CN111363026A - 一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法，多肽HLA‑I类复合物向T细胞的高效呈递功能得益于复合物内稳定的相互作用，与亲和力相比，HLA‑I复合物的稳定性更能反映其免疫原性。本发明可解决针对肿瘤特异性抗原与HLA‑I类分子低亲和力结合及结合后多肽HLA‑I分子复合物稳定性差的问题，适用于肿瘤相关抗原和肿瘤新生抗原的抗原表位改造，HLA‑I类分子限制性多肽表位除P2位外，P1、P3‑P9位氨基酸残基的单个残基分别替换为His/Tyr/Trp后，其亲和力和稳定性均增强，且不影响HLA‑A*2402对残基替换后抗原多肽的特异性，这对采用肿瘤特异性多肽的抗肿瘤免疫治疗，或依据此原理对T细胞受体改造后的T细胞免疫治疗的抗肿瘤免疫治疗均具有较高的临床实践意义。

Description

一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法

技术领域

本发明涉及抗原多肽技术领域，尤其是涉及一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法。

背景技术

主要组织相容性复合体I类(MHC-I)分子在细胞免疫反应中起重要作用，向细胞毒性T淋巴细胞(CTL)呈递多肽，使免疫系统能够仔细检查细胞内正在进行的生物学过程[1]。目前，许多免疫疗法的研究发现，肿瘤特异性抗原肽不仅通过低亲和力的方式结合MHC，还经常表现出抗原加工和提呈功能的缺陷，从而导致免疫逃避[2]，因此它们对基于T细胞的免疫治疗构成了巨大的挑战。通过替换HLA锚定残基来增加肽与MHC-I类分子结合裂隙间的互补性，是提高抗原肽结合能力和抗原性的常用步骤。但是，这种改变必须根据每个MHC-I等位基因型，并可能由于抗原肽的构象改变而招募不同特异性的CTL，即降低了T细胞识别概率[3]。多肽-MHC-I类(pMHC-I)复合物向T细胞的高效呈递功能得益于多肽-MHC-I之间稳定的相互作用[4]。与亲和力相比，pMHC-I复合物的稳定性更能反映CTL的免疫原性[5]。但是，很难将稳定性与MHC-I结合的其他要素区分开，如亲和力。科学家建立了一种高通量检测pMHC-I稳定性的方法，即包含pMHC-I复合物稳定性评估的大型数据库。人工神经网络被用来构造能够预测pMHC-I复合物半衰期的稳定性预测器[6]。通过柔性分子对接来预测抗原多肽与不同的MHC同种异型的结合亲和力已被证实具有相当高的预测精度[7]。

结合在MHC多肽结合槽中的多肽已被证明通过影响功能的方式来影响T细胞和其他受体的识别。多肽可以调节MHC本身的运动，从而影响其他蛋白质对肽/MHC复合物的识别[8]。因此，肽-MHC复合物的结构建模有可能揭示T细胞激活的未知驱动因素，从而有助于开发更好和更安全的免疫疗法[9]。有研究指出脯氨酸(Pro)取代多肽第三位残基，不仅能够显著增强抗肿瘤CTL对野生型表位的识别能力[10]，还提高了pMHC的亲和力和复合物的稳定性[11]。通过MHC/肽复合物的晶体结构分析表明，修饰后抗原多肽的构象与野生型相似，且与哺乳动物MHC-I分子中已知的最保守的酪氨酸残基Y159相互作用而保持稳定的结合[12]。锚定残基同一性的改变可能会产生显著的影响，如改变肽-MHC复合物的构象，从而影响抗原多肽上的残基与TCR接触。黑色素瘤分化抗原gp100 T细胞表位G9-209的TCR样重组抗体的结合完全依赖于第2位单肽锚定残基的同一性，即TCR样抗体只能在使用与HLA-A2亲和力提高的修饰肽G9-209-2M的条件下才能识别特定的复合物，而不能与未经修饰的天然肽识别。提示锚点残基的修饰可以显著影响MHC肽槽的构象，从而可能对TCR相互作用产生深远影响[13]。与非抗原肽相比，抗原肽往往更稳定地与MHC-I分子结合，并且证实多肽第2位的非合适的锚定残基特别容易与MHC-I发生不稳定的相互作用[5]。

发明内容

针对解决上述技术问题，本发明提供一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法，解决针对肿瘤特异性抗原与HLA-I类分子低亲和力结合及结合后多肽HLA-I分子复合物稳定性差的问题。

本发明提供一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法，将HLA-A*2402限制性HLA-I类分子抗原多肽(表位)第1位(P1)的半胱氨酸(Cys)残基、第4位(P4)的亮氨酸(Leu)残基/缬氨酸(Val)残基、第7位(P7)的苏氨酸(Thr)残基分别替换为组氨酸(His)来增强该抗原多肽与HLA-A*2402亲和力和结合稳定性。

本发明提供一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法，将HLA-A*2402限制性HLA-I类分子抗原多肽(表位)第1位(P1)的半胱氨酸(Cys)残基、第3位(P3)的丝氨酸(Ser)残基、第4位(P4)的亮氨酸(Leu)残基/缬氨酸(Val)残基、第6位(P6)的甘氨酸(Gly)残基、第7位(P7)的苏氨酸(Thr)残基、第8位(P8)的苏氨酸(Thr)残基分别替换为酪氨酸(Tyr)来增强该抗原多肽与HLA-A*2402亲和力和结合稳定性。

本发明提供一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法，将HLA-A*2402限制性HLAI类分子抗原多肽(表位)第1位(P1)的半胱氨酸(Cys)残基、第4位(P4)的亮氨酸(Leu)残基/缬氨酸(Val)残基、第5位(P5)的酪氨酸(Tyr)残基、第6位(P6)的甘氨酸(Gly)残基、第7位(P7)的苏氨酸(Thr)残基、第9位(P9)的亮氨酸(Leu)残基分别替换为色氨酸(Trp)来增强该抗原多肽与HLA-A*2402亲和力和结合稳定性。

本发明提供一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法，将HLA-A*2402限制性HLAI类分子抗原多肽(表位)的第1位(P1)、第3位(P3)、第4位(P4)、第7位(P7)、第9位(P9)的氨基酸残基分别替换为芳香族R基团/带正电荷R基团(碱性)氨基酸，用以提高抗原与HLA的亲和力；将第1位(P1)、第4位(P4)、第5位(P5)、第6位(P6)、第7位(P7)、第8位(P8)、第9位(P9)位的氨基酸残基分别替换为芳香族R基团/带正电荷R基团(碱性)氨基酸残基，用以增强抗原与HLA的稳定性。由于pi stack是常见的分子间相互作用力，且与Auto Vina对接结合能有显著的相关性，而通过体外结合力的有或无进行分别分析发现，区别于体外不结合的多肽，体外结合的多肽与HLA相互作用的氨基酸残基为组氨酸、酪氨酸和色氨酸，我们认为这三种氨基酸在多肽与HLA结合过程中起着重要的作用，通过把这三种氨基酸分别替换多肽序列的第1-9位氨基酸，我们发现某些位置的氨基酸被这三种氨基酸替换后，亲和力和或稳定性明显提高。

本发明提供一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法，在对接柔性多肽和HLA-A*2402分子后，根据分子间相互作用力π-π堆积(pi stack)的有或无、形成该非共价键的位于抗原多肽上的氨基酸残基的侧链性质(芳香族R基团的氨基酸/带正电荷R基团(碱性)氨基酸)来预测HLA-A*2402限制性抗原多肽的亲和力和结合稳定性。其依据来源于上述4条内容的总结，多肽与HLA之间具有pi stack的分子间作用力，多肽序列的某些位置表达固定的芳香族氨基酸或者带正电荷的碱性氨基酸，其亲和力和或稳定性都有所提高。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明同时适用于肿瘤相关抗原和肿瘤新生抗原的抗原表位改造，HLA-I类分子限制性多肽表位除P2位外，P1、P3-P 9位氨基酸残基的单个残基(Cys/Ser/Leu/Val/Gly/Thr)分别替换为His/Tyr/Trp后，其亲和力和稳定性均增强，且不影响HLA-A*2402对残基替换后抗原多肽的特异性，这对采用肿瘤特异性多肽的抗肿瘤免疫治疗，或依据此原理对T细胞受体改造后的T细胞免疫治疗(TCR-T)的抗肿瘤免疫治疗均具有较高的临床实践意义。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的具体实验方法如下

1.数据收集

已有研究的HLA-A*2402限制性抗原肽的氨基酸序列、体外竞争性结合实验结果来源于文献[14]。抗原肽与HLA-A*2402的亲和力预测数据采用NetMHCpan v4.0服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)计算[15]。抗原肽与HLA-A*2402的稳定性预测数据采用NetMHCstab v1.0服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCstab/)计算[16]。

2.分子对接

与抗原多肽对接的HLA-A*2402晶体模型(PDBID:2BCK)来源于PDB数据库(http://www.rcsb.org/)[17]。采用Auto Vina[18]对接限制性抗原多肽与HLA-A*2402；Flexpepdock[19]优化对接限制性抗原多肽与HLA-A*2402对接形式；MM-GBSA[20]计算对接限制性抗原多肽与HLA-A*2402的结合自由能；Maestro(Schrodinger,LLC,New York,NY,2019)[21]测算对接相关参数。

3.统计学分析

相关分析采用Spearman相关系数统计分析，p＜0.05被认为具有统计学意义。

本发明实验结果分析如下

1.抗原多肽的序列、体外实验结果和预测亲和力及稳定性值

HLA-A*2402限制性抗原多肽的氨基酸序列、体外竞争性结合实验结果以及NetMHCpan v4.0预测的亲和力值和NetMHCstab v1.0预测的稳定性值见表1，其中，亲和力阈值：Threshold for strong binder:％Rank：0.5，Threshold for weak binder:％Rank：2。即0.5＜％Rank≤2为弱结合力(WB)，％Rank≤0.5为强结合力(SB)，其余均为不结合(NB)。稳定性阈值：Threshold for highly stable binder(hours)：6，Threshold forweakly stable binder(hours)：2。即2≤Thalf＜6为弱稳定性(WS)，Thalf≥6为强稳定性(HS)，其余均为不稳定(NS)。

从表中发现36条抗原多肽中有19条多肽在体外与HLA-A*2402分子竞争性结合，其余17条多肽无结合力；19条多肽中分别有8条多肽被预测具有强结合力或者弱结合力，其余11条被预测无结合力；而8条被预测具有结合力的多肽中，只有2条多肽被预测具有弱稳定性。其中CYSLYGTTL与CYSVYGTTL这两条多肽，体外实验证实能够竞争性结合、亲和力预测能够结合，并且稳定性预测能够稳定结合。

表1.抗原多肽的序列、体外实验结果和预测亲和力及稳定性值

2.抗原多肽的结合能值和相互作用力分析

Auto Vina对接抗原多肽与HLA-A*2402的结合能值、Flexpepdock优化对接的结合能值、MM-GBSA的结合自由能值以及Maestro-v12.0分析的氢键、pi stack见表2。表2提示维系抗原多肽与HLA-A*2402分子间相互作用力主要靠HB，其次为pi stack。

具有体外结合力的抗原多肽的结合能和相互作用力以及预测亲和力、稳定性值的相关性统计学分析结果见表3.1-3.8，*代表p<0.05，**代表p<0.01，均提示结果具有统计学意义。

表3-1～表3-8分别为利用相关分析去研究Experimental binding capacity(体外竞争性结合力)、％Rank(亲和力阈值)、Thalf(稳定性阈值)、Auto(分子对接)、Flex(优化对接)、GBSA(结合自由能)、HB(分子间相互作用)、和pi stack(分子间相互作用)共计8项参数之间的相关关系，使用Spearman相关系数去表示相关关系的强弱情况。

表3-1提示Experimental binding capacity和％Rank之间的相关系数值为0.623，并且呈现出0.01水平的显著性，因而说明Experimental binding capacity和％Rank之间有着显著的正相关关系。而Experimental binding capacity和Thalf之间的相关系数值为-0.333，接近于0，并且P值为0.163>0.05，因而说明Experimental bindingcapacity和Thalf之间并没有相关关系；同理可得Experimental binding capacity分别与Auto、Flex、GBSA、HB、pi stack之间没有相关关系。

表3-2提示％Rank和Thalf之间有着显著的负相关关系，分别与Experimentalbinding capacity、Auto之间有着显著的正相关关系；而％Rank分别与Flex、GBSA、HB、pistack之间没有相关关系。

表3-3提示Thalf与％Rank之间有着显著的负相关关系；而Thalf分别与Experimental binding capacity、Auto、Flex、GBSA、HB、pi stack之间没有相关关系。

表3-4提示Auto分别与％Rank、Flex、GBSA之间有着显著的正相关关系，与pistack之间有显著的负相关关系；而Auto分别与Experimental binding capacity、Thalf、HB之间没有相关关系。

表3-5提示Flex与Auto之间有着显著的正相关关系；而Flex分别与Experimentalbinding capacity、Thalf、％Rank、GBSA、HB、pi stack之间没有相关关系。

表3-6提示GBSA与Auto之间有着显著的正相关关系，与HB之间有显著的负相关关系；而GBSA分别与Experimental binding capacity、Thalf、％Rank、Flex、pi stack之间没有相关关系。

表3-7提示HB与GBSA之间有显著的负相关关系；而HB分别与Experimentalbinding capacity、Thalf、％Rank、Auto、Flex、pi stack之间没有相关关系。

表3-8提示pi stack与Auto之间有显著的负相关关系；而pi stack分别与Experimental binding capacity、Thalf、％Rank、Flex、HB、GBSA之间没有相关关系。上述结果提示体外竞争性结合力与％Rank预测阈值具有显著的正相关性，而％Rank分别与Thalf预测阈值及Auto结合能有显著的相关关系。Auto结合能分别与Flex结合能、GBSA结合自由能及pi stack分子间相互作用具有显著的相关关系。GBSA结合自由能与HB分子间相互作用具有显著的相关关系。

形成pi stack相互作用的位于抗原多肽和HLA-A*2402分子上的氨基酸残基见表4，P1-P9分别代表氨基酸序列的第1-9位氨基酸残基。

表4提示HLA-A*2402与抗原多肽形成的pi stack主要与P2位氨基酸残基Y(Tyr)，其次为P5与P7位氨基酸残基Y(Tyr)。

根据体外竞争性结合状态区分，体外结合的抗原多肽P2位氨基酸残基为Y(Tyr)；P3位氨基酸残基为H(His)；P5位氨基酸残基为Y(Tyr)；P7位氨基酸残基为Y(Tyr)；P9位氨基酸残基为W(Trp)。

而体外不结合的抗原多肽P2主要为Y(Tyr)，其次为W(Trp)；P1位氨基酸残基为H(His)；P9位氨基酸残基为F(Phe)。

表2.抗原多肽的结合能值和相互作用力

表3-1体外竞争性结合力与预测值和分子对接的相关性

表3-2预测值与体外竞争性结合力和分子对接的相关性

表3-3预测值与体外竞争性结合力和分子对接的相关性

表3-4分子对接与预测值和体外竞争性结合力的相关性

表3-5分子对接与预测值和体外竞争性结合力的相关性

表3-6分子对接与预测值和体外竞争性结合力的相关性

表3-7分子对接与预测值和体外竞争性结合力的相关性

表3-8分子对接与预测值和体外竞争性结合力的相关性

表4.抗原多肽上与HLA形成pi stack作用的氨基酸残基

3.定点替换后的抗原多肽的亲和力与稳定性预测

表4提示根据体外竞争性结合状态区分，体外结合的抗原多肽区别于不结合的抗原多肽主要为：P3位氨基酸残基为H(His)；P5位氨基酸残基为Y(Tyr)；P7位氨基酸残基为Y(Tyr)；P9位氨基酸残基为W(Trp)。

表1提示CYSLYGTTL与CYSVYGTTL这两条多肽，体外实验证实能够竞争性结合、亲和力预测能够结合，并且稳定性预测能够稳定结合。因此我们将上述两条多肽的P1-P9位氨基酸残基分别定点替换为H、Y、W，分析替换后抗原多肽的亲和力预测值与稳定性预测值的变化。

替换后的多肽序列与亲和力预测值(％Rank)及稳定性预测值(Thalf)见表5。结果提示，定点替换后有17条替换后抗原多肽的％Rank值低于原抗原多肽(CYSLYGTTL与CYSVYGTTL)，提示单个残基替换后的抗原肽的亲和力强于原抗原肽；22条替换后抗原多肽的Thalf值高于原抗原多肽(CYSLYGTTL与CYSVYGTTL)，提示单个残基替换后的抗原肽的稳定性强于原抗原肽。

表5所示，P1位氨基酸残基由C(Cys)替换为Y、H、W后，亲和力提高，由C替换为Y、H后，稳定性增强。

P2位氨基酸残基由Y替换为H、W后，亲和力未提高，稳定性未增强。

P3位氨基酸残基由S(Ser)替换为Y后，亲和力提高，稳定性未增强。

P4位氨基酸残基由L(Leu)/V(Val)替换为Y、H、W后，亲和力提高，由L/V替换为Y、W后，稳定性增强。

P5位氨基酸残基由Y替换为W后，稳定性增强。

P6位氨基酸残基由G(Gly)替换为Y、W后，稳定性增强。

P7位氨基酸残基由T(Thr)替换为Y、H后，亲和力提高，由T替换为Y、H、W后，稳定性增强。

P8位氨基酸残基由T(Thr)替换为Y后，稳定性增强。

P9位氨基酸残基由L(Leu)替换为W后，亲和力提高、稳定性增强。

表6所示P1位氨基酸残基由极性不带电荷R基团氨基酸替换为芳香族R基团或者带正电荷R基团(碱性)的氨基酸后，亲和力和稳定性均提高。

P3位氨基酸残基由极性不带电荷R基团氨基酸替换为芳香族R基团氨基酸后，亲和力提高。

P4位氨基酸残基由非极性脂肪族R基团氨基酸替换为带正电荷R基团(碱性)或芳香族R基团的氨基酸，亲和力提高，替换为芳香族R基团氨基酸，稳定性增强。

P5位氨基酸残基由芳香族R基团氨基酸Y替换为芳香族R基团氨基酸W后，稳定性增强。

P6位氨基酸残基由非极性脂肪族R基团氨基酸替换为芳香族R基团氨基酸后，稳定性增强。

P7位氨基酸残基由极性不带电荷R基团氨基酸替换为芳香族R基团或者带正电荷R基团(碱性)的氨基酸后，亲和力和稳定性均提高。

P8位氨基酸残基由极性不带电荷R基团氨基酸替换为芳香族R基团氨基酸后，稳定性增强。

P9位氨基酸残基由非极性脂肪族R基团氨基酸替换为芳香族R基团氨基酸后，亲和力和稳定性均提高。

综上所述，HLA-A*2402抗原多肽的亲和力主要与P1、P3、P4、P7、P9位的氨基酸残基的氨基酸侧链特性相关，替换为芳香族R基团/带正电荷R基团(碱性)氨基酸后，亲和力提高。抗原多肽的稳定性主要与P1、P4、P5、P6、P7、P8、P9位的氨基酸残基的氨基酸侧链特性相关，替换为芳香族R基团(主要)/带正电荷R基团(碱性)氨基酸后，稳定性增强。

表5.替换后多肽序列与亲和力及稳定性预测值

表6.替换前后氨基酸残基的性质与亲和力及稳定性的关系

参考文献

[1]Pedersen LE,Harndahl M,Rasmussen M,Lamberth K,Golde WT,Lund O,Nielsen M,Buus S.(2011)Porcine major histocompatibility complex(MHC)class Imolecules and analysis of their peptide-binding specificities.Immunogenetics,63(12):821-834.

[2]Zou W.(2005)Immunosuppressive networks in the tumour environmentand their therapeutic relevance.Nat Rev Cancer,5(4):263-274.

[3]van der Burg SH,Arens R,Ossendorp F,van Hall T,Melief CJ.(2016)Vaccines for established cancer:overcoming the challenges posed by immuneevasion.Nat Rev Cancer,16(4):219-233.

[4]Lebedeva T,Anikeeva N,Kalams SA,Walker BD,Gaidarov I,Keen JH,Sykulev Y.(2004)Major histocompatibility complex class I-intercellularadhesion molecule-1association on the surface of target cells:implicationsfor antigen presentation to cytotoxic T lymphocytes.Immunology,113(4):460-471.

[5]Harndahl M,Rasmussen M,Roder G,Dalgaard Pedersen I,

M,Nielsen M,Buus S.(2012)Peptide-MHC class I stability is a better predictorthan peptide affinity of CTL immunogenicity.Eur J Immunol,42(6):1405-1416.

[6]Rasmussen M,Fenoy E,Harndahl M,Kristensen AB,Nielsen IK,Nielsen M,Buus S.(2016)Pan-Specific Prediction of Peptide-MHC Class I ComplexStability,a Correlate of T Cell Immunogenicity.J Immunol,197(4):1517-1524.

[7]Bordner AJ,Abagyan R.(2006)Ab initio prediction of peptide-MHCbinding geometry for diverse class I MHC allotypes.Proteins,63(3):512-526.

[8]Ayres CM,Corcelli SA,Baker BM.(2017)Peptide and Peptide-DependentMotions in MHC Proteins:Immunological Implications and BiophysicalUnderpinnings.Front Immunol,8:935.

[9]Antunes DA,Abella JR,Devaurs D,Rigo MM,Kavraki LE.(2018)Structure-based Methods for Binding Mode and Binding Affinity Prediction for Peptide-MHC Complexes.Curr Top Med Chem,18(26):2239-2255.

[10]Hafstrand I,Doorduijn EM,Sun R,Talyzina A,Sluijter M,PellegrinoS,Sandalova T,DuruAD,van Hall T,Achour A.(2018)The Immunogenicity of aProline-Substituted Altered Peptide Ligand toward the Cancer-Associated TEIPPNeoepitope Trh4 Is Unrelated to Complex Stability.J Immunol,200(8):2860-2868.

[11]Uchtenhagen H,Abualrous ET,Stahl E,Allerbring EB,Sluijter M,Zacharias M,Sandalova T,van Hall T,Springer S,Nygren

Achour A.(2013)Proline substitution independently enhances H-2Db complex stabilization andTCR recognition of melanoma-associated peptides.Eur J Immunol,43(11):3051-3060.

[12]van Stipdonk MJ,Badia-Martinez D,Sluijter M,Offringa R,van HallT,Achour A.(2009)Design of Agonistic Altered Peptides for the RobustInduction of CTL Directed towards H-2Db in Complex with the Melanoma-Associated Epitope gp100.Cancer Res,69(19):7784-7792.

[13]Denkberg G,Klechevsky E,Reiter Y.(2002)Modification of a Tumor-Derived Peptide at an HLA-A2 Anchor Residue Can Alter the Conformation of theMHC-Peptide Complex:Probing with TCR-Like Recombinant Antibodies.J Immunol,169(8):4399-407.

[14]Bonsack M,Hoppe S,Winter J,Tichy D,Zeller C,Küpper MD,SchitterEC,Blatnik R,Riemer AB.(2019)Performance Evaluation of MHC Class-I BindingPrediction Tools Based on an Experimentally Validated MHC-Peptide BindingData Set[J].Cancer Immunol Res,7(5):719-736.

[15]Jurtz V,Paul S,Andreatta M,Marcatili P,Peters B,Nielsen M.(2017)NetMHCpan-4.0:Improved Peptide-MHC Class I Interaction PredictionsIntegrating Eluted Ligand and Peptide Binding Affinity Data.J Immunol,199(9):3360-3368.

[16]

KW,Rasmussen M,Buus S,Nielsen M.(2014)NetMHCstab-predicting stability of peptide-MHC-I complexes；impacts for cytotoxic Tlymphocyte epitope discovery.Immunology,141(1):18-26.

[17]Cole,D.K.,Rizkallah,P.J.,Gao,F.,Watson,N.I.,Boulter,J.M.,Bell,J.I.,Sami,M.,Gao,G.F.,Jakobsen,B.K.(2006)Crystal structure of HLA-A*2402complexed with a telomerase peptide.Eur.J.Immunol,36:170-179.

[18]O.Trott,A.J.Olson.(2010)AutoDock Vina:improving the speed andaccuracy of docking with a new scoring function,efficient optimization andmultithreading.Journal of Computational Chemistry,31,455-461.

[19]London N,Raveh B,Cohen E,Fathi G,Schueler-Furman O.(2011)RosettaFlexPepDock web server-high resolution modeling of peptide-proteininteractions.Nucleic Acids Research,39,suppl_2:W249–W253.

[20]Wang E,Sun H,Wang J,et al.(2019)End-Point Binding Free EnergyCalculation with MM/PBSA and MM/GBSA:Strategies and Applications in DrugDesign.Chem Rev,119(16):9478-9508.

[21]

AB,

Z,Sari S,Utku S,Uysal M.(2019)A new series ofpyndazinone derivatives as chohnesterases inhibitors:Synthesis,in vitroactivity and molecular modeling studies.Pharmacol Rep,71(6):1253-1263.

Claims (5)

1.一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法，其特征在于，将HLA-A*2402限制性HLA-I类分子抗原多肽表位第1位的半胱氨酸残基、第4位的亮氨酸残基/缬氨酸残基、第7位的苏氨酸残基分别替换为组氨酸来增强该抗原多肽与HLA-A*2402亲和力和结合稳定性。

2.一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法，其特征在于，将HLA-A*2402限制性HLA-I类分子抗原多肽表位第1位的半胱氨酸残基、第3位的丝氨酸残基、第4位的亮氨酸残基/缬氨酸残基、第6位的甘氨酸残基、第7位的苏氨酸残基、第8位的苏氨酸残基分别替换为酪氨酸来增强该抗原多肽与HLA-A*2402亲和力和结合稳定性。

3.一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法，其特征在于，将HLA-A*2402限制性HLA I类分子抗原多肽(表位)第1位的半胱氨酸残基、第4位的亮氨酸残基/缬氨酸残基、第5位的酪氨酸残基、第6位的甘氨酸残基、第7位的苏氨酸残基、第9位的亮氨酸残基分别替换为色氨酸来增强该抗原多肽与HLA-A*2402亲和力和结合稳定性。

4.一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法，其特征在于，将HLA-A*2402限制性HLA I类分子抗原多肽表位第1位、第3位、第4位、第7位、第9位的氨基酸残基分别替换为芳香族R基团/带正电荷R基团碱性氨基酸，用以提高抗原与HLA的亲和力；

将第1位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位的氨基酸残基分别替换为芳香族R基团/带正电荷R基团碱性氨基酸残基，用以增强抗原与HLA的稳定性。

5.一种增强抗原多肽亲和力和稳定性的方法，其特征在于，在对接柔性多肽和HLA-A*2402分子后，根据分子间相互作用力π-π堆积的有或无、形成该非共价键的位于抗原多肽上的氨基酸残基的侧链性质来预测HLA-A*2402限制性抗原多肽的亲和力和结合稳定性。