CN102256620B - 用于治疗阿尔茨海默氏病的免疫治疗组合物 - Google Patents

用于治疗阿尔茨海默氏病的免疫治疗组合物 Download PDF

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Abstract

公开了一种用于预防、减缓、终止或者逆转人类患者中阿尔茨海默氏病的进程的安全并有效的疫苗。疫苗包括配制在油包水Th2偏向的佐剂/递送系统中的与免疫原性载体(例如DT)缀和的Aβ1‑42或者β淀粉状蛋白自身表位(例如，Aβ1‑15或者其他来源于Aβ1‑42的7聚体或者15聚体肽表位)。

Description

用于治疗阿尔茨海默氏病的免疫治疗组合物
相关申请的引用
本申请要求2008年8月7日提交的美国临时专利申请系列号61,086,938的优先权，将该临时专利申请的公开在本文中引入作为参考。
发明领域
本发明涉及用以预防、减缓、停止或者逆转阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)(AD)的进程的安全并有效的疫苗。AD以β淀粉状蛋白(Aβ)沉积物沉积在脑中为特征。通过Aβ1-42疫苗(AN1792)的Aβ清除已经显示在临床上是有希望的，但是一部分患者经受了限制性炎症作用。自身抗原如Aβ是低免疫原性的，需要有效的佐剂例如QS21，在AN1792疫苗中使用的皂苷，其诱导Th1偏向的应答。明矾——经批准的Th2偏向的佐剂——对自身抗原表现不佳。
发明背景
阿尔茨海默氏病是以认知功能的渐进性损失为特征的神经变性疾病，且是老年人中痴呆最常见的类型，影响了所有痴呆患者的几乎一半。
因此，高龄是AD的主要危险因素。65岁的人之中，2-3％表现出疾病的病征，而25-50％85岁的人具有AD的症状，并且甚至更多的人在没有特征性症状的情况下，具有该疾病的一些病理学特征。65岁以后，每5年，患病的可能性就翻一倍。在美国，85岁以上AD的比例是AD人群的最快增长部分，尽管目前的估计表明75-84岁的老年人群与85岁以上的人群具有大约相同数目的患者(Herbert等，2003)。阿尔茨海默氏病协会(Alzheimer’s Association)最近报道，在美国存在多于5百万患AD的人(阿尔茨海默氏病协会，2007)。这一数字期望到2050年达到3倍。
目前，政府机构对AD患者的护理费用是相当大的，并且增长迅速：到2010年，用于AD的医疗保险方案支出期望增长到493亿美元(比2000年的费用增加54％)，并且医疗补助方案支出将增长到330亿美元(比2000年增加80％)。已经报道，AD每年花费美国企业610亿美元。在该数额中，由于工人成为AD患者的亲属的照顾者时的生产力损失和替代费用的年度费用估计为365亿美元。这些费用既不能反映家庭护理者的经济损失(例如，失去收入)，也不能反映与提供临终护理的家庭成员中情绪压抑相关的代价。目前还不能治愈AD，并且虽然可用的药物为一些患者提供了相当小的症状性益处，但是并没有减缓疾病进程。
AD以脑淀粉状蛋白β(Aβ)蛋白质沉积、神经斑、神经胶质细胞活化和由超磷酸化的tau蛋白组成的神经原纤维缠结为特征(Selkoe，2001)。流行病学的、病理学的和遗传学的证据表明，Aβ在AD的发病机理中具有关键性的作用(Golde，2003)。用在弗氏佐剂中的聚集的Aβ1-42肽腹膜内注射免疫淀粉状蛋白前体蛋白质(APP)转基因小鼠导致脑Aβ的降低(Schenk等，1999)。也已经报道了用Aβ1-40肽鼻内免疫接种后，在PDAPP-tg小鼠中降低的脑Aβ水平(Lemere等，2000；Weiner等，2000)。之后不久，一些报道证实了抗体介导的Aβ清除的重要性以及其在改善认知中的作用(Bard等，2000；Janus等，2000；Morgan等，2000；Dodart等，2002)。此外，在用使用多种佐剂进行Aβ免疫(Lemere等，2002；Cribbs等，2003；Lemere等，2000，2002，0203；Spooner等，2002；Maier等，2005；Ghochikyan等，2006)和通过DNA免疫(Ghochikyan等，2003，Zhang等，2003，Okura等，2006，Frazer等，2007)后已经诱导了抗Aβ抗体。除主动的免疫策略外，在AD的小鼠模型中，用针对Aβ的抗体的被动免疫也已经显示出可以从脑清除Aβ，并与改善认知功能有关(Bard等，2000，DeMattos等，2001)。这些令人鼓舞的动物数据一起导致多中心Aβ疫苗(AN1792)临床试验(Schenk，2002；Orgogozo等，2003；Gilman等，2005)。
AN1792疫苗在两方面存在缺陷。首先，AN1792仅在300名接受治疗的患者的59人中诱导了有效的免疫应答，第二，当18名(6％)经治疗的受试者经历脑膜脑炎症状时，临床试验不得不终止(Schenk，2002；Orgogozo等，2003；Gilman等，2005)。来自接受了AN1792接种的受试者的尸检病例报告显示与对照相比具有强烈降低的斑块数目的区域(Nicoll等，2003；Ferrer等，2004；Masliah等，2005)。然而，在两例病例中，在柔脑脊膜、血管周围间隙和脑实质中存在T细胞浸润(主要是CD4+和很少的CD8+细胞)，表明针对AN1792接种的T细胞介导的免疫应答。尽管在临床前研究中没有观察到神经炎症，但最近的报道表明，用Aβ和百日咳菌毒素免疫接种C57BL/6小鼠诱导了自身免疫脑膜脑炎，其具有与在用AN1792免疫接种的人类中观察到的那些症状类似的特征(Furlan等，2003)。对AN1792试验的随访研究显示，产生了与Aβ斑块结合的抗体的AD患者显示出显著放缓的认知功能下降速率。这些发现表明，通过主动免疫产生抗Aβ抗体是AD有希望的免疫治疗方法，条件是可以在这些老年患者中诱导出强烈的免疫应答，并且过多的细胞介导的免疫反应最小以避免不想要的神经炎症。Aβ抗体降低脑中Aβ负担的精确机制还不知道，但是假说包括通过小神经胶质的Fc受体介导的吞噬作用、淀粉状蛋白纤丝的溶解或者循环Aβ的螯合导致了Aβ从脑中增加的净流出(Vasilevko和Cribbs，2006)。显而易见，无论何种机制，主动或被动的免疫治疗具有在AD中清除Aβ并改善认知功能的潜力。
已经研发了主动免疫方案以最小化T淋巴细胞介导的免疫反应并最大化抗体产生。在人类(Geylis等，2005)、猴子(Lemere等，2004)和小鼠(Lemere等，2000；McLaurin等，2002；Agadjanyan等，2005)中B细胞表位位于Aβ1-15区域，而T细胞表位已经在Aβ15-42内作图(Cribbs等，2003；Monsonego等，2003)。因此，跨B细胞表位而非T细胞表位的Aβ片段可以是更安全的免疫原以潜在地避免有害的抗Aβ细胞免疫应答。已经研究了许多方法以增强这些较短的Aβ片段的免疫原性，例如缀和B细胞表位Aβ1-15到通用辅助T细胞表位PADER上(Agadjanyan等，2005；Ghochikyan等，2006)、提供添加赖氨酸残基扩增和谷氨酸替代以降低β折叠含量(Siguardsson等，2001，2004)或者递呈为多拷贝(Zhou等，2005)。最近，已经描述了 AD免疫治疗疫苗，其中用外源 表位取代了Aβ1-42固有的自身Th表位(Wang等，2007)。来自猕猴中重复计量毒性研究的结果没有显示出用这种Aβ1-14 疫苗免疫接种后的免疫毒性或者整体毒性的证据。
树状聚体Aβ1-15(dAβ1-15)是有效的免疫原，其由分枝赖氨酸核心上16个拷贝的Aβ1-15组成，所述核心包括Aβ特异的B细胞表位但缺乏T细胞表位。使用实验佐剂LT(R192G)(突变的大肠杆菌热不稳定的肠毒素)，用dAβ1-15鼻内(i.n.)免疫(Dickinson和Clements，1995)，在J20APP-tg小鼠中造成了强烈的体液免疫应答，脑斑块负担显著降低(Seabrook等，2006)。当在小鼠中用LT(R192G)佐剂皮下注射dAβ1-15时，诱导了体液免疫应答，具有主要是IgG1同种型和较低水平的IgG2a和IgG2b的抗Aβ抗体，所述抗Aβ抗体与来自AD患者的脑组织中的脑Aβ斑块结合(Seabrook等，2006)。在另一研究中，使用LT(R192G)佐剂，用串联重复的两个赖氨酸连接的Aβ1-15序列(2×Aβ1-15)鼻内免疫接种，在hAPP小鼠中降低了脑Aβ负担和认知缺陷，不存Aβ特异的细胞免疫应答(Maier等，2006)。
除使用具有较少固有神经毒性的短Aβ衍生物外，可以将免疫应答导向Th2表型的佐剂也对设计安全的、免疫原性强烈的且有效的AD疫苗是关键的(Cribbs等，2003；Ghochikyan等，2006)。QS21——已知诱导强的Th1体液免疫应答(在小鼠中的IgG2a抗体)的佐剂用于AN1792试验中，并且可能有助于在其临床评价期间观察到的T细胞介导的炎症。到目前为止，许多在动物中的研究集中于通过使用产生混合的Th1/Th2免疫应答的强佐剂，例如CFA/IFA得到好的抗体滴度。已经显示，当配制于明矾(偏向Th2的佐剂)中时，与通用辅助T细胞表位(PADRE)串联的Aβ1-15(PADRE Aβ1-15-MAP)主要产生了IgG1抗体同种型，但得到了比配制在Quil A(主要产生IgG2a同种型的偏向Th1的佐剂)中时弱的免疫应答(Ghochikyan等，2006)。尽管还没有报道皮下或者肌内途径后，针对Aβ的强烈Th2型体液应答，但是在用使用LT(R192G)佐剂的Aβ肽鼻内免疫接种后，在APP/TG小鼠中的Th2型体液应答与显著减少的脑Aβ斑块负担、减少的局部小神经胶质和星形胶质细胞的活化以及降低的神经炎性营养不良(neuritic dystrophy)相关(Weiner等，2000)。因此，原则上，在AD人群中诱导强烈的Th2偏向的免疫应答的抗Aβ疫苗应当对治疗AD是有效的。
发明概述
诱导强烈的Th2偏向的免疫应答而又避免有害的炎性Th1偏向的细胞免疫应答的抗Aβ疫苗对治疗AD可能是有效的。在合适的佐剂中的Aβ1-42也可以达到这种结果。此外，缺乏Th1表位的B细胞特异的短Aβ肽表位由于避免了潜在有害的炎性细胞免疫应答，对用于AD的有效免疫治疗方案是有希望的候选物。然而，此种肽自身表位需要额外的T细胞辅助，并额外地需要强的Th2偏向的佐剂以在人类中驱动想要的免疫应答和产生高滴度的抗Aβ抗体。本发明提供了在油包水乳液型Th2偏向的佐剂/递送系统中的Aβ肽表位例如Aβ1-42，以避免或者抑制Th1偏向的细胞介导的炎症。本发明的一个实施方案涉及缺少Th1表位、与免疫原性载体(DT)缀合以形成Aβ15DT缀合物的自身表位(Aβ1-15)，然后将其配制于油包水乳液佐剂/递送系统中以诱导Th2偏向的免疫应答。在一个实例中，免疫原性组合物可以通过皮下或者肌内注射施用给患者。
公开的免疫治疗组合物涉及免疫原，其包括：配制在油包水乳液型佐剂中的Aβ1-42或者来源于其的氨基酸残基，包括通过C末端肽间隔区与免疫原性载体例如白喉毒素(DT-经批准的儿童和成人疫苗的组分)偶联的Aβ的1-15个氨基酸残基。组合物被设计成诱导针对Aβ的中和抗体同时避免Th1偏向的细胞毒性T细胞介导的炎症。
附图简述
图1A和B描述了免疫后血浆中的抗Aβ1-42抗体水平和Ig同种型。
图2显示了来自用在CFA/IFA、IFA或者MAS-1佐剂中的Aβ1-42免疫的小鼠的血浆与来自APP Tg小鼠的脑切片中的Aβ斑块的结合。
图3显示了配制在MAS-1中的分别为7和22的肽与载体取代率的Aβ15(7)DT和Aβ15(22)DT缀合物在小鼠中的致免疫力。
图4显示了配制在MAS-1中的分别为7和22的肽与载体取代率的Aβ15(7)DT和Aβ15(22)DT缀合物在小鼠中的致免疫力。
图5描述了在C57BL/6小鼠中通过MAS-1中的Aβ1-42、Aβ15(7)DT和Aβ15(22)DT诱导的抗Aβ同种型。
图6显示了通过MAS-1中的Aβ1-42、Aβ15(7)DT和Aβ15(22)DT诱导的抗Aβ特异性的表位作图。
图7显示了来自用MAS-1中的抗Aβ1-42、Aβ15(7)DT和Aβ15(22)DT免疫的DBA小鼠的血浆对人类AD斑块可比较的抗Aβ免疫反应性。
图8描述了3×Tg-AD小鼠中的抗Aβ水平。
图9显示了脾细胞刺激测定。
图10描述了Aβ斑块染色的每3×Tg-AD小鼠的脑切片。
发明详述
在发明详述中提供的实施例和图仅是例子，其不应当以任何权利要求构造或者解释限制权利要求的范围。
AD治疗疫苗
将小分子包括肽与免疫原性载体例如DT缀合是已建立的增强其免疫原性的方法。然而，为了使得自身抗原缀合物在人类中强的免疫原性，还需要用合适的佐剂配制。MAS-1，是从Mercia Pharma公司可得到的包含二缩甘露醇一油酸酯、鲨烯和鲨烷的油包水乳液佐剂系统。研发了MAS-1用于在人类中与自身抗原缀合物构建体一起使用以产生治疗性疫苗，所述治疗性疫苗在不诱导细胞介导的细胞毒性或者破坏针对疫苗的自身组分的免疫自身耐受的情况下刺激对自身抗原持续的中和抗体应答，并且是良好耐受的和无全身性毒性。
基于二缩甘露醇一油酸酯的佐剂是商业可得到的，例如从许多来源可得到的不完全弗氏佐剂(IFA)和从法国巴黎的SEPPIC公司可得到的ISA51和ISA 720。油包水型乳液佐剂也可以用从许多来源(例如Combe公司的Aelacel商标下)商业可得到的二缩甘露醇一油酸酯以及鲨烯和鲨烷(来自一些商业来源)配制。可以配制在公开的组合物中使用的油包水佐剂以便使在运载抗原的乳液中的含水小球具有小于1微米的直径中值(直径中值范围大约为100纳米至大约1微米，且一般地平均直径为大约300纳米)。MAS-1的油性组分是可代谢的天然存在的生物油，不同于包含熟知的弗氏佐剂(不完全制剂和完全制剂二者)的油相的矿物油。
许多载体蛋白质例如但不限于，白喉毒素(DT)、CRM197(Wyeth)-DT的突变形式、破伤风类毒素(TT)和匙孔血蓝蛋白(KLH)都可以在本发明的组合物中使用。DT是优选的载体蛋白质，因为它被批准在儿童和成人疫苗中使用，具有极好的安全记录，并由许多商业来源根据cGMP大量生产。
佐剂/递送系统的特异性
几十年来，弗氏佐剂乳剂(CFA/IFA)是衡量其他佐剂的标准。CFA并不适合于在人类中使用，特别是因为其分枝杆菌组分诱导的强烈的炎症反应；尽管如此，IFA已经在临床试验中使用，但是还没有被批准用于任何的人类适应症。然而，通常认为这些油包水(W/O)乳剂是有效的佐剂，并广泛地在动物研究中使用。
明矾是目前美国唯一批准的具有避免细胞介导的细胞毒性的Th2偏向的佐剂，但是由于致免疫力不足，明矾不适合作为用于自身表位缀合物疫苗的佐剂。基于矿物油的IFA型佐剂例如ISA 51作为在治疗慢性疾病情况中重复使用的佐剂存在缺点，因为IFA的矿物油沉积物残存在注射位点并可以导致囊肿的形成。
特别研发了MAS-1佐剂/递送系统用于加强对人类中低免疫原性的自身抗原的体液应答。在免疫原性方面，MAS-1佐剂乳剂比明矾明显更有效，并且比得上或者优于IFA乳剂，但是在肌内或者皮下注射后，MAS-1比IFA被明显更好地耐受并且具有极好的药物物理化学特性。这些包括用于高效抗原递呈的均质小球大小分布、有助于低体积剂量的低黏度和在冷藏温度下延长的稳定性，有助于经过标准冷链程序的分配。
不同于IFA，MAS-1由天然且可代谢的组分组成，其提供了疫苗贮库，并因此促进延长的有效的免疫刺激。MAS-1最终从注射位点中清除。无论是大量制备还是作为点使用的单一单位，MAS-1乳剂都是强烈的、可再生的和稳定的，并且可以以制剂生产，其具有携带直径中值小于1微米和一般地大约300纳米的抗原的含水小球。相比之下，IFA乳剂以制剂施用，所述制剂具有直径大约3至10或者甚至50微米的含水小球，在乳剂稳定性中伴随着易变性，并且IFA是高粘度的，使得小体积给药和大规模的批量生产很困难。
在MAS-1中配制的Aβ1-42肽疫苗
将Aβ1-42疫苗(AN1792)配制在基于QS21的佐剂中。QS21(强的Th1偏向的佐剂)可能有助于AN1792疫苗的炎症副作用。评价了配制在MAS-1中的Aβ1-42促进针对脑组织中淀粉状蛋白斑块强烈的Th2偏向的抗体应答，同时避免产生与Th1应答有关的β淀粉状蛋白特异的细胞介导的免疫的能力。
图1A和B描述了免疫后的血浆中抗Aβ1-42抗体水平和Ig同种型。
1(A)在第0天、第14天、第42天和第84天用100ug Aβ1-42皮下免疫接种雌性DBA小鼠，并通过ELISA测量了在基线、第28天、第56天和第98天血浆中的抗Aβ1-42抗体和B)在第98天的Ig同种型。
通过标准的固相肽合成方法合成Aβ1-40和Aβ1-42肽抗原。在第0天、第14天、第42天和第84天用配制在MAS-1、CFA/IFA或者IFA中的100μg Aβ(75μg Aβ1-40和25μg Aβ1-42)皮下(s.c.)注射DBA2小鼠(n＝4)。在第0天、第28天、第56天和第98天通过ELISA测定血浆中的抗体滴度。结果显示，在第28天、第56天和第98天，配制在MAS-1中的全长Aβ诱导了优于IFA的强烈的抗体滴度(图1A)。
通过标准的固相肽合成方法合成Aβ1-40和Aβ1-42肽抗原。在第0天、第14天、第42天和第84天用配制在MAS-1、CFA/IFA或者IFA中的100μg Aβ(75μg Aβ1-40和25μg Aβ1-42)皮下(s.c.)注射DBA2小鼠(n＝4)。在第0天、第28天、第56天和第98天通过ELISA测定血浆中的抗体滴度。结果显示，在第28天、第56天和第98天，配制在MAS-1中的全长Aβ诱导了优于IFA的强烈抗体滴度(图1A)。在CFA/IFA中的Aβ1-42(阳性对照)，如所期望地产生了比MAS-1或者IFA制剂更快速的和最初更高的抗体水平。对MAS-1和IFA制剂二者的应答在整个研究中都在增加，并且在第98天取得最终的血液样品的时候还没有达到平台期；第98天的样品的同种型分型显示，CFA/IFA诱发了混合型Th1/Th2免疫应答，分别具有IgG2a和IgG2b抗体的显著滴度。然而，MAS-1和IFA制剂诱发了Th2主导的应答，以IgG1为优势的同种型，伴随IgM、低水平的IgG2b，以及仅非常低水平的Th1型IgG2a抗体(图1B)。来自用CFA/IFA、IFA和MAS-1中的全长Aβ1-42免疫的小鼠的血浆与来自APP Tg小鼠的脑切片中的人类Aβ斑块显示出同等水平的结合(图2)，表明Th2优势抗体同种型有效地识别了淀粉状蛋白斑块，说明偏向Th2的疫苗具有降低淀粉状蛋白斑块负担同时避免Th1介导的毒性的潜力。
图2显示了来自用CFA/IFA、IFA或者MAS-1佐剂中的Aβ1-42免疫的小鼠的血浆与来自APP Tg小鼠的脑切片中的Aβ斑块的结合。在第98天从在第0天、第14天、第42天和第84天用CFA/IFA、IFA和MAS-1中的Aβ1-42免疫的小鼠中取得的血浆同等地结合来自APP Tg小鼠的脑切片中的脑Aβ斑块(下图)。免疫前血浆用作对照且没有结合脑Aβ斑块(上图)。
来自用CFA/IFA、IFA和MAS-1中的全长Aβ1-42免疫的小鼠的血浆与来自APP Tg小鼠的脑切片中人类Aβ斑块显示出同等水平的结合(图2)，表明Th2优势抗体同种型有效地识别了淀粉状蛋白斑块，说明Th2偏向的疫苗具有降低淀粉状蛋白斑块负担同时避免Th1介导的毒性的潜力。
AβDT缀合的疫苗
肽表位选择：靶向AβB细胞表位同时避免Aβ特异的T细胞表位是一些研究者追求的策略，以避免在用纤丝状的全长Aβ1-42进行的AH1792临床试验中看到的一些副作用。已经表明Aβ1-15序列编码有关B细胞表位(Geylis等，2005；Lemere等，2004；Lemere等，2000；McLaurin等，2002；Agadjanyan等，2005)。可以将该序列与免疫原性载体缀合以改善免疫原性。
在图1A、1B和2中显示的数据表明，当将Aβ1-40和Aβ1-42配制在MAS-1佐剂或者IFA佐剂中时，这些Aβ疫苗可以诱导Th2主导的免疫应答。然而，配制在CFA中的Aβ1-40和Aβ1-42也诱导了诱导显著的Th1免疫应答，其造成了如在AN1792疫苗中用配制在QS21佐剂中的Aβ1-40和Aβ1-42所报道的Th1细胞介导的炎症。因此，基于这些结果，包含来源于Aβ氨基酸残基16到40和16到42的Aβ表位序列的缀合Aβ疫苗，当与合适的免疫原性载体缀合时，当配制为基于MAS-1或者IFA的疫苗时可以期望诱导强烈的且安全的Th2主导的免疫应答。同样地，当将这些构建体用明矾(经批准的Th2偏向的佐剂)配制时，也可以期望地产生Th2主导的免疫应答。这些表位序列一般可以含有来源于Aβ序列1-40和1-42的7至15个连续的氨基酸残基。
免疫原性载体选择：当配制在Th2偏向的明矾佐剂中时，缺乏辅助T细胞表位的Aβ1-15肽是低免疫原性的(Agadjanyan等，2005)。这可能对于配制在MAS-1中的Aβ1-15肽是事实，因为配制在IFA中的Aβ1-14在豚鼠中已经显示出为弱免疫原，除非通过与匙孔血蓝蛋白(KLH)载体蛋白质或者外源UBITh表位连接来提供外来的T细胞辅助(Wang等，2007)。类似地，包含来源于Aβ1-40和Aβ1-42的7至15个氨基酸残基的Aβ肽，当配制在IFA、MAS-1或者明矾佐剂中时，也被预测是低免疫原性的。
短的非免疫原性的肽的免疫原性一般可以通过与Th表位例如合成的PADRE构建体(Agadjanyan等，2005)或者与免疫原性载体蛋白例如突变的霍乱B毒素(CBT)、KLH、突变的白喉毒素(CRM)或者与类毒素例如破伤风类毒素(TT)或者白喉类毒素偶联来增强，所有这些物质都含有Th表位以为IgG产生和免疫记忆提供T细胞辅助。在该AD疫苗中，挑选DT作为免疫原性载体，因为它已经被批准在儿童和成人疫苗中使用，并且作为符合GMP的组分是可得到的。在一个实施方案中，使用双功能交联剂，将Aβ肽表位通过具有末端半胱氨酸残基的7个残基间隔区序列通过该末端半胱氨酸残基的巯基部分与DT缀合。在其他的实施方案中，没有7残基间隔区序列但是以半胱氨酸残基结束的Aβ表位可以通过其巯基部分与免疫原性载体缀合。备选的偶联化学是本领域熟知的，例如碳二亚胺化学，也可以用于实现Aβ表位与免疫原性载体的缀合。
Aβ15DT缀合物的合成：结果表明，免疫原性可能受到肽与载体取代率的影响。Aβ15肽序列和缀合方法提供如下。总的来说，22个残基的Aβ15聚体肽通过固相化学合成。Aβ15DT缀合物以二Aβ15肽：DT摩尔取代率制备。通过在SDS-PAGE上的迁移率确定的两种Aβ15DT缀合物的取代率为7.6(#1)和21.1(#2)(参见表1)。从每摩尔免疫原性载体大约5摩尔至大约30摩尔的肽的缀合率对组合物是有用的。
表1：通过SDS-PAGE表征Aβ15DT缀合物
DT Aβ15DT#1 Aβ15DT#2
分子中值 55.1kD 75.6kD 111.8kD
摩尔取代率(肽：DT) NA 7.6 21.1
Aβ15DT在MAS-1中的致免疫力：用在0.1mL AMS-1中的100μg剂量的缀合物在第0天、第14天、第42天和第84天皮下免疫年轻DBA2(6周龄；n＝4/组)和年老C57BL/6(12月龄；n＝2/组)雌性小鼠。在免疫前和第28天、第56天和第98天获取血液样品，并使用Aβ1-42肽作为靶抗原通过ELISA测定Aβ抗体滴度。结果在图4中给出。
图4显示了分别在7和22的肽与载体取代率下在MAS-1中配制的Aβ15(7)DT和Aβ15(22)DT缀合物在小鼠中的致免疫力。Aβ15DT缀合物以7和22摩尔/摩尔的肽与DT取代率合成。将缀合物和Aβ1-42配制在MAS-1佐剂中并以100μg/0.1mL的皮下剂量，在第0天、第14天、第42天和第84天注射来评价在6周龄DBA(n＝4/组)和12月龄C57BL/6(n＝2/组)小鼠中的致免疫力。血浆Aβ抗体通过针对Aβ1-40的ELISA测量。
Aβ15(7)DT和Aβ15(22)DT缀合物在MAS-1中都诱导了通过ELISA测量的快速且有效的抗体应答。用在MAS-1中的Aβ15(22)DT进一步免疫后，抗Aβ滴度持续地上升。抗Aβ特异性抗体的诱导显著地优于用在MAS-1中的Aβ1-42所观察到的抗Aβ特异性抗体的诱导，如在图1中所示，在第28天后者在DBA株小鼠中大约为50μg/mL。在第28天，在DBA小鼠中，两种Aβ15DT缀合物产生的抗Aβ抗体水平要比用在MAS-1中的Aβ1-42产生的抗Aβ抗体水平高5倍以上。这些结果证实，在MAS-1中的Aβ15DT是高效的免疫原，甚至在一般对Aβ肽低免疫应答的老年C57BL/6小鼠中也是如此，并且令人惊奇地显示出免疫应答能力随着表位与免疫原性载体的摩尔取代率的增加而增加。
结果表明，免疫原性可以受到肽与载体取代率、剂量和剂量方案的影响。在MAS-1中的两种缀合物都主要诱导了Th2抗体同种型(图5)，其识别Aβ1-42的N末端区域(图6)并与在石蜡包埋的人类AD脑组织切片中的淀粉状蛋白斑块结合(图7)。
图6显示了通过在MAS-1中的Aβ1-42、Aβ15(7)DT和Aβ15(22)DT诱导的抗Aβ特异性的表位作图。表位作图通过使用Aβ1-40包被Ag孔和Aβ肽片段作为小鼠Ab结合的抑制剂的抑制ELISA进行。类似的Ab同种型和特异性结果用DBA小鼠获得。
图3显示了配制在MAS-1中的分别为7和22的肽与载体取代率的Aβ15(7)DT和Aβ15(22)DT在小鼠中的致免疫力。DA(6周龄；n＝4/组)和老年C57BL/6(12月龄；n＝2/组)雌性小鼠在第0天和第14天皮下接受100μg在0.1mL MAS-1中的每种缀合物。在免疫前和第28天获取血液样品并通过ELISA测定Aβ抗体滴度。
在MAS-1中的Aβ15(7)DT和Aβ15(22)DT的0.4∶1w/w混合物在14月龄的3×Tg-AD小鼠中引起了显著的抗AβAb应答(图8)。将这些动物用4剂量的100μg 0.1mL MAS-1中的Aβ15DT在第0天、第2天、第6天和第12周皮下免疫接种，并在第16周(即在18月龄)实施安乐死。来自经免疫动物的脾细胞对Aβ15DT而非全长Aβ1-40/42特异性应答，表明对天然Aβ的免疫耐受得到了保留(图9)。来自经Aβ15DT处理的和MAS-1安慰剂组的每一动物的脑切片(6/小鼠)揭示通过在MAS-1中的Aβ15DT与MAS-1安慰剂比较显示出淀粉状蛋白斑块负担74％的降低(p 0.0543单尾斯氏t检验)。在第14月，在3×Tg-AD小鼠中，在海马中的淀粉状蛋白斑块沉积已经良好建立。在接种组中，本质上缺少显著的淀粉状蛋白斑块表明用MAS-1中Aβ15DT免疫造成了淀粉状蛋白斑块的减少并且并没有简单地阻止淀粉状蛋白斑块的进一步形成，说明15DT/MAS-1免疫在预防和治疗阿尔茨海默氏病中的潜在用途。
图8描述了3×Tg-AD小鼠中的抗Aβ水平。将两组年龄匹配的3×Tg-AD小鼠(14月龄；n＝4/组；3只雄性、1只雌性)在第0周、第2周、第6周、第12周和第16周用100μg/0.1mL由在MAS-1中的Aβ15(7)DT和Aβ15(22)DT缀合物的0.4∶1w/w的混合物或者MAS-1安慰剂皮下免疫接种。在17周免疫治疗后处死动物(主动免疫治疗为18.5月龄，安慰剂免疫治疗为18.3月龄)。抗Aβ1-40抗体通过ELISA用在第0周(免疫前)、第4周、第8周和第16周收集的血液样品测定。
将这些动物用4次剂量的100μg在0.1mL MAS-1中的Aβ15DT在第0周、第2周、第6周和第12周皮下免疫接种，并在第16周(即在18月龄)处死。来自经免疫动物的脾细胞对Aβ15DT而非全长Aβ1-40/42特异应答，表明对天然Aβ的免疫耐受得到了保留(图9)。
图9显示了脾细胞刺激测定。将两组年龄匹配的3×Tg-AD小鼠(14月龄；n＝4/组；3只雄性、1只雌性)在第0周、第2周、第6周、第12周和第16周用100μg/0.1mL由在MAS-1中的Aβ15(7)DT和Aβ15(22)DT缀合物的0.4∶1w/w的混合物或者MAS-1安慰剂皮下免疫接种。在17周免疫治疗后处死动物(主动免疫治疗为18.5月龄，安慰剂免疫治疗为18.3月龄)。
来自经Aβ15DT处理的和MAS-1安慰剂组的每一动物的脑切片(6个/小鼠)揭示了在MAS-1中的Aβ15DT与MAS-1安慰剂相比，淀粉状蛋白斑块负担74％的降低(p 0.0543单尾斯氏t检验)。在第14月，在3×Tg-AD小鼠中，海马中的淀粉状蛋白斑块沉积已经良好建立。在接种组中，本质上缺少显著的淀粉状蛋白斑块表明用MAS-1中的Aβ15DT免疫造成了淀粉状蛋白斑块的减少并且并没有简单地防止淀粉状蛋白斑块的进一步形成，说明15DT/MAS-1免疫在预防和治疗阿尔茨海默氏病中的潜在用途。
免疫原性和效力可以受到多种因素的任何一种例如肽与载体取代率、佐剂、油包水乳液的配制、剂量和剂量方案的影响。这表明必须评估这些因素以便优化AD疫苗的效力。
图10描述了来自Aβ斑块染色的每只3×Tg-AD小鼠的脑切片显示，在用MAS-1中的Aβ15DT缀合物免疫的动物中而非用MAS-1安慰剂免疫的动物中海马斑块负担的显著降低。
我们的结果表明，免疫原性和效力可以受到多种因素的任何一种例如肽与载体取代率、佐剂、油包水乳液的配制、剂量和剂量方案的影响。这表明必须评估这些因素以便优化AD疫苗的效力。
油包水乳液佐剂/递送系统
可以修饰许多因素，例如抗原、佐剂和递送系统以诱发特异的细胞和体液免疫应答。数据显示，配制在油包水佐剂递送系统例如MAS-1中的Aβ1-42在首次用于实验的小鼠中诱导了具有主要是Th2偏向的(IgG1和IgG2b同种型)显著的体液抗体应答(图1和2)。
然而，短Aβ片段，虽然潜在地避免了Aβ特异的细胞免疫应答，但是是低免疫原性的。将小分子包括肽，与免疫原性载体例如DT缀合是已建立的增强免疫原性的方法，但是为了是治疗上有效的，就连DT缀合的自身表位也可能需要具有比明矾佐剂更高效力的Th2偏向的佐剂。油包水佐剂乳剂例如MAS-1可以诱导针对Aβ15DT缀合的自身抗原的强烈的Th2偏向的免疫应答，同时具有避免Th1偏向的细胞介导的炎症副作用的能力，所述副作用限制了以前尝试研发的用于阿尔茨海默氏病的Aβ15DT疫苗的有效性。
在一个实例中，适合于在组合物中使用的油性佐剂载体的组分包括第一种糖酯乳化剂例如二缩甘露醇一油酸酯(MMO)或者山梨聚糖一油酸酯，第二种乳化剂例如氢化蓖麻油，例如聚氧乙烯-40-氢化蓖麻油(POCO)和天然存在且可代谢的油类，优选鲨烯和鲨烷。可代谢油类通常包含按油重量计大约85％至大约90％的油，按油重量计大约9％至大约12％的第一种糖酯乳化剂，和按油重量计大约0.5％至大约0.7％的第二种乳化剂。在一个实例中，可代谢的油组分通常是按重量计50％的鲨烯和50％鲨烷，但是这些组分的浓度可以在该组分中变化。在组合物中使用的合适的佐剂载体是MAS-1，其包含来源于植物源的天然存在的且可代谢的组分，并且是从Mercia Pharma公司，Scarsdale，NY(www.merciapharma.com)通过商业途径可得到的。
油载体的组分，包括它们的起始物质，可以来源于动物源或者植物源或者它们的组合物，都是从多种来源通过商业途径可获得的。作为第一种乳化剂的合适的糖酯除MMO外还包括聚山梨酯，特别是山梨聚糖一油酸酯。除POCO作为第二种乳化剂外，可以使用山梨聚糖酯例如山梨聚糖一棕榈酸酯、聚山醇酯例如吐温家族的乳化剂以及Hypermers B239和B246。
在一个实例中，公开的纳米颗粒疫苗乳剂一般含有按重量计大约65％至按重量计大约75％的佐剂油性载体和按重量计大约25％至大约35％的含有蛋白质抗原的水相。在组合物的某些实施方案中，水相占疫苗乳剂重量的大约27％至大约33％。
在一个实例中，可以配制在组合物中使用的油包水疫苗乳剂使得在携带抗原的乳剂中的含水小球具有直径中值范围为大约100纳米至大约1微米的小于1微米的直径中值，并且一般具有大约300纳米的平均直径。在一个实例中，佐剂的油性组分优选地是可代谢的天然存在的生物油类，不同于包含熟知的弗氏佐剂(不完全和完全制剂二者)的油相的矿物油。
公开的疫苗乳剂可以耐受高浓度的抗原(高达至少10mg/mL)并且应当与通常使用的蛋白质增溶剂(例如，4M尿素、30％DMSO)相容。不同于IFA乳剂，在一个实例中，它们应当与具有宽范围pH(3-8)的水相相容，并且在宽范围盐浓度下不受影响。不像IFA乳剂(＞1,500cP)，在一个实例中的疫苗乳剂应当具有低黏度(＜100cP)，因为自由流动的乳剂允许高精度的低体积(0.1mL)给药。在一个实例中，公开的疫苗乳剂的物理化学特性应当具有小于或者等于1μm的小球大小直径的中值分布(D(v，0.5))，并且不受水相中高浓度的蛋白质的影响。
用于评价免疫原性组合物的动物模型
基因靶向的和转基因小鼠是用于建模AD病理学的多种方面的有价值的工具，尽管还没有小鼠模型完全地复制其整个神经病理学。3×Tg-AD小鼠在相关的脑区域中产生了由Aβ肽组成的斑块和由超磷酸化Tau蛋白组成的神经原纤维缠结，在空间的和上下文相关的认知和记忆示例中具有认知表型的相关的年龄依赖的下降。因此，它们提供了用于评价潜在的AD疗法的有价值的模型(Oddo等，2003)。
肽免疫原Aβ1-42在临床前和临床研究中已经显示出引起治疗性抗Aβ抗体，并且在MAS-1中的Aβ1-42诱导了识别脑组织切片中淀粉状蛋白斑块的Th2偏向的抗Aβ抗体。
3×Tg-AD三重转基因小鼠表达人突变APP、tau和早老蛋白1。这些小鼠起源于C57BL/6/129S背景，但是已经与C57BL/6小鼠回交了许多代，造成了非常少的129基因型保留。它们是纯合的，容易育种并渐进地发生Aβ和tau病理，所述Aβ和tau病理具有接近模拟在人类AD脑中的病理发展的时间和区域特异谱。在这些小鼠中，Aβ沉积发生在tau病理，其与淀粉状蛋白级联假说一致，该假说规定Aβ是触发器，并且tau病理是Aβ病理的下游结果(Hardy和Selkoe，2002)。
为了进一步评价公开的免疫治疗组合物，可以在6月龄(年轻/预防)和14月龄(老年/治疗)时通过用最佳剂量皮下注射来免疫3×Tg-AD小鼠，所述最佳剂量从用载体取代率经优化的Aβ1-15：DT进行的剂量范围剂量方案研究确定。小鼠可以在预防性研究中免疫9个月和在治疗性研究中免疫5-6个月。在预防和治疗研究中，用在MAS-1中的Aβ1-42接种的小鼠组可以被包括为阳性对照，并且用在所选择的佐剂或W/O安慰剂佐剂中的DT免疫的小鼠组为阴性对照组。由于研究的行为成分的可变性，将需要16只3×Tg-AD小鼠的组大小。
在一个实例中，使用Morris Water Maze进行行为测试应当在每一研究结束时进行。虽然在3×Tg-AD小鼠中已经较好地建立了行为表现与淀粉状蛋白斑块沉积之间的相关性，但空间学习可以通过潜伏期和到平台的距离来测量，而记忆可以通过探头试验测量。
用在MAS-1中的Aβ15DT免疫的3×Tg-AD小鼠导致了强烈的Th2占优的体液免疫应答，避免了Th1占优的免疫和在脑中诱导细胞介导的炎症改变的潜力。通过本发明的组合物诱导Aβ特异的调节性T细胞会进一步降低细胞介导的炎症副作用的潜力。产生的抗体导致了脑中Aβ的减少，其应当与小鼠的认知功能的改善相关。期望的是已经积累了脑Aβ后免疫小鼠(14个月)将仅仅部分降低斑块负担，因为众所周知，年老的3×Tg-AD小鼠一般表达更弱的免疫应答，然而，事实上观察到的是有效的Th2优势的体液免疫应答并且伴随着海马斑块负担的统计学显著减少，没有微出血证据。
在来自AN1792临床试验的3例尸检病例中，尽管清除了实质Aβ，但仍保留了大量的血管Aβ，并且它们中的一例具有大量的脑微出血(Nicoll等，2003；Ferrer等，2004；Maliash等，2005)。在评价免疫治疗组合物中，应当密切注意脑微出血的出现，因为这也已经在用Aβ单克隆抗体被动免疫小鼠后观察到(Pfeifer等，2002；Wilcock等，2004；Racke等，2005；Lee等，2005)。认为这些微出血是由通过高剂量的高亲和力单克隆抗体对Aβ实质沉积物以及它们的随后血管沉积的过快地清除，以及可能由在微血管系统中Aβ单克隆抗体与Aβ结合引起的。
一般而言，在小鼠中主动免疫与脑微出血的发生不相关，只是最近的报道表明，用在CFA/IFA中配制的Aβ1-42主动免疫APP+PS1转基因小鼠与微出血的增加有关(Wilcock等，2007)。通过Asuni等(2006)最近的研究表明，用在明矾(有利于Th2应答的佐剂)中的Aβ衍生物接种Tg2576小鼠降低了Aβ负担，在没有任何微出血证据。因此，不同于在基于QS21佐剂中的Aβ1-42(AN1792)或用于促进针对Aβ的强烈免疫应答的其他Th1偏向的佐剂制剂的情况，在本文中用在MAS-1中的Aβ1-42或者在MAS-1中的Aβ15DT在3×Tg-AD小鼠中所观察到的结果预测，这些组合物作为用于早期预防和治疗阿尔茨海默氏病的治疗性疫苗是合适的，并且期望诱导显著的更强的Th2主导的免疫应答，避免Th1介导的细胞毒性或者破坏对内源性目标的免疫自身耐受的可能，同时降低或者预防淀粉状蛋白斑块沉积并且具有降低随后发生超磷酸化Tau蛋白的可能。
材料和方法
Aβ1-42肽：42个残基肽可以通过固相合成生产。这种肽的序列显示如下：
DAEFR5HDSGY10EVHHQ15KLVFF20AEDVG25SNKGA30IIGLM35VGGVV40IA42
(SEQ ID NO：1)
Aβ肽表位：具有7个氨基酸残基肽间隔区(XXXXXXC-COOH)的22个残基15聚体Aβ肽肽免疫模拟肽可以使用固相合成生产。15聚体Aβ1-15、Aβ16-30、Aβ21-35和Aβ31-42的序列显示如下：
NH2-D1AEFR5HDSGY10EVHHQ15XXXXXXC-COOH
(SEQ ID NO：2)
NH2-K16LVFF20AEDVG25SNKGA30XXXXXXC-COOH
(SEQ ID NO：3)
NH2-A21EDVG25SNKGA30IIGLM35XXXXXXC-COOH
(SEQ ID NO：4)
NH2-I31IGLM35VGGVV40IA42XXXXXXC-COOH
(SEQ ID NO：5)
多种间隔区肽是本领域已知的，并且这些和其他肽序列可以在本发明中使用。美国专利号5,023,077、5,468,494和5,688,506及其公开都在此处引用作为参考，描述了可以在公开的组合物中使用的有用的肽间隔区序列。
AβDT缀合物：将肽与免疫原性载体蛋白质缀合的方法是本领域熟知的，例如美国专利号5,468,494、5,688,506和6,359,116，其公开在此处引入作为参考。
Aβ1-15肽合成和Aβ15DT缀合：包含Aβ残基1-15的22聚体肽可以使用马来酰亚胺-NHS酯双功能交联化学方法与DT偶联。通过本领域技术人员熟知的双功能交联剂，例如ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(eMCS)交联剂和相关的双功能类似物(Sulfo-eMCS)，肽通过其C末端CySH残基可以与DT载体偶联。已经选择了这种偶联机制，因为它是高度特异的。在能使连接体的琥珀酰亚胺部分与DT上的自由氨基基团反应的pH条件下，首先用eMCS活化DT以产生马来酰亚胺活化的DT(MDT)。一旦完成，除去未反应的eMCS和其降解产物，并将活化缓冲液交换成偶联缓冲液，其最适于肽的自由巯基与MDT的马来酰亚胺基团反应以使肽与载体缀合。然后纯化并分析缀合物。选择合适的eMCS∶DT比率和活化/偶联条件导致实验室和生产批量规模下一致的肽：载体取代率。每种缀合物可以通过分析方法表征。肽：载体摩尔取代率可以通过定量氨基酸分析和/或通过在SDS-PAGE上的迁移率测定。缀合物纯度可以通过SECHPLC和通过SDS PAGE评估。缀合物同一性可以使用来自SDS PAGE凝胶的额外样品通过蛋白质印迹法和通过氨基酸分析来检测。
Aβ1-15BSA缀合物：将没有间隔区序列但是具有C末端Cys残基的Aβ1-15表位与BSA缀合，用作为ELISA中的目标抗原用于测量肽特异性抗体。备选地，Aβ1-15肽或者从N末端开始并包括多达42个残基的Aβ的更长的肽可以在ELISA中用作为目标抗原。
动物免疫：通过熟知的方法，将100μl的免疫原皮下地(s.c.)注射到小鼠的颈背或者后肢侧面或者腹膜内(i.p.)注射。
血液和组织收集：在免疫前和免疫期间从尾静脉对小鼠取血，制备血清并冻存于-20℃。对于收集较大体积的血清，在实验的最后通过心脏穿刺对小鼠最后取血，并如上制备血清，用作为实验的参考标准。通过CO2吸入并用盐水心包灌注处死3×Tg-AD小鼠。去除脑并沿中线分为两半。将一个半脑快速冷冻在液氮中并保存于-80℃用于生物化学研究(例如，AβELISA)。另外一个半脑或者室温逐滴固定(drop-fixed)于PBS中的4％多聚甲醛中2小时，在4℃蔗糖保护于10-30％的蔗糖中，并包埋在OCT(TissueTek)中用于冷冻切片或者室温下逐滴固定于中性缓冲的福尔马林中2小时、在TBS中洗涤、脱水、清除脂质(Histoclear)并包埋于石蜡中用于石蜡矢状切面切片。切割6-10的微米矢状冷冻切片和12微米的石蜡连续切片并保存用于染色。在无菌条件下切除用于增殖和细胞因子分析的脾组织。
小鼠脾细胞增殖测定：通过在Lympholyte-M(Cederlane，Hornby，ON，Mayada)上离心单细胞悬液制备脾细胞。在96孔板中，将脾细胞以2×106/ml的浓度培养在补充了10％FBS的RPMI中，并用Aβ1-15、Aβ1-42和DT以及Aβ15DT(0-50μg/ml)刺激。Conmayavalin A用作为阳性对照以确保细胞的存活。在48小时收获培养上清用于细胞因子ELISA。培养72小时后，向每孔中加入1μCi[3H]胸苷并将细胞额外培养18小时。使用洗板机(plate washer)获取细胞并使用液体闪烁计数器测量放射性。使用下面的公式计算刺激指数(SI)：使用肽抗原的每分钟计数(CPM)/没有用肽抗原的CPM。
通过ELISA测量小鼠血清中的抗Aβ抗体：用正常小鼠IgG(标准曲线)和2μg/ml Aβ1-42肽包被平板并在4℃温育过夜。然后将平板在5％山羊血清、1％BAS和0.005％吐温20中室温封闭2小时。洗涤后，将小鼠血清稀释液加入孔中并室温温育2小时。与HRP缀合的山羊抗小鼠抗体(Kirkegaard和Perry实验室，Gaithersburg，MD)用作为第二抗体并在平板上室温温育1小时。在加入显色底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)30分钟后，用0.5M HCl终止反应并在平板读出器上在450nm处读取平板。
同种型分析：使用IgG1、IgG2a、IgG2b、IgA和IgM的同种型特异性第二抗体(Zymed，SanFrancisco，CA)进行定量的同种型特异性ELISA，并向上述标准ELISA添加适当的同种型的标准曲线(SouthernBiotechnology，AL)。
检测人类和小鼠脑中的Aβ斑块：将来自经免疫的和对照小鼠的血清1∶100到1∶10,000连续稀释并应用到人类AD和J20APP转基因小鼠脑切片用于斑块和血管淀粉状蛋白的免疫组织化学检测。生物素化的山羊抗小鼠第二抗体与ABC ELITE HRP标准品(A和B)一起使用并与DAB反应用于显色。相邻的切片用Aβ抗体例如R1282(通用Aβ多克隆，Selkoe实验室)或者6E10(单克隆Aβ1-17，Covance Research Products，Dedham，MA)标记。
Aβ蛋白质ELISA：通过ELISA试剂盒(Signet)依据厂商说明书(Covance Research Products，Berkeley，CA)测定脑中可溶性和不溶性Aβ40和Aβ42水平。将快速冷冻的整个半脑在4倍体积的含有蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Indianapolis，IN)的PBS中匀浆。将匀浆在4℃、100×g离心30分钟。通过ELISA分析上清液的可溶性Aβ水平。在10倍体积的胍缓冲液(5M盐酸胍，50mM Tris pH8.0)中重悬浮PBS沉淀物。室温混合样品4小时。然后将脑匀浆在酪蛋白缓冲液(0.25％酪蛋白、5mM EDTA、在PBS中的蛋白酶抑制剂混合物)中1∶10稀释，混合并在16,000×g离心20分钟。在具有0.1％BSA的0.5M胍缓冲液中制备额外的稀释液并通过ELISA测量不溶性Aβ水平。
免疫组织化学、组织学和图像分析：免疫组织化学使用VectorLaboratories(Burlingame，CA)的ELITE ABC方法进行并将DAB作为生色团。简而言之，将石蜡切片在Histoclear(National Diagnostics，Atlanta，GA)中脱蜡并在梯度的乙醇到水中再水化。解冻冰冻切片、风干15分钟并在TBS中轻轻地洗涤。此后，石蜡切片和冰冻切片的染色步骤是相同的。淬灭内源的甲醇，将切片在TBS中的10％血清中封闭，并将切片在4℃在第一抗体中温育过夜。
然后在TBS中洗涤切片，在生物素化的第二抗体(Vector Labs)中室温温育30分钟，在TBS中洗涤，在亲和素-HRP复合物(Vector Labs)中室温温育30分钟并然后在DAB中显色。
在苏木精中复染切片(除非设计用于图像分析)、脱水、清洗并用Permount(Fisher)盖片。双免疫荧光法如下进行：在2％血清中封闭，混合两种第一抗体(MoAb和PAb)并在4℃应用于切片过夜，在0.1M Tris中漂洗，在Tris中2％血清中封闭，混合两种荧光标记的第二抗体并室温应用于切片2小时，在Tris中漂洗两次，在暗室中将切片在70％的乙醇中的0.3％Sudan Black B中温育10分钟，在TBS中洗涤，在水中洗涤，在暗室中在福尔马林中固定1小时，在水中洗涤并用Hydromount非荧光含水介质(National Diagnostics，Atlanta)盖载玻片。
用干净的指甲油密封盖玻片以防止变干。用于IHC和IF的阴性对照包括省略第一抗体或者使用小鼠IgG作为第一抗体。用于免疫组织化学检测Aβ和炎症标志物的第一抗体列举如下。
用于免疫组织化学的第一抗体：Aβ(R1282，Dr.Selkoe，Brigham和Women’s Hospital，Boston)；Aβ40、Aβ42和6E10(BioSource和CovanceResearch Products)、神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)Mab(Dako，丹麦)、小胶质细胞/巨噬细胞Mab[CD45(Serotec)、CD11b/Mac-1(Serotec)、MHCII(PharMingen)、F4/80(Serotec)、FcgR II-CD16和II-CD32(PharMingen)]、B细胞(CD40，Novacastra Laboratories，英国)、T细胞(CD5、CD3；Sterotec)、APP Mab(IG6，Covance Research Products)、磷酸-tau(AT8，Innogenetics)、小鼠Ig(山羊抗小鼠IgG)。
组织学染色：通过将切片在1％的硫黄素S水溶液中温育10分钟，然后在80％和95％乙醇和然后蒸馏水中漂洗来进行硫黄素S染色以检测脑切片中的原纤维Aβ蛋白质。通过将水化的切片在2％盐酸中的2％氰亚铁酸中温育15分钟来进行血铁黄素染色以检测微出血。苏木精和伊红(H&E)染色用于评估脑、肺、心、肝和脾切片中的单核细胞浸润。
定量图像分析：Aβ斑块负担和神经胶质增生的计算机辅助定量使用如前所述的IP Lab Spectrum 7.1Image Analyzer(Fairfax，VA)进行(Weiner等，2000)。使用具有Leica电动载物台和SPOT照相机的Nikon显微镜以等距离水平(～100μm间距)经过每只小鼠的脑捕获4至8张经免疫标记的切片的矢状图像。在整个图像分析中，一个实验的所有图像都以恒定的阈值在同一天捕获。计算免疫反应性(阈值以上)占据的百分比面积。
提供的实施例的备选组合和变型基于本公开是显而易见的。不可能为所述实施方案的所有可能组合和变型提供具体的实施例，但是此类组合和变型可以是最终授予的权利要求。

Claims (6)

1.用于治疗阿尔茨海默氏病的免疫治疗组合物，其包含：包含人Aβ1－15的免疫原，其中人Aβ1－15通过肽间隔区缀合到白喉类毒素(DT)，缀合率为每摩尔白喉类毒素5至30摩尔的人Aβ1－15，并且
所述免疫原与油性佐剂载体配制在油包水乳液中，
所述油性佐剂载体包含鲨烯、鲨烷和二缩甘露醇一油酸酯，其中所述免疫原包含在具有100纳米至1微米的直径中值的含水小球中。
2.权利要求1的组合物，其中含水小球直径的平均值是300纳米。
3.权利要求1的组合物，其中所述缀合率在5:1至25:1的范围内。
4.权利要求1的组合物，其中所述缀合率为7:1或22:1。
5.权利要求1的组合物，其中所述油性佐剂载体是MAS-1，所述MAS-1是从Mercia Pharma公司得到的油包水乳液佐剂系统。
6.权利要求1的免疫治疗组合物在制备治疗或者预防人类患者中阿尔茨海默氏病的药物中的用途。
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