CN113105527B - 一条hla-a2限制性肿瘤相关抗原e蛋白的抗肿瘤优势ctl表位肽及应用 - Google Patents
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Abstract
一条来源于肿瘤相关抗原E蛋白的抗肿瘤优势CTL表位肽，为HLA‑A2限制性抗肿瘤CTL表位肽，能被DC内吞后以肽‑MHC‑I类复合物形式呈递出来，为十四肽，其序列为：VGYAAPPSPPLSR；所述的抗肿瘤优势CTL表位肽，为具有该氨基酸序列的游离型多肽、融合型多肽和嵌合型多肽；以及以上所述为单体的各种形式的聚合体。本发明的能被DC内吞后以肽‑MHC‑I类复合物形式呈递出来特异性诱导CTL的优势表位肽体外容易合成，能够诱导特异性CTL分泌一定的IFN‑γ，并对HLA‑A*0201和E蛋白表达阳性的BT‑549和MDA‑MB‑231细胞产生一定的抗原特异性杀伤效应，制成的E蛋白表达阳性肿瘤的治疗性多肽疫苗，能够诱导产生显著抗肿瘤免疫反应，在肿瘤特异性免疫治疗领域有着巨大的开发应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域的多肽技术领域，具体涉及一种E蛋白来源的抗肿瘤CTL优势表位肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是新世纪人类的第一杀手。手术、放疗及化疗等传统治疗方法对某些肿瘤尤其是晚期恶性肿瘤的治疗效果尚不理想。目前细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic Tlymphocyte，CTL）在抑制肿瘤中的作用受到极大重视，如何有效激发 CTL 介导的特异性细胞免疫应答，发挥抗肿瘤效能，已经成为当今肿瘤治疗性多肽疫苗研制领域的一个重要课题。CD8+T细胞所识别的抗原需先经抗原提呈细胞处理，之后以“抗原肽-MHC-I类分子”复合物的形式呈现在抗原提呈细胞或靶细胞表面，相应的与MHC-I类分子结合的抗原肽即为CTL表位肽，因此，研究开发一种抗肿瘤CTL优势表位肽是目前亟待解决的新课题。
发明内容
肿瘤抗原的发现及其CTL表位肽的鉴定是肿瘤特异性免疫治疗以及肿瘤治疗性多肽疫苗研制的重要前提。本发明目的在于找到有效激发 CTL 介导的特异性细胞免疫应答，发挥抗肿瘤效能的CTL优势表位肽。细胞外基质蛋白-1在多种肿瘤细胞中显著高表达，且与多种肿瘤的发生和迁移显著相关，是肿瘤诊断和抗肿瘤治疗中有潜力的靶点。本发明通过高通量筛选和鉴定，精准筛选得到能够被DC内吞后以肽-MHC-I类分子复合物形式呈递在表面的CTL表位肽，可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的表位肽，从而有效杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的，以及所述表位肽在制备用于临床治疗和检测肿瘤性疾病疫苗中的用途；免疫原性弱和免疫耐受极大地限制了天然 CTL 表位在肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用，因此，有效提高天然 CTL 表位的免疫原性并打破机体的免疫耐受成为肿瘤治疗性多肽疫苗发展的关键。在众多肿瘤治疗性多肽疫苗的增强策略中，对天然 CTL 表位进行分子改造被认为是最行之有效的方法之一。由于 CTL 表位与主要组织相容性复合体 (MHC)- I类分子的结合是诱导 CTL 免疫应答的关键因素，而CTL表位与 MHC- I类分子结合的重要基础是锚定残基，因此，可通过改变锚定残基或其相邻位置的氨基酸残基以达到增强免疫原性而不影响特异性的目的。本发明提供一种肿瘤相关抗原E蛋白来源的MHC-I 限制性CTL表位，该表位能够被DC内吞后以高亲和力结合MHC-I类分子，所形成的复合物稳定，能够诱导肽特异性的 CTL 免疫应答，表现为刺激肽特异性CTL 分泌高水平的 IFN-γ 并对肿瘤细胞产生特异性杀伤效应；该肿瘤相关抗原优势表位肽为十三肽，其氨基酸序列为：VGYAAPPSPPLS所述的能够被DC内吞后以肽-MHC-I类复合物形式呈递在DC表面限制性靶向抗肿瘤CTL优势表位肽可通过人工合成，或通过原核细胞或真核细胞表达出纯化获得；所述的抗肿瘤CTL优势表位肽根据表位肽与人HLA-A2分子相互作用机理，并根据其能有效与HLA-A2分子结合并能激活特异性T淋巴细胞的特性鉴定为有效的表位肽，该表位肽长度为13个氨基酸序列，体外容易合成，方便临床应用；本发明的要点在于提供能与人HLA-A2类分子的结合位点进行结合、可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的表位肽。其基本原理是：利用生物信息学分析E蛋白在多种肿瘤细胞中表达，利用E蛋白全蛋白表达序列筛选E蛋白表位肽，验证表位肽与人HLA-A2分子的理论结合能力，并通过T2亲和力实验进一步验证表位肽与HLA-A2分子的结合力；然后通过Fmoc固相合成法合成、HPLC纯化表位肽，并通过HPLC-MS分析其纯度和分子量；最终利用DC负载表位肽诱导CTL细胞，并通过与MHC-I类分子表型的肿瘤靶细胞混合培养，观察CTL细胞免疫杀伤靶细胞的HLA-A2分子的限定性；本发明的有益效果在于:本发明公开了来源于肿瘤相关抗原的天然 CTL 优势表位肽，该 CTL优势表位能够肽能够诱导肽特异性的CTL免疫应答，表现为可刺激肽特异性CTL分泌高水平IFN-γ 并对该表位肽来源蛋白阳性肿瘤细胞产生特异性杀伤效应，在肿瘤免疫治疗领域具有很好的应用前景。
附图说明
下面结合附图及实例对本发明进行详细说明。
图1为该肿瘤抗原在多种肿瘤细胞中的表达结果。
图2为该表位肽与T2细胞亲和力的验证结果。
图3为该表位肽的质谱分析图。
图4为该表位肽的高效液相色谱法分析图。
图5为该表位肽对HLA-A*0201和E蛋白阳性肿瘤细胞的杀伤效应。
具体实施方式
该肿瘤相关抗原优势CTL优势表位肽，能与人HLA-A2分子的结合位点进行结合，可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞，该表位肽具有下列氨基酸序列为：
VGYAAPPSPPLS
所述的人HLA-A2限制性靶向抗肿瘤CTL优势表位肽可通过人工合成，或通过原核细胞或真核细胞表达出纯化获得。
所述的抗肿瘤CTL优势表位肽根据表位肽与人HLA-A2分子相互作用机理，并根据其能有效与HLA-A2分子结合并能激活特异性T淋巴细胞的特性鉴定为有效的表位肽，该表位肽长度为13个氨基酸序列，体外容易合成，方便临床应用。
以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明不限于这些内容。
实施例一
表位肽与人MHC-I类分子亲和力验证：
1. 通过超基序法，验证本发明设计的多肽序列与MHC-I类分子结合特性。
超基序法是基于在同一人白细胞抗原（HLA）家族，甚至不同家族的HLA同种异型分子接纳的抗原肽具有相同或相似的锚点残基构成的肽基序，超基序主要作用的锚点残基是位于肽链2位（P2）氨基酸残基及羧基末端9位（P9）氨基酸残基。当P2、P9的残基为A、I、L、M、V、T时，且第二位为芳香族氨基酸，第九位为疏水性氨基酸，与HLA-A2分子具有较高的亲和力。这些氨基酸的特定基序是多肽分子与MHC-I分子结合的活性位点或关键氨基酸，决定了与MHC-I类分子结合多肽的活性特征。
应用http://tools.iedb.org/mhci/ 提供分析软件对多肽氨基酸序列进行超基序法分析。
表1显示,超基序法表明表位肽HLA-A2分子具有很好的结合能力；
表2为20种氨基酸的缩写表。
表1 超基序法获得多肽氨基酸序列与HLA-A2 结合的评分
表2 氨基酸缩写表
1. E蛋白在多种肿瘤中表达情况
本实施例中利用GEPIA数据库分析E蛋白在多种肿瘤细胞中的表达
T2亲和力实验检测表位肽与MHC-I类分子的结合
本实施例利用T2细胞系的特点，检测表位肽与人MHC-I类分子的亲合力。T2 细胞可表达MHC-I类分子，但因其内源性抗原呈递途径中必需的抗原多肽转运蛋白(TAP)缺陷，故不能转运内源性抗原，只能将空载的HLA-A2分子呈递在细胞表面，而空载的HLA-A2分子在细胞表面不稳定，很快降解或返回细胞内部。但外源给予的抗原多肽与HLA-A2 分子结合成复合物后，可增强细胞表面HLA-A2分子的稳定性，而留在细胞表面。抗原肽与HLA-A2 的结合力越强，则T2细胞表面HLA-A2分子的表达量就越高。所以检测抗原多肽处理的T2细胞表面HLA-A2分子表达量的增加，可直观地反映外来抗原多肽与HLA-A2分子的结合力以及结合的稳定性，能够进一步证明本发明的多肽的有效性。
实施例中，T2 细胞经PBS洗涤2次，以无血清IMDM培养基重悬后，在6 孔培养板上按1×106/孔的密度种植，抗原多肽以二甲基亚砜(DMSO)溶解后，以 50ug/ml的浓度加入到T2细胞的培养液中，并设置空白对照组及阳性对照组，阳性对照组加入30ug/ml流感病毒基质蛋白多肽。各孔均加入3ug/ml人β2 微球蛋白。T2 细胞37℃，5%CO2、饱和湿度条件下培养24h 后。孵育结束后，T2 细胞以1000rpm离心5min，沉淀细胞以冰PBS洗涤3次，然后以100u1冰PBS 重悬，加入5ul鼠抗人HLA-A2.1-FITC单抗，4℃孵育15min，离心弃上清后以300u1冰PBS重悬，在流式细胞仪上检测平均荧光强度（MFI)。表3所示即为表位肽与 MHC-分子的亲和力实验结果。
结果以荧光系数（FI）作为衡量指标，计算公式为：荧光系数(FI)=(多肽平均荧光强度-β2微球蛋白平均荧光强度)/ β2微球蛋白平均荧光强度，判断标准：FI>1.5为多肽与HLA-A2.1结合力高，1.0<FI<1.5为中等结合力，FI>0.5为低结合力。
表3 表位肽与MHC-I分子的亲和力实验结果
实验结果表明：该CTL优势表位肽与MHC-I类分子有很高的结合力
实施例二
表位肽的合成、纯化及分子量测定:
采用标准Fmoc方案，应用美国PE公司生产的ABI43IA型多肽合成仪进行多肽的合成，简述如下：按照多肽序列使肽链从羧基端向氨基端延伸，合成后,选用TFA/DCM进行切割，表位肽收集液在常温下减压干燥至1-2mL，然后用至少50mL预冷乙醚沉淀，然后抽滤，得到的多肽粗产品。将获得的表位肽粗品用少量 DMS0 溶解后，用水稀释至所需体积，浓度为10mg/mL，经 0.22um 纤维膜过滤后，在美国Waters公司产品Delta600型HPLC上纯化并进行纯度分析。流动相选用含0.1%TFA水溶液和含0.1%TFA乙氰溶液。各肽的纯化选用C18制备柱
(美国Waters公司，7.0um，100A，7.8mm×150mm)，各肽的纯度分析选用C18 分析柱(美国Waters公司，5.0um，100A，3.9mm×150mm)。各纯化后多肽的相对分子质量测定在API2000型(美国Waters公司)质谱仪上按常规方法进行。其质谱分析图参见图3，HPLC分析图参见图4，可以看出该CTL优势表位肽的分子量理论值均与实测值相近，在允许无擦好范围之内，且纯度均在95%以上，说明合成效果好，可用于下一步实验。上述多肽经冻干处理后放于-70℃保存、备用。
实施例三
钙黄素（Calcein-AM）释放实验表位肽对肿瘤细胞的靶向免疫杀伤效果:
1. 效应细胞的制备
诱导成熟的人DC，以 PBS清洗后，无血清IMDM培养基重悬，加 50ug/ml 表位肽，37℃孵育过夜。DC经PBS清洗、计数，按 30ug/ml的浓度加入丝裂霉素C，37℃孵育 30min。
DC经冰PBS清洗、计数后，与繁殖期T细胞按1:20比例共培养，并加入 50U/ml的IL-2，以刺激T细胞。1周刺激1次，共3次，将T细胞诱导成细胞毒性T细胞（CTL），即效应细胞。
2. 靶细胞的制备
复苏乳腺癌细胞MDA-MB-231和上皮细胞BT-549正常培养、传代。二者均为HLA-A2.1阳性。
3. 钙黄素释放实验
以10mM浓度的Calcein-AM标记靶细胞，清洗、重悬；效应细胞与标记后的肿瘤细胞按照10:1、20:1、40:1的效靶比例，37℃共培养4h；然后收集培养液，1000rpm离心5min，取100ul上清液测定平均荧光强度，以单纯靶细胞作为自发释放量，以单纯靶细胞加去垢剂作为最大释放量。
效应细胞对靶细胞的杀伤率以细胞裂解率表示: 细胞裂解率=(实验释放量-自发释放量)/(最大释放量-自发释放量)。图5即为表位肽诱导的效应细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤结果。
注:杀伤作用以杀伤率(%已省略)表
实验结果表明: 该表位肽具有特异性杀伤肿瘤细胞效应。
序列表
<110> 辽宁中健医药科技有限公司
<120> 一条HLA-A2限制性肿瘤相关抗原E蛋白的抗肿瘤优势CTL表位肽及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
Val Gly Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Pro Pro Leu Ser Arg
1 5 10
Claims (3)
1.一种来源于肿瘤相关抗原E蛋白的抗肿瘤CTL表位肽，其特征在于：所述的抗肿瘤表位肽具有被DC细胞内吞后与人HLA-A2分子特异性结合呈递在细胞表面，激活特异性细胞毒性T淋巴细胞，其序列为VGYAAPPSPPLSR。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤CTL表位肽获得方法，其特征在于：所述的抗肿瘤CTL表位肽可采用固相合成法人工合成或通过原核细胞或真核细胞表达纯化获得。
3.权利要求1所述的抗肿瘤CTL表位肽在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
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