CN113311153B - 一种用于阿尔茨海默病诊疗一体化的多功能的纳米粒子 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医学工程技术领域领域，公开了一种用于阿尔茨海默病诊疗一体化的多功能的纳米粒子，该多功能的纳米粒子，是由氨基、羧基或N‑羟基琥珀酰亚胺修饰的纳米粒子与抗hAβ1‑42抗体偶联而成。本发明利用抗hAβ1‑42抗体对纳米粒子进行功能化，得到的抗体功能化的纳米粒子，能够用于检测、清除人β‑淀粉样蛋白(human amyloid beta peptide(1‑42),hAβ1‑42)、氧自由基与成像示踪，集多种功能于一体。

Description

一种用于阿尔茨海默病诊疗一体化的多功能的纳米粒子
技术领域
本发明属于医学工程技术领域领域，更具体地，涉及一种用于阿尔茨海默病诊疗一体化的多功能的纳米粒子。
背景技术
阿兹海默病(Alzheimer's disease,AD)，又译为阿尔茨海默病，是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，其病理特征是淀粉样斑块和神经原纤维缠结的大脑沉积。目前，大多数阿尔茨海默病的病因仍然是未知的，只有1％到5％的病例的基因差异已经被确认。阿尔茨海默病是痴呆症最常见的病因，全球60％至80％的痴呆症病例由阿尔茨海默病导致。阿尔茨海默病在老年人中患病率高，且其发病率随年龄增长而成倍增加。截至2020年，中国阿尔茨海默病每年新发患者超过100万例，阿尔茨海默病总患者人数接近750万例。随着老龄化趋势的加重，我国人口结构已经步入老龄化，据不完全统计我国阿尔茨海默病患者总数至2029年预计将会超过1000万例。毫无疑问，防治阿尔茨海默病已经成为全球最重要的公共卫生问题。目前用于阿尔茨海默病治疗的药物均为改善症状的药物，尚无真正的改善疾病的治疗(disease modifying therapy，DMT) 来减缓、阻止或逆转AD患者的神经元丢失，毫无疑问，这是目前最迫切的未满足临床需求。
目前认为，人淀粉样蛋白-β(Aβ)在AD发生、发展中起重要作用。Aβ多肽经历了由单体(monomers)到寡聚体(oligomers)，然后再形成原纤维(protofibrillar)和纤维(fibrillar)的聚集过程，在这一过程中Aβ的二级结构由a螺旋向β折叠转换。尽管早些年的研究倾向于支持纤维化Aβ具有更大的细胞毒性，近年的“Aβ寡聚体学说”认为可溶性Aβ寡聚物(Aβo)是神经毒性的主要来源，这种可溶性Aβ在纳摩尔水平就可以引起神经元损伤、突触功能异常和氧化应激反应等，并影响突触的可塑性。人们逐渐认识到Aβ代谢失常是AD病理改变的中心环节，Aβ的产生和清除之间的不平衡引发 Aβ沉积。因此，抑制Aβ产生、聚集以及促进Aβ清除成为AD治疗的有效策略。Irina Conboy及其同事发现用生理盐水和白蛋白的混合物替换一半的血浆可以逆转衰老的迹象，并使年老小鼠的肌肉、大脑和肝脏组织恢复活力。此外，Fenglei Gao及其同事利用基于氮化碳的纳米捕获器：具有金属离子螯合作用的智能纳米系统，用于增强磁靶向光疗老年痴呆症。Taeghwan Hyeon等利用磁铁矿/二氧化铈纳米粒子组件用于阿尔茨海默氏病体外清除淀粉样β蛋白。上述的治疗方法均取得一定的治疗效果，表明，外周血液 hAβ的清除有利于减缓AD疾病的病理进程。但是，大分子蛋白(抗体)通过血脑屏障的运输效率很低，药物载体的无靶向特异性也降低了药物在目标区域的作用效率和治疗效果。研究表明，几乎98％的药物分子都难以透过而入脑，即使是一些蛋白多肽和基因药物也难顺利的通过血脑屏障，故而给我们在治愈脑部疾病上带来了巨大的挑战。而药物能透过血脑屏障通常需具备分子量在500Da以下和较高的脂溶性，然而用于治疗AD 的药物只有极少数能达到这点。因此，传统的单一抗体治疗或者磁铁矿/二氧化铈纳米粒子仅能实现外周血中Aβ或者氧自由基的清除，而不能进一步的进入脑中实现脑中Aβ和氧自由基的清除。相反脑中Aβ和氧自由基的清除，对减缓疾病的进程更为重要。但是，目前的目前既能实现外周血中及脑中双向清除的Aβ或者氧自由基的多功能纳米粒子很少报道。更为重要的是治疗过程与动态成像示踪及体外诊断亦不能同时进行，对疾病的靶向治疗和体外诊断的效果有限。因此，发展集靶向治疗与成像示踪及体外诊断于一体的新技术手段，具有十分重要的社会意义和经济意义。
纳米粒载药系统作为AD药物治疗的载体，可使生物大分子、化学药物通过脑靶向递药的策略提高脑部的摄取，减小药物对其他组织器官产生的不良影响，从而提高治疗效果。目前研究的靶向药物传输载体主要有脂质体、纳米粒和胶束。其中，纳米粒通常指粒径小于100nm的形状规则的粒子，它们具有穿透生物BBB屏障的惊人能力，从而提高了整体治疗性能。此外，由于纳米粒子可以进一步的修饰成为具有靶向性、抗氧化与螯合金属离子于一体的多功能的纳米颗粒。
对于AD，靶向药物传输显得更为重要。具有靶向性的纳米颗粒，可使生物大分子及化学药物顺利通过血脑屏障，靶向运输到病灶位置，从而提高治疗效果。越来越多的研究表明只有沉积在致密的神经斑才会有神经毒性，而毒性物质的聚集才是真正病理改变的第一步。Aβ的产生和清除在生理情况下是一个动态平衡的过程，病理情况下失衡导致了神经元功能丧失和痴呆。Aβ的聚集过程不仅是依靠Aβ肽与肽之间的相互作用，同时也受其他因素的调节如β、γ分泌酶的活性、氧自由基等，所以通过针对性地选择药物抑制该过程，将可能作为药物的靶标之一。因此，针对Aβ聚集的阻断和生成的调节进行研究，并开发出相应的药物被认为是很有前途的。
对于AD这种具有进行性的退行性神经疾病，单纯的靶向治疗还是远远不够的，准确的检测并评估疾病的进程是评价治疗的关键。目前AD的临床检测主要有β-淀粉样蛋白的PET成像和基于脑脊液的Aβ检测这两种方法。临床上PET检测价格昂贵，每次检测价格在人民币7千至1万元之间，且设备有限，导致了很多患者未能及时就医，进而失去了最佳治疗时间；而基于脑脊液生物标志物的检测需要通过腰椎穿刺，创伤较大，难以短时间内进行多次取样。相反，基于血液生物标志物的测试方式简单、易用，有利于对病人的筛查，但存在生物标志物浓度低，干扰信号大的缺陷。早期的研究结果表明外周血中异常减少的可溶性的hAβ1–42是AD很好的生物标志物与AD疾病进程密切相关。随后的研究结果进一步证明，相比其他形式的淀粉样蛋如人淀粉样蛋白-β1-38 (hAβ1-38)、人淀粉样蛋白-β1-40(hAβ1-40)，可溶性淀粉样蛋白寡聚体(hAβ1-42Oligomers， hAβ1-42Os)显示出强神经毒性和抑制突触功能，与认知能力下降相关性更大，是AD诊断与治疗很有吸引力的靶标。目前已报道了多种针对淀粉样蛋白单体及可溶性寡聚体的检测方法，较为遗憾的是，目前仅实现了单靶标的检测且主要基于较为传统的ELISA 检测方法，难以进行像血液等复杂生物样本的检测。此外，由于血液中的淀粉样蛋白单体及可溶性寡聚体含量极低，检测前通常需要进行富集，以提高检测的准确率。与传统的ELISA检测方法相比，基于双抗夹心法建立的免疫纳米粒子检测技术，能够在特殊生物样品中特异的富集靶标物质，进而对靶标物质进行定性定量的检测。相比传统的 ELISA检测方法，其灵敏度更高，检测时间更短。但是，目前很少报道将免疫纳米粒子检测技术应用于阿尔茨海默病的早期诊断，同时实现淀粉样蛋白单体、寡聚体的两种生物标志物的检测方法还尚未报道。利用抗体功能化的纳米粒子应用于清除外周血及脑中淀粉样蛋白及异常的氧自由基还未见报道，是否有助于缓解期阿尔茨海默病的疾病进程还有待进一步的确定。
综上所述，开发一种用于阿尔茨海默病诊疗一体化的多功能的纳米粒子，并将其应用于阿尔茨海默病的早期诊断及其靶向清除对于阿尔茨海默的早期诊断，靶向治疗具有重大意义。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种用于阿尔茨海默病诊疗一体化的多功能的纳米粒子，利用抗hAβ1-42抗体对纳米粒子进行功能化，得到的抗体功能化的纳米粒子(即，多功能纳米粒子)能够用于检测、清除人β-淀粉样蛋白 (humanamyloid beta peptide(1-42),hAβ1-42)、氧自由基与成像示踪，集多种功能于一体。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于阿尔茨海默病诊疗一体化的多功能的纳米粒子，其特征在于，是由氨基、羧基或N-羟基琥珀酰亚胺修饰的纳米粒子与抗hAβ1-42抗体偶联而成。
作为本发明的进一步优选，所述纳米粒子选自四氧化三铁纳米粒子、氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子；其中，所述氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子是由氧化铈纳米粒子、氧化铁纳米粒子与介孔硅纳米粒子三者经过化学反应形成的混合物。
作为本发明的进一步优选，所述氨基、羧基或N-羟基琥珀酰亚胺修饰的纳米粒子，具体选自：氨基修饰的四氧化三铁纳米粒子，氨基修饰的氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子，羧基修饰的介孔硅纳米粒子，氨基、羧基、或者N-羟基琥珀酰亚胺修饰的磁性纳米粒子，氨基、羧基、或者N-羟基琥珀酰亚胺修饰的富勒烯，氨基、羧基、或者N-羟基琥珀酰亚胺修饰的碳纳米管。
作为本发明的进一步优选，所述抗hAβ1-42抗体选自：单克隆抗体1F12、单克隆抗体2C6、单克隆抗体6E10、单克隆抗体158，以及具有相似功能的能识别hAβ1–42Ms、 hAβ1–42Os或hAβ1–42Fs的多克隆抗体，具有相似功能的能识别hAβ1–42Ms、hAβ1–42Os或 hAβ1–42Fs的单链抗体；其中，hAβ1–42Ms代表人β-淀粉样蛋白单体；hAβ1–42Os代表人β- 淀粉样蛋白寡聚体；hAβ1–42Fs代表人β-淀粉样蛋白原纤维；
优选的，所述抗hAβ1-42抗体选自：单克隆抗体1F12、单克隆抗体2C6、单克隆抗体6E10，其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9 月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020131；分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020132。
按照本发明的另一方面，本发明提供了上述多功能的纳米粒子的应用，其特征在于，是用于制备：
(i)人淀粉样蛋白-β单体(Aβ1–42Monomers(Aβ1–42Ms))和人淀粉样蛋白-β寡聚体(Aβ1-42Oligomers(Aβ1–42Os))特异性检测试剂盒；
或(ii)人淀粉样蛋白-β寡聚体(Aβ1-42Oligomers(Aβ1–42Os))特异性检测试剂盒；
或(iii)清除血液以及脑中Aβ1–42Ms、Aβ1–42Os和/或氧自由基的生物制品；
或(iv)人淀粉样蛋白-β单体(Aβ1–42Monomers(Aβ1–42Ms))、或人淀粉样蛋白-β寡聚体(Aβ1-42Oligomers(Aβ1–42Os))的特异性成像示踪试剂。
按照本发明的又一方面，本发明提供了一种用于检测人淀粉样蛋白-β单体和人淀粉样蛋白-β寡聚体的特异性检测试剂盒，其特征在于，包括上述多功能的纳米粒子与HRP标记的抗hAβ1-42抗体，其中，
所述多功能的纳米粒子表面的抗hAβ1-42抗体具体为单克隆抗体1F12；
所述HRP标记的抗hAβ1-42抗体具体为HRP标记的单克隆抗体2C6；
其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9月14 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020131，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学；分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020132，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学。
按照本发明的再一方面，本发明提供了一种用于特异性检测人淀粉样蛋白-β寡聚体的检测试剂盒，其特征在于，包括上述多功能的纳米粒子与HRP标记的抗hAβ1-42抗体，其中，
所述多功能的纳米粒子表面的抗hAβ1-42抗体具体为单克隆抗体1F12；
所述HRP标记的抗hAβ1-42抗体具体为HRP标记的单克隆抗体1F12；
其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9月14 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020131。
作为本发明的进一步优选，所述检测试剂盒还包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB) 组分，用于起到催化作用。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明利用抗hAβ1-42抗体对纳米粒子进行功能化，得到可用于阿尔茨海默病诊疗一体化的多功能的纳米粒子，是一种用于检测、清除外周血和脑中人β-淀粉样蛋白(human amyloid beta peptide(1-42),hAβ1-42)、氧自由基与成像示踪于一体的多功能纳米粒子。该多功能纳米粒子，包括能特异性识别hAβ1-42的单克隆抗体如1F12、2C6，氨基或羧基修饰的纳米粒子如磁性四氧化三铁纳米粒子、氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子及HRP标记的抗hAβ1-42抗体1F12、2C6等构建的纳米磁珠检测传感器用于快速、灵敏的检测人β-淀粉样蛋白单体(Aβ1–42 Monomers(Aβ1– 42Ms))，寡聚体(Aβ1-42Oligomers(Aβ1–42Os))，得到检测不同形式人β-淀粉样蛋白免疫纳米磁珠检测试剂盒。此外，合成的抗体功能化的纳米粒子可进一步的用于清除血液以及脑中Aβ1–42Ms，Aβ1–42Os及氧自由基以缓解阿尔茨海默氏症的疾病进程并进一步的进行成像示踪疾病进展。
基于本发明能够快速、灵敏的检测人淀粉样蛋白-β单体(Aβ1–42Monomers (Aβ1– 42Ms))、寡聚体(Aβ1-42Oligomers(Aβ1–42Os))；例如，可将抗hAβ1-42单克隆抗体如1F12分别偶联到纳米粒子如四氧化三铁纳米粒子及氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子上用于捕捉富集Aβ1–42Ms、Aβ1–42Os，配合HRP标记的抗hAβ1-42抗体如1F12、2C6，可形成三明治结构，在例如TMB催化的作用下，含有Aβ1–42Ms、Aβ1–42Os样本会显示蓝色，不含有Aβ1–42Ms，Aβ1–42Os样本则为无色，实现快速、灵敏的检测。即：
基于本发明，可以构建用于检测人淀粉样蛋白-β单体和人淀粉样蛋白-β寡聚体的特异性检测试剂盒，它包括多功能的纳米粒子与HRP标记的抗hAβ1-42抗体，其中，多功能的纳米粒子表面的抗hAβ1-42抗体具体为单克隆抗体1F12，HRP标记的抗hAβ1-42抗体具体为HRP标记的单克隆抗体2C6(其抗原表位不同于单克隆抗体1F12)，利用一对识别不同抗原表位的单克隆抗体可以同时实现对人淀粉样蛋白-β单体、人淀粉样蛋白-β寡聚体的检测。
基于本发明，也可以构建用于特异性检测人淀粉样蛋白-β寡聚体的检测试剂盒，它包括多功能的纳米粒子与HRP标记的抗hAβ1-42抗体，其中，多功能的纳米粒子内的抗 hAβ1-42抗体具体为单克隆抗体1F12，HRP标记的抗hAβ1-42抗体具体为HRP标记的单克隆抗体1F12；由于寡聚体是由多个单体聚集而成的，利用的是一对相同的表位的单克隆抗体，保证了仅能寡聚体被检测得到，而单体不能被检测出。
例如，本发明的双抗夹心免疫纳米粒子特异的检测人β-淀粉样蛋白Aβ1–42Ms、 Aβ1–42Os的检测方法具体步骤可以如下：
(1)在待测样品中添加结合有单克隆抗体1F12的免疫纳米粒子，混匀后于37℃反应30min，然后进行磁性分离，弃上清液，然后加入PBS-T溶液重悬后再进行磁性分离，重复2-3次；
(2)加入100μL标记HRP的单克隆抗体1F12，2C6，37℃反应30min；
(3)磁性分离，弃上清液，然后加入PBS-T溶液重悬后，进行磁性分离，重复3-4 次；加入100μL显色液，37℃避光反应10min；
(4)直接通过肉眼观察液体是否变蓝，判断是否存在Aβ1–42Ms，Aβ1–42Os；检测方法为常规检测法。反应结束后，直接用肉眼观察结果；结果判定：如果1F12-1F12组合结果显示蓝色，则说明样品中含有Aβ1–42Os，检测结果为阳性；不出现蓝色，则说明样品中不含有Aβ1– 42Os，检测结果为阴性；如果1F12-2C6组合结果为阳性，但1F12-1F12 组合检测结果为阴性，则说明样品中仅含有Aβ1–42Ms。
基于本发明尤其能够快速、灵敏、特异的检测Aβ1–42Os；例如，可将抗hAβ1-42单克隆抗体如1F12功能化的四氧化三铁纳米粒子及氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子上用于捕捉富集Aβ1–42Os，与加入的HRP标记的抗hAβ1-42抗体如1F12形成三明治结构，在例如TMB催化的作用下，含有Aβ1–42Os样本会显示蓝色，不含有Aβ1–42Os样本则为无色。
本发明中特异性识别人Aβ1–42Ms、Aβ1–42Os的抗体功能化的纳米粒子还可应用于清除外周血、脑中人β-淀粉样蛋白；或可应用于清除外周血、脑中异常产生的有害的氧自由。
另外，本发明中抗体功能化的纳米粒子，可应用于清除血液以及脑中Aβ1–42M、 Aβ1–42Os、氧自由基，进而缓解阿尔茨海默氏症的疾病进程，例如，可将抗hAβ1-42单克隆抗体如1F12功能化的纳米粒子如四氧化三铁纳米粒子及氧化铈/氧化铁/介孔硅注射到APP/PS1外周血中，进一步扩散到脑中，进入血液、脑中的功能化的纳米粒子能与人淀粉样蛋白及其斑块结合并抑制Aβ1–42Ms折叠成Aβ1–42Os，随后将其代谢到体外，从而减轻血液和脑中人淀粉样蛋白的负担。此外，抗体功能化的纳米粒子可以进一步清除体内产生的有害的氧自由基，减缓疾病的进程。
实验结果表明本发明公开的阿尔茨海默病诊疗一体化的多功能的纳米粒子在检测人β-淀粉样蛋白和清除人β-淀粉样蛋白及其多聚体方面具有良好的积极效果。本发明与现有技术相比所具有的积极效果在于：
(1)本发明具有操作简便、快速、无需特殊设备等特点，适合于基层推广应用；此外，本发明将双抗夹心技术与免疫纳米磁珠技术相结合，可以通过肉眼直接观察和判定结果，仅需例如1h，无需昂贵的仪器如正电子发射计算机断层显像、核磁共振成像等进行淀粉样蛋白-β的诊断；
(2)基于纳米磁珠传感器的敏感、特异、成本低廉、便于操作等诸多优势，本发明在一定程度上提高了我国阿兹海默综合症的检测能力，为阿兹海默综合症的临床实时快速诊断、潜在患病者的快速准确检测提供了新技术来源，以及普及先进技术在基层检验检疫机构的推广应用均具有重要意；特别对于血液等特殊样品的检测，此方法解决了从血液等特殊样品中靶标物质的获取、富集的难题，其灵敏度比利用普通ELISA检测方法高。
(3)本发明制备的抗体功能化的纳米粒子不仅能够清除外周血中淀粉样蛋白-β及氧自由基，更能顺利的穿过血脑屏障进一步清除脑中淀粉样蛋白-β及氧自由基。
总之，本发明合成的抗体功能化的纳米粒子能够快速准确的检测Aβ1–42Ms、 Aβ1– 42Os，能够快速的清除Aβ1–42Ms，Aβ1–42Os和氧自由基。对比未治疗组，注射抗体功能化的纳米粒子的老年痴呆症转基因小鼠APP/PS1的外周血、脑中β-淀粉样蛋白及其斑块显著的减少。本发明制备的抗体功能化的纳米粒子用于阿尔茨海默氏症的早期诊断及治疗的应用有广阔的前景。
附图说明
图1中的A为本发明的免疫纳米粒子检测原理图；图1中的B为本发明制备的羧基修饰的磁性四氧化三铁的扫描电镜图；图1中的C为本发明制备的氨基修饰的磁性四氧化三铁的粒径分布图；图1中的D为本发明制备的氨基修饰的氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子透射电镜图；图1中的E为本发明制备的氨基修饰的氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子的粒径分布图；图1中的F为本发明制备的羧基修饰的磁性四氧化三铁偶联抗体 SDS-PAGE图；图1中的G为本发明制备的氨基修饰的氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子偶联抗体SDS-PAGE图；图1中的H为发明制备的羧基修饰的磁性四氧化三铁偶联抗体，氨基修饰的氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子偶联抗体ELISA活性检测图；图1中的 I为发明制备的氨基修饰的氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子偶联抗体后抗氧化检测图。对于图1中的B和图1中的D，其中的标尺分别代表200nm、50nm。
图2中的A为本发明基于免疫纳米磁珠传感器检测hAβ1-42Os的特异性可视化图；图2中的B为本发特异性检测hAβ1-42Os的光密度曲线图；图2中的C为本发明基于免疫纳米磁珠传感器检测hAβ1-42Os、hAβ1-42Ms的特异性可视化图；图2中的D为本发特异性检测hAβ1-42Os、hAβ1-42Ms的光密度曲线图。如图2中的B所示，具有最强波峰的，对应的是hAβ1-42Os；如图2中的D所示，具有最强波峰、次强波峰的，分别对应的是 hAβ1-42Os、hAβ1-42Ms。
图3是本发明基于免疫纳米磁珠传感器分别检测hAβ1-42Ms、hAβ1-42Os的灵敏度可视化图及灵敏度光密度曲线。其中，图3中的A为本发明基于免疫纳米磁珠传感器检测 hAβ1- 42Ms的灵敏度可视化图；图3中的B为本发明基于免疫纳米磁珠传感器检测 hAβ1-42Ms的灵敏度光密度曲线图；图3中的C为检测hAβ1-42Os的灵敏度光密度曲线图；图3中的D为检测hAβ1- 42Os的灵敏度光密度曲线图。如图3中的B所示，波峰强度自强至弱依次对应100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、 1.563ng/mL、0.781ng/mL、0.391ng/mL、0.195ng/mL、0.0977ng/mL和control；如图3 中的D所示，波峰强度自强至弱依次对应100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、 6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.563ng/mL、0.781ng/mL、0.391ng/mL、0.195ng/mL、 0.0977ng/mL和control。
图4中的A为本发明制备的抗体功能化的荧光探针的荧光图；图4中的B为C57 小鼠注射抗体功能化的荧光探针顺利的穿过血脑屏障进去脑实质的组织切片染色结果图；图4中的C为抗体功能化的探针治疗组与对照组治疗期间血液β-淀粉样蛋白含量的动态变化的检测结果；图4中的D为抗体功能化的探针治疗组与对照组治疗前后血液β- 淀粉样蛋白含量对比结果；图4中的E为治疗后各组小鼠脑组织中的人β-淀粉样蛋白含量检测结果；图4中的F为抗体功能化的探针治疗组与对照组脑组织中的人β-淀粉样蛋白斑块的荧光染色统计结果；图4中的G为抗体功能化的探针治疗组与对照组血液、脑组织中的人可溶性β-淀粉样蛋白WB检测结果。针对图4中的B，其中的标尺代表100 μm。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。下述实施例中使用的试剂，除特殊说明外，均可采用常规试剂。
实施例1：纳米磁珠传感器检测方法的建立(如图1中的A所示)，具体包括：
1、氨基修饰的磁性四氧化三铁、氧化铁/氧化铈/二氧化硅纳米粒子的合成
1.1氨基修饰的磁性四氧化三铁的合成
5g 1,6-己二胺加入到30mL EG中，50℃下超声搅拌溶解后加入1g FeCl3-6H2O，超声搅拌后加入2g NaAc，继续超声搅拌30min后转入100mL聚四氟乙烯反应釜中， 190℃下反应6h。反应结束后，自然冷却至室温，磁析，乙醇及去离子水分别洗涤3 次，产物经真空干燥后得到黑色的粉末。
结果：成功制备出氨基修饰的磁性四氧化三铁其扫描电镜结果如图1中的B所示；图1中的C为本发明制备的氨基修饰的磁性四氧化三铁的粒径分布图。
1.2、氨基修饰的氧化铁/氧化铈/二氧化硅纳米粒子的合成
1.2.1、氨基修饰的介孔硅纳米粒子(MSN)的合成
MSN的制备：将0.5g的十六院基-三甲基-氯化按(cetyltrimethylammoniumchloride, CTAC)和0.06g的三乙醇胺(triethanolamine，TEA)溶解于21.5mL的去离子水中并磁力搅拌升温到95℃，1h后，将1.5mL的正硅酸乙酯(Tetraethylorthosilicate,TEOS)逐滴加入并保持温度继续磁力搅拌1h。然后，通过离心和乙醇洗涤3次得到MSN。将得到的MSN在1％(v/v)的盐酸乙醇溶液中60℃搅拌3h，重复3次，离心得到去模板剂CTAC的MSN。
氨基修饰的MSN的制备：将100mg MSN分散在100mL的乙醇中，加入200μL 3- 氨基丙基-三乙氧基硅烷((3-aminopropyl)trimethoxysilane，APTES)磁力揽拌升温到 60℃，4h后，离心得到氨基修饰的MSN，产物最终分散于N-二甲基甲酰胺 (N,N-dimethylformamide,DMF)。
1.2.2、超小型氧化铁纳米晶(Iron Oxide Nanocrystals,IONC)的合成和配体转换超小型 IONC的合成：
首先，按照Park等报道的方法合成油酸铁复合物。然后，取干燥的油酸铁复合物(1.8g)，油酸(640μL)和油醇(1.9mL)加到二苯醚(10g)中混合，该混合液在 90℃温度下进行脱气处理，2h后，以10℃/min的加热速率将该混合液逐渐加热到 250℃，维持温度，并在惰性气体保护反应体系中老化30min，反应结束后，立即快速冷却到室温。用丙酮(100mL)沉淀，离心得到油酸包裹的粒径小于10nm的超小型IONC，产物分散在氯仿中保存。
超小型IONC的配体转换：将合成得到的超小型IONC(30mg)、二溴代异丁酸(bromo-2-methylpropionic acid,BMPA)(1g)和柠檬酸(0.1g)依次加入15mL氯仿和15mLDMF构成的混合溶剂中，磁力搅拌12h，离心得到BMPA修饰的超小型IONC。
1.2.3、超小型纳米晶(Ceria Nanocrystals，CeNC)的合成和配体转换
超小型CeNC的合成：将醋酸铈(III)水合物(0.43g)和油胺(3.25g)加入到二甲苯(15mL)中，室温磁力搅拌，24h后，在惰性气体保护的反应体系中以2℃/min 的加热速率将该混合物逐渐加热到90℃，维持温度，将1mL去离子水迅速注入其中老化3h，反应结束后，立即快速冷却到室温。用丙酮(100mL)沉淀，离心得到粒径小于10nm的超小型CeNC，产物分散在氯仿中进行保存。
超小型CeNC的配体转换：将合成得到的超小型CeNC(15mg)、BMPA(0.5g) 和柠檬酸(0.05g)依次加入7.5mL氯仿和7.5mL DMF构成的混合溶剂中，磁力搅拌3h后离心得到BMPA修饰的超小型CeNC。
1.2.4、氧化铈/氧化铁/介孔硅(CeNC/IONC/MSN)的合成
将5mL氨基修饰的MSN溶液溶于5mL经BMPA修饰后的CeNC和IONC的DMF 溶液中反应过夜即得，所得产物分散在二甲基亚砜(DMSO)中保存。
结果：成功合成出氨基修饰的CeNC/IONC/MSN其透射电镜图如图1中的D所示；图1中的E为本发明制备的氨基修饰的氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子的粒径分布图。
1.3、免疫纳米磁珠的制备
1)将氨基修饰的磁性四氧化三铁纳米粒子混合均匀，取10mg磁珠加入到2mL离心管中，磁性分离去除上清液；
2)加入1mL去离子水，混合均匀，磁性分离区上清液(重复2次)；
3)加入500～1000μL反应缓冲液(100mM MES,pH 5.0)，混合重悬磁珠，磁性分离去除上清液(重复2次)；
4)加入200μL反应缓冲液，混合重悬纳米粒子；
5)加入200～300μg抗体(提前用200μL反应缓冲液溶解)，分别加入100μL 10 mg/mL的EDC-HCl和100μL 10mg/mL的NHS室温旋转混合30min；
抗体例如可采用单克隆抗体1F12，hAβ1-42蛋白抗体1F12是由分泌抗hAβ1-42蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F12所制备，详细可参见本发明发明人所在课题组早前申请的3件中国专利申请“分泌人淀粉样蛋白-β单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用”(申请号：2020112278085)、“用于检测人淀粉样蛋白-β双抗夹心ELISA检测试剂盒”(申请号：2020112274188)、“用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸及其制备” (申请号：2021100676796)，本申请请求引用这3件中国专利申请的全部内容；
同理，单克隆抗体1F12也可以用单克隆抗体2C6替代，相似的，hAβ1-42蛋白抗体2C6是由分泌抗人Aβ1-42蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C6所制备；
杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12的保藏号为：CCTCC NO：C2020131；杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6的保藏号为：CCTCC NO：C2020132。
6)将活化好的抗体加入到预处理的磁珠中室温旋转混合2h；
7)加入1mL PBS-T，混合重悬纳米粒子，磁性分离去除上清液(重复3～5次)；
8)加入1mL 0.1M Tris-HCl，室温旋转混合1h，磁性分离去除上清液；
9)将上述磁珠分散于PBS，pH 7.4，0.1％BSA，0.02％NaN3长期保存；
结果：单抗1F12成功偶联到纳米粒子上，并进行活性验证，其SDS-PAGE结果如图1中的F，图1中的G所示，其ELISA活性检测结果如图1中的H所示。
1.4、HRP-1F12，2C6探针的制备
1)将5mg HRP溶于0.5mL 0.1mol/L NaHCO3溶液中，加0.5mL 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2h；
2)加0.75mL 0.1mol/L Na2CO3混匀；
3)加入0.75mL小鼠已处理的腹水分别由杂交瘤细胞株1F12，2C6制备，混匀；
4)称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5mL注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用(避光)3h或4℃过夜；
5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20体积新鲜配制的5mg/mLNaBH4溶液，混匀，室温作用30min；再加入3/20体积NaBH4溶液，混匀，室温作用 1h(或4℃过夜)；
6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集峰；
7)HRP-1F12，2C6抗体结合物的保存：加入等量甘油后，可小量分装-20℃存放；
1.5、建立免疫磁珠检测传感器
(a)抗体结合反应：将样本加入到免疫纳米磁珠溶液中，于37℃100转/分钟反应0.5h；然后进行磁性分离，加入1mL的PBS-T重悬后磁性分离(此步骤重复3次)。
(b)加入酶标抗体将步骤(a)中的纳米磁珠-抗体-抗原的复合物中加入100μLHRP-mAb探针(1:1000)于37℃反应20min；
(c)显色：用PBS-T洗5次后，弃上清，加入100μL TMB避光显色10min；
(d)终止：最后加入50μL 2M H2SO4，在450nm处测其吸光值；
1.5.1、特异性检测
分别用免疫纳米磁珠捕获①含有Aβ1–42Ms；②含有Aβ1–42Os；③不含Aβ1–42Ms、 Aβ1–42Os，但含有Aβ1–40Ms、Aβ1–40Os、RL-30、BSA的混合物；捕获完成后按照实施例 1中的1.5进行；
结果：在1F12-1F12组合中(本发明中的1F12-1F12组合表述，第一个1F12代表捕获抗体为单克隆抗体1F12，第二个1F12代表检测抗体为HRP标记的单克隆抗体 1F12)，仅Aβ1–42Os能被检测出来，反应液体为蓝色并展现出强的光密度曲线，而 Aβ1–42Ms、Aβ1–40Ms、Aβ1–40Os、RL-30、BSA均无明显阳性，反应液体为无色和弱的光密度曲线，其结果如图2中的A，图2中的B所示。在1F12-2C6组合中(本发明中的 1F12-2C6组合表述，1F12代表捕获抗体为单克隆抗体1F12，2C6代表检测抗体为HRP 标记的单克隆抗体2C6)，Aβ1–42Ms、Aβ1–42Os表现出强阳性，反应液体为蓝色并展现出强的光密度曲线，而Aβ1–40Ms、Aβ1–40Os、RL-30、BSA均无明显阳性，反应液体为无色和弱的光密度曲线，其结果如图2中的C，图2中的D所示。
1.5.2、灵敏度检测
分别用小鼠血液稀释Aβ1–42Ms，Aβ1–42Os至终浓度100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.563ng/mL、0.781ng/mL、0.391ng/mL、0.195 ng/mL、0.0977ng/mL。取30μL的纳米磁珠依次加入到上述样本中于37℃100转/分钟反应0.5h；磁性分离后按照实施例1中的步骤1.5进行纳米磁珠检测传感器灵敏度测试；
结果：利用纳米磁珠的检测方法，可将模拟血液样本中Aβ1–42Ms，Aβ1–42Os快速准确的检测出来，且检测下限达到0.0977ng/mL，Aβ1–42Ms可视化检测结果如图3中的A，图3中的B所示；Aβ1–42Os可视化检测结果如图3中的C、图4中的D所示。
实施例2：抗体功能化的纳米粒子用于清除外周血、脑中hAβ1-42及氧自由基
2.1、合成靶向hAβ1-42荧光探针
1)将氨基修饰的氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子混合均匀，取10mg磁珠加入到2mL离心管中，磁性分离去除上清液；
2)加入1mL去离子水，混合均匀，磁性分离区上清液(重复2次)；
3)加入500～1000μL反应缓冲液(100mM MES,pH 5.0)，混合重悬磁珠，磁性分离去除上清液(重复2次)；
4)加入200μL反应缓冲液，混合重悬磁珠；
5)加入200～300μg抗体(提前用200μL反应缓冲液溶解)，分别加入100μL 10 mg/mL的EDC-HCl和100μL 10mg/mL的NHS室温旋转混合30min；
抗体例如可采用单克隆抗体1F12，另外，单克隆抗体1F12也可以用单克隆抗体2C6替代。
6)将活化好的抗体加入到预处理的氨基修饰的氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子中室温旋转混合2h；
7)加入1mL PBS-T，混合重悬磁珠，磁性分离去除上清液(重复3～5次)；
8)加入1mL 0.1M Tris-HCl，室温旋转混合1h，磁性分离去除上清液；
9)将上述磁珠分散于PBS，用0.1M Na2CO3调节其pH值在8.5-9之间。在漩涡的状态下加入NHS-Cy3，室温混匀3h。
10)混匀后，将合成好的荧光探针过PD-10柱，除去未结合的Cy3，即得到靶向hAβ1-42荧光探针。
结果：成功合成靶向hAβ1-42荧光探针，其荧光成像结果如图4中的A所示。
2.2、静脉注射hAβ1-42荧光探针
取100μL合成的靶向hAβ1-42荧光探针静脉注射到APP/PS1小鼠中，每周注射一次，连续注射三周。同时设置未功能化的纳米粒子作为对照，治疗结束后，取治疗组、对照鼠的鼠脑进行斑块面积的统计，评价治疗结果。
结果：对比未抗体功能化的荧光探针，C57小鼠静脉注射靶向hAβ1-42荧光探针后其鼠脑中的荧光信号显著增强，组织切片结果如图4中的B所示，表明抗体功能化的纳米粒子能过顺利的通过血脑屏障。在APP/PS1小鼠中，注射靶向hAβ1-42探针后，其外周血、脑中的β-淀粉样蛋白显著降低，而未抗体功能化的探针，PBS对照组中的β-淀粉样蛋白无显著性变化。经过一个月治疗后，对比未抗体功能化的探针，PBS对照组，阳性组小鼠血液中β-淀粉样蛋白含量显著降低如图4中的C、图4中的D所示。脑中β-淀粉样蛋白含量也显著降低，其ELISA、脑组织切片免疫荧光β-淀粉样蛋白斑块统计结果如图4中的E、图4中的F所示。免疫共沉淀后的WB结果进一步验证了ELISA、免疫荧光的结果，其结果如图4中的G所示。
另外，从图3中也可以看出抗体功能化的磁性四氧化三铁纳米粒子或者氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子能够在体外快速灵敏的检测Aβ1–42Ms、Aβ1–42Os。
综上所述，本发明报道的抗体功能化的纳米粒子能够应用于快速、灵敏、可视化的检测不同形式β-淀粉样蛋白，并可进一步的用于外周血和脑中β-淀粉样蛋白的清除，其效果显著。制备的一种阿尔茨海默病诊疗一体化的多功能的纳米粒子，对于早期诊断及靶向诊断治疗具有重大意义。
上述实施例1、2已经详尽的描述了一种用于阿尔茨海默病诊疗一体化的多功能的纳米粒子的制备及其应用，但是上述实施例仅为示例，本发明中的抗体功能化的纳米粒子不仅限于上述实施例。上述实施例中所描述了一种用于阿尔茨海默病诊疗一体化的多功能的纳米粒子，其所用的单克隆抗体为1F12、2C6，仅为示例，除了单克隆抗体1F12、单克隆抗体2C6外，基于本发明还可以使用现有技术中已知的具有相似功能的其他抗 hAβ1-42抗体，如单克隆抗体6E10(例如，Invitrogen厂家的市售产品)、单克隆抗体158 (例如，可参见“Sensitive ELISA detection of amyloid-βprotofibrils in biological samples”文献)，以及多克隆抗体、单链抗体等具有相似功能的蛋白。凡是基于这些蛋白与纳米粒子结合用于阿尔茨海默病的早期诊断和治疗的均在本专利保护范围内。此外，本专利实施例所述的纳米粒子也不限于氨基修饰的磁性四氧化三铁纳米粒子、氧化铈/氧化铁/ 介孔硅纳米粒子，也可以是羧基修饰的具有相似功能的纳米粒子如生物相容的介孔硅纳米粒子，氨基、羧基、或者N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)修饰的磁性纳米粒子、富勒烯、碳纳米管等，氨基、羧基或者N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)修饰的功能性纳米粒子等。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种用于阿尔茨海默病诊疗一体化的多功能的纳米粒子的应用，其特征在于，所述纳米粒子用于制备（i）清除脑中人淀粉样蛋白-β1-42单体、人淀粉样蛋白-β1-42寡聚体和/或氧自由基的生物制品；
或（ii）人淀粉样蛋白-β1-42单体、或人淀粉样蛋白-β1-42寡聚体在脑中的特异性成像示踪试剂；
所述纳米粒子是由氨基、羧基或N-羟基琥珀酰亚胺修饰的纳米粒子与抗hAβ1-42抗体偶联而成；
所述抗hAβ1-42抗体选自：单克隆抗体1F12、单克隆抗体2C6；其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020131；分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020132；
所述氨基、羧基或N-羟基琥珀酰亚胺修饰的纳米粒子，具体选自：氨基修饰的四氧化三铁纳米粒子，氨基修饰的氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子，羧基修饰的介孔硅纳米粒子，氨基、羧基、或者N-羟基琥珀酰亚胺修饰的磁性纳米粒子，氨基、羧基、或者N-羟基琥珀酰亚胺修饰的富勒烯，氨基、羧基、或者N-羟基琥珀酰亚胺修饰的碳纳米管。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米粒子选自四氧化三铁纳米粒子、氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子；其中，所述氧化铈/氧化铁/介孔硅纳米粒子是由氧化铈纳米粒子、氧化铁纳米粒子与介孔硅纳米粒子三者经过化学反应形成的混合物。
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