CN117586370A - 强毒性淀粉样蛋白寡聚体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的强毒性淀粉样蛋白寡聚体Aβo*3F及其用途，所述Aβo*3F被3F抗体特异性结合，存在于AD患者和AD源性轻度认知障碍(MCI)患者的脑脊液(CSF)、血液和/或脑组织中，且水平在AD患者、MCI患者和健康老年人的CSF、血液和/或脑中呈现极显著差别，为超强毒性寡聚体，是Aβ寡聚体混合物中最主要的毒性成分，具有强烈的致病作用，在AD的发生和发展中起着关键作用。Aβo*3F为AD提供了新的治疗和/或预防、诊断靶点和新的治疗和/或预防、诊断途径。

Description

强毒性淀粉样蛋白寡聚体及其用途
技术领域
本发明涉及新的强毒性淀粉样蛋白寡聚体及其用途。具体而言，本发明涉及新的分离的强毒性淀粉样蛋白寡聚体Aβo*3F及其制备方法，包含其的免疫原性组合物、疫苗，针对其的抗体，及其用途。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD，俗称老年性痴呆)是一种慢性神经退行性疾病，目前全球大约有5000万AD患者，迄今为止，没有任何特异性的有效治疗药物和手段，已给人类带来沉重负担。AD的发展时程较长，起初患者无明显临床症状，逐步发展为记忆减退、性格行为发生变化，后期AD患者脑内的神经元广泛死亡，大脑显著萎缩，治疗药物难以起效。近几年的临床试验表明，对于早期发现、早期有预警的AD患者进行早期干预，可延缓AD的发展，而要实现对AD患者的早期治疗和干预，首先应及时准确地鉴别诊断出AD患者，但目前尚无理想的早期诊断方法和技术应用于临床。研究表明，诱发AD发生发展的β淀粉样蛋白(Aβ)变化早在临床症状出现15～20年之前就已经出现。
AD的病理特征为脑内Aβ聚集形成的老年斑和tau蛋白聚集形成的神经纤维缠结。Aβ可聚集成寡聚体、前纤维和成熟的纤维。Aβ寡聚体是最具神经毒性的聚集体形式，报道较多的为Aβ二聚体、三聚体、ADDL等形式。Aβ寡聚体按照分子量大小可分为低分子量和高分子量两种类型，并且高分子量寡聚体具有更大的神经细胞毒性。Aβ二聚体是最小的Aβ寡聚体，一般认为Aβ二聚体可能是Aβ寡聚体的基本组成单元。Aβ二聚体在AD患者和AD转基因小鼠的大脑中含量升高，且在SDS和强变性剂中稳定，具有一定的神经毒性。除Aβ二聚体外，Aβ三聚体也被认为是多种Aβ寡聚体如六聚体和十二聚体的聚集单元，Aβ三聚体在AD患者和AD转基因小鼠大脑中出现较早，但Aβ三聚体与Aβ斑块沉积之间没有显著相关性，且其毒性目前还存在争议。另外，Aβ寡聚体还能够通过进一步聚集形成直径约为12nm的球形低聚物(ASPD)和直径为5-6nm的可扩散寡聚体(ADDL)。此两种形式的聚合物均被认为是具有独特构象且具有神经毒性的Aβ寡聚体。目前，尽管已有多种Aβ寡聚体形式被发现，然而具体哪种或哪些Aβ寡聚体毒性最大，且对AD的发生发展起到主要作用尚未可知，这可能是针对Aβ寡聚体的药物开发一直没有成功的原因。此外，Aβ寡聚体的不稳定限制了对某种单一构型寡聚体的提取和研究，因此，提高Aβ寡聚体的提取和检测技术，是明确Aβ寡聚体类型及其对应功能的关键之一。而且，特异检测寡聚体，特别是毒性寡聚体的方法十分有限，获得特异结合毒性淀粉样蛋白寡聚体的抗体尤其困难，这严重限制了针对Aβ寡聚体的临床检测和治疗制剂的开发。
大量研究表明，神经退行性疾病的严重程度与患者脑内的淀粉样蛋白寡聚体水平密切相关，Aβ寡聚体通过引起功能性神经元死亡、认知损伤和痴呆，在AD的发生和发展中发挥关键作用，但Aβ寡聚体种类繁多，可通过多种作用机制影响中枢神经的功能，各种Aβ寡聚体间毒性各异，在大小、构象、聚集方式、毒性以及在脑内出现的时间上也存在很大的差异。尽管许多研究表明一些Aβ寡聚体，如二聚体、三聚体、ADDL等能够发挥神经毒性作用，但当前对于真正能够起到关键致病作用的Aβ寡聚体的形式了解还不够深入。因此，对于Aβ寡聚体毒性研究应该精确到Aβ寡聚体的类型以及对应的毒性机制，而不是寡聚体混合物。确定与AD发生发展关系密切的关键毒性寡聚体，可为AD的早期预警和早期诊断提供理想标志物，也可为AD的治疗提供理想的精准靶标。
免疫治疗一直为AD治疗领域研究的焦点，Aβ抗体和疫苗经历了从靶向Aβ整体分子、Aβ的N端、Aβ聚集体的空间结构三代产品的研发。近年来，先后有数十种靶向Aβ的抗体和疫苗进入了临床试验阶段。虽然这些制剂在动物试验阶段表现出了良好的治疗效果，显著改善AD转基因动物的认知水平，降低动物脑内老年斑的量及其他病理变化，但在AD临床试验中，由于治疗效果欠佳或严重的副作用，迄今鲜有通过临床III期试验。2021年6月，美国食品药品监督管理局(FDA)通过加速审批项目批准了Aduhelm(aducanumab阿杜努单抗)上市。该抗体可特异性地识别Aβ寡聚体，在临床试验中显示出一定的疗效，但该抗体仍存在脑水肿、炎症等不良反应，抗体疗效也颇受争议。
因此，本领域仍然存在对确定在AD的发生和发展中起关键作用的特定Aβ寡聚体并将其用于治疗和/或预防AD的迫切需求。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种分离的Aβo*3F，其中所述Aβo*3F是与3F抗体特异性结合的Aβ寡聚体，基于分子排阻色谱(SEC)分析，其总分子量约588kDa，所述3F抗体的轻重链CDR序列分别如SEQ ID NO：17-22所示。
在一些实施方案中，所述分离的Aβo*3F为体外制备的。
本发明的第二方面涉及一种组合物，其包含如上所述的Aβo*3F。
在一些实施方案中，所述的组合物为免疫原组合物、药物组合物或疫苗。
在一些实施方案中，所述的组合物还包含药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。
在一些实施方案中，所述的组合物还包含其他活性成分，优选地，所述其他活性成分为其他形式的Aβ寡聚体、前纤维和成熟的纤维，如Aβ二聚体、三聚体、六聚体、十二聚体、ASPD、ADDL等。在一些实施方案中，所述的组合物还包含其他用于治疗轻度认知障碍(MCI)、AD的药物。
本发明的第三方面涉及一种体外制备如上所述的Aβo*3F的方法，其包括如下步骤：将Aβ42、Aβ40或其他形式的Aβ溶解在50mM NaOH中，浓度为1mg/mL，涡旋3-5min，超声1min，然后用预冷的PBS稀释至10μM；4℃，21000g离心30-40min，丢弃沉淀部分(约为起始体积的5％)，得到Aβ单体；将Aβ单体在25℃静止孵育2天，将其与交联了3F抗体的Protein A磁珠4℃孵育过夜；第二天，磁珠用0.1％PBST洗三遍后，用20-100mM甘氨酸(pH 2.0)洗脱3-5min，洗脱两次，洗脱液用1M Tris中和到pH 7，得到Aβo*3F。
本发明的第四方面涉及一种Aβo*3F作为靶点在制备用于预防和/或治疗受试者中MCI和/或AD的药物中的用途，其中所述Aβo*3F是与3F抗体特异性结合的Aβ寡聚体，基于分子排阻色谱(SEC)分析，其总分子量约588kDa，所述3F抗体的轻重链CDR序列分别如SEQ IDNO：17-22所示。
在一些实施方案中，所述药物为特异性结合Aβo*3F的抗血清、抗体、小分子药物，优选地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一方面涉及一种特异性结合如上所述的Aβo*3F的结合剂，其中所述结合剂是3F和7B。
在一些实施方案中，所述结合剂是特异性结合Aβo*3F的抗血清、抗体、小分子药物，优选地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体为单链抗体。在一些实施方案中，所述抗体的重链CDR序列分别如SEQ ID NO：25-27所示，轻链CDR序列分别如SEQ ID NO：28-30所示。
在另一个方面中，本发明涉及一种制备如上所述的结合剂的方法，其包括步骤：用免疫有效量的如上所述的Aβo*3F免疫动物，或者用如上所述的Aβo*3F作为底物进行噬菌体展示肽库、抗体库和化合物库等的筛选。
在一些实施方案中，所述动物是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、绵羊、山羊、猴、马、牛、羊驼、非人灵长类动物。
本发明的再一个方面涉及一种组合物，其包含如上所述的结合剂或如上所述方法获得的结合剂。在一些实施方案中，所述组合物还包含另一种神经退行性疾病治疗剂，优选地，所述另一种神经退行性疾病治疗剂选自乙酰胆碱酯酶抑制剂如多奈哌齐、加兰他敏、卡巴斯汀等，和天门冬氨酸受体拮抗剂如美金刚等。
在另一个方面中，本发明涉及如上所述的Aβo*3F、组合物或结合剂在制备用于预防和/或治疗受试者中MCI和/或AD的药物中的用途。
在再一个方面中，本发明涉及如上所述的Aβo*3F、组合物或结合剂，其用作预防和/或治疗受试者中MCI和/或AD的药物。
本发明的再一个方面涉及一种预防和/或治疗受试者中MCI和/或AD的方法，其包括向所述受试者施用预防和/或治疗有效量的如上所述的Aβo*3F、组合物或结合剂。
本发明的再一个方面涉及Aβo*3F作为受试者中MCI和/或AD的诊断靶点的用途，所述Aβo*3FAβo*3F是受试者中与3F抗体特异性结合的Aβ寡聚体，基于分子排阻色谱(SEC)分析，其总分子量约588kDa，所述3F抗体的轻重链CDR序列分别如SEQ ID NO：17-22所示。换言之，如上所述的受试者中的Aβo*3F可以作为诊断受试者中MCI和/或AD是否存在的生物标志物。本领域技术人员知晓如何基于作为生物标志物的Aβo*3F来诊断受试者是否患有MCI和/或AD和/或处于患有MCI和/或AD的风险中的方法。在一些实施方案中，可以利用特异性结合Aβo*3F的抗体如3F或7B来实施所述诊断。
本发明的又一个方面涉及Aβo*3F作为受试者中MCI和/或AD的预防和/或治疗靶点的用途，所述Aβo*3FAβo*3F是受试者中与3F抗体特异性结合的Aβ寡聚体，基于分子排阻色谱(SEC)分析，其总分子量约588kDa，所述3F抗体的轻重链CDR序列分别如SEQ ID NO：17-22所示。换言之，如上所述的受试者中的Aβo*3F可以作为预防和/或治疗受试者中MCI和/或AD的靶点。本领域技术人员知晓如何基于作为靶点的Aβo*3F来预防和/或治疗受试者的MCI和/或AD的方法。在一些实施方案中，可以利用特异性结合Aβo*3F的抗体如3F或7B或小分子药物来实施所述预防和/或治疗。
在一些实施方案中，所述受试者为人、非人灵长类动物、猫或犬。
换言之，在前期研究中，本发明人利用噬菌体显示技术在国际上率先筛选出了特异结合Aβ寡聚体的全人源单链抗体W20(CN101463082A)，3F抗体(氨基酸序列如SEQ IDNo.23所示)是W20抗体的改进形式，其相对于W20抗体，与Aβ寡聚体的亲和力显著提高，能够更显著地抑制Aβ的聚集和Aβ寡聚体诱导的神经细胞毒性，更有效地改善AD模型小鼠的认知和记忆功能，降低小鼠脑内的病理变化。更有意义的是，该抗体特异识别的Aβ寡聚体为超强毒性寡聚体，是Aβ寡聚体混合物中最主要的毒性成分，具有强烈的致病作用，在AD的发生和发展中起着关键作用，3F识别的强毒性寡聚体存在于AD患者和AD源性MCI患者的CSF、血液和/或脑组织中，且其水平在AD患者、MCI患者和健康老年人三类人群的CSF、血液和/或脑中呈现极显著差别，因此可精确区分出AD患者、MCI患者和健康老年人群。该种毒性寡聚体也存在于AD转基因小鼠中，并与AD转基因小鼠的发病直接相关。本发明中将3F识别的强毒性Aβ寡聚体称为AβO*3F，可采用免疫沉淀(3F抗体)从Aβ寡聚体混合物中分离而来，其典型特征为Aβ高分子量寡聚体，基于分子排阻色谱(SEC)分析，其分子量大小约为588kDa，直径约为10nm，对神经元有强毒性作用，其毒性比Aβ寡聚体混合物毒性强200倍以上。Aβo*3F可激活小胶质细胞和/或星形胶质细胞，分泌大量的炎症因子。更重要的是，本发明在体外制备出了Aβo*3F，体外制备的Aβo*3F与利用3F抗体从AD患者的脑脊液或血浆中免疫沉淀而来的产物在组成上一致，在理化性质和功能上相同。该体外制备的Aβo*3F可以例如作为免疫原，用于免疫目标生物，获得针对Aβo*3F的抗血清、多克隆抗体或单克隆抗体，并用于治疗和/或预防AD患者或MCI患者，也可以例如作为治疗性或预防性疫苗，用于免疫目标患者，以治疗和/或预防目标患者中的AD或MCI。本文所述的Aβo*3F或其组合物为AD或MCI提供了新的治疗和/或预防靶点和新的治疗和/或预防途径。
附图说明
图1显示了免疫沉淀制备Aβo*3F、Aβ*6E10和Aβ-ID示意图。
图2显示了Aβo*3F的分子量大小和形态表征：
A：ThT检测Aβ聚集状态；
B：Dot blot检测不同孵育条件得到的寡聚体与3F、A11和6E10抗体的结合情况；
C：10μM Aβ孵育0-4天得到的Aβos与3F抗体的亲和力；
D：Western blot检测sAβo*3F的条带分布；
E：分子排阻色谱(SEC)分析sAβo*3F分子量大小；sAβo*3F和SEC标准品的SEC分析(Superdex 200 10/300)，SEC标准品：1.甲状腺球蛋白(669kDa)，2.铁蛋白(440kDa)，3.醛缩酶(158kDa)，4.伴清蛋白(75kDa)，5.卵清蛋白(44kDa)，6.碳酸酐酶(29kDa)；
F：根据SEC标准品分子量和洗脱体积拟合线性方程(Y)，和相关系数(r2)；
G：Western blot检测mAβo*3F的条带分布；
H：SEC分析mAβo*3F分子量大小；
I：Western blot检测hAβo*3F的条带分布。
图3显示了Aβo*3F的神经细胞毒性作用：
A：sAβos对N2a细胞毒性的IC50；
B：sAβo*3F对N2a细胞毒性的IC50；
C：MTT法比较sAβos、sAβo*3F和sAβ-ID对N2a细胞的神经毒性；
D：mAβo*3F对N2a细胞和原代神经元毒性的IC50；
E：MTT法比较mAβ*6E10、mAβo*3F和mAβ-ID对原代神经元的细胞毒性；
F：hAβo*3F对原代神经元毒性的IC50；
G：MTT法比较hAβ*6E10、hAβo*3F和hAβ-ID对原代神经元的细胞毒性。
图4显示了Aβo*3F对胶质细胞的细胞因子表达水平的影响：
A：mAβo*3F对小胶质细胞的TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平的影响；
B：mAβo*3F对原代星形胶质细胞的TNF-α、iNos、IL-1β、IL-6表达水平的影响；
C：mAβo*3F对原代星形胶质细胞的TSP1、Gpc4和Gpc6表达水平的影响。
图5显示了Aβo*3F对小鼠认知的影响和对脑内神经元的损伤作用：
A：新事物识别实验中各组小鼠的认知指数；
B：Y迷宫实验中各组小鼠在新臂的持续时间；
C：Golgi染色检测小鼠神经元树突棘的密度；
D：对C中树突棘密度的统计分析；
E：尼氏染色检测小鼠海马区神经元的数量，比例尺：20μm；
F、G：通过Image J软件对DG区(F)和CA1区(G)神经元数量进行统计分析。
图6显示了Aβo*3F激活小鼠脑内的胶质细胞产生神经炎症：
A：免疫组织化学实验检测小鼠海马DG区和CA1区小胶质细胞的活化程度，比例尺：20μm；
B：免疫组织化学实验检测小鼠海马DG区和CA1区星形胶质细胞的活化程度，比例尺：20μm；
C、D：用Image J软件量化DG区(C)和CA1区(D)Iba-1阳性小胶质细胞的面积；
E、F：用Image J软件量化DG区(E)和CA1区(F)GFAP阳性星形胶质细胞的面积；
G、H：ELISA检测小鼠海马区IL-6(G)和IL-1β(H)的表达水平。
图7显示了电化学发光法检测AD患者CSF和血浆中Aβo*3F水平：
A、B：MSD法检测AD患者和健康人群(Con)的CSF中分离出的Aβo*3F中相应的Aβ42(A)和Aβ40(B)的水平；
C、D：MSD法检测轻度认知障碍(MCI)、AD和健康人群(Con)的血浆中分离出的Aβo*3F中相应的Aβ42(C)和Aβ40(D)的水平。
图8显示了ABW疫苗诱导产生的抗体特异性结合Aβ寡聚体。在动物第三次和第四次免疫两周后取血，ELISA方法测定血清中抗体滴度。
图9显示了水迷宫实验中ABW疫苗显著改善AD转基因小鼠的记忆力。(A)在训练期，小鼠找到平台的潜伏期；(B-D)在撤除平台后，小鼠到达平台区域的潜伏期(B)、穿过平台所在位置的次数(C)和目标象限停留时间(D)。
图10显示了ABW疫苗降低AD小鼠脑内Aβ水平。应用ABW疫苗治疗的AD小鼠，以ELISA法测定小鼠脑内可溶性Aβ40(A)、可溶性Aβ42(B)、和不可溶性Aβ40、Aβ42(C)水平。
图11显示了ABW疫苗减少AD小鼠脑内Aβ斑块。以6E10抗体进行免疫组化染色，比例尺＝100μm；对Aβ斑块染色区域的定量分析。
图12显示了7B抗体与Aβo*3F结合的ELISA结果。
图13显示了7B抗体显著改善AD转基因小鼠的认知能力。新事物识别实验中各组小鼠的认知指数。
图14硫磺素S(THS)染色显示了7B抗体减少AD小鼠脑内Aβ斑块。
具体实施方式
定义
除非另外指明，否则权利要求和说明书中使用的术语如下文所示进行定义。
除非本文中另外定义，否则与本文所述的本发明方法和组合物结合使用的科学和技术术语应具有本领域中的普通技术人员通常所理解的含义。另外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。通常，与以下结合使用的命名法和以下技术为本领域中众所周知且常用的那些：本文所述的生物化学、免疫学酶学、分子与细胞生物学、微生物学、遗传学和多肽化学。
除非另外指明，否则本文所述的方法和技术通常是根据本领域中众所周知的常规方法并且如在本说明书中通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述来执行的。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992，以及至2002年的增刊)；Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)；Taylor和Drickamer,Introduction to Glycobiology,Oxford Univ.Press(2003)；Worthington EnzymeManual,Worthington Biochemical Corp.,Freehold,N.J.；Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,第I卷,CRC Press(1976)；Handbook of Biochemistry:Section AProteins,第II卷,CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology,Cold Spring HarborLaboratory Press(1999)。
本文提及的所有出版物、专利和其他参考文献均以特此引用的方式整体并入本文。
除非另外指示，否则以下术语应理解成具有以下含义。
当与数目结合使用时，术语“约”指在所提及数目的±1、±5或±10％内的任何数目。
术语“Aβo*3F”是指与3F抗体特异性结合的Aβ寡聚体，基于分子排阻色谱(SEC)分析，其分子量约588kDa，所述3F抗体的轻重链CDR序列分别如SEQ ID NO：17-22所示。在一些实施方案中，所述分子排阻色谱(SEC)分析利用Superdex 200 10/300GL分子筛色谱柱进行。
在一些实施方案中，Aβo*3F是分离的Aβo*3F。在一些实施方案中，Aβo*3F是体外制备的。在一些实施方案中，Aβo*3F是体外制备且纯化的。在一些实施方案中，纯化的Aβo*3F的纯度为纯化产物重量的至少1％，例如1.5-99.9％，优选地，15-99.9％、25-99.9％、50-99.9％、65-99.9％、95-99.9％、95-99.9％，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5％或更高。在一些实施方案中，所述纯化为亲和纯化，例如利用特异性针对Aβo*3F的单克隆抗体进行，例如3F。在一些实施方案中，Aβo*3F的体外制备如下进行：
将Aβ42、Aβ40或其他形式的Aβ溶解在50mM NaOH中，浓度为1mg/mL，涡旋3-5min，超声1min，然后用预冷的PBS稀释至10μM。4℃，21000g离心30-40min，丢弃沉淀部分(约为起始体积的5％)，得到Aβ单体。将Aβ单体在25℃静止孵育2天，将其与交联了3F抗体的Protein A磁珠4℃孵育过夜。第二天，磁珠用0.1％PBST洗三遍后，用20-100mM甘氨酸(pH 2.0)洗脱3-5min，洗脱两次，洗脱液用1M Tris中和到pH 7，得到Aβo*3F。
在一些实施方案中，本文提供的是包含Aβo*3F的组合物，其重量占组合物总重量的0.01-99.9％，例如0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更高。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含Aβo*3F，其中所述Aβo*3F存在于组合物中的量通常为1-200μg/mL、合适地1-100μg/mL、合适地5-50μg/mL的范围内，优选8至40μg/mL，更优选16-32μg/mL，例如16、18、20、22、24、26、28、30或32μg/mL。适合于人使用的按体积计的剂量通常为0.25至1.5ml。在一个实施方案中，人剂量是0.5ml。在一个进一步实施方案中，人剂量高于0.5ml，例如0.6、0.7、0.8、0.9或1ml。在一个进一步实施方案中，人剂量是1ml-1.5ml。
在一些实施方案中，组合物是免疫原性组合物。如本文使用的，“免疫原性组合物”指可以在组合物施用于其的宿主或受试者中引发免疫应答的组合物。免疫原性组合物包含免疫有效量的本发明的AβO*3F以及任何其他组分。“免疫有效量”意味着将该量作为单一剂量或作为系列的一部分施用给个体对治疗或预防有效，或可产生可检测量的多克隆抗体或多克隆抗体。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、年龄、期望的保护程度、疫苗配制和其他相关因素而不同。该量将落入可以通过常规试验确定的相对宽的范围。
在一些实施方案中，免疫原性组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物是进一步包含药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的免疫原性组合物可以在施用于受试者之前被配制成药物组合物。本发明还提供了包含本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂或载体的疫苗。如本文使用的，“药学上可接受的载体”指稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物，其与组合物一起施用，并且是无毒的并且不应干扰活性成分的功效。疫苗制剂通常描述于Vaccine Design(“The subunit and adjuvantapproach”(编辑Powell M.F.&Newman M.J.)(1995)Plenum Press New York)。
本发明的免疫原性组合物或疫苗可与施用说明一起包括于容器、包装或分配器中。本发明提供了试剂盒，其包含：(i)第一容器，其包含本发明的免疫原性组合物或疫苗；和任选地，(ii)第二容器，其包含如本文所述的佐剂。
本文还考虑的是组合物，其任选地进一步包含其他形式的Aβ寡聚体、前纤维和成熟的纤维，如Aβ二聚体、三聚体、六聚体、十二聚体、ASPD、ADDL等。
在某些实施方案中，本文所述的组合物(例如，药物组合物和/或免疫原性组合物)包含佐剂或与佐剂组合施用。用于与本文所述的组合物组合施用的佐剂可以在所述组合物的施用之前(例如在72小时、48小时、24小时、12小时、6小时、2小时、1小时、10分钟内)、同时或之后(例如在72小时、48小时、24小时、12小时、6小时、2小时、1小时、10分钟内)进行施用。
在某些实施方案中，本文所述的组合物不包含佐剂并且不与佐剂组合施用。
本文公开的免疫原性组合物通常含有一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。药学上可接受的载体和赋形剂是众所周知的，并且可以由本领域技术人员选择。形容词“药学上可接受的”表明指示物适用于施用于受试者(例如，人或动物受试者)。Remington'sPharmaceutical Sciences,E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,第15版(1975)描述了适用于药物递送治疗性和/或预防性组合物的组合物和制剂(包括稀释剂)，包括免疫原性组合物。
例如，所述载体或赋形剂可以有利地包括缓冲剂。任选地，所述载体或赋形剂也含有至少一种稳定溶解度和/或稳定性的组分。增溶剂/稳定剂的实例包括去污剂，例如月桂肌氨酸和/或Tween。许多药学上可接受的载体和/或药学上可接受的赋形剂是本领域中已知的，并且描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,E.W.Martin,MackPublishing Co.,Easton,Pa.,第5版(1975)。因此，本领域技术人员可以选择合适的赋形剂和载体以产生适用于通过选择的施用途径递送给受试者的制剂。
合适的赋形剂包括，但不限于：甘油、聚乙二醇(PEG)、山梨糖醇、海藻糖、N-月桂酰肌氨酸钠盐、L-脯氨酸、非去污剂磺基甜菜碱、盐酸胍、尿素、三甲胺氧化物、KCl、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+和其他二价阳离子相关的盐、二硫苏糖醇、二硫赤藓醇和13-巯基乙醇。其他赋形剂可以是去污剂(包括：Tween80、Tween20、Triton X-00、NP-40、Empigen BB、辛基葡糖苷、月桂酰麦芽糖苷、Zwittergent 3-08、Zwittergent 3-0、Zwittergent3-2、Zwittergent 3-4、Zwittergent 3-6、CHAPS、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵)。
任选地，可以将本发明的免疫原性组合物配制成含有其他组分，包括例如，佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。
如本文所用的“佐剂”是指增强对免疫原的免疫应答的组合物。包含佐剂的根据本发明的组合物可以用作疫苗，例如用于人受试者。与施用单独的抗原相比，佐剂加速、延长和/或增强对抗原/免疫原的免疫应答的质量和/或强度，因此减少任何给定疫苗中必需的抗原/免疫原的量，和/或为了生成对目标抗原/免疫原的足够免疫应答所必需的注射频率。
可以在本发明的组合物的上下文中使用的佐剂的实例包括无机佐剂(例如无机金属盐，诸如磷酸铝或氢氧化铝)，氢氧化铝的凝胶样沉淀(明矾)；AlPO4；水凝胶；来自革兰氏阴性细菌的外膜的细菌产物，特别是单磷酰脂质A(MPLA)，脂多糖(LPS)，胞壁酰二肽及其衍生物；弗氏不完全佐剂；脂质体，特别是中性脂质体，含有该组合物和任选细胞因子的脂质体；AS01B，AS01E，AS02；非离子嵌段共聚物；ISCOMATRIX佐剂；包含CpG二核苷酸(CpG基序)的未甲基化DNA，特别是具有硫代磷酸酯(PTO)主链的CpG ODN(CpG PTO ODN)或具有磷酸二酯(PO)主链的CpG ODN(CpG PO ODN)；合成脂肽衍生物，特别是Pam3Cys；脂质阿拉伯甘露聚糖；肽聚糖；酵母聚糖；热休克蛋白(HSP)，特别是HSP 70；dsRNA及其合成衍生物，特别是聚I：聚C；聚阳离子肽，特别是聚-L-精氨酸；紫杉醇；纤连蛋白；鞭毛蛋白；咪唑喹啉；具有佐剂活性的细胞因子，特别是GM-CSF，白介素(IL-2、IL-6、IL-7、IL-18)，I和II型干扰素，特别是干扰素-γ、TNF-α；2,5-二羟基维生素D3(骨化三醇)；和合成的寡肽，特别是MHCII-呈递的肽。含有聚氧乙烯(POE)和聚氧丙烯(POP)的非离子嵌段聚合物，诸如POE-POP-POE嵌段共聚物，可以用作佐剂。
佐剂的额外实例包括无机佐剂(例如无机金属盐诸如磷酸铝或氢氧化铝)、有机佐剂(例如皂苷，诸如QS21或角鲨烯)、基于油的佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、细胞因子(例如IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和INF-γ)、微粒佐剂(例如免疫刺激性复合物(ISCOMS)、脂质体、可生物降解的微球、病毒体、细菌佐剂(例如单磷酰脂质A，诸如3-脱-O-酰化的单磷酰脂质A(3D-MPL)或胞壁酰基肽)、合成的佐剂(例如单磷酰脂质A(MPL)，特别是3-脱-O-酰化的单磷酰脂质A(3D-MPL)，和胞壁酰基肽类似物或合成的脂质A，和合成的多核苷酸佐剂，例如聚精氨酸或聚赖氨酸。
皂苷也是合适的佐剂，例如，皂苷Quil A(源自南美洲皂树Molina的树皮)及其级分。Quil A的纯化级分也被称作免疫刺激剂，诸如角鲨烯、QS21、QS17和QS7(Quil-A的非溶血级分)。QS21和聚山梨酯或环糊精的组合也是合适的。
佐剂的另一种实例是含有存在于DNA中的未甲基化的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序(“CpG”)的免疫刺激性的寡核苷酸。当通过全身和粘膜途径施用时，CpG被称作佐剂。当配制在疫苗中时，其可以与游离抗原一起在游离溶液中施用，或共价地缀合至抗原，或与载体诸如氢氧化铝一起配制。
特定受体的活化可以刺激免疫应答。此类受体是技术人员已知的，并且包括例如细胞因子受体，特别是I型细胞因子受体，II型细胞因子受体，TNF受体；和充当转录因子的维生素D受体；和Toll-样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR-6、TLR7和TLR9。此类受体的激动剂具有佐剂活性，即是免疫刺激性的。其他合适的佐剂包括烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)或AGP的药学上可接受的盐。一些AGP是TLR4激动剂，且一些是TLR4拮抗剂。本发明的组合物的佐剂可以是一种或多种Toll-样受体激动剂。在一个更优选实施方案中，所述佐剂是Toll-样受体4激动剂。在一个尤其优选的实施方案中，所述佐剂是Toll-样受体9激动剂。
诸如上述的那些佐剂可以与载体诸如脂质体、水包油乳剂和/或金属性盐(包括铝盐，诸如氢氧化铝)一起配制。例如，可以将3D-MPL与氢氧化铝或水包油乳剂一起配制；可以将QS21与含有胆固醇的脂质体、水包油乳剂或明矾一起配制；可以将CpG与明矾一起或与其他阳离子载体一起配制。
可以在本发明中利用佐剂的组合，特别是单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，更特别是QS21和3D-MPL的组合，或其中将QS21在含有胆固醇的脂质体(DQ)中淬灭的组合物。或者，CpG+皂苷(诸如QS21)的组合是适合用在本发明中的佐剂，如同包含在水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚的有效佐剂制剂一样。可以将皂苷佐剂配制在脂质体中，并与免疫刺激性的寡核苷酸组合。因而，合适的佐剂系统包括，例如，单磷酰脂质A(优选3D-MPL)与铝盐一起的组合。另一种示例性的佐剂包含QS21和/或MPL和/或CpG。可以将QS21在含有胆固醇的脂质体中淬灭。
本发明还提供了制备本发明的免疫原性组合物或疫苗的方法，其包括将本发明的AβO*3F与药学上可接受的赋形剂或载体混合的步骤。
本发明的组合物可以是水性形式(即溶液或悬浮液)或干燥形式(例如冻干的)。如果使用干燥疫苗，则在注射之前将其重构成液体介质。疫苗的冻干是本领域中已知的。当本发明的免疫原性组合物包括冻干组分时，通常分开制备该组分，混合且然后冻干。为了在冻干期间稳定抗原，可以在冷冻干燥之前添加非活性组分，例如作为稳定剂。用于包括的优选稳定剂是乳糖、蔗糖和甘露醇，以及其混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。通过冻干材料的水性重构获得的最终疫苗因此可以含有乳糖和/或蔗糖。优选当制备冻干疫苗时使用无定形的赋形剂和/或无定形的缓冲剂。
在某些实施方案中，本文所述的组合物被配制为适合于对受试者的预期施用途径。例如，本文所述的组合物(例如，药物和/或免疫原性组合物)可以配制用于皮下、肠胃外、经口、舌下、颊、皮内、经皮、结肠直肠、腹膜内、直肠施用、静脉内、鼻内、气管内、肌内、局部、经皮或皮内施用。在一个具体实施方案中，本文提供的组合物(例如，药物和/或免疫原性组合物)被配制用于肌内注射。在一些实施方案中，本文所述的Aβo*3F可用于预防和/或治疗AD，例如，作为用于诱导免疫应答的疫苗。如本文所用，免疫应答的诱导是指所述Aβo*3F(也称为“抗原”或“免疫原”)诱导针对Aβo*3F的T细胞和/或体液免疫应答的能力。例如，免疫原性组合物可以在用该组合物免疫后相对于未治疗的受试者诱导记忆性T和/或B细胞群。
可以通过本领域中已知的方法，包括具体目标淋巴细胞类型(例如，B细胞、T-细胞、T细胞系和T细胞克隆)的增殖或效应子功能的诱导的测定法，来测量免疫应答。
因此，在一些实施方案中，提供了诱导受试者中的免疫应答的方法，其包括将本发明的Aβo*3F或免疫原性组合物施用于所述受试者。所述免疫应答优选是保护性的，并且优选涉及抗体。所述方法可以产生加强应答。本发明的组合物优选以0.5ml剂量(如上所讨论)施用于患者。在一个实施方案中，所述受试者是Aβo*3F血清阴性的。如果受试者没有过去或当前Aβo*3F存在的血清学证据，则所述受试者是“血清阴性的”。在另一个实施方案中，所述受试者是Aβo*3F血清阳性的。如果受试者具有过去或当前Aβo*3F存在的血清学证据，则所述受试者是“血清阳性的”。
还提供了经设计以使本发明的Aβo*3F或免疫原性组合物的免疫原性最大化的给药方案。因此，在一个实施方案中，提供了诱导受试者中的免疫应答的方法，其包括将两个或更多个剂量的本发明的Aβo*3F和/或免疫原性组合物施用于所述受试者。在某些实施方案中，所述剂量间隔一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或更多周。在另一个实施方案中，所述剂量间隔一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或更多个月。或者，剂量可以间隔一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或更多年。
还提供了治疗和/或预防受试者中AD的方法，其包括将本发明的Aβo*3F或免疫原性组合物施用于所述受试者。
在某些实施方案中，可以将本文所述的组合物或AβO*3F施用于受试者，以诱导免疫应答，其包括抗体。此类抗体可以使用本领域技术人员已知的技术(例如，免疫亲和层析、免疫沉淀、离心等)进行分离。
本文描述的AβO*3F或组合物在受试者中生成免疫应答的能力，可以使用本领域技术人员已知或本文描述的任何方法进行评价，如免疫测定例如ELISA(参见例如，Van denDobbelsteen等人，2016，Vaccine 34:4152-4160)、或基于电化学发光或化学发光的免疫测定进行测试。
使用本文提供的AβO*3F或组合物诱导、引发或鉴定的抗体可以用于监测疗法的功效和/或疾病进展。本领域已知的任何免疫测定系统可以用于此目的，包括但不限于使用以下技术的竞争性和非竞争性测定系统：如放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、基于电化学发光或化学发光的免疫测定、“夹心”免疫测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定和免疫电泳测定。这些测定中的几种，例如基于电化学发光或化学发光的免疫测定可以以多重形式完成，并且通常多重测定形式是优选的。
本发明还提供了本发明的AβO*3F或组合物，其用作药物。
本发明还提供了本发明的AβO*3F或组合物在制备用于在哺乳动物中产生免疫应答的药物中的用途。
这些用途和方法优选地用于预防和/或治疗受试者中的MCI和/或AD。
在一些实施方案中，本发明的AβO*3F或组合物可用于诊断受试者中的MCI和/或AD。
如本文使用的，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性措施，其中目的是预防或减慢(减轻)不希望的生理变化或障碍，如AD的发展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病的程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以意指存活期相较于未接受治疗时的预期存活期延长。需要治疗的那些包括已患有病症或障碍的那些以及易于患上病症或障碍的那些或要预防病症或障碍的表现的那些。如本文使用的“药物”是用于治疗不期望的生理变化或障碍的药剂。
术语“抗血清”是指含有多克隆抗体的血清。在一些实施方案中，所述抗血清是用本文所述的AβO*3F或组合物免疫目标生物获得的，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猴、山羊、绵羊、马、牛等哺乳动物。
术语“多克隆抗体”是指由抗原的多种抗原决定簇刺激机体所产生的多种抗体的混合物，即为多克隆抗体。由于本文所述的AβO*3F为复杂的蛋白寡聚物，用该寡聚物免疫动物所产生的抗体通常为多克隆抗体。可以对产生的所述多克隆抗体进行分离纯化，如亲和层析纯化、免疫沉淀、分子排阻色谱等，以进一步获得针对单个抗原决定簇的抗体。术语“抗体”是指免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的具有结合到抗原的表位上的能力的片段。天然存在的抗体典型地包含四聚体，其通常由至少两条重(H)链和至少两条轻(L)链构成。免疫球蛋白包括如下同种型：IgG、IgA、IgM、IgD以及IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型，IgA可分为IgA1和IgA2亚型。轻链根据恒定区的不同分为κ链和λ链。本发明的抗体可以具有任何同种型。同种型的选择通常由希望的效应物功能(如ADCC诱导)来决定。示例性同种型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用人轻链恒定域κ或λ中任一者。如果需要，可以通过已知方法转换本发明抗体的类别。例如，最初是IgG的本发明抗体可以类别转换为本发明的IgM抗体。此外，类别转换技术可以用来将一个IgG亚类转化成另一亚类，例如从IgGl转换为IgG2。因此，本发明抗体的效应物功能可以通过同种型切换变为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体，以用于各种治疗用途，条件是所述抗体的C1q结合活性降低或消除。在一些实施方案中，本发明的抗体是IgM或IgG1、2、3或4型抗体。如果抗体的氨基酸序列相对于其他同种型与该同种型大部分同源，则该抗体属于特定同种型。
在本文中，术语“抗体”以最广泛意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于完整抗体和抗体的抗原结合片段。
“可变区”或“可变结构域”是抗体的重链或轻链中参与抗体与其抗原的结合的结构域。抗体的每条重链由重链可变区(本文中简称为VH)和重链恒定区(本文中简称为CH)构成，重链恒定区通常由3个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区(本文中缩写为CL)组成。重链和轻链可变区典型地负责抗原识别，而重链和轻链恒定域可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)、Fc受体和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。重链和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合区。VH和VL区可以进一步细分成称作“互补性决定区(CDR)”的超变区(HVR)，它们中间穿插着更保守的称为“骨架区”(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR域和四个FR域构成，按以下顺序从氨基末端排到羧基末端：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
术语“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”(在本文中与超变区“HVR”可以互换使用)即指抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。在本文中，重链的三个CDR称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链的三个CDR称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。
应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
术语“单抗”、“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制剂，指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即包含个体抗体的群体除可能少量存在的天然发生的突变之外是相同的。常规的单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。在某些实施方案中，单克隆抗体可以由多于一种Fab域构成，由此增加对多于一种靶标的特异性。术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”并不受限于任何具体的产生方法(例如，重组的、转基因的、杂交瘤等)。
本发明还包括“双特异性抗体”。
术语“抗体的抗原结合片段”指能够与表位结合的抗体的片段、部分、区域或结构域(例如可经由切割、重组、合成等获得)。抗原结合片段可以含有该类抗体的1、2、3、4、5或所有6个CDR域，并且尽管能够结合到所述表位，仍可以展现出不同的特异性、亲和力或选择性。优选地，抗原结合片段含有所述抗体的所有6个CDR域。抗体的抗原结合片段可以是单条多肽链(例如，scFv)的一部分或包含单条多肽链，或者可以是两条或更多条多肽链(各自具有氨基末端和羧基末端)，例如，双抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、骆驼或纳米抗体等。
在一些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段是单链抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段是嵌合抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段是人源化抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段是人抗体或全人抗体。
变体抗体也包括在本发明范围之内。
本发明中的氨基酸残基的编号是根据(the internationalImMunoGeneTics information system)/>或Kabat,E.A.，Wu,T.T.，Perry,H.M.，Gottesmann,K.S.&Foeller,C.,(1991),Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，NIH公开号91-3242，美国卫生与公众服务部；Chothia,C.&Lesk,A.M.,(1987),Canonical structures For The Hypervariable domains OfImmunoglobulins.,J.Mol.Biol.,196,901-917进行的。在没有明确指明的情况下，本发明中的氨基酸残基的编号是根据Kabat编号系统进行。
抗体或其抗原结合片段“特异性地”结合另一分子的区域(即，表位)是指，它相对于另外的表位与该表位更加频繁地、更加快速地、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力或亲合力反应或结合。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段以至少10-7M的亲和力结合淀粉样蛋白，尤其是其毒性形式，特别是AβO*3F，例如10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或更高。优选地，抗体或其抗原结合片段在生理条件下(例如，在体内)结合。因此，特异性结合淀粉样蛋白尤其是其毒性形式特别是AβO*3F，是指该抗体或其抗原结合片段以上述特异性和/或在这样的条件下结合到淀粉样蛋白尤其是其毒性形式特别是AβO*3F上的能力。适合于确定所述结合的方法是本领域已知的。
在抗体与指定抗原结合的背景下，术语“结合”通常是指以对应于约10-6M或更小的KD的亲和力结合，该KD比该抗体对与除指定抗原或紧密相关抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力低至少10倍，如低至少100倍、至少1,000倍。
如本文所用，术语“kd”(sec-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值又称为koff值。
如本文所用，术语“ka”(M-1x sec-1或1/Msec)是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数。
如本文所用，术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数并且通过kd除以ka获得。
如本文所用，术语“KA”(M-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的结合平衡常数并且通过ka除以kd获得。
通过本领域已知的任何技术产生本发明的抗体，如但不限于任何化学、生物学、遗传学或酶学技术，可单独使用或组合使用。通常，知道期望序列的氨基酸序列，本领域技术人员可通过用于产生多肽的标准技术容易地产生所述抗体。例如，可以使用公知的固相方法合成这些抗体，优选使用市售的肽合成装置(如Applied Biosystems,Foster City,California制造的装置)并遵循制造商的说明书合成这些抗体。或者，可以通过本领域熟知的重组DNA技术合成本发明的抗体。例如，在将编码抗体的DNA序列并入表达载体并将这些载体导入合适的表达所需抗体的真核或原核宿主中后，可以获得作为DNA表达产物的抗体，之后可以使用已知技术从宿主分离抗体。
可以通过包含任何“适合”数目的经修饰的氨基酸和/或与偶联取代基结合来修饰本发明的抗体及其抗原结合片段。
本发明的抗体及其抗原结合片段还可以通过共价偶联到聚合物而化学修饰，以增加其循环半衰期。
本发明的抗体及其抗原结合片段可以在不同细胞系中产生，如人细胞系、非人哺乳动物细胞系和昆虫细胞系，例如CHO细胞系、HEK细胞系、BHK-21细胞系、鼠类细胞系(如骨髓瘤细胞系)、纤维肉瘤细胞系、PER.C6细胞系、HKB-11细胞系、CAP细胞系和HuH-7人细胞系(Dumont等人，2015,Crit Rev Biotechnol.,Sep.18,1-13.，其内容通过引用并入本文)。
通过常规免疫球蛋白纯化方法适当地将本发明的抗体与培养基分离，所述方法如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法。
术语“受试者”是指温血动物，优选哺乳动物(包括人、家畜和农场动物、动物园动物、运动动物或宠物动物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等)，更优选人。在一个实施方案中，受试者可以是“患者”，即，温血动物，更优选是人，其正在等待接受或正在接受医疗护理或将是医疗程序、或疾病发展监测的对象。在一个实施方案中，受试者是成年人(例如18岁以上的受试者)。在另一个实施方案中，受试者是儿童(例如，18岁以下的受试者)。在一个实施方案中，受试者是年龄大于55、60、65、70、75、80、85、90岁或更大岁数的老年人。在一个实施方案中，受试者是男性。在另一个实施方案中，受试者是女性。
下文将通过实施例来具体描述本发明的技术方案，这些实施例是描述性、例证性的，而不意味着限制。下述实施例中所用的试剂，如无特殊标注，均可从试剂公司如SigmaAldrich、Merck容易地商购，所述试验方法，如无特殊备注，均可以从教科书如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Press,New York中找到。
实施例
实施例1与3F特异性结合的Aβ寡聚体的获取
1.1实验材料和方法
1.1.1实验材料
Protein A磁珠：Bio-RAD，#1614833
Protein G磁珠：Bio-RAD，#1614023
Protein A/G琼脂糖凝胶：Abmart，#A10001S
6E10抗体：Biolegend，#803002
人源Aβ42检测试剂盒：Immuno-Biological Laboratories
1.1.2主要溶液
(1)50mM氢氧化钠(pH 10.0)；
(2)20mM磷酸盐缓冲液(PBS)：pH 7.4；
(3)0.1％PBST：含0.1％Tween-20的PBS；
(4)20mM甘氨酸洗脱液(pH 2.0)；
(5)1M Tris中和液：pH 10.0；
备注：实施例2、3、4、5和6中提及但未给出来源的相关试剂和溶液与实施例1中的相同。
1.2小鼠脑匀浆制备
APP/PS1小鼠用戊巴比妥钠深度麻醉，经心脏灌注含有肝素(10U/mL)的冰冷PBS后处死取脑。向脑组织中加入1mL RIPA强裂解剂(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)，用Tissue LyserⅡ组织研磨器以30Hz的频率破碎8min，4℃，14000rpm离心30min，收集上清液。在免疫沉淀之前，将脑匀浆加入到100μL Protein A/G-琼脂糖凝胶中，4℃孵育1h去除小鼠脑匀浆中内源性IgG，再将脑匀浆加入到交联了APP抗体的Protein A磁珠中，去除小鼠脑内源性APP。
1.3抗体与磁珠交联
首先将3F和6E10抗体分别与Protein A或Protein G磁珠交联，具体交联步骤为：
(1)取200μL Protein A或Protein G磁珠，用2mL 0.1％PBST洗三次，每次都充分混匀磁珠，再放在磁力架上，弃掉上清液；
(2)将50μg 3F或6E10抗体加入到磁珠中，室温摇晃反应30min使磁珠与抗体充分结合，然后用0.1％PBST洗三次；
(3)磁珠用交联缓冲液(0.2M三乙醇胺，pH 8.2)清洗一次，然后将12mg DMP溶解到2mL交联缓冲液中，加入到磁珠中，室温摇晃反应1h。反应结束后，将交联液弃掉，加入2mL封闭缓冲液(0.1M乙醇胺，pH8.2)清洗一次，然后再加入2mL封闭缓冲液，室温封闭2h；
(4)封闭结束后，用PBS将磁珠洗三次，然后用0.1M甘氨酸(pH2.5)洗脱磁珠一次，反应5min，再用0.1％PBST将磁珠洗三次，将磁珠浸在含0.02％NaN3的PBST中，4℃保存。
1.4Aβo*3F的体外制备
将1mg Aβ42、Aβ40或其他形式的Aβ(中肽生化有限公司)溶于1mL 100％六氟异丙醇(HFIP)，涡旋5min，水浴超声10min后，分装到EP管中，过夜挥发溶剂，并放于-20℃保存。在使用之前，将HFIP处理分装的Aβ溶解在50mM NaOH中，浓度为1mg/mL，涡旋3-5min，超声1min，然后用预冷的PBS稀释至10μM。4℃，21000g离心30-40min，丢弃沉淀部分(约为起始体积的5％)，得到Aβ单体。将Aβ单体在25℃静止孵育2天，将其与交联了3F抗体的Protein A磁珠4℃孵育过夜。第二天，磁珠用0.1％PBST洗三遍后，用20-100mM甘氨酸(pH 2.0)洗脱3-5min，洗脱两次，洗脱液用1M Tris中和到pH 7，得到sAβo*3F(体外制备的Aβos)。
1.5APP/PS1小鼠脑匀浆以及AD患者CSF中Aβo*3F的分离制备
为了制备3F特异性识别的Aβos(Aβo*3F)，将APP/PS1小鼠脑匀浆以及AD患者CSF样品(来自郑州大学第一附属医院，签署知情同意书并获得了郑州大学第一附属医院伦理审查委员会批准)与交联了3F抗体的Protein A磁珠4℃孵育过夜。第二天，磁珠用0.1％PBST洗三遍后，用20mM-100mM甘氨酸(具体使用20mM，pH 2.0)洗脱3min，洗脱两次，洗脱液用1MTris中和到pH 7，得到APP/PS1小鼠脑内的Aβo*3F(mAβo*3F，AD小鼠脑内分离的Aβo*3F)，或AD患者CSF中提取的Aβo*3F(hAβo*3F，AD患者脑脊液分离的Aβo*3F)。3F免疫耗竭后的Aβ聚集体混合物被称为Aβ-ID，分别是sAβ-ID(体外制备)、mAβ-ID(APP/PS1小鼠脑内分离制备)和hAβ-ID(AD患者CSF中分离制备)，用作对照。
Aβ聚集体混合物Aβ*6E10是通过将APP/PS1小鼠脑匀浆或AD患者CSF与交联了6E10抗体的Protein G磁珠混合，4℃反应过夜，然后用20mM-100mM甘氨酸(具体使用20mM，pH2.0)洗脱3-5min(具体为3min)，洗脱两次，洗脱液用1M Tris中和到pH 7，得到APP/PS1小鼠脑内的Aβo*6E10(mAβo*6E10，AD小鼠脑内分离的Aβo*6E10)，或AD患者CSF中提取的Aβo*6E10(hAβo*6E10，AD患者CSF内分离的Aβo*6E10)(图1)。免疫沉淀得到的Aβ浓度通过Aβ检测试剂盒进行测定。
实施例2Aβo*3F分子量大小和形态表征
2.1实验材料和方法
2.1.1实验材料
Aβ多肽：中肽生化；
Superdex 200 10/300GL分子筛：GE Healthcare；
A11抗体：Invitrogen，#AHB0052；
分子筛蛋白marker：GE healthcare；
3-8％Tris-Acetate预制胶：Invitrogen；
碳膜支持铜网：中科科仪；
醋酸双氧铀：中科科仪；
ECL化学发光试剂盒：Pierce Biotechnology；
ThT检测试剂：Sigma-Aldrich；
硝酸纤维素膜：Millipore。
2.1.2实验仪器
AKTA蛋白层析仪：GE Healthcare Life Science，USA；
蛋白电泳仪：Bio-rad，USA；
蛋白转膜系统：Bio-rad，USA；
HT7700透射电镜：Hitachi，日本；
Safire2TM酶标仪：Tecan Group，瑞士；
Amersham Imager 680成像系统：GE，USA。
2.1.3主要溶液
(1)20mM TBS缓冲液：称取2.4g Tris，8g氯化钠，用去离子水溶解，用稀盐酸调pH到7.5，并定容到1L。
(2)0.1％TBST：将1mL Tween-20加入1L TBS中，搅拌20min。
(3)ThT溶液：用50mM PB(磷酸盐缓冲液，pH＝6.5)溶液配制100X ThT母液(500μM)，使用时用50mM PB(PH＝6.5)稀释为1X。
(4)5％脱脂牛奶。
(5)电泳缓冲液：将30g Tris、144g Glycine和10g SDS溶解，以去离子水定容至1L，稀释10倍使用。
(6)5×非还原型上样缓冲液(10mL)：2mL 10％SDS，0.6mL 1M Tris-HCl(pH6.8)，5mL甘油，1mL 1％溴酚蓝，以去离子水定容至10mL。
(7)转膜缓冲液：将30g Tris、144g Glycine溶解于去离子水中，并定容至1L，稀释10倍使用。
2.2Aβ单体、寡聚物和纤维的制备和表征
Aβ单体制备同1.4。将Aβ单体在25℃静止孵育0-4天，每隔24h用ThT检测Aβ的聚集状态，具体操作如下：用PBS缓冲液将Aβ样品稀释至10μM，然后将190μLThT检测液和10μL待测样品在黑色酶标板中充分混匀，并使用Safire2TM酶标仪测量荧光，激发波长为440nm，发射波长为480nm。结果显示，随着孵育时间的增加，Aβ样品的ThT读数逐渐增大，表明Aβ单体逐渐向寡聚体、纤维形式聚集(图2的A图)。
Dot blot实验用于评估不同抗体与Aβ单体和聚集体的结合情况。将Aβ样品点在硝酸纤维素膜上，用5％脱脂牛奶室温封闭1h。将膜与不同的检测抗体室温孵育1-2h，然后用0.1％TBST洗涤三次，每次5min，并加入HRP标记的二抗室温孵育1h。用0.1％TBST洗涤三次，每次5min，膜上加入ECL化学发光液，使用Amersham Imager 680成像系统进行显色，并用Image J软件对印迹的大小以及光密度进行定量分析。结果显示，6E10是一个广泛结合Aβ单体、寡聚体和纤维的抗体，其可以与10μM、20μM的Aβ结合，而且结合情况无明显差异。3F与A11抗体都不与Aβ单体结合，而且3F与A11抗体结合不同的寡聚体类型，3F主要与10μM Aβos结合，而A11抗体主要结合20μMAβos，表明3F与A11识别不同的寡聚体构象(图2的B图)。此外，通过统计孵育0-4天得到的10μM Aβos与3F的亲和力显示，10μM孵育2天得到的Aβos(sAβos)与3F的亲和力最高，因此，后续实验就采用该寡聚体(sAβo*3F，体外制备的Aβo*3F)与3F进行免疫沉淀(图2的C图)。
2.3sAβo*3F的分子量表征
首先用Western blot对sAβo*3F的分子量大小进行检测。具体操作如下：将Aβ样品加样到15％SDS-PAGE凝胶电泳或者3-8％Tris-Acetate凝胶中。对于Tris-Acetate凝胶，样品在上样前与NovexTM Tris-Glycine样品缓冲液混合。电泳在Tris-Glycine电泳缓冲液(含0.5mM DTT、1mM ATP和5mM MgCl2)中进行，4℃，150V电泳4h。对于Western blot，将SDS-PAGE或Tris–Acetate凝胶分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。用5％脱脂牛奶将膜室温封闭1-2h，加检测抗体(6E10)4℃孵育过夜，然后用0.1％TBST将膜洗涤三次，每次5min，并与相应的二抗(HRP标记的山羊抗小鼠二抗)室温反应1h。TBST洗涤三次后，膜上覆盖ECL显色液，在Amersham Imager 680成像系统中显色，并通过Image J软件对蛋白条带进行量化。
SDS-PAGE实验结果显示，sAβo*3F主要由两种分子量的寡聚体组成，一个分子量大约为12kDa，一个分子量大于180kDa；而native-PAGE结果显示，sAβo*3F主要由一个分子量约为500kDa的寡聚体组成，两种电泳结果出现差异可能是由于SDS的影响(图2的D图)。
为了进一步确定sAβo*3F的分子量大小，将500μL sAβo*3F或100μL SEC Marker上样到与AKTA pure系统相连的Superdex 200 10/300GL分子筛色谱柱中。色谱柱预先用Tris-Gly缓冲液平衡，以0.5mL/min的流速洗脱。通过与Marker比对发现sAβo*3F的分子量大小为588kDa(图2的E、F图)。
2.4mAβo*3F的分子量大小和形态表征
将APP/PS1小鼠脑内的Aβo*3F进行提取(mAβo*3F)，并对其分子量大小进行分析。与sAβo*3F结果一致，mAβo*3F在SDS-PAGE中呈现出两条带，分子量大小分别为12kDa和大于180kDa，而在native-PAGE中，mAβo*3F只有一个分子量约为500kDa的条带(图2的G图)。SEC结果显示，mAβo*3F分子量为588kDa(图2的H图)。此外，将10μL Aβo*3F滴在200目铜网上吸附20min，滤纸吸干，2％醋酸双氧铀负染30s，滤纸吸干后风干。在投射电子显微镜(TEM，日立H7700，日本)下以120kV的工作电压在100,000×倍数下检查样品。结果显示，mAβo*3F是直径约为10nm的颗粒(图2的H图)。
2.5AD患者CSF中的Aβo*3F的分子量表征
AD患者CSF中提取的Aβo*3F(hAβo*3F)分子量大小和分布与sAβo*3F和mAβo*3F结果一致，hAβo*3F在native-PAGE中只有一个条带，分子量约为500kDa，而在SDS-PAGE中有两个分子量为12kDa和大于180kDa的条带(图2的I图)。
实施例3Aβo*3F的神经毒性检测
3.1实验材料
N2a细胞：国家实验细胞资源共享服务平台(NICR)；
D-聚赖氨酸氢溴酸盐(PDL)：Sigma-Aldrich
B27补充剂(50×)：Thermo Fisher Scientific
NeurobasalTM-A培养基：Gibco
70μm尼龙细胞滤网：BD Bioscience
3.2原代神经元培养
将孕14至15天的C57BL/6(购自北京华富康生物科技股份有限公司)胎鼠脑取出，在HBSS(Hank's平衡盐溶液)中剥离血脑膜，并用镊子将分离的海马和皮层剪碎。将碎组织块转移到15mL离心管中，600rpm离心3min，向沉淀中加入10mL稀释10倍的胰酶消化液(含DNaseⅠ)，37℃消化10min，每5min轻轻颠倒几下。消化结束后，用40mL DMEM培养基(含10％FBS)终止胰酶消化反应，并将细胞悬液通过70μm细胞筛网去除未消化的组织块。1200rpm离心10min收集细胞，并用DMEM培养基重悬细胞，铺到12孔板中。2-4h后换成Neurobasal培养基(含B27、0.5mM L-谷氨酰胺、0.5％青霉素和链霉素)，继续培养7-9天用于后续实验。
3.3sAβo*3F的细胞毒性检测
本实验主要采用MTT法来检测Aβ聚集体对神经元的毒性。具体操作如下：将N2a细胞培养在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中。培养皿中的细胞经胰酶消化，离心，培养基重悬后，接种在96孔板中，每孔约5000个细胞/100μL培养基。12h后，用一系列浓度梯度的sAβo*3F、sAβos处理细胞，同时将相同体积的溶剂加入到细胞中作对照。72h后，向每个孔中添加25μL 5mg/mL MTT。37℃继续培养3h后，吸掉培养基，加入150μL DMSO。用MD-M5酶标仪测量570nm和630nm处的吸光度。每个样品和对照使用六个重复孔的平均值，每个实验重复三次。通过将添加样品孔的吸光度(经背景校正)除以添加溶剂孔的吸光度(经背景校正)来计算细胞活力。
MTT结果显示sAβo*3F对细胞活力的半抑制浓度(IC50)约为0.186nM，而免疫沉淀前的sAβos的IC50约为63.26nM，两者IC50相差340倍(图3的A、B图)。此外，将0.5nM sAβo*3F加入到N2a细胞中可造成66％的细胞死亡，而同浓度的sAβos和sAβ-ID则无明显的神经毒性作用。当sAβos浓度达到200nM时，才可产生70％细胞毒性，而此时sAβ-ID的神经毒性只能达到32％(图3的C图)。这些结果表明，sAβo*3F是一种具有强神经毒性的寡聚体。
3.4mAβo*3F的细胞毒性检测
MTT法检测mAβo*3F对N2a细胞的IC50约为0.111nM；对原代神经元细胞的IC50约为0.057nM(图3的D图)。具体地，0.5nM mAβo*3F可造成78％的原代神经元细胞死亡，而同浓度的mAβ*6E10和mAβ-ID则没有明显的细胞毒性；当浓度提高到200nM时，mAβ*6E10可产生54％的神经毒性，而mAβ-ID的神经毒性只有20％(图3的E图)。
3.5hAβo*3F的细胞毒性检测
MTT检测hAβo*3F对原代神经元的IC50约为0.076nM(图3的F图)。具体地，将0.2nMhAβo*3F加入到原代神经元中可减少68％的细胞活力，而hAβ*6E10和hAβ-ID在此浓度下对神经元存活没有显著影响；当浓度增加到40nM时，hAβ*6E10使细胞活力降低66％，而hAβ-ID仅可降低40％的细胞活力(图3的G图)。
实施例4Aβo*3F对胶质细胞的细胞因子表达水平的影响
4.1实验材料和方法
4.1.1实验材料
BV2细胞：NICR
反转录试剂盒：康为世纪
UltraSYBR Mixture(Low ROX)：康为世纪
4.1.2实验仪器
7500Fast实时定量PCR仪：Applied Biosystems
T100 Thermal Cycler PCR仪：BIO-RAD
NanoDrop微量分光光度计：Quawell
4.2Aβo*3F可提升小胶质细胞炎症因子的表达水平
将BV2细胞培养在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中。培养皿中的细胞经胰酶消化，离心，培养基重悬后，接种在12孔板中，每孔约5×10^5个细胞/mL培养基。12h后，用不同的Aβ样品处理BV2细胞，同时将相同体积的溶剂加入到细胞中作对照。48h后，通过荧光定量PCR(qPCR)检测细胞内促炎因子的表达水平。具体操作如下：常规方法制得细胞总mRNA并使用微量分管光度计测定mRNA浓度。根据反转录试剂盒说明书进行反转录得到cDNA，然后使用EasyQuick RT MasterMix检测目标基因的表达水平。所用引物如下：
mTNF-α：5’-GATTATGGCTCAGGGTCCAA-3’(SEQ ID NO：1)，
5’-GCTCCAGTGAATTCGGAAAG-3(SEQ ID NO：2)；
mIL-1β：5’-CCCAAGCAATACCCAAAGAA-3’(SEQ ID NO：3)，
5’-GCTTGTGCTCTGCTTGTGAG-3’(SEQ ID NO：4)；
mIL-6：5’-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3’(SEQ ID NO：5)，
5’-TTGCCATTGCACAACTCTTT-3’(SEQ ID NO：6)；
GAPDH：5’-TGAATACGGCTACAGCAACA-3’(SEQ ID NO：7)，
5’-AGGCCCCTCCTGTTATTATG-3’(SEQ ID NO：8)。
qPCR结果显示，0.3nM mAβo*3F、200nM mAβ*6E10和200nM mAβ-ID可诱导小胶质细胞促炎因子的表达水平显著增加，包括TNF-α、IL-6和IL-1β，但0.3nM mAβ*6E10或0.3nM mAβ-ID则无明显刺激作用(图4的A图)。
4.3原代星形胶质细胞培养
取1-2天龄C57BL/6新生鼠，在75％酒精中浸泡消毒后取出大脑浸泡于HBSS缓冲液中，剥除血脑膜，将大脑用组织剪剪碎，置于15mL离心管中，600rpm离心3min，向沉淀中加入10mL稀释10倍的胰酶消化液(含DNaseⅠ)，37℃消化10min，每5min轻轻颠倒几下。消化结束后，用40mL DMEM培养基(含10％FBS)终止胰酶消化反应，并将细胞悬液通过70μm细胞筛网去除未消化的组织块。1200rpm离心10min收集细胞，用DMEM培养基重悬细胞，并将细胞铺于T-75培养瓶中，在37℃下用DMEM培养基培养5-7天。每2-3天更换一次培养基。细胞培养7天后用胰酶消化，将细胞铺到12孔板中使用。
4.4Aβo*3F可刺激星形胶质细胞炎症因子的表达
用不同的Aβ样品处理原代星形胶质细胞，qPCR探究其对原代星形胶质细胞的炎症因子表达水平的影响，具体操作步骤同4.2。所用引物如下：
miNos：5’-CACCTGGAACAGCACTCTCT-3’(SEQ ID NO：9)，
5’-CTTTGTGCGAAGTGTCAGTG-3’(SEQ ID NO：10)；
mTNF-α：SEQ ID NO：1和2；
mIL-1β：SEQ ID NO：3和4；
mIL-6：SEQ ID NO：5和6；
GAPDH：SEQ ID NO：7和8。
结果显示，0.3nM mAβo*3F、200nM mAβ*6E10和200nM mAβ-ID可导致原代星形胶质细胞的促炎因子表达水平显著提高，包括TNF-α、IL-6、IL-1β和iNos，但0.3nM mAβ*6E10或0.3nM mAβ-ID对星形胶质细胞的炎症因子的表达水平无明显影响(图4的B图)。
4.5Aβo*3F破坏星形胶质细胞介导的突触生成。
星形胶质细胞可以通过分泌突触因子如TSP1和Gpc4/6来诱导突触形成。将mAβo*3F加入到原代星形胶质细胞中，以qPCR检测星形胶质细胞的多种突触因子表达水平的变化。所用引物如下：
mGpc4：5’-CTGGAGGGTCCTTTCAACATT-3’(SEQ ID NO：11)，
5’-GACATCAGTAACCAGTCGGTC-3’(SEQ ID NO：12)；
mGpc6：5’-TAGTCCTGTATTGGCAGCCAC-3’(SEQ ID NO：13)，
5’-GGCTAATGTCTATAGCAGGGAA-3’(SEQ ID NO：14)；
mTSP1：5’-GGTAGCTGGAAATGTGGTGCGT-3’(SEQ ID NO：15)，
5’-GCACCGATGTTCTCCGTTGTGA-3’(SEQ ID NO：16)；
GAPDH：SEQ ID NO：7和8。
结果显示，0.3nM mAβo*3F和200nM mAβ*6E10处理细胞可显著降低TSP1和Gpc4/6的表达水平，而0.3nM mAβ*6E10或0.3nM mAβ-ID无明显作用。只有当mAβ-ID的浓度增加到200nM时，才可降低星形胶质细胞的Gpc4表达水平(图4的C图)。
实施例5Aβo*3F对小鼠认知的影响和脑内神经元的损伤作用
5.1实验材料和方法
5.1.1实验材料
快速Golgi染色试剂盒：FD NeuroTechnologies
尼氏染色试剂盒：索莱宝
5.1.2实验仪器
脑立体定位注射系统：中国医学科学院
Y迷宫设备：中国医学科学院
新事物识别设备：中国医学科学院
5.2实验动物
3月龄C57BL/6小鼠。所有小鼠饲养在22±2℃和45％±10％湿度的洁净室中，均可随意进食和饮水，并按照12h光照和12h黑暗进行循环。所有动物实验均按照《中国公共卫生服务实验动物的护理和使用指南》进行，涉及小鼠的实验均得到了清华大学动物保护和使用委员会的批准。
5.3脑立体定位注射
3月龄C57BL/6小鼠随机分为6组，每组6-8只，分别是：注射2.5nM(45.5pg)mAβo*3F组，注射2.5nM(45.5pg)mAβ*6E10组，注射2.5nM(45.5pg)mAβ-ID组，注射600nM(10.9ng)mAβ*6E10组，注射600nM(10.9ng)mAβ-ID组，以及注射Tris-Gly溶剂的对照组。将小鼠用氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)的混合麻醉剂深度麻醉后，固定在脑立体定位注射台上，将小鼠脑部皮肤沿中线剪开，露出头骨，利用立体定位仪定位注射部位：以前囟(bregma)为起点，AP＝-1.7mm，ML＝±1.0mm，DV＝-1.5mm。用颅钻沿定位点开颅后，进行双侧注射，每半脑注射4μL，注射速度为0.4mL/min。注射结束后，继续留针3min，使样品完全吸收。用无菌生理盐水清洗手术部位并缝合切口。术后对小鼠状态进行监测并提供术后护理。在立体定位注射24h后开始检测小鼠的行为和认知能力，然后解剖小鼠进行生理生化分析。
5.4Aβo*3F严重损伤了小鼠的记忆能力
新事物识别实验和Y迷宫实验被应用于检测小鼠的认知能力变化。
5.4.1新事物识别实验
新事物识别实验是基于小鼠对新的、不熟悉的物体表现出更多的互动这一自发倾向而设计的实验。实验主要分为三个阶段：
(1)熟悉环境阶段，准备一个宽40cm×深40cm×高40cm的白色盒子，在盒子里没有物体的情况下，允许每只小鼠自由地探索盒子5min。1h后给小鼠注射Aβ样品；
(2)训练阶段，24h后，盒子里放置两个完全相同的物体，将每只小鼠放在与第一阶段相同的盒子里，允许小鼠自由探索5min。记录小鼠嗅探和接触每个物体的次数；
(3)测试阶段，训练6h后，将右侧物体换成一个材质，颜色，形状都不相同的一个新物体，让小鼠继续自由探索5min，记录小鼠对于这两个物体的嗅探和触碰的次数，以此来检测小鼠的记忆能力。辨别指数是通过以下计算公式确定的：(新物体的次数–旧物体的次数)/(新物体的次数+旧物体的次数)。
结果显示，与对照组相比，2.5nM mAβo*3F和600nM mAβ*6E10处理的小鼠对新事物的辨别指数明显下降，而其他Aβ处理组的小鼠对新事物的辨别指数与对照组相比则无明显差异，表明Aβo*3F明显降低了小鼠的记忆能力(图5的A图)。
5.4.2Y迷宫实验
新事物识别实验后，小鼠的空间记忆能力通过Y迷宫实验来检测。Y迷宫是由三条完全一样的臂组成，每条臂之间有120度的角度。每条臂的尺寸是8cm×30cm×15cm(宽×长×高)。实验主要分为两个阶段：
(1)训练阶段，将三条臂随机的命名为A、B、C，A、B臂在实验阶段全程开放，而C作为新臂，在训练阶段是封闭的。从A臂中放入后，每只小鼠允许在A、B臂中自由探索10min；
(2)训练1h后，将C臂打开，再次按顺序将小鼠从A臂中放入，允许小鼠在A、B、C臂中探索5min，分析小鼠在三个臂中的停留时间。所有的试验过程都通过安装在Y迷宫上方的摄像机进行记录。
结果显示，2.5nM mAβo*3F和600nM mAβ*6E10处理的小鼠在新臂的持续时间与对照组小鼠相比明显减少。而注射2.5nM mAβ*6E10、2.5nM mAβ*ID和600nM mAβ*ID的小鼠与对照组相比无明显差异。这表明mAβo*3F，而不是mAβ*6E10或mAβ-ID，在低浓度时就会引起小鼠严重的记忆障碍，对于mAβ*6E10，只有当浓度增加到600nM时，才能使小鼠出现类似程度的记忆损伤(图5的B图)。
5.5Aβo*3F显著降低了小鼠神经元的树突棘密度
使用FD快速Golgi染色试剂盒对小鼠的大脑样本进行染色。在解剖小鼠前24h，将试剂盒中的A和B溶液进行1：1混合，避光保存。将小鼠处死后，无需灌流，直接取脑，将大脑沿中线分为左右半脑，左半脑用PBS冲掉表面的血液，用滤纸吸干组织表面的溶液，然后将组织放入到提前配置好的A+B溶液中。24h后换液一次，室温避光放置2周，在浸泡期间，每周对组织进行两次轻轻上下颠倒以取得最佳结果。2周后，将组织转移到C溶液中，24h后换液一次，室温避光放置5天。然后，用冷冻切片机在-22℃获得100μm厚的冷冻切片。待切片室温自然干燥后，开始染色。首先将切片用Milli-Q水洗涤两次，每次4min，然后配置染色工作液，将切片置于染色工作液中染色15min，用Milli-Q水洗涤两次，每次5min。染色结束后，用50％、75％、95％和100％的乙醇对切片进行脱水，每个浓度梯度脱水4min。然后将切片放于二甲苯中，并进行中性树脂封片观察。使用Olympus倒置显微镜的100×镜头物镜观察海马CA1区神经元的树突和树突棘。树突棘密度是由Image J软件分析确定(树突密度＝树突棘数量/树突长度)。
通过计算树突棘密度发现，与对照组相比，2.5nM mAβo*3F和600nM mAβ*6E10处理的小鼠脑CA1区神经元的树突棘密度明显下降，但2.5nM mAβ*6E10、2.5nM mAβ-ID或600nMmAβ-ID则对小鼠脑神经元树突棘密度无明显作用(图5的C、D图)。
5.5Aβo*3F显著减少小鼠海马区神经元数量
5.5.1石蜡包埋和切片
行为学实验结束后，用戊巴比妥钠(50mg/kg)对小鼠进行深度麻醉，并经心脏灌注含有肝素(10U/mL)的冰冷PBS，最后处死解剖。将小鼠的大脑取出后，沿中线分为左右半脑，左半脑浸泡在4％多聚甲醛中固定48h后，进行乙醇梯度脱水：50％、70％、80％、90％乙醇各1h。100％乙醇1h，重复一次，然后50％二甲苯30min，重复一次。脱水后将组织浸泡在石蜡中4h，进行组织包埋。用石蜡组织切片机得到5μm的组织切片。
5.5.1尼氏染色
5μm石蜡切片在60℃加热30min后，浸泡在100％二甲苯、50％二甲苯、100％酒精中各10min，75％乙醇、50％乙醇、30％乙醇和去离子水中各5min进行切片脱蜡。然后根据尼氏染色说明书，在切片上滴加甲酚紫溶液，56℃加热反应1h，室温分化1-3min至背景接近于无色后，用梯度酒精脱色(70％、95％和100％；各20秒)，并浸泡在二甲苯中，中性树脂进行封片后，用显微镜采集数据并分析。结果显示，2.5nM mAβo*3F和600nM mAβ*6E10会造成小鼠脑内CA1区和DG区的神经元数量明显减少，而2.5nM mAβ*6E10、2.5nM mAβ-ID或600nM mAβ-ID则对神经元数量没有明显影响(图5的E、F、G图)。
实施例6Aβo*3F激活小鼠脑内的胶质细胞产生神经炎症
6.1实验材料和方法
6.1.1实验材料
抗GFAP抗体：Cell Signaling Technology，#3670
抗Iba-1抗体：GeneTex，#GTX101495
BCA试剂盒：Thermo Fisher Scientific
RIPA强裂解液索莱宝
蛋白酶抑制剂：Millipore
磷酸酶抑制剂(100×)：索莱宝
小鼠IL-1β检测试剂盒：Biolegend
小鼠IL-6检测试剂盒：Biolegend
6.1.2实验仪器
MD-M5酶标仪：Molecular Devices，USA
Tissue LyserⅡ组织研磨器：Qiagen
6.1.3免疫组织化学
将脱蜡后的5μm石蜡切片浸泡在柠檬酸抗原修复液(3g柠檬酸三钠、0.4g柠檬酸溶于去离子水中，定容至1L)中，水浴煮沸15min，并室温自然冷却。抗原修复后，用PBS洗涤切片3次，每次5min，然后用80％(vol/vol)含有0.3％H2O2的甲醇固定切片并去除内源性的过氧化氢酶。然后PBS洗涤3次，每次5min，将切片放在0.3％Triton X-100穿透液中，室温穿透20min，PBS洗涤3次，每次5min。切片用10％驴血清室温封闭1h后，加入相应的一抗4℃孵育过夜。第二天，切片用PBS洗涤3次，每次5min后，加入相应二抗，室温孵育1h，并用PBS洗涤3次后显色，观察。
6.2Aβo*3F可激活小胶质细胞和星形胶质细胞
通过对海马区小胶质细胞标志物Iba-1进行染色发现，2.5nM mAβo*3F，600nM mAβ*6E10可显著激活海马DG区和CA1区域的小胶质细胞，增加小胶质细胞中Iba-1的表达水平，但是2.5nM mAβ*6E10或mAβ-ID处理小鼠没有明显作用(图6的A、C、D图)。而且，2.5nM mAβo*3F和600nM mAβ*6E10能明显地诱导DG区的小胶质细胞进入到胞体变大、分支变少的阿米巴样状态，这是代表小胶质细胞处于过度激活的状态(图6的A图)。通过对小鼠海马区星形胶质细胞标志物GFAP进行染色发现，2.5nM mAβo*3F和600nM mAβ*6E10注射到小鼠脑内，激活了海马DG区和CA1区的星形胶质细胞，增加了海马区GFAP的表达水平(图6的B、E、F图)。
6.3Aβo*3F增加了小鼠脑海马区的炎症因子水平
按照制造商的说明书，分别使用IL-6和IL-1βELISA试剂盒检测小鼠脑中的炎症因子(IL-6和IL-1β)水平。简单地说，将脑匀浆稀释一定倍数加入到ELISA板中，板上预先包被了相应的捕获抗体，然后加入相应的检测抗体和二抗。以TMB为底物，采用MD-M5酶标仪在450nm处测定吸光度。结果显示，小鼠注射2.5nM mAβo*3F、600nM mAβ*6E10和600nM mAβ-ID后可显著增加海马区IL-1β和IL-6的水平，而注射2.5nM mAβ*6E10或2.5nM mAβ-ID的小鼠脑内IL-1β和IL-6的水平与对照组无明显差异(图6的G、H图)。
实施例7AD患者CSF和血浆中Aβo*3F水平检测(MSD方法)
7.1实验材料与方法
7.1.1实验材料
Aβ多因子检测试剂盒(4G8) Meso Scale Diagnostics
7.1.2实验仪器
MSD-S600电化学发光检测仪 Meso Scale Diagnostics，USA
7.2AD患者血浆和CSF中Aβo*3F水平检测
为了评估3F特异性识别的Aβos(Aβo*3F)与AD患者发病机制之间的相关性，测试了从AD患者的CSF和血浆中分离的Aβo*3F含有的Aβ42和Aβ40的水平。
本研究所使用的人血浆和CSF样本均得到郑州大学第一附属医院伦理审查委员会批准，所有受试者在参加研究之前都签署了书面知情同意书。本研究中所使用的受试者样本的基本信息如下：收集了20例平均年龄为73.3岁(年龄范围为57-84岁)的轻度认知障碍(MCI)患者，20例平均年龄为69.4岁(年龄范围为52-85岁)的AD患者，以及20例平均年龄为70.9岁(年龄范围为65-78岁)健康人的血浆样本。此外，还收集了7名AD患者的CSF样本，他们的平均年龄为68岁(年龄范围为59-77岁)和7名非痴呆症受试者的CSF样本，他们的平均年龄为66.3岁(年龄范围为48-79岁)。
为了提取AD患者和健康老年人血浆和CSF中的Aβo*3F，首先将人血浆或CSF样本加入到100μL Protein A/G-琼脂糖凝胶中，4℃孵育1h去除内源性IgG，然后将样品与交联了3F抗体的Protein A磁珠4℃常温孵育2h。第二天，磁珠用0.1％PBST洗三遍后，用20mM甘氨酸(pH 2.0)洗脱3min，洗脱两次，洗脱液用1M Tris中和到pH7。免疫沉淀提取得到的Aβo*3F浓度用MSD Aβ多因子检测试剂盒(4G8)进行检测。结果显示，与健康老年人相比，AD患者CSF和血浆中Aβo*3F含有的Aβ42和Aβ40的水平都显著增加(图7)。此外，MCI患者血浆中Aβo*3F含有的Aβ42和Aβ40的水平也明显高于对照组，而且都随着AD病理发展而逐渐升高(图7的C、D图)。这些结果表明，AD患者和AD源性MCI患者CSF和血浆中Aβo*3F的水平明显高于健康老年人，且与AD病理发展趋势密切相关，说明Aβo*3F可作为AD诊断，尤其是AD早期诊断的生物标志物。使用GraphPad Prism 8软件中one-way ANOVA伴随Tukey’s多重比较检验的统计方法进行统计，95％置信区间，*代表P<0.05，表示具有显著的统计学差异；**代表P<0.01，表示具有非常显著的统计学差异；***代表P<0.001，表示具有极显著的统计学差异；****代表P<0.0001，表示具有极显著的统计学差异。
实施例8以Aβo*3F为免疫原制备的疫苗(ABW疫苗)能够显著改善AD小鼠的认知功能，降低小鼠脑内的病理变化。
8.1小鼠免疫及抗体滴度测定
取4-6周龄的雌性BalB/c小鼠，每组6只。将Aβo*3F混合Alum佐剂(ThermoFisher，77161)，Alum佐剂与抗原比例为1:1到1:3(v/v)。每只小鼠皮下接种100μg Aβo*3F，每次免疫间隔两周。免疫前通过静脉取血，收集血清，于-80℃保存。分别在免疫三次的两周后及免疫四次的两周后，静脉取血，收集血清，用ELISA检测血清中抗体滴度。
在96孔板中包被Aβo*3F(0.5μg/100uL)，4℃包被过夜；包被结束后，甩掉包被液，0.05％PBST洗板3次；加入3％BSA,300μL/孔,37℃封闭2h；0.05％PBST洗板2次；加入血清(3％BSA稀释)，100μL/孔，37℃孵育2h；0.05％PBST洗8次；加入HRP标记的抗IgG二抗,100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗6次；加入TMB底物显色液，每孔100μL，室温显色10min；加入0.1MH2SO4终止反应，每孔100μL；酶标仪检测450nm处吸光值。
结果表明，在免疫3次后，抗Aβo*3F的抗体滴度显著升高，说明Aβo*3F能够免疫刺激产生抗Aβo*3F特异性抗体(图8)。
8.2ABW疫苗能够显著改善AD小鼠的认知能力，减轻小鼠脑部的病理变化。
8.2.1水迷宫实验
水迷宫由一个直径为110cm的水池和一个直径为10cm的平台组成，水池中含有不透明的水(22±1℃)，水池四周分别标记上不同的符号以方便小鼠进行定位识别。在连续5天的训练期间，平台置于水下约1cm。将小鼠从随机位置放入水池，让其游泳60s以寻找平台，并在平台上停留10s。当小鼠找到平台时，试验结束，并记录寻找平台的时间。无法找到平台的小鼠被引导到平台上，潜伏期记录为60s。每次训练完成后，用干毛巾将小鼠擦干，并用加热器将小鼠烘干，放回鼠笼。每天训练2次，间隔3～4h，记录各组小鼠潜伏期、游泳距离、平均游泳速度和探索模式。在最后一次学习试验24h后，撤去平台，随机选择一个入水点，将小鼠置于水中，游泳60s，在没有平台的情况下，测试小鼠的记忆保持能力。通过安装在迷宫上方的摄像机进行监控和记录，以软件分析测定目标象限滞留时间、游泳路程、平均游泳速度、探索路径和穿台次数等参数。
我们将上述疫苗注射到6月龄AD转基因小鼠APP/PS1进行主动免疫治疗，免疫4次的两周后进行行为学检测。水迷宫实验表明，疫苗能够提高AD转基因小鼠空间认知能力(图9)，在训练期，与PBS对照组的AD小鼠相比，ABW疫苗治疗的AD小鼠到达平台的时间显著缩短(图9的A图)。在撤除平台的测试中，ABW疫苗治疗组的AD小鼠表现出明显的空间定向游泳行为，与PBS对照组AD小鼠相比，到达平台位置所需的时间显著缩短(图9的B图)，穿台次数更多(图9的C图)以及在目标象限停留更长时间(图9的D图)。
8.2.2脑匀浆中Aβ水平测定
脑匀浆的制备：将小鼠右半脑在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中进行裂解匀浆，然后将组织在14000g下于4℃离心30min，收集含有可溶性Aβ的上清液(RIPA可溶性部分)。将不溶性沉淀重新悬浮于盐酸胍缓冲液(5.0M盐酸胍，pH 8.0)中，并在14000g转速下于4℃离心1h，以获得含有不溶性Aβ(胍可溶部分)的上清液。使用IBL公司的Aβ40ELISA检测试剂盒和Aβ42ELISA检测试剂盒进行检测。
结果表明，ABW疫苗治疗能够显著降低AD小鼠脑内的可溶和不溶性Aβ40和Aβ42的水平(图10的A-C图)。
8.2.3小鼠脑内Aβ的免疫染色
为了探讨ABW疫苗治疗对AD小鼠脑内Aβ斑块的影响，本发明采用免疫组化检测了AD小鼠脑内6E10阳性Aβ斑块的水平。结果表明，与PBS对照组的AD小鼠相比，ABW疫苗治疗组小鼠脑内Aβ斑块染色面积显著减少(图11)。
实施例9基于噬菌体筛选技术获得的特异性结合Aβo*3F的单链抗体7B能够显著改善AD小鼠的认知能力，减轻小鼠脑部的病理变化。
9.1基于噬菌体筛选技术获得的特异结合Aβo*3F的单链抗体7B的筛选及亲和力测定。
本发明依据专利CN101463082A所述的噬菌体筛选技术，以包被缓冲液(PBS，pH＝7.4)稀释Aβo*3F至10～100μg/mL，取4mL加入到免疫管中，4℃包被过夜。经过四轮富集筛选，筛选获得阳性克隆，经测序鉴定，该单链抗体序列如SEQ ID NO：24(轻重链CDR序列分别如SEQ ID NO：25-30所示)所示，命名为7B。ELISA分析表明，该抗体与Aβo*3F具有较高的亲和力(图12)。
9.2抗体7B能够显著改善AD小鼠的认知能力，减轻小鼠脑部的病理变化。
本发明向APP/PS1转基因小鼠经鼻给予7B抗体及PBS溶剂对照，每天一次，21天后通过新事物识别实验检测小鼠的认知能力。应用硫磺素S(THS)染色检测APP/PS1转基因小鼠脑内老年斑水平。
小鼠新事物识别实验方法如5.4.1所述。结果表明，PBS溶剂对照组APP/PS1小鼠对于新事物的认知能力低于WT组小鼠，与PBS组APP/PS1小鼠相比，7B抗体治疗组APP/PS1小鼠的认知能力显著提高(图13)。
对小鼠脑切片应用硫磺素S(THS)染色，结果表明，7B抗体治疗能够显著降低APP/PS1转基因小鼠皮层和海马区域老年斑水平(图14)。
等同方案
虽然本文已经描述和示出了本发明的多个实施方案，但本领域普通技术人员将容易预想到用于实现本文所述的功能和/或获得本文所述的结果和/或一个或多个优点的各种其他手段和/或结构，并且认为每一个这样的变化和/或修改均在本发明的范围内。更广泛地，本领域技术人员将容易理解，本文所述的所有参数、材料和设定意为示例性的，并且实际的参数、材料和/或设定将取决于使用本发明的教导的具体应用。本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。因此，应当理解，前述实施方案和实施例仅通过示例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等同方案的范围内，本发明可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施。如果这样的特征、系统、物品、材料和/或方法不是相互冲突的话，则两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料和/或方法的任意组合包括在本发明的范围内。
本发明说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为意指如此结合的元素的“任一或两者”，即在一些情况下结合存在而在其他情况下不结合存在的元素。除了由“和/或”从句具体标识的元素之外，可以任选地存在其他元素，无论与那些具体标识的元素相关或不相关，除非另外明确指出。因此，作为非限制性示例，当与开放式语言例如“包含”结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施方案中可以指有A没B(任选地包括除B之外的其他元素)；在另一个实施方案中，指有B没A(任选地包括除A之外的元素)；在又一个实施方案中，指有A和B两者(任选地包括其他元素)；等等。
如本文在说明书和权利要求中所用，“或”应理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分隔列表中的项时，“或”或“和/或”应理解为包含性的，即包括多个元素或元素列表的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地，其他未列出的项。只有明确指出相反的术语，例如“仅其一”或“正好其一”，或当用于权力要求中时，“由……组成”将指包含多个元素或元素列表的正好一个元素。通常，当前面有排他性术语，例如“任一”、“其一”、“仅其一”或“正好其一”时，本文所用的术语“或”应该仅理解为表示排他性的替代方案(即，“一个或另一个但不是两者”)。“基本上由……组成”用于权利要求中时，应具有其在专利法领域中的普通含义。
如本文在说明书和权利要求中所用，指代一个或多个元素的列表时，短语“至少一个”应理解为意指选自所述元素列表的任意一个或多个元素中的至少一个元素，但不一定包括所述元素列表中具体列出的每个元素的至少一个，并且不排除所述元素列表中元素的任意组合。这个定义还允许除短语“至少一个”指代的元素列表中具体标识的元素之外的元素可以任选地存在，无论与那些具体标识的元素相关或不相关。因此，作为非限制性示例，在一个实施方案中，“A和B的至少一个”(或等价地，“A或B的至少一个”，或等价地，“A和/或B的至少一个”)可以指至少一个，任选地包括多于一个A，不存在B(并且任选地包括除B之外的元素)；在另一个实施方案中，指至少一个，任选地包括多于一个B，不存在A(并且任选地包括除A之外的元素)；在又一个实施方案中，指至少一个，任选地包括多于一个A，和至少一个，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他元素)；等等。
在权利要求以及上述说明书中，所有连接词，例如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“拥有”等理解为是开放式的，即意味着包括但不限于。仅连接词“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是封闭式或半封闭式的连接词。
在权利要求中使用顺序术语，例如“第一”、“第二”、“第三”等来修改权利要求元素本身并不意味着一个权利要求元素相对于另一个权利要求元素的任何优先级、优先性或顺序，或一个方法中动作进行的时间顺序，而仅仅用作将具有某一名称的一个权利要求元素与具有相同名称的另一个元素区分开(但用于序数术语)的标签，以区分权利要求元素。

Claims (20)

1.一种分离的Aβo*3F，其中所述Aβo*3F是与3F抗体特异性结合的Aβ寡聚体，基于分子排阻色谱(SEC)分析，其总分子量约588kDa，所述3F抗体的轻重链CDR序列分别如SEQ IDNO：17-22所示。
2.根据权利要求1所述的Aβo*3F，其为体外制备的。
3.一种组合物，其包含根据权利要求1或2所述的Aβo*3F。
4.根据权利要求3所述的组合物，其为免疫原组合物、药物组合物或疫苗。
5.根据权利要求3或4所述的组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。
6.根据权利要求3-5任一项所述的组合物，其还包含其他活性成分，优选地，所述其他活性成分为其他形式的Aβ寡聚体、前纤维和成熟的纤维，如Aβ二聚体、三聚体、六聚体、十二聚体、ASPD、ADDL等。
7.一种体外制备权利要求1或2所述的Aβo*3F的方法，其包括如下步骤：将Aβ42、Aβ40或其他形式的Aβ溶解在50mM NaOH中，浓度为1mg/mL，涡旋3-5min，超声1min，然后用预冷的PBS稀释至10μM；4℃，21000g离心30-40min，丢弃沉淀部分(约为起始体积的5％)，得到Aβ单体；将Aβ单体在25℃静止孵育2天，将其与交联了3F抗体的Protein A磁珠4℃孵育过夜；第二天，磁珠用0.1％PBST洗三遍后，用20-100mM甘氨酸(pH 2.0)洗脱3-5min，洗脱两次，洗脱液用1M Tris中和到pH 7，得到Aβo*3F。
8.一种Aβo*3F作为靶点在制备用于预防和/或治疗受试者中MCI和/或AD的药物中的用途，其中所述Aβo*3F是与3F抗体特异性结合的Aβ寡聚体，基于分子排阻色谱(SEC)分析，其总分子量约588kDa，所述3F抗体的轻重链CDR序列分别如SEQ ID NO：17-22所示。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述药物为特异性结合Aβo*3F的抗血清、抗体、小分子药物，优选地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体或其抗原结合片段。
10.一种特异性结合权利要求1或2所述的Aβo*3F的结合剂，其中所述结合剂是3F和7B。
11.根据权利要求10所述的结合剂，其中所述结合剂是特异性结合Aβo*3F的抗血清、抗体、小分子药物，优选地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体或其抗原结合片段。
12.一种制备权利要求10或11所述的结合剂的方法，其包括步骤：用免疫有效量的权利要求1或2所述的Aβo*3F免疫动物，或者用权利要求1或2所述的Aβo*3F作为底物进行噬菌体展示肽库、抗体库和化合物库的筛选。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述动物是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、绵羊、山羊、猴、马、牛、羊驼、非人灵长类动物。
14.一种组合物，其包含权利要求10或11所述的结合剂或权利要求12或13所述方法获得的结合剂。
15.根据权利要求1或2所述的Aβo*3F、根据权利要求3-6和14-15任一项所述的组合物或根据权利要求10或11所述的结合剂在制备用于预防和/或治疗受试者中MCI和/或AD的药物中的用途。
16.根据权利要求1或2所述的Aβo*3F、根据权利要求3-6和14-15任一项所述的组合物或根据权利要求10或11所述的结合剂，其用作预防和/或治疗受试者中MCI和/或AD的药物。
17.一种预防和/或治疗受试者中MCI和/或AD的方法，其包括向所述受试者施用预防和/或治疗有效量的根据权利要求1或2所述的Aβo*3F、根据权利要求3-6和14-15任一项所述的组合物或根据权利要求10或11所述的结合剂。
18.Aβo*3F作为受试者中MCI和/或AD的诊断靶点的用途，所述Aβo*3F是受试者中与3F抗体特异性结合的Aβ寡聚体，基于分子排阻色谱(SEC)分析，其总分子量约588kDa，所述3F抗体的轻重链CDR序列分别如SEQ ID NO：17-22所示。
19.Aβo*3F作为受试者中MCI和/或AD的预防和/或治疗靶点的用途，所述Aβo*3F是受试者中与3F抗体特异性结合的Aβ寡聚体，基于分子排阻色谱(SEC)分析，其总分子量约588kDa，所述3F抗体的轻重链CDR序列分别如SEQ ID NO：17-22所示。
20.根据权利要求15所述的用途、根据权利要求16所述的Aβo*3F、组合物或结合剂、根据权利要求17所述的方法或根据权利要求18或19所述的用途，其中所述受试者为人、非人灵长类动物、猫或犬。
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