CN106459167A - 急性骨髓性白血病(aml)等几种血液肿瘤的新型免疫疗法 - Google Patents

急性骨髓性白血病(aml)等几种血液肿瘤的新型免疫疗法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明还涉及单独使用或与其它肿瘤相关肽(刺激抗肿瘤免疫反应疫苗复合物的活性药物成分)联合使用的肿瘤相关细胞毒性T辅助细胞(CTL)肽表位。本发明涉及数种新型肽序列及其变体，它们源自可用于引发抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物中的人肿瘤HLA‑I类和HLA‑II类分子。

Description

急性骨髓性白血病(AML)等几种血液肿瘤的新型免疫疗法
本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明还涉及单独使用或与其它肿瘤相关肽(刺激抗肿瘤免疫反应疫苗复合物的活性药物成分)联合使用的肿瘤相关细胞毒性T辅助细胞(CTL)肽表位。本发明涉及数种新型肽序列及其变体，它们源自可用于引发抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物中的人肿瘤HLA-I类和HLA-II类分子。
发明背景
急性髓性白血病(AML)，也称为急性骨髓性白血病或急性非淋巴细胞白血病(ANLL)，是血细胞髓性细胞系的一种癌症，其特征在于累积于骨髓并干扰产生正常血细胞的异常白血细胞的快速生长。AML是影响成年人最常见的急性白血病，并且其发病率随年龄而增加。虽然AML是一种比较罕见的疾病，在美国占癌症死亡病例大约1.2％，但是，随着人口老龄化，预计其发病率会增加。
AML的症状由白血病细胞替代正常骨髓而导致，这会引起红血细胞、血小板和正常白细胞下降。这些症状包括疲劳、呼吸急促、易擦伤出血以及感染风险增加。有几个风险因素和染色体异常情况已经确定，但具体原因尚不清楚。AML作为一种急性白血病，进展迅速，如果不及时治疗，通常在几周或几个月内致命。
AML有几种亚型；治疗及预后根据其亚型而各不相同。根据不同亚型，五年生存率为15-70％，复发率为33-78％。AML初次用化疗方法治疗时旨在诱导缓解；患者可能继续获得额外的化疗或造血干细胞移植。
美国2005/0261190 A1号专利公开了Fas相关因子1的多肽片段，其结合到Hsc70/Hsp70，泛素化蛋白或含缬酪肽蛋白。本文中披露的一些片段包括SEQ ID NO：5。
同样地，KR100692416披露了FAF-1片段(Fas相关因子1)对血管生成和细胞增殖有抑制作用。因此，它被证明可作为一种抗癌剂，例如肿瘤转移抑制剂。对肿瘤转移有抑制作用的片段由FAF1的290-345氨基酸组成。
Hassan等人(The human leukocyte antigen-presented ligandome of Blymphocytes.Mol Cell Proteomics.2013Jul；12(7)：1829-43)披露了构成B细胞HLA配体组的14,500个肽配体的鉴定和相对定量是解决大量特异性免疫问题的起点。
Kowalewski等人(Mapping The HLA Ligandome Of Chronic LymphocyticLeukemia-Towards Peptide Based Immunotherapy Blood 2013；122(21)：4123)描述了分析25名CLL患者和35名健康对照者的HLA-I类肽体的方法。
尽管如此，对于血癌等癌症仍然需要新型有效和安全的治疗方案，特别是急性髓性白血病(AML)以及不同表型的其它血液癌症，这样可在不需要过量使用化疗药物或其它可能导致严重副作用的药物的情况下，即可改善患者的健康。
本发明采用刺激患者免疫系统的肽并以一种无创方式充当抗肿瘤制剂。
发明摘要
在本发明的第一方面，本发明涉及一种肽，包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605的组的一个氨基酸序列、或该序列的与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605具有至少80％，优选至少90％同源(优选至少80％或至少90％相同)的一种变体序列(其中所述变体诱导T细胞与所述肽发生交叉反应)，或其药用盐(其中所述肽不是潜在全长多肽)。
本发明还涉及一种肽，包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605组的一个序列、或该序列的与SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605具有至少80％，优选至少90％同源(优选至少80％或至少90％相同)的一种变体，其中所述肽或其变体的总长度对于SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325为8至100个氨基酸，优选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸，而对于SEQ ID NO：SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605为12至100个氨基酸，优选为12至30并最优选为12至18个氨基酸。
下表显示了根据本发明的肽、它们各自的SEQ ID NO、以及这些肽的可能源蛋白。表1中所有肽与HLA-A、HLA-B或HLA-C等位基因结合，表2中的肽并确认为源自AML相关抗原，表3中的肽与HLA-DR(MHC-II类)等位基因结合。表3中的II类肽还可用于诊断和/或治疗AML、慢性淋巴性白血病(CLL)和其它恶性血液病，这些疾病涉及过量表达或过度提呈各潜在多肽。
因此，本发明特别涉及本发明的一种肽，包含选自SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605的一个序列、或与SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605具有至少80％、优选90％同源性的一种变体，其中所述肽或其变体的总长度为12至100个、优选为12至30个、最优选为12至18个氨基酸。本发明特别涉及本发明的一种肽，其由SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605的序列组成。
表1：本发明的肽，潜在多肽用加粗字体表示
该表显示了HLA-I类配体组源性肿瘤相关抗原(LiTAA)，其在AML患者(n=15)中表示频率≥20％且提呈有各自HLA限制标注的HLA配体(LiTAP)。缩写词：rep.，representation(表示)；n.a.，not assigned(未分配)
表2：与潜在抗原(描述为与AML相关)相关的本发明的其它肽
该表显示了源自确定AML相关抗原的提呈HLA配体，不同组织(15份AML样本、30份PBMC样本和5份BMNC样本)的表示频率以及相应的HLA限制。缩写词：rep.，representation(表示)；n.a.，not assigned(未分配)。
下面表3中的肽还有可用于诊断和/或治疗恶性血液肿瘤、AML和/或慢性淋巴性白血病(CLL)细胞，但优选为AML。
表3：本发明的MHC-II类肽
该表显示了HLA-II类配体组源性肿瘤相关抗原(LiTAA)，其在AML患者(n=12)中表示频率＞20％且提呈HLA配体(LiTAP)。缩写词：rep.，representation(表示)。
下面表4中的肽也可用于诊断和/或治疗恶性AML和/或CLL，优选为AML。
表4：也可用于治疗AML和CLL的本发明中的肽
因此，特别优选的情况是为至少一种本发明中的肽，其选自SEQ ID NO：448、520、471、472、439、353、522、318、178、68、201、474、381、323、46、241、450、357、491、492、493、494、441、442、498、495、354、45、382、445、443、202、179、296、383、525、325和180的组，且用于AML和/或CLL中的治疗，如本文所述。
本发明还涉及本发明的肽用于治疗AML以外的增殖性疾病，例如，CLL。但是，如下面表5所示，本发明中的许多肽还可用于其它适应症。
表5：本发明的肽以及在其它增殖性疾病(任选其它器官)中的用途。
因此，本发明的另一个方面涉及本发明中肽的用途-优选联合用于治疗选自非典型脂肪瘤组中的增殖性疾病；
脑癌和选自肾嗜酸细胞瘤和淋巴恶性黑色素瘤的一种增殖性疾病；胶质母细胞瘤，和选自非骨化性纤维瘤、脑膜瘤、乳腺癌、子宫内膜腺癌、大网膜平滑肌肉瘤、腮腺多形性腺瘤、皮肤鳞状细胞癌、甲状腺结节增生和宫颈鳞状细胞癌的一种增殖性疾病；
乳腺小叶癌；
乳腺导管内癌；
结肠或直肠癌，以及选自腺癌、肾上腺皮质癌、乳腺粘液癌、腺癌、子宫内膜苗勒混合瘤、纤维瘤病、肾癌、肝癌局灶性结节性增生、肝细胞癌、肺小细胞癌、肺鳞状细胞癌、乳腺癌、淋巴结非霍奇金淋巴瘤、转移性肾细胞癌、子宫肌层平滑肌瘤、卵巢畸胎瘤、卵泡膜细胞瘤-纤维瘤、甲状旁腺腺瘤、前列腺良性结节性增生、直肠腺癌、脾慢性骨髓性白血病、脾髓外造血、胃腺癌、滑膜肉瘤、睾丸精原细胞瘤、胸腺胸腺瘤和宫颈鳞状细胞癌的一种增殖性疾病；
结肠腺瘤；
子宫内膜腺癌；
食管腺癌；
肾血管平滑肌脂肪瘤；
肾透明细胞癌以及选自非骨化性纤维瘤、脑脊膜瘤、结肠腺癌、结肠腺瘤、结肠非霍奇金淋巴瘤的一种增殖性疾病；
肾透明细胞癌以及选自子宫内膜癌、肾血管平滑肌脂肪瘤、肾多囊肾病、肾移行细胞癌、脂肪瘤非霍奇金淋巴瘤、卵巢腺癌、腮腺多形性腺瘤、前列腺癌、脾非霍奇金淋巴瘤选择增生性疾病、胃肠道间质瘤(GIST)、滑膜肉瘤和甲状腺结节性增生的一种增殖性疾病；
肾，肾细胞癌：例如：非透明细胞型；
脂肪肉瘤；
肝脏局灶性结节增生；
肝，肝细胞癌以及选自肾上腺皮质腺瘤、乳房癌、腺样囊性癌、结肠腺癌、肝局灶性结节性增生、肝细胞癌、肺腺癌、胰腺癌、腮腺多形性腺瘤、小肠胃肠道间质瘤、甲状腺结节增生、纤维瘤、肾血管平滑肌脂肪瘤、肾细胞癌、肝局灶性结节性增生、肺大细胞癌、子宫肌瘤以及宫颈鳞状细胞癌的一种增殖性疾病；肺腺癌；
非小细胞肺癌以及选自非骨化性纤维瘤、肾脏癌、肝细胞癌、肺腺癌、肺神经内分泌癌、网膜、腺癌、神经鞘瘤、脾慢性骨髓性白血病、脾髓外造血、胃腺癌、睾丸精原细胞瘤、胸腺胸腺瘤和宫颈鳞状细胞癌的一种增殖性疾病；
淋巴结乳腺浸润性癌；
淋巴结非霍奇金淋巴瘤；
恶性纤维组织细胞瘤；
乳腺转移性浸润癌
转移性肾细胞癌；
大网膜腺癌；
卵巢腺癌，透明细胞型；
卵巢颗粒细胞瘤；
胰腺腺癌以及选自骨巨细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、软骨肉瘤、肌肉内脂肪瘤、脂肪瘤、肺腺癌、淋巴结霍奇金病、子宫肌层、子宫肌瘤、卵巢粘液性囊腺癌、胃腺癌、和胸腺瘤的一种增殖性疾病；
甲状旁腺腺瘤；
前列腺癌；
直肠腺癌；
小肠胃肠道间质瘤；
脾慢性粒细胞白血病；
脾髓外造血；
鳞状细胞癌；
胃腺癌以及选自脑脊膜瘤、肝类癌瘤转移、前列腺癌和脾慢性骨髓性白血病的一种增殖性疾病；
胃分化亚型腺癌以及选自结肠腺癌、结肠非霍奇金淋巴瘤、子宫内膜腺癌、肾癌肾母细胞瘤、肺腺癌、肺小细胞癌、淋巴结非霍奇金淋巴瘤、恶性纤维组织细胞瘤、乳腺转移性浸润性小叶癌、甲状旁腺腺瘤、直肠腺癌、胃腺癌、睾丸精原细胞瘤和宫颈鳞状细胞癌的一种增殖性疾病；
胃腺癌以及选自肺腺癌、转移性肾细胞癌、子宫肌层平滑肌瘤、非霍奇金淋巴瘤、蕈样霉菌病、卵巢腺癌、胰腺癌和白血细胞慢性淋巴细胞性白血病的一种增殖性疾病；
胃子宫内膜，腺癌；
转移性胃癌以及选自腺癌、非骨化性纤维瘤、乳腺癌、十二指肠腺癌、肝腺瘤、肺大细胞癌、肺神经内分泌癌、肺鳞状细胞癌、淋巴结非霍奇金淋巴瘤、卵巢粒层细胞瘤、卵巢苗勒管混合瘤、胰腺癌、前列腺良性增生结节、直肠腺癌和基底细胞癌的一种增殖性疾病；
甲状腺结节性增生；
以及宫颈鳞状细胞癌。
ACBD6编码一种模块化蛋白，该蛋白在其N-末端携带酰基辅酶A结合域并在其C末端携带两个锚蛋白基序。ACBD6仅在具有血液和血管发育功能的组织细胞和祖细胞中表达。CBD6可在骨髓、脾脏、胎盘、脐带血、循环CD34+祖细胞、以及来自胎盘的胚胎样干细胞中检测到(Soupene et al.，2008)。
BRAP编码BRCA1相关蛋白，其通过其与BRCA1和其它蛋白的核定位信号结合能力来识别。它是一种细胞质蛋白，可通过保留细胞质的蛋白核定位信号来调节核靶向性(RefSeq，2002)。BRAP已被描述为白血病相关抗原(Greiner et a1.，2003)。
CDCA7L编码细胞分裂周期相关7样蛋白，该蛋白与癌基因c-Myc相互作用并增强其转化活性(Huang et al.，2005)。CDCA7L在肝癌细胞中强烈上调，且CDCA7L异位过度表达会促进肝癌细胞增殖和集落形成(Tian et al.，2013)。
CHTF18编码一种蛋白质，其与CHTF8和DCC1一起组成另一种复制因子C复合物，该复合物在细胞周期的S期将PCNA载入到DNA上(RefSeq，2002)。CHTF18连同复制因子C复合物的其它基因一起可诱发减少秀丽隐杆线虫体细胞增殖的合成致死基因相互作用。因此，CHTF18被确定为抗癌药物候选靶点(McLellan et al.，2009)。在非子宫内膜样子宫内膜肿瘤中出现具有统计学意义的ESCO1和CHTF18体细胞突变同时出现(Price et al.，2014)。
KIF15编码驱动蛋白家族成员15，该蛋白参与有丝分裂纺锤体的装配和稳定(Vanneste et al.，2009)。在乳腺癌中，KIF15被证明过量表达并具有免疫原性，这是因为抗KIF15抗体可从乳腺癌患者中分离获得(Scanlan et al.，2001)。此外，似乎肺腺癌中含有KIF15(Bidkhori et al.，2013)。
NOP14编码在18S rRNA预加工和小核糖体亚基组装中发挥作用的蛋白质(RefSeq，2002)。在胰腺癌中检测到了NOP14基因突变和异常表达。在胰腺癌细胞中，NOP14过度表达促进细胞迁移、增殖和集落形成(Zhou et al.，2012b；Zhou et al.，2012a)。卵巢癌患者全血样本中NOP14表达下调与预后不良相关(Isaksson et a1.，2014)。
NUDCD1编码含NUDC域1蛋白以及卵巢癌相关抗原66(OVA66)(RefSeq，2002)。在人类癌细胞中，NUDCD1通过调节I型胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)信号通路而影响肿瘤形成(Rao et al.，2014a)。NUDCD1诱导NIH3T3(小鼠胚胎成纤维细胞系)的致癌性转化(Raoet al.，2014b)。
PRIM1编码一种是小49kDa引发酶亚基的蛋白。引发酶和DNA聚合酶α是真核细胞中DNA复制的两个关键酶组分(RefSeq，2002)。PRIM1被发现在22个儿科骨肉瘤样本中扩增41％。PRIM1与核心12q13扩增子基因CDK4、SAS和OS9共同扩增，并被物理映射非常接近它们(Yotov et al.，1999)。SIX1在宫颈癌中表达上调导致与DNA复制启动相关的多个基因(包括PRIM1)表达上调(Liu et al.，2014)。
QTRTD1编码tRNA鸟嘌呤性转糖基酶亚基，其通过合成7-脱氮鸟嘌呤辫苷在tRNA修饰中起着关键作用。所编码的蛋白质可在辫苷5′-单磷酸补救途径中发挥作用(RefSeq，2002)。
SDAD1编码一种特征不良蛋白，其可能参与rRNA加工。SDAD1基因内的单核苷酸多态性显示出与季节性变应性鼻炎有关(Babbio et al.，2004；Zhang et al.，2005)。
TARBP1编码TAR(HIV-1)RNA结合蛋白1(一种双链RNA结合蛋白)，该蛋白可在转录延伸时从HIV-1 TAR中分离RNA聚合酶II(RefSeq，2002)。TARBP1表达被证明在皮肤基底细胞癌和鳞状上皮细胞癌中显著上调(Sand et al.，2012)。
VCPIP1(也称为VCIP135)和p47被证明可在高尔基体与ER组件中发挥功能(Uchiyama et al.，2002)。VCPIP1在乳腺癌中表达下调(Kuznetsova et al.，2007)。VCPIP1是一种去泛素酶，是卵巢肿瘤家族(OTU)成员之一(Enesa and Evans，2014)。
ZNF131编码锌指蛋白131(一种表征不佳转录调控因子)，该蛋白可能充当雌激素受体α的抑制蛋白(Oh and Chung，2012)。
本发明还涉及本发明的肽，其具有与主要组织兼容性复合体(MHC)I或II类分子结合的能力。
本发明进一步涉及本发明的肽，其中所述肽(每个)均系由或基本系由根据SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605组的一个氨基酸序列组成。
基本上由所指氨基酸序列组成的一种肽可能有一个或两个非锚定氨基酸(见下面锚基序相关内容)被交换，而不存在这种情况，即相比于未修饰的肽，与人类主要组织兼容性复合体(MHC)-I或II类分子的能力基本上被改变或受到不利影响。在另一种基本上由氨基酸序列组成的肽中，一个或两个氨基酸与其保守交换伙伴交换(见下文)，而不存在这种情况，即相比于未修饰的肽，与人类主要组织兼容性复合体(MHC)-I或II类分子的能力基本上被改变或受到不利影响。
本发明进一步涉及本发明的肽，其中所述肽被修饰和/或包含非肽键。
本发明进一步涉及本发明的肽，其中所述肽为融合蛋白的一部分，特别是与HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸融合，或与抗体(例如，树突状细胞特定抗体)或抗体的序列融合。
本发明进一步涉及一种核酸，其编码本发明的肽。
本发明进一步涉及一种本发明的核酸，为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能为其组合物。
本发明进一步涉及一种能表达或表达本发明核酸的表达载体。
本发明进一步涉及本发明的一种肽、本发明的一种核酸或本发明的一种药用表达载体。
本发明进一步涉及本发明的抗体以及制造抗体的方法。
本发明进一步涉及本发明的T细胞受体(TCR)，特别是可溶性TCR(sTCR)，以及制造它们的方法。
本发明进一步涉及含本发明核酸或前述表达载体的一种宿主细胞。
本发明进一步涉及为一种抗原提呈细胞的本发明宿主细胞。
本发明进一步涉及本发明的宿主细胞，其中抗原提呈细胞为树突细胞。
本发明进一步涉及配制本发明一种肽的一种方法，该方法包括培养本发明的宿主细胞和从宿主细胞或其培养基中分离肽。
本发明进一步涉及一种体外制备启动的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，该方法包括将CTL与载有抗原的人I或II类MHC分子进行体外连接，这些分子在合适的抗原提呈细胞表面表达足够的一段时间从而以抗原特异性方式启动CTL，其中所述抗原为本发明的任何一种肽。
本发明进一步涉及本发明中的方法，其中抗原通过与足够量的含抗原提呈细胞的抗原结合被载入表达于合适抗原提呈细胞表面的I或II类MHC分子。
本发明进一步涉及本发明的方法，其中抗原提呈细胞由能表达含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605所述肽的表达载体、或所述氨基酸序列组成。
本发明进一步涉及以本发明方法制备的启动细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，该淋巴细胞有选择性地识别一种细胞，该细胞异常表达含一种本发明氨基酸序列的多肽。
本发明进一步涉及一种杀伤患者靶细胞的方法，其中患者的靶细胞异常表达含本发明任何氨基酸序列的多肽，该方法包括给予患者本方法有效量的毒性T淋巴细胞(CTL)。
本发明进一步涉及任何所述肽、本发明的一种核酸、本发明的一种表达载体、本发明的一种细胞、本发明一种作为药剂或制造药剂的启动细胞毒性T淋巴细胞的用途。
本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中所述药剂为一种疫苗。
本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中药剂可有效抗癌。
本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中所述癌细胞为血液恶性肿瘤、AML或慢性淋巴性白血病(CLL)细胞。
本发明进一步涉及一种基于本发明肽的特定标志物蛋白和生物标志物，其可用于诊断和/或判断血液恶性肿瘤、AML或慢性淋巴性白血病(CLL)细胞，优选为AML。
此外，本发明涉及这些供癌症治疗使用的新靶点。
此外，本发明涉及一种使用预筛选肿瘤相关肽的存储库(数据库)制备个性化抗癌疫苗用于单个患者的方法。
是否能刺激免疫反应取决于是否存在被宿主免疫系统视为异物的抗原。发现肿瘤相关抗原的存在增加了运用宿主免疫系统干预肿瘤生长的可能性。目前，针对癌症免疫治疗，正在探索利用免疫系统的体液和细胞进行免疫的各种机制。
细胞免疫反应的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的细胞毒性T-细胞(CTL)表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。特别是CD8阳性T细胞在这种反应中发挥重要作用，TCD8+能识别通常8至10个源自蛋白或位于细胞质的缺损核糖体产物(DRIP)的氨基酸残基的主要组织兼容性复合体(MHC)所载的肽中所含的I类分子。人MHC分子也称为人白细胞抗原(HLA)。
MHC分子有两类：大部分有细胞核的细胞上都可发现的MHC-I类分子。MHC分子分别由一条α重链和β-2-微球蛋白(MHC-I类受体)或一条α和一条β链(MHC-II类受体)组成。其三维构造形成一个结合槽，用于与肽进行非共价相互作用。MHC-I类分子提呈主要为内源性的蛋白、DRIPS和较大肽裂解生成的肽。MHC II类分子主要发现于专业抗原提呈细胞(APC)上，并且主要提呈在内吞作用过程中由APC占据并且随后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。肽和MHC I类分子的复合体由负载相应TCR(T细胞受体)的CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞进行识别，而肽和MHC II类分子的复合体由负载相应TCR的CD4阳性辅助T细胞进行识别。因此，TCR、肽和MHC因此按照1∶1∶1的化学计量呈现，这一点已是共识。
CD4阳性辅助T细胞在诱导和维持CD8阳性细胞毒性T细胞的有效反应中发挥重要作用。肿瘤相关抗原(TAA)衍生的CD4阳性T细胞表位的识别对开发能引发抗肿瘤免疫反应的药物产品可能非常重要Gnjatic S，et al.Survey of naturally occurring CD4+ Tcell responses against NY-ESO-1 in cancer patients：correlation with antibodyresponses.Proc Natl Acad Sci U S A.2003Jul 22；100(15)：8862-7)。在肿瘤部位，T辅助细胞支持CTL友好型细胞因子环境(Mortara L，et al.CIITA-induced MHC class IIexpression in mammary adenocarcinoma leads to a Thl polarization of the tumormicroenvironment，tumor rejection，and specific antitumor memory.Clin CancerRes.2006Jun 1；12(11Pt 1)：3435-43)并吸引效应细胞，如CTL、NK细胞、巨噬细胞、粒细胞(Hwang ML，et al.Cognate memory CD4+ T cells generated with dendritic cellpriming influence the expansion，trafficking，and differentiation of secondaryCD8+ T cells and enhance tumor control.J Immunol.2007 Nov1；179(9)：5829-38)。
在没有炎症的情况下，MHC II类分子的表达主要局限于免疫系统细胞，尤其是专业抗原提呈细胞(APC)，例如，单核细胞、单核细胞源性细胞、巨噬细胞、树突状细胞。出人意料的是，在癌症患者的肿瘤细胞中发现有MHC II类分子的表达(Dengjel J，etal.Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renalcell carcinomas.Clin Cancer Res.2006Jul 15；12(14Pt 1)：4163-70)。
哺乳动物(如小鼠)模型显示，即使没有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应细胞(如，CD8阳性T淋巴细胞)，CD4阳性T细胞也能通过分泌干扰素-γ(IFNγ)阻止血管新生抑制肿瘤表现。
此外，研究还显示，由于CD4阳性T细胞可从由HLA II类分子提呈的肿瘤相关抗原中识别出肽，因此能够通过诱导抗体(Ab)反应而阻止肿瘤进展。
与结合至HLA I类分子的肿瘤相关肽相反，迄今只有少量的肿瘤相关抗原(TAA)的II类配体获得描述。
因为HLAII类分子的组成性表达通常仅限于免疫系统细胞，所以直接从原发性肿瘤中分离II类肽被认为是不可能的。然而，Dengjel等人成功地在肿瘤中直接识别了多个MHC II类表位(WO 2007/028574，EP 1 760 088 B1；(Dengjel et al.，2006)。
肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞所识别的抗原，即它们的表位，可以是源自所有蛋白类型的分子，如酶、受体、转录因子等，它们在相应肿瘤的细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达上调。
由于CD8依赖型和CD4依赖型这两种反应共同并协同地促进抗肿瘤作用，因此，确定和表征由CD8+ CTL(配体：MHC I类分子+肽表位)或CD4阳性T辅助细胞(配体：MHC II类分子+肽表位)识别的肿瘤相关抗原对开发肿瘤疫苗非常重要。
本发明还涉及两种很有用的新MHC-II类肽(根据SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605)。这些肽特别有利于诊断和/或治疗AML和其它过量表达和/或过度提呈抗原的癌症，其中所述抗原分别源自这些肽。
本发明还涉及本发明MHC-II类肽(根据SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605)所谓的长度变体。
长度变体一般为N-和/或C-末端延伸(1至5个氨基酸，优选为1至10个氨基酸)或N-和/或C-末端缩短(1至5个氨基酸)的肽，其中所述肽还可以与MHC结合，并且可引发本文所述的细胞免疫应答。本领域已知，与II类蛋白结合的肽大小不受限，长度可能为11-30个氨基酸。与MHC-II类分子槽结合的肽两端是开放的，从而使之可与相对较长的肽结合。虽然“核心”9残基长片段最有助于识别肽，但是侧翼区对于识别II类等位基因的肽特异性也很重要(例如：Meydan C，et al.，Prediction of peptides binding to MHC class I andII alleles by temporal motif mining.BMC Bioinformatics.2013；14 Suppl 2：S13)。使用很多种可用的软件工具(如上所述)，本领域技术人员可识别结合基序，从而识别延伸和/或删除表3中MHC-II类肽的可能性，以便建立长度变体。
对于触发(引发)细胞免疫反应的肽，它必须与MHC分子结合。这一过程依赖于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特异性多态性。MHC-I类-结合肽的长度通常为8-12个氨基酸残基，并且在其与MHC分子相应结合沟槽相互作用的序列中通常包含两个保守残基(“锚”)。这样，每个MHC的等位基因都有“结合基序”，从而确定哪些肽能与结合沟槽特异性结合。
在MHC-I类依赖性免疫反应中，肽不仅能与肿瘤细胞表达的某些MHC-I类分子结合，而且它们还必须能被T细胞特异性T细胞受体(TCR)识别。
肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞所识别的抗原，即它们的表位，可以是源自所有蛋白类型的分子，如酶、受体、转录因子等，它们在相应肿瘤的细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达上调。
目前将肿瘤相关肽分类为以下主要几组：
a)癌-睾丸抗原：T细胞能够识别的，最先确认的肿瘤相关抗原(TAA)属于这一类抗原。由于其成员表达于组织学相异的人肿瘤中、正常组织中、仅在睾丸的精母细胞/精原细胞中、偶尔在胎盘中，因此，它最初被称为癌-睾丸(CT)抗原。由于睾丸细胞不表达HLA I类和II类分子，所以，在正常组织中，这些抗原不能被T细胞识别，因此在免疫学上可考虑为具有肿瘤特异性。CT抗原大家熟知的例子是MAGE家族成员或NY-ESO-1。
b)分化抗原：肿瘤和正常组织(肿瘤源自该组织)都含有TAA，大多数TAA发现于黑色素瘤和正常黑色素细胞中。许多此类黑色素细胞谱系相关蛋白参与黑色素的生物合成，因此这些蛋白不具有肿瘤特异性，但是仍然被广泛用于癌症的免疫治疗。例子包括，但不仅限于，黑色素瘤的酪氨酸酶和Melan-A/MART-1或前列腺癌的PSA。
c)过量表达的TAA：在组织学相异的肿瘤中以及许多正常组织中都检测到了基因编码被广泛表达的TAA，一般表达水平较低。有可能许多由正常组织加工和潜在提呈的表位低于T细胞识别的阈值水平，而它们在肿瘤细胞中的过量表达能够通过打破先前确立的耐受性而引发抗癌反应。这类TAA的典型例子为Her-2/neu、生存素、端粒酶或WT1。
d)肿瘤特异性抗原：这些独特的TAA产生于正常基因(如β-catenin、CDK4等)的突变。这些分子变化中有一些与致瘤性转化和/或进展相关。肿瘤特异性抗原一般可在不对正常组织带来自体免疫反应风险的情况下诱导很强的免疫反应。另一方面，这些TAA在多数情况下只与其上确认了有TAA的确切肿瘤相关，并且通常在许多个体肿瘤之间并不都共享TAA。
e)由异常翻译后修饰产生的TAA：此类TAA可能由肿瘤中既不具有特异性也不过量表达的蛋白产生，但其仍然具有肿瘤相关性(该相关性由主要对肿瘤具有活性的翻译后加工所致)。此类TAA产生于变糖基化模式的改变，导致肿瘤产生针对MUC1的新型表位或在降解过程中导致诸如蛋白拼接的事件，这可能具有也可能不具有肿瘤特异性。
f)肿瘤病毒蛋白：这些TTA是病毒蛋白，可在致癌过程中发挥关键作用，并且由于它们是外源蛋白(非人源蛋白)，所以能够激发T细胞反应。这类蛋白的例子有人乳头状瘤16型病毒蛋白、E6和E7，它们在宫颈癌中表达。
对于被细胞毒性T淋巴细胞识别为肿瘤特异性抗原或相关性抗原以及用于治疗的蛋白质，必须具备特殊的条件。该抗原应主要由肿瘤细胞表达，而不由正常健康组织表达，或表达数量相对较少；或在另一优选实施方案中，与正常健康组织相比，肿瘤细胞应该过度提呈肽。更为适宜的情况是，该相应抗原不仅出现于一种肿瘤中，而且浓度(即每个细胞的相应肽拷贝数目)高。肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原往往是源自直接参与因细胞周期控制或凋亡抑制中的一项功能而发生的正常细胞向肿瘤细胞转化的蛋白。另外，这些直接导致转化事件的蛋白的下游靶标可能会被上调，因此可能与肿瘤间接相关。这些间接肿瘤相关抗原也可能是预防接种方法的靶标(Singh-Jasuia etal.The Tübingen approach：identification，selection，and validation of tumor-associated HLA peptides forcancer therapy.Cancer Immunol Immunother.2004Mar；53(3)：187-95)。在这两种情况中，至关重要的是，都要存在抗原氨基酸序列的表位，所以这种来自肿瘤相关抗原的肽(“免疫原性肽”)可导致体外或体内T细胞反应。
基本上，任何能与MHC分子结合的肽都可能充当一个T细胞表位。诱导体外或体内T细胞反应的前提是存在具有相应TCR的T细胞并且不存在对该特定表位的免疫耐受性。
因此，TAA是肿瘤疫苗研制的起点。识别和表征TAA的方法基于对患者或健康受试者CTL的使用情况，或基于肿瘤与正常组织肽之间差别转录特性或差别表达模式的产生。
然而，对肿瘤组织或人肿瘤细胞株中过量表达或选择性表达的基因的识别并不提供在免疫疗法中使用这些基因所转录抗原的准确信息。这是因为，有着相应TCR的T细胞必须要存在而且对这个特定表位的免疫耐受性必须不存在或为最低水平，因此，这些抗原的表位只有一部分适合这种应用。因此，在本发明的一非常优选的实施例中，只选择那些针对可发现功能性和/或增殖性T细胞情况的过量提呈或选择性提呈肽，这一点非常重要。这种功能性T细胞被定义为在以特异性抗原刺激后能够克隆地扩展并能够执行效应子功能(“效应子T细胞”)的T细胞。
在本发明的TCR和抗体下，潜在肽的免疫原性是次要的。对于本发明的TCR和抗体，提呈是决定性因素。
辅助T细胞在编排抗肿瘤免疫的CTL效应子功能中发挥着重要作用。触发TH1细胞反应的辅助T细胞表位支持CD8阳性杀伤T细胞的效应子功能，其中包括直接作用于肿瘤细胞的细胞毒性功能(该类肿瘤细胞表面显示有肿瘤相关肽/MHC复合体)。这样，肿瘤相关T辅助细胞表位单独使用或与其它肿瘤相关肽结合使用可作为刺激抗肿瘤免疫反应的疫苗化合物的活性药物成分。
有关医治其它癌症的用途在本发明肽的以下更详细描述中进行披露。
发明的详细说明
除非另有说明，否则本文使用的所有术语定义如下。
本文所用“肽”这一术语，系指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。这些肽的长度优选为9个氨基酸，但至短可为8个氨基酸长度，至长可为10、11、12、13或14个氨基酸长度，如果为MHC-II类肽时，至长可为15、16、17、18、19或20个氨基酸长度。
除此之外，“肽”这一术语应包括一系列氨基酸残基的盐，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。优选的情况是，盐为肽的药用盐，例如：氯化物或乙酸(三氟乙酸)盐。
术语“肽”应包括“寡肽”。本文使用的术语“寡肽”是指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。寡肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要在寡肽中保持正确的表位即可。通常，寡肽长度约小于30个氨基酸残基，约长于15个氨基酸。
“本发明的肽”这一术语包括的肽应由根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ IDNO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605的如上定义的一个肽组成。
“多肽”这一术语是指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。多肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要保持正确的表位即可。与术语肽或寡肽相对，多肽摂这一术语是指包含多于约30个氨基酸残基的分子。
一种肽、寡肽、蛋白质或编码该分子的核苷酸如果能诱导免疫反应，则具有“免疫原性”(因此是本发明中的一种“免疫原”)。在本发明的情况下，免疫原性的更具体定义是诱导T细胞反应的能力。因此，“免疫原”是一种能够诱导免疫反应的分子，并且在本发明的情况下，是一种能诱导T细胞反应的分子。在另一方面，所述免疫原可以是肽，肽与MHC的复合物、和/或用于提高特异性抗体或TCR抗性的蛋白。
I类T细胞“表位”要求的是一种结合至MHC I类受体上的短肽，从而形成一种三元复合体(MHC I类α链、β-2-微球蛋白和肽)，他可以通过T细胞负载匹配T细胞受体与具有适当亲和力的MHC/肽复合物结合来识别。结合至MHC I类分子的肽的典型长度为8-14个氨基酸，最典型为9个氨基酸长度。
在人类中，有三种编码MHC I类分子的不同基因位点(人MHC分子也是指定的人白细胞抗原(HLA))：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02和HLA-B*07是可从这些基因位点表达的不同MHC I类等位基因的实例。
表6：HLA*A02和最常见HLA-DR血清类型的表达频率F。频率根据Mori等人(Mori M，et al.HLA gene and haplotype frequencies in the North American population：theNational Marrow Donor Program Donor Registry.Transplantation.1997Oct 15；64(7)：1017-27)使用Hardy-Weinberg公式F=i-(1-Gf)2，从美国人群范围内的单体型频率Gf中推导出。由于连锁不平衡，某些HLA-DR等位基因内的A*02组合与其预期单一频率相比，可能是浓缩的或频率较低。有关详细信息，请参阅Chanock等人的文献(S.J.Chanock，et al(2004)HLA-A，-B，-Cw，-DQA1 and DRB1 in an African American population fromBethesda，USA Human Immunology，65：1223-1235)。
因此，为了治疗和诊断目的，与数种不同的HLA II类受体以合适的亲和力结合的肽是非常理想的。与数种不同的HLAII类分子结合的肽被称为混杂结合剂。
本文提到的DNA序列既包括单链DNA也包括双链DNA。因此，除非本文另有所指，否则具体的序列是该序列的单链DNA、该序列与其互补序列的双工(双链DNA)以及该序列的互补序列。“编码区”这一术语是指在基因的天然基因组环境中天然或正常编码该基因的表达产物的那部分基因，即，体内编码该基因的天然表达产物的区域。
编码区可来自非突变(“正常”)基因、突变基因或异常基因，甚至还可以来自DNA序列，完全可在实验室中使用本领域熟知的DNA合成方法合成。
术语“核苷酸序列”系指脱氧核苷酸的杂聚物。
编码特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可为天然核苷酸序列，也可为合成核苷酸序列。一般来说，编码肽、多肽以及本发明蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸衔接物，或一系列寡核苷酸组成，以提供一种合成基因，该基因能够在包含源自微生物或病毒操纵子的调节元素的重组转录单元中被表达。
如本文所用的术语“肽的核苷酸编码”系指对肽进行核苷酸序列编码，其中该肽包括与将要表达该序列的生物系统兼容的人工(人造)启动和停止密码子。
“表达产物”这一术语是指多肽或蛋白，它是基因和遗传码退化并因而编码同样的氨基酸所造成的任何核酸序列编码同等物的翻译产物。
“片断”这一术语，当指的是一种编码序列时，表示包含非完整编码区的DNA的一部分，其表达产物与完整编码区表达产物基本上具有相同的生物学功能或活性。
“DNA片段”这一术语是指一种DNA聚合物，以单独的片段形式或一种较大DNA结构的组分形式存在，它们从至少分离过一次的DNA中以基本纯净的形式获得，即不含污染性内源性材料，并且获得的数量或浓度能够使用标准生化方法，例如使用克隆载体，进行识别、操纵和回收该片段及其组分核苷酸序列。此类片段以开放阅读框架(未被内部未翻译序列打断)或内含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。未翻译DNA序列可能存在于开放阅读框架的下游，在那里它不会干预编码区的操纵或表达。
“引物”这一术语表示一种短核酸序列，其可与一个DNA链配对，并在DNA聚合酶开始合成脱氧核糖核酸链之处提供一个游离的3′-OH末端。
“启动子”这一术语表示参与RNA聚合酶的结合从而启动转录的DNA区域。
术语“分离”表示一种物质从其原来的环境(例如，如果是天然发生的则是天然环境)中被移走。例如，活体动物中的天然核苷酸或多肽不是分离的，但是，从天然系统中一些或所有共存物质中分离出来的核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可能是载体的一部分和/或此类多核苷酸和多肽可能是一种组合物的一部分，并且由于该载体或组合物不是其天然环境的一部分，因此它仍然是分离的。
本发明中披露的多核苷酸和重组或免疫原性多肽也可能以“纯化”的形式存在。术语“纯化”并非要求绝对的纯度；它只是一个相对的定义，可以包括高度纯化或部分纯化的制剂，相关领域技术人员能理解这些术语。例如，各个从已用传统方法纯化为具有电泳同构型的cDNA库中分离出的各种克隆物。明确考虑到将起始材料或天然物质纯化至少一个数量级，优选为两或三个数量级，更优选为四或五个数量级。此外，明确考虑到所述多肽的纯度优选为99.999％，或至少为99.99％或99.9％；甚而适宜为以重量计99％或更高。
根据本发明公开的核酸和多肽表达产物，以及包含此类核酸和/或多肽的表达载体可能以“浓缩的形式”存在。本文使用的术语“浓缩”是指材料的浓度至少是其自然浓度的大约2、5、10、100或1000倍，有优势的是，按重量计为0.01％，优选为至少0.1％。也明确考虑到，按重量计约为0.5％、1％、5％、10％和20％的浓缩制剂。序列、构型、载体、克隆物以及包含本发明的其它材料可有优势地以浓缩或分离的形式存在。
“活性片段”这一术语是指产生免疫反应的片段(即具有免疫原性活性)，不论是单独或可选地与合适的佐剂一起给予一种动物，比如哺乳动物，例如兔子或小鼠，也包括人；这种免疫反应采用的形式是在接受动物(如：人)体内刺激T细胞反应。或者，“活性片段”也可用于诱导体外T细胞反应。
本文使用的“部分”(portion)、“节段”(segment)、“片段”(fragment)这几个术语，当与多肽相关地使用时是指残基的连续序列，比如氨基酸残基，其序列形成一个较大序列的子集。例如，如果一个多肽以任一种肽链内切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)进行处理，则该处理获得的寡肽会代表起始多肽的部分、节段或片段。当与多核苷酸相关地使用时，这些术语系指用任何核酸内切酶处理所述多核苷酸产生的产物。
根据本发明，术语“等同度百分比”或“等同百分比”，如果指的是序列，则表示在待对比序列(“被对比序列”)与所述序列或权利要求的序列(“参考序列”)对准之后将被对比序列与所述序列或权利要求的序列进行比较。然后根据下列公式计算等同度百分比：
等同度百分比=100[1-(C/R)]
其中C是参考序列与被对比序列之间对准长度上参考序列与被对比序列之间的差异数量，其中
(i)参考序列中每个碱基或氨基酸序列在被对比序列中没有对应的对准碱基或氨基酸；
(ii)参考序列中每个空隙，以及
(iii)参考序列中每个对准碱基或氨基酸与被比对比序列中对准碱基或氨基酸不同，即构成一个差异以及
(iiii)必须在对准序列的第1位置开始对准；
并且R是参考序列与被对比序列对准长度上在参考序列中产生任何空隙也计算为一个碱基或氨基酸的参考序列中的碱基或氨基酸数目。
如果“被对比序列”和“参考序列”之间存在的一个对准按上述计算的等同度百分比大致等于或大于指定的最低等同度百分比，则被对比序列与参考序列具有指定的最低等同度百分比，虽然可能存在按本文上述计算的等同度百分比低于指定等同度百分比的对准。
如果无另有说明，那么本文公开的原始(未修饰)肽可以通过在肽链内的不同(可能为选择性)位点上取代一个或多个残基而被修饰。优选情况时，这些取代位于氨基酸链的末端。此取代可能是保守性的，例如，其中一个氨基酸被具有类似结构和特点的另一个氨基酸所取代，比如其中一个疏水性氨基酸被另一个疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或类似的大小和化学性质的氨基酸间的取代，例如，亮氨酸被异亮氨酸取代。在天然同源蛋白质家族序列变异的研究中，某些氨基酸的取代往往比其它氨基酸更具有耐受性，这些氨基酸往往表现出它们与原氨基酸的大小、电荷、极性和疏水性的相似性相关，这是确定“保守取代”的基础。
在本文中，保守取代定义为在以下五种基团之一的内部进行交换：基团1-小脂肪族、非极性或略具极性的残基(Ala，Ser，Thr，Pro，Gly)；基团2-极性、带负电荷的残基及其酰胺(Asp，Asn，Glu，Gln)；基团3-极性、带正电荷的残基(His，Arg，Lys)；基团4-大脂肪族非极性残基(Met，Leu，Ile，Val，Cys)以及基团5-大芳香残基(Phe，Tyr，Trp)。
较不保守的取代可能涉及一个氨基酸被另一个具有类似特点但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如：丙氨酸被异亮氨酸残基取代。高度不保守的取代可能涉及一个酸性氨基酸被另一个具有极性或甚至具有碱性性质的氨基酸所取代。然而，这种“激进”取代不能认为是无效的而不予考虑，因为化学作用是不完全可预测的，激进的取代可能会带来其简单化学原理中无法预见的偶然效果。
当然，这种取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其它结构。因此，D-氨基酸可能被本发明的抗原肽中常见的L-氨基酸取代，也仍在本公开的范围之内。此外，具有非标准R基团的氨基酸(即，除了天然蛋白的20个常见氨基酸之外的R基团)也可以用于取代之目的，以生产根据本发明的免疫原和免疫原性多肽。
如果在一个以上位置上的取代发现导致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定义值，则对这些取代的组合进行测试，以确定组合的取代是否产生对肽抗原性的迭加或协同效应。肽内被同时取代的位置最多不能超过4个。
本发明的肽可被拉长多达四个氨基酸，即1、2、3或4个氨基酸，可按照4∶0与0∶4之间的任何组合添加至任意一端。
本发明的拉长组合情况如下面的表7所示：
C-端 N-端
4 0
3 0或1
2 0或1或2
1 0或1或2或3
0 0或1或2或3或4
N-端 C-端
4 0
3 0或1
2 0或1或2
1 0或1或2或3
0 0或1或2或3或4
拉仲的氨基酸可以是所述蛋白或任何其它氨基酸的原序列肽。拉长可用于增强所述肽的稳定性或溶解性。
术语“T细胞反应”是指由一种肽在体外或体内诱导的效应子功能的特异性扩散和启动。对于MHC I类限制性CTL，效应子功能可能为溶解肽脉冲的、肽前体脉冲的或天然肽提呈的靶细胞、分泌细胞因子，优选为肽诱导的干扰素-γ，TNF-α或IL-2，分泌效应分子，优选为肽诱导的颗粒酶或穿孔素，或脱颗粒。
优选情况是，当本发明的肽特异性CTL相比于取代肽受到检测时，如果取代肽在相对于背景肽溶解度增加达到最大值的一半，则该肽浓度不超过约1mM，优选为不超过约1μM，更优选为不超过约1nM，再优选为不超过约100pM，最优选为不超过约10pM。其它也被优选的是，取代肽被一个以上的CTL识别，最少为2个，更优选为3个。
因此，本发明所述的表位可能与天然肿瘤相关表位或肿瘤特异性表位相同，也可能包括来自参考肽的不超过4个残基的不同肽，只要它们有基本相同的抗原活性即可。
是否能刺激免疫反应取决于是否存在被宿主免疫系统视为异物的抗原。发现肿瘤相关抗原的提呈增加了运用宿主免疫系统干预肿瘤生长的可能性。对于癌症免疫疗法，目前正在探索控制免疫系统中的体液和细胞免疫的各种机制。
细胞免疫反应的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的细胞毒性T-细胞(CTL)表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。特别是CD8阳性T细胞在这种反应中发挥重要作用，他能识别通常8至12个源自蛋白或位于细胞质的缺损核糖体产物(DRIP)的氨基酸残基的主要组织兼容性复合体(MHC)所载的肽中所含的I类分子。人MHC分子也称为人白细胞抗原(HLA)。
MHC-I类分子，在细胞核提呈因主要内源性、细胞质或细胞核蛋白质、DRIPS和较大肽蛋白裂解产生的肽的细胞上都能发现此类分子。然而，源自内体结构或外源性来源的肽也经常在MHC-I类分子上发现。这种I-类分子非经典提呈方式在文献中被称为交叉提呈。
由于CD8及CD4依赖型反应共同和协同促进抗肿瘤作用，因此，CD8阳性CTL(MHC-I分子)或CD4阳性CTL(MHC-II类分子)对肿瘤相关抗原的识别和鉴定对开发肿瘤疫苗非常重要。因此，提出含有与任一类MHC复合体结合的肽组合物是本发明的一个目标。
考虑到治疗癌症相关的严重副作用和费用，迫切需要更好的预后和诊断方法。因此，通常有必要确定代表癌症生物标志物的其它因子，尤其是肺癌。此外，有必要确定可用于治疗癌症的因子，尤其是AML。
本发明提出了可用于治疗癌症/肿瘤，优选为肺癌，更优选为AML和其它癌症(见表5)，这些癌症过量或专门提呈本发明的肽。这些肽由质谱分析法直接显示出，而由HLA分子自然提呈于人原发性人AML样本中。
与正常组织相比，肿瘤组织中高度过量表达肽来源的源基因/蛋白质(也指定为“全长蛋白”或“潜在蛋白”)(见AML的实施例1和图2)，这表明肿瘤与这些源基因的高度关联性。此外，这些肽本身也在肿瘤组织中大量提呈，但不在正常组织中提呈(见实施例1和图3)。
HLA结合肽能够被免疫系统识别，特别是T淋巴细胞/T细胞。T细胞可破坏提呈被识别HLA/肽复合体的细胞(如：提呈衍生肽的肺癌细胞)。
本发明的所有肽已被证明具有刺激T细胞反应的能力，并过量提呈，因而可用于制备本发明的抗体和/或TCR，特别是sTCR(参见实施例1和图4)。此外，肽与相应的MHC组合时，也可用于制备本发明的抗体和/或TCR，特别是sTCR。各个方法均为技术人员所熟知，并在各个文献中可找到。因此，本发明的肽可用于在患者中产生免疫反应，从而能够毁灭肿瘤细胞。患者的免疫反应能够通过直接给予患者所述肽或前体物质(如，加长肽、蛋白或编码这些肽的核酸)，较理想是与加强免疫原性的制剂相结合，而进行诱导。源自该治疗性疫苗的免疫反应预期能够高度特异性地对抗肿瘤细胞，因为本发明的目标肽在正常组织上提呈的复制数目较少，防止患者发生对抗正常细胞的不良自体免疫反应的风险。
药品组合物包括游离形式或以一种药用盐形式存在的肽(也参见上文)。此处使用的“药用盐”系指所公开的肽的一种衍生物，其中该肽由制造药剂的酸或碱盐进行改性。例如，用与适合的酸反应的游离碱(通常其中的中性药物有一个中性-NH2基团)制备酸式盐。适合制备酸盐的酸包括有机酸，如：乙酸、丙酸、羟基酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水杨酸等等、以及无机酸，如：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一种肽上提呈的酸性基团的碱盐制剂使用药用碱基进行制备，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等等。
在特别优选的实施例中，药物组合物包括乙酸(醋酸盐)，三氟乙酸盐或盐酸(氯化物)形式的肽。
本发明的肽除了用于治疗癌症，也可用于诊断。由于肽由肺癌细胞产生，并且已确定这些肽在正常组织中不存在或水平较低，因此这些肽可用于诊断癌症是否存在。
组织切片中含权利要求的肽，可有助于病理师诊断癌症。用抗体、质谱或其它本领域内已知的方法检测某些肽可使病理师判断该组织为恶性的、炎症还是一般病变。肽基团的提呈使得能对病变组织进行分类或进一步分成子类。
对病变标本中肽的检测使得能对免疫系统治疗方法的利益进行判断，特别是如果T-淋巴细胞已知或预计与作用机制有关。MHC表达的缺失是一种机制，充分说明了哪些受感染的恶性细胞逃避了免疫监视。因此，肽的提呈表明，分析过的细胞并没有利用这种机制。
本发明的肽可用于分析淋巴细胞对肽的反应(如T细胞反应)，或抗体对肽或MHC分子络合的肽发生的反应。这些淋巴细胞反应可以作为预后指标，决定是否采取进一步的治疗。这些反应也可以用作免疫疗法中的替代指标，旨在以不同方式诱导淋巴细胞反应，如接种蛋白疫苗、核酸、自体材料、淋巴细胞过继转移。基因治疗中，淋巴细胞对肽发生的反应可以在副作用的评估中考虑。淋巴细胞反应监测也可能成为移植疗法随访检查中的一种有价值的工具，如，用于检测移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。
本发明中的肽可用于生成和开发出针对MHC/肽复合物的特定抗体。这些抗体可用于治疗，将毒素或放射性物质靶向病变组织。这些抗体的另一用途是为了成像之目的(如PET)将放射性核素靶向病变组织。这可有助于检测小转移灶或确定病变组织的大小和准确位置。
因此，本发明的另一方面是提出产生特异性结合至与HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织兼容性复合体(MHC)的一种重组抗体的方法，该方法包括：用可溶形式的与HLA限制性抗原络合的(MHC)I或II类分子对包含表达所述主要组织兼容性说复合体(MHC)I或II类的基因工程非人哺乳动物进行免疫；将mRNA分子与产生所述非人哺乳动物细胞的抗体分离；产生一个噬菌体显示库，显示由所述mRNA分子编码的蛋白分子；以及将至少一个噬菌体与所述噬菌体显示库分离，所述的至少一个噬菌体显示所述抗体特异性地结合至与HLA限制性抗原络合的所述人主要组织兼容性说复合体(MHC)I或II类。
本发明的另一方面提出一种抗体，其特异性结合至与一种HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织兼容性说复合体(MHC)，其中该抗体优选为多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体和/或嵌合抗体。
此外，本发明的另一个方面涉及产生特异性结合至与HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织兼容性复合体(MHC)的一种抗体的方法，该方法包括：用可溶形式的与HLA限制性抗原络合的(MHC)I或II类分子对包含表达所述主要组织兼容性说复合体(MHC)I或II类的基因工程非人哺乳动物进行免疫；将mRNA分子与产生所述非人哺乳动物细胞的抗体分离；产生一个噬菌体显示库，显示由所述mRNA分子编码的蛋白分子；以及将至少一个噬菌体与所述噬菌体显示库分离，所述的至少一个噬菌体显示所述抗体可特异性地结合至与HLA限制性抗原络合的所述人主要组织兼容性说复合体(MHC)I或II类。产生这种抗体和单链I类主要组织兼容性复合物的相应方法，以及产生这些抗体的其它工具在WO 03/068201、WO2004/084798、WO 01/72768、WO 03/070752以及Cohen CJ，et al.Recombinant antibodieswith MHC-restricted，peptide-specific，T-cell receptor-like specificity：newtools to study antigen presentation and TCR-peptide-MHC interactions.J MolRecognit.2003 Sep-Oct；16(5)：324-32.；Denkberg G，et al.Selective targeting ofmelanoma and APCs using a recombinant antibody with TCR-like specificitydirected toward a melanoma differentiation antigen.J Immunol.2003 Sep1；171(5)：2197-207；以及Cohen CJ，et al.Direct phenotypic analysis of human MHC classI antigen presentation：visualization，quantitation，and in situ detection ofhuman viral epitopes using peptide-specific，MHC-restricted human recombinantantibodies.J Immunol.2003 Apr15；170(8)：4349-61中进行了披露，为了本发明之目的，所有参考文献通过引用被完整地并入本文。
优选地，该抗体与复合体的结合亲和力低于20纳摩尔，优选为低于10纳摩尔，这在本发明情况下被视为具有“特异性”。
本发明的另一方面提出了制备识别特异性肽-MHC复合物的可溶性T细胞受体的一种方法。这种可溶性T细胞受体可从特异性T细胞克隆中产生，并且它们的亲和力可以通过互补决定区靶向诱变而增加。为了T细胞受体选择之目的，可以使用噬菌体展示(美国2010/0113300，Liddy N，et al.Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing.Nat Med2012Jun；18(6)：980-987)。为了在噬菌体展示期间以及实际使用为药物时稳定T细胞受体之目的，可通过非天然二硫键、其它共价键(单链T细胞受体)或通过二聚化结构域连接α和β链(参见Boulter JM，et al.Stable，soluble T-cell receptor molecules forcrystallization and therapeutics.Protein Eng 2003Sep；16(9)：707-711.；Card KF，et al.A soluble single-chain T-cell receptor IL-2 fusion protein retains MHC-restricted peptide specificity and IL-2bioactivity.Cancer Immunol Immunother2004 Apr；53(4)：345-357；以及Willcox BE.et al.Production of soluble alphabetaT-cell receptor heterodimers suitable for biophysical analysis of ligandbinding.Protein Sci 1999 Nov；8(11)：2418-2423)。T细胞受体可以连接到毒素、药物、细胞因子(参见US 2013/0115191)、域招募效应细胞，如抗CD3域等，以便对靶细胞执行特定的功能。此外，它可能表达于用于过继转移的T细胞。
进一步的信息可在WO 2004/033685A1和WO 2004/074322A1中找到。sTCR的组合在WO 2012/056407A1中进行了描述。WO 2013/057586A1中公开了制备的进一步的方法。
此外，可用这些TUMAP在活检样本的基础上验证病理师对癌症的诊断。
为了选择过度提呈的肽，计算了提呈图，其显示样本中位提呈量以及复制变化。该特点使相关肿瘤实体的样本与正常组织样本的基线值并列。通过计算调节线性混合效应模型(J.Pinheiro，et al.The nlme Package：Linear and Nonlinear Mixed EffectsModels.2007)的p值可以将以上每个特点并入过度提呈分数中，从而通过假发现率调整多项检验(Y.Benjamini and Y.Hochberg.Controlling the False Discovery Rate：APractical and Powerful Approach to Multiple Testing.Journal of the RoyalStatistical Society.Series B(Methodological)，Vol.57(No.1)：289-300，1995)。
对于通过质谱法对HLA配体的识别和相对定量，对来自冲击冷冻组织样本的HLA分子进行纯化并对HLA相关肽进行分离。分离的肽分开，并通过在线纳米-电喷雾-电离(nanoESI)液相色谱-质谱(LC-MS)实验进行鉴定。由此产生的肽序列的验证方法是，将AML样本中记录的天然TUMAP的片段模式与相同序列相应合成参考肽的片段模式进行比较。由于这些肽被直接鉴定为原发性肿瘤HLA分子的配体，因此这些结果为获得自AML患者的原发性肿瘤组织上确定肽的天然加工和提呈提供了直接证据。
发现管道v2.1(例如，参见US 2013-0096016，并在此通过引用将其整体并入本文)考虑到识别和选择相关过量提呈的候选肽疫苗，这基于与几种不同的非癌组织和器官相比癌症或其它受感染组织的HLA限制肽水平直接相对定量结果。这通过以下方法实现：使用专有数据分析管道处理的LC-MS采集数据、结合序列识别算法、谱聚类、计算离子、保留时间调整、充电状态反卷积以及正态化而开发无标记差异化定量方法。
为每种肽和样本确立了提呈水平，包括误差估计值。肿瘤组织大量提呈的肽以及肿瘤与非肿瘤组织和器官中过量提呈的肽已经得到确定。
在本发明中，对来自50份冲击冷冻AML肿瘤组织样本的HLA肽复合物进行纯化，并且对HLA相关肽使用LC-MS进行分离和分析(见实施例)。本申请中包含的所有TUMAP使用原发性AML肿瘤样本的方法进行鉴定，确认其在原发性AML上的提呈。
在多个AML肿瘤和正常组织上确定的TUMAP用无标记LC-MS数据的离子计数方法进行量化。该方法假定肽的LC-MS信号区域与样本中其丰度相关。各种LC-MS实验中肽的所有量化信号在集中趋势基础上进行正常化，根据每个样品进行平均，并合并入柱状图(被称为提呈图)。提呈图整合了不同分析方法，如：蛋白数据库检索、谱聚类、充电状态反卷积(除电)和保留时间校准和正态化。
因此，本发明涉及一种肽，包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605的组的一个序列、或与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605具有至少90％同源(优选为相同)的一种变体、或诱导与所述肽发生T细胞交叉反应的一种变体，其中所述肽不是全长多肽。
本发明进一步涉及一种肽，包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605的组的一个序列、或与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605具有至少90％同源(优选为相同)的一种变体，其中该肽或变体的总长度为8至100个氨基酸，优选为8至30个氨基酸，最优选为8至14个氨基酸。
本发明进一步涉及本发明的肽，它具有与主要组织兼容性复合体(MHC)I或II类分子结合的能力。
本发明进一步涉及本发明的肽，其中该肽系由或基本系由根据SEQ ID NO：1至SEQID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605的一个氨基酸序列组成。
本发明进一步涉及本发明的肽，其中该肽(在化学上)被修饰和/或包含非肽键。
本发明进一步涉及本发明的肽，其中该肽为融合蛋白的一部分，特别包括HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸，或其中该肽与一种抗体(例如，树突状细胞特定抗体)融合。
本发明进一步涉及一种核酸，其编码本发明所述肽，前提是该肽并非完整的人蛋白。
本发明进一步涉及一种本发明的核酸，为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能为其组合物。
本发明进一步涉及一种能表达本发明核酸的表达载体。
本发明进一步涉及本发明的一种肽、本发明的一种核酸或本发明的一种药用表达载体。
本发明进一步涉及含本发明核酸或本发明表达载体的一种宿主细胞。
本发明进一步涉及为一种抗原提呈细胞的本发明宿主细胞。
本发明进一步涉及本发明的宿主细胞，其中抗原提呈细胞为树突细胞。
本发明进一步涉及配制一种本发明肽的一种方法，该方法包括培养所述宿主细胞和从宿主细胞或其培养基中分离肽。
本发明进一步涉及一种体外制备启动的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，该方法包括将CTL与载有抗原的人I或II类MHC分子进行体外连接，这些分子在合适的抗原提呈细胞表面表达足够的一段时间从而以抗原特异性方式启动CTL，其中所述抗原为本发明的任何一种肽。
本发明进一步涉及所述方法，其中所述抗原通过与足够量的含抗原提呈细胞的抗原结合被载入表达于合适抗原提呈细胞表面的I或II类MHC分子。
本发明进一步涉及本发明的方法，其中抗原提呈细胞由能表达含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605所述肽的表达载体、或所述氨基酸序列组成。
本发明进一步涉及以本发明中方法制备的启动细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，该淋巴细胞有选择性地识别一种细胞，该细胞异常表达含一种所述氨基酸序列的多肽。
本发明进一步涉及一种杀伤患者靶细胞的方法，其中患者的靶细胞异常表达含本发明任何氨基酸序列的多肽，该方法包括给予患者本方法有效量的毒性T淋巴细胞(CTL)。
本发明进一步涉及本发明的任何肽、本发明的一种核酸、本发明的一种表达载体、本发明的一种细胞、或本发明一种作为药剂或制造药剂的启动细胞毒性T淋巴细胞的用途。
本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中该药剂为一种疫苗。
本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中药剂可有效抗癌。
本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中所述癌细胞为AML细胞或其它非实体肿瘤细胞。
本发明进一步涉及可用作肺癌预后的特殊标志物蛋白和生物标志物。
此外，本发明涉及按本发明所述使用新型靶点来进行癌症治疗。
本文中术语“抗体”为广义上的定义，既包括多克隆也包括单克隆抗体。除了完整或“全部”的免疫球蛋白分子，“抗体”这一术语还包括这些免疫球蛋白分子和人源化免疫球蛋白分子的片段或聚合物，只要它们表现出本发明的任何期望属性(例如，肺癌标志物多肽的特异性结合、将毒素传递给肺癌标志物基因表达水平增加时的肺癌细胞和/或肺癌标志物多肽的活性)。
只要有可能，本发明的抗体可从商业来源购买。本发明的抗体也可能使用已知的方法制得。技术人员会了解全长肺癌标志物多肽或其片段可用于制备本发明的抗体。用于产生本发明抗体的多肽可部分或全部地由天然源经纯化而得，也可利用重组DNA技术生产。
例如，本发明的编码肽的cDNA，例如，该肽为根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605多肽的肽，或其中一个变体或片段，可在原核细胞中(如：细菌)或真核细胞(如：酵母、昆虫或哺乳动物细胞)中表达，之后，可纯化重组蛋白，并用于产生一种特异性结合用于产生本发明抗体的肺癌标志物多肽的单克隆或多克隆抗体制剂。
本领域的技术人员会认识到，两种或两种以上不同集合的单克隆抗体或多克隆抗体能最大限度地增加获得一种含预期用途所需的特异性和亲和力(例如，ELISA法、免疫组织化学、体内成像、免疫毒素疗法)的抗体的可能性。根据抗体的用途，用已知的方法对其期望活性进行测试(例如，ELISA法、免疫组织化学、免疫治疗等；要获取产生和测试抗体的进一步指导，请参阅，例如，Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988，new 2nd edition2013)。例如，该抗体可用ELISA法、免疫印迹法、免疫组织化学染色福尔马林固定的肺癌样本或冰冻的组织切片进行检测。在初次体外表征后，用于治疗或体内诊断用途的抗体根据已知的临床测试方法进行检测。
此处使用的术语“单克隆抗体”系指从大量同质抗体中获得的一种抗体，即，由相同的抗体组成的抗体群，但可能少量提呈的自然突变除外。此处所述的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与从特定物种中获得的抗体或属于特定抗体类型和分类型抗体的相应序列相同(同质)，同时，剩余链与从其它物种中获得的抗体或属于特定抗体类型和子类型抗体的相应序列以及这些抗体的片段相同(同质)，只要它们表现出预期的拮抗活性(美国4816567号专利，其在此以其整体并入)。
本发明的单克隆抗体可能使用杂交瘤方法制得。在杂交瘤方法中，老鼠或其它适当的宿主动物，通常用免疫制剂以引发产生或能产生将特异性结合至免疫制剂的抗体。或者，淋巴细胞可在体外进行免疫。
单克隆抗体也可由DNA重组方法制得，如：美国4816567号专利所述。编码本发明单克隆抗体的DNA可很容易地使用传统程序进行分离和测序(例如：通过使用能与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
体外方法也适用于制备单价抗体。抗体消化以产生抗体的片段，尤其是Fab片段，可以通过使用本领域已知的常规技术完成。例如，可以通过使用木瓜蛋白酶完成消化。木瓜蛋白酶消化的实施例在WO 94/29348和美国4342566号专利中有描述。抗体的木瓜蛋白酶消化通常产生两种相同的抗原结合性片段，称为Fab片段(每个片段都有一个抗原结合点)和残余Fc片段。胃蛋白酶处理产生aF(ab′)2片段和pFc′片段。
抗体片段，不论其是否附着于其它序列，均可包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、删除、替换、或其它选择性修饰，但前提是，片段的活性与非修饰的抗体或抗体片段相比没有显著的改变或损害。这些修饰可提供一些额外的属性，如：删除/添加可与二硫键结合的氨基酸，以增加其生物寿命、改变其分泌特性等。在任何情况下，抗体片段必须拥有生物活性的特性，如：结合活性、调节结合域的结合力等。抗体的功能性或活性区域可通过蛋白特定区域的基因突变、随后表达和测试所表达的多肽进行确定。这些方法为本行业技术人员所熟知，可包括编码抗体片段的核酸的特定位点基因突变。
本发明的抗体可进一步包括人源化抗体或人抗体。非人(如：鼠)抗体的人源化形式为嵌合抗体免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如：Fv、Fab、Fab′或抗体的其它抗原结合序列)，其中包含从非人免疫球蛋白中获得的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有预期特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠或兔子)CDR的残基取代。在某些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架(FR)残基被相应的非人残基取代。人源化抗体可能还包括既非受体抗体、也非输入CDR或框架序列中发现的残基。一般来说，人源化抗体将包括几乎所有的至少一个、通常为二个可变域，其中，全部或几乎全部的CDR区域均对应于非人免疫球蛋白的区域并且全部或几乎全部的FR区域均为人免疫球蛋白相同序列的区域。理想情况是，人源化抗体还将包括至少免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的一部分。
人源化非人抗体的方法为本行业所熟知。一般来说，人源化抗体具有一个或多个从非人源头引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基往往被称为“输入”残基，通常从“输入”可变域中获得。人源化基本上可以通过将啮齿动物CDR或CDR序列取代为相应的人抗体序列而完成。因此，这种“人源化”抗体为嵌合抗体(美国4816567号专利)，其中远不及于完整的人可变域被来自于非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常为人抗体，其中有些CDR残基以及可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代。
可使用免疫后在内源性免疫球蛋白产生缺失时能产生完整人抗体的转基因动物(如：小鼠)。例如，它被描述为，嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链连接区域基因的纯合性缺失导致内源性抗体生成的完全抑制。在此种系变种小鼠中人种系免疫球蛋白基因数组的转移在抗原挑战后将导致人抗体的生成。人抗体也可在噬菌体展示库中产生。
本发明的抗体优选为通过药用载体的形式给予受试者。通常，在制剂中使用适量的药用盐，以使制剂等渗。药用载体的例子包括生理盐水、林格氏液和葡萄糖溶液。溶液的pH值优选为约5至8，更优选为约7至7.5。此外，载体还包括缓释制剂，如：含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，其中基质为有形物品形式，如：薄膜、脂质体或微粒。本行业的技术人员熟知，某些载体可能为更优选，取决于例如，抗体的给药途径和浓度。
该抗体可通过注射(如：静脉内、腹腔内、皮下、肌肉内)或通过输注等其它方法给予受试者、患者或细胞，确保其以有效的形式传输到血液中。这些抗体也可以通过瘤内或瘤周途径给予，从而发挥局部和全身的治疗作用。局部或静脉注射为优选。
抗体给药的有效剂量和时间表可根据经验确定，并且作出此类决定属本行业的技术范围内。本行业的技术人员会明白，必须给予的抗体剂量根据以下因素会有所不同，例如：接受抗体的受试者、给药途径、使用的抗体以及其它正在使用的药物的特定类型。单独使用的抗体的通常日剂量可能为约1μg/kg至最多100mg/kg体重或更多，这取决于上述因素。给予抗体治疗肺癌后，治疗抗体的疗效可通过技术人员熟知的不同方法评估。例如：接受治疗的受试者肺癌的大小、数量和/或分布可使用标准肿瘤成像技术进行监测。因治疗而给予的抗体与不给予抗体时的病程相比，可阻止肿瘤生长、导致肿瘤缩小、和/或阻止新肿瘤的发展，这样的抗体是一种有效治疗肺癌的抗体。
由于本发明表2和表5中提及的肽(与AML特定相关)以及其潜在的多肽在AML中呈高表达而在正常细胞中表达极低，因此，ABCA13和/或MMP12表达或多肽活性的抑制可优选地并入防治AML的治疗性策略中。
反义治疗的原理是基于这样的假设：基因表达的序列特异性抑制(通过转录或翻译)可能是通过基因组DNA或mRNA与互补反义种类之间的杂交而实现。这种杂交核酸双工的形成干扰目标肿瘤抗原编码基因组DNA的转录，或目标肿瘤抗原mRNA的加工/运输/翻译和/或稳定性。
反义核酸可用各种方法传递。例如，反义寡核苷酸或反义RNA可以让肿瘤细胞吸收的方式直接给予(例如，通过静脉注射)受试者。另外，编码反义RNA(或RNA片段)的病毒或质粒载体可导入体内细胞。还可通过有义序列诱发反义效果；然而，表型变化的程度大不相同。通过有效的反义治疗诱导的表型变化可根据，例如，靶mRNA水平、靶蛋白水平、和/或靶蛋白活性水平的变化进行评估。
在一个具体的实施例中，可通过直接向受试者给予反义肺癌标志物RNA而实现反义基因治疗抑制肺癌标志物的功能。肿瘤标志物反义RNA可通过任何标准技术制造和分离，但最容易的制造方法是在控制高效启动子(例如，T7启动子)的情况下使用肿瘤标志物反义cDNA经体外转录制得。肿瘤标志物反义RNA给到细胞可通过下文所述的核酸直接给药方法中的任何一种进行。
使用基因疗法抑制ABCA13和MMP12功能的另一策略涉及抗-ABCA13、-MMP12抗体的细胞内表达或抗-ABCA13、-MMP12抗体的一个部分。例如，编码特异性结合至ABCA13、MMP12多肽和抑制其生物活性的单克隆抗体的基因(或基因片段)其特异性(例如：组织特异性或肿瘤特异性)基因调节序列在核酸表达载体内被置于转录控制之下。然后，载体给予受试者，以便被肺癌细胞或其它细胞吸收，之后，这些细胞分泌抗-ABCA13、-MMP12抗体而且阻滞ABCA13、MMP12多肽的生物活性。优选情况是，ABCA13、MMP12多肽出现于AML癌细胞外表面。
在上述的方法中，其中包括将外源性DNA给入受试者的细胞并被其吸收(即基因转导或转染)，本发明的核酸可为裸露DNA形式或核酸可位于载体中将核酸传递至细胞以抑制AML癌标志物蛋白的表达。该载体可以是一种市售的制剂，如腺病毒载体(量子生物技术公司，Laval，Quebec，Canada)。核酸或载体可通过多种机制传递至细胞中。例如，可使用市售的脂质体，如：LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO--25BRL公司，Gaithersburg，Md.)、SUPERFECT(Qiagen公司，Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(Promega Biotec公司，Madison，Wis.，US)以及根据本领域标准程序开发的其它脂质体，通过这些脂质体传递。此外，本发明的核酸或载体可通过体内电穿孔传递，该技术可从Genetronics公司(San Diego，US)获得，以及通过SONOPORATION机(ImaRx制药公司，Tucson，Arizona，US)的方式传递。
例如，载体可通过病毒系统(如可包裹重组逆转录病毒基因组的逆转录病毒载体系统)传递。重组逆转录病毒可用于感染，从而传递至抑制BCA13和/或MMP12表达的受感染细胞反义核酸。当然，将改变的核酸准确地导入至哺乳动物细胞细胞内并不限于使用逆转录病毒载体。对于这一程序有广泛的其它技术可供使用，包括使用腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、假型逆转录病毒载体。也可使用物理转导技术，如脂质体传递和受体介导的及其它内吞作用机制。本发明可与这些技术或其它常用基因转移方法中的任何方法配合使用。
该抗体也可用于体内诊断实验。一般来说，抗体用放射性核素标记(如：111In、99Tc、14C、131I、3H、32P或35S)，从而可用免疫闪烁扫描法使肿瘤局限化。在一实施方案中，其中的抗体或片段与两个或两个以上ABCA13和MMP12靶标的细胞外域结合，并且亲和力值(Kd)低于1 x 10μM。
诊断用抗体可通过各种影像学方法使用适合检测的探针进行标记。探针检测方法包括但不限于，荧光、光、共聚焦和电镜方法；磁共振成像和光谱学技术；透视、计算机断层扫描和正电子发射断层扫描。合适的探针包括但不限于，荧光素、罗丹明、曙红及其它荧光团、放射性同位素、黄金、钆和其它稀土、顺磁铁、氟-18和其它正电子发射放射性核素。此外，探针可能是双功能或多功能的，并且用一种以上的上述方法可进行检测。这些抗体可用所述的探针直接或间接进行标记。抗体探针的连接，包括探针的共价连接、将探针融合入抗体、以及螯合化合物的共价连接从而结合探针、以及其它本行业熟知的方法。对于免疫组织化学方法，疾病组织样本可能是新鲜或冷冻或可能包埋于石蜡中以及用福尔马林等防腐剂固定。固定或包埋的切片包括与标记一抗和二抗接触的样本，其中该抗体用于检测原位ABCA13和/或MMP12蛋白的表达。
因此，本发明提出了一种肽，包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605的组的一个序列、或与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605具有90％同源的一种变体、或将诱导与所述肽发生T细胞交叉反应的一种变体。
本发明所诉的肽具有与主要组织兼容性复合体(MHC)I或II类分子结合的能力。
在本发明中，“同源性”一词系指两个氨基酸序列之间的同一度(参见上文的等同度百分比，如肽或多肽序列。前文所述的“同源”是通过将理想条件下调整的两个序列与待比较序列进行比对后确定的。此类序列同源性可通过使用ClustalW等算法创建一个排列而进行计算。也可用使用一般序列分析软件，更具体地说，是Vector NTI、GENETYX或由公共数据库提供的其它分析工具。
本领域技术人员能评估特定肽变体诱导的T细胞是否可与该肽本身发生交叉反应(Fong L，et al.Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expandeddendritic cells for tumor immunotherapy.Proc Natl Acad Sci U S A.2001 Jul 17；98(15)：8809-14；Zaremba S，et al.Identification of an enhancer agonistcytotoxic T lymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen.CancerRes.1997 Oct 15；57(20)：4570-7；Colombetti S，et al.Impact of orthologous melan-A peptide immunizations on the anti-self melan-A/HLA-A2 T cell cross-reactivity.J Immunol.2006 Jun 1；176(11)：6560-7；Appay V，et al.Decreasedspecific CD8+ T cell cross-reactivity of antigen recognition followingvaccination with Melan-A peptide.Eur J Immunol.2006Jul；36(7)：1805-14)。
发明人用给定氨基酸序列的“变体”表示，一个或多个氨基酸残基等的侧链通过被另一个天然氨基酸残基的侧链或其它侧链取代而发生改变，这样，这种肽仍然能够以含有给定氨基酸序列(由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQID NO：448至SEQ ID NO：605组成)的肽大致同样的方式与HLA分子结合。例如，一种肽可能被修饰以便至少维持(如没有提高)其能与HLA-A*02或-DR等合适MHC分子的结合槽相互作用和结合，以及至少维持(如没有提高)其与启动CTL的TCR结合的能力。
随后，这些CTL可与细胞和杀伤细胞发生交叉反应，这些细胞表达多肽(其中包含本发明中定义的同源肽的天然氨基酸序列)。正如科学文献(Godkin A，et al.Use ofeluted peptide sequence data to identify the binding characteristics ofpeptides to the insulin-dependent diabetes susceptibility allele HLA-DQ8(DQ3.2).Int Immunol.1997Jun；9(6)：905-11)和数据库(Rammensee H.et al.SYFPEITHI：database for MHC ligands and peptide motifs.Immunogenetics.1999 Nov；50(3-4)：213-9)中所述，HLA-A结合肽的某些位点通常为锚定残基，可形成一种与HLA结合槽的结合模序相称的核心序列，其定义由构成结合槽的多肽链的极性、电物理、疏水性和空间特性确定。因此，本领域技术人员能够通过保持已知的锚残基来修饰SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605提出的氨基酸序列，并且能确定这些变体是否保持与MHC I或II类分子结合的能力。本发明的变体保持与启动CTL的TCR结合的能力，随后，这些CTL可与表达一种包含本发明的肽的天然氨基酸序列的多肽的细胞发生交叉反应并杀死该等细胞。
这些基本不与T细胞受体互动的氨基酸残基可通过取代另一个几乎不影响T细胞反应并不妨碍与相关MHC结合的氨基酸而得到修饰。因此，除了特定限制性条件外，本发明的肽可能为任何包括给定氨基酸序列或部分或其变体的肽(发明人所用的这个术语包括寡肽或多肽)。
较长的肽也可能适合。MHC I类表位(通常长度为8至11个氨基酸)也可能由肽从较长的肽或包含实际表位的蛋白中加工而产生。两侧有实际表位的残基优选为在加工过程中几乎不影响暴露实际表位所需蛋白裂解的残基。
因此，本发明还提出了MHC I类表位的肽和变体，其中所述肽或抗体的总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸长度(即10、11、12、13、14个氨基酸，如果为II类结合肽时，长度也可为15、16、17、18、19、20、21或23个氨基酸)。
当然，本发明的肽或变体能与人主要组织兼容性复合体(MHC)I或II类分子结合。肽或变体与MHC复合体的结合可用本领域内的已知方法进行测试。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，该肽系由或基本系由根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605的一个氨基酸序列组成。
“基本由...组成”系指本发明的肽，除了根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605中的任一序列或其变体组成外，还含有位于其它N和/或C端延伸处的氨基酸，而它们不一定能形成作为MHC分子表位的肽。
但这些延伸区域对有效将本发明中的肽引进细胞具有重要作用。在本发明的一实施例中，肽为融合蛋白，含来自NCBI、GenBank登录号X00497的HLA-DR抗原相关不变链(p33，以下称为“Ii”)的80个N-端氨基酸等。在其它的融合中，本发明的肽可以被融合到本文所述的抗体、或其功能性部分，特别是融合入抗体的序列，以便所述抗体进行特异性靶向作用，或者，例如进入树突状细胞特异性抗体。
此外，该肽或变体可进一步修饰以提高稳定性和/或与MHC分子结合，从而引发更强的免疫反应。肽序列的该类优化方法是本领域内所熟知的，包括，例如，反式肽键和非肽键的引入。
在反式肽键氨基酸中，肽(-CO-NH-)并未连接其残基，但是其肽键是反向的。这种逆向反向模拟肽(retro-inverso peptidomimetics)可通过本领域已知的方法制备，例如：Meziere等在《免疫学杂志》((1997)J.Immunol.159，3230-3237)中所述的方法，以引用的方式并入本文。这种方法涉及制备包含骨架(而并非侧链)改变的模拟肽。Meziere等人(1997年)的研究显示，这些模拟肽有利于MHC的结合和辅助性T细胞的反应。以NH-CO键替代CO-NH肽键的逆向反向肽大大地提高了抗水解性能。
非肽键为-CH2-NH、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-等。美国4897445号专利提出了多肽链中非肽键(-CH2-NH)的非固相合成法，该方法涉及按标准程序合成的多肽以及通过氨基醛和一种含NaCNBH3的氨基酸相互作用而合成的非肽键。
含上述序列的肽可与其氨基和/或羧基末端的其它化学基团进行合成，从而提高肽的稳定性、生物利用度、和/或亲和力等。例如，苄氧羰基、丹酰基等疏水基团或叔丁氧羰基团可加入肽的氨基末端。同样，乙酰基或9-芴甲氧羰基可能位于肽的氨基末端。此外，疏水基团、叔丁氧羰基团或氨基团都可能被加入肽的羧基末端。
另外，本发明中的所有肽都可能经合成而改变其空间构型。例如，可能使用这些肽的一个或多个氨基酸残基的右旋体，通常不是其左旋体。更进一步地，本发明中肽的至少一个氨基酸残基可被熟知的一个非天然氨基酸残基取代。诸如此类的改变可能有助于增加本发明肽的稳定性、生物利用度和/或结合作用。
同样，本发明中的肽或变体可在合成肽之前或之后通过特异氨基酸的反应而进行化学修饰。此类修饰的实施例为本领域所熟知，例如，在R.Lundblad所著的《ChemicalReagents for Protein Modification》(3rd ed.CRC Press，2005)中有概述，以参考文献的方式并入本文。虽然氨基酸的化学修饰方法无限制，但其包括(但不限于)通过以下方法修饰：酰基化、脒基化、赖氨酸吡哆基化、还原烷基化、以2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苯基化氨基团、通过将半胱氨酸过甲酸氧化为磺基丙氨酸而对羧基团和巯基进行氨基修饰、形成易变衍生物、与其它巯基化合物形成混合二硫化合物、与马来酰亚胺反应，与碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化、在碱性pH值下与氰酸盐甲氨酰化。在这方面，技术人员参考了《Current Protocols In Protein Science》(Eds.Coligan et al.(John Wiley and SonsNY 1995-2000))中第15章所述的在蛋白质化学修饰相关的广泛方法。
简言之，修饰蛋白质的精氨酰残基等往往基于于邻二羰基化合物(如苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮以及1，2-烯巳二酮)的反应而形成加合物。另一个实施例是丙酮醛与精氨酸残基的反应。半胱氨酸可在赖氨酸和组氨酸等亲核位点不作随同修饰的情况下就得到修饰。因此，有大量试剂可进行半胱氨酸的修饰。Sigma-Aldrich(http://www.sigma-aldrich.com)等公司的网站含有具体试剂的信息。
蛋白质中二硫键的选择性还原也很普遍。二硫键可在生物制药热处理中形成和氧化。
伍德沃德氏试剂K可用于修饰特定的谷氨酸残基。N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基-碳二亚胺可用于形成赖氨酸残基和谷氨酸残基的分子内交联。
例如：焦碳酸二乙酯是修饰蛋白质组氨酸残基的试剂。组氨酸也可使用4-羟基-2-壬烯醛进行修饰。
赖氨酸残基与其它醹-氨基团的反应，例如，有利于肽结合到蛋白/肽的表面或交联处。赖氨酸聚是多(乙烯)乙二醇的附着点，也是蛋白质糖基化的主要修饰位点。
蛋白质的蛋氨酸残基可通过碘乙酰胺、溴乙胺、氯胺T等被修饰。
四硝基甲烷和N-乙酰基咪唑可用于酪氨酸残基的修饰。经二酪氨酸形成的交联可通过过氧化氢/铜离子完成。
对色氨酸修饰的最近研究中使用了N-溴代琥珀酰亚胺、2-羟基-5-硝基苄溴或3-溴-3-甲基-2-(2-硝苯巯基)-3H-吲哚(BPNS-粪臭素)。
当蛋白与戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯和甲醛的交联用于配制水凝胶时，治疗性蛋白和含聚乙二醇的肽的成功修饰往往可延长循环半衰期。针对免疫治疗的变态反应原化学修饰往往通过氰酸钾的氨基甲酰化实现。
一种肽或变体，其中肽被修饰或含非肽键，优选为本发明的实施例。一般来说，肽和变体(至少含氨基酸残基之间的肽联接)可使用Lukas et al.(Solid-phase peptidesynthesis under continuous-flow conditions.Proc Natl Acad Sci U S A.May 1981；78(5)：2791-2795)中以及本文列出的参考文献所披露的固相肽合成Fmoc-聚酰胺模式进行合成。芴甲氧羰基(Fmoc)团对N-氨基提供临时保护。使用含20％呱啶的N，N-二甲基甲酰胺给这种对碱高度敏感的保护基团进行重复分裂。由于它们的丁基醚(在丝氨酸苏氨酸和酪氨酸的情况下)、丁基酯(在谷氨酸和天门冬氨酸的情况下)、叔丁氧羰基衍生物(在赖氨酸和组氨酸的情况下)、三苯甲基衍生物(在半胱氨酸的情况下)及4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基衍生物(在精氨酸的情况下)，侧链功能可能会受到保护。只要谷氨酰胺和天冬酰胺为C-末端残基，侧链氨基功能保护所使用的是由4，4′-二甲氧基二苯基团。固相支撑基于聚二甲基丙烯酰胺聚合物，其由三个单体二甲基丙烯酰胺(骨架单体)、双丙烯酰乙烯二胺(交联剂)和N-丙烯酰肌胺酸甲酯(功能剂)构成。使用的肽-树脂联剂为酸敏感的4-羟甲基苯氧乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物均作为其预制对称酸酐衍生物加入，但是天冬酰胺和谷氨酰胺除外，它们使用被逆转的N，N-二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑介导的耦合程序而加入。所有的耦合和脱保护反应用茚三酮、硝基苯磺酸或isotin测试程序监测。合成完成后，用浓度为95％含50％清道夫混合物的三氟醋酸，从伴随去除侧链保护基团的树脂支承物中裂解肽。常用的清道夫混合物包括乙二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，准确的选择依据合成肽的氨基酸组成。此外，固相和液相方法结合使用对肽进行合成是可能的(例如，请参阅Bruckdorfer T，et al.From production of peptides in milligram amounts forresearch to multi-tons quantities for drugs of the future.Curr PharmBiotechnol.2004Feb；5(1)：29-43。综述以及本文引用的参考文献)。
三氟乙酸用真空中蒸发、随后用承载粗肽的二乙基乙醚滴定进行去除。用简单萃取程序(水相冻干后，该程序制得不含清道夫混合物的肽)清除任何存在的清道夫混合物。肽合成试剂一般可从Calbiochem-Novabiochem(英国)公司(NG72QJ，英国)获得。
纯化可通过以下技术的任何一种或组合方法进行，如：再结晶法、体积排阻色谱法、离子交换色谱法、疏水作用色谱法以及(通常)反相高效液相色谱法(如使用乙腈/水梯度分离)。
可以使用薄层色谱法、电泳特别是毛细管电泳、固相萃取(CSPE)、反相高效液相色谱法、酸解后的氨基酸分析、快原子轰击(FAB)质谱分析以及MALDI和ESI-Q-TOF质谱分析进行肽分析。
另一方面，本发明提出了一种编码本发明中肽或肽变体的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可能为，例如，DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合物，它们可为单链和/或双链、或多聚核苷酸的原生或稳定形式(如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸)，并且只要它编码肽，就可能包含也可能不包含内含子。当然，多聚核苷酸只能编码加入天然肽键并含有天然氨基酸残基的肽。另一个方面，本发明提出了一种可根据本发明表达多肽的表达载体。
对于连接多核苷酸，已经开发出多种方法，尤其是针对DNA，可通过向载体补充可连接性末端等方法进行连接。例如，可向DNA片段加入补充性均聚物轨道，之后DNA片段被插入到载体DNA。然后，通过补充性均聚物尾巴的氢键结合，将载体和DNA片段结合，从而形成重组DNA分子。
含有一个或多个酶切位点的合成接头为DNA片段与载体连接提供了另一种方法。含各种限制性核酸内切酶的合成接头可通过多种管道购得，其中包括从国际生物技术公司(International Biotechnologies Inc，New Haven，CN，美国)购得。
编码本发明多肽的DNA理想修饰方法是使用Saiki等人所采用的聚合酶链反应方法。(Diagnosis of sickle cell anemia and beta-thalassemia with enzymaticallyamplified DNA and nonradioactive allele-specific oligonucleotide probes.NEngl J Med.1988 Sep 1；319(9)：537-41)。此方法可用于将DNA引入合适的载体(例如，通过设计合适的酶切位点)，也可用于本领域已知的其它有用方法修饰DNA。如果使用病毒载体，痘病毒载体或腺病毒载体为优选。
之后，DNA(或在逆转录病毒载体情况下，RNA)可能表达于合适的宿主，从而制成含本发明肽或变体的多肽。因此，可根据已知技术使用编码本发明肽或变体的DNA，用本文所述方法适当修饰后，构建表达载体，然后表达载体用于转化合适宿主细胞，从而表达和产生本发明中的多肽。这些方法包括下列美国专利中披露的方法：4,440,859、4,530,901、4,582,800、4,677,063、4,678,751、4,704,362、4,710,463、4,757,006、4,766,075和4,810,648。
编码含本发明化合物多肽的DNA(或在逆转录病毒载体情况下，RNA)可能被加入到其它多种DNA序列，从而引入到合适的宿主中。同伴DNA将取决于宿主的性质、DNA引入宿主的方式、以及是否需要保持为游离体还是要相互结合。
一般来说，DNA可以适当的方向和正确的表达阅读框架附着到一种表达载体(如质粒)中。如有必要，该DNA可能与所需宿主所识别的相应转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，尽管表达载体中一般存在此类控制功能。然后，该载体通过标准方法被引入宿主。一般来说，并不是所有的宿主都会被载体转化。因此，有必要选择转化过的宿主细胞。选择方法包括用任何必要的控制元素向表达载体插入一个DNA序列，该序列对转化细胞中的可选择性属性(如抗生素耐药性)进行编码。
另外，有这种选择属性的基因可在另外一个载体上，该载体用来协同转化所需的宿主细胞。
然后，本发明中的重组DNA所转化的宿主细胞在本文中所述本领域技术人员熟悉的合适条件下培养足够长的时间，从而表达之后可回收的肽。
有许多已知的表达系统，包括细菌(如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、酵母(如酵母菌)、丝状真菌(如曲霉菌)、植物细胞、动物细胞及昆虫细胞。该系统可优选为哺乳动物细胞，如来自ATCC细胞生物学库(Cell Biology Collection)中的CHO细胞。
典型的哺乳动物细胞组成型表达载体质粒包括CMV或含一个合适的多聚A尾巴的SV40启动子以及抗性标志物(如新霉素)。一个实例为从Pharmacia公司(Piscataway，新泽西，美国)获得的pSVL。一种可诱导型哺乳动物表达载体的例子是pMSG，也可以从Pharmacia公司获得。有用的酵母质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，一般可从StratageneCloning Systems公司(La Jolla，CA 92037，美国)获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合型质粒(YIp)，并插入了酵母可选择性标记物HIS3、TRP1、LEU2和URA3。pRS413-416质粒为酵母着丝粒质粒(Ycp)。基于CMV启动子的载体(如，来自于Sigma-Aldrich公司)提供了瞬时或稳定的表达、胞浆表达或分泌，以及FLAG、3xFLAG、c-myc或MATN不同组合物中的N-端或C-端标记。这些融合蛋白可用于检测、纯化及分析重组蛋白。双标融合为检测提供了灵活性。
强劲的人巨细胞病毒(CMV)启动子调控区使得COS细胞中的组成蛋白表达水平高达1mg/L。对于较弱的细胞株，蛋白水平一般低于0.1mg/L。SV40复制原点的出现将导致DNA在SV40复制容纳性COS细胞中高水平复制。例如，CMV载体可包含细菌细胞中的pMB1(pBR322的衍生物)复制原点、细菌中进行氨苄青霉素抗性选育的钙-内酰胺酶基因、hGH polyA和f1的原点。含前胰岛素原引导(PPT)序列的载体可使用抗FLAG抗体、树脂和板引导FLAG融合蛋白分泌到进行纯化的培养基中。其它与各种宿主细胞一起应用的载体和表达系统是本领域熟知众所周知的。
在另一个实施方案中，对本发明的两个或更多的肽或肽变体进行编码，因此，以一个连续顺序(类似于“一串珠子”的构建体)表达。在达到目标，所述肽或肽变体可能通过连接子氨基酸的延伸处(例如LLLLLL)连接或融合一起，也可能它们之间没有任何附加的肽而被连接。
本发明还涉及一种宿主细胞，其以本发明的多核苷酸载体构建转化而来。宿主细胞可为原核细胞，也可为真核细胞。在有些情况下，细菌细胞为优选原核宿主细胞，典型为大肠杆菌株，例如，大肠杆菌菌株DH5(从Bethesda Research Laboratories公司(Bethesda，MD，美国)获得)和RR1(从美国菌种保藏中心(ATCC，Rockville，MD，美国)，ATCC编号31343获得)。首选的真核宿主细胞包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选为脊椎动物细胞，如：小鼠、大鼠、猴子或人成纤维细胞和结肠癌细胞株中的细胞。酵母宿主细胞包括YPH499、YPH500和YPH501，一般可从Stratagene Cloning Systems公司(La Jolla，CA92037，美国)获得。首选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为ATCC中的CCL61细胞、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3为ATCC中的CRL 1658细胞、猴肾源性COS-1细胞为ATCC中的CRL 1650细胞以及人胚胎肾细胞的293号细胞。首选昆虫细胞为Sf9细胞，可用杆状病毒表达载体转染。有关针对表达选择合适宿主细胞的概要，可从教科书(Paulina Balbásand Argelia Lorence《Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression，Reviews and Protocols》Part One，Second Edition，ISBN 978-1-58829-262-9)和本领域技术人员知道的其它文献中查到。
含本发明DNA结构的适当宿主细胞的转化可使用大家熟知的方法完成，通常取决于使用载体的类型。对于原核宿主细胞的转化，可参阅，如：Cohen等人(1972)在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1972，69，2110中以及Sambrook等人(1989)所著《MolecularCloning，A Laboratory Manual》Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY中使用的方法。酵母细胞的转化在Sherman等人(1986)在Methods In Yeast Genetics，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY中有描述。Beggs(1978)Nature 275，104-109中所述方法也很有用。对于脊椎动物细胞，转染这些细胞的试剂等，例如，磷酸钙和DEAE-葡聚糖或脂质体配方，可从Stratagene Cloning Systems公司或Life Technologies公司(Gaithersburg，MD 20877，美国)获得。电穿孔也可用于转化和/或转染细胞，是本领域用于转化酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞和脊椎动物细胞大家熟知的方法。
被成功转化的细胞(即含本发明DNA结构的细胞)可用大家熟知的方法(如PCR)进行识别。另外，上清液存在的蛋白可使用抗体进行检测。
应了解，本发明中的某些宿主细胞用于制备本发明中的肽，例如细菌细胞、酵母细胞和昆虫细胞。但是，其它宿主细胞可能对某些治疗方法有用。例如，抗原提呈细胞(如树突状细胞)可用于表达本发明中的肽，使它们可以加加载相应的MHC分子中。因此，本发明提出了含本发明中核酸或表达载体的一种宿主细胞。
在一个优选实施方案中，宿主细胞为抗原提呈细胞，尤其是树突状细胞或抗原提呈细胞。2010年4月29日，美国食品和药物管理局(FDA)批准载有含前列腺酸性磷酸酶(PAP)的重组融合蛋白可用于治疗无症状或症状轻微的转移性HRPC(Sipuleucel-T)(Small EJ，et al.Placebo-controlled phase III trial of immunologic therapy withsipuleucel-T(APC8015)in patients with metastatic，asymptomatic hormonerefractory prostate cancer.J Clin Oncol.2006 Jul 1；24(19)：3089-94.Rini etal.Combination immunotherapy with prostatic acid phosphatase pulsed antigen-presenting cells(provenge)plus bevacizumab in patients with serologicprogression of prostate cancer after definitive local therapy.Cancer.2006Jul1；107(1)：67-74)。
那么，本发明的另一方面提出了一种配制一种肽及其变体的方法，该方法包括培养宿主细胞和从宿主细胞或其培养基中分离肽。
在另一个实施方案中，本发明中的肽、核酸或表达载体用于药物中。例如，肽或其变体可制备为静脉(i.v.)注射剂、皮下(s.c.)注射剂、皮内(i.d.)注射剂、腹膜内(i.p.)注射剂、肌肉(i.m.)注射剂。肽注射的优选方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的优选方法为i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如，给予50μg至1.5mg，优选为125μg至500μg的肽或DNA，这取决于具体的肽或DNA。上述剂量范围在以前的试验中成功使用(Walter et al.，Nature Medicine 18，1254-1261(2012))。
本发明的另一方面包括一种体外制备启动的T细胞的方法，该方法包括将T细胞与载有抗原的人MHC分子进行体外连接，这些分子在合适的抗原提呈细胞表面表达足够的一段时间从而以抗原特异性方式启动T细胞，其中所述抗原为根据本发明所述的一种肽。优选情况是足够量的抗原与抗原提呈细胞一同使用。
优选情况是，哺乳动物细胞的TAP肽转运载体缺乏或水平下降或功能降低。缺乏TAP肽转运载体的适合细胞包括T2、RMA-S和果蝇细胞。TAP是与抗原加工相关的转运载体。
人体肽载入的缺陷细胞株T2从属美国菌种保藏中心(ATCC，12301 ParklawnDrive，Rockville，Maryland 20852，美国)目录号CRL1992；果蝇细胞株Schneider 2号株从属ATCC目录CRL 19863；小鼠RMA-S细胞株在Karre et a11985(Ljunggren，H.-G.，andK.Karre.1985.J.Exp.Med.162：1745)中有过描述。
优选情况是，宿主细胞在转染前基本上不表达MHC I类分子。刺激因子细胞还优选为表达对T细胞共刺激信号起到重要作用的分子，如，B7.1、B7.2、ICAM-1和LFA 3中的任一种分子。大量MHC I类分子和共刺激分子的核酸序列可从GenBank和EMBL数据库中公开获得。
当MHC I类表位用作一种抗原时，T细胞为CD8阳性CTL。
如果抗原提呈细胞转染以表达这样的表位，优选为细胞含有SEQ ID NO：1至SEQID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605所述肽的表达载体、或本文所述的氨基酸序列组成。
可使用其它一些方法来体外生成CTL。例如，自体肿瘤浸润性淋巴细胞可用于生成CTL。Plebanski et al(1995)(Induction of peptide-specific primary cytotoxic Tlymphocyte responses from human peripheral blood.Eur J Immunol.1995Jun；25(6)：1783-7)使用自体外周血淋巴细胞(PLB)制备CTL。另外，也可能用肽或多肽脉冲处理树突状细胞或通过与重组病毒感染而制成自体CTL。此外，B细胞可用于制备自体CTL。此外，用肽或多肽脉冲处理或用重组病毒感染的巨噬细胞可用于配制自体CTL。Walter等人在2003(Cutting edge：predetermined avidity of human CD8 T cells expanded oncalibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres.J Immunol.2003Nov 15；171(10)：4974-8)中描述了通过使用人工抗原提呈细胞(aAPC)体外启动T细胞，这也是生成作用于所选肽的T细胞的一种合适方法。在本发明中，根据生物素：链霉素生物化学方法通过将预制的MHC：肽复合物耦合到聚苯乙烯颗粒(微球)而生成aAPC。该系统实现了对aAPC上的MHC密度进行精确调节，这使得可以在血液样本中选择地引发高或低亲合力的高效抗原特异性T细胞反应。除了MHC：肽复合物外，aAPC还应携运含共刺激活性的其它蛋白，如耦合至表面的抗-CD28抗体。此外，此类基于aAPC的系统往往需要加入适当的可溶性因子，例如，诸如白细胞介素-12的细胞因子。
也可用同种异体细胞制得T细胞，在WO 97/26328中详细描述了一种方法，以参考文献方式并入本文。例如，除了果蝇细胞和T2细胞，也可用其它细胞来提呈肽，如CHO细胞、杆状病毒感染的昆虫细胞、细菌、酵母、牛痘感染的靶细胞。此外，也可使用植物病毒(例如，参阅Porta et al(1994)Development of cowpea mosaic virus as a high-yieldingsystem for the presentation of foreign peptides.Virology.1994 Aug1；202(2)：949-55)，其中描述了将豇豆花叶病毒开发为一种提呈外来肽的高产系统。
被启动的T细胞直接针对本发明中的肽，有助于治疗。因此，本发明的另一方面提出了用本发明前述方法制得的启动T细胞。
按上述方法制成的启动T细胞将会有选择性地识别异常表达含SEQ ID NO：1至SEQID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605氨基酸序列的多肽。
优选情况是，T细胞通过与其含HLA/肽复合物的TCR相互作用(如，结合)而识别该细胞。T细胞是杀伤患者靶细胞方法中有用的细胞，其靶细胞异常表达含本发明中氨基酸序列的多肽。此类患者给予有效量的启动T细胞。给予患者的T细胞可能源自该患者，并按上述方法启动(即，它们为自体T细胞)。或者，T细胞不是源自该患者，而是来自另一个人。当然，优选情况是该供体为健康人。发明人使用“健康个人”系指一个人一般状况良好，优选为免疫系统合格，更优选为无任何可很容易测试或检测到的疾病。
根据本发明，CD8-阳性T细胞的体内靶细胞可为肿瘤细胞(有时表达MHC-II类抗原)和/或肿瘤周围的基质细胞(肿瘤细胞)(有时也表达MHC-II类抗原；(Dengjel et al.，2006))。
本发明所述的T细胞可用作治疗性组合物中的活性成分。因此，本发明也提出了一种杀伤患者靶细胞的方法，其中患者的靶细胞异常表达含本发明中氨基酸序列的多肽，该方法包括给予患者上述有效量的T细胞。
发明人所用的“异常表达”的意思还包括，与正常表达水平相比，多肽过量表达，或该基因在源自肿瘤的组织中未表达，但是在该肿瘤中却表达。“过量表达”系指多肽水平至少为正常组织中的1.2倍；优选为至少为正常组织中的2倍，更优选为至少5或10倍。
T细胞可用本领域已知的方法制得(如，上述方法)。
T细胞继转移方案为本领域所熟知的方案。综述可发现于：Gattinoni L，etal.Adoptive immunotherapy for cancer：building on success.Nat RevImmunol.2006May；6(5)：383-93.Review.以及Morgan RA，et al.Cancer regression inpatients after transfer of genetically engineered lymphocytes.Science.2006Oct6；314(5796)：126-9)。
本发明的任一分子(即肽、核酸、抗体、表达载体、细胞，启动CTL、T细胞受体或编码核酸)都有益于治疗疾病，其特点在于细胞逃避免疫反应的打击。因此，本发明的任一分子都可用作药剂或用于制造药剂。这种分子可单独使用也可与本发明中的其它分子或已知分子联合使用。
本发明中所述的药剂优选为一种疫苗。该疫苗可直接给到患者的受影响器官，也可i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射方式全身给药，或体外应用到来自患者或其细胞株的细胞(随后再将这些细胞注入到患者中)，或体外用于从来自患者的免疫细胞的一个细胞亚群(然后再将细胞重新给予患者)。如果核酸体外注入细胞，可能有益于细胞转染，以共同表达免疫刺激细胞因子(如白细胞介素-2)。肽可完全单独给药，也可与免疫刺激佐剂相结合(见下文)、或与免疫刺激细胞因子联合使用、或以适当的输送系统给药(例如脂质体)。该肽也可共轭形成一种合适的载体(如钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)或甘露)到合适的载体(参阅WO95/18145及Longenecker，1993)。肽也可能被标记，可能是融合蛋白，或可能是杂交分子。在本发明中给出序列的肽预计能刺激CD4或CD8 T细胞。然而，在有CD4 T-辅助细胞的帮助时，CD8 CTL刺激更加有效。因此，对于刺激CD8 CTL的MHC I类表位而言，杂交分子的融合配偶体或融合部分适当提供刺激CD4-阳性T细胞的表位。CD4-和CD8刺激表位为本领域所熟知、并包括本发明中确定的表位。
一方面，疫苗包括至少含有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：605中提出的一种肽以及至少另外一种肽，优选为2至50个、更优选为2至25个、再优选为2至20个、最优选为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个肽。肽可能从一个或多个特定TAA中衍生，并且可能与MHC I类分子结合。
另一方面，疫苗包括至少含有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447至SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605中提出的一种肽以及至少另外一种肽，优选为2至50个、更优选为2至25个、再优选为2至20个、最优选为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个肽。肽可能从一个或多个特定TAA中衍生，并且可能与MHC I类分子结合。
多聚核苷酸可为基本纯化形式，也可包被于载体或输送系统。核酸可能为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能为其组合物。这种核酸的设计和引入方法为本领域所熟知。例如，文献中有其概述(Pascolo et al.，2005 Human peripheral blood mononuclear cellstransfected with messenger RNA stimulate antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes in vitro.Cell Mol Life Sci.2005 Aug；62(15)：1755-62)。多核苷酸疫苗很容易制备，但这些载体诱导免疫反应的作用模式尚未完全了解。合适的载体和输送系统包括病毒DNA和/或RNA，如基于腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺相关病毒或含一种以上病毒元素的混合病毒的系统。非病毒输送系统包括阳离子脂质体和阳离子聚合物，是DNA输送所属领域内熟知的系统。也可使用物理输送系统，如通过“基因枪”。肽或核酸编码的肽可以是一种融合蛋白，例如，含刺激T细胞进行上述CDR的表位。
本发明的药剂也可能包括一种或多种佐剂。佐剂是那些非特异性地增强或加强免疫反应的物质(例如，通过CTL和辅助T(TH)细胞介导的对一种抗原的免疫应答，因此被视为对本发明的药剂有用。适合的佐剂包括(但不仅限于)1018ISS、铝盐、AS15、BCG、CP-870，893、CPG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生的TLR5配体、FLT3配体、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特()、resiquimod、ImuFact IMP321、白细胞介素IL-2、IL-13、IL-21、干扰素α或B，或其聚乙二醇衍生物、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、LipoVac、MALP2、MF59、单磷酰脂A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、水包油和油包水乳状液、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、载体系统、基于聚丙交酯复合乙交酯[PLG]和右旋糖苷微粒、重组人乳铁传递蛋白SRL172、病毒颗粒和其它病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支杆菌提取物和细菌细胞壁合成模拟物的Aquila公司的QS21刺激子，以及其它专有佐剂，如：Ribi′s Detox、Quil或Superfos。优选佐剂如：弗氏佐剂或GM-CSF。前人对一些树突状细胞特异性免疫佐剂(如MF59)及其制备方法进行了描述(Allison and Krummel，1995The Yin and Yang of T cellcostimulation.Science.1995Nov 10；270(5238)：932-3.Review)。也可能使用细胞因子。一些细胞因子直接影响树突状细胞向淋巴组织迁移(如，TNF-)，加速树突状细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原提呈细胞(如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国5849589号专利，特别以其完整引用形式并入本文)，并充当免疫佐剂(如IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α、IFN-β)(Gabrilovich，1996Production of vascular endothelial growth factor by humantumors inhibits the functional maturation of dendritic cells Nat Med.1996Oct；2(10)：1096-103)。
据报告，CpG免疫刺激寡核苷酸可提高佐剂在疫苗中的作用。如果没有理论的约束，CpG寡核苷酸可通过Toll样受体(TLR)(主要为TLR9)启动先天(非适应性)免疫系统从而起作用。CpG引发的TLR9活化作用提高了对各种抗原的抗原特异性体液和细胞反应，这些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被杀死的病毒、树突状细胞疫苗、自体细胞疫苗以及预防性和治疗性疫苗中的多糖结合物。更重要的是，它会增强树突状细胞的成熟和分化，导致TH1细胞的活化增强以及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成加强，甚至CD4T细胞说明的缺失。甚至有疫苗佐剂的存在也能维持TLR9活化作用诱发的TH1偏移，这些佐剂如：正常促进TH2偏移的明矾或弗氏不完全佐剂(IFA)。CpG寡核苷酸与以下其它佐剂或配方一起制备或联合给药时，表现出更强的佐剂活性，如微粒、纳米粒子、脂肪乳或类似制剂，当抗原相对较弱时，这些对诱发强反应尤为必要。它们还能加速免疫反应，使抗原剂量减少约两个数量级，在有些实验中，对不含CpG的全剂量疫苗也能产生类似的抗体反应(Krieg，2006)。美国6406705 B1号专利对CpG寡核苷酸、非核酸佐剂和抗原结合使用促使抗原特异性免疫反应进行了描述。一种CpG TLR9拮抗剂为Mologen公司(德国柏林)的dSLIM(双干环免疫调节剂)，这是本发明药物组合物的优选成分。也可使用其它如TLR结合分子，如：RNA结合TLR7、TLR8和/或TLR9。
其它有用的佐剂例子包括(但不限于)化学修饰性CpG(如CpR、Idera)、dsRNA模拟物，如，Poly(I：C)及其衍生物(如：多聚-(ICLC)、多聚(IC-R)、多聚(I：C12U))、非CpG细菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗体，如：环磷酰胺、舒尼替单抗、贝伐单抗、西乐葆、NCX-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、替莫唑胺、temsirolimus、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、VEGF Trap、ZD2171、AZD2171、抗-CTLA4、免疫系统的其它抗体靶向性主要结构(如：抗-CD40、抗-TGFβ、抗-TNFα受体)和SC58175，这些药物都可能有治疗作用和/或充当佐剂。技术人员无需过度进行不当实验就很容易确定本发明中有用的佐剂和添加剂的数量和浓度。
首选佐剂是咪喹莫特、瑞喹莫德、GM-CSF、环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐单抗、干扰素醹、CpG寡核苷酸及衍生物、多聚(I：C)及衍生物、RNA、西地那非和PLG或病毒颗粒的微粒制剂。
本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂从含集落刺激因子制剂中选择，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、环磷酰胺、咪喹莫特、resiquimod和干扰素-α。
本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂从含集落刺激因子制剂中选择，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、环磷酰胺、咪喹莫特和resimiquimod。
在本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂为环磷酰胺、咪喹莫特或resiquimod。
更优选的佐剂是Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、聚ICLC和抗CD40 mAB或其组合物。
此组合药物为非肠道注射使用，如皮下、皮内、肌肉注射，也可口服。为此，肽和其它选择性分子在药用载体中分解或悬浮，优选为水载体。此外，组合物可包含辅料，如：缓冲剂、结合剂、冲击剂、稀释剂、香料、润滑剂等。这些肽也可与免疫刺激物质合用，如：细胞因子。可用于此类组合物的更多辅料可在从A.Kibbe所著的Handbook of PharmaceuticalExcipients(第3版，2000年，美国医药协会和制药出版社)等书中获知。此组合药物可用于阻止、预防和/或治疗腺瘤或癌性疾病。例如，EP2113253中有示例制剂。
但是，根据本发明肽的数量和物理化学特征，需要进一步研究以提出肽特定组合的制剂，特别是稳定性超过12至18个月20种以上的肽的组合物。
本发明提出了一种药剂，其用于治疗癌症，特别是AML、慢性淋巴性白血病(CLL)和其它血液学恶性肿瘤。
本发明还涉及一种套件，其包括：
(a)一个容器，包含上述溶液或冻干粉形式的药物组合物；
(b)可选的第二个容器，其含有冻干粉剂型的稀释剂或重组溶液；和
(c)可选的(i)溶液使用或(ii)重组和/或冻干制剂使用的说明。
该套件还步包括一个或多个(iii)缓冲剂，(iv)稀释剂，(v)过滤液，(vi)针，或(v)注射器。容器最好是瓶子、小瓶、注射器或试管，可以为多用途容器。药物组合物最好是冻干的。
本发明中的套件优选包含一种置于合适容器中的冻干制剂以及重组和/或使用说明。适当的容器包括，例如瓶子、西林瓶(如双室瓶)、注射器(如双室注射器)和试管。该容器可能由多种材料制成，如玻璃或塑料。试剂盒和/或容器最好有容器或关于容器的说明书，指明重组和/或使用的方向。例如，标签可能表明冻干剂型将重组为上述肽浓度。该标签可进一步表明制剂用于皮下注射。
存放制剂的容器可使用多用途西林瓶，使得可重复给予(例如，2-6次)重组剂型。该套件可进一步包括装有合适稀释剂(如碳酸氢钠溶液)的第二个容器。
稀释液和冻干制剂混合后，重组制剂中的肽终浓度优选为至少0.15mg/mL/肽(=75μg)，不超过3mg/mL/肽(=1500μg)。该套件还可包括商业和用户角度来说可取的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂，过滤液、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。
本发明中的套件可能有一个单独的容器，其中包含本发明所述的药物组合物制剂，该制剂可有其它成分(例如，其它化合物或及其药物组合物)，也可无其它成分，或者每种成分都有其不同容器。
优选情况是，本发明的套件包括与本发明的一种制剂，包装后与第二种化合物(如佐剂(例如GM-CSF)、化疗药物、天然产品、激素或拮抗剂、抗血管生成剂或抑制剂、凋亡诱导剂或螯合剂)或其药物组合物联合使用。该套件的成分可进行预络合或每种成分在给予患者之前可放置于单独的不同容器。该套件的成分可以是一种或多种溶液，优选为水溶液，更优选为无菌水溶液。该套件的成分也可为固体形式，加入合适的溶剂后转换为液体，最好放置于另一个不同的容器中。
治疗套件的容器可能为西林瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器、或任何其它盛装固体或液体的工具。通常，当成分不只一种时，套件将包含第二个西林瓶或其它容器，使之可以单独定量。该套件还可能包含另一个装载药用液体的容器。优选情况是，治疗套件将包含一个设备(如，一个或多个针头、注射器、滴眼器、吸液管等)，使得可注射本发明的药物(本套件的组合物)。
本发明的药物配方适合以任何可接受的途径进行肽给药，如口服(肠道)、鼻内、眼内、皮下、皮内、肌内，静脉或经皮给药。优选为皮下给药，最优选为皮内给药，也可通过输液泵给药。
由于本发明的肽从AML相关肿瘤组织中分离而得，因此，本发明的药剂优选用于治疗AML。在一项优选的实施方案中，源自ABCA13和MMP12的本发明中的肽从AML中分离而得，本发明的药剂优选用于治疗过量表达这些多肽的AML。
本发明进一步包括为个体患者制备个体化药物的一种方法，其中包括：制造含选自预筛选TUMAP存储库(数据库)至少一种肽的药物组合物，其中药物组合物中所用的至少一种肽选择为适合于个体患者。优选情况是，药物组合物为一种疫苗。该方法也可以改动以产生下游应用的T细胞克隆物，如：TCR隔离物。
“个体化药物”系指专门针对个体患者的治疗，将仅用于该等个体患者，包括个体化活性癌症疫苗以及使用自体组织的过继细胞疗法。
如本文所述，“存储库”应指已经接受免疫原性预筛查并在特定肿瘤类型中过量提呈的一组肽，例如，以数据库或实际存储单元的形式。“存储库”一词并不暗示，疫苗中包括的特定肽已预先制造并储存于物理设备中，虽然预期有这种可能性。明确预期所述肽可以用于新制造每种个体化疫苗，也可能被预先制造和储存。
存储库(例如，数据库或实际存储单元形式)由肿瘤相关肽组成，其在分析的几位HLA-A、HLA-B和HLA-C阳性AML患者的肿瘤组织中高度过表(见表1至表3)。其含有包括MHC I类和MHC II类肽。除了从几种GBM组织中采集的肿瘤相关肽外，存储库还可能包含HLA-A*02和HLA-A*24标记肽。对于这些肽，可比较TUMAPS以定量方式诱导的T细胞免疫幅度，因此，可以对疫苗诱导抗肿瘤反应的能力作出重要的结论。第二，在患者中没有观察到对源自“自身”抗原的TUMAP产生任何疫苗诱导的T细胞反应时，其充当源自“非自身”抗原的一种重要的阳性对照肽。第三，它还可对患者的免疫功能状态得出结论。
存储库(例如，数据库或实际存储单元形式)的HLA I类和II类TUMAP通过使用一种功能基因组学方法进行鉴定，该方法结合了基因表达分析、质谱法和T细胞免疫学。该方法确保了只选择真实存在于高百分比肿瘤但在正常组织中不表达或仅很少量表达的TUMAP用于进一步分析。对于肽的选择，患者的AML样本和健康供体的血液以循序渐进的方法进行分析：
1.恶性材料的HLA配体用质谱法确定
2.使用微数组的全基因组信使核糖核酸(mRNA)表达分析法用于确定恶性肿瘤组织(AML)与一系列正常器官和组织相比过度表达的基因。
3.确定的HLA配体与基因表达数据进行比较。第1步中检测到的选择性表达或过量表达基因所编码的肽考虑为多肽疫苗的合适候选TUMAP。
4.文献检索以确定更多证据以支持确认为TUMP的肽的相关性
5.过度表达在mRNA水平的相关性由肿瘤组织第3步选定的TUMAP重新检测而确定，并且在健康组织上缺乏(或不经常)检测
6.为了评估通过选定的肽诱导体内T细胞反应是否可行，使用健康供体以及AML患者的人T细胞进行体外免疫原性测定。
一方面，在纳入存储库之前，所述肽接受免疫原性预筛查。举例来说(但不限于此)，纳入存储库的肽的免疫原性的确定方法包括体外T细胞启动，具体为：用装载肽/MHC复合物和抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞反复刺激来自健康供体的CD8+T细胞。
这种方法优选用于罕见癌症以及有罕见表达谱的患者。与含目前开发为固定组分的多肽鸡尾酒相反的是，存储库可将肿瘤中抗原的实际表达于疫苗进行更高程度的匹配。在多目标方法中，每名患者将使用几种“现成”肽的选定单一肽或组合。理论上来说，基于从50抗原肽库中选择例如5种不同抗原肽的一种方法可提供大约170万种可能的药物产品(DP)组分。
在一方面，选择所述肽用于疫苗，其基于个体患者的适合性，并使用本发明此处以及后文所述的一种方法。
HLA表型、转录和肽组学资料将从患者的肿瘤材料和血液样本中收集，以确定最合适每名患者且含有存储库(数据库)和患者独特(即突变)TUMAP的肽。将选择的那些肽选择性地或过度表达于患者肿瘤中，并且可能的情况下，如果用患者个体PBMC进行检测，则表现出很强的体外免疫原性。
优选的情况是，疫苗所包括的肽的一种确定方法包括：(a)识别由来自个体患者肿瘤样本提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；(b)将(a)中鉴定的肽与上述肽的存储库(数据库)进行比对；且(c)从与患者中确定的肿瘤相关肽相关的存储库(数据库)中选择至少一种肽。例如，肿瘤样本提呈的TUMAP的鉴定方法有：(a1)将来自肿瘤样本的表达数据与所述肿瘤样本组织类型相对应的正常组织样本的表达数据相比对，以识别肿瘤组织中过量表达或异常表达的蛋白；以及(a2)将表达数据与结合到肿瘤样本中I类MHC和/或II类分子的MHC配体序列想关联，以确定来源于肿瘤过量表达或异常表达的蛋白质的MHC配体。优选情况是，MHC配体的序列的确定方法是：洗脱来自肿瘤样本分离的MHC分子结合肽，并测序洗脱配体。优选情况是，肿瘤样本和正常组织从同一患者获得。
除了使用存储模型选择肽以外，或作为一种替代方法，TUMAP可能在新患者中进行鉴定，然后列入疫苗中。作为一种实施例，患者中的候选TUMAP可通过以下方法进行鉴定：(a1)将来自肿瘤样本的表达数据与所述肿瘤样本组织类型相对应的正常组织样本的表达数据相比对，以识别肿瘤组织中过量表达或异常表达的蛋白；以及(a2)将表达数据与结合到肿瘤样本中I类MHC和/或II类分子的MHC配体序列想关联，以确定来源于肿瘤过量表达或异常表达的蛋白质的MHC配体。作为另一实施例，蛋白的鉴定方法为可包含突变，其对于肿瘤样本相对于个体患者的相应正常组织是独特的，并且TUMAP可通过特异性靶向作用于变异来鉴定。例如，肿瘤以及相应正常组织的基因组可通过全基因组测序方法进行测序：为了发现基因蛋白质编码区域的非同义突变，从肿瘤组织中萃取基因组DNA和RNA，从外周血单核细胞(PBMC)中提取正常非突变基因组种系DNA。运用的NGS方法只限于蛋白编码区的重测序(外显子组重测序)。为了这一目的，使用供货商提供的靶序列富集试剂盒来捕获来自人样本的外显子DNA，随后使用HiSeq2000(Illumina公司)进行测序。此外，对肿瘤的mRNA进行测序，以直接定量基因表达，并确认突变基因在患者肿瘤中表达。得到的数以百万计的序列读数通过软件算法处理。输出列表中包含突变和基因表达。肿瘤特异性体突变通过与PBMC衍生的种系变化比较来确定，并进行优化。然后，为了存储库(数据库)可能测试新确定的肽了解如上所述的免疫原性，并且选择具有合适免疫原性的候选TUMAP用于疫苗。
在一个示范实施方案中，疫苗中所含肽通过以下方法确定：(a)用上述方法识别由来自个体患者肿瘤样本提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；(b)将(a)中鉴定的肽与进行肿瘤(与相应的正常组织相比)免疫原性和过量提呈预筛查肽的存储库(数据库)进行比对；(c)从与患者中确定的肿瘤相关肽相关的存储库(数据库)中选择至少一种肽；及(d)可选地在(a)中选择至少一种新确定的肽，确认其免疫原性。
在一个示范实施方案中，疫苗中所含肽通过以下方法确定：(a)识别由来自个体患者肿瘤样本提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；以及(b)在(a)中选择至少一种新确定的肽，并确认其免疫原性。
一旦选择该肽时，则制造疫苗。
该疫苗优选为一种液体制剂，包括溶解于33％DMSO中的个体肽。
列入产品的每种肽都溶于DMSO中。单个肽溶液浓度的选择取决于要列入产品中的肽的数量。单肽-DMSO溶液均等混合，以实现一种溶液中包含所有的肽，且浓度为每肽～2.5mg/ml。然后该混合溶液按照1∶3比例用注射用水进行稀释，以达到在33％DMSO中每肽0.826mg/ml的浓度。稀释的溶液通过0.22μm无菌筛检程序进行过滤。从而获得最终本体溶液。
最终本体溶液填充到小瓶中，在使用前储存于-20℃下。一个小瓶包含700μL溶液，其中每种肽含有0.578mg。其中的500μL(每种肽约400μg)将用于皮内注射。
下列描述优选方案的参照随附图表的实施例将对本发明进行说明(但是不仅限于此)。考虑到本发明的目的，文中引用的所有参考文献通过引用的方式并入在本文中。
附图简要说明
图1显示了原发性AML样本和健康供体HSC的HLA表面表达。使用QIFIKIT(Dako公司)进行体外定量。(a)CD34+AML原始细胞与自体CD15+正常单核细胞相比时的HLA I类(W6/32 mAb)表达。(b)CD34+AML原始细胞与自体CD15+正常单核细胞相比时的HLA-DR(L243mAb)表达。(c)CD34+AML原始细胞(n=5)与源自健康供体的自体CD34+CD38-造血干细胞(n=5)相比时的HLA I类(W6/32 mAb)表达。(d)CD34+AML原始细胞(n=5)与源自健康供体的自体CD34+CD38-造血干细胞(n=5)相比时的HLA-DR(L243 mAb)表达。*P＜0.05，***P＜0.001，非配对t检验。缩写词：UPN，uniform patient number(统一患者号)
图2显示了HLA配体的数目以及来自原发性AML样本的源蛋白质鉴定。在原发性AML样本中针对HLA I类(W6/32mAb，n=15)以及针对HLA II类(Tü39mAb，n=12)使用LC-MS/MS鉴定的唯一ID(肽序列和相应的源蛋白质)。只有满足≥500(HLA I类)和≥100(HLA II类)独特配体识别(每样本)阈值的样本才被列入本研究。缩写词：ID，identification(鉴定)；UPN，uniform patient number(统一患者号)
图3显示了基于AML(n=15)、PBMC(n=30)和BMNC(n=5)HLA I类配体组/源蛋白组表征的肽疫苗目标的鉴定。(a)AML、PBMC和BMNC的HLA I类配体源蛋白的重迭。(b)基于AML、PBMC和BMNC的HLA限制表示的频率，比较分析HLA I类配体源蛋白。各源蛋白(x轴)HLA限制表示阳性的患者/供体绝对数量都在y轴上表示。虚线表示每个相应队列的100％表示。左侧方框示突出显示了源蛋白的子集，显示AML排他性表示，频率为＞20％(LiTAA：配体源性肿瘤相关抗原)。(c)HLA-I类配体组的公开AML相关抗原的代表分析。纵轴表示AML、PBMC和BMNC的HLA I类配体对相应抗原的相对表示。(d)FLT3-ITD突变(n=8)与FLT3-WT(n=7)AMLHLA I类配体组的子集特定分析。针对FLT3-ITD和FLT3-WT AML的AML排他性源蛋白重迭分析(定义如(b))。(c)基于FLT3-ITD和FLT3-WT AML的HLA限制表示的频率，比较分析AML排他性HLA I类配体源蛋白。中间的方框示突出显示了共享源蛋白的子集，其中包括91.3％此处定义的LiTAA。
图4显示了HLA I类AML-LiTAP的功能特性。(a)在用2种不同A*03限制型AML LiTAP(配体组源性肿瘤相关肽)库(PI 1和PI 2)刺激后，对AML患者的PBMC进行IFN-γELISPOT测定。PHA作为阳性对照，用HIV GAG18-26A*03肽作为阴性对照进行刺激。对于PI 1和PI 2，观察到了明显的IFN-γ产生。(b)PI 1和PI 2刺激的AML患者的PBMC的IFN-γ和TNF-α细胞内染色(与(a)中相同)。PMA/离子霉素作为阳性对照，HIV GAG18-26A*03肽作为阴性对照。(c)用A*03限制型AML LiTAP库PI 1和PI 2刺激后，对健康供体的PBMC进行IFN-γELISPOT交叉检查，显示无显著的IFN-γ产生。
图5显示了基于AML HLA II类配体组表征的附加/协同肽疫苗靶的鉴定。(a)AML(n=12)、PBMC(n=13)和BMNC(n=2)HLA II类配体源蛋白组的重迭分析。(b)基于AML、PBMC和BMNC的HLA限制表示的频率，比较分析HLA II类配体源蛋白。各源蛋白(x轴)HLA限制表示阳性的患者/供体绝对数量都在y轴上表示。虚线表示每个相应队列的100％表示。左侧方框示突出显示了源蛋白的子集，显示AML排他性表示，频率为＞20％。(c)HLA I类和HLA II类AML排他性源蛋白的重迭分析。(d)在43个共享AML排他性源蛋白中，确定3个蛋白以包括嵌入HLA II类肽的完整HLA I类配体。嵌入的序列用粗体字表示。(e)在不同的HLA II类AMLLiTAP(PII 1、PIII 2和PIII 3)刺激后，对AML患者的PBMC进行IFN-γELISPOT测定。PHA作为阳性对照，用FLNA1669-1683HLA-DR肽作为阴性对照进行刺激。对于PII 1、PIII 2和PIII 3，在多名患者中观察到了明显的IFN-γ产生增加。缩写词：UPN，uniform patient number(统一患者号)。
图6显示了实验的结果，该试验评价FLT3-ITD(n=8)与FLT3-WT(n=7)子集中HLA I类配体组的内部异质性。发明人进行了半定量相似度索引。为了比较不同HLA类型的配体组，发明人对HLA配体源蛋白水平进行了分析。半定量信息来源于分析表示HLA配体的光谱计数(PSM)。欧氏距离作为样本-配对相似度/相异性的指标进行了分析，低值表示高相似性，高值表示高相异性。使用内部Python脚本(Python v3.3.3，Python SoftwareFoundation)分别计算每个子集内每个可能的样本对的欧氏距离。简言之，每个样本对的总PSM计数进行了正常化处理，使之成为相应更高计数的样本。源蛋白列表进行了合并，并对代表相应源蛋白的PSM计数差的绝对值进行了总结，以获得欧氏距离。***P＜0.001，非配对t检验。
实施例
实施例1：
细胞表面提呈的肿瘤相关肽的识别和定量
组织样本
患者的肿瘤样本由德国蒂宾根大学提供。所有患者都提供了书面的知情同意。手术后立即用液态氮对样本进行冷休克处理，在分离TUMAP前储存于-80℃下。对于配体组分析，在治疗前诊断或复发时从AML患者身上获取的PBMC(血液中AML原始细胞计数＞80％)以及健康供体的PBMC和BMNC通过密度梯度离心进行分离。
从组织样本中分离HLA肽
HLA I类和II类分子采用前面所述的标准免疫亲和纯化方法进行分离。简言之，速冻细胞颗粒在含1x蛋白酶抑制剂(Complete，Roche，Basel，Switzerland)的10mM CHAPS/PBS(AppliChem，St.Louis，MO，USA/Gibco，Carlsbad，CA，USA)中溶解。HLA分子分别采用共价连接到CNBr活化琼脂糖(GE Healthcare，Chalfont St Giles，UK)的泛HLA I类特异性mAb W6/32和泛HLA II类特异性mAb Tü39进行单步纯化。HLA：肽复合物通过反复加入0.2％三氟乙酸(TFA，Merck，Whitehouse Station，NJ，USA)进行洗脱。洗脱级分E1-E8进行汇集，并使用离心过滤装置(Amicon，Millipore，Billerica，MA，USA)超滤对游离的HLA配体进行分离。使用ZipTip C18枪头(Millipore)从滤液中提取HLA配体并进行脱盐。提取肽在35μl的80％乙腈(ACN，Merck)/0.2％TFA中洗脱，离心完成干燥，并再混悬于25μl的1％ACN/0.05％TFA。在进行LC-MS/MS分析之前，在-20℃下存储样本。
通过LC-MS/MS分析HLA配体
肽样本通过反相液相色谱法(nanoUHPLC，UltiMate 3000RSLCnano，ThermoFisher，Waltham，MA，USA)分析，随后用在线耦合的LTQ Orbitrap XL混合质谱仪(ThermoFisher)进行分析。样本用5次技术重复进行分析。将5μl(20％)样本体积以注射到75μm x 2cm的捕获柱(Acclaim PepMap RSLC，ThermoFisher)，速度为4μl/分，共5.75分钟。随后在50℃下和175nl/分的流速在50μm x 50cm的分离柱(Acclaim PepMap RSLC，ThermoFisher)上进行肽分离，在140分钟的过程中施加2.4至32.0％CAN的梯度。洗脱肽通过纳喷雾电离进行电离，并在质谱仪中进行分析，其执行5次CID(碰撞诱导解离)方法，为调查扫描中5个最丰富的前体离子生成片段光谱。分辨率设置为60000。对于HLA I类配体，质量范围限于400-650m/z，充电状态2和3允许碎片化处理。对于HLA II类配体，分析了质量范围300-1,500m/z，充电状态≥2允许碎片化处理。
示范性过度提呈肽的提呈谱示于图3中。
肽特异性T细胞的扩增
来自AML患者和健康志愿者的PBMC在RPMI1640培养基(Gibco)中培养，该培养基补充有10％保存人血清(PHS，内部制备)、100mMβ巯基乙醇(Roth，Karlsruhe，Germany)和1％青霉素/链霉素(GE)。对于CD8+T细胞刺激，将PBMC解冻并用每肽1μg/ml进行脉冲。肽脉冲PBMC(5-6x 106个细胞/ml)在37℃和5％CO2下培养12天。在第0天与第1天，向培养基中加入5ng/ml IL-4(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)和5ng/ml IL-7(Promokine，Heidelberg，Germany)。在第3、5、7和9天，向培养基中加入2ng/ml IL-2(R&D Systems)。肽刺激的PBMC分别在第12天使用ELISPOT测定法和第13天使用细胞内细胞因子染色法进行功能特征分析。对于CD4+T细胞刺激，对CD8+T细胞按所述方法进行培养，并进行2次修饰：使用10μg/ml II类HLA肽进行冲击，不要加入IL-4和IL-7。
IFN-γELISPOT测定
IFN-γELISPOT测定按照前述方法进行(Widenmeyer M，Griesemann H，Stevanovic S，Feyerabend S，Klein R，Attig S，et al.Promiscuous survivin peptideinduces robust CD4+ T-cell responses in the majority of vaccinated cancerpatients.Int J Cancer.2012 Jul1；131(1)：140-9)。简言之，96孔硝基纤维素板(Millipore)涂覆有1mg/ml IFN-γmAb(Mabtech，Cincinnati，OH，USA)，并在4℃下温育过夜。培养板在37℃下用10％PHS封堵2小时。5x 105个细胞/孔的预刺激PBMC用1μg/ml(HLA I类)或2.5μg/ml(HLA II类)肽进行冲击，并温育24-26小时。根据制造商的说明进行读数。斑点用免疫斑点S5分析仪(CTL，Shaker Heights，OH，USA)进行计数。当计数为15个斑点/孔并且每孔的平均斑点数至少3倍高于阴性对照孔的平均斑点数时，则视为T细胞反应为阳性(根据癌症免疫指导计划(CIP)的指导方针)。
细胞内IFN-γ和TNF-a染色
肽特异性CD8+T细胞的频率和功能通过细胞内IFN-γ和TNF-α染色进行分析。PBMC用1μg/ml的个别肽进行冲击，并在含有10μg/ml布雷菲德菌素A(Sigma，St.Louis，MO，USA)和10μg/ml GolgiStop(BD)的溶液中温育6-8小时。细胞用Cytofix/Cytoperm(BD)、CD8-PECy7(Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA)、CD4-APC(BD Bioscience)、TNF-α-PE(Beckman Coulter)和IFN-γ-FITC(BD)进行标记。样本在FACS Canto II上分析。
HLA表面表达的量化
为了能与健康单核细胞进行比较，在含有CD15-AML原始细胞以及至少5％正常CD15+单核细胞(通过免疫表型分型确定)的附加患者样本中进行HLA表面表达的量化。HLA表面表达使用定量流式细胞测定试剂盒(Dako，Glostrup，Denmark)根据制造商的说明进行分析。简言之，一式三份的每种样本分别用泛HLA I类特异性单克隆抗体(mAb)W6/32、HLA-DR特异性mAb L243(两者均由内部制备)或IgG同种型对照物(BioLegend，SanDiego，CA，USA)进行染色。随后，在PBMC、BMNC以及量化珠上使用FITC缀合兔抗小鼠F(ab’)2片段(Dako)进行二次染色。表面标记物用直接标记的CD34(BD，Franklin Lakes，NJ，USA)、CD15(BD)、CD45(BD)和CD38(BD)进行染色。7AAD(BioLegend)添加为活力标志物，之后紧接着在LSR Fortessa细胞分析仪(BD)上进行流式细胞仪分析。
结果
原发性AML样本显示与自体良性白细胞相比，没有HLA表达或表达下调
AML原始细胞相比于相应良性白细胞的HLA表达水平已经测定。为此，HLA表面水平用流式细胞仪在5例CD15-AML患者和5名健康BMNC供体的小组中进行量化。AML原始细胞门控为CD34+、CD45med活细胞，并且它们的HLA表达与自体CD15+正常粒细胞和单核细胞进行了比较。HLA水平被认为与总HLA I类分子计数范围不同，在AML原始细胞上为45,189-261,647个分子/细胞，在CD15+细胞上为75,344-239,496个分子/细胞。HLA表面表达的患者个体分析(一式三份)显示在3/5的患者中有轻微但显著的过量表达(配对t检验，P≤0.001)。HLA-DR在AML原始细胞中表达量为1,476-45,150个分子/细胞，在CD15+细胞中表达量为0-3,252，并且在所有分析的患者中在AML原始细胞中明显较高(P≤0.001)。为了参考所需，对5名健康BMNC供体的造血干细胞(HSC，CD34+CD38-)上的HLA表面分子计数进行了分析。AML上HLA表面表达的综合统计学分析显示，与正常单核细胞相比平均HLA I类和II表达量无显著差异。正常HSC上的平均HLA I类计数(248587±35351个分子/细胞)被认为显著高于AML细胞(116445±37855个分子/细胞，P=0.034，图1c)。正常HSC上的平均HLA II类计数(38,373±5,159个分子/细胞)显示，与AML细胞相比，水平无显著上升(17,103±7,604个分子/细胞，P＝0.053)。
LC-MS/MS识别众多天然提呈HLA I和II类配体
对于在15名AML患者(表1)中代表6，104个源蛋白的共13238个不同肽，对于HLA I类配体组基因图谱进行了确定。每名患者确定的(癌症)独特肽的数目为563-2,733不等(平均1,299个肽)。在健康人群(30名PBMC供体，5名BMNC供体)中，共计确定17,940个独特肽(PBMC上17,322个肽/7,207个原始蛋白；BMNC上1,738个肽/1,384个原始蛋白，补充)。12名AML患者中HLA II类分析产生共2,816个独特肽(104-753个肽/患者，平均332个肽)，代表885个源蛋白。HLA II类健康人群(13名PBMC供体，2名BMNC供体)共产生2,202个不同的肽(PBMC上2,046个肽/756个原始蛋白；BMNC上317个肽/164个原始蛋白)。分析的细胞数量和肽鉴定数量发现与HLA I类(Spearman r=0.27，P=0.33)和HLA II类(r=0.31，P=0.33)均无相关性。
HLA-I类配体组的比较分析显示了大量AML相关抗原
为了确定AML肽疫苗的新靶点，AML、PBMC和BMNC组的HLA配体源蛋白进行了相对映射。HLA源蛋白的重迭分析显示，1,435个蛋白(23.6％的映射AML源蛋白)专门在AML患者的HLA配体组中表示。AML被发现与PBMC共享75.5％(4,588个蛋白)HLA源蛋白，与BMNC共享19.3％(1，173个蛋白)。BMNC的HLA配体源蛋白质显示，89.9％(1，173个蛋白)与PBMC源蛋白组重迭。在大量的潜在靶点中，我们选择最相关和广泛适用的候选靶点，以用于当前的疫苗设计。因此，我们将AML-排他性以及在AML配体组中的高频率代表性作为我们平台选用抗原的最重要标准。根据这些标准的HLA配体源蛋白排行确定了132个蛋白的子集(2.2％的AML源蛋白)专门在≥20％的AML配体组中表示。在以上两种标准定义的这些LiTAA(配体组源性肿瘤相关抗原)中，我们确定了排名最高的FAS相关因子1(FAF1)，这在8/15(53.3％)的患者配体组中检测到，并表示为6种不同的HLA配体(AEQFRLEQI(SEQ ID NO：1)(B*44)，FTAEFSSRY(SEQ ID NO：2)(A*03)，HHDESVLTNVF(SEQ ID NO：3)(B*38：01)，REQDEAYRL(SEQID NO：4)(B*44：25)，RPVMPSRQI(SEQ ID NO：5)(B*07)，VQREYNLNF(SEQ ID NO：6)(B*15)。在≥33％AML配体组中表示的排名前15的LiTAA概述见表2。总之，排名前132个最频繁LiTAA各个独自均可提供超过25种不同HLA限制的341个不同天然提呈HLA配体(LiTAP，配体组源性肿瘤相关肽)组，适合开发广泛适用的AML特异性肽疫苗。此外，表示频率＜20％且以1,727个不同HLA配体为代表的其它1,389个AML排他性源蛋白可以充当更多个性化疫苗设计方法的储存库。
源自确定AML相关抗原的天然提呈HLA-I类配体的识别
次要数据挖掘方法主要在天然提呈HLA配体数据集中对AML相关抗原进行识别和排名(如Anguille S，Van Tendeloo VF，Bememan ZN.Leukemia-associated antigens andtheir relevance to the immunotherapy of acute myeloidleukemia.Leukemia.2012Oct；26(10)：2186-96中的总结)。识别了122种不同的HLA配体，代表29种公布的抗原。引人注目的是，这些抗原中，我们发现＞80％(24/29)的抗原也在良性PBMC和/或BMNC上表达，因此并不具有AML特异性。
发现了FLT3(SELKMMTQL，B*40)(SEQ ID NO：338)、PASD1(LLGHLPAEI，C*01：02)(SEQ ID NO：447)、HOXA9(DAADELSVGRY，A*26：01)(SEQ ID NO：437)、AURKA(REVEIQSHL，B*49：01)(SEQ ID NO：400)和CCNA1的HLA表达相关的AML排他性(LEADPFLKY，B*18：01(SEQ IDNO：402)；EPPAVLLL，B*51：01(SEQ ID NO：401))。对于髓过氧化物酶(MPO)，共有19种不同的HLA配体被识别，并检测到在6/15(40％)的AML和0/30的PBMC配体组中表达。但是，对正常BMNC的分析显示，其在3/5(60％)的配体组中表达，强调了使用PBMC和BMNC进行靶点识别的相关性。总之，我们的分析表明，大部分确定的AML相关抗原均不符合肿瘤排他性HLA限制性表达的要求。
FLT3-ITD突变与FLT3-WT AML HLA I类配体组的子集特定分析确定了共享的LiTAA(虽然配体组有明显的不同)。
为了评估各种不同子集AML新靶点的适用性，我们分析了FMS-样酪氨酸激酶3内部串联复制(FLT3-ITD，n=8)和FLT3野生型(FLT3-WT，n=7)患者亚群中LiTAA表达的特点。HLAI类配体组的相似性索引显示，FLT3-WT子集显示相比于FLT3-TID子集(均值1687.0±156.5，n=21)显著较低的内部异质性(均值916.2±70.6，n=21，P＜0.0001，图6)。AML-排他性HLA源蛋白(FLT3-WT：748个蛋白，FLT3-ITD：926个蛋白)的重迭分析显示，重迭分别为32.0％(FLT3-WT/FLT3-ITD)和25.6％(FLT3-ITD/FLT3-WT)(图3d)。需要注意的是，42/46(91.3％)排名高的LiTAA被发现在这两个亚群中均有表达(图3e)。三种HLA配体源蛋白SKP1(5/8)、C16orf13(5/8)和ERLIN1(4/8)专门在FLT3-ITD子集中进行了识别，表达频率达到了≥50％。FLT3-WT特定LiTAA MUL1在4/7(57.1％)的FLT3-WT配体组中表达。总之，这些数据支持在靶点选择时HLA配体组人群分析的策略，同时指出了一小部分高频率、子集特定靶点。
LiTAP功能分析表明了AML-相关免疫反应
为了评估我们的HLA-A*03LiTAP的免疫原性和特异性，发明人接下来进行了为期12天回忆IFN-γELISPOT分析。从6名AML患者以及8名健康个体中获得的PBMC用不同库(PI 1和pI 2)排名高的HLA-A*03LiTAP进行刺激。使用两种肽库时，均在2/6的AML样本中观察到了明显的IFN-γ分泌(图4a)。为了证实这些发现，使用12天预刺激PBMC对IFN-γ和TNF-α进行了细胞内细胞因子染色和流式细胞术试验(图4b)。结果确认，PI 1和PI 2特异性CD8+T细胞反应的功能由IFN-γ(PI 1：1.6％，PI 2：1.7％CD8+T细胞)和TNF-α(PI 1：2.6％，PI 2：2.4％CD8+T细胞)分泌确定。使用经PI 1和PI 2刺激的A*03阳性健康供体PBMC进行的交叉检查ELISPOT分析显示IFN-γ无显著分泌(0/8，图4c)。这些初步表征证明，本文定义的LiTAP可充当AML特异性T细胞表位。
HLA II类配体组分析提供了额外的靶点，并精确定位潜在的协同嵌入式配体
HLA II类源蛋白的重迭分析显示，1,079个不同的HLA配体代表的396个蛋白(44.7％)专门在AML患者的HLA配体组中表达。AML被发现与PBMC和BMNC分别共享53.3％(472个蛋白)和15.1％(134个蛋白)的源蛋白组。BMNC显示，88.2％(127个蛋白)源蛋白组与PBMC重迭。执行上述针对HLA I类的相对HLA源蛋白组分析后，发明人能够确定36个LiTAA(以152个不同的HLA II类配体表达)，表达频率为≥20％。排名最高的II类LiTAA(A1BG)被在6/12(50％)患者中确定，其由5种不同的配体来代表。为了识别在HLA I类和II类配体组中均提呈的LiTAA，发明人随后与相应的AML排他性源蛋白组进行了比较。这表明，只有43个共享源蛋白组(HLA I类/HLA II类源蛋白组分别为3.0％/10.4％)。对II类配体进行相应的I类配体映射后，确定了3个含有完整嵌入式HLA I类配体的HLA II类肽。
为了在功能上分析HLA II类LiTAP，发明人进行了为期12天回忆IFN-γELISPOT检测。对于3/7排名靠前的LiTAP，在AML患者中检测到显著的IFN-γ分泌。对于肽PII 1(CLSTN1836-852)，4/15(26.7％)的AML患者中检测到了T细胞反应；对于肽PII 2(LAB5A123-138)，3/15(20.0％)的AML患者中检测到了T细胞反应；对于肽PII 3(MBL2191-206)，2/15(13.3％)的AML患者中检测到了T细胞反应。图5e显示了AML患者中PII 1、PII 2和PII 3肽特异性T细胞频率的一个实例。使用经PII 1、pII 2和pII 3刺激的健康供体PBMC进行的交叉检查ELISPOT分析显示IFN-γ无显著分泌(0/8)。因此，本文定义的AML-特定HLA II类表位可对HLAI类肽疫苗进行补充。
实施例2
编码本发明肽的基因的表达谱
并不是所有确定的AML并由MHC分子提呈于肿瘤细胞表面的肽都适合用于免疫治疗，这是因为这些肽大部分都由许多类型细胞表达的正常细胞蛋白衍生而来。这些肽只有很少一部分具有肿瘤相关性，并可能能够诱导对其来源肿瘤识别有高特异性的T细胞。为了确定这些肽并最大限度地降低这些肽接种所诱导的自身免疫风险，发明人主要采用从过量表达于肿瘤细胞上(与大多数正常组织相比)的蛋白中所获得的肽。
理想的肽来源于对该肿瘤独一无二且不出现于其它组织中的蛋白中。为了确定具有与理想基因相似表达谱的基因所产生的肽，确定的肽被分别分配到蛋白和基因中，从中获得基因并生成这些基因的表达谱。
RNA来源与制备
手术切除组织标本由德国海德堡大学(参见实施例1)在获得每名患者的书面知情同意后提供。手术后立即在液态氮中速冻肿瘤组织标本，之后在液态氮中用杵臼匀浆。使用TRI试剂(Ambion公司，Darmstadt，德国)之后用RNeasy(QIAGEN公司，Hilden，德国)清理从这些样本中制备总RNA；这两种方法都根据制造商的方案进行。
健康人体组织中的总RNA从商业途径获得(Ambion公司，Huntingdon，英国；Clontech公司，海德堡，德国；Stratagene公司，阿姆斯特丹，荷兰；BioChain公司，Hayward，CA，美国)。混合数个人(2至123个人)的RNA，从而使每个人的RNA得到等加权。
所有RNA样本的质量和数量都在Agilent 2100 Bioanalyzer分析仪(Agilent公司，Waldbronn，德国)上使用RNA 6000 Pico LabChip Kit试剂盒(Agilent公司)进行评估。
微数组实验
所有肿瘤和正常组织的RNA样本都使用Affymetrix Human Genome(HG)U133A或HG-U133Plus 2.0Affymetrix寡核苷酸芯片(Affymetrix公司，Santa Clara，CA，美国)进行基因表达分析。所有步骤都根据Affymetrix手册进行。简言之，如手册中所述，使用SuperScript RTII(Invitrogen公司)以及oligo-dT-T7引物(MWG Biotech公司，Ebersberg，德国)从5-8μg RNA中合成双链cDNA。用BioArray High Yield RNA TranscriptLabelling Kit(ENZO Diagnostics公司，Farmingdale，NY，美国)进行U133A测定或用GeneChip IVT Labelling Kit(Affymetrix公司)进行U133 Plus 2.0测定，之后用链霉亲和素-藻红蛋白和生物素化抗链霉素蛋白抗体(Molecular Probes公司，Leiden，荷兰)进行破碎、杂交和染色，这样完成体外转录。用Agilent 2500A GeneArray Scanner(U133A)或Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000(U133 Plus 2.0)对图像进行扫描，用GCOS软件(Affymetrix公司)在所有参数默认设置情况下对数据进行分析。为了实现标准化，使用了Affymetrix公司提供的100种管家基因(housekeeping gene)。相对表达值用软件给定的signal log ratio进行计算，正常肾组织样本的值任意设置为1.0。
本发明的代表性源基因在AML中高度过量表达的表达谱如图3所示。
实施例3
AML MHC-I类提呈肽的体外免疫原性
为了获得关于本发明TUMAP的免疫原性信息，发明人使用体外T细胞扩增分析方法进行了研究，其中该分析方法基于使用装载肽/MHC复合物和抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞(aAPC)进行反复刺激。用这种方法，发明人可显示出本发明目前为止9种HLA-A*0201限制TUMAP具有免疫原性，这表明这些肽为对抗人CD8+前体T细胞的T细胞表位。
CD8+T细胞体外启动
为了用载有肽-MHC复合物(pMHC)和抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞进行体外刺激，发明人首先从Transfusion Medicine Tuebingen，Germany中获取健康供体CD8微珠(Miltenyi Biotec，Bergisch-Gladbach，Germany)通过积极选择白细胞清除术后新鲜HLA-A*02产物而分离出CD8+T细胞。
分离出的CD8+淋巴细胞或PBMC使用前在T细胞培养基(TCM)中培养，培养基包括RPMI-Glutamax(Invitrogen公司，Karlsruhe，德国)并补充10％热灭活人AB血清(PAN-Biotech公司，Aidenbach，德国)、100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Cambrex公司，Cologne，德国)，1mM丙酮酸钠(CC Pro公司，Oberdorla，德国)和20μg/ml庆大霉素(Cambrex公司)。在此步骤中，2.5ng/ml的IL-7(Promo Cell公司，Heidelberg，德国)和10U/ml的IL-2(Novartis Pharma公司，Nümberg，德国)也加入TCM。
对于pMHC/抗-CD28涂层珠的生成、T细胞的刺激和读出，使用每刺激条件四个不同pMHC分子以及每个读出条件8个不同的pMHC分子在高度限定的体外系统中进行。
用于aAPC装载和流式细胞读出的所有pMHC复合物均来自于紫外线引起的MHC配体交换(Rodenko B，et al.Generation of peptide-MHC class I complexes through UV-mediated ligand exchange.Nat Protoc.2006；1(3)：1120-32)，并稍作修饰。为了确定通过交换获得的pMHC单体量，发明人根据Rodenko B，et al.，2006进行了乙链霉夹心ELISA检测。
纯化共刺激小鼠IgG2a抗人CD28 Ab 9.3(Jung G，et al.Induction ofcytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibodyheteroconjugates.Proc Natl Acad Sci USA.1987Jul；84(13)：4611-5)使用制造商(Perbio公司，波恩，德国)推荐的N-羟基琥珀酰亚胺生物素进行化学生物素化处理。所用珠为5.6μm的链霉抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙烯颗粒(Bangs Labooratories，伊利诺伊州，美国)。
用于阳性和阴性对照刺激物的pMHC分别为A*0201/MLA-001(从Melan-A/MART-1中修饰制得的肽ELAGIGILTV (SEQ ID NO：606))和A*0201/DDX5-001(从DDX5中获得的YLLPAIVHI(SEQ ID NO：607))。
800.000珠/200μl包裹于含有4x 12.5ng不同生物素-pMHC的96孔板、进行洗涤，随后加入体积为200μl的600ng生物素抗-CD28。在37℃下，在含5ng/ml IL-12(PromoCell)的200μl TCM中共培养1x106CD8+T细胞与2x105的清洗涂层珠3至4天，从而启动刺激。之后，一半培养基与补充80U/ml IL-2的新鲜TCM进行交换，并且培养在37℃下持续3至4天。这种刺激性周期总共进行3次。对于使用每条件8种不同pMHC分子的pMHC多聚体读出，二维组合编码方法如前述使用(Andersen et al.，2012Parallel detection of antigen-specific Tcell responses by combinatorial encoding of MHC multimers.Nat Protoc.2012 Apr12；7(5)：891-902.)，稍作修饰，涵盖耦合至5种不同的荧光染料。最后，用Live/dead nearIR染料(Invitrogen公司，Karlsruhe，德国)、CD8-FITC抗体克隆SK1(BD公司，Heidelberg，德国)和荧光pMHC多聚体而执行多聚体分析。对于分析，使用了配有合适激光仪和筛检程序的BD LSRII SORP细胞仪。肽特异性细胞以占总CD8+细胞的百分比形式进行计算。多聚体分析结果使用FlowJo软件(Tree Star公司，Oregon，美国)进行评估。特定多聚体+CD8+淋巴细胞的体外填装用与阴性对照刺激组比较而进行检测。如果健康供体中的至少一个可评价的体外刺激孔在体外刺激后发现含有特异性CD8+T细胞株(即该孔包含至少1％特定多聚体+细胞，并且特定多聚体+的百分比至少为阴性对照刺激中位数的10倍)，则检测给定抗原的免疫原性。
AML肽体外免疫原性
对于受到测试的HLA-I类肽，可通过肽特异性T细胞株的生成证明其体外免疫原性。TUMAP特异性多聚体对本发明的两种肽染色后流式细胞仪检测的典型结果如图4所示，同时也含有相应的阴性对照信息。
实施例4
肽的合成
所有的肽通过使用Fmoc策略以标准、广为接受的固相肽合成法合成。用制备方法RP-HPLC纯化之后，进行离子交换纯化程序从而加入生理兼容性反离子(例如，三氟乙酸盐、乙酸盐、铵或氯化物)。
每个肽的身份和纯度已使用质谱和RP-HPLC分析法确定。离子交换程序后，用冻干法获得白色至类白色的肽，纯度为90％至99.7％。
所有的TUMAP优选作为三氟乙酸盐或乙酸盐进行给药，其它合适的盐形式也可以。对于实施例3的测量，使用了该肽的三氟乙酸盐。
实施例5
MHC结合检测-MHC I类
本发明基于T细胞疗法的候选肽进一步测试其MHC结合能力(亲和性)。需要进行这些测定的单个肽-MHC复合物通过与分析的相关肽交换产生。只有可以与肽接受MHC分子有效地结合并稳定的候选肽才能防止MHC复合物的解离。为了确定交换反应的产率，将基于稳定MHC复合物轻链(β2m)的检测结果进行ELISA测定。检测总体上按照Rodenko等人(Rodenko，B.et a1.，Nat Protoc.1(2006)：1120-1132)描述的方法进行。
96孔Maxisorp板(NUNC)在室温下在PBS中以2ug/ml链霉包被过夜，用4倍洗涤并在37℃下在含封闭缓冲液的2％BSA中封闭1小时。折迭的HLA-A*0201/MLA-001单体作为标准品，涵盖15-500ng/ml的范围。紫外线交换反应的肽-MHC单体在封闭缓冲液中稀释100倍。样本在37℃下孵育1小时，洗涤四次，在37℃下以2μg/ml HRP缀合抗-β2m温育1小时，再次洗涤，并以NH2SO4封堵的TMB溶液进行检测。在450nm处测量吸收。在生成和产生抗体或其片段时和/或T细胞受体或其片段时，通常优选显示为高交换产率(优选为高于50％，最优选高于75％)的候选肽，这是因为它们对MHC分子表现出足够的亲合力，并能防止MHC复合物的解离。
测试的肽MHC I类结合评分为：＜20％=+；20％-49％=++；50％-75％=+++；＞=75％=++++
实施例6
MHC结合检测-MHC II类
HLA II类蛋白分为三个主要的同种型HLA-DR、-DP和DQ，它们由众多单倍型编码。各种α-和β-链的组合增加了任意人群中HLA II类蛋白的多样性。因此，选定的HLA II类TUMAP须与几个不同的HLA-DR分子结合(即，显示混杂结合能力)，才能在显著百分比的患者中产生有效的T细胞应答。
GALNT7-001和ERGIC1-001与各种HLA-DR单倍型的混杂结合情况以及所形成的复合物的稳定性在体外结合测定中进行了评估。
测试的肽有：
序列ID号 肽编号 序列 长度
597 GALNT7-001 GNQLFRINEANQLMQ 15
604 ERGIC1-001 FEGQFSINKVPGNFHVS 17
根据在HLA-A*02-和HLA-A*24-阳性的北美人群中的出现频率，选定了七个已被研究的HLA-DR单倍型。数据来自于美国国家骨髓库中登记的135万名各类HLA志愿者的分析(Mori M，Beatty PG，Graves M，Boucher KM，Milford EL(1997)。HLA gene and haplotypefrequencies in the North American population：the National Marrow DonorProgram Donor Registry.Transplantation 64，1017-1027)。该分析人口细分为以下族群：美国白人(N=997193)，非裔美国人(N=110057)，亚裔美国人(N=81139)，拉丁美洲人(N=100128)以及美洲原住民(N=19203)。
使用的MHC-肽结合测定法确定了每个候选肽结合到选定HLA II类单倍型以及稳定HLA肽复合物的能力。因此，候选肽用特定HLA II类蛋白在体外组合。
对于每个HLA单倍型，候选肽与特定HLA分子的结合能力与已知具有很强结合性的参考肽(阳性对照)进行了比较。实验标准误差从三次阳性对照的结合实验中得出。
除了肽与特定HLA分子的亲和力之外，所形成的HLA-肽复合物的持久稳定性对于发生免疫应答至关重要。因此，在在37℃下温育24小时后进行测定了解是否存在形成的HLA肽复合物。形成的MHC-肽复合物的稳定性计算为24小时时的以及在重折叠后立即收到的(相应地为0时)结合分数(百分比)。
GALNT7-001和ERGIC1-001在MHC-肽结合试验中的分析结果表明，这两种肽均与各种HLA单倍型结合。两种肽均显示可形成一种复合物，其中含有七个研究的HLA单倍型中的5个(HLA-DR1、-DR2、-DR4、-DR5和-DR7)。与阳性对照相比，所检测的结合分数范围0.02至约78.5％，明显高于非结合肽的分数。GALNT7-001表明与七个研究的HLA单倍型中四个(HLA-DR1、-DR2、-DR4、-DR7)具有较强的混杂结合力(即，结合分数超过15％，根据服务提供者的经验，该值被认为可反映强结合力)。对于ERGIC-001，两个研究的HLA单倍型的结合分数分别为约或超过15％(HLA-DR4、-DR5)。两种肽均没有与HLA-DR3和HLA-DR6结合。
所形成的HLA-GALNT7-001和HLA-ERGIC1-001复合物的稳定性分析表明，7个研究HLA肽复合物中的4个，24小时后在37℃下保持稳定(HLA-DR1、-DR4、-DR5、-DR7)。
GALNT7-001和ERGIC1-001与最常见HLA-DR单倍型结合力使用体外结合测定法分析显示两种肽具有混杂结合能力。两种肽均形成了复合物，含有7个研究HLA-DR单倍型中的5个。因此，分析表明，GALNT7-001具有与至少4个HLA-DR单倍型，ERGICl-001具有与至少2个HLA-DR单倍型结合的能力。此外，每个研究肽的5个HLA肽复合物中4个稳定至少24小时。因此，分析结果表明，这两种肽应当能够有助于在显著百分比的患者中产生有效的T细胞应答。
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Claims (48)

1.一种长度为9-100个氨基酸的肽，其包含与选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605的一个序列至少80％同源的一种氨基酸序列，或其一种药用盐。
2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽具有与人类主要组织兼容性复合物(MHC)I类分子和/或人类主要组织兼容性复合体(MHC)II类分子结合的能力。
3.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽的长度为9至30个氨基酸。
4.根据权利要求1所述的肽，其包括长度不超过10个氨基酸的N-末端和/或C-末端氨基酸延伸。
5.根据权利要求1至3任意一项所述的一种肽，其选自包括以下项的组：
(a)一种肽，其由与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605至少80％同源的氨基酸序列组成。
(b)(a)中的肽，其具有长度不超过10个氨基酸的核心序列N-末端延伸。
(c)(a)或(b)中的肽，其具有长度不超过10个氨基酸的C-末端延伸。
6.根据权利要求1至5任意一项所述的肽，其中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1至SEQID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605至少90％同源。
7.根据权利要求1至6任意一项所述的肽，其中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1至SEQID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605至少95％同源。
8.根据权利要求1至6任意一项所述的肽，其中，所述氨基酸序列包括任何SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605。
9.根据权利要求1或2所述的肽，其中，所述氨基酸序列包括任何SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605。
10.根据权利要求1至9任一项中所述的肽，其中该肽被修饰和/或包含非肽键。
11.一种与HLA配体反应的T细胞受体，其由与选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605组成的组的氨基酸序列至少80％同源。
12.根据权利要求11所述的T细胞受体，其中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605至少90％或95％同源。
13.根据权利要求11或12所述的T细胞受体，其中，所述氨基酸序列包括任何SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605。
14.根据权利要求11至13任意一项所述的T细胞受体，其中，所述氨基酸序列包括任何SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQID NO：605。
15.一种融合蛋白，其包括：
(a)一种氨基酸序列，其与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ IDNO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605至少80％同源；以及
(b)HLA-DR抗原相关不变链(Ii)N-端的1-80个氨基酸。
16.根据权利要求15所述的融合蛋白，其中，(a)的所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605至少90％，优选为95％同源。
17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中，(a)的所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326至SEQ ID NO：447或SEQ ID NO：448至SEQ ID NO：605。
18.一种核酸，其编码：
(a)根据权利要求1至10任一项中所述的肽；
(b)根据权利要求11至14任一项中所述的T细胞受体；或
(c)根据权利要求15至17任一项中所述的融合蛋白。
19.根据权利要求18中所述的核酸，其为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能为其组合物。
20.根据权利要求18或19中所述的一种包括核酸的表达载体。
21.根据权利要求18或19中所述的一种包括核酸的宿主细胞或根据权利要求20中所述的一种表达载体。
22.根据权利要求21中所述为一种抗原提呈细胞(例如树突状细胞)的宿主细胞。
23.根据权利要求1至10任一项中所述的肽、根据权利要求12至14任一项中所述的T细胞受体或根据权利要求15至17任一项中所述的融合蛋白的一种制备方法，所述方法包括培养根据权利要求21所述的宿主细胞以及从宿主细胞和/或其培养基中分离出所述肽、所述T细胞受体或所述融合蛋白。
24.一种体外制备启动的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，该方法包括将CTL与载有抗原的人I或II类MHC分子进行体外连接，这些分子在合适的抗原提呈细胞表面表达足够的一段时间从而以抗原特异性方式启动CTL，其中所述抗原为权利要求1至10任一项中所述的肽。
25.根据权利要求24中所述的方法，其中所述抗原通过与足够量的含抗原提呈细胞的抗原结合被载入表达于合适抗原提呈细胞表面的I或II类MHC分子。
26.根据权利要求25中所述的方法，其中该抗原提呈细胞包括一个表达载体，该载体有能力表达根据权利要求1至9任意项所述的肽。
27.一种启动细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其根据权利要求24至26中任一项所述的方法制备。
28.一种在患者中杀死靶向癌细胞的方法，该方法包括给予所述患者根据权利要求27所述的有效数量细胞毒性T淋巴细胞。
29.根据权利要求1至10任一项中所述的肽、根据权利要求12至14任一项中所述的T细胞受体、根据权利要求15至17任一项中所述的融合蛋白、根据权利要求18或19中所述的核酸、根据权利要求20中所述的表达载体、根据权利要求22或23中所述的宿主细胞或根据权利要求27中所述的启动细胞毒性T淋巴细胞作为药剂或用于制造药剂中的用途。
30.根据权利要求29中所述的用途，其中所述药剂系指一种疫苗。
31.根据权利要求29或30中所述的用途，其中所述药剂有抗癌活性。
32.根据权利要求29至31任一项中所述的用途，其中所述癌症为急性骨髓性白血病和/或慢性淋巴性白血病。
33.一种药物组合物，其包括至少一种活性成分，该成分选自根据权利要求1至10任一项中所述的肽、根据权利要求12至14任一项中所述的T细胞受体、根据权利要求15至17任一项中所述的融合蛋白、根据权利要求18或19中所述的核酸、根据权利要求20中所述的表达载体、根据权利要求22或23中所述的宿主细胞或根据权利要求27中所述的启动细胞毒性T淋巴细胞组成的组，以及一种药用载体。
34.一种药物组合物，其包括至少一种活性成分，该成分选自以下项组成的组
a)一种肽，具有与人类主要组织兼容性复合物(MHC)I类分子和/或人类主要组织兼容性复合体(MHC)II类分子结合的能力，并且其中所述肽是源自一种蛋白，其选自FAF1，PLXND1，GMNN，CPQ，ATP5L，ITGA5，SKP1，CHD1L，TGFBRAP1，NGLY1，APLP2，KIF2C，ELP3，DGKZ，MYCH2，SLC31A2，ERLIN1，SERPINB2，ABHD2，GAA，OPRL1，WDR45B，TUFM，MFAP1，ZNF543，STK4，ZKSCAN8，FNDC3B，TMEM164，THOC7，KLF2，TMEM126B，UFD1L，MUL1，VCPIP1，KIF20B，CSF3R，NOC4L，EMILIN2，SHANK3，UCK2，PHPT1，KIF15，SLC12A6，DOLK，EEF2K，PIK3R2，TMEM194A，CCS，ZNF264，LYRM1，NBN，TIPRL TIP41，RPS6KA4，RCBTB2，PAK4，ERCC1，DMD，UNG，CPA3，AZU1，ATP2B4，MARK3，HLA-DMA，NDUFS1，S100A11，HAL，PRIM1，RENBP，CCNG1，ZNF131，HRSP12，EIF6，TMPRSS3，UBE2G2，NOP14，TFCP2，TARBP1，TTL12，HLX，CBX2，ZNF638，C3AR1，TAF9，FSCN1，ZNF805，CLEC 12A，SLX4IP，RLTPR，RNF19B，DDX46，LRRC8D，C16orf62，GOLGA7，RHOT1，BBS1，CEP76，GANC，ATP8B4，PPIL4，HPT1，CHTF18，DGCR8，ANKS1A，TOP1MT，PHACTR3，CCDC115，SORCS2，ACCS，ACBD6，ORAI3，SIKE1，C9orf156，EDEM2，NUP85，PANK2，SPATC1L，IKZF4，DHX33，METTL7A，QTRTD1，TMBIM4，RAVER2，SDAD1，UCKL1，STMN3，CHIC2，ODF2L，PRR12，FARSA，CTDP1，A1BG，CORO1A，RPS5，C19orf10，PLIN3，CLSTN1，HSP90B1，B4GALT1，SPN，METAP1，HSPG2，QSOX1，MANBA，CREG1，LDHA，CP，COL1A1，CRP，APRT，MBL2，IFI30，LBP，RAB5A，ICAM3，MAN1A1，RBMX，PBX2，YARS，TPM4，RBL36A，GANAB，HSP90B2P，LAIR1，GALNT7，ARRDC1，和ERGIC1组成的组；
(b)与根据(a)中所述的肽产生反应的一种T细胞受体；
c)由根据(a)中所述的肽以及HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的第1至80N-端氨基酸组成的融合蛋白；
d)编码a)至c)任一项的一种核酸或一种包含所述核酸的表达载体。
e)包括d中表达载体的宿主细胞，和
f)一种启动的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，通过一种方法获得，该方法包括将CTL与a)中所述肽进行体外连接，该肽在合适的抗原提呈细胞表面表达足够的一段时间从而以抗原特异性方式启动该CTL；和一种药用载体。
35.一种在患者中杀死靶向细胞的方法，所述方法包括给予所述患者根据权利要求34所述的有效数量药物组合物。
36.一种用于识别肿瘤相关肽加入肽疫苗的方法，所述方法包括：
(a)洗脱和识别来自至少一种原发性肿瘤样本以及至少一种相应正常细胞样本的天然提呈HLA配体，
(b)基于识别的所述HLA配体，产生来自至少一种原发性肿瘤样本以及至少一种正常细胞样本的配体组；以及
(c)选择至少一种适用于作为组合物的HLA配体，a)其来源于至少一种肿瘤样本的所述细胞专用提呈的抗原，和b)其在至少一种肿瘤的所述配体组中表现出高频提呈性。
37.权利要求36所述的方法，其中所述提呈频率选自至少5％、10％和20％。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中使用多个样本，并产生了多个配体组。
39.一种用于识别肿瘤相关肽加入个体化肽疫苗的方法，其中在步骤(a)中使用来自个体患者的肿瘤样本。
40.根据权利要求36至39任一项所述的方法，其中，步骤(c)中的所述选择包括将所述配体组与进行肿瘤(与相应的非肿瘤组织相比)免疫原性和过量提呈预筛查肽的数据库进行比对。
41.根据权利要求36至40任一项所述的方法，其中，所述识别包括洗脱来自所述肿瘤样本的MHC分子结合肽，并测序所述洗脱的肽。
42.根据权利要求36至41任一项所述的方法，其中，至少正常组织样本与来自患者的肿瘤样本的组织类型向对应。
43.根据权利要求39至42任一项中所述的方法，其中数据库包含的所述肽用包括以下项的方法进行识别：
1)用质谱法识别来自所述肿瘤材料的HLA配体；
2)使用微数组的全基因组信使核糖核酸(mRNA)表达分析法识别肿瘤材料中过量表达的基因(与一系列正常组织相比)；
3)确定的HLA配体与基因表达数据进行比较；
4)选择步骤b)检测到的特异性表达或过量表达的基因所编码的肽；
5)确认肿瘤组织与正常组织相比，步骤c)选定的HLA配体重新检测而确定的在mRNA水平过度表达的相关性；和
6)为了评估通过选定的肽诱导体内T细胞反应是否可行，使用患者或健康供体的人T细胞进行体外免疫原性测定。
44.根据权利要求40至43任一项所述的方法，其中数据库是否包括肽免疫原性由选自体外免疫原性实验、个体HLA结合性患者免疫监测、MHC多聚体染色、ELISPOT分析以及细胞内细胞因子染色组成的一群方法中的一种方法确定。
45.根据权利要求40至44任一项中所述的方法，其中数据库包含SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：605的肽。
46.根据权利要求40至43任一项所述的方法，其进一步包括该步骤：识别至少一种具有至少一种突变并与该个体患者相应正常组织相比对所述肿瘤样本具有唯一性的肽，以及选择所述肽加入疫苗。
47.根据权利要求46中所述的方法，其中所述至少一种突变通过全基因组测序鉴定。
48.根据权利要求36至47任一项所述的方法，进一步包括该步骤：产生包含根据(c)选定的至少一种肿瘤相关肽的肽疫苗，其中所述的肽疫苗优选为个体化。
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