CN102348796A - 新型癌抗原eEF2 - Google Patents
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Abstract
本发明提供使用在多种癌症中表达的蛋白来检测癌症的方法、以及用于治疗或预防以该蛋白为靶的癌症的药物组合物。本发明还提供包含来自该蛋白的癌抗原肽的药物组合物。详细而言，该方法包括测定在由对象得到的试样中eEF2多肽或eEF2抗体的存在或量的步骤。
Description
技术领域
本发明提供检测癌症的方法和癌症治疗/预防用药物组合物。本发明还提供包含与HLA分子具有结合能力的来自eEF2蛋白的连续的氨基酸的肽、包含这些肽的癌症治疗/预防用药物组合物，详细而言，提供HLA-A*2402限制性eEF2肽、HLA-A*0201限制性eEF2肽、或HLA-A*0206限制性eEF2肽、以及包含这些肽的癌症治疗/预防用药物组合物等。需要说明的是，本申请对日本国专利申请第2009-002608号主张优先权，并通过参照而将其全部内容纳入本申请。
背景技术
迄今为止已知有各种癌症标志物，但通过一种标志物可以诊断多种癌症的癌症标志物几乎不存在，人们正在积极探索所述的癌症标志物。另一方面，现在人们相继开发了以HER2为靶的曲妥珠单抗(trastuzumab)、以酪氨酸激酶中的一种为靶的伊马替尼(imatinib)、以EGFR为靶的吉非替尼(gefitinib)、以CD20抗原为靶的利妥昔单抗(rituximab)等癌分子靶向药物，但以作为翻译延伸因子而已知的真核翻译延伸因子(eukaryotic translation elongation factor 2，eEF2)为靶的癌症治疗/预防用药物组合物尚不存在(非专利文献1)。另外，人们还就各种癌症进行了抗原蛋白的检索，但被证明是癌抗原的抗原蛋白不多。
非专利文献1：Nygard O，Nilsson L.Kinetic determination of the effectsof ADP-ribosylation on the interaction of eukaryotic elongation factor 2with ribosomes.J Biol Chem.1990；265：6030-4
发明内容
发明所要解决的课题
因此，本发明的解决课题在于：提供以在多种癌症中表达的蛋白为指标来检测癌症的方法、以及用于治疗或预防通过该方法检测出的癌症的药物组合物。本发明的解决课题还在于：提供包含来自该蛋白的癌抗原肽的药物组合物。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题，进行了深入研究。于是，发现了在多种癌组织中高度表达的1种标志物蛋白eEF2，完成了以该标志物蛋白的表达和相对于该标志物蛋白在体内产生的抗体为指标的癌症的检测方法、以及以eEF2蛋白为靶的癌症的治疗/预防用药物组合物。本发明人等还发现：编码eEF2蛋白的连续的氨基酸序列的一部分发挥癌抗原肽的功能，显示可以将它们用作癌症的治疗/预防用药物组合物。
即，本发明提供下述(1)～(26)：
(1)检测对象的癌症的方法，该方法包括：测定在由该对象得到的试样中eEF2多肽、eEF2抗体或eEF2基因的转录物的存在或量的步骤。
(2)(1)所述的方法，其中，上述癌症选自肺腺癌、非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌、头颈部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大肠癌、胰管癌、神经胶质母细胞瘤(神経膠芽腫)和恶性淋巴瘤。
(3)双链siRNA，该双链siRNA抑制癌细胞的增殖，其中，有义链由SEQ ID NO：2所示的RNA序列构成，反义链由SEQ ID NO：3所示的RNA序列构成。
(4)(3)所述的双链siRNA，其中，上述癌细胞来自选自胃癌、肺癌、胰癌、神经胶质母细胞瘤和恶性淋巴瘤的癌。
(5)药物组合物，其用于治疗或预防癌症，该药物组合物包含(3)或(4)所述的双链siRNA作为有效成分。
(6)用于治疗或预防癌症的方法，其特征在于：给予对象有效量的权利要求5所述的药物组合物。
(7)(3)或(4)所述的双链siRNA在制造用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
(8)shRNA，该shRNA抑制癌细胞的增殖，并以由SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19所示的DNA序列转录的mRNA为靶。
(9)核酸，该核酸是(8)所述的shRNA所转录的核酸，其具有SEQID NO：20或SEQ ID NO：22所示的DNA序列。
(10)载体，该载体包含(9)所述的核酸。
(11)药物组合物，其用于治疗或预防癌症，该药物组合物含有(8)所述的shRNA、(9)所述的核酸或(10)所述的载体。
(12)用于治疗或预防癌症的方法，其特征在于：给予对象有效量的(11)所述的药物组合物。
(13)(8)所述的shRNA、(9)所述的核酸或(10)所述的载体在制造用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
(14)药物组合物，其用于治疗或预防HLA-A*2402阳性对象的癌症，该药物组合物包含eEF2肽，所述eEF2肽具有由来自eEF2蛋白的连续的氨基酸构成的氨基酸序列，上述氨基酸序列选自下述(a)～(e)：
(a)Arg Phe Tyr Ala Phe Gly Arg Val Phe(SEQ ID NO：4)；
(b)Ala Phe Gly Arg Val Phe Ser Gly Leu(SEQ ID NO：5)；
(c)Arg Phe Asp Val His Asp Val Thr Leu(SEQ ID NO：6)；
(d)Ala Tyr Leu Pro Val Asn Glu Ser Phe(SEQ ID NO：7)；以及
(e)在(a)～(d)所示的氨基酸序列中，取代、缺失或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列。
(15)(14)所述的药物组合物，其中，氨基酸序列为Ala Tyr Leu ProVal Asn Glu Ser Phe(SEQ ID NO：7)。
(16)药物组合物，其用于治疗或预防对象的癌症，该药物组合物包含编码(14)所述的肽的多核苷酸。
(17)(14)～(16)中任一项所述的药物组合物，其中，上述癌症选自肺腺癌、小细胞性肺癌、食道癌、胃癌、大肠癌、胰管癌、恶性神经胶质母细胞瘤、恶性淋巴瘤和头颈部扁平上皮癌。
(18)用于治疗或预防癌症的方法，其特征在于：对HLA-A*2402阳性对象给予有效量的(14)～(17)中任一项所述的药物组合物。
(19)(14)所述的肽在制造用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
(20)药物组合物，其用于治疗或预防HLA-A*0201阳性对象的癌症，该药物组合物包含eEF2肽，所述eEF2肽具有由来自eEF2蛋白的连续的氨基酸构成的氨基酸序列，上述氨基酸序列选自下述(a)～(h)：
(a)Arg Leu Met Glu Pro Ile Tyr Leu Val(SEQ ID NO：8)；
(b)Lys Leu Val Glu Gly Leu Lys Arg Leu(SEQ ID NO：9)；
(c)Tyr Leu Asn Glu Ile Lys Asp Ser Val(SEQ ID NO：10)；
(d)Ile Leu Thr Asp Ile Thr Lys Gly Val(SEQ ID NO：11)；
(e)Leu Met Met Tyr Ile Ser Lys Met Val(SEQ ID NO：12)；
(f)Lys Leu Pro Arg Thr Phe Cys Gln Leu(SEQ ID NO：13)；
(g)Leu Ile Leu Asp Pro Ile Phe Lys Val(SEQ ID NO：14)；以及
(h)在(a)～(g)所示的氨基酸序列中，取代、缺失或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列。
(21)(20)所述的药物组合物，其中，氨基酸序列为Arg Leu Met GluPro Ile Tyr Leu Val(SEQ ID NO：8)或Ile Leu Thr Asp Ile Thr Lys GlyVal(SEQ ID NO：11)。
(22)(20)所述的药物组合物，其中，氨基酸序列为在Leu Ile LeuAsp Pro Ile Phe Lys Val(SEQ ID NO：14)中将第2位氨基酸Ile取代成Leu或Met、和/或将第9位氨基酸Val取代成Leu而得到的氨基酸序列。
(23)药物组合物，其用于治疗或预防对象的癌症，该药物组合物包含编码(20)所述的肽的多核苷酸。
(24)(20)～(23)中任一项所述的药物组合物，其中，上述癌症选自肺腺癌、小细胞性肺癌、食道癌、胃癌、大肠癌、胰管癌、恶性神经胶质母细胞瘤、恶性淋巴瘤和头颈部扁平上皮癌。
(25)用于治疗或预防癌症的方法，其特征在于：给予对象有效量的(20)～(24)中任一项所述的药物组合物。
(26)(20)所述的肽在制造用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
发明效果
根据本发明，在患有癌症或有可能患有癌症的对象或预后的对象中，可以高灵敏度地检测多种癌症、例如肺腺癌、非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌、头颈部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大肠癌、胰管癌、神经胶质母细胞瘤、恶性淋巴瘤等。并且，可以抑制通过上述方法检测出的癌细胞的增殖。根据本发明，还可以得到HLA-A*2402限制性eEF2肽或HLA-A*0201限制性eEF2肽、以及包含这些肽的癌症的治疗/预防用药物组合物等，因此可以在具有HLA-A*2402或HLA-A*0201的对象中诱导体内和体外的eEF2特异性CTL。特别是约55％的日本人具有至少一种HLA-A*2402分子、而约19.9％的日本人具有至少一种HLA-A*0201分子，所以可以在非常广范围的对象中诱导eEF2特异性CTL。
附图说明
图1显示在来自肺癌患者的血清中检测出eEF2IgG抗体。
图2显示使用由患有非小细胞性肺癌(左图)和小细胞性肺癌(右图)的患者得到的肺的组织切片中的抗eEF2抗体的免疫染色的结果。
图3显示使用由患有头颈部扁平上皮癌(左图)和食道扁平上皮癌(右图)的患者得到的头颈部扁平上皮和食道扁平上皮的组织切片中的抗eEF2抗体的免疫染色的结果。
图4显示使用由患有胃癌(左图)和大肠癌(右图)的患者得到的胃和大肠的组织切片中的抗eEF2抗体进行的免疫染色的结果。
图5显示由各种癌症的患者和健康人得到的血清中的eEF2抗体的检测。
图6显示在非小细胞性肺癌患者中，血清中的eEF2抗体效价的值高的对象中预后良好。
图7显示以eEF2基因的mRNA为靶的双链siRNA抑制胃癌细胞株的增殖。
图8显示以eEF2基因的mRNA为靶的双链siRNA抑制各种癌细胞株的细胞增殖。
图9显示使用eEF2786-794肽诱导的CTL的细胞毒活性。
图10显示使用eEF2786-794肽诱导的CTL对内源性eEF2基因表达细胞的细胞毒活性。
图11显示通过FACS分析使用eEF2739-747肽诱导的干扰素γ的图。
图12显示通过FACS分析使用eEF2661-669肽诱导的干扰素γ的图。
图13是显示eEF2蛋白的强制表达促进细胞周期G2/M期的进展的图。
图14是显示eEF2蛋白的强制表达促进体内的肿瘤形成的图。
图15是显示eEF2蛋白的强制表达促进体内的肿瘤形成的图。
图16是显示使用eEF2739-747肽诱导的CTL的细胞毒活性的图。
图17是显示使用eEF2519-527肽诱导的CTL的细胞毒活性的图。
图18是显示使用eEF2671-679肽诱导的CTL的细胞毒活性的图。
图19是显示使用eEF2661-669肽诱导的CTL的细胞毒活性的图。
图20是显示使用eEF2394-402肽诱导的CTL的细胞毒活性的图。
图21是显示使用eEF2284-292肽诱导的CTL的细胞毒活性的图。
图22是显示使用eEF2292-300肽诱导的CTL的细胞毒活性的图。
图23是显示使用eEF2292-3002L肽诱导的CTL的细胞毒活性的图。
图24是显示使用eEF2292-3002M肽诱导的CTL的细胞毒活性的图。
图25是显示使用eEF2292-3002L9L肽诱导的CTL的细胞毒活性的图。
图26是显示用eEF2292-300肽或修饰型eEF2292-300肽(eEF2292-3002L、eEF2292-3002M和eEF2292-3002L9L肽)进行脉冲时的干扰素-γ活性测定的结果的图。
图27是显示eEF2的新型shRNA在体外抑制癌细胞增殖的图。细胞数以导入有表达eEF2的shRNA的载体的细胞数相对于导入有对照载体即shLuc的细胞数的比例(％)表示。
图28是显示用修饰型eEF2292-300肽(eEF2292-3002M9L肽)进行脉冲时的干扰素-γ活性测定的结果的图。
图29是显示7种eEF2肽(eEF2292-300肽、eEF2739-747肽、eEF2519-527肽、eEF2671-679肽、eEF2661-669肽、eEF2394-402肽和eEF2284-292肽)也是HLA-A*0206限制性肽的干扰素γ活性测定的结果。
图30是显示用3种eEF2肽(eEF2409-417肽、eEF2412-420肽和eEF2701-709肽)进行脉冲时的干扰素-γ活性测定的结果的图。
具体实施方式
在一个方案中，本发明提供检测癌症的方法。可以利用本发明的方法检测癌症的对象可以是任何动物、例如人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、牛、马、绵羊、山羊、猪、狗、猫、兔等，但最优选为人。在本发明中，即使对象动物健康也可以使用，优选为患有癌症或有可能患有癌症的状态。另外，即使对象是癌症治疗的预后也可以使用。并且，本发明的特征在于：可以较用作现有的癌症标志物的CEA更早地检测出癌症。例如，本发明的方法可以在早期阶段、特别是在I期阶段以高灵敏度检测出非小细胞性肺癌。这里，I期阶段是指在由恶性肿瘤的病期分类即国际癌症防治联合会规定的TNM分类中，表示分类为T1或T2、N0和M0的肿瘤的状态的时期。
本发明可以使用由上述对象得到的试样来实施。本发明中使用的试样可以是任何试样，例如可以使用含有细胞的组织。本发明中使用的试样优选为各种组织切片或血清。由对象获得试样可以在本领域技术人员中利用普通方法来进行。例如，使用组织切片作为本发明中使用的试样时，可以将通过手术或活体得到的组织在10％福尔马林中固定一夜，之后进行石蜡包埋以制成薄切切片。此外，使用血清作为本发明中使用的试样时，可以使对象的末梢血在装有分离剂的试管中凝固，之后通过离心来获取。
通过本发明的方法能够检测的癌症包括表达eEF2蛋白的所有癌症，优选为肺腺癌、非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌、头颈部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大肠癌、胰管癌、神经胶质母细胞瘤和恶性淋巴瘤。特别优选的癌症为肺腺癌、小细胞性肺癌、胃癌、大肠癌、恶性淋巴瘤。本发明中检测的癌症可以是处于任何分期的癌症。例如，可以检测由上述国际癌症防治联合会规定的TNM分类的I期、II期、III期中任一分期的癌症。另外，在本发明的方法中，特别可以在早期检测的癌症是非小细胞性肺癌。
在对象中实施本发明的检测方法时，可以测定上述试样中eEF2多肽的存在或量。本发明中的eEF2多肽是指具有eEF2蛋白的氨基酸序列或其部分序列的多肽，包括以下的突变型多肽。即，本发明中的eEF2多肽可以是具有SEQ ID NO：1所示的人eEF2蛋白的氨基酸序列的多肽，或者可以是具有下述氨基酸序列的多肽：在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列；或在SEQ ID NO：1的氨基酸中，缺失、取代、添加和/或插入1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列，例如缺失、取代或添加1～9个、优选1～5个、1～4个、1～3个、进一步优选1～2个、更优选1个氨基酸而得到的氨基酸序列，或缺失、取代、添加和/或插入1～9个、优选1～5个、1～4个、1～3个、进一步优选1～2个、更优选1个氨基酸而得到的氨基酸序列；与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有70％以上的同源性、优选80％以上的同源性、更优选90％以上的同源性、进一步优选93％、95％或99％以上的同源性的氨基酸序列；以及上述中的任一个氨基酸序列的片段的氨基酸序列。氨基酸序列的同源性可以利用FASTA、BLAST等普通的序列分析用工具来测定。本发明中的片段是指上述eEF2多肽的一部分。并且，在本发明中，eEF2多肽是指与eEF2蛋白具有同等性质的多肽，包括具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列由在严格条件下与编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码。本说明书中的同等的性质是指，作为eEF2蛋白，具有同等的生物学、化学和物理学特性。在本发明中，eEF2蛋白是来源于人的eEF2蛋白，但即使是来源于例如小鼠、猴、大鼠、牛、猫等其他动物的eEF2蛋白，这些动物种中的eEF2也可以包含在本说明书中的eEF2蛋白中。
本发明中，上述杂交条件可以根据J.Sambrook等人，“MolecularCloning：A Laboratory Manual，Second Edition”，1989，Cold SpringHarbor Laboratory Press的记载，由本领域技术人员适当选择。杂交条件可以是严格性差的条件，但优选为严格性强的条件。严格性差的条件是指，根据上述文献在杂交后的清洗中，例如42℃、0.1×SSC、0.1％SDS的条件，优选为50℃、0.1×SSC、0.1％SDS的条件。严格性强的条件例如包括65℃、5×SSC和0.1％SDS的条件等。但是，本领域技术人员通过适当选择这些要素，可以实现同样的条件。
本发明的检测方法可以通过任何方法来进行。例如，本发明的检测方法可以使用抗上述eEF2多肽的抗体来进行。在本发明的检测方法中，可以使用抗具有上述eEF2多肽的任何区的氨基酸序列的多肽的抗体，例如可以是抗具有人eEF2蛋白的氨基酸序列中的第1～417位或第411～858位的区的多肽的抗体。本发明中使用的抗体可以是IgG、IgA、IgM、IgD、IgE中的任一个同种型。本发明中使用的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本发明中使用的抗体可以利用普通方法来制作，可以是市售的抗体。
本发明的检测方法还可以使用抗eEF2抗体的抗体来进行。本发明中可以检测的eEF2抗体是在体内、即对象的体内制作的抗体。在本发明的检测方法中，上述抗eEF2抗体的抗体可以利用公知的方法来制作，或者可以是市售的抗体。优选为抗-eEF2抗体(H-118，SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)。
本发明中，为了测定试样中的eEF2多肽或eEF2抗体的存在或量，可以使用公知的手段、方法。只要是可以定性、定量地检测eEF2多肽或eEF2抗体的方法，可以是任何手段、方法，例如包括免疫染色法、点渍法、荧光抗体法、补体结合反应、中和抗体测定法、免疫沉淀法、蛋白质印迹法、放射免疫测定(RIA)法、ELISA法、双杂交系统等免疫学的蛋白检测方法。在本发明中，可以优选使用免疫染色法或点渍法。
在本发明的检测方法中，通过将由对象得到的试样中的eEF2多肽或eEF2抗体的存在或量与由健康对象或正常时期的对象得到的试样中的eEF2多肽或eEF2抗体的存在或量进行比较，可以确定为阳性。在本发明的检测方法中，使用血清作为试样时，可以以血清中的eEF2抗体的抗体效价(光密度单位(densitometric units))为指标。此时，利用点渍法测定对象的血清中的eEF2抗体的抗体效价，可以确定高于来自健康对象的血清的数值、优选1000以上、更优选2000以上的抗体效价(光密度单位)为阳性，但该数值可以依赖于癌症的种类或组织等各种因子而变动，本领域技术人员可以适当设定。另外，使用组织切片作为试样时，可以以组织切片中免疫染色法的染色程度为基准。此时，例如与对应的正常细胞相比显示出强染色的癌细胞为癌细胞总体的25％以上时，可以判断为阳性，但本领域技术人员可以适当判断。
当在对象中实施本发明的检测方法时，可以测定试样中eEF2基因的转录物的存在或量。本发明中的eEF2基因的转录物是指由编码上述eEF2多肽或其片段的氨基酸序列的核苷酸序列转录的产物，例如可以是mRNA或所有的其他类型的RNA、以及它们的片段等。另外，在本发明的检测方法中，可以测定具有编码eEF2多肽或其片段的氨基酸序列的核苷酸序列(例如DNA序列)的多核苷酸的存在或量。
在本发明中，为了测定试样中的上述转录物或多核苷酸的存在或量，作为多核苷酸的检测方法，在本领域技术人员中可以使用普通的手段、方法。例如包括原位杂交法、RNA印迹法、DNA印迹法、点渍法、RNA酶保护试验(RNase Protection Assay)法、PCR法、RT-PCR法、实时PCR等多核苷酸的检测方法。另外，还可以进行使用微阵列(例如DNA微阵列、microRNA微阵列、蛋白微阵列等)的基因分析方法，只要可以定性、定量地检测上述转录物或多核苷酸，可以是上述方法以外的方法。
并且，本发明的方法可用于诊断患有癌症的对象的预后。可以应用本发明的方法的癌症可以是如上所述的表达eEF2蛋白的任何癌症，但优选为肺腺癌、非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌、头颈部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大肠癌、胰管癌、神经胶质母细胞瘤、恶性淋巴瘤。更优选为非小细胞性癌。在本发明的预后的诊断中，由对象得到的试样中的eEF2抗体的抗体效价越高，则可以判断预后越良好。eEF2抗体的抗体效价(光密度单位)例如为1000以上、优选2000以上、更优选为4000以上的值，本领域技术人员可以考虑各种因素后适当确定。
在另一方案中，本发明涉及用于检测癌症的诊断试剂盒，该试剂盒包含抗上述eEF2多肽或eEF2抗体的抗体、或与上述eEF2基因的转录物或其一部分互补的多核苷酸探针作为必须构成成分。在本发明中，上述抗体或探针优选被标记。上述标记可以按照普通方法进行。本发明的试剂盒除包含抗上述eEF多肽或eEF2抗体的抗体、或与上述eEF2基因的转录物或其一部分互补的多核苷酸探针以外，还包含例如蛋白或多核苷酸的检测方法所必须的试剂、试样的获取手段、反应容器等。通常，试剂盒中附带操作说明书。使用本发明的试剂盒，可以在血清或组织中高效率地检测表达eEF2蛋白的癌症。
在又一方案中，本发明涉及抑制癌细胞增殖的双链siRNA。本发明中，可以抑制增殖的癌细胞可以是表达eEF2蛋白的任一种癌，优选为肺腺癌、非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌、头颈部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大肠癌、胰管癌、神经胶质母细胞瘤和恶性淋巴瘤。特别优选的癌是肺腺癌、小细胞性肺癌、胃癌、大肠癌、恶性淋巴瘤。
本发明的siRNA是包含以由人eEF2基因转录的mRNA的核苷酸序列为靶的有义链和反义链的双链siRNA。本发明的siRNA所靶向的核苷酸序列可以是编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列的部分序列。本发明的siRNA优选为由具有以下所示的RNA序列的有义链(SEQ ID NO：2)和反义链(SEQ ID NO：3)构成的双链siRNA。本发明的siRNA的有义链(SEQ ID NO：2)；
5’-CAUGGGCAACAUCAUGAUCGAUCCUGUCCU-3’
本发明的siRNA的反义链(SEQ ID NO：3)；
5’-AGGACAGGAUCGAUCAUGAUGUUGCCCAUG-3’
本发明的siRNA的优选的RNA序列为上述SEQ ID NO：2和SEQID NO：3所示的序列，但在这些序列中可以添加、缺失、取代1个、2个或3个碱基。或者，在这些序列中可以取代、缺失、添加和/或插入1～3个、优选1个或2个、更优选1个碱基。就此时的杂交条件而言，当向生物体内给予本发明的siRNA而加以使用时，杂交条件为生物体内的条件；当将本发明的siRNA作为试剂在体外使用时，杂交条件为中度的严格条件或严格性强的条件，作为这样的条件，例如有400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、50℃～70℃下、12～16小时的杂交条件。另外，本发明的siRNA的有义链序列与靶序列具有90％以上、优选95％以上、进一步优选95、96、97、98或99％以上的序列同源性。
并且，本发明的siRNA可以在5’末端或3’末端添加突出端序列。这里，突出端序列是指，为了提高双链siRNA的稳定性而添加在有义链和反义链配对的双链序列的5’末端或3’末端的任一端的突出的序列，例如从5’侧起是AG、UA、AUG、UUG和AAGCUU等序列，但可以是任何序列。本发明的双链siRNA优选在有义链和反义链的3’末端添加UU。另外，上述的本发明的双链siRNA可以通过环状序列(loop sequence)连接双链siRNA以形成shRNA。
本发明的双链siRNA在本领域技术人员中可以通过普通方法来制备。例如，可以在体外进行化学或酶合成、或者可以在体内合成，但并不限于这些方法。优选为化学合成法。利用上述合成方法合成各链后，可以在一般的配对条件下使之配对。使用时，根据需要可以适当纯化。另外，本发明的双链siRNA可以以表达上述siRNA的RNA序列(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)的siRNA表达载体的形式制备。此时，例如可以使用tRNA-shRNA表达载体、piGENE tRNA Pur(Clontech，Palo Alto，CA)来制作。对本发明中使用的siRNA的长度没有特别限定，但作为本发明的优选的siRNA的例子，有15～50mer的siRNA；作为进一步优选的例子，有20～40mer的siRNA；作为更优选的例子，有25～35mer(例如30mer)的siRNA。因此，本发明的优选的siRNA的例子有：可以和eEF2 mRNA的5’-CAUGGGCAACAUCAUGAUCGAUCCUGUCCU-3’序列杂交的双链siRNA，其中，各siRNA的长度为15～50mer、优选20～40mer、进一步优选25～35mer(例如30mer)的双链siRNA。
通常，已知在导入有siRNA的细胞内，通过靶基因与mRNA的结合来抑制siRNA的表达。因此，本发明的双链siRNA具有抑制eEF2基因的表达的功能，由此可以抑制导入有双链siRNA的对象中的细胞的增殖。本发明中的siRNA的导入或给药方法可以是：使用转染试剂的磷酸钙法、脂质体法、非脂质体法、电穿孔、磁颗粒等本领域技术人员中公知的方法、或将siRNA插入普通siRNA表达载体中后利用上述公知的方法将其导入的方法。优选利用公知方法导入表达上述siRNA的RNA序列(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)的siRNA表达载体。另外，如下所述，本发明的siRNA可以以药物组合物的形式进行给药。
在本发明中，提供以上述双链siRNA作为有效成分的用于治疗或预防癌症的药物组合物。在本发明的药物组合物中，作为有效成分，除上述双链siRNA以外，还可以含有公知的抗癌药。
在本发明的药物组合物中，作为有效成分的siRNA可以以被插入到载体中的形式含有。例如，可以以克隆到由制造商市售的siRNA表达载体等公知的siRNA表达载体或根据使用方式适当重组的公知的siRNA表达载体中的形态含有。因此，本发明提供编码本发明的siRNA的核酸、以及包含该核酸的载体。
本发明的药物组合物可以含有药学上可接受的载体。本发明中可以使用的药学上可接受的载体可以是选自生理盐水、蒸馏水、林格液(Ringer’s液)、缓冲生理盐水、葡萄糖溶液、麦芽葡萄糖溶液、甘油、乙醇和脂质体中的一种或多种成分，但并不限于这些。还可以在本发明的药物组合物中添加抗氧剂、缓冲水溶液、抑菌剂等其他普通的添加剂。另外，为了制造注射用溶液、丸药、胶囊、颗粒或片剂，可以进一步添加稀释剂、喷雾剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂。
本发明的药物组合物的给药方式可以是口服给药或胃肠外给药(例如静脉内给药、皮内给药、皮下给药、肌肉内给药、经鼻给药或口服给药)，只要能够将有效成分有效送达患处或其附近，也可以是上述给药方式以外的给药方式。可以根据对象的状态、例如对象的重量、年龄、性别和健康状态等、以及饭量、给药频率、给药方法、排泄量和疾病的严重程度等确定以本发明的药物组合物的形式给药的本发明的siRNA的有效量。以本发明的药物组合物的形式给药的本发明的siRNA的有效量通常为每天0.01～100mg/kg，优选为每天0.1～10mg/kg。
在又一方案中，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，其特征在于：给予对象有效量的上述药物组合物。所治疗或预防的癌症只要是表达eEF2蛋白的癌症即可，可以是任一种癌症，例如包括肺腺癌、非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌、头颈部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大肠癌、胰管癌、神经胶质母细胞瘤和恶性淋巴瘤。另外，本发明优选对通过上述癌症的检测方法确定为阳性的对象进行给药。
在又一方案中，本发明涉及上述双链siRNA在制造用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
需要说明的是，在又一方案中，本发明涉及抑制癌细胞增殖的shRNA或siRNA。shRNA(short hairpin RNA or small hairpin RNA，短发夹RNA或小发夹RNA)通常是指有义链和反义链通过环状序列连结而成的RNA，有时在细胞内环状结构被切断而形成双链siRNA。本发明的siRNA优选为双链siRNA。对本发明的shRNA或siRNA所靶向的eEF2的区没有特别限定，优选的例子有：以由下述DNA序列：5’-gcc tggccgagga catcgataaa ggcgagg-3’(SEQ ID NO：18)或5’-actcaac cataacactt gatgccgttt ctt-3’(SEQ ID NO：19)转录的mRNA为靶的shRNA或siRNA。本发明的shRNA可以是由包含DNA序列的载体转录的shRNA，所述DNA序列由上述DNA序列的有义序列-环状序列-反义序列构成。若由包含所述DNA序列的载体转录到RNA中，则来自有义序列和反义序列的RNA结合，形成短的发夹(短发夹)RNA，变得稳定。需要说明的是，本发明中使用的环状序列可以是任何序列，本领域技术人员可以适当选择。本发明的优选的siRNA的例子有：能够与由5’-gcc tggccgagga catcgataaa ggcgagg-3’(SEQ ID NO：18)或5’-actcaac cataacactt gatgccgttt ctt-3’(SEQ ID NO：19)转录的mRNA杂交的siRNA。本发明的更具体的siRNA的例子有：与由5’-gcc tggccgagga catcgataaa ggcgagg-3’(SEQ ID NO：18)或5’-actcaac cataacactt gatgccgttt ctt-3’(SEQ ID NO：19)转录的mRNA具有互补序列的siRNA。或者，本发明的siRNA可以是由与SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19所示的DNA序列对应的RNA的有义链和反义链构成的双链siRNA。此外，本发明的优选的shRNA的例子有：包含能够与由5’-gcc tggccgagga catcgataaa ggcgagg-3’(SEQ ID NO：18)转录的mRNA杂交的RNA和能够与该RNA杂交的RNA的shRNA。并且，本发明的优选的shRNA的例子有：包含能够与由5’-actcaaccataacactt gatgccgttt ctt-3’(SEQ ID NO：19)转录的mRNA杂交的RNA和能够与该RNA杂交的RNA的shRNA。本发明的shRNA的更具体的例子有：由具有下述DNA序列：
5’-gcc tggccgagga catcgatgaa agcgtgg cttcctgtca cctcgcc tttatcgatgtcctcggcca ggc-3’(SEQ ID NO：20)；
5’-actcaac cataacactt gataccattt gtt cttcctgtca aag aaacggcatc aagtgttatggttgagt-3’(SEQ ID NO：22)；
3’-cgg accggctcct gtagctactt tcgcacc gaaggacagt ggagcgg aaatagctacaggagccggt ccg-5’(SEQ ID NO：21)；或
3’-tgagttg gtattgtgaa ctatggtaaa caa gaaggacagt ttc tttgccgtag ttcacaataccaactca-5’(SEQ ID NO：23)
的核酸转录的shRNA。本发明可以在上述DNA序列或RNA序列中添加、缺失、取代1个、2个或3个碱基，或者可以是与上述DNA序列或RNA序列具有90％以上、优选95％以上、进一步优选95、96、97、98或99％以上的序列同源性的shRNA。需要说明的是，同源性、杂交条件、siRNA的长度如上所述。另外，本发明可以在上述DNA序列或RNA序列中添加、缺失、取代和/或插入1个、2个或3个碱基。
本发明的shRNA或siRNA可以在本领域技术人员中利用普通方法进行制备。例如，可以在体外进行化学或酶合成、或者可以在体内合成，并不限于这些方法。另外，本发明的shRNA或siRNA可以以包含上述SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：22所示的DNA序列的shRNA表达载体或siRNA表达载体的形式制备。此时，例如可以使用tRNA-shRNA表达载体、piGENE tRNA Pur(Clontech，Palo Alto，CA)来制作。
本发明的shRNA或siRNA的导入或给药方法可以是：使用转染试剂的磷酸钙法、脂质体法、非脂质体法、电穿孔、磁颗粒等本领域技术人员中公知的方法、或插入普通siRNA表达载体中后利用上述公知的方法将其导入的方法。如下所述，本发明的shRNA或siRNA可以以药物组合物的形式给药。
在本发明中，提供以上述shRNA或siRNA作为有效成分的、用于治疗或预防癌症的药物组合物。本发明的药物组合物可以同时含有公知的抗癌药。
本发明的药物组合物可以含有编码本发明的shRNA或siRNA的核酸(例如包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：22所示的DNA序列的核酸)作为有效成分。例如，包含所述的DNA序列的核酸可以是被插入到市售的shRNA表达载体或siRNA表达载体中核酸。因此，本发明提供编码本发明的shRNA或siRNA的核酸、以及包含该核酸的载体。
本发明的药物组合物可以含有药学上可接受的普通载体和添加剂。本发明的药物组合物的给药方式可以是口服给药或胃肠外给药(例如静脉内给药、皮内给药、皮下给药、肌肉内给药、经鼻给药或口服给药)。以本发明的药物组合物的形式给药的本发明的shRNA或siRNA的有效量可以根据对象的状态、例如对象的重量、年龄、性别和健康状态等、以及饭量、给药频率、给药方法、排泄量和疾病的严重程度等来确定。
在又一方案中，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，其特征在于：给予对象有效量的上述药物组合物。所治疗或预防的癌症只要是表达eEF2蛋白的癌症即可，可以是任一种癌症，例如包括肺腺癌、非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌、头颈部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大肠癌、胰管癌、神经胶质母细胞瘤和恶性淋巴瘤。
在又一方案中，本发明涉及上述shRNA或siRNA在制造用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
在又一方案中，本发明涉及包含来自eEF2蛋白的连续的氨基酸的肽。本发明的肽的例子有：包含后述的氨基酸序列的肽或由后述的氨基酸序列构成的肽。优选这些肽与HLA分子具有结合能力。优选这些肽诱导细胞毒活性。优选这些肽为HLA-A*2402限制性eEF2肽、HLA-A*0201限制性eEF2肽或HLA-A*0206限制性eEF2肽。优选这些肽为9～30个氨基酸的长度。本发明还提供：包含这些肽的、用于治疗或预防癌症的药物组合物；这些肽在制备用于治疗或预防癌症的药物中的应用；以及癌症的治疗或预防方法等，该方法的特征在于将这些肽给予对象。
因此，在一个方案中，本发明提供HLA-A*2402限制性eEF2肽。本发明还提供用于治疗或预防HLA-A*2402阳性对象的癌症的HLA-A*2402限制性eEF2肽、以及包含这些肽的药物组合物。作为本发明中使用的HLA-A*2402限制性eEF2肽，可以例示具有由来自eEF2蛋白的连续的氨基酸构成的氨基酸序列的肽或含有由来自eEF2蛋白的连续的氨基酸构成的氨基酸序列的肽，上述氨基酸序列选自：ArgPhe Tyr Ala Phe Gly Arg Val Phe(SEQ ID NO：4)；Ala Phe Gly Arg ValPhe Ser Gly Leu(SEQ ID NO：5)；Arg Phe Asp Val His Asp Val Thr Leu(SEQ ID NO：6)；Ala Tyr Leu Pro Val Asn Glu Ser Phe(SEQ ID NO：7)；以及在上述中的1个氨基酸序列中，取代、缺失或添加多个、例如1～9个、优选1～5个、1～4个、1～3个、进一步优选1～2个、更优选1个氨基酸而得到的氨基酸序列，但并不限于这些肽。还可以包含：上述氨基酸序列选自在上述中的1个氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入多个、例如1～9个、优选1～5个、1～4个、1～3个、进一步优选1～2个、更优选1个氨基酸而得到的氨基酸序列的肽。取代上述肽的氨基酸时，优选的取代位点有：2位和/或9位的氨基酸。上述肽的2位的氨基酸的优选例子有：Phe或Tyr。上述肽的9位的氨基酸的优选例子有：Ile、Leu或Phe。这样的修饰型肽的具体例子有：表12或表13所记载的肽。本发明中优选的eEF2肽为Ala Tyr Leu Pro Val AsnGlu Ser Phe(SEQ ID NO：7)。但即使是上述的任一种肽，也是以保持与HLA-A*2402分子的结合能力为条件。在本说明书中，将保持与HLA-A*2402的结合能力的肽称作HLA-A*2402限制性eEF2肽。需要说明的是，本发明的上述肽可用于HLA-A*2402阳性对象以外的对象。因此，本发明提供包含上述任一个氨基酸序列的肽、以及包含该肽的药物组合物。
在又一方案中，本发明提供HLA-A*0201限制性eEF2肽。本发明还提供用于治疗或预防HLA-A*0201阳性对象的癌症的、包含HLA-A*0201限制性eEF2肽的药物组合物。本发明中使用的HLA-A*0201限制性eEF2肽是具有由来自eEF2蛋白的连续的氨基酸构成的氨基酸序列的肽或含有由来自eEF2蛋白的连续的氨基酸构成的氨基酸序列的肽。下述表1～7中例示本发明中使用的HLA-A*0201限制性eEF2肽的候选。其中，作为本发明中优选的肽，例示上述氨基酸序列选自下述序列的肽：Arg Leu Met Glu Pro Ile Tyr Leu Val(SEQ ID NO：8)；Lys Leu Val Glu Gly Leu Lys Arg Leu(SEQ ID NO：9)；Tyr Leu Asn Glu Ile Lys Asp Ser Val(SEQ ID NO：10)；Ile Leu ThrAsp Ile Thr Lys Gly Val(SEQ ID NO：11)；Leu Met Met Tyr Ile Ser LysMet Val(SEQ ID NO：12)；Lys Leu Pro Arg Thr Phe Cys Gln Leu(SEQID NO：13)；Leu Ile Leu Asp Pro Ile Phe Lys Val(SEQ ID NO：14)；以及上述中的1个氨基酸序列中，取代、缺失或添加多个、例如1～9个、优选1～5个、1～4个、1～3个、进一步优选1～2个、更优选1个氨基酸而得到的氨基酸序列，但并不限于这些肽。还可以包含：上述氨基酸序列选自在上述中的1个氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入多个、例如1～9个、优选1～5个、1～4个、1～3个、进一步优选1～2个、更优选1个氨基酸而得到的氨基酸序列的肽。其中，特别优选的HLA-A*0201限制性eEF2肽为Arg Leu Met Glu Pro Ile Tyr Leu Val(SEQ ID NO：8)或Ile Leu Thr Asp Ile Thr Lys Gly Val(SEQ ID NO：11)。本发明的HLA-A*0201限制性eEF2肽特别可以是将第2位的氨基酸和/或第9位的氨基酸取代成其他氨基酸的肽。上述肽的2位的氨基酸的优选例子有Leu或Met。上述肽的9位的氨基酸的优选例子有Leu或Val。这样的修饰型肽的例子有表15～21中记载的肽，优选列举在Leu Ile Leu Asp Pro Ile Phe Lys Val(SEQ ID NO：14)中将第2位的氨基酸Ile取代成Leu或Met、和/或将第9位的氨基酸Val取代成Leu的肽。特别优选的例子有：Leu Leu Leu Asp Pro Ile Phe Lys Val(SEQ IDNO：15)、Leu Met Leu Asp Pro Ile Phe Lys Val(SEQ ID NO：16)或LeuLeu Leu Asp Pro Ile Phe Lys Leu(SEQ ID NO：17)、Leu Met Leu AspPro Ile Phe Lys Leu(SEQ ID NO：24)。但即使是上述的任一种肽，也是以保持与HLA-A*0201分子的结合能力为条件。在本说明书中，将保持与HLA-A*0201的结合能力的肽称作HLA-A*0201限制性eEF2肽。另外，本发明的HLA-A*0201限制性eEF2肽可以具有使干扰素γ活性升高的作用。需要说明的是，本发明的上述肽可用于HLA-A*0201阳性对象以外的对象。因此，本发明提供包含上述任一个氨基酸序列的肽、以及包含该肽的药物组合物。
在又一方案中，本发明提供HLA-A*0206限制性eEF2肽。本发明还提供用于治疗或预防HLA-A*0206阳性对象的癌症的、包含HLA-A*0206限制性eEF2肽的药物组合物。本发明中使用的HLA-A*0206限制性eEF2肽是具有由来自eEF2蛋白的连续的氨基酸构成的氨基酸序列的肽或含有由来自eEF2蛋白的连续的氨基酸构成的氨基酸序列的肽。在本发明所使用的HLA-A*0206限制性eEF2肽中，作为优选的肽，可以例示上述氨基酸序列为Arg Leu Met Glu ProIle Tyr Leu Val(SEQ ID NO：8)；Lys Leu Val Glu Gly Leu Lys Arg Leu(SEQ ID NO：9)；Tyr Leu Ash Glu Ile Lys Asp Ser Val(SEQ ID NO：10)；Ile Leu Thr Asp Ile Thr Lys Gly Val(SEQ ID NO：11)；Leu Met Met TyrIle Ser Lys Met Val(SEQ ID NO：12)；Lys Leu Pro Arg Thr Phe Cys GlnLeu(SEQ ID NO：13)；Leu Ile Leu Asp Pro Ile Phe Lys Val(SEQ ID NO：14)的肽；以及上述氨基酸序列选自在上述中的1个氨基酸序列中取代、缺失和/或添加多个、例如1～9个、优选1～5个、1～4个、1～3个、进一步优选1～2个、更优选1个氨基酸而得到的氨基酸序列的肽，但并不限于这些肽。还可以包含上述氨基酸序列选自在上述中的1个氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入多个、例如1～9个、优选1～5个、1～4个、1～3个、进一步优选1～2个、更优选1个氨基酸而得到的氨基酸序列的肽。但即使是上述的任一种肽，也是以保持与HLA-A*0206分子的结合能力为条件。在本说明书中，将保持与HLA-A*0206的结合能力的肽称作HLA-A*0206限制性eEF2肽。另外，本发明的HLA-A*0206限制性eEF2肽可以具有使干扰素γ活性升高的作用。需要说明的是，本发明的上述肽可用于HLA-A*0206阳性对象以外的对象。因此，本发明提供包含上述任一种氨基酸序列的肽、以及包含该肽的药物组合物。
[表1]
[表2]
[表3]
[表4]
[表5]
[表6]
[表7]
本发明中使用的肽来自eEF2蛋白，可以包含上述连续的氨基酸序列或其修饰序列，可以是包含这些序列的肽。当为包含上述氨基酸序列的肽时，对其肽的长度没有特别限定，可以是任何长度的肽。包含上述连续的氨基酸序列的肽的优选例子有9～30个氨基酸的肽；更优选的例子有9～15个氨基酸的肽；进一步优选的例子有9～12个氨基酸的肽。因此，本发明中使用的肽例如可以是包含上述氨基酸序列的肽本身，或者可以是包含上述氨基酸序列的eEF2蛋白或其一部分。本发明中使用的肽还可以在包含上述氨基酸序列的肽的N末端和/或C末端结合各种物质。例如，可以结合氨基酸、肽、它们的类似物等。
本发明中使用的肽中结合有这些物质时，这些物质例如通过生物体内酶等、或细胞内加工等的过程进行处理，最终生成由上述氨基酸序列构成的肽，以与HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子形成的复合体的形式提呈在细胞表面，从而可以得到细胞毒性T细胞(CTL)诱导效果。这些物质可以是调节本发明中使用的肽的溶解性的物质，还可以是提高其稳定性(耐蛋白酶作用等)的物质，例如可以是特异性地将本发明中使用的肽释放(deliver)到规定的组织、器官中的物质，或者可以是具有增强抗原提呈细胞的摄入效率的作用等的物质。这些物质还可以是增大CTL诱导能力的物质、例如辅助肽(helper peptide)等。
本发明中使用的肽可以利用该技术领域中通常使用的方法或这些方法的变法来合成。所述的合成方法例如记载在Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；The Proteins，第2卷，Academic Press Inc.，New York，1976；ペプチド合成、丸善(株)，1975；ペプチド合成の基礎と実験(肽合成的基础和实验)、丸善(株)，1985；医薬品の開発続第14卷，ペプチド合成、広川書店，1991等中。
本发明中使用的肽还可以根据编码本发明中使用的肽的核苷酸序列信息，利用基因工程学的方法来制备。所述的基因工程学方法为本领域技术人员所周知的基因工程学方法。
本发明涉及用于治疗或预防癌症的药物组合物，该药物组合物中包含上述eEF2肽。由于eEF2基因在例如肺腺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、大肠癌、胰管癌、恶性神经胶质母细胞瘤、恶性淋巴瘤、头颈部扁平上皮癌等中高度表达，所以可以将本发明的药物组合物用于治疗或预防表达eEF2基因的癌症。若将本发明的药物组合物给予HLA-A*2402或HLA-A*0201阳性对象，则利用该药物组合物中所含的HLA-A*2402限制性eEF2肽或HLA-A*0201限制性eEF2肽诱导eEF2特异性CTL，通过所述的CTL杀伤对象中的癌细胞。
本发明的药物组合物除了含有作为有效成分的上述eEF2肽以外，还可以包含例如载体、赋形剂等。由于本发明的药物组合物中所含的HLA-A*2402限制性eEF2肽或HLA-A*0201限制性eEF2肽诱导eEF2特异性CTL，所以使其诱导效率增强，因此本发明的药物组合物包含适当的佐剂，或者可以和适当的佐剂一同给药。优选的佐剂例如有完全或不完全弗氏佐剂、氢氧化铝等，但并不限于这些。另外，本发明的药物组合物可以同时包含上述eEF2肽以外的公知的肽、例如WT1肽等作为有效成分。
本发明的药物组合物的给药方法可以根据疾病的种类、对象的状态、靶部位等条件适当选择。该方法例如有皮内给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药、经鼻给药、口服给药等，但并不限于这些。并且，上述方法可以是淋巴细胞疗法或DC(树状细胞)疗法。本发明的药物组合物中所含的肽的量、药物组合物的剂型、给药次数等可以根据疾病的种类、对象的状态、靶部位等条件适当选择，每次的肽给药量通常为0.0001mg～1000mg，优选为0.001mg～10000mg。
在又一方案中，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，其特征在于：给予HLA-A*2402阳性对象或HLA-A*0201阳性对象有效量的上述药物组合物。所治疗或预防的癌症可以是任一种癌症，例如包含肺腺癌、非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌、头颈部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大肠癌、胰管癌、神经胶质母细胞瘤和恶性淋巴瘤。
需要说明的是，在又一方案中，本发明涉及eEF2肽在制备上述药物组合物中的应用。
在又一方案中，本发明涉及编码上述eEF2肽的多核苷酸(以下还称作eEF2多核苷酸)。本发明的多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。本发明的多核苷酸的核苷酸序列可以根据上述eEF2肽的氨基酸序列来确定。上述多核苷酸例如可以利用DNA或RNA合成方法、PCR法等来制备。
在又一方案中，本发明涉及包含上述多核苷酸的表达载体(以下还记作eEF2表达载体)。表达载体的种类、上述多核苷酸序列以外所含的序列等可以根据导入该表达载体的宿主的种类、目的等适当选择。将本发明的表达载体给予对象，在生物体内产生eEF2肽，诱导eEF2特异性CTL，由此杀伤对象中的造血器官肿瘤细胞、实体癌细胞等，从而可以治疗或预防该造血器官肿瘤、实体癌。
在又一方案中，本发明涉及用于治疗或预防癌症的药物组合物，该药物组合物包含上述eEF2多核苷酸或上述eEF2表达载体。本发明的该方案的药物组合物的组成、给药方法等如上所述。
在又一方案中，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，其特征在于：给予对象有效量的包含上述eEF2多核苷酸或eEF2表达载体的药物组合物。所治疗或预防的癌症例如包括肺腺癌、非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌、头颈部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大肠癌、胰管癌、神经胶质母细胞瘤、恶性淋巴瘤等癌症。
需要说明的是，在又一方案中，本发明涉及eEF2多核苷酸或eEF2表达载体在制备包含上述eEF2多核苷酸或eEF2表达载体的药物组合物中的应用。
在又一方案中，本发明涉及含有上述eEF2表达载体的细胞。本发明的细胞例如可以通过使用上述表达载体转化大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等宿主细胞来制备。向宿主细胞中导入表达载体的方法可以适当选择使用各种方法。培养已转化的细胞，回收、纯化所产生的eEF2肽，从而可以制备本发明的肽。
在又一方案中，本发明涉及通过上述eEF2肽诱导的eEF2特异性CTL。本发明的CTL识别eEF2肽与HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子的复合体。因此，使用本发明的CTL可以特异性地杀伤HLA-A*2402阳性或HLA-A*0201阳性、且eEF2高度表达的肿瘤细胞。
在又一方案中，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，其特征在于：给予HLA-A*2402阳性或HLA-A*0201阳性对象eEF2特异性CTL。eEF2特异性CTL的给药方法可以根据疾病的种类、对象的状态、靶部位等条件适当选择。该方法例如有静脉内给药、皮内给药、皮下给药、肌肉内给药、经鼻给药、口服给药等，但并不限于这些。
在又一方案中，本发明涉及eEF2特异性CTL的诱导方法，其特征在于：在上述HLA-A*2402限制性eEF2肽或HLA-A*0201限制性eEF2肽的存在下培养末梢血单核细胞，由该末梢血单核细胞诱导eEF2特异性CTL。末梢血单核细胞所来自的对象只要具有HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子即可，可以是任一个对象。通过在HLA-A*2402限制性eEF2肽或HLA-A*0201限制性eEF2肽的存在下培养末梢血单核细胞，由末梢血单核细胞中的CTL前体细胞诱导eEF2特异性CTL。通过给予HLA-A*2402阳性对象或HLA-A*0201阳性对象利用本发明得到的eEF2特异性CTL，可以治疗或预防对象的造血器官肿瘤、实体癌。这里，本说明书中的末梢血单核细胞包含作为抗原提呈细胞的前体的未成熟抗原提呈细胞(例如树状细胞、B-淋巴细胞、巨噬细胞等前体)，由于未成熟抗原提呈细胞包含在例如末梢血单核细胞等中，所以可以在上述eEF2肽的存在下培养所述的细胞。
在又一方案中，本发明涉及用于诱导eEF2特异性CTL的试剂盒，该试剂盒中包含HLA-A*2402限制性eEF2肽或HLA-A*0201限制性eEF2肽作为必须构成成分。优选在上述eEF2特异性CTL的诱导方法中使用该试剂盒。本发明的试剂盒除了包含上述HLA-A*2402限制性eEF2肽或HLA-A*0201限制性eEF2肽以外，例如还可以包含末梢血单核细胞的获取手段、佐剂、反应容器等。通常，试剂盒中附带操作说明书。使用本发明的试剂盒，可以高效率地诱导eEF2特异性CTL。
在又一方案中，本发明涉及经由HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子提呈上述eEF2肽的抗原提呈细胞(例如树状细胞、B-淋巴细胞、巨噬细胞等)。本发明的抗原提呈细胞通过上述HLA-A*2402限制性eEF2肽或HLA-A*0201限制性eEF2肽来诱导。通过使用本发明的抗原提呈细胞，高效率地诱导上述eEF2特异性CTL。
在又一方案中，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，其特征在于：给予HLA-A*2402阳性对象或HLA-A*0201阳性对象经由HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子提呈上述eEF2肽的抗原提呈细胞。抗原提呈细胞的给药方法可以根据疾病的种类、对象的状态、靶部位等条件适当选择。该方法例如有静脉内给药、皮内给药、皮下给药、肌肉内给药、经鼻给药、口服给药等，但并不限于这些。
在又一方案中，本发明涉及用于预防或治疗癌症的方法，其特征在于：诱导经由HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子提呈eEF2肽的抗原提呈细胞，该方法包括下述步骤：
(a)使具有编码eEF2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列或其部分序列的核酸或上述eEF2肽与试样反应；
(b)得到该试样中所含的、经由HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子提呈eEF2肽的抗原提呈细胞；
(c)给予HLA-A*2402阳性对象或HLA-A*0201阳性对象上述抗原提呈细胞。
上述方法中的试样只要有可能包含淋巴细胞或树状细胞即可，可以是任一种试样，例如有血液等来自对象的试样、细胞培养液等。上述方法中的反应可以利用普通方法进行，优选利用电穿孔来进行。抗原提呈细胞的获取可以利用本领域技术人员已知的方法进行。关于各步骤中的试样中细胞的培养条件，本领域技术人员可以适当确定。抗原提呈细胞的给药方法可以是上述的方法。
本发明还涉及用于预防或治疗癌症的试剂盒，该试剂盒包含具有编码eEF2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列或其部分序列的核酸或eEF2肽作为必须构成成分。该试剂盒的特征在于：诱导经由HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子提呈上述eEF2肽的抗原提呈细胞。本发明的试剂盒除了包含上述必须构成成分以外，例如还可以包含试样的获取手段、反应容器等。通常，试剂盒中附带操作说明书。使用本发明的试剂盒，可以高效率地得到经由HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子提呈eEF2肽的抗原提呈细胞，通过给予该抗原提呈细胞，可用于癌症的治疗或预防。
在又一方案中，本发明涉及抗HLA-A*2402限制性eEF2肽或HLA-A*0201限制性eEF2肽的抗体或抗编码该肽的多核苷酸的抗体。本发明的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。
在又一方案中，本发明涉及癌症的诊断方法，其特征在于：使用上述eEF2特异性CTL、经由HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子提呈上述eEF2肽的抗原提呈细胞、或抗HLA-A*2402限制性eEF2肽或HLA-A*0201限制性eEF2肽的抗体或抗编码该肽的多核苷酸的抗体。优选在本发明的诊断方法中使用eEF2特异性CTL。例如，将上述CTL、抗原提呈细胞或抗体与来自HLA-A*2402阳性对象或HLA-A*0201阳性对象的试样一起进行培养，或者将上述CTL、抗原提呈细胞或抗体给予HLA-A*2402阳性对象或HLA-A*0201阳性对象，接下来确定该CTL、抗原提呈细胞或抗体的例如位置、部位、量等，从而可以诊断癌症。上述CTL、抗原提呈细胞或抗体可以被标记。通过附上所述的标记，可以高效率地实施本发明的诊断方法。
在又一方案中，本发明涉及癌症的诊断用试剂盒，该试剂盒包含上述eEF2特异性CTL、经由HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子提呈eEF2肽的抗原提呈细胞、或抗HLA-A*2402限制性eEF2肽或HLA-A*0201限制性eEF2肽的抗体或抗编码该肽的多核苷酸的抗体作为必须构成成分。
在又一方案中，本发明涉及确定HLA-A*2402阳性对象或HLA-A*0201阳性对象中eEF2特异性CTL的存在或量的方法，该方法包括下述步骤：
(a)使eEF2肽与HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子的复合体与来自该对象的试样反应；接下来
(b)测定该试样中所含的识别该复合体的CTL的存在或量。来自对象的试样只要有可能包含淋巴细胞即可，可以是任一种试样，例如有血液、淋巴液等体液、组织等。关于eEF2肽与HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子的复合体，例如可以使用生物素链霉亲和素法等本领域技术人员已知的方法，形成例如四聚体、五聚体等形态。识别所述复合体的CTL的存在或量可以通过本领域技术人员已知的方法来测定。在本发明的该方案中，上述复合体可以被标记。作为标记，可以使用荧光标记、放射性标记等公知的标记。通过标记，CTL的存在或量的确定变得容易且迅速。使用本发明的该方案的方法，可以进行癌症的诊断、预后诊断等。
因此，本发明还提供包含eEF2肽与HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子的复合体的组合物，该组合物用于确定HLA-A*2402阳性对象或HLA-A*0201阳性对象中eEF2特异性CTL的存在或量。
本发明还提供用于确定HLA-A*2402阳性对象或HLA-A*0201阳性对象中eEF2特异性CTL的存在或量的试剂盒，该试剂盒中包含eEF2肽与HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子的复合体。
在又一方案中，本发明涉及使用eEF2肽与HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子的复合体来获得eEF2特异性CTL的方法，该方法包括下述步骤：
(a)使复合体与试样反应；
(b)得到该试样中所含的识别该复合体的CTL。
eEF2肽与HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子的复合体如上所述。试样只要有可能包含淋巴细胞即可，可以是任一种试样，例如有血液等来自对象的试样、细胞培养液等。识别复合体的CTL的获取例如可以利用FACS、MACS等本领域技术人员已知的方法来进行。还可以培养所得的eEF2特异性CTL，将其用于各种癌症的治疗或预防。
因此，本发明还涉及eEF2特异性CTL，该eEF2特异性CTL可以通过使用eEF2肽与HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子的复合体得到eEF2特异性CTL的方法而得到。
本发明还涉及用于得到eEF2特异性CTL的试剂盒，该试剂盒包含eEF2肽与HLA-A*2402分子或HLA-A*0201分子的复合体。
在一个方案中，本发明提供用于肿瘤形成的试剂盒，该试剂盒的特征在于：表达eEF2多肽。即，本发明的试剂盒是以在细胞或非人动物中表达eEF2多肽为必须构成要件。因此，编码该多肽的氨基酸序列的多核苷酸或插入有该多核苷酸的载体是必须构成成分。这里，本说明书中的非人动物表示人以外的动物。本发明的试剂盒基于eEF2蛋白的强制表达促进细胞周期中的G2/M期的认知。另外，本发明的试剂盒除了包含上述多核苷酸或载体以外，还可以包含例如将上述多核苷酸或载体导入细胞或非人动物组织中的手段、导入用试剂、反应容器等。通常，试剂盒中附带操作说明书。通过使用本发明的试剂盒可以达到下述目的：在体内或体外形成肿瘤，然后例如试验候选分子对肿瘤形成或细胞增殖的效果。
需要说明的是，本发明的方法可以在体内进行，也可以在体外进行。
以下给出实施例，以具体且详细地说明本发明，但实施例不应理解为限定本发明。
实施例1
癌症患者血清中的eEF2IgG抗体的检测
将肺癌细胞株PCI4和LU-99B、白血病细胞株K562细胞溶解于SDS-样品缓冲液中。通过SDS-PAGE分离其中所含的蛋白，之后转移到PVDF膜上，稀释由10名肺癌患者和10名健康者得到的血清至1500∶1，使用所得的稀释血清作为一次抗体，使用抗人IgG抗体使与膜结合的IgG抗体可视化。其结果，发现了被肺癌患者血清特异性识别的约100kDa的蛋白(图1)。图1是蛋白质印迹的代表例。之后，分离该蛋白，然后通过质量分析的方法确定为eEF2。
eEF2在各种癌症中的过剩表达
由石蜡包埋块准备薄切切片。脱石蜡处理后，在枸橼酸缓冲液(pH6.0)中进行抗原激活处理，使其与抗-eEF2抗体(H-118，Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA、1∶100稀释)在4℃下反应一夜，之后使其与Envision试剂盒/HRP(Dako Cytomation)在室温下反应30分钟。与0.7％H2O2溶液反应后，以DAB为底物进行显色，之后使用苏木精进行核染色。其结果，在肺腺癌、小细胞性肺癌、头颈部扁平上皮癌、食道癌、胃癌和结肠癌患者的各自的患处组织中观察到抗体阳性细胞(图2～4)。
各种癌症中的eEF2抗体的检测
在获得同意的基础上，由72名非小细胞肺癌患者、42名大肠癌患者、20名头颈部扁平上皮癌患者、18名神经胶质母细胞瘤患者和17名健康者得到末梢血。使其凝固后，通过离心分离得到血清。制作插入有编码eEF2的第411-858位氨基酸序列的基因序列的重组蛋白表达用载体pGEX-5X-3(GE)。调整已纯化的重组GST-eEF2411-858蛋白使达到150ng/泳道，进行SDS-PAGE。将其电转移到PVDF膜上。使其与稀释至1500∶1的血清在室温下反应一夜，使用抗人IgG抗体将与膜结合的IgG抗体可视化。测定该谱带的密度，作为抗eEF2抗体效价。17名健康者的抗体效价的平均值为500光密度单位、标准偏差为500，所以截断水平为平均值+3SD即2000光密度单位。其结果，特异度为94.7％，eEF2 IgG抗体在非小细胞肺癌中的特异度为66.7％、在大肠癌中的特异度为71.8％、在头颈部扁平上皮癌中的特异度为60.0％、在神经胶质母细胞瘤中的特异度为88.9％，呈阳性(图5)。通过免疫染色法分析各种癌症中eEF2蛋白的表达。当与对应的正常细胞相比显示出强染色的癌细胞为癌细胞总体的25％以上时，判定为阳性(表8)。
[表8]
利用eEF2抗体进行癌症的早期检测
在70名明确了血清CEA值的非小细胞肺癌患者(I期44名、II期13名、III期13名)中，比较eEF2抗体效价的阳性率和CEA的阳性率。这里，I期、II期、III期的分类根据由国际癌症防治联合会规定的TNM分类来进行。eEF2抗体效价通过点渍法确定。其结果可知，在非小细胞肺癌的各病期中eEF2IgG抗体的阳性率从I期起就为高值(表9)。
[表9]
eEF2抗体效价与无病存活率(disease-free survival rate)的关系
对非小细胞肺癌中的eEF2抗体效价与无病存活率的关系进行分析。44名患者中，在eEF2抗体效价为4000光密度单位以上的组(11名)中，与eEF2抗体效价为2000～4000光密度单位的组(26名)或eEF2抗体效价不足2000光密度单位的组(7名)相比，无病存活率明显高(时序检验(log rank test)、图6)。
实施例2
抑制各种细胞株中的细胞增殖
使用tRNA-shRNA表达载体、piGENE tRNA Pur(Clontech，PaloAlto，CA)制作表达以eEF2mRNA的5’-caugggcaacaucaugaucgauccuguccu-3’序列为靶的siRNA的载体(以下记作shEF2)。接下来，使用GenePulser Xcell(注册商标)系统(Bio Rad，Hercules，CA)，在165V、1000μF的条件下，通过电穿孔将10μg shEF2或空的shRNA载体(shMock)导入表达eEF2的胃癌细胞株AZ-521和MKN28、大肠癌细胞株SW620、肺癌细胞株LU99B和PC-14、胰癌细胞株MiaPaCa2和PCI6、神经胶质母细胞瘤细胞株A172和U87MG、以及恶性淋巴瘤细胞株IB4和YT(各5×105个)中。导入后，在24、48、72和96小时后，对细胞进行胰蛋白酶处理，计算存活细胞数。实验以重复试验的形式独立进行3次。在所有实验中，shEF2均显著抑制细胞增殖(图7和图8)。
实施例3
eEF2肽的选择
首先，在4种肽的选择中，利用ProPred-I网址(http://www.imtech.res.in/raghava/propred1/)预测eEF2蛋白的氨基酸序列中的能够与HLA-A*2402分子结合的序列。其结果见以下的表10。
(表10.使用各种程序(NetMHC3.0、Rankpep和SYFPEITHI)选择的、与HLA-A*2402分子具有高结合亲和性的候选eEF2肽)
[表10]
起始残基编号为SEQ ID NO：1所示的编号。所有的候选eEF2肽由9个残基的氨基酸构成。例如，起始残基编号786的肽是由SEQ ID NO：1的第786位的残基A～第794位的残基F的9个氨基酸残基构成的肽。
接下来，实际上通过MHC稳定测定分析候选eEF2肽与HLA-A2402分子的结合能力。简单来说，就是将1×106个与HLA分子不具有抗原提呈能力、且强制表达人HLA-A*2402分子的T2-2402细胞在含有10μM的合成肽、且不含血清的RPMI1640培养基中、于27℃下培养16小时，之后在37℃下放置3小时。由于HLA-A24分子在细胞表面的表达通过肽的结合而变得稳定，所以在利用各种肽处理后，通过流式细胞术分析细胞表面的HLA-A24分子的表达，评价各肽与HLA-A2402分子的结合能力。其结果，eEF2409-417(SEQ ID NO：4)、eEF2412-420(SEQ ID NO：5)、eEF2701-709(SEQ ID NO：6)和eEF2786-794(SEQ ID NO：7)各肽对HLA-A2402分子显示出结合能力(表11)。
[表11]
干扰素活性的测定
将T细胞和用eEF2肽(eEF2409-417、eEF2412-420和eEF2701-709肽)进行脉冲的HLA-A*2402分子表达T2细胞一起在布雷菲德菌素A(Sigma)存在下，于37℃下培养5小时。用PBS清洗后，使用PerCP结合抗CD3(BD Biosciences)和PE结合抗CD8(Caltag，Burlingame，CA)抗体将作为细胞表面抗原的CD3和CD8分子在冰上染色15分钟。接下来，使用Cytofix(BD Biosciences)在冰上固定细胞20分钟，利用FITC结合抗IFN-γ抗体(BD Biosciences)使细胞内的IFN-γ在冰上反应30分钟。使用流式细胞仪进行分析，分析IFN-γ阳性细胞在CD8阳性T细胞中所占的频率。其结果可知，eEF2409-417、eEF2412-420和eEF2701-709肽使干扰素γ活性上升，因此这些肽是HLA-A*2402限制性肽(图30)。
修饰型eEF2肽与HLA-A *-2402分子的结合亲和性
并且，上述肽中，在eEF2786-794(SEQ ID NO：7)和eEF2409-417(SEQID NO：4)肽中，对于氨基酸序列的第2位(以下也称作P2)和/或第9位(以下也称作P9)改变成其他氨基酸的修饰型eEF2肽，也如上所述预测结合亲和性。
(表12.预测eEF2786-794肽的修饰型(SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26)与HLA-A*2402分子的结合亲和性)
[表12]
(表13.预测修饰型eEF2409-417肽(SEQ ID NO：27～31)与HLA-A*2402分子的结合亲和性)
[表13]
在eEF2786-794(SEQ ID NO：7)肽中，由于P2为Y、P9为F，Y和F是锚定残基，因此即使改变成其他残基，也无法确认到结合亲和性的提高(表12)。而在eEF2409-417(SEQ ID NO：4)肽中，若将P2改变成锚定残基Y，则确认到结合亲和性显著提高(表13)。
eEF2特异性杀伤T细胞的诱导
使用CD25MicroBeads(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)，从由持有HLA-A*2402分子的供体得到的末梢血单核细胞中除去CD4+CD25+Treg细胞。接下来，使用BD IMag CD14分离试剂盒(BD Bioscience)分离供体的单细胞，在含有IL-4和GM-CSF、且补充了1％人AB血清的X-VIVO15(Bio Whittaker，Walkersville，MD)中培养，第2天添加IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE-2，以使树状细胞成熟，再培养3天。对树状细胞进行放射线(30G)照射后，将其在含有10μg/mL的肽的培养基中培养2小时，用肽脉冲树状细胞后，将2×106个已除去了Treg细胞的单核细胞与进行了肽脉冲的树状细胞以10∶1的比例进行共同培养，用肽进行刺激，第2天向培养基中添加IL-2。之后，每隔10天用进行了肽脉冲的放射线照射供体单核细胞进行再刺激，进行多次刺激后，用含有IL-7和IL-15的培养基进行培养，建立T细胞克隆。
细胞毒活性的测定
使用CD8 Microbeads，从如上建立的T细胞克隆中纯化CD8阳性T细胞，制备效应细胞。接下来，用51Cr-标记铬酸钠(AmershamBiosciences Corp.，NJ)培养靶细胞1小时进行标记，之后将其与效应细胞以细胞数之比为1∶1、3∶1和9∶1的CTL/靶细胞(E/T)的比例混合，放置4小时。溶解的细胞的比例通过下式来计算。
％特异性溶解＝[(cpm实验释放-cpm自然释放)/(cpm最大释放-cpm自然释放)]×100
靶细胞使用用eEF2786-794肽脉冲的T2-2402细胞，而阴性对照使用没有用eEF2786-794肽(SEQ ID NO：7)脉冲的T2-2402细胞。由此显示，用eEF2786-794肽脉冲的T2-2402细胞的％特异性溶解随着E/T比的增加而显著上升(图9)。另外，靶细胞使用具有内源性的eEF2表达、且在细胞表面具有HLA-A*2402表达的大肠癌SW480细胞，而阴性对照使用具有内源性的eEF2表达、但在细胞表面不具有HLA-A*2402表达的胃癌AZ-521细胞和胰癌MiaPaCa2细胞。该结果显示：被eEF2786-794肽活化的细胞毒性T细胞表达eEF2、且特异性杀伤具有HLA-A*2402分子的细胞(图10)。
实施例4
eEF2肽的选择
选择肽时，使用ProPred-I网址(http://www.imtech.res.in/raghava/propred1/)预测eEF2蛋白的氨基酸序列中的能够与HLA-A*0201分子结合的序列(表1～7)。接下来，实际上通过MHC稳定测定分析与HLA-A0201分子的结合能力。简单说来，就是将1×106个不具有与HLA分子的抗原提呈能力、且强制表达人HLA-A*0201分子的T2-0201细胞在含有10μM的合成肽、且不含血清的RPMI1640培养基中、于27℃下培养16小时，之后在37℃下放置3小时。由于HLA-A*0201分子在细胞表面的表达通过肽的结合而变得稳定，所以利用各种肽处理后，通过流式细胞术分析细胞表面的HLA-A0201分子的表达，评价各肽与HLA-A0201分子的结合能力。其结果，eEF2284-292(SEQ IDNO：13)、eEF2394-402(SEQ ID NO：12)、eEF2519-527(SEQ ID NO：9)、eEF2661-669(SEQ ID NO：11)、eEF2671-679(SEQ ID NO：10)和eEF2739-747(SEQ ID NO：8)各肽对HLA-A*0201分子显示出结合能力(表14)。
[表14]
干扰素活性的测定
将T细胞和脉冲了HLA-A*0201限制性eEF2肽的HLA-A*0201分子表达T2细胞一起在布雷菲德菌素A(Sigma)存在下，于37℃下培养5小时。用PBS清洗后，利用PerCP-结合抗CD3(BD Biosciences)和PE-结合抗CD8(Caltag，Burlingame，CA)抗体在冰上将作为细胞表面抗原的CD3和CD8分子染色15分钟。接下来，使用Cytofix(BDBiosciences)在冰上固定细胞20分钟，利用FITC-结合抗-IFN-γ抗体(BD Biosciences)使细胞内的IFN-γ在冰上反应30分钟。使用流式细胞仪进行分析，分析IFN-γ阳性细胞在CD8阳性T细胞中所占的频率。在图11中使用eEF2739-747肽，在图12中使用eEF2661-669肽。由该结果可知：eEF2661-669(SEQ ID NO：11)和eEF2739-747(SEQ ID NO：8)肽使干扰素γ活性上升(图11和12)。
细胞毒活性的测定
然后，测定如上选择的6种候选肽(即eEF2739-747(SEQ ID NO：8)、eEF2519-527(SEQ ID NO：9)、eEF2671-679(SEQ ID NO：10)、eEF2661-669(SEQ ID NO：11)、eEF2394-402(SEQ ID NO：12)和eEF2284-292(SEQ IDNO：13)，eEF2292-300(SEQ ID NO：14)除外)实际上是否具有细胞毒活性。进行与上述实施例3几乎相同的实验。即，从保有HLA-A*0201分子的健康供体采集血液，分离末梢血单核细胞，用6种候选肽进行第1次刺激(刺激物：自身PBMC)。之后，以8～13天的间隔进行第2天以后的肽刺激(刺激物：allo B-LCL 3mg/ml)。并且，第2次以后每隔2天以20IU/ml的最终浓度添加IL-2。从最终肽刺激起6天后进行细胞毒性测定。其结果，在上述6种肽中发现细胞毒活性上升(图16～21)。由以上结果可知：上述6种肽(eEF2739-747(SEQ ID NO：8)、eEF2519-527(SEQ ID NO：9)、eEF2671-679(SEQ ID NO：10)、eEF2661-669(SEQ ID NO：11)、eEF2394-402(SEQ ID NO：12)和eEF2284-292(SEQ ID NO：13)与HLA-A*0201分子结合、且具有细胞毒性活性。
接下来，测定上述6种肽和eEF2292-300肽(SEQ ID NO：14)能否与HLA-A*0206分子结合以产生干扰素-γ。除使用保有HLA-A*0206分子的供体以外，利用与上述方法相同的方法进行实验。由其结果可知：进行试验的所有肽均使干扰素-γ的产生增加(图29)。
修饰型eEF2肽与HLA-A *-0201分子的结合亲和性
然后，在上述6种肽(eEF2739-747、eEF2519-527、eEF2671-679、eEF2661-669、eEF2394-402和eEF2284-292)以及eEF2292-300肽(SEQ ID NO：14)中，即使对于将第2位氨基酸和/或第9位氨基酸改变成其他氨基酸的修饰型eEF2肽，也如上所述利用程序预测结合亲和性(表15～21)。
[表15]
[表16]
[表17]
[表18]
[表19]
[表20]
[表21]
并且，上述肽中，对于eEF2292-300(SEQ ID NO：14)的修饰型肽(SEQID NO：15～17和24)，使用上述方法，测定其与HLA-A*0201分子的实际的结合亲和性(表22)、细胞毒性(图22～25)和干扰素γ活性(图26)。
[表22]
由该结果可知：与原始的eEF2292-300肽相比，在eEF2292-300肽的修饰型中，eEF2292-3002L(eEF2292-300肽中，第2位的氨基酸由I改变成L的肽、SEQ ID NO：15)、eEF2292-3002M(eEF2292-300肽中，第2位的氨基酸由I改变成L的肽、SEQ ID NO：16)、eEF2292-3002L9L(eEF2292-300肽中，第2位的氨基酸由I改变成L、且第9位的氨基酸由V改变成L的肽、SEQ ID NO：17)和eEF2292-3002M9L(eEF2292-300肽中，第2位的氨基酸由I改变成M、且第9位的氨基酸由V改变成L的肽、SEQ ID NO：24)与HLA-A*0201分子的结合高(表22)，使在人中的细胞毒性和干扰素γ活性上升(图22～26、28)。
实施例5
癌细胞株中的eEF2强制表达
建立在胃癌细胞株AZ-521中表达eEF2表达载体或空的表达载体的细胞克隆。eEF2表达载体是在pcDNA3.1(+)(Invitrogen)的限制酶切位点EcoRI中插入有eEF2基因的核苷酸序列的载体。在非同步的情况下培养这些细胞，由培养开始后48小时和72小时后的细胞数计算细胞的倍增时间。再用80％乙醇固定1×105个细胞，之后将细胞在含有5μg/ml的碘化丙锭(PI)和200μg/ml的RNaseA的PBS中放置30分钟，利用流式细胞术分析细胞周期的每一阶段的分布(图13、左上图)。接下来，由于细胞的倍增时间相当于细胞周期的长度，所以通过将各细胞周期的阶段的分布的比例与其相乘，计算各阶段的进行时间(图13、右上图和下表)。其结果，观察到在表达eEF2的细胞中G2/M期的细胞数减少、进行时间变短(图13)。这暗示eEF2促进G2/M期的进行。
将5×106个如上建立的、强制表达eEF2的胃癌细胞株AZ-521(2克隆)和5×106个表达对照的空载体的AZ-521(2克隆)与Matrigel(Becton Dickinson)混和，对裸小鼠的左右腹部进行皮下注射，形成肿瘤，每周计测其大小2次，观察34天。肿瘤体积(mm3)通过(短径)2×(长径)2/2来计算。显示各克隆的独立3次实验的结果(图14)。由该结果显示：与对照相比，在注射了强制表达eEF2的细胞的小鼠中肿瘤体积显著肥大。图15显示代表例。左侧的肿瘤为表达空载体的AZ-521细胞，右侧的肿瘤为强制表达eEF2的AZ-521细胞。
实施例6
以eEF2为靶的shRNA的新的靶序列的鉴定
为了开发以eEF2为靶有效抑制eEF2的表达、且能够抑制癌增殖的shRNA(以下称作shEF2)，重新在eEF2的序列中选择能够作为靶的2个序列(以下称作shEF-1918和shEF-2804)。
eEF2基因的第1918～1947位(从编码eEF2蛋白的DNA序列的5’末端起第1918～1947位)的靶序列：
5’-gcc tggccgagga catcgataaa ggcgagg-3’(SEQ ID NO：18)
eEF2基因的第2804～2833位(从编码eEF2蛋白的DNA序列的5’末端起第2804～2833位)的靶序列：
5’-actcaac cataacactt gatgccgttt ctt-3’(SEQ ID NO：19)
shRNA的构建
为了构建针对上述序列(SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19)的shRNA，化学合成由靶序列的有义序列(30个碱基)-环状序列(10个碱基)-反义序列(30个碱基)构成的DNA序列(shEF-1918或shEF-2804(有义链))及其互补DNA序列(shEF-1918或shEF-2804(反义链))，之后退火，插入到tRNA-shRNA表达载体、piGENE tRNA Pur(Clontech，PaloAlto，CA)的SacI和KpnI的识别位点中。所插入的DNA序列如下所示。这里，在靶序列的一部分有义序列中加入突变(在以下的序列中用下划线表示)，以使在转录有序列的RNA被切断时，反义链高效率地进入RISC中。
·shEF-1918(有义链)：
5’-(gcc tggccgagga catcgatgaa agcgtgg)cttcctgtca(cctcgcc tttatcgatgtcctcggcca ggc)-3’(SEQ ID NO：20)
·shEF-1918(反义链)：
3’-(cgg accggctcct gtagctactt tcgcacc)gaaggacagt(ggagcgg aaatagctacaggagccggt ccg)-5’(SEQ ID NO：21)
·shEF-2804(有义链)：
5’-(actcaac cataacactt gataccattt gtt)cttcctgtca(aag aaacggcatc aagtgttatggttgagt)-3’(SEQ ID NO：22)
·shEF-2804(反义链)：
3’-(tgagttg gtattgtgaa ctatggtaaa caa)gaaggacagt(ttc tttgccgtag ttcacaataccaactca)-5’(SEQ ID NO：23)
细胞培养和shRNA的导入
在MEM 10％FBS中培养肺癌细胞PC-14、胰癌细胞PCI6、纤维肉瘤细胞HT-1080和恶性神经胶质瘤细胞A172。为了导入ShRNA，将1×105个细胞用PBS清洗2次，之后将其悬浮于250μL不含FBS的RPMI1640培养基中，向其中分别加入用50uL不含FBS的RPMI1640培养基溶解的10ug的shEF-1918、shEF-2804、或抗萤光素酶的shRNA载体、shLuc，在950μFD、175V的条件下，使用GenePu1sor II(BioRad)进行电穿孔。该条件下细胞的存活率为约90％。导入shRNA后，计算活细胞数，以1×105细胞/mL的密度接种细胞，72小时后进行胰蛋白酶处理，计算细胞数。其结果，与shLuc相比，在所分析的4种细胞中，shEF-1918和shEF-2804均显著抑制其增殖(图27)。
产业实用性
根据本发明，提供使用eEF2作为标志物的癌症的检测方法、以eEF2为靶的用于治疗或预防的药物组合物、HLA-A*2402限制性或HLA-A*0201限制性的eEF2肽、以及包含这些肽的药物组合物等，所以可以在药品等领域、例如高度表达eEF2基因的各种造血器官肿瘤、实体癌的预防药或治疗药的开发、制造领域中应用。
序列表自由文本
SEQ ID NO：2：eEF2 siRNA
SEQ ID NO：3：eEF2 siRNA
SEQ ID NO：18：eEF2 1918-1947
SEQ ID NO：19：eEF2 2804-2833
SEQ ID NO：20：shEF-1918有义
SEQ ID NO：21：shEF-1918反义
SEQ ID NO：22：shEF-2804有义
SEQ ID NO：23：shEF-2804反义
Claims (26)
1.检测对象的癌症的方法，该方法包括：测定在由该对象得到的试样中eEF2多肽、eEF2抗体或eEF2基因的转录物的存在或量的步骤。
2.权利要求1所述的方法，其中，上述癌症选自肺腺癌、非小细胞性肺癌、小细胞性肺癌、头颈部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大肠癌、胰管癌、神经胶质母细胞瘤和恶性淋巴瘤。
3.双链siRNA，该双链siRNA抑制癌细胞的增殖，其中，有义链由SEQ ID NO：2所示的RNA序列构成，反义链由SEQ ID NO：3所示的RNA序列构成。
4.权利要求3所述的双链siRNA，其中，上述癌细胞来自选自胃癌、肺癌、胰癌、神经胶质母细胞瘤和恶性淋巴瘤的癌。
5.药物组合物，其用于治疗或预防癌症，该药物组合物含有权利要求3或4所述的双链siRNA作为有效成分。
6.用于治疗或预防癌症的方法，其特征在于：给予对象有效量的权利要求5所述的药物组合物。
7.权利要求3或4所述的双链siRNA在制造用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
8.shRNA，该shRNA抑制癌细胞的增殖，并以由SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19所示的DNA序列转录的mRNA为靶。
9.核酸，该核酸是权利要求8所述的shRNA所转录的核酸，其具有SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：22所示的DNA序列。
10.载体，该载体包含权利要求9所述的核酸。
11.药物组合物，其用于治疗或预防癌症，该药物组合物含有权利要求8所述的shRNA、权利要求9所述的核酸或权利要求10所述的载体。
12.用于治疗或预防癌症的方法，其特征在于：给予对象有效量的权利要求11所述的药物组合物。
13.权利要求8所述的shRNA、权利要求9所述的核酸或权利要求10所述的载体在制造用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
14.药物组合物，其用于治疗或预防HLA-A*2402阳性对象的癌症，该药物组合物中包含eEF2肽，所述eEF2肽具有由来自eEF2蛋白的连续的氨基酸构成的氨基酸序列，上述氨基酸序列选自下述(a)～(e)：
(a)Arg Phe Tyr Ala Phe Gly Arg Val Phe即SEQ ID NO：4；
(b)Ala Phe Gly Arg Val Phe Ser Gly Leu即SEQ ID NO：5；
(c)Arg Phe Asp Val His Asp Val Thr Leu即SEQ ID NO：6；
(d)Ala Tyr Leu Pro Val Asn Glu Ser Phe即SEQ ID NO：7；以及
(e)在(a)～(d)所示的氨基酸序列中，取代、缺失或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列。
15.权利要求14所述的药物组合物，其中，氨基酸序列为Ala TyrLeu Pro Val Asn Glu Ser Phe即SEQ ID NO：7。
16.药物组合物，其用于治疗或预防对象的癌症，该药物组合物中含有编码权利要求14所述的肽的多核苷酸。
17.权利要求14～16中任一项所述的药物组合物，其中，上述癌症选自肺腺癌、小细胞性肺癌、食道癌、胃癌、大肠癌、胰管癌、恶性神经胶质母细胞瘤、恶性淋巴瘤和头颈部扁平上皮癌。
18.用于治疗或预防癌症的方法，其特征在于：对HLA-A*2402阳性对象给予有效量的权利要求14～17中任一项所述的药物组合物。
19.权利要求14所述的肽在制造用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
20.药物组合物，其用于治疗或预防HLA-A*0201阳性对象的癌症，该药物组合物中包含eEF2肽，所述eEF2肽具有由来自eEF2蛋白的连续的氨基酸构成的氨基酸序列，上述氨基酸序列选自下述(a)～(h)：
(a)Arg Leu Met Glu Pro Ile Tyr Leu Val即SEQ ID NO：8；
(b)Lys Leu Val Glu Gly Leu Lys Arg Leu即SEQ ID NO：9；
(c)Tyr Leu Asn Glu Ile Lys Asp Ser Val即SEQ ID NO：10；
(d)Ile Leu Thr Asp Ile Thr Lys Gly Val即SEQ ID NO：11；
(e)Leu Met Met Tyr Ile Ser Lys Met Val即SEQ ID NO：12；
(f)Lys Leu Pro Arg Thr Phe Cys Gln Leu即SEQ ID NO：13；
(g)Leu Ile Leu Asp Pro Ile Phe Lys Val即SEQ ID NO：14；以及
(h)在(a)～(g)所示的氨基酸序列中，取代、缺失或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列。
21.权利要求20所述的药物组合物，其中，氨基酸序列为Arg LeuMet Glu Pro Ile Tyr Leu Val即SEQ ID NO：8或Ile Leu Thr Asp Ile ThrLys Gly Val即SEQ ID NO：11。
22.权利要求20所述的药物组合物，其中，氨基酸序列为在LeuIle Leu Asp Pro Ile Phe Lys Val即SEQ ID NO：14中将第2位氨基酸Ile取代成Leu或Met、和/或将第9位氨基酸Val取代成Leu而得到的氨基酸序列。
23.药物组合物，其用于治疗或预防对象的癌症，该药物组合物包含编码权利要求20所述的肽的多核苷酸。
24.权利要求20～23中任一项所述的药物组合物，其中，上述癌症选自肺腺癌、小细胞性肺癌、食道癌、胃癌、大肠癌、胰管癌、恶性神经胶质母细胞瘤、恶性淋巴瘤和头颈部扁平上皮癌。
25.用于治疗或预防癌症的方法，其特征在于：给予对象有效量的权利要求20～24中任一项所述的药物组合物。
26.权利要求20所述的肽在制造用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
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