CN112409449B - Hla-a0201限定性kif15特异性抗肿瘤ctl优势表位肽及应用 - Google Patents
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Abstract
一种HLA‑A0201限定性KIF15特异性抗肿瘤CTL优势表位肽，为HLA‑A2限制性抗肿瘤CTL表位肽，能与人HLA‑A2分子的结合位点进行结合，为九肽，其序列为：Leu‑Leu‑Asp‑Ser‑Ala‑Ser‑Ala‑Gly‑Leu。本发明的能特异性诱导CTL的优势表位肽是使用配体组学、计算机模拟软件及药效学实验相结合的方法筛选得到，该短肽体外容易合成，能够诱导产生显著抗肿瘤免疫反应，具有非常大的开发应用价值，应用于肿瘤免疫治疗技术领域中。
Description
技术领域
本发明属于及肿瘤免疫治疗技术领域的多肽技术领域，具体涉及一种MHC-I类限制性抗肿瘤CTL优势表位肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
近年来，随着对免疫应答分子机制研究的深入，现已深入意识到机体免疫细胞并不是应对于各种各样的病原体或天然抗原的整体分子，而是针对各种各样抗原分子的抗原表位。目前细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）在抑制肿瘤中的作用受到极大重视，CD8+T细胞所识别的抗原需先经抗原提呈细胞处理，之后以“抗原肽-MHC-I类分子”复合物的形式呈现在抗原提呈细胞或靶细胞表面，相应的与MHC-I类分子结合的抗原肽即为CTL表位肽。表位肽能够激活诱导产生特异性CTL细胞，可对人类白细胞抗原HLA配型成功的肿瘤具有一定的杀伤效果。因此，研究开发一种抗肿瘤CTL优势表位肽是目前亟待解决的新课题。
发明内容
本发明目的在于找到有效激发 CTL 介导的特异性细胞免疫应答，发挥抗肿瘤效能的CTL优势表位肽。该发明利用配体组学方法得到的多肽进行预测、筛选和鉴定，精准筛选得到能够与人HLA-A2分子的结合位点进行结合、可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的表位肽，从而有效杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的，以及所述表位肽在制备用于临床治疗和检测肿瘤性疾病疫苗中的用途。
本发明实现方法：本发明提供一种肿瘤相关抗原来源的MHC-I 限制性 CTL 表位，该表位能够以高亲和力结合MHC-I类分子，所形成的复合物稳定，能够诱导肽特异性的 CTL免疫应答，表现为刺激肽特异性CTL 分泌高水平的 IFN-γ 并对肿瘤细胞产生特异性杀伤效应。
该肿瘤相关抗原优势表位肽为九肽，其氨基酸序列为：Leu-Leu-Asp-Ser-Ala-Ser-Ala-Gly-Leu。
所述的MHC-I类限制性靶向抗肿瘤CTL优势表位肽可通过人工固相合成，或通过原核细胞或真核细胞表达出纯化获得。
所述的抗肿瘤CTL优势表位肽根据表位肽与人HLA-A2分子相互作用机理，并根据其能有效与HLA-A2分子结合并能激活特异性T淋巴细胞的特性鉴定为有效的表位肽，该表位肽长度仅为9个氨基酸序列，体外容易合成，方便临床应用。
本发明的要点：提供能与人HLA-A2类分子的结合位点进行结合、可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的表位肽。其基本原理是：配体组学精准筛选得到差异肽段，生物信息学原理验证表位肽与人HLA-A2分子的理论结合能力，并通过计算机模拟联合T2亲和力实验进一步验证表位肽与HLA-A2分子的结合力；然后通过Fmoc固相合成法合成、HPLC纯化表位肽，并通过HPLC-MS分析其纯度和分子量；最终利用DC负载表位肽诱导CTL细胞，并通过与MHC-I类分子表型的肿瘤靶细胞混合培养，观察CTL细胞免疫杀伤靶细胞的HLA-A2分子的限定性。
本发明的有益效果在于: 本发明公开了来源于肿瘤相关抗原的天然 CTL 优势表位肽，该 CTL优势表位能够肽能够诱导肽特异性的CTL免疫应答，表现为可刺激肽特异性CTL分泌高水平 IFN-γ 并对该表位肽来源蛋白阳性肿瘤细胞产生特异性杀伤效应，在肿瘤免疫治疗领域 具有很好的应用前景。
附图说明
下面结合附图及实例对本发明进行详细说明。
图1为该表位肽的空间结构模拟图。
图2为该表位肽和人HLA-A2分子结合的空间结构模拟图。
图3为该表位肽和人HLA-A2分子结合的空间电子云密度图。
图4为该表位肽的质谱分析图。
图5为该表位肽的高效液相色谱法分析图。
图6为该表位肽诱导的效应细胞对乳腺癌MDA-MB-231细胞及乳腺上皮细胞的杀伤作用。
具体实施方式
以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。
该肿瘤相关抗原优势CTL优势表位肽，能与人HLA-A2分子的结合位点进行结合，可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞，该表位肽具有下列氨基酸序列为：Leu-Leu-Asp-Ser-Ala-Ser-Ala-Gly-Leu。
所述的人HLA-A2限制性靶向抗肿瘤CTL优势表位肽可通过人工合成，或通过原核细胞或真核细胞表达出纯化获得。
所述的抗肿瘤CTL优势表位肽根据表位肽与人HLA-A2分子相互作用机理，并根据其能有效与HLA-A2分子结合并能激活特异性T淋巴细胞的特性鉴定为有效的表位肽，该表位肽长度仅为9个氨基酸序列，体外容易合成，方便临床应用。
以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明不限于这些内容。
实施例一
利用配体组学筛选得到该CTL优势表位肽。
利用亲和层析获得与HLA-A2亲和的表位肽，通过LC/MS确认其结构，并利用NCBIBlast确认其来源蛋白，筛选获得来源于KIF15的优势CTL表位肽。
表位肽与人MHC-I类分子亲和力验证。
通过超基序法，验证本发明设计的多肽序列与MHC-I类分子结合特性。
1. 超基序法是基于在同一人白细胞抗原（HLA）家族，甚至不同家族的HLA同种异型分子接纳的抗原肽具有相同或相似的锚点残基构成的肽基序，超基序主要作用的锚点残基是位于肽链2位（P2）氨基酸残基及羧基末端9位（P9）氨基酸残基。当P2、P9的残基为A、I、L、M、V、T时，且第二位为芳香族氨基酸，第九位为疏水性氨基酸，与HLA-A2分子具有较高的亲和力。这些氨基酸的特定基序是多肽分子与MHC-I分子结合的活性位点或关键氨基酸，决定了与MHC-I类分子结合多肽的活性特征。
超基序法预测CTL表位虽然克服了以往采用简单基序法易产生的假阴性结果,但由于此预测法与基序法具有相同的弱点,即在预测中仅仅考虑了二、九位残基的影响而忽略了其它位点的残基结合情况，易出现假阳性结果，故应联合量化基序法提高CTL表位预测的准确性(表1)。表1显示,超基序法表明表位肽HLA-A2分子具有很好的结合能力；表2为20种氨基酸的缩写表。
表1 超基序法获得多肽氨基酸序列与HLA-A2 结合的评分。
| 名称 | 123456789 | 超基序法 |
| CTL优势表位肽 | LLDSASAGL | 25 |
2.应用国际公认的表位肽预测网站http://tools.iedb.org/mhci/提供的分析软件对KIF15优势表位肽进行HLA-A2限定性分析，其percentile rank<2且IC50<50nM,具有高亲和力（表2）。
IEDB是用于向科学界公众提供与免疫表位识别相关的已发表实验数据，它记录了在传染病，过敏，自身免疫和移植背景下在人类，非人灵长类动物和其他动物物种中研究的抗体和T细胞表位的实验数据。IEDB还提供有助于预测和分析表位的工具。IEDB作为公开而可靠的实验数据库可以用于检测适应性免疫受体对免疫表位的识别。
通过应用IEBD中所提供的MHC-I类分子结合预测分析软件，可以完成对多肽氨基酸序列的分析（http://tools.iedb.org/mhci/）。
IEDB预测表明表位肽HLA-A0201分子具有很好的结合能力；表3为20种氨基酸的缩写表。
表2 IEDB获得多肽氨基酸序列与HLA-A1101 结合的评分
| 名称 | 123456789 | 百分比排名 | Ann_IC50 | Smm_IC50 |
| KIF15 | LLDSASAGL | 1.6 | 48.34 | 94.43 |
表3 氨基酸缩写表
计算机模拟表位肽与人 MHC-I 类分子的结合。
对上述所得表位肽用 ChemOffice软件包中的ChemDraw Ultra、ChemDraw 3DUltra分别建立表位肽的二维和三维结构；用 MOE 软件对表位肽和和HA-A2.1的能量和结构进行修饰，模拟二者结合的三维结构，进行分子动力学结合模拟和生理活性和运用价值的预估，主要包括以下方法: (1)表位肽分子模型构建。运用ChemOffice 软件包中的ChemDraw Ultra构建表位肽分子二维结构，再将表位肽的二维结构导入 ChemDraw 3DUltra得到三维模型并保存为Mol2格式，在对接模拟环节将三维结构导入MOE软件件中，依次选择下拉菜单Compute-Minimize- Molecule，出现 Minimize对话框进行多肽分子的能级优化，使之能级达到最小最适合与HLA-A2.1的复合物进行分子对接的能量和结构状态，然后将优化后的表位肽导出为MOL2格式，以备和HLA-A2.1的结合槽凹槽进行三维对接。(2)HLA-A2.1的复合物进行分子动力学模拟前准备。HLA-A2.1的初始坐标来自于蛋白质晶体结构专属网站 http://www.rcsb.org/pdb/，将获得的HLA-A2.1结构数据导入MOE 软件中，依次选择下拉菜单Applications-Docking Suite-Docking Ligands，出现 Docking对话框，在Filename栏的右边选择 Define对HLA-A2.1结构进行对接前结构修饰(修复侧链，脱水加氢)，结构修饰完成后分析获得 HLA-A2.1 的结合槽凹槽三维信息，保存以备与表位肽进行对接。(3)对接模型的构建。在MOE软件中依次打开 Applications- Docking Suite-Docking Ligands，出现Docking对话框，在Docking Model和Filename 栏选择获得的HLA-A2.1 的结合槽凹槽三维信息，在Ligand Source栏中选择Mole2 File 并选择MOL2格式的各个已经优化并处于能级最低的表位肽数据，分别进行对接并最终得到对接模拟的评分,通过对接模拟的评分值对表位肽分子和 HLA-A2.1 的结合力做预估，由于抗原肽与HLA-A2分子之间主要通过疏水作用、H键、盐键等弱相互作用进行分子间的识别，这些次级键作用越强，结合则越紧密。计算机模拟结果显示，该CTL表位肽与HLA-A2.1能有很好的结合（如图2）。
实施例二
表位肽的合成、纯化及分子量测定。
采用标准Fmoc方案，应用美国PE公司生产的ABI43IA型多肽合成仪进行多肽的合成，简述如下：按照多肽序列使肽链从羧基端向氨基端延伸，合成后,选用TFA/DCM进行切割，表位肽收集液在常温下减压干燥至1-2mL，然后用至少50mL预冷乙醚沉淀，然后抽滤，得到的多肽粗产品。将获得的表位肽粗品用少量 DMS0 溶解后，用水稀释至所需体积，浓度为10mg/mL，经 0.22um 纤维膜过滤后，在美国Waters公司产品Delta600型HPLC上纯化并进行纯度分析。流动相选用含0.1%TFA水溶液和含0.1%TFA乙氰溶液。各肽的纯化选用C18制备柱(美国Waters公司，7.0um，100A，7.8mm×150mm)，各肽的纯度分析选用C18 分析柱(美国Waters公司，5.0um，100A，3.9mm×150mm)。各纯化后多肽的相对分子质量测定在API 2000型(美国Waters公司)质谱仪上按常规方法进行，质谱分析图参见图4，HPLC分析图参见图5，表明了该CTL优势表位肽的分子量理论值均与实测值相近，且在允许误差范围之内、纯度均在95%以上，说明合成效果好，可用于下一步实验。上述多肽经冻干处理后放于-70℃保存、备用。
实施例三
T2亲和力实验检测表位肽与MHC-I类分子的结合。
本实施例利用T2细胞系的特点，检测表位肽与人MHC-I类分子的亲合力。T2 细胞可表达MHC-I类分子，但因其内源性抗原呈递途径中必需的抗原多肽转运蛋白(TAP)缺陷，故不能转运内源性抗原，只能将空载的HLA-A2分子呈递在细胞表面，而空载的HLA-A2分子在细胞表面不稳定，很快降解或返回细胞内部。但外源给予的抗原多肽与HLA-A2 分子结合成复合物后，可增强细胞表面HLA-A2分子的稳定性，而留在细胞表面。抗原肽与HLA-A2 的结合力越强，则T2细胞表面HLA-A2分子的表达量就越高。所以检测抗原多肽处理的T2细胞表面HLA-A2分子表达量的增加，可直观地反映外来抗原多肽与HLA-A2分子的结合力以及结合的稳定性，能够进一步证明本发明的多肽的有效性。
实施例中，T2 细胞经PBS洗涤2次，以无血清IMDM培养基重悬后，在6 孔培养板上按1×106/孔的密度种植，抗原多肽以二甲基亚砜(DMSO)溶解后，以 50ug/ml的浓度加入到T2细胞的培养液中，并设置空白对照组及阳性对照组，阳性对照组加入30ug/ml流感病毒基质蛋白多肽。各孔均加入3ug/ml人β2 微球蛋白。T2 细胞37℃，5%CO2、饱和湿度条件下培养24h 后。孵育结束后，T2 细胞以1000rpm离心5min，沉淀细胞以冰PBS洗涤3次，然后以100u1冰PBS 重悬，加入5ul鼠抗人HLA-A2.1-FITC单抗，4℃孵育15min，离心弃上清后以300u1冰PBS重悬，在流式细胞仪上检测平均荧光强度（MFI)。表3所示即为表位肽与 MHC-分子的亲和力实验结果。
结果以荧光系数（FI）作为衡量指标，计算公式为：荧光系数(FI)=(多肽平均荧光强度-β2微球蛋白平均荧光强度)/ β2微球蛋白平均荧光强度，判断标准：FI>1.5为多肽与HLA-A2.1结合力高，1.0<FI<1.5为中等结合力，FI>0.5为低结合力。
表4表位肽与MHC-I分子的亲和力实验结果。
| 抗原多肽 | 平均荧光强度(MFI) | 荧光系数(FI) |
| β2 微球蛋白 | 5304 | —— |
| 阳性对照 | 20917 | 2.94 |
| CTL优势表位肽 | 19682 | 2.71 |
实验结果表明：该CTL优势表位肽与MHC-I类分子有很高的结合力。
实施例四
钙黄素（Calcein-AM）释放实验表位肽对肿瘤细胞的靶向免疫杀伤效果。
1. 效应细胞的制备
诱导成熟的人DC，以 PBS清洗后，无血清IMDM培养基重悬，加 50ug/ml 表位肽，37℃孵育过夜。DC经PBS清洗、计数，按 30ug/ml的浓度加入丝裂霉素C，37℃孵育 30min。
DC经冰PBS清洗、计数后，与繁殖期T细胞按1:20比例共培养，并加入 50U/ml的IL-2，以刺激T细胞。1周刺激1次，共3次，将T细胞诱导成细胞毒性T细胞（CTL），即效应细胞。
2. 靶细胞的制备。。
复苏乳腺癌细胞MDA-MB-231和上皮细胞MCF-10A正常培养、传代。二者均为HLA-A2.1阳性。
3. 钙黄素释放实验。
以10mM浓度的Calcein-AM标记靶细胞，清洗、重悬；效应细胞与标记后的肿瘤细胞按照10:1、20:1、40:1的效靶比例，37℃共培养4h；然后收集培养液，1000rpm离心5min，取100ul上清液测定平均荧光强度，以单纯靶细胞作为自发释放量，以单纯靶细胞加去垢剂作为最大释放量。
效应细胞对靶细胞的杀伤率以细胞裂解率表示: 细胞裂解率=(实验释放量-自发释放量)/(最大释放量-自发释放量)。图6即为表位肽诱导的效应细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤结果。
注:杀伤作用以杀伤率(%已省略)表。
实验结果表明: 该表位肽具有特异性杀伤肿瘤细胞效应。
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
Leu Leu Asp Ser Ala Ser Ala Gly Leu 9
Claims (3)
1.一种来源于肿瘤相关抗原KIF15的抗肿瘤CTL表位肽，其特征在于：所述的抗肿瘤CTL表位肽与人HLA-A2分子特异性结合，激活特异性细胞毒性T淋巴细胞，其序列为Leu-Leu-Asp-Ser-Ala-Ser-Ala-Gly-Leu。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤CTL表位肽的制备方法，其特征在于：所述的抗肿瘤CTL表位肽采用固相合成法人工合成或通过原核细胞或真核细胞表达纯化获得。
3.权利要求1所述的抗肿瘤CTL表位肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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