BRPI0706818A2 - composições, métodos e usos de imunogênicos antiamilóides - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES, MéTODOS E USOS DE IMUNOGéNICOS ANTIAMILóIDES A presente invenção fornece um imunogênico recombinante obtido por multimerização em tandem de um fragmento que contém uma céluia-B epítopo de A1342, dentro do sítio do ciclo ativo de um carregador (local de exibição), preferencialmente tiorredoxina (Trx) bacteriana. Polipeptídios contendo várias cópias de fragmentos de Af342, preferencialmente com um linker de aminoácido interposto, foram construídos e injetados em camundongos, juntamente com um adjuvante. Descobriu-se que os anticorpos obtidos ligam-se seletivamente a A13 fibrilares e/ou oligómeros em placas neuríticas de DA.

Description

COMPOSIÇÕES, MÉTODOS E USOS DE IMUNOGÊNICOS ANTIAMILÓIDES

Campo Da Invenção

A presente invenção está relacionada a construções de imunogênicos compostospor um fragmento de Αβ42 e um carregador caracterizado neste fragmento é posicionadodentro do sítio do anel ativo (local de exibição) do carregador, método de produção eusos do mesmo.

Histórico Da Invenção

Doenças amiloidogênicas como a doença de Alzheimer (DA) foram reconhecidascomo a principal causa de demência em pessoas mais velhas. O declínio da capacidadecognitiva na DA está associado a alterações histopatológicas no cérebro, sendo que amais relevante é a formação de placas amilóides e emaranhados neurofibrilares.Embora as placas amilóides contenham muitas proteínas, são constituídas principalmentepelo peptídeo amilóide-β (Αβ). A formação do peptídeo Αβ e, conseqüentemente, dasplacas amilóides Αβ, decorre do processamento aberrante da proteína precursora doamilóide (PPA).

Atualmente, foram desenvolvidas várias abordagens farmacológicas para retardarou reverter a progressão da DA. Embora várias abordagens estejam voltadas para ainibição da geração metabólica do peptídeo Αβ, outras estão voltadas para evitar aagregação do amilóide Αβ ao cérebro de pacientes afetados pela DA.

Contudo, as abordagens mais promissoras estão voltadas para o aumento da depuraçãode placas Αβ do cérebro, através da administração de antígenos capazes de gerar umaresposta imune contra Αβ (imunização ativa) ou de anticorpos dirigidos contra Αβ(imunização passiva).

Cópia De Confirmação

Antígenos ou imunógenos normalmente são macromoléculas que contêm sítiosantigênicos distintos, ou "epítopos", que são reconhecidos e interagem com os várioscomponentes do sistema imune. Eles geralmente são compostos por uma moléculapequena ou "hapteno", como um peptídeo curto, ligada a um carregador adequado. Oscarregadores normalmente são proteínas de alto peso molecular, com capacidade decausar uma resposta imunológica quando administrada in vivo.

Em uma resposta imune, os anticorpos são produzidos e secretados pelos linfócitos B,em conjunto com as células TH (T-helper). Na maioria dos sistemas hapteno-carregador, ascélulas B produzem anticorpos específicos para o hapteno e o carregador. Nestes casos, oslinfócitos T terão domínios de ligação específicos sobre o carregador, mas nãoreconhecerão o hapteno sozinho. Em um tipo de sinergia, as células BeT cooperam parainduzir uma resposta de anticorpo específica para o hapteno.Assim, α seleção do carregador e do hapteno apropriados é crucial na construçãode um antígeno eficaz, a fim de garantir uma resposta imunogênica robusta e seletiva. Asegurança do antígeno também é extremamente importante. A administração dapromissora vacina AN-1792, constituída pelo pré-agregado Αβ42 e pelo adjuvante imuneQS-21 a pacientes com DA, por exemplo, acarretou meningoencefalite grave emaproximadamente 6% dos indivíduos tratados. Tanto a ativação central de células Tcitotóxicas quando as reações auto-imunes foram propostas como possíveis mecanismosde toxicidade. Uma resposta imunológica contra o Αβ monomérico endógeno pode sernociva, já que espécies de Αβ não agregadas possuem um papel fisiológico na atividadeneuronal.

Assim, é de grande importância a seleção adequada do hapteno e do carregadorpara garantir a seletividade do anticorpo para as espécies de Αβ nocivas e para evitar atoxicidade auto-imune.

WO 2005058940 propõe conjugar um imunógeno peptídico composto pelo peptídeoΑβ ou fragmento deste a um carregador proteína/polipeptídio.

As construções imunogênicas são produzidas por um método químico formado peladerivação de grupos funcionais de resíduos de aminoácidos do carregador, em quequalquer grupo funcional derivado e não conjugado dos resíduos de aminoácidos édesativado por "capping", para impedir que reaja com outras moléculas. Este métodoresulta em imunógenos em que o fragmento Αβ está ligado às cadeias do ladoaminoácido do carregador. Embora em W02005058940 tenham sido propostos várioscarregadores e haptenos diferentes, sua eficácia histopatológica in vivo não foidemonstrada.

Kim, H.D. et al, em Biochem. Biophys, Res. Commun. Volume 336, páginas 84-92,propõe uma vacina de DNA anti-Αβ, composta por 11 repetições não sobrepostas de Αβί-6.

Esta construção gerou anticorpos que reconheciam indiscriminadamente espéciesde Αβ42 monoméricas, oligoméricas e fibrilares.

Em geral, o direcionamento seletivo de imunógenos para diferentes estados deassociação de Αβ42 (monômeros, oligômeros ou fibrilas) ainda não foi obtido.

Em vista das considerações acima, existe ainda a necessidade de se desenvolveruma construção de imunogênico segura e eficaz que possa ser usada em composiçõespara vacinação terapêutica, para prevenir a agregação do amilóide Αβ ao cérebro depacientes afetados por DA ou outras doenças amiloidogênicas, como a síndrome deDown.A presente invenção fornece uma construção imunogênica recombinantecaracterizada em que os fragmentos Αβ estão posicionados dentro do sítio do anel ativo(local de exibição) do carregador, e não ligados às extremidades do carregador. Estepeptídeo é obtido por multimerização em tandem de um fragmento que contém umacélula-B epítopo de Αβ42, dentro do sítio do anel ativo (local de exibição) de umcarregador, preferencialmente tiorredoxina (Trx).

Descobriu-se que os imunógenos da presente invenção produzem anticorpos quereconhecem espécies oligoméricas neurotóxicas do amilóide Αβ, que recentemente foramindicadas como os agentes causais mais próximos de doenças amiloidogênicas.Esta capacidade foi associada à construção do imunógeno que apresenta o amilóide Αβno carregador. Tal configuração até certo ponto permite a conformação correta daproteína imunogênica e a apresenta ao sistema imune de maneira mais eficaz. Quando oimunógeno carrega mais de um fragmento do amilóide Αβ, e particularmente um númeroespecíficos desses fragmentos, acredita-se que a semelhança do imunógeno com osoligômeros do amilóide Αβ aumente ainda mais sua eficácia, além de aumentar aseletividade.

Um linker entre o carregador e os fragmentos também auxilia na preservação doestado de associação do epítopo de peptídeo.

Resumo Da Invenção

A presente invenção fornece uma construção imunogênica (também indicadaneste documento como imunógeno) composta por um fragmento contendo um epítopode célula B imunodominante de Αβ42 e um carregador caracterizado em que o fragmentoestá posicionado dentro do sítio do anel ativo (local de exibição) do carregador. Ocarregador é preferivelmente tiorredoxina, enquanto que o fragmento Αβ é,favoravelmente, um fragmento N-terminal de menos de 30 resíduos de aminoácido,preferivelmente menos de 20 aminoácidos, e mais preferivelmente é o Αβ 1-15.

Ainda mais preferivelmente, a construção imunogênica contém mais de umfragmento, preferivelmente 2 a 16, mais preferivelmente 4 fragmentos.

A presente invenção fornece ainda um método para construção deste imunógeno,método composto por uma multimerização em tandem auxiliada por Iinker de um epítopode célula B contendo um fragmento de Αβ42 na exibição do carregador, preferivelmenteum fragmento N-terminal de menos de 30 resíduos de aminoácido.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição contendo oimunógeno mencionado para vacinação ativa contra doenças amiloidogênicas.Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece o uso deste imunógenopara desenvolvimento de anticorpos, preferencialmente anticorpos monoclonais, a seremusados para vacinação passiva contra doenças amiloidogênicas.

Descrição Das Figuras

A figura Ia mostra a construção Trx(Αβ 1 -15-Gli-Oli-Pro) η, de acordo com a presenteinvenção.

A figura Ib mostra a purificação até a homogeneidade por cromatografia deafinidade com metal de construções com uma, quatro ou oito cópias de Αβ1-15evidenciado por Trx.

A figura Ic mostra os níveis do anticorpo anti-Αβ obtidos pelos imunógenos, deacordo com as formas de execução da presente invenção.

A figura 1 d mostra imunógenos de resposta polarizados por Th2, de acordo com asformas de execução da presente invenção.

As figuras 2a-b-c mostram seções do cérebro humano tratadas com soro decamundongos imunizados com imunógenos, de acordo com as formas de execução dapresente invenção.

A figura 3 traz imagens de microscópio de força atômica (MFA) mostrando ligaçõespreferenciais de imunógenos, de acordo com as formas de execução da presenteinvenção.

Descrição Detalhada Das Formas De Execução Preferíveis

A presente invenção fornece uma construção imunogênica (ou imunógeno)composta por um carregador com pelo menos um fragmento Αβ42. Este fragmento estáposicionado em uma região com superfície exposta (sítio de anel ativo ou sítio deexposição) do carregador, que estabiliza sua conformação.

O tamanho exato e a homogeneidade química da construção são determinadosnormalmente por eletroforese em gel e espectrometria de massas.

A estrutura da construção pode ser determinada por técnicas analíticas; contudo,emprega-se preferivelmente a ressonância nuclear magnética (RNM).

O carregador é, preferivelmente, a tiorredoxina (Trx). A Trx é particularmenteadequada por seu tamanho pequeno (109 aminoácido), capacidade de expor peptídeose capacidade de atuar como imuno-melhorador não-tóxico capaz de estimular aproliferação de células T murinas. Outros carregadores também podem ser utilizados.

O fragmento amilóide Αβ é uma extremidade N-terminal, favoravelmente um fragmento N-terminal com menos de 30 resíduos de aminoácido, preferivelmente menos de 20aminoácidos e, mais preferivelmente, selecionado do grupo composto por Αβ1-3, 1-4, 1-5,1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15 relacionados na tabela 1 abaixo, de acordocom o código de uma letra para aminoácidos. Preferivelmente, o fragmento amilóide Αβ éΑβ1-15.

Vantajosamente, a construção imunogênica da invenção contém mais de umfragmento, preferivelmente 2 a 16, mais preferivelmente 4 fragmentos.

Em uma forma de execução preferível os fragmentos são ligados ao carregadoratravés de um linker, para evitar a formação de epítopos de junção. Este Iinker é umaseqüência curta de aminoácidos, preferivelmente um linker constituído por 1 a 5 resíduosde aminoácido, mais preferivelmente glicina-glicina-prolina (gli-gli-pro). No entanto,também podem ser usados outros linkers, como glicina-prolina-glicina-prolina-glicina (gli-pro-gli-pro-gli) ou serina-glicina-serina-glicina (ser-gli-ser-gli).

A construção preferível do imunógeno consiste em tiorredoxina ligada,opcionalmente através de um linker adequado, a quatro fragmentos de Αβ1-15, aquiindicados como 1ϊχ(Αβ1 -15)4.

O método para construção deste imunógeno é um método de clonagem quecompreende a amplificação do carregador em uma bactéria adequada, inserindo ocarregador em um vetor adequado, sendo que este vetor é composto por um promotor T7para a expressão da proteína através do sistema pET, a preparação de uma inserção deDNA no fragmento de Αβ, a restrição e a ligação de um carregador-vetor e a inserção deDNA no fragmento de Αβ.

Preferivelmente, a inserção de DNA no fragmento de Αβ compreende um linker deaminoácido. Quando se prepara multímeros emprega-se um excesso de inserção de DNAno fragmento de Αβ.

Tabela 1

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A construção imunogênica preferível da presente invenção, com injeções mensaisdurante 4 meses em camundongos transgênicos nos quais foi induzida uma patologiacerebral β-amilóide, parece reduzir o número e o tamanho das placas Αβ no hipocampo eno córtex cerebral. Ademais, descobriu-se que a construção imunogênica preferível dainvenção fornece anticorpos que reconhecem determinadas espécies de Αβ42.

Esses anticorpos, mediante injeção intra-hipocampal, foram capazes de depurarplacas positivas para Αβ42 no hipocampo e no córtex de camundongos transgênicos; esteefeito de depuração foi particularmente evidente em espécies Αβ oligoméricas. Estesanticorpos também mostraram aumentar muito a astrogliose associada ao Αβ (exemplo 2).

Assim sendo, as construções imunogênicas da presente invenção podem formarcomposições para uso como vacinas ativas e passivas contra doenças amiloidogênicas.Para vacinação ativa, uma composição farmacêutica contendo a construçãoimunogênica da invenção é vantajosamente administrada em combinação com umadjuvante.

A seleção de um adjuvante e/ou carregador depende da estabilidade da vacinaque contém o adjuvante, a via de administração, o esquema de dosagem, a eficácia doadjuvante para as espécies vacinadas e, em humanos, um adjuvante farmaceuticamenteaceitável é aquele que foi aprovado ou é aprovável para administração em sereshumanos pelos órgãos reguladores pertinentes. O adjuvante completo de Freund, porexemplo, não é adequado para administração em seres humanos. Os adjuvantesadequados incluem monofosforil lipídio A (MPL) 3-O-desacilado, muramil dipeptídeo esaponinas como QS21 e Quil A.

Uma classe preferível de adjuvantes são os sais de alumínio (alum), como o hidróxidode alumínio, o fosfato de alumínio e o sulfato de alumínio. Outros adjuvantes incluemcitocinas, como as interleucinas (IL-I, IL-2 e IL-12), o fator estimulador de colônias demacrófagos (M-CSF) e o fator de necrose tumoral (TNF).

Um adjuvante pode ser administrado com o imunógeno na forma de uma composiçãoúnica, ou pode ser administrado antes, juntamente ou após a administração doimunógeno. Opcionalmente, dois ou mais adjuvantes diferentes podem ser usadossimultaneamente.

O imunógeno e o adjuvante podem ser embalados e fornecidos no mesmo frascoou em frascos separados e misturados antes do uso.

As composições farmacêuticas que compõem a construção imunogênica da invençãopodem também incluir uma variedade de outros componentes farmaceuticamenteaceitáveis. Consulte Remington's Pharmaceutical Science (15a. Ed., Mack PublishingCompany, Easton, Pennsylvania, 1980).

A forma farmacêutica preferível depende do modo de administração pretendido eda aplicação terapêutica. As composições também podem incluir, dependendo daformulação desejada, veículos ou diluentes não-tóxicos farmaceuticamente aceitáveis.definidos como veículos geralmente usados para formular composições farmacêuticaspara administração em animais ou seres humanos.

O diluente é selecionado de forma a não afetar a atividade biológica dacombinação. Exemplos desses diluentes são água destilada, solução salina fisiológicatamponada com fosfato, soluções de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank.

Para a administração parenteral, a construção imunogênica da invenção pode seradministrada na forma de doses injetáveis de uma solução ou suspensão da substância emum diluente fisiologicamente aceitável com um veículo farmacêutico que pode ser umlíquido estéril como água, óleos, solução salina, glicerol ou etanol.

Além disso, substâncias auxiliares como agentes umedecedores ou emulsificantes,surfactantes, substâncias para tamponamento do pH e similares podem estar presentes nascomposições.

As composições da invenção podem ser preparadas como injetáveis, seja comosoluções líquidas ou suspensões; também podem ser preparadas formas sólidas adequadaspara solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção.

A construção imunogênica da invenção pode ser administrada na forma de umapreparação para injeção depot ou implante, que pode ser formulada de maneira apermitir uma liberação constante do ingrediente ativo.

Outras formulações adequadas para outras vias de administração incluemformulações orais, intranasais e pulmonares, supositórios e formulações transdérmicas.

Para vacinação passiva a composição é injetada em um mamífero, como uma cobaia ououtra espécie animal, e os anticorpos resultantes são purificados e posteriormente injetadosem seres humanos.

Os anticorpos são preferivelmente monoclonais e produzidos pela imunização deum mamífero com a construção imunogênica Τϊχ(Αβ1-15)4. Estes anticorpos são usadospara a prevenção e o tratamento de doenças amiloidogênicas, particularmente a doençade Alzheimer.

Exemplo 1

Preparação de diferentes construções imunogênicas de ΤΓχΑβ e avaliação ex vivodos efeitos de diferentes anticorpos anti-TrxAP

Uma estratégia de clonagem baseada no uso de um excesso de inserção de DNAem Αβ1-15 com relação a um vetor recipiente modificado contendo a seqüência dacodificação da Trx sob controle de um promotor do fago T7 foi utilizada para a construçãoΤΓχ(Αβ1-15)η (figura la). Construções contendo uma, quatro ou oito cópias de Αβ1-15evidenciado por Trx foram isoladas e usadas para expressar os polipeptídioscorrespondentes, que foram então purificados por cromatografia de afinidade com metal(figura lb).

A direcionalidade e a capacidade de fusão in-frame do sítio exclusivo do Cpolpresente na seqüência de Trx (posições de nucleotídeo 99-105, correspondentes aosresíduos de aminoácido 34-35, identificados como 5' ... CG/GT(A)CCG .. .3'), assim como aincorporação ao DNA de Αβ1-15 de uma seqüência terminal com codificação para umaintervenção de Iinker Gli-Gli-Pro, prevenindo assim a formação de epítopos de junção,foram fundamentais para a produção de multímetros de Αβ1-15 adequadamentedefinidos.

Uma quarta construção (Το<Αβ42) com uma única cópia do peptídeo Αβ42completo foi preparada de maneira similar. Enquanto que todos os polipeptídios Τη<(Αβ1-15)n eram solúveis independente da multiplicidade do Αβ1-15, a maioria das proteínasΤαΑβ42 terminaram em corpos de inclusão, em forma insolúvel (não mostrada). Assim, oΑβ42 parece ser pouco solúvel mesmo quando fundido a Trx no contexto heterólogo decélulas bacterianas.

Cinco grupos de 10 camundongos BALB/c machos foram tratados com 10 nmol dospolipeptídios Τθ((Αβ15)η acima ou com quantidades equivalentes de Αβ42 ou Τη<Αβ42sintético pré-agregado, todos complementados com alum, um adjuvante aprovado parauso em seres humanos (figura lc).

Dois outros grupos injetados com solução tampão (PBS) ou Αβ42 sem alum serviramcomo controles negativos. O soro foi coletado duas semanas após a quarta injeção, compares formados aleatoriamente, e analisado com ELISA (ensaio por enzimas imuno-adsorvidas) usando Αβ42 agregado como antígeno alvo. Conforme mostrado na figura lc,os níveis médios de anticorpo anti-Αβ obtidos por ΤΓχ(Αβ1-15)4 e TrxfApI-15)8, mas não porΤΓχΑβ1-15, foram significativamente mais altos (P<0,05) que os dos controles e semelhantesaos dos grupos tratados com Αβ42, em que o TrxAp42 teve desempenho semelhante ao doΑβ42 livre.

P é o valor ρ associado ao teste t no controle transformado em Iog e aos dadosexperimentais, usando-se os desvios-padrão de Bayes e regularizado; P indica aprobabilidade de que o resultado obtido em um teste estatístico se deva ao acaso e não auma relação real entre as medições.

Uma resposta altamente antiinflamatória polarizada por Th2, típica do adjuvantealum, foi revelada por perfil de isotipo (figura ld). Apesar da prevalência de imunoglobulinade classe G e subclasses 1 (IgGl) observada com todos os antígenos, proporção IgGl/lgG2(imunoglobulina de classe G e subclasses 2) foi reprodutivelmente maior (P<0,05) paraΤΓχ(Αβ1-15)η multimérico e imunoconjugados Το<Αβ42 que para Αβ42 não conjugado.m seguida, pesquisou-se a capacidade do anti-soro gerado em resposta a Trx(A(31-15)n se ligar a placas amilóides. Esta propriedade, atualmente considerada a melhorindicação prognostica da eficácia do anticorpo anti-Αβ in vivo, não é comum a todos osanti-soros anti-Αβ descritos anteriormente (como m266 e outros anticorpos que visavam aporção C-terminal de Αβ42).

Conforme mostrado na figura 2a-b, o soro de camundongos imunizados com asformas tetramérica ou octamérica de Τϊχ(Αβ1-15)η se liga a placas amilóides até umadiluição de 1/1000.

Grandes placas neuríticas, assim como placas maduras e não-maduras, foramclassificadas por anticorpos "1ϊχ(Αβ1-15)η antimultiméricos. Uma maior imunocoloração,especialmente nos núcleos de placas senis, foi observada com o controle positivo anti-soroanti-Pan β-amilóide, gerado em coelhos usando Αβ40 como antígeno (não mostrado). Emcomparação, nenhuma placa foi detectada com soro de animais tratados com o controle(não apresentado) nem com o soro de camundongos imunizados com 1ϊχΑβ1-15monomérico (figura 2c).

Finalmente, foram utilizados imunoblots para avaliar a capacidade dos váriosanticorpos anti-Trx(pi-15)n para vários estados de conformação de Αβ42 (monômeros,oligômeros e fibrilas) gerados in vitro sob condições predeterminadas e verificadas pormicroscopia de força atômica (MFA). Os resultados desta análise são apresentados nafigura 3, que mostra que anticorpos anti-Trx(Api-15)8 se ligam a todas as três espécies deΑβ42, enquanto que anticorpos αηίί-ΪΓχ(Αβ1-15)4 se ligam preferencialmente a oligômeros efibrilas solúveis, mas não a monômeros Αβ42. Em claro contraste, os anticorpos obtidoscontra o antígeno ΤΓχΑβΙ-15 monomérico não apresenta ligações, além de nãoreconhecer fibrilas de Αβ42. A última observação está de acordo com a incapacidadedestes anticorpos de reconhecer agregados de Αβ42 de ordens altas em ELISAs, assimcomo fibrilas de Αβ em placas de DA (vide figuras Ic e 2c). É interessante, porém, queanticorpos Τι-χΑβΙ-15 antimonoméricos se liguem a monômeros e oligômeros de Αβ42 (figura3). Assim, ΤΓχ(Αβ1 -15)4 é um derivado solúvel de β amilóide sem epítopo de célula T comboa atividade imunogênica, mesmo quando formulado com um adjuvante de forçamoderada como o alum, AI(OH)3. Também significativa é a capacidade do ΤΓχ(Αβ1-15)4de gerar anticorpos que se ligam aos oligômeros e fibrilas sinaptotóxicas de Αβ42, mas nãocom espécies monoméricas de Αβ presumivelmente fisiológicas.

As principais vantagens de Trx-dPI em comparação com outras estratégias deimunização por peptídeos são sua economia de tempo e custos, a ausência de toxicidadecelular e a formação de imunoconjugados quimicamente homogêneos, cuja consistêncialote a lote pode ser prontamente verificada. Além disso, após a identificação do "antígenoprincipal" modificações adicionais são implementadas facilmente, incluindo aincorporação de epítopos de peptídeo adicionais e a substituição de vetores para fins devacinação com DNA.

Construções de ΊϊχΑβ. A codificação da seqüência para tiorredoxina de E. coli foiampliada por reação de polimerização em cadeia (PCR) empregando primers 1 e 2(tabela 2), projetada para conferir os sítios de restrição Ndel e BamHI. O fragmentoampliado foi duplamente digerido com enzimas de restrição Ndel e BamHI e ligado apET28b® (Novagen) digerido com as mesmas duas enzimas; o vetor resultante,denominado pT7Kan-Trx, abriga a seqüência para uma versão da tiorredoxina bacterianacom cauda de His6 N-terminal e C-terminal, juntamente com um marcador de resistência acanamicina. O sítio Cpol exclusivo presente na seqüência de codificação da Trx (posições99-105, do nucleotídeo, correspondente aos resíduos de aminoácido 34-35, identificadocomo 5'... CG/GT(A)CCG ... 3') foi usado como sítio de clonagem.

A direcionalidade e a capacidade de fusão in-frame do sítio exclusivo do Cpolforam fundamentais para a produção de multímeros.

ρΤ7Καη-ΤϊχΑβ1-15. A codificação da seqüência para o peptídeo Αβ 1-15, o fragmento N-terminal do peptídeo beta amilóide Αβ42, foi obtida pelo anelamento dosoligonucleotídeos fosforilados:

5'-

GTCCGATGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAGGCG-3'(forward)

3'-

GCTACCTACGTCTTAAGGCTGTACTGAGTCCTATACTTCAAGTAGTAGTTCCGCCAG-5'(reverse)

contendo uma seqüência de reconhecimento terminal de Cpol. A inserção de DNAde 57 bp (Cpol saliente de 5') foi ligada a pT7Kan-Trx digerido com Cpol, a uma razãomolar vetor/inserção de 1/10.

N-n4-6xHis-n 10-TRX( 1 -33)GPMDAEFRHDSGYEVHHQGGPTRX(36-109)-nl5-6xHis-C

A seqüência completa é:

mgsshhhhhhssglvprgshMGDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPMDAEFRHDSGYEVHHQGGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLRdpnsssvdklaaalehhhhhh.

As características principais da construção TrxApi-15 se referem à presença de umresíduo Met (M) na terminação N do peptídeo Αβ1-15, um Iinker Gli-Gli-Pro na terminação Cdo peptídeo Αβ1-15 e α codificação de seqüências para uma versão da tiorredoxinabacteriana com cauda de Hisó N-terminal e C-terminal.

pT7Kan-Trx(Αβ 1-15)4 e ρΤ7Καη-1ϊχ(Αβ1-15)8. Foram obtidas construções contendomais cópias do peptídeo Αβ1-15 de maneira semelhante, mas com uma razão molarvetor/inserção de 1/100. Clones recombinantes foram analisados por digestão comrestrição/eletroforese em gel e dois deles, com quatro ou oito cópias da seqüência de Αβί-15, foram usados para expressar e purificar as proteínas recombinantes correspondentesΤηχ(Αβ1-15)4 e ΤΓχ(Αβ1-15)8.

A presença de duas caudas de Hisó auxilia na etapa de purificação e podeaumentar a imunogenicidade, como no caso de repetições em tandem de resíduos delisina.

Tabela 2

<table>table see original document page 12</column></row><table>

Expressão e purificação dos polipeptídios Trx Αβ. A expressão foi induzida pelaadição de 1 mM de IPTG (isopropil-P-D-tiogalactopiranosida) a células de E. coli BL21 Star(DE3) (Invitrogen) transformadas com cada uma das construções acima, permitindo-se areação por 2 horas a 37°C. Uma cepa diferente de E. coli (Origami-DE3; Novagen) econdições de expressão diferentes (vetor pT7-Amp-Trx, 5 horas a 30°C) foram usadas paraΤη<Αβ42 que era, antes, completamente insolúvel. Após a Iise celular, os polipeptídios Το<Αβcom cauda de Hisó foram ligados a resina com afinidade por metal (Talon; Clontech),purificados de acordo com as instruções do fabricante e em seguida, sofreram diáliseampla contra solução salina tamponada com fosfato (PBS). A concentração de proteínasfoi determinada com o método de coloração de Coomassie (Bio-Rad) e por absorbânciaUV. A composição e a pureza dos polipeptídios individuais foi avaliada por eletroforese emgel, com gel de poliacrilamida-SDS a 11% e por análise por MALDI-TOF (MassLynx 4.0,Waters).

Protocolo de imunização. Os polipeptídios TrxAβ recombinantes (2 mg/ml em PBS)foram filtrados-esterilizados e uma alíquota de cada (10 nmol) foi misturada a 1 mg de alum(Sigma-AIdrich), em um volume final de 400 μΙ, imediatamente antes do uso. O Αβ42 (Sigma-Aldrich) foi dissolvido em PBS (2 mg/ml) e agregado até o dia seguinte a 37°C, antes daimunização. Cinco grupos de camundongos BALB/c machos (Charles River Laboratories; 10animais de cada), com um mês de vida e reunidos aleatoriamente receberam injeçõessubcutâneas com os antígenos acima nos dias 1, 15, 30 e 60, conforme especificado nafigura lc. O mesmo tratamento foi aplicado a dois grupos de controle negativo quereceberam injeção de PBS e de Αβ42 agregado, ambas sem alum. O soro foi coletadoduas semanas após a última aplicação e separado em pares aleatórios.

Detecção de anticorpos αηίί-Αβ42. O total de anticorpos anti-A(342 foi detectadopor ELISA, a uma diluição fixa de 1/200, usando-se Αβ42 agregado (0.5 Mg/cavidade) comoantígeno23 alvo. Após a incubação, a lavagem e a adição de imunoglobulinasanticamundongo conjugadas com horseradish peroxidase (HRP) (1/5000; Sigma-AIdrich) esubstrato cromogênico o-fenilendiamina (Sigma-AIdrich), as placas passaram por leituraespectrofotométrica a 450 nm. A determinação de isotipo da imunoglobulina foi conduzidaa uma diluição fixa de 1/200, usando anticorpos de rato secundários anticamundongoespecífico para subclasse Ig, conjugado com HRP (TechniPharm). Foram conduzidosensaios ELISA em triplicata para os cinco pares de soro de cada grupo; apenas umsubconjunto de soro das três melhores respostas dos grupos 1, 3, 4, 6 e 7 (figura lc) foiutilizado para determinação do isotipo. As comparações entre os grupos foram conduzidaspor ANOVA unidirecional (one-way), usando o software Analyze-it.

Imunohistoquímica. O soro dos camundongos imunizados com cada um dos trêspolipeptídios 1ϊχΑβ1-15 foi analisado para verificação de sua capacidade de se ligar aplacas Αβ em seções do cérebro de um paciente humano de 68 anos de idade comsintomas neuropatológicos e clínicos típicos de doença de Alzheimer grave. Foramanalisadas várias diluições (1/100-1/1000) de soro agrupado dos três mais responsivos dosgrupos 5, 6 e 7; os melhores resultados foram obtidos com uma diluição 1/500. O soro foiadicionado a seções de 8 pm de tecido cortical temporal de cérebro fixadas comformalina, pré-tratadas com ácido fórmico (80%, 15 min). Foram usados soro dos animais decontrole tratados com PBS e uma preparação comercial de anticorpo policlonal αηίί-Αβ40(Anti-Pan β-Amyloid, Biosource) como controles negativo e positivo, respectivamente. Aimunoidentificação foi revelada com o sistema EnVision Plus/horseradish peroxidase (Dako),usando 3-3'-diaminobenzidina como substrato cromogênico, seguindo as instruções dofabricante.

As imagens foram capturas com uma câmera digital, com ampliações variando de50 a 400X.

Testes dot-blot e imagens por MFA. As espécies de Αβ42 para análise dot-blot forampreparadas de acordo com protocolos já conhecidos na área (vide, por exemplo, Stine,W.B. et al em J. Biol. Chem. Volume 278, páginas 11612-11622).

O Αβ42 dissolvido em DMSO 2M (concentração final 1 mM) foi rapidamente utilizadocomo a origem da forma monomérica; usou-se a diluição da solução estoque de DMSOem meio de Ham Fl2 K frio (isento de vermelho de fenol; Biosource) a uma concentraçãofinal de 100 μΜ, seguida pela incubação por 24 horas a 4°C para preparar oligômerossolúveis; α mesma solução estoque diluída em 10 mM de HCI até uma concentração finalde 100 μΜ e incubada por 24 horas a 37°C foi usada para gerar fibrilas Αβ.. A identidade devárias espécies Αβ., assim como a ausência de fibrilas de soluções de oligõmeros solúveis,foi verificada por MFA. Para isso, as soluções de Αβ42 descritas acima foram diluídas 10vezes em 20 μΙ de tampão de deposição (HEPES 4 mM e pH 7,4, NaCI 10 mM , MgCI2 7 mM)até uma concentração final de 10 μΜ e imediatamente depositadas em mica rubi recémcortada, à temperatura ambiente. Após cinco minutos, os discos de mica foram lavadosem água grau mili-Q e cuidadosamente secos em fluxo de nitrogênio. As imagens foramcoletadas com um microscópio Nanoscope Ill (Digital Instruments) operado em modocontato (tapping), usando ponta comercial de imersão de silicone (MikroMasch). Umvolume fixo de cada espécie de Αβ., correspondente a 0,1 pmol ou 1 pmol de peptídeoΑβ42 foi colocada em membranas de nitrocelulose (GE Healthcare Life Sciences) pré-umedecidas com Tris-HCI 20 mM, pH 7,5, NaCI 0,8% (TBS) usando um aparelho de dot-blotoperado a vácuo (96 cavidades; Bio-Rad). Os dot-blots foram preparados em lotes de oitomembranas cada, secos e armazenados a 4°C por no máximo duas semanas antes do uso.

O anti-soro para a análise dot-blot foi purificado por afinidade em minicolunas de proteínaA (Diatheva), seguindo as instruções do fabricante. Após a determinação daconcentração total de imunoglobulina com o método de coloração de Coomassie, asimunoglobulinas purificadas foram usadas para testes dot-blot a uma concentração finalde 0,75 μg/ml. Após agrupamento à temperatura ambiente com 5% de leite em pódesnatado em TBS suplementado com Tween 20 0,05% (TBST), os blots foram incubados por1,5 hora com cada um dos três principais anticorpos ΤΓχΑβ1-15 em leite em pó-TBST, lavadospor 3x10 minutos com TBST, e em seguida passaram por detecção de imunoglobulina decamundongo com kit SuperSignaI West Femto (Pierce), conforme especificado pelofabricante. Três replicações técnicas independentes foram realizadas com anti-soro dosprincipais respondentes de cada grupo.

Exemplo 2

Avaliação dos efeitos de anticorpos anti-Trx(Api-15)4 in vivo sobre patologiaamilóide β no cérebro de camundongos Tg2576 transgênicos adultos.

Métodos

Camundongos transgênicos DA fêmeas (Tg2576) expressando a mutação sueca daPPA humana (1) foram obtidos na colônia de camundongos do AIzheimer1S Disease Centerda Universidade de Boston. As matrizes para esta colônia foram fornecidas pela Dra. KarenHsiao-Ashe (Departamento de Neurologia, Escola de Medicina da Universidade deMinnesota). Os camundongos APP Tg2576 desenvolveram anormalidades comportamentaise exibiram evidências histológicas de depósitos de Αβ no cérebro na forma de placas.juntamente com a astrogliose associada, a partir de 8 meses. O genótipo doscamundongos foi determinado usando-se um ensaio de PCR padronizado no DNA dacauda; foram mantidos quatro animais em cada gaiola, sob condições padrão, comacesso livre a alimentos e água. Camundongos APP de seis meses de vida (32-34 g cada),em esquema de 12 horas de luz, foram usados para cirurgias. Os camundongos foramanestesiados com injeção intraperitonial de cloridrato de cetamina/xilazina (100 mg/kg decetamina e 10 mg/kg de xilazina; 100 μΙ/10 g de peso corporal) e foram colocados em umaparelho estereotáxico (Koph) com um adaptador para a cabeça do camundongo. Atermorregulação foi mantida a 37°C usando-se uma almofada aquecida commonitoramento respiratório durante todo o procedimento. A incisão com bisturi foi feita nalinha média, para expor a sutura sagital, e as coordenadas estereotáxicas de ambos oshemisférios foram determinadas (2). O bregma foi usado como ponto de referência (2,0mm) e os furos foram feitos no calvário, na junção das coordenadas laterais esquerda edireita (1,75 mm). Anticorpos αηίΐ-1ϊχ(Αβ1-15)4 purificados por afinidade, juntamente comimunoglobulinas inativas de camundongos tratados com PBS (2 μΙ cada) foramestereotaxicamente injetados nos hipocampos direito e esquerdo (2,0 mm ventral),respectivamente, usando uma seringa de 10 μΙ de ponta grossa (Hamilton). Noposicionamento da seringa houve um período de contato de 2 minutos, seguido por umtempo de injeção de 4 minutos e de mais dois minutos de espera antes da remoção daseringa. Um antisséptico tópico foi aplicado assim que a incisão foi fechada, usando-se umautoclip de 9 mm. Os camundongos foram colocados em uma almofada aquecida atésua recuperação completa. Todos os experimentos com animais foram realizados deacordo com o Guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório dos Institutosnacionais de saúde e com as Comissões de cuidados com animais da Administração dosVeteranos e da Universidade de Boston. Sete dias após a injeção, os camundongos foramprofundamente anestesiados e submetidos a perfusão transcardíaca com paraformaldeídotamponado a 2% (100 ml). Os cérebros foram pós-fixados por 2 horas, crioprotegidos emséries graduadas de glicerol e posteriormente seccionados congelados (50 μιη). As seçõesde tecido de camundongo cortadas em série foram coloridas para substância de Nissl,imunocoradas com anticorpos anti-A£42 (cat. no. 344; Biosource International), oligômeroanti-Αβ (Ali; Biosource International) e antígeno da proteína fibrilar glial (GFAP; Dako), ecoradas com prata usando o método Campbell-Switzer para identificação de placas Αβmaduras. Seções de tecido coronal cortadas em série e imunocoradas com Αβ42 dentrodo hipocampo, começando da linha interaural: 1,68 mm/Bregma: -2,12 mm até a linhainteraural: 2,16 mm/Bregma -1,64 mm foram analisados quantitativamente. As placaspositivas para Αβ42 foram quantificadas a partir de imagens de alta resolução das mesmasáreas do cérebro do hemisfério tratado com anti-Trx(Api-15)4 e do hemisfério contralateraltratado com PBS, usando os softwares BioVision (3) e Neurolucida (MicroBrightField, Williston,VT). O BioVision diferencia e conta placas da neurópila de fundo, enquanto que oNeurolucida extrai os dados das imagens do BioVision, exportando-as para o Excel(Microsoft, Redmond, WA) para análise estatística.

Resultados

Em seguida, o potencial imunoterapêutico do anti-Trx(Api-15)4 foi avaliadoinjetando-se estereotaxicamente este anticorpo no hipocampo de camundongos DAtransgênicos APP (Tg2576) de 14 meses de vida. As imunoglobulinas inativas decamundongos tratados apenas com PBS, injetadas no hemisfério contralateral, serviramcomo controle interno para este experimento. Sete dias após a injeção, o examehistopatológico revelou uma redução acentuada da imunocoração por Αβ no hipocampoe no neocórtex de camundongos que recebem o anticorpo anti-Trx(A(31-15)4, em contrastecom o hemisfério injetado com o controle. Placas positivas para Αβ não apenas estavamausentes no local da injeção como também estavam significativamente reduzidas dentroda área de penumbra da injeção (2 mm anterior/posterior ao local da injeção).

Isto sugere que não apenas fibrilas e oligômeros pequenos, mas também oligômerosmaiores são visados in vivo pelo anticorpo αηΜΓχ(Αβ1-15)4. Para verificar se estasdescobertas não eram o resultado de uma competição entre o anti- Τηχ(Αβ1 -15)4 e oanticorpo anti-Αβ primário, realizamos análises histopatológicas alternativas usandoimunocoração por antígeno da proteína fibrilar glial (GFAP) e coloração por prata deCampbell-Switzer para detectar astrogliose e placas Αβ. A astrogliose e as placasassociadas a glia foram acentuadamente reduzidas na área de penumbra na injeção deanticorpo αηίί-1ϊχ(Αβ1-15)4 em comparação com o hemisfério contralateral injetado com ocontrole. Além disso, conforme revelado pela coloração por prata de Campbell-Switzer,havia muito menos placas no hemisfério injetado com αηΜΓχ(Αβ1-15)4 em comparaçãocom o hemisfério injetado com controle. Ambas as observações foram coerentes com osdados de imunocoração obtidos com a detecção de anticorpo anti-Αβ. De um ponto devista quantitativo, houve uma redução significativa no número de placas positivas paraΑβ42 no hemisfério tratado com anti-Trx(Api-15)4. em comparação com o hemisfériotratado com PBS (hemisfério tratado com PBS: 3,34x103 ± 0,58; hemisfério tratado com anti-TrxfApl-15)4: 0,97x103 ± 0,27, P < 0,01).

Claims (36)

1. Construção imunogênica caracterizada por ser composta por um carregador; sendo queeste carregador contém pelo menos um fragmento de Αβ42 em seu sítio do anel ativo.

2. Construção imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato deo carregador ser a tiorredoxina.

3. Construção imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato deo fragmento de Αβ42 estar ligado ao carregador por meio de um Iinker de aminoácido.

4. Construção imunogênica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato deque pelo menos um fragmento de Αβ42 é um fragmento N-terminal de menos de 30resíduos de aminoácido, preferivelmente selecionado de um grupo composto por Αβί-3, - 1-4. 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15.

5. Construção imunogênica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato deque pelo menos um fragmento de Αβ42 é Αβ1-15.

6. Construção imunogênica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato dofragmento de Αβί-15 estar ligado à tiorredoxina por meio de um Iinkerde aminoácido.

7. Construção imunogênica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato dolinker de aminoácido ser Gli-Gli-Pro.

8. Construção imunogênica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato datiorredoxina conter mais de um fragmento de Αβί-15.

9. Construção Imunogênica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato datiorredoxina conter 4 a 16 fragmentos de Αβί-15.

10. Construção imunogênica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fatoda tiorredoxina conter quatro fragmentos Αβ1-15 (ΤΓχ(Αβ1-15)4).

11. Construção imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 10,caracterizada pelo fato de cada fragmento de Αβί-15 estar ligado à tiorredoxina por meiode um Iinker de aminoácido.

12. Construção imunogênica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fatodo o Iinker de aminoácido ser Gli-Gli-Pro.

13. Composição farmacêutica para uso como vacina terapêutica contra doençasamiloidogênicas, caracterizada por compreender uma construção imunogênica compostapor um carregador, sendo que este carregador contém pelo menos um fragmento de Αβ42em seu sítio do anel ativo.

14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fatodo carregador ser a tiorredoxina.

15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fatodo fragmento de Αβ42 estar ligado ao carregador por meio de um Iinker de aminoácido.

16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fatode pelo menos um fragmento de Αβ42 ser um fragmento N-terminal de menos de 30resíduos de aminoácido, preferivelmente selecionado do grupo composto por Αβί-3, 1-4, 1--5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15.

17. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fatode que pelo menos um fragmento de Αβ42 é Αβ1-15.

18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fatodo fragmento de Αβί-15 estar ligado à tiorredoxina por meio de um Iinker de aminoácido.

19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fatodo Iinker de aminoácido ser Gli-Gli-Pro.

20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fatoda tiorredoxina conter mais de um fragmento de Αβί-15.

21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fatoda tiorredoxina conter de 4 a 16 fragmentos de Αβί-15.

22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fatoda tiorredoxina conter 4 fragmentos de Αβί-15.

23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fatode que cada fragmento de Αβί-15 está ligado à tiorredoxina por meio de um Iinker deaminoácido.

24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fatodo Iinker de aminoácido ser Gli-Gli-Pro.

25. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada porconter também um adjuvante.

26. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada peloadjuvante ser selecionado de um grupo composto por monofosforil lipídio A (MPL) 3-0-desacilado, a saponina QS21, muramil dipeptídeo ou um sal de alumínio.

27. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fatodo sal de alumínio ser selecionado do grupo composto por hidróxido de alumínio, fosfatode alumínio e sulfato de alumínio.

28. Anticorpo monoclonal, caracterizado por reconhecer a construção imunogênica dasreivindicações 1 a 12.

29. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato daconstrução imunogênica ser ΪΓχ(Αβ1 -15)4.

30. Agente terapêutico para prevenção ou tratamento de uma doença amiloidogênica,caracterizado pelo fato de ter o anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 28ou 29 como ingrediente ativo.

31. Agente terapêutico, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato dadoença amiloidogênica ser a doença de Alzheimer.

32. Método para preparação de uma construção imunogênica composta por umcarregador, sendo que este carregador contém pelo menos um fragmento de Αβ42 emseu sítio do anel ativo; este método caracterizado por compreender: i) amplificação docarregador em uma bactéria adequada; ii) inserção do carregador em um vetoradequado, sendo que este vetor é composto por um promotor T7 para a expressão daproteína através do sistema pET; iii) preparação de uma inserção de DNA no fragmento deΑβ; iv) restrição e ligação do carregador-vetor e inserção de DNA no fragmento de Αβ.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato do carregador sera tiorredoxina.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato da bactéria ser E.Coli.

35. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato do vetor serpT7Kan-Trx.

36. Construção imunogênica, caracterizada pelo fato de ser obtida pelo método dareivindicação 32.