KR20080097188A - 항아밀로이드 면역성성분, 그 제조방법 및 용도 - Google Patents

항아밀로이드 면역성성분, 그 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 가급적 박테리아 치오레독신(Trx)로 되는 캐리어(디스플레이 사이트)의 활성적인 루프사이트(loop site) 내에서 Aβ42의 소편을 갖는 B-세포 에피토프(B-cell epitope)의 연속적인 다중화(tandem multimerization)에 의해 얻어지는 재조합 면역원(recombinant immunogenic)을 제공한다. 가급적 끼워넣은 아미노산 링커를 갖는 Aβ42 소편의 다중복제를 갖는 폴리펩티드를 보조약과 조합하여 구축하고 쥐에 주사한다. 유도된 항체가 신경염적인 AD 반 내에서 피브릴 섬유 및/또는 올리고머를 선택적으로 결합하기 위해 발견되었다.

Description

항아밀로이드 면역성성분, 그 제조방법 및 용도{Anti-amyloid immunogenic compositions, methods and use}
본 발명은 Aβ42의 소편(fragment)과 담체 또는 캐리어(carrier), 즉 전달물질로 이루어지는 면역성 구조물(immunogenic constructs) 및 그 제조방법과 용도에 관한 것이다. 여기에서 프래그먼트는 담체의 활성루프사이트(loop site:디스플래이 사이트(display site)) 내에 위치된다.
알츠하이머 질병(AD)과 같은 아밀로이드 생성질병(amyloidogenic diseases)은 연로한 사람들에게 치매(dementia)의 주원인으로 인식되어 왔다. AD에서의 인식능력의 저하는 두뇌에서 조직병리학적 변화(histopathological changes)와 관련되고, 가장 관련이 깊은 것은 아밀로이드반, 즉 반점(amyloid plaques)의 형성과 신경원섬유엉킴(neurofibrilary tangles)의 발생이다.
아밀로이드반이 많은 단백질을 함유하는 한, 이들은 주성분인 아밀로이드-베타(Aβ)펩티드(amyloid-β(Aβ) peptide)를 가진다. Aβ펩티드의 형성과 그에 따른 Aβ 아밀로이드반은 아밀로이드 선행단백질(amyloid precursor protein:APP)의 이 상작용(aberrant processing)으로부터 생기게 된다.
현재, 여러가지 AD진행을 지연시키거나 없애기 위해 여러가지 약리학적 접근방법이 시도되어 왔다. 여러가지 접근방법들이 Aβ펩티드의 변형발생을 억제하는데에 집중되어 왔고, 다른 방법들은 AD를 겪고 있는 환자의 두뇌에 Aβ아밀로이드가 집합되는 것을 방지하는데 집중되어 있다.
그러나, 가장 확실한 약리학적 접근방법은 Aβ(활성적인 면역성 부여)에 대한 면역반응을 발생시키거나 또는 Aβ(수동적인 면역성 부여)에 대한 항체(antibodies)를 만들어줄 수 있는 항원(antigens)의 투여를 통해 Aβ반의 두뇌클리어런스(brain clearance)를 증가시키는 것이다.
항원 또는 면역원(immunogens)은 통상 거대고분자(macromolecules)로 이루어지는데, 면역시스템의 여러가지 구성인자와 인식되거나 내부작용하는 명확한 항원사이트(antigenic sites) 또는 "에피토프(epitopes)", 즉 분자상의 특이항원결정부위(抗原決定部位)를 갖는다. 이들은 통상 짧은 펩티드(short peptide)와 같이 작은 분자 또는 "부착체 또는 합텐(hapten)"을 구성하고 적절한 캐리어와 짝을 이룬다. 캐리어는 대표적으로 단백질과 같이 고분자 중량을 갖는 것인데, 이를 생채 내에 투여할 때 면역반응을 일으킬 수 있다.
면역응답(immune response), 즉 면역반응으로 항체(antibodies)들이 만들어지고 T-헬퍼(helper:TH) 세포에 관련된 B-림포사이트(lymphocytes), 즉 B-임파구에 의해 또한 분비된다. 합텐-캐리어시스템(hapten-carrier system)의 대부분에서 B세포는 항체를 생산하는데, 이 항체는 합텐과 캐리어 양쪽 모두에 특정적으로 작용한 다. 이들 경우에 T임파구(T lymphocytes)는 캐리어상에 특정결합영역(specific binding domains)을 갖는다. 그러나 합텐만을 인식하지는 않는다. 상승작용(synergism)의 하나로, B세포와 T세포는 합텐특수항체반응(hapten specific antibody response)를 서로 협력하여 유도한다.
따라서, 효과적인 항원(antigen)을 구축하려면, 적절한 캐리어의 선택과 적절한 합텐의 선택이 중요하고 확고하게 선정된 면역성 반응을 보장하는데 필수적이다. 항원의 안정성도 매우 중요하다. 예컨대 AD환자에 미리 집합 또는 응집시킨 Aβ42에 의해 구성되는 AN-1792 백신투여를 들 수 있고, 약 6% 처리된 대상물에 심한 수막뇌염(meningoencephalitis)을 가져오는 면역성 보조제(immune adjuvant)의 투여를 들 수 있다. 이 두가지 세포독성 T세포의 중심적 작용과 자기면역성반응(autoimmune reaction)은 잠재적인 독성메카니즘으로 제안되어 있다. 내인성 모노머 단량체인 Aβ(endogenous monomeric Aβ)에 대한 면역감시성 반응은 비응집 Aβ종(species)이 신경작용(neuronal activity)상 생리학적 역할을 가지므로 유해하다.
이와 같이, 유해한 Aβ종을 향하여 항체 선택도를 보장하고 자기면역독성(autoimmune toxicity) 발생을 방지한다는 점에서 합텐(hapten)과 캐리어의 적절한 선정이야말로 매우 중요하다.
WO 2005058940호에서는 단백질/폴리펩티드 캐리어에 대하여 Aβ펩티드 또는 그 소편(fragment)를 구성하는 펩티드면역원(peptide immunogen)을 접합(conjugating)시킬 것이 제안되고 있다.
면역원으로 조합(immunogenic constructs)된 것은 캐리어의 아미노산 잔류물(residues)의 파생화된 기능성 그룹(derivatizing functional groups)으로 구성되는 화학적 방법으로 제조되는데, 여기에서는 비접합되고 파생화된 아미노산 잔류물의 기능성 그룹이 다른 분자들과 반응하는 것으로부터 이들을 봉쇄하기 위한 덮어씌움(capping)에 의해 비활성화된다. 이와 같은 방법은 Aβ소편이 캐리어의 아미노산 측쇄(amino acid side chains)에 묶이게 되는 면역원을 만들게 된다. WO 2005058940호에서는 여러가지 다른 캐리어와 합텐이 제안되어 있으나, 이 들의 생체내 조직병리학적 효능(histopathological efficacy)은 아직도 증명된바 없다.
Kim, H. D. 등이 바이오캠, 바이오피직스 리서치, 콤뮨 제 336권 84-92페이지에서 발표하여 제안한 것 중에 골격을 이루지 못한 Aβ1-6의 11-폴드리피트(unseaffolded 11-fold repeats)로 구성된 반(anti)-Aβ DNA 백신이 있다. 그러나 이러한 구성물은 모노머성, 올리고머성 그리고 근섬유성(fibrillar) Aβ42종(species)으로 분별 없이 인식된 항체를 만든다.
일반적으로, Aβ42의 서로 다른 앗셈블리상(assembly state)(모노머성, 올리고머성 또는 근섬유성)에 대한 면역원의 선택적 목표가 지금까지 달성된 적은 없다.
상술한 바를 고려하여 보면, 아직도 AD에 영향받는 환자의 두뇌에 있는 Aβ아밀로이드의 응집 또는 집합을 방지하거나 다운신드롬(Down Syndrome)과 같은 아밀로이드 생성질병(amyloidgenic deseases)을 예방하기 위해 치료용 백신성분들로서 안전하고 효과적인 면역원 구조물 또는 구조체(immunogenic construct) 개발의 필요성이 제기되고 있다.
본 발명은 Aβ소편이 캐리어 단부, 즉 캐리어 끝부분에 한정되기보다는 캐리어의 활성루프사이트(active loop site:display site) 내에 위치되는 것을 특징으로 하는 재조합된 면역원 구조체(recombinant immunogenic construct)를 제공하기 위한 것이다. 상기 펩티드는 캐리어의 활성루프사이트(display site) 내에서 우선적으로 치오레독신(thioredoxin: Trx)으로 되는 Aβ42의 소편을 갖는 B-세포 에피토프(B-cell epitope)의 연속적인 다중결합(tandem multimerization)으로 얻어진다.
본 발명상의 면역원은 Aβ아밀로이드의 신경독성올리고머성 종(neurotoxic oligomeric species)으로 인식되어 있는 항체를 이끌어내는 과정에서 발견되었는데, 이 신경독성올리고머성 종은 아밀로이드 생성질병의 가장 가까운 근인제(近因劑:proximate causative agent)로 최근 지목되어 왔다.
이러한 사실은 캐리어 내에서 Aβ아밀로이드로 특징지워지는 면역원의 구조와 연관되어 있다. 그러한 배열은 면역원 단백질을 어느정도 변형되는 것을 허용하고 면역시스템에 보다 효과적으로 나타난다. 면역원이 하나 이상의 Aβ아밀로이드 소편을 갖게 되면, 그리고 특히 상기 소편의 특정갯수를 갖게 되면 Aβ아밀로이드 올리고머(oligomers)와, Aβ아밀로이드 올리고머에 대한 면역원의 유사종은 선택범위를 증가시켜줌은 물론 그 효능도 더욱 향상시켜주는 것으로 믿어지고 있다.
캐리어와 소편(fragment) 사이의 링커(linker)는 펩티드 에피토프 앗셈블리상(peptide epitope assembly) 상태보존을 또한 도와준다.
(발명이 해결해야 할 과제)
본 발명은 면역원구조체(이하 "면역원"이라 약칭함)를 제공한다. 이 면역원구조체는 Aβ42의 면역우세성 B-세포 에피토프(immunodominant B-cell epitope)와 캐리어의 활성루프(active loop site:display site) 내에 상기 소편이 위치되는 것을 특징으로 하는 캐리어로 구성된다. 이 캐리어는 Aβ소편이 가급적 30 미만의 아미노산 잔류물보다 적은 N-터미널소편(N-terminal fragment)으로 되고, 특히 그중에서도 20 아미노산보다 적고, 더욱 바람직하게는 Aβ1-15인 치오레독신(thioredoxin)이 좋다.
면역원구조체는 더 나아가 하나 이상의 소편, 가급적 2~16, 특히 그중에서도 4개의 소편을 갖는게 가장 바람직하다.
본 발명은 이상과 같이 상기 면역원을 구축하는 방법을 제공하고 이 방법은 캐리어 디스플래이 내에서 Aβ42의 소편을 갖는 B-세포 에피토프의 연속다중화(multimerization)에 지지되는 링커(linker)와 또한 가급적 30 미만의 아미노산 잔류물의 N-터미널 소편으로 구성되는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 아밀로이드 발생질병에 대해 활성적인 백신(active vaccination)용 상기 면역원 제공에 있다.
또한, 상기 항체를 개발하여 상기 면역원의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 여기에서 항체는 가급적 모노클론항체, 즉 단클론항체(monoclonal antibody)를 아밀로이드 발생질병에 수동적 백신(passive vaccine)으로 사용되도록 한다.
(발명의 구성)
본 발명은 적어도 하나 이상인 Aβ42 소편(fragment)을 갖는 캐리어(carrier)로 구성되는 면역원구조체(또는 면역원)를 제공한다. 상기 소편은 이를 안정시키는 캐리어의 표면노출역(활성루프사이트:active loop site 또는 디스플래이 사이트) 내에 위치된다. 상기 구조체의 정확한 사이즈와 화학적 균일성은 매스 스펙트로메터(mass spectrometry) 등에 의해 상시적으로 결정된다.
상기 구조체의 조직은 분석기술로 조사되나, 핵자기공명(nuclear magnetic resonance(NMR)) 기술도 통상 채용된다.
캐리어로는 치오레독신(Trx)이 바람직하다. Trx는 특히 그 작은 크기(109 아미노산)를 가진 펩티드 디스플래이용량에 적합하고, 쥐과의 동물의 T-세포증식(T-cell proliferation)을 자극하는 능력을 가진 비독성 면역촉진능이 있다.
Aβ아밀로이드 소편(amyloid fragment)은 N-터미널단부(N-terminal end)로서, 30아미노산 잔류물보다 작은 N-터미널소편(N-terminal fragment)를 가진다. 특히 그중에서도 20아미노산보다 작고, 더욱 바람직하게는 아래의 표 1에 기재되어 있는 Aβ1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15를 구성하는 그룹으로부터 선택하는 것이다. 이는 아미노산에 대해 1자 코드에 따라 선택한다. 가급적 Aβ아밀로이드소편으로는 Aβ1-15이 좋다.
본 발명의 면역원구조체(immunogenic construct)는 하나 이상의 편(fragment), 가급적 2~16편, 보다 바람직하게는 4편을 갖는 것이다.
상기 바람직한 예에서, 편은 접합 에피토프(junctional epitopes)의 형성방지를 위해 링커(linker)를 통해 캐리어에 결합된다. 상기 링커는 단(短) 아미노산계열로서, 바람직하게는 1~5 아미노산 잔류물(amino acid residues)로 이루어지는 링커로 되고, 더욱 바람직하게는 글리신-글리신-프롤린(Gly-Gly-Pro)로 이루어지도록 하는 것이다. 그리고 다른 링커들도 사용되는데, 예컨대 글리신-프롤린-글리신-프롤린-글리신(Glycine-Proline-Glycine-Proline-Glycine:Gly-Pro-Gly-Pro-Gly) 또는 세린(Serine)-글리신(Glycine)-세린-글리신(Ser-Gly-Ser-Gly)로 이루어지는 것이다.
바람직한 면역원구조체(immunogen construct)로는 링크연결된 치오레독신(thioredoxin)으로 이루어지는 것을 들 수 있고, 선택적으로는 적절한 링커를 통해 이하에 Trx(Aβ1-15)4로 표시할 4개의 Aβ1-15 소편들(fragments)에 선택적으로 연결되는 것을 들 수 있다.
상기 면역원을 구축하는 방법에는 클로닝 법(cloning method)이 있는데, 이 방법은 캐리어를 적절한 박테리아로 증식하고 또한 적절한 벡터(vector)에 캐리어를 집어넣는 것으로 구성되며; 이 벡터는 PET을 통해 단백질반응용 T7 추진제(promoter)와 Aβ소편 DNA 인서트(insert)를 제조하고; 캐리어-벡터(carrier-vector)와 Aβ소편 DNA 인서트를 제한하고 결찰(ligating)한다.
바람직하게는 Aβ소편 DNA 인서트(Aβ fragment DNA insert)를 아미노산링커(linker)로 구성되게 하는 것이다.
다중결합이 제조될 때마다 과잉의 Aβ소편 DNA 인서트가 채용된다.
Figure 112008053193418-PCT00001
본 발명의 바람직한 면역성 구조체는 이식유전자를 가진 쥐(transgenic mice)에 매월 한번씩 4개월동안 주사를 놓음에 따라 그 쥐의 두뇌 β-아밀로이드 병리학(β-amyloid pathology)이 유도되어, 해마의 Aβ반과 뇌피질(cerebral cortex)의 수와 크기를 감소시키는 것으로 나타난다. 더욱이 본 발명의 바람직한 면역성구조는 Aβ42의 결정된 종을 식별하는 항체를 이끌어내는 것으로 확인되었다.
상기 항체는 상기 내부해마주입(intra-hippocampal injection)에 따라 해마에서의 Aβ42- 양의 반(plaques)과 이식유전자 쥐의 뇌피질을 제거할 능력을 갖는데, 상기 제거효과는 특히 올리고머성 Aβ종에 대해 특별히 증명된다. 상기 항체는 또한 Aβ-관련 대신경교세포(Aβ-associated astrogliosis)(실시예 2)를 강하게 향상시키는 사실이 또한 발견되었다.
따라서, 본 발명의 면역성구조체는 아밀로이드 유전자질병(amyloidogenic diseases)에 대해 능동적 및 수동적인 백신 모두에 사용되는 조성물을 형성한다.
능동적 백신을 위해 본 발명상의 면역구조체로 이루어지는 약제성분은 보조제(adjuvant)와 조합시켜 투여되는 것이 바람직하다.
보조제(adjuvant) 및/또는 캐리어의 선정은 보조제를 함유하는 백신의 안정성, 투여경로, 도스 스케쥴(dosing schedule), 백신화되는 종(species)에 대한 보조제 효능 등에 좌우된다. 그리고 사람에게 투여할 때에는 약학적으로 수용가능한 보조제로 투여허용되어 왔거나 정상적인 인체투여가 혀용 가능한 것이라야 한다. 예컨대 프론드 보조제(Freund's adjuvant)는 인체투여용으로는 적합치않다. 적절한 보조제로는 3De-O-아크릴화된 모노포스포릴 리피드 A(3De-O-acrylated monophosphoryl lipid A:MPL), 무라밀-디-펩티드(muramyl-di-peptide) 및 QS21 및 퀼(Quil) A와 같은 사포닌(saponins)를 포함하는 보조제를 들 수 있다.
보조제의 바람직한 등급으로는 명반과 같은 알루미늄 염(alum), 예컨대 알루미늄 수산화물, 알루미늄 인산염(aluminum phosphate), 알루미늄 황산염(aluminum sulphate)과 같은 알루미늄염을 들 수 있다. 더 나아가 보조제로 인터루킨(interleukins:IL-1, IL-2, IL-12)과 같은 시토킨(cytokines), 대식세포군체 자극인자(macrophage colony stimulating factor:M-CSF), 종양괴사성 인자(tumor necrosis factor:TNF) 등과 같은 것을 들 수 있다.
보조제는 단일성분으로서의 면역원과 같이 투여 가능하다. 또는 그 전에, 또는 면역원 투여후 또는 동시에 투여 가능하다. 또한 둘 또는 그 이상의 서로 다른 보조제를 동시에 투여하여 사용할 수도 있다.
면역원(immunogen)과 보조제는 같이 포장되어 같은 용기에 또는 별도의 용기(vials)에 담아 투여할 수 있고, 사용하기 전에 혼합투여할 수도 있다.
본 발명상의 면역원 구조를 이루는 약제성분은 또한 다른 약학적으로 수용가능한 여러가지 성분들을 포함한 것으로 구성할 수도 있다.(레밍톤의 제약사이언스 15차 간행, 맥크 파블리슁 캄페니, 이스턴, 펜실바니아 1980년판 참조)
바람직한 약학적 형태는 투여모드에 좌우되고 치료용도에 좌우된다. 이 성분은 또한 소정의 처방에 좌우되고, 약학적으로 수용가능한가, 비독성 캐리어이거나 희석제인가에 좌우된다. 이들은 동물이건 사람이건 투여시 약학적 성분을 처방하는데 통상 사용되는 부형약(vehicle)으로 한정된다.
희석제는 조합시 생물학적 활성에 영향을 주지 않도록 선정한다. 희석제의 예를 들면 증류수, 생리학적 인산염-완충된 염류(physiological phosphate-buffered saline), 링거 액(Ringer's solutions), 덱스트로즈 용액(dextrose solution), 행크 용액(Hank's solution) 등을 들 수 있다.
비경구투여를 위해서 본 발명 면역원 구조체는 물 오일, 염류, 글리세롤 또는 에탄올과 같은 살균된 액체로 되는 약학적 캐리어(pharmaceutical carrier)와 더불어 생리학적으로 받아들일 수 있는 희석제에서 주입 가능한 용액도스 또는 현탁물(suspension)로 투여가능하게 되어 있다. 추가적으로 보조물질로서 습윤제 또는 에멀죤화제(emulsifying agent), 표면활성제(surfactants), PH 완충제(PH buffering substances) 등도 구성 가능하다.
본 발명의 성분들은 주입제로 제조되고, 또는 액체용액이나 현탁물 형태로 제조되며, 고체의 경우에는 용액에 용해되기에 적합하거나 현탁물에 적합하거나 해야하고 주입(주사)전에 액상 부형약(liquid vehicles)으로도 또한 제조 가능하다.
본 발명상의 면역성 구조체는 활성요소 또는 활성성분(active ingredient)의 지속적 방출(sustained release)시 가능하면 축차적 주입(depot injection), 또는 이식제조(implant preparation)의 형태로 투여한다. 또한 경구, 코, 폐, 좌약(suppositories), 경피적 방법으로 투여한다.
수동적 백신용(passive vaccination)으로, 성분을 기니 돼지(Guinea pig), 기타 다른 동물과 같은 포유류 동물에 주사하고 그 몸속에서 나오는 항체를 정제하고 인체에 연속주입한다.
항체는 통상 모노클론(monoclonal)으로 되고 Trx(Aβ1-15)4 면역원 구조를 가진 포유류 동물을 면역되게 제조한다. 상기 항체는 아밀로이드 유전자질병(amyloidogenic deseases), 특히 알츠하이머 질병치료에 사용된다.
도 1a는 본 발명에 따른 Trx(Aβ1-15-Gly-Gly-Pro)n 구조를 나타낸다.
도 1b는 1, 4 또는 8카피(copy)의 Trx-디스플래이된 Aβ1-15를 갖는 금속친 화 크로마토그라피(metal-affinity chromatograpy)에 의한 균일성으로의 순도(purification)를 나타낸다.
도 1c는 본 발명의 일실시예에 따른 면역원에 의해 유도해낸 항-Aβ항체(antibody) 레벨을 나타낸다.
도 1d는 본 발명의 일실시예에 따른 Th2-극성화된 응답면역원(Th2-polarized response immunogens)을 나타낸다.
도 2a-b-c는 본 발명의 일실시예에 따른 면역원으로 면역시킨 쥐로부터 혈청처리된 인간두뇌 단면을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일실시예로서의 면역원의 우선적인 결합을 나타내는 AFM 이미지도면이다.
(실시예 1)
서로 다른 TrxA β 면역원구조체의 제조 및 서로 다른 비 TrxA β항체의 효과에 대한 생체밖 평가
(박테리아)분해 바이러스(phage) T7 추진제의 제어하에 Trx 코드작용 시
Figure 112008053193418-PCT00002
스(coding sequence)를 갖는 개질된 수용체 벡터(modified recipient vector)에 관해 Aβ1-15 DNA 인서트(insert)를 과잉으로 사용하는데 따른 클로닝 대책(cloning strategy)을 Trx(Aβ1-15)n 구조(도 1a)에 사용하였다. 이때 1, 4 또는 8 Trx-디스플래이된 Aβ1-15의 모사본을 구비한 구조체(constructs)를 분리하여 대응되는 폴 리펩티드(polypeptides)를 나타내는데 사용하고 다음 이를 금속-친화성 크로마토그라피(metal-affinity chromatography)(도 1b)에 의해 균질성을 갖도록 정화하였다.
적절히 조합된 Aβ1-15 다중결합(multimers)의 제조에 필수적인 것은, 개재되는 Gly-Gly-Pro 링커용 말단시
Figure 112008053193418-PCT00003
스 코팅(terminal sequence coding)의 Aβ1-15 DNA으로의 합체(incorporation)는 물론이고, Trx 시
Figure 112008053193418-PCT00004
스(5'‥‥CG/GT(A) CCG‥‥3'로 식별되는 아미노산 잔류물 34-35에 대응되는 뉴클레오티드 nucleotide 위치 99-105) 내에 존재하는 유일한 CpoI 사이트(site)의 틀 내의 용융능력과 방향성이었고, 이에 따라 접합 에피토프(junctional epitopes)의 형성방지가 또한 중요하였다.
전길이의 Aβ42 펩티드의 단일모사본(copy)을 갖는 네번째 면역구조체(TrxAβ42)는 간단한 방법으로 제조하였다. 모든 Trx(Aβ1-15)n 폴리펩티드가 Aβ1-15 다중성(multiplicity)에 관계 없이 용해되는 동안 대부분의 TrxAβ42 단백질(protein)은 개재물 몸체(inclusion bodies)에 용해안된 상태(도시안됨)로 들어갔다. 이와 같이 Aβ42는 박테리아세포의 이질구조(heterologous context)로 Trx로 융해되더라도 빈약한 용해성을 나타낸다.
10마리의 숫 발브쥐 다섯그룹을 상기 Trx(Aβ15)n 폴리펩티드 10nmol로 처리하거나 이에 준하는 량의 예비-집합된 합성 Aβ42(또는 TrxAβ42)로 처리하고, 모두 명반(alum)과 인체용으로 허용되는 보조약을 보충하였다.(도 1c)
2개의 추가그룹은 완충제(buffer:PBS)만 주입되거나 알루미늄 없는 Aβ42로 주입되게 하여 부(negative)의 제어기능을 하였다. 세라(sera)쥐를 2주간 4차 주사한 뒤에 집합시키고 쌍으로 임의 채취하여 목표항원(target antigen)으로서 응집된 Aβ42를 이용하여 효소-연결된 면역성흡착제 분석(Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay:ELISA) 기법으로 분석하였다. 표 1c에서 나타나 있는 바와 같이, 평균 항Aβ항체레벨은 Trx(Aβ1-15)4와 Trx(Aβ1-15)8에 의해 이끌어지는; 단 TrxAβ1-15에 의한 것이 아닌 상기 항체레벨은 그대로 처리된 제어의 그것보다 현저히 높고(P<0.05) 또한 Aβ42는 물론이고 Trx Aβ42가 수행되는 Aβ42-처리그룹의 그것에 유사하였다.
P는 바예지언(Bayesian) 또는 정규 표준편차를 이용하는 로그변환제어(log transformed control) t-테스트와 실험데이터에 연관된 P-값(value)이다. P는 통계적 시험으로 얻어지는 결과가 측정물들 사이의 진정한 관계보다는 기회에 따라 달라지는 확률을 가리킨다.
강하게 항염증성으로 Th2-극성화된 응답(Th2-polarized response), 대표적인 알룸 보조약(alum adjuvant)을 표준도표(isotype profiling)(도 1d)로 나타내었다. G급 면역글로블린(immunogloblin)과 서브클래스 1(IgG1)의 우세가 모든 항원(antigens)으로 관측되긴 했지만 IgG1/IgG2(G급 및 서브클래스 2의 면역글로블린) 비율은 결합안된 Aβ42의 경우보다 다중 Trx(Aβ1-15)n과 TrxAβ42 면역결합된 것이 현저히 높았다(P<0.05).
아밀로이드 반(amyloid plaques)을 결합시키기 위해 Trx(Aβ1-15)n에 따라 발생된 반혈청능(antisera)을 다음에 조사하였다. 이 성질은 현재 생체 내에서 항-Aβ항체효능을 예측하는 최고의 예측지수(prognostic indication)로 간주되고 있다. 이 성질은 그러나, 전술한 모든 항-Aβ 반혈청(antisera:예컨대 m266 및 Aβ42의 C-터미널부를 표적으로 하는 다른 항체)에 의해 나누어지는 것은 아니다.
도 2a-b에서 도시되어 있는 바와 같이, Trx(Aβ1-15)n의 4중 또는 8중결합의 형태로 면역된 쥐로부터의 혈청(seta)은 1/1000의 희석도에 이르기까지 아밀로이드 반에 좌우된다. 큰 신경성 반(neuritic plaques)은 그것이 완전한 것이든 불완전한(immature) 것이든, 항 다중성 Trx(Aβ1-15)n 항체로 표시하고, 보다 넓은 면역얼룩, 특히 노쇠한 반점의 핵(senile plaque cores) 안에 있는 것은, Aβ40을 항원(도시안됨)으로 사용하여 토끼에서 발생되는 항-팬(anti-Pan) β-아밀로이드 항혈청(antiserum)의 능동제어(positive control)로 조사하였다. 조사 비교결과, 완충제만으로 처리된(mock-treated) 동물(도시안됨)로부터의 혈청으로부터든, 아니면 모노머 TrxAβ1-15(도 2c)로 면역처리한 쥐의 혈청으로부터든 어떠한 반도 검출되지 않았다.
마지막으로, 면역얼룩(immunoblots)은 서로 다른 Aβ42(모노머, 올리고머샌드 피브릴스(oligomersand fibrils))의 서로 다른 앗셈블리 상태를 향하여 여러가지 항-Trx(Aβ1-15)n 항체의 용량을 평가하는데 사용되었다. 이는 앞서 결정된 조건과 원자의 힘 마이크로스코피(atomic force microscopy:AFM)에 의한 증명하에 시험관 내에서 발생된 것이다. 이 분석결과는 도 3에 나타나 있는데, 여기에서 항- Trx(Aβ1-15)8 항체는 모든 3개의 Aβ42종을 결합시키고, 그에 비해 항-Trx(Aβ1-15)4 항체는 용해 가능한 올리고머와 가는 원(原)섬유(fibrils) 양쪽을, 단 Aβ42 모노머는 제외하고, 우선적으로 결합한다.
보다 깊이 비교결과 Aβ42원섬유의 인식부족은 물론이고, 모노머의 Trx Aβ1-15 항원에 대항하여 생긴 항체는 어떠한 결합상태(binding)도 보여주지 않았다. 후자의 경우에는 AD 반에서의 Aβ원섬유는 물론이고 ELISA에서 고차 Aβ42 응집(higher order Aβ42 aggregates in ELISAs)을 식별하기 위한 이들 항체의 불능으로 인한 것임이 관찰되었다(도 1c 및 도 2c 참조).
그러나, 흥미롭게도 항-모노머성 TrxAβ1-15 항체는 Aβ42모노머와 올리고머를 결합한다(도 3). Trx(Aβ1-15)4는 따라서 용해 가능한, 양호한 면역원 활동을 가진 T세포 에피토프-결여된 아밀로이드-β 추출물(Tcell epitope-lacking amyloid-β derivative)로 하며, 알룸(alum), Al(OH)3와 같은 적절한 강도를 갖는 보조약으로 조형되는 경우에도 이와 같다. 또한 중요한 것은 연접독성(synaptotoxic) Aβ42 올리고머와 원섬유(fibrils)에 결합하는 항체를 만든다는 것이지, 생리적인 것이라 추정되는 모노머 Aβ42종은 아니다.
다른 펩티드 면역화 방책과 비교되는 Trx-dPI의 가장 중요한 주되는 장점은 그 시간과 비용효과이고, 세포독성 제거와 화학적으로 균일한 면역접합체(immunoconjugates)의 생산성(yield)이며, 즉시 증명 가능한 뱃치-에서-뱃치로의 일관성(batch-to-batch)이다. 더욱이 한번 "선도 항원(lead antigen)"이 확인되기 만 하면 DNA 백신목적으로 추가적인 펩티드 에피토프와 벡터대체(vector replacement)의 합체를 포함하여 추가로 변경, 개질을 행하는 것은 쉽다.
TrxA β 구조체. E.Coli 치오레독신에 대한 시
Figure 112008053193418-PCT00005
스코딩(sequence coding)은 프라이머(primer)1 및 프라이머2(표 2)를 취하여 폴리머체인반응(PCR)으로 확장되고, 제한사이트(restriction site) Ndel e BamHI를 주도록 설계된다. 이 확장된 소편은 Ndel e BamHI 제한효소로 이중소화처리되고(digested) 동일한 2개의 효소(enzymes)로 소화되는 PET28b®(Novagen)에 결착된다. 그 결과로 나오는 벡터(vector)는 PT7Kan-Trx로 설계되고, 카나마이싱 저항마커(kanamicin resistance marker)를 따라 박테리아의 치오레독신의 N- 및 C-말단에 His6-태그를 단 표시에 대해 시
Figure 112008053193418-PCT00006
스를 머무르게 한다.
유일한 CpoI 사이트는 Trx 코딩시
Figure 112008053193418-PCT00007
스(뉴클레오티드 위치 99-105, 아미노산 잔류물 34-35에 해당하고, 5'‥‥CG/GT(A) CCG‥‥3'로 식별되는) 내에 나타나는 것으로, 클로닝사이트(cloning site)로 사용되었다.
다중결합의 제조의 요점은 방향성과 유일한 CpoI 사이트의 틀내융해능(in-frame fusion capabilities)이다.
pT7Kan - TrxA β1-15. Aβ1-15 펩티드에 대한 시
Figure 112008053193418-PCT00008
스코딩, 아밀로이드 베타펩티드 Aβ42의 N-터미널소편은, 부(付)인산반응된 올리고핵산염(phosphorylated oligonucleotides)의 아닐링으로 얻어진다.
Figure 112008053193418-PCT00009
터미널 CpoI 식별시
Figure 112008053193418-PCT00010
스를 가짐. 57bp(5'-CpoI 침투)이 DNA 인서트(insert)가 1/10벡터/인서트 몰비(molar ratio)에서 CpoI 소화된 pT7Kan-Trx로 결찰되었다.
N- n4 -6 xHis - n10 - TRX (1-33) GP MDAEFRHDSGYEVHHQGG PTRX (36-109)- n15 -6 xHis -C
전체 시
Figure 112008053193418-PCT00011
스는 :
Figure 112008053193418-PCT00012
TrxAβ1-15 구조체의 주요특징은 Aβ1-15펩티드의 N-터미널들에서의 멧트잔류물(Met residue:M)의 존재에 관련되고, Aβ1-15펩티드의 C-터미널들에서의 Gly-Gly-Pro 링커(linker)에 관한 것이고, 박테리아 치오레독신(bacteria thioredoxin)의 N- 및 C-터미널적으로 His6-태그된 변형(His6-tagged version)에 관한 것이다.
pT7Kan - Trx (Aβ1-15) 4 e pT7Kan - Trx (Aβ1-15) 8 . 보다 많은 Aβ1-15펩티드의 모사본을 갖는 구조체가 같은 방법으로 얻어졌으나 1/100벡터/인서트 몰 비(vector/insert molar ratio)로 얻어진 것이다. 재조합형(recombinant clones)은 제한분해(restriction digestion)겔 전기이동법(gel electrophoresis)에 의해 재조합형 클론이 스크린처리되었다. 그리고 Aβ1-15시
Figure 112008053193418-PCT00013
스의 4 또는 8 모사본을 갖는 이들 중 두가지가 대응되는 재조합 단백질 Trx(Aβ1-15)4 및 Trx(Aβ1-15)8를 나타내고 또한 순수세정하는데 사용되었다.
2개의 His6-태그(tag) 표시는 세정단계에 도움을 주고, 리신 잔류물(lysine residues)의 연속반복의 경우처럼 면역원 생성능을 증가시켜준다.
Figure 112008053193418-PCT00014
TrxA β 폴리펩티드의 노정 및 세정. 노정(expression)은 상기 구조체의 각각으로 변환되고 37℃에서 2hr동안 추진되도록 허용된 E.Coli BL 21 star(DE3) 세포(시험관 내)에 1mM의 이소프로필 - β - D - 치오갈락토피라노시드 (thiogalactophranoside:IPTG)에 첨가함으로써 유도된다. 서로 다른 E. Coli 스트레인(오리가미(Origami)-DE3;노바겐(Novagen))과 변경된 노정조건(pT7-Amp-Trx벡터;30℃에서 5hr)을 TrxAβ42에 대해 사용하였다. 그 이외의 것들은 완전히 불용해(insoluble)였다. 오는 세포분해(cell lysis) 다음으로, His6-태그붙인 TrxAβ폴 리펩티드를 금속친화성수지(metal-affinity resin:예컨대 Talon; Clontech사제)에 결합되고, 제조자 주문에 따라 세정되며 인산염 완충된 염류(phosphate buffered saline:PBS)에 대하여 광범위하게 투석화(dialyzed)되었다. 단백질농도는 쿠마시에 염색기법(Coomassie dye method:Bio-Rad)으로 결정하였고 자외선(UV) 흡수로 결정되었다. 각각의 폴리펩티드의 성분과 순도는 11% 폴리아크릴아미드-에스디에스 겔(polyacrylamide-SDS gels)과 MALDI-TOF 분석법(MassLynx 4.0, 물)에 겔 전기이동법(gel electrophoresis)에 의해 평가하였다.
면역화 프로토콜( Immunization protocol ) 재조합형. TrxAβ폴리펩티드(PBS에 2㎎/㎖)를 여과-살균하고 각(10nmol) 공약수만큼(aliquot)에 1㎎의 명반(Sigma-Aldrich 사제)을 혼합하여 최종적으로 400㎕의 부피가 되도록 하여 사용직전의 상태로 만들었다. Aβ42(Sigma-Aldrich)를 PBS (2㎎/㎖)에 용해하고 37℃에서 면역처리하기전에 밤새도록 농축시켰다. 한달된 숫놈 BALB/c 쥐(찰스리버실험실;각각) 10마리씩으로 된 그룹으로 5개의 분류로 만들어 도 1c 에서와 같이 하루 1, 15, 30, 60으로 상기 항원으로 피하(subcutaneously) 주사를 놓았다. 또한 PBS 주사놓은 그리고 농축된 Aβ42, 양쪽 모두 명반(alum) 없이, 주사 놓은 2개의 부의 제어그룹(negative control groups)에 대해 동일한 처리를 적용하였다. 그런후 2주간 혈청을 채집하였다.
항-Aβ42 항체검출( Detection of antiA β42 antibodies ). 1/200 고정비율로 희석하고, 목표항원 23으로 농축된 Aβ42(0.5㎍/well)를 사용하여 ELISA에 의해 총 항-Aβ42 항체를 검출하였다. 다음, 인큐베이팅에 이어 세척, 그리고 당근과산화효 소(horseradish peroxidase:HRP)-항 쥐 면역글루불린(anti-mouse immunogloblins) (1/5000; Sigma-Aldrich회사 제)을 접합하고- 그리고 염색된 기질 o-페닐렌디아민(Sigma-Aldrich)에 이어, 450nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 판(plates)을 판독하였다. 면역글로불린 표본결정(immunoglobulin isotype determination)을 고정된 1/200 희석비율로 행하였다. 이 때 항-쥐 Ig 서브클라스-명세(subclass-specific), GRP-접합된 제 2차 항체(Techni Pharm사 제)를 이용하였다. 각 그룹으로부터 5쌍의 혈청위에 세겹으로 ELISA를 투입하였다; 그룹 1, 3, 4, 6 및 7(도 1c)에서 3개의 톱 반응물질(top responders)로부터 혈청의 일부만을 떼어 표본결정용으로 사용하였다. 그룹들 사이의 비교는 분석용 소프트웨어를 이용하여 일방성(one-way) ANOVA로 수행하였다.
면역조직화학( Immunohistochemistry ). 3개의 TrxAβ1-15 폴리펩티드의 각각으로 면역을 준 쥐로부터의 혈청을, 알츠하이머 질병의 전형적인 신경병리학과 임상증상을 가진 68세된 환자의 뇌에 Aβ반을 결합시킬 수 있는 능력부여를 위해 스크린하였다. 그룹 5, 6 및 7에 있는 3개의 톱 응답물질로부터 모은 혈청의 여러가지 희석비(1/100~1/1000)를 분석하고, 그중에서 가장 양호한 결과를 1/500 희석비로 얻었다. 다음 혈청을 포르말린-고정하고 일시적인 외피조직(temporal cortical tissue)을 가지고, 포름산(80%, 15분간)으로 예비처리된 8-㎛ 두뇌부위에 순차적으로 가하였다. 원형에 가까운 모형처리된(PBS) 동물로부터의 혈청과 상업적인 항-Aβ40 폴리클론 항체제조품(항-팬(Anti-Pan)), 베타-아밀로이드(β-Amyloid), 생물원(Biosource)을 각각 수동제어(negative controls)와 능동제어(positive controls)로 사용하였다. 제조자의 지시에 따라 염색된 기질(chromogenic substrate)로서 3-3'-디아미노벤지딘(diaminobenzidine)을 사용하여 양고추냉이 과산화효소시스템(Dako)으로 면역 식별표시하였다.
50~400배(×)의 범위에 걸친 확대로도 디지탈 카메로 이미지를 잡았다.
도트블로트 분석( Dot blot assays ) 및 AFM 이미지 만들기 . Aβ42종을 도트블로트 해석을 위해 종래 알려진 프로토콜(protocols)에 따라 준비하였다(예컨대 Stine, W. B. 등이 발표한 저널 바이올러지 켐 제 278권 11612-11622페이지 참조).
요컨대, 2M DMSO(1mM 최종농도)로 용해된 Aβ42를 모노머형(monomeric form)의 원물질(source)로 이용하는 것으로; 100μM의 최종농도로, 4℃에서 24시간동안 인큐베이션(incubation)에 뒤이어, 햄의 F12K 중간물질(Ham's F12K medium: 빨간색 없는 페놀; 바이오 원물질(Biosource) 속으로 DMSO 스톡용액(DMSO stock solution)을 희석한 것을 용해 가능한 올리고머를 제조하는데 사용하였다; 다음 100μM의 최종농도에서 10mM HCl 속으로 희석된 동일한 이 저장용액을 Aβ42 피브릴섬유를 만드는데 사용하였다. 여러가지 Aβ종의 동일성(identity)은, 용해가능한 올리고머 용액으로부터의 피브릴섬유 없는 경우는 물론이고, AFM에 의해 증명되었다. 이러한 목적으로, 상술한 Aβ42 용액을 용착완충액(4mM HEPES PH 7.4, 10mM NaCl, 7mM MgCl2)으로 10배 희석하여 최종농도 10μM의 것으로 만들고, 이를 즉시 상온에서 쪼개진 루비운모위에 도포하였다. 5분 경과후, 운모디스크를 밀리-큐 급의 물(milli-Q grade water)로 헹구고, 질소흐름으로 천천히 건조시켰다. 다음, 상업적인 다이 빙판 실리콘 외팔보(diving board silicon cantilevers:MikroMasch)를 이용하여 태핑모드(tapping mode)에서 작업되는 나노스코프(Nanoscope)Ⅲ 현미경(디지털기구)으로 이미지를 집중시켰다. Aβ42 펩티드의 0.1pmol 또는 1pmol의 어느쪽이든 그에 대응되는 고정된 체적을 가진 각 Aβ종을 진공처리한 돗트블로터(dot blotter)장치(96 웰(wells)); 바이오-방사(Bio-Rad)를 이용하여 20mM 3배-HCl, PH 7.5, 0.8% NaCl(TBS)로 예비습윤처리한 니트로셀루로즈멤브레인(nitrocellulose membranes:GE Healthcare Life Science지) 위로 점점이 떨어뜨려 적하하였다. 각 8개의 멤브레인의 묶음에서 도트블로트(dot blots)를 제조하고, 사용 2주전에 4℃에서 이를 건조하고 저장하였다. 도트블로트 분석을 위해 반혈청(antisera)을 제조자 지시에 따라 단백질-A 미니칼럼(minicolumns:Diatheva) 위에서 친화-세정되게 하였다. 쿠마시에 염색법(Coomassie dye method)으로 총 면역성글로블린 농도의 결정에 이어, 세정된 면역성글로블린(immunoglobulins)을 최종농도 0.75㎍/㎖에서 도트블로트 시험분석용으로 사용하였다. 상온에서 0.05% 트윈(Tween) 20(TBST)로 보완된 TBS에서 5% 비지질 건조밀크로 블로킹(blocking)한다음 블로트(blots)를 건조 밀크-TBST에서 3개의 각 초기 Trx Aβ1-15 항체로 1.5시간동안 인큐베이팅하고, 다음 TBST로 3×10min 세척하고, 뒤이어 제조자가 명시한 바와 같이 슈퍼시그널 웨스트 펨토 키트(Super Signal West Femto kit:Pierce)로 쥐 면역글로블린(immunoglobulin) 검출을 행하였다. 3개의 독립적인 기술적인 복제품(replicates)이 각 그룹별로 상부 대응푸울(top responding pool)로부터 반혈청(anticera)으로 이송되었다.
(실시예 2)
성인 Tg2576 유전자이식 쥐에서의 뇌 β-아밀로이드 병리학에 대한 생체내의 항- Trx (Aβ1-15) 4 항체 효과의 평가
방법( method)
인체 APP(1)의 스웨덴 변종으로 되는 유전자이식 AD(Tg 2576) 암쥐를 보스톤대학 알츠하이머 질병센터의 쥐 연구부서로부터 취득하였다. 이 연구부서로부터 얻은 것들을 카렌 사이오-아쉐(Dr. Karen Hsiao-Ashe:미네소타 의과대학의 신경학과)가 제공하였다. APP Tg 2576 쥐는 8개월이나 일찍부터 관련 대신경교세포(astrogliosis)에 따라 비정상적인 행동을 조사하고, 반으로서 뇌 Aβ도포물의 조직학적 증명(histological evidence)을 가져오는 것으로 선정한 것이다. 쥐들은 꼬리 DNA에 표준화된 PCR 평가를 이용하여 유전자형(genotyped)으로 하고, 음식과 물을 임의로 제공하는 표준조건하에 각 케이지별로 4마리씩 나누어 집어넣었다. 6마리의 14개월된 APP 쥐(각 마리당 32~34g)를 12간동안 넣고, 해부용으로 사용하였다.
이들 쥐들을 케타민 HCl/크실라진(xylazine) 복막주사(100㎎/kg 케타민 및 10㎎/kg 키실라진; 100㎕/10g 체중)로 마취시켰다. 그리고 쥐머리어댑터(head adapter)를 가진 뇌검사장치(stereotaxic apparatus:Koph)에 위치시켰다. 아울러 절차진행과정 전체에 걸쳐 호흡추적장치를 붙인 워밍 패드(warming pad)를 이용하여 37℃에서 체온을 유지시켰다. 머리가죽을 중간선에서 절개하여 두개의 반구체에 서 화살촉 형상의 봉합장치와 뇌검사장치가 노출되도록 하였다. 또한 2개 계측점의 하나인 브레그마(bregma)를 관련점(reference point)(2.0㎜)으로 이용하여 좌ㆍ우 경사부위(1.75㎜)의 교차점에서 구멍을 뚫었다. PBS-처리된 쥐(각각 2㎕)로부터 모의 면역글로불린(mock immunoglobulins)을 따라 친화성-세정된 항-Trx(Aβ1-15)4 항체를 무딘끝 뾰족부(blunt-tipped)를 가진 하밀톤 10㎕ 주사기(syringe)를 사용하여, 각각 좌ㆍ우 피하(복부 아래로 2.0㎜) 속으로 뇌검사를 위해 주사하였다. 피하 위치에 2분간 방치하고, 뒤이어 4분간 주사하고 주사기를 제거하기 전에 추가적으로 2분간 주사하였다. 그리고 위 쥐들에 9㎜ 오토클립(autoclip)을 사용하여 절개한 부분을 무균처리하여 봉합하였다. 그런 다음 회복할 때까지 쥐들에 워밍패드를 붙여 체온을 유지시켰다.
모든 동물실험들은 국립건강원에서의 실험동물 사용지침에 따라 수행되었으며, 베테랑 투입지침과 보스턴대학 동물실험 주의지침에 따라 수행되었다.
7일간의 주사후, 쥐들을 전신마취하고 2% 완충 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 100㎖를 살포한 다음, 2시간동안 글리세롤과 연속적으로 얼린 절개면(frozen sectioned)(50㎛)을 등급매긴 배열로 저온보존(cryoprotected) 상태로 뇌를 고정유지시켰다. 일련적으로 절단한 쥐 세포단면을 니슬물질(Nissl substance)로 염색하고 항-Aβ42(고양이 번호 344; 바이오소스 인터내쇼널), 항- Aβ올리고머(모두; 바이오소스 인터내쇼널)와 신경교의 피브릴섬유 항원단백질(GFAP; Dako) 항체로 면역식별하였으며 숙성된 Aβ반의 캄벨-스윗처(Campbell- Switzer) 식별법을 이용하여 은색으로 염색한 것이다. 일련적으로 절단한 Aβ42 면역염색된 관상의 조직단면은 내부청각기관으로부터 시작되는 피하조직 내에서:1.68㎜/브레그마(Bregam):-2.12㎜에서 내부청각기관으로: 2.16㎜/브레그마: -1.64㎜를 정량적으로 분석하였다. Aβ42-포지티브 반(positive plaques)을 동일뇌역(brain areas)의 고해상이미지로부터 정량화하였다. 이는 항 Trx(Aβ1-15)4-처리된 반구내에서 그리고 반대측 PBS-처리반구내에서 행해졌으며, 이때 사용한 것은 바이오비젼(Bio Vision)(3)과 뉴로루시다 소프트웨어 프로그램(Neurolucida software program: Micro Bright Field, Williston, VT)이었다. 바이오비젼은 배후신경망(background neuropil)으로부터의 반과 달리하고 셈한다. 한편, 뉴로루시다 프로그램은 바이오비젼 이미지로부터 데이터를 추출하고, 통계분석을 위해 엑셀(Excel: Microsoft, Redmond, WA)에 수출되고 있다.
결과( Result )
항-Trx(Aβ1-15)4의 면역치료적 잠재력(immunotherapeutic potential)을 14개월 된 APP 유전자이식 AD(Tg 2576) 쥐의 피하조직으로 이 항체를 뇌검사 주사한 다음 평가하였다. PBS만으로 처리된 쥐로부터 모의 면역글로불린(mock immunoglobulins)을 이 실험을 위해 내부제어로 작용하는 반대측 반구속으로 주입하였다. 7일동안의 주사, 조직병리학적 조사는 피하조직에서 Aβ면역체 얼룩(Aβimmunostaining) 부분이 현저히 감소하고, 모의 주사한 반구에 비교하여 항-Trx(Aβ1-15)4 항체를 받는 쥐의 대뇌신피질(neocortex)의 겹침이 현저히 감소되는 것을 나타내었다. Aβ포지티브 반점은 주사부위에서 없어졌을 뿐 아니라, 주사반음영부(injection penumbra: 주사부위에 대해 2㎜ 전면부/배면부) 내에서의 반점들이 현저히 사그라졌다.
이는 피브릴 섬유(fibrils)와 작은 올리고머 뿐 아니라 보다 높은 서열의 올리고머(higher-order oligomers)가 항-Trx(Aβ1-15)4 항체에 의해 생체 내에서 표적으로 될 것임을 시사 또는 암시한다. 이들 발견들은 항-Trx(Aβ1-15)4와 초기 항-Aβ 항체와의 사이에서의 경쟁결과로 나온 것이 아니라는 것을 증명하기 위하여, 발명자들은 초기신경교 피브릴섬유항원 단백질(glial fibrillary antigen protein:GFAP) 면역표시용 염색과 캠프벨-스윗처 은색(Campbell-Switzer silver staining) 얼룩을 이용하여 대신경교세포(astrogliosis)와 Aβ반을 검출하기 위해 또다른 조직병리학적 분석(histopathological analysis)을 행하였다. 그 결과 대신경교세포와 신경교-관련 반은 항-Trx(Aβ1-15)4 항체주사 X선상의 명암선(penumbra) 내에서 현저히 감소되었다. 이는 다른쪽 그대로 모의주사된 반구에 비해 현저한 감소가 이루어진 것으로 나타났다. 더욱이 캠프벨-스윗처 은색얼룩으로 나타난 바와 같이, 그대로의 모의주사된 반구(mock-injected hemisphere)에 비해 항-Trx(Aβ1-15)4 주사된 반구에서는 훨씬 적은 반점들이 나타났다. 양쪽 관찰은 항-Aβ항체검출로 이루어진 면역얼룩데이터(immunostaining data)로 지속적으로 이루어졌다. 정량적인 관점에서 PBS-처리된 반구에 비하여, 항 Trx(Aβ1-15)4 처리된 반구(PBS-처리 된 반구:3.34×103±0.58;항-Trx(Aβ1-15)4-처리된 반구:0.97×103±0.27, P＜0.01)에서의 Aβ42-포지티브 반점의 수가 현저히 감소된 것이다.

Claims (36)

  1. 활성루프사이트(active loop site) 내에 하나 이상의 Aβ42의 소편(fragment)를 구비하는 캐리어(carrier)로 구성되는 것을 특징으로 하는 면역원 구조체(An immunogenic construct).
  2. 제 1항에 있어서, 상기 캐리어는 치오레독신(thioredoxin)으로 되는 면역원구조체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 Aβ42 소편은 아미노산링커(linker)에 의해 캐리어에 한정되는 면역원구조체.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 하나 이상의 Aβ42 소편은 30 아미노산 잔류물보다도 적은 N-터미널소편(N-terminal fragment)으로 되고, 가급적 Aβ1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 면역원구조체.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 하나 이상의 Aβ42 소편은 Aβ1-15인 면역원구조체.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 Aβ1-15 소편은 아미노산 링커에 의해 치오레독 신(thioredoxin)에 한정되는 면역원구조체.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 아미노산 링커는 Gly-Gly-Pro인 면역원구조체.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 치오레독신은 하나 이상의 Aβ1-15 소편을 갖는 면역원구조체.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 치오레독신은 4~16개의 Aβ1-15 소편을 갖는 면역원구조체.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 치오레독신은 4개의 Aβ1-15 소편(Trx(Aβ1-15)4)을 갖는 면역원구조체.
  11. 제 8항 내지 제 10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 각 Aβ1-15 소편은 아미노산링커에 의해 치오레독신에 한정되는 면역원구조체.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 아미노산 링커는 Gly-Gly-Pro인 면역원구조체.
  13. 캐리어(carrier)로 구성되고, 이 캐리어는 그 활성적인 루프사이트(active loop site) 내에서 하나 이상의 Aβ42 소편을 갖는 면역원구조체로 이루어지는 아밀로이도 생성질병(amyloidogenic diseases)에 대한 치료용 백신(therapeutical vaccine)으로서의 약제조성(A pharmaceutical composition).
  14. 제 13항에 있어서, 상기 캐리어는 치오레독신으로 되는 약제조성.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 Aβ42 소편은 아미노산링커에 의해 한정되는 약제조성.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 하나 이상의 Aβ42 소편은 30 아미노산 잔류물보다 적은 N-터미널 소편으로 되고, 가급적 Aβ1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 약제조성.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 하나 이상의 Aβ42 소편은 Aβ1-15인 약제조성.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 Aβ1-15 소편은 아미노산링커에 의해 치오레독신에 한정되는 약제조성.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 아미노산링커는 Gly-Gly-Pro인 약제조성.
  20. 제 17항에 있어서, 상기 치오레독신은 하나 이상의 Aβ1-15 소편을 갖는 약제조성.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 치오레독신은 4~16개의 Aβ1-15 소편을 갖는 약제조성.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 치오레독신은 4개의 Aβ1-15 소편을 갖는 약제조성.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 각 Aβ1-15 소편은 아미노산링커에 의해 치오레독신에 한정되는 약제조성.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 아미노산링커는 Gly-Gly-Pro인 약제조성.
  25. 제 13항에 있어서, 상기 약제조성은 보조약(adjuvant)을 추가로 구성하는 약제조성.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 보조약은 3 De-O-아실레이티드 모노포스포릴리피트(3 De-O-acylated monophosphoryl lipid A : MPL), 사포닌(saponin) QS21, 무라밀-디-펩티드(muramyl-di-peptide) 또는 알루미늄염으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 약제조성.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 알루미늄염은 알루미늄 수산화물(aluminum hydroxide), 알루미늄 인산염(aluminum phosphate), 알루미늄 황산염(aluminum sulfate)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 약제조성.
  28. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 하나의 항에 기재된 면역원구조체를 식별하는 모노클론 항체(A monoclonal antibody)
  29. 제 28항에 있어서, 상기 면역원구조체는 Trx(Aβ1-15)4인 모노클론항체.
  30. 활성성분(active ingredient)으로서 제 28항 또는 제 29항에 기재된 모노클론항체로 구성되는 아밀로이도 생성질병을 예방 또는 치료하기 위한 치료제(A therapeutic agent).
  31. 제 30항에 있어서, 상기 아밀로이도 생성질병은 알츠하이머질병인 치료제.
  32. 캐리어(carrier)로 구성되고, 이 캐리어는 그 활성루프사이트(active loop site) 내에서 하나 이상의 소편 Aβ42를 갖는 면역원구조체를 제조하기 위한 방법은
    ⅰ) 적절한 박테리아에서 캐리어를 증폭(amplifying the carrier)하는 단계;
    ⅱ) 상기 캐리어를 적절한 벡터(vector)에 삽입하고, 이 벡터는 PET 시스템을 통해 단백질표시를 촉진하는 T7 추진제(promoter)를 구성하는 단계;
    ⅲ) Aβ소편 DNA 인서트(insert)를 제조하는 단계;
    ⅳ) 캐리어-벡터와 Aβ소편 DNA 인서트를 제한하고 결찰(ligating)하는 단계
    로 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역원구조체의 제조방법(A method for preparing an immunogenic construct).
  33. 제 32항에 있어서, 상기 캐리어는 체오레독신인 면역원구조체의 제조방법.
  34. 제 32항에 있어서, 상기 박테리아는 이 콜리(E. Coli)인 면역원구조체 제조방법.
  35. 제 32항에 있어서, 상기 벡터는 pT7 Kan-Trx로 되는 면역원구조체 제조방법.
  36. 제 32항에 기재된 방법으로 얻게 되는 면역원구조체(An immunogenic construct).
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