TWI453217B

TWI453217B - 抗β類澱粉蛋白單株抗體

Info

Publication number: TWI453217B
Application number: TW097122016A
Authority: TW
Inventors: Andrea Pfeifer; Maria Pihlgren; Andreas Muhs; Ryan Watts
Original assignee: Ac Immune Sa; Genentech Inc
Priority date: 2007-06-12
Filing date: 2008-06-12
Publication date: 2014-09-21
Also published as: JP5436414B2; CN101802007B; IL202563A; BRPI0812484A2; EP2527366A1; RU2010100354A; CL2012001817A1; ES2548102T3; WO2008156621A1; TW201441256A; EP2170953A1; EP2170953B1; KR101600095B1; PE20131141A1; RU2571856C2; HK1140500A1; PE20090831A1; KR20160017126A; MX2009013503A; IL202563A0

Description

抗β類澱粉蛋白單株抗體

本發明係關於在由類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質引起或與其相關之疾病及病症之治療中用於治療及診斷用途的方法及組合物，該等疾病及病症包括澱粉樣變性病，其為一群與類澱粉蛋白質相關之病症及異常，諸如阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)。

澱粉樣變性病並非單一疾病實體，而是一群不同的以蠟狀澱粉樣蛋白(稱為類澱粉蛋白)(其在一或多個器官或身體系統中積聚)之細胞外組織沈積物為特徵的進行性疾病過程。隨著類澱粉蛋白沈積物積累，其開始干擾器官或身體系統之正常功能。存在至少15種不同類型之澱粉樣變性病。主要形式為無已知前因之原發性澱粉樣變性病、一些其它病狀後之繼發性澱粉樣變性病及遺傳性澱粉樣變性病。

繼發性澱粉樣變性病出現在患有慢性感染或發炎性疾病(諸如結核病、稱為家族性地中海熱之細菌感染、骨感染(骨髓炎)、類風濕性關節炎、小腸發炎(肉芽腫性回腸炎)、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)及痲瘋病)之人群中。

占類澱粉蛋白物質約90%之類澱粉蛋白質原纖維包含若干不同類型蛋白質之一。某些該等蛋白質能夠摺疊成所謂的"β摺疊"片原纖維，其為一種對剛果紅(Congo red)展現結合位點從而產生類澱粉蛋白質之獨特染色性質的獨特蛋白質構形。另外，類澱粉蛋白沈積物與類澱粉蛋白P(五邊形)組份(AP)(一種與正常血清類澱粉蛋白P(SAP)相關之醣蛋白)及與硫酸化葡萄糖胺聚糖(GAG)(結締組織之複雜碳水化合物)緊密相關。

許多衰老疾病係基於類澱粉狀蛋白質或與其相關，且其特徵部分為促進疾病之發病機制以及疾病進程的類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白物質細胞外沈積物之積累。此等疾病包括(但不限於)神經學病症，諸如阿茲海默氏病(AD)，包括以認知記憶能力損失為特徵之疾病或病狀，諸如輕度認知障礙(MCI)、路易體性癡呆(Lewy body dementia)、唐氏症候群(Down's syndrome)、遺傳性大腦出血併發澱粉樣變性病(荷蘭型)及關島帕金森－癡呆綜合症(Guam Parkinson－Dementia complex)。基於類澱粉狀蛋白質或與其相關之其他疾病為進行性核上麻痺、多發性硬化症；庫賈氏病(Creutzfeld Jacob disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、HIV相關之癡呆、ALS(肌萎縮性脊髓側索硬化症)、包涵體肌炎(IBM)、成年發病型糖尿病；老年心臟澱粉樣變性病；內分泌腫瘤及其它疾病，包括黃斑退化。

儘管此等疾病之發病機制可能不同，但其特徵沈積物常含有多種共有之分子組份。在很大程度上，其可歸因於前發炎路徑之局部活化，進而與活化補體組份、急性期反應物、免疫調節劑及其他發炎性介體之同時沈積相關(McGeer等人，1994)。

阿茲海默氏病(AD)為一種神經學病症，主要認為其係由類澱粉蛋白斑塊(蛋白質異常沈積物在腦中之積聚)引起。在患病個體之腦中發現的最常見之類澱粉蛋白類型主要由Aβ原纖維構成。科學證據證明，斑塊中β－類澱粉蛋白質產生及積聚之增加導致神經細胞死亡，其促使AD發展及進展。關鍵腦區域中神經細胞之損失又引起神經傳遞素之減少及記憶力受損。原則上造成斑塊積累之蛋白質包括類澱粉蛋白前驅蛋白(APP)及2種早老蛋白(早老蛋白I及早老蛋白II)。藉由酶β及γ分泌酶連續分裂類澱粉蛋白前驅蛋白(APP)(其在大多數細胞中構成性表現及異化)導致釋放39至43個胺基酸之Aβ肽。APP降解可能增加其在斑塊中聚集之傾向。Aβ(1－42)片段由於在其C末端處具有2個疏水性極高之胺基酸殘基尤其具有建立聚集體之高傾向。因此，據信Aβ(1－42)片段主要涉及且造成AD中神經炎斑塊形成之起始且因此具有高病理學潛力。因此，需要可靶向類澱粉蛋白斑塊形成且使其擴散之特異性抗體。

AD症狀表現緩慢，且第一症狀可僅為輕度健忘。在該階段，個體可能忘記近來事件、活動、熟人姓名或事情，且可能無法解答簡單數學問題。隨著疾病進展，症狀更易察覺且變得足夠嚴重以使患有AD之人或其家族成員尋求醫學幫助。AD之中期症狀包括忘記如何做簡單任務(諸如整理)，且在說話、理解、讀取或書寫方面出現問題。後期AD患者可變得焦慮或有攻擊性，可能離家出走且最終需要完全護理。

目前，診斷AD之唯一明確方式為在個體死亡後的屍體解剖中鑑別腦組織中之斑塊及纏結。因此，在人仍然活著時，醫生僅可作出"可能"或"很可能"患有AD之診斷。使用當前方法，醫師能在至多90%之時間使用若干診斷"很可能"AD之工具正確診斷AD。醫師詢問關於患者之一般健康狀態、過去醫學問題及患者進行日常活動之任何困難之歷史的問題。記憶力、問題解決、注意力、計算及語言之行為測試提供有關認知退化之資訊，且醫學測試(諸如血液、尿液或脊髓液之測試)及腦部掃描可提供一些其它資訊。

AD管理係由基於藥物之治療及不基於藥物之治療組成。迄今為止，針對改變疾病之基本過程(延遲或逆轉進程)之治療大部分為不成功的。已展示恢復神經細胞之化學訊息素(神經傳遞素)不足(缺乏)或功能障礙之藥物、尤其膽鹼酯酶抑制劑(ChEI)(諸如他克林(tacrine)及雷斯替明(rivastigmine))可改良症狀。ChEI阻礙神經傳遞素之酶促降解，進而增加腦中可用以傳遞神經信號之化學訊息素之量。

對處於疾病早期及中期之一些人而言，藥物他克林(COGNEX,Morris Plains,NJ)、多奈哌齊(donepezil)(ARICEPT,Tokyo,JP)、雷斯替明(EXELON,East Hanover,NJ)或加蘭他敏(galantamine)(REMINYL,New Brunswick,NJ)可幫助預防在限定時間內一些症狀變得惡化。另一種藥物美金剛胺(memantine)(NAMENDA,New York,NY)已獲批准用於治療中度至重度AD。藥物治療亦可用以解決AD之精神病學表現。又，一些藥物可幫助控制AD之行為症狀，諸如失眠、躁動、精神恍惚、焦慮及抑鬱。治療此等症狀常使患者更為舒適且使其更易於由護理者來護理。不幸的是，儘管存在展示此類藥劑可靠地優於安慰劑之顯著治療優勢，但疾病持續進展，且對精神功能之平均影響僅為適中的。用於AD藥物治療中之許多藥物(諸如ChEI)亦具有副作用，其包括胃腸功能失調、肝毒性及體重減輕。

基於類澱粉狀蛋白質之積聚及沈積或與其相關之其他疾病為輕度認知障礙、路易體性癡呆(LBD)、肌萎縮性側索硬化(ALS)、包涵體肌炎(IBM)及黃斑退化(尤其與年齡相關之黃斑退化(AMD))。

輕度認知障礙(MCI)為最常定義為輕微但可量測之記憶病症的通用術語。患有MCI之人經歷與伴隨年老通常所預期相比更大之記憶問題，但不展示其它癡呆症狀，諸如削弱的判斷或推理。MCI為常常反映AD臨床前階段之病狀。

據信內嗅皮質(EC)內之β－類澱粉蛋白沈積在老年人之輕度認知障礙(MCI)之發展中起關鍵作用。其與AD在臨床上變得明顯後觀察到CSF－A Aβ(1－42)含量顯著下降相一致。與CSF－Aβ(1－42)相反，CSF－τ含量在MCI階段顯著增加，且此等值之後繼續升高，表明CSF－τ含量增加可幫助偵測預測發展成AD之MCI個體。

路易體性癡呆(LBD)為一種可出現在年齡65歲以上人群中的神經退化性病症，其通常引起認知(思考)障礙及異常行為改變之症狀。症狀可包括認知障礙、神經徵象、睡眠障礙及自主神經衰竭。認知障礙為LBD在大部分病例中呈現之特徵。患者具有精神錯亂之週期性發作，其逐步惡化。認知能力之波動常與注意力及警惕性之轉移程度相關。認知障礙及思考波動可在幾分鐘、幾小時或幾天內變化。

路易體係自磷酸化及非磷酸化神經絲蛋白質形成；其含有突觸蛋白質α－突觸核蛋白(synuclein)以及泛素，泛素涉及受損蛋白質或異常蛋白質之消除。除路易體外，亦可存在路易神經突，其為神經細胞之細胞過程中的包涵體。類澱粉蛋白斑塊可形成於罹患LBD之患者的腦中，但其在數量上趨向於比在患有阿茲海默氏病之患者中所見更少。神經原纖維纏結(AD之另一顯微病理學標誌)並不是LBD之主要特徵，但除類澱粉蛋白斑塊外其常常存在。

肌萎縮性側索硬化(ALS)以上運動神經元及下運動神經元之退化為特徵。在一些ALS患者中，可能存在癡呆或失語症(ALS－D)。癡呆最常為額顳葉型癡呆(FTD)，且許多該等病例在齒狀回以及額葉及顳葉之表面層的神經元中具有泛素陽性、τ陰性包涵物。

包涵體肌炎(IBM)為一種常見於年齡50歲以上人群中的致殘疾病，其中肌肉纖維發生炎症且開始萎縮，但其中腦未受損且患者保持完全智力。在患有老年人中該最常見進行性肌肉疾病的患者之肌肉細胞內部，發現2種涉及類澱粉蛋白－β蛋白質產生之酶增加，其中類澱粉蛋白－β亦增加。

基於類澱粉狀蛋白質之積聚及沈積或與其相關之另一疾病為黃斑退化。

黃斑退化為一種引起視網膜(眼睛後部之薄紙樣組織，其中感光細胞將視覺信號傳送至腦)中心區黃斑退化的常見眼病。經黃斑處理產生清楚、明晰、"直線向前"之視覺。對黃斑之破壞導致出現盲點及視力模糊或扭曲。與年齡相關之黃斑退化(AMD)為美國及年齡65歲以上人群之視覺障礙的主要原因，其為高加索人中法定失明之主要原因。大約180萬40歲及年齡更大之美國人患有晚期AMD，且另外730萬患有中度AMD的人處於視力損失之實質風險中。政府估計到2020年將有290萬人患有晚期AMD。AMD之受害者常驚奇且沮喪地發現對於該失明病狀之起因及治療的瞭解非常少。

存在兩種形式之黃斑退化：乾性黃斑退化及濕性黃斑退化。85%之黃斑退化病例診斷為乾性形式，其中黃斑細胞緩慢開始破壞。雖然一隻眼睛可能失去視力而另一隻眼睛保持不受影響，但通常雙眼均受到乾性AMD影響。玻璃膜疣(drusen)為視網膜下之黃色沈積物，其為乾性AMD之常見早期徵象。隨著玻璃膜疣之數量或尺寸增加，發展成晚期乾性AMD或濕性AMD之風險增加。乾性AMD可能在不轉變成該疾病之濕性形式的情況下發展且引起視力損失；然而，早期乾性AMD亦可能突然變成濕性形式。

雖然濕性形式僅占病例之15%，但其導致90%之失明且視為晚期AMD(無早期或中期濕性AMD)。濕性AMD之前總是出現該疾病之乾性形式。隨著乾性形式惡化，一些人開始具有在黃斑之後生長之異常血管。該等血管極脆且將漏出流體及血液(因此為"濕性"黃斑退化)，從而對黃斑造成快速破壞。

乾性形式之AMD最初常引起輕度視力模糊。隨後視力中心可尤其變得模糊且隨著疾病進展該區域長大。若僅一隻眼睛受影響，則可能無法察覺症狀。在濕性AMD中，直線可呈現波狀且可快速出現中心視力損失。

黃斑退化之診斷通常涉及散瞳眼睛檢查、視覺敏銳度測試及使用用以幫助診斷AMD的稱為眼底鏡檢查之程序觀察眼睛後部，且若懷疑為濕性AMD，則亦可進行螢光素血管攝影術。若干性AMD到達晚期，則目前尚無預防視力損失之治療。然而，抗氧化劑及鋅之特定高劑量配方可延遲或預防中期AMD發展至晚期。Macugen(哌加他尼鈉(pegaptanib sodium)注射劑)、雷射光凝法及光動力學療法可控制黃斑中之異常血管生長及出血，其有助於患有濕性AMD之一些人；然而，無法藉由該等技術恢復已損失之視力。若視力已損失，則可用已存在之可幫助改良生活品質之低視力輔助物。

與年齡相關之黃斑退化(AMD)之最早徵象之一為玻璃膜疣在視網膜色素上皮(RPE)之基底層與布魯赫膜(Bruch's membrane，BM)之間的積聚。藉由Anderson等人進行之近期研究已確認，玻璃膜疣含有類澱粉蛋白β。(Experimental Eye Research 78(2004)243－256)。

正在進行中之研究繼續探索可促進AMD之環境、遺傳及飲食因素的研究。亦正在探索新的治療策略，包括視網膜細胞移植物、預防或減慢疾病進程之藥物、放射療法、基因療法、植入視網膜中可幫助刺激視力之電腦晶片及預防黃斑下新血管生長之藥劑。

開發新藥時所考慮的重要因素為供標靶患者使用之簡易性。口服藥物傳遞(特別為錠劑、膠囊及軟凝膠)因為患者便利性而占所有消耗劑型之70%。藥物研發者認同患者青睞口服傳遞勝於自身接受注射或其他更具侵襲性之藥物投藥形式。產生低給藥時間間隔(亦即每天一次或持續釋放)之調配物亦較佳。投與呈口服劑型之抗生素的簡易性在治療期間產生患者順應性之增加。

需要有效之方法及組合物用以產生高特異性及高效抗體，若欲以口服劑型提供抗體則抗體產生為先決條件。該等抗體將較佳識別各種抗原(諸如類澱粉蛋白質)上之特定抗原決定基。

因此，亦需要有效之組合物及方法用以解決與由類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質引起或與其相關之疾病及病症相關的併發症，該等疾病及病症包括澱粉樣變性病，其為一群與類澱粉蛋白斑塊形成相關之疾病及病症，包括繼發性澱粉樣變性病及與年齡相關之澱粉樣變性病，包括(但不限於)神經學病症，諸如阿茲海默氏病(AD)，包括以認知記憶能力損失為特徵之疾病或病狀，諸如輕度認知障礙(MCI)、路易體性癡呆、唐氏症候群、遺傳性大腦出血併發澱粉樣變性病(荷蘭型)；關島帕金森－癡呆綜合症；以及基於類澱粉狀蛋白質或與其相關之其他疾病，諸如進行性核上麻痺、多發性硬化症；庫賈氏病、帕金森氏病、HIV相關之癡呆、ALS(肌萎縮性側索硬化)、包涵體肌炎(IBM)、成年發病型糖尿病；老年心臟澱粉樣變性病；內分泌腫瘤及其它疾病，包括黃斑退化。詳言之，需要能夠抵消疾病之生理表現(諸如與類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白肽之纖維聚集相關之斑塊形成)的專門及高度有效抗體。

已證明對於人類阿茲海默氏病而言，藉由接種與弗氏(Freund)完全或不完全佐劑混合之Aβ_1－42 所引出的抗類澱粉蛋白抗體能夠減少轉殖基因小鼠中之類澱粉蛋白負荷(Schenk等人，1999)。

對NORBA轉殖基因小鼠腹膜內接種於脂質體中重構之四棕櫚醯基化Aβ_1－16 引出顯著效價之抗類澱粉蛋白抗體，亦已證明其能夠活體外及活體內溶解類澱粉蛋白纖維及斑塊(Nicolau等人，2002)。

發生類澱粉蛋白斑塊及纖維溶解之可能機制首先由Bard等人(2000)提出，其基於資料得出結論，即抗體調理斑塊使其隨後由微神經膠質細胞之巨噬細胞破壞。De Mattos等人(2001)指出，針對β－類澱粉蛋白中心區域之MAb能夠結合且完全螫合血漿類澱粉蛋白。其主張循環中該等mAb之存在移動Aβ在腦與血漿之間的平衡，從而有助於周邊清除及異化作用以替代在腦中之沈積。

本發明提供包含具有特異性地識別及結合特定β－類澱粉蛋白質之能力之高特異性及高度有效抗體的新穎方法及組合物。由本發明之教示實現之抗體尤其適用於治療由類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質引起或與其相關之疾病及病症，該等疾病及病症包括澱粉樣變性病，其為一群與類澱粉蛋白斑塊形成相關之疾病及病症，包括繼發性澱粉樣變性病及與年齡相關之澱粉樣變性病，包括(但不限於)神經學病症，諸如阿茲海默氏病(AD)，包括以認知記憶能力損失為特徵之疾病或病狀，諸如輕度認知障礙(MCI)、路易體性癡呆、唐氏症候群、遺傳性大腦出血併發澱粉樣變性病(荷蘭型)；關島帕金森－癡呆綜合症；以及基於類澱粉狀蛋白質或與其相關之其他疾病，諸如進行性核上麻痺、多發性硬化症、庫賈氏病、遺傳性大腦出血併發澱粉樣變性病(荷蘭型)、帕金森氏病、HIV相關之癡呆、ALS(肌萎縮性側索硬化)、包涵體肌炎(IBM)、成年發病型糖尿病；老年心臟澱粉樣變性病；內分泌腫瘤及其它疾病，包括黃斑退化，僅舉數例。

此外，本發明提供保持或增加展現與類澱粉蛋白相關之疾病或病狀之哺乳動物的認知記憶能力的新穎方法及組合物，其包含向需要該治療之動物、尤其哺乳動物、更尤其人類投與治療有效量之本發明之單株抗體。

本發明利用導致較佳抗原構形之增強暴露及穩定化作用以最終產生具有獨特性質之抗體的抗原呈現作用。

在本發明之一實施例中，提供包括任何功能相等抗體或其功能部分之抗體，或更尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，其係已針對超分子抗原構築體產生，該構築體包含對應於β－類澱粉蛋白肽(尤其為β－類澱粉蛋白肽之所選片段)之胺基酸序列之抗原肽，該抗體經諸如聚乙二醇(PEG)之親水性部分修飾或在替代情形中經諸如棕櫚酸之疏水性部分修飾，其中該親水性或疏水性部分經由至少一個、尤其一或兩個諸如離胺酸、麩胺酸及半胱胺酸之胺基酸或能夠用作用於將親水性或疏水性部分與肽片段偶合之連接裝置之任何其他適合胺基酸或胺基酸類似物共價地結合至抗原肽之各末端。

當使用諸如PEG之親水性部分時，β－類澱粉蛋白肽之所選片段可為分別對應於胺基酸序列Aβ_22－35 及Aβ_29－40 之片段，且游離PEG末端可共價地結合磷脂醯乙醇胺或適於起錨定元件作用(例如)以將抗原構築體嵌埋於脂質體之雙層中的任何其他化合物。

當使用諸如棕櫚酸之疏水性部分時，β－類澱粉蛋白肽之所選片段可為對應於胺基酸序列Aβ_1－15 之片段，且該疏水性部分可直接用作錨定元件(例如)以將抗原構築體嵌埋於脂質體之雙層中。

在本發明之一實施例中，提供抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體識別且結合構形抗原決定基且分別結合聚合可溶性類澱粉蛋白及類澱粉蛋白原纖維或纖維，尤其分別結合聚合可溶性類澱粉蛋白Aβ肽及類澱粉蛋白Aβ原纖維或纖維。

在本發明之一實施例中，提供抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體識別且結合構形抗原決定基，該構形抗原決定基分別優先呈現於聚合可溶性類澱粉蛋白及寡聚類澱粉蛋白肽上，尤其分別呈現於包含多個單體Aβ 1－42肽之聚合可溶性類澱粉蛋白Aβ肽及寡聚類澱粉蛋白Aβ肽上。

在本發明之一實施例中，提供抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體識別且結合構形抗原決定基，該構形抗原決定基分別優先呈現於聚合可溶性類澱粉蛋白及寡聚類澱粉蛋白肽上，而且呈現於類澱粉蛋白原纖維或纖維上，尤其分別呈現於包含多個單體Aβ 1－42肽之聚合可溶性類澱粉蛋白Aβ肽及寡聚類澱粉蛋白Aβ肽上，及併有多個該等寡聚肽之類澱粉蛋白原纖維或纖維上。

載脂蛋白E(apoE4)之ε4等位基因之遺傳性為AD之強遺傳風險因子。該蛋白質能夠結合類澱粉蛋白且已知其涉及血液－腦障壁中之Aβ清除以及Aβ沈積之促進。相反，類澱粉蛋白之結合定位於ApoE之疏水性脂蛋白結合區中且該聯繫顯著降低ApoE之總脂質結合能力。

因此，本發明之另一實施例提供抗體，尤其為如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體能夠在動物(尤其哺乳動物，更尤其為人類)之腦中、尤其在罹患腦中Aβ之濃度增加相關之疾病或病狀的動物(尤其哺乳動物，更尤其為人類)之腦中抑制或者減輕類澱粉蛋白與ApoE4之相互作用。根據本發明之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體因此分別優先地結合聚合可溶性類澱粉蛋白及寡聚類澱粉蛋白肽，尤其分別結合包含多個Aβ 1－42單體肽之可溶性聚合Aβ肽及寡聚Aβ肽。在一實施例中，本發明係關於如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合具有至少30個、尤其至少35個、更尤其至少38個、甚至更尤其至少40個胺基酸殘基之Aβ單體肽，但基本上不展示與具有小於30個殘基之Aβ單體肽、尤其具有小於20個殘基之肽、更尤其具有小於10個殘基之肽、更尤其具有8個及8個以下殘基之肽之結合。

在一特定實施例中，本發明係關於如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合具有至少30個、尤其至少35個、更尤其至少38個、甚至更尤其至少40個胺基酸殘基之Aβ單體肽，尤其結合Aβ單體肽1－40且結合包含多個Aβ1－42單體肽之可溶性聚合及/或寡聚類澱粉蛋白肽，但基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合。

在本發明之另一特定實施例中，提供如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合Aβ單體肽1－40，尤其結合Aβ單體肽1－40及包含多個Aβ1－42單體肽之可溶性聚合及/或寡聚類澱粉蛋白肽，但基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合。

在本發明之另一特定實施例中，提供如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合Aβ單體肽1－40，尤其結合Aβ單體肽1－40及包含多個Aβ1－42單體肽之可溶性聚合及/或寡聚類澱粉蛋白肽，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合。

在本發明之另一特定實施例中，提供如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合Aβ單體肽1－40，尤其結合Aβ單體肽1－40及包含多個Aβ1－42單體肽之可溶性聚合及/或寡聚類澱粉蛋白肽，但展示與Aβ單體肽1－42之中等結合。

在本發明之另一特定實施例中，提供如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合Aβ單體肽1－40，尤其結合Aβ單體肽1－40及包含多個Aβ1－42單體肽之可溶性聚合及/或寡聚類澱粉蛋白肽，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及與單體肽1－42之中等結合。

在本發明之另一特定實施例中，提供如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合Aβ單體肽1－40，尤其結合Aβ單體肽1－40及包含多個Aβ1－42單體肽之可溶性聚合及/或寡聚類澱粉蛋白肽，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合且基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合。

在本發明之另一特定實施例中，提供如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合Aβ單體肽1－40，尤其結合Aβ單體肽1－40及包含多個Aβ1－42單體肽之可溶性聚合及/或寡聚類澱粉蛋白肽，但展示與Aβ單體肽1－42之中等結合且基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合。

在本發明之另一特定實施例中，提供如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合Aβ單體肽1－40，尤其結合Aβ單體肽1－40及包含多個Aβ1－42單體肽之可溶性聚合及/或寡聚類澱粉蛋白肽，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及與單體肽1－42之中等結合且不展示與Aβ單體肽17－40之結合。

在一實施例中，根據本發明且如本文中所述之抗體在與呈單體及/或寡聚形式之具有至少30個、尤其至少35個、更尤其至少38個、甚至更尤其至少40個胺基酸殘基之呈單體及/或寡聚形式的Aβ單體肽、尤其與Aβ_1－42 單體肽及/或包含多個該等Aβ1－42單體肽之寡聚肽，尤其以至多1：1000之抗體與Aβ1－42之莫耳濃度比、尤其以在1：10與1：100之間的莫耳濃度比共同培育後，抑制Aβ單體及/或寡聚物聚集成高分子聚合原纖維。

詳言之，根據本發明之抗體與類澱粉蛋白單體及/或寡聚肽之共同培育係在28℃與40℃之間、尤其32℃與38℃之間、更尤其37℃之溫度下進行24小時至60小時、尤其30小時至50小時、更尤其48小時。

在本發明之一特定實施例中，與類澱粉蛋白單體及/或寡聚肽之共同培育係在37℃之溫度下歷時48小時來完成。

詳言之，抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之根據本發明之單株抗體優先地結合Aβ_1－40 單體肽，且在與Aβ_1－40 單體及/或寡聚肽共同培育後，抑制Aβ單體聚集成高分子聚合原纖維。

在一實施例中，提供抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之根據本發明之單株抗體，該抗體優先地結合Aβ_1－40 單體肽，尤其結合Aβ單體肽1－40及包含多個Aβ1－42單體肽之可溶性聚合及/或寡聚類澱粉蛋白肽，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及與單體肽1－42之中等結合且基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合，且在與Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽共同培育後，抑制Aβ單體聚集成高分子聚合原纖維。

在一實施例中，提供抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之根據本發明之單株抗體，該抗體優先地結合Aβ_1－40 單體肽以及Aβ_1－42 寡聚及/或聚合肽，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及/或與單體肽1－42之中等結合及/或基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合，且在與Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽共同培育後，抑制Aβ單體及/或寡聚物聚集成高分子聚合原纖維。

在一實施例中，與緩衝液中培養之各別類澱粉蛋白肽單體(對照)相比，抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之根據本發明之單株抗體抑制Aβ單體聚集成高分子聚合原纖維至少40%、至少50%、尤其至少60%、尤其至少65%、更尤其至少75%、甚至更尤其至少80%、尤其至少85%－90%或90%以上。

在一實施例中，提供抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之根據本發明之單株抗體，該抗體優先地結合Aβ_1－40 單體肽以及Aβ_1－42 寡聚及/或聚合肽，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及/或與單體肽1－42之中等結合及/或基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合，且在37℃之溫度下與Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽共同培育24小時後，如藉由硫黃素T(Th－T)螢光檢定、尤其如下文實例1.4及2.4中所述之硫黃素T(Th－T)螢光檢定所測定，在1：100之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，抗體抑制Aβ單體及/或寡聚物聚集成高分子聚合原纖維至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、尤其至少60%、尤其至少65%、更尤其至少75%、甚至更尤其至少80%、尤其至少85%－90%，且在1：10之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，抗體抑制Aβ單體及/或寡聚物聚集成高分子聚合原纖維至少40%、至少50%、尤其至少60%、尤其至少65%、更尤其至少75%、甚至更尤其至少80%、尤其至少85%－90%。

根據本發明且如本文中所述之抗體與類澱粉蛋白生成單體及/或寡聚肽、尤其與類澱粉蛋白形式(1－42)之結合導致抑制單體及/或寡聚類澱粉蛋白生成肽聚集成高分子原纖維或纖維絲。經由抑制類澱粉蛋白生成單體及/或寡聚肽之聚集，根據本發明之抗體能夠預防或減慢類澱粉蛋白斑塊、尤其類澱粉蛋白形式(1－42)之形成，已知類澱粉蛋白形式(1－42)藉由二級構形改變而變得不可溶且為患病動物或人類之腦中類澱粉蛋白斑塊之主要部分。

根據本發明之抗體之聚集抑制潛力可藉由此項技術中已知之任何適合方法，例如藉由密度－梯度超速離心接著對預形成梯度之SDS－PAGE沈降分析及/或藉由硫黃素T(Th－T)螢光檢定來測定。

在一實施例中，本發明係關於抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之如本文中所述之單株抗體，在尤其以在1：10與1：1000之間的莫耳濃度比、更尤其以1：100之比率，在與藉由具有至少30個、尤其至少35個、更尤其至少38個、甚至更尤其至少40個胺基酸殘基之呈單體形式及/或呈包含多個該等單體肽之寡聚形式的Aβ單體及/或寡聚肽、尤其Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽之聚集而形成之預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲共同培育後，該抗體能夠將預形成聚合原纖維或纖維絲解聚至少20%、至少30%、至少35%、尤其至少40%、更尤其至少50%、甚至更尤其至少60%、尤其至少70%或70%以上。

在本發明之一特定實施例中，抗體之聚集抑制及解聚潛力分別藉由密度－梯度超速離心接著對預形成梯度之SDS－PAGE沈降分析來測定。

在本發明之另一特定實施例中，抗體之聚集抑制及解聚潛力分別藉由硫黃素T(Th－T)螢光檢定來測定。

在另一特定實施例中，根據本發明之抗體係在28℃與40℃之間、尤其32℃與38℃之間、更尤其37℃之溫度下，與預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲共同培育12小時至36小時、尤其18小時至30小時、更尤其24小時。詳言之，與預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲之共同培育係在37℃之溫度下執行24小時。

在一實施例中，本發明係關於抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之根據本發明之單株抗體，該抗體優先地結合Aβ_1－40 單體肽，尤其結合Aβ單體肽1－40及包含多個Aβ1－42單體肽之可溶性聚合及/或寡聚類澱粉蛋白肽，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及與單體肽1－42之中等結合且基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合，且在與藉由Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽之聚集而形成之預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲共同培育後，能夠將預形成聚合原纖維或纖維絲解聚尤其至少5%、至少10%、至少20%、尤其至少30%、更尤其至少40%、甚至更尤其至少50%、尤其至少60%且甚至更尤其70%或70%以上。

詳言之，本發明係關於抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之根據本發明之單株抗體，該抗體優先地結合Aβ_1－40 單體肽以及Aβ_1－42 寡聚及/或聚合肽，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及/或與單體肽1－42之中等結合及/或基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合，且在與藉由Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽之聚集而形成之預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲共同培育後，能夠將預形成聚合原纖維或纖維絲解聚尤其至少5%、至少10%、至少20%、尤其至少30%、更尤其至少40%、甚至更尤其至少50%、尤其至少60%、至少70%、至少80%或80%以上。

在本發明之一實施例中，提供抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之根據本發明之單株抗體，該抗體優先地結合Aβ_1－40 單體肽以及Aβ_1－42 寡聚及/或聚合肽，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及/或與單體肽1－42之中等結合及/或基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合，且在37℃之溫度下，與藉由Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽之聚集而形成之預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲共同培育24小時後，如藉由硫黃素T(Th－T)螢光檢定、尤其如下文實例1.4及2.4中所述之硫黃素T(Th－T)螢光檢定所測定，在1：100之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，導致預形成聚合原纖維或纖維絲解聚至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、尤其至少55%、尤其至少60%、更尤其至少70%及70%以上，且在1：10之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，導致預形成聚合原纖維或纖維絲解聚至少40%、至少50%、尤其至少60%、尤其至少65%、更尤其至少75%、甚至更尤其至少80%、尤其至少85%－90%。

經由抑制類澱粉蛋白質之聚集及經由類澱粉蛋白生成聚合原纖維或纖維絲之解聚，根據本發明之抗體能夠預防或減慢類澱粉蛋白斑塊之形成，引起與疾病相關之症狀之減輕及其進程之延遲或逆轉。

因此，本發明之另一實施例提供抗體，尤其為如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體能夠減少罹患腦中Aβ濃度增加相關之疾病或病狀之動物、尤其哺乳動物、尤其人類腦中的Aβ總量。

在本發明之另一實施例中，提供抗體，尤其為如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體能夠破壞斑塊，因此降低罹患腦中斑塊負荷增加相關之疾病或病狀之動物、尤其哺乳動物、尤其人類腦中的斑塊負荷。包括任何功能相等抗體或其功能部分之根據本發明之抗體降低腦中之斑塊負荷至少10%、至少20%、尤其至少25%、更尤其至少30%、至少40%、至少50%、尤其至少60%、尤其至少65%、更尤其至少75%、甚至更尤其至少80%、尤其至少85%－90%。

在本發明之另一實施例中，提供抗體，尤其為如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體能夠溶解斑塊，引起罹患腦中斑塊負荷增加相關之疾病或病狀之動物、尤其哺乳動物、尤其人類腦中的斑塊量降低。包括任何功能相等抗體或其功能部分之根據本發明之抗體降低腦中之斑塊量至少10%、尤其至少15%、更尤其至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、尤其至少60%、尤其至少65%、更尤其至少75%、甚至更尤其至少80%、尤其至少85%－90%。

應瞭解，根據本發明之抗體可以各種組合展現如本文中所述之特定性質中之一種、兩種或兩種以上。

舉例而言，在一實施例中，本發明提供抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該等抗體為雙特異性或雙有效性的，因為其展現如本文中所定義之聚集抑制性質及解聚性質，尤其配以高程度構形敏感性。

在一實施例中，根據本發明且如本文中所述之抗體為雙特異性或雙有效性的，且在與具有至少30個、尤其至少35個、更尤其至少38個、甚至更尤其至少40個胺基酸殘基之呈單體形式及/或呈包含多個該等單體肽之寡聚形式的Aβ單體及/或寡聚肽、尤其與Aβ_1－42 單體肽及/或寡聚肽共同培育後，抑制Aβ單體聚集成高分子聚合原纖維，且另外，在與藉由具有至少30個、尤其至少35個、更尤其至少38個、甚至更尤其至少40個胺基酸殘基之呈單體形式及/或呈包含多個該等單體肽之寡聚形式的Aβ單體及/或寡聚肽、尤其Aβ_1－42 單體肽及/或寡聚肽之聚集而形成之預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲共同培育後，能夠將預形成聚合原纖維或纖維絲解聚。

詳言之，分別與類澱粉蛋白單體及/或寡聚肽及預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲之共同培育係以至多1：1000之莫耳濃度比，尤其以1：10與1：100之間的莫耳濃度比，尤其以1：100之莫耳濃度比發生。

根據本發明之抗體與類澱粉蛋白單體及/或寡聚肽之共同培育係在28℃與40℃之間、尤其32℃與38℃之間、更尤其37℃之溫度下進行24小時至60小時、尤其30小時至50小時、更尤其48小時，而其與類澱粉蛋白預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲之共同培育係在28℃與40℃之間、尤其32℃與38℃之間、更尤其37℃之溫度下進行12小時至36小時、尤其18小時至30小時、更尤其24小時。

在一實施例中，根據本發明且如本文中所述之雙特異性或雙有效抗體能夠將預形成聚合原纖維或纖維絲解聚至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、尤其至少55%、尤其至少65%、更尤其至少70%、甚至更尤其至少70%、尤其至少75%－80%。

在一實施例中，本發明提供如本文中所述之雙特異性或雙有效抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，與緩衝液中培養之各別類澱粉蛋白肽單體(對照)相比，該抗體抑制具有至少30個、尤其至少35個、更尤其至少38個、甚至更尤其至少40個胺基酸殘基之呈單體形式及/或呈包含多個該等單體肽之寡聚形式的Aβ單體及/或寡聚肽、尤其Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽之聚集至少40%、至少50%、尤其至少65%、更尤其至少75%、甚至更尤其至少80%、尤其至少85%－90%或90%以上。

在一實施例中，本發明提供如本文中所述之雙特異性或雙有效抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體對Aβ_1－40 單體肽、尤其對Aβ單體肽1－40及包含多個Aβ1－42單體肽之可溶性聚合及/或寡聚類澱粉蛋白肽展現高特異性，但基本上不與選自由以下各物組成之群之類澱粉蛋白肽單體展示交叉反應性或僅展示微小至中度交叉反應性：Aβ_1－28 、Aβ_17－40 、Aβ_1－38 、Aβ_1－39 、Aβ_1－41 及/或Aβ_1－42 單體肽。

在一特定實施例中，本發明係關於如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，與Aβ_1－28 、Aβ_17－40 、Aβ_1－38 、Aβ_1－39 、Aβ_1－41 、Aβ_1－42 相比，該抗體對類澱粉蛋白肽Aβ_1－40 敏感至多1000倍、尤其50至100倍、更尤其80至100倍、尤其100倍，且能夠活體外及活體內抑制類澱粉蛋白生成單體及/或寡聚肽之聚集。

在一實施例中，提供如本文中所述之雙特異性或雙有效抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體優先地結合Aβ_1－40 單體肽以及Aβ_1－42 寡聚及/或聚合肽，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及/或與單體肽1－42之中等結合及/或基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合，且在37℃之溫度下，與Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽共同培育24小時後，如藉由硫黃素T(Th－T)螢光檢定、尤其如下文實例1.4及2.4中所述之硫黃素T(Th－T)螢光檢定所測定，在1：100之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，抗體抑制Aβ單體及/或寡聚物聚集成高分子聚合原纖維至少5%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、尤其至少55%、尤其至少65%、更尤其至少70%，且在1：10之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，抗體抑制Aβ單體及/或寡聚物聚集成高分子聚合原纖維至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、尤其至少60%、尤其至少65%、更尤其至少75%、甚至更尤其至少80%、尤其至少85%－90%，且在37℃之溫度下，與藉由Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽之聚集而形成之預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲共同培育24小時後，在1：100 之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，導致預形成聚合原纖維或纖維絲解聚至少10%，且在1：10之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，導致預形成聚合原纖維或纖維絲解聚至少20%。

在另一特定實施例中，本發明係關於如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體對類澱粉蛋白肽Aβ_1－40 具有高結合敏感性且能夠偵測呈至多0.01 μg、尤其呈0.5 μg與0.01 μg之間的濃度範圍、更尤其呈0.1 μg與0.01 μg之間的濃度範圍、尤其呈0.01 μg之濃度的Aβ_1－42 可溶性寡聚物及/或聚合類澱粉蛋白肽。

在一實施例中，本發明提供如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體係已針對超分子抗原構築體產生，該構築體包含對應於β－類澱粉蛋白肽Aβ_1－15 之胺基酸序列之抗原肽，該抗體經疏水性棕櫚酸部分修飾，其中該疏水性部分經由諸如離胺酸之胺基酸或能夠用作連接子分子之任何其他適合胺基酸或胺基酸類似物共價地結合各末端。

根據本發明且如本文中所述之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體識別且結合構形抗原決定基。

在一實施例中，本發明係關於輕鏈可變區，其展現與SEQ ID NO：7中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含具有多肽序列SEQ ID NO：9－11之輕鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。

在一實施例中，本發明係關於重鏈可變區，其展現與SEQ ID NO：8中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含具有多肽序列SEQ ID NO：12－14之重鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。

另外，本發明係關於抗體，尤其為根據本發明且如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域，其展現與SEQ ID NO：7中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含具有多肽序列SEQ ID NO：9－11之輕鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。

另外，本發明係關於抗體，尤其為根據本發明且如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，其中該抗體包含重鏈可變域，其展現與SEQ ID NO：8中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含具有多肽序列SEQ ID NO：12－14之重鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。

在一實施例中，本發明係關於抗體，尤其為根據本發明且如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，其中該抗體包含輕鏈及重鏈可變域，其展現與SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含具有多肽序列SEQ ID NO：9－14之部分或所有重鏈及輕鏈CDR。

本發明另外係關於包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體包含SEQ ID NO：7及/或SEQ ID NO：8中所述之多肽序列。本發明另外係關於具有多肽序列SEQ ID NO：7－8之單株抗體ACI－24－Ab－3。

本發明亦包含抗體，其序列已藉由將至少一個、尤其至少2個、更尤其至少3個或3個以上保守性取代引入SEQ ID NO：7－8之序列中而經改變，以便抗體基本上維持其完全功能性。

在一實施例中，本發明係關於肽片段，其包含如SEQ ID NO：9中所示之輕鏈CDR1及/或如SEQ ID NO：10中所示之輕鏈CDR2及/或如SEQ ID NO：11中所示之輕鏈CDR3。

在一實施例中，本發明係關於肽片段，其包含如SEQ ID NO：12中所示之重鏈CDR1及/或如SEQ ID NO：13中所示之重鏈CDR2及/或如SEQ ID NO：14中所示之重鏈CDR3。

在一實施例中，本發明係關於如SEQ ID NO：9中所示之輕鏈CDR1。

在一實施例中，本發明係關於如SEQ ID NO：10中所示之輕鏈CDR2。

在一實施例中，本發明係關於如SEQ ID NO：11中所示之輕鏈CDR3。

在一實施例中，本發明係關於如SEQ ID NO：12中所示之重鏈CDR1。

在一實施例中，本發明係關於如SEQ ID NO：13中所示之重鏈CDR2。

在一實施例中，本發明係關於如SEQ ID NO：14中所示之重鏈CDR3。

在一實施例中，本發明係關於包含編碼輕鏈可變區之核苷酸序列之聚核苷酸，該輕鏈可變區展現與SEQ IDNO：7中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含具有多肽序列SEQ ID NO：9－11之輕鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。在一實施例中，本發明係關於包含編碼重鏈可變區之核苷酸序列之聚核苷酸，該重鏈可變區展現與SEQ ID NO：8中所示之序列85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含具有多肽序列SEQ ID NO：12－14之重鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。

在一實施例中，本發明係關於包含編碼抗體、尤其根據本發明且如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體的核苷酸序列的聚核苷酸，其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域展現與SEQ ID NO：7中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含具有多肽序列SEQ ID NO：9－11之輕鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。

在一實施例中，本發明係關於包含編碼抗體、尤其根據本發明且如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體的核苷酸序列的聚核苷酸，其中該抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域展現與SEQ ID NO：8中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含具有多肽序列SEQ ID NO：12－14之重鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。

在一實施例中，本發明係關於包含編碼抗體、尤其根據本發明且如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體的核苷酸序列的聚核苷酸，其中該抗體包含輕鏈及重鏈可變域，該等可變域展現與SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含具有多肽序列SEQ ID NO：9－14之輕鏈及重鏈CDR。

在本發明之另一實施例中，提供聚核苷酸，其包含編碼根據本發明且如本文中所述之抗體之核苷酸序列，尤其為編碼具有多肽序列SEQ ID NO：7－8之單株抗體之核苷酸序列。詳言之，該等聚核苷酸序列為SEQ ID NO：15－16。

在另一實施例中，提供聚核苷酸，其在嚴格條件下與編碼具有多肽序列SEQ ID NO：7－8之單株抗體之核苷酸序列雜交。詳言之，提供聚核苷酸，其在嚴格條件下與核苷酸序列SEQ ID NO：15－16雜交。

詳言之，SEQ ID NO：8之位置52可為任何胺基酸。在另一實施例中，位置52可為酪胺酸、絲胺酸或半胱胺酸殘基。更特定而言，位置52為半胱胺酸殘基。

在一特定實施例中，本發明係關於包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體具有藉由2007年5月25日寄存且給予寄存編號DSM ACC2844之融合瘤細胞株EJ1A9產生之抗體的特徵性質。

詳言之，本發明係關於包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體藉由2007年5月25日寄存且給予寄存編號DSM ACC2844之融合瘤細胞株EJ1A9產生。

詳言之，本發明亦係關於結合包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體之Aβ抗原決定基，該抗體係已針對超分子抗原構築體產生，該構築體包含對應於β－類澱粉蛋白肽Aβ_1－15 之胺基酸序列之抗原肽，該抗體經疏水性棕櫚酸部分修飾，其中該疏水性部分經由諸如離胺酸之胺基酸或能夠用作連接子分子之任何其他適合胺基酸或胺基酸類似物共價地結合各末端。本發明另外係關於結合單株抗體ACI－24－Ab－3之Aβ抗原決定基。

在一實施例中，本發明係關於如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合具有至少10個、尤其至少20個、更尤其至少30個、甚至更尤其至少40個胺基酸殘基之Aβ單體肽，及/或包含多個該等類澱粉蛋白單體肽之可溶性聚合類澱粉蛋白肽及/或併有多個該等聚合肽之類澱粉蛋白纖維或原纖維、尤其結合Aβ_1－42 單體肽及包含多個Aβ_1－42 單體肽之聚合可溶性Aβ肽及併有多個該等聚合肽之Aβ原纖維或纖維，且該抗體基本上不展示與具有8個或更少胺基酸殘基之Aβ單體肽之結合。

在一特定實施例中，本發明係關於如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合具有至少30個、甚至更尤其至少40個胺基酸殘基之Aβ單體肽，及/或包含多個該等類澱粉蛋白單體肽之可溶性聚合類澱粉蛋白肽及/或併有多個該等聚合肽之類澱粉蛋白纖維或原纖維、尤其結合Aβ_1－42 單體肽及包含多個β_1－42 單體肽之聚合可溶性Aβ肽及併有多個該等聚合肽之Aβ原纖維或纖維，但該抗體基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合。

在本發明之另一特定實施例中，提供如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合Aβ單體肽1－42及包含多個Aβ_1－42 單體肽之聚合可溶性Aβ肽及併有多個該等聚合肽之Aβ原纖維或纖維，但該抗體展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合。

在本發明之另一特定實施例中，提供如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合Aβ單體肽1－42及包含多個Aβ_1－42 單體肽之聚合可溶性Aβ肽及併有多個該等聚合肽之Aβ原纖維或纖維，但該抗體展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合且基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合。

詳言之，抗體、尤其根據本發明之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體結合Aβ1－42單體肽及包含多個Aβ1－42單體肽之聚合可溶性Aβ肽及併有多個該等聚合肽之Aβ原纖維或纖維，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及/或基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合，且在與Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽共同培育後，抑制Aβ單體聚集成高分子聚合原纖維。

在一實施例中，與緩衝液中培養之各別類澱粉蛋白肽單體(對照)相比，抗體、尤其根據本發明之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體抑制Aβ單體及/或寡聚物聚集成高分子聚合原纖維至少20%、至少30%、尤其至少40%、尤其至少50%、更尤其至少60%、甚至更尤其至少70%、尤其至少80%－90%或90%以上。

在本發明之一實施例中，提供抗體，尤其為根據本發明之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合Aβ1－42單體肽及包含多個Aβ1－42單體肽之聚合可溶性Aβ肽及併有多個該等聚合肽之Aβ原纖維或纖維，但該抗體展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及/或基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合，且在37℃之溫度下，與Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽共同培育24小時後，如藉由硫黃素T(Th－T)螢光檢定、尤其如下文實例1.4及2.4中所述之硫黃素T(Th－T)螢光檢定所測定，在1：100之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，抗體抑制Aβ單體聚集成高分子聚合原纖維至少20%、至少30%、尤其至少40%、尤其至少50%、更尤其至少60%、甚至更尤其至少70%，且在1：10之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，抗體抑制Aβ單體聚集成高分子聚合原纖維至少50%、更尤其至少60%、更尤其至少65%、甚至更尤其至少70%。

詳言之，本發明係關於抗體，尤其為根據本發明之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合Aβ1－42單體肽及包含多個Aβ1－42單體肽之聚合可溶性Aβ 肽及併有多個該等聚合肽之Aβ原纖維或纖維，但該抗體展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及/或基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合，且在與藉由Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽之聚集而形成之預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲共同培育後，能夠將預形成聚合原纖維或纖維絲解聚尤其至少10%、至少20%、尤其至少30%、更尤其至少40%、甚至更尤其至少50%、尤其至少60%或60%以上。

在本發明之一實施例中，提供抗體，尤其為根據本發明之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合Aβ1－42單體肽及包含多個Aβ1－42單體肽之聚合可溶性Aβ肽及併有多個該等聚合肽之Aβ原纖維或纖維，但該抗體展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及/或基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合，且在37℃之溫度下，與藉由Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽之聚集而形成之預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲共同培育24小時後，如藉由硫黃素T(Th－T)螢光檢定、尤其如下文實例1.4及2.4中所述之硫黃素T(Th－T)螢光檢定所測定，在1：100之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，導致預形成聚合原纖維或纖維絲解聚至少10%、至少20%、至少30%、尤其至少40%、尤其至少50%、更尤其至少60%、甚至更尤其至少70%，且在1：10之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，導致預形成聚合原纖維或纖維絲解聚至少40%、尤其至少50%、更尤其至少60%、甚至更尤其至少70%。

經由抑制類澱粉蛋白質之聚集及/或經由類澱粉蛋白生成聚合原纖維或纖維絲之解聚，根據本發明之抗體能夠預防或減慢類澱粉蛋白斑塊之形成，引起與疾病相關之症狀之減輕及其進程之延遲或逆轉。

在本發明之另一實施例中，提供抗體，尤其為如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體能夠破壞斑塊因此降低罹患腦中斑塊負荷增加相關之疾病或病狀之動物、尤其哺乳動物、尤其人類腦中的斑塊負荷。根據本發明之包括任何功能相等抗體或其功能部分之抗體降低腦中之斑塊負荷至少20%、尤其至少25%、更尤其至少30%、甚至更尤其超過30%。

在本發明之另一實施例中，提供抗體，尤其為如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體能夠溶解斑塊，引起罹患腦中斑塊負荷增加相關之疾病或病狀之動物、尤其哺乳動物、尤其人類腦中的斑塊量降低。根據本發明之包括任何功能相等抗體或其功能部分之抗體降低腦中之斑塊量至少10%、尤其至少15%、更尤其至少20%。

在一實施例中，根據本發明且如本文中所述之抗體為雙特異性或雙有效性的，且在與具有至少30個、尤其至少35個、更尤其至少38個、甚至更尤其至少40個胺基酸殘基之Aβ單體及/或寡聚肽、尤其與Aβ_1－42 單體肽及/或寡聚肽共同培育後，抑制Aβ單體聚集成高分子聚合原纖維，且另外，在與藉由具有至少30個、尤其至少35個、更尤其至少38個、甚至更尤其至少40個胺基酸殘基之Aβ單體及/或寡聚肽、尤其Aβ_1－42 單體肽及/或寡聚肽之聚集而形成之預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲共同培育後，能夠將預形成聚合原纖維或纖維絲解聚。

詳言之，分別與類澱粉蛋白單體及/或寡聚肽及預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲之共同培育係以至多1：1000之莫耳濃度比，尤其以1：10與1：1000之間的莫耳濃度比，尤其以1：100之莫耳濃度比發生。

根據本發明之抗體與類澱粉蛋白單體及/或寡聚肽之共同培育係在28℃與40℃之間、尤其32℃與38℃之間、更尤其37℃之溫度下進行24小時至60小時、尤其30小時至50小時、更尤其48小時，而其與類澱粉蛋白預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲之共同培育係在28℃與40℃之間、尤其32℃與38℃之間、更尤其37℃之溫度下進行12小時至36小時、尤其18小時至30小時、更尤其24小時。在一實施例中，根據本發明且如本文中所述之雙特異性或雙有效抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體能夠將預形成聚合原纖維或纖維絲解聚至少10%、至少20%、至少30%、尤其至少40%、尤其至少50%、更尤其至少60%、甚至更尤其至少70%。

在一實施例中，與緩衝液中培養之各別類澱粉蛋白肽單體(對照)相比，根據本發明且如本文中所述之雙特異性或雙有效抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體能夠抑制具有至少30個、尤其至少35個、更尤其至少38個、甚至更尤其至少40個胺基酸殘基之Aβ單體及/或寡聚肽、尤其Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽之聚集至少30%、尤其至少40%、尤其至少50%、更尤其至少60%、甚至更尤其至少70%、尤其至少80－90%或90%以上。

在一實施例中，本發明提供如本文中所述之雙特異性或雙有效抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體對Aβ_1－42 單體肽展現高特異性，但基本上不與選自由Aβ_1－28 及Aβ_17－40 單體肽組成之群之類澱粉蛋白肽單體展示交叉反應性或僅展示微小交叉反應性。

在一特定實施例中，本發明係關於如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，與Aβ_1－28 及/或Aβ_17－40 相比，該抗體對類澱粉蛋白肽Aβ_1－42 敏感至多1000倍、尤其50至1000倍、更尤其80至100倍、尤其100倍，且能夠活體外及活體內抑制類澱粉蛋白生成單體及/或寡聚肽之聚集及/或能夠解聚預形成聚合原纖維或纖維絲。

在一實施例中，本發明提供如本文中所述之雙特異性或雙有效抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體結合Aβ1－42單體肽及包含多個Aβ1－42單體肽之聚合可溶性Aβ肽及併有多個該等聚合肽之Aβ原纖維或纖維，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及/或基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合，且在37℃之溫度下，與Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽共同培育24小時後，如藉由硫黃素T(Th－T)螢光檢定、尤其如下文實例1.4及2.4中所述之硫黃素T(Th－T)螢光檢定所測定，在1：100之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，抗體抑制Aβ單體聚集成高分子聚合原纖維至少30%，且在1：10之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，抗體抑制Aβ單體聚集成高分子聚合原纖維至少65%，且在37℃之溫度下，與藉由Aβ_1－42 單體及/或寡聚肽之聚集而形成之預形成高分子聚合類澱粉蛋白原纖維或纖維絲共同培育24小時後，在1：100之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，導致預形成聚合原纖維或纖維絲解聚至少20%，且在1：10之抗體與Aβ_1－42 之莫耳濃度比下，導致預形成聚合原纖維或纖維絲解聚至少50%。

在另一特定實施例中，本發明係關於如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體對類澱粉蛋白肽Aβ_1－42 具有高結合敏感性且能夠偵測呈至多0.01 μg、尤其呈0.5 μg與0.01 μg之間的濃度範圍、更尤其呈0.1 μg與0.01 μg之間的濃度範圍、尤其呈0.01 μg之濃度的Aβ_1－42 纖維。

在一實施例中，本發明提供如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體係已針對超分子抗原構築體產生，該構築體包含分別對應於β－類澱粉蛋白肽Aβ_22－35 及Aβ_29－40 之胺基酸序列之抗原肽，該抗體經諸如聚乙二醇(PEG)之親水性部分修飾，其中該親水性部分經由諸如離胺酸之胺基酸或能夠用作連接子分子之任何其他適合胺基酸或胺基酸類似物共價地結合各末端。

在一實施例中，本發明係關於輕鏈可變區，其展現分別與SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：19中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含輕鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。

在一實施例中，本發明係關於重鏈可變區，其展現分別與SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：20中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含重鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。

另外，本發明係關於抗體，尤其為根據本發明且如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域，其展現分別與SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：19中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含輕鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。

另外，本發明係關於抗體，尤其為根據本發明且如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，其中該抗體包含重鏈可變域，其展現分別與SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：20中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含重鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。

在一實施例中，本發明係關於抗體，尤其為根據本發明且如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，其中該抗體包含輕鏈及重鏈可變域，其展現與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：18及 SEQ ID NO：20中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含部分或所有重鏈及輕鏈CDR。

本發明另外係關於包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體包含如SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：19及/或SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：20中所示之多肽序列。本發明另外係關於具有多肽序列SEQ ID NO：17－18之單株抗體ACI－11－Ab－9及具有多肽序列SEQ ID NO：19－20之ACI－12－Ab－11。

本發明亦包含抗體，其序列已藉由將至少一個、尤其至少2個、更尤其至少3個或3個以上保守性取代分別引入SEQ ID NO：17－18及SEQ ID NO：19－20之序列中而經改變，以便抗體基本上維持其完全功能性。

在一實施例中，本發明係關於包含如SEQ ID NO：21中所示之輕鏈CDR1及/或如SEQ ID NO：22中所示之輕鏈CDR2及/或如SEQ ID NO：23中所示之輕鏈CDR3之肽片段。

在一實施例中，本發明係關於包含如SEQ ID NO：24中所示之重鏈CDR1及/或如SEQ ID NO：25中所示之重鏈CDR2及/或如SEQ ID NO：26中所示之重鏈CDR3之肽片段。

在一實施例中，本發明係關於如SEQ ID NO：21中所示之輕鏈CDR1。

在一實施例中，本發明係關於如SEQ ID NO：22中所示之輕鏈CDR2。

在一實施例中，本發明係關於如SEQ ID NO：23中所示之輕鏈CDR3。

在一實施例中，本發明係關於如SEQ ID NO：24中所示之重鏈CDR1。

在一實施例中，本發明係關於如SEQ ID NO：25中所示之重鏈CDR2。

在一實施例中，本發明係關於如SEQ ID NO：26中所示之重鏈CDR3。

在一實施例中，本發明係關於包含編碼輕鏈可變區之核苷酸序列之聚核苷酸，該輕鏈可變區展現分別與SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：19中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含如SEQ ID NO：21－23中所述之輕鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。

在一實施例中，本發明係關於包含編碼重鏈可變區之核苷酸序列之聚核苷酸，該重鏈可變區展現分別與SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：20中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含如SEQ ID NO：24－26中所述之重鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。

在一實施例中，本發明係關於包含編碼抗體、尤其根據本發明且如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體的核苷酸序列的聚核苷酸，其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域展現分別與SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：19中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含如SEQ ID NO：21－23中所述之輕鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。

在一實施例中，本發明係關於包含編碼抗體、尤其根據本發明且如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體的核苷酸序列的聚核苷酸，其中該抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域展現分別與SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：20中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含如SEQ ID NO：24－26中所述之重鏈CDR中之至少一者、尤其至少兩者、更尤其至少三者，但特別是所有包含於其天然框架區域中之CDRs。

在一實施例中，本發明係關於包含編碼抗體、尤其根據本發明且如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體的核苷酸序列的聚核苷酸，其中該抗體包含輕鏈及重鏈可變域，該等可變域展現分別與SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：19中及SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：20中所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列或其功能部分，該功能部分包含如SEQ ID NO：21－26中所述之輕鏈及重鏈CDR。

在本發明之另一實施例中，提供聚核苷酸，其包含編碼根據本發明且如本文中所述之抗體之核苷酸序列，尤其為編碼具有SEQ ID NO：17－18中之多肽序列之單株抗體或具有多肽序列SEQ ID NO：19－20之單株抗體的核苷酸序列。詳言之，編碼SEQ ID NO：17－18及SEQ ID NO：19－20之聚核苷酸分別為SEQ ID NO：27－28及SEQ ID NO：29－30。

在另一實施例中，提供聚核苷酸，其在嚴格條件下與編碼具有多肽序列SEQ ID NO：17－18之單株抗體或具有多肽序列SEQ ID NO：19－20之單株抗體之核苷酸序列雜交。詳言之，提供聚核苷酸，其在嚴格條件下與核苷酸序列SEQ ID NO：27－28或SEQ ID NO：29－30雜交。在一特定實施例中，本發明係關於包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體具有藉由2007年5月25日寄存為DSM ACC2845之融合瘤細胞株FG1F9E4產生之抗體的特徵性質。

詳言之，本發明係關於包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體藉由2007年5月25日寄存為DSM ACC2845之融合瘤細胞株FG1F9E4產生。

在一特定實施例中，本發明係關於包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體具有藉由2007年5月25日寄存為DSM ACC2846之融合瘤細胞株FK2A6A6產生之抗體的特徵性質。

詳言之，本發明係關於包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該抗體藉由2007年5月25日寄存為DSM ACC2846之融合瘤細胞株FK2A6A6產生。

詳言之，本發明亦係關於結合包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體之Aβ抗原決定基，該抗體係已針對超分子抗原構築體產生，該構築體包含分別對應於β－類澱粉蛋白肽Aβ_22－35 及Aβ_29－40 之胺基酸序列之抗原肽，該抗體經諸如聚乙二醇(PEG)之親水性部分修飾，其中該親水性部分經由諸如離胺酸之胺基酸或能夠用作連接子分子之任何其他適合胺基酸或胺基酸類似物共價地結合各末端。本發明另外係關於結合單株抗體ACI－11－Ab－9之Aβ抗原決定基。本發明另外係關於結合單株抗體ACI－12－Ab－11之Aβ抗原決定基。在一態樣中，根據本發明且如本文中所述之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體能夠減少罹患腦中可溶性Aβ濃度增加相關之疾病或病狀之動物、尤其哺乳動物、尤其人類腦中的可溶性Aβ總量。

在另一態樣中，根據本發明且如本文中所述之抗體能夠破壞斑塊因此降低罹患腦中斑塊負荷增加相關之疾病或病狀之動物、尤其哺乳動物、尤其人類腦中的斑塊負荷。

在另一態樣中，根據本發明且如本文中所述之抗體能夠溶解斑塊，引起罹患腦中斑塊負荷增加相關之疾病或病狀之動物、尤其哺乳動物、尤其人類腦中的斑塊量降低。

本發明之另一目的在於提供包含根據本發明且如本文中所述之抗體之方法及組合物，其係(例如)藉由用根據本發明且如本文中之前所述之抗體將人類或動物被動免疫來預防及/或治療性治療及/或減輕由類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質引起或與其相關之疾病及病症之影響，該等疾病及病症包括(但不限於)澱粉樣變性病(其為一群與類澱粉蛋白斑塊形成相關之疾病及病症，包括繼發性澱粉樣變性病及與年齡相關之澱粉樣變性病，諸如包括(但不限於)以下各病之疾病：神經學病症，諸如阿茲海默氏病(AD)，以認知記憶能力損失為特徵之疾病或病狀，諸如輕度認知障礙(MCI)、路易體性癡呆、唐氏症候群、遺傳性大腦出血併發澱粉樣變性病(荷蘭型)；關島帕金森－癡呆綜合症；以及基於類澱粉狀蛋白質或與其相關之其他疾病及病狀，諸如進行性核上麻痺、多發性硬化症；庫賈氏病、帕金森氏病、HIV相關之癡呆、ALS(肌萎縮性側索硬化)、包涵體肌炎(IBM)、成年發病型糖尿病；及老年心臟澱粉樣變性病)；內分泌腫瘤及黃斑退化。

在本發明之一特定態樣中，該等方法之單株抗體為如本文中所述之具有多肽序列SEQ ID NO：7－8之ACI－24－Ab－3或其功能部分。

在本發明之另一特定態樣中，該等方法之單株抗體分別為如本文中所述之具有多肽序列SEQ ID NO：17－18之ACI－11－Ab－9或具有多肽序列SEQ ID NO：9－10之ACI－12－Ab－11或其功能部分。

本發明另外關於治療組合物，其包含治療有效量之如本文中所述之抗體，尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體。

在一個實施例中，醫藥組合物另外包含尤其治療有效量之醫藥學上可接受之載劑。

在一個實施例中，本發明提供一種如本文中所述之用於治療類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質所引起或相關之疾病及病症之組合物，該等疾病及病症包括(但不限於)澱粉樣變性病、腫瘤及黃斑退化。

在該等實施例之一個特定態樣中，所用單株抗體為如本文中所述之具有多肽序列SEQ ID NO：7－8之ACI－24－Ab－3或其功能部分。

在該等實施例之另一個特定態樣中，所用單株抗體係選自如本文中所述之具有多肽序列SEQ ID NO：17－18之單株抗體ACI－11－Ab－9及具有多肽序列SEQ ID NO：19－20之單株抗體ACI－12－Ab－11或其功能部分。

根據本發明之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體可與用於治療疾病之其他生物活性物質或其他治療程序組合投與。該等其他生物活性物質可為已包含根據本發明之抗體的相同組合物之部分，呈混合物形式，其中抗體及其他生物活性物質在相同醫藥學上可接受之溶劑及/或載劑中混合或與其混合，或抗體及其他生物活性物質可作為各別組合物之部分各別提供，該各別組合物可各別提供，或以多部分套組之形式一起提供。

抗體、尤其根據本發明之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體可與其他生物活性物質同時、間歇或依次投與。舉例而言，根據本發明之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體可與第一其他生物活性物質同時投與或在投與抗體之後或之前依次投與。若選擇將一種以上其他生物活性物質連同至少一種根據本發明之抗體一起投與之應用方案，則該等化合物或物質可以各種組合而部分同時、部分依次投與。

在一實施例中，本發明係關於混合物，其包含呈治療有效量之如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體；及另一生物活性物質或化合物，尤其為用於由類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質引起或與其相關之疾病及病症之藥物治療中的化合物，該等疾病及病症包括(但不限於)澱粉樣變性病、內分泌腫瘤及黃斑退化；及/或醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑及/或賦形劑。

在一實施例中，提供根據本發明且如本文中所述之混合物，其包含如本文中所述之抗體，尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體；且另外包含至少一種選自由以下各物組成之群之化合物：抵抗氧化應力之化合物、抗細胞凋亡化合物、金屬螯合劑、DNA修復抑制劑(諸如哌侖西平(pirenzepin)及代謝物)、3－胺基－1－丙烷磺酸(3APS)、1,3－丙烷二磺酸酯(1,3PDS)、分泌酶活化劑、β及γ分泌酶抑制劑、τ蛋白質、神經傳遞素、β－片斷裂劑、消炎分子或膽鹼酯酶抑制劑(ChEI)(諸如他克林、雷斯替明、多奈哌齊及/或加蘭他敏)及其他藥物及營養補充物；且視需要包含醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑及/或賦形劑。

在一特定實施例中，本發明提供混合物，其包含如本文中所述之抗體、尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該混合物另外包含至少一種為膽鹼酯酶抑制劑(ChEI)之化合物。

在另一特定實施例中，本發明提供混合物，其包含如本文中所述之抗體、尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，該混合物另外包含至少一種選自由以下各物組成之群之額外化合物：他克林、雷斯替明、多奈哌齊、加蘭他敏、菸鹼酸及美金剛胺。

在本發明之另一實施例中，提供混合物，其包含如本文中所述之抗體、尤其為包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體；其另外包含至少一種"非典型抗精神病劑"，諸如用於治療陽性及陰性精神病症狀之氯氮平(clozapine)、齊拉西酮(ziprasidone)、利螺環酮(risperidone)、阿立哌唑(aripiprazole)或奧氮平(olanzapine)，該等症狀包括幻覺、妄想、思考障礙(藉由明顯不連貫、思維出軌(derailment)、偏離主題(tangentiality)表現)及怪異或紊亂行為以及快感缺乏、情感貧乏、淡漠及社交能力喪失；且其視需要另外包含醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑及/或賦形劑。

可適當地在混合物中與根據本發明之包括任何功能相等抗體或其功能部分之抗體組合使用的其他化合物(例如)描述於WO 2004/058258(尤其參見第16及17頁)中，包括治療藥物標靶(第36－39頁)、烷磺酸及烷醇硫酸(第39－51頁)、膽鹼酯酶抑制劑(第51－56頁)、NMDA受體拮抗劑(第56－58頁)、雌激素(第58－59頁)、非甾族消炎藥(第60－61頁)、抗氧化劑(第61－62頁)、過氧化體增生物活化受體(PPAR)促效劑(第63－67頁)、降膽固醇劑(第68－75頁)、類澱粉蛋白抑制劑(第75－77頁)、類澱粉蛋白形成抑制劑(第77－78頁)、金屬螯合劑(第78－79頁)、抗精神病劑及抗抑鬱劑(第80－82頁)、營養補充劑(第83－89頁)及增加腦中生物活性物質之可用性之化合物(參見第89－93頁)及前藥(第93及94頁)，該文獻以引用之方式併入本文。

詳言之，根據本發明之混合物包含呈治療有效量之包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體及/或生物活性物質。

在一實施例中，本發明係關於產生如本文中所述之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體的方法，該方法包含在適合宿主生物體中針對超分子抗原構築體產生抗體，該構築體包含對應於β－類澱粉蛋白肽或其片段、尤其β－類澱粉蛋白肽Aβ_1－15 之胺基酸序列之抗原肽，該抗體經疏水性部分、尤其棕櫚酸部分修飾，或在替代情形中，該構築體包含尤其分別對應於β－類澱粉蛋白肽Aβ_22－35 及Aβ_29－40 之胺基酸序列之抗原肽，該抗體經親水性部分、尤其聚乙二醇(PEG)部分修飾，其中該疏水性或親水性部分經由至少一個、尤其一或兩個諸如離胺酸、麩胺酸及半胱胺酸之胺基酸或能夠用作連接子分子之任何其他適合胺基酸或胺基酸類似物共價地結合各末端；及分離該抗體。

當使用諸如PEG之親水性部分時，β－類澱粉蛋白肽之所選片段可為分別對應於胺基酸序列Aβ_22－35 及Aβ_29－40 之片段，且游離PEG末端可共價地結合磷脂醯乙醇胺或適於起錨定元件作用以(例如)將抗原構築體嵌埋於脂質體之雙層中的任何其他化合物。

在一實施例中，本發明係關於根據本發明且如本文中所述之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體及/或根據本發明且如本文中所述之醫藥組合物或根據本發明且如本文中所述之混合物的用途，其用於製備治療或減輕由類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質引起或與其相關之疾病及病症之影響的藥劑，該等疾病及病症包括(但不限於)澱粉樣變性病、內分泌腫瘤及黃斑退化。

在一實施例中，本發明係關於使用根據本發明且如本文中所述之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體來製備用於治療或減輕由類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質引起或與其相關之疾病及病症之影響的根據本發明且如本文中所述之醫藥組合物或混合物的方法，該等疾病及病症包括(但不限於)澱粉樣變性病、內分泌腫瘤及黃斑退化。

在一實施例中，本發明提供使用根據本發明且如本文中所述之抗體(尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體)、醫藥組合物或混合物來製備用於預防、治療或減輕由類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質引起或與其相關之疾病及病症之影響的藥劑的方法，該等疾病及病症包括(但不限於)澱粉樣變性病、內分泌腫瘤及黃斑退化。

在一特定實施例中，本發明係關於尤其使用根據本發明且如本文中所述之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體來製備醫藥組合物之方法，其包含以醫藥學上可接受之形式調配該抗體，尤其以便該抗體以治療有效量包含在組合物中。

在本發明之一態樣中，提供用於降低罹患腦中斑塊負荷增加相關之疾病或病狀之動物、尤其哺乳動物、尤其人類腦中的斑塊負荷的方法，其包含向需要該治療之動物、尤其哺乳動物、更尤其人類投與治療有效量之根據本發明且如本文中之前所述的抗體(尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體)或組合物或混合物。

在本發明之一特定態樣中，用於該等方法中之單株抗體為如本文中所述之具有多肽序列SEQ ID NO：7－8之ACI－24－Ab－3或其功能部分。詳言之，單株抗體係藉由2007年5 月25日寄存為DSM ACC2844之融合瘤EJ1A9來產生。

在本發明之另一特定態樣中，用於該等方法中之單株抗體為選自包含以下各抗體之抗體群之單株抗體：如本文中所述之具有多肽序列SEQ ID NO：17－18之ACI－11－Ab－9及具有多肽序列SEQ ID NO：19－20之ACI－12－Ab－11或其功能部分。詳言之，單株抗體係藉由2007年5月25日寄存為DSM ACC2845之融合瘤FG1F9E4或2007年5月25日寄存為DSM ACC2846之融合瘤FK2A6A6來產生。

詳言之，斑塊負荷降低至少20%，尤其至少25%，更尤其至少30%，甚至更尤其超過30%。

在本發明之另一態樣中，提供用於降低罹患腦中斑塊負荷增加相關之疾病或病狀之動物、尤其哺乳動物、尤其人類腦中的斑塊量的方法，其包含向需要該治療之動物、尤其哺乳動物、更尤其人類投與治療有效量之根據本發明且如本文中之前所述的抗體(尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體)或組合物或混合物。

在本發明之一特定態樣中，用於該等方法中之單株抗體為如本文中所述之具有多肽序列SEQ ID NO：7－8之ACI－24－Ab－3或其功能部分。詳言之，單株抗體係藉由2007年5月25日寄存為DSM ACC2844之融合瘤EJ1A9來產生。

詳言之，腦中斑塊量降低至少10%，尤其至少15%，更尤其超過15%。

在本發明之另一態樣中，提供用於減少罹患腦中可溶性Aβ濃度增加相關之疾病或病狀之動物、尤其哺乳動物、尤其人類腦中的可溶性Aβ總量的方法，其包含向需要該治療之動物、尤其哺乳動物、更尤其人類投與治療有效量之根據本發明且如本文中所述之抗體(尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體)或組合物或混合物。

在本發明之一特定態樣中，該等方法之單株抗體為如本文中所述之具有多肽序列SEQ ID NO：7－8之ACI－24－Ab－3或其功能部分。詳言之，單株抗體係藉由2007年5月25日寄存為DSM ACC2844之融合瘤EJ1A9來產生。

在本發明之另一態樣中，提供用於在受由類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質引起或與其相關之疾病及病症影響之動物、哺乳動物或人類中，預防、治療或減輕該等疾病及病症之影響之方法，該方法藉由向需要該治療之動物、尤其哺乳動物、更尤其人類投與治療有效量之根據本發明且如本文中所述之抗體(尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體)或組合物或混合物來進行，該等疾病及病症包括(但不限於)澱粉樣變性病、內分泌腫瘤及黃斑退化。

在本發明之另一態樣中，提供用於在展現與類澱粉蛋白相關之疾病或病狀之哺乳動物中保留或增加認知記憶能力之方法，其包含向需要該治療之動物、尤其哺乳動物、更尤其人類投與治療有效量之根據本發明或如本文中之前所述之抗體(尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體)或組合物或混合物。

在一實施例中，本發明係關於融合瘤細胞株，其特徵在於該融合瘤細胞株產生根據本發明或如本文中之前所述之單株抗體。

詳言之，本發明係關於融合瘤細胞株，其特徵在於該融合瘤細胞株產生單株抗體，該抗體具有藉由2007年5月25日寄存且給予寄存編號DSM ACC2844之融合瘤EJ1A9產生之抗體的特徵性質。

在本發明之一特定實施例中，提供2007年5月25日寄存且給予寄存編號DSM ACC2844之融合瘤細胞株EJ1A9。

詳言之，本發明係關於融合瘤細胞株，其特徵在於該融合瘤細胞株產生單株抗體，該抗體具有藉由2007年5月25 日寄存為DSM ACC2845之融合瘤FG1F9E4或2007年5月25日寄存為DSM ACC2846之融合瘤FK2A6A6產生之抗體的特徵性質。

在本發明之一特定實施例中，提供2007年5月25日寄存為DSM ACC2845之融合瘤細胞株FG1F9E4。

在本發明之另一特定實施例中，提供2007年5月25日寄存為DSM ACC2846之融合瘤細胞株FK2A6A6。

在一實施例中，本發明係關於在患者中診斷與類澱粉蛋白相關之疾病或病狀的方法，其包含在樣本中或就地偵測如本文中所述之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體與類澱粉蛋白質之抗原決定基的免疫特異結合，該方法包括以下步驟

(a)使懷疑含有類澱粉蛋白質之樣本或特定身體部分或身體區域與根據本發明之抗體接觸，該抗體結合類澱粉蛋白質之構形抗原決定基；(b)使抗體結合類澱粉蛋白質以形成免疫複合物；(c)偵測免疫複合物之形成，尤其以便使免疫複合物之存在或不存在與類澱粉蛋白質之存在或不存在關聯；及(d)將免疫複合物之存在或不存在與樣本或特定身體部分或區域中類澱粉蛋白質之存在或不存在關聯。

在一特定實施例中，步驟(a)之組合物包含用於治療該患者之抗體之組合。

在一實施例中，提供測定組織中之類澱粉蛋白生成斑塊負荷程度之方法，其包含 (a)獲得代表正研究之組織之樣本；(b)用根據本發明且如本文中所述之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體測試該樣本中類澱粉蛋白斑塊之存在情況；(c)測定與樣本結合之抗體量，尤其以便使免疫複合物之存在或不存在與類澱粉蛋白斑塊之存在或不存在關聯；及(d)計算組織中之斑塊負荷。

在一實施例中，提供在患者中診斷與類澱粉蛋白相關之疾病或病狀之素因的方法，其包含在樣本中或就地偵測如本文中所述之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體與類澱粉蛋白質之抗原決定基的特異結合，該方法包括以下步驟

(a)使懷疑含有類澱粉蛋白質之樣本或特定身體部分或身體區域與抗體接觸，其中該抗體結合類澱粉蛋白質之構形抗原決定基；(b)使抗體結合樣本中之任何類澱粉蛋白質以形成免疫複合物；(c)偵測免疫複合物之形成；(d)將免疫複合物之存在或不存在與樣本或特定身體部分或區域中類澱粉蛋白質之存在或不存在關聯；及(e)將該免疫複合物之量與正常對照值比較，其中與正常對照值比較，該複合物之量之增加表明該患者罹患類澱粉蛋白相關之疾病或病狀或處於發展與類澱粉蛋白相關之疾病或病狀之風險中。

在一實施例中，提供用於在用根據本發明之抗體或組合物治療後在患者中監測最小殘留疾病之方法，其中該方法包含：(a)使懷疑含有類澱粉蛋白質之樣本或特定身體部分或身體區域與根據本發明且如本文中所述之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體接觸，該抗體結合類澱粉蛋白質之構形抗原決定基；(b)使抗體結合類澱粉蛋白質以形成免疫複合物；(c)偵測免疫複合物之形成；(d)將免疫複合物之存在或不存在與樣本或特定身體部分或區域中類澱粉蛋白質之存在或不存在關聯；及(e)將該免疫複合物之量與正常對照值比較，其中與正常對照值比較，該複合物之量之增加表明該患者仍罹患最小殘留疾病。

在一實施例中，提供用於預測用根據本發明之抗體或組合物治療之患者之反應性的方法，其包含(a)使懷疑含有類澱粉蛋白質之樣本或特定身體部分或身體區域與根據本發明且如本文中所述之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體接觸，該抗體結合類澱粉蛋白質之構形抗原決定基；(b)使抗體結合類澱粉蛋白抗原以形成免疫複合物；(c)偵測免疫複合物之形成； (d)將免疫複合物之存在或不存在與樣本或特定身體部分或區域中類澱粉蛋白質之存在或不存在關聯；及(e)比較治療開始之前及之後該免疫複合物的量，其中該免疫複合物之量之減少表明該患者具有對治療起反應之高潛力。

在一實施例中，本發明係關於用於偵測及診斷與類澱粉蛋白相關之疾病及病狀之測試套組，其包含根據本發明且如本文中所述之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體，及關於使用該抗體以用於結合類澱粉蛋白質以形成免疫複合物及偵測免疫複合物之形成以便使免疫複合物之存在或不存在與類澱粉蛋白質之存在或不存在關聯之目的的說明書。

本發明之該等及其他目的、特徵及優點將在評論所揭示實施例之以下實施方式及附加申請專利範圍後變得顯而易見。

定義

如本文中所使用之術語"多肽"、"肽"及"蛋白質"可互換，且定義為意謂由藉由肽鍵連接之胺基酸構成之生物分子。

如本文中所使用之術語"一"及"該"定義為意謂"一或多個"，且除非情況不適用，否則包括複數。

如本文中所使用之術語"偵測"或"經偵測"意謂使用諸如免疫化學或組織學方法之已知技術來偵測生物分子，且係指定性或定量測定研究中之生物分子的存在或濃度。

"類澱粉蛋白β、Aβ或β－類澱粉蛋白"為此項技術中認可之術語且係指類澱粉蛋白β蛋白質及肽、類澱粉蛋白β前驅蛋白(APP)以及其修飾物、片段及任何功能相等物。如本文中所使用，類澱粉蛋白β係指藉由APP之蛋白水解分裂而產生之任何片段，尤其為類澱粉蛋白病理所涉及或與其相關之彼等片段，包括(但不限於)Aβ_1－38 、Aβ_1－39 、Aβ_1－40 、Aβ_1－41 、Aβ_1－42 及Aβ_1－43 。

如上所述之類澱粉蛋白β肽之結構及序列為熟習此項技術者所熟知，且產生該等肽或將其自腦及其他組織提取之方法描述於(例如)Glenner及Wong,Biochem Biophys Res Comm 129,885－890(1984)。此外，類澱粉蛋白β肽亦以各種形式市售。

"Aβ原纖維"或"Aβ纖維絲"或"類澱粉蛋白原纖維"為形成具有恆定纖維直徑之個別或成束纖維的單體蛋白之聚合形式，其不溶於水性介質且其核中含有大量交叉β結構；大部分具有垂直於原纖維軸之β股。

"單體Aβ"或"Aβ單體"為在水性介質中完全溶解而無聚集複合物之類澱粉蛋白β蛋白質。

如本文中所使用之"基原纖維"或"基原纖維製劑"係指聚合Aβ類澱粉蛋白肽之較高分子量部分，其富集可溶性類澱粉蛋白Aβ寡聚物。

"聚合可溶性類澱粉蛋白"及"寡聚類澱粉蛋白肽Aβ"及"Aβ寡聚物"在本文中可互換使用，且係指形成寡聚或聚合結構之類澱粉蛋白肽或類澱粉狀蛋白肽或經修飾或截斷類澱粉蛋白肽或類澱粉蛋白肽之其他衍生物之多聚集單體，其在活體外可溶於水性介質中且在活體內可溶於哺乳動物或人體中，更尤其可溶於腦中；尤其係指類澱粉蛋白肽或經修飾或截斷類澱粉蛋白肽或其衍生物之多聚集單體，其可溶於哺乳動物或人體中，更尤其可溶於腦中。

"聚合可溶性類澱粉蛋白Aβ肽"及"寡聚類澱粉蛋白Aβ肽"及"Aβ寡聚物"在本文中可互換使用，且係指形成寡聚或聚合結構之類澱粉蛋白Aβ肽或經修飾或截斷類澱粉蛋白Aβ肽或類澱粉蛋白Aβ肽之其他衍生物之多聚集單體，其在活體外可溶於水性介質中且在活體內可溶於哺乳動物或人體中，更尤其可溶於腦中；尤其係指類澱粉蛋白β(Aβ)肽或經修飾或截斷類澱粉蛋白β(Aβ)肽或其衍生物之多聚集單體，其可溶於哺乳動物或人體中，更尤其可溶於腦中。

就包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體而言，該抗體結合Aβ單體肽1－40，尤其結合Aβ單體肽1－40及包含多個Aβ1－42單體肽之可溶性聚合及/或寡聚類澱粉蛋白肽，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及與單體肽1－42之中等結合且基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合；"實質上較弱結合"意謂結合小於與Aβ單體肽1－40之結合至少約80%、尤其至少約85%、更尤其至少約90%、尤其至少約95%。

就包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體而言，該抗體結合Aβ單體肽1－42及包含多個Aβ_1－42 單體肽之聚合可溶性Aβ肽及併有多個該等聚合肽之Aβ原纖維或纖維，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合且基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合；"實質上較弱結合"意謂結合小於與Aβ單體肽1－42之結合至少約60%、尤其至少約65%、更尤其至少約70%、甚至更尤其至少約80%、尤其至少約90%且至多100%。

就包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體而言，該抗體結合Aβ單體肽1－40，尤其結合Aβ單體肽1－40及包含多個Aβ1－42單體肽之可溶性聚合及/或寡聚類澱粉蛋白肽，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及與單體肽1－42之中等結合且基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合；"實質上較弱結合"意謂結合小於與Aβ單體肽1－40之結合至少約60%、尤其至少約65%、更尤其至少約70%、甚至更尤其至少約80%。

就包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體而言，該抗體結合Aβ單體肽1－40，尤其結合Aβ單體肽1－40及包含多個Aβ1－42單體肽之可溶性聚合及/或寡聚類澱粉蛋白肽，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合及與單體肽1－42之中等結合且基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合；"實質上較弱結合"意謂結合小於與Aβ單體肽1－40之結合至少約95%、尤其至少約98%、尤其至少約99%且至多100%。

就包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體而言，該抗體結合Aβ單體肽1－42及包含多個Aβ_1－42 單體肽之聚合可溶性Aβ肽及併有多個該等聚合肽之Aβ原纖維或纖維，但展示與Aβ單體肽1－28之實質上較弱結合且基本上不展示與Aβ單體肽17－40之結合；"實質上較弱結合"意謂結合小於與Aβ單體肽1－42之結合至少約85%、尤其至少約90%、更尤其至少約95%、甚至更尤其至少約98%、尤其至少約99%且至多100%。

根據本發明且如本文中所述之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體與Aβ單體肽之結合係藉由ELISA型檢定、尤其藉由使用生物素標記Aβ單體肽之ELISA檢定、尤其藉由如下文實例1.16及2.16中所述之ELISA檢定來測定。

"經分離"意謂生物分子不含至少一些與其一起天然存在之組份。

術語"由類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質引起或與其相關之疾病及病症"包括(但不限於)藉由單體、原纖維或聚合狀態或三者之任何組合之類澱粉狀蛋白質的存在或活性引起的疾病及病症。該等疾病及病症包括(但不限於)澱粉樣變性病、內分泌腫瘤及黃斑退化。

術語"澱粉樣變性病"係指一群與類澱粉蛋白斑塊形成相關之疾病及病症，包括(但不限於)繼發性澱粉樣變性病及與年齡相關之澱粉樣變性病，諸如包括(但不限於)以下各病之疾病：神經學病症，諸如阿茲海默氏病(AD)，包括以認知記憶能力損失為特徵之疾病或病狀，諸如輕度認知障礙(MCI)、路易體性癡呆、唐氏症候群、遺傳性大腦出血併發澱粉樣變性病(荷蘭型)；關島帕金森－癡呆綜合症；以及基於類澱粉狀蛋白質或與其相關之其他疾病，諸如進行性核上麻痺、多發性硬化症；庫賈氏病、帕金森氏病、HIV相關之癡呆、ALS(肌萎縮性側索硬化)、包涵體肌炎(IBM)、成年發病型糖尿病；及老年心臟澱粉樣變性病，及各種眼睛疾病，包括黃斑退化、與玻璃膜疣相關之視神經病及由於β－類澱粉蛋白沈積引起之白內障。

如本文中所使用之術語"抗體"為此項技術中認可之術語且理解為係指結合已知抗原之分子或分子之活性片段，尤其係指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦即含有免疫特異性結合抗原之結合位點之分子。根據本發明之免疫球蛋白可為任何類型(IgG、IgM、IgD、IgE、IgA及IgY)或類別(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或免疫球蛋白分子之子類。

本發明之範疇內之"抗體"意欲包括單株、多株、嵌合、單鏈、雙特異性或雙有效性、模擬、人類及人化抗體以及其活性片段。結合已知抗原之分子之活性片段的實例包括Fab、F(ab')₂ 、scFv及Fv片段，包括Fab免疫球蛋白表現文庫之產物及任何上述抗體及片段之抗原決定基結合片段。

該等活性片段可藉由許多此項技術中已知之技術自本發明之抗體衍生而來。舉例而言，經純化單株抗體可用諸如胃蛋白酶之酶來分裂，且使其經受HPLC凝膠過濾。可隨後收集含有Fab片段之適當溶離份且藉由膜過濾及其類似方法來濃縮。對用於分離抗體活性片段之通用技術的進一步描述，參見(例如)Khaw,B.A.等人J.Nucl.Med.23：1011－1019(1982)；Rousseaux等人Methods Enzymology,121：663－69,Academic Press,1986。

"人化抗體"係指一類工程改造抗體，其具有衍生自非人類供體免疫球蛋白之CDR，該分子之剩餘免疫球蛋白衍生部分衍生自一個(或多個)人免疫球蛋白。另外，框架支撐殘基可經改變以保存結合親和力。獲得"人化抗體"之方法為熟習此項技術者所熟知。(參見(例如)Queen等人，Proc.Natl Acad Sci USA,86：10029－10032(1989)；Hodgson等人，Bio/Technology,9：421(1991))。

"人化抗體"亦可藉由新穎遺傳工程改造途徑獲得，該途徑使親和力成熟似人類多株抗體能在例如兔之大型動物中產生(參見(例如)美國專利第7,129,084號)。

術語"單株抗體"亦在此項技術中得到充分認可且係指在實驗室中自單一純系大量產生且僅識別一種抗原之抗體。單株抗體通常藉由將常常短暫存活的產生抗體之B細胞與快速生長細胞(諸如癌細胞)(有時稱為"永生"細胞)融合來製得。所得雜交細胞或融合瘤快速繁殖，產生可產生大量抗體之純系。對於本發明之目的而言，"單株抗體"亦應理解為包含藉由尚未達到完全單株性之母純系產生之抗體。

術語"CDR"係指抗體之高變區。術語"高變區"、"HVR"或"HV"當在本文中使用時，係指序列具有高變性及/或在結構上形成限定環之抗體可變域的區域。通常，抗體包含6個高變區；3個在VH(H1、H2、H3)中且3個在VL(L1、L2、L3)中。本文中使用且涵蓋許多高變區描述。Kabat互補判定區係基於序列可變性且最常用(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版。Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。

術語"CDR"之前的字母"HC"及"LC"分別係指重鏈及輕鏈之CDR。Chothia取而代之係指結構環之位置(Chothia及Lesk J.Mol.Biol.196：901－917(1987))。AbM高變區表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且藉由Oxford Molecular's AbM抗體模型化軟體使用。"接觸"高變區係基於可用複雜晶體結構之分析。來自該等高變區之各者之殘基註釋於下文。

高變區可包含如下之"擴展高變區"：VL中之24－36或24－34(L1)、46－56或50－56(L2)及89－97或89－96(L3)，及VH中之26－35(H1)、50－65或49－65(H2)及93－102、94－102或95－102(H3)。對該等定義之各者而言，可變域殘基係根據Kabat等人(同上)來編號。

術語"按Kabat中編號之可變域殘基"或"按Kabat中編號之胺基酸位置"及其變化形式係指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中用於抗體編輯之重鏈可變域或輕鏈可變域之編號系統。

使用該編號系統，實際直鏈胺基酸序列可含有與可變域之FR或HVR之縮短或插入對應的較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括H2之殘基52之後的單一胺基酸插入物(根據Kabat之殘基52a)及重鏈FR殘基82之後的插入殘基(例如，根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。可藉由在抗體序列之具有同源性之區域處與"標準"Kabat編號序列比對來確定給定抗體之殘基之Kabat編號。

在本發明之範疇內，"功能相等抗體"理解為係指與抗體實質上共有至少一種主要功能性質(例如本文中所述之功能性質)之抗體，該等功能性質包括(但不限於)：與β－類澱粉蛋白質、尤其與Aβ_1－42 蛋白質且更尤其與Aβ_1－42 蛋白質之4－16抗原決定區之結合特異性；活體外免疫反應性；抑制Aβ_1－42 單體聚集成高分子聚合原纖維及/或預形成 Aβ1－42聚合原纖維之解聚；及/或β－摺疊片斷裂性質；及當預防性或治療性投與時，減輕由類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質引起或與其相關之疾病及病症之影響，該等疾病及病症包括(但不限於)澱粉樣變性病、內分泌腫瘤及黃斑退化。抗體可為任何類別(諸如IgG、IgM或IgA等)或任何子類(諸如IgG1、IgG2a等及本文中所述或此項技術中已知之其它子類，尤其為IgG4類)。另外，抗體可藉由任何方法(諸如噬菌體呈現)產生，或可在任何生物體或細胞株中產生，包括細菌、昆蟲、哺乳動物或產生具有所要特徵之抗體(諸如人化抗體)的其它類型之細胞或細胞株。抗體亦可藉由組合來自不同物種之Fab部分及Fc區來形成。

術語"雙特異性"或"雙功能"及"雙有效性"在本申請案之範疇內同義使用，以表徵展現對類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白纖維形成之抑制性質及類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白纖維之解聚性質的抗體。

術語"抗原"係指可在生物體、尤其動物、更尤其哺乳動物(包括人類)體內誘導免疫反應之實體或其片段。該術語包括免疫原及其負責抗原性或抗原決定子之區域。

如本文中所使用，術語"可溶"意謂部分或完全溶解於水溶液中。

亦如本文中所使用，術語"免疫原性"係指引出或增強針對免疫原性劑之抗體、T細胞或其它反應性免疫細胞之產生且促進人類或動物體內之免疫反應的物質。

當個體針對所投與之本發明之免疫原性組合物產生足夠的抗體、T細胞及其它反應性免疫細胞時，發生免疫反應以緩解或減輕待治療之病症。

"聚合可溶性類澱粉蛋白"係指形成寡聚或聚合結構之類澱粉蛋白肽或類澱粉狀蛋白肽或經修飾或截短之類澱粉蛋白肽或類澱粉蛋白肽之其他衍生物之多聚集單體，其可溶於哺乳動物或人體中、更尤其腦中，尤其係指類澱粉蛋白β(Aβ)或經修飾或截短之類澱粉蛋白β(Aβ)肽或其衍生物之多聚集單體，其可溶於哺乳動物或人體中、更尤其腦中。

術語"融合瘤"在此項技術中得到認可且熟習此項技術者應瞭解其係指藉由將抗體產生細胞與永生細胞(例如多發性骨髓瘤細胞)融合而產生之細胞。該雜交細胞能夠產生抗體之連續供應。關於一種此項技術中已知之融合方法之更詳細描述，參見上文"單株抗體"之定義及下文之實例。

如本文中所使用，術語"載體"意謂抗原肽或超分子構築體可併入其中或可與其締合，進而將抗原肽或肽部分呈現或暴露於人類或動物之免疫系統的結構。在本發明之情況中，可適用於動物或人類療法中之任何粒子(諸如微脂粒、粒子或微粒體)均可用作載體。該術語另外包含傳遞方法，其中可將包含抗原肽之超分子抗原構築體組合物藉由傳遞機制傳送至所要位點。該傳遞系統之一實例利用膠態金屬，諸如膠態金。術語"載體"另外包含熟習此項技術者已知之傳遞機制，包括(但不限於)匙孔螺血氰蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)及其它佐劑。

在根據本發明之超分子抗原構築體中，脂質體可具有雙重功能，因為其可用作包含如本文中所述之超分子構築體之載體，同時其起增加或刺激欲用根據本發明之治療疫苗來治療之標靶動物或人類體內的免疫反應的佐劑作用。亦應瞭解，本發明之超分子抗原構築體組合物可另外包含額外佐劑，諸如脂質A、礬、磷酸鈣、介白素1及/或多醣及蛋白質之微膠囊，尤其為去毒脂質A，諸如單磷醯基或二磷醯基脂質A，或礬；其他防腐劑、稀釋劑、乳化劑、穩定劑及此項技術中已知且用於疫苗中之其他組份。此外，此項技術中已知之任何佐劑系統可用於本發明之組合物中。該等佐劑包括(但不限於)佛氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant)、佛氏完全佐劑、多分散β－(1,4)連接乙醯化甘露聚糖("Acemannan")、TITERMAX(來自CytRx Corporation之聚氧化乙烯－聚氧化丙烯共聚物佐劑)、來自Chiron Corporation之經修飾脂質佐劑、來自Cambridge Biotech之皂素衍生物佐劑、死百日咳博德氏桿菌(Bordetella pertussis )、革蘭氏陰性菌之脂多醣(LPS)、諸如硫酸葡聚糖之大聚合陰離子及諸如礬、氫氧化鋁或磷酸鋁之無機凝膠。

可用於本發明之超分子抗原構築體組合物中之載體蛋白包括(但不限於)麥芽糖結合蛋白"MBP"；牛血清白蛋白"BSA"；匙孔螺血氰蛋白"KLH"；卵白蛋白；鞭毛蛋白；甲狀腺球蛋白；任何物種之血清白蛋白；任何物種之γ球蛋白；同源細胞；具有Ia抗原之同源細胞；及D－及/或L－胺基酸之聚合物。

另外，術語"治療有效量"係指在投與人類或動物時在該人或動物體內引出足以產生治療效應之免疫反應的抗體之量。有效量容易藉由熟習此項技術者按照常規程序來確定。

兩個序列之間的"同源性"藉由序列同一性來測定。若欲彼此比較之兩個序列長度不同，則序列同一性較佳涉及與較長序列之核苷酸殘基相同之較短序列之核苷酸殘基的百分比。序列同一性可習知地藉助於諸如Bestfit程式(Wisconsin Sequence Analysis Package，用於Unix之第8版，Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive Madison,WI 53711)之電腦程式來測定。Bestfit利用Smith及Waterman,Advances in Applied Mathematics 2(1981),482－489之局部同源性算法，以尋找在兩個序列之間具有最高序列同一性之區段。當使用Bestfit或另一序列校準程式以確定特定序列是否與本發明之參考序列具有(例如)95%同一性時，較佳調整參數以便在參考序列之整個長度範圍內計算同一性百分比且在參考序列中允許至多為聚核苷酸總數之5%之同源性間隙。當使用Bestfit時，所謂的任選參數較佳保留在其預置值("預設值")。在給定序列與本發明之上述序列之間的比較中出現的偏差可(例如)藉由添加、缺失、取代、插入或重組而引起。該序列比較亦可較佳用程式"fasta20u66"(第2.0u66版，1998年9月，William R.Pearson及the University of Virginia；亦參見W.R.Pearson(1990),Methods in Enzymology 183,63－98，附加實例及httP：//workbench.sdsc.edu/)來進行。對該目的而言，可使用"預設"參數設定。

如本文中所使用，"保守性改變"係指為實質上構形性或抗原性中性之改變，與天然蛋白質相比，其分別在突變多肽之三級結構中產生最小改變，或在突變多肽之抗原決定子中產生最小改變。當提及本發明之抗體及抗體片段時，保守性改變意謂不會使抗體不能與主體受體結合之胺基酸取代。熟習此項技術者將能預測在維持構形性及抗原性中性之高機率的同時可進行何種胺基酸取代。該指導提供(例如)於Berzofsky,(1985)Science 229：932－940及Bowie等人(1990)Science 247：1306－1310中。欲視為影響維持構形及抗原中性之機率之因素包括(但不限於)：(a)疏水性胺基酸之取代較少可能影響抗原性，因為疏水性殘基很可能位於蛋白質之內部；(b)生理化學相似胺基酸之取代較少可能影響構形，因為經取代胺基酸在結構上模擬天然胺基酸；及(c)進化性保守序列之改變可能不利地影響構形，因為該保守暗示胺基酸序列可具有功能重要性。熟習此項技術者將能使用熟知檢定來評估蛋白質構形之改變，諸如(但不限於)微量補體固定方法(參見(例如)Wasserman等人(1961)J.Immunol.87：290－295；Levine等人(1967)Meth.Enzymol.11：928－936)及經由使用構形依賴性單株抗體之結合研究(參見(例如)Lewis等人(1983)Biochem.22：948－954)。

如本文中所使用之術語"雜交"係指習知雜交條件，較佳係指5xSSPE、1% SDS、1xDenhardts溶液用作溶液及/或雜交溫度在35℃與70℃之間、較佳為65℃之雜交條件。雜交後，在35℃與70℃之間的溫度下、較佳在65℃下，較佳先用2xSSC、1% SDS且隨後用0.2xSSC進行洗滌(關於SSPE、SSC及Denhardts溶液之定義，參見Sambrook等人Molecular Biology：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York,1989)。(例如)描述於Sambrook等人(同上)中之嚴格雜交條件尤其較佳。若如上文所指示，在65℃下進行雜交及洗滌，則(例如)實現尤其較佳之嚴格雜交條件。(例如)在45℃下進行雜交及洗滌之非嚴格雜交條件次較佳且在35℃下甚至更次。

藉由參考本文所包括之特定實施例之以下實施方式，可更容易理解本發明。雖然已參考本發明之某些實施例之特定細節描述本發明，但並非意欲將該等細節視為對本發明之範疇的限制。

本發明提供抗體及其功能部分，其為構形敏感抗體。該等抗體識別多種類澱粉蛋白質抗原上之特定抗原決定基。抗體適用於在由類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質引起或與其相關之疾病及病症中且尤其在阿茲海默氏病中的診斷及治療干預。

抗體可投與至個體以將其被動免疫來抵抗由類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質引起或與其相關之各種疾病及病症，諸如阿茲海默氏病。

本文中提供之抗體為單株或多株抗體，其對涉及由類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質引起或與其相關之各種疾病及病症(諸如阿茲海默氏病)之引發、進程及/或惡化的抗原肽具有結合特異性。

藉由用超分子抗原構築體組合物將動物(諸如小鼠、大鼠、兔或可產生天然或人類抗體之任何其他動物物種)免疫來製備根據本發明之抗體。

如本文中所揭示之超分子抗原構築體通常包含經修飾以增強抗原效應之肽，其中該等肽經由聚乙二醇化(使用聚乙二醇或經修飾之聚乙二醇)修飾，或經由其它方法(諸如，經棕櫚酸、聚胺基酸(例如聚甘胺酸、聚組胺酸)、多醣(例如聚半乳糖醛酸、聚乳酸、聚乙交酯、甲殼素、聚葡萄胺糖)、合成聚合物(聚醯胺、聚胺基甲酸酯、聚酯)或共聚物(例如，聚(甲基丙烯酸)及N－(2－羥基)丙基甲基丙烯醯胺)及其類似物)修飾。

雖然在脂質體雙層中向肽提供錨定物，但棕櫚酸所進行之修飾(棕櫚醯化)由於C_16：0 脂肪酸部分之相對縮短之長度而導致肽實際上位於脂質體表面上。因此，處理抗原之細胞必須吸收具有肽之整個脂質體，其在大多數情況下導致相對其而言之較慢免疫反應。

在本發明之一實施例中，經修飾類澱粉蛋白Aβ_22－35 肽及Aβ_29－40 肽分別用於製備抗體、尤其根據本發明之單株抗體。

在本發明之一實施例中，經修飾類澱粉蛋白Aβ_1－15 肽用於製備抗體、尤其根據本發明之單株抗體。

經修飾類澱粉蛋白Aβ_1－15 肽可按照Nicolau等人2002中報導之方法來合成。Nicolau等人中報導之方法涉及藉由親脂性或疏水性部分與預形成肽之末端胺基酸殘基之樹脂上接枝來修飾抗原肽，產生具有顯著高純度之產物。詳言之，使用已知偶合化學使經保護之胺基酸、尤其經Fmoc保護之胺基酸連接於樹脂。移除保護基且偶合第二經保護胺基酸殘基。隨後，使用已知保護化學(尤其Fmoc/tBu化學)及標準側鏈保護基之標準自動肽合成用以藉由分別偶合於類澱粉蛋白質Aβ_1－42 之胺基酸22至25、29至40及1至15上以產生肽片段從而合成Aβ抗原肽。在最終步驟中，使兩個其他經保護胺基酸偶合至生長中之肽片段上。隨後可選擇性分裂Mtt基團且使其偶合至棕櫚酸。洗滌樹脂後，移除保護基且同時分裂樹脂，隨後使用標準方法進行側鏈去保護。隨後可獲得高純度之最終產物且藉由此項技術中已知之方法(諸如電噴霧質譜法)確認其同一性。

根據本發明之親脂性或疏水性部分可為脂肪酸、三甘油酯或磷脂，其中脂肪酸碳主鏈具有至少10個碳原子。特定而言，親脂性或疏水性部分為碳主鏈具有至少約14個碳原子且至多約24個碳原子之脂肪酸，在該範圍內之各個別碳原子數亦為本發明之部分。更特定而言，親脂性或疏水性部分具有至少14個碳原子之碳主鏈。疏水性部分之實例包括(但不限於)棕櫚酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸、油酸、亞麻油酸、次亞麻油酸及膽固醇或DSPE。在本發明之一特定實施例中，親脂性或疏水性部分為棕櫚酸。

為增強免疫反應，可適當應用另一錨定物/間隔物以重構脂質體中之肽，例如聚乙二醇(PEG)。

將PEG共價連接至肽之兩末端處所結合之胺基酸殘基，尤其是Glu、Cys或Lys胺基酸殘基或可適用於使PEG共價結合至肽之任何其他胺基酸殘基。在鏈之另一端，可共價結合疏水性部分以起到脂質體雙層中之錨定元件作用，例如磷脂醯基乙醇胺(PEA)。因此，脂質體仍起佐劑作用且足夠遠離雙層之肽可經單獨處理，且因此與棕櫚醯化抗原相比增加其免疫原性。

在某些實施例中，本發明之範疇內所使用之超分子抗原構築體包含共價連接於聚乙二醇化離胺酸(各末端一個)之肽序列。PEG(聚乙二醇)鏈之長度可自n＝8變化至n＝150,000或150,000以上，尤其自n＝10變化至n＝80,000，更尤其自n＝20變化至n＝10,000。在本發明之一特定實施例中，PEG鏈之長度不超過n＝45，尤其在n＝5與n＝40之間，更尤其在n＝10與n＝30之間且甚至更尤其n＝10。

本文中所述之超分子構築體可使用自動肽合成及已知保護化學、尤其Fmoc/tBu化學及標準側鏈保護基來合成。通常，肽之聚乙二醇化產生區位異構體之混合物。

為達成PEG－脂質結合物與Aβ之C－及N－末端之位點特異性連接，可使用經部分保護之肽。對於含有內部Lys或His殘基之彼等肽序列而言，將經正交保護之Lys(ivDde)添加至各末端。可將額外Gly添加至C－末端以幫助合成。移除保護基團且使用乙酸酐進行N－乙醯化，接著選擇性分裂ivDde基團。

樹脂、尤其2－氯三苯甲基樹脂為有利的，其為酸敏感性的且因此使經保護之肽能夠分離。

在本發明之一特定實施例中，偶合反應在溶液相中執行。隨後在溫和條件下自樹脂之選擇性分裂釋放內部經保護之肽。

用分別得自諸如Aβ_22－35 及Aβ_29－40 或Aβ_1－15 之β－類澱粉蛋白質序列之肽成功地實現與經脂肪酸－磷脂醯膽鹼(諸如DSPE)修飾之PEG分子的溶液相偶合。最終側鏈去保護前之單偶合產物及雙偶合產物的分離可藉由使用陽離子交換層析法來達成。後續肽側鏈去保護引起具有可接受之純度的所要結合物之分離。可藉由此項技術中熟知之方法(諸如HPLC等)達成純化。

使用經保護之肽合成N－末端及C－末端脂質－PEGβ－類澱粉蛋白抗原之該方法可適用於多種肽序列。

根據本發明之脂質體抗原可隨後如Nicolau等人，2002中所述來製備。經修飾類澱粉蛋白Aβ抗原肽、尤其經修飾聚乙二醇化Aβ_22－35 及Aβ_29－40 抗原肽或棕櫚醯化Aβ_1－15 抗原肽可重構於由脂質體組成之構築體中，該等脂質體尤其為由二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPEA)、二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油(DMPG)及視需要含有單磷醯基脂質A之膽固醇製得之脂質體。

在本發明之一特定實施例中，使用具有脂質A之脂質體作為佐劑來製備抗類澱粉蛋白疫苗。將雙肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼、雙肉豆蔻醯磷脂醯甘油及膽固醇尤其以0.9：1.0：0.7之莫耳比率混合。隨後以適合濃度，尤其以30與50mg/mmol之間的濃度，更尤其以40 mg/mmol磷脂之濃度添加強免疫調節劑，諸如單磷醯基脂質A。隨後，以在1：30與1：200之間的肽與磷脂莫耳比率，尤其以在1：1000、1：50與1：120之間的莫耳比率，更尤其以1：100之莫耳比率添加經修飾抗原Aβ肽。(例如)經由蒸發移除溶劑，且使所得薄膜與諸如PBS之無菌緩衝溶液水合。

亦可藉由如(例如)Wagner等人(2002)Journal of Liposome Research第12(3)卷，第259－270頁中所述之交叉流動注射技術來製備脂質體。在將脂質溶液注射至水性緩衝系統中期間，脂質趨向於形成"沈澱物"，接著在微脂粒中自身排列。所得微脂粒尺寸視諸如脂質濃度、攪拌速率、注射速率及脂質選擇之因素而定。製備系統可由交叉流動注射模組、極性相(例如PBS緩衝溶液)之容器、乙醇/脂質溶液容器及壓力裝置(尤其為氮壓力裝置)組成。在經由交叉流動注射模組泵抽水性或極性溶液的同時，在施加變化壓力下將乙醇/脂質溶液注射入極性相中。

脂質體仍起佐劑作用且足夠遠離雙層之肽可經單獨處理，且因此與棕櫚醯化抗原相比增加其免疫原性。

游離PEG末端共價連接於磷脂醯基乙醇胺分子(其中脂肪酸可為肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸等或其組合)以起錨定元件作用。可藉由在由磷脂及膽固醇(呈各種莫耳比率之磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、膽固醇)組成之脂質體中重構來錨定該超分子結構。可使用其他磷脂。以約40 μg/μmole磷脂之濃度使用脂質A。

在某些實施例中，棕櫚醯化或聚乙二醇化超分子抗原構築體包含具有β－類澱粉蛋白之胺基酸序列的肽。該等肽亦可包含或對應於整個類澱粉蛋白β肽及其活性片段。另外，適用於本發明之肽尤其分別包含Aβ_22－35 及Aβ_29－40 或Aβ_1－15 及其活性片段。

為引出及製備抗體且為測定經修飾Aβ抗原構築體之免疫原性，用抗原肽將選自由以下動物組成之群的適合動物免疫：小鼠、大鼠、兔、豬、鳥等，尤其為小鼠，尤其為C57BL/6小鼠。藉由在免疫後以適合時間間隔使用免疫檢定(諸如ELISA檢定)探測血清樣本來測定抗原構築體之免疫原性。

本發明之單株抗體可使用此項技術中熟知之經典選殖及細胞融合技術來製備。通常將所關注之免疫原(抗原)投與(例如腹膜內注射)野生型或近親交配小鼠(例如BALB/c或尤其C57BL/6小鼠)、大鼠、兔或其他動物物種或可產生天然或人類抗體之轉殖基因小鼠。免疫原可單獨投與，或與佐劑混合，或自載體(VEE複製子載體、牛痘)表現，或表現為DNA，或表現為融合蛋白質以誘導免疫反應。融合蛋白質包含針對其需要免疫反應之肽，其偶合至載體蛋白，諸如β－半乳糖苷酶、麩胱甘肽S－轉移酶、匙孔螺血氰蛋白(KLH)及牛血清白蛋白。在該等狀況下，肽用作具有載體蛋白之半抗原。將動物加強(例如)兩次或兩次以上後，自所免疫動物收穫脾細胞且使用Kohler及Milstein(Nature 256：495－497(1975))及Harlow及Lane(Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,New York 1988))之熟知方法，藉由將敏化脾細胞與骨髓瘤細胞株(諸如鼠SP2/O骨髓瘤細胞(ATCC,Manassas,VA))融合來產生融合瘤。

在本發明之一特定實施例中，將根據本發明之抗原構築體、尤其為呈醫藥學上可接受之形式的包含該抗原構築體之疫苗組合物以在1與10週之間的時間間隔、尤其以在1與6週之間的時間間隔、更尤其以在1與4週之間的時間間隔且甚至更尤其以2與3週之間的時間間隔，以重複劑量、尤其以1至15次劑量、更尤其以2至10次劑量、甚至更尤其以3至7次劑量、尤其以4至6次劑量來投與。藉由在加強後之適合時間、尤其加強後3至10天、更尤其加強後4至8天且更尤其加強後5至6天採集血清樣本且使用已知方法，尤其為通常所用之免疫檢定之一(諸如ELISA檢定)測定抗原構築體之免疫原性來監測免疫反應。

用根據本發明之抗原構築體、尤其用呈醫藥學上可接受之形式的包含根據本發明之抗原構築體之疫苗組合物免疫會在所治療動物中引起顯著免疫反應。選擇具有治療效價之動物、尤其小鼠用於抗體產生細胞、尤其B－淋巴細胞與連續生長或永生細胞株(諸如骨髓瘤細胞株)之融合。藉由添加聚乙二醇誘導細胞融合。治療效價為在ELISA檢定中以1：4000與1：6000之間、尤其1：4500與1：5500之間的稀釋率、更尤其以1：5000之稀釋率得到陽性結果之彼等效價。

隨後以習知方式(例如使用限制稀釋)選殖所得雜交細胞，且培養所得純系，其產生所要單株抗體。

藉由將細胞塗在含有次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(HAT)之選擇培養基中來化學選擇由此獲得之融合瘤。

隨後根據產生針對特定類澱粉蛋白相關疾病或病症之單株抗體之能力來篩選融合瘤。選殖產生所關注抗體之融合瘤，使其繁殖且冷凍儲存以用於未來生產。較佳融合瘤產生具有IgG同型之單株抗體。

藉由用本文中所述之本發明之超分子抗原構築體組合物將動物(諸如小鼠或兔或任何其他適合動物)免疫來製備多株抗體。隨後自動物收集血清，且根據針對類澱粉蛋白質之結合反應性來篩選血清中之抗體。

可使用已知技術將根據本發明之抗體製備成生理學上可接受之調配物且其可包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑。舉例而言，將根據本發明且如本文中所述之包括任何功能相等抗體或其功能部分之抗體、尤其包括任何功能相等抗體或其功能部分之單株抗體與醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑組合以形成治療組合物。適合醫藥載劑、稀釋劑及/或賦形劑在此項技術中熟知，且包括(例如)磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)、各種類型之濕潤劑、無菌溶液等。

根據本發明之醫藥組合物之調配可根據熟習此項技術者已知之標準方法來完成。

可將本發明之組合物以固體、液體或氣溶膠形式，以適合的醫藥學上有效之劑量投與個體。固體組合物之實例包括丸劑、乳膏及可植入劑量單元。丸劑可經口投與。治療乳膏可局部投與。可植入劑量單元可局部投與(例如在腫瘤位點處)或可經植入用於全身釋放治療組合物(例如皮下)。液體組合物之實例包括適於肌肉內、皮下、靜脈內、動脈內注射之調配物及用於局部及眼內投藥之調配物。氣溶膠調配物之實例包括用於對肺投藥之吸入調配物。

可藉由標準投藥途徑投與組合物。一般而言，可藉由局部、口服、直腸、鼻部、真皮內、腹膜內或非經腸(例如靜脈內、皮下或肌肉內)途徑投與組合物。另外，可將組合物併入持續釋放基質中，諸如生物可降解聚合物，將該聚合物在需要傳遞之位置(例如腫瘤位點)附近植入。該方法包括單劑量投藥、以預定時間間隔重複劑量投藥及持續投藥歷時預定時間段。

如本文中所使用，持續釋放基質為由通常為可經酶促或酸/鹼水解或經溶解而降解之聚合物之材料製成的基質。一旦插入體內，基質就受酶及體液作用。持續釋放基質理想選擇為可生物相容之材料，諸如脂質體、聚丙交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸之聚合物)、聚丙交酯共乙交酯(乳酸與乙醇酸之共聚物)、聚酸酐、聚(原酸)酯、多肽、玻尿酸、膠原蛋白、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多醣、核酸、聚胺基酸、胺基酸(諸如苯丙胺酸、酪胺酸、異白胺酸)、聚核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯啶酮及聚矽氧。較佳的可生物降解基質為具有聚丙交酯、聚乙交酯或聚丙交酯共乙交酯(乳酸與乙醇酸之共聚物)之一的基質。

熟習此項技術者熟知，組合物之劑量將視各種因素而定，諸如，所治療之病狀、所使用之特定組合物及其它臨床因素，諸如患者體重、體型、性別及一般健康狀況、體表面積、欲投與之特定化合物或組合物、同時投與之其他藥物及投藥途徑。

組合物可與包含生物活性物質或化合物、尤其至少一種選自由以下各物組成之群之化合物的其他組合物，連同根據本發明之抗體及(視需要)醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑及/或賦形劑及用於治療疾病之說明書一起組合投與：抗氧化應力之化合物、抗細胞凋亡之化合物、金屬螯合劑、DNA修復抑制劑(諸如哌侖西平及代謝物)、3－胺基－1－丙烷磺酸(3APS)、1,3－丙烷二磺酸(1,3PDS)、分泌酶活化劑、β－及γ－分泌酶抑制劑、τ蛋白、神經傳遞素、β－片斷裂劑、消炎分子、"非典型精神抑制劑"(諸如氯氮平、齊拉西酮、利培酮、阿立哌唑或奧氮平)或膽鹼酯酶抑制劑(ChEI)(諸如他克林、雷斯替明、多奈哌齊及/或加蘭他敏)及其它藥物及營養補充劑，諸如維生素B12、半胱胺酸、乙醯膽鹼之前驅體、卵磷脂、膽鹼、銀杏(Ginkgo biloba)、乙醯基－L－肉鹼、艾地苯醌(idebenone)、丙戊茶鹼 (propentofylline)或黃嘌呤衍生物。

蛋白質醫藥活性物質可以每劑量1 ng與10 mg之間的量存在。通常，投藥方案應在0.1 μg與10 mg之間的本發明抗體之範圍內，尤其在1.0 μg至1.0 mg之範圍內且更尤其在1.0 μg與100 μg之間的範圍內，該等範圍內之所有個別數量亦為本發明之部分。若投藥經由連續輸注來發生，則更適合之劑量可在每小時每公斤體重0.01 μg與10 mg單位之間的範圍內，該等範圍內之所有個別數量亦為本發明之部分。

投藥通常為非經腸投藥，例如靜脈內投藥。用於非經腸投藥之製劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。非水性溶劑包括(不限於)丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。水性溶劑可選自由以下各物組成之群：水、醇/水性溶液、乳液或懸浮液(包括鹽水及經緩衝介質)。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸林格氏溶液或不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充物、電解質補充物(諸如基於林格氏右旋糖之彼等補充物)及其它物質。亦可存在防腐劑，諸如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。

醫藥組合物可另外包含蛋白質載體，諸如尤其為人類起源之血清白蛋白或免疫球蛋白。視本發明之醫藥組合物的所欲用途而定，其他生物活性劑可存在於本發明之醫藥組合物中。

當結合標靶位於腦內時，本發明之某些實施例提供穿越血腦障壁之抗體或其活性片段。某些神經變性疾病與血腦障壁之滲透性增加相關，以便可容易地將抗體或其活性片段引入腦中。當血腦障壁保持完整時，存在若干運送分子跨越血腦障壁之此項技術中已知之方法，其包括(但不限於)物理方法、基於脂質之方法以及基於受體及通道之方法。

運送抗體或其活性片段跨越血腦障壁之物理方法包括(但不限於)完全繞過血腦障壁或藉由在血腦障壁內產生開口。繞過方法包括(但不限於)直接注射入腦內(參見(例如)Papanastassiou等人，Gene Therapy9：398－406(2002))及將傳遞裝置植入腦內(參見(例如)Gill等人，Nature Med.9：589－595(2003)；及Gliadel Wafers^TM ,Guildford Pharmaceutical)。在障壁中產生開口之方法包括(但不限於)超音(參見(例如)美國專利公開案第2002/0038086號)、滲透壓力(例如，藉由投與高滲壓甘露醇(Neuwelt,E.A.,Implication of the Blood－Brain Barrier and its Manipulation，第1及2卷，Plenum Press,N.Y.(1989)))、藉由(例如)緩激肽或滲透劑A－7之滲透化作用(參見(例如)美國專利第5,112,596、5,268,164、5,506,206及5,686,416號)及用含有編碼抗體或抗原結合片段之基因之載體轉染跨立血腦屏障的神經元(參見(例如)美國專利公開案第2003/0083299號)。

運送抗體或其活性片段跨越血腦障壁之基於脂質之方法包括(但不限於)將抗體或其活性片段囊封於脂質體內，該等脂質體與結合血腦障壁之血管內皮上之受體的其活性片段偶合(參見(例如)美國專利申請公開案第20020025313號)，以及以低密度脂蛋白粒子(參見(例如)美國專利申請公開案第20040204354號)或脂蛋白元E(參見(例如)美國專利申請公開案第20040131692號)塗佈抗體或其活性片段。

運送抗體或其活性片段跨越血腦障壁之基於受體及通道之方法包括(但不限於)使用糖皮質激素阻斷劑以增加血腦屏障之滲透性(參見(例如)美國專利申請公開案第2002/0065259、2003/0162695及2005/0124533號)；活化鉀通道(參見(例如)美國專利申請公開案第2005/0089473號)；抑制ABC藥物轉運體(參見(例如)美國專利申請公開案第2003/0073713號)；用運鐵蛋白塗佈抗體且調節一或多種運鐵蛋白受體之活性(參見(例如)美國專利申請公開案第2003/0129186號)；及將抗體陽離子化(參見(例如)美國專利第5,004,697號)。

在另一實施例中，本發明提供用於偵測及診斷與類澱粉蛋白相關之疾病或病狀、用於診斷與類澱粉蛋白相關之疾病或病狀之素因或用於監測患者之最小殘留疾病或用於預測患者對用根據本發明且如本文中所述之抗體或疫苗組合物治療之反應性的方法及套組。該等方法包括通常用於偵測或定量生物樣本或就地病狀中之物質的已知免疫學方法。

患者之與類澱粉蛋白相關之疾病或病狀或與類澱粉蛋白相關之疾病或病狀之素因的診斷可藉由偵測本發明之抗體、尤其單株抗體或其活性片段與樣本中或就地類澱粉蛋白質之抗原決定基的免疫特異性結合來達成，該偵測包括使懷疑含有類澱粉蛋白質之樣本或特定身體部分或身體區域與結合類澱粉蛋白質之抗原決定基之抗體接觸，使抗體結合類澱粉蛋白質以形成免疫複合物，偵測免疫複合物之形成且使免疫複合物之存在或不存在與樣本或特定身體部分或區域中之類澱粉蛋白質之存在或不存在關聯，視需要將該免疫複合物之量與正常對照值比較，其中與正常對照值相比，該免疫複合物之量之增加表明，該患者罹患類澱粉蛋白相關之疾病或病狀或冒有發展與類澱粉蛋白相關之疾病或病狀之風險。類澱粉蛋白質可呈單體、原纖維及/或聚合形式。抗體或其活性部分可對單體、原纖維及/或聚合形式之類澱粉蛋白質呈特異性。

在用本發明之抗體或疫苗組合物治療之後，監測患者之最小殘留疾病可藉由偵測本發明之抗體、尤其單株抗體或其活性片段與樣本中或就地類澱粉蛋白質之抗原決定基的免疫特異性結合來達成，其包括使懷疑含有類澱粉蛋白質之樣本或特定身體部分或身體區域與結合類澱粉蛋白質之抗原決定基之抗體接觸，使抗體結合類澱粉蛋白質以形成免疫複合物，偵測免疫複合物之形成且使免疫複合物之存在或不存在與樣本或特定身體部分或區域中之類澱粉蛋白質之存在或不存在關聯，視需要將該免疫複合物之量與正常對照值比較，其中與正常對照值相比，該免疫複合物之量之增加表明，該患者仍罹患最小殘留疾病。類澱粉蛋白質可呈單體、原纖維及/或聚合形式。抗體或其活性部分可對單體、原纖維及/或聚合形式之類澱粉蛋白質呈特異性。

預測患者對用根據本發明之疫苗組合物治療之反應性可藉由偵測單株抗體或其活性片段與樣本中或就地類澱粉蛋白質之抗原決定基的免疫特異性結合來達成，其包括使懷疑含有類澱粉蛋白質之樣本或特定身體部分或身體區域與結合類澱粉蛋白質之抗原決定基之抗體接觸，使抗體結合類澱粉蛋白質以形成免疫複合物，偵測免疫複合物之形成且使免疫複合物之存在或不存在與樣本或特定身體部分或區域中之類澱粉蛋白質之存在或不存在關聯，視需要比較治療開始之前及之後該免疫複合物之量，其中該免疫複合物之量之減少指示，該患者具有對治療起反應之高潛力。類澱粉蛋白質可呈單體、原纖維及/或聚合形式。抗體或其活性部分可對單體、原纖維及/或聚合形式之類澱粉蛋白質呈特異性。

可用於診斷與類澱粉蛋白相關之疾病或病狀、用於診斷與類澱粉蛋白相關之疾病或病狀之素因或用於監測患者之最小殘留疾病或用於預測患者對用根據本發明且如本文中所述之抗體或疫苗組合物治療之反應性的生物樣本為(例如)體液，諸如血清、血漿、唾液、胃分泌物、黏液、腦脊髓液、淋巴液及其類似物；或自生物體獲得之組織或細胞樣本，諸如神經、腦、心臟或血管組織。為測定樣本中之類澱粉蛋白質之存在或不存在，可使用熟習此項技術者已知之任何免疫檢定，諸如利用間接偵測方法(使用用於偵測之第二試劑)之檢定、ELISA檢定及免疫沈澱及凝集檢定。該等檢定之詳細描述(例如)提供於Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,New York 1988 555－612；Maertens及Stuyver之WO 96/13590；Zrein等人(1998)；及WO 96/29605中。為就地診斷，抗體或其任何活性及功能部分可藉由此項技術中已知之方法(諸如靜脈內、鼻內、腹膜內、腦內、動脈內注射)投與欲診斷之生物體，以便在根據本發明之抗體與類澱粉蛋白質上之抗原決定區之間可發生特異性結合。抗體/抗原複合物可方便地經由一個連接於抗體或其功能性片段之標記或任何其他此項技術中已知之偵測方法來偵測。

診斷應用中或用於診斷類澱粉蛋白相關疾病或病狀之素因或用於監測患者之最小殘留疾病或用於預測患者對於根據本發明且如本文中所述之抗體或疫苗組合物治療之反應之應用中所用的免疫檢定通常依賴經標記之抗原、抗體或用於偵測之第二試劑。可用熟習此項技術者通常已知之化合物來標記該等蛋白質或試劑，該等化合物包括酶、放射性同位素，及螢光、發光及發色物質，包括(但不限於)有色粒子，諸如膠體金及乳膠珠粒。其中，放射性標記可用於幾乎所有類型之檢定且具有最多變化。當必須避免放射活性時或當需要快速結果時，與酶結合之標記尤其適用。雖然螢光染料之使用需要昂貴設備，但其提供極靈敏之偵測方法。適用於該等檢定之抗體包括單株抗體、多株抗體及經親和純化之多株抗體。

或者，可藉由抗體與對免疫球蛋白具有親和力之經標記物質(諸如蛋白A或蛋白G或第二抗體)反應而間接標記抗體。可使抗體與第二物質結合，且用對於與抗體結合之第二物質具有親和力之經標記第三物質來偵測。舉例而言，可使抗體與生物素結合，且使用經標記之抗生物蛋白或抗生蛋白鏈菌素來偵測抗體－生物素結合物。類似地，可使抗體與半抗原結合，且使用經標記之抗半抗原抗體來偵測抗體－半抗原結合物。

熟習此項技術者將瞭解可根據本發明使用之該等及其他適合標記。該等標記與抗體或其片段之結合可使用熟習此項技術者通常已知之標準技術完成。典型技術由Kennedy J.H.等人，1976(Clin.Chim.Acta 70：1－31)及Schurs,A.H.W.M.等人，1977(Clin.Chim Acta 81：1－40)描述。後者提及之偶合技術為戊二醛方法、過碘酸鹽方法、二馬來醯亞胺方法及其他方法，全部以引用之方式併入本文。

當前之免疫檢定利用雙抗體方法來偵測分析物之存在，其中抗體藉由與已用可偵測標記標記之第二抗體反應而經間接標記。第二抗體較佳為與獲得單株抗體之動物之抗體結合的抗體。換言之，若單株抗體為小鼠抗體，則經標記之第二抗體為抗小鼠抗體。對本文中所述之檢定中所用之抗體而言，該標記較佳為塗佈抗體之珠粒，尤其為磁性珠粒。對本文中所述之免疫檢定中所用之抗體而言，標記較佳為可偵測分子，諸如放射性、螢光或電化學發光物質。

在本發明之範疇內亦可使用常稱為快速格式系統之替代性雙抗體系統，因為其適於快速測定分析物之存在。該系統需要抗體與分析物之間的高親和力。根據本發明之一實施例，使用一對各自對類澱粉蛋白質具有特異性之抗體來測定類澱粉蛋白質之存在。該等抗體對中之一者在本文中稱為"偵測抗體"且該等抗體對中之另一者在本文中稱為"俘獲抗體"。本發明之單株抗體可用作俘獲抗體或偵測抗體。本發明之單株抗體亦可在單一檢定中共同用作俘獲抗體及偵測抗體。本發明之一實施例因此使用雙抗體夾層法來偵測生物液體樣本中之類澱粉蛋白質。在該方法中，使分析物(類澱粉蛋白質)夾在偵測抗體與俘獲抗體之間，俘獲抗體係不可逆地固定至固體支撐物上。偵測抗體含有可偵測標記以鑑別抗體－分析物夾層物之存在且因此鑑別分析物之存在。

示範性固相物質包括(但不限於)微量滴定板、聚苯乙烯試管、磁性、塑膠或玻璃珠粒及放射免疫檢定及酶免疫檢定領域中熟知之載片。用於將抗體偶合於固相之方法亦為熟習此項技術者熟知。近來，諸如耐綸、硝化纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維及其他多孔聚合物之許多多孔材料已用作固體支撐物。

本發明亦係關於一種用於偵測生物樣本中之類澱粉蛋白質之診斷套組，其包含如上文所定義之組合物。此外，本發明係關於除如上文所定義之組合物外亦包含如上文所定義之偵測試劑的後一種診斷套組。術語"診斷套組"一般而言係指此項技術中已知之任何診斷套組。更特定而言，後一術語係指如Zrein等人(1998)中所述之診斷套組。

本發明之另一目的為提供用於偵測及診斷與類澱粉蛋白相關之疾病及病狀之新穎免疫探針及測試套組，其包含根據本發明之抗體。對於免疫探針而言，使抗體直接或間接連接至適合之報導分子，例如酶或放射性核素。測試套組包括容納一或多種根據本發明之抗體之容器及關於使用抗體以達到以下目的之說明書：結合類澱粉蛋白抗原以形成免疫複合物及偵測免疫複合物之形成以便將免疫複合物之存在或不存在與類澱粉蛋白質之存在或不存在關聯。

實例 實例1：經由用棕櫚醯化Aβ _1－15 超分子抗原構築體免疫而產生之抗體

實例1.1製造棕櫚醯化Aβ _1－15 超分子抗原構築體之方法 1.1.1合成四(棕櫚醯基離胺酸)－Aβ_1－15 肽抗原按照改良之先前報導方法(Nicolau等人2002)合成棕櫚醯化類澱粉蛋白1－15肽。該新穎方法涉及棕櫚酸與預形成肽之末端Lys殘基之樹脂上接枝，而非併入經修飾胺基酸9－茀基甲氧基羰基(Fmoc)－Lys(Pal)－OH之逐步固相合成。該新穎方法改良偶合效率且得到具有顯著較高純度之產物。因此，使用[2－(1H－苯并三唑－1－基)－1,1,3,3－四甲基六氟磷酸鹽](HBTU)偶合化學，將正交保護胺基酸Fmoc－ Lys(Mtt)－OH連接於Wang樹脂。使用於DMF中之20%哌啶移除Fmoc基團且偶合Fmoc－Lys(Mtt)－OH之第二殘基。隨後，使用Fmoc/tBu化學及標準側鏈保護基之標準自動肽合成用以偶合下一15個胺基酸以產生肽序列。最後，最後2個偶合之胺基酸為Fmoc－Lys(Mtt)－OH。隨後，使用於二氯甲烷中之1%三氟乙酸(TFA)選擇性分裂Mtt基團以釋放肽片段且隨後使用HBTU將其與棕櫚酸偶合。樹脂洗滌後，用於二甲基甲醯胺(DMF)中之20%哌啶移除Fmoc基團且最後使用TFA在標準條件下同時進行樹脂分裂及側鏈去保護。自冷乙醚濕磨得到呈白色固體之產物。電噴霧質譜分析確認產物之身份(m/z預期值：1097.9([M]3＋)；實驗值：1096.8([M－3H]3＋)，未偵測到其他三、二或單棕櫚醯化肽。

實例1.2：藉由超分子抗原構築體引出之抗體製造針對棕櫚醯化Aβ _1－15 超分子抗原構築體產生之mAb 棕櫚醯化抗原(ACI－24，Aβ_1－15 )用於以2週時間間隔在C57BL/6小鼠中進行免疫。用各抗原免疫10－12隻動物(注射體積：200 μl，含有8 nmole肽)。在處死動物之前4天執行最後注射。5次加強後，選擇具有治療效價之小鼠(當血清之1：5,000稀釋液在ELISA中為陽性時)用於融合。自免疫動物收穫脾細胞，且藉由將敏化脾細胞與骨髓瘤細胞株融合來產生融合瘤。使用Kohler及Milstein(Nature 256：495－497(1975))及Harlow及Lane(Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,New York 1988)) 之熟知方法來進行來自脾之小鼠B－淋巴細胞與骨髓瘤細胞株SP2－0(ATCC,Manassas,VA)之細胞的融合。

藉由添加聚乙二醇誘導細胞融合。隨後，以習知方式將所得雜交細胞培養10±14天以允許純系生長。使用限制稀釋進行初始純系選擇。藉由ELISA選擇及測試產生IgG之融合瘤純系與Aβ_1－42 肽之特異性結合，且培養所得純系，其產生所要單株抗體。

隨後根據產生抵抗特定類澱粉蛋白相關疾病或病症之單株抗體之能力來篩選融合瘤。一旦識別母純系，就將其次選殖4次以保證單株性且使雜交體穩定。選殖產生所關注抗體之融合瘤，使其繁殖且冷凍儲存以用於未來生產。

用市售小鼠單株同型套組將抗體同型化，且使穩定純系適應無血清培養基且將其置放於生物反應器中用於抗體產生。

較佳融合瘤產生具有IgG1同型之單株抗體。

實例1.3：抗體mACI－24－Ab3之特異性測定 為分析抗體mACI－24－Ab3之特異性，將不同濃度之預形成類澱粉蛋白1－42、1－40及17－40、1－28原纖維點墨於Hybond ECL硝化纖維素膜(Amersham Biosciences)上。用10%乳粉及0.7% Tween 20阻斷後，在室溫下用20 μg/ml之第一抗體將膜培養2小時。洗滌後，在室溫下用辣根過氧化酶結合綿羊抗小鼠IgG抗體(Amersham Biosciences)將膜培養1小時，洗滌且用化學發光溶液培養，接著使膜暴露至X射線薄膜。

為量測mAb mACI－24－Ab3與類澱粉蛋白β 1－42、1－40及17－40之結合，在37℃下預形成1－28纖維歷時7天且在膜上點墨。20 μg/ml抗體用以量測結合能力且藉由辣根過氧化酶結合綿羊抗小鼠IgG抗體經20分鐘之暴露來偵測所結合抗體。

實例1.4：硫黃素T(Th－T)螢光檢定 為量測mAb之聚集抑制以及解聚性質，使用硫黃素T(Th－T)螢光檢定，其特異地結合原纖維Aβ_1－42 分子且隨後將螢光發射強度與溶液中存在之Aβ_1－42 纖維絲的量關聯。

在六氟異丙醇(HFIP)中將Aβ1－42冷凍乾燥粉末復水至1 mM。在室溫下將肽溶液超音波處理15分鐘，攪動隔夜且在非矽化微離心管中製得等分試樣。隨後在氬氣流下蒸發HFIP。將所得肽薄膜真空乾燥10分鐘且在－80℃下儲存直至使用。

1.4.1 Aβ1－42聚集檢定為檢定Aβ1－42聚集之抗體介導抑制，在PBS中將抗體預稀釋，且在非矽化培養管中製得含有以下組份之檢定溶液：3.3或0.33 μM預稀釋抗體、10 μM硫黃素T、33 μM Aβ1－42及8.2% DMSO。因此，抗體與Aβ1－42之最終莫耳比率為1：10及1：100。亦製備適當對照溶液。隨後，在37℃下將溶液培養24小時，且在Perkin－Elmer FluoroCount光譜螢光計上重複6次讀取黑色348孔培養板(Perkin－Elmer)中之光譜螢光(相對螢光單位；RFU)。聚集之抑制或解聚根據以下方程式分別表示為與對照相比A之平均抑制%或解聚% 在1：100之抗體與Aβ1－42之莫耳比率下，抑制平均值為26%(2次獨立實驗)，而在1：10莫耳比率下，抑制為51%(2次獨立實驗)。

1.4.2 Aβ1－42解聚檢定為量測mAb之解聚性質，使用硫黃素T(ThT)螢光檢定，其特異地結合原纖維Aβ_1－42 分子且隨後將螢光發射強度與溶液中存在之Aβ_1－42 纖維絲的量關聯。

為檢定預聚集Aβ1－42之抗體介導解聚，將如上所述製備之低分子量Aβ1－42製成於27% DMSO及1xPBS中之110 μM溶液。隨後在37℃下使該溶液聚集24小時，其後添加以下物質：3.3或0.33 μM預稀釋抗體及10 μM硫黃素T。其產生1：10及1：100抗體與Aβ1－42之莫耳比率，含有8.2% DMSO。隨後在37℃下將該溶液另外培養24小時。隨後量測光譜螢光且如上所述計算解聚%。

抗體ACI－24－Ab－3在解聚檢定中展示預聚集Aβ1－42之顯著解聚。在1：100之抗體與Aβ1－42之莫耳比率下，解聚平均值為12%(2次獨立實驗)，而在1：10莫耳比率下，解聚為20%(2次獨立實驗)。

根據上文結果，顯然ACI－24－Ab－3在與Aβ_1－42 纖維絲之相互作用中展現雙功能性，因為其能夠抑制Aβ1－42之聚集且使預形成之Aβ1－42纖維解聚。

實例1.5：mACI－01Ab7 C2－Aβ _1－42 相互作用 使用表面電漿共振來研究抗體ACI－24－Ab－3與類澱粉蛋白肽Aβ_1－42 之間的相互作用。測定小鼠抗體與Aβ_1－42 之單體或纖維之結合。

所有SPR實驗均在Biacore X儀器(Biacore AB)上進行。用於固定之試劑(EDC、NHS及乙醇胺)、感應器晶片CM5及SA以及工作及樣本緩衝液HBS－EP均自Biacore AB購買。乙酸鈉(10 mM，pH 5.0)用作增加偶合產率之偶合緩衝液。藉由將PBS緩衝液添加至Aβ_1－42 中達到3 mg/ml之最終濃度且在37℃下將小瓶保留7天來製備原纖維Aβ_1－42 (BAchem)。將原纖維Aβ_1－42 偶合至含有表面結合羧甲基葡聚糖基質之CM5感應器晶片。將生物素標記之單體Aβ_1－42 (Bachem)偶合至由羧甲基葡聚糖基質與共價連接抗生蛋白鏈菌素組成之感應器晶片SA。通常藉由使用工作緩衝液連續稀釋來檢定4或5種濃度之mAb。自最低濃度開始執行注射，且以30 μL/min之流動速率在fc 1及2上通過3分鐘。流動小室2未經衍生且自fc 1減去反應以校正儀器雜訊及本體折射改變。注射完成後，立即用工作緩衝液洗滌表面5分鐘。為自Aβ_1－42 原纖維移除剩餘結合抗體，藉由注射10mM NaOH之脈衝來執行表面再生。使用用於數值積分及整體分析之算法，使用BIAevaluation 3.0來執行動力學分析。將對不同濃度分析物之注射獲得之曲線重疊且將基線調整至零點。對於曲線擬合，將所有資料相對1：1均質複合物同時擬合。

測定小鼠ACI－24－Ab－3抗體與類澱粉蛋白之結合。

實例1.6：ACI－24－Ab－3單株抗體與類澱粉蛋白纖維之結合 為分析抗體ACI－24－Ab－3在預形成纖維上之分子結合側，執行負反差透射電子顯微法(negatively contrasted transmission electronic microscopy，TEM)。

根據Slot JW,Geuze HJ(1985)將抗體ACI－24－Ab－3與8 nm膠態金偶合。為進行類澱粉蛋白1－42(Aβ1－42)纖維之共同培育，在室溫下以1：100之莫耳比率用金標記抗體將6.65 μM纖維培養24小時。隨後，在用鈀/C薄膜覆蓋之新鮮輝光放電Cu柵格(200目)上培養5 μl樣本歷時45秒，用水洗滌3次且用2%新鮮稀釋及過濾之乙酸鈾醯酯洗滌1次。在2%乙酸鈾醯酯中將樣本染色15－20秒。吸出柵格上之過量染色物且進而風乾。各樣本製備3個柵格。在透射電子顯微鏡Hitachi 7000中分析柵格。

實例1.7；藉由密度－梯度超速離心之分離 單株抗體ACI－24－Ab－3在抑制Aβ_1－42 纖維聚合及解聚Aβ_1－42 纖維方面之性質藉由密度－梯度超速離心(Rzepecki等人，2004)來研究，該方法係基於在用或不用抗體培養後之不同尺寸所得肽纖維之間分布之原理，接著在預形成梯度(OptiPrep^TM )上之SDS－PAGE沈降分析。預形成Aβ纖維群體、共同培育抗體之解聚及聚集抑制性質及抗體與纖維之結合的同時分析為該方法之明顯優點。

為抑制Aβ_1－42 聚集，用mAb ACI－24－Ab－3以2種不同莫耳比率(單體Aβ_1－42 比mAb高30倍或100倍之莫耳比率)培養Aβ_1－42 單體，Aβ最終濃度為50 μM。在37℃下培養24小時後，將樣本覆蓋於不連續梯度之Optiprep^TM 上且在4℃下以259 000 g將管旋轉3小時。收穫15個溶離份(各140 μL)，溶離份1為來自梯度頂部之最不稠密溶離份且溶離份15為來自梯度底部之最稠密溶離份。亦取出小球。藉由SDS－PAGE用銀染色分析所收集溶離份。用於抑制檢定之Aβ_1－42 濃度小於用於解聚檢定之濃度5倍，其減少類澱粉蛋白聚集動力學且確保在線性相內之量測。

為藉由與mAb ACI－24－Ab－3共同培育(以2種不同莫耳比率1：30及1：100，mAb＋單體Aβ_1－42 ，Aβ最終濃度為246 μM)使預形成Aβ_1－42 原纖維解聚，在37℃下將樣本培養24小時。24小時後，藉由超速離心法分離樣本且如上文及之前所述(Rzepecki等人，2004)藉由SDS－PAGE分離。

實例1.8：評估藉由與mAb ACI－24－Ab－3共同培育而引起之Aβ _1－42 纖維絲聚集之抑制及預形成Aβ _1－42 纖維絲之解聚的螢光檢定 BIS－ANS螢光檢定為評估rnAb之抑制性質，使用BIS－ANS(LeVine,2002)螢光檢定，其特異地偵測Aβ_1－42 纖維絲之單體或非纖維狀群體。螢光量測之前，在37℃下用緩衝液(用作對照)或mAb ACI－24－Ab－3(莫耳比率1：100，mAb比Aβ_1－42 肽)將Aβ_1－42 單體預培養14小時。自動記錄相對螢光單位且結果以百分比表示為相比對照之改變。

實例1.9：ACI－24－Ab－3單株抗體與經 ¹³ C標記之β－類澱粉蛋白1－42肽之相互作用的NMR及螢光表徵 為評估mAb溶解預形成纖維或抑制纖維形成之潛在機制，執行經U－¹³ C Tyr10及Val12標記之β－類澱粉蛋白1－42肽之Th－T螢光檢定與固態NMR之間的頭對頭實驗(head－to－head－experiment)。因此，該研究之目的為在β－類澱粉蛋白肽中及在單株抗體存在下藉由固態NMR光譜學跟蹤β－摺疊片轉變且將其與藉由Th－T螢光檢定所量測之解聚能力直接比較。

固態NMR光譜學不僅偵測二級結構轉變，而且其亦允許定位支配結構轉變之Aβ_1－42 肽之區域。固態NMR已證明其對該問題之適用性，因為其促進Aβ_1－42 纖維之結構測定(Petkova等人，2004；Petkova等人，2002)。詳言之，¹³ C_α 及¹³ C_β 化學位移與二級結構之關聯(Cornilescu等人，1999；Luca等人，2001；Iwadate等人，1999)為測試肽內二級結構之改變之有價值工具。

藉由Fmoc合成方案執行經標記肽之合成，該經標記肽包括在位置12處之¹³ C預標記纈胺酸(¹² Val)及在位置10處之¹³ C預標記酪胺酸(¹⁰ Tyr)。肽之身份及純度藉由MALDI質譜分析來確認。經標記β－類澱粉蛋白肽(1－42)用以藉由在37℃下在PBS緩衝液中將肽溶液培養1週來產生纖維。主要問題，即類澱粉蛋白β－肽於PBS緩衝液中之不良溶解性，可以以下方式解決：用微量氨暫時增加PBS緩衝液之pH值以溶解類澱粉蛋白β－肽。使用氨之揮發性特徵，藉由在較大PBS浴存在下培養樣本而再獲得PBS緩衝液之原始pH值。

為量測β－摺疊片斷裂抗體之效應，在37℃下用抗體將纖維之溶液培養24小時以用於NMR及Th－T檢定。為即時比較，將相同溶液之等分試樣用於Th－T螢光檢定且將剩餘溶液冷凍乾燥用於NMR量測。

使用Th－T螢光檢定，藉由與預形成之經¹³ C標記的類澱粉蛋白β－纖維共同培育來分析ACI－24－Ab－3之解聚能力。

為研究PBS(對照)與mAb培養之間的差異，使用PeakFit(www.systat.com/－products/PeakFit)將各光譜解迴旋。藉由使用混合Lorentzian/Gaussian擬合程序將直線充分匹配。

實例1.10：ACI－24－Ab－3對類澱粉蛋白纖維之功能性 12.1 ACI－24－Ab－3抗體之結合後，Aβ1－42纖維之構形修飾及解聚引發為評估抗體能夠解聚預形成β－類澱粉蛋白(Aβ_1－42 )纖維之機制，執行硫黃素－T(Th－T)螢光檢定之頭對頭比較以量測解聚，且經U－¹³ C酪胺酸10及纈胺酸12標記之Aβ1－42肽之固態核磁共振(NMR)分析二級構形。

實例1.11：單株抗體ACI－24－Ab－3之抗原決定基定位 使用包含涵蓋Aβ1－42(藉由Mimotopes,Clayton Victoria,Australia生產且自ANAWA Trading SA,Wangen Switzerland購買)之完整胺基酸(aa)序列之總共33個生物素標記肽的肽文庫，藉由ELISA執行單株抗體ACI－24－Ab－3之抗原決定基定位。肽文庫中之肽由8、9或10－mer aa肽構成。生物素標記之完整Aβ1－42肽(人類序列)用作陽性對照(Bachem,Bubendorf,Switzerland)。另外，涵蓋Aβ1－28、Aβ17－40、Aβ1－40及Aβ1－42之較長肽用以界定該等抗體可結合之較廣區域。該等四種肽亦經生物素標記(藉由Anaspec製造且自ANAWA Trading SA,Switzerland購買)。根據製造商(Mimotopes)之說明書進行抗原決定基定位。簡言之，在4℃下，用於PBS中之0.1% BSA阻斷經抗生蛋白鏈菌素塗佈之培養板(NUNC,Roskilde,Denmark)隔夜。用PBS－0.05% Tween 20洗滌後，在室溫下用來自文庫之不同肽將培養板塗佈1小時，在於PBS中之0.1% BSA、0.1%疊氮化鈉中稀釋至10 μM之最終濃度。洗滌後，在室溫下用不同抗體將培養板培養1小時，對ACI－24－Ab－3而言，在於PBS中之2% BSA、0.1%疊氮化鈉中稀釋至10 μg/ml。再次洗滌培養板且在室溫下用鹼性磷酸酶結合山羊抗小鼠IgG(Jackson Immunresearch West Grove,PA,USA)培養1小時。最終洗滌後，用磷酸酶底物(pNPP,Sigma－Aldrich,St Louis,MO,USA)培養培養板且使用ELISA培養板讀取器在3小時培養後在405 nm處讀數。

驚人地發現，雖然ACI－24－Ab－3能夠抑制Aβ1－42聚集，但其不顯著結合Aβ1－42且亦不展示與文庫中之任何其他肽的任何結合。

為測定ACI－24－Ab－3是否可識別其他Aβ肽，評估與Aβ1－28、Aβ17－40及Aβ1－40及Aβ1－42之結合。ACI－24－Ab－3不展示與Aβ17－40之結合，不展示與Aβ1－28及Aβ1－42之結合或展示弱結合，但展示與Aβ1－40之顯著結合。該結果暗示ACI－24－Ab－3可對Aβ1－40具有特異性。

實例1.12：在單一轉殖基因hAPP小鼠中，用ACI－24－Ab－3被動疫苗接種對腦類澱粉蛋白負荷之影響 為評估ACI－24－Ab－3單株抗體結合可溶性類澱粉蛋白且將可溶性類澱粉蛋白清除出腦之活體內能力，6個月大之單一hAPP小鼠(性別及年齡匹配)用於不同劑量下之被動免疫研究。在研究結束時，藉由收穫動物腦且藉由執行Aβ1－40及Aβ1－42特異性ELISA(TGC,Germany)來分析可溶性類澱粉蛋白負荷。

每組8－13隻動物以一週之時間間隔接受於200 μl PBS中之100、300及1000 μg單株抗體之2次注射，而單獨之PBS注射用作對照。第二次注射後1天，處死動物用於可溶性類澱粉蛋白部分之生化分析。為定量腦勻漿及/或腦脊髓液(CSF)中之可溶性部分中之人類Aβ 1－40及人類Aβ 1－42的量，使用市售酶聯結免疫吸附劑檢定(ELISA)套組(h類澱粉蛋白β 40或β 42 ELISA高靈敏性，TGC，Switzerland)。根據製造商之方案執行ELISA。簡言之，在無蛋白結合能力之96孔聚丙烯培養板(Greiner,Germany)中製備標準(合成Aβ 1－40或Aβ 1－42之稀釋液)及樣本。在備有ELISA套組之樣本稀釋劑中，製備最終濃度為1000、500、250、125、62.5、31.3及15.6 pg/ml之標準稀釋液及樣本，達到60 μl之最終體積。因為類澱粉蛋白含量隨小鼠年齡而增加且因為實際評估需要樣本之讀數在標準曲線之線性部分內，所以將用於Aβ 40分析之樣本2：3稀釋，不稀釋用於Aβ 42分析之樣本。

將樣本、標準及空白(50 μl)添加至經抗Aβ塗佈的聚苯乙烯培養板中(俘獲抗體選擇性識別抗原之C－末端)，該培養板另外含有選擇性抗Aβ－抗體結合物(經生物素標記之偵測抗體)，且在4℃下培養隔夜以允許形成抗體－類澱粉蛋白－抗體複合物。第二天，添加抗生蛋白鏈菌素－過氧化酶結合物，30分鐘後接著添加TMB/過氧化物混合物，導致底物轉化為有色產物，且藉助於光度測量學，用具有450 nm濾光器之ELISA讀取器量測顏色強度。藉由將吸光度與用合成Aβ 1－40或Aβ 1－42製得之標準曲線比較來獲得樣本之Aβ含量之定量。資料表示為相比平均對照值之個別改變(以相比對照之百分比計)。

實例1.13：在雙重轉殖基因hAPPxPS1小鼠中，ACI－24－Ab－3之慢性被動投藥對斑塊負荷之影響 為評估ACI－24－Ab－3單株抗體結合類澱粉蛋白且減少腦中類澱粉蛋白斑塊之活體內能力，3.5個月大之雙重轉殖基因hAPPxPS1小鼠(性別及年齡匹配)用於4個月長之慢性被動免疫研究。在研究結束時，藉由動物腦之組織化學，藉由硫黃素S之結合來分析類澱粉蛋白斑塊。

15隻轉殖基因動物接受於PBS中之500 μg單株抗體之16次每週注射。單獨用PBS注射15隻動物，用作對照。所有注射係腹膜內給予。在處死時，將小鼠麻醉，且在4℃ 下，用生理血清經賁門沖洗以自腦血管移除血液。隨後，自頭蓋骨移除腦且以冠狀/額狀面中之切割分離後腦及前腦。藉由使用中線矢狀切割，將前腦均勻分成左半球及右半球。一個半球在4%聚甲醛中後固定隔夜用於組織學。將矢狀冷凍切片(vibratome)部分(40 μm)切割用於自由浮動培養且在4℃下儲存直至在具有0.1%疊氮化鈉之PBS中染色。用硫黃素S將不同含量之5個切片針對稠密斑塊染色。將所用之所有動物之切片隨機化用於染色及盲定量。用配備Sony DXC－9100P照相機之Leica DMR顯微鏡獲得影像且用電腦，使用Leica Q－Win軟體來分析。顯微鏡之光強度及聚光器設定在影像獲取方法期間保持恆定。所有獲得之影像經受相同電腦子程序以最小化研究者偏差。在分析期間，均勻應用密度切月定限(density slice thresholding)。選擇菌絲層區域用於硫黃素S染色中之類澱粉蛋白負荷之自動定量。

實例1.14：在單一轉殖基因hAPP小鼠中，用ACI－24－Ab－3被動疫苗接種對記憶能力之影響 為分析ACI－24－Ab－3抗體改變或增加認知功能性之活體內能力，9個月大之單一hAPP小鼠(性別及年齡匹配)用於被動免疫研究。在免疫時期結束時，藉由新物體識別作業(Object Recognition Task，ORT)量測非空間認知。

每組12隻動物接受於200 μl PBS中之400 μg單株抗體之2次腹膜內注射，而單獨的PBS注射用作對照。第二次注射後1天，在新物體識別作業(ORT)^12,13 中研究認知能力。為進行ORT登記，將小鼠置放於行為場地中10分鐘且面向新的未知物體。記錄探查時間。3小時後，將相同動物再置放至相同場地中歷時第2活動期，但面對舊的、先前已探查之物體及另外面對新物體。再次記錄對兩個物體之探查時間且所得認知指數經計算為對新物體之探查時間相對總探查時間之比率，且表示為相比對照之比例變化。

實例1.15－小鼠單株抗體與Aβ1－42肽之基原纖維(PF)寡聚物富集製劑超過低分子量(LMW)單體之優先結合 可使用ELISA執行小鼠抗類澱粉蛋白β單株抗體與低分子量(LMW)單體Aβ1－42肽及Aβ1－42肽之較高分子量基原纖維(PF)寡聚物富集製劑之結合。

使用2個SEC管柱、Superdex 75 HR 10/30(範圍3－70 kDa)及Superose 6 HR 10/30(範圍5－5,000 kDa)之尺寸排阻層析(SEC)用以製備由Aβ1－42肽之較高分子量(HMW)基原纖維(PF)寡聚物富集製劑及低分子量(LMW)單體製劑組成之Aβ1－42肽溶離份。隨後，用乙酸鈾醯酯將所得溶離液染色且藉由高解析度透射電子顯微法(TEM)在100 kV下檢查以驗證所溶離Aβ1－42溶離份之結構形態。

隨後，藉由將Aβ1－42溶離份以2 μM塗佈於高度結合檢定培養板上隔夜來執行ELISA。隨後，用1.0% BSA阻斷經塗佈之培養板且添加呈以20 μg/ml開始之連續稀釋液之ACI－24－Ab－3(小鼠EJ1A9)抗體。亦使用標準抗體(6E10,Chemicon)之連續稀釋液。與鹼性磷酸酶及磷酸4－硝基苯酯結合之抗小鼠IgG抗體用於偵測結合。在405 nm處讀取培養板。以<0.2之變化係數(CV)將所有條件重複檢定2次。

藉由ELISA量測小鼠抗Aβ抗體ACI－24－Ab－3(小鼠EJ1A9)及對照抗體6E10之結合。表1.4及圖5展示ACI－24－Ab－3(小鼠EJ1A9)抗體在與人類Aβ1－42肽之基原纖維(PF)寡聚物富集製劑及LMW單體製劑結合後之光學密度(O.D.)值。表1.5及圖6展示6E10抗Aβ1－42對照抗體在與人類Aβ1－42肽之基原纖維(PF)寡聚物富集製劑及LMW單體製劑結合後之光學密度(O.D.)值。

該等結果表明，ACI－24－Ab－3單株抗體對具有高階PF/寡聚形態學之Ab1－42肽比對LMW單體肽展示更強的結合。另外，該等結果暗示ACI－24－Ab－3結合優先呈現於Aβ1－42之基原纖維(PF)寡聚物富集溶離份上之抗原決定基。

實例1.16：單株抗體ACI－24－Ab－3與類澱粉蛋白β1－42肽之單體及寡聚物之結合 評估抗類澱粉蛋白β抗體ACI－24－Ab－3(純系：EJ1A9)與Aβ1－42肽之單體及寡聚物之結合。在用於該研究之前，在－80℃下儲存抗體。將Aβ1－42肽(W.M.Keck Facility,Yale University)作為冷凍乾燥粉末儲存直至使用當天。除非另作指示，否則所有其他材料均來自Sigma－Aldrich(Sigma－Aldrich Chemie GmbH,Buchs,Switzerland)。

為製備Aβ1－42肽之單體及具有改良寡聚物富集之較高分子溶離份，使用利用尺寸排阻層析(SEC)之改良方法。2個SEC管柱Supelco TSK G4000PW－XL(範圍：10－1500 kDa： Sigma)及Superose 6 HR 10/30(範圍5－5,000 kDa；GE Healthcare Bio－Sciences AB Uppsala,Sweden)用以製備富集LMW單體及較高重量寡聚物溶離份之Aβ1－42肽溶離份。隨後，用乙酸鈾醯酯將所得SEC溶離液染色且藉由高解析度透射電子顯微法(TEM)在100 kV下檢查以驗證Aβ1－42溶離份之結構形態(未圖示)。為研究抗體與Aβ1－42溶離份之結合，執行ELISA。以於PBS中之2.2 μM將Aβ1－42溶離份塗佈於高度結合檢定培養板上歷時2小時。隨後，用於PBS中之0.05% Tween－20將經塗佈之培養板洗滌5次且用1.0% BSA阻斷。添加呈以指定濃度開始之連續稀釋液之抗Aβ抗體，包括對照抗體(6E10)。與鹼性磷酸酶(Jackson ImmunoResearch,Suffolk,England)及磷酸4－硝基苯酯結合之抗小鼠IgG抗體用於偵測結合。在室溫下培養14小時後，在405 nm處讀取培養板。將檢定重複3次。圖7展示自3次單獨ELISA檢定獲得之平均(±SEM)光學密度(O.D.)值。與不富集寡聚物且主要由Aβ1－42單體組成之溶離份相比，抗體ACI－24－Ab－3顯示與富集寡聚物之Aβ1－42製劑之優越結合(圖7A)。比較起來，對照抗體6E10與兩種Aβ1－42溶離份均同樣良好地結合。表1.6及1.7展示在ELISA檢定1、2及3中分別對抗體ACI－24－Ab－3及6E10所獲得之O.D.值。

該等結果表明，抗體ACI－24－Ab－3(純系：EJ1A9)對Aβ1－42之寡聚物富集製劑比對Aβ1－42之單體製劑展示優越的結合親和力。

實例2：經由用聚乙二醇化超分子抗原構築體免疫而產生 之抗體

實例2.1：製造超分子抗原構築體之方法 2.1.1合成聚乙二醇化β－類澱粉蛋白肽抗原為增強免疫反應，已應用錨定物/間隔物以重構脂質體中之肽，例如聚乙二醇(PEG)。將PEG共價連接於肽之兩個末端處之離胺酸殘基。在鏈之另一端(PEG n＝70)共價結合磷脂醯基乙醇胺(PEA)以起脂質體雙層中之錨定元件作用。因此，脂質體仍起佐劑作用且足夠遠離雙層之肽可經單獨處理，且因此與棕櫚醯化抗原相比增加其免疫原性。

本文中所述之超分子構築體係使用標準Fmoc/tBu胺基酸側鏈保護來獨特地合成。肽之聚乙二醇化通常產生區位異構體之混合物。本文中，用於PEG－脂質結合物與Aβ之C－及N－末端之位點特異性連接的適宜方法係使用經部分保護之肽來示範。

對於含有內部Lys或His殘基(22－35)之彼等肽序列而言，將經正交保護之Lys(ivDde)添加至各末端。將額外Gly添加至C－末端以幫助合成。用於DMF中之20%哌啶移除Fmoc基團且使用乙酸酐進行N－乙醯化。用於DMF中之3%水合肼來達成ivDde基團之選擇性分裂歷時1小時。2－氯三苯甲基樹脂比更廣泛使用之Wang樹脂有利，因為證明前者對肼解更具抵抗力。另外，2－氯三苯甲基樹脂對酸極為敏感且因此，不同於Wang樹脂，使經保護之肽能分離。實際上，必需在溶液相中執行偶合反應，因為樹脂結合肽與預活化聚乙二醇化脂質試劑DSPE－PEG－SPA之偶合不產生任何偶合產物。因此，在溫和條件(乙酸/三氟乙醇/二氯甲烷，1：1：8，1小時，室溫)下自樹脂選擇性分裂得到內部經保護之肽。

在DMSO及過量鹼中，成功達成分別得自序列Aβ_22－35 及Aβ_29－40 之肽與DSPE－PEG－SPA之溶液相偶合。隨後，藉由添加過量乙醇胺中止反應2小時且將溶液冷凍乾燥。

對序列29－40而言，不需要特殊保護策略。

藉由HPLC(半製備型逆相C₄ 管柱)純化得到純度在50－70%之間的N－及C－末端PEG－脂質結合物，其身份藉由MALDI(基質輔助雷射脫附電離)來確認。各序列展示偶合反應簡易性之可觀變化且因此調整條件(溫度、DSPE－PEG－SPA之莫耳當量數、時間)。為自所要產物分離過量DSPE－PEG－SPA，應用HPLC純化。最終側鏈去保護前之單偶合產物及雙偶合產物的分離可藉由使用陽離子交換層析法來達成。後續肽側鏈去保護及過量經中止DSPE－PEG－SPA之分離引起具有可接受之純度的所要結合物之分離。

使用經保護之肽合成N－末端及C－末端脂質－PEG β－類澱粉蛋白抗原之該方法可適用於多種肽序列。

實例2.2：藉由超分子抗原構築體引出之抗體 製造針對聚乙二醇化Aβ _22－35 及Aβ _29－40 超分子抗原構築體產生之mAb 如所述製備脂質體抗原(Nicolau等人，2002,PNAS,99 ,2332－37)。在由以下各物製得之脂質體組成之構築體(含有單磷醯基脂質A(40 mg/mM磷脂))中重構序列PEG－Aβ_22－35 及 PEG－Aβ_29－40 ：二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPEA)、二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油(DMPG)及膽固醇(0.9：0.1：0.1：0.7莫耳比率)。該等抗原用於以2週時間間隔在C57BL/6小鼠中進行免疫。用各抗原將10－12隻動物免疫。3至6次加強後，選擇具有治療效價之小鼠(當血清之1：5,000稀釋液在ELISA中為陽性時)用於融合。自免疫動物收穫脾細胞，且藉由將敏化脾細胞與骨髓瘤細胞株融合來產生融合瘤。使用Kohler及Milstein(Nature 256：495－497(1975))及Harlow及Lane(Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,New York 1988))之熟知方法來進行來自脾之小鼠B－淋巴細胞與骨髓瘤細胞株SP2－0(ATCC,Manassas,VA)之細胞的融合。

藉由添加聚乙二醇誘導細胞融合。隨後以習知方式(例如使用限制稀釋)選殖所得雜交細胞。藉由ELISA選擇及測試產生IgG之融合瘤純系與Aβ_1－42 肽之特異性結合，且培養所得純系，其產生所要單株抗體。

隨後根據產生抵抗特定類澱粉蛋白相關疾病或病症之單株抗體之能力來篩選融合瘤。選殖產生所關注抗體之融合瘤，使其繁殖且冷凍儲存以用於未來生產。較佳融合瘤產生具有IgG同型之單株抗體。

實例2.3：抗體ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11之特異性測定 為分析抗體ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11之特異性，將不同濃度之預形成類澱粉蛋白1－42、1－40及17－40、1－28原纖維點墨於Hybond ECL硝化纖維素膜(Amersham Biosciences)上。用10%乳粉及0.7% Tween 20阻斷後，在室溫下用20 μg/ml之第一抗體將膜培養2小時。洗滌後，在室溫下用辣根過氧化酶結合綿羊抗小鼠IgG抗體(Amersham Biosciences)將膜培養1小時，洗滌且用化學發光溶液培養，接著使膜暴露至X射線薄膜。

為量測mAb ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11與類澱粉蛋白β 1－42、1－40及17－40之結合，在37℃下預形成1－28纖維歷時7天且在膜上點墨。20 μg/ml抗體用以量測結合能力且藉由辣根過氧化酶結合綿羊抗小鼠IgG抗體經20分鐘之暴露來偵測所結合抗體。

實例2.4：硫黃素T(Th－T)螢光檢定 為量測mAb之聚集抑制以及解聚性質，使用硫黃素T(Th－T)螢光檢定，其特異地結合原纖維Aβ_1－42 分子且隨後將螢光發射強度與溶液中存在之Aβ_1－42 纖維絲的量關聯。

在六氟異丙醇(HFIP)中將Aβ1－42冷凍乾燥粉末復水至1 mM。在室溫下將肽溶液超音波處理15分鐘，攪動隔夜且在非矽化微離心管中製得等分試樣。隨後在氬氣流下蒸發HFIP。將所得肽薄膜真空乾燥10分鐘，且在－80℃下儲存直至使用。

2.4.1 Aβ1－42聚集檢定為檢定Aβ1－42聚集之抗體介導抑制，在PBS中將抗體預稀釋，且在非矽化培養管中製得含有以下組份之檢定溶液：3.3或0.33 μM預稀釋抗體、10 μM硫黃素T、33 μM Aβ1－42及8.2% DMSO。因此，抗體與Aβ1－42之最終莫耳比率為1：10及1：100。亦製備適當對照溶液。隨後，在37℃下將溶液培養24小時，且在Perkin－Elmer FluoroCount光譜螢光計上重複6次讀取黑色348孔培養板(Perkin－Elmer)中之光譜螢光(相對螢光單位；RFU)。聚集之抑制或解聚根據以下方程式分別表示為與對照相比之平均抑制%或解聚%。

抗體ACI－11－Ab－9展示與對照相比，Aβ1－42聚集之顯著抑制。在1：100之抗體與Aβ1－42之莫耳比率下，抑制平均值為34%(3次獨立實驗)，而在1：10莫耳比率下，抑制為69%(2次獨立實驗)。

抗體ACI－12－Ab－11亦展示與對照相比，Aβ1－42聚集之顯著抑制。在1：100之抗體與Aβ1－42之莫耳比率下，抑制平均值為30%(2次獨立實驗)，而在1：10莫耳比率下，抑制為66%(2次獨立實驗)。

2.4.2 Aβ1－42解聚檢定為量測mAb之解聚性質，使用硫黃素T(ThT)螢光檢定，其特異地結合原纖維Aβ_1－42 分子且隨後將螢光發射強度與溶液中存在之Aβ_1－42 纖維絲的量關聯。

為檢定預聚集Aβ1－42之抗體介導解聚，將如上所述製備之低分子量Aβ1－42製成於27% DMSO及1xPBS中之110 μM 溶液。隨後在37℃下使該溶液聚集24小時，其後添加以下物質：3.3或0.33 μM預稀釋抗體及10 μM硫黃素T。其產生1：10及1：100抗體與Aβ1－42之莫耳比率，含有8.2% DMSO。隨後在37℃下，將該溶液另外培養24小時。隨後量測光譜螢光且如上所述計算解聚%。

抗體ACI－11－Ab－9在解聚檢定中展示預聚集Aβ1－42之顯著解聚。在1：100之抗體與Aβ1－42之莫耳比率下，解聚平均值為22%(3次獨立實驗)，而在1：10莫耳比率下，解聚為52%(3次獨立實驗)。

抗體ACI－12－Ab－11亦在解聚檢定中展示預聚集Aβ1－42之顯著解聚。在1：100之抗體與Aβ1－42之莫耳比率下，解聚平均值為18%(2次獨立實驗)，而在1：10莫耳比率下，解聚為54%(2次獨立實驗)。

根據上文結果，顯然抗體ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11在與Aβ_1－42 纖維絲之相互作用中展現雙功能性，因為該兩種抗體能夠抑制Aβ1－42之聚集且解聚預形成之Aβ1－42纖維。

實例2.5：ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11相互作用 使用表面電漿共振來研究抗體ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11與類澱粉蛋白肽Aβ_1－42 之間的相互作用。測定小鼠抗體與Aβ_1－42 之單體或纖維之結合。

所有SPR實驗均在Biacore X儀器(Biacore AB)上進行。用於固定之試劑(EDC、NHS及乙醇胺)、感應器晶片CM5及SA以及工作及樣本緩衝液HBS－EP均自Biacore AB購買。乙酸鈉(10 mM，pH 5.0)用作增加偶合產率之偶合緩衝液。藉由將PBS緩衝液添加至Aβ_1－42 中達到3 mg/ml之最終濃度且在37℃下將小瓶保留7天來製備原纖維Aβ_1－42 (BAchem)。將原纖維Aβ_1－42 偶合至含有表面結合羧甲基葡聚糖基質之CM5感應器晶片。將生物素標記之單體Aβ_1－42 (Bachem)偶合至由羧甲基葡聚糖基質與共價連接抗生蛋白鏈菌素組成之感應器晶片SA。通常使用工作緩衝液藉由連續稀釋來檢定4或5種濃度之mAb。自最低濃度開始執行注射，且以30 μL/min之流動速率在fc 1及2上通過3分鐘。流動小室2未經衍生且自fc 1減去反應以校正儀器雜訊及本體折射改變。注射完成後，立即用工作緩衝液洗滌表面5分鐘。為自Aβ_1－42 原纖維移除剩餘結合抗體，藉由注射10 mM NaOH之脈衝執行表面再生。使用用於數值積分及整體分析之算法，使用BIAevaluation 3.0來執行動力學分析。將對不同濃度分析物之注射獲得之曲線重疊且將基線調整至零點。為進行曲線擬合，將所有資料相對1：1均質複合物同時擬合。

測定小鼠ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11抗體與類澱粉蛋白之結合。

實例2.6：ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11單株抗體與類澱粉蛋白纖維之結合 為分析抗體ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11在預形成纖維上之分子結合側，執行負反差透射電子顯微法(TEM)。

根據Slot JW,Geuze HJ(1985)將抗體ACI－11－Ab－9及ACI－ 12－Ab－11與8 nm膠態金偶合。為進行類澱粉蛋白1－42(Aβ1－42)纖維之共同培育，在室溫下以1：100之莫耳比率用金標記抗體將6.65 μM纖維培養24小時。隨後，在用鈀/C薄膜覆蓋之新鮮輝光放電Cu柵格(200目)上培養5 μl樣本歷時45秒，用水洗滌3次且用2%新鮮稀釋及過濾之乙酸鈾醯酯洗滌1次。在2%乙酸鈾醯酯中將樣本染色15－20秒。吸出柵格上之過量染色物且進而風乾。各樣本製備3個柵格。在透射電子顯微鏡Hitachi 7000中分析柵格。

實例2.7：藉由密度－梯度超速離心之分離 單株抗體ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11在抑制Aβ_1－42 纖維聚合及解聚Aβ_1－42 纖維方面之性質藉由密度－梯度超速離心(Rzepecki等人，2004)來研究，該方法基於在用或不用抗體培養後之不同尺寸所得肽纖維之間分布之原理，接著在預形成梯度(OptiPrep^TM )上之SDS－PAGE沈降分析。預形成Aβ纖維群體、共同培育抗體之解聚及聚集抑制性質及抗體與纖維之結合的同時分析為該方法之明顯優點。

為抑制Aβ_1－42 聚集，分別用mAb ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11以2種不同莫耳比率(單體Aβ_1－42 比mAb高30倍或100倍之莫耳比率)培養Aβ_1－42 單體，Aβ最終濃度為50 μM。在37℃下培養24小時後，將樣本覆蓋於不連續梯度之Optiprep^TM 上且在4℃下以259 000 g將管旋轉3小時。收穫15個溶離份(各140 μL)，溶離份1為來自梯度頂部之最不稠密溶離份且溶離份15為來自梯度底部之最稠密溶離份。亦取出小球。藉由SDS－PAGE用銀染色分析所收集溶離份。用於抑制檢定之Aβ_1－42 濃度小於用於解聚檢定之濃度5倍，其減少類澱粉蛋白聚集動力學且確保在線性相內之量測。

為藉由與mAb ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11共同培育(以2種不同莫耳比率1：30及1：100，mAb＋單體Aβ_1－42 ，Aβ最終濃度為246 μM)使預形成Aβ_1－42 原纖維解聚，在37℃下將樣本培養24小時。24小時後，藉由超速離心法分離樣本且如上文及之前所述(Rzepecki等人，2004)藉由SDS－PAGE分離。

實例2.8：評估藉由分別與mAb ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11共同培育而引起之Aβ _1－42 纖維絲聚集之抑制及預形成Aβ _1－42 纖維絲之解聚的螢光檢定 BIS－ANS螢光檢定為評估mAb之抑制性質，使用BIS－ANS(LeVine,2002)螢光檢定，其特異地偵測Aβ_1－42 纖維絲之單體或非纖維狀群體。螢光量測之前，在37℃下用緩衝液(用作對照)或mAb ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11(莫耳比率1：100，mAb比Aβ_1－42 肽)將Aβ_1－42 單體預培養14小時。自動記錄相對螢光單位且結果以百分比表示為相比對照之改變。

實例2.9：ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11單株抗體與經 ¹³ C標記之β－類澱粉蛋白1－42肽之相互作用的NMR及螢光表徵 為評估mAb溶解預形成纖維或抑制纖維形成之潛在機制，執行經U－¹³ C Tyr10及Val12標記之β－類澱粉蛋白1－42肽之Th－T螢光檢定與固態NMR之間的頭對頭實驗。因此，該研究之目的為在β－類澱粉蛋白肽中及在單株抗體存在下藉由固態NMR光譜學跟蹤β－摺疊片轉變且將其與藉由Th－T螢光檢定所量測之解聚能力直接比較。

藉由Fmoc合成方案執行經標記肽之合成，該經標記肽包括在位置12處之¹³ C預標記纈胺酸(¹² Val)及在位置10處之¹³ C預標記酪胺酸(¹⁰ Tyr)。肽之身份及純度藉由MALDI質譜分析來確認。經標記β－類澱粉蛋白肽(1－42)用以藉由在37℃下在PBS緩衝液中將肽溶液培養1週來產生纖維。主要問題，即類澱粉蛋白β－肽於PBS緩衝液中之不良溶解性，可以以下方式解決；用微量氨暫時增加PBS緩衝液之pH值以溶解類澱粉蛋白β－肽。使用氨之揮發性特徵，藉由在較大PBS浴存在下培養樣本而再獲得PBS緩衝液之原始pH值。

使用Th－T螢光檢定，藉由與預形成之經¹³ C標記的類澱粉蛋白β－纖維共同培育來分析ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11之解聚能力。

為研究PBS(對照)與mAb培養之間的差異，使用PeakFit(http：//www.systat.com/－products/PeakFit)將各光譜解迴旋。藉由使用混合Lorentzian/Gaussian擬合程序將直線充分匹配。

實例2.10：ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11對類澱粉蛋白纖維之功能性 12.1 ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11抗體之結合後，Aβ1－42纖維之構形修飾及解聚引發為評估抗體能夠解聚預形成β－類澱粉蛋白(Aβ_1－42 )纖維之機制，執行硫黃素－T(Th－T)螢光檢定之頭對頭比較以量測解聚，且經U－¹³ C酪胺酸10及纈胺酸12標記之Aβ1－42肽之固態核磁共振(NMR)分析二級構形。

實例2.11：單株抗體ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11之抗原決定基定位 使用包含涵蓋Aβ1－42(藉由Mimotopes,Clayton Victoria,Australia生產且自ANAWA Trading SA,Wangen Switzerland購買)之完整胺基酸(aa)序列之總共33個生物素標記肽的肽文庫，藉由ELISA執行單株抗體ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11之抗原決定基定位。肽文庫中之肽由8、9或10－mer aa肽構成。生物素標記之完整Aβ1－42肽(人類序列)用作陽性對照(Bachem,Bubendorf,Switzerland)。另外，涵蓋Aβ1－28、Aβ17－40、Aβ1－40及Aβ1－42之較長肽用以界定該等抗體可結合之較廣區域。該等四種肽亦經生物素標記(藉由Anaspec製造且自ANAWA Trading SA,Switzerland購買)。根據製造商(Mimotopes)之說明書進行抗原決定基定位。簡言之，在4℃下，用於PBS中之0.1% BSA阻斷經抗生蛋白鏈菌素塗佈之培養板(NUNC,Roskilde,Denmark)隔夜。用PBS－0.05% Tween 20洗滌後，在室溫下用來自文庫之不同肽將培養板塗佈1小時，在於PBS中之0.1% BSA、0.1%疊氮化鈉中稀釋至10 μM之最終濃度。洗滌後，在室溫下用不同抗體將培養板培養1小時，對抗體ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11而言，在於PBS中之2% BSA、0.1%疊氮化鈉中稀釋至10 μg/ml。再次洗滌培養板且在室溫下用鹼性磷酸酶結合山羊抗小鼠IgG(Jackson Immunresearch West Grove,PA,USA)培養1小時。最終洗滌後，用磷酸酶底物(pNPP,Sigma－Aldrich,St Louis,MO,USA)培養培養板且使用ELISA培養板讀取器在3小時培養後在405 nm處讀數。

ACI－11－Ab－9展示與Aβ1－42之顯著結合，但不能結合肽文庫中之任何短肽。因此推斷，抗體需要超過8個aa以結合抗原決定基及/或ACI－11－Ab－9可識別僅存在於全長Aβ1－42中之構形抗原決定基。

ACI－12－Ab－11亦展示與Ab1－42之顯著結合，但與ACI－11－Ab－9相似，ACI－12－Ab－11不結合肽文庫中之任何短肽。

為測定抗體ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11是否可識別其他Aβ肽，評估與Aβ1－28、Aβ17－40及Aβ1－40及Aβ1－42之結合。

ACI－11－Ab－9展示與Aβ1－28、Aβ1－40及Aβ1－42之可觀結合，但不展示與Aβ17－40之任何結合。

總之，該等結果暗示，ACI－11－Ab－9之抗原決定基位於Aβ之區域1－28，且該抗原決定基比8個aa更長及/或與Aβ之結合視Aβ之構形而定。

ACI－12－Ab－11展示與Aβ1－40及Aβ1－42之顯著結合，但不展示與Aβ1－28或與Aβ17－40之任何結合。因此，ACI－12－Ab－11可僅結合全長Aβ1－40及Aβ1－42且不結合Aβ之任何較短肽。該等結果暗示，ACI－12－Ab－11所識別之抗原決定基視Aβ之構形而定，因為即使Aβ之24或28－mers亦不足以結合抗體。

實例2.12：在單一轉殖基因hAPP小鼠中，用ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11被動疫苗接種對腦類澱粉蛋白負荷之影響 為評估ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11單株抗體結合可溶性類澱粉蛋白且將可溶性類澱粉蛋白清除出腦之活體內能力，6個月大之單一hAPP小鼠(性別及年齡匹配)用於不同劑量下之被動免疫研究。在研究結束時，藉由收穫動物腦且藉由執行Aβ 1－40及Aβ 1－42特異性ELISA(TGC,Germany)來分析可溶性類澱粉蛋白負荷。

每組8－13隻動物以一週之時間間隔接受於200 μl PBS中之100、300及1000 μg單株抗體之2次注射，而單獨之PBS注射用作對照。第二次注射後1天，處死動物用於可溶性類澱粉蛋白部分之生化分析。為定量腦勻漿及/或腦脊髓液(CSF)中之可溶性部分中之人類Aβ 1－40及人類Aβ 1－42的量，使用市售酶聯結免疫吸附劑檢定(ELISA)套組(h類澱粉蛋白β 40或β 42ELISA高靈敏性，TGC，Switzerland)。根據製造商之方案執行ELISA。簡言之，在無蛋白結合能力之96孔聚丙烯培養板(Greiner,Germany)中製備標準(合成Aβ 1－40或Aβ 1－42之稀釋液)及樣本。在備有ELISA套組之樣本稀釋劑中，製備最終濃度為1000、500、250、125、62.5、31.3及15.6 pg/ml之標準稀釋液及樣本，達到60 μl之最終體積。因為類澱粉蛋白含量隨小鼠年齡而增加且因為實際評估需要樣本之讀數在標準曲線之線性部分內，所以將用於Aβ 40分析之樣本2：3稀釋，不稀釋用於Aβ 42分析之樣本。

將樣本、標準及空白(50 μl)添加至經抗Aβ塗佈的聚苯乙烯培養板(俘獲抗體選擇性識別抗原之C－末端)，該培養板另外含有選擇性抗Aβ－抗體結合物(經生物素標記之偵測抗體)，且在4℃下培養隔夜以允許形成抗體－類澱粉蛋白－抗體複合物。第二天，添加抗生蛋白鏈菌素－過氧化酶結合物，30分鐘後接著添加TMB/過氧化物混合物，導致底物轉化為有色產物，且藉助於光度測量學，用具有450 nm濾光器之ELISA讀取器量測顏色強度。藉由將吸光度與用合成Aβ 1－40或Aβ 1－42製得之標準曲線比較來獲得樣本之Aβ含量之定量。資料表示為相比平均對照值之個別改變(以相比對照之百分比計)。

實例2.13：在雙重轉殖基因hAPPxPS1小鼠中，ACI－11－ Ab－9及ACI－12－Ab－11之慢性被動投藥對斑塊負荷之影響 為評估ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11單株抗體結合類澱粉蛋白且減少腦中類澱粉蛋白斑塊之活體內能力，3.5個月大之雙重轉殖基因hAPPxPS1小鼠(性別及年齡匹配)用於4個月長之慢性被動免疫研究。在研究結束時，藉由動物腦之組織化學，藉由硫黃素S之結合來分析類澱粉蛋白斑塊。

15隻轉殖基因動物接受於PBS中之500 μg單株抗體之16次每週注射。單獨用PBS注射15隻動物，用作對照。所有注射係腹膜內給予。在處死時，將小鼠麻醉，且在4℃下，用生理血清經賁門沖洗以自腦血管移除血液。隨後，自頭蓋骨移除腦且以冠狀/額狀面中之切割分離後腦及前腦。藉由使用中線矢狀切割，將前腦均勻分成左半球及右半球。一個半球在4%聚甲醛中後固定隔夜用於組織學。將矢狀冷凍切片(vibratome)部分(40 μm)切割用於自由浮動培養且在4℃下儲存直至在具有0.1%疊氮化鈉之PBS中染色。用硫黃素S將不同含量之5個切片針對稠密斑塊染色。將所用之所有動物之切片隨機化用於染色及盲定量。用配備Sony DXC－9100P照相機之Leica DMR顯微鏡獲得影像且用電腦，使用Leica Q－Win軟體來分析。顯微鏡之光強度及聚光器設定在影像獲取方法期間保持恆定。所有獲得之影像經受相同電腦子程序以最小化研究者偏差。在分析期間，均勻應用密度切片定限。選擇菌絲層區域用於硫黃素S染色中之類澱粉蛋白負荷之自動定量。

實例2.14：在單一轉殖基因hAPP小鼠中，用ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11被動疫苗接種對記憶能力之影響 為分析ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11抗體改變或增加認知功能性之活體內能力，9個月大之單一hAPP小鼠(性別及年齡匹配)用於被動免疫研究。在免疫時期結束時，藉由新物體識別作業量測非空間認知。

每組12隻動物接受於200 μl PBS中之400 μg單株抗體之2次腹膜內注射，而單獨之PBS注射用作對照。第二次注射後1天，在新物體識別作業(ORT)^12,13 中研究認知能力。為進行ORT登記，將小鼠置放於行為場地中10分鐘且面向新的未知物體。記錄探查時間。3小時後，將相同動物再置放至相同場地中歷時第2活動期，但面對舊的、先前已探查之物體及另外面對新物體。再次記錄對兩個物體之探查時間且所得認知指數經計算為對新物體之探查時間相對總探查時間之比率，且表示為相比對照之比例變化。

實例2.15－小鼠單株抗體與Aβ1－42肽之基原纖維(PF)寡聚物富集溶離份超過低分子量(LMW)單體之結合 可使用ELISA執行小鼠抗類澱粉蛋白β單株抗體與低分子量(LMW)單體Aβ1－42肽及Aβ1－42肽之較高分子量基原纖維(PF)寡聚物富集製劑之結合。

使用2個SEC管柱、Superdex 75 HR 10/30(範圍3－70 kDa)及Superose 6 HR 10/30(範圍5－5,000 kDa)之尺寸排阻層析(SEC)用以製備由Aβ1－42肽之較高分子量(HMW)基原纖維(PF)寡聚物富集製劑及低分子量(LMW)單體製劑組成之 Aβ1－42肽溶離份。隨後，用乙酸鈾醯酯將所得溶離液染色且藉由高解析度透射電子顯微法(TEM)在100 kV下檢查以驗證所溶離Aβ1－42溶離份之結構形態。

實例2.16－ACI－12－Ab－11單株抗體(純系FK2A6A6)與Aβ1－42肽之單體富集溶離份及寡聚物富集溶離份之結合 評估抗Aβ改進抗體ACI－12－Ab－11(純系：FK2A6A6)與Aβ1－42肽之單體及寡聚物之結合。在用於該研究之前，在－80℃下儲存抗體。將Aβ1－42肽(W.M.Keck Facility,Yale University)作為冷凍乾燥粉末儲存直至使用當天。除非另外指示，否則所有其他材料均來自Sigma－Aldrich(Sigma－Aldrich Chemie GmbH,Buchs,Switzerland)。

為製備Aβ1－42肽之單體及具有改良寡聚物富集之較高分子溶離份，使用利用尺寸排阻層析(SEC)之改良方法。2個SEC管柱Supelco TSK G4000PW－XL(範圍：10－1500 kDa；Sigma)及Superose 6 HR 10/30(範圍5－5,000 kDa；GE Healthcare Bio－sciences AB Uppsala,Sweden)用以製備富集LMW單體及較高重量寡聚物溶離份之Aβ1－42肽溶離份。隨後，用乙酸鈾醯酯將所得SEC溶離液染色且藉由高解析度透射電子顯微法(TEM)在100 kV下檢查以驗證Aβ1－42溶離份之結構形態(未圖示)。為研究抗體與Aβ1－42溶離份之結合，執行ELISA。以於PBS中之2.2 μM將Aβ1－42溶離份塗佈於高度結合檢定培養板上歷時2小時。隨後，用於PBS中之0.05% Tween－20將經塗佈之培養板洗滌5次且用1.0% BSA阻斷。添加呈以指定濃度開始之連續稀釋液之抗Aβ抗體，包括對照抗體(6E10)。與鹼性磷酸酶(Jackson ImmunoResearch,Suffolk,England)及磷酸4－硝基苯酯結合之抗小鼠IgG抗體用於偵測結合。在室溫下培養14小時後，在405 nm處讀取培養板。將檢定重複3次。

圖16展示自3次單獨ELISA檢定獲得之平均(±SEM)光學密度(O.D.)值。與不富集寡聚物且主要由Aβ1－42單體組成之溶離份相比，抗體ACI－12－Ab－11顯示與富集寡聚物之Aβ1－42溶離份之優越結合(圖16A)。比較起來，對照抗體6E10與兩種Aβ1－42溶離份均同樣良好地結合(圖16B)。表2.4及2.5展示在ELISA檢定1、2及3中分別對抗體ACI－12－Ab－11及6E10所獲得之O.D.值。

該等結果表明，抗體ACI－12－Ab－11(純系：FK2A6A6)對Aβ1－42之寡聚物富集溶離份比對單體Aβ1－42展示優越之結合親和力。

實例3：Aβ ₄₂ －ApoE4結合之抑制

評估ApoE4與類澱粉蛋白之結合及根據本發明之單株抗體抑制ApoE4與Aβ₄₂ 肽之間相互作用之能力。

用PBS將人類重組ApoE4稀釋至200 nM，且在－80℃下以0.5 ml等分試樣來儲存。將1 mg之Aβ₄₂ －生物素肽再懸浮於20 μl之DMSO中且隨後再懸浮於1980 μl之PBS/0.1% BSA/0.1%疊氮化鈉中以獲得0.5 mg/ml之最終溶液。ELISA檢定用以測定rhApoE4與Aβ₄₂ 之結合。在37℃下用Aβ₄₂ －生物素(1 μM)將rhApoE4(100 nM)培養3小時以允許蛋白質與肽之結合。將混合物應用於經抗生蛋白鏈菌素塗佈之培養板上，之後用PBST(PBS＋0.05% Tween 20)洗滌3次。在室溫下(RT)培養1小時後，用PBST將培養板洗滌3次，且在4℃下用含有0.1% BSA之PBS阻斷隔夜。以在PBS中之1：3000稀釋液來使用之IgG1小鼠抗人類ApoE抗體偵測所結合ApoE4，且在室溫下將其應用於培養板上歷時2.5小時。用PBST將培養板洗滌4次，且隨後在室溫下用在PBS中1：5000稀釋之偵測抗體(偶合至鹼性磷酸酶(AP)之抗小鼠IgG)培養1小時。用4xPBST最終洗滌後，用AP底物pNPP(磷酸酶底物，磷酸4－硝基苯酯二鈉鹽六水合物)將培養板培養5.5小時，且在405 nm處使用ELISA培養板讀取器讀取。圖17概括該實驗。

藉由進行8次rhApoE4(150 nM)與Aβ₄₂ －生物素(1.5 μM)之混合物之2倍稀釋來發展ELISA檢定。添加以下陰性對照：(1)單獨的rhApoE4；(2)Aβ₄₂ －生物素；及(3)rhApoE4－Aβ₄₂ －生物素(無小鼠抗ApoE4之方案)。圖18展示僅當存在rhApoE4及Aβ₄₂ －生物素且採取完整ELISA方案時獲得之正信號。

為優化rhApoE4及Aβ₄₂ －生物素在檢定中之濃度，用恆定濃度之Aβ₄₂ －生物素(例如，正常：1.5 μM或過量：15 μM)測試rhApoE4之稀釋液(例如150 nM)。圖19展示，過量之Aβ₄₂ －生物素稀釋ELISA檢定之信號，因為結合至培養板上的與rhApoE4複合之Aβ₄₂ －生物素較少。基於該測試，選擇rhApoE4之最佳濃度。

使用恆定濃度之100 nM之rhApoE4將該檢定中Aβ₄₂ －生物素之濃度優化。在ELISA設定中測試Aβ₄₂ －生物素之稀釋液(例如，起始濃度為1.5 μM(稀釋至較低濃度，例如低達1500 nM))。基於圖20中所示之結果，選擇Aβ₄₂ －生物素之1 μM之最佳濃度以測定單株抗體對rhApoE4與Aβ₄₂ －生物素之結合之效應。

使用上述ELISA檢定評估本發明之抗體中之一或多者對rhApoE4與Aβ₄₂ －生物素之結合的效應，但另外包括在塗佈之前呈結合混合物之本發明抗體。舉例而言，可使用抗體之2倍稀釋液，以50 μg/mL之濃度開始。可在先組合ApoE4及Aβ₄₂ －生物素時包括抗體，或可在先組合ApoE4及Aβ₄₂ －生物素之後(例如若干小時後)包括抗體。在前一情況下，評估本發明之抗體防止或抑制ApoE4與Aβ₄₂ －生物素之相互作用的能力，而在後一情況下，評估本發明之抗體破壞ApoE4與Aβ₄₂ －生物素之間的預先存在複合物的能力。

寄存物： 以下融合瘤細胞株係依據布達佩斯條約(Budapest Treaty)之規定，由Braunschweig,Mascheroder Weg 1 B,38124 Branuschweig之"Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)寄存：

參考文獻

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WO 2004/058258 WO 96/1359 WO 96/29605

圖1展示使用涵蓋Aβ1－42之完整胺基酸序列的重疊肽的肽文庫，藉由ELISA所執行之鼠單株抗體ACI－24－Ab－3之抗原決定基定位研究的結果。與完整Aβ1－42之結合用作陽性對照。所有其他肽為8－10 aa長。肽編號對應於肽以其起始之Aβ1－42序列中之aa。結果表示為O.D.。

圖2展示使用涵蓋Aβ1－28、17－40、1－40、1－42A(Anaspec)或1－42B(Bachem)之較長肽，藉由ELISA所執行之鼠單株抗體ACI－24－Ab－3的抗原決定基定位研究的結果。結果表示為扣除背景後之O.D.。結果展示2次獨立實驗之平均值±1標準誤差。

圖3描述在1：100及1：10抗體與Aβ1－42之莫耳比率下，Aβ1－42聚集之ACI－24－Ab－3介導抑制。結果展示2次獨立實驗之平均值±1標準誤差。

圖4描述在1：100及1：10抗體與Aβ1－42之莫耳比率下，預聚集Aβ1－42之ACI－24－Ab－3介導解聚。結果展示2次獨立實驗之平均值±1標準誤差。

圖5描述ACI－24－Ab－3抗體與Aβ1－42肽之較高分子量(HMW)基原纖維(PF)寡聚物富集製劑及低分子量(LMW)單體製劑之結合。

圖6描述6E10對照抗體與Aβ1－42肽之較高分子量(HMW)基原纖維(PF)寡聚物富集製劑及低分子量(LMW)單體製劑之結合。

圖7描述ACI－24－Ab－3抗體(A)及對照抗體6E10(B)與Aβ1－42肽之單體及寡聚物之結合。結果報導為3次獨立實驗之平均(±SEM)光學密度(O.D.)值。

圖8展示使用涵蓋Aβ1－42之完整胺基酸序列的重疊肽的肽文庫，藉由ELISA所執行之鼠單株抗體ACI－11－Ab－9之抗原決定基定位研究的結果。與完整Aβ1－42之結合用作陽性對照。所有其他肽為8－10 aa長。肽編號對應於肽以其起始之Aβ1－42序列中之aa。結果表示為O.D.。

圖9展示使用涵蓋Aβ1－28、17－40、1－40、1－42A(Anaspec)或1－42B(Bachem)之較長肽，藉由ELISA所執行之鼠單株抗體ACI－11－Ab－9之抗原決定基定位研究的結果。結果表示為扣除背景後之O.D.。結果展示2次獨立實驗之平均值±1標準誤差。

圖10展示使用涵蓋Aβ1－42之完整胺基酸序列的重疊肽的肽文庫，藉由ELISA所執行之鼠單株抗體ACI－12－Ab－11之抗原決定基定位研究的結果。與完整Aβ1－42之結合用作陽性對照。所有其他肽為8－10 aa長。肽編號對應於肽以其起始之Aβ1－42序列中之aa。結果表示為O.D.。

圖11展示使用涵蓋Aβ1－28、17－40、1－40、1－42A(Anaspec)或1－42B(Bachem)之較長肽，藉由ELISA所執行之鼠單株抗體ACI－11－Ab－9之抗原決定基定位研究的結果。結果表示為扣除背景後之O.D.。結果展示2次獨立實驗之平均值±1標準誤差。

圖12描述在1：100及1：10抗體與Aβ1－42之莫耳比率下，Aβ1－42聚集之ACI－11－Ab－9介導抑制。結果展示2次獨立實驗之平均值±1標準誤差。

圖13描述在1：100及1：10抗體與Aβ1－42之莫耳比率下，預聚集Aβ1－42之ACI－11－Ab－9介導解聚。結果展示3次獨立實驗之平均值±1標準誤差。

圖14描述在1：100及1：10抗體與Aβ1－42之莫耳比率下，Aβ1－42聚集之ACI－12－Ab－11介導抑制。結果展示2次獨立實驗之平均值±1標準誤差。

圖15描述在1：100及1：10抗體與Aβ1－42之莫耳比率下，預聚集Aβ1－42之ACI－12－Ab－11介導解聚。結果展示2次獨立實驗之平均值±1標準誤差。

圖16描述ACI－12－Ab－11抗體(A)及對照抗體6E10(B)與Aβ1－42肽之單體及寡聚物之結合。結果報導為3次獨立實驗之平均(±SEM)光學密度(O.D.)值。

圖17描述在本發明中用以分析rhApoE4與Aβ₄₂ －生物素之結合之ELISA檢定中的步驟。

圖18表示自用於rhApoE4與Aβ₄₂ －生物素結合之ELISA檢定之顯影獲得的結果。為優化rhApoE4及Aβ₄₂ －生物素之濃度，用恆定濃度之Aβ₄₂ －生物素(正常：1.5 μM或過量：15 μM)測試rhApoE4(150 nM)之8*2倍稀釋液。使用恆定濃度之100 nM之rhApoE4優化Aβ₄₂ －生物素之濃度。在ELISA設定中測試Aβ₄₂ －生物素之8*2倍稀釋液，起始濃度為1.5 μM(1500 nM)。

圖19描述過量之Aβ₄₂ －生物素對與rhApoE4複合之Aβ₄₂ －生物素與ELISA檢定培養板之結合的效應。

圖20描述用於測定單株抗體對rhApoE4與Aβ₄₂ －生物素之結合之效應的Aβ₄₂ －生物素之最佳濃度。

表1.1闡明本文中所述之抗體及用於產生某些抗體之抗原構築體。

表1.2 Aβ肽與ACI－24－Ab－3之結合。結果表示為背景扣除後之O.D.。

表1.3 如藉由ELISA所分析ACI－24－Ab－3與Aβ1－42之33個重疊肽的結合。與完整Aβ1－42之結合用作陽性對照。所有其他肽為8－10 aa長。肽編號對應於肽以其起始之Aβ1－42序列中之aa。結果表示為O.D.。

表1.4 ACI－24－Ab－3(小鼠EJ1A9)抗體與Aβ1－42肽之較高分子量(HMW)基原纖維(PF)寡聚物富集製劑及低分子量(LMW)單體製劑之結合。

表1.5 6E10對照抗體與Aβ1－42肽之基原纖維製劑及LMW較高分子量(HMW)基原纖維(PF)寡聚物富集製劑及低分子量(LMW)單體製劑之結合。

表1.6 ACI－24－Ab－3(小鼠EJ1A9)抗體與Aβ1－42肽之單體及寡聚物之結合。結果表示為O.D.值。

表1.7 6E10對照抗體與Aβ1－42肽之單體及寡聚物之結合。結果表示為O.D.值。

表2.1陳述本文中所述之抗體及用於產生某些抗體之抗原構築體。

表2.2 Aβ肽與ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11之結合。結果表示為背景扣除後之O.D.。

表2.3如藉由ELISA所分析ACI－11－Ab－9及ACI－12－Ab－11與Aβ1－42之33個重疊肽的結合。與完整Aβ1－42之結合用作陽性對照。所有其他肽為8－10 aa長。肽編號對應於肽以其起始之Aβ1－42序列中之aa。結果表示為O.D.。

表2.4 ACI－12－Ab－11(純系FK2A6A6)抗體與Aβ1－42肽之單體及寡聚物之結合。結果表示為O.D.值。

表2.5 6E10對照抗體與Aβ1－42肽之單體及寡聚物之結合。結果表示為O.D.值。

SEQ ID NO：1：抗原肽Aβ_22－35

SEQ ID NO：2：抗原肽Aβ_29－40

SEQ ID NO：3：Aβ肽片段Aβ _1－28

SEQ ID NO：4：Aβ肽片段Aβ _17－40

SEQ ID NO：5：Aβ肽片段Aβ_1－40

SEQ ID NO：6：Aβ肽片段Aβ _1－42

SEQ ID NO：7：ACI－24－Ab－3之輕鏈可變域序列之胺基酸序列。

SEQ ID NO：8：ACI－24－Ab－3之重鏈可變域序列之胺基酸序列。

SEQ ID NO：9：輕鏈CDR1之胺基酸序列

SEQ ID NO：10：輕鏈CDR2之胺基酸序列

SEQ ID NO：11：輕鏈CDR3之胺基酸序列

SEQ ID NO：12：重鏈CDR1之胺基酸序列

SEQ ID NO：13：重鏈CDR2之胺基酸序列

SEQ ID NO：14：重鏈CDR3之胺基酸序列

SEQ ID NO：15：編碼ACI－24－Ab－3之輕鏈可變域序列之聚核苷酸序列。

SEQ ID NO：16：編碼ACI－24－Ab－3之重鏈可變域序列之聚核苷酸序列。

SEQ ID NO：17：ACI－11－Ab－9之輕鏈可變域序列之胺基酸序列。

SEQ ID NO：18：ACI－11－Ab－9之重鏈可變域序列之胺基酸序列。

SEQ ID NO：19：ACI－12－Ab－11之輕鏈可變域序列之胺基酸序列。

SEQ ID NO：20：ACI－12－Ab－11之重鏈可變域序列之胺基酸序列。

SEQ ID NO：21：輕鏈CDR1之胺基酸序列

SEQ ID NO：22：輕鏈CDR2之胺基酸序列

SEQ ID NO：23：輕鏈CDR3之胺基酸序列

SEQ ID NO：24：重鏈CDR1之胺基酸序列

SEQ ID NO：25：重鏈CDR2之胺基酸序列

SEQ ID NO：26：重鏈CDR3之胺基酸序列

SEQ ID NO：27：編碼ACI－11－Ab－9之輕鏈可變域序列之聚核苷酸序列。

SEQ ID NO：28：編碼ACI－11－Ab－9之重鏈可變域序列之聚核苷酸序列。

SEQ ID NO：29：編碼ACI－12－Ab－11之輕鏈可變域序列之聚核苷酸序列。

SEQ ID NO：30：編碼ACI－12－Ab－11之輕鏈可變域序列之聚核苷酸序列。

<110> 1.瑞士商AC免疫公司2.美商建南德克公司<120> 單株抗體<130> 089667－0105 <140> 097122016 <141> 2008－06－12 <150> 60/943,543 60/943,541 60/943,790 <151> 2007－06－12 2007－06－12 2007－06－13 <160> 16 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> 智人<220> <221> MISC_FEATURE <223> 抗原肽AB 22－35 <400> 1<210> 2 <211>12 <212> PRT <213> 智人<220> <221> MISC_FEATURE <223> 抗原肽AB 29－40 <400> 2<210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> 智人<220> <221> MISC_FEATURE <223> A－β肽片段AB 1－28 <400> 3<210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> 智人<220> <221> MISC_FEATURE <223> A－β肽片段AB 17－40 <400> 4<210> 5 <211> 40 <212> PRT <213> 智人<220> <221> MISC_FEATURE <223> A－β肽片段AB 1－40 <400> 5<210> 6 <211> 42 <212> PRT <213> 智人<220> <221> MISC_FEATURE <223> A－β肽片段AB 1－42 <400> 6<210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> ACI－24－Ab－3之輕鏈可變域<400> 7<210> 8 <211> 121 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> ACI－24－Ab－3之重鏈可變域X可為任何胺基酸<220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸<400> 8 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 輕鏈CDR1 <400> 9<210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 輕鏈CDR2 <400> 10<210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 輕鏈CDR3 <400> 11<210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 重鏈CDR1 <400> 12<210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 重鏈CDR2 X可為任何胺基酸<220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸<400> 13<210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 重鏈CDR3 <400> 14<210> 15 <211> 321 <212> DNA <213> 小家鼠<220> <221> misc_feature <223> ACI－24－Ab－3輕鏈可變區編碼序列<400> 15<210> 16 <211> 363 <212> DNA <213> 小家鼠 <220> <221> misc_feature <223> ACI－24－Ab－3重鏈可變區編碼序列<400> 16<210> 17 <211> 109 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> ACI－11－Ab－9之輕鏈可變域<400> 17<210> 18 <211> 117 <212> RRT <213>小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> ACI－11Ab－9之重鏈可變域 <400> 18<210> 19 <211> 109 <212> FRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> ACI－12－Ab－11之輕鏈可變域<400> 19<210> 20 <211> 117 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> ACI－12－Ab－11之重鏈可變域<400> 20<210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISSC_FEATURE <223> 輕鏈CDR1 <400> 21<210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 輕鏈CDR2 <400> 22 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 輕鏈CDR 3<400> 23<210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 重鏈CDR1 <400> 24<210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 重鏈CDR2 <400> 25<210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> MISC_FEATURE <223> 重鏈CDR3 <400> 26<210> 27 <211> 327 <212> DNA <213> 小家鼠<220> <221> misc_feature <223> ACI－11－Ab－9輕鏈可變域編碼序列<400> 27<210> 28 <211> 351 <212> DNA <213> 小家鼠<220> <221> misc_feature <223> ACT－11－Ab－9重鏈可變域編碼序列<400> 28<210> 29 <211> 327 <212> DNA <213> 小家鼠<220> <221> misc_feature <223> ACI－12－Ab－11輕鏈可變域編碼序列<400> 29 <210> 30 <211> 351 <212> DNA <213> 小家鼠<220> <221> misc_feature <223> ACI－12－Ab－11重鏈可變域編碼序列<400> 30

(無元件符號說明)

Claims

一種特異性結合β類澱粉蛋白之抗體或其抗原決定區結合片段，其中該抗體或其抗原決定區結合片段包含：a. 一輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：7所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列，或其功能部分，其包含包括SEQ ID NO：9-11所示多肽序列之三個輕鏈CDR；及一重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：8所示之序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列，或其功能部分，其包含包括SEQ ID NO：12-14所示多肽序列之三個重鏈CDR；或b. SEQ ID NO：7及8所示之胺基酸序列，其中該抗體已藉由將至少1個、至少2個、至少3個或3個以上保守性取代引入SEQ ID NO：7及8之序列中而改變，其中該抗體基本上維持完全功能性，且其中SEQ ID NO：8序列中位置52之胺基酸係任何胺基酸。
如請求項1之抗體或其抗原決定區結合片段，其中該抗體或其抗原決定區結合片段包含：SEQ ID NO：7及8所示之胺基酸序列，其中該抗體已藉由將1個、2個、或3個保守性取代引入SEQ ID NO：7及8之序列中而改變，且其中SEQ ID NO：8序列中位置52之胺基酸係選自由半胱胺酸、酪胺酸及絲胺酸組成之群。
如請求項2之抗體或其抗原決定區結合片段，其中該抗體或其抗原決定區結合片段包含：SEQ ID NO：7及8所示之胺基酸序列，其中該抗體已藉由將1個、2個、或3個保守性取代引入SEQ ID NO：7及8之序列中而改變，且其中SEQ ID NO：8序列中位置52之胺基酸係半胱胺酸。
如請求項1之抗體或其抗原決定區結合片段，其中該抗體或其抗原決定區結合片段包含：(i)包含如SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列之輕鏈可變區，及(ii)包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列之重鏈可變區。
一種特異性結合β類澱粉蛋白之抗體或其抗原決定區結合片段，其中該抗體或其抗原決定區結合片段之CDR區為：i 包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之該抗體輕鏈可變區之CDR1；ii 包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之該抗體輕鏈可變區之CDR2；iii 包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之該抗體輕鏈可變區之CDR3；iv 包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之該抗體重鏈可變區之CDR1；v. 包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之該抗體重鏈可變區之CDR2；及vi. 包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之該抗體重鏈可變區之CDR3。
如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段，其中該抗體為單株抗體。
如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段，其中該抗體係經分離。
如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段，其中該抗體係嵌合抗體或人類抗體。
如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段，其中該抗體係人化抗體。
如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段，其中該抗原決定區結合片段係Fab、F(ab')₂ 、scFv或Fv片段。
一種經分離之多核苷酸，其編碼如請求項1至10中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段。
如請求項11之經分離之多核苷酸，其包含至少一個如SEQ ID NO：15-16所示之核苷酸序列。
一種治療組合物，其包含治療有效量的如請求項1至10中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段。
如請求項13之組合物，其進一步包含生物活性物質，其係選自由一或多種用於類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質所引起或相關之疾病及病症之藥物治療中的化合物，該等疾病及病症包括澱粉樣變性病；抵抗氧化應力之化合物；抗細胞凋亡化合物；金屬螯合劑；DNA修復抑制劑，諸如哌侖西平(pirenzepin)及代謝物；3-胺基-1-丙烷磺酸(3APS)；1,3-丙烷二磺酸酯(1,3PDS)；分泌酶活化劑；β及γ分泌酶抑制劑；τ蛋白質；神經傳遞素；β-片斷裂劑；消炎分子；或膽鹼酯酶抑制劑(ChEIs)，諸如他克林(tacrine)、雷斯替明(rivastigmine)、多奈哌齊(donepezil)、加蘭他敏(galantamine)，及/或營養補充物。
如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段，其係用於a. 治療類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質所引起或相關之疾病及病症，包括澱粉樣變性病；或b. 治療或減輕類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質所引起或相關之疾病及病症之影響，該等疾病及病症包括澱粉樣變性病，神經學病症，諸如阿茲海默氏病(AD)，及以認知記憶能力損失為特徵之疾病或病狀，諸如輕度認知障礙(MCI)、路易體性癡呆(Lewy body dementia)、唐氏症候群(Down's syndrome)、遺傳性大腦出血併發澱粉樣變性病(荷蘭型)(Dutch type)；關島帕金森-癡呆綜合症(Guam Parkinson-Dementia com-plex)；以及其他基於類澱粉狀蛋白質或相關之疾病，諸如進行性核上麻痺、多發性硬化症；庫賈氏病(Creutzfeld Jacob disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、HIV相關之癡呆、ALS(肌萎縮性側索硬化)、包涵體肌炎(IBM)、成年發病型糖尿病；老年心臟澱粉樣變性病；內分泌腫瘤，及黃斑退化；或c. 降低罹患腦中斑塊負荷增加相關疾病或病狀之個體腦中斑塊負荷；或d. 降低罹患腦中斑塊負荷增加相關疾病或病狀之個體腦中的斑塊量；或e. 減少罹患腦中可溶性Aβ濃度增加相關疾病或病狀之個體腦中可溶性Aβ總量；或f. 保留或增加具有類澱粉蛋白相關之疾病或病狀之個體之認知記憶能力。
如請求項15之抗體或其抗原決定區結合片段，其中該個體為人類。
一種細胞株，其特徵在於產生如請求項1至10中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段。
一種診斷患者類澱粉蛋白相關之疾病或病狀或其因素之方法，其包含偵測取自患者之樣本中之抗體或其抗原決定區結合片段與該類澱粉蛋白質之抗原決定基之免疫特異結合，該方法包括以下步驟(a)使取自患者之懷疑含有該類澱粉蛋白質之樣本與如請求項1至10中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段接觸；(b)使該抗體或其抗原決定區結合片段結合該類澱粉蛋白質以形成免疫複合物；(c)偵測該免疫複合物之形成；及(d)將該免疫複合物之存在或不存在與該樣本中類澱粉蛋白質之存在或不存在相關聯。
一種測定個體組織中類澱粉蛋白生成之斑塊負荷程度之方法，其包含(a)用如請求項1至10中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段測試取自受試個體之樣本中類澱粉蛋白質之存在，其中該樣本為該個體組織之代表；(b)測定與該抗原或其抗原決定區結合片段結合之抗體量；及(c)計算該個體組織中之斑塊負荷。
一種用於監測個體最小殘留疾病之方法，其中該方法包含：(a)使取自個體之懷疑含有該類澱粉蛋白質之樣本與如請求項1至10中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段接觸；(b)使該抗體或其抗原決定區結合片段結合該類澱粉蛋白質以形成免疫複合物；(c)偵測該免疫複合物之形成；(d)將該免疫複合物之存在或不存在與該樣本中類澱粉蛋白質之存在或不存在相關聯；及(e)將該免疫複合物之量與正常對照值比較，其中與正常對照值相比，該聚集體之量增加表示該個體仍罹患最小殘留疾病。
一種用於預測個體對以如請求項1至10中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段治療之反應性的方法，其包含 (a)使取自個體之懷疑含有該類澱粉蛋白質之樣本與如請求項1至10中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段接觸；(b)使該抗體或其抗原決定區結合片段結合該類澱粉蛋白質以形成免疫複合物；(c)偵測該免疫複合物之形成；(d)將該免疫複合物之存在或不存在與該樣本中類澱粉蛋白質之存在或不存在相關聯；及(e)比較該治療開始之前及之後該免疫複合物的量，其中該聚集體之量減少表示該個體對於該治療具有高反應潛力。
如請求項18至21中任一項之方法，其中該患者或個體為人類。
一種測試套組，其包含如請求項1至10中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段。
如請求項13之治療組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑。
如請求項23之測試套組，其進一步包含關於使用該等抗體或其抗原決定區結合片段以結合類澱粉蛋白質以形成免疫複合物及偵測該免疫複合物之形成以便將該免疫複合物之存在或不存在與類澱粉蛋白質之存在或不存在相關聯之說明書。
一種如請求項1至10中任一項之抗體或其抗原決定區結合片段之用途，其係用於製備供下列用途之藥物： a. 治療類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質所引起或相關之疾病及病症，包括澱粉樣變性病；或b. 治療或減輕類澱粉蛋白或類澱粉狀蛋白質所引起或相關之疾病及病症之影響，該等疾病及病症包括澱粉樣變性病，神經學病症，諸如阿茲海默氏病(AD)，及以認知記憶能力損失為特徵之疾病或病狀，諸如輕度認知障礙(MCI)、路易體性癡呆(Lewy body dementia)、唐氏症候群(Down's syndrome)、遺傳性大腦出血併發澱粉樣變性病(荷蘭型)(Dutch type)；關島帕金森-癡呆綜合症(Guam Parkinson-Dementia com-plex)；以及其他基於類澱粉狀蛋白質或相關之疾病，諸如進行性核上麻痺、多發性硬化症；庫賈氏病(Creutzfeld Jacob disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、HIV相關之癡呆、ALS(肌萎縮性側索硬化)、包涵體肌炎(IBM)、成年發病型糖尿病；老年心臟澱粉樣變性病；內分泌腫瘤，及黃斑退化；或c. 降低罹患腦中斑塊負荷增加相關疾病或病狀之個體腦中斑塊負荷；或d. 降低罹患腦中斑塊負荷增加相關疾病或病狀之個體腦中的斑塊量；或e. 減少罹患腦中可溶性Aβ濃度增加相關疾病或病狀之個體腦中可溶性Aβ總量；或f. 保留或增加具有類澱粉蛋白相關之疾病或病狀之個體之認知記憶能力。
如請求項26之用途，其中該個體為人類。
一種製造特異性結合β類澱粉蛋白之抗體之方法，其包含培養如請求項17之細胞株之步驟。
如請求項28之方法，其進一步包含自細胞株分離該抗體。