imágenes inmunocitoquímicas correspondientes a los experimentos descritos en el Ejemplo 6.4. El enlace del oligómero de ?ß1-42 ha neuritas, fue reducido por el anticuerpo monoclonal de IgG4 anti-?ß. Células corticales mezcladas de ratas Pl fueron tratadas con una concentración 2 µ? de ?ß1-42 con o sin 100 g/ml del MABT o un testigo de IgG por 30 minutos (mostrado) o 18 horas (no mostrado) . Las figuras de izquierda a derecha muestran: tratamiento con testigo de solución reguladora del pH, oligómeros ?ß1-42 y oligómeros ?ß1-42 con MABT (A) . Se usó DAPI para marcar los núcleos celulares; un anticuerpo contra una tubulina neurona-especifica, TuJl, fue usado para marcar neuronas y un anticuerpo anti-?ß (clon 6E10) fue usado para marcar beta-amiloide . La hilera inferior muestra todos los tres marcadores mientras que la hilera superior muestra solo ?ß y DAPI. Los dos recuadros ilustran el enlace de los oligómeros ?ß1-42 a neuritas (izquierda) y la inhibición de este enlace por el anticuerpo monoclonal de MABT (derecha) . Se muestran medidas cuantitativas de fluorescencia para tratamiento de 30 minutos y tratamiento de 18 horas (B) . Se muestran los resultados promedio (±SEM) de dos experimentos. ?ß1-42 marcado con fluor-488 de HyLite verifico que MABT inhibía el enlace de ?ß1-42 a neuritas. Cultivos corticales de ratas Pl fueron tratados como se describe para (A) excepto que se usó ?ß1-42 marcado con fluor-488 de HyLite (C) . Muestras ?ß1-42 marcadas son mostradas en el panel superior y muestras DAPI-teñidas son mostradas en el panel inferior. Se muestra un experimento representativo. Se cuantifico la fluorescencia de ?ß1-42, se muestra la media (+SEM) de los experimentos independientes (D) . La acumulación intracelular de ?ß1-42 fue analizada al efectuar un análisis de ELISA en cuanto a ?ß1-42 sobre células tripsina-despejadas como se describe en Métodos (C) . Se muestran los resultados promedios (+SEM) de tres experimentos. Después del tratamiento con MABT, los oligómeros ?ß1-42 parecieron son absorbidos por las células que se asemejan a microglia, como se muestra en (F) . Se usó DAPI para marcar los núcleos celulares y se usó un anticuerpo anti-?ß para marcar beta-amiloides .
La Figura 4 ( que comprende de la figura 4A a la figura 4F) provee gráficas e imágenes confocales correspondientes a los experimentos descritos en el Ejemplo 6.5. Los oligómeros de ?ß1-42 fueron absorbidos vía un mecanismo FcR-moderado a microglia después del tratamiento con MABT. Se usó representación de imagen confocal para mostrar que los oligómeros de ?ß1-42 acomplejados a MABT son absorbidos a microglia. Se usó DAPI para marcar los núcleos celulares para mostrar- la microglia misma y se usó anticuerpo anti-?ß para marcar oligómeros de ?ß1-42 (A) . Se obtuvo una rebanada apical a distal de una imagen tridimensional presentáda de z-pilas. Se llevó a cabo la representación de imagen confocal sobre células corticales mezcladas marcadas por ?ß (periferia) y teñidas con DAPI (centro) como se describe en la sección de ejemplos bajo materiales y métodos. Las micro glía. fueron identificadas y exploradas en cuanto a la -intensidad de fluorescencia máxima a través de una serie de pilas confocales que representan ubicaciones intracelulares (B) y el área total de señal fluorescente por encima de un umbral mínimo fue cuantificada (C) . Cada marca en la gráfica representa el área total de ?ß teñido de una sola célula. Un mínimo de 20 célula fueron analizadas para cada condición de tratamiento. Los datos fueron comparados utilizando A OVA multidireccional seguida por comparación múltiples de Tukey post-hoc. Se muestran las medias (+SEM) . Las microglias (Ibal+) fue verificada como el tipo de célula que absorte ?ß1-42 acomplejado a ABT (D) . Se usó Ibal como marcador para microglia, se usó ?ß1-42 fluor-488 de HyLite marcado para mostrar ?ß1-42 A y se usó DAPI para mostrar los núcleos celulares. Se muestra la colocalización de Ibal y ?ß1-42. La internalización del oligómero de ?ß1-42µ ?ß1-42 por diferentes anticuerpos monoclonales de IgG se correlación con enlace de FCYR. En enlace diferencial a FcYlIIa-V158 fue verificado en un análisis de enlace (E) . Un anticuerpo monoclonal anti-?ß requiere que el enlace de FCYR para el pleno efecto protector contra la toxicidad del oligómero de ?ß1-42. Células corticales mezcladas de ratas Pl fueron tratadas con oligómeros de ?ß1-42 con o sin MABT, MAT-IgGl-D265A, MABT-IgGl o un mAb testigo de IgGl (F) . La gráfica muestra el por ciento de incremento promedio (±SEM) en supervivencia celular en comparación con las células tratadas con el oligómero de ?ß1-42 de 5 experimentos independientes. El análisis estadístico fue realizado utilizando A OVA unidireccional seguido por comparación múltiple de Tukey post- oc.
La Figura 5 ( que comprende de la figura 5A a la figura 5D) provee gráficas e imágenes inmunocitoquímicas correspondientes a los experimentos descritos en el Ejemplo 6.6. Cuando es acomplejado a oligómeros de ?ß1-42, la adición de la IgGl con una cadena fundamental tipo silvestre incremento significativamente la activación de p38 con respecto a aquella mostrada para microglia tratado con el oligómero de ?ß1-42. Células corticales mezcladas de ratas Pl fueron tratadas con una concentración 1 0 µ? de ?ß1-42 por 30 minutos con o sin 100 g/ml de MABT, MABT-IgGl-d265A o MABT-IgGl tipo silvestre. Un anticuerpo monoclonal de IgGl que no se enlaza a ?ß fue usado como testigo. La actividad de p38MAPK fue. medida por un ELIS fosfo-especifico como se describe en Métodos (A) . Se muestra la media (±SEM) de cuatro experimentos independientes. Se realizó el análisis estadístico utilizando A OVA unidireccional seguido por comparación múltiple de Tukey post-hoc. La activación de p38MAPK con oligómeros ?ß1-42 acomplejados con el anticuerpo monoclonal fue específica a microglia (B) . Las células fueron tratadas como se describe anteriormente y luego teñidas en cuanto a fosfo-p38MAPK, con Ibal (microglia) y con DAPI (núcleos celulares) . Las figuras de izquierda a derecha muestran: tratamiento con testigo de solución reguladora del H, oligómeros ?ß1-42 y oligómeros ?ß1-42 con MABT. Se muestra la colocalización de fosfo-p38MAPK e Ibal en el recuadro derecho. Microglia puras de ratones CX3CR1-GFP fueron usadas para verificar la actividad de p38 microglia-especifica (C) . Se muestra el teñido para ' fosfo-p38 solo en el panel superior y la señal de CX3CR1-GFP (microglia) junto con fosfo-p38 es mostrada en el. panel inferior. La actividad de p38MAPK fue requerida para el pleno efecto protector de MABT contra la toxicidad de oligómero de ?ß1-42. Células corticales mezclas de ratas Pl fueron tratadas con una concentración 10 µ? de oligómeros de ?ß1-42 solos o junto con 100 g/ml de MABT o MABT-IgGl-D265A en presencia de una concentración 1 µ? de SB239063, un inhibidor p38 -especifico (D) . Un análisis de citotoxicidad que utiliza la lectura de MTT fue efectuado después de 24 horas. Se muestra la media (+SEM) de cuatro experimentos. El análisis estadístico fue realizado ANOVA unidireccional seguido por comparación múltiple de Tukey post-hoc.
La Figura · 6 provee una gráfica correspondiente a los experimentos descritos en el Ejemplo 6.6. La alta afinidad de IgGl a FCYR la hace menos efectiva para reducir la liberación pro-inflamatoria ?ß?-42-moderada por microglia. La liberación de TNF-OÍ por microglia enriquecida fue medida enseguida de 24 horas de tratamiento (véase Métodos) . Se muestra la media (+SEM) de tres experimentos independientes. El análisis estadístico fue realizado utilizando ANOVA unidireccional seguido por comparación múltiple de Tukey post-hoc.
La Figura 7 provee gráficas correspondientes descritos en el Ejemplo 6.1. Cargas de placa reducidas y memoria no espacial mejorada en el modelo de ratón APP. El porcentaje de carga de placa (A) y numero promedio de placas (B) en ratones transgénicos APP/PSI dobles fueron medidos después de inmunización pasiva crónica con mMABT, la versión de ratón del anticuerpo monoclonal de MABT. Los animales inyectados con PBS sirvieron como testigos (PBS) . Se usó tioflavina-S (ThS) para teñir placas densas (véanse Métodos) . La funcionalidad fue demostrada en ratones mutantes hAPP transgénicos individuales enseguida de dos administraciones en mMABT (C) . El índice de reconocimiento (RI) , con medida de memoria de recuerdo, fue estudiado utilizando la prueba de reconocimiento de objeto nuevos (véanse Métodos) . Los animales inyectados con PBS sirvieron como testigos (PBS) .cada circulo en la gráfica representa un ratón individual. Se muestran las medias (±SEM) , *P<0.01.
La Figura 8 provee un Western blot correspondiente a los experimentos descritos en el Ejemplo 6.1. ?ß1-42 neurotóxica es una mezcla de oligómeros de bajo y alto peso molecular. Los oligómeros ?ß?-4.2 neurotóxicos fueron preparados (véanse Métodos) y usados para experimentos in vitro que analizan los efectos del tratamiento de anticuerpo monoclonal sobre la neurotoxicidad moderada por el oligómero de ?ß1-42. Los oligómeros de ?ß1-42 se hicieron correr sobre un gel de gradiente de 4-12% de SDS/PAGE, transferidos a una membrana de nitrocelulosa y manchados con un anticuerpo anti-?ß (clon 6E10) .
La Figura 9 provee una gráfica correspondiente a los experimentos descritos en el Ejemplo 6.2. El MABT dirigido al dominio medio inhibe la interacción de ?ß1-42 con ApoE4. Se usó un análisis de ELISA para determinar el efecto de anti-?ß-?-terminal (clones 6E10 y W02) , C-terminal (clon G2-11) o anticuerpos monoclonales de dominio medio (MABT) sobre el enlace de ?ß1-42 al ApoE4 humano recombinante . Se muestra el por ciento de inhibición de señal sin un anticuerpo monoclonal de IgG.
La Figura 10 provee gráficas e imágenes inmunocitoquímicas correspondientes a los experimentos descritos en el Ejemplo 6.5. El anticuerpo monoclonal de IgG 4 de MABT reticulado tuvo actividad de enlace reducida cuando se compara con el tipo silvestre de IgGl. El tipo silvestre de IgGl anti-?ß reticulado se enlazo a todos los receptores de FcRy con actividades similares al testigo delgG.l sin enlace de ?ß positivo. Tanto MABT como MABT-IgGl-D265A tuvieron enlace sustancialmente reducido a todos los Fcyr en comparación con IgGl de ????-?ß y el testigo positivo de IgGl sin enlace de ?ß. Estos hallazgos son consistentes con los datos publicados para anticuerpos de IgG4 humanos (Gessner et al., 1998) y anticuerpos de IgGl que portan la mutación D265A (Shields et al., 2001).
La Figura 11 provee la representación de imagen in vivo de placas ?ß en ratones APP/PS1 tratados con anticuerpos anti-beta amiloide fue efectuado. La dosificación sistémica e MABT mudo las placas amiloides. individuales in vivo. Placas amiloides en animales APP/PS1 fueron marcadas con metoxi-X04 inyectado I.P., visualizadas mediante microscopía de dos fotones in vivo y rastreadas en múltiples semanas (A) . El cambio relativo en volumen de placa con respecto al tiempo graficado como veces de incremento de la sesión de representación de imagen inicial (B) . En promedio, el tamaño de placa individual disminuyo en volumen después de la dosificación sistémica con MABT (x placas 2 animal 4.1 .. Descripción de secuencias SEQ ID N0:1 Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada humanizada de MABT (CDR1) SEQ ID NO: 2 Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada humanizada de MABT (CDR2) SEQ ID NO: 3 Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada humanizada de MABT (CDR3) SEQ ID NO: 4 Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera humanizada de MABT (CDR1) SEQ ID NO: 5 Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera humanizada de MABT (CDR2) SEQ ID NO: 6 Secuencia de aminoácidos de •región variable de cadena ligera humanizada de MABT (CDR3) SEQ ID NO: 7 Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera humanizada de MABT SEQ ID NO: 8 Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera humanizada de MABT SEQ ID NO: 9 Secuencia de aminoácidos de región <constante de MABT humanizada (CDR1) SEQ ID NO: 10 Secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada humanizada de MABT SEQ ID NO: 11 Secuencia de aminoácidos, cadena pesada humanizada de MABT SEQ ID NO: 12 Secuencia de aminoácidos de REGION C DE CADENA GAMA 4 IG-modificáda SEQ ID NO: 13 Secuencia de nucleótidos de CDR2 de región variable de cadena pesada humanizada de MABT SEQ ID NO: 14 Secuencia de nucleótidos de CDR3 de región variable de cadena pesada humanizada de MABT SÉQ ID NO: 15 Secuencia de nucleótidos de CDRl de región variable de cadena ligera humanizada de MABT SEQ ID NO: 16 Secuencia de nucleótidos de región variable de cadena ligera humanizada de MABT SEQ ID NO: 17 Secuencia de nucleótidos de ligera pesada humanizada de MABT SEQ ID NO: 18 Secuencia de nucleótidos de región constante de ligera humanizada de MABT , SEQ ID NO: 19 Secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada humanizada de MABT SEQ ID NO: 20 Secuencia de nucleótidos de cadena pesada humanizada de MABT SEQ ID NO: 21 Secuencia de nucleótidos de . región constante de cadena pesada humanizada de MABT SEQ ID NO: 22 Secuencia de aminoácidos típica precedente a HCDR2.
DESCRIPCION DETALLADA Se describen a continuación sistemas de análisis a base de células para probar anticuerpos anti-amiloides y métodos para monitorear y el ajustar el tratamiento de un paciente con anticuerpos anti-amiloides beta. También descritos a continuación están sistemas y análisis a base de células para probar la seguridad o eficacia de un agente neuroprotector y métodos para monitorear y ajustar el tratamiento de un paciente con un agente neuroprotector. Se describen además a continuación anticuerpos seguros y funcionales y métodos para usar tales anticuerpos seguros y funcionales para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer. También se describen preparaciones farmacéuticas y modos de administración. 5.1 Sistema de análisis a base de células Se proveen en la presente sistemas de análisis a base de células in vitro para probar la seguridad y funcionalidad de anticuerpos u otros agentes para el tratamiento de amiloidosis. En ciertas modalidades, las células que son afectadas por la amiloidosis ("células objetivo"), la proteína amiloide en su forma patológica y células efectoras inmunes, por ejemplo células asesinas naturales, macrófagos tales como células de microglia, neutrófilos y células cebadas (son incubados en presencia y ausencia del anticuerpo de prueba) . Los parámetros que pueden ser medidos para probar la seguridad y funcionalidad del anticuerpo incluyen proporción de supervivencia de las células objetivo, internalización de . la proteína amiloide a las células efectoras inmunes y activación de la ruta de cinasa de MAP p38 en las células efectoras inmunes. En ciertas modalidades, un anticuerpo seguro y funcional da como resultado internalización máxima y activación intermedia de las rutas de cinasa de MAP de p38.
En modalidades más específicas, la amiloidosis es enfermedad de Alzheimer, la proteína amiloide es beta amiloide y las células efectoras inmunes son células de microglia y las células objetivo son neuronas. En modalidades específicas, las células son obtenidas de líneas celulares existentes para crear un cultivo mezclado. En otras modalidades, el cultivo celular mezclado es un cultivo cortical primario (Meberg & Miller 2003, Methods Cell Biol 71:111-127). En ciertas modalidades, el cultivo celular mezclado es un cultivo cortical primario de rata, ratón o chimpancé. En ciertas modalidades, el cultivo cortical primario es obtenido mediante biopsia cortical o biopsia espinal de un paciente humano .
Un cultivo celular mezclado que incluye neuronas y células de microglia es incubado con la proteína beta amiloide. En una modalidad, la proteína beta amiloide es provista como oligómero de beta amiloide. Los siguientes parámetros pueden ser medidos en este sistema de análisis: (1) la proporción de supervivencia neuronal puede ser determinada, por ejemplo mediante el rendimiento metabólico, tal rendimiento metabólico puede ser determinado, por ejemplo mediante oxidación mitocondrial de bromuro de 3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -2 , 5-difeniltretrazolip (MTT) o liberación de ATP: (2) internalización del oligómero beta-amiloide a microglia puede ser determinada, por ejemplo mediante inmuno citoquímica contra proteína beta amiloide o marcación y medición directa y/o visualización de la proteina beta amiloide y (3) la activación de la ruta de MAPK p38 puede ser determinada, por ejemplo mediante ELISA contra p38MAPK fosforilado ( "fosfo-p38" ) .
En ciertas modalidades, la proporción de supervivencia neüronal en presencia de beta amiloide y un anticuerpo seguro y funcional es incrementada por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475% o por lo menos 500% en comparación con la proporción de supervivencia neuronal en ausencia del anticuerpo seguro y funcional.
En ciertas modalidades, la internalización de beta amiloide a microglia en presencia de un anticuerpo seguro y funcional es incrementada por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475% o por lo menos 500% en comparación con la proporción de internalización en ausencia del anticuerpo seguro y funcional.
En ciertas modalidades, la activación de cinasa de MAP p38 en microglia en presencia de beta amiloide y un anticuerpo seguro y funcional es incrementada por entre 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45¾, 40%-50% o 45%-55% en comparación con la activación de cinasa de MAP p38 en presencia de beta amiloide pero en ausencia de un anticuerpo seguro y funcional. En una modalidad más específica, la activación de cinasa de MAP p38 en microglia en presencia de beta amiloide y un anticuerpo seguro y funcional es incrementada por entre 10%-30% en comparación con la activación de cinasa MPA p38 en presencia de beta amiloide pero en presencia de un anticuerpo seguro y funcional. Además, la activación de cinasa de MAP p38 en microglia en presencia de beta amiloide y un anticuerpo seguro y funcional es incrementada por 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%, 40%-50% o 45%-55% o menos que la cinasa MAP p38 es activada en presencia de un anticuerpo anti-beta amiloide de isotipo de IgGl .
En ciertas modalidades, una forma patológica de beta amiloide, por ejemplo beta amiloide oligomerico, un anticuerpo de prueba y células de microglia son incubados para determinar la seguridad y funcionalidad del anticuerpo. Los siguientes parámetros pueden ser medidos en este sistema de análisis: (1) internalización del oligómero beta amiloide a microglia puede ser determinada, por ejemplo mediante inmuno citoquímica contra la proteína beta amiloide o marcación de la proteína amiloide y (2) la activación de la ruta de MAPK p38 puede ser determinada, por ejemplo mediante ELISA contra fosfo p38.
Para determinar la activación de cinasa de MAP p38, se puede usar cualquier método conocido para aquel de habilidad ordinaria en el arte. En ciertas modalidades, ELISA, Western blot o inmuno citoquímica con un anticuerpo que se enlaza específicamente a la cinasa de MAP p38 fosforilada es usado para determinar los niveles de cinasa de MAP p38 fosforilada, esto es, activada. En ciertas moda lides, la activación de cinasa de MAP p38 es determinada mediante inmuno citoquímica utilizando un anticuerpo que se enlaza específicamente a la cinasa de MAP de p38 para determinar el grado de localización nuclear de la cinasa de MAP p38. Mientras más alto es el grado de localización nuclear de la cinasa de MAP p38, más alto es el nivel de activación de cinasa de MAP p38.
En ciertas modalidades, se puede medir la activación de otros componentes en la ruta de señalización de cinasa de MAP p38. En ciertas modalidades, se pueden medir los niveles de expresión de un objetivo corriente debajo de una cinasa de MAP p38 para determinar la activación de cinasa de MAP p38 en el paciente. Tales objetivos corriente abajo incluyen pero no están limitados a cinasa S6 ribosomal de 90 kDa (pp90rsk) ; familia de (RSK) : RSK1, RSK2 , MNKl/2 y MSKl/2 y factores de traducción nuclear tales como Elk-1, ATF2, STAT3 y CREB. Los niveles de expresión de objetivos corriente abajo pueden ser determinados mediante cualquier método conocido para aquel de habilidad ordinaria en el arte, tales como pero no limitados a Northern blotting, Western Blotting o reacción en cadena de polimerasa . 5.2 Monitoreo y ajuste del tratamiento En ciertas modalidades, la activación de cinasa de MAP p38 es monitoreada en células efectoras inmunes, tales como células de microglia, de un paciente que es tratado con un anticuerpo seguro y funcional que se enlaza específicamente a una proteína amiloide, tal como beta amiloide. Células efectoras inmunes pueden ser obtenidas de un paciente mediante cualquier método conocido para aquel de habilidad ordinaria en el arte . En modalidades específicas, las células de microglia son obtenidas mediante biopsia cortical o biopsia espinal. Las células efectoras inmunes pueden ser mantenidas en cultivo mediante cualquier método conocido para aquel de habilidad ordinaria en el arte.
En ciertas modalidades, la activación de cinasa de MAP p38 es monitoreada en células efectoras inmunes, tales como células de microglia de un paciente que es tratado con un agente tal como un agente néuroprotector . En ciertas modalidades más específicas, el paciente es tratado por una amiloidosis, tal como enfermedad de Alzheimer. En ciertas modalidades aún más específicas, el paciente es tratado con tacrina (COGNEX, Morris Plains, NJ) , donepezil (ARICEPT, Tokio, JP) , rivastigmina (EXELON, East Hanover, NJ) , galantamina (REMINYL, New Brunswick, NJ) o memantina (NAMENDA, Nueva York, NY) .
En ciertas modalidades, - la dosificación de administración y/o régimen de administración es ajustado para el paciente de tal manera que la activación de cinasa de MAP p38 en células de microglia está a niveles intermedios, esto es, más altos que en ausencia del anticuerpo pero más bajos que en presencia de un anticuerpo IgGl que se enlaza específicamente a beta amiloide en presencia de un oligómero beta amiloide. Si la activación de cinasa de MAP p38 está por encima de los niveles intermedios, la dosificación es reducida y/o la frecuencia de administración es reducida. Si la activación de cinasa de MAP p38 está por debajo de niveles intermedios, la dosificación es incrementada y/o la frecuencia de administración es incrementada.
En ciertas modalidades, un modulador de la ruta de señalización de cinasa de MAP p38, es co-administrado con el anticuerpo seguro y funcional para ajustar la activación de cinasa de MAP p38 a niveles intermedios. Si la activación de cinasa de MAP p38 está por encima de niveles intermedios, un inhibidor de la ruta de señalización de cinasa de MAP p38 puede ser co-administrado. Si la activación de cinasa de MAP p38 está por debajo de niveles intermedios, un activador de la ruta de señalización de cinasa de MAP p38 puede ser co administrado .
Inhibidores ilustrativos de la ruta de señalización de MAP p38 incluyen 4- [4- (4-fluorofenil) -5- (4-piridinil) -1H-imidazol-2-il] fenol ("SB 202190"); 4- [5- (4-fluorofenil) -2- [4-(metilsulfonil) fenil] -lH-imidazol-4-il] iridina ("SB 203580") y trans-4- [4- (4 -fluorofenil) -5- (2-metoxi-4-pirimidinil) -1H-imidazol-l-il] ciclohexanol ("SB 239063") y derivados farmacéuticamente apropiados de los mismos.
Activadores ilustrativos de la ruta de señalización de cinasa de MAP p38 incluyen anisomicina, MKK, Rae, Cdc4f2 y PAK1, IL-1, receptor de IL-1, TNF, LPS, TRAF6 y TAB1/2.
En ciertas modalidades, los niveles de activación intermedios de la cinasa de MPA p38 están entre 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%, 40%-50% o 45%-55% por encima de la activación de cinasa de MPA p38 en células de microglia del paciente en ausencia del anticuerpo seguro y funcional.
Para determinar la activación de cinasa de MAP p38, se puede usar cualquier método conocido para aquel de habilidad ordinaria en el arte. En ciertas modalidades, ELISA, Western blotting o inmuno citoquímica con un anticuerpo que se enlaza específicamente a la cinasa de MAP p38 fosforilada es usado para determinar los niveles de cinasa de MAP p38 fosforilada, esto es, activada. En ciertas modalidades, la activación de cinasa de MAP p38 es determinada mediante inmuno citoquimica utilizando un anticuerpo que se enlaza específicamente a la cinasa de MAP p38 para determinar el grado de localización nuclear de la cinasa de MAP p38. Mientras más alto es el grado de localización nuclear de la cinasa de MAP p38, más alto es el nivel de activación de la cinasa de MAP p38.
En ciertas modalidades, se puede medir la activación de otros componentes en la ruta de señalización de cinasa de MAP p38.
En ciertas modalidades, se pueden medir los niveles de expresión de un objetivo corriente debajo de la cinasa de MAP p38 para determinar la activación de cinasa de MAP p38 en el paciente. Tales objetivos corriente abajo incluyen pero no están limitados a cinasa S6 ribosomal de 90 kDa (pp90rsk) ; familia de (RSK) : RSK1, RS 2 , MNKl/2 y MSKl/2 y factores de traducción nuclear tales como Elk-1, ATF2 , STAT3 y CREB. Los niveles de expresión de objetivos corriente abajo pueden ser determinados mediante cualquier método conocido para aquel de habilidad ordinaria en el arte, tales como pero no limitados a Northern blotting, Western blotting o detección de transcripciones, genéticas mediante, por ejemplo RT-PCR.
Se provee además en la presente un método para evaluar la seguridad y funcionalidad de un anticuerpo anti-beta amiloide para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer en un paciente. En ciertas modalidades, las células de microglia pueden ser obtenidas del paciente. En una modalidad específica, las células de microglia pueden ser obtenidas del paciente antes del tratamiento del paciente con el anticuerpo anti-beta amiloide ha comenzado. Las células de microglia del paciente pueden ser obtenidas en cultivo celular utilizando técnicas conocidas en el arte estándar.
En ciertas modalidades, las células de microglia del paciente son incubadas con el anticuerpo anti-beta amiloide y oligómeros beta-amiloide. Los siguientes parámetros pueden ser determinados: enlace del anticuerpo-complejo beta amiloide a las células de microglia; internalización del complejo de anticuerpo-beta amiloide a las células de microglia y/o activación de cinasa de MPA p38 en las células de microglia.
Los testigos pueden ser efectuados al incubar las células de microglia del paciente con el anticuerpo anti-beta amiloide solo (esto es, sin oligómero beta-amiloide) y/o con oligómero beta amiloide solos (esto es, sin el anticuerpo) y/o con un anticuerpo anti-beta-amiloide de IgGl en presencia del oligómero beta-amiloide. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-beta-amiloide es seguro y funcional si la activación de cinasa de MAP p38 es de entre 5%-15¾; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%, 40%-50% o 45%-55% por encima de la activación de cinasa de MAP p38 en células de microglia testigo del paciente en presencia del oligómero beta-amiloide pero en ausencia del anticuerpo seguro y funcional . En ciertas modalidades, ¦ un anticuerpo anti beta-amiloide es seguro y funcional si la internalización beta-amiloide a células de microglia es de entre 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%, 40%-50% o 45%-55% por encima o debajo de aquel del anticuerpo monoclonal de MABT (véase sección 6) . 5.3 Anticuerpos seguros y funcionales En ciertas modalidades, la región constante de un anticuerpo que se enlaza específicamente a la proteína amiloide de la amiloidosis a ser tratada puede ser modificada o ser tratada para proveer un anticuerpo seguro y funcional. En ciertas modalidades, la región constante del anticuerpo resultante se enlaza con actividad intermedia al receptor de Fe sobre la superficie de células efectoras inmunes tales como células asesinas naturales, macrófagos, neutrófilos y células cebadas. En ciertas modalidades, el anticuerpo resultante activa la ruta de MAPK p38 en la célula efectora inmune a niveles intermedios, esto es, por encima de la activación de cinasa de MAP p38 en ausencia del anticuerpo pero debajo de la activación de cinasa de MAP p38 en presencia de la misma concentración de un anticuerpo de. IgG con la misma especificad de enlace. En ciertas modalidades las regiones variables fuera de las regiones determinantes de complementariedad ("CDR") pueden también ser modificadas para proveer un anticuerpo seguro y funcional. También se proveen en la presente métodos para generar tal anticuerpo y composiciones farmacéuticas que comprende tal anticuerpo.
La especificidad de enlace de antígeno es provista por las regiones determinantes de complementariedad ("CDR"). que están incrustadas en las regiones variables de una cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo, respectivamente. Las regiones constantes de anticuerpo y las regiones de estructura que rodean las CDR que pueden ser usadas para la construcción de los anticuerpos seguros y funcionales provistos en la presente incluyen aquellas descritas en la sección 5.3.1. En ciertas modalidades, CDR o regiones variables que pueden ser usadas para la construcción de anticuerpos seguros y funcionales pueden ser derivadas de los anticuerpos resumidos en la Tabla 2.
En ciertas modalidades, las CDR de un anticuerpo conocido que se enlaza específicamente a beta-amiloide humano (véase Tabla 2 a continuación) son combinadas con la región constante de una IgG4 humana y las regiones de estructura entre las CDR del anticuerpo son reemplazadas con las regiones de estructura de una IgG humana tal como IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4. En cierta modalidades, las regiones variables de un anticuerpo anti-beta amiloide humanizado conocido, por ejemplo Bapineuzumab o Solanezumab, son combinadas con la región constante de una IgG4 humana. 5.3.1. Regiones constantes Regiones constantes de anticuerpo para la generación de anticuerpos seguros y funcionales provistos en la presente pueden ser derivadas de cualquier isotipo incluyendo IgA, IgD, IgE e IgM. En ciertas modalidades, regiones constantes de anticuerpo para la generación de los anticuerpos seguros y funcionales provistos en la presente pueden ser derivadas del subtipo de IgAl, IgA2, IgGl, IgG2, iGg3 e IgG4.
Similarmente, regiones de estructura de regiones de cadena pesada de anticuerpo para la generación de anticuerpos seguros y funcionales provistos en la presente pueden ser derivadas de cualquier isotipo, incluyendo IgA, IgD, IgE e IgM. En ciertas modalidades, las regiones de estructura de anticuerpo para la generación de anticuerpos seguros y funcionales provistos en la presente pueden ser derivadas de del subtipo de IgAl, IgA2, IgGl, IgG2, iGg3 e IgG4.
En una modalidad específica, la región constante para la generación de un anticuerpo seguro y funcional provisto en la presente puede ser derivada del isotipo IgG. En una modalidad aún más específica, la región constante para la generación de un anticuerpo seguro y funcional provisto en la presente ¦puede ser derivada del subtipo IgG4.
En una modalidad específica, las regiones de estructura para la generación de un anticuerpo seguro y funcional provisto en la presente pueden ser derivadas del subtipo IgG. En una modalidad aún más específica, las regiones de estructura para la generación de un anticuerpo seguro y funcional provisto en la presente puede ser derivada del subtipo IgG .
En ciertas modalidades, la región constante de la cadena pesada de un anticuerpo seguro y funcional es una región constante quimérica de diferentes isotipos o subtipos. En una modalidad específica/ la región constante de la cadena pesada es una quimera entre aquella porción de la región constante de cadena pesada de IgG4 que es responsable por la función efectora de IgG4 y un subtipo diferente de IgG. En una modalidad específica, la región constante de la cadena pesada es una quimera entre el dominio de CH2 de una región constante de cadena pesada de IgG4 humana y un subtipo diferente de IgG.
En ciertas modalidades, la región constante quimérica tiene una actividad de enlace intermedia a FCY como, se describe posteriormente en la presente. En ciertas modalidades, la región constante quimérica modera la internalización a células efectoras inmunes, tales como microglia, de tal manera que la actividad de ruta de cinasa de MAP p38 está a un nivel intermedio tal como se determina mediante un sistema de análisis a base de células descrito en la sección 5.1.
En ciertas modalidades una región constante es optimizada al introducir mutaciones. Las mutaciones pueden ser introducidas a la región constante utilizando tecnología de ADN recombinante . En ciertas modalidades, los anticuerpos resultantes promueven la internalización de beta amiloide a célula de microglia a altos niveles mientras que la activación de la ruta de cinasa de MAP p38 está a niveles intermedios. La proporción de internalización y activación de cinasa de MAP p38 pueden ser determinadas utilizando el sistema de análisis a base de células descrito en la sección 5.1. En ciertas modalidades, el anticuerpo con región constante mutada tiene una actividad de enlace intermedia a un receptor de Fe como se describe posteriormente en la presente.
En ciertas modalidades, una región constante es optimizada al alterar el patrón de glicosilación . El patrón de glicosilación puede ser alterado en virtud del sistema de expresión en donde el anticuerpo es sintetizado y/o mutación del aminoácido que es glicosilado (por ejemplo Asn297) . En ciertas modalidades, los anticuerpos resultantes promueven la internalización de beta amiloide a células de microglia a altos niveles mientras que la activación de la ruta de cinasa de MAP p38 está a niveles intermedios. La proporción de internalización y activación de cinasa de MAP p38 puede ser determinada utilizando el sistema de análisis a base de células descrito en la sección 5.1. En ciertas modalidades, el anticuerpo con región constante con patrón de glicosilación alterado tiene actividad de enlace intermedia aun receptor de Fe como se describe posteriormente en la presente.
En ciertas modalidades, la región constante tiene una actividad de enlace intermedia a su receptor de Fe . Resumidos en la Tabla 1 se encuentran receptores de Fe ilustrativos y sus respectivo ligando de anticuerpo principal. La actividad de enlace entre el ligando de anticuerpo y receptor de Fe puede ser determinada utilizando cualquier método conocido, par a aquel de habilidad ordinaria en el arte. Métodos ejemplares para medir la afinidad de enlace incluyen pero no están limitados a análisis de ELISA y análisis de BIACORE. En ciertas modalidades más específicas, el receptor de Fe es un receptor de Fe que modera la internalización del complejo de anticuerpo-antígeno a una célula efectora inmune. En ciertas modalidades aún más específicas, el receptor de Fe es un receptor de Fcy que es expresado en células de microglia.
Tabla 1 : Isotipos o subtipos ilustrativos de anticuerpos y sus respectivo receptor de Fe En ciertas modalidades, la región constante de anticuerpo es del isótipo de IgG y el receptor de Fe es un receptor de Fcy. La región constante para la generación de un anticuerpo seguro y funcional tiene una actividad de enlace al receptor de Fcy que es de entre 10% y 30%; entre 20% y 40%, entre 30% y 50%, entre 40% y 60%, entre 50% y 70%, entre 60% y 80% o entre 70% y 90% de la actividad de enlace de IgGl al receptor de Fcy. En una modalidad específica, la región constante para la generación de un anticuerpo seguro y funcional para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer es de entre 15% y 25% o más específicamente alrededor de 20% de-la actividad de enlace de IgGl a Fcy.
En ciertas modalidades, la región efectora del anticuerpo anti-?ß es modificada de tal manera que la función efectora del anticuerpo es reducida o eliminada. La modificación puede ser cualquier alteración genética que da como resultado una sustitución y/o cancelación de aminoácidos. En modalidades más específicas, la región constante es una región constante de IgGl modificada con función efectora reducida o eliminada. Tales modificaciones pueden ser introducidas como se describe por ejemplo en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional WO 00/42072 publicada el 20 de Julio de 2000, que es incorporada en la presente en su totalidad. En ciertas modalidades, la habilidad del anticuerpo con la región constante modificada para enlazarse a su receptor de Fe es reducida en relación con la región constante sin modificar. En otras modalidades, el enlace entre la región constante y su receptor de Fe no es alterado pero funciones efectoras tales como citotoxicidad en presencia de células efectoras son reducidas en relación con la región constante sin modificar. 5.3.2 Regiones variables En ciertas modalidades, las regiones variables de un anticuerpo que se sabe que se enlazan específicamente a beta amiloide y/o su (s) forma (s) patológica (s) pueden ser usadas para la generación del anticuerpo seguro y funcional. En ciertas modalidades más específicas, las regiones variables de un anticuerpo humanizado que se sabe que se enlaza específicamente a beta amiloide y/o su (s) forma (s) patológica (s) pueden ser usadas para la generación de un anticuerpo seguro y funcional. En ciertas modalidades, las regiones variables son obtenidas de un anticuerpo humanizado sin IgG4. En una modalidad específica, las regiones variables son obtenidas de un anticuerpo humanizado sin IgG4 y una región constante dé IgG4 es usada como región constante.
CDR de anticuerpos que se sabe que se enlazan a una proteína amiloide de interés pueden ser usadas para la generación de un anticuerpo seguro y funcional útil en los métodos descritos en la presente. En ciertas modalidades, las CDR de un anticuerpo que se sabe que se enlaza específicamente a beta amiloide y/o su (s) forma (s) patológica (s) pueden ser usadas para la generación de tal anticuerpo seguro y funcional.
Anticuerpos ilustrativos cuyas CDR o regiones variables pueden ser usadas incluyen pero no están limitados a aquellos resumidos en la Tabla 2 Tabla 2 : An-tlcuerpos anti-beta amiloides ilustrativos Anticuerpo Referencia/Fuente mACI-01-Ab7 WO 2007/068412 publicada el 21 de Junio, 2007 mACI-01-Ab7 WO 2008/060364 publicada el 22 de Mayo, 2008 mACI-02-Ab6 WO 2007/068412 publicada el 21 de Junio, 2007 mACI-ll-Ab9 WO 2007/068412 publicada el 21 de Junio, 2007 mACI-12-Abll WO 2007/068412 publicada el 21 de Junio, 2007 mACI-24-Ab4 WO 2007/068412 publicada el 21 de Junio, 2007 ACI-24-Ab-3 WO 2008/156621 publicada el 24 de Diciembre, 2008 ACI-ll-Ab-9 WO 2008/156621 publicada el 24 de Diciembre, 2008 ACI-12-Ah-ll WO 2008/156621 publicada el 24 de Diciembre, 2008 20C2 WO 2007/050359 publicada el 3 de Mayo, 2007 8F5 WO 2007/064972 publicada el 7 de Junio, 2007 8C5 WO 2007/064972 publicada el 7 de Junio, 2007 6E10 Pirttila et al. 1994, J. Neurol Sci 127:90-95 4G8 Pirttila et al. 1994, J. Neurol Sci 127:90-95 MS-Rochetf3 y MS-Roche#3 WO 03/070760 publicada el 28 de Agosto, 2003 derivada de anticuerpos MS-Roche #7 y MS-Roche#7 WO 03/070760 publicada el 28 de Agosto de 2003 derivados de anticuerpos MS-Roche#8 y MS-Roche#8 WO 03/070760 publicada el 28 de Agosto de 2003 derivados de anticuerpos 3D6 WO 02/46237 publicada el 13 de Junio, 2002 10D5 WO 02/46237 publicada el 13 de Junio, 2002 12 B4 WO 2006/066171 publicada el 22 de Junio, 2006 12A11 WO 2006/066171 publicada el 22 de Junio, 2006 6C6 WO 2006/066171 publicada el 22 de Junio, 2006; Frenkel et al, 1999, J Neuroimmunol 95:135-142 G8 WO 2006/066171 publicada el 22 de Junio, 2006 1C2 WO 2006/066171 publicada el 22 de Junio, 2006 2B1 WO 2006/066171 publicada el 22 de Junio, 2006 3A3 Bard et al. 2003, PNAAS 100:2023-2028 266 Us 2004/0043418 publicada el 4 de Marzo, 2004 6H9 WO 2006/066171 publicada el 22 de Junio, 2006 (Fig. 17 y 18) 15C11 WO 2006/066171 publicada el 22 de Junio, 2006 9G8 WO 2006/066171 publicada el 22 de Junio, 2006 (Fig. 17 y 18) 2H3 Frenkel et al, 1999, J Neuroimmunol 95:135-142 FvlEl EP 1 741 783 Al publicada el 1 de Octubre, 2007 FvlE4 EP 1 741 783 Al publicada el 1 de Octubre, 2007 FvlE7 EP 1 741 783 Al publicada el 1 de Octubre, 2007 Fv2A7 EP 1 741 783 Al publicada el 1 de Octubre, 2007 Fv2A8 EP 1 741 783 Al publicada el 1 de Octubre, 2007 Fv2B6 EP 1 741 783 Al publicada el 1 de Octubre, 2007 FIO EP 1 741 783 Al publicada el 1 de Octubre, 2007 B7 EP 1 741 783 Al publicada el 1 de Octubre, 2007 B6 EP 1 741 783 Al publicada el 1 de Octubre, 2007 DI EP 1 741 783 Al publicada el 1 de Octubre, 2007 VLA2 EP 1 741 783 Al publicada el 1 de Octubre, 2007 Hlv2b (scFv) Liu et al. 2004, Biochemistry 43:6959-6967 scFv59 (scFv) Fukuchi et al. 2006, Biochem and Biophys Res Comm 344:79-86 R7CN US 2003/0108551 publicada el 12 de Junio, 2003 6F/3D Accurate Chemicals AMY-33 Zymed IgM 508 Frenkel et al, 2000, J Neuroimmunol 106:23-31 NU-1 Lambert et al. 2007, J Neurochem 100:23-35 NU-2 Lambert et al. 2007, J Neurochem 100:23-35 NU-4 Lambert et al. 2007, J Neurochem 100:23-35 NU-6 Lambert et al. 2007, J Neurochem 100:23-35 2A10 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 2B4 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 2D6 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 4C2 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 4E2 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 5F10 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 5G12 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 Anticuerpo Referencia/Fuente 6B7 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 6B11 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 11B4 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 11B5 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 14A11 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 15G6 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 17G4 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 3B7 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 2H4 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 3B3 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 1F6 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 1F4 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 2E12 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 26D6 WO 2006/055178 publicada el 26 de Mayo, 2006 9TL y variantes WO 2008/110885 publicada el 18 de Septiembre, 2008 6G y variantes WO 2008/110885 publicada el 18 de Septiembre, 2008 5F7 WO 2007/062852 publicada el 7 de Junio, 2007 10F11 WO 2007/062852 publicada el 7 de Junio, 2007 7C6 WO 2007/062852 publicada el 7 de Junio, 2007 4B7 WO 2007/062852 publicada el 7 de Junio, 2007 2F2 WO 2007/062852 publicada el 7 de Junio, 2007 6a 2 WO 2007/062852 publicada el 7 de Junio, 2007 4D10 WO 2007/062852 publicada el 7 de Junio, 2007 7E5 WO 2007/062852 publicada el 7 de Junio, 2007 10CI WO 2007/062852 publicada el 7 de Junio, 2007 3B10 WO 2007/062852 publicada el 7 de Junio, 2007 10F4 WO 2007/062852 publicada el 7 de Junio, 2007 3C5 WO 2007/062852 publicada el 7 de Junio, 2007 BAM10 santa cruz biotechonology, ¡nc. 6G12 santa cruz biotechonology, inc. 20-1 santa cruz biotechonology, inc. 2B9 santa cruz biotechonology, inc. 2C8 santa cruz biotechonology, inc. 6A6 santa cruz biotechonology, inc.
B-4 santa cruz biotechonology, inc.
DE2B4 santa cruz biotechonology, inc.
LN27 santa cruz biotechonology, inc.
NAB228 santa cruz biotechonology, ¡nc. 1304.1 santa cruz biotechonology, inc. 5C3 santa cruz biotechonology, inc.
Anticuerpo Referencia/Fuente BD1350 santa cruz biotechonology, inc.
KP14.1 santa cruz biotechonology, inc. 11H3 santa cruz biotechonology, inc. 9F1 santa cruz biotechonology, inc. 19H11 santa cruz biotechonology, inc. 1B11F3 santa cruz biotechonology, inc. 310-03 santa cruz biotechonology, inc. 79010Y santa cruz biotechonology, inc. 16E9 santa cruz biotechonology, inc. 19B8 santa cruz biotechonology, inc. 3G5 santa cruz biotechonology, inc.
Mcl santa cruz biotechonology, inc. 9C4 santa cruz biotechonology, inc. 3H2 santa cruz biotechonology, inc. 6E10 santa cruz biotechonology, inc. 4H309 santa cruz biotechonology, inc. 3H530 santa cruz biotechonology, inc.
En una modalidad específica, las CDR de un anticuerpo seguro y funcional de la invención son como sigue: CDR1 de la cadena pesada tiene la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO:l, CDR2 de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, CDR3 de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; CDR1 de la cadena ligera tiene la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 4 , CDR2 de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, CDR3 de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 .
En otra modalidad específica, la región variable de cadena pesada de un anticuerpo seguro y funcional de la invención tiene una secuencia de amino ácidos que es por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 7. En una modalidad más especifica, la región variable de cadena pesada de un anticuerpo seguro y funcional de la ' invención tiene una secuencia de amino ácidos que es 100% idéntica a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 7.
En otra modalidad específica, la región variable de cadena ligera de un anticuerpo seguro y funcional de la invención tiene una secuencia de amino ácidos que es por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o por lo menos 99% .idéntica a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 10. En una modalidad más específica, la región variable de cadena ligera de un anticuerpo seguro y funcional de la invención tiene una secuencia de amino ácidos que es 100% idéntica a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 10.
En una modalidad aún más específica,' la región variable de cadena pesada de un anticuerpo seguro y funcional de la invención tiene una secuencia de amino ácidos que es por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 7 y la región variable de cadena ligera de un anticuerpo seguro y funcional de la invención tiene una secuencia de amino ácidos que es por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 10.
En una modalidad, la región variable de cadena pesada de un anticuerpo seguro y funcional de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que es 100% idéntica a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 7 y la región variable de cadena ligera de un anticuerpo seguro y funcional de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que es 100% idéntica a la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 10.
La secuencia de CDRL2 ( " VSNRFS" (SEQ ID NO: 5)) de el anticuerpo mMABT puede ser modificada ligeramente sin afectar adversamente la actividad de anticuerpo. Se pueden hacer sustituciones conservadoras por medio de intercambio de R por K en posición 50 y S por N en posición 53. Las dos secuencias de CDRL2 alternativas son por consiguiente "RVSNRFS" y "KVSSRFS" , respectivamente. Estas son incorporadas a la secuencia de VK murina sin ningún otro cambio como mMABT VK-R y mMABT VK-S, respectivamente. 5.3.3 Construcción de anticuerpos En ciertas modalidades, las CDR de un anticuerpo que se enlaza específicamente a una proteína amiloide o su forma patológica, tal como beta amiloide, son reemplazadas a un anticuerpo con regiones constates consistentes con un anticuerpo seguro y funcional de la invención (sección 5.3.1). En ciertas modalidades, las regiones variables de un anticuerpo que se enlaza específicamente a una proteína amiloide o su forma patológica, tal como beta amiloide son combinadas con regiones constantes consistentes con un anticuerpo seguro y funcional de la invención (sección 5.3.1) .
Métodos para construir anticuerpos humanizados son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, métodos para generar anticuerpos humanizados son descritos en la Solicitud de Patente Internacional PCT/US2007/073504 publicada como WO2008/011348 que es incorporada por referencia en su totalidad. 5.3.4. Pruebas de seguridad Efectos secundarios observados durante el tratamiento de enfermedad de Alzheimer con anticuerpos anti-beta amiloides incluyen efectos secundarios inflamatorios, tales como meningitis y meningoencefalitis y acumulación de fluido en el cerebro (edema cerebral) . Otros efectos secundarios incluyen reacción inmune adversa, esto es una reacción inmune por el paciente contra el anticuerpo amiloide anti-beta administrado. 5.3.4.1 Reacción inmune adversa Un efecto secundario que puede ser monitoreado en un paciente que ha recibido un anticuerpo anti-beta amiloide es una respuesta del anticuerpo al anticuerpo. Cualquier técnica conocida para aquel de habilidad ordinaria en el arte, paira detectar, monitorear o cuantificar la extensión de tal reacción inmune adversa puede ser usada, tal respuesta de anticuerpo ocurre cuando un anticuerpo se enlaza al anticuerpo anti-beta amiloide. Cuando antígenos solubles se combinan con anticuerpos en el compartimiento vascular, pueden formar complejos inmunes circulante que son atrapados no específicamente en los lechos vasculares de varios órganos, provocando las llamadas enfermedades complejas inmunes, tales como enfermedad de suero, vasculitis, nefritis, lupus eritomatoso sistémico con vasculitis o glomerulonefritis .
La enfermedad compleja inmune puede ser detectada y/o monitoreada utilizando cualquier método conocido en el arte. Por ejemplo, una prueba compleja inmune puede ser usada para demostrar complejos inmunes circulantes en la sangre, para estimar la severidad de la enfermedad complejo inmune. Una prueba compleja inmune puede ser efectuada mediante cualquier método conocido por aquel de habilidad ordinaria en el arte. En particular, una prueba compleja inmune puede ser efectuada utilizando cualquiera de uno o más de los métodos descritos en las Patentes Estadounidenses 4,141,965; 4,210,622; 4,210,622; 4,331,649; 4,544,640; 4,753,893 y 5,888,834, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad.
Otro método es el uso de un inmunoanálisis , tal como un análisis inmunoabsorbente enzima-enlazado (ELISA) para detectar anticuerpos anti-idiotipicos contra el anticuerpo. Véase, Gerostamoulos, J. et al. (2001) . The Use of Elisa (Enzyme-Linked Immunoasorbent Assay) Screening in Postmortem Blood. TIAFT, The Inernational Association of Forensic Toxicologists; Clarke, W. y Dufour, D.R. Editors (2006) . Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Harris, N. y Winter, W; Presta, Patente Estadounidense 6,737,056; Harlow y Lañe, Antibodies : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York 1988 555-612); WO 96/13590 y WO 96/29065. 5.3.4 Edema Un efecto secundario que puede ser monitoreado en un paciente que ha recibido un anticuerpo anti-beta amiloide es edema, en particular · edema cerebral que puede ser determinado, por ejemplo mediante barrido de MRI, barrido de DCE-MRI, barrido de PET y/o barrido de CT. Cualquier técnica conocida para aquel de habilidad ordinaria en el arte para detectar, monitorear o cuantificar la extensión de edema puede ser usada . El edema puede también ser medido en un modelo de animal de edema. En tales métodos, se calculan los volúmenes de edema (volumen semiesférico del volumen lateral semiesférico ipsilateral del contralateral) .
En RI CT-TI-controlada en edema cerebral pueden ser visualizados como una lesión hipodensa o hiperintensa. Edema cerebral y otras estructuras con un alto contenido de agua, tales como fluido cerebroespinal, son hipertensos MRI-T2 ponderado. Imágenes de MR de inversión-recuperación fluido-atenuadas proveen información aditiva puesto que el. edema cerebral es claramente visualizado como una lesión hiperintensa contra un fondo iso-o hiper- intenso. 5.3.4.3 Meningitis Un efecto secundario que puede ser monitoreado en un paciente que ha recibido un anticuerpo anti-beta amiloide es meningitis. Cualquier técnica conocida para aquel de habilidad ordinaria en el arte para detectar, monitorear o cuantificar la extensión de meningitis puede ser usada. Un examen neurológico puede también ser llevado a cabo, que involucra una serie de pruebas diseñadas para determinar: función motriz y sensorial; función de nervios; audición y habla; visión,- coordinación y equilibrio; estatus mental y cambios en el estado de ánimo o comportamiento. La función del sistema nervioso puede ser determinada por medio de pruebas de resistencia y sensación con la ayuda de ítems tal como un diapasón, martillo de reflejo ligero pequeño y alfileres .
El análisis del fluido cerebro espinal que rodeo y protege el cerebro y medula espinal pueden detectar inflamación aguda y crónica. En un procedimiento conocido como derivación espinal (o punción lumbar), una cantidad pequeña de fluido cerebroespinal es removida por una aguja especial que es insertada en la espalda inferior. La piel es insensibilizada con un anestésico local antes de la toma de muestras . El fluido que es completamente claro en gente saludable, es probado para detectar la presencia de bacterias o sangre, también como para medir los niveles de glucosa (un nivel de glucosa bajo es un signó de meningitis bacteriana o fungal) y glóbulos blancos sanguíneos, conteos elevados de glóbulos blancos sanguíneos son también un signo de infección) . El procedimiento es hecho usualmente en un hospital y toma alrededor de 45 minutos.
Los procedimientos de representación de imagen no invasivos son usados sistemáticamente para alcanzar una diagnosis de meningitis. Tal representación de imagen auxiliada por computadora puede revelar signos de inflamación del cerebro; sangrado interno o hemorragia y otras anormalidades del cerebro que pueden estar asociadas con meningitis. La tomografía computada, también conocida como barrido de CT, combina tecnología de rayos x y computadora para producir imágenes bidimensionales rápidas, claras de huesos, órganos y tejidos. Ocasionalmente, un tinte de contraste es inyectado a la corriente sanguínea para resaltar los diferentes tejidos en el cerebro y para detectar inflamación de las meninges. La representación de imagen de resonancia magnética (MRI) utiliza ondas de radio generadas por computadora y un imán fuerte para producir imágenes detalladas de estructuras del cuerpo, incluyendo tejidos, órganos, huesos y nervios. Un tinte de contraste puede ser inyectado antes de las pruebas para revelar más detalles. Otra técnica de representación de imagen usada para ayudar en la diagnosis de meningitis es ultrasonido.
La electroencefalografía o EEG puede identificar ondas del cerebro anormales asociadas con meningitis al monitorear la actividad eléctrica en el cerebro a través del cráneo. Se usa EEG para ayudar a diagnosticar inflamación del cerebro. 5.3.5 Pruebas de funcionalidad 5.3.5.1 Pruebas de neuropsicologicas La funcionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer descrito en la presente puede ser determinado utilizando una o más pruebas neuropsicologicas. Pruebas neuropsicologicas ejemplares sori descritas a continuación e incluyen sin limitación aquellas establecidas por el Consortium to Establish a Registry for- Alzheimer' s Disease ("CERAD", véase, por ejemplo Morris JC, Mohs RC, Rogers H, Fillenbaum G, Heyman A. Consortium to establish a registry for Alzheimer disease (CERAD) clinical and neuropsychological assessment of Alzheimer disease. Psychopharmacol Bull. 1988:24 (4) :641-52; Morris C, Heyman A, Mohs RC, Hughes JP, van Belle G, Fillenbaum G, Mellitis ED, Clark C. The consortium to Establish a Registry of Alzheimer disease. Neurology. 1989 Sep; 39 (9) : 1159-65 y Welsh K. Butters, N. Hughes J, Mohs R, Heyman A. la detección de declinación de memoria anormal en casos moderados de enfermedad de Alzheimer utilizando CERAD medidas neuropsxcológicas. Arch Neurol, 1991 Mar; 48 (3) :278-81) En una modalidad, la funcionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer descrito en la presente puede ser determinada utilizando la prueba de Escala-Cogniscitiva de Determinación de Alzheimer ( "ADAS-Cog" ; véase, por ejemplo, Rosen WG, Mohs RC, Davis KL. A new rating scale for Alzheimer disease. Am J Psychiatry, 1984 Nov; 141 (11) : 1356-64 ; Ihl R, Brinkmeyer J, Janner M, Kerdar MS . A comparison of ADAS and EEG in the discrimination of patiens with dementia of the Alzheimer type from healthy controls . Neuropsychobiology . 2000 Jan; 41(2):102-7 y Weyer G, Erzigkeit H. Kanowski S. Ihl R, Hadler D. Alzhéimer's Disease Assessment Scale: reliability and validity in a multicenter clinical trial. Int Psychogeriatr, 1997 Jun; 9 (2) : 123-38) .
En otra modalidad, la funcionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer descrito en la presente puede ser determinada utilizando la escala de clasificación de patología conductual en enfermedad de Alzheimer ( "BEHAVE-AD" ; véase, por ejemplo, Reisberg B, Borenstein J, Salob SP, Ferris SH, Franssen E, Georgotas A. . Behavioral symptoms in Alzheimer' s disease: phenomenology and treatment J. Clin Psychiatry. 1987 May; 48 Suppl:9-15).
En otra modalidad, la f ncionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer descrito en la presente puede ser determinada utilizando la prueba de Blessed-Dementia Information-Memory-Concentration Test (véase, por ejemplo, Blessed G, Tomlinson BE, Roth M. The association bet een quantitative measures of dementia and of senile change in the cerebral grey matter of elderly subjects. Br J Psichiatry. 1968 Jul; 114 (512) : 797-811) .
En otra modalidad, la funcionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer descrito en la presente puede ser determinada utilizando la batería automatizada de pruebas, neuropsicológicas de Cambridge ("CANTAB"; véase, por ejemplo Swainson R, Hodges JR, Galton CJ, Semple J, Michael A, Dunn BD, Iddon JL, Robbins TW, Sahakian BJ. Early detection and differential diagnosis of Alzheimer disease and depression with neuropsychological tasks . Dement Geriatr Cogn Disord. 2001;12:265-280; Fray PJ, Robbins TW. CANTAB battery: proposed utility in neurotoxocology. Neurotoxicol Teratol . 1996 Jul-Aug; 18 (4) : 499-504 y Robbins TW, James M, Owen AM, Sahakian BJ, Mclnnes L, Rabbitt P. Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery (CANTAB) : a factor analytic study of a large simple of normal elderly volunteers. Dementia. 1994 Sep-Oct; 5 (5) : 266-81) .
En otra modalidad, la funcionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer descrito en la presente puede ser determinada utilizando la prueba de Clock Draw (véase, por ejemplo, Sunderland T, Hill JL, Mellow AM, Lawlor BA, Gundersheimer J, Ne house PA, Grafman JH. Clock drawing en Alzheimer disease. A novel measure of dementia severity. J Am Geriatr Soc . 1989 Aug: 37 (8) 725-9 y Lee H. Swanwick GR, Coen RF, Lawlor BA. Use of the clock drawing task in the diagnosis of mild and very mild Alzheimer' s disease. Int Psychogeriatr . 1996 Fall; 8 (3) :469-76) .
En otra modalidad, la funcionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer descrito en la presente puede ser determinada utilizando la escala de Cornell por Depresión en Demencia ("CSDD"; Alexopoulos GS, Abrams RC, Young RC, Shamoian CA. Cornell Scale for Depression in Dementia. Biol Psychiatry. 1988 Feb 1 ; 23 (3) : 271-84 ) .
En otra modalidad, la funcionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer descrito en la presente puede ser determinada utilizando la escala de depresión geriátrica ( "GDS" ; véase, por ejemplo, Burke J, Roccaforte WH, Wengel SP. The short form of the Geriatric Depression Scale: a comparison with the 30-item form. J Geriatr Psychiatry Neurol. 1991 Jul-Sep; 4(3): 173-8).
En otra modalidad, la funcionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer descrito en la presente puede ser determinada utilizando el examen de Mini Estado Mental ( "MMSE" , véase, por ejemplo, Folstein MF, Folstein SE y McHugh PR. "Mini-Mental State" : a practical method for grading the cognitive state of patiens for the clinician. J Psychiatr Res. 1975; 12:189-198 y Cokrell JR y Folstein MF. Mini-Mental State Examination (MMSE). Psychopharm Bull . 1988/24 (4) ;689-692) .
En otra modalidad, la funcionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer descrito en la presente puede ser determinada utilizando el inventario neuropsiquiatrico ("NPI"; Cummings JL, Mega M, Gray K, Rosenberg-Thompson S, Carusi DA, Gombein J. The Neuropsychiatric Inventory: comprehensive assessment of psychopathology in dementia. Neurology. 1994 Dec; 44 (12) : 2308-14 ; Cummings JL. The Neuropsychiatric Inventory: assessing psychopathology in dementia patiens. Neurology. 1997 May; 48 (5 Suppl 6) :S10-6) .
En otra modalidad, la funcionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer descrito en la presente puede ser determinado utilizando la Selección de 7 minutos (véase, por ejemplo, Solomon PR, Pendlebury WW. Recognition of Alzheimer' s disease: the 7 Minute Screen. Fam Med. 1998 Apr; 30(4):265-71 y Solomon PR, Hirschoff A, Kelly B, Relin M, Brush M, DeVeaux RD, Pendlebury . A 7 minute neurocognitive screening battery highly sensitive to Azlheimer's disease. Arch Neurol. 1998 Mar; 55 (3) : 349-55) . 5.3.5.2 Representación de imagen in vivo La funcionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer descrito en la presente puede ser determinada utilizando representación de imagen in vivo en sujetos.
Reactivos de representación de imagen pueden ser administrados mediante inyección intravenosa al cuerpo del paciente o directamente al cerebro mediante inyección intra craneal o mediante perforación de un agujero a través del cráneo. La dosificación de reactivo debe estar dentro de los mismos intervalos como para los métodos de tratamiento. Comúnmente, el reactivo es marcado, aunque en algunos métodos, el reactivo primario con afinidad esta sin marcar y un agente de marcación secundario es usado para enlazarse al reactivo primario. La elección del marcador depende de los medios de detección. Por ejemplo, un marcador fluorescente es apropiado para detección óptica. El uso de marcadores paramagnéticos es apropiado para detección tomográfica sin intervención quirúrgica. Marcadores radioactivos pueden también ser detectados utilizando tomografía de emisión de positrón (PET) o tomografía computada de emisión de un solo protón (SPECT) .
La funcionalidad del tratamiento puede ser determinada al comparar el número, tamaño y/o intensidad de sitios marcados a valores de línea de referencia correspondientes. Los valores de línea de referencia pueden representar los niveles promedio en una población de individuos que no tienen enfermedad de Alzheimer. Alternativamente, los valores de línea de referencia pueden representar niveles previas determinados en el mismo paciente. Por ejemplo, los valores de referencia pueden ser determinados en un paciente antes de comenzar el tratamiento y los valores medidos después de esto comparados con los valores de referencia. Una disminución en los valores en relación con la referencia puede señalar una respuesta positiva al tratamiento.
Los anticuerpos anti-beta amiloides son también útiles para determinar si formas truncadas de ?ß están presentes en fluidos cerebro espinal u otros tejidos o fluidos corporales. La presencia de tales formas a niveles disminuidos . en un paciente en relación con la referencia puede señalar una respuesta positiva al tratamiento. (1) Tomografia de emisión de positrón En una modalidad, la funcionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer descrito en la presente puede ser determinada utilizando rastreadores radiactivamente marcados como sondas con tomografia de emisión de positrón (PET) para monitorear la pato fisiología de enfermedad de Alzheimer (véase, por ejemplo» Nagren et al 2009, European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, Radiopharmaceuticals for positrón emission tomography inyestigations of Alzheimer disease, published online December 22, 2009). Por ejemplo, el compuesto de B de Pittsburgh marcado con carbono- 11 puede ser usado como radio rastreador con PET para la representación de imagen de la carga de placa amiloide (véase, por ejemplo, Rinne 2010, Lancet Neurology 9 :363-372) .otros rastreadores para representación de imagen de PET de carga de placa amiloide incluyen estilbenos 18F-marcados y estirilpiridinas (véase, por ejemplo, Kung et al. 2010, Journal of Medicinal Chemistry 53:933-941); el 18FFPIB-derivado 3' 18F-marcado benzotiazol (???)-3'; una versión 11C y 18F-marcada del SB-13 derivado de Rojo de Congo y el 18FFDDNP amino-naftilderivado (véase, por ejemplo, Henriksen et al., 2008, European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Suppl 1:S75-81) . (2) Representación de imagen de resonancia magnética En una modalidad, la funcionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer descrito en la presente puede ser determinada al utilizar representación de imagen de resonancia magnética (MRI) . Se puede usar MRI para determinar cambios en volumen en el sistema nervioso central (véase, por ejemplo Fagan et al., 2009, Annals of Neurology 65:176-1833) y para cuantificar el edema vasogenico (véase, por ejemplo, Black et al, 2010, Alzheimer Disease and Associated Disorders 24 : 198-203) . 5.3.5.3 Modelos de animal En algunas modalidades, la funcionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer descrito en la presente puede ser probada in vivo utilizando un modelo de enfermedad de Alzheimer, tales modelos en animales de enfermedad de Alzheimer son bien conocidos en el arte e incluyen sin limitación modelos que usan ratones, ratas y primates .
Un modelo murino ejemplar de enfermedad de Alzheimer incluye ratones TgCRND8 (véase, por ejemplo Chishti, M. A. et al., Early-onset amyloid deposition and cognitive déficits in transgenic mice expressing a doublé mutant form of amyloid precursor protein 695. J. Biol Chem 276, 21562-21570 (2001); janus, C. et al., ?ß peptide immunization reduces behaviorual impariment and plaques in a model of Alzheimer' s disease. Nature 408, 979-982 (2000)). Los ratones TgCRND8 expresan un transgen de proteína precursor amiloide humano (APP695) que lleva dos mutaciones de falso sentido que se sabe que provocan enfermedad de Alzheimer en humanos (KM670/671NL y V717F) . A alrededor de tres meses de enfermedad, estos ratones muestran déficit de aprendizaje espacial progresivos que son acompañados tanto por niveles de ?ß cerebral elevados y por números incrementados de placas amiloides extracelulares cerebrales. A los seis meses de edad, los niveles de ?ß y la morfología, densidad y distribución de las placas amiloides en el cerebro de ratones TgCRNDS son similares a aquellas observados en los cerebros de humanos con enfermedad de Alzheimer bien establecida. Como en pacientes humanos con enfermedad de Alzheimer, los elementos bioquímicos, conductuales y neuropatológicos del modelo de ratón son acompañados por mortalidad acelerada. Otros modelos murinos ejemplares de enfermedad de Alzheimer son conocidos en el arte y tales ratones están disponibles comercialmente (véase, por ejemplo el Recurso de Modelo de ratón de Enfermedad de Alzheimer disponible en el sitio web de The Jackson Laboratory) .
Modelos de primates para enfermedad de Alzheimer son también conocidos en el arte (véase, por ejemplo, Wenk, 1993, Behavioural Brain Research 57 (2) : 117-122 y Fainman et al., 2007, American Journal of Medical Genetics 144B (6) : 818-819) .
Después del tratamiento de tal enfermedad de Alzheimer en modelos de animal, la funcionalidad del tratamiento puede ser determinada utilizando métodos conocidos en el arte, incluyendo sin limitación, aquellos descritos posteriormente en la presente. (1) Censo de supervivencia La probabilidad de supervivencia de ratones puede ser determinada utilizando la técnica de Kaplan-Meier que calcula la probabilidad de supervivencia en cada presencia de muerte, haciéndola así apropiada para tamaños de muestra pequeños. Para análisis de supervivencia, los ratones pueden ser agrupados en grupos testigo (s) de tratamiento y la comparación entre los grupos puede ser determinada utilizando por e emplo la prueba de Tarone-Ware. (2) Prueba de laberinto de agua de Morris Las pruebas de laberinto de agua de Morris pueden ser efectuadas como se describe previamente (véase, por ejemplo Morris, R. Develpment of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat . J. Neurosci Methods 11, 47-60(1984)). En este procedimiento, un rato puede ser colocado en una piscina circular llena con agua, con una plataforma de escape sumergida justo debajo de la superficie del agua. Un marcador visible puede ser colocado sobre la plataforma de tal manera que el animal pueda encontrarlo al navegar hacia una pista visual próxima. (Alternativamente, una forma más compleja de la prueba en la cual no hay pistas formales para marcar la ubicación de la plataforma pueden ser dadas a los ratones. De esta manera, los ratones deben aprender la ubicación de la plataforma en relación con las pistas visuales distantes) . La duración de tiempo que los ratones permanecen en el agua esta inversamente relacionado con la habilidad cognoscitiva.
Una prueba ejemplar es como sigue: los ratones entran a la prueba de laberinto de agua Morris con una plataforma oculta un día sin pre-entrenamiento . Ratones pueden ser probados por 3 días con 6 pruebas por día. En el cuarto día, la plataforma puede ser removida de la piscina y se da a cada ratón una prueba de sonda de nadar de 30 segundos. En el último día, se le puede administrar a los ratones una prueba de pista con el fin de evaluar su habilidad de nadar, visión y conocimiento general. La prueba de pista puede ser compuesto con la plataforma siendo colocada en un cuadrante diferente que aquel usado para las pruebas y puede ser marcado con una bandera. Se puede permitir a los animales 60 segundos para encontrar la plataforma. Los animales que no encuentran la plataforma no son usados en los análisis finales de memoria espacial. Los datos conductuales pueden ser analizados utilizando un modelo mezclado de análisis de varianza factorial (ANOVA) con fármaco o genotipo y sesiones de entrenamiento como factores de medida repetidos . (3) Actividad locomotora La actividad locomotora puede ser determinada utilizando procedimientos conocidos, por ejemplo utilizando un rota vastago (San Diego Instruments, San Diego, California) . Por ejemplo, los ratones pueden ser analizados por dos vías en el rota vastagos que se describe previamente (véase, por ejemplo, Masliah, et al. (2000)). En tal análisis, en el primer día los ratones pueden ser entrenados por 5 pruebas: la primera a 10 rpm, la segunda a 20 rpm y la tercera a quinta a 40 rpm. En el segundo día, los ratones pueden ser probados por 7 pruebas a 40 rpm cada uno. Durante las pruebas, los ratones pueden ser colocados individualmente sobre el cilindro y la velocidad de rotación es incrementada a la velocidad apropiada en un periodo de tiempo. La duración de tiempo que los ratones permanecen en el vástago (Latencia de caída) puede ser registrada y usada como medida de función motora . (4) Carga amiloide cerebral La carga amiloide cerebral puede ser probada como sigue. Los cerebros animales de prueba pueden ser removidos y un hemisferio puede ser fijado en para formaldehído al 4% y embebido en cera de parafina en el plano sagital medio. Para generar conjuntos de secciones aleatorias uniformes sistemáticas, secciones seriales de 5 mieras pueden ser recolectadas a través de toda la semi esfera! Conjuntos de secciones a intervalos de 50 mieras pueden ser usados para análisis (10-14 secciones/conjunto) . Las placas pueden ser identificadas después de la recuperación de antígeno con ácido fórmico e incubación con anticuerpo anti-beta amiloide primario (por ejemplo, Dako M-0872) seguido por anticuerpo secundario (por ejemplo, complejo de Dako StreptABC/kit de rábano) . Los productos finales pueden ser visualizados con diaminobenzidina (DAB) y pueden ser contra teñidos con por ejemplo azul fast luxol. La carga de placa amiloide puede ser determinada utilizando por ejemplo elementos de programación de análisis de imagen Leco 1A-3001 interconectado con microscópico Leica y cámara de video KP-MIU CCD de Hitachi. Elementos de programación de representación de imagen Openlab (Improvision, Lexington, Mass.) pueden ser usados para convertir las micrografías a imágenes binarias para determinación de número de placa y área de placa. (5) Amiloide de beta de plasma y cerebral Los niveles de beta amiloide pueden ser determinadas en el plasma y cerebro como sigue: las muestras de semi-cerebro pueden ser homogeneizadas en una solución de sacarosa de pH regulado, seguido ya sea por dietilamina al 0.4%/NaCl 100 mM en cuanto a niveles de beta amiloide soluble o acido fórmico frió para el aislamiento de ?ß total. Después de la neutralización, las muestras pueden ser diluidas y analizadas en cuanto a ?ß utilizando kits disponibles comercialmente (por ejemplo, aquellos provistos por BIOSOURCE International) . Análisis de Western blot pueden ser efectuados sobre todas las fracciones utilizando geles de urea para las especies de ?ß (véase, por ejemplo, Wiltfang, J. et al., Highly conserved and disease-especific patterns fo carboxyterminally truncated Abeta peptides 1-37/38/39 in addition to 1-40/42 in Alzheimer's disease and in patiens with chronic neuroinflammation J Neurochem 81, 481-496 (2002)). Beta amiloide puede ser detectado utilizando por ejemplo, 6E10 (BIOSOURCE International) and Enchanced Chemiluminenscence (Amersham) . (6) Análisis de APP en el cerebro APP puede ser detectado en el cerebro como sigue: muestras de semi-cerebro de ratón pueden ser homogeneizadas y centrifugadas a 109,000 x en Tris 20 mM (pH 7.4), sacarosa al 0.25 , EDTA 1 mM y EGTA 1 mM y un coctel de inhibidor de proteasa, mezclado con DEA al 0.4% (dietilamina) /NaCl 100 mM. Los sobrenadantes pueden ser analizados en cuanto a niveles de APP mediante Western blot utilizando anticuerpo monoclonal, mientras que las pelotillas pueden ser analizadas en cuanto a holoproteina de APP con pro ejemplo anticuerpo monoclonal Cl/6.1 como se describe previamente (véase, por ejemplo, Chishti, M. A. et al., Early-onset amyloid deposition and cognitive déficits in transgenic mice expressing a doublé mutant form of amyloid precursor protein 695. J. Biol Chem 276, 21562-21570 (2001) y Janus, C. et a. , A. beta. Peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease. Nature 408, 979-982 (2000) ) . (7) Potenciación a largo plazo Los potenciales de campo pueden ser registrados en la división DAl del hipocampo de ratón utilizando procedimientos estándar (véase, por ejemplo Sarvey, J M, Burgard E C & Decker G. Long-term potentiation: studies in the hippocampal slice. J. Neurosci Methods 28, 109-124 (1989) y Stanton, P K & Sarvey J M. Norepinephrine regulates long-term potentiation of both the population spike and dendritic EPSP in hippocampal dentate gyrus. Brain Res Bull, 18, 115-119 (1987)). Los cerebros de ratones pueden ser removidos y el hipocampo de cada hemisferio puede ser aislado, del cual se pueden preparar secciones (por ejemplo, se pueden elaborar secciones coronales de 350 mieras) . Las secciones pueden ser transferidas a una cámara de contención que contiene NaCl-CSF y se permite que se recupere por más de una hora. Una vez colocadas en la cámara, las secciones pueden ser sometidas a perfusión continuamente por un bucle cerrado que contiene 15 mi de ACSF para conservar el ?ß oligomérico. Después de 20 minutos de referencia estable, 1 mi de medio acondicionado 7PA2 concentrado 15X puede ser agregado al bucle de perfusión. Un electrodo estimulante bipolar (por ejemplo, aquellos provistos por World Precisión Inst.), puede ser colocado en los colaterales de Schaffer para alimentar estímulos de referencia y tetani . Un electrodo de registro de vidrio de boro silicato que contiene ACSF puede ser colocado aproximadamente 75-200 mieras del electrodo estimulante. La intensidad del estímulo (comúnmente entre 10-20 pAmps) puede ser ajustada para obtener 25-40% de la respuesta potencial de campo máxima. Los estímulos de prueba pueden ser alimentados a 0.05 Hz. Para inducir potenciación a largo plazo, 4 tetani (100 Hz por 1 segundo) pueden ser alimentados 5 minutos aparte. La respuestas potenciales pueden ser amplificadas 10 veces utilizando por ejemplo, un dispositivo Axopatch 200B. Los datos pueden ser muestreados a 10 kHz y filtrados a 2kHz. Las trazas pueden ser analizadas utilizando por ejemplo pClamp 9.2. La pendiente del potencial de campo puede ser estimada utilizando aproximadamente 10-60% de la respuesta total . (8) Cuantificación de sinaptofisina El teñido inmunohistoquímico de sinaptofisina puede ser efectuado en tres secciones sagitales espaciadas igualmente de ratones tratados con para formaldehído-fijo y testigo. Las secciones pueden ser inmuno marcadas por sinaptofisina con por ejemplo, anti-sinaptofisina IgG (1:40; Roche, Laval, PQ) .
Las imágenes digitales pueden ser capturadas y analizadas. Dentro de cada sección, tres áreas de 100 m escogidas aleatoriamente de la región de CAI del hipocampo pueden ser contadas en cuanto a cuerpos celulares reactivos a sinaptofisina y botones. Los resultados, pueden ser expresados como la media del número de cuerpo reactivos y botones por 100 pm (véase, por ejemplo, Chen, F. et al. Carboxyl-terminal fragments of Alzheimer beta-amyloid precursor protein accumulate in restricted and unpredict intracelular compartments in presenilin 1-deficient cells. J Biol. Chem. 275, 36794-36802 (2002); Phinney, A. et al., No hippocampal neuron or synaptic bouton loss in learning-impaired aged ß-amyloid precursor protein-null mice. Neuroscience 90, 1207-1216 (1999) ) . (9) Aversión de gusto acondicionado La aversión del gusto acondicionado (CTA) es una prueba estándar muy sensible bien conocida usada para probar la función cognoscitiva del animal antes y después de administración del tratamiento. CTA es usada para probar la habilidad del animal para prender a enfermedad asociada con un nuevo estimulo, tal como gusto de tal manera que los animales evitan el nuevo gusto después de re-exposición subsecuente a los nuevos estímulos. CTA involucra el cerebro en una variedad de niveles corticales y subcorticales . La asociación que enlaza información ascendente y descendente que produce conjuntamente un compartimiento aversivo puede ser ya sea atenuada o reforzada por cambios que afectan cualquiera de las unidades de interconexión. Como una forma de aprendizaje asociativo, la fuerza de CTA es determinado por un gran número de variables incluyendo novedad del estímulo, oral (por ejemplo, los estímulos no nuevos no pueden ser acondicionados aversivamente) , grado de "enfermedad producida" (toxicidad) , numero de repeticiones (entrenamiento) , contra impulsos (tales como tres) por nombrar unos pocos. Aunque una amplia variedad de agentes químicos y físicos pueden producir CTA de manera dependiente de la dosis, cloruro de litio produce confiablemente enfermedad y anorexia. Como una enfermedad que ocurre naturalmente, el litio produce un CTA al estimular las rutas descritas anteriormente, incluyendo liberación de citoquina. (10) Laberinto de Barnes El laberinto de Barnes consiste de una mesa circular con agujeros circulares alrededor de la circunferencia de la mesa. Debajo de cada agujero esta ranura para una caja, llamada la caja de caída. El objetivo del animal en el laberinto es alcanzar la caja de caída, que es una caja que tiene la parte superior abierta y puede ser alcanzada de uno de los agujeros en la parte superior de la mesa. La exposición sobre la superficie de la mesa sirve como refuerzo negativo, motivando al sujeto de prueba a buscar protección. La única protección disponible es la caja de caída, a la cual el sujeto de prueba debe escapar. Con el fin. de acostumbrar al sujeto de prueba al laberinto, es guiado a la caja de caída por una mano protectora. Después de cuatro a cinco corridas, un sujeto de prueba normal puede rápidamente ubicar el agujero de caída. Pistas visuales fijas establecidas alrededor de la plataforma sirven para orientar al roedor durante las pruebas.
El desempeño es medido comúnmente por el número de errores que el sujeto hace, esto es, el número de veces que se pega en la nariz o dirige su cabeza sobre un agujero circular que no contiene la caja de caída. La proporción de declinación en el- número de errores/prueba es medida a través de .los sujetos. Otros valores de desempeño pueden también ser medidos, por ejemplo la estrategia usada por cada roedor puede ser puntuada como aleatoria (verificar aleatoriamente cada agujero) , sistemática (verificar cada agujero en un patrón) o espacial (movimiento directo al agujero con la caja de caída) . (11) Coincidencia retarda a la muestra El procedimiento de coincidencia retardada a la muestra (D TS) es usado comúnmente para evaluar la memoria de reconocimiento espacial en animales de laboratorio. En un protocolo ejemplar, un sujeto es colocado en una cámara equipada con dos palancas retractables y un surtidor de pelotilla de alimento. Después de un periodo de tiempo, una palanca de muestra es presentada y el sujeto tiene que oprimir la palanca para obtener el alimento. La palanca es luego retractada y después de un retardo de duración diferente, ambas palancas son presentadas otra vez y se requiere que el sujeto escoja. Bajo condiciones coincidentes, una respuesta correcta constituiría oprimir la palanca que ha sido presentada antes y es recomenzado por la entrega de una pelotilla de alimento. Una respuesta incorrecta es castigada con 1 periodo fuera de 5 segundos durante el cual la luz es apagada. La memoria de trabaja es determinada al analizar el número de respuesta correctas e incorrectas del sujeto. (12) Activación microglial La activación de microglia puede servir para un papel benéfico en el tratamiento de enfermedad de Alzheimer. Así, la funcionalidad de un tratamiento de enfermedad de Alzheimer puede ser determinada utilizando métodos conocidos para medir activación microglial (véase, por ejemplo Higuchi, 2009, Current Alzheimer Research 6:137-143). Tales métodos utilizan técnicas de reproducción de imagen tales como aquellas descritas anteriormente, incluyendo representación de imagen de PET, para determinar niveles de activación de microglia de sujetos tratados en comparación con aquellos de sujetos testigo. 5.4 Métodos de tratamiento Se proveen en la presente métodos para tratamiento seguro y funcional de una amiloidosis, incluyendo pero no limitado a enfermedad de Alzheimer utilizando anticuerpos seguros y funcionales. En ciertas modalidades, los métodos comprenden la administración de un anticuerpo sin IgGl que se enlaza específicamente a una proteína amiloide y/o su forma patológica, tales como agregados, utilizando un régimen de dosis y/o administración de tal manera que la cinasa de MAP p38 es activada a niveles intermedios en células efectoras inmunes. El término "niveles intermedios" en relación con la activación de cinasa de MAP p38 como se usa en esta sección significa niveles más altos que en ausencia del anticuerpo pero más bajos que la presencia de un anticuerpo con la misma especificidad de enlace pero con la región constante de un anticuerpo de IgGl. Los niveles de activación de MAP de p38 pueden ser determinados como se resume en la sección 5.1 En ciertas modalidades, un anticuerpo sin IgGl que se enlaza específicamente a una proteína amiloide y/o su forma patológica, tales como agregados, es administrado utilizando un régimen de dosis y/o administración que da como resultado internalización máxima del antígeno objetivo, tal como proteína beta amiloide a células efectoras inmunes, tales como células de microglia y activación de cinasa de MAP p38 a niveles intermedios. En ciertas modalidades, el anticuerpo es administrado en combinación con un modulador de la ruta de cinasa de MAP p38 de tal manera que la cinasa de MAP p38 es activada a niveles intermedios .
En ciertas modalidades, el anticuerpo sin IgGl a ser usado con los métodos en la presente es un anticuerpo con la región constante de un anticuerpo de IgG4 humano. En ciertas modalidades, el anticuerpo sin IgGl tiene la región constante de un anticuerpo de IgG con el dominio de CH2 de un anticuerpo de IgG4 humano. En ciertas modalidades, las CDR de un anticuerpo no humanizado conocido que se enlaza específicamente a beta amiloide humano (véase Tabla 2 posteriormente en la presente) son combinadas con la región constante de un anticuerpo de IgG4 humano y las regiones de estructura entre las CDR del anticuerpo y reemplazadas con las regiones de estructura de un anticuerpo de IgG humano, tales como IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4. En ciertas modalidades, las regiones variables de un anticuerpo anti-beta amiloide humanizado conocido, por ejemplo Bapineuzumab o Solanezumab son combinados con la región constante de un anticuerpo de IgG4 humano .
La internalización de beta amiloide a microglia y activación de cinasa de MAP p38 pueden ser medidas utilizando cualquier técnica conocida para aquel de habilidad ordinaria en el arte. En ciertas modalidades, la dosificación de un anticuerpo seguro y funcional de la invención puede ser usada en el tratamiento de una amiloidosis, incluyendo pero no limitado a enfermedad de Alzheimer, es determinada utilizando un sistema de análisis a base de célula descrito en la sección 5.1. En particular, la dosificación es ajustada de tal manera que la internalización de beta amiloide a microglia es maximizada mientras que la activación de la ruta de cinasa de MAP p38 es activada por 5%-15%, 10%-20%, 15%-25%, 20%-30%, 35%-45%, 40%-50% o 45%-55% menor que la cinasa de MAP p38 es activada en presencia de un anticuerpo anti-beta amiloide de isotipo de IgGl .
En ciertas modalidades, el régimen de administración de un anticuerpo seguro y funcional de la invención a ser usado en el tratamiento de una amiloidosis incluyendo pero no limitado a enfermedad de Alzheimer es determinado utilizando un análisis a base de células descrito en la sección 5.1. En particular, la dosificación es ajustada de tal manera que la internalización de beta amiloide a microglia es maximizada mientras que la activación de la ruta de cinasa de MAP p38 es activada por 5%-15%, 10%-20%, 15%-25%, 20%-30%, 35%-45%, 40%-50% o 45%-55% menor que la cinasa de MAP p38 es activada en presencia de un anticuerpo anti-beta amiloide de isotipo de IgGl.
En ciertas modalidades, el régimen de administración de un anticuerpo seguro y funcional de la invención a ser usado en el tratamiento de una amiloidosis incluyendo pero no limitado a enfermedad de Alzheimer es determinado utilizando un sistema de análisis a base de células descrito en la sección 5.1. En particular, la dosificación es ajustada de tal manera que la internalización de beta amiloide a microglia es maximizada mientras que la activación de la ruta de cinasa de MAP p38 es activada por 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%, 40%-50% o 45%-55% menos que la cinasa de MAP p38 es activada en presencia de un anticuerpo beta amiloide de isotipo de IgGl .
En ciertas modalidades, la dosificación de un anticuerpo seguro y funcional de la invención es ajustada de tal manera que la internalización de beta amiloide a microglia es maximizada mientras que la activación de ruta de cinasa de MPA p38 es activada por 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%, 40%-50% o 45%-55% por encima de los niveles de activación de cinasa de MAP p38 en ausencia del anticuerpo.
En ciertas modalidades, el régimen de administración de un anticuerpo seguro y funcional de la invención a ser usado en el tratamiento de una amiloidosis incluyendo pero no limitado a enfermedad de Alzheimer es determinado utilizando un sistema de análisis a base .de células descrito en la sección 5.1. En particular, la dosificación es ajustada de tal manera que la internalización de beta amiloide a microglia es maximizada mientras que la activación ruta de cinasa de MAP p38 es activada por 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%, 40%-50% o 45%-55% por encima de los niveles de activación de cinasa de MAP p38 en ausencia del anticuerpo .
En modalidades específicas, la amiloidosis es enfermedad de Alzheimer, la proteína amiloide es beta-amiloide y las células efectoras inmunes son células de microglia. Mientras que los métodos y composiciones son resumidos en más detalle específicamente para enfermedad de Alzheimer, estos métodos y composiciones son en general aplicables al tratamiento y prevención de amiloidosis incluyendo pero no limitado a amiloidosis secundaria y amiloidosis relacionada con la edad tales como enfermedades que incluyen pero no están limitadas a alteraciones neurológicas tales como enfermedad de Alzheimer (AD) , incluyendo enfermedades o condiciones caracterizadas por una pérdida de capacidad de memoria cognoscitiva tal como por ejemplo deterioro cognoscitivo suave (MCI) , demencia de cuerpo de . Lewy, Síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria como amiloidosis (tipo holandés) ; el complejo de Parkinson-demencia de Guam. También como otras enfermedades que están basadas en o asociadas con proteínas semejantes a amiloides tales perlesía supra nuclear progresiva, esclerosis múltiple; enfermedad de Creutzfeld Jacob, enfermedad de Parkinson, demencia VIH-relacionada, ALS (esclerosis lateral amiotropica) , miositis de cuerpo de inclusión (IBM) , diabetes de inicio adulto; tumores endocrinos y amiloidosis cardiaca senil y varias enfermedades de los ojos incluyendo degeneración macular, neuropatía óptica drusen-relacionada y catarata debido a deposición beta-amiloide . En . modalidades específicas, la amiloidosis es enfermedad de Alzheimer y el paciente es un paciente humano.
En ciertas modalidades, la enfermedad de Alzheimer es tratada utilizando una combinación de un anticuerpo seguro y funcional provisto en la presente y uno o más de los siguientes fármacos usados actualmente para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer tal como tacrina (COGNEX, Morris Plains, NJ) , donepezil (ARICEPT, Tokio, JP) , rivastigmina (EXELON, East Hanover, NJ) , galantamina (REMINYL, New Brunswick, NJ) y memantina (NAMENDA, Nueva York, NY) . 5.5 Preparación farmacéutica y administración Un anticuerpo seguro y funcional provisto en la presente, (sección 5.2) puede ser preparado en una formulación fisiológicamente aceptable y puede comprender un portador, diluyente y/o excipiente aceptable farmacéuticamente utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, un anticuerpo seguro y funcional como se describe en la presente es combinado con un portador, diluyente y/o excipiente aceptable farmacéuticamente para formar una composición farmacéutica. Tales portadores, diluyentes y/o excipientes farmacéuticos apropiados son bien conocidos en el arte e incluyen por ejemplo soluciones salinas de pH regulado con fosfato, agua, emulsiones, emulsiones tales como aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc.
La formulación de las composiciones farmacéuticas provistas en la presente se pueden llevar a cabo de acuerdo con metodologías estándar conocidas para aquel de habilidad ordinaria en el arte .
Una composición farmacéutica provista en la presente puede ser administrada a un sujeto en forma de un sólido, líquido o aerosol a una dosis apropiada farmacéuticamente funcional. Ejemplos de composiciones solidas incluyen pildoras, cremas y unidades de dosificación implantables. Las pildoras pueden ser administradas oralmente. Las cremas terapéuticas pueden ser administradas tópicamente. Las unidades de dosificación implantables pueden ser administradas localmente, por ejemplo en un sitio de tumor o pueden ser implantadas para la liberación sistémica de la composición terapéutica, por ejemplo subcutáneamente. Ejemplos de composiciones liquidas incluyen formulaciones aptas para inyección intramuscular, subcutánea, intravenosa, intraarterialmente y formulaciones para administración tópica e intraocular. Ejemplos de formulaciones en aerosol incluyen formulaciones de inhalador para administración a los pulmones .
Las composiciones pueden ser administradas mediante rutas de administración estándar. En general, la composición puede ser administrada mediante rutas tópicas, oral, rectal, nasal, intradérmica, intraperitoneal o parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea o intramuscular). Además, la composición puede ser incorporada a matrices de liberación sostenida tales como polímeros biodegradables, los polímeros son implantados en la vecindad de donde sea la administración, por ejemplo en el sitio de un tumor. El método incluye la administración de una sola dosis, administración de dosis repetidas a intervalos de tiempo predeterminados y administración sostenida por un periodo de tiempo pre-determinado .
Una matriz de liberación sostenida, como se usa en la presente, es una matriz fabricada de materiales usualmente polímeros que son degradables mediante hidrólisis enzimática o hidrólisis acido/base o mediante disolución. Una vez insertada al cuerpo, se actúa sobre la matriz por encima y fluidos corporales. La matriz de liberación sostenida es escogida deseablemente por materiales biocompatibles tales como liposomas, polilacturos (ácido polilactico) , poliglicolato (polimérico de ácido glicolico) , polilacturo co-glicolato (copolímero de ácido láctico y ácido glicolico) , poli anhídridos, poli (orto) esteres, polipéptidos, ácido hialuronico, ' colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos , polisacáridos , ácidos nucleicos, poli aminoácidos, aminoácidos tales como fenil alanina, tirosina, isoleucina, poli nucleótidos, polivinilpropileno, polivinilpirrolidona y silicona. Matrices biodegradables empleadas comúnmente para los propósitos de la invención incluyen pero no están limitadas . a una matriz ya sea de uno u otro polilacturo, poliglicolato o polilacturos co-glicolato (copolímeros de ácido láctico y ácido glicolico) .
Es bien conocido para aquel de habilidad ordinaria en el arte que la dosificación de la composición dependerá de varios factores tales como ejemplo la condición que es tratada, la composición particular usada y otros factores clínicos, tales como peso, tamaño, sexo y la condición de salud general del paciente, áreas superficial corporal, el compuesto o composición particular a ser administrada, otros fármacos que son administrados concurrentemente y la ruta de administración.
La composición puede ser administrada en combinación con otras composiciones que comprende una sustancia o compuesto biológicamente activo, particularmente por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de compuestos contra estrés oxidante, compuestos anti-apoptoticos , agentes quelantes de metal, inhibidores de reparación de ADN, tales como pirenzepina y metabolitos, acido 3-amino-l-propansulfonico (3APS) , 1, 3-propandisulfonato (1,3 PDS) activadores de -secretasa inhibidores de ß- y ?- secretasa, proteínas tau, neurotransmisores, rompedores de hoja ß, agentes atrayentes para componentes de despeje ß amiloide/agotamiento celular, inhibidores de ß amiloide truncado N-terminal incluyendo beta amiloide 3-42 piroglutamato, moléculas anti-inflamatorias , "antipsicóticos atipicos" tales como por ejemplo clozapina, ziprasidona, ripseridona, aipriprazol o inhibidores de colinesterasa (ChEls) , tales como tacrina rivastigmina, donepezil y/o galantamina, agonistas de MI y otros fármacos incluyendo cualquier amiloide o fármaco modificante tau y complementos nutritivos tales como por ejemplo vitamina B12, cisteína, un precursor de acetilcolina, lecitina, colina, Ginkgo bilova, acetil-L-carnitina, idebenona, propentoflina o un derivad de xantina junto con un anticuerpo con la presente invención y opcionalmente un portador y/o un diluyente y/o un excipiente aceptable farmacéuticamente y procedimientos para el tratamiento de enfermedades.
La administración será en general parenteralmente, por ejemplo intravenosamente. Preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones y emulsiones. Solventes no acuosos incluyen pero no están limitados' a propilenglicol , polietilenglicol , aceite vegetal tal como aceite de oliva y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Solventes acuosos pueden ser escogidos del grupo que consiste de agua, soluciones alcohol/acuosas, emulsiones o suspensiones incluyendo solución salina y medios de pH regulado. Vehículos parentales incluyendo solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer lactada o aceites fijos. Vehículos intravenosos incluyen re abastecedores de fluido y nutrientes, re abastecedores de electrolitos (tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer y otros) . Conservadores pueden también estar presentes, tales como por ejemplo antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, etc.
La composición farmacéutica puede comprender además portadores proteinaceos, tales como por ejemplo albúmina de suero o inmunoglobulina, particularmente de origen humano. Agentes biológicamente activos adicionales pueden estar presentes en la composición farmacéutica de la invención, dependiendo de su uso propuesto.
Cuando el objetivo de enlace está localizado en el cerebro, ciertas modalidades de la invención proveen que el anticuerpo o fragmento del mismo atraviese la barrera de sangre-cerebro . Ciertas enfermedades neurodegenerativas están asociadas con un incremento de permeabilidad de la barrera de sangre-cerebral, de tal manera que el anticuerpo o fragmento activo del mismo puede ser introducido fácilmente al cerebro. Cuando la barrera de sangre-cerebro permanece intacta, existen varios procedimientos conocidos en el arte para transportar moléculas a través de la misma, incluyendo pero no limitado a métodos físicos, métodos a base de lípidos y métodos a base de receptor y canal .
Los métodos físicos para transportar el anticuerpo o fragmento activo del mismo a través de la barrera de sangre-cerebro incluyen pero no están limitados a circunvenir la barrera de sangre-cerebro completamente o al crear aberturas en la barrera de sangre-cerebro . Los métodos de circunvención incluyen pero no están limitados a inyección directa al cerebro (véase, por ejemplo Papanastassiou et al., Gene Therapy 9:398-406 (2002)) e implante de un dispositivo de administración en el cerebro (véase, por ejemplo, Gilí et al., Nature Med. 9:589-595(2003) y Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical) . Métodos para crear aberturas en la barrera incluyen pero no están limitados a ultrasonido (véase, por ejemplo Publicación de Patente Estadounidense 2002/0038086) , presión osmótica (por ejemplo, mediante la administración manitol hipertónico (Neuwelt Press, N.Y. (1989) , permeabilización, por ejemplo mediante bradikinina o permeabilizante A-7 (véanse, por ejemplo Patentes Estadounidenses 5,112,596; 5,268,164; 5,506,206 y 5,686,416)) y transfección de neuronas que se montan a ambos lados de la barrera de sangre-cerebro con vectores que contienen genes que codifican el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno (véase, por ejemplo Publicación de Patente Estadounidense 2003/0083299) .
Los métodos a base de lípido para transportar el anticuerpo o fragmento activo del mismo a través de la barrer de sangre-cerebro incluyen pero no están limitados a encapsular el anticuerpo o fragmento activo del mismo en liposomas que son acopladas a fragmentos de enlace de anticuerpo que se enlazan a receptores sobre el endotelio vascular de la barrera de sangre-cerebro (véase, por ejemplo, Publicación de Solicitud de ¦ Patente Estadounidense 20020025313) y recubrir el anticuerpo o fragmento activo del mismo en partículas de lipoproteína de baja densidad (véase, por ejemplo Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 20040204354) o apolipoproteina E (véase, por ejemplo Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 20040131692) .
Los métodos a base de receptor y canal para transportar el anticuerpo o fragmento activo del mismo a través de la barrera de sangre-cerebro incluyen pero no están limitados a usar bloqueadores gluco corticoides para incrementar la permeabilidad de la barrera de sangre-cerebro (véase, Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 2002/0065259, 2003/0162695 y 2005/0124533); activar canales de potasio (véase, por ejemplo Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 2005/0089473) , inhibir transportadores de fármaco ABC (véase, por ejemplo Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 2003/0073713) ; recubrir anticuerpos con una transferina y modular la actividad de uno o más receptores de transferrina (véase, por ejemplo Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 2003/0129186) y cationización de los anticuerpos (véase, por ejemplo Patente Estadounidense 5,004,697).
Aquel de habilidad ordinaria en el arte reconocerá o será apto de indagar, utilizando no más que experimentación de rutina, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención descrita en la presente . Se pretende que tales equivalentes sean abarcados por las siguientes reivindicaciones.
Todas las referencias citadas en la presente son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos a la misma extensión como si cada Publicación o Patente o Solicitud de Patente Individual fuera indicada especifica e individualmente para ser incorporada por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
La presente invención no está limitada en alcance por las modalidades específicas descritas en la presente. Por supuesto, varias modificaciones de la invención, además de aquellas descritas en la presente se harán evidentes para aquel de habilidad ordinaria en el arte a partir de la descripción anterior y figuras adjuntas. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. 6. EJEMPLOS 6.1 Identificación de un anticuerpo IgG4 humanizado que se enlaza igualmente a múltiples conformaciones ?ß Anticuerpos monoclonales anti-?ß múranos fueron generados al inmunizar ratones con un antígeno de péptido ?ß utilizando una formulación de vacuna liposomal como se describe previamente (Muhs et al., 2007) .varios criterios fueron usados para seleccionar anticuerpos candidatos incluyendo la habilidad para enlazarse a múltiples especies ?ß y para inhibir el ensamble de ?ß1-42 a agregados de péptidos citotóxicos pequeños. Un mAb murino monoclonal con una cadena fundamental de IgG2B (mMABT) fue seleccionado para estudios de funcionalidad in vivo utilizando tanto modelos de APP humanos mutantes murinos transgénicos individuales y modelos APP/PS1 humanos mutantes murinos doble transgénicos de enfermedad de Alzheimer. El tratamiento con mMABT mejoro la memoria y redujo la carga de placa (véase Figura 7) . El m ABT fue además madurado por afinidad y humanizado sobre una cadena fundamental de IgG4 humana (el anticuerpo resultante es también denominado como "mMBAT" ) . Para probar el enlace de mMABT a ?ß in vitro, una' serie de preparaciones de ?ß1-42 diferentes fueron elaboradas y caracterizadas. Estas variaron de fracciones ?ß1-42 monomericas y oligomericas aisladas mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) , fibras ?ß1-42 maduras, a una mezcla más compleja de ensambles de oligómero ?ß1-42 altamente neurotóxicas que varían de tamaño de dímeros y trímeros a multimeros de peso molecular más alto (véase Figura 8) . El enlace del MABT a diferentes preparaciones de péptido ?ß1-52 fue medido mediante un análisis de ELISA y similar al mABT, mostró que es altamente comparable entre los diferentes estados de ensamble de ?ß1-42 (Figuras 1A-C) .
MABT fue probado subsecuentemente en cuanto a enlaces a placas ?ß en los cerebros de ratones transgénicos que expresan la proteína precursora amiloide humana (hAPP) y a placas amiloides en secciones de cerebro AD humanas. Placas amiloides tanto en ratones transgénicos Happ (Figura ID parte superior) y cerebro AD (Figura ID inferior) fueron inmuno decoradas con el anticuerpo monoclonal de MABT. Tomados conjuntamente, estos datos proveen evidencia fuerte de enlace de MABT tanto a oligómeros de ?ß neurotóxicos solubles como conjuntos de ?ß presentes en cerebros AD. 6.2 Inhibición del ensamble de ?ß y desagregación de péptidos ?ß1-42 protofibrilares preformados Los datos in vitro han demostrado que los anticuerpos anti-?ß cuando son combinados con ?ß pueden impedir la formación de ensambles ?ß de orden superior patológicos e invertir los agregados ?ß preformados (Legleiter et al. 2004; Solomon et al., 1997). El epítope de enlace de receptor del anticuerpo monoclonal de MABT fue mapeado a los aminoácidos 14 a 23 de ?ß1-42 y por consiguiente se traslapa con el segmento catiónico hidrofóbico principal de ?ß1-42 responsable por la auto asociación, oligomerización subsecuente y el núcleo del ensamble de hoja ß ?ß-142 (Pike et al., 1993; Esler et al., 1996; Haass y Selkoe, 2007). Los efectos de MABT sobre la agregación de ?ß1-42 in vitro fueron probados utilizando tioflavina-T (ThT) un tinte que no impide el ensamble amiloide pero fluoresce en el enlace a agregados amiloides pequeños ricos en hojas ß (Levine, III, 1993) . Cuando son comparados con un anticuerpo monoclonal anti-ß testigo dirigido contra el termino .N de ?ß1-42 (y así que no se traslapa con los aminoácidos de núcleo que forman el dominio de auto ensamble) , MABT demostró un efecto inhibidor fuerte sobre la agregación de ?ß1-42 (Figura 1E panel izquierdo) y la disipación del péptido ?ß1-42 pre agregado (Figura 1E panel derecho) . El anticuerpo monoclonal testigo dirigido contra el termino N de ?ß, tuvo alrededor de la mitad de actividad inhibidora en comparación con el anticuerpo monoclonal de MABT anti dominio medio en ambos análisis. Resultados similares fueron obtenidos cuando el MABT fue comparado con un anticuerpo monoclonal anti-?ß anti-C-terminal (no mostrado) . Estos análisis in vitro están basados en la habilidad de ThT para enlazarse a hojas ß extendidas del péptido ?ß1-42 (Levine, II, 1993) . Por consiguiente, para verificar que este no fue un artefacto debido al desplazamiento moderado por anticuerpo monoclonal potencial del enlace de ThT a ?ß1-42 rico en hoja beta, un análisis que no depende de la fluorescencia de ThT, sino más bien en la capacidad de ?ß1-42 marcado para agregarse o auto ensamblarse sobre ?ß1-42 sin marcar inmovilizado fue efectuado. Resultados comparables fueron obtenidos en este análisis, es decir el MABT impido el auto-ensamble de ?ß1-42 de manera dependiente de la dosis (Figura 1F) . Estos datos demuestran que un anticuerpo dirigido contra el dominio medio de ?ß tal como MABT provee el efecto inhibidor más robusto sobre el alargamiento y/o agregación del fibrilo ?ß1-42 en relación con anticuerpos que apuntan a otros dominios de ?ß en este análisis.
La habilidad de los oligómeros ?ß1-42 solubles para enlazarse a otras proteínas, tanto solubles como enlazadas a membranas, ha sido demostrado que contribuye a su toxicidad (Strittmatter et al., 1993; Liu et al., 2009). El sitio de interacción de ApoE4 con ?ß1-42 requiere aminoácidos 18 a 28 (Strittmatter et al., 1993). El efecto de MABT sobre el enlace de ?ß1-42 a ApoE4 humano recombinante fue probado in vitro y comparado con anticuerpos monoclonales específicos para el termino N o C de ?ß1-42. Bajo condiciones en donde concentraciones de saturación de ApoE4 y ?ß1-42 fueron usadas, MABT inhibió más del 80% de la interacción de ?ß1-42 y ApoE4 , mayor que con cualquiera de los otros anticuerpos monoclonales probados (véase, Figura 9) . Para resumir, estos datos muestran que MABT impide la oligomerización adicional de ?ß1-42 a estados de ensamble biológicamente activos tóxicos y disipa ?ß1-42 ya agregado o placa-enlazado . Además, con un epitope de enlace localizado centralmente, MABT puede competir por la interacción de péptidos ?ß a otras proteínas, tales como ApoE, bloqueando así interacciones con ?ß que requieren aminoácidos en el dominio central de ?ß incluyendo auto asociación. 6.3 Neutralización MABT-moderada de los efectos neurotóxicos de los efectos de ?ß1-42 in vitro Tanto con datos de funcionalidad bioquímicos como in vivo que muestran una funcionalidad terapéutica para el anticuerpo monoclonal MABT, los efectos del anticuerpo monoclonal MABT en un modelo de cultivo celular primario fueron probados utilizando oligomeros ?ß1-42 citotóxicos. Cultivos corticales primarios de ratas Pl fueron cultivados y tratados con oligomeros ?ß1-42 libres u oligomeros acoplados a MABT. Un anticuerpo monoclonal de IgG no específico fue usado como testigo en todos los experimentos. El tratamiento de cultivos corticales con una concentración 2.5 o 5 µ? de oligomeros ?ß1-42 en 24 horas dio como resultado una reducción en el rendimiento metabólico tal como es medido mediante oxidación mitocondrial de MTT (Figura 2A) , un indicador de viabilidad celular. Un rescate completo de toxicidad fue observado para la concentración de oligómero ?ß1-42 hasta 5 µ? en presencia de MABT (proporción molar de MABT a oligómero de ?ß1-42 de 1:7.5). Para confirmar estos resultados, la liberación de ATP fue medida utilizando un análisis de luminiscencia y también mostró un efecto cito protector similar de MABT (Figura 2B) . Para determinar además el efecto de MABT sobre la muerte de células neuronal ?ß1-42 moderada, neuronas corticales embriónicas de ratón fueron mantenidas en cultivo por 6 días y tratadas con ?ß1-42 con o sin MABT por cuatro días. Los cultivos testigo mostraron morfología saludable (Figura 2C, panel izquierdo) . El tratamiento con ?ß1-42 por 4 días dio como resultado degeneración de axón y provoco una disminución en el número total de axones (Figura 2C, panel central) . Las células tratadas con la combinación de ?ß1-42 y MABT parecieron similares a las células testigo (Figura 2C, panel derecho) . Estos resultados demuestran que el anticuerpo monoclonal de MABT anti-?ß fue apto de proteger tanto cultivos corticales de rata de la perdida de viabilidad moderada por oligómero de ?ß1-42 aguda como neuronas corticales de ratón embrionicas de la degeneración inducida por ?ß1-42. 6.4 La interacción del oligómero de ?ß1-42 con membranas celulares es inhibida mediante mAb de MABT anti-?ß Se sabe que los péptidos de ?ß, especialmente intermediarios de agregación (Bateman et al, 2007) se asocian con varios lípidos y proteínas presentes en membranas celulares. Si MABT puede ejercer sus efectos neuroprotectores al reducir o aun bloquear el enlace de oligómeros de ?ß1-42 a las neuronas fue probado. Un teñido de inmunofluorescencia para ?ß membrana-enlazado fue efectuado. Los oligómeros ?ß?-42 fueron aplicados a cultivos corticales mezclados pro 30 minutos o 18 horas, después de lo cual los cultivos fueron teñidos por ?ß y con un anticuerpo a la clase III especifica de neurona ß-tubulina TuJl . El tratamiento de neuronas corticales con oligómeros ?ß1-42 dio como resultado una asociación fuerte de ?ß con neuronas, en particular con procesos neuríticos (Figura 3A, paneles medios y recuadros) . El co-tratamiento con MABT bloqueo la interacción de oligómeros ?ß1-42 con neuronas, especialmente el enlace a procesos neuronales . Este efecto fue fácilmente, evidente tan temprano como 30 minutos (Figura 3A y 3B) y permaneció por al menos 18 horas de tratamiento (Figura 3B) . aunque un mAb anti-?ß-?-terminal (clon 6E10) fue usado en el análisis para el teñido en cuanto a oligómeros de ?ß1-42 (Figura 3A) , reduciendo así el potencial por interferencia entre MABT y el anticuerpo monoclonal de detección usado para el teñido, estos resultados fueron confirmados utilizando ?ß1-42 marcados fluorescentemente con fluor-488 de HiLyte. El tratamiento de cultivos corticales con este péptido de ?ß1-42 marcado directamente soporto adicionalmente la conclusión de que el enlace reducido de MABT de ?ß1-42 a procesos neuronales en cultivos corticales primarios (Figuras 3C y 3D) .
Se ha demostrado que la acumulación de ?ß1-42 intra neuronal contribuye significativamente a la disfunción neuronal (Casas et al., 2004; irths et al., 2001; Cleary et al., 2005; Oddo et al., 2003). La acumulación intracelular de ?ß1-42 fue determinada en células tripsina-despejadas utilizando un análisis de ELISA. Este análisis demostró que MABT redujo la internalización del oligómero de ?ß1-42 por más del 60% (Figura 3E) . inesperadamente, las observaciones de estudios de inmunofluorescencia también indicaron que en presencia de MABT, hubo un desplazamiento en la asociación del oligómero de ?ß1-42 de procesos neuronales hacia perfiles celulares que se asemejan a raicroglia (Figura 3F) . 6.5 Absorción microglial de los oligómeros ?ß?-42 La relación entre la formación del complejo de MABT/ ?ß1-42 y la absorción microglial de ?ß1-42 fue investigada. Para verificar que los oligómeros de ?ß1-42 acomplejados a MABT son absorbidos por microglia se llevó a cabo la representación de imagen confocal sobre cultivos neuronales mezclados tratados . Cuando se compara con las células tratadas con oligómeros de ?ß1-42 solos, se encontró que MABT modero la absorción rápida de oligómeros de ?ß1-42 en perfiles celulares probables de ser microglia (Figura 4A) . esto fue fácilmente evidente tan prematuramente como 30 minutos enseguida del tratamiento. Las microglia juegan un papel crucial en la absorción y degeneración de ?ß, una función que es comprometida en ratones APP (Hickman et al., 2008)'. En relación con la inmunoterapia anti-?ß, se ha propuesto que un mecanismo posible mediante el cual las placas ?ß son despejadas es por medio de las propiedades de enlace de FCYR del anti-?ß enlazado a ?ß (Koenigsknecht-Talboo et al., 2008) . Sin embargo, la absorción de complejos anti-?ß/?ß por microglia y la activación de FcyR puede activar estas células para volverse activadas.
Además de superar la citotoxicidad de los oligómeros ?ß1-42 en neuronas, un anticuerpo anti-?ß terapéutico tendría idealmente una respuesta proinflamatoria significativamente reducida con una reducción significativa en las consecuencias negativas resultantes de tal respuesta proinflamatoria. Por consiguiente MABT, fue comparado con anticuerpos que portan las mismas secuencias de enlace de antígeno, pero albergan diferentes cadenas fundamentales de IgG con afinidades de enlace de FCYR variables y por consiguiente diferente potencial de activación de microglia. Estas incluyen una IgGl humana tipo silvestre con plena capacidad de enlace de FcyR (MABT-IgGl) y una cadena fundamental de IgGl humana que porta una tmutación de D65A (MABT-IgGl-D276A) se reduce espectacularmente el enlace de FcyR (Shields et al, 2001) . Todas las variantes de cadena fundamental se enlazaron con afinidad similar ?ß1-42 tal como se verifica utilizando la resonancia de plasmón superficial.
La habilidad de estas diferentes cadenas fundamentales de anticuerpo monoclonal para internalizar oligómeros de ?ß?-42 a microglia fue luego comparada utilizando representación de imagen confocal sobre microglia cortical primaria tratado con oligómero ?ß1-42. Se encontró que la internalización del oligómero de ?ß1-42 se correlacionaba bien con el enlace de FcyR con MAB -IgGl > MABT > MABT-IgGl-D265A (Figuras 4B y 4C) . para verificar que las macroglia son por supuesto las células que absorben ?ß1-42 acomplejado a anticuerpos monoclonales, el estudio fue repetido utilizando ?ß1-42 marcado con fluor-488 de Hylite y co-teñido por el marcador microglial Ibal . Después del enlace ya sea a MABT o el anticuerpo monoclonal de MABT-IgGl, ?ß1-42 marcado se enriqueció en microglia Ibal+ (Figura 4D) . en cultivos celulares tratados con ?ß1-42 en combinación con el anticuerpo monoclonal de MABT-IgGl, la microglia tendría núcleos más condensados y teñido de Ibal más brillante, elementos que sugieren mayor activación microglial antígeno/anticuerpo-moderada. Para verificar las diferencias de enlace de FcyR, el enlace del mAb de IgG reticulado diferente al FcyRIIIa-V158 de baja afinidad fue medido y una jerarquía de enlace fue identificada en donde MABT-IgGl > MABT > MABT-IgGl-D265A (Figura 4E) . el enlace a otros elementos de la familia de FcyR es mostrado en la Figura 10.
Las diferentes cadenas fundamentales de anticuerpo monoclonal de IgG fueron probadas en cuanto a su habilidad para invertir la toxicidad moderada por el oligómero de ?ß?-42 en cultivos corticales primarios mezclados. La actividad de enlace de FcyR funcional presente tanto para los anticuerpos monoclonales de MABT como MABT-IgGl fue requerida para la plena inversión "de la toxicidad moderada por el oligómero de ?ß1-42 (Figura 4F) . el anticuerpo monoclonal MABT- IgGl-D265a, que carece de funcionalidad de enlace de FcyR, mostró solo una tendencia no significativa hacia la inversión de toxicidad celular moderada por el oligómero de ?ß1-42. Sorprendentemente, el anticuerpo monoclonal tipo silvestre de MABT-IgG, que porta mayor afinidad de enlace de FCYR en comparación con el anticuerpo monoclonal de MABT de IgG4, tendió hacia un efecto protector más pequeño cuando se compara con MABT. Así, mientras que el enlace a FcyR microglial es necesario para el pleno rescate, el enlace mejorado de la cadena fundamental de MABT-IgGl a FcyR en comparación con aquel de un MABT puede dar como resultado una activación de microglia indeseable, lo que se puede traducir a protección global reducida contra la neurotoxicidad moderada por el oligómero de ?ß1-42. 6.6 La cadena fundamental tipo silvestre de MABT-IgGl conduce a una respuesta de microglia proinflamatoria En esfuerzos por identificar mediadores corrientes debajo de toxicidad inducida por oligómero de ?ß1-42 cuyos estados de activación son alterados por los anticuerpos monoclonales ?ß, varias rutas de señalización candidatas fueron examinadas. El papel de p38 MAPK en contribuir a la neurotoxicidad y activación microglial ha sido ampliamente documentada (Li .et al., 2004; Wang et al., 2004) . La activación de p38 MAPK fue examinada en cultivos corticales mezclados primarios tratados con oligómeros ?ß1-42. Cuando las células fueron tratados con oligómeros ?ß?-42, p38 MPAK fue activado en el transcurso de 15 minutos (no mostrado) y alcanzo un máximo a 30 minutos. Después de la combinación con los diferentes anticuerpos monoclonales , solamente MABT-IGgl que porta la cadena fundamental tipo silvestre IgGl y que tiene la afinidad de enlace mayor a FcyR incremento la actividad de p38 MAPK inducida por el oligómero de ?ß1-42 aun además como se muestra por análisis de ELISA fosfo-p38 MAPK-especifico (Figura 5A) . Puesto que los varios anticuerpos anti-?ß se enlazan con afinidad similar a ?ß?-42, el anticuerpo monoclonal MABT-IgGl debe neutralizar los oligómeros de ?ß1-42 tóxicos en el mismo grado como MABT. Sin embargo, la mayor afinidad de enlace de FCYR de la cadena fundamental de IgGl puede dar como resultado activación de microglia y puede ser perjudicial a células que son altamente susceptibles a las acciones de los oligómeros ?ß1-42, tales como neuronas. El anticuerpo monoclonal de MABT acomplejado a oligómeros de ?ß1-42 no redujo la actividad de p38 MAPK inducida por el oligómero de ?ß1-42, sino que más bien mostró una tendencia hacia actividad más alta, reflejando la activación de FcyR parcial por este anticuerpo.
Ya que estos análisis iniciales midieron la afinidad de p38 MAPK total en cultivos corticales mezclados, incluyendo tanto células neuronales como células gliales, la pregunta de si la actividad de p38 MAPK detectada cuando las células fueron tratadas con la combinación de oligómeros de ?ß1-42 y MAB fue específica a la microglia fue probada. Las células fueron tratadas como previamente, pero esta vez la actividad de fosfo-p38 MAPK fue examinada mediante teñido de inmunofluorescencia junto el marcador de microglia Ibal. Después del tratamiento con oligómeros de ?ß1-42 acomplejados a ' anticuerpos monoclonales de MABT o MABT-IgGl, aproximadamente el 93% de las células tiñen positivo para fosfo-p38 MAPK fueron Ibal+ (Figura 5B) . Para confirmar la activación de p38 MAPK en microglia, microglia purificadas fueron tratadas de la misma manera. Bajo estas condiciones, la activación de p38 MAPK moderada por el complejo de ?ß?-42/IgG en microglia fue fácilmente identificada (Figura 5C) .
Para tratar la contribución de activación de p38 MAPK a la neurotoxicidad moderada por oligómero de ?ß1-42, las células fueron tratadas con una segunda generación de inhibidor p38 MAPK-especifico y luego con oligómeros ?ß1-42 solos o en combinación ya sea con el MABT o el anticuerpo monoclonal MABT-IgGl-D265A de bajo enlace de FcyR. Inesperadamente, el incremento MABT-moderado en señal de MTT fue reducido a aquel de MABT-IgGl-D265A en presencia del inhibidor de p38 MAPK, indicando una reducción en función de rescate moderada por MABT después de la inhibición de p38 MPAK (Figura 5D) . La inhibición de p38 MAPK no tuvo ningún efecto sobre células tratadas con oligómeros de ?ß1-42 acomplejados con el anticuerpo monoclonal de MABT-IgGl-D265A.
Estos resultados demuestran que aunque el anticuerpo monoclonal de MABT no induce niveles de p38 MAPK significativamente sobre aquellos observados con los oligómeros de ?ß1-42 solos, la activación de p38 MAPK juega un papel en la neuro protección MABT-moderada. Sin estar limitados por la teoría, los objetivos células de esta actividad en el sistema de cultivo mezclado fueron las células de microglia.
Para enlazar la actividad de microglia incrementada .más directamente a una lectura pro- inflamatoria corriente abajo, la liberación de TNF-a por cultivos celulares primarios enriquecidos por microglia fue medida (>61% de Ibal+, no mostrado) . La liberación de TNFOÍ pro-inflamatoria por microglia enriquecida cuando es tratada con oligómeros de ?ß1-42 fue reducida en presencia de todos los anticuerpos monoclonales anti-?ß probados (Figura 6) . Sin embargo, el mayor efecto fue observado en presencia de MABT. Así, un anticuerpo monoclonal de IgG4 anti-?ß puede tener un perfil más deseable en comparación con un anticuerpo monoclonal de IgGl anti-?ß combinando los efectos neuroprotectores y habilidad para promover la absorción de ?ß por microglia con activación microglial limitada. 6.7 MATERIALES Y METODOS 6.7.1 Preparación de cultivo celular Cultivos corticales primarios de ratas fueron preparados de ratas Sprague-Dawley (Charles River Laboratories L' Arbresele, Francia) en el día 1 post-natal, como se describe por Meberg y iller (Meberg y Miller, 2003) . El cerebelum y meninges fueron removidos y los cortices fueron cortados en piezas pequeñas y disociados con disrupción enzimática a 37° en solución reguladora del pH de disociación (papaína, CaCl2, EDTA y HEPES; todos de Invitrogen, Carlsvad, CA) . Se agregó DNasa (Invitrogen) por 10 minutos. Enseguida de la disociación, las neuronas corticales dispersadas fueron depositadas sobre placas de cultivo de tejido de 6 cavidades, 24 cavidades o 96 cavidades recubiertas poli-L-lisina (al 0.01%; peso molecular 150,000-300,000; Sigma) . Para inmuno citoquímica, las células fueron cultivadas sobre cubre objetos de vidrio recubiertos a placas de 24 cavidades. Las células fueron mantenidas en medio neuro basal (Invitrogen) sin rojo de fenol, sin la adición de L-glutamina (2 mM; Sigma) , complemento B27 (Invitrogen) y penicilina/estreptomicina (Sigma) en una incubadora humidificada a 37°C y 5% de C02. Enseguida de 1 hora y 30 minutos en cultivo, el medio fue reemplazado con medio astrocito acondicionado. Después de 4 días adicionales en cultivo, la proliferación celular fue bloqueada mediante tratamiento con citosina arabinóside (Ara-C) a 2.5 m (Invitrogen) . Bajo estas condiciones de cultivo, el 20% de las células fueron identificadas como neuronas mediante teñido de Neu /DAPI (no mostrado) . Experimentos usando cultivos corticales mezclados fueron efectuados en general a vías in vitro 6 ( "DIV" ) a no ser que se afirme de otra manera. La microglia enriquecida preparada de corteza e hipocampo fueron cosechadas como se describe para cultivos corticales anteriores. La corteza e hipocampo fueron puestos en DMEM que tiene alto contenido de glucosa y homogeneizados mediante pipeteado con una pipeta de 10 mi y luego con una jeringa. El producto homogeneizado fue centrifugado por 3 minutos a 1000 g y luego resuspendidos en DMEM precalentado que tiene alto contenido de glucosa que contiene 10% de FCS y penicilina/estreptomicina (medio de microglia) . La suspensión celular fue enseguida transferida a un matraz de cultivo de tejido T75 y mantenida en incubadora humidificada a 37 °C y 5% de C02 por 1 semana. El matraz fue agitado para separar la microglia de células adherentes y recolectadas hidratadas en DMEM. Las células resultantes fueron re suspendidas en 1 mi de medio de microglia contadas y depositadas a 5 x 104 células/cavidad. Para verificar el enriquecimiento microglial, las células fueron teñidas con los marcadores astrogliales y microgliales GFAP e Ibal, respectivamente. Más del 60% de células tiñeron positivas para Ibal con ninguna célula que tiñe para ambos GFAP e Ibal . Microglias puras fueron preparadas de ratones 3CX3CR1-GFP de tres días postnatal (Jackson Laboratories) . La corteza e hipocampo fueron disecados y triturados en DMEM que contiene alto contenido de glucosa utilizando una pipeta de 10 mi y luego con una aguja de calibre 18. El homogeneizado fue centrifugado por 3 minutos a 1000 g y luego resuspendido en DMEM recalentado que contiene alto contenido de glucosa, 10% 1 de FBS y penicilina/estreptomicina (medio de microglia) . La suspensión celular fue enseguida transferida a un matraz de cultivo de tejido T75 y mantenida en una incubadora humidificada a 37°C y 5% . de C02 por 7-10 días. Las microglias fueron aisladas mediante agitación, recolectas y lavadas en DMEM. Las células resultantes fueron re suspendidas en 1 mi de medio de microglia, contadas y depositadas sobre portaobjetos de cámara de vidrio tratados con cultivo de tejido a 5 x 10 células/cavidad para uso en los experimentos. 6.7.2 Generación de anticuerpos anti-?ß El anticuerpo monoclonal anti-?ß de IgG4 de MABT es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal de IgG2B de ratón (mMABT) generado al inmunizar ratones con una vacuna preparada como se describe previamente (Muhs et al., 2007). 6.7.3 Enlace de FcyR El enlace de anticuerpos de prueba a un panel de receptores de FcyR humanos (FCYR) fue medido utilizando análisis inmunoabsorbente enzima-enlazado (ELISA) . Las FcyR humanas .(Genentech, Inc., CA) son proteínas de fusión que contienen el dominio extracelular de la cadena gama de receptor con una etiqueta de polipéptido de S transferasa (GST)de Gly/6xHis/glutationa en el término C. un anticuerpo monoclonal con estructura de IgGl humana fue usado como el testigo positivo (testigo de IgGl) . Las placas fueron recubiertas con un anticuerpo anti-GST monoclonal de ratón (Genentech, Inc.) en una solución reguladora del pH de carbonato de sodio 0.05M (pH 9.6) de la noche a la mañana a 4°C. Después del bloqueo con una solución reguladora del pH de análisis que contiene solución salina de pH regulado de fosfato (PBS) , BSA al 0.5% y Tween-20 al 0.05%, las placas fueron incubadas con FcyR a temperatura ambiente por una hora. Las FcyR humanas fueron inmovilizadas a la placa vía interacción con el recubrimiento anti-GST. Diluciones seriales de MABT anti-?ß, MABT-IgGl, MABT- IgGl-D265a o anticuerpos monoclonales testigo de IgGl fueron preparadas en la solución reguladora del pH de análisis que contiene caseína bloqueadora al 10% en PBS (Pierce; Rockford, IL) . Las muestras diluidas fueron aplicadas como formas monomericas para el receptor de alta afinidad (FcyRIa) o formas multimericas para los receptores de baja afinidad (FcYRIIa, FcyRIIb y FcyRIIIa) . Las formas multimericas de anticuerpos de prueba fueron generadas mediante reticulación del fragmento de F(ab')2 de cadena anti-humana de cabra (MP Biomedicals, Solón, OH) , con anticuerpo monoclonal de prueba a una proporción molar aproximada de 3:1. Las placas fueron incubadas con FcyR a temperatura ambiente por 2 horas. Las placas fueron lavadas tres veces con solución reguladora del pH de lavado que contiene PBS y Tween 20 al.0.05% después de cada etapa de incubación. Los anticuerpos enlazados a los FcyR fueron detectados con fragmentos de F(ab' >2 peroxidasa de rábano (HRP) -conjugado de F(ab')2 anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories; West Grove, PA) . Tetrametilbenzidina (TMB; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) sirvió como sustrato. Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente por 15 a 20 minutos para permitir el desarrollo de color. La reacción fue terminada con H3PO4 1 M y la absorbancia a 450 nm con referencia a 350 nm fue leída en un lector de placas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . Las curvas de enlace fueron generadas al graficar los valores de absorbancia media de duplicados de diluciones de muestra contra la absorbancia de muestra respectiva . 6.7.4 Estudios de funcionalidad in vivo Dos estudios fueron efectuados para determinaciones de funcionalidad in vivo. Para medir la memoria de recuerdo, 12 ratones APP humanos mutantes por grupo recibieron 2 inyecciones i.p. de anticuerpo monoclonal MABT o testigo de vehículo (PBS) . Un día después de la segunda inyección, la memoria de recuerdo fue estudiada utilizando la tarea de reconocimiento de objeto nuevo (ORT) como se describe (Dewachter et al., 2002). El índice de reconocimiento (RI) fue definido como la proporción del tiempo graficado explorando un nuevo objeto con respecto al tiempo gastado explorando tanto un nuevo objeto como un objeto observado 3 horas previamente, una medida de memoria no espacial que involucra el hipocampo. En un estudio separado, ratones APP/PS1 mutantes humanos positivos de placa amiloide transgénicos dobles fueron usados para medir el efecto de la administración de anticuerpo monoclonal sobre la carga de placa cortical. Los ratones fueron inyectados i.p. semanalmente con 500 µ?? de anticuerpo monoclonal de MABT en un periodo de 16 semanas, después de lo cual la carga de placa cortical fue medida. Los cerebros fueron disectados y el hemisferio cerebral derecho fue fijado por inmersión en para formaldehído en PBS al 4% de la noche a la mañana y secciones de vibra tomo sagital (40 µp?) fueron cortadas para incubaciones flotantes libres y almacenadas a 4°C en PBS con azida de sodio al 0.1% hasta el teñido. 5 secciones a diferentes niveles fueron teñidas para placas densas con tioflavina-S . Las secciones fueron aleatorizadas para el teñido y cuantificación ciega. Se adquirieron imágenes con un microscopio DMR de Leica equipada con una cámara Sony DSC-9100P y analizadas con una computadora utilizando elementos de programación Q-Win de Leica. La intensidad de luz y ajuste del condensador para el microscopio fueron mantenidos constantes en todo el proceso de adquisición de imagen. El área del subiculum fue seleccionada para cuantificación automática de la carga amiloide en el teñido con tioflavina-S. 6.7.5 Preparación de oligómeros ?ß1-42 tóxicos El péptido ?ß1-42 (Bachem) fue disuelto en HFIP, sonificado y agitado de la noche a la mañana a temperatura ambiente. Luego las alícuotas fueron secadas bajo un flujo de argón, secadas al vacío y almacenadas a -80°C como una película de péptido de ?ß1-42 monomérico hasta el uso. Una alícuota de 165 g dé película de péptido fue re suspendida en 7 µ? de DIVISO, 85 µ? de PBS y 9 µ? de SDS al 2% e incubada por 6 horas a 37 °C. Luego, se agregaron 300 µ? de agua y después de una incubación de la noche a la mañana a 37°C, los oligómeros ?ß1-42 fueron precipitados con 900 µ? de solución de metanol al 33%, ácido acético al 4% por una hora a 4°C, centrifugados a 16,200 g por 10 minutos. El sobrenadante fue removido y los oligómeros ?ß1-42 fueron secados antes de ser resuspendidos en solución de Na2HP04/NaCl para una concentración final de 1 pg/µ?. 6.7.6 Análisis de citotoxicidad de ?ß1-42 La citotoxicidad de oligómeros de ?ß1-42 fue probada sobre cultivos corticales mezclados al DIV 5. Todos los anticuerpos, a una concentración final de 100 g/ml, fueron co-incubados con oligómeros ?ß1-42 por 30 minutos en medio de cultivo celular libre de suero a 37 °C antes del tratamiento de las células. Para algunos experimentos, los cultivos corticales mezclados fueron pre-tratados por 1 hora con SB239063 1 µ?, un inhibidor de p38 de segunda generación potente, antes del tratamiento con los oligómeros ?ß1-42. Para evaluar la viabilidad celular, análisis de reducción con bromuro de 3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio ( TT) estandarizados (Promega, Madison, WI, Estados Unidos de América) se llevaron a cabo, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para evaluar la viabilidad celular en respuesta a varios tratamientos, análisis de reducción con bromuro de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio (MTT) estandarizados (Promega, Madison, WI, Estados Unidos de América) se llevaron a cabo. Brevemente, por las últimas 3 horas de tratamiento, las células cultivadas en placas de 96 cavidades (Costar) fueron incubadas con la solución de tinte de MTT y la generación de un producto de formazan azul fue medida al leer la absorbancia a 570 y 690 nm utilizando un lector de placa (Tecan) . Los resultados son presentados como porcentaje de incremento en supervivencia con respecto a células tratados con oligómeros de ?ß1-42. La habilidad del anticuerpo monoclonal de MABT para proteger a las neuronas de la degeneración inducida por el oligómero ?ß1-42 fue también determinada en un análisis in vitro utilizando inmunofluorescencia. Neuronas corticales de ratón del día embrionico 17.5 fueron aisladas, disociadas y cultivadas in vitro en medio neurobasal con complemento B27. ?ß1-42 fue preparado como se describe anteriormente para la película de péptido monomérico de ?ß1-42, después de lo cual se agregaron 10 µ? de DMSO para disolver el péptido. Luego, se agregaron 78.6 µ? de medio F12 de Ham y la solución del péptido ?ß1-42 a una concentración de 25 µ? fue incubada a 4°C durante 48 horas antes del tratamiento celular. Las células fueron cultivadas por 9 días en total y fueron alimentadas en el día 3 y en el día del tratamiento. Para el tratamiento, ?ß1-42 a una concentración de 2 µ? con o sin MABT a 50 pg/ml fue agregado en el día 5 o día 6 con DMSF0-F12 solo al mismo volumen que fue usado como el testigo de vehículo. En el día 9, enseguida de 3 a 4 días del tratamiento, las neuronas fueron fijadas y teñidas con TuJl, un anticuerpo anti-ß-tubulina. Un anticuerpo secundario FITC-marcado fue usado para visualizar micro túbulos utilizando microscopía de fluorescencia. 6.7.7 Inmunohistoquimica Secciones de cerebro de lóbulo temporal montadas en parafina (20 pm) de un paciente con AD y de un testigo sin AD de edad, coincidente (Tissue Solutions, Clydebank, Reino Unido de la Gran Bretaña) fueron usados para el teñido de inmunohistoquimica. Las secciones desparafinizadas fueron sometidas a recuperación de antígeno utilizando ácido fórmico y luego marcadas con 50 g/ml de MABT como el anticuerpo primario. Una IgG biotinilada anti-humana de cabra fue usada como anticuerpo secundario. El teñido se hizo con diaminobenzidina (Dako, Glostrup, Dinamarca) y el montaje utilizando el medio de montaje Eukitt. Se adquirieron imágenes en un microscopio invertido LSM 700 de Zeiss. 6.7.8 ELISA de ?ß1-42 Para · medir la acumulación de ?ß1-42 intracelular mediante ELISA, cultivos corticales primarios fueron tratados en placas de cultivo células de 6 cavidades (Costar) después de lo cual fueron lavados y despejados con tripsina (Bateman et al., 2007) antes de la lisis en solución reguladora del pH de lisis celular que consiste de Tris-HCl 50 mM(pH 8.0), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, orto vanadato de sodio 1 mM, Tritón X-100 al 1% y cocteles de inhibidor de proteasa y fosfatasa. La concentración de proteína fue determinada mediante el análisis de BCA (Pierce) . Un ELISA ?ß1-42 especifico de alta sensibilidad (The Genetics Company, Inc., Zurich, Suiza) fue usado para medir el lisado celular ?ß1-42 de acuerdo con las instrucciones del fabricante . 6.7.9 Inmunohistoquimica y representación de imagen confocal Las células fueron cultivadas sobre cubre objetos de vidrio. Enseguida del tratamiento, las células fueron lavadas rápidamente con PBS y luego fijadas con para formaldehído al 4% por 20 minutos. Después de lavados completos, las células fueron sumergidas en metanol al 10% por 10 minutos a -20 °C. Luego fueron lavadas otra vez e incubadas en una solución de bloqueo, PBS que contiene' suero de cabra normal al 10% por 1 hora a temperatura ambiente. Después de una incubación de la noche a la mañana con el anticuerpo primario, las células fueron lavadas e incubadas por 2 horas con el anticuerpo secundario, luego lavadas y montadas sobre portaobjetos de vidrio utilizando el reactivo anti desvanecimiento de oro de ProLong (Invitrogen) . La epifluorescencia e imágenes confocales fueron adquiridas en un microscopio invertido LSM 700 de Zeiss, utilizando una lente 63x. La intensidad de fluorescencia fue medida en cuerpos celulares delineados mediante imágenes de epifluorescencia saturadas. Las pilas Z fueron presentadas en una imagen tridimensional utilizando los elementos de programación ImageJ 1.42 (National Institutes of Health, producto libre) del cual una rebanada apical a distal que contiene las proteínas marcadas fue obtenida. Las células tratadas .con ?ß1-42 Fluor-488 de HyLite-marcadas fueron tratadas de la misma manera excepto que no se usaron ni anticuerpos primarios ni secundarios para marcar por ?ß1-42. 6.7.10 ELISA de fosfo-p38 Cultivos corticales de rata fueron sembradas sobre placas de cultivo celular de 6 cavidades recubiertas con poli-L-lisina (Costar, Cambridge, MA, Estados Unidos de América) y usados al DIV 5. A no ser que indique de otra manera, las células fueron tratadas con oligómeros ?ß1-42 2 µ? con o . sin anticuerpo monoclonal a 100 µg/ml por 30 minutos. En algunos análisis, las células fueron pre-tratadas por 1 hora con el inhibidor de p38 de segunda generación SB239063. Se usó anisomicina como testigo positivo. Los tratamientos fueron detenidos al colocar las células sobre hielo y aspirar el medio. Las células fueron lavadas con PBS helado, cosechadas utilizando un raspador celular y sometidas a lisis en solución reguladora del pH de lisis que consiste de Tris-HCl 50 mM (pH 8.0), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, orto vanadato de sodio 1 mM, Tritón X-100 al 1% y cocteles que contienen inhibidor de proteasa y fosfatasa. La concentración de proteína fue determinada mediante el análisis de BCA (Pierce, Rockford, IL, Estados Unidos de América) . Para la medición semi-cuantitativa de activación de p38 MAPK, se usó un kit de ELISA colorimétrico de fosfo-p38 MAPK de rata (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, Estados Unidos de América), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las placas fueron leídas . sobre un lector de placas espectrofotométrico . (Tecan) a 370 nm. Para algunos experimentos, fosfo-p38 fue analizado utilizando inmuno citoquímica . 6.7.11 Liberación de TNFct Cultivos corticales de rata enriquecidos por microglia (> 60% Ibal+ células DAPI+ totales) fueron tratadas con oligómeros ?ß1-42 10 µ? con o sin 100 g/ml de anticuerpos por 6 horas y 24 horas. Se usó LPS (Sigma) a 1 pg/ml como estímulo de testigo positivo. Los sobrenadantes celulares fueron removidos a los puntos en el tiempo indicados, se hicieron pasar a través de un filtro de 0.2 µp? y probados en cuanto a TNFOÍ con un TNFOÍ/TNFSFIA de rata de Quantikina (R&D Systems), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Además, cultivos microgliales puros de ratones CX3CR1-GFP P3 son tratados con 1 pg/ml de LPS, oligómeros ?ß1-42 10 µ solos o en combinación con MABT anti-?ß 100 ug/ml, MABT-IgGl, MABT-IgGl-D265A, IgGl testigo o anticuerpos solos por 24 horas. Los sobrenadantes celulares son cosechados, se hacen pasar a través de un filtro de 0.2 µp\ y se hacen correr sobre un análisis 23-plex de ratón Bio-Plex (Bio-Rad, Hercules, CA, Estados Unidos de América) . 6.7.12 Análisis estadístico Todos los análisis estadísticos fueron se hicieron utilizando Prism GraphPad versión 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, Estados Unidos de América) . Los datos son presentados como medias + desviación estándar (SD) o error estándar de la media (SEM) como se indica. Los datos fueron analizados mediante la prueba t de Student, A OVA unidireccional seguida por comparaciones múltiples Tukey-post-hoc o prueba no paramédica de suma de rangos de Wilcoxon cuando sea apropiado. Un valor P de < 0.05 fue tomado para indicar una diferencia estadísticamente significativa. 6.7.13 Representación de imagen in vivo de placas amiloides Ventanas craneales fueron implantadas por encima de la corteza somato sensorial de ratones hAPP (v7171I)/PSl APP de 10 meses de edad como se describe previamente (Trachtenberg et al 2002, Holtmaat et al, 2009) , dos semanas antes de la sesión de representación de imagen inicial. Veinticuatro horas antes de cada sesión de representación de imagen, los animales fueron inyectados con 10 mg/kg de Metoxy-X04 i.p. para visualizar placas amiloides individuales (Klunk et al 2002) e inmediatamente antes de la representación de imagen inyectados i.v. con AngioSense680 (VisEn Medical) para visualizar vasos sanguíneos. Para cada sesión de representación de imagen, los animales fueron anestesiados con una mezcla de isoflurano-oxígeno y montados al microscopio utilizando un poste de cabeza. Las imágenes fueron recolectadas vía un microscopio de barrido de láser de dos fotones (Ultima in vivo; Prairie Techonologies) utilizando un láser de Ti: zafiro (MaiTai DeepSee; Spectra Physics) ajustado a 820 nm que alimentan -30 m al plano posterior-focal de una lente obetivo 0x NA. 0.8 (Olympus) . El patrón de la vasculatura fue usado para colocar reproduciblemente el ratón en relación con el objetivo de día a día, permitiendo que placas amiloides individuales sean representadas en imágenes durante muchas semanas. Los volúmenes de placas individuales fueron estimados al sumar el número de pixeles por encima délos puntos dentro de una región de interés dibujada alrededor de una placa dada. El fondo es definido como la intensidad de pixel media más dos desviaciones estándar dentro de una región de interés dibujada adyacente a una placa amiloide. Enseguida de la cuarta y octava sesión de representación de imagen, los animales fueron dosificados i.p. con 60 mg/kg de MABT.

Claims (29)

REIVINDICACIONES
1. Un método para monitorear el curso del tratamiento de amiloidosis, tal como enfermedad de Alzheimer en un paciente, caracterizado . porque el método comprende medir el grado de activación de cinasa de MAP p38 en células de microglia del paciente.
2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la amiloidosis es tratada con un anticuerpo anti-beta-amiloide .
3. Un método para probar la actividad neuro protectora de un agente, en donde el método comprende: a. incubar células de microglia con oligómeros ?ß1-42 neurotóxicos y el anticuerpo anti-?ß amiloide; · b. medir la absorción de péptido beta amiloide por células de microglia.
4. Un método para probar la seguridad de un agente , en donde el método comprende : a. incubar células de microglia con oligómeros ?ß1-42 neurotóxicos y el anticuerpo anti-?ß amiloide; b. medir la activación de cinasa de MAP p38 por células de microglia.
5. El método de la reivindicación 3 o 4, caracterizado porque el agente es un anticuerpo anti-beta amiloide.
6. Un método para tratamiento de amiloidosis, tal como enfermedad de Alzheimer, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo, una cantidad seguro y funcional de un anticuerpo anti-Beta amiloide sin IgGl humanizado en donde la cantidad segura y funcional da como resultado la activación de cinasa de MAP p38 en células de microglia del paciente a un nivel por encima del nivel de activación de la cinasa de MAP p38 en ausencia del anticuerpo anti-beta amiloide sin IgGl humanizado pero debajo del nivel de activación de MAP p3.8 en presencia de la misma concentración de un anticuerpo anti-beta amiloide de IgGl que se enlaza a beta amiloide con la misma Kd como el anticuerpo anti-beta amiloide sin IgGl humanizado.
7. El método de la reivindicación 5, caracterizado porque la activación de cinasa de MAP p38 en células de microglia del paciente es de entre 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%, 40%-50% o 45%-55% por encima de la activación de cinasa de MAP p38 en células de microglia del paciente en ausencia del anticuerpo beta amiloide sin IgGl humanizado.
8. Un método para tratamiento de amiloidosis, tal como enfermedad de Alzheimer, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo, un anticuerpo anti-Beta amiloide sin IgGl humanizado en un régimen de dosificación, en donde el régimen de dosificación da como resultado activación de cinasa de MAP p38 en células dé microglia del paciente a un nivel por encima del nivel de activación de cinasa de MAP p38 en ausencia del anticuerpo anti-beta amiloide sin IgGl humanizado pero debajo del nivel de activación de MAP p38 en presencia de la misma -concentración de un anticuerpo anti-beta amiloide de IgGl que se enlaza a beta amiloide. con la misma Kd como el anticuerpo anti-beta amiloide sin IgGl humanizado.
9. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque la activación de cinasa de MAP p38 en células de microglia del paciente es de entre 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%, 40%-50% o 45%-55% por encima de la activación de' cinasa de MAP p38 en células de microglia del paciente en ausencia del anticuerpo beta amiloide sin IgGl humanizado.
10. Un método para producir un anticuerpo anti-beta- amiloide humanizado seguro y funcional caracterizado porque comprende reemplazar la región constante en un anticuerpo sin IgG4 que tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable que se enlaza funcionalmente a beta-amiloide con una región constante derivada de un anticuerpo de IgG4.
11. Un método para probar la actividad neuro protectora de un anticuerpo anti-beta amiloide, caracterizado porque comprende : a. obtener el cultivo celular cortical primario mezclado; b. incubar el cultivo celular con los oligómeros ?ß1-42 neuro óxicos y el anticuerpo anti-beta amiloide y c. medir la proporción de supervivencia neurona1.
12. El método de la reivindicación 6, caracterizado porque la proporción de supervivencia neuronal es medida mediante rendimiento metabólico tal como se determina mediante oxidación mitocondrial de TT.
13. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque la proporción de supervivencia neuronal es medida mediante liberación de ATP.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2,3, 4, 5, 6, 8 o 10, caracterizado porque el anticuerpo anti-beta amiloide comprende: a. una CDR1 de- región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de las CDR1 de región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2 ; b. una CDR2 de región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de las CDR2 de región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2 c. una CDR3 de región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de las CDR3 de región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2
15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2,3, 4, 5, 6, 8 o 10, caracterizado porque el anticuerpo anti-beta amiloide comprende : a. una CDR1 de región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de las CDR1 de región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2 ; b. una CDR2 de región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de las CDR2 de región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2 c . una CDR3 de región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de las CDR3 de región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2
16. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque las CDR1, CDR2 y CD3 de la región variable de cadena ligera y las CDR1, CDR2 y CDR2 de la región variable de cadena pesada son todas derivadas del mismo anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2.
17. Un anticuerpo anti-beta amiloide humanizado caracterizado porque tiene i) una secuencia de amino ácidos de una región variable que se enlaza a beta-amiloide derivado de un anticuerpo humanizado sin IgG4 y ii) una secuencia de aminoácidos de una región constante derivada de un anticuerpo de lgG4.
18. El anticuerpo anti-beta amiloide humanizado de la reivindicación 17, caracterizado porque el anticuerpo humanizado sin IgG4 es seleccionado del grupo que consiste de anticuerpos anti-beta amiloides enlistados en la Tabla 2.
19. Un anticuerpo anti-beta amiloide humanizado caracterizado porque tiene i) una secuencia de amino ácidos de la región variable que se enlaza a beta-amiloide derivado de un anticuerpo humanizado de IgGl y ii) una secuencia de aminoácidos de una región constante derivada de un anticuerpo de IgG4.
20. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad segura y funcional del anticuerpo humanizado de las reivindicaciones 17 o 19 y un portador aceptable farmacéutico.
21. El anticuerpo de las reivindicaciones 17 o 19, caracterizado porque el anticuerpo anti-beta amiloide comprende : a. una CDR1 de región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de las CDR1 de región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2 ; b. una CDR2 de región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de las CDR2 de región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2 c. una CDR3 de región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de las CDR3 de región Variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2
22. El anticuerpo' de las reivindicaciones 17 o 19, caracterizado porque el anticuerpo anti-beta amiloide comprende : a. una CDR1 de región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de las CDR1 de región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2 ,- b. una CDR2 de región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de las CDR2 de región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2 c. una CDR3 de región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de las CDR3 de región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2
23. El método de la reivindicación 21, caracterizado porque las CDR1, CDR2 y CD3 de la' región variable de cadena ligera y las CDR1, CDR2 y CDR2 de la región variable de cadena pesada son todas derivadas del mismo anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2.
24. U anticuerpo anti-beta amiloide humanizado caracterizado porque tiene i) una secuencia de amino ácidos de una región variable que se enlaza a beta-amiloide derivado de un anticuerpo humanizado sin IgGl y ii) una secuencia de aminoácidos de una región constante derivada de un anticuerpo sin IgGl.
25. Un método para mejorar la seguridad de un anticuerpo anti-beta amiloide sin IgG4 caracterizado porque comprende reemplazar la región constante de dicho anticuerpo sin IgG4 con una región constante derivada de un anticuerpo de IgG4.
26. Un método para mejorar la seguridad de un anticuerpo anti-beta amiloide sin IgG4 caracterizado porque comprende reemplazar la región constante de dicho anticuerpo sin IgG4 con una región constante derivada de un anticuerpo sin IgGl.
27. Un método para mejorar la seguridad de un anticuerpo antibeta amiloide sin IgG4 caracterizado de las reivindicaciones 25 o 26,caracterizado porque dicho anticuerpo sin IgG4 es un anticuerpo de IgGl.
28. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque las CDR1, CDR2 y CD3 de la región variable de cadena ligera y las CDR1, CDR2 y CDR2 de la región variable de cadena pesada son todas derivadas del mismo anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2.
29. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque las CDR1, CDR2 y CD3 de la región variable de cadena ligera y las CDR1, CDR2 y CDR2 de la región variable de cadena pesada son todas derivadas del mismo anticuerpo anti-beta amiloide enlistado en la Tabla 2.
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2046833B9 (en) 2006-07-14 2014-02-19 AC Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
SI2170389T1 (sl) * 2007-06-12 2015-03-31 Ac Immune S.A. Humanizirana protitelesa proti amiloidu beta
BRPI0818621A8 (pt) * 2007-10-05 2018-01-30 Ac Immune Sa composição farmacêutica, e, métodos para reduzir a carga da placa e a quantidade de placas na camada de célula de gânglio retinal de um indivíduo, para prevenir, tratar e/ou aliviar os efeitos de uma doença ocular, para diagnosticar uma doença ocular e uma predisposição a uma doença ocular, para monitorar doença ocular, para predizer responsividade de um paciente, e para reter ou diminuir pressão ocular nos olhos de um indivíduo
RU2604181C2 (ru) 2007-10-05 2016-12-10 Дженентек, Инк. Применение антитела против амилоида бета при глазных заболеваниях
MY164579A (en) 2010-07-30 2018-01-15 Ac Immune Sa Safe and functional humanized antibodies
US20130190606A1 (en) * 2012-01-25 2013-07-25 Huntington Medical Research Institutes Combined quantitative mri and quantitative mrs for diagnosis of alzheimers disease and hippocampal sclerosis
MX2016002799A (es) 2013-09-13 2016-05-26 Genentech Inc Composiciones y metodos para detectar y cuantificar la proteina en la celula hospedera en las lineas de celulas y productos de polipeptidos recombinantes.
NZ756750A (en) 2013-09-13 2022-05-27 Genentech Inc Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides
AU2015214058B2 (en) * 2014-02-08 2020-07-09 Genentech, Inc. Methods of treating Alzheimer's Disease
CN107208062B (zh) 2015-01-16 2021-03-09 新加坡科技研究局 从多能干细胞分化巨噬细胞
KR20180085736A (ko) 2015-11-09 2018-07-27 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 아밀로이드 베타 중간-영역 내 에피토프 및 이에 대해 구조적으로 선택성인 항체
CA3004498A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Neil R. Cashman Amyloid beta epitopes and antibodies thereto
EP3877399A4 (en) 2018-11-06 2022-10-19 Alsatech, Inc. CELL-BASED GENE THERAPY FOR NEURODEGENERATIVE DISEASES
CN109602895A (zh) * 2018-12-27 2019-04-12 中山大学附属第医院 Mfg-e8在制备用于选择性调控淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞极化的药物中的应用
CN111518206B (zh) * 2019-02-01 2022-03-29 长春金赛药业有限责任公司 人源化抗Aβ单克隆抗体及其应用
CN111518793A (zh) * 2020-05-20 2020-08-11 谭骏 年轻人血源APPα-分泌酶在阿尔茨海默病中的应用
AU2021310926A1 (en) 2020-07-23 2023-03-23 Othair Prothena Limited Anti-abeta antibodies
WO2023004386A1 (en) * 2021-07-22 2023-01-26 Genentech, Inc. Brain targeting compositions and methods of use thereof
CN117586388A (zh) * 2022-08-09 2024-02-23 深圳智源生物医药有限公司 改进的β淀粉样蛋白寡聚体特异性结合抗体

Family Cites Families (268)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1590524A (en) 1976-11-24 1981-06-03 Nat Res Dev Assay of immune complexes
US4210622A (en) 1977-09-07 1980-07-01 National Research Development Corporation Kit for assay of immune complexes
US4331649A (en) 1978-10-10 1982-05-25 Burroughs Wellcome Co. Immune complex assay
DE3364347D1 (en) 1982-04-09 1986-08-07 Fujirebio Kk Anti immune complex antibody and preparation thereof
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
US4753893A (en) 1985-05-31 1988-06-28 Biostar Medical Products, Inc. Method and article for detection of immune complexes
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5525339A (en) 1986-08-27 1996-06-11 Dms Pharmaceutical Inc. Isolated components of dense microspheres derived from mammalian brain tissue and antibodies thereto
US5231170A (en) 1986-08-27 1993-07-27 Paul Averback Antibodies to dense microspheres
DE3702789A1 (de) 1987-01-30 1988-08-18 Bayer Ag Vorlaeuferprotein des apc-polypeptids, dafuer codierende dna und diagnostische verwendung der dna und des proteins
IT1217123B (it) 1987-02-05 1990-03-14 Rotta Research Lab Derivati otticamente attivi dell acido 5 pentilammino 5 oxo pentanoico r ad attivita antagonista della colecistochinina e procedimento per la loro preparazione
DE3805744C2 (de) 1987-03-04 1999-09-23 Novartis Ag Phenylcarbamate zur Hemmung der Acetylcholinesterase
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
FI95572C (fi) 1987-06-22 1996-02-26 Eisai Co Ltd Menetelmä lääkeaineena käyttökelpoisen piperidiinijohdannaisten tai sen farmaseuttisen suolan valmistamiseksi
CA1340802C (en) 1987-08-15 1999-10-26 Yasuyuki Takahashi Senile amyloid precursor protein and an antibody specific for the same
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US5231000A (en) 1987-10-08 1993-07-27 The Mclean Hospital Antibodies to A4 amyloid peptide
US5843708A (en) 1988-01-05 1998-12-01 Ciba-Geigy Corporation Chimeric antibodies
AU3204689A (en) 1988-02-10 1989-09-06 Children's Medical Center Corporation Amyloid protein precursors, genetic probes, antibodies, and methods of use
US6287793B1 (en) 1988-08-19 2001-09-11 Elan Pharmaceuticals, Inc. Diagnostic methods for alzheimer's disease
US5215889A (en) 1988-11-18 1993-06-01 The Regents Of The University Of California Catalytic and reactive polypeptides and methods for their preparation and use
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US20040049014A1 (en) 1988-12-28 2004-03-11 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5262332A (en) 1989-04-05 1993-11-16 Brigham And Women's Hospital Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue
CH676310B5 (es) 1989-04-14 1991-07-15 Dubois & Depraz Sa
AU5439790A (en) 1989-04-14 1990-11-16 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Cerebrovascular amyloid protein-specific monoclonal antibody sv17-6e10
US5234814A (en) 1989-06-01 1993-08-10 Du Pont Merck Pharmaceutical Company Diagnostic assay for alzheimer's disease
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5268164A (en) 1990-04-23 1993-12-07 Alkermes, Inc. Increasing blood-brain barrier permeability with permeabilizer peptides
US5112596A (en) 1990-04-23 1992-05-12 Alkermes, Inc. Method for increasing blood-brain barrier permeability by administering a bradykinin agonist of blood-brain barrier permeability
AT396939B (de) 1990-05-29 1993-12-27 Alois Dipl Ing Dr Jungbauer Komplexes virales antigen von hiv-1 bindendes rekombinantes protein
US5502658A (en) 1990-12-27 1996-03-26 Relin; Arkadi Sampled-continuous probability method of velocity measurement of the object having informatively-structural inhomogeneity
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
JP3277211B2 (ja) 1991-11-12 2002-04-22 プラナ・バイオテクノロジー・リミテッド アルツハイマー病の試験方法と治療方法
US20010029293A1 (en) 1992-01-27 2001-10-11 Icos Corporation Icam-related protein
US5837822A (en) 1992-01-27 1998-11-17 Icos Corporation Humanized antibodies specific for ICAM related protein
US5773218A (en) 1992-01-27 1998-06-30 Icos Corporation Method to identify compounds which modulate ICAM-related protein interactions
US5538845A (en) 1992-02-05 1996-07-23 Athena Neurosciences, Inc. Beta-amyloid peptide production inhibitors and methods for their identification
US5604102A (en) 1992-04-15 1997-02-18 Athena Neurosciences, Inc. Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors
US5441870A (en) 1992-04-15 1995-08-15 Athena Neurosciences, Inc. Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein
US5837672A (en) 1992-07-10 1998-11-17 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide
US6610493B1 (en) 1993-06-17 2003-08-26 Brigham And Women's Hospital Screening compounds for the ability to alter the production of amyloid-β peptide
US5766846A (en) 1992-07-10 1998-06-16 Athena Neurosciences Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production
ATE191853T1 (de) 1992-07-27 2000-05-15 Us Health Zielgerichte liposome zur blut-hirne schranke
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5605811A (en) 1992-10-26 1997-02-25 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein
US5891623A (en) 1992-11-09 1999-04-06 Consorzio Per Le Biotecnologie Diagnosis and treatment of AIDS onset
ZA938243B (en) 1992-11-12 1995-05-04 Hybritech Inc Altered affinity polypeptides of metal chelate binding antibodies
US5750349A (en) 1993-01-25 1998-05-12 Takeda Chemical Industries Ltd. Antibodies to β-amyloids or their derivatives and use thereof
US5955317A (en) 1993-01-25 1999-09-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to β-amyloids or their derivatives and use thereof
CA2115900A1 (en) 1993-02-22 1994-08-23 Gerald W. Becker Pharmaceutical screens and antibodies
US5840294A (en) 1993-03-29 1998-11-24 Queen's University At Kingston Method for treating amyloidosis
WO1995014041A1 (fr) 1993-11-19 1995-05-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps humain reconstitue contre des cellules medulloblastomateuses humaines
CA2127476C (en) 1994-07-06 1999-12-07 Daniel G. Pomerleau Logging or measurement while tripping
JPH10507643A (ja) 1994-10-21 1998-07-28 イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型の新規配列、ならびにそれらの予防薬、治療薬および診断薬としての使用
JPH08178926A (ja) 1994-10-25 1996-07-12 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd イムノアッセイプレートおよびその用途
US6114133A (en) 1994-11-14 2000-09-05 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41)
US5589154A (en) 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
US5688651A (en) 1994-12-16 1997-11-18 Ramot University Authority For Applied Research And Development Ltd. Prevention of protein aggregation
US5786180A (en) 1995-02-14 1998-07-28 Bayer Corporation Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide
US6303567B1 (en) 1995-03-14 2001-10-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc . Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5756662A (en) 1995-03-14 1998-05-26 Corixa Corporation Compounds and methods for the detection of T. cruzi infection
AU5752696A (en) 1995-05-18 1996-11-29 Regents Of The University Of Michigan, The Dna binding antibodies
AU6255096A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York, The Pegylated modified proteins
US6632976B1 (en) 1995-08-29 2003-10-14 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric mice that are produced by microcell mediated chromosome transfer and that retain a human antibody gene
US5846533A (en) 1995-09-14 1998-12-08 The Regents Of The University Of California Antibodies specific for native PrPSc
AUPN649395A0 (en) 1995-11-10 1995-12-07 Ramsay Health Care Pty Ltd A method for diagnosing alzheimer's disease
EP0866805A1 (en) 1995-12-12 1998-09-30 Karolinska Innovations AB PEPTIDE BINDING THE KLVFF-SEQUENCE OF AMYLOID $g(b)
JPH09178743A (ja) 1995-12-27 1997-07-11 Oriental Yeast Co Ltd 可溶性ａｐｐの定量法
EP0959888B1 (en) 1996-08-13 2001-09-05 P.N. Gerolymatos S.A. Use of the chelating agent clioquinol for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of alzheimer's disease
US20030068316A1 (en) 1997-02-05 2003-04-10 Klein William L. Anti-ADDL antibodies and uses thereof
US6218506B1 (en) 1997-02-05 2001-04-17 Northwestern University Amyloid β protein (globular assembly and uses thereof)
US20020086847A1 (en) 1997-04-09 2002-07-04 Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
CA2296842C (en) 1997-07-21 2012-03-20 Arpi Matossian-Rogers Ligands, including antibodies, showing reactivity against endocrine cells
IT1293511B1 (it) 1997-07-30 1999-03-01 Gentili Ist Spa Anticorpi monoclonali catalitici ad attivita' proteasica per la lisi selettiva della componente proteica di placche e aggregati correlati
EP1017375A2 (en) 1997-09-24 2000-07-12 Nova Molecular, Inc. Methods for increasing apoe levels for the treatment of neurodegenerative disease
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6743427B1 (en) 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7179892B2 (en) 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6913745B1 (en) 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6418338B1 (en) 1998-02-06 2002-07-09 Phylatron Ltd. Method for detecting and surgically removing lymphoid tissue involved in tumor progression
MXPA00007815A (es) 1998-02-11 2002-04-24 Neurochem Inc Metodo para modular la activacion de macrofagos.
JP2002512776A (ja) 1998-04-28 2002-05-08 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 免疫原性の低下したモノクローナル抗体
AU3726299A (en) 1998-05-15 1999-12-06 Neurochem, Inc. Use of amyloid inhibitors for modulating neuronal cell death
US20030147882A1 (en) 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US7083950B2 (en) 1998-09-25 2006-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity fusion proteins and therapeutic and diagnostic methods for use
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1141024B1 (en) 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
AR022952A1 (es) 1999-03-19 2002-09-04 Smithkline Beecham Corp ANTICUERPO MONOCLONAL DE ROEDOR ESPECIFICAMENTE NEUTRALIZANTE PARA LA INTERLEUQUINA-18 HUMANA , UN FRAGMENTO FAB NEUTRALIZANTE o FRAGMENTO F(AB')2, UNA REGION DE COMPLEMENTARIEDAD DE CADENA LIGERA DE INMONOGLOBULINA(CDR), UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO, COMPOSICION FARMACEUTICA QUE LO COMPRENDE, EL
US6998124B1 (en) 1999-04-14 2006-02-14 Smithkline Beecham Corporation Erythropoietin receptor antibodies
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
DK1409654T3 (da) 1999-06-16 2008-12-08 Boston Biomedical Res Inst Immunologisk styring af beta-amyloid-niveauer in vivo
WO2001016364A2 (en) 1999-09-01 2001-03-08 Evotec Neurosciences Gmbh Methods of diagnosing or prognosticating age-related macular degeneration
ES2344189T3 (es) 1999-09-03 2010-08-20 RAMOT UNIVERSITY AUTHORITY FOR APPLIED RESEARCH &amp; INDUSTRIAL DEVELOPMENT LTD. Agentes, composiciones y metodos que los utilizan utiles en el tratamiento o la prevencion de la enfermedad de alzheimer.
US20040013647A1 (en) 1999-09-03 2004-01-22 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Methods and compositions for treating a plaque-forming disease
US6294171B2 (en) 1999-09-14 2001-09-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Methods for treating disease states comprising administration of low levels of antibodies
US20020094335A1 (en) 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
KR20020073341A (ko) 1999-11-29 2002-09-23 뉴로켐, 인크. 알츠하이머 및 아밀로이드 관련 질병의 예방 및 치료용 백신
WO2001085093A2 (en) 1999-12-23 2001-11-15 Neurochem, Inc. Compounds and methods for modulating cerebral amyloid angiopathy
US20020182660A1 (en) 2000-02-18 2002-12-05 Fong Kei-Lai L. N- and C-terminus specific immunoassays for full length beta-amyloid peptide-Abeta(1-40), Abeta(1-39), Abeta(1-40), Abeta(1-42) , and Abeta(1-43)
WO2001062801A2 (en) 2000-02-24 2001-08-30 Washington University Humanized antibodies that sequester amyloid beta peptide
EP1130032A1 (en) 2000-02-28 2001-09-05 Gesellschaft für biotechnologische Forschung mbH (GBF) Single-chain antibodies recognizing the human vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2/KDR)
WO2001075165A2 (en) 2000-03-30 2001-10-11 Elan Pharmaceuticals, Inc. Screening markers and methods for neurodegenerative disorders
WO2001075110A2 (en) 2000-03-30 2001-10-11 Dyax Corp. Mucin-1 specific binding members and methods of use thereof
US7371365B2 (en) 2000-04-04 2008-05-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for detecting parenchymal plaques in vivo
US20020009445A1 (en) 2000-07-12 2002-01-24 Yansheng Du Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease
US6514221B2 (en) 2000-07-27 2003-02-04 Brigham And Women's Hospital, Inc. Blood-brain barrier opening
MXPA03001915A (es) 2000-08-03 2004-09-10 Therapeutic Human Polyclonals Produccion de anticuerpos humanizados en animales transgenicos.
US6750210B2 (en) 2000-08-05 2004-06-15 Smithkline Beecham Corporation Formulation containing novel anti-inflammatory androstane derivative
WO2002017930A2 (en) 2000-08-30 2002-03-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Glucocorticoid blocking agents for increasing blood-brain barrier permeability
ATE441663T1 (de) 2000-09-06 2009-09-15 Aventis Pharma Sa Verfahren und zusammensetzungen für amyloidosis- verbundene krankheiten
US7034036B2 (en) 2000-10-30 2006-04-25 Pain Therapeutics, Inc. Inhibitors of ABC drug transporters at the blood-brain barrier
US20030083299A1 (en) 2000-11-04 2003-05-01 Ferguson Ian A. Non-invasive delivery of polypeptides through the blood-brain barrier
TWI255272B (en) 2000-12-06 2006-05-21 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20040191264A1 (en) 2001-02-19 2004-09-30 Nielsen Klaus Gregorius Synthetic vaccine agents
US6815175B2 (en) 2001-03-16 2004-11-09 Cornell Research Foundation, Inc. Anti-amyloid peptide antibody based diagnosis and treatment of a neurological disease or disorder
AU2002258808A1 (en) 2001-04-30 2002-11-11 Eli Lilly And Company Humanized antibodies
WO2002088307A2 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Eli Lilly And Company Humanized antibodies
DE10121982B4 (de) 2001-05-05 2008-01-24 Lts Lohmann Therapie-Systeme Ag Nanopartikel aus Protein mit gekoppeltem Apolipoprotein E zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke und Verfahren zu ihrer Herstellung
ATE277952T1 (de) 2001-06-12 2004-10-15 Wiltfang Jens Monoklonaler antikörper, mbab 1e8, welcher für die zwei ersten n-terminalen aminosäuren von amyloid-beta-peptiden spezifisch ist und dessen verwendung zum nachweis von amyloid-beta peptiden und/oder sappa
US6638722B2 (en) 2001-06-13 2003-10-28 Invitrogen Corporation Method for rapid amplification of DNA
US20020197258A1 (en) 2001-06-22 2002-12-26 Ghanbari Hossein A. Compositions and methods for preventing protein aggregation in neurodegenerative diseases
CN1396183A (zh) 2001-07-13 2003-02-12 张小如 降低脑内与老年痴呆有关的淀粉样变纤维的融合人抗体
AU2002322720B2 (en) 2001-07-25 2008-11-13 Raptor Pharmaceutical Inc. Compositions and methods for modulating blood-brain barrier transport
EP1420032B2 (en) 2001-08-03 2015-12-16 Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. Antibody recognizing gm1 ganglioside-bound amyloid beta-protein and dna encoding the antibody
AU2002329775C1 (en) 2001-08-17 2011-04-07 Eli Lilly And Company Assay method for alzheimer's disease
WO2003015691A2 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company RAPID IMPROVEMENT OF COGNITION IN CONDITIONS RELATED TO A$g(b)
US20040192898A1 (en) 2001-08-17 2004-09-30 Jia Audrey Yunhua Anti-abeta antibodies
US20040241164A1 (en) 2001-08-17 2004-12-02 Bales Kelly Renee Use of antibodies having high affinity for soluble ab to treat conditions and diseases related to ass
US20030082191A1 (en) 2001-08-29 2003-05-01 Poduslo Joseph F. Treatment for central nervous system disorders
GB0124317D0 (en) 2001-10-10 2001-11-28 Celltech R&D Ltd Biological products
EP1448601A4 (en) 2001-11-02 2006-04-26 Diagenics Internat Corp METHOD AND COMPOSITIONS OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO BETA-AMYLOIDE PROTEINS
US7390885B2 (en) 2001-11-26 2008-06-24 Cell Matrix, Inc. Humanized collagen antibodies and related methods
EP1975179A1 (en) 2001-12-26 2008-10-01 Araclon Biotech, S.L. Polyclonal antibodies, preparation method thereof and use of same
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
US20030162695A1 (en) 2002-02-27 2003-08-28 Schatzberg Alan F. Glucocorticoid blocking agents for increasing blood-brain barrier permeability
WO2003076006A2 (en) 2002-03-07 2003-09-18 Advisys, Inc. Electrode assembly for constant-current electroporation and use
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20030190689A1 (en) 2002-04-05 2003-10-09 Cell Signaling Technology,Inc. Molecular profiling of disease and therapeutic response using phospho-specific antibodies
WO2003086310A2 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Prevention of brain inflammation as a result of induced autoimmune response
EP1497321B1 (en) 2002-04-19 2011-06-29 The Governing Council Of The University Of Toronto Immunological methods and compositions for the treatment of alzheimer's disease
DE60325717D1 (de) 2002-04-25 2009-02-26 Lilly Co Eli Verfahren zur behandlung von angststörungen bei älteren personen
EP1911765A3 (en) 2002-07-24 2008-04-23 Innogenetics N.V. Prevention, treatment and diagnosis of diseases associated with Beta-Amyloid formation and/or aggregation
US8871447B2 (en) 2002-09-12 2014-10-28 The Regents Of The University Of California Immunogens and corresponding antibodies specific for high molecular weight aggregation intermediates common to amyloids formed from proteins of differing sequence
WO2004029629A1 (en) 2002-09-27 2004-04-08 Janssen Pharmaceutica N.V. N-11 truncated amyloid-beta nomoclonal antibodies, compositions, methods and uses
US7541440B2 (en) 2002-09-30 2009-06-02 Immunomedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-granulocyte antibodies and methods of use
JP2006508072A (ja) 2002-10-01 2006-03-09 ノースウエスタン ユニバーシティ アミロイドベータ由来拡散性リガンド（ＡＤＤＬｓ）、ＡＤＤＬ代替物、ＡＤＤＬ結合性分子、およびそれらの使用
US20070213512A1 (en) 2002-10-01 2007-09-13 Krafft Grant A Amyloid beta peptide analogs and assemblies thereof
WO2004032868A2 (en) 2002-10-09 2004-04-22 Rinat Neuroscience Corp. Methods of treating alzheimer's disease using antibodies directed against amyloid beta peptide and compositions thereof
US20050097625A1 (en) 2002-11-27 2005-05-05 Meade Harry M. Modified antibodies stably produced in milk and methods of producing same
DE10256900A1 (de) 2002-11-29 2004-06-24 Nemod Immuntherapie Ag Tumorspezifische Erkennungsmoleküle
KR101186210B1 (ko) 2002-12-03 2012-10-08 블랜체트 록펠러 뉴로사이언시즈 인스티튜트 혈뇌장벽을 통과하는 물질 수송용 인공 저밀도 지단백질 운반체
WO2004056318A2 (en) 2002-12-19 2004-07-08 New York University Method for treating amyloid disease
EP1439192A1 (en) 2003-01-15 2004-07-21 Xerion Pharmaceuticals AG Neuropilin-1 inhibitors
BR0317747A (pt) 2002-12-24 2005-11-22 Neurochem Int Ltd Método de tratamento terapêutico concomitante de um indivìduo, composição farmacêutica, kit, uso de um primeiro agente e um segundo agente, e, métodos de prevenir ou tratar uma doença relacionada com amilóide-b, doença de alzheimer e insuficiência cognitiva suave
US20050031651A1 (en) 2002-12-24 2005-02-10 Francine Gervais Therapeutic formulations for the treatment of beta-amyloid related diseases
EP1587540B1 (en) 2003-01-09 2021-09-15 MacroGenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
AT413945B (de) 2003-01-14 2006-07-15 Mattner Frank Dr Impfstoff für die alzheimer-krankheit
WO2004065569A2 (en) 2003-01-23 2004-08-05 The Regents Of The University Of California Multi-functional antibodies
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
ZA200505782B (en) 2003-02-01 2006-09-27 Neuralab Ltd Active immunization to generate antibodies to soluble A-beta
WO2004071408A2 (en) 2003-02-10 2004-08-26 Applied Molecular Evolution, Inc. Aβ BINDING MOLECULES
US20040242845A1 (en) 2003-02-21 2004-12-02 Nicolau Yves Claude Methods and compositions comprising supramolecular antigenic constructs and antibodies elicited against them
US8663650B2 (en) 2003-02-21 2014-03-04 Ac Immune Sa Methods and compositions comprising supramolecular constructs
AU2004274390A1 (en) 2003-03-28 2005-03-31 Jacqueline M. Benson Anti-amyloid antibodies, compositions, methods and uses
EP1469312A1 (en) 2003-04-18 2004-10-20 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Diagnosis of Alzheimer's disease
US20040223912A1 (en) 2003-05-07 2004-11-11 Montalto Michael Christopher Compositions and methods for non-invasive imaging of soluble beta-amyloid
ES2246177B1 (es) 2003-05-08 2007-03-01 Universidad De Zaragoza. Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas.
US20090005257A1 (en) 2003-05-14 2009-01-01 Jespers Laurent S Process for Recovering Polypeptides that Unfold Reversibly from a Polypeptide Repertoire
EP1480041A1 (en) 2003-05-22 2004-11-24 Innogenetics N.V. Method for the prediction, diagnosis and differential diagnosis of Alzheimer's disease
TWI306458B (en) 2003-05-30 2009-02-21 Elan Pharma Int Ltd Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
AU2004294893A1 (en) 2003-06-06 2005-06-16 Oncomax Acquisition Corp. Antibodies specific for cancer associated antigen SM5-1 and uses thereof
US20050124016A1 (en) 2003-08-01 2005-06-09 Enh Research Institute Antibodies specific for toxic amyloid beta protein oligomers
WO2005018424A2 (en) 2003-08-18 2005-03-03 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Antibodies specific for fibrillar amyloid and a procedure to detect fibrillar amyloid deposits
US20070031416A1 (en) 2003-09-09 2007-02-08 Takeda Pharmaceutical Company Limited Use of antibody
JP2007505142A (ja) 2003-09-10 2007-03-08 セダーズ−シナイ メディカル センター 血液脳関門を通過する薬剤のカリウムチャネル媒介性送達
US20070110750A1 (en) 2003-09-12 2007-05-17 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibodies specific for high molecular weight aggregation intermediates common to amyloids formed from proteins of differing sequence
US20070015218A1 (en) 2003-10-14 2007-01-18 University Of South Florida A Method for the Separation Anti-Amyloid Beta Antibody with Amyloid Beta Peptide
JP4870348B2 (ja) 2003-12-04 2012-02-08 株式会社ペルセウスプロテオミクス 細胞表面抗原に対する抗体取得とその抗原同定
JP4696079B2 (ja) 2003-12-17 2011-06-08 ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー Ａβ免疫原性ペプチド担体結合物およびそれの製造方法
JP4824547B2 (ja) 2004-02-20 2011-11-30 インテレクト ニュウロサイエンシス，インク． モノクローナル抗体およびその利用
AU2005217596B2 (en) 2004-02-23 2012-01-19 Eli Lilly And Company Anti-ABeta antibody
US20040260068A1 (en) 2004-02-26 2004-12-23 Naoya Tsurushita Humanized chicken antibodies
CA2564432A1 (en) 2004-04-27 2005-11-10 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Human anti-amyloid .beta. peptide antibody and fragment of said antibody
DE602005022871D1 (de) 2004-06-07 2010-09-23 Univ Ramot Verfahren zur passiven immunisierung gegen eine durch amyloidaggregation gekennzeichnete krankheit oder erkrankung mit vermindertem nervenentzündungsrisiko
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
EP1769002A1 (en) 2004-07-02 2007-04-04 Northwestern University Monolocal antibodies that target pathological assemblies of amyloid beta; (abeta)
WO2006006172A2 (en) 2004-07-15 2006-01-19 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Use of anti-amyloid agents for treating and typing pathogen infections
EP1781704A2 (en) 2004-07-30 2007-05-09 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
JP4820757B2 (ja) 2004-08-11 2011-11-24 国立大学法人京都大学 抗体及びその利用
US7335491B2 (en) 2004-08-27 2008-02-26 Wyeth Research Ireland Limited Production of anti-abeta
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
US20060246075A1 (en) 2004-09-29 2006-11-02 Marc Mercken Anti-amyloid antibodies, compositions, methods and uses
WO2006039327A2 (en) 2004-10-01 2006-04-13 Merck & Co., Inc. Methods of treatment or prophylaxis of amyloidogenic diseases of the eye or optic nerve
DE602005026219D1 (de) 2004-10-01 2011-03-17 Max Planck Gesellschaft Gegen das säugetier-eag1-ionenkanalprotein gerichtete antikörper
BRPI0518151A2 (pt) 2004-10-13 2009-06-16 Ablynx Nv polipetìdeos contra amiloide-beta, ácido nucléico que codifica tal polipetìdeo, composição compreendendo tal polipetìdeo, método para produzir um polipetìdeo e uso do mesmo
WO2006055178A2 (en) 2004-10-25 2006-05-26 Merck & Co., Inc. Anti-addl antibodies and uses thereof
WO2006047670A2 (en) 2004-10-26 2006-05-04 Wyeth Methods for assessing antibodies to neurodegenerative disease-associated antigens
EP1813947A4 (en) 2004-10-28 2008-06-11 Sanko Junyaku Kk METHOD FOR THE STUDY OF MORBUS ALZHEIMER AND DIAGNOSTIC REAGENT
PE20061152A1 (es) 2004-12-15 2006-10-13 Neuralab Ltd Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo
EP1838348B1 (en) 2004-12-15 2013-06-26 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition
US20060257396A1 (en) 2004-12-15 2006-11-16 Jacobsen Jack S Abeta antibodies for use in improving cognition
US20090074775A1 (en) 2004-12-22 2009-03-19 David Michael Holtzman Use Of Anti-AB Antibody To Treat Traumatic Brain Injury
JP2008527005A (ja) 2005-01-14 2008-07-24 ザ、リージェンツ、オブ、ザ、ユニバーシティ、オブ、カリフォルニア ドルーゼン形成を阻害するため、およびドルーゼン関連障害を診断または治療するための組成物および方法
EP1841455A1 (en) 2005-01-24 2007-10-10 Amgen Inc. Humanized anti-amyloid antibody
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
WO2006094724A2 (en) 2005-03-05 2006-09-14 Abbott Gmbh & Co. Kg Screening method, process for purifying of non-diffusible a-beta oligomers, selective antibodies against said non-diffusible a-beta oligomers and a process for manufacturing of said antibodies
ES2259270B1 (es) 2005-03-09 2007-11-01 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Metodo de diagnostico in vitro de la enfermedad de alzheimer mediante un anticuerpo monoclonal.
ES2318918B1 (es) 2005-04-01 2010-02-16 Biotherapix Molecular Medicines, S.L.U. Anticuerpos humanos con capacidad de union al peptido beta-amiloide y sus aplicaciones.
PE20061323A1 (es) 2005-04-29 2007-02-09 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos dirigidos contra el peptido amiloide beta y metodos que utilizan los mismos
UA96917C2 (ru) * 2005-04-29 2011-12-26 Ринат Нейросаенз Корп. Антитела, направленные против пептида бета-амилоида, и способы их применения
EP1879613B1 (en) 2005-05-05 2011-11-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Peptide conjugate compositions and methods for the prevention and treatment of alzheimer's disease
KR101247836B1 (ko) 2005-06-17 2013-03-28 와이어쓰 엘엘씨 항 ａ 베타 항체의 정제 방법
AU2006270245A1 (en) 2005-07-13 2007-01-25 Coimmune Inc. Catalytic immunoglobulins
EA015629B1 (ru) 2005-08-11 2011-10-31 Арпи Матоссиан-Роджерс Пептиды, используемые для лечения и диагностики аутоиммунных заболеваний
EP1937720B1 (en) 2005-08-18 2014-04-09 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Single chain antibodies against beta-amyloid peptide
JP2007077103A (ja) 2005-09-16 2007-03-29 Yokohama City Univ アルツハイマー病の予防又は治療剤
ES2856451T3 (es) 2005-10-11 2021-09-27 Amgen Res Munich Gmbh Composiciones que comprenden anticuerpos específicos para diferentes especies, y usos de las mismas
JP5289963B2 (ja) 2005-10-21 2013-09-11 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション 抗ａｄｄｌモノクローナル抗体およびその使用
CA2630964A1 (en) 2005-11-22 2007-05-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antibody treatment of alzheimer's and related diseases
PL2289909T3 (pl) 2005-11-30 2015-04-30 Abbvie Inc Sposób przeszukiwania, proces oczyszczania niedyfundujących oligomerów Abeta, selektywne przeciwciała przeciw niedyfundującym oligomerom Abeta i sposób wytwarzania tych przeciwciał
US8497072B2 (en) 2005-11-30 2013-07-30 Abbott Laboratories Amyloid-beta globulomer antibodies
CN101528770A (zh) 2005-11-30 2009-09-09 艾博特公司 制备重组形式的人β-淀粉样蛋白的方法和这些蛋白质的应用
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
PT2361638E (pt) 2005-12-12 2014-04-17 Ac Immune Sa Anticorpos monoclonais específicos beta 1-42 com propriedades terapêuticas
JP5145241B2 (ja) 2005-12-12 2013-02-13 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 可変領域におけるグリコシル化を有するアミロイドβに対する抗体
KR101372690B1 (ko) 2005-12-13 2014-03-17 아스트라제네카 아베 인슐린 유사 성장 인자에 특이적인 결합 단백질 및 이의용도
ES2409844T3 (es) 2006-01-30 2013-06-28 Grifols Therapeutics Inc. Metodo para el tratamiento y la profilaxis de enfermedades relacionadas con la deposicion de amiloide utilizando IgM
NZ567888A (en) 2006-03-23 2010-08-27 Bioarctic Neuroscience Ab Improved protofibril selective antibodies and the use thereof
CN101415729B (zh) 2006-03-30 2013-09-04 葛兰素集团有限公司 针对β-淀粉样蛋白肽的抗体
KR101132293B1 (ko) 2006-04-21 2012-04-05 주식회사 피플바이오 삼차원적 상호작용을 이용하여 멀티머-형성 폴리펩타이드의모노머로부터 멀티머를 분별 검출하는 방법
US7427342B2 (en) 2006-06-02 2008-09-23 General Electric Company Method and apparatus for shifting current distribution in electrodeionization systems
EP2043687A4 (en) 2006-06-29 2010-03-17 Centocor Ortho Biotech Inc ANTI-AMYLOID ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
EP2046833B9 (en) 2006-07-14 2014-02-19 AC Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
WO2008008463A2 (en) 2006-07-14 2008-01-17 Trustees Of Columbia University In The City Of New York METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING AND QUANTIFYING SAPPβ
RS53160B (en) * 2006-07-14 2014-06-30 Ac Immune S.A. HUMANIZED BETA AMILOID ANTIBODY
DE602006005806D1 (de) 2006-07-28 2009-04-30 Vista Ventures Gmbh Verfahren zum Nachweis der amyloid-beta Oligomere in Körperflüssigkeiten
WO2008070229A2 (en) 2006-08-28 2008-06-12 Case Western Reserve University Detection of pathogenic aggregates of protein in a sample by homologous elisa
WO2008030251A1 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Georgetown University Deglycosylated anti-amyloid beta antibodies
DK2074145T5 (en) 2006-10-02 2017-10-16 Ac Immune Sa HUMANIZED ANTIBODY AGAINST AMYLOID BETA
US20100104577A1 (en) 2006-10-10 2010-04-29 Golde Todd E Methods and materials related to anti-a (beta) antibodies
CN101578269A (zh) 2006-11-24 2009-11-11 Ac免疫有限公司 用于治疗与淀粉样物质或淀粉样蛋白有关的疾病像阿尔茨海默病的n-甲基-1h-吡唑-3-胺、n-甲基-吡啶-2-胺和n-甲基-噻唑-2-胺衍生物
JP2008135645A (ja) 2006-11-29 2008-06-12 Toshiba Corp 多層プリント配線板および多層プリント配線板の層間接合方法
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
EP2094730A4 (en) 2006-12-07 2010-08-04 Mayo Foundation METHODS AND MATERIALS ASSOCIATED WITH ANTI-AMYLOID ANTIBODIES
TW200831133A (en) 2006-12-11 2008-08-01 Hoffmann La Roche Mab Abeta lyophylized formulation
WO2008104386A2 (en) 2007-02-27 2008-09-04 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
WO2008104385A1 (en) 2007-02-27 2008-09-04 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
US20090022728A1 (en) 2007-03-09 2009-01-22 Rinat Neuroscience Corporation Methods of treating ophthalmic diseases
JP2007238096A (ja) 2007-05-09 2007-09-20 Bridgestone Corp ランフラットタイヤ
PE20090329A1 (es) 2007-05-30 2009-03-27 Abbott Lab Anticuerpos humanizados contra el globulomero ab(20-42) y sus usos
US20090232801A1 (en) 2007-05-30 2009-09-17 Abbot Laboratories Humanized Antibodies Which Bind To AB (1-42) Globulomer And Uses Thereof
NZ601843A (en) 2007-06-12 2014-01-31 Ac Immune Sa Monoclonal anti beta amyloid antibody
SI2170389T1 (sl) 2007-06-12 2015-03-31 Ac Immune S.A. Humanizirana protitelesa proti amiloidu beta
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
BRPI0818621A8 (pt) 2007-10-05 2018-01-30 Ac Immune Sa composição farmacêutica, e, métodos para reduzir a carga da placa e a quantidade de placas na camada de célula de gânglio retinal de um indivíduo, para prevenir, tratar e/ou aliviar os efeitos de uma doença ocular, para diagnosticar uma doença ocular e uma predisposição a uma doença ocular, para monitorar doença ocular, para predizer responsividade de um paciente, e para reter ou diminuir pressão ocular nos olhos de um indivíduo
ES2609918T3 (es) 2007-10-05 2017-04-25 Genentech, Inc. Uso de anticuerpo anti-amiloide beta en enfermedades oculares
RU2604181C2 (ru) 2007-10-05 2016-12-10 Дженентек, Инк. Применение антитела против амилоида бета при глазных заболеваниях
JO3076B1 (ar) * 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
PE20091449A1 (es) 2007-12-11 2009-10-07 Glaxo Group Ltd Proteinas de union a antigenos
MY164579A (en) 2010-07-30 2018-01-15 Ac Immune Sa Safe and functional humanized antibodies

Also Published As

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JP2017051188A (ja) 2017-03-16

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