CN108601811A - 用于免疫治疗的slc45a2肽 - Google Patents

用于免疫治疗的slc45a2肽 Download PDF

Info

Publication number
CN108601811A
CN108601811A CN201680079367.4A CN201680079367A CN108601811A CN 108601811 A CN108601811 A CN 108601811A CN 201680079367 A CN201680079367 A CN 201680079367A CN 108601811 A CN108601811 A CN 108601811A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
slc45a2
melanoma
cell
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680079367.4A
Other languages
English (en)
Inventor
格雷戈里·利泽
卡西安·伊
帕特里克·维
亚诺什·罗西克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Texas System
Original Assignee
University of Texas System
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Texas System filed Critical University of Texas System
Publication of CN108601811A publication Critical patent/CN108601811A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00119—Melanoma antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46449—Melanoma antigens
    • A61K39/464491—Melan-A/MART
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46449—Melanoma antigens
    • A61K39/464492—Glycoprotein 100 [Gp100]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464493—Prostate associated antigens e.g. Prostate stem cell antigen [PSCA]; Prostate carcinoma tumor antigen [PCTA]; Prostatic acid phosphatase [PAP]; Prostate-specific G-protein-coupled receptor [PSGR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/876—Skin, melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca

Abstract

提供了与黑素瘤细胞或其他抗原呈递细胞上的MHC I(HLA‑A2)结合并且被T细胞上的T细胞受体识别的SLC45A2肽。所述SLC45A2肽可治疗性地用于治疗癌症，例如皮肤黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、黏膜黑素瘤或转移性黑素瘤。还提供了用于扩增靶向SLC45A2的T细胞群的方法。

Description

用于免疫治疗的SLC45A2肽
发明背景
本申请要求于2015年12月4日提交的美国临时专利申请No.62/263,189和于2015年12月7日提交的美国临时专利申请No.62/263,835的权益，其全部内容通过引用并入本文。
1.技术领域
本发明总体上涉及免疫学和医学的领域。更特别地，本发明涉及被T细胞识别并且可用于治疗癌症的肽片段。
2.背景技术
过继性T细胞治疗(adoptive T cell therapy，ACT；还称作“过继性细胞转移”)已经显示出作为用于治疗黑素瘤的方法的显著前景；遗憾的是，这种方法也已由于包括对非癌组织的毒性在内的限制而受到阻碍。ACT通常涉及将大量的活化的自体肿瘤特异性T细胞输注到患者中，例如以治疗癌症。ACT已经在黑素瘤患者中引起治疗性临床应答(Yee 2002；Dudley 2002；Yee 2014；Chapuis 2016)。一般来说，为了产生有效的抗肿瘤T细胞应答，通常需要以下三个步骤：使抗原特异性T细胞致敏并活化，使活化的T细胞迁移至肿瘤部位，以及通过抗原特异性T细胞来识别并杀伤肿瘤。靶抗原的选择对于诱导有效的抗原特异性T细胞而言是重要的。
针对用ACT治疗黑素瘤而选择的数种抗原已显示出显著的不利自身免疫副作用。靶抗原的选择对于诱导有效的抗原特异性T细胞而言也是重要的。在过去的数十年中，MART-1、gp1 00和酪氨酸酶已经被鉴定为被来自于人PBL或TIL的T细胞识别的人黑素瘤分化抗原(melanoma differentiation antigen，MDA)(Yee 2002，Chapuis 2012；Coulie1994；Kawakami 1995)。正常组织(例如皮肤和眼中的黑素细胞以及内耳细胞)也表达MDA。遗憾的是，根据来自最近临床试验的结果，使用对这些MDA具有特异性的T细胞的ACT通过破坏正常组织而诱导不期望的自身免疫应答，导致白癜风、视力丧失和内耳毒性(Yee C2000；Brichard V 1993；Seaman 2012)。鉴定具有较低毒性和最佳效力的针对黑素瘤的新的靶抗原将是期望的。显然，需要可用于过继性T细胞治疗的新的抗原靶标和肽。
发明内容
本发明通过提供SLC45A2的新MHC I类表位来克服现有技术中的限制。抗原性SLC45A2肽可用于癌症治疗，例如用作癌症疫苗或用于过继性T细胞治疗。还可产生抗体(例如治疗性人源化抗体)，其选择性地结合一种或更多种SLC45A2肽或通过SLC45A2肽与(HLA-A2或HLA-A24)结合而形成的复合物。SLC45A2肽可用于治疗黑素瘤，例如皮肤黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、黏膜黑素瘤或转移性黑素瘤。本发明部分地基于以下发现：在肿瘤细胞表面上的MHC I(HLA-A2或HLA-A24)提供被T细胞上的T细胞受体识别的细胞内蛋白质SLC45A2的肽。在多个方面，提供了可结合MHC I(HLA-A2或HLA-A24)并且可被T细胞上的T细胞受体识别的SLC45A2肽。SLC45A2肽可治疗性地用于治疗癌症，例如黑素瘤。还提供了用于扩增靶向SLC45A2的T细胞群的方法。在一些方面，提供了可用于产生有效地杀伤黑素瘤细胞而不破坏正常黑素细胞的CD8 T细胞的SLC45A2肽。这种针对非癌细胞的毒性降低对于治疗黑素瘤可特别有用。
如以下实施例中所示，表征了黑素瘤和正常组织中SLC45A2的表达，且SLC45A2肽SLC45A2382-390(SEQ ID NO：1)和SLC45A2393-402(SEQ ID NO：2)被鉴定为可分别与HLA-A*0201(HLA-A2)和HLA-A*2402(HLA-A24)选择性地结合的免疫原性表位，并且观察到使用这些肽增殖的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)高效地杀伤多种黑素瘤细胞，包括多种皮肤黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、黏膜黑素瘤和转移性黑素瘤。表4中提供了可用于本发明多个实施方案的另外的SLC45A2肽。如以下实例中所示，显示这些SLC45A2肽展现出抗原特异性且HLA-A*0201或HLAA*2402限制性的SLC45A2特异性CD8 T细胞应答。SLC45A2382-390(SEQ ID NO：1)和/或SLC45A2393-402(SEQ ID NO：2)可用于治疗黑素瘤的多种免疫治疗方法(例如，用作治疗性疫苗、用于过继性T细胞治疗)。
本发明的一个方面涉及分离的肽，其长度为35个氨基酸或更少并且包含SLC45A2382-390(SEQ ID NO：1)或SLC45A2393-402(SEQ ID NO：2)的序列或者与SLC45A2382-390(SEQ ID NO：1)或SLC45A2393-402(SEQ ID NO：2)具有至少90％同一性的序列，其中所述肽选择性地结合HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A24或HLA-A*2402。在一些实施方案中，所述肽的长度为30个氨基酸或更少、25个氨基酸或更少、20个氨基酸或更少或者15个氨基酸或更少。在一些实施方案中，所述肽包含SLC45A2382-390(SEQ ID NO：1)或由其组成并且其中所述肽选择性地结合HLA-A2或HLA-A*0201。在一些实施方案中，所述肽包含SLC45A2393-402(SEQ ID NO：2)或由其组成并且其中所述肽结合HLA-A24或HLA-A*2402。所述肽可包含在药物制剂中。在一些实施方案中，药物制剂配制成用于肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射。所述肽可包含在脂质体、含脂质纳米粒中，或基于脂质的载体中。在一些实施方案中，药物制剂配制成用于注射或作为鼻喷雾剂吸入。在一些实施方案中，所述肽包含在细胞培养基中。
本发明的另一个方面涉及包含本发明或如上所述的肽的细胞培养基。
本发明的另一个方面涉及包含本发明或如上所述的肽、以及赋形剂的药物组合物。药物制剂可以配制成用于肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射。在一些实施方案中，所述肽包含在脂质体、含脂质纳米粒中，或基于脂质的载体中。
本发明的另一个方面涉及包含本发明或如上所述的肽的组合物，其用于治疗性治疗。在一些实施方案中，所述组合物用于治疗黑素瘤。在一些实施方案中，所述肽的长度为25个氨基酸或更少、20个氨基酸或更少或者15个氨基酸或更少。在一些实施方案中，所述肽包含SLC45A2382-390(SEQ ID NO：1)或由其组成。在一些实施方案中，所述肽包含SLC45A2393-402(SEQ ID NO：2)或由其组成。所述肽可包含在药物制剂中。在一些实施方案中，药物制剂配制成用于肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射。所述肽可包含在脂质体、含脂质纳米粒中，或基于脂质的载体中。在一些实施方案中，药物制剂配制成用于注射或作为鼻喷雾剂吸入。所述肽可通过肽合成产生。所述肽可重组产生。黑素瘤可以是皮肤黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、黏膜黑素瘤或转移性黑素瘤。
本发明的另一个方面涉及在哺乳动物对象中治疗黑素瘤的方法，其包括向所述对象施用有效量的本发明或如上所述的肽。所述肽可包含在药物制剂中。药物制剂可配制成用于肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射。所述对象可以是人。黑素瘤可以是皮肤黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、黏膜黑素瘤或转移性黑素瘤。在一些实施方案中，向所述对象施用第二抗癌治疗。在一些实施方案中，第二抗癌治疗选自化学治疗、放射治疗、免疫治疗或外科手术。在一些实施方案中，所述肽以有效地促进对象中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)裂解或杀伤对象中癌细胞的量施用于对象。
本发明的另一个方面涉及用于诱导T细胞群增殖的体外方法，其包括使T细胞与一定量的权利要求1至12中任一项所述的肽在体外接触，所述量足以结合T细胞中HLA-A*0201或HLA-A2并且促进一种或更多种T细胞增殖。所述T细胞可以是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。所述T细胞可以是CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括在所述增殖之后将T细胞施用于对象。所述对象可以是哺乳动物对象，例如人。
本发明的另一个方面涉及在对象中促进针对SLC45A2之免疫应答的方法，其包括向所述对象施用有效地引起选择性地靶向SLC45A2的T细胞增殖之量的本发明或如上所述的肽。在一些实施方案中，所述T细胞是细胞毒性T淋巴细胞。所述对象可以是人。在一些实施方案中，所述对象患有黑素瘤。所述黑素瘤可以是皮肤黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、黏膜黑素瘤或转移性黑素瘤。在一些实施方案中，所述对象未患癌症。
本发明的另一个方面涉及编码本发明或如上所述的肽的分离的核酸。所述核酸可以是DNA或RNA。本发明的另一个方面涉及载体，其包含由核酸区段(segment)组成的连续序列(contiguous sequence)。在一些实施方案中，所述载体还包含异源启动子。在一些实施方案中，所述核酸或载体可包含在小基因、质粒或RNA中；例如，所述核酸或载体可用于例如改造抗原呈递细胞(例如，树突细胞、人工APC或T细胞)中表位的表达。
本发明的另一个方面涉及与本发明或如上所述的肽选择性地结合的分离的抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体，包含在多克隆抗血清中，或是抗体片段。所述抗体可以是人抗体或人源化抗体。所述抗体可包含在融合构建体、可溶性融合构建体、ImmTAC或免疫毒素中；例如可使多种部分(moiety)与抗体连接以实现另外的治疗效果，例如，如Oates等(2015)和Liddy等(2012)中所描述的，其通过引用整体并入本文而不放弃任何权利。例如，在一些实施方案中，所述抗体可与人源化分化群3(cluster ofdifferentiation 3，CD3)特异性单链抗体片段(scFv)融合。
本发明的另一个方面涉及与肽-HLA-A2复合物选择性地结合的分离的抗体，其中所述肽-HLA-A2复合物包含与HLA-A2结合的权利要求1至12中任一项所述的肽。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体，包含在多克隆抗血清中，或是抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体或人源化抗体。
本发明的另一个方面涉及包含在容器中的本发明或如上所述的肽的药盒(kit)。在一些实施方案中，所述肽包含在药物制剂中。在一些实施方案中，所述药物制剂配制成用于肠胃外施用或吸入。在一些实施方案中，所述肽包含在细胞培养基中。
就特定组分而言，本文中使用的“基本上无”在本文中用于意指特定组分均不被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非预期污染产生的特定组分的总量远低于0.05％，优选地低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法未检测到特定组分之量的组合物。
HLA-A2是指人白细胞抗原血清型A2并且还被称作HLA-A*02。许多HLA-A*02等位基因的基因产物的数种血清型是公知的，包括HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206、*0207和*0211基因产物。
HLA-A24是指人白细胞抗原血清型A24并且还被称作HLA-A*24。许多HLA-A*24等位基因的基因产物的数种血清型是公知的，包括HLA-A*2402和*2403基因产物。
当用于权利要求书和/或说明书时，术语“抑制”、“降低”或“阻止”或者这些术语的任何变化形式包括实现期望结果的任何可测量的降低或完全抑制。
当术语“有效的”用于说明书和/或权利要求书时，该术语意指适合于实现期望的、预计的或预期的结果。
当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词可意指“一个/一种”，但是其还与“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。
考虑本说明书中所讨论的任何实施方案可根据本发明的任何方法或组合物来实施，并且反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
在本申请通篇，术语“约”用于表示值包括用于测定该值的装置、方法的固有误差变化，或者研究对象之间存在的变化。
除非明确指出仅指代替代方案或替代方案相互排斥，否则术语“或/或者”在权利要求书中的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持仅指代替代方案以及“和/或”的定义。
在本说明书和权利要求书中使用的词语“包含”(及其任何变化形式)、“具有”(及其任何变化形式)、“包括”(及其任何变化形式)或“含有”(及其任何变化形式)是包括性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。
本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应理解的是，详细描述和具体实例尽管指出了本发明的一些优选实施方案但是仅作为举例说明给出，但因为根据本详细描述，在本发明精神和范围之内的不同变化和修改对于本领域技术人员而言将变得明显。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分并且为了进一步示出本发明的某些方面而包括在内。通过参照这些附图中的一个或更多个并结合本文中提出的一些特定实施方案的详细描述可更好地理解本发明。
图1A-C：皮肤黑素瘤细胞系和高限制性组织中SLC45A2的表达。图1A，示出如通过RT-PCR确定的24种皮肤黑素瘤细胞系中MDA表达之结果的总结。图1B，皮肤黑素瘤细胞中的SLC45A2 mRNA表达。与其他黑素细胞分化抗原(例如MART-1、gp100和酪氨酸酶)一样，通过RT-PCR分析在大多数黑素瘤细胞(包括起源于不同部位的转移性黑素瘤细胞)中检测到SLC45A2 mRNA。图1C，通过RT-PCR分析在多种肿瘤类型细胞中无SLC45A2 mRNA表达。除黑素瘤之外的不同类型的肿瘤细胞不表达SLC45A2。
图2A-B：肿瘤来源的肽和合成SLC45A2来源的肽的质谱。图2A，HLA-A*0201限制性SLC45A2肽。图2B，HLA-A*2402限制性肽。图2C，从黑素瘤细胞系中鉴定黑素瘤肿瘤特异性肽的实验策略。
图3A-C：HLA A*0201或A*2402限制性健康供体的PBMC中SLC45A2特异性CD8 T细胞的产生。图3A，用于产生SLC45A2特异性CD8 T细胞的方案。图3B，SLC45A2四聚体阳性CD8 T细胞的诱导。分别用自体SLC45A2382-390肽或SLC45A2393-402肽脉冲DC刺激来自HLA A*0201或A*2402限制性健康供体的PBMC。SLC45A2四聚体阳性CD8 T细胞在2次刺激之后通过ARIA分选仪进行分选(上图)，并且根据迅速扩增方案(rapid expansion protocol，REP)扩增分选的SLC45A2四聚体阳性CD8 T细胞。然后，使用扩增的细胞作为SLC45A2特异性CD8 T细胞(中间图)。使用具有对应于24种不同特异性的Vβ抗体的IOTest Beta Mark TCR-Vβ库试剂盒进行SLC45A2特异性CD8 T细胞的TCR库分析(下图)。图3C，SLC45A2特异性CD8 T细胞的表型。在REP之后14天，通过流式细胞术使用针对CD45RA、CCR7、CD62L和CD28的抗体测试表型。
图4A-F：SLC45A2特异性CD8 T细胞的效应功能。图4A，A*0201限制性SLC45A2特异性CD8 T细胞对皮肤黑素瘤细胞的杀伤作用。SLC45A特异性CD8 T细胞识别并杀伤内源性表达SLC45A2的HLA A*0201限制性黑素瘤细胞(HLA-A*0201+/SLC45A2+：Mel888(用A2转导)、Mel526、Mel624和MeWo)。SLC45A2特异性CD8 T细胞不杀伤表达SLC45A2但不表达HLA A*0201的Mel888(HLA-A*0201-/SLC45A2+)和表达HLA A*0201但不表达SLC45A2的A375(HLA-A*0201+/SLC45A2-)。SLC45A2特异性CD8 T细胞显示出针对表达HLA-A*0201和SLC45A2+的转移性黑素瘤的杀伤作用。使用来自供体#1的SLC45A2特异性CD8 T细胞。在不同E∶T比例下进行细胞毒活性的标准51Cr释放测定。示出了所进行的至少3个实验中一个代表性实验的结果。图4B，A*2402限制性SLC45A特异性CD8 T细胞对皮肤黑素瘤细胞的杀伤作用。A*2402限制性SLC45A特异性CD8 T细胞杀伤表达SLC45A2和HLA A*2402的皮肤黑素瘤细胞。在不同E∶T比例下进行细胞毒活性的标准51Cr释放测定。示出了所进行的至少2个实验中一个代表性实验的结果。图4C，SLC45A特异性CD8 T细胞的功能性亲合力。将SLC45A2特异性CD8 T细胞与用与不同浓度(100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0nM)的SLC45A2382-390肽和不匹配肽MART-127-35预孵育的T2细胞一起培养(上图)。将MART-1或gp100特异性CD8 T细胞与用指定浓度的M27-35或G154-162肽预孵育的T2细胞一起培养(下图)。在孵育之后48小时，通过ELISA测定来测量IFN-γ产生。测量SLC45A2、MART-1和gp100特异性CD8 T细胞的肽剂量阈值用于比较抗原特异性CD8 T细胞的肽敏感性。图4D，示出了使用黑素瘤异种移植模型的过继性T细胞转移的实验时间轴的示意图。图4E-4F，示出了过继性转移的SLC45A2特异性CTL(图4E)或MART1特异性CTL(图4F)针对人黑素瘤Mel526异种移植物的治疗效果的肿瘤生长曲线。用1×107个Mel526细胞皮下接种裸鼠。在肿瘤攻击之后七天，每周一次地静脉内注射SLC45A2特异性CTL或MART-1特异性CTL(1×107)持续4周，并监测肿瘤生长。
图5A-D：SLC45A2的表达和SLC45A2特异性CD8 T细胞针对黑素细胞的细胞毒活性。图5A，黑素细胞中黑素瘤分化抗原的表达。通过RT-PCR在两种不同的黑素细胞4C0197(4C)和3C0661(3C)中测试SLC45A2、MART-1、gp100和酪氨酸酶的mRNA表达。SLC45A2 mRNA在这两种黑素细胞中均表达，但与黑素瘤细胞相比水平非常低，然而其他黑素瘤分化抗原(例如MART-1、gp100和酪氨酸酶)在黑素细胞中以与黑素瘤类似的水平表达。示出了所进行的至少3个实验中一个代表性实验的结果。图5B，HLA-A*0201限制性SLC45A2特异性CD8 T细胞针对黑素细胞的细胞毒活性。SLC45A2特异性CD8 T细胞不很好地杀伤两种类型的黑素细胞(HLA-A*0201+)，但以高细胞毒作用杀伤黑素瘤细胞。相反，MART-1和gp100特异性CD8 T细胞杀伤黑素细胞以及黑素瘤细胞。使用HLA-A*0201限制性SLC45A2、MART-1和gp100特异性CD8 T细胞在不同E∶T比例下进行标准51Cr释放测定。使用Mel526(HLA-A*0201+/SLC45A2+)和A375(HLA-A*0201+/SLC45A2-)分别作为阳性对照和阴性对照。图5C，HLA-A*2402限制性SLC45A2特异性CD8 T细胞针对黑素细胞的细胞毒活性。HLA-A*2402限制性SLC45A2特异性CD8 T细胞不很好地杀伤表达HLA-A*2402的黑素细胞4C0197，但杀伤表达HLA-A*2402+/SLC45A2+的黑素瘤细胞。使用Mel526(HLA-A*2402-/SLC45A2+)作为阴性对照。用1ug/mlSLYSYFQKV(SEQ ID NO：1)肽脉冲原代黑素细胞系3C和4C，并且在标准51Cr释放测定中将其用作HLA-A*0201限制性SLC45A2特异性CTL的靶标。图5D，用mAb BB7.2染色和流式细胞术分析之后Mel526、A375以及原代黑素细胞3C和4C中表面HLA-A*0201表达的比较。
图6A-E：SLC45A2表达和SLC45A2特异性CD8 T细胞针对葡萄膜和黏膜黑素瘤细胞的细胞毒活性。图6A，葡萄膜黑素瘤细胞上的SLC45A2表达。通过RT-PCR分析SLC45A2表达并且本研究中使用的所有葡萄膜黑素瘤细胞均表达SLC45A2。图6B，SLC45A特异性CD8 T细胞针对葡萄膜黑素瘤细胞的细胞毒作用。HLAA*0201限制性SLC45A特异性CD8T细胞裂解OMM1(表达SLC45A2和HLA A*0201的葡萄膜黑素瘤细胞)但并不裂解202(表达SLC45A2但不表达HLAA*0201的葡萄膜黑素瘤细胞)。HLA A*2402限制性SLC45A特异性CD8 T细胞显示出针对表达SLC45A2和HLA A*2402的UPMD2的杀伤作用。当用S933-402肽对UPMD2进行脉冲时，HLAA*2402限制性SLC45A特异性CD8 T细胞显示出更高的细胞毒性。表达SLC45A2+和HLAA*2402-的UPMD1不被HLAA*2402限制性SLC45A特异性CD8 T细胞杀伤。在不同E∶T比例下进行细胞毒活性的标准51Cr释放测定。示出了所进行的至少2个实验中一个代表性实验的结果。图6C，HLAA*2402限制性SLC45A2特异性CTL显示出针对葡萄膜黑素瘤细胞系的裂解活性。图6D，黏膜黑素瘤细胞上的SLC45A2表达。两种类型的黏膜黑素瘤细胞均表达SLC45A2。通过RT-PCR分析SLC45A2的表达。图6E，SLC45A特异性CD8 T细胞针对黏膜黑素瘤细胞的细胞毒作用。SLC45A特异性CD8 T细胞杀伤2170(表达SLC45A2和HLA A*0201的黏膜黑素瘤细胞)但并不杀伤2042(其表达SLC45A2但不表达HLA A*0201)。在不同E∶T比例下进行细胞毒活性的标准51Cr释放测定。示出了所进行的至少2个实验中一个代表性实验的结果。
图7A-C：MAPK途径对SLC45A2表达的控制和MAPK抑制剂处理之后增强的黑素瘤细胞CTL杀伤。图7A，如通过基因表达微阵列分析所评估的被转导以表达GFP、野生型BRAF或突变BRAF(V600E)的原代黑素细胞中的黑素细胞分化抗原表达。示出了与未经转导细胞相比的SLC45A2、MART-1、gpl00、酪氨酸酶相关蛋白和酪氨酸酶的相对表达。图7B，用BRAF(V600E)特异性抑制剂达拉非尼(dabrafenib)(50nM)、MEK抑制剂曲美替尼(trametinib)(50nM)或这两种抑制剂处理BRAF(V600E)阳性黑素瘤细胞系Mel526或A375。48小时后，通过定量RT-PCR分析SLC45A2和MART-1的mRNA表达。使用未经处理的黑素瘤细胞作为对照。图7C，在用BRAFi、MEKi或这两种抑制剂处理48小时之后SLC45A2特异性T细胞介导的对黑素瘤细胞系Mel526或A375的细胞毒性杀伤。示出了与未经处理靶标相比在标准51Cr释放测定(E∶T比例＝20∶1)中SLC45A2特异性CTL针对经药物处理靶标的细胞毒活性。
图8：正常组织和癌组织中SLC45A2的表达。正常组织和癌组织中黑素细胞分化抗原的相对基因表达。正常组织中和癌症患者样品中黑素细胞分化抗原的基因表达分别使用基因型-组织表达(Genotype-Tissue Expression，GTEx)门户数据和癌症基因组图谱(theCancer Genome Atlas，TCGA)门户数据进行分析。SLC45A2在许多正常组织中几乎不表达，然而在大多数正常组织中观察到MART-1和gp100的基因表达，即使其为水平低。SLC45A2、MART-1、酪氨酸酶和gp100基因表达显示与其他癌组织中相比在皮肤黑素瘤和葡萄膜黑素瘤组织中的高表达。
图9：SLC45A2+黑素瘤细胞系Mel888中HLA的异位表达。
图10：HLA A*0201限制性健康供体的PBMC中SLC45A2特异性CD8 T细胞的产生。SLC45A2四聚体阳性CD8 T细胞的诱导。用自体SLC45A2382-390肽脉冲DC刺激来自另外两个HLA A*0201限制性健康供体的PBMC。在两次刺激之后对SLC45A2四聚体阳性CD8 T细胞进行分选，并且根据REP对分选的SLC45A2四聚体阳性CD8 T细胞进行扩增。将扩增的SLC45A2四聚体阳性CD8 T细胞用于其他实验。使用具有对应于24种不同特异性的Vβ抗体的IOTestBeta Mark TCR-Vβ库试剂盒进行SLC45A2特异性CD8 T细胞的TCR库分析。
图11：黑素细胞中的HLA表达。通过用抗HLA A2抗体和抗HLA A24抗体染色在具有不同来源的黑素细胞3C0661和4C0197中评估HLA表达。3C0661表达HLA A2和HLA A24二者。4C0197表达HLA A2但不表达HLAA24。
图12A-B：来自其他HLA-A*0201限制性供体的SLC45A2特异性CD8T细胞针对黑素细胞的细胞毒活性。图12A，来自其他供体的HLA-A*0201限制性SLC45A2特异性CD8 T细胞针对黑素细胞的细胞毒活性。SLC45A2特异性CD8 T细胞并不很好地杀伤两种类型的黑素细胞(HLA-A*0201+)但以高细胞毒性作用杀伤黑素瘤细胞。相反，MART-1和gp100特异性CD8 T细胞杀伤黑素细胞以及黑素瘤细胞。使用HLA-A*0201限制性SLC45A2特异性CD8 T细胞在E∶T＝20∶1的比例下进行标准51Cr释放测定。使用Mel526(HLA-A*0201+/SLC45A2+)和A375(HLA-A*0201+/SLC45A2-)分别作为阳性对照和阴性对照。图12B，来自其他供体的HLA-A*2402限制性SLC45A2特异性CD8 T细胞针对黑素细胞的细胞毒活性。
图13A-B：黑素瘤和原代黑素细胞中MDA基因表达的比较。图13A，正常组织(GTex门户数据库)、皮肤和葡萄膜黑素瘤肿瘤(TCGA数据库)、黑素瘤细胞系(MD Anderson TIL实验室数据库)或原代黑素细胞中MART1、gp100、酪氨酸酶和SLC45A2的RNAseq转录物表达。TPM，转录物/百万(transcript per million)。图13B，如通过公式{平均肿瘤转录物表达/平均原代黑素细胞转录物表达}所计算的MART1、gp100、酪氨酸酶和SLC45A2的肿瘤过表达指数。
具体实施方式
I.使用SLC45A2肽的免疫治疗
本文中所述的SLC45A2肽(例如，包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)可用于癌症的免疫治疗。例如，SLC45A2肽可与T细胞群接触或用于刺激T细胞群以诱导识别或结合SLC45A2肽的T细胞增殖。在另一些实施方案中，本发明的SLC45A2肽可施用于对象(例如人患者)以增强对象针对癌症的免疫应答。对于肿瘤(例如黑素瘤)，已显示肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)的过继性转移产生显著的患者益处(Hawkins等，2010)。
SLC45A2肽可包含在主动免疫治疗(例如，癌症疫苗)或被动免疫治疗(例如，过继性免疫治疗)中。主动免疫治疗包括用经纯化的SLC45A2肽抗原或免疫显性SLC45A2肽(天然或经修饰的)对对象进行免疫接种；或者，可向对象施用经SLC45A2肽脉冲(或经编码SLC45A2抗原的基因转染)的抗原呈递细胞。SLC45A2肽可以是经修饰的或包含一个或更多个突变，例如替换突变。被动免疫治疗包括过继性免疫治疗。过继性免疫治疗通常涉及向对象施用细胞，其中所述细胞(例如，细胞毒性T细胞)已经在体外针对SLC45A2致敏(参见例如US 7910109)。
在一些实施方案中，可在过继性免疫治疗中使用流式细胞术以用于通过与基于羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE)的增殖测定组合使用例如T细胞受体(TCR)Vβ抗体来迅速分离人肿瘤抗原特异性T细胞克隆。参见例如Lee等(2008)，其通过引用并入而不放弃任何权利。在一些实施方案中，可使用四聚体引导的细胞分选，例如Pollack等中所述的方法。用于过继性免疫治疗的多种培养方案也是已知的，并且可用于本发明；在一些实施方案中，可在不需要使用抗原呈递细胞的条件下培养细胞(例如Hida等，2002)。在另一些实施方案中，可在利用抗原呈递细胞(例如树突细胞)的培养条件下扩增T细胞(Nestle等，1998)，并且在一些实施方案中，出于此目的可使用人工抗原呈递细胞(Maus等，2002)。用于过继性免疫治疗的另外的方法在Dudley等(2003)中公开，其可用于与本发明。多种方法是已知的并且可用于克隆和扩增人抗原特异性T细胞(参见例如Riddell等，1990)。
在某些实施方案中，可使用以下方案来产生选择性地识别SLC45A2肽的T细胞。可使用先前报道的方法从HLA-A2+正常供体和患者中产生肽特异性T细胞系(Hida等，2002)。简言之，可在96孔U型底微培养板(Coming Incorporated，Lowell，MA)中的约200μl培养基中用约10μg/ml的每种肽一式四份地刺激PBMC(1×105个细胞/孔)。所述培养基可由以下组成：50％AIM-V培养基(Invitrogen)、50％RPMI 1640培养基(Invitrogen)、10％人AB血清(Valley Biomedical，Winchester，VA)和100IU/ml的白介素-2(IL-2)。可用对应的肽约每3天再刺激细胞。在5次刺激后，可洗涤来自每个孔的T细胞并在存在或不存在对应肽的情况下将其与T2细胞一起孵育。在约18小时后，可通过ELISA来确定上清液中干扰素(IFN)-γ的产生。分泌大量IFN-γ的T细胞可通过迅速扩增方案进一步扩增(Riddell等，1990；Yee等，2002b)。
在一些实施方案中，免疫治疗可使用与细胞渗透剂(例如脂质体或细胞渗透肽(cell penetrating peptide，CPP))缔合的本发明SLC45A2肽。用肽脉冲的抗原呈递细胞(例如树突细胞)可用于增强抗肿瘤免疫(Celluzzi等，1996；Young等，1996)。脂质体和CPP将在以下进一步详细描述。在一些实施方案中，免疫治疗可使用编码本发明SLC45A2肽的核酸，其中所述核酸例如在病毒载体或非病毒载体中递送。
SLC45A2在癌症(例如黑素瘤)中表达。SLC45A2(溶质载体家族45，成员2；还称作膜缔合蛋白MATP或AIM-1)是黑素细胞分化蛋白(例如MART-1、gp100、酪氨酸酶和TRP-1)，并且是定位在黑素体膜中的转运蛋白(Newton jm 2001)。尽管精确的功能未知，但其可能与以两种不同作用之一产生黑素相关。一种是适当地加工并将酪氨酸酶运输至黑素体(Costin2003)，并且另一种是在黑素体内维持特定的pH(Graf等，2005；Lucotte等，2010)。SLC45A2与深色皮肤、毛发和眼睛色素沉着有关，并且在人中，SLC45A2的致病性突变通过破坏黑素生物合成而导致IV型眼皮肤白化病(type IV oculocutaneous albinism，OCA4)(Fukamachi 2001，Newton2001，du2002)。令人感兴趣的是，突变的SLC45A2变体与黑素瘤风险相关，并且已提出其基因是浅肤色群体中的黑素瘤易感性基因(Guedj m2008，Fernandeslp 2008，ibarrola 2012)。
在一些实施方案中，本发明的SLC45A2肽可用于免疫治疗以在哺乳动物对象(例如人患者)中治疗黑素瘤。黑素瘤可以是例如皮肤黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、黏膜黑素瘤或转移性黑素瘤。预期，表达SLC45A2的任何癌症可通过使用本发明的SLC45A2肽的免疫治疗进行治疗。
识别黑素细胞抗原(MART-1、gp100、酪氨酸酶)的循环肿瘤抗原特异性T细胞可在黑素瘤患者中检测到，使用基于四聚体的技术从外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)中分离，并且利用经辐照的饲养细胞使用抗CD3和IL-2扩增超过20倍(Yee 2012)。可通过使用用识别CTL表位之肽脉冲的自体树突细胞(dendritic cell，DC)刺激PBMC来在体外诱导肿瘤抗原特异性CD8 T细胞。在致敏期间，IL-21的暴露导致抗原特异性CTL的频率和数目提高并且驱使至具有记忆样表型的CTL，其经历长期体内持续性并且介导肿瘤消退(Li 2005；Chapuis 2013)。在离体产生用于过继性转移的强效肿瘤抗原特异性CTL中使用IL-21的策略非常有用并且已如以下实例中所所述使用。
II.SLC45A2肽
本文中使用的术语“肽”涵盖以下氨基酸链，其包含7至35个氨基酸，优选8至35个氨基酸残基，并且甚至更优选8至25个氨基酸，或者长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸，或者可从其中来源的任何范围。例如，在一些实施方案中，本发明的SLC45A2肽可包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的SLC45A2肽，或者由其组成。表4中提供了可用于本发明多个方面的另外的SLC45A2肽。本文中使用的“抗原性肽”是以下肽，其当引入脊椎动物中时可刺激在脊椎动物中产生抗体(即是抗原性的)，并且其中该抗体可选择性地识别和/或结合该抗原性肽。抗原性肽可包含免疫反应性SLC45A2肽，并且可包含另外的序列。另外的序列可来自于天然抗原且可以是异源性的，并且这样的序列可以但不需要是免疫原性的。在一些实施方案中，SLC45A2肽可以与HLA-A2或HLA-A24选择性地结合。在某些实施方案中，SLC45A2肽的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸，或可从其中来源的任何范围。优选地，SLC45A2肽的长度为8至35个氨基酸。在一些实施方案中，SLC45A2肽的长度为8至10个氨基酸。
如本领域技术人员所理解的，MHC分子可结合不同尺寸的肽，但通常不结合全长蛋白质。尽管MHC I类分子传统地被描述为与长度为8至11个氨基酸的肽结合，但是已经显示，长度为15个氨基酸的肽可通过在结合位点的中间凸出或延伸到MHC I类结合沟之外而与MHC I类分子结合(Guo等，1992；Burrows等，2006；Samino等，2006；Stryhn等，2000；Collins等，1994；Blanchard和Shastri，2008)。此外，最近的研究也表明较长的肽可被较高效地内呑、加工、以及由抗原呈递细胞呈递(Zwaveling等，2002；Bijker等，2007；Melief和van derBurg，2008；Quintarelli等，2011)。如Zwaveling等(2002)中所表明的，长度为多至35个氨基酸的肽可用于选择性地结合II类MHC并且是有效的。如技术人员会立刻理解的，天然存在的全长SLC45A2将不可用于选择性地结合II类MHC以使其被内呑并且产生T细胞增殖。通常来说，天然存在的全长SLC45A2蛋白并不会展现出这些特性并将因此不可用于这些免疫治疗目的。
在某些实施方案中，SLC45A2肽是免疫原性或抗原性的。如以下实例中所示出的，本发明的多种SLC45A2肽可促进T细胞增殖。预期，这样的肽可用于诱导一定程度的保护性免疫。
SLC45A2肽可以是重组肽、合成肽、经纯化肽、固定化肽、经可检测地标记的肽、经包封肽或载体表达的肽(例如，由在载体中的核酸编码的肽，所述载体包含与该核酸可操作地连接的异源启动子)。在一些实施方案中，可向对象(例如人患者)施用合成的SLC45A2肽以在该对象中诱导免疫应答。与重组表达肽相比，合成的肽可展现出某些优点，例如细菌污染的风险降低。SLC45A2肽还可包含在配制成用于施用于哺乳动物或人对象的药物组合物(例如疫苗组合物)中。
A.细胞渗透肽
SLC45A2肽还可与细胞渗透肽(CPP)缔合或共价结合。可与SLC45A2肽共价结合的细胞渗透肽包括例如HIV Tat、疱疹病毒VP22、果蝇触角足(Drosophila Antennapedia)同源框基因(homeobox)产物、信号序列、融合序列或抗微生物肽I(protegrin I)。使肽与CPP共价结合可延长树突细胞对肽的呈递，因此增强抗肿瘤免疫(Wang和Wang，2002)。在一些实施方案中，本发明的SLC45A2肽(例如，包含在肽或多表位串内)可与CPP共价结合(例如，通过肽键)以产生融合蛋白。在另一些实施方案中，SLC45A2肽或编码SLC45A2肽的核酸可被包封在脂质体(例如多层、囊泡状或多囊泡状脂质体)内或与其缔合。
本文中使用的“缔合”意指物理缔合、化学缔合或二者。例如，缔合可涉及共价键、疏水性相互作用、包封、表面吸附等。
本文中使用的“细胞渗透剂”是指增强肽/多表位串向抗原呈递细胞的细胞内递送的组合物或化合物。例如，细胞渗透剂可以是当与肽缔合时增强其穿过质膜之能力的脂质。或者，细胞渗透剂可以是肽。细胞渗透肽(CPP)是本领域中已知的，并且包括例如HIV的Tat蛋白(Frankel和Pabo，1988)、HSV的VP22蛋白(Elliott和O′Hare，1997)和成纤维细胞生长因子(Lin等，1995)。
已从果蝇触角足同源框基因(Antp)的第三个螺旋、HIV Tat和疱疹病毒VP22中鉴定出细胞渗透肽(或“蛋白质转导结构域”)，其所有均包含富含精氨酸和赖氨酸残基的带正电荷的结构域(Schwarze等，2000；Schwarze等，1999)。此外，来自于信号序列的疏水性肽也已被鉴定为细胞渗透肽。(Rojas等，1996；Rojas等，1998；Du等，1998)。已经显示，使这些肽与标志物蛋白(例如β-半乳糖苷酶)偶联赋予标志物蛋白被高效地内化到细胞中，并且包含这些肽的嵌合框内融合蛋白已经被用于在体外和体内将蛋白质递送到广谱细胞类型中(Drin等，2002)。这些细胞渗透肽与根据本发明的SLC45A2肽的融合可增强多肽的细胞摄取。
在一些实施方案中，通过使脂质(例如硬脂酸酯或豆蔻酸酯)与多肽连接来促进细胞摄取。已经显示，脂化(lipidation)增强肽进入细胞中。脂质部分的连接是本发明提高细胞的多肽摄取的另一种方式。细胞摄取在以下进一步讨论。
本发明的SLC45A2肽可包含在脂质体疫苗组合物中。例如，脂质体组合物可以是或包含脂蛋白体组合物(proteoliposomal composition)。用于产生可用于本发明的脂蛋白体组合物的方法例如在Neelapu等(2007)和Popescu等(2007)中描述。在一些实施方案中，脂蛋白体组合物可用于治疗黑素瘤。
通过增强SLC45A2多肽的摄取，降低治疗所需的蛋白质或肽的量可以是可能的。这进而可显著降低治疗成本并提高治疗剂的供应。较低的剂量还可使肽的潜在免疫原性最小化并限制毒性副作用。
在一些实施方案中，SLC45A2肽可与纳米粒缔合以形成纳米粒-多肽复合物。在一些实施方案中，纳米粒是脂质体或其他基于脂质的纳米粒，例如基于脂质的囊泡(例如，DOTAP：胆固醇囊泡)。在另一些实施方案中，纳米粒是基于铁氧化物的超顺磁性纳米粒。直径为约10nm至100nm的超顺磁性纳米粒足够小以避免被脾扣押(sequester)，但足够大以避免被肝清除。该尺寸的颗粒可渗透非常小的毛细血管并且可有效地分布在身体组织中。可使用超顺磁性纳米粒-多肽复合物作为MRI造影剂来鉴定和追踪摄取SLC45A2肽的那些细胞。在一些实施方案中，纳米粒是半导体纳米晶体或半导体量子点，其二者均可用于光学成像。在另一些实施方案中，纳米粒可以是在二氧化硅核心之上包含金层的纳米壳。纳米壳的一个优点是可使用标准化学来使多肽与金层缀合。在另一些实施方案中，纳米粒可以是富勒烯或纳米管(Gupta等，2005)。
肽通过肾从循环中迅速除去，并且在血清中对通过蛋白酶的降解敏感。通过使SLC45A2肽与纳米粒缔合，本发明的纳米粒-多肽复合物可提供针对降解的保护和/或降低通过肾的清除。这可提高多肽的血清半衰期，从而降低有效治疗的多肽剂量需求。此外，这可降低治疗成本，并且使治疗的免疫学问题和毒性反应最小化。
B.多表位串
在一些实施方案中，SLC45A2肽包括或包含在多表位串中。多表位串是包含连接在一起的来自一个或更多个抗原的多个抗原表位的肽或多肽。多表位串可用于在对象(例如人对象)中诱导免疫应答。多表位串先前已被用于靶向疟疾和其他病原体(Baraldo等，2005；Moorthy等，2004；Baird等，2004)。多表位串可以是指核酸(例如，编码包括SLC45A2肽在内的多种抗原的核酸)，或者肽或多肽(例如，包含包括SLC45A2肽在内的多种抗原)。多表位串可包含在癌症疫苗组合物中。
C.生物功能等同物
本发明的SLC45A2肽可被修饰以包含不改变其分别与HLA-A2或HLA-A24结合区的相互作用的氨基酸替换、插入和/或缺失。SLC45A2肽的此类生物功能等同物可以是具有类似特征或在其他方面期望的特征(例如，HLA-A2或HLA-A24的结合)的分子。作为一个非限制性实例，在本文中公开的SLC45A2肽中某些氨基酸可被替换成其他氨基酸而没有可感知的相互作用能力损失，如通过肽与HLA-A2或HLA-A24的结合可检测地未改变所表明的。在一些实施方案中，SLC45A2在锚定位置具有替换突变，例如在以下位置中一个、两个或全部处具有替换突变：1(P1)、2(P2)和/或9(P9)。因此，考虑在序列和/或结构上被修饰但生物学效用或活性未改变的本文中公开的SLC45A2肽(或编码这样的肽的核酸)仍在本发明的范围之内。
技术人员还充分理解的是，生物功能等同肽的定义所固有的是以下概念：存在对可在分子的限定部分中做出同时仍然维持可接受水平的等同生物活性的改变的数量的限制。因此，本文中将生物功能等同肽定义为其中某些(不是大部分或所有)氨基酸可被替换的那些肽。当然，根据本发明可容易地制备和使用多种具有不同替换的不同肽。
技术人员还意识到，在显示某些残基(例如在特定表位中的残基)对肽的生物或结构特性特别重要的情况下，这样的残基通常可不更换。在本发明中可以是这种情况，如本文中公开的SLC45A2肽中的突变可导致物种特异性丧失并且进而降低所得肽用于本发明方法的效用。因此，抗原性的(例如，特异性地结合HLA-A2或HLA-A24)并且包含保守氨基酸替换的肽被理解为包括在本发明中。保守替换最不可能显著地改变蛋白质的活性。“保守氨基酸替换”是指将氨基酸用化学上类似的氨基酸替换，即将非极性氨基酸用其他非极性氨基酸替换；将极性氨基酸用其他极性氨基酸替换，将酸性残基用其他酸性氨基酸替换，等。
氨基酸替换(例如可用于修饰本文中公开的SLC45A2肽的那些)通常基于氨基酸侧链取代基的相对类似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。对氨基酸侧链取代基的尺寸、形状和类型的分析揭示，精氨酸、赖氨酸和组氨酸全部是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸全部具有类似的尺寸；并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸全部具有大致相似的形状。因此，基于这些考虑，本文中将精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸定义为生物功能等同物。在一些实施方案中，突变可增强TCR-pMHC相互作用和/或肽-MHC结合。
本发明还考虑了本文中公开的SLC45A2肽的同种型。同种型与本发明的肽包含相同数目和种类的氨基酸，但同种型具有不同的分子结构。本发明所考虑的同种型是与本文中所述的本发明肽具有相同特性的那些。
可通过对已存在氨基酸进行化学修饰或通过从头合成本文中公开的肽在蛋白质中并入非标准氨基酸。非标准氨基酸是指与由遗传密码所编码的二十种标准氨基酸在化学结构上不同的氨基酸。
在一些选定实施方案中，本发明考虑了本文中公开的SLC45A2肽的化学衍生物。“化学衍生物”是指具有一个或更多个通过功能性侧基的反应而化学衍生化的残基并且保留生物活性和效用的肽。这样的衍生化肽包括例如以下那些，其中游离氨基已被衍生化以形成特定盐或通过烷基化和/或酰化、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基、甲酰基或乙酰基等衍生化。游离的羧基可被衍生化以形成有机或无机盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼并且优选酰胺(伯胺或仲胺)。化学衍生物可包括包含20种标准氨基酸的一种或更多种天然氨基酸衍生物的那些肽。例如，可用4-羟脯氨酸替换丝氨酸；并且可用鸟氨酸替换赖氨酸。
应注意的是，所有氨基酸残基序列在本文中均用左右取向为氨基末端至羧基末端的常规方向的式来表示。此外，应注意的是，在氨基酸残基序列的起点或末端的短划线表示与具有一个或更多个氨基酸残基的另外序列的肽键。本文中所述的氨基酸优选是“L”异构体形式。然而，可用“D”异构体形式的残基替换任何L-氨基酸残基，只要蛋白质保留本文中所述的期望功能特性即可。
优选的SLC45A2肽或其类似物优选特异性地或优先地结合HLA-A2或HLA-A24。确定特定SLC45A2肽或经标记肽或者其类似物是否或以何种程度可结合HLA-A2或HLA-A24并且可使用例如以下体外测定来进行评估：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、免疫染色、胶乳凝集(latex agglutination)、间接血凝测定(indirect hemagglutination assay，IHA)、补体结合(complement fixation)、间接免疫荧光测定(FA)、浊度法(nephelometry)、流式细胞术测定、化学发光测定、侧流免疫测定、u-捕获测定、质谱测定、基于颗粒的测定、抑制测定和/或亲合力测定。
D.编码SLC45A2肽的核酸
在一方面，本发明提供了编码分离的SLC45A2肽的核酸，所述SLC45A2肽包含与SEQID NO.1至2中任一个具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，或者所述肽与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2相比可具有1、2、3或4个点突变(例如，替换突变)。如上所述，这样的SLC45A2肽的长度可以是例如8至35个氨基酸，或可从其中来源的任何范围。在一些实施方案中，SLC45A2肽对应于SLC45A2蛋白的一部分(NM_016180或NM_00101250；可使用这些剪接变体中的任一种)。术语“核酸”旨在包括DNA和RNA并且可以是双链或单链的。
本发明的一些实施方案提供了可特异性地结合HLA-A2或HLA-A24的重组产生的SLC45A2肽。因此，可使编码SLC45A2肽的核酸与表达载体可操作地连接，并且使用分子生物学领域中公知的方法在合适的表达系统中产生肽。编码本文中公开的SLC45A2肽的核酸可并入到确保该肽良好表达的任何表达载体中。可能的表达载体包括但不限于黏粒、质粒或经修饰病毒(例如复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，只要该载体适合于宿主细胞的转化即可。
“适合于宿主细胞的转化”的重组表达载体意指，该表达载体包含本发明的核酸分子和与该核酸分子有效连接的基于待用于表达的宿主细胞选择的调节序列。术语“有效连接”或“可操作地连接”可互换使用，并且旨在意指核酸以允许该核酸表达的方式与调节序列连接。
因此，本发明提供了重组表达载体，其包含编码SLC45A2肽的核酸，和用于转录和翻译所插入的蛋白质序列的必需调节序列。合适的调节序列可来自于多种来源，包括细菌基因、真菌基因或病毒基因(例如参见Goeddel(1990)中描述的调节序列)。
合适调节序列的选择通常取决于所选择的宿主细胞，并且可由本领域普通技术人员容易地实现。这样的调节序列的一些实例包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列；核糖体结合序列，其包括翻译起始信号。此外，根据所选择的宿主细胞和所使用的载体，其他序列(例如复制起点、另外的DNA限制性位点、增强子和赋予转录可诱导性的序列)也可并入到表达载体中。还将理解的是，必需调节序列可由天然蛋白质和/或其侧翼区提供。
重组表达载体还可包含选择性标志基因，其有利于选择用本文中公开的重组SLC45A2肽转化或转染的宿主细胞。选择性标志基因的实例是编码赋予针对某些药物之抗性的蛋白质(例如G418和潮霉素)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或萤火虫萤光素酶的基因。选择性标志基因的转录通过选择性标志蛋白质(例如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或萤火虫萤光素酶)的浓度改变来监测。如果选择性标志基因编码赋予抗生素抗性(例如新霉素抗性)的蛋白质，则可用G418选择转化体细胞。已经并入选择性标志基因的细胞将存活下来，而其他细胞将死亡。这使得可以可视化和测定重组表达载体的表达，并且特别地确定突变对表达和表型的影响。将理解的是，选择性标志可引入与目的核酸不同的载体上。
重组表达载体可被引入到宿主细胞中以产生转化体宿主细胞。术语“转化体宿主细胞”旨在包括已经用本发明的重组表达载体转化或转染的原核和真核细胞。术语“用......转化”、“用......转染”、“转化”和“转染”旨在涵盖通过本领域中已知的许多可能技术之一将核酸(例如载体)引入到细胞中。合适的宿主细胞包括很多种原核和真核宿主细胞。例如，本发明的蛋白质可在细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli))、昆虫细胞(使用杆状病毒)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。
本发明的核酸分子也可使用标准技术化学合成。化学合成多聚脱氧核苷酸的多种方法是已知的，包括固相合成，其与肽合成类似已经在可商购获得的DNA合成仪中完全自动化(参见例如Itakura等，美国专利No.4,598,049；Caruthers等，美国专利No.4,458,066；以及Itakura，美国专利No.4,401,796和4,373,071)。
III.抗体
在本发明的某些方面，可针对本发明SLC45A2肽、SLC45A2肽-HLA-A2复合物或SLC45A2肽-HLA-A24复合物产生一种或更多种抗体。这些抗体可用于例如治疗癌症，或可包含在癌症疫苗中。在一些实施方案中，可向对象(例如人患者)施用选择性地识别SLC45A2肽、SLC45A2肽-HLA-A2复合物或SLC45A2肽-HLA-A24复合物的抗体以治疗黑素瘤。
在一些实施方案中，存在诱导针对表达所靶向细胞表面多肽的靶细胞的树突细胞(DC)介导的细胞杀伤的方法，其包括：a)使靶细胞与包含选择性地结合SLC45A2肽-HLA-A2复合物或SLC45A2肽-HLA-A24复合物的抗体的多肽接触；以及b)在促进靶细胞杀伤的条件下使靶细胞暴露于树突细胞。
本文中使用的术语“抗体”旨在广泛地是指任何免疫结合剂，例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常来说，在一些实施方案中优选IgG和/或IgM，因为其典型地是在生理情况下最常见的抗体，并且因为其在实验室环境中容易制备。
术语“抗体”用于指具有抗原结合区的任何抗体样分子，并且包括抗体片段，例如Fab′、Fab、F(ab′)2、单结构域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)等。用于制备和使用多种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域中公知的。用于制备和表征抗体的方式也是本领域中公知的(参见例如，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；其通过引用并入本文)。
“微型抗体(mini-antibody)”或“微抗体(minibody)”也被考虑用于本发明。微抗体是在其C端包含通过铰链区与sFv分开的寡聚化结构域的sFv多肽链。Pack等(1992)。寡聚化结构域包含自缔合α螺旋(例如亮氨酸拉链)，其可通过另外的二硫键进一步稳定化。寡聚化结构域被设计成与跨膜矢量折叠相容，所述跨膜矢量折叠是被认为促进将多肽在体内折叠成功能性结合蛋白质的过程。通常来说，微抗体使用本领域中公知的重组方法来产生。参见例如Pack等(1992)；Cumber等(1992)。
本发明还考虑了抗体样结合肽模拟物。Liu等(2003)描述了“抗体样结合肽模拟物”(ABiP)，其为用作简化抗体的肽并且具有某些优点(血清半衰期更长以及合成方法较不麻烦)。
认识到单克隆抗体(monoclonal antibody，MAb)具有某些优点，例如可重现性和大规模生产，并且其通常优选使用。本发明因此提供了人、鼠、猴、大鼠、仓鼠、兔和甚至鸡来源的单克隆抗体。由于制备容易且试剂可现成获得，将经常优选鼠单克隆抗体。
“人源化”抗体也在考虑之中，如携带人恒定区结构域和/或可变区结构域的来自小鼠、大鼠或其他物种的嵌合抗体、双特异性抗体、重组和经改造抗体，及其片段。本文中使用的术语“人源化”免疫球蛋白是指包含人框架区和来自非人(通常为小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或更多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被称作“供体(donor)”并且提供框架的人免疫球蛋白被称作“接纳体(acceptor)”。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。
A.用于产生单克隆抗体的方法
用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常与用于制备多克隆抗体的那些以相同的方式开始。简言之，多克隆抗体通过用根据本发明的LEE或CEE组合物免疫接种动物并从经免疫接种动物中收集抗血清来制备。
广泛范围的动物物种可用于产生抗血清。通常来说，用于产生抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。如本领域技术人员知晓的，动物的选择可取决于操作的容易程度、成本或期望的血清量。本发明的抗体还可通过产生针对目的免疫球蛋白重链和轻链序列的转基因哺乳动物或植物并从其以可回收形式产生抗体来转基因产生。关于在哺乳动物中的转基因产生，抗体可在山羊、乳牛或其他哺乳动物的乳中产生并从其回收。参见例如美国专利No.5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957。
如本领域中还公知的，特定免疫原组合物的免疫原性可通过使用免疫应答的非特异性刺激物(被称作佐剂)来增强。合适的佐剂包括所有可接受的免疫刺激性化合物，例如细胞因子、趋化因子、辅因子、毒素、疟原虫、编码这样的佐剂的合成组合物或者LEE或CEE。
可使用的佐剂包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-干扰素、GMCSP、BCG、氢氧化铝、MDP化合物(例如thur-MDP和nor-MDP)、CGP(MTP-PE)、脂质A、以及单磷酰脂质A(MPL)。RIBI也在预期之中，其在2％角鲨烯/吐温80乳剂中包含从细菌中提取的三种组分：MPL、海藻糖双霉菌酸酯(trehalose dimycolate，TDM)和细胞壁骨架(cell wall skeleton，CWS)。甚至可使用MHC抗原。示例性的通常优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(含有死结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的免疫应答的非特异性刺激物)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
除佐剂之外，还可期望共施用已经显示上调T细胞免疫或下调抑制细胞活性的生物应答调节剂(biologic response modifier，BRM)。这样的BRM包括但不限于西咪替丁(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA)；低剂量环磷酰胺(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead，NJ)；细胞因子，例如γ-干扰素、IL-2或IL-12或者编码参与免疫辅助功能的蛋白质(例如B-7)的基因。
用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫接种的动物而变化。多种途径可用于施用免疫原，包括但不限于皮下、肌内、皮内、表皮内、静脉内和腹膜内。多克隆抗体的产生可通过在免疫接种之后的不同点对经免疫接种动物的血液进行采样来监测。
还可给予第二、加强的剂量(例如，以注射剂提供)。重复加强和滴定的过程直至达到合适的效价。当获得期望的免疫原性水平时，可对经免疫接种动物取血，分离并储存血清，和/或可将动物用于产生MAb。
对于兔多克隆抗体的产生，可通过耳静脉或作为替代地通过心脏穿刺对动物取血。使取出的血液凝固，并随后离心以使血清组分与全细胞和血块分离。可将血清原样用于多种应用，或者可通过公知方法(例如使用另一种抗体、与固体基质结合的肽、或者通过使用例如蛋白A或蛋白G色谱进行亲和色谱)来纯化期望的抗体级分。
MAb可通过使用公知的技术容易地制备，所述技术例如通过引用并入本文的美国专利4,196,265中例示的那些。通常来说，该技术涉及用选定的免疫原组合物(例如，经纯化或经部分纯化的蛋白质、多肽、肽或结构域)免疫接种合适的动物，无论所述免疫原组合物是野生型组合物还是突变组合物。免疫接种组合物以有效地刺激抗体产生细胞的方式施用。
用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常与用于制备多克隆抗体的那些以相同的方式开始。啮齿动物(例如小鼠和大鼠)是优选的动物，然而也可使用兔、绵羊或青蛙细胞。大鼠的使用可提供某些优点(Goding，1986，第60-61页)，但优选小鼠，其中BALB/c小鼠是最优选的，因为其最常规地使用并且通常提供较高百分比的稳定融合。
向动物注射抗原，通常如上所述。抗原可与佐剂(例如弗氏完全或不完全佐剂)混合。用相同抗原或编码该抗原的DNA进行加强施用会以约2周的间隔发生。
在免疫接种之后，选择具有用于产生抗体之潜力的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)用于MAb产生方案。这些细胞可从活检的脾、扁桃体或淋巴结中或从外周血样品中获得。优选脾细胞和外周血细胞，前者是因为其是在正分裂的浆母细胞阶段的抗体产生细胞的丰富来源，且后者因为外周血是容易获取的。
通常来说，对动物组进行免疫接种，且移取具有最高抗体效价的动物的脾，并通过用注射器使脾匀浆来获得脾淋巴细胞。通常来说，来自经免疫接种小鼠的脾包含约5×107至2×108个淋巴细胞。
然后，使来自经免疫接种动物的抗体产生B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞的细胞融合，所述永生化骨髓瘤细胞通常是与经免疫接种动物相同物种的细胞。适合用于杂交瘤产生融合过程的骨髓瘤细胞系优选地是非抗体产生的，具有高融合效率和使其随后不能够在仅支持期望融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择性培养基中生长的酶缺陷。
如本领域技术人员已知的，可使用多种骨髓瘤细胞中的任一种(Goding，第65-66页，1986；Campbell，第75-83页，1984)。引用)。例如，当经免疫接种动物是小鼠时，可使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul；对于大鼠，可使用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；并且U-266、GM 1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6全部可用于与人细胞融合结合。关于骨髓瘤表达系统的讨论，参见Yoo等(2002)。
一种优选的鼠骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也称作P3-NS-1-Ag4-1)，其容易地可通过请求细胞系库编号GM3573从NIGMS人遗传突变体细胞库获得。可使用的另一种小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠鼠骨髓瘤SP2/0非生产细胞系。
用于产生抗体产生脾细胞或抗体产生淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包括：在存在促进细胞膜融合的试剂(化学的或电的)的情况下使体细胞与骨髓瘤细胞以2∶1的比例混合，但是该比例可分别从约20∶1变化到约1∶1。Kohler和Milstein(1975；1976)已经描述了使用仙台病毒(Sendai virus)的融合方法，并且Gefter等(1977)已经描述了使用聚乙二醇(PEG)(例如37％(v/v)PEG)的那些方法。使用电诱导融合方法也是合适的(Goding第71-74页，1986)。
融合操作通常以低频率(约1×10-6至1×10-8)产生活杂交体。然而，这并不构成问题，因为通过在选择性培养基中培养，活的融合杂交体与亲本未融合细胞(特别是在正常情况下将继续无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)区分开来。选择性培养基通常是在组织培养基中包含阻断核苷酸的从头合成的试剂的培养基。示例性且优选的试剂为氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶二者的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。当使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤时，向培养基补充作为核苷酸来源的次黄嘌呤和胸苷(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，向培养基补充次黄嘌呤。
在一些实施方案中，使用HAT选择培养基。通常来说，只有能够操作核苷酸补救途径的细胞才能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救途径的关键酶(例如，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine phosphoribosyl transferase，HPRT))中有缺陷，并且其不能存活。B细胞可操作该途径，但是其在培养中具有有限的寿命并且通常在约2周内死亡。因此，可在选择性培养基中存活的唯一细胞是由杂交瘤和B细胞形成的那些杂交体。
这种培养可提供从中可选择特定杂交瘤的杂交瘤群。通常来说，杂交瘤的选择如下进行：通过在微量滴定板中进行单克隆稀释来培养细胞，随后测试单独的克隆上清液(在约2至3周之后)的期望反应性。测定应是灵敏、简单且迅速的，例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬斑测定、斑点免疫结合测定等。
然后，可使选定的杂交瘤连续稀释并克隆到单独的抗体产生细胞系中，所述克隆可随后无限增殖以提供MAb。细胞系可以以两种基本方式用于MAb产生。第一，可将杂交瘤样品注射(通常注射到腹膜腔中)到用于提供用于原始融合的体细胞和骨髓瘤细胞的类型的组织相容性动物(例如，同基因小鼠)中。任选地，该动物在注射前用烃(尤其是例如姥鲛烷(四甲基十五烷)的油)致敏。经注射的动物产生分泌由融合细胞杂交体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后，可取出动物的体液(例如血清或腹水)以提供高浓度的MAb。第二，可体外培养单独的细胞系，在此MAb被自然地分泌到培养基中，其可从培养基中以高浓度容易地获得。
进一步地，可使用许多已知的技术来增强由生产细胞系表达本发明的抗体(或从其来源的其他部分)。例如，谷氨酰胺合成酶和DHFR基因表达系统是用于在某些条件下增强表达的常见方法。高表达细胞克隆可使用常规技术(例如有限稀释克隆和微滴技术)来鉴定。GS系统与欧洲专利No.0 216 846、0 256 055和0 323 997以及欧洲专利申请No.89303964.4结合全部或部分地讨论。
如果期望的话，可使用过滤、离心和多种色谱方法(例如HPLC或亲和色谱)对通过任一种方式产生的MAb进行进一步纯化。本发明单克隆抗体的片段可通过包括用酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化的方法和/或通过经化学还原切割二硫键来由如此产生的单克隆抗体获得。或者，本发明所涵盖的单克隆抗体片段可使用自动化肽合成仪来合成。
还考虑了可使用分子克隆方法来产生单克隆抗体。在一个实施方案中，由从经免疫接种动物的脾分离的RNA制备组合免疫球蛋白噬菌粒文库，并且通过使用表达抗原的细胞和对照细胞进行淘选来选择表达合适抗体的噬菌粒。该方法相对于常规杂交瘤技术的优点是在单轮中可产生并筛选约104倍多的抗体，并且通过进一步提高发现合适抗体的机会的H链和L链组合产生新特异性。在另一个实例中，LEE或CEE可用于在体外用无细胞系统产生抗原。这些可作为靶标用于扫描单链抗体文库。这将使得能够无需使用动物即可非常快速地鉴定出许多不同的抗体。
可用于本发明一些实施方案的用于产生抗体的另一个实施方案见于美国专利No.6,091,001，其描述了使用Cre介导的位点特异性重组来产生由包含经修饰免疫球蛋白基因座的细胞基因组序列表达抗体的细胞的方法。该方法涉及：首先用包含lox位点和与第一DNA序列同源的靶向序列的同源性靶向载体转染抗体产生细胞，所述第一DNA序列临近基因组序列的待转化成经修饰区域的免疫球蛋白基因座区域，这样第一lox位点通过位点特异性同源重组插入到基因组序列中。然后，用lox靶向载体转染细胞，所述载体包含适合于与已整合的lox位点进行Cre介导的重组的第二lox位点和用于将免疫球蛋白基因座区域转化成经修饰区域的修饰序列。该转化如下进行：使lox位点与Cre在体内相互作用，使得修饰序列通过lox位点的Cre介导的位点特异性重组插入到基因组序列中。
或者，本发明所涵盖的单克隆抗体片段可使用自动化肽合成仪、或通过在大肠杆菌(E.coli)中表达全长基因或基因片段来合成。
B.抗体缀合物
本发明还提供了针对本发明的SLC45A2肽或SLC45A2肽-HLA-A2复合物的、通常为单克隆类型的抗体，其与至少一种试剂连接以形成抗体缀合物。为了提高抗体分子作为诊断剂或治疗剂的效力，常规地与至少一种期望的分子或部分连接或共价结合或复合。这样的分子或部分可以是但不限于至少一种效应分子或报道分子。效应分子包含具有期望活性(例如细胞毒活性)的分子。已与抗体连接的效应分子的非限制性实例包括毒素、抗肿瘤剂、治疗性酶、放射性标记的核苷酸、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡核苷酸或多核苷酸。相比之下，报道分子被定义为可使用测定检测的任何部分。与抗体缀合的报道分子的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、生色团、发光分子、光亲和分子、着色颗粒或配体(例如生物素)。
可使用具有足够选择性、特异性或亲和力的任何抗体作为抗体缀合物的基础。这样的特性可使用本领域技术人员已知的常规免疫学筛选方法来评价。抗体分子中用于与生物活性分子结合的位点除典型的抗原结合位点之外还包括可结合以下的位于可变结构域中的位点：病原体、B细胞超抗原、T细胞共受体CD4和HIV-1包膜(Sasso等，1989；Shorki等，1991；Silvermann等，1995；Cleary等，1994；Lenert等，1990；Berberian等，1993；Kreier等，1991)。此外，可变结构域参与抗体自结合(Kang等，1988)，并且包含被抗抗体(anti-antibody)识别的表位(独特位(idiotope))(Kohler等，1989)。
抗体缀合物的某些实例是其中抗体与可检测标记连接的那些缀合物。“可检测标记”是由于其特定的功能特性和/或化学特征而可进行检测的化合物和/或元素，其使用允许检测和/或如果期望的话进一步量化与其连接的抗体。另一个这样的实例是形成包含与细胞毒性或抗细胞剂连接的抗体的缀合物，并且其可被称作“免疫毒素”。
通常优选使用抗体缀合物作为诊断剂。抗体诊断剂通常属于两类：用于体外诊断(例如用于多种免疫测定)的那些；和/或通常称作“抗体导向的成像(antibody-directedimaging)”的用于体内诊断方案的那些。
许多合适的成像剂是本领域中已知的，用于使其与抗体连接的方法也如此(参见例如美国专利No.5,021,236；4,938,948；以及4,472,509，其各自通过引用并入本文)。所使用的成像部分可以是顺磁性离子；放射性同位素；荧光染料；NMR可检测物质；X射线成像。
在顺磁性离子的情况下，可通过例如以下示例性离子来提及：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，其中特别优选钆。在另一些情况(例如X射线成像)下可用的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)和尤其是铋(III)。
在放射性同位素用于治疗性和/或诊断性应用的情况下，可提及砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m和/或钇90。125I通常优选用于某些实施方案，并且锝99m和铟111由于其低能量和对长程检测的适用性也经常是优选的。本发明的放射性标记的单克隆抗体可根据本领域中公知的方法来产生。例如，可通过与碘化钠和/或碘化钾和化学氧化剂(例如次氯酸钠)或酶促氧化剂(例如乳过氧化物酶)接触来使单克隆抗体碘化。可通过配体交换过程来用锝99m标记根据本发明的单克隆抗体，例如通过用二价锡溶液还原高锝酸盐(pertechnate)，将还原后的锝螯合到Sephadex柱上，并将抗体施加至该柱上来进行。或者，可使用直接标记技术，例如通过孵育高锝酸盐、还原剂(例如SNCl2)、缓冲溶液(例如邻苯二甲酸钾钠溶液)和抗体。通常用于使作为金属离子存在的放射性同位素与抗体结合的媒介官能团是二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid，DTPA)或乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetracetic acid，EDTA)。
在考虑作为缀合物使用的荧光标记之中包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、CascadeBlue、Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、Oregon Green 488、Oregon Green500、Oregon Green 514、Pacific Blue、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或德克萨斯红(Texas Red)。
在本发明中考虑的另一种类型的抗体缀合物是主要意图用于体外应用的那些，其中抗体与第二结合配体和/或在与显色底物接触后将产生着色产物的酶(酶标签)连接。合适酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体是生物素和/或亲和素和链霉亲和素化合物。这样的标记的用途对于本领域技术人员是公知的，并且在例如美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中描述，其各自通过引用并入本文。
分子与抗体的位点特异性连接的另一种已知方法包括使抗体与基于半抗原的亲和标记反应。实质上，基于半抗原的亲和标记与抗原结合位点中的氨基酸反应，由此破坏该位点并且阻断特异性抗原反应。然而，这可以是不利的，因为其导致通过抗体缀合物的抗原结合丧失。
包含叠氮基的分子也可用于经由通过低强度紫外光产生的反应性氮烯中间体来与蛋白质形成共价键(Potter和Haley，1983)。特别地，已使用嘌呤核苷酸的2-叠氮类似物和8-叠氮类似物作为定点光探针以鉴定粗制细胞提取物中的核苷酸结合蛋白(Owens和Haley，1987；Atherton等，1985)。2-叠氮类似物和8-叠氮类似物还已被用于对经纯化蛋白的核苷酸结合结构域进行作图(Khatoon等，1989；King等，1989；和Dholakia等，1989)并且可用作抗体结合剂。
用于使抗体与其缀合部分连接或缀合的数种方法是本领域中已知的。一些连接方法涉及使用与抗体相连的金属螯合络合物，其利用例如有机螯合剂，例如二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)、亚乙基三胺四乙酸、N-氯-对甲苯磺酰胺、和/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3(tetrachloro-3α-6α-diphenylglycouril-3)(美国专利No.4,472,509和4,938,948，其各自通过引用并入本文)。单克隆抗体还可在存在偶联剂例如戊二醛或高碘酸盐的情况下与酶反应。与荧光素标志物的缀合物在存在这些偶联剂的情况下或通过与异硫氰酸酯反应来制备。在美国专利No.4,938,948中，使用单克隆抗体实现乳腺肿瘤的成像并且使用接头(例如对羟基苯甲亚氨酸甲酯或N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯)使可检测成像部分与抗体结合。
在另一些实施方案中，考虑通过使用不改变抗体结合位点的反应条件选择性地将巯基引入免疫球蛋白的Fc区中来使免疫球蛋白衍生化。公开了根据这种方法产生的抗体缀合物显示出提高的寿命、特异性和敏感性(美国专利No.5,196,066，其通过引用并入本文)。在文献中也已经公开了效应分子或报道分子的位点特异性连接，其中报道分子或效应分子与Fc区中的碳水化合物残基缀合(O′Shannessy等，1987)。已报道，该方法产生目前处于临床评价之中的在诊断和治疗方面有希望的抗体。
在本发明的另一个实施方案中，抗(SLC45A2肽)抗体或抗(SLC45A2肽-HLA-A2)抗体可与半导体纳米晶体连接，例如在美国专利No.6,048,616、5,990,479、5,690,807、5,505,928、5,262,357(其均整体并入本文)；以及PCT公开No.99/26299(1999年5月27日公开)中描述的那些。特别地，在本发明的生物和化学测定中作为半导体纳米晶体使用的示例性材料包括但不限于上述那些，其包括第II-VI族、第III-V族和第IV族半导体，例如ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InP、InAs、InSb、AlS、AlP、AlSb、PbS、PbSe、Ge和Si，及其三元和四元混合物。用于使半导体纳米晶体与抗体连接的方法在美国专利No.6,630,307和6,274,323中描述。
在另一些实施方案中，本发明涉及用于结合、纯化、去除、量化和/或以其他方式一般性检测例如T细胞或者选择性地结合或识别SLC45A2肽或SLC45A2肽-HLA-A2复合物的生物组分的免疫检测方法。在一些实施方案中，四聚体测定可用于本发明。四聚体测定通常涉及产生可结合抗原特异性T淋巴细胞的可溶性肽-MHC四聚体，并且例如在Altman等(1996)中描述了四聚体测定方法。可使用的一些免疫检测方法包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定、四聚体测定和Western印迹。多种可用的免疫检测方法的步骤已在科学文献(例如Doolittle和Ben-Zeev，1999；Gulbis和Galand，1993；De Jager等，1993；以及Nakamura等，1987，其各自通过引用并入本文)中描述。
IV.药物制剂
在一些选定实施方案中，考虑了本发明的SLC45A2肽可包含在疫苗组合物中并且施用于对象以在对象中诱导针对表达SLC45A2的癌症(例如黑素瘤)的治疗性免疫应答。用于在对象中的药物应用的疫苗组合物可包含本文中公开的SLC45A2肽组合物和可药用载体。或者，与SLC45A2肽-HLA-A2复合物选择性地结合的抗体可包含在可药用载体中。
短语“药物的”、“可药用的”或“药理学上可接受的”是指当在适当时向动物(例如人)施用时不产生不良反应、变态反应或其他不利反应的分子实体和组合物。本文中使用的“可药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、这样的类似材料，及其组合，如本领域普通技术人员已知的(参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Pharmaceutical Press，2011，其通过引用并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则其在本发明疫苗组合物中的使用在考虑之中。
本文中使用的“保护性免疫应答”是指哺乳动物宿主的免疫系统针对癌症的应答。保护性免疫应答可提供用于治疗癌症的治疗效果，例如减小肿瘤尺寸、提高存活等。
在一些实施方案中，本发明的疫苗组合物可包含本发明的SLC45A2肽、抗(SLC45A2肽-HLA-A2复合物)抗体或抗(SLC45A2肽-HLA-A24复合物)抗体。在一些实施方案中，包含在药物制剂中的SLC45A2肽选择性地结合HLA-A2或HLA-A24。包含SLC45A2肽或与SLC45A2肽-HLA-A2复合物或SLC45A2肽-HLA-A24复合物选择性地结合的抗体的疫苗组合物可用于诱导针对表达SLC45A2的癌症的保护性免疫应答。
医学领域普通技术人员将理解，向动物或人患者施用的疫苗组合物的实际剂量可由物理和生理因素(例如体重、病症的严重程度、所治疗疾病的类型、先前或同时的治疗性干预、患者的特发病和施用途径)决定。在任何情况下，负责施用的从业人员均将确定组合物中活性成分的浓度和用于个体对象的合适剂量。
在某些实施方案中，疫苗组合物可包含例如至少约0.1％的SLC45A2肽、抗(SLC45A2肽-HLA-A2复合物)抗体或抗(SLC45A2肽-HLA-A24复合物)抗体。在另一些实施方案中，活性化合物可例如占单位重量的约2％至约75％，或约25％至约60％，以及可从其中来源的任何范围。与许多疫苗组合物一样，施用频率以及剂量将以免疫学领域技术人员可预测的方式因动物群或人群中的成员而改变。作为非限制性实例，药物组合物和疫苗可通过注射(例如，皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻内(例如，通过吸入)或经口施用。可在1至36周的时间内施用1至3个剂量。优选地，以3至4个月的间隔施用3个剂量，并且在此之后可定期给予加强疫苗接种。
在一些实施方案中，“合适的剂量”是当如上所述施用时能够在经免疫接种患者中引发针对癌症的免疫应答的SLC45A2肽、抗(SLC45A2肽-HLA-A2复合物)抗体或抗(SLC45A2肽-HLA-A24复合物)抗体的量。通常来说，以合适剂量存在(或以一定剂量由核酸原位产生)的肽的量可以是每kg宿主约0.01至100mg、约0.01至100mg，优选约0.05至50mg并且更优选约0.1至10mg。在一些实施方案中，SLC45A2肽可以以约0.25mg至约1mg/每个疫苗剂量的剂量施用。
本发明的疫苗组合物可包含不同类型的载体，这取决于其是以固体、液体或气雾剂形式施用，以及对于例如注射的施用途径是否需要是无菌的。本文中公开的疫苗组合物可如下施用：静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹腔内、皮下、结膜下、囊内(intravesicularlly)、经黏膜、心包内、脐带内(intraumbilically)、眼内、经口、表面、局部、以及通过吸入、注射、输注、连续输注、灌洗和局部灌注。还可通过导管、在乳膏中(incremes)、在脂质组合物中、通过弹道颗粒递送(ballistic particulate delivery)或通过其他方法或上述方法的任意组合来向对象施用疫苗组合物，如本领域普通技术人员知晓的(参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版.LippincottWilliams和Wilkins，2005，其通过引用并入本文)。
尽管本领域普通技术人员已知的任何合适载体均可用于本发明的药物组合物，但是载体的类型将根据施用模式而变化。对于肠胃外施用(例如皮下注射)，载体优选地包含水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。对于经口施用，可使用上述任何载体或固体载体，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。生物可降解的微球(例如，聚乳酸半乳糖(polylactic galactide))也可用作本发明的药物组合物的载体。例如在美国专利4,897,268和5,075,109中公开了合适的生物可降解微球。
在一些实施方案中，疫苗组合物可通过微结构化经皮或弹道颗粒递送来施用。作为疫苗制剂的载体的微结构是用于疫苗应用的理想构造，并且是本领域中广泛已知的(Gerstel和Place，1976(美国专利3,964,482)；Ganderton和McAinsh，1974(美国专利3,814,097)；美国专利5,797,898、5,770,219和5,783,208，以及美国专利申请2005/0065463)。这样的配制成用于弹道颗粒递送的疫苗组合物可包含固定在支持基底表面上的本文中公开的分离的SLC45A2肽。在这些实施方案中，支持基底可包括但不限于微囊、微粒、微球、纳米囊、纳米粒、纳米球、或其组合。
用作本文中公开的SLC45A2肽、抗(SLC45A2肽-HLA-A2复合物)抗体或抗(SLC45A2肽-HLA-A24复合物)抗体的支持基底的微结构或弹道颗粒可包含生物可降解材料和非生物可降解材料，并且这样的支持基底可包含合成聚合物、二氧化硅、脂质、碳水化合物、蛋白质、凝集素、离子试剂、交联剂和本领域可获得的其他微结构组分。用于使本发明肽固定至由这样的材料构成的支持基底的方案和试剂是在商业上和本领域中可广泛获得的。
在另一些实施方案中，疫苗组合物包含固定化或经包封的本文中公开的SLC45A2肽、抗(SLC45A2肽-HLA-A2复合物)抗体或抗(SLC45A2肽-HLA-A24复合物)抗体，以及支持基底。在这些实施方案中，支持基底可包括但不限于脂质微球、脂质纳米粒、醇质体(ethosome)、脂质体、泡囊(niosome)、磷脂、鞘脂体(sphingosome)、表面活性剂、转染体(transferosome)、乳剂、或其组合。脂质体和其他脂质纳米载体制剂和脂质微载体制剂的形成和使用通常是本领域普通技术人员已知的，并且脂质体、微粒、纳米囊等的使用已在治疗剂的递送方面得到广泛应用(例如，美国专利5,741，516，其特别地通过引用整体并入本文)。已经综述了作为潜在的药物载体的脂质体和脂质体样制剂的许多方法，其包括肽包封(美国专利5,567,434、5,552,157、5,565,213、5,738,868和5,795,587，其各自特别地通过引用整体并入)。
除本文中所述的递送方法之外，还考虑了许多作为替代的技术用于施用所公开的疫苗组合物。作为非限制性实例，疫苗组合物可通过以下施用：已在美国专利5,656,016中使用并描述的用于增强药物渗透进入并通过循环系统的速率和效力的超声波导入法(sonophoresis)(即，超声)、骨内注射(美国专利5,779,708)、或反馈控制递送(美国专利5,697,899)，并且本段中的每个专利都特别地通过引用整体并入本文。
多种佐剂中的任一种可用于本发明的疫苗以非特异性地增强免疫应答。大多数佐剂包含被设计成保护抗原免受迅速分解代谢的物质(例如氢氧化铝或矿物油)和免疫应答的非特异性刺激物，例如脂质A、百日咳鲍特菌(Bortadella pertussis)或结核分枝杆菌。合适的佐剂可商购获得，如例如弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，Mich.)以及Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)。其他合适的佐剂包括明矾、生物可降解微球、单磷酰脂质A和quil A。
肽可以以中性或盐形式配制到组合物中。可药用盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且其与无机酸(例如盐酸或磷酸)或例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的此类有机酸形成。与游离羧基形成的盐也可来自于无机碱(例如钠、钾、铵、钙或三价铁的氢氧化物)和例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。
在任何情况下，组合物可包含多种抗氧化剂以延迟一种或更多种组分的氧化。此外，通过防腐剂可产生对微生物作用的防止，所述防腐剂例如多种抗细菌剂和抗真菌剂，其包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。
无菌可注射溶液通过使所需量的活性肽与以上列举的多种其他成分(如有需要的话)并入合适的溶剂中、随后过滤灭菌来制备。通常来说，通过将多种经灭菌活性成分并入包含基本分散介质(basic dispersion medium)和/或其他成分的无菌载剂中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、混悬剂或乳剂的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，这由其经先前无菌过滤的液体介质产生活性成分加任何另外期望成分的粉末。如果必要的话，液体介质应被适当地缓冲，并且在用足够的盐水或葡萄糖注射之前先用液体稀释剂实现等张。用于直接注射的高度浓缩组合物的制剂也在考虑之中，其中预见使用DMSO作为溶剂以实现极其迅速的渗透，从而使高浓度的活性剂递送至小区域。
组合物在制造和储存条件下必须稳定，并且防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。将理解，内毒素污染应在安全水平保持最低，例如小于0.5ng/mg蛋白质。
在一些特定的实施方案中，通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或其组合)，可实现可注射组合物的延长吸收。
A.检测和疫苗接种药盒
本发明的SLC45A2肽、抗(SLC45A2肽-HLA-A2复合物)抗体、抗(SLC45A2肽-HLA-A24复合物)抗体或抗SLC45A2肽抗体可包括在药盒中。在药盒中的SLC45A2肽或抗体可被可检测地标记或固定在也包含在药盒中的支持基底的表面上。SLC45A2肽或抗体可例如以合适的形式(例如无菌、冻干或二者)在药盒中提供。
包含在本发明的药盒中的支持基底可基于待进行的方法来选择。作为非限制性实例，支持基底可以是多孔板或微板、膜、过滤器、纸、乳剂、珠、微珠、微球、纳米珠、纳米球、纳米粒、醇质体、脂质体、泡囊、转移体、浸棒(dipstick)、卡片、赛璐珞条、载玻片、微载片、生物传感器、侧流装置、微芯片、梳子、二氧化硅颗粒、磁性颗粒或自组装单层。
与所进行的方法相适应，药盒还可包含一个或更多个用于将组合物递送至对象或用于以其他方式操作本发明组合物的装置。作为非限制性实例，药盒可包括作为以下的装置：注射器、滴眼器、弹道颗粒施加器(例如，在美国专利5,797,898、5,770,219和5,783,208以及美国专利申请2005/0065463中公开的施加器)、匙(scoopula)、微载片盖、测试条保持器或盖子，等。
用于标记药盒组分的检测试剂可任选地包含在药盒中用于进行本发明的方法。在一些特别的实施方案中，标记或检测试剂选自包含本领域中通常使用的试剂并且包括但不限于以下的组：放射性元素、酶、吸收在UV范围内的光的分子、以及荧光团(例如荧光素、罗丹明、金胺(auramine)、德克萨斯红(Texas Red)、AMCA蓝和萤虫黄(Lucifer Yellow))。在另一些实施方案中，提供了包含一个或更多个容器装置和已经用检测试剂标记的BST蛋白的药盒，所述检测试剂选自包含以下的组：放射性元素、酶、吸收在UV范围内的光的分子和荧光团。
当包含在药盒中的试剂和/或组分以冻干形式(冻干物)或作为干粉提供时，冻干物或粉末可通过添加合适的溶剂来重构。在一些特别的实施方案中，溶剂可以是无菌的可药用缓冲剂和/或其他稀释剂。预见这样的溶剂也可以作为药盒的一部分提供。
当药盒中的组分在一种和/或更多种液体溶液中提供时，作为非限制性实例，液体溶液可以是无菌的水性溶液。组合物还可配制成施用组合物。在这种情况下，容器装置自身可以是注射器、吸移管、局部施用器等，从其中可将制剂施用至身体的受影响区域、注射到对象中、和/或施加到药盒的其他组分或与其混合。
V.实施例
包括以下实施例以示出本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解的是，在随后实施例中公开的技术代表本发明人发现在本发明的实践中工作良好的技术，并因此可被认为构成用于实施本发明的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应理解，可对所公开的特定实施方案作出许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果而不背离本发明的精神和范围。
实施例1
材料和方法
供体、细胞系和抗体
外周血(peripheral blood，PB)样品从具有HLAA*0201和HLAA*2402的健康供体中获得。
使黑素瘤细胞系维持在含有4mM L-谷氨酰胺、1mM非必需氨基酸、10mM丙酮酸钠和50U/ml青霉素、50mg/ml链霉素和10％FBS(TCB)的RPMI 1640中。用包含10％FBS、50U/ml青霉素、50mg/ml和链霉素的RPMI 1640培养葡萄膜黑素瘤。使用LCL作为饲养细胞并且用包含10％FBS、50U/ml青霉素、50mg/ml和链霉素的RPMI 1640培养。用于T细胞培养的CTL培养基包含10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素。
HLA免疫沉淀和通过串联质谱的结合肽检测
从分离自新鲜肿瘤组织标本或肿瘤细胞系的HLA I类分子中直接洗脱肿瘤相关肽。将肿瘤标本(约250mg)切成小块并在无血清RPMI 1640培养基中的酶混合物缓冲液中消化直至完全消化，然后洗涤，并将肿瘤细胞裂解并收集上清液。在测量蛋白质浓度后，将肿瘤细胞裂解物与W6/32抗体(对HLA-A、HLA-B和HLA-C具有特异性)一起孵育，然后使用树脂珠纯化。对HLA I类结合肽进行洗脱并且通过Western印迹分析证实HLA的存在。如下所述，通过质谱分析阳性洗脱级分。
对于发现相串联质谱(MS/MS)，将洗脱的MHC I类结合肽注射到高灵敏度HPLC系统(Dionex 3000RSLC)上，通过在1.8微米C18(Agilent Technologies)上在0.1％甲酸水-乙腈中进行反相色谱进行分离，并使用数据依赖性采集在Orbitrap Elite质谱仪(ThermoScientific)上分析。Mascot算法使用10ppm亲本质量容差、0.8d片段离子容差、Met氧化、无酶选择性针对SwissProt完全人蛋白质数据库对获取的MS/MS谱进行搜索。搜索结果与使用NetMHC 3.4[101]的合适MHC结合特异性相互参考。
SLC45A2特异性CD8 T细胞的产生和扩增
用先前描述的方式(Li 2005)产生肿瘤抗原特异性CTL。通过用肿瘤抗原肽脉冲的自体DC刺激HLA-A*0201阳性的白细胞去除术(leukapheresis)PBMC。对于诱导树突细胞，将黏附PBMC与GMCSF和IL-4一起在AIM-V培养基(Invitrogen Life Technologies)中培养6天并且随后添加IL1b、IL-6、TNF-a和PGE2用于成熟。1天后，将成熟DC在室温下在存在3ug/mlβ2-微球蛋白的情况下以2×10^6个细胞/ml 1％人血清白蛋白(HAS)/PBS用40ug/ml肽脉冲4小时。在用1％HSA/PBS洗涤后，将DC以1.5×10^6个细胞/ml/孔与PBMC在48孔板中混合。初始和在培养之后3至4天添加IL-21(30ng/m1)。在第二次刺激之后1天添加IL-2和IL-7以扩增活化的特异性T细胞。
在第二次刺激之后6天，用SLC45A2382-390肽/MHC-PE缀合四聚体和CD8-APC抗体对细胞进行染色，并随后通过ARIA II分选CD8和四聚体阳性细胞。通过迅速扩增方案(REP)利用饲养细胞PBL和LCL在IL-21下扩增分选的SLC45A2特异性CD8 T细胞。
肽-MHC四聚体染色
通过用针对HLA A*0201的SLC45A2382-390肽/MHC复合物或针对HLA A*2402的SLC45A2393-402肽/MHC复合物的四聚体染色证实SLC45A2特异性CD8 T细胞。将CD8 T细胞与PE缀合的四聚体一起孵育20分钟，洗涤并随后在室温下用APC缀合的CD8抗体染色15分钟。在洗涤后，通过流式细胞术(LSRFortessa X-20分析仪)分析细胞。分别包含SLSC45A2382-390、SLC45A2393-402的HLA-A*A0201和HLA-A*A2402四聚体购自弗雷德哈钦森癌症研究中心(Fred Hutchinson Cancer Research Center)。
SLC45A2特异性CD8 T细胞的TCR库分析
为了评估TCR Vβ库，使用IOTest Beta Mark TCR-Vp库试剂盒。该试剂盒包含覆盖TCR-Vβ区域的24种TCR-Vβ抗原和正常人TCR-Vβ库的约70％的抗体：Vβ1、Vβ2、Vβ3、Vβ4、Vβ5.1、Vβ5.2、Vβ5.3、Vβ 7.1、Vβ7.2、Vβ 8、Vβ 9、Vβ 11、Vβ 12、Vβ13.1、Vβ13.2、Vβ13.6、Vβ14、Vβ16、Vβ17、Vβ18、Vβ 20、Vβ 21.3、Vβ 22、和Vβ 23。这些抗体与异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)或藻红蛋白(phycoerythrin，PE)缀合。当进行TCR-Vβ库测定时，添加抗CD8别藻蓝蛋白(APC)。
51铬释放测定
使用标准51铬(51Cr)释放测定对SLC45A2特异性CD8 T细胞对表达或不表达SLC45A2的靶标的比裂解(specific lysis)进行测定。用100uCi的51Cr标记靶标2小时并且在洗涤3次后，将经标记的靶标以每孔2000个靶标平板接种一式三份的孔。将效应细胞与靶标以不同的效应物：靶标(E∶T)比例一起孵育。4小时后，从每孔中收集30ul的上清液并通过下计数器测量51Cr。计算比裂解的百分比。
肽结合测定
将SLC45A2、Mart-1和g100特异性CD8 T细胞(1×10^5个细胞)与T2细胞(4×10^4个细胞)一起孵育，所述T2细胞已用不同浓度(100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0nM)的SLC45A2382-390、M27-35或G154-162肽预孵育。在孵育之后48小时，通过ELISA测定测量IFN-γ的产生。
RT-PCR和定量RT-PCR
为了分析黑素细胞分化抗原的mRNA表达，进行RT-PCR。简言之，通过异硫氰酸胍/氯化铯操作提取总细胞RNA。用高容量cDNA逆转录试剂盒由1ug RNA合成cDNA并通过利用对SLC45A2、MART-1、gp100、酪氨酸酶具有特异性的引物进行30个PCR循环来扩增。引物序列在补充表1中列出。将PCR产物在2％琼脂糖凝胶上运行并通过Gel Red可视化。
用SLC45A2、MART-1、gp100和酪氨酸酶的引物使用power syber green PCR主混合物(Applied biosystems life technologies)进行实时PCR。通过编码GAPDH的基因的量使值归一化。
用BRAF V600E抑制剂达拉非尼(50nM)或MEK抑制剂曲美替尼(50nM)(GlaxoSmithKline)或这二者处理Me1526和A375(BRAF V600E+)以及MeWo(BRAF野生型)48小时。使用未经处理的黑素瘤作为对照。
RNAseq分析
使用具有Ribo-Zero Gold的Illumina TruSeq标准总RNA试剂盒由AveraInstitute for Human Genetics对肿瘤样品进行全转录组Seq(RNA-Seq)。每个肿瘤RNA样品使用约2亿个配对末端读数。使用ISIS v2.4.60解复用(demultiplexing)并转化为FASTQ格式来对BCL(Illumina HigSeq的原始输出)文件进行处理。使用适用于特定运行的参数(例如，对于51个碱基的测序运行，3个错配中有2个在前40个种子区域中)使用BWA将FASTQ文件和序列读数与基因组(Hg19)比对。然后，在任何下游分析之前，使用Picard和GATK程序对经比对的BAM文件进行标记重复、重新比对和重新校准。使用TopHat、TopHat-Fusion和Cufflinks算法处理RNASeq数据。
统计分析
使用GraphPad prism 6.0e版本进行数据分析。使用参数检验(Anova或非配对t检验)分析正态分布的数据。如果p值＜0.05，则统计学检验差异被认为是显著的。
实施例2
SLC45A2的表达高度局限于黑素瘤
在多种黑素瘤细胞(包括皮肤黑素瘤细胞、葡萄膜黑素瘤细胞和黏膜黑素瘤细胞)中评价SLC45A2的表达。通过RT-PCR在多种类型的肿瘤细胞(包括黑素瘤细胞系)中分析SLC45A2 mRNA表达(表1)。SLC45A2mRNA在大多数黑素瘤细胞中检测到，但在其他类型的肿瘤细胞中未检测到(图1A-C)。还在起源于不同部位的转移性黑素瘤细胞中检测到SLC45A2的表达(表2)。16种受试转移性黑素瘤细胞中有11种表达SLC45A2 mRNA(图1A)。在多种黑素瘤细胞中，将SLC45A2的表达比例与其他黑素瘤分化抗原(MDA)(例如MART-1、gpl00和酪氨酸酶)的表达比例进行比较。发现不同的黑素瘤分化抗原显示出类似的表达比例(78.7％至84.8％)(表3)。黑素瘤和原代黑素细胞中MDA基因表达的比较示于图13A-13B中。
表1.用于RT-PCR的人MDA基因引物序列
表2.黑素瘤细胞中的SLC45A2表达和HLA类型
表3.黑素瘤细胞系中MDA表达比例的比较
mRNA表达 阳性# 阴性# 总计# 比例(％)
SLC45A2 26 7 33 78.7
MART-1 28 5 33 84.8
Gp100 28 5 33 84.8
酪氨酸酶 26 7 33 78.7
使用基因型-组织表达(GTEx)和癌症基因组图谱(TCGA)门户数据分析正常组织和癌症组织中SLC45A2的相对基因表达。SLC45A2基因的表达在多种正常组织中未检测到或以低水平检测到(图8)。然而，MART-1和gp100在许多正常组织样品(特别是正常皮肤)中显示出显著更高的表达。SLC45A2与其他MDA一起在皮肤黑素瘤和葡萄膜黑素瘤组织中显示出高表达(图8)。SLC45A2在包括转移性黑素瘤细胞在内的大多数皮肤黑素瘤细胞中表达，但在其他类型的肿瘤细胞中不表达，表明SLC45A2的表达是黑素瘤特异性的。
实施例3
HLA-A*0201和A*2402限制性SLC45A2来源的CD8 T细胞表位的鉴定
使用HLA-A、B、C的免疫沉淀、酸洗脱和串联质谱(MS/MS)分析数种MDACC患者来源的黑素瘤细胞系和新鲜黑素瘤肿瘤标本的表面HLA I类结合肽。从多个标本中检测到预测结合4种不同HLA等位基因的六种不同的SLC45A2来源的肽，表明其构成共有的肿瘤相关抗原(表4)。这些肽被天然加工并呈递的另外的证据示于表5中：用慢病毒载体转导Mel888黑素瘤细胞以表达HLA-A*0201、A*2402或A*0301。如上所述对亲本和经转导Mel888细胞进行免疫肽组(immunopeptidome)分析。以这种方式，表4中鉴定的6种肽中有5种在经转导的细胞中也检测到，但只有在其表达合适的HLA等位基因时(表5和图2)。如所示，使用MS分析通过从经HLA A*0201或A*2402转导的Me1888洗脱来确认新的SLC45A2382-390(SLYSYFQKV；SEQID NO：1)和SLC45A2393-402(SYIGLKGLYF，SEQ ID NO：2)肽。
表4.通过对黑素瘤细胞系进行质谱分析检测到的SLC45A2来源的肽
表5.通过HLA转导的天然肽加工和呈递的确认
检测到的肽的Ion评分列于表格左侧在特定经HLA转导SLC45A2黑素瘤细胞系下方。表格中的“-”表示该肽未检测到。
实施例4
SLC45A2特异性CD8 T细胞的诱导
通过用以IL-21处理的SLC45A2382-390或SLC45A2393-402肽脉冲树突细胞(DC)刺激自体HLA-A*0201或A*2402阳性PBMC产生SLC45A2特异性CD8 T细胞。根据图3A中描述的时间表，通过以IL-21处理的SLC45A2382-390和SLC45A2393-402肽脉冲DC分别刺激HLA-A*0201和A*2402限制性PBMC。在第二次刺激后，以约淋巴细胞设门群体的2％至25％和CD8设门群体的6.68％至30％的频率诱导SLC45A2-四聚体阳性CD8 T细胞(图3B上图)。对SLC45A2四聚体阳性CD8 T细胞进行分选并通过迅速扩增方案(REP)扩增。REP后，SLC45A2四聚体阳性群体的频率为淋巴细胞设门群体的91％至99％和CD8设门群体的97％至99％(图3B中间图)。在这些健康供体PBMC中几乎观察不到SLC45A2-四聚体阳性CD8 T细胞。也成功地由其他两个HLAA*0201或A*2402限制性健康供体的PBMC诱导SLC45A2特异性CD8 T细胞(图10)。
为了研究SLC45A2特异性CD8 T细胞的克隆性，使用对应于24种不同特异性的Vβ抗体分析TCR Vβ库。从每个供体中诱导的SLC45A2特异性CD8 T细胞的Vβ链包括Vβ3、Vβ14、Vβ18、Vβ21.3和Vβ23(图3B下图、图10)。从单个孔中分选并通过REP扩增的SLC45A2四聚体阳性CD8 T细胞展现出一个主要的Vβ群，其范围为92％至99％。
对于诱导的SLC45A2特异性CD8 T细胞的表型分析，通过流式细胞术在SLC45A2四聚体阳性CD8 T细胞中测试CD45RA、CCR7、CD62L和CD28的表达。SLC45A2特异性CD8 T细胞不表达CD45RA、CCR7和CD62L，但表达CD28，这表明其具有与效应记忆T细胞类似的表型(图3C)。
实施例5
SLC45A2特异性CD8 T细胞的抗原特异性识别和功能
为了确定SLC45A2特异性CD8 T细胞识别和杀伤表达SLC45A2之黑素瘤细胞的能力，使用SLC45A2表达黑素瘤细胞系以不同的E∶T比例进行标准51Cr释放测定。使用表达SLC45A2和HLA A*0201二者的Mel526、Mel624、FM6和MeWo细胞作为靶标(表2)。发现SLC45A2特异性CD8 T细胞有效地杀伤多种黑色瘤细胞系(图4A)。这表明SLC45A2特异性CD8 T细胞可识别由黑素瘤细胞内源性加工的SLC45A2表位SLYSYFQKV(SEQ ID NO：1)。作为对照，SLC45A2表达阴性的HLA-A*0201黑素瘤细胞(A375)和表达SLC45A2但是HLA-A*0201阴性的黑素瘤细胞(Mel888)不被SLC45A2特异性CD8 T细胞裂解。用HLA-A*0201转导Mel888细胞使该细胞容易被SLC45A2特异性CD8 T细胞裂解，表明SLC45A2特异性CD8 T细胞具有HLA-A*0201限制性应答。还检测了SLC45A2特异性CD8 T细胞对来自于不同组织的转移性黑素瘤细胞的细胞毒活性。本研究中使用的所有转移性黑素瘤细胞均为HLA-A*0201阳性。
另外，发现对HLA-A*2402限制性表位SYIGLKGLYF(SEQ ID NO：2)具有特异性的T细胞裂解表达HLA-A*2402的黑素瘤细胞系组：与HLA-A*0201限制性T细胞相似，A*2402限制性T细胞有效地裂解表达SLC45A2蛋白的Mel888、Mel2381、Mel2508、Mel2400、Mel2412和Mel2559细胞；然而，不表达SLC45A2蛋白的A*2402阳性Mel2461和Mel2333细胞未被裂解(图4B)。
实施例6
SLC45A2特异性CTL的功能性亲合力
为了评价SLC45A2特异性CD8 T细胞针对靶标识别的功能性亲合力，使用ELISA测定在存在用不同浓度的SLC45A2382-390肽(SLYSYFQKV，SEQ ID NO：1)预孵育的T2细胞的情况下检测SLC45A2特异性CTL产生IFN-γ的能力。用HLA-A*0201结合对照肽MART-l27-35(AAGIGILTV，SEQ ID NO：17)和gp100154-162(KTWGQYWQV，SEQ ID NO：18)预孵育的T2细胞用于确定SLC45A2特异性CD8 T细胞的肽特异性应答。在SLC45A2、MART-1和gp100特异性CTL之间比较各肽的结合能力(图4C)。令人感兴趣的是，SCL45A2特异性CD8 T细胞能够应答于经低至0.1ug/ml的肽脉冲的T2细胞而具有高IFN-γ产生，并且在肽浓度为0.01ug/ml时显示出降低的IFN-γ产生(图4C上图)。在相同肽浓度下，MART-1特异性CD8 T细胞的IFN-γ产生显著低于SCL45A2特异性CD8 T细胞的IFN-γ产生(图4C下图)。此外，gp100特异性CD8 T细胞的结合亲和力与SLC45A2特异性CD8 T细胞的结合亲和力类似。这些数据表明，SLC45A2特异性CD8 T细胞可以以高亲和力对表达SLC45A2的靶标作出应答。这些结果与分别为7nM、9nM和2498nM的针对HLA-A*0201的SLC45A2、gp100和MART-1肽的预测HLA结合亲和力一致。
实施例7
SLC45A2的低表达和SLC45A2特异性CD8 T细胞针对黑素细胞的低细胞毒活性
由于SLC45A2是黑素细胞分化蛋白，因此在正常黑素细胞中研究SLC45A2的表达，并且确定SLC45A2特异性CD8 T细胞针对正常黑素细胞的细胞毒活性。人表皮黑素细胞3C0661和4C0197从轻度着色的新生皮肤分离。3C0661表达HLAA*0201和A*2402二者，并且4C0197为HLA A*0201-阳性且A*2402-阴性(图11)。如图5A中所示，这些黑素细胞表达SLC45A2，但与黑素瘤细胞相比，在黑素细胞中的表达显著更低。然而，其他黑素细胞分化蛋白(例如MART-1、gp100和酪氨酸酶)在黑素细胞中以与其在黑素瘤细胞中的表达类似的水平表达(图5A)。此外，使用RNA测序和TCGA数据比较黑素细胞与黑素瘤细胞之间SLC45A2、MART-1、gp100和酪氨酸酶的RNA表达水平。发现在黑素细胞中SLC45A2的表达与黑素瘤相比更低，而黑素细胞中MART-1和gp100的表达显著更高，并且与其在黑素瘤细胞中的表达类似(表6)。
表6.黑素瘤和正常组织中的黑素细胞分化抗原表达
研究了SLC45A2、MART-1和gp100特异性CD8 T细胞针对来自于2个HLA-A*0201阳性健康供体的原代黑素细胞的细胞毒性。MART-1和gp100特异性CD8 T细胞分别显示出针对黑素细胞的35％至42％和55％至65％的细胞毒性，但令人惊讶的是，SLC45A2特异性CD8 T细胞显示针对相同黑素细胞的细胞毒性小于8％(图5B)。另外，从其他健康供体中产生的SLC45A2特异性CD8 T细胞对黑素细胞也具有低毒性(图12A-B)。另外，发现HLAA*2402限制性SLC45A2特异性CD8 T细胞对A*2402阳性黑素细胞3C0661没有细胞毒性(图5C)。这些结果表明，与其他MDA(例如MART-1和gp100)不同，SLC45A2特异性CD8 T细胞可有效地杀伤黑素瘤细胞而不破坏正常的黑素细胞。
实施例8
SLC45A2表达和SLC45A2特异性CD8 T细胞针对葡萄膜和黏膜黑素瘤细胞的细胞毒性
葡萄膜黑素瘤细胞202、92.1、UPMD1和UPMD2来自于原发性肿瘤，并且OMM1细胞来自于转移性肿瘤。本研究中使用的所有葡萄膜黑素瘤细胞均表达SLC45A2 mRNA(图6A)。
研究了SLC45A2特异性CD8 T细胞针对葡萄膜黑素瘤细胞的细胞毒性。观察到SLC45A2阳性的OMM1细胞和202细胞被HLAA*0201限制性SLC45A2特异性CD8 T细胞杀伤(图6B)。然后，针对葡萄膜黑素瘤检测MART-1和gp100特异性CD8 T细胞的细胞毒性。与SLC45A2和gp100特异性CD8 T细胞相比，MART-1特异性CD8 T细胞显示对葡萄膜黑素瘤细胞的细胞毒性更低。A*2402限制性SLC45A2特异性CD8 T细胞杀伤表达SLC45A2和HLA A*2402的UPMD2细胞。当用A*2402限制性肽SLC45A2393-402脉冲UPMD2细胞时，SLC45A2特异性CD8 T细胞的细胞毒性提高。SLC45A2阳性但HLA A*2402阴性的UPMD1细胞不被A*2402限制性SLC45A2特异性CD8 T细胞裂解(图6C)。
在黏膜黑素瘤中测试SLC45A2表达和SLC45A2特异性CD8 T细胞的细胞毒性。黏膜黑素瘤细胞以与其他MDA的表达类似的水平表达SLC45A2(图6D)。A*0201限制性SLC45A2特异性CD8 T细胞裂解表达SLC45A2和HLA A*0201的2170黏膜黑素瘤细胞，但不裂解表达SLC45A2而不表达HLAA*0201的2042细胞(图6E)。SLC45A2、MART-1和gp100特异性CD8 T细胞之间针对黏膜黑素瘤细胞的细胞毒活性类似。这些结果表明，SLC45A2特异性CD8 T细胞可有效地杀伤表达SLC45A2和合适HLA类型的葡萄膜黑素瘤细胞和黏膜黑素瘤细胞。
实施例9
在用MAPK途径抑制剂处理之后增强的SLC45A2表达和黑素瘤细胞杀伤
与其他黑素细胞分化蛋白(例如MART-1、gp100和酪氨酸酶)类似，SLC45A2基因受MITF转录因子调节(J Biol Chem，2002，277：402-406，Gen Soci Ame，2008178：761-769)。MITF蛋白水平通过ERK介导的磷酸化和降解而被致癌BRAF抑制(J Cell Biol，2005，170：703-708)。因此，接下来研究BRAF或MEK抑制剂是否可调节SLC45A2表达。将黑素瘤细胞用BRAF V600E的特异性抑制剂达拉非尼(50nM)或MEK抑制剂曲美替尼(50nM)或这二者处理48小时，并通过RT-PCR分析SLC45A2和MART-1的mRNA表达。如图7A所示，在用BRAF或MEK抑制剂处理后，在Me1526细胞(表达突变BRAF V600E)中观察到SLC45A2和MART-1的显著提高，而MeWo细胞(表达野生型BRAF)未显示出提高的SLC45A2和MART-1表达。为了评估用BRAF和MEK抑制剂处理后SCL45A2特异性CD8 T细胞针对黑素瘤细胞的杀伤作用，在经BRAF抑制剂、MEK抑制剂或这二者处理48小时的黑素瘤细胞中进行51Cr释放测定。与未经处理的黑素瘤细胞相比，SCL45A2特异性CD8 T细胞在经BRAF抑制剂、MEK抑制剂或这二者处理的黑素瘤细胞中显示出提高的细胞毒性(图7B)。这些数据表明，MAPK途径的抑制提高由MITF调节的SLC45A2的表达，这增强SLC45A2特异性CD8 T细胞的靶标识别和细胞毒性。
结论：重要的是，SLC45A特异性CD8 T细胞有效地杀伤黑素瘤细胞，但不杀伤正常黑素细胞，而MART-1和gp100特异性CD8 T细胞杀伤黑素细胞和黑素瘤细胞二者。此外，用BRAF和MEK抑制剂处理在黑素瘤细胞中提高SLC45A表达、SLC45A2特异性CD8 T细胞的靶标识别和细胞毒性。总的来说，本研究分别鉴定出新的HLA-A*0201和A*2402限制性肽SLC45A2382-390和SLC45A2393-402，并且表明SLC45A2作为黑素瘤分化抗原可以是用于黑素瘤中免疫治疗的具有高效力和低毒性的有效靶标。SLC45A2作为黑素瘤特异性抗原的这一发现对于过继性T细胞免疫治疗的发展可以是重要的。
＊＊＊
根据本公开内容，本文中公开且要求保护的所有方法均可在没有过度实验的情况下做出和执行。虽然本发明的组合物和方法已根据一些优选实施方案进行描述，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下可对本文中所述方法以及本文所述方法的步骤或步骤顺序作出改变。更具体地，显而易见的是，在化学和生理两方面都相关的某些试剂可替代本文中所述的试剂而实现相同或类似的结果。对本领域技术人员而言明显的所有这样的类似替代和修改被认为在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念之内。
参考文献
以下参考文献就其提供补充本文中阐述内容的示例性操作或其他细节而言特别地通过引用并入本文。
美国专利3,814,097
美国专利3,817,837
美国专利3,850,752
美国专利3,939,350
美国专利3,964,482
美国专利3,996,345
美国专利4,196,265
美国专利4,275,149
美国专利4,277,437
美国专利4,366,241
美国专利4,373,071
美国专利4,401,796
美国专利4,458，066
美国专利4,472,509
美国专利4,598,049
美国专利4,897,268
美国专利4,938,948
美国专利5,021,236
美国专利5,075,109
美国专利5,196,066
美国专利5,262,357
美国专利5,505,928
美国专利5,552,157
美国专利5,565,213
美国专利5,567,434
美国专利5,656,016
美国专利5,690,807
美国专利5,697,899
美国专利5,738,868
美国专利5,741,516
美国专利5,741,957
美国专利5,750,172
美国专利5,756,687
美国专利5,770,219
美国专利5,770,219
美国专利5,779,708
美国专利5,783,208
美国专利5,795,587
美国专利5,797,898
美国专利5,827,690
美国专利5,990,479
美国专利6,048,616
美国专利6,091,001
美国专利6,274,323
美国专利6,630,307
美国专利7,910,109
美国专利申请2005/0065463
Aggarwal et al.，Mod.Pathol.，22：：06-215，2008.
Altman et al.Science 274(5284)：94-6，1996.
Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988.
Atherton et al.，Biol.of Reproduction，32，155-171，1985.
Baird et al.，Scand.J.Immunol.，60(4)：363-71，2004.
Baraldo et al.，Infect.Immun.，73(9)：5835-41，2005.
Bendandi et al.，Nat.Med.，5：1171-1177，1999.
Berberian et al.，Science，261：1588-1591，1993.
Bertinetti et al.，Cancer Res.，66：4496-4502，2006.
Bijker et al.，J.Immunol.，179：5033-5040，2007.
Blanchard and Shastri，Curr.Opin.Immunol.，20：82-88，2008.
Burrows et al.，Trends Immunol.，27：11-16，2006.
Campbell，In：Monoclonal Antibody Technology，LaboratoryTech.Biochem.Molec.Biol.，Vol.13，Burden and Von Knippenberg(Eds.)，75-83，Amsterdam，Elsevier，1984.
Celluzzi et al.，J.Exp.Med.，183 283-287，1996.
Chapuis，A.G.，et al.(2016).″T-Cell Therapy Using IL-21 Primed CTLCombined with CTLA-4Blockade Results in Longterm Cell Persistence and DurableTumor Regression″J Clin Oncol，in press.
Cheson and Leonard，N.Eng.J.Med.，359：613-626，2008.
Cleary et al.，J.Biol.Chem.，269(29)：18747-9，1994.
Coiffier et al.，N.Eng.J.Med.，346：235-242，2002.
Collins et al.，Nature，371：626-629，1994.
Coulie，P.G.，et al.(1994).″A new gene coding for a differentiationantigen recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on HLA-A2 melanomas[see comments].″Journal of Experimental Medicine 180(1)：35-42.
Cumber et al.，J.Immunol..，149B：120-126，1992.
De Jager et al.，Semin.Nucl.Med.23(2)，165-179，1993.
Dholakia et al.，J.Biol.Chem.，264，20638-20642，1989.
Di Nicola et al.，Blood，113：18-27，2009.
Doolittle and Ben-Zeev，Methods Mol.Biol.，109，：215-237，1999.
Drin et al.，AAPS Pharm.Sci.，4(4)：E26，2002.
Du et al.，J.Pept.Res.，51：235-243，1998.
Dudley et al.，J.Immunol.，26(4)：332-342，2003.
Elliott and O′Hare，Cell，88：23-233，1997.
European Patent 0 216 846
European Patent 0 256 055
European Patent 0 323 997
European Patent Appl.89303964.4
Frankel and Pabo，Cell，55：189-1193，1988.
Gefter et al.，Somatic Cell Genet.，3：231-236，1977.
Goding，In：Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，2d ed.，Orlando，Fla.，Academic Press，60-61，65-66，71-74，1986.
Goeddel，Methods Enzymol.，185：3-7，1990.
Gritti et al.，Blood，92：368-373，1998.
Gulbis and Galand，Hum.Pathol.24(12)，1271-1285，1993.
Guo et al.，Nature，360：364-366，1992.
Gupta et al.，Biomaterials，26：3995-4021，2005.
Hawkins et al.，Hum.Gene Ther.，21(6)：665-72，2010.
Hefrling et al.，Am.J.Surg.Pathol.，31：1123-1129，2007.
Hefrling et al.，Blood，114(21)：4675-4686，2009.
Hida et al.，Cancer Immunol.Immunotherapy，51：219-228，2002.
Houot and Levy，BloodRev.，23：137-142，2009.
Hoyer et al.，J.Immunol.，175：864-873，2005.
Hoyer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：14392-14397，2002.
Inoges et al.，J.Natl.Cancer Inst.，98：1292-1301，2006.
Irvine et al.，Nature，419：845-849，2002.
Kang et al.，Blood，105：1288-1294，2005.
Kang et al.，Science，240：1034-1036，1988.
Kawakami，Y.，et al.(1995).″Recognition of multiple epitopes in thehuman melanoma antigen gp 100by tumor-infiltrating T lymphocytes associatedwith in vivo tumor regression.″Journal of Immunology 154(8)：3961-3968.
Khatoon et al.，Ann.of Neurology，26，210-219，1989.
King et al.，J.Biol.Chem.，269，10210-10218，1989.
Kohler and Milstein，Eur.J.Immunol.，6，511-519，1976.
Kohler and Milstein，Nature，256，495-497，1975.
Kohler et al.，Methods Enzymol.，178：3，1989.
Kreier et al.，In：Infection，Resistance and Immunity，Harper and Row，NewYork，1991.
Kwak et al.，N.Eng.J.Med.，327：1209-1215，1992.
Laine et al.，Molec.Cell，6：395-407，2000.
Lee et al.，J.Immunol.Methods，331：13-26，2008.
Lenert et al.，Science，248：1639-1643，1990.
Liddy N.et al.，Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing.Nat Med18(6)：980-7，2012.
Lin et al.，Immunol.Cell Biol.，86：353-362，2008.
Lin etal.，J.Biol.Chem.，270：4255-14258，1995.
Liu et al.，Cell Mol.Biol.，49(2)：209-216，2003.
Malyguine et al.，J.Transl.Med.，2：9，2004.
Marcus et al.，Blood，105：1417-1423，2005.
Maus et al.，Nat.Biotech.，20：143-148，2002.
McKee et al.，J Transl Med.3：35，2005.
McLaughlin et al.，J.Clin.Oncol.，16：2825-2833，1998.
Melief and van der Burg，Nat.Rev.Cancer，8：351-360，2008.
Moorthy et al.，PLoS Med.，1(2)：e33，2004.
Nakamura et al.，In：Enzyme Immunoassays：Heterogeneous and HomogeneousSystems，Chapter 27，1987.
Narducci et al.，Cancer Res.，57：5452-5456，1997b.
Narducci et al.，Cancer Res.，60：2095-2100，2000.
Narducci et al.，Oncogene，15：919-926，1997a.
Narducci et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：11712-11717，2002.
Navanete et al.，Blood，117：1483-1491，2011.
Neelapu et al.，Nat.Med.，11：986-991，2005.
Neelapu et al.，Blood，15：109(12)：5160-5163，2007.
Nestle et al.，Nat.Med.，4：328，1998.
Oates J.et al.ImmTACs for targeted cancer therapy：Why，what，how，andwhich(2015)Mol Immunol.2015 Oct；67(2 Pt A)：67-74.
O′Shannessy et al.，J.Immun.Meth.，99，153-161，1987.
Owens and Haley，J.Biol.Chem.，259，14843-14848，1987.
Pack et al.，Biochem.，31：1579-1584，1992.
Park and Neelapu，Br.J.Haemat.，142：179-191，2008.
PCT Publn.WO 99/26299
Pekarsky et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，105：19643-19648，2008.
Pollack，S.M.，R.L.Jones，E.A.Farrar，S.R.Riddell，and C.Yee.2014.TetramerGuided Cell Sorter Assisted Production of Clinical Grade Autologous NY-ESO-1Specific CD8+ T Cells.Journal of Immunotherapy of Cancer in press.
Popescu et al.Blood，15：109(12)：5407-5410，2007.
Potter and Haley，Meth.Enzymol.，91，613-633，1983.
Quintarelli et al.，Blood，117：3353-3362，2011.
Ramuz et al.，Int.J Oncol.，26：151-157，2005.
Remington，In：The Science and Practice of Pharmacy，21stEd.，LippincottWilliams and Wilkins，2005.
Remington，In：The Science and Practice of Pharmacy，21stEd.，Pharmaceutical Press，2011.
Ribas et al.，Trends Immunol.，24：58-61，2003.
Riddell et al.，J.Immunol.，128(2)：189-201，1990.
Rojas et al.，J.Biol.Chem.，271：27456-27461，1996.
Rojas et al.，Proc.West.Pharmacol.Soc.，41：55-56，1998.
Said et al.，Lab.Invest.81：555-564，2001.
Samino et al.，J.Biol.Chem.，281：6358-6365，2006.
Sasso et al.，J.Immunol.，142：2778-2783，1989.
Seaman BJ，et al.Audiovestibular dysfunction associated with adoptivecell immunotherapy for melanoma.Otolaryngology--head and neck surgery；Otolaryngol Head Neck Surg May 17，2012.
Schuster et al.，J.Clin.Oncol.，29(20)：2787-94，2011.
Schwarze et al.，Trends in Cell Biol.，10：290-295，2000.
Schwenzer et al.，J.Biol.Chem.，274：19368-19374，1999.
Shorki et al.，J.Immunol.，146：936-940，1991.
Silvermann et al.，J.Clin.Invest.，96：417-426，1995.
Skull and Kemp，Arch.Dis.Child.，74：527-530，1996.
Stryhn et al.，Eur.J.Immunol.，30：3089-3099，2000.
Teitell，Nat.Rev.Cancer，5：640-648，2005.
Timmerman et al.，Blood，99：1517-1526，2002.
Virgilio et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：3885-3889，1998.
Wakim et al.，Nature，471：629-632，2011.
Wang and Wang，Nat.Biotechnol.，20：149-154，2002.
Yee et al.，J.Immunol.Methods，261(1-2)：1-20，2002.
Yee，C.，et al.，.Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+ Tcell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma：in vivopersistence，migration，and antitumor effect of transferred T cells.Proc NatlAcad Sci U S A 99：16168-16173，2002b.
Yee et al.The use of endogenous T cells for adoptivetransfer.Immunological reviews 257：250-263.2014.
Young et al.，J.Exp.Med.，183：-11，1996.
Zwaveling et al.，J.Immunol.，169：350-358，2002.
序列表
<110> 得克萨斯州大学系统董事会
<120> 用于免疫治疗的SLC45A2肽
<130> UTFC.P1278WO
<150> US 62/263,835
<151> 2015-12-07
<150> US 62/263,189
<151> 2015-12-04
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Ser Leu Tyr Ser Tyr Phe Gln Lys Val
1 5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 2
Ser Tyr Ile Gly Leu Lys Gly Leu Tyr Phe
1 5 10
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 3
ctggccgcca catctataaa t 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 4
gtagcagaac tctcttccga ac 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 5
acagtgatcc tgggagtctt ac 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 6
ttgaagagac actttgctgt cc 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 7
aggtgccttt ctccgtgag 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 8
gcttcagcca gatagccact 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 9
gcaaagcata ccatcagctc a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 10
gcagtgcatc cattgacaca t 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 11
aatcccatca ccatcttcca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 12
tggactccac gacgtactca 20
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 13
Arg Leu Leu Gly Thr Glu Phe Gln Val
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
Val Trp Phe Leu Ser Pro Ile Leu Gly Phe
1 5 10
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 15
Ala Leu Ile Ala Asn Pro Arg Arg Lys
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
Ser Gly Gln Ala Gly Arg His Ile Tyr
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val
1 5

Claims (75)

1.分离的肽，其长度为35个氨基酸或更少并且包含SLC45A2382-390(SEQ ID NO：1)或SLC45A2393-402(SEQ ID NO：2)的序列或者与SLC45A2382-390(SEQ ID NO：1)或SLC45A2393-402(SEQ ID NO：2)具有至少90％同一性的序列，其中所述肽选择性地结合HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A24或HLA-A*2402。
2.权利要求1所述的肽，其中所述肽的长度为30个氨基酸或更少。
3.权利要求2所述的肽，其中所述肽的长度为25个氨基酸或更少。
4.权利要求3所述的肽，其中所述肽的长度为20个氨基酸或更少。
5.权利要求4所述的肽，其中所述肽的长度为15个氨基酸或更少。
6.权利要求1所述的肽，其中所述肽包含SLC45A2382-390(SEQ ID NO：1)或由其组成，并且其中所述肽选择性地结合HLA-A2或HLA-A*0201。
7.权利要求6所述的肽，其中所述肽包含SLC45A2393-402(SEQ ID NO：2)或由其组成，并且其中所述肽选择性地结合HLA-A24或HLA-A*2402。
8.权利要求1至7中任一项所述的肽，其中所述肽包含在药物制剂中。
9.权利要求8所述的肽，其中所述药物制剂配制成用于肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射。
10.权利要求9所述的肽，其中所述肽包含在脂质体、含脂质纳米粒中，或基于脂质的载体中。
11.权利要求10所述的肽，其中所述药物制剂配制成用于注射或作为鼻喷雾剂吸入。
12.权利要求1所述的肽，其中所述肽包含在细胞培养基中。
13.细胞培养基，其包含权利要求1至7中任一项所述的肽。
14.药物组合物，其包含权利要求1至7中任一项所述的肽、以及赋形剂。
15.权利要求14所述的组合物，其中药物制剂配制成用于肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射。
16.权利要求14所述的肽，其中所述肽包含在脂质体、含脂质纳米粒中，或基于脂质的载体中。
17.包含根据权利要求1至12中任一项所述肽的组合物，其用于治疗性治疗。
18.权利要求17所述的组合物，其中所述组合物用于治疗黑素瘤。
19.权利要求17所述的组合物，其中肽的长度为25个氨基酸或更少。
20.权利要求17所述的组合物，其中肽的长度为20个氨基酸或更少。
21.权利要求17所述的组合物，其中肽的长度为15个氨基酸或更少。
22.权利要求17所述的组合物，其中所述肽包含SLC45A2382-390(SEQ ID NO：1)或由其组成。
23.权利要求22所述的组合物，其中所述肽包含SLC45A2393-402(SEQ ID NO：2)或由其组成。
24.权利要求17所述的组合物，其中所述肽包含在药物制剂中。
25.权利要求24所述的组合物，其中所述药物制剂配制成用于肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射。
26.权利要求25所述的组合物，其中所述肽包含在脂质体、含脂质纳米粒中，或基于脂质的载体中。
27.权利要求26所述的组合物，其中所述药物制剂配制成用于注射或作为鼻喷雾剂吸入。
28.权利要求18所述的肽，其中所述肽通过肽合成产生。
29.权利要求18所述的肽，其中所述肽重组产生。
30.权利要求18所述的组合物，其中所述黑素瘤是皮肤黑素瘤。
31.权利要求18所述的组合物，其中所述黑素瘤是葡萄膜黑素瘤。
32.权利要求18所述的组合物，其中所述黑素瘤是黏膜黑素瘤。
33.权利要求18所述的组合物，其中所述黑素瘤是转移性黑素瘤。
34.在哺乳动物对象中治疗黑素瘤的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求1至12中任一项所述的肽。
35.权利要求34所述的方法，其中所述肽包含在药物制剂中。
36.权利要求35所述的方法，其中所述药物制剂配制成用于肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射。
37.权利要求34所述的方法，其中所述对象是人。
38.权利要求34所述的方法，其中所述黑素瘤是皮肤黑素瘤。
39.权利要求34所述的方法，其中所述黑素瘤是葡萄膜黑素瘤。
40.权利要求34所述的方法，其中所述黑素瘤是黏膜黑素瘤。
41.权利要求34所述的方法，其中所述黑素瘤是转移性黑素瘤。
42.权利要求34所述的方法，其中向所述对象施用第二抗癌治疗。
43.权利要求42所述的方法，其中所述第二抗癌治疗选自化学治疗、放射治疗、免疫治疗或外科手术。
44.权利要求42所述的方法，其中所述肽以有效促进所述对象中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)裂解或杀伤所述对象中癌细胞的量施用于所述对象。
45.用于诱导T细胞群增殖的体外方法，其包括使T细胞与一定量的权利要求1至12中任一项所述的肽在体外接触，所述量足以结合所述T细胞中HLA-A*0201或HLA-A2并促进一种或更多种所述T细胞的增殖。
46.权利要求45所述的方法，其中所述T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
47.权利要求45所述的方法，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
48.权利要求45所述的方法，其还包括在所述增殖之后将所述T细胞施用于对象。
49.权利要求48所述的方法，其中所述对象是人。
50.在对象中促进针对SLC45A2之免疫应答的方法，其包括向所述对象施用有效引起选择性地靶向SLC45A2的T细胞增殖之量的权利要求1至12中任一项所述的肽。
51.权利要求50所述的方法，其中所述T细胞是细胞毒性T淋巴细胞。
52.权利要求50所述的方法，其中所述对象是人。
53.权利要求50所述的方法，其中所述对象患有黑素瘤。
54.权利要求53所述的方法，其中所述黑素瘤是皮肤黑素瘤。
55.权利要求53所述的方法，其中所述黑素瘤是葡萄膜黑素瘤。
56.权利要求53所述的方法，其中所述黑素瘤是黏膜黑素瘤。
57.权利要求53所述的方法，其中所述黑素瘤是转移性黑素瘤。
58.权利要求50所述的方法，其中所述对象未患癌症。
59.分离的核酸，其编码权利要求1至7中任一项所述的肽。
60.权利要求59所述的核酸，其中所述核酸包含在小基因或质粒中。
61.权利要求59或60所述的核酸，其中所述核酸是RNA。
62.载体，其包含由权利要求59所述的核酸区段组成的连续序列。
63.权利要求62所述的载体，其中所述载体还包含异源启动子。
64.权利要求62或63所述的载体，其中所述载体包含在小基因或质粒中。
65.分离的抗体，其与权利要求1所述的肽选择性地结合。
66.权利要求65所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体，包含在多克隆抗血清中，或者是抗体片段。
67.权利要求65所述的抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
68.分离的抗体，其与肽-HLA-A2复合物选择性地结合，其中所述肽-HLA-A2复合物包含与HLA-A2结合的权利要求1至12中任一项所述的肽。
69.权利要求68所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体，包含在多克隆抗血清中，或者是抗体片段。
70.权利要求68所述的抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
71.权利要求65至70中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含在融合构建体、可溶性融合构建体、ImmTAC或免疫毒素中。
72.药盒，其包含在容器中的权利要求1至12中任一项所述的肽。
73.权利要求72所述的药盒，其中所述肽包含在药物制剂中。
74.权利要求73所述的药盒，其中所述药物制剂配制成用于肠胃外施用或吸入。
75.权利要求72所述的药盒，其中所述肽包含在细胞培养基中。
CN201680079367.4A 2015-12-04 2016-12-02 用于免疫治疗的slc45a2肽 Pending CN108601811A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562263189P 2015-12-04 2015-12-04
US62/263,189 2015-12-04
US201562263835P 2015-12-07 2015-12-07
US62/263,835 2015-12-07
PCT/US2016/064825 WO2017096304A1 (en) 2015-12-04 2016-12-02 Slc45a2 peptides for immunotherapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108601811A true CN108601811A (zh) 2018-09-28

Family

ID=58798003

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680079367.4A Pending CN108601811A (zh) 2015-12-04 2016-12-02 用于免疫治疗的slc45a2肽

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20190169262A1 (zh)
EP (1) EP3383418B1 (zh)
JP (1) JP2019507582A (zh)
KR (1) KR20180118105A (zh)
CN (1) CN108601811A (zh)
AU (1) AU2016363006B2 (zh)
CA (1) CA3007301A1 (zh)
ES (1) ES2902477T3 (zh)
IL (1) IL259793A (zh)
SG (1) SG11201804648RA (zh)
WO (1) WO2017096304A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111363026A (zh) * 2020-03-31 2020-07-03 浙江省中医院、浙江中医药大学附属第一医院（浙江省东方医院） 一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201520595D0 (en) * 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520568D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd Peptides
GB201520550D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
IL298653A (en) 2015-12-11 2023-01-01 Immatics Biotechnologies Gmbh New peptides and a combination of peptides for use in immunotherapy against several types of cancer
GB201521894D0 (en) * 2015-12-11 2016-01-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various cancers
PE20181897A1 (es) 2016-04-21 2018-12-11 Immatics Biotechnologies Gmbh Inmunoterapia contra el melanoma y otros tipos de cancer
EP3642331B1 (en) * 2017-06-22 2023-05-24 NEOGAP Therapeutics AB T-cell expansion method and uses
AU2018346957A1 (en) * 2017-10-12 2020-04-23 Board Of Regents, The University Of Texas System T cell receptors for immunotherapy
KR102322832B1 (ko) * 2019-04-22 2021-11-12 한국과학기술연구원 인간 백혈구 항원 a24:02 대립유전자에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
CN115927356B (zh) * 2022-09-16 2024-04-30 湖南家辉生物技术有限公司 Slc45a2致病突变基因、致病突变体及在制备眼皮肤白化病ⅳ型诊断试剂盒中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030175962A1 (en) * 2001-06-08 2003-09-18 Shoji Fukamachi Gene encoding b protein
US20110086805A1 (en) * 2007-11-21 2011-04-14 Assistance Publique - Hopitaux De Paris In vitro method for diagnosing skin cancer
CN103890587A (zh) * 2011-08-31 2014-06-25 昂科赛特公司 用于治疗和诊断癌症的方法和组合物
WO2014150671A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 The Broad Institute, Inc. Methods of identifying responses to map kinase inhibition therapy
CN104302276A (zh) * 2012-03-26 2015-01-21 生物技术公司 用于免疫治疗的rna制剂
WO2017089768A1 (en) * 2015-11-23 2017-06-01 Immunocore Limited Peptides

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3964482A (en) 1971-05-17 1976-06-22 Alza Corporation Drug delivery device
BE795384A (fr) 1972-02-14 1973-08-13 Ici Ltd Pansements
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4373071A (en) 1981-04-30 1983-02-08 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4401796A (en) 1981-04-30 1983-08-30 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4957939A (en) 1981-07-24 1990-09-18 Schering Aktiengesellschaft Sterile pharmaceutical compositions of gadolinium chelates useful enhancing NMR imaging
US4472509A (en) 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4598049A (en) 1983-08-31 1986-07-01 Systec Inc. General purpose gene synthesizer
GB2183662B (en) 1985-04-01 1989-01-25 Celltech Ltd Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4938948A (en) 1985-10-07 1990-07-03 Cetus Corporation Method for imaging breast tumors using labeled monoclonal anti-human breast cancer antibodies
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
US5549910A (en) 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
US5252334A (en) 1989-09-08 1993-10-12 Cygnus Therapeutic Systems Solid matrix system for transdermal drug delivery
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
JPH049249A (ja) 1990-04-27 1992-01-14 Kusuda:Kk 塗型剤吹き付け機
JP3218637B2 (ja) 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
JP2958076B2 (ja) 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
US5262357A (en) 1991-11-22 1993-11-16 The Regents Of The University Of California Low temperature thin films formed from nanocrystal precursors
US5505928A (en) 1991-11-22 1996-04-09 The Regents Of University Of California Preparation of III-V semiconductor nanocrystals
WO1994019935A1 (en) 1993-03-09 1994-09-15 Genzyme Corporation Isolation of components of interest from milk
US6048616A (en) 1993-04-21 2000-04-11 Philips Electronics N.A. Corp. Encapsulated quantum sized doped semiconductor particles and method of manufacturing same
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5741516A (en) 1994-06-20 1998-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5697899A (en) 1995-02-07 1997-12-16 Gensia Feedback controlled drug delivery system
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US5738868A (en) 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
US5690807A (en) 1995-08-03 1997-11-25 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing semiconductor particles
US5656016A (en) 1996-03-18 1997-08-12 Abbott Laboratories Sonophoretic drug delivery system
US5797898A (en) 1996-07-02 1998-08-25 Massachusetts Institute Of Technology Microchip drug delivery devices
US5783208A (en) 1996-07-19 1998-07-21 Theratech, Inc. Transdermal drug delivery matrix for coadministering estradiol and another steroid
US5779708A (en) 1996-08-15 1998-07-14 Cyberdent, Inc. Intraosseous drug delivery device and method
US6322901B1 (en) 1997-11-13 2001-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Highly luminescent color-selective nano-crystalline materials
US5990479A (en) 1997-11-25 1999-11-23 Regents Of The University Of California Organo Luminescent semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
AU4701200A (en) 1999-05-07 2000-11-21 Quantum Dot Corporation A method of detecting an analyte using semiconductor nanocrystals
GB0203420D0 (en) 2002-02-13 2002-04-03 Oxford Biomedica Ltd Peptide
US8353861B2 (en) 2003-09-18 2013-01-15 Texmac, Inc. Applicator for applying functional substances into human skin
FR2907681B1 (fr) * 2006-10-26 2012-10-19 Vincience Composition pharmaceutique et/ou cosmetique contenant des polypeptides ou des peptides.
US20110177042A1 (en) * 2008-10-03 2011-07-21 Meenhard Herlyn Method for Dedifferentiating Melanocytes
US9149455B2 (en) * 2012-11-09 2015-10-06 Abraxis Bioscience, Llc Methods of treating melanoma
WO2015056774A1 (ja) * 2013-10-18 2015-04-23 大鵬薬品工業株式会社 Ｈｌａクラスｉ発現非ヒト動物

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030175962A1 (en) * 2001-06-08 2003-09-18 Shoji Fukamachi Gene encoding b protein
US20110086805A1 (en) * 2007-11-21 2011-04-14 Assistance Publique - Hopitaux De Paris In vitro method for diagnosing skin cancer
CN103890587A (zh) * 2011-08-31 2014-06-25 昂科赛特公司 用于治疗和诊断癌症的方法和组合物
US20140206574A1 (en) * 2011-08-31 2014-07-24 Karen Chapman Methods and Compositons for the Treatment and Diagnosis of Cancer
CN104302276A (zh) * 2012-03-26 2015-01-21 生物技术公司 用于免疫治疗的rna制剂
WO2014150671A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 The Broad Institute, Inc. Methods of identifying responses to map kinase inhibition therapy
WO2017089768A1 (en) * 2015-11-23 2017-06-01 Immunocore Limited Peptides

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J PARK等: "SLC45A2: A Melanoma Antigen with High Tumor Selectivity and Reduced Potential for Autoimmune Toxicity", 《CANCER IMMUNOL RES.》 *
MAMORU HARADA等: "Use of an in Vitro Immunoselected Tumor Line to Identify Shared Melanoma Antigens Recognized by HLA-A*0201-restricted T Cells", 《CANCER RESEARCH》 *
YONGQING LI等: "IL-21–mediated Foxp3 suppression leads to enhanced generation of antigen-specific CD8 cytotoxic T lymphocytes", 《IMMUNOBIOLOGY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111363026A (zh) * 2020-03-31 2020-07-03 浙江省中医院、浙江中医药大学附属第一医院（浙江省东方医院） 一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法
CN111363026B (zh) * 2020-03-31 2022-03-25 浙江省中医院、浙江中医药大学附属第一医院（浙江省东方医院） 一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019507582A (ja) 2019-03-22
IL259793A (en) 2018-07-31
KR20180118105A (ko) 2018-10-30
EP3383418A4 (en) 2019-08-07
SG11201804648RA (en) 2018-06-28
CA3007301A1 (en) 2017-06-08
ES2902477T3 (es) 2022-03-28
US20190169262A1 (en) 2019-06-06
EP3383418B1 (en) 2021-10-20
US20210170002A1 (en) 2021-06-10
AU2016363006A1 (en) 2018-06-28
EP3383418A1 (en) 2018-10-10
WO2017096304A1 (en) 2017-06-08
AU2016363006B2 (en) 2021-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108601811A (zh) 用于免疫治疗的slc45a2肽
CN105377288B (zh) Xbp1、cd138和cs1肽的组合物制备药物的用途
CN108117584B (zh) Foxm1肽和包含foxm1肽的药剂
CN108713024A (zh) 用于nhl和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物
CN107921111A (zh) 用于各种癌症免疫治疗的新型肽、肽组合物和支架
CN106459167A (zh) 急性骨髓性白血病(aml)等几种血液肿瘤的新型免疫疗法
US9487567B2 (en) Method for the production of an immunostimulating mucin (MUC1)
CN102356155B (zh) Neil3肽及包含它的疫苗
CN109748953A (zh) 用于治疗多种肿瘤（例如包括nsclc在内的肺癌）的新型免疫疗法
CN111499716A (zh) 用于癌症免疫治疗的肽及其肽组合物
CN105164256A (zh) Kntc2肽及包含它们的疫苗
CN102822193B (zh) 修饰的melk肽及包含它们的疫苗
TW201138806A (en) CDCA5 peptides and vaccines including the same
JP6255593B2 (ja) Ｔｈ１細胞のＣＤＣＡ１エピトープペプチドおよびこれを含有するワクチン
CN103339253B (zh) Tomm34肽及包含它们的疫苗
CN103694315B (zh) Cdc45l肽及包含它的疫苗
CN102459314B (zh) Ttk肽及包含它们的疫苗
CN113382747A (zh) 靶向肿瘤表位的疫苗
CN102884190B (zh) Hjurp肽及包含它们的疫苗
CN102939379B (zh) Ect2肽及包含它们的疫苗
TW201043244A (en) VANGL1 peptides and vaccines including the same
US9290541B2 (en) TCL1 peptides for immunotherapy
CN108137652A (zh) Foxm1衍生的肽和包含它们的疫苗
CN103270156B (zh) Wdhd1肽及包含它们的疫苗
CN103282494B (zh) C18orf54肽及包含它们的疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1260643

Country of ref document: HK

RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180928

RJ01 Rejection of invention patent application after publication