JP5559789B2

JP5559789B2 - アルツハイマー病の処置のための免疫治療組成物

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Publication number: JP5559789B2
Application number: JP2011522064A
Authority: JP
Inventors: ピーター・ブラックバーン; スティーブン・グライムス
Original assignee: Mercia Pharma Inc
Current assignee: Mercia Pharma Inc
Priority date: 2008-08-07
Filing date: 2009-08-06
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2029-08-06
Also published as: US20200000893A1; CA2739318A1; CN102256620A; US20110206742A1; US20220062395A1; WO2010016912A3; US9498522B2; US11419924B2; JP2011530505A; US10335468B2; US11110155B2; US20170106063A1; WO2010016912A2; CN102256620B

Description

関連出願との関係
本出願は、２００８年８月７日に出願された米国仮出願第６１，０８６，９３８号（この内容は、出典明示により本明細書に包含させる）の利益を主張する。

技術分野
本願は、アルツハイマー病（ＡＤ）の進行を予防、遅延、停止または反転するための安全かつ効果的なワクチンに関する。ＡＤは脳におけるアミロイドβ（Ａβ）沈着により特徴付けられる。Ａβ１−４２ワクチン接種（ＡＮ１７９２）によるＡβのクリアランスは、臨床的に有望であると示されているが、患者の一部は制限的な炎症作用に苦しんでいる。Ａβのような自己抗原は免疫原性が乏しく、Ｔｈ１バイアス(biased)反応を誘導する強力なアジュバント、例えば、ＡＮ１７９２ワクチンにおいて使用されるサポニンＱＳ２１を必要とする。承認されているＴｈ２バイアスアジュバントであるアラム(Alum)は、自己抗原とあまり作用しない。

発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知機能の進行性喪失により特徴付けられる神経変性障害であり、高齢者における認知症の最も頻度の高い型であり、認知症を有するすべての患者のほぼ半数に影響する。

したがって、加齢がＡＤに関する主な危険因子である。６５歳の人々において２−３％が該疾患の徴候を示し、８５歳の人々の２５−５０％がＡＤの症状を有し、さらに多数の人々が特徴的症状なく該疾患の病理学的特徴を有する。６５歳から５年ごとに、該疾患を有する確率が２倍になる。８５歳を越えるＡＤの割合は、米国におけるＡＤ人口において急速に増加しているが、現在、７５−８４歳の人口は８５歳を越える人口とほぼ同じ数の患者を有すると概算されている（Herbert at al., 2003）。アルツハイマー病協会は最近、米国においてＡＤ患者が５００万人を越えていることを報告した（Alzheimer’s Association, 2007）。この数は２０５０年までに３倍になると予測される。

ＡＤを有する患者のケアにおける政府機関の現在のコストは相当であり、急速に増加している。２０１０年には、ＡＤにおけるメディケア費用は４９３億ドル（２０００年のコストの５４％増）に増加することが予測され、メディケイド費用は３３０億ドル（２０００年のコストの８０％増）に増加するであろう。ＡＤは、アメリカにおける取引が毎年６１０億ドルかかることが報告されている。このうち、生産性の喪失に起因する毎年のコストおよび労働者がＡＤを有する親類のための介護者となるときの代替コストは、３６５億ドルと概算される。これらのコストは、家族の介護者に対する直接的財政的コスト（例えば、収入の喪失）も終末期のケアを提供する家族中の鬱病と関連するコストも反映されていない（Prigerson, 2003）。現在、ＡＤの治癒はなく、利用できる薬物治療は、多少の患者に対して比較的小さい対症的効果を提供するが、疾患の進行を遅延しない。

ＡＤは、脳アミロイド−β（Ａβ）タンパク質の沈着、老人斑、グリア細胞活性化、および過リン酸化タウタンパク質から構成される神経原線維変化により特徴付けられる（Selkoe, 2001）。疫学的、病理学的および遺伝学的証拠は、ＡβがＡＤの病因において極めて重要な役割を有することを証明する（Golde, 2003）。腹腔内に注射されるフロイントアジュバント中の凝集Ａβ１−４２ペプチドによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）トランスジェニックマウスの免疫化は、脳Ａβの低下を引き起こした（Schenk et al., 1999）。Ａβ１−４０ペプチドによる鼻腔内免疫化後のＰＤＡＰＰ−ｔｇマウスにおける脳Ａβレベルの減少も、報告されている（Lemere et al., 2000; Weiner et al., 2000）。その後すぐに、いくつかの報告において、Ａβの抗体−介在クリアランスの重要性および認知の改善におけるその役割が証明された（Bard et al., 2000; Janus et al., 2000; Morgan et al., 2000; Dodart et al., 2002）。加えて、抗Ａβ抗体が、種々のアジュバントを使用するＡβにおける免疫化後に（Lemere et al., 2002; Cribbs et al., 2003; Lemere et a1.,2000, 2002, 2003; Spooner et al., 2002: Maier et al., 2005; Ghochikyan et al., 2006）、およびＤＮＡ免疫化により（Ghochikyan et al., 2003, Zhang et al., 2003, Okura et al., 2006, Frazer et al, 2007）誘導されている。能動免疫化戦略に加えて、Ａβに対する抗体を用いる受動免疫化も、脳からＡβを除去することが示されており、ＡＤのマウスモデルにおける認知機能の改善と関連する（Bard et al., 2000, DeMattos et al., 2001）。加えて、これらの有望な動物データは多施設Ａβワクチン（ＡＮ１７９２）臨床試験につながった（Schenk, 2002; Orgogozo et al., 2003; Gilman et al., 2005）。

ＡＮ１７９２ワクチンは、２つの点で欠点があった。第１に、ＡＮ１７９２は処置された患者の３００人中５９人のみ（１９．７％）において有効な免疫反応を誘導し、第２に、処置された対象の１８人（６％）が髄膜脳炎の症状を経験し、臨床試験を中断しなければならなかった（Schenk, 2002; Orgogozo et al., 2003; Gilman et al., 2005）。ＡＮ１７９２ワクチン接種を受けた対象からの剖検例報告は、対照と比較してプラークの数の劇的な減少を示した領域を証明した（Nicoll et al., 2003; Ferrer et al., 2004; Masliah et al., 2005）。しかしながら、Ｔ細胞浸潤物（主にＣＤ４^＋わずかにＣＤ８^＋細胞）は、２つの場合において軟髄膜、血管周囲腔および脳実質に存在しており、ＡＮ１７９２ワクチン接種に対するＴ細胞介在免疫反応を示唆した。神経性炎症(neuroinflammation)は前臨床試験において観察されなかったが、最近の報告によって、Ａβおよび百日咳毒素にて免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウスがＡＮ１７９２にて免疫化されたヒトにおいて観察されるものと同様の特性を有する自己免疫性髄膜脳炎を誘導することが示されている（Furlan et al., 2003）。ＡＮ１７９２試験における追跡調査によって、Ａβプラークに結合した抗体を発現したＡＤ患者が認知機能の減少において顕著に遅い速度を示すことが示された。これらの知見は、能動免疫による抗Ａβ抗体の産生がＡＤに対する有望な免疫治療アプローチであることが示唆される（ただし、良好な免疫反応をこれらの高齢患者において誘導することができ、望ましくない神経性炎症を避けるために、過剰な細胞介在免疫反応を最小化する場合である）。Ａβ抗体が脳におけるＡβ負荷を減少させる正確なメカニズムは知られていないが、仮説として、ミクログリアを介するＦｃ−受容体介在食作用、アミロイド原線維の分解または脳からのＡβの正味の流出の増加をもたらす循環Ａβの隔離が挙げられる（Vasilevko and Cribbs, 2006）。明らかに、たとえどのようなメカニズムであっても、能動または受動免疫療法は、ＡＤにおけるＡβを除去し、認知機能を改善する可能性を有する。

能動免疫スケジュールは、Ｔリンパ球−介在免疫反応を最小にし、抗体産生を最大にするように開発されている。ヒト（Geylis et al., 2005）、サル（Lemere et al., 2004）およびマウス（Lemere et al., 2000; McLaurin, et al., 2002; Agadjanyan et al., 2005）におけるＢ細胞エピトープはＡβ１−１５領域内に位置するが、Ｔ細胞エピトープはＡβ１５−４２内に位置している（Cribbs et al., 2003; Monsonego et al., 2003）。したがって、Ｔ細胞エピトープではなくＢ細胞エピトープにかかるＡβフラグメントは、有害な抗−Ａβ細胞性免疫反応を回避する可能性がある安全な免疫原であり得る。これらのさらに短いＡβフラグメントの免疫原性を増強するための多数のアプローチ、例えば、ユニバーサル(universal)ヘルパーＴ細胞エピトープであるＰＡＤＲＥへのＢ細胞エピトープであるＡβ１−１５の複合体化（Agadjanyan et al., 2005; Ghochikyan et al., 2006）、β−シート量を減少させるためのリジン残基の付加およびグルタミン酸置換の増加（Siguardsson et al., 2001, 2004）または複数コピーの提示（Zhou et al., 2005）が研究されている。最近、ＵＢＩＴｈ^{（登録商標）}ＡＤ免疫治療ワクチンは、Ａβ１−４２の内因性自己Ｔｈエピトープが外来ＵＢＩＴｈ^{（登録商標）}エピトープと置き換えられることが報告されている（Wang et al., 2007）。マカクザルにおける反復投与毒性試験の結果は、このＡβ１−１４ＵＢＩＴｈ^{（登録商標）}ワクチンでの免疫化後、免疫毒性または全毒性の証拠を示さなかった。

Ｔ細胞エピトープを欠いているがＡβ−特異的Ｂ細胞エピトープを含む、分岐リジン核におけるＡβ１−１５の１６コピーから構成されるデンドリマー状Ａβ１−１５（ｄＡβ１−１５）は、有効な免疫原である。変異大腸菌易熱性エンテロトキシン（Dickinson and Clements, 1995）である実験用アジュバントＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）を使用するｄＡβ１−１５での鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫化は、Ｊ２０ＡＰＰ−ｔｇマウスにおいて脳プラーク負荷における有意な減少を伴う良好な体液性免疫反応をもたらした（Seabrook et al., 2006）。マウスｄＡβ１−１５をＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）アジュバントと共に皮下注射したとき、ＡＤ患者由来の脳組織において脳Ａβプラークと結合する、低レベルにおいてＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂであるが主にＩｇＧ１アイソタイプの抗−Ａβ抗体にて体液性免疫反応が誘導された（Seabrook et al., 2006）。他の試験において、ＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）アジュバントを使用する２つのリジン−連結Ａβ１−１５配列（２×Ａβ１−１５）のタンデムリピートでの鼻腔内免疫化は、Ａβ−特異的細胞性免疫反応の非存在下でｈＡＰＰマウスにおける脳Ａβ負荷および学習障害を減少させた（Maier et al., 2006）。

低い内因性神経毒性を有する短Ａβ誘導体を使用することに加えて、Ｔｈ２表現型に対する免疫反応を指向することができるアジュバントも、ＡＤに対する安全、免疫原性的に良好かつ効果的なワクチンの設計のために重要であり得る（Cribbs et al., 2003; Ghochikyan et al., 2006）。強いＴｈ１体液性応答を誘導することが知られているアジュバントであるＱＳ２１（マウスにおけるＩｇＧ２ａ抗体）はＡＮ１７９２試験において使用され、その臨床評価中に観察されたＴ細胞介在炎症に寄与し得た。これまでの動物における多数の試験は、混合Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応を与える強いアジュバント、例えば、ＣＦＡ／ＩＦＡを使用することにより、良好な抗体力価を得ることに集中していた。ユニバーサルヘルパーＴ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ）とタンデムに連結したＡβ１−１５であるＰＡＤＲＥＡβ１−１５−ＭＡＰは、Ｔｈ２バイアスアジュバントであるアラム中で製剤化したとき、主にＩｇＧ１抗体アイソタイプを産生するが、主にＩｇＧ２ａアイソタイプを産生するＴｈ１バイアスアジュバントであるＱｕｉｌＡにおいて製剤化したときよりあまり強力な免疫反応を引き起こさないことが示されている（Ghochikyan et al., 2006）。皮下または筋肉内経路によるＡβに対する良好なＴｈ−２型体液性応答は報告されていないが、ＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）アジュバントを使用するＡβペプチドでの鼻腔内ワクチン接種後のＡＰＰ／ＴＧマウスにおけるＴｈ２−型体液性応答は、脳Ａβプラーク負荷における有意な減少、局所的なミクログリアおよびアストロサイト活性化の減少、および神経炎性ジストロフィーの減少と関連していた（Weiner et al., 2000）。したがって、原則として、ＡＤ集団において良好なＴｈ２バイアス免疫反応を誘導する抗−ＡβワクチンはＡＤの処置に効果的であるはずである。

発明の概要
強力なＴｈ２バイアス免疫反応を誘導するが、有害な炎症性Ｔｈ１バイアス細胞性免疫反応を回避する抗−Ａβワクチンは、ＡＤの処置に効果的であり得る。適当なアジュバント中のＡβ１−４２も、この結果を達成し得る。加えて、Ｔｈ１エピトープを欠いているＢ細胞−特異的短Ａβペプチドエピトープは、起こりうる有害な炎症性細胞性免疫反応を回避することにより、ＡＤに関する有効な免疫療法レジメンのための有望な候補である。しかしながら、このようなペプチド自己エピトープはさらなるＴ細胞の助けを必要とし、さらにヒトにおいて所望の免疫反応を引き起こし、高い力価の抗−Ａβ抗体を産生するように、強いＴｈ２バイアスアジュバントを必要とする。本発明は、Ｔｈ１バイアス細胞介在炎症を回避するか、または抑制するために、油中水型エマルジョン型Ｔｈ２バイアスアジュバント／送達系中のＡβペプチドエピトープ、例えば、Ａβ１−４２を提供する。本発明の１つの態様は、Ａβ１５ＤＴ複合体を形成するように免疫原性担体（ＤＴ）と複合体化したＴｈ１エピトープを欠く自己エピトープ（Ａβ１−１５）に関し、次にこれはＴｈ２バイアス免疫反応を誘導するように油中水型エマルジョンアジュバント／送達系中で製剤化される。免疫原性組成物は、一つの例において、皮下または筋肉内注射により患者に投与され得る。

記載されている免疫治療組成物は、油中水型エマルジョン型アジュバント中で製剤化された、Ｃ−末端ペプチドスペーサーを介して免疫原性担体、例えば、ジフテリアトキソイド（ＤＴ−承認されている小児および成人ワクチンの成分）に連結した、Ａβ１−４２、またはＡβのアミノ酸残基１−１５を含むそれから誘導されるアミノ酸残基から構成される免疫原に関する。組成物は、Ａβに対する中和抗体を誘導するが、Ｔｈ１に基づく細胞毒性Ｔ細胞介在炎症を回避するように設計される。

図面の簡単な説明
図１ＡおよびＢは、免疫化後の血漿における抗−Ａβ１−４２抗体レベルおよびＩｇアイソタイプを描写している。

図２は、ＣＦＡ／ＩＦＡ、ＩＦＡまたはＭＡＳ−１アジュバント中のＡβ１−４２で免疫化されたマウス由来の血漿の、ＡＰＰＴｇマウス由来の脳の切片におけるＡβプラークへの結合を示す。

図３は、ＭＡＳ−１中で製剤化されたそれぞれ７および２２のペプチド−対−担体の代替比率におけるＡβ１５_（７）ＤＴおよびＡβ１５_（２２）ＤＴ複合体のマウスにおける免疫能(immunopotency)を示す。

図４は、ＭＡＳ−１中で製剤化されたそれぞれ７および２２のペプチド−対−担体の代替比率におけるＡβ１５_（７）ＤＴおよびＡβ１５_（２２）ＤＴ複合体のマウスにおける免疫能を示す。

図５は、ＭＡＳ−１中のＡβ１−４２、Ａβ１５_（７）ＤＴおよびＡβ１５_（２２）ＤＴにより誘導されるＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗−Ａβアイソタイプを描写している。

図６は、ＭＡＳ−１中のＡβ１−４２、Ａβ１５_（７）ＤＴおよびＡβ１５_（２２）ＤＴにより誘導される抗−Ａβ特異性のエピトープ位置を示す。

図７は、ＭＡＳ−１中の抗−Ａβ１−４２、Ａβ１５_（７）ＤＴおよびＡβ１５_（２２）ＤＴで免疫化されたＤＢＡマウス由来の血漿によるヒトＡＤプラークに対する比較可能な抗−Ａβ免疫反応性を示す。

図８は、３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおける抗−Ａβレベルを描写している。

図９は、脾細胞刺激アッセイを示す。

図１０は、Ａβプラークに対して染色されたそれぞれの３×Ｔｇ−ＡＤマウス由来の脳切片を描写している。

詳細な説明
詳細な説明において提供されている実施例および図は、単なる例であり、いかなる特許請求の範囲の説明または解釈においても特許請求の範囲を限定するために使用してはならない。

ＡＤ治療ワクチン
ペプチドを含む小分子と免疫原性担体、例えば、ＤＴとの複合体化は、免疫原性を増強するための確立された手段である。しかしながら、ヒトにおいて自己抗原複合体を強い免疫原性にするためには、また、適当なアジュバントと製剤化する必要がある。ＭＡＳ−１は、Mercia Pharma, Incから市販されているマンニドモノオレエート(Mannide monooleate)、スクアレンおよびスクアランを含む油中水型エマルジョンアジュバント系である。ＭＡＳ−１は、細胞介在細胞毒性を引き起こすことなく、またはワクチンの自己成分に対する免疫自己寛容を破壊することなく、自己抗原に対する持続的中和抗体反応を刺激し、耐容性が良く、全身毒性ではない治療ワクチンを生産するために、自己抗原複合体構築物と共にヒトにおいて使用するために開発された。

マンニドモノオレエートベースのアジュバントは、例えば、多くの提供源から市販されているフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、ならびにSEPPIC, Paris, Franceから入手可能なＩＳＡ５１およびＩＳＡ７２０である。油中水型エマルジョンアジュバントは、また、多くの提供源から市販されているマンニドモノオレエート（例えば、Combe, Inc.、商品名Ａｒｌａｃｅｌの下）ならびにスクアレンおよびスクアラン（いくつかの市販している提供源から）と共に製剤化され得る。記載されている組成物において使用される油中水型アジュバントは、抗原を有するエマルジョンにおける水球が、１ミクロン未満の中央直径、約１００ナノメートルから約１ミクロンの範囲における中央直径、一般的に約３００ナノメートルの平均直径を有するように、製剤化され得る。ＭＡＳ−１の油成分は、周知のフロイントアジュバント（不完全および完全製剤両方）の油相を含む鉱油とは異なって、代謝可能である天然生物的油である。

例えば、限定はしないが、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ＣＲＭ１９７（Ｗｙｅｔｈ）−ＤＴの変異型、破傷風菌トキソイド（ＴＴ）およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む、多くの担体タンパク質は、本発明の組成物において使用され得る。ＤＴは、優れた安全記録で小児および成人ワクチンにおける使用のために承認されており、多くの提供源によりｃＧＭＰの量において生産されているため、好ましい担体タンパク質である。

アジュバント／送達系の特異性
数十年間、フロイントアジュバントエマルジョン（ＣＦＡ／ＩＦＡ）は、他のアジュバントと比較する基準である。ＣＦＡは、特にマイコバクテリウム成分により誘導される激しい炎症反応のため、ヒトにおける使用に適当ではないが；ＩＦＡは、ヒト適応に対して未だ承認されていないが臨床試験において使用されている。それにもかかわらず、これらの油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルジョンは、強力なアジュバントとして一般的に認識されており、動物試験において幅広く使用されている。

アラムは、細胞介在細胞毒性を回避するＴｈ２バイアスを伴う現在米国で承認されている唯一のアジュバントであるが、アラムは、不十分な免疫能のため、自己−エピトープ複合体ワクチンのためのアジュバントとして不適当である。鉱油ベースであるＩＦＡ型アジュバント、例えばＩＳＡ５１は、ＩＦＡの鉱油沈澱が注射部位にとどまり、嚢胞の形成を引き起こし得るので、慢性疾患状態の処置における反復使用のためのアジュバントとして欠点を有する。

ＭＡＳ−１アジュバント／送達系は、特に、ヒトにおいて弱い免疫原性自己抗原に対する体液性応答を増強するために開発された。ＭＡＳ−１アジュバントエマルジョンは、免疫原性に関して、アラムよりも有意に強力であり、ＩＦＡエマルジョンに匹敵するか、またはそれよりも優れているが、ＭＡＳ−１は筋肉内または皮下注射後にＩＦＡより有意に耐容性が良く、優れた医薬的物理化学的特性を有する。これらは、有効な抗原提示のための均一の球サイズ分布、低用量を容易にする低粘度、および標準的なコールドチェーン手段を介する分配を容易にする冷蔵温度における拡大された安定性を含む。

ＩＦＡと異なって、ＭＡＳ−１は、ワクチンのデポー製剤を提供し、それにより長期的に有効な免疫刺激を促進する、天然かつ代謝可能な成分から構成される。ＭＡＳ−１は、最終的に注射部位から除去される。ＭＡＳ−１エマルジョンは、使用時に大量または少量単位で作られても強力、再現可能かつ安定であり、１ミクロン未満の中央直径、一般的に約３００ナノメートルを有する抗原を含む水球と共に製剤化され得る。対照的に、ＩＦＡエマルジョンは、エマルジョン安定性における変動性と付随して約３から１０またはさらに５０ミクロンの直径の水球を有する製剤にて投与され、小量の投与および大規模製造を困難にさせる高い粘性である。

ＭＡＳ−１において製剤化されたＡβ１−４２ペプチドワクチン
Ａβ１−４２ワクチン（ＡＮ１７９２）は、ＱＳ２１ベースのアジュバント中で製剤化される。強いＴｈ１バイアスアジュバントであるＱＳ２１は、ＡＮ１７９２ワクチンの炎症性副作用に寄与し得る。ＭＡＳ−１中で製剤化されたＡβ１−４２を、脳組織におけるアミロイドプラークに対する強力なＴｈ２バイアス抗体反応を促進するが、Ｔｈ１反応と関連するアミロイドベータ特異的細胞介在免疫の産生を回避する能力に関して評価する。

図１ＡおよびＢは、免疫化後の血漿における抗−Ａβ１−４２抗体レベルおよびＩｇアイソタイプを描写している。

１（Ａ）メスＤＢＡマウスを、０、１４、４２および８４日目に１００ｕｇのＡβ１−４２で皮下免疫化し、抗−Ａβ抗体をベースライン、２８、５６および９８日目にＥＬＩＳＡにより血漿において測定し、Ｂ）Ｉｇアイソタイプを９８日目に測定する。

Ａβ１−４０およびＡβ１−４２ペプチド抗原は、標準固相ペプチド合成方法論により合成される。ＤＢＡ２マウス（ｎ＝４）に、０、１４、４２および８４日目に、ＭＡＳ−１、ＣＦＡ／ＩＦＡまたはＩＦＡ中で製剤化された１００μｇのＡβ（７５μｇのＡβ１−４０および２５μｇのＡβ１−４２）を皮下（ｓ．ｃ．）に注射する。血漿における抗体力価を、０、２８、５６および９８日目に、ＥＬＩＳＡにより測定する。結果は、ＭＡＳ−１中で製剤化された全長Ａβが、２８、５６および９８日目に、ＩＦＡよりも優れた強力な抗体力価を誘導することを示す（図１Ａ）。

Ａβ１−４０およびＡβ１−４２ペプチド抗原は、標準固相ペプチド合成方法論により合成される。ＤＢＡ２マウス（ｎ＝４）に、０、１４、４２および８４日目に、ＭＡＳ−１、ＣＦＡ／ＩＦＡまたはＩＦＡ中で製剤化された１００μｇのＡβ（７５μｇのＡβ１−４０および２５μｇのＡβ１−４２）を皮下（ｓ．ｃ．）に注射する。血漿における抗体力価を、０、２８、５６および９８日目に、ＥＬＩＳＡにより測定する。結果は、ＭＡＳ−１中で製剤化された全長Ａβが、２８、５６および９８日目に、ＩＦＡよりも優れた強力な抗体力価を誘導することを示す（図１Ａ）。予期されるとおり、ＣＦＡ／ＩＦＡ中のＡβ１−４２（ポシティブ対照）は、ＭＡＳ−１またはＩＦＡ製剤のいずれかよりも、より迅速に、かつ最初に高い抗体レベルをもたらした。ＭＡＳ−１およびＩＦＡ製剤の両方に対する反応は、該試験にわたって増加し、最終血液サンプルを得た９８日目に停滞期に到達しなかった。９８日目のサンプルのアイソタイプは、ＣＦＡ／ＩＦＡがＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体それぞれにおいて有意な力価にて混合Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応を引き起こすことを示した。一方で、ＭＡＳ−１およびＩＦＡ製剤は、主なアイソタイプであるＩｇＧ１とＩｇＭ、低レベルのＩｇＧ２ｂおよびほんのわずかなレベルのＴｈ−１型ＩｇＧ２ａ抗体と共に、Ｔｈ２ドミナント反応を引き起こした（図１Ｂ）。ＣＦＡ／ＩＦＡ、ＩＦＡおよびＭＡＳ−１中の全長Ａβ１−４２で免疫化されたマウス由来の血漿は、ＡＰＰＴｇマウス由来の脳切片におけるヒトＡβプラークへの同レベルの結合を示し（図２）、Ｔｈ−２ドミナント抗体アイソタイプがアミロイドプラークを有効に認識することを証明し、Ｔｈ−２バイアスワクチンがＴｈ−１介在毒性を回避してアミロイドプラーク負荷を減少させる可能性を有することを示唆する。

図２は、ＣＦＡ／ＩＦＡ、ＩＦＡまたはＭＡＳ−１アジュバント中のＡβ１−４２で免疫化されたマウス由来の血漿の、ＡＰＰＴｇマウス由来の脳の切片におけるＡβプラークへの結合を示す。血漿は、ＣＦＡ／ＩＦＡ、ＩＦＡおよびＭＡＳ−１中のＡβ１−４２で免疫化されたマウスから９８日目に採取し、０、１４、４２および８４日目に等しく、ＡＰＰＴｇマウス由来の脳切片における脳Ａβプラークと結合した（下部パネル）。免疫前血漿は対照として使用し、脳Ａβプラークに結合しなかった（上部パネル）。

ＣＦＡ／ＩＦＡ、ＩＦＡおよびＭＡＳ−１中の全長Ａβ１−４２で免疫化されたマウス由来の血漿は、ＡＰＰＴｇマウス由来の脳切片におけるヒトＡβプラークへの同レベルの結合を示し（図２）、Ｔｈ−２ドミナント抗体アイソタイプがアミロイドプラークを有効に認識することを証明し、Ｔｈ−２バイアスワクチンがＴｈ−１介在毒性を回避してアミロイドプラーク負荷を減少させる可能性を有することを示唆する。

ＡβＤＴ複合体化ワクチン
ペプチドエピトープ選択：Ａβ−特異的Ｔ細胞エピトープを回避するＡβＢ細胞エピトープへの標的化は、全長Ａβ１−４２である原線維でのＡＮ１７９２臨床試験において見られるいくつかの副作用を回避するために治験担当医により遂行されている戦略である。Ａβ１−１５配列が関連Ｂ細胞エピトープをコードすることが示されている（Geylis et al., 2005; Lemere et al., 2004; Lemere et al., 2000; McLaurin, et al., 2002; Agadjanyan et al., 2005）。この配列は、免疫原性を改善するために、免疫原性担体と複合体化され得る。

図１Ａ、１Ｂおよび２に示されているデータは、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２がＭＡＳ−１アジュバントまたはＩＦＡアジュバント中で製剤化されたとき、これらのＡβワクチンがＴｈ２優位の免疫反応を誘導し得ることを示す。一方、ＣＦＡ中で製剤化されたＡβ１−４０およびＡβ１−４２は有意なＴｈ１免疫反応を誘導し、これは、ＡＮ１７９２ワクチンにおけるＱＳ２１アジュバント中で製剤化されたＡβ１−４０およびＡβ１−４２で報告されているとおり、Ｔｈ１細胞介在炎症を引き起こす。したがって、これらの結果に基づいて、適当な免疫原性担体と複合体化した場合、Ａβアミノ酸残基１６から４０および１６から４２由来のＡβエピトープ配列を含む複合体化Ａβワクチンは、ＭＡＳ−１またはＩＦＡベースのワクチンとして製剤化された場合に、強力かつ安全なＴｈ２優位の免疫反応を誘導することが予期され得る。同様に、承認されているＴｈ２バイアスアジュバントであるアラムと製剤化した場合、これらの構築物は、また、Ｔｈ２優位の免疫反応を生じることが予期され得る。これらのエピトープ配列は、一般的に、Ａβ配列１−４０および１−４２由来の７から１５の連続したアミノ酸残基を含み得る。

免疫原性担体選択：ヘルパーＴ細胞エピトープを欠いているＡβ１−１５ペプチドは、Ｔｈ−２バイアスアラムアジュバント中で製剤化した場合、免疫原性が乏しい（Agadjanyan et al., 2005）。ＩＦＡ中で製剤化されたＡβ１−１４は、外因性Ｔ細胞の助けがキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体タンパク質または外来ＵＢＩＴｈエピトープへ連結することにより提供されない限り、モルモットにおいて乏しい免疫原であることが示されているので（Wang et al., 2007）、ＭＡＳ−１中で製剤化されたＡβ１−１５ペプチドについても、おそらく同様である。同様に、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２由来の７から１５アミノ酸残基を含むＡβペプチドも、ＩＦＡ、ＭＡＳ−１またはアラムアジュバント中でそれら自体が製剤化される場合、免疫原性が乏しいことが予測される。

短い非免疫原性ペプチドの免疫原性は、一般的に、Ｔｈエピトープ、例えば、合成ＰＡＤＲＥ構築物（Agadjanyan et al., 2005）、または免疫原性担体タンパク質、例えば、変異コレラＢ毒素（ＣＢＴ）、ＫＬＨ、変異ジフテリア毒素（ＣＲＭ）、またはトキソイド、例えば、破傷風菌トキソイド（ＴＴ）もしくはジフテリアトキソイド（ＤＴ）（これらすべては、ＩｇＧ産生および免疫記憶に対するＴ細胞の助けを提供するためにＴｈエピトープを含む）へ連結することにより増強され得る。小児および成人ワクチンにおける使用のために長く承認されており、ＧＭＰ対応成分として利用することができるため、ＤＴが該ＡＤワクチンにおける免疫原性担体として選択される。１つの態様において、Ａβペプチドエピトープは、二官能性架橋剤を使用して、末端システイン残基を有する７残基スペーサー配列を介し、そのスルフヒドリル部分を介してＤＴと複合体化する。他の態様において、７残基スペーサー配列を有さないが末端システイン残基で終わるＡβエピトープは、そのスルフヒドリル部分を介して該免疫原性担体と複合体化し得る。当分野で周知の他の連結構造、例えば、カルボジイミド構造もまた、Ａβエピトープと該免疫原性担体の複合体化を達成するために使用され得る。

Ａβ１５ＤＴ複合体の合成：結果は、免疫原性がペプチド−対−担体の代替比率により影響され得ることを示す。Ａβ１５ペプチド配列および複合体化方法は以下に提供されている。要約すると、２２残基Ａβ１５−ｍｅｒペプチドは固相化学により合成される。Ａβ１５ＤＴ複合体は２つのＡβ１５ペプチド：ＤＴモル代替比率にて製造される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける移動度により決定される２つのＡβ１５ＤＴ複合体の代替比率は、７．６（＃１）および２１．１（＃２）である（表１参照）。免疫原性担体１モルあたり約５モルから約３０モルのペプチドの複合比率が該組成物に有用である。

表１：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＡβ１５ＤＴ複合体の特性化

ＭＡＳ−１におけるＡβ１５ＤＴの免疫能：若年ＤＢＡ２（６週齢；ｎ＝４／グループ）および高齢Ｃ５７ＢＬ／６（１２月齢；ｎ＝２／グループ）メスマウスの両方を、０、１４、４２および８４日目にｓ．ｃ．にて、０．１ｍＬのＭＡＳ−１中の１００μｇの用量の複合体で免疫化する。血液サンプルを免疫前および２８、５６および９８日目に採取し、Ａβ抗体力価を標的抗原としてＡβ１−４２ペプチドを使用するＥＬＩＳＡによりアッセイする。結果は図４に示されている。

図４は、ＭＡＳ−１中で製剤化された、それぞれ７および２２のペプチド−対−担体の代替比率におけるＡβ１５_（７）ＤＴおよびＡβ１５_（２２）ＤＴ複合体のマウスにおける免疫能を示す。Ａβ１５ＤＴ複合体を、７および２２モル／モルのペプチド−対−ＤＴの代替比率にて合成する。複合体およびＡβ１−４２をＭＡＳ−１アジュバント中で製剤化し、６週齢のＤＢＡ（ｎ＝４／グループ）および１２月齢のＣ５７ＢＬ／６（ｎ＝２／グループ）マウスにおける免疫能に関して、１００μｇ／０．１ｍＬのｓ．ｃ投与にて０、１４、４２および８４日目に注射して評価する。血漿Ａβ抗体をＡβ１−４０に対するＥＬＩＳＡにより測定する。

ＭＡＳ−１中のＡβ１５_（７）ＤＴおよびＡβ１５_（２２）ＤＴ複合体の両方は、ＥＬＩＳＡによる測定されるとおり、Ａβに対する迅速かつ強力な抗体反応を誘導した。抗−Ａβ力価は、ＭＡＳ−１中のＡβ１５_（２２）ＤＴでのさらなる免疫化後、上がり続けた。抗−Ａβ特異的抗体の誘導は、ＭＡＳ−１中のＡβ１−４２で見られるものより有意に優れており、それは、図１に示されているとおり、ＤＢＡ系統マウスにおいて２８日目に約５０μｇ／ｍＬである。２８日目に、両方のＡβ１５ＤＴ複合体は、ＤＢＡマウスにおいてＭＡＳ−１中のＡβ１−４２で生じたものより５倍以上高い抗−Ａβ抗体レベルを生じる。これらの結果は、ＭＡＳ−１中のＡβ１５ＤＴがＡβペプチドに対して一般的に乏しい免疫反応である高齢のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてでさえ非常に有効な免疫原であることを確認し、驚くべきことに、エピトープ−対−免疫原性担体のモル代替比率が増加すると免疫反応の効力が増加したことを示す。

結果は、免疫原性がペプチド−対−担体の代替比率、用量および投与レジメンにより影響され得ることを示す。ＭＡＳ−１中の複合体は両方とも主にＴｈ−２抗体アイソタイプを誘導し（図５）、これはＡβ１−４２のＮ−末端領域を認識し（図６）、パラフィン−包埋したヒトＡＤ脳組織切片におけるアミロイドプラークに結合する（図７）。

図６は、ＭＡＳ−１中のＡβ１−４２、Ａβ１５_（７）ＤＴおよびＡβ１５_（２２）ＤＴにより誘導される抗−Ａβ特異性のエピトープマッピングを示す。エピトープマッピングを、Ａβ１−４０コーティングＡｇウェルおよびマウスＡｂ結合のインヒビターとしてＡβペプチドフラグメントを使用する阻害ＥＬＩＳＡにより実施した。同様のＡβアイソタイプおよび特異性結果がＤＢＡマウスにて得られる。

図３は、ＭＡＳ−１中で製剤化されたそれぞれ７および２２のペプチド−対−担体の代替比率におけるＡβ１５_（７）ＤＴおよびＡβ１５_（２２）ＤＴ複合体のマウスにおける免疫能を示す。ＤＡ（６週齢；ｎ＝４／グループ）および高齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１２月齢；ｎ＝２／グループ）メスマウスに０および１４日目にｓ．ｃ．にて、０．１ｍＬのＭＡＳ−１中の１００μｇの各複合体を投与した。血液サンプルを免疫前および２８日目に採取し、Ａβ抗体力価をＥＬＩＳＡによりアッセイする。

ＭＡＳ−１中のおけるＡβ１５_（７）ＤＴおよびＡβ１５_（２２）ＤＴの０．４：１ｗ／ｗ混合物は、１４月齢の３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて有意な抗−Ａβ Ａｂ反応を誘導した（図８）。これらの動物を０．１ｍＬのＭＡＳ−１中の１００ｕｇのＡβ１５ＤＴで０、２、６および１２週目に４回ｓ．ｃ．にて免疫化し、１６週目（すなわち、１８月齢）に安楽死させる。免疫化された動物由来の脾細胞は特異的にＡβ１５ＤＴに応答したが、全長Ａβ１−４０／４２に応答せず、天然Ａβに対する免疫寛容が保存されていたことを証明する（図９）。Ａβ１５ＤＴ処置およびＭＡＳ−１プラセボグループのそれぞれの動物由来の脳切片（６／マウス）は、ＭＡＳ−１プラセボと比較してＭＡＳ−１中のＡβ１５ＤＴのアミロイドプラーク負荷において７４％減少（ｐ０．０５４３片側ステューデントｔ検定）を示した。３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおける１４月齢に海馬におけるアミロイドプラーク沈着が立証される。ワクチン接種したグループにおける有意なアミロイドプラークの実質的な非存在は、ＭＡＳ−１中のＡβ１５ＤＴでの免疫化がアミロイドプラークの減少を引き起こし、単にアミロイドプラークのさらなる増大を防止するのではなかったことを証明し、アルツハイマー病を予防および処置するためのＡβ１５ＤＴ／ＭＡＳ−１免疫化に関する潜在的有用性を示唆する。

図８は３×Ｔｇ−ＡＤマウス中の抗−Ａβレベルを描写している。３×Ｔｇ−ＡＤマウスの２つの年齢適合グループ（１４月齢；ｎ＝４／グループ；３Ｍ、１Ｆ）を、０、２、６、１２および１６週目にＭＡＳ−１中におけるＡβ１５_（７）ＤＴおよびＡβ１５_（２２）ＤＴ複合体の０．４：１ｗ／ｗ混合物（１００μｇ／０．１ｍＬ）またはＭＡＳ−１プラセボでｓ．ｃ．にて免疫化する。１７週の免疫療法後、動物を安楽死させる（アクティブ１８．５およびプラセボ１８．３月齢、各々）。抗−Ａβ１−４０抗体は、０（免疫前）、４、８および１６週目に回収された血液サンプルにおいてＥＬＩＳＡにより測定される。

これらの動物を０．１ｍＬのＭＡＳ−１中の１００ｕｇのＡβ１５ＤＴを０、２、６および１２週目に４回ｓ．ｃ．にて免疫化し、１６週目（すなわち、１８月齢）に安楽死させる。免疫化された動物由来の脾細胞は特異的にＡβ１５ＤＴに応答したが、全長Ａβ１−４０／４２に応答せず、天然Ａβに対する免疫寛容が保存されていることを証明する（図９）。

図９は脾細胞刺激アッセイを示す。３×Ｔｇ−ＡＤマウスの２つの年齢適合グループ（１４月齢；ｎ＝４／グループ；３Ｍ、１Ｆ）を、０、２、６、１２および１６週目にＭＡＳ−１中におけるＡβ１５_（７）ＤＴおよびＡβ１５_（２２）ＤＴ複合体の０．４：１ｗ／ｗ混合物（１００μｇ／０．１ｍＬ）またはＭＡＳ−１プラセボでｓ．ｃ．にて免疫化する。１７週の免疫療法後、動物を安楽死させる（アクティブ１８．５およびプラセボ１８．３月齢、各々）。

Ａβ１５ＤＴ処置およびＭＡＳ−１プラセボグループのそれぞれの動物由来の脳切片（６／マウス）は、ＭＡＳ−１プラセボと比較してＭＡＳ−１中のＡβ１５ＤＴのアミロイドプラーク負荷において７４％減少（ｐ０．０５４３片側ステューデントｔ検定）を示した。３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおける１４月齢に海馬におけるアミロイドプラーク沈着が立証される。ワクチン接種したグループにおける有意なアミロイドプラークの実質的な非存在は、ＭＡＳ−１中のＡβ１５ＤＴでの免疫化がアミロイドプラークの減少を引き起こし、単にアミロイドプラークのさらなる増大を防止するのではなかったことを証明し、アルツハイマー病を予防および処置するためのＡβ１５ＤＴ／ＭＡＳ−１免疫化に関する潜在的有用性を示唆する。

免疫原性および有効性は、種々の因子、例えば、ペプチド−対−担体の代替比率、アジュバント、油中水型エマルジョンの製剤化、用量および投与レジメンにより影響され得る。これは、これらの因子がＡＤワクチン有効性を最適化するために評価されなければならないことを示す。

図１０は、Ａβプラークに対して染色されたそれぞれの３×Ｔｇ−ＡＤマウス由来の脳切片が、ＭＡＳ−１中のＡβ１５ＤＴ複合体で免疫化された動物において海馬プラーク負荷の有意な減少を示すが、ＭＡＳ−１プラセボで免疫化された動物では示さないことを描写している。

発明者らの結果は、免疫原性および有効性が種々の因子、例えば、ペプチド−対−担体の代替比率、アジュバント、油中水型エマルジョンの製剤化、用量および投与レジメンにより影響され得ることを示す。これは、これらの因子がＡＤワクチン有効性を最適化するために評価されなければならないことを示す。

油中水型エマルジョンアジュバント／送達系
多数の因子、例えば、抗原、アジュバントおよび送達系は、特異的細胞性および体液性免疫反応を引き起こすために修飾され得る。データは、油中水型アジュバント送達系、例えば、ＭＡＳ−１中で製剤化されたＡβ１−４２が、主にＴｈ２バイアス（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂアイソタイプ）にて未処理マウスにおいて有意な体液性抗体反応を誘導することを示す（図１および２）。

しかしながら、短Ａβフラグメントは、潜在的にＡβ−特異的細胞性免疫反応を回避するが、免疫原性が乏しい。ペプチドを包含する小分子と免疫原性担体、例えば、ＤＴの複合体化は、免疫原性を増強する確立された手段であるが、ＤＴ複合体化自己エピトープは、治療的に有効であるために、アラムアジュバントよりも優れた効力を有するＴｈ−２バイアスアジュバントを必要とし得る。油中水型アジュバントエマルジョン、例えば、ＭＡＳ−１は、アルツハイマー病のためのＡβ１５ＤＴワクチンを開発するための従来の試みの有効性を限定させているＴｈ１バイアス細胞介在炎症性副作用を回避する可能性を有する一方で、Ａβ１５ＤＴ複合体化自己抗原に対する強力なＴｈ２バイアス免疫反応を誘導し得る。

１つの例において、該組成物における使用のために適当な油アジュバントビヒクルの成分は、第１の糖エステル乳化剤、例えば、マンニドモノオレエート（ＭＭＯ）またはソルビタンオレイン酸モノエステル、第２の乳化剤、例えば、水素化ヒマシ油、例えば、ポリオキシル−４０−水素化ヒマシ油（ＰＯＣＯ）、および天然かつ代謝可能な油、好ましくはスクアレンおよびスクアランを含む。代謝可能な油は、一般的に、該油の約８５重量％から約９０重量％を構成し、第１の糖エステル乳化剤は該油の約９重量％から約１２重量％を構成し、第２の乳化剤は該油の約０．５重量％から約０．７重量％を構成する。１つの例において、代謝可能な油成分は、一般的に、５０％スクアレン、５０重量％スクアランであるが、これらの成分の濃度は該成分内で変化し得る。該組成物における使用のための適当なアジュバントビヒクルは、植物源由来の天然かつ代謝可能な成分から成り、Mercia Pharma, Inc, Scarsdale, NY（www.merciapharma.com）から市販されている、ＭＡＳ−１である。

出発物質を包含する油ビヒクルの成分は、動物または植物源のいずれか、またはそれらの組合せ由来であってよく、すべて複数の提供元から市販されている。ＭＭＯに加えて、第１の乳化剤として適当な糖エステルは、ポリソルベート、特にソルビタンオレイン酸モノエステルを含む。第２の乳化剤としてＰＯＣＯに加えて、ソルビタンエステル、例えば、ソルビタンモノパルミテート、ポリソルベート、例えば、乳化剤のＴｗｅｅｎファミリーならびにＨｙｐｅｒｍｅｒＢ２３９およびＢ２４６が有用であり得る。

１つの例において、開示されるナノ粒子ワクチンエマルジョンは、一般的に、約６５重量％から約７５重量％のアジュバント油ビヒクル、および約２５重量％から約３５重量％のタンパク質抗原を含む水相を含む。該組成物のある特定の態様において、水相はワクチンエマルジョンの約２７重量％から約３３重量％を構成する。

該組成物において使用される油中水型ワクチンエマルジョンは、１つの例において、抗原を含有するエマルジョンにおける水球が、約１００ナノメートルから約１ミクロンの範囲における中央直径、および一般的に約３００ナノメートルの平均直径で、１ミクロン未満の中央直径を有するように製剤化され得る。１つの例において、アジュバントの油成分は、周知のフロイントアジュバント（不完全および完全製剤両方）の油相を含む鉱油とは異なって、好ましくは代謝可能な天然生物的油である。

記載されているワクチンエマルジョンは、高濃度の抗原（少なくとも１０ｍｇ／ｍＬまで）を許容し得るものであり、一般的に使用されるタンパク質可溶化剤（例えば、４Ｍのウレア、３０％のＤＭＳＯ）と適合性である。ＩＦＡエマルジョンと異なって、１つの例において、それらは広範なｐＨ（３−８）を有する水相と適合性であり、広範な塩濃度にわたって影響されない。ＩＦＡエマルジョン（＞１，５００ｃＰ）と異なって、該ワクチンエマルジョンは、１つの例において、流動性エマルジョンとして低粘度（＜１００ｃＰ）を有し、高精度低容量（０．１ｍＬ）投与を可能にする。記載されているワクチンエマルジョンの物理化学的特性は、１つの例において、１．０μｍ以下の球サイズ直径（Ｄ（ｖ，０．５））の中央分布を有し、水相中の高濃度のタンパク質により影響されない。

免疫原性組成物を評価するための動物モデル
遺伝子標的化トランスジェニックマウスはＡＤ病理学の種々の局面のモデリングのための重要なツールであるが、マウスモデルは神経病理学を完全には再現しない。３×Ｔｇ−ＡＤマウスは、空間的かつ文脈的学習および記憶パラダイムの両方における認知表現型における年齢依存性の減少と共に、関連脳領域においてＡβペプチドから構成されるプラークおよび過リン酸化タウタンパク質から構成される神経原線維変化の両方を生じる。したがって、それらはＡＤ治療の可能性を評価するための重要なモデルを提供する（Oddo et al., 2003）。

ペプチド免疫原Ａβ１−４２は、前臨床および臨床試験において治療抗−Ａβ抗体を誘導することが示されており、ＭＡＳ−１中のＡβ１−４２は、脳組織スライスにおいてアミロイドプラークを認識するＴｈ２バイアス抗−Ａβ抗体を誘導する。

３×Ｔｇ−ＡＤトリプルトランスジェニックマウスは、ヒト変異ＡＰＰ、タウおよびプレセニリン１を発現する。これらのマウスはＣ５７ＢＬ／６／１２９Ｓバックグラウンド起源であったが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける多数の産生のために戻し交雑されており、ほんの少し１２９遺伝子型を維持している。それらはホモ接合体であり、繁殖させることが容易であり、ヒトＡＤ脳における病理学的発達が非常に似ている時間および地域特異的プロファイルを有するＡβおよびタウ病理学が革新的に発達している。Ａβ沈着は、タウ病理学前にこれらのマウスにおいて発生し、これはアミロイドカスケード仮説と一致し、このことは、Ａβが誘導物質であり、タウ病理学がＡβ病理学の下流結果であることを規定する（Hardy and Selkoe, 2002）。

記載されている免疫治療組成物をさらに評価するために、ペプチド−対−担体代替比率に関して最適化されたＡβ１−１５：ＤＴにて、投与量決定投与レジメン試験から決定された最適用量にて、ｓ．ｃ．注射により、６月齢（若年／予防）および１４月齢（高齢／処置）の３×Ｔｇ−ＡＤマウスを免疫化してもよい。マウスは、予防試験において９月間および処置試験において５−６月間、免疫化され得る。予防および処置試験両方において、ＭＡＳ−１中のＡβ１−４２をワクチン接種したマウスグループは、ポシティブ対照として包含され、ネガティブ対照グループは、選択されたアジュバントまたはＷ／Ｏプラセボアジュバント中のＤＴで免疫化した。試験の行動的成分における変動性のため、１６匹の３×Ｔｇ−ＡＤマウスのグループサイズが必要である。

１つの例において、ＭｏｒｒｉｓＷａｔｅｒＭａｚｅを使用する行動的試験は、それぞれの試験の最後に実施すべきである。空間的学習は、プラットフォームへの待ち時間および距離により測定され得、記憶維持は、プローブ試験により測定され得るが、行動遂行とアミロイドプラーク沈着との間の相互関係は３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいてよく確立されている。

ＭＡＳ−１中のＡβ１５ＤＴでの３×Ｔｇ−ＡＤマウスの免疫化は、Ｔｈ−１優位の免疫および脳における細胞介在炎症性変化を誘導する可能性を回避する、強力なＴｈ−２優位の体液性免疫反応を誘導する。本発明の組成物によるＡβ特異的制御性Ｔ細胞の誘導は、細胞介在炎症性副作用の可能性をさらに減少させる。産生された抗体は、マウスにおける認知機能における改善と相関する脳におけるＡβの減少を引き起こす。高齢３×Ｔｇ−ＡＤマウスが一般的にあまり強力ではない免疫反応を示すことがよく認識されているので、脳Ａβが蓄積された後（１４月）に、マウスを免疫化することは、部分的にプラーク負荷を低下させるだけであることが予期されたが、実際には、微小出血に関する証拠なしに、強力なＴｈ−２優位の体液性免疫反応および同時に海馬プラーク負荷における統計的に有意な減少が見られる。

ＡＮ１７９２臨床試験由来の３つの剖検例において、実質のＡβクリアランスにもかかわらず、広範囲の血管Ａβは維持され、これらの１つは多数の脳微小出血を有した（Nicoll et al., 2003; Ferrer et al., 2004; Maliash et al., 2005）。免疫治療組成物の評価において、脳微小出血の発生はＡβモノクローナル抗体におけるマウスの受動免疫後にも観察されたので、脳微小出血の発生に細心の注意を払うべきである（Pfeifer et al., 2002, Wilcock et al., 2004, Racke et al., 2005; Lee et al., 2005）。これらの微小出血は、高用量の高親和性ｍＡｂによるＡβの実質の沈着およびその後の血管沈着の過度に迅速なクリアランスにより、ならびに、おそらく微小血管系におけるＡβｍＡｂとＡβの結合により引き起こされると考えられている。

一般的に、ＣＦＡ／ＩＦＡ中で製剤化されたＡβ１−４２でのＡＰＰ＋ＰＳ１トランスジェニックマウスの能動免疫化が微小出血における増加と関連していたことを示す最近の報告（Wilcock et al., 2007）を除いて、マウスにおける能動免疫化は脳微小出血の発生と関連していない。Asuni et al., (2006)による最近の研究によって、Ｔｈ２反応に好ましいアジュバントであるアラム中のＡβ誘導体でのＴｇ２５７６マウスのワクチン接種が、微小出血に関する証拠なしにＡβ負荷を減少させたことが示された。したがって、ＱＳ２１ベースアジュバント（ＡＮ１７９２）中のＡβ１−４２、またはＡβに対する強力な免疫反応を促進するために使用される他のＴｈ−１バイアスアジュバント製剤の場合と異なって、本明細書に記載の３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいてＭＡＳ−１中のＡβ１−４２またはＭＡＳ−１中のＡβ１５ＤＴにて観察される結果は、これらの組成物がアルツハイマー病の早期の予防および処置のための治療ワクチンとして適当であり、Ｔｈ−１介在細胞毒性または内因性標的に対する免疫自己寛容の破壊の可能性を回避しつつ、アミロイドプラーク沈着を減少または予防し、過リン酸化タウタンパク質のその後の発生を減少させる可能性を有する、非常に強力なＴｈ−２優位の免疫反応を誘導することが予期されることを予測している。

物質および方法
Ａβ１−４２ペプチド：４２残基ペプチドは固相合成を使用して製造され得る。このペプチドの配列を以下に示す：ＤＡＥＦＲ^５ＨＤＳＧＹ^１０ＥＶＨＨＱ^１５ＫＬＶＦＦ^２０ＡＥＤＶＧ^２５ＳＮＫＧＡ^３０ＩＩＧＬＭ^３５ＶＧＧＶＶ^４０ＩＡ^４２（配列番号：１）。

Ａβペプチドエピトープ：７アミノ酸残基ペプチドスペーサー（ＸＸＸＸＸＸＣ−Ｃ００Ｈ）を有する２２残基の１５−ｍｅｒＡβペプチド免疫模倣性ペプチドは、固相合成を使用して製造され得る。１５−ｍｅｒＡβ１−１５、Ａβ１６−３０、Ａβ２１−３５およびＡβ３１−４２の配列を以下に示す：

種々のスペーサーペプチドは当業者に既知であり、これらのおよび他のペプチド配列は本発明において使用され得る。米国特許第５，０２３，０７７号、第５，４６８，４９４号および第５，６８８，５０６号（これらの記載を出典明示により本明細書に包含させる）は、記載されている組成物において使用され得る有用なペプチドスペーサー配列を記載している。

ＡβＤＴ複合体：ペプチドと免疫原性担体タンパク質を複合体化する方法は当業者に周知である。例えば、米国特許第５，４６８，４９４号、第５，６８８，５０６号および第６，３５９，１１６号（これらの記載を出典明示により本明細書に包含させる）を参照のこと。

Ａβ１−１５ペプチド合成およびＡβ１５ＤＴ複合体化：Ａβ残基１−１５を含む２２ｍｅｒペプチドは、マレイミド−ＮＨＳエステル二官能性架橋剤を使用してＤＴへ連結され得る。該ペプチドは、そのＣ−末端ＣｙＳＨ残基を介して、当業者に周知の二官能性架橋剤、例えば、イプシロン−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｅＭＣＳ）架橋剤および関連する二官能性アナログ（Ｓｕｌｆｏ−ｅＭＣＳ）によりＤＴ担体へ連結され得る。高い特異性であるため、該連結メカニズムが選択されている。最初にＤＴは、ＤＴ上の遊離アミノ基に対するリンカーのスクシンイミジル部分の反応を可能にするｐＨ条件下でｅＭＣＳで活性化され、マレイミド−活性化ＤＴ（ＭＤＴ）を生産する。完了後、未反応ｅＭＣＳおよびその分解産物を除去し、活性化バッファーを、該ペプチドの遊離スルフヒドリルとＭＤＴのマレイミド基との反応に最適な連結バッファーと交換して、該ペプチドと該担体を複合体化する。次に該複合体を精製し、分析する。適当なｅＭＣＳ：ＤＴ比および活性化／連結条件の選択は、実験室および製造バッチスケールの両方にて、一貫したペプチド：担体代替比率をもたらす。それぞれの複合体は分析方法により特徴付けられ得る。該ペプチド：担体のモル代替比率は、定量アミノ酸分析および／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける移動度により測定され得る。複合体純度は、ＳＥＣＨＰＬＣおよびＳＤＳＰＡＧＥにより評価され得る。複合体同一性は、ＳＤＳＰＡＧＥのゲルのサンプルをさらに利用するウエスタンブロットおよびアミノ酸分析により試験され得る。

Ａβ１−１５ＢＳＡ複合体：スペーサー配列を有さないがＣ−末端Ｃｙｓ残基を有するＡβ１−１５エピトープは、ペプチド特異的抗体の測定のためのＥＬＩＳＡにおいて標的抗原としての使用のために、ＢＳＡと複合体化される。あるいは、Ａβ１−１５ペプチド、またはＮ末端から出発して、４２残基にわたる残基を含むＡβのより長いペプチドは、ＥＬＩＳＡにおける標的抗原として使用され得る。

動物免疫化：マウスに、周知の方法論により、１００μｌの免疫原を襟首または後肢側面に皮下的に（ｓ．ｃ．）または腹腔内に（ｉ．ｐ．）注射する。

血液および組織回収：マウスを免疫化前および免疫中に尾静脈から出血させ、血清を準備し、−２０℃で凍結させる。多量の血清の回収のため、最終的にマウスを実験の最後に心穿刺により出血させ、血清を上記の通り準備し、実験のための参照基準として使用する。３×Ｔｇ−ＡＤマウスをＣＯ_２吸入により安楽死させ、塩水で心膜内かん流する。脳を取り出し、中線に沿って半分に分ける。一方の半分の脳を、液体窒素にてスナップ状に凍結させ、生化学的試験（例えば、Ａβ ＥＬＩＳＡ）のために−８０℃にて保存する。他方の半分の脳を、ＲＴにて２時間ＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒドで滴下固定し、４℃にて１０−３０％のスクロースにてスクロース保護し(sucrose protected)、そして低温切開片のためにＯＣＴ（Tissue Tek）中に包埋するか、または、ＲＴにて２時間１０％の中性緩衝ホルマリンで滴下固定し、ＴＢＳにて洗浄し、脱水し、脂質を除去し（Histoclear）、そしてパラフィン矢状切片のためにパラフィン中に包埋する。６−１０ミクロン矢状低温切開片および１２−ミクロンパラフィン連続切片をカットし、染色のために保存する。増殖およびサイトカイン分析のための脾臓組織を無菌条件下で取り出す。

マウス脾細胞増殖アッセイ：脾細胞をＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ（Cederlane, Hornby, ON, Mayada）における単一細胞懸濁液の遠心分離により調製する。２×１０^６／ｍｌの濃度における脾細胞を１０％のＦＢＳを補ったＲＰＭＩ中で培養し、９６ウェルプレート中においてＡβ１−１５、Ａβ１−４２およびＤＴおよびＡβ１５ＤＴ（０−５０μｇ／ｍｌ）で刺激する。細胞の生存能力を保証するために、ＣｏｎｍａｙａｖａｌｉｎＡをポシティブ対照として使用する。培養上清を４８時間でサイトカインＥＬＩＳＡのために回収する。培養７２時間後、１μＣｉ［^３Ｈ］チミジンをそれぞれのウェルに加え、細胞をさらに１８時間培養する。プレートウォッシャーを使用して細胞を回収し、液体シンチレーションカウンターを使用して放射能を測定する。以下の式：ペプチド抗原がある場合のカウント毎分（ＣＰＭ）／抗原無しにおけるＣＰＭを使用して、刺激指数（ＳＩ）を計算する。

ＥＬＩＳＡによるマウス血清における抗Ａβ抗体の測定：プレートを正常マウスＩｇＧ（標準曲線）および２μｇ／ｍｌのＡβ１−４２ペプチドでコーティングし、一晩４℃でインキュベートする。次にプレートを、２時間ＲＴで５％のヤギ血清、１％のＢＳＡおよび０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０でブロックする。洗浄後、マウス血清の希釈物をウェルに加え、２時間ＲＴでインキュベートする。ＨＲＰと複合体化したヤギ抗−マウス（Kirkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD）を二次抗体として使用し、１時間ＲＴでプレート上でインキュベートする。発色基質である３，３’、５．５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の添加３０分後、反応を０．５ＭのＨＣｌで停止させ、プレートをプレートリーダーにて４５０ｎｍで読む。アイソタイプ分析：定量アイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＡおよびＩｇＭに対するアイソタイプ特異的二次抗体（Zymed, San Francisco, CA）を用いて行い、上記標準ＥＬＩＳＡに対して適当なアイソタイプ（Southern Biotechnology, AL）の標準曲線をあてはめる。

ヒトおよびマウス脳におけるＡβプラークの検出：免疫化および対照マウス由来の血清を１：１００から１：１０，０００に連続希釈し、プラークおよび血管アミロイドの免疫組織化学的検出のために、ヒトＡＤおよびＪ２０ＡＰＰトランスジェニックマウス脳切片に適用する。ビオチン化ヤギ抗−マウス二次抗体をＡＢＣＥＬＩＴＥＨＲＰ標準（ＡおよびＢ）と共に使用し、視覚化のためにＤＡＢと反応させる。隣接切片をＡβ抗体、例えば、Ｒ１２８２（一般的なＡβポリクローナル、Selkoe lab）または６Ｅ１０（モノクローナルＡβ１−１７、Covance Research Products, Dedham, MA）で標識する。

Ａβタンパク質ＥＬＩＳＡ：脳における可溶性および不溶性Ａβ４０およびＡβ４２レベルを、製造業者の指示（Covance Research Products, Inc, Berkeley, CA.）にしたがってＥＬＩＳＡキット（Signet）により測定する。スナップ状に凍結された全脳半球を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche, Indianapolis, IN）を含む４容量のＰＢＳ中でホモジェナイズする。ホモジネートを３０分間４℃で１００×ｇにて回転させる。上清を、ＥＬＩＳＡにより、可溶性Ａβレベルに関して分析する。ＰＢＳペレットを、１０容量のグアニジンバッファー（５ＭのグアニジンＨＣＬ、５０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８．０）中で再懸濁する。サンプルを４時間ＲＴで混合する。次に脳ホモジネートをカゼインバッファー（０．２５％のカゼイン、５ｍＭのＥＤＴＡ、ＰＢＳ中のプロテアーゼ阻害剤カクテル）にて１：１０に希釈し、混合し、１６，０００×ｇで２０分間回転させる。さらなる希釈物を０．１％のＢＳＡを有する０．５Ｍのグアニジンバッファーにて作り、不溶性ＡβレベルをＥＬＩＳＡにより測定する。

免疫組織化学、組織学および画像分析：ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＥＬＩＴＥＡＢＣ方法（Burlingame, CA）および色素(chromagen)としてＤＡＢを使用して、免疫組織化学を行う。簡潔に言えば、パラフィン切片をＨｉｓｔｏｃｌｅａｒ（National Diagnostics, Atlanta, GA）にて脱パラフィン処理し、エタノール−水勾配にて再水和する。低温切開片を解凍し、１５分空気乾燥させ、穏やかにＴＢＳで洗浄する。この時点から、染色方法はパラフィン切片および低温切開片両方に関して同じである。内因性メタノールをクエンチし、切片をＴＢＳ中の１０％の血清にてブロックし、切片を４℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートする。

次に、切片をＴＢＳで洗浄し、３０分間ＲＴでビオチン化二次抗体（Vector Labs）とインキュベートし、ＴＢＳで洗浄し、３０分間ＲＴでアビジン−ＨＲＰ複合体（Vector Labs）とインキュベートし、次にＤＡＢにて発現させる。

切片を、ヘマトキシリン（画像分析のための場合を除いて）で対比染色し、脱水し、洗浄し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Fisher）でカバースリップ(coverslipped)する。二重免疫蛍光を、２％の血清でブロックし、２つの一次抗体（ＭｏＡｂおよびＰＡｂ）と混合して、一晩４℃で切片に適用し、０．１ＭのＴｒｉｓで濯ぎ、Ｔｒｉｓ中の２％の血清でブロックし、２つの蛍光標識二次抗体と混合し、２時間ＲＴで切片に適用し、Ｔｒｉｓで２回濯ぎ、１０分間暗下で７０％のエタノール中の０．３％のＳｕｄａｎＢｌａｃｋＢ中で切片をインキュベートし、ＴＢＳで洗浄し、水で洗浄し、暗下で１時間ホルマリンで固定し、水で洗浄し、Ｈｙｄｒｏｍｏｕｎｔ非蛍光性水性媒体（National Diagnostics, Atlanta）でスライドをカバースリップすることにより行う。

乾燥を防ぐために、カバースリップを透明なマニキュア液で密閉する。ＩＨＣおよびＩＦに対するネガティブ対照は、一次抗体の省略または一次抗体としてマウスＩｇＧを使用するものを含んだ。Ａβの免疫組織学的検出のための一次抗体および炎症のマーカーを以下に記す。

免疫組織化学のための一次抗体：Ａβ（R1282, Dr. Selkoe, Brigham and Women’s Hospital, Boston）；Ａβ４０、Ａβ４２および６Ｅ１０（BioSource and Covance Research Products）、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）Ｍａｂ（Dako, Denmark）、ミクログリア／マクロファージＭａｂ［ＣＤ４５（Serotec）、ＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１（Serotec）、ＭＨＣＩＩ（PharMingen）、Ｆ４／８０（Serotec）、ＦｃｇＲＩＩ−ＣＤ１６およびＩＩ−ＣＤ３２（PharMingen）］、Ｂ細胞（CD40, Novacastra Laboratories, UK）、Ｔ細胞（CD5, CD3; Serotec）、ＡＰＰＭａｂ（IG6, Covance Research Products）、ホスホ−タウ（AT8, Innogenetics）、マウスＩｇ（ヤギ抗−マウスＩｇＧ）。

組織学的染色：脳切片における原線維Ａβタンパク質を検出するためのチオフラビンＳ染色は、スライドを１０分間チオフラビンＳの１％水溶液とインキュベートし、次に８０および９５％のエタノール、ならびに蒸留水にて濯ぐことにより行う。微小出血を検出するためのヘモシデリン染色は、水和切片を１５分間２％の塩酸中の２％のフェロシアン化物とインキュベートすることにより行う。脳、肺、心臓、肝臓および脾臓切片における単核細胞浸潤を評価するために、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用する。

定量画像分析：Ａβプラーク負荷およびグリオーシスのコンピューター支援定量化を、以前に記載された（Weiner et al., 2000）とおりに、IP Lab Spectrum 7.1 Image Analyzer(Fairfax, VA)を使用して行う。免疫標識化切片の４対８矢状画像を、Ｌｅｉｃａモーター駆動ステージおよびＳＰＯＴカメラを備えたＮｉｋｏｎ顕微鏡を使用して、それぞれのマウス脳において等距離レベル（〜１００μｍ離れて）にて撮る。１つの実験に関する全ての画像を、画像分析を通して一定に保持されている閾値で同じ日に撮る。免疫反応により占められるパーセントエリア（上記閾値）を計算する。

提供されている例の他の組合せおよび変化は、本記載に基づいて明らかになるであろう。記載されている態様の多数の可能な組合せおよび変化の全てについて具体的な例を提供することは不可能であるが、このような組合せおよび変化は、結局、特許請求の範囲である。

Claims

免疫原性担体と複合体化しているヒトＡβ１−１５ペプチドを含む免疫原を含む、アルツハイマー病の処置または予防のための免疫治療組成物であって、
該担体は、ＤＴ、ＴＴおよびＫＬＨからなる群から選択され、
該ペプチドは、免疫原性担体と複合体化しており、
該免疫原は、油アジュバントビヒクルを含む油中水型エマルジョン中で製剤化され、
該油アジュバントビヒクルは、スクアレン、スクアランおよびマンニドモノオレエートを含み、
該免疫原は、約１００ナノメートルから約１ミクロンの中央直径を有する水球内に含まれている、免疫治療組成物。
平均水球直径が約３００ナノメートルである、請求項１に記載の免疫治療組成物。
免疫原性担体タンパク質がＤＴを含み、そしてＡβペプチド１−１５残基−対−担体の複合比率が１モルの担体あたり約５から約３０モルのペプチドである、請求項１または２に記載の免疫治療組成物。
複合比率が７：１または２２：１であるか、または約５：１から約２５：１の範囲内の複合比率における複合体の組合せである、請求項３に記載の免疫治療組成物。
ヒト患者におけるアルツハイマー病の処置または予防のための、請求項１から４のいずれかに記載の免疫治療組成物。
Ａβ１−４２ペプチドである免疫原を含む、ヒト患者におけるベータ−アミロイドプラークを減少させるための免疫治療組成物であって、
該ペプチドは、Ｔｈ２バイアス(biased)アジュバント中で製剤化され、
該Ｔｈ２バイアスアジュバントは、スクアレン、スクアランおよびマンニドモノオレエートを含む油中水型エマルジョンであり、
該エマルジョンは、水球を含み、
該水球の平均直径は、約３００ナノメートルである、免疫治療組成物。
ペプチドがＡβ残基１−１５ペプチドである、請求項６に記載の免疫治療組成物。
Ａβ１−１５ペプチドが免疫原性担体タンパク質と複合体化している、請求項７に記載の免疫治療組成物。
担体タンパク質がＤＴ、ＴＴまたはＫＬＨである、請求項８に記載の免疫治療組成物。
担体タンパク質がＤＴであり、そしてＡβ１−１５−対−ＤＴの複合比率が１モルの担体あたり約５から約３０モルのペプチドである、請求項９に記載の免疫治療組成物。
アジュバントがＭＡＳ−１である、請求項６−１０のいずれかに記載の免疫治療組成物。
ヒト患者におけるベータ−アミロイドプラークを減少させるための薬剤の製造のための、請求項６−１１のいずれかに記載の免疫治療組成物の使用。