KR20180012865A - 골수종 및 기타 암의 면역요법에서의 사용을 위한 신규 세포 에피톱 및 세포 에피톱의 조합 - Google Patents

골수종 및 기타 암의 면역요법에서의 사용을 위한 신규 세포 에피톱 및 세포 에피톱의 조합 Download PDF

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한스-게오르크 람멘제
율리안 스틱켈
다니엘 코발레브스키
스테판 스테파노픽
시몬 발츠
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Abstract

본 발명은 면역요법 방법에서의 사용을 위한 펩티드, 단백질, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히 본 발명은 암, 특히 골수종의 면역요법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단독 또는 예를 들어 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 역할 가능한 기타 종양 연관 펩티드들과 병용하여 항종양 면역 반응을 촉진하거나 또는 세포를 생체외 촉진하여 환자로 이전하기 위한 종양 연관 T 세포 에피톱에 관한 것이다. 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합된 펩티드 또한 그러한 펩티드는 항체, 가용성 T 세포 수용체 및 기타 결합하는 분자의 표적일 수도 있다.

Description

골수종 및 기타 암의 면역요법에서의 사용을 위한 신규 세포 에피톱 및 세포 에피톱의 조합
본 발명은 면역요법에 사용되는 펩티드, 단백질, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히 본 발명은 암의 면역요법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 종양 연관 T 세포 에피톱을 단독으로 또는 예를 들어 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 역할 가능한 기타 종양 연관 펩티드들과 병용하여 항종양 면역 반응을 촉진하거나 또는 T 세포를 생체외 자극하여 환자에게 이전하는 것과 관련된다. 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합된 펩티드 또는 그러한 펩티드는 항체, 가용성 T 세포 수용체 및 기타 결합하는 분자의 표적일 수도 있다.
본 발명은 항종양 면역 반응을 이끌어내는데 필요한 백신 조성물에 또는 약학적/면역학적 활성 화합물 및 세포의 개발에 필요한 표적으로서 사용할 수 있는 인간 종양 세포의 HLA 클래스 I 및 II 분자로부터 유래하는 몇몇 신규 펩티드 서열들 및 이들의 변이체들에 관한 것이다.
다발성 골수종(MM)은 낮은 등급의 B세포 림프종으로 골수에서 악성 종양의 혈장 세포의 증식에 의해 특성화되었다[14]. 고용량 화합요법과 그 이후 자가 줄기세포 이식을 신규 면역조절 약물 및 프로테오솜 억제제 등 최근의 치료 관련 발전에도 불구하고 MM은 대개 치료불능한 것으로 남아 있다[15, 16]. 이것은 대부분 미세 잔존 질환(MRD)에 기인하며, 이는 높은 재발률을 유발시킨다[17, 18].
암 치료와 연관된 중증의 부작용과 비용을 비교하면, 일반적인 암 그리고 특히 골수종의 치료에서 사용가능한 요인들을 동정할 필요가 있다. 또한 일반적인 암 그리고 특히 골수종에 대한 암의 보다 나은 진찰과 예후의 평가 및 치료 성공의 예측을 초래하는 바이오마커를 나타내는 요인들을 동정할 필요도 있다.
항원 특이적 면역요법은 임상적으로 효과적인 T 세포 반응을 유도하는 잠재력을 보유하며, 장래의 병용 시험에서 암 면역요법의 특이성을 인도하고 증가시키기 위해 이용할 수 있다[3]. 이 목적을 위해, 종양 관련/특이적 T 세포 에피톱에 대한 정확한 지식이 중대하다. 과발현된 종양 항원에 대한 수십 년 동안의 연구 이후, 그 초점이 돌연변이 유래된 신생항원의 환자 개인화 확인으로 최근에 이동되었다[4, 5]. 이러한 연구로부터의 격려되는 발견 내용[6 ~ 8]은 네오에피톱을 항암 면역 반응의 우세한 표적으로서 간주하도록 유도했다[9 ~ 11].
그러나 본 발명자들은 혈액 악성 종양의 안티게놈을 분석하여, 돌연변이 되지 않은 항원이 자발적인 항백혈병 T 세포 반응의 관련 표적임을 최근에 입증하였다[12, 13]. 이러한 연구에서 구현된 전략은 건강 및 질병 상태의 혈액학적 세포의 자연적으로 제시된 HLA 리간돔을 질량분석법에 의해 차등적으로 시도화하며, 관련 있는 종양 관련 항원을 효율적으로 확인하는 것으로 나타났다.
지금까지 MM에 대해 확립된 면역요법적 접근 방식은 동종이형 조기 세포 이식이 유일하며, 이는 높은 이환율 및 사망률과 연관이 있으며 작은 비율만의 환자를 위한 옵션으로 남아 있다[19 ~ 21]. 특히 유리한 작용기 대 표적 비율에 의해 특성화되는 MRD의 배열에 있어서, 항원 특이적 T 세포 기반의 면역요법[22, 23]은 효과적이며 낮은 부작용 옵션을 제시할 수 있다[24].
종양 관련 항원(TAA)의 현재 분류는 다음과 같은 주요 군을 포함한다:
a) 암-고환 항원: 이미 확인되어 T 세포에 의해 인식된 첫 번째 TAA는 이 종류에 속하며, 이는 그 멤버들의 발현이 조직학적으로 인간 종양과 다르며, 정상 조직 중, 고환의 정모 세포/정원 세포에만 있으며, 때로는 태반에 있기 때문에 최초에 암-고환(CT) 항원이라고 불렸다. 고환 세포가 클래스 I 또는 II HLA 분자를 발현하지 않기 때문에, 이 항원들은 정상 세포에 있는 T 세포에 의해 인식될 수 없으며 면역학적으로 종양-특이적이라고 간주될 수 있다. CT 항원의 잘 알려진 예로는 MAGE 구성원 및 NY-ESO-1이 있다.
b) 분화 항원: 이러한 TAA는 종양 그리고 종양이 발생한 정상 세포 사이에 공유된다. 대부분의 알려진 분화 항원은 흑색종과 정상 멜라닌 세포에서 발견된다. 이러한 많은 멜라닌 세포 계통-관련 단백질은 멜라닌의 생합성과 관련되어 있으며 그러므로 종양 특이적은 아니지만 암 면역치료에 널리 사용된다. 예로는, 흑색종을 위한 티로시나아제 및 Melan-A/MART-1 또는 전립선암을 위한 PSA가 있고 이에 국한되지 않는다.
c) 과발현된 TAA: 일반적으로 낮은 발현 수준이 있는 많은 정상 조직뿐만 아니라 조직학적으로 다른 유형의 종양에서 유전자 인코딩에서 널리 발현된 TAA가 발견된다. 정상 조직에 의해 처리되고 잠재적으로 제시되는 많은 에피톱이 T 세포 인식의 임계치 수준보다 낮을 수 있고, T 세포의 종양 세포에서의 과발현은 이전에 확립된 내성을 중단시켜 항암 반응을 개시할 수 있다. 이 클래스 TAA의 유력한 예로는 Her-2/neu, 서바이빈, 텔로머라제 또는 WT1가 있다.
d) 종양 특이적 항원: 이러한 독특한 TAA는 정상 유전자의 변이로써 발생한다(β-카테닌, CDK4 등). 이러한 분자 변경의 일부는 종양 변이 및/또는 진행과 관련되어 있다. 종양 특이적 항원은 일반적으로 강한 면역 반응을 정상 조직에 대한 자가 면역 반응 위험성 없이 유도할 수 있다. 반면에, 대부분의 경우 TAA는 발견되어 일반적으로 많은 개별 종양에서 대개 공유되지 않은 해당 종양에만 적절하다. 종양 특이적(연관된) 아형을 갖는 단백질의 경우 펩티드가 종양(관련) 엑손으로부터 비롯된다면 펩티드의 종양-특이성(또는 연관성) 또한 발생할 수 있다.
e) 비정상 번역 후 변형에서 발생하는 TAA: 이러한 TAA는 특이적이 아니고 과발현되지도 않는 단백질에서 발생할 수 있지만 종양에서 주로 활동적인 번역 후 과정에 의해 종양과 관련된다. 이 클래스의 예는 종양 특이적일 수도 있고 아닐 수도 있는 분해 과정 동안 단백질 스플라이싱과 같은 이벤트 또는 MUC1의 경우 종양의 새로운 에피톱으로 이끄는 변화된 당화 패턴에서 발생한다.
f) 종양 바이러스 단백질: 이러한 TAA는 종양발생 과정에서 중요한 역할을 할 수 있는 바이러스 단백질이며, 그들이 이질적이기 때문에(인간 태생이 아닌), T 세포 반응을 일으킬 수 있다. 이런 단백질의 예로는 인간 유두종 타입 16 바이러스 단백질, 및 경부 암종에서 발현하는 E6와 E7이 있다.
T 세포 기반의 면역요법은 종양-관련 또는 종양-특정 단백질로부터 유래된 펩티드 에피톱을 표적으로 하며, 이는 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 의해 제시된다. 종양 특정 세포 독성 T 림프구에 의해 인식되는 항원, 즉 그들의 에피톱은, 발현되고, 같은 원조의 변형없는 세포들에 비해서, 각각의 종양의 대개 상향조절된 세포인 효소, 수용체, 전사 인자 등과 같은 모든 단백질 클래스에서 유도된 분자일 수 있다.
MHC-분자에는 두 클래스가 있으며, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II이다. MHC 클래스 I 알파 중사슬과 베타-2-저분자글로불린, 알파와 베타 사슬의 MHC 클래스 II 분자로 구성되어 있다. 이들의 3차원 형태는 결합 홈을 형성하며, 이는 펩티드와의 비공유결합에 사용된다.
MHC 클래스 I 분자는 대부분의 유핵 세포에서 찾을 수 있다. 이는 대부분 내인 단백질, 결손 리보솜 생성물(DRIP)과 큰 펩티드의 단백질분해성 절단으로 인해 생성된 펩티드를 제시한다. 그러나 엔도솜 구획이나 외생 출처로부터 유래된 펩티드 또한 MHC 클래스 I 분자에서 발견된다. 이러한 비고전적 방식의 클래스 I 제시를 문헌에서는 교차-제시라고 칭한다(Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC 클래스 II 분자는 대부분 전문적인 항원 제시 세포(APC)에서 찾아 볼 수 있으며, 이들은 주로 APC에 의해 섭취된 외인 또는 막횡단 단백질의 펩티드를 제시하며(예: 세포내이입 동안), 이는 후에 처리된다.
펩티드와 MHC 클래스 I 분자의 복합물은 적당한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 CD8-양성 T 세포에 의해서 인식이 되는 반면, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 복합물은 적당한 TCR을 갖는 CD4-양성 조력 T 세포에 의해 인식이 된다. TCR, 펩티드 및 MHC가 이로써 1:1:1의 화학양론적 반응량으로 존재한다는 사실은 잘 알려져 있다.
CD4-양성 보조 T 세포는 CD8-양성 세포 독성 T 세포에 의한 효과적인 반응을 유도하고 지속하는데 중요한 역할을 한다. 종양 연관 항원(TAA)에서 유도된 CD4-양성 T 세포 에피톱의 동정은 항-종양 면역 반응을 일으키기 위한 의약품의 개발에 아주 중요하다(Gnjatic et al., 2003). 종양 부위에서, 보조 T 세포는, 세포독성 T 세포(CTL) 친화적 사이토킨 주위 환경을 지원하고(Mortara et al., 2006) 효과기 세포, 예를 들면 CTL, 자연 살해(NK) 세포, 대식 세포, 과립구를 유치한다(Hwang et al., 2007).
염증이 없는 경우, MHC 클래스 II 분자의 발현은 주로 면역계의 세포, 특히 전문적 항원 제시 세포(APC), 예를 들면, 단핵 세포, 단핵 세포-유도된 세포, 대식 세포, 수지상 세포로 제한된다. 암 환자에서, 종양의 세포는 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 것으로 밝혀졌다(Dengjel J, et al., 2006).
본 발명의 신장 펩티드는 HLA 클래스 II 활성 에피톱으로 작용할 수 있다.
MHC 클래스 II에 의해 활성화된 조력 T 세포는 항-종양 면역에서 CTL 효과기 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다. CD8-양성 킬러 T 세포의 TH1 유형 지원 효과기 기능의 조력 T 세포 반응을 일으키는 조력 T 세포 에피톱은, 세포 표면에 종양-관련 펩티드/MHC 복합체를 보이는 종양 세포에 대한 세포 독성 기능을 포함한다. 이런 식으로 종양-관련 조력 T 세포 펩티드 에피톱은, 따로 또는 다른 종양-관련 펩티드와 함께, 항-종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성의 활성 약학 원료로 사용될 수 있다.
예를 들면, 생쥐 같은 포유류 동물 모델에서는 심지어 CD8-양성 T 림프구의 부재 하에서도, CD4-양성 T 세포가 인터페론-감마(IFNγ의 분비에 의한 혈관신생의 저해를 통한 종양의 억제 징후에 충분하다는 것이 보여졌다(Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). CD4 T 세포가 직접적 항종양 작용기라는 증거가 있다(Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).
이전에는 HLA 클래스 II 분자의 구성적 발현이 일반적으로 면역 세포로 제한되기 때문에, 클래스 II 펩티드를 원발성 종양에서 직접 격리하는 것은 가능하지 않다고 간주되었다. 그러나, Dengjel 등은 MHC 클래스 II 에피톱을 종양에서 직접적으로 식별하는데 성공 했다(WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1).
CD8 및 CD4에 의존하는 두 유형의 반응이 함께 상승작용에 의해 항종양 효과에 기여함으로써, CD8+ T 세포(리간드: MHC 클래스 I 분자 + 펩티드 에피톱) 또는 CD4-양성 조력 T 세포(리간드: MHC 클래스 II 분자 + 펩티드 에피톱)에 의해 인식되는 종양-관련 항원의 식별 및 특성화가 종양 백신의 개발에 중요하다.
MHC 클래스 I 펩티드 세포 면역 반응을 촉발(유도)하려면 MHC-분자에도 결합해야 한다. 이 프로세스는 MHC-분자의 대립형질 그리고 그 펩티드의 아미노산 서열의 특정한 다형성에 의존한다. MHC-클래스 I-결합 펩티드는 대개 길이가 8 내지 12개의 아미노산 잔기이며 대개 그 서열 내에 MHC-분자와 상응하는 결합 홈과 상호작용하는 두 개의 보존 잔기("고정")를 포함하고 있다. 이렇게 함으로써 각 MHC 대립형질은 어떤 펩티드가 결합 홈에 특정적으로 결합할 수 있는가를 결정하는 "결합 모티프"를 갖는다.
MHC 클래스 I 의존 면역 반응에서, 펩티드는 종양 세포에 의해 발현되는 어떤 MHC 클래스 I 분자와 결합할 수 있어야 하며 또한 추후 특정한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 T 세포에 의해 인식될 수 있어야 한다.
종양-특이 또는 연관 항원으로서 T 림프구에 의해 단백질이 인식되고, 치료에 사용되려면, 특정한 전제 조건이 충족되어야 한다. 항원은 주로 종양 세포에 의해 발현되어야 하며 비교적 소량일지라도 건강한 정상 조직에 의해서는 발현되어서는 안 된다. 바람직한 구현에서, 펩티드는 건강한 정상 조직과 비교하여 종양 세포에 의해 과다제시되어야 한다. 더욱이 각각의 항원이 하나의 유형의 종양에서뿐만 아니라 높은 농도로 나타나는 것이 바람직하다(즉 세포마다 펩티드의 각각의 사본 번호). 종양-특정 및 종양-관련 항원은 흔히 기능 때문에(예: 세포 주기 관리 또는 아폽토시스의 억제) 정상 세포를 종양 세포로 전환하는 것과 직접 관련된 단백질에서 유도된다. 또한, 변환을 직접적으로 일으키는 단백질의 하류 표적은 상향조절될 수 있으며 따라서 간접적으로 종양과 연관될 수 있다. 이러한 간접적 종양-관련 항원은 백신 접근법의 표적이 될 수도 있다(Singh-Jasuja et al., 2004). 에피톱이 항원의 아미노산 서열에 나타나는 것이 중요하며, 종양 관련 항원에서 유도된 그러한 펩티드("면역성 펩티드")는 시험관 내 또는 생체 내 T 세포반응을 유도해야 한다.
기본적으로, MHC 분자에 결합할 수 있는 모든 펩티드는 T 세포 에피톱으로서 기능할 수 있다. 시험관 내 또는 생체 내 T 세포 반응을 유도하는 전제 조건은 상응하는 TCR이 있는 T 세포의 존재와 이 특정 에피톱에 대한 면역 내성의 부재이다.
그러므로, TAA는 종양 백신으로 제한되지 않지만 이를 포함하는 T 세포 기반 요법의 개발에 있어서 시작점이 된다. TAA의 식별과 특성화의 방법은 대개 환자 또는 건강한 대상에서 격리될 수 있는 CTL의 사용에 기반되거나, 또는 다른 전송 프로파일 또는 종양과 정상 조직 사이의 차등 전사 프로파일이나 차등 펩티드 발현 패턴의 생성에 기반한다. 그러나, 종양 조직 또는 인간 종양 세포주에서 과발현되거나 그런 조직 또는 세포주에서 선택적으로 발현되는 유전자의 식별은 면역 치료에서 이런 유전자에서 전사된 항원의 이용에 대한 정밀한 정보를 제공하지 않는다. 이것은 상응하는 TCR이 있는 T 세포가 나타나야 하고 이 특정 에피톱에 대한 면역 내성이 없거나 최소화되어야 하므로 이러한 항원의 에피톱의 개개의 소집단만이 그런 응용에 적합하기 때문이다. 따라서 본 발명의 매우 바람직한 구현에서, 기능성 및/또는 증식성 T 세포가 발견될 수 있는 MHC 분자와 관련이 있게 나타나는 과발현된 또는 선택적으로 발현된 펩티드만 선택하는 것이 중요하다. 이러한 기능성 T 세포는 특정 항원에 의해 자극되었을 때 클론에 의해 확대되고 효과기 기능("효과기 T 세포")을 실행할 수 있는 T 세포로 정의된다.
본 발명에 따른 특정 TCR(예: 가용성 TCR) 및 항체 또는 다른 결합 분자(골격)에 의해 펩티드-MHC를 표적화하는 경우, 기저 펩티드의 면역원성은 이차적인 것이다. 이러한 경우, 제시가 결정요인이다.
다양한 골수종 관련 T 세포 항원이 과거 연구에서 묘사된 바 있다[25 ~ 35]. 이러한 항원의 대부분은 유전자 발현 분석 및 역면역학에 근거하여 확인되었다. 이러한 항원의 일부(WT1 [36, 37], RHAMM [38, 39], hTERT [40] 및 서바이빈(Survivin)[40, 41])는 이미 임상 시험에 사용되었으며, 단일 환자에서 특이적 T 세포 반응은 물론 임상적 반응의 유도의 관점에서 촉망받는 결과를 보여준다. 그러나 광범위한 임상적 효과는 아직 달성되지 않았다. 이러한 과거의 연구들은 아주 소수의 HLA-동종이형 및 단일 항원/에피톱으로 제약되었으며[42], 이 치료 접근방식에 적격인 환자 모집단 그리고 유도가능한 종양 특이적 T 세포 반응의 스펙트럼을 모두 제한한다. 주목할 것은 최근의 연구에서는, 이러한 여러 종양 항원에 대한 종양 관련성 부족이 나타났으며, 이는 전사체 수준[43] 그리고 중요하게는 HLA 제한 제시의 수준에 관한 것이다[12, 13].
Kowalewski 등(참고문헌: Carfilzomib alters the HLA - presented peptidome of myeloma cells and impairs presentation of peptides with aromatic C- termini. Blood Cancer J. 2016 Apr 8)은 다발성 골수종은 면역원성 질환이며 이는 항원 특이적 T 세포 면역요법에 의해 효과적으로 표적화될 수 있다고 밝힌다. 4780개의 다른 HLA 리간드들의 상대적 제시 수준이 MM.1S 및 U266 골수종 세포에 대한 카르필조밉 치료를 사용하는 실험관내 모델을 통해 정량화되었으며, 이를 통해 HLA 제시된 펩티돔의 상당한 부분에서 유의한 조절이 나타났다. 이러한 발견 내용은 카르필조밉이 HLA 리간드 처리 및 제시에 대한 직접적인 펩티드 모티프 특이적 억제 효과를 매개한다는 점을 내포한다. 본질적으로, 이것은 카르필조밉 치료를 받고 있는 환자에서 항원 특이적 치료 접근 방식의 구현에 대한 넓은 범위의 연관이 가능하다.
암의 면역요법은 부작용을 최소화시키는 반면 암 세포에 대한 특이적 표적화의 옵션을 나타낸다. 암 면역요법은 종양 관련 항원의 존재를 이용한다. 그러므로 본 발명의 목적은 암, 특히 골수종의 면역요법에 사용할 신규 에피톱을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 1 양태에서, 본 발명은 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228에 대해 적어도 77%, 바람직하게는 적어도 88%, 상동성인(바람직하게는 적어도 77% 또는 적어도 88% 동일한) 이의 변이체 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것으로, 상기 변이체는 MHC에 결합하였거나 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하며, 상기 펩티드는 기저의 전장 폴리펩티드가 아니다.
본 발명자들은 MM의 항원 풍경을 HLA 리간드 수준에 대해 직접적으로 분석함으로써 항원 특이적 면역요법에 적합한 신규 골수종 관련 에피톱의 패널을 제공한다.
본 발명은 또한 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228에 대해 적어도 77%, 바람직하게는 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 적어도 77% 또는 적어도 88% 동일한) 이의 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 본 발명의 펩티드에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 이의 변이체가 갖는 전체 길이는 8 ~ 100, 바람직하게는 8 ~ 30, 가장 바람직하게는 8 ~ 14의 아미노산이다.
다음 표에는 본 발명에 따른 펩티드와 각각의 서열 식별 번호, HLA 결합 그리고 이 펩티드의 유망한 소스(기저) 유전자가 나와 있다.
[표 1]
본 발명에 따른 펩티드
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
사용되는 약어는 다음과 같다: TXNDC11 = 티오레독신 도메인 함유 11, MOGS = 만노실-올리고당 글루코시다아제, FNDC3B = 피브로넥틴 III형 도메인 함유 3B, NUDT14 = 누딕스(뉴클레오시드 디포스페이트 연계 모이어티 X)-형 모티프 14, SLC1A5 = 용질 운반체 계열 1(중성 아미노산 수송체), 구성원 5 , ARHGAP11A = Rho GTPase 활성화 단백질 11A, BHLHA15 = 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 계열, 구성원 a15, LRRC47 = 류신 풍부 반복 함유 47, PPP2R3C = 단백질 인산분해효소 2, 조절 아단위 B'', 감마, SLX1A = SLX1 구조 특이적 엔도뉴클레아제 아단위 상동체 A(S. cerevisiae), BAZ2B = 아연 핑거 도메인 인접 브로모도메인, 2B, NOC2L = 핵소체 복합체 관련 2 상동체(S. cerevisiae), BTN3A1 = 부티로필린 아계열 3, 구성원 A1, TNFRSF13B = 종양 괴사 인자 수용체 상계열, 구성원 13B, NPC1 = 니만 피크병, C1형, MRPS12 = 미토콘드리아성 리보솜 단백질 S12, NUPL2 = 뉴클레오포린 유사 2, CREB3 = cAMP 반응성 요소 결합 단백질 3, TBC1D4 = TBC1 도메인 계열, 구성원 4, RAD1 = RAD1 체크포인트 DNA 엑소뉴클레아제, NBN = 니브린, WFS1 = 월프람 증후군 1, WHSC1= 월프-허쉬호른 증후군 후보 1, ASS1 = 아르기노석시네이트 합성효소 1, CYC1 = 시트크롬 c-1, PDIA4 = 단백질 이황화 이소머라아제 계열 A, 구성원 4, LAP3 = 류신 아미노펩티다제 3, KDELR2 = KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) 소포체 단백질 유지 수용체, SLC1A4 = 용질 운반체 계열 1(글루타메이트/중성 아미노산 수송체), 구성원 4, P49770 = EIF2B2 = 진핵 번역 개시 인자 2B, 아단위 2 베타, 39kDa, SERPINH1 = 세르핀 펩티다아제 억제제, 클레이드 H(열충격 단백질 47), 구성원 1, DAP3 = 죽음 관련 단백질 3, IRF9 = 인터페론 조절 인자 9, NAE1 = NEDD8 활성화 효소 E1 아단위 1, Q53HL2 = CDCA8 = 세포 분열 주기 관련 8 , KIAA1217 , MED27 = 매개자 복합체 아단위 27, MRPL55 = 미토콘드리아 리보솜 단백질 L55 , TMEM126B = 막횡단 단백질 126B, CMTR1 = cap 메틸전이효소 1, MB21D1 = Mab-21 도메인 함유 1, CSNK2A1 = 카세인 키나제 2, 알파 1 폴리펩티드, COG1 = 올리고머 골지 복합체의 구성요소 1, MZB1 = 변연부 B 및 B1 세포 특이적 단백질, TP53INP1 = 종양 단백질 p53 유도가능한 핵 단백질 1, HSH2D = 조혈 SH2 도메인 함유, UBL7 = 유비퀴틴 유사 7, SPATC1L = 정자발생 및 중심소체 관련 1-유사, SEMA4A = 세마 도메인, 면역글로불린 도메인(Ig), 막횡단 도메인(TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 4A , LIME1 = Lck 상호작용 막횡단 어댑터 1, SETD8 = SET 도메인 함유(리신 메틸전이효소) 8, DYRK4 = 이중특이성 티로신-(Y)-인산화 조절 키나제 4, BFAR = 이중기능성 세포자멸사 조절인자, NDUFAF4 = NADH 탈수소효소(유비퀴논) 복합체 I, 조립 인자 4 , ZBTB21 = 아연 핑거 및 BTB 도메인 함유 21, DOLK = 돌리콜 키나제, SNX14 = 소팅 넥신 14, NPC1 = 니만피크병, C1형.
본 발명은 또한 암 그리고 펩티드 서열 식별 번호 1 내지 서열 식별 번호 228에서 유래하는 단백질의 과발현을 보이는 기타 종양 및 특히 골수종과 같은 증식성 질병의 치료에서의 사용을 위한 본 발명에 따른 펩티드와 일반적으로 관련이 있으며, 여기서 상기 암은 폐암, 뇌암, 간장암, 신장암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 전립선암, 백혈병, 유방암, 메르켈세포 암종, 흑색종, 난소암 및 식도암의 군으로부터 선택된다.
특히 바람직하기로는 다음 표 2에 따른 서열 식별 번호들로 구성된 군에서 선택된 본 발명에 따른 단독 또는 조합의 펩티드 그리고 암 그리고 펩티드 서열 식별 번호 1 내지 서열 식별 번호 228에서 유래하는 단백질의 과발현을 보이는 기타 종양 및 특히 골수종과 같은 증식성 질병의 면역요법에서의 사용이며, 여기서 상기 암은 폐암, 뇌암, 간장암, 신장암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 전립선암, 백혈병, 유방암, 메르켈세포 암종, 흑색종, 난소암 및 식도암의 군으로부터 선택된다.
[표 2]
본 발명에 따른 바람직한 펩티드
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
본 발명에 따른 많은 펩티드는 다른 종양 유형에서도 발견되며 따라서 다른 적응증의 면역요법에도 사용될 수 있다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 암, 그리고 펩티드 서열 식별 번호 1부터 서열 식별 번호 228까지에서 유래하는 단백질의 과발현을 보여주는 다른 종양 및 특히 골수종의 군으로부터 선택되는 증식성 질병에서 바람직하게는 병용 치료를 위한 본 발명에 따른 펩티드의 사용에 관한 것이며, 여기서 상기 암은 폐암, 뇌암, 간장암, 신장암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 전립선암, 백혈병, 유방암, 메르켈세포 암종, 흑색종, 난소암 및 식도암의 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II, 또는 길이 변이체와 같은 긴 형태의 MHC 클래스 II의 분자와 결합하는 능력을 가진 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는(각각) 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 필수적으로 구성된 펩티드이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 변형되며/거나 비펩티드 결합을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 융합 단백질의 일부이며 특히 HLA-DR 항원-결합 항원-연관된 불변사슬(Ii)에 융합되거나 또는 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체와 같은 항체에(또는 그 서열 안으로) 융합된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합인 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있거나 발현하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 질병의 치료와 의학 특히 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 대해 특이적인 항체 또는 본 발명에 따른 상기 펩티드와 MHC와의 복합체 그리고 이들을 만드는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 T 세포 수용체(TCR), 특히 가용성 TCR(sTCR) 및 상동성 또는 동종이형 T 세포로 조작된 복제된 TCR 그리고 이러한 수용체를 만드는 방법은 물론 상기 TCR을 함유하거나 상기 TCR과 교차반응하는 NK 세포 또는 기타 세포들에 관한 것이다.
항체 및 TCR는 즉시 가용한 본 발명에 펩티드의 면역치료적 사용의 추가 구현이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 또는 전에 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항원 제시 세포인 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 발명에 따른 숙주 세포의 배양과 상기 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드의 분리를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 방법에 관한 것으로, 충분한 수량의 항원을 항원 제시 세포와 접촉시킴으로써 항원이 적합한 항원 제시 세포 또는 인공 항원 제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 항원 제시 세포는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228, 바람직하게는 표 2에 따른 서열 식별 번호를 적어도 하나 또는 변이체 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 상기 펩티드를 발현할 수 있거나 발현하는 발현 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 제공된 활성화된 T 세포에 관한 것으로, 상기 T 세포는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
본 발명은 또한 표적 세포가 본 발명에 따른 일체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자에서 그 표적 세포를 죽이는 방법에 관한 것으로, 그 방법은 본 발명에 따라 생산된 효과적인 수의 T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 설명한 일체의 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포, 활성화된 T 림프구, T 세포 수용체 또는 항체, 또는 본 발명에 따른 다른 펩티드 및/또는 펩티드-MHC-결합 분자를 약제로서 또는 약제의 제조에서의 사용에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 약제는 암에 대해 활성이다. 바람직하게는 상기 약제는 암에 대해 활성이다.
바람직하게는 상기 약제는 세포 요법, 백신 또는 가용성 TCR 또는 항체에 근거한 단백질이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로, 상기 암 세포는 폐암, 뇌암, 간세포암, 신장암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 전립선암, 백혈병, 유방암, 메르켈 세포 암종, 흑색종, 난소암 및 식도암 세포, 그리고 바람직하기로는 골수종 세포이다.
본 발명은 또한 여기서 "표적"이라 칭하며 암 바람직하게는 골수종의 진단에 사용할 수 있는 본 발명에 따른 펩티드에 근거하는 바이오마커에 관한 것이다. 마커는 펩티드 자체의 과다 제시 또는 상응하는 유전자의 과발현일 수 있다. 또한 마커는 치료, 바람직하게는 면역요법 그리고 가장 바람직하게는 바이오마커에 의해 동정된 동일한 표적을 대상으로 하는 면역요법의 성공 확률을 예측하는데 사용할 수도 있다. 예를 들어, 항체 또는 가용성 TCR은 MHC와의 복합체에서 관심 있는 펩티드의 존재를 검출하기 위해 종양의 부분들 염색에 사용할 수 있다.
임의적으로 그 항체는 면역 자극 도메인 또는 독소와 같은 추가의 반응기 기능을 갖는다.
본 발명은 또 암 치료의 맥락에서 이러한 신규 표적들의 사용에 관한 것이다.
다른 암 질병에 대한 치료 및 진단적 사용이 다음에 나오는 본 발명에 따른 펩티드의 기저 발현 생성물(폴리페티드)의 보다 상세한 설명에 공개된다.
발명의 상세한 설명
면역 반응 자극은 숙주 면역계가 외부 물질로 인식하는 항원의 존재에 의존한다. 종양 연관 항원의 발견은 숙주의 면역계를 종양 성장에 개입하는 데 사용할 가능성을 제기했다. 면역계의 체액성 그리고 세포성 지류를 이용하는 다양한 기전이 현재 암 면역 치료에서 탐색되고 있다.
세포 면역 반응의 특정 요소들은 종양 세포를 특이적으로 인식하고 파괴할 수 있다. T 세포의 종양 침투 세포 군락 또는 말초 혈액에서의 분리는 이러한 T 세포가 암에 대해 자연 면역 방어로써의 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 시토졸에 자리잡은 단백질 또는 불완전 리보솜 생성물(DRIPS)에서 파생된 보통 8 ~ 10의 아미노산 잔기로 이루어진 주조직적합 복합체(MHC)를 가진 펩티드의 클래스 I 분자를 인식하는 CD8 양성 T 세포는 특히, 이 반응에서 중요한 역할을 한다. 인간의 MHC-분자도 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지정된다.
여기서 사용되는 모든 용어는 달리 지적하지 않는 한 다음과 같이 정의된다.
"T-세포 반응"이란 특이적 증식과 시험관 내 또는 생체 내에서 유도되는 효과기 기능의 활성화를 의미한다. MHC 클래스 I 제한 세포 독성 T 세포의 경우, 효과기 기능이 펩티드 펄스, 펩티드 전조 펄스 또는 자연적 펩티드 제시 표적 세포들의 용해, 시토카인의 분비, 바람직하게는 펩티드에서 유도되는 인터페론 감마, TNF 알파, 또는 IL-2, 효과기 분자의 분비, 바람직하게는 펩티드에서 유도되는 그랜자임 또는 퍼로린 또는 탈과립일 수 있다.
"펩티드"란 용어는 여기서 이웃 아미노산의 알파 아미노와 카보닐 기 사이에 펩티드 결합으로 보통 서로 연결되는 일련의 아미노산 잔기를 지정하기 위해 사용한다. 펩티드는 아미노산 9개의 길이가 바람직하지만 아미노산 8개까지 짧을 수도 있고 아미노산까지 10, 11, 12 또는 심지어 더 길 수도 있으며, MHC 클래스 II 펩티드의 경우(예: 본 발명의 펩티드의 연장된 변이) 그 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 23개 이상의 아미노산일 수 있다.
더욱이 "펩티드"라는 용어는 알파 아미노 기와 이웃 아미노산의 카보닐 기 사이의 펩티드 결합으로 보통 서로 연결되는 아미노산 잔기의 서열에 의한 염을 포함한다. 바람직하게는 이 염은 예를 들어 염화물 또는 아세트산염(삼분화 아세트산염)과 같은 약학적으로 허용되는 펩티드의 염이다. 본 발명에 따른 펩티드의 염은 펩티드가 생체 내에서 염이 아니므로 생체 내 상태의 펩티드와는 실질적으로 다르다는 점을 유의해야 한다.
"펩티드"라는 용어는 "올리고펩티드"도 포함한다. 여기에서 "올리고펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 알파 아미노 기 및 카보닐 기 사이에서 일반적으로 펩티드 결합으로 연결되는, 아미노산 잔기를 지정하는 데 사용된다. 본 발명에서 올리고펩티드의 길이는 올바른 에피톱이 유지되는 이상 중요하지 않다. 올리고펩티드는 일반적으로 30개 아미노산 보다 길이가 짧고, 15개 아미노산 보다 길다.
"폴리펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 알파 아미노 기 및 카보닐 기 사이에서 일반적으로 펩티드 결합으로 연결되는, 일련의 아미노산 잔기를 지정하는 데 사용된다. 본 발명에서 폴리펩티드의 길이는 정확한 에피톱들이 유지되는 이상 중요하지 않다. 펩티드 또는 올리고 펩티드와 다르게, 폴리펩티드는 약 30개 아미노산 잔기 이상의 분자를 가지고 있는 것을 언급한다.
이런 분자의 펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 또는 폴리뉴클레오티드 코딩은 면역 반응을 유도할 수 있으면 "면역성"(따라서 본 발명에서의 "면역원")이다. 본 발명의 경우, 면역성은 T 세포 반응을 유도하는 능력으로 특정하게 정의된다. 그러므로, "면역원"은 면역 반응을 유도할 수 있는 분자이고, 본 발명의 경우, T 세포 반응을 유도할 수 있는 분자이다. 다른 양태에서, 면역원은 펩티드, 펩티드와 MHC의 복합체, 올리고펩티드 및/또는 특정 항체나 항체에 대한 TCR을 높이는데 사용되는 단백질일 수 있다.
클래스 I T 세포 "에피톱"은 적당한 친화력을 가진 MHC/펩티드 혼합물에 결합하는 T 세포 수용체에 일치하는 T 세포에 의해 인식되는 삼항 혼합물(MHC 클래스 I 알파 사슬, 베타-2-미세글로블린 및 펩티드)을 생성하는 클래스 I 또는 II MHC 수용체에 결합하는 짧은 펩티드를 필요로 한다. MHC 클래스 I 분자에 결합하는 펩티드는 일반적으로 길 이가 8 내지 14개 아미노산이며, 대개 일반적으로 길이가 9개 아미노산이다.
인간에는 MHC 클래스 I 분자를 인코딩하는 세 개의 유전자 부위가 있다(인간의 MHC 분자도 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지정된다(HLA)): HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02, 및 HLA-A*07은 유전자 부위에서 발현할 수 있는 다른 MHC 클래스 I 대립형질의 예이다.
표 3은 HLA-A*02, HLA-A*24 및 가장 빈번한 HLA-DR 혈청형의 발현 빈도를 나타낸다. 빈도는 Mori 등(Mori et al., 1997)으로부터 조정된 미국 인구 내에서의 일배체형 빈도 Gf로부터 유추되며(Mori et al., 1997), 하디-와인버그 공식 F = 1-(1-Gf)2을 사용한다. A*02 또는 A*24와 일부 HLA-DR 대립형질의 조합은 강화되거나 연관 불평형으로 인해 단일 빈도보다 덜 빈번할 수 있다. 자세한 내용은 Chanock 등을 참조한다(Chanock et al., 2004).
[표 3]
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Figure pct00013
본 발명의 펩티드는 바람직하게는 여기서 설명한 바와 같이 본 발명의 백신에 포함되는 경우 바람직하게는 HLA-A*02에 결합한다. 백신은 범-결합 MHC 클래스 II 펩티드를 포함할 수도 있다. 그러므로 본 발명의 백신은 A*02 양성인 환자의 암을 치료하는데 사용할 수 있는 반면, MHC 클래스 II 동종형에 대한 선택은 이 펩티드의 범-결합 성격으로 인해 필요하지 않다.
본 발명의 A*02 펩티드가 다른 대립형질, 예를 들어 A*24와 결합하는 펩티드와 조합되는 경우, 모든 환자 모집단에서 MHC 클래스 I 대립형질 하나만을 취급하는 것에 비해 더 높은 비율의 치료가 가능하다. 대부분의 모집단에서 하나의 대립형질만으로는 환자의 50% 미만을 해결할 수 있는 반면, HLA-A*24 및 HLA-A*02로 구성되는 백신은 일체의 관련있는 모집단에서 적어도 환자의 60% 치료가 가능하다. 구체적으로 환자의 다음 백분율은 다양한 지역에서 적어도 하나의 이러한 대립형질에 대해 양성이 된다: 미국 61%, 서부 유럽 62%, 중국 75%, 한국 77%, 일본 86%(www.allelefrequencies.net의 자료로부터 계산됨).
한 바람직한 구현에서 용어 "뉴클레오티드 서열"은 디옥시리보뉴클레오티드의 이성중합체를 언급한다.
특정 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열 코딩은 자연적으로 발생하거나 합성 구축될 수 도 있다. 일반적으로, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 인코딩하는 DNA 절편은 cDNA 분절과 짧은 올리고뉴클레오티드 링커, 또는 일련의 올리고뉴클레오티드에서 미생물이나 바이러스 오페론에서 유도된 조절 요소를 구성하는 재조합 전사 단위에서 발현될 수 있는 합성 유전자를 제공하기 위해서 조립된다.
여기서 사용되는 용어 "펩티드를 코딩(또는 인코딩)하는 뉴클레오티드"는 예를 들어, 수지상 세포 또는 TCR 제조에 유용한 다른 세포계에 의해 서열이 발현되는 생물학적 체계와 호환가능한 인공(사람이 만든) 시작 및 정지 코돈을 포함하는 펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열 코딩을 지칭한다.
여기서 사용되는 핵산 서열에 대한 언급에는 한 가닥 및 두 가닥 핵산 모두가 포함된다. 그러므로, 예를 들어 DNA의 경우 특정 서열이란 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 이러한 서열의 단일 가닥 DNA, 보완이 있는 이러한 서열의 중복(이중 가닥 DNA) 및 이러한 서열의 보완을 언급한다.
용어 "코딩 영역"은 자연적인 게놈 환경에서 유전자의 발현 생성물에 대해 자연스럽게 또는 정상적으로 코딩하는 유전자의 부분을 언급한다(즉, 유전자 본래의 발현 생성물에 대한 생체 내 영역 코딩).
코딩 영역은 비변이("정상적")이거나 변이 또는 개조된 유전자에서 찾을 수 있거나, 심지어는 DNA 서열, 또는 DNA 합성 기술을 보유한 제조업자에게 잘 알려진 방법을 사용해서 실험실에서 전적으로 합성된 유전자에서 찾을 수 있다.
용어 "발현 생성물"은 유전자의 자연 번역 생성물인 폴리펩티드 또는 단백질, 그리고 유전적 코딩 퇴화 및 이에 따른 동일 아미노산 코딩으로 인해 초래된 어떤 핵산 서열 코딩 생성물을 의미한다.
코딩 서열을 말할 때, 용어 "단편"은 발현 제품이 완전한 코딩 영역의 발현 생성물과 같은 생물학적 기능이나 활 동을 유지하는 완전한 코딩 영역보다 적은 부분의 DNA를 언급한다.
용어 "DNA 분절"은 최소한 한번 이상의 상당히 순수한 형태로 분리된 DNA에서 유도된 단편의 형태, 또는 큰 DNA 구조의 구성 요소로서 DNA 중합체를 언급한다. 여기서 순수한 형태는 내인성 오염 물질이 없고 분절 및 표준 생화학 방법, 예를 들면, 복제 벡터에 따른 그 구성 요소 뉴클레오티드 서열의 식별, 조작 및 복구를 가능하게 하는 양 또는 농도를 언급한다. 이러한 분절은 일반적으로 진핵 생물 유전자에 존재하는 내부 비번역 서열, 또는 인트론에 의해 방해되지 않는 오픈 리딩 프레임의 형태로 제공된다. 비번역 DNA 서열은 동일 서열이 코딩 영역의 조작이나 발현을 방해하지 않는 오픈 리딩 프레임의 하단에 나타날 수 있다.
용어 "프라이머"는 하나의 표준 DNA와 짝을 이룰 수 있는 짧은 핵산 서열을 의미하며 DNA 폴리머라아제가 디옥시리보뉴클레오티드 사슬 합성을 시작하는 자유 3'-OH 말단을 제공한다.
용어 "프로모터"는 모사를 시작하기 위한 RNA 폴리머라아제의 결합에 관여하는 DNA 영역을 뜻한다.
용어 "분리"는 그 물질이 원래의 환경(예를 들면, 자연적으로 발생하는 경우에는 자연 환경)에서 제거되는 것을 뜻한다. 예를 들면, 자연 발생하는 살아 있는 동물에 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리되지 않지만, 자연계에서 공존하는 물질의 부분 또는 전체에서 분리되는 같은 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 제거된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 운송체 및/또는 이러한 폴리뉴클레오티드의 부분이거나 폴리펩티드는 구성의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 구성이 자연 환경의 일부가 아닐 때 여전히 분리될 수 있다.
본 발명에서 밝혀지는 폴리뉴클레오티드 및 재조합 또는 면역성의 폴리펩티드는 "순수한" 형태일 수도 있다. 용어 "정제"는 절대적인 순도를 필요로 하지 않는다. 오히려, 그것은 상대적인 정의를 의도하며, 관련된 당업자들이 이해하는 용어로써 상당히 정제된 제조 또는 부분적으로 정제된 제조를 포함할 수 있다. 예를 들면, cDNA 라이브러리에서 분리된 각각의 클론은 전기 영동 동일성으로 통상적으로 정제된다. 시작 물질 또는 자연 물질의 최소한 하나 이상의 순서, 바람직하게 2 ~ 3개 순서, 더 바람직하게는 4 ~ 5개 순서의 크기로 정제가 명시적으로 심사숙고된다. 또한 바람직하게는 중량으로 99.999%, 또는 최소한 99.99% 또는 99.9%; 및 심지어는 바람직하게 99%보다 큰 순도를 가진 특허청구범위에 기재된 폴리펩티드는 명시적으로 심사숙고된다.
본 발명에서 밝혀진 핵산과 폴리펩티드 발현 생성물은, 이러한 핵산 및/또는 이러한 폴리펩티드를 가진 발현 벡터뿐만 아니라, "강화된 형태"일 수 있다. 여기에서 사용되는 것처럼, 용어 "강화"는 물질의 농도가 최소한 그것의 자연적 농도(예를 들면)의 최소한 2, 5, 10, 100, 또는 1000배 정도이고, 유리하게는 0.01 중량%, 바람직하게는 최소한 약 0.1 중량% 정도임을 의미한다. 중량으로 약 0.5%, 1%, 5%, 10%, 및 20% 강화된 제조도 심사 숙고된다. 서열, 구성, 벡터, 클론, 및 본 발명의 다른 물질들은 유리하게 강화된 또는 격리된 형태가 될 수 있다. 용어 "활성 단편"은 예를 들면 토끼 또는 쥐 및 인간을 포함한 포유류 같은 동물에게 따로 또는 선택적으로 적당한 보조제와 함께 또는 매개체로서 투여했을 때 면역 반응(즉, 면역성 활동이 있는)을 생성하고 인간과 같은 받는 동물 내에서 T 세포 반응을 자극하는 형태로 면역 반응을 나타내는 펩티드, 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 단편을 의미한다. 그렇지 않으면, "활성 단편"은 또한 시험관 내 T 세포 반응을 유도하기 위해서 사용될 수도 있다.
여기에서 사용되는, "부분", "분절" 및 "단편" 이라는 용어는, 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 서열이 더 큰 서열의 하위 집합을 형성하는 경우 아미노산 잔기와 같은 잔기의 지속적인 서열을 언급한다. 예를 들면, 만약에 폴리펩티드가 트립신이나 키모트립신 같은 일반적인 엔도펩티다아제 치료를 받는다면, 그런 치료로 인해 생기는 올리고펩티드는 폴리펩티드의 시작 부분, 분절 또는 단편을 나타낼 것이다. 폴리뉴클레오티드와 관련해서 사용될 때, 이러한 용어들은 일반적인 엔도뉴클레아제 중 어떤 것과 함께 상기 폴리뉴클레오티드의 치료에 의해 생성된 생성물을 언급한다.
본 발명에 따라, 서열을 언급할 때 용어 "백분율 동일성" 또는 "백분율 동일한"은 설명되거나 명시된 서열("기준 서열")에 비교될 서열의 정렬 후("비교 서열") 서열이 명시된 또는 설명된 서열에 비교되는 것을 언급한다. 백분율 동일성은 하기 공식에 따라서 결정된다:
백분율 동일성 = 100 [1 -(C/R)]
상기 식에서,
C는 기준 서열과 비교 서열의 정렬의 길이에 비해 기준 서열과 비교 서열의 차이의 개수이되,
(i) 비교 서열에서 상응하는 정렬된 염기 또는 아미노산이 없는 기준 서열에 각 염기 또는 아미노산,
(ii) 기준 서열의 각 차이, 및
(iii) 비교 서열의 정렬된 염기 또는 아미노산과 다른 기준 서열의 각 정렬된 염기 또는 아미노산이 차이를 구성하며,
(iv) 정렬은 정렬된 서열의 위치 1에서 시작해야 하고;
R은 비교 서열과의 정렬의 길이에 대한 기준 서열 염기 또는 아미노산의 수이고 기준 서열에 생긴 공백도 염기 또는 아미노산 개수로 계산된다.
만약에 위에서와 같이 계산된 비교 서열과 기준 서열 사이의 백분율 동일성이 특정 최소 백분율과 같거나 더 크면 위에서 계산된 백분율 동일성이 특정 백분율 동일성보다 작은 경우에 정렬이 있더라도 비교 서열은 기준 서열에 대해 특정한 최소 백분율 동일성이 있다.
위에서 언급된 바와 같이, 본 발명은 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 펩티드 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228에 대해 88% 상동성인 그 변이체 또는 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하는 그 변이체를 제공한다. 본 발명의 펩티드는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I의 분자에 결합하는 능력 또는 신장된 버전의 상기 펩티드가 클래스 II에 결합하는 능력을 갖는다.
본 발명에서, "상동"이라는 용어는 두 개의 아미노산 서열, 즉, 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 일치 정도(위의 백분율 동일성 참조)를 일컫는다. 전술한 "상동"은 비교될 두 개의 서열을 최적 상태에서 나란히 정렬하여 비교하여 결정된다. 이러한 서열 상동 관계는 예를 들면 ClustalW 알고리즘을 이용하여 정렬을 만들어 계산할 수 있다. 일반적으로 사용이 가능한 서열 분석 소프트웨어, 더 구체적으로 벡터 NTI, GENETYX 또는 다른 도구들은 공용 데이터베이스에서 제공된다.
이 분야의 당업자는 특정 펩티드의 변이체에 의해서 유도된 T 세포가 그 펩티드 자체와 교차 반응할 수 있을지를 평가할 수 있을 것이다(Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).
주어진 아미노산 서열의 "변이체"에 의해, 발명자들은 예를 들면, 하나 또는 두 개의 아미노산 잔기의 곁사슬이 변경되어 그 펩티드가 여전히 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228의 아미노산 서열로 구성된 펩티드와 실질적으로 같은 방법으로 HLA 분자와 결합할 수 있음을 의미한다(예를 들면 그들을 자연적으로 발생하는 다른 아미노산 잔기 또는 다른 곁사슬로 구성된 군으로부터 선택된 본 발명에 따른 단일 또는 조합의 펩티드이다). 예를 들면, 펩티드 변형에 의해 HLA-A*02 또는 DR와 같은 적합한 MHC 분자의 결합 홈과 상호 작용하여 결합하는 능력이 향상되지 않으면 적어도 유지하고 마찬가지로 활성화된 T 세포의 TCR과 결합할 수 있는 능력이 향상되지 않으면 적어도 유지할 수 있다.
이 T 세포는 그 결과로 본 발명의 한 양태에서 정의가 된 바 있는 동족의 펩티드의 자연 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 교차 반응을 하고 이러한 세포를 죽일 수 있다. 과학 문헌 및 데이터베이스(Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997)에서 얻을 수 있듯이, HLA 결합 펩티드의 특정한 위치는 전형적으로 HLA 수용기의 결합 모티프에 일치하는 핵심 고정 잔기이며 이는 결합 홈을 이루고 있는 폴리펩티드의 극성, 전기 물리성, 소수성 및 공간적 특성에 의해 정의된다. 따라서 이 분야의 당업자는 알려진 고정 잔기를 유지함으로써 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228에 정해진 아미노산 서열을 변형할 수 있고 이러한 변이체들이 MHC 클래스 I 또는 II 분자와 결합할 수 있는 능력을 유지할 수 있는지를 결정할 수 있어야 한다. 이 본 발명의 변이체는 활성화된 T 세포의 TCR과 결합할 수 있는 능력을 유지하고, 이는 그 결과로 본 발명의 양태에서 동족의 펩티드라고 정의된 자연 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 교차 반응을 하고 이 세포를 죽일 수 있다.
여기에서 밝혀진 본래 (변형되지 않은) 펩티드는 달리 언급되지 않는 이상 아마도 선택적인 다른 부위에서 펩티드 사슬의 부위의 하나 이상의 잔기의 치환에 의해 변형될 수 있다. 바람직하게 이러한 치환은 아미노산 사슬의 말단에 위치한다. 그런 치환은, 예를 들면, 소수성의 아미노산이 다른 소수성의 아미노산으로 치환되는 것처럼, 보수적일 수 있다. 심지어 더 보수적인 것은 류신이 이소류신으로 치환되는 것 같이, 같거나 비슷한 크기와 화학적 특성을 가진 아미노산으로 치환되는 것이다. 자연적으로 발생하는 동종 단백질의 종족에서의 서열 변화의 연구에서, 특정 아미노산의 치환은 다른 것들보다 더 자주 용인되고 있으며, 이들은 본래의 아미노산과 치환 사이에서 크기, 전하, 극성, 및 소수성이 비슷한 상관관계를 보이며, 이것은 "보존적 치환"를 정의하는데 기본이 된다.
여기서 보존적 치환은 아래의 다섯 개 군 중 하나의 교환으로 정의된다: 군 1- 작은 지방성, 무극성 또는 약간 극성의 잔기(Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); 군 2- 극성, 음성 하전된 잔기와 그 아미드(Asp, Asn, Glu, Gln); 군 3- 극성, 양성 하전된 잔기(His, Arg, Lys); 군 4- 큰, 지방성, 무극성 잔기(Met, Leu, Ile, Val, Cys); 및 군 5- 큰, 방향족 잔기(Phe, Tyr, Trp).
덜 보존적 치환은 알라닌을 이소류신 잔기로 치환하는 것처럼, 비슷한 성질이지만 크기가 어느 정도 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 아주 비보수적인 치환은 산성 아미노산을 극성, 또는 심지어 염기성 아미노산으로 치환하는 것을 포함할 수도 있다. 그러나 이러한 "급진적" 치환은 화학적 작용이 완전히 예측 불가능하고 급진적 치환은 단순한 화학 원리에서 예측 가능하지 않은 뜻밖의 발생이 있을 수 있기 때문에 효과가 없다고 기각할 수는 없다.
물론, 이런 치환은 일반적인 L-아미노산 외 다른 구조를 포함할 수 있다. 그러므로, D-아미노산을 본 발명의 항원 펩티드에서 흔히 발견되는 L-아미노산으로 교체할 수 있고 여기에서 공개를 통해 계속 포함시킬 수 있다. 또한, 비표준 아미노산(즉, 흔히 자연적으로 발생하는 단백질성 아미노산이 아닌) 역시 본 발명에 따라 면역성과 면역성 폴리펩티드를 생산하기 위해서 치환될 수 있다.
아래에서 정의된 것과 상당히 동일하거나 더 큰 항원 활성이 있는 펩티드의 하나 이상의 위치에서 치환이 발견되면, 이러한 치환의 조합은 조합된 치환이 펩티드의 항원성에 추가적 효과 또는 상승 효과의 결과를 내는지 결정하기 위해 시험된다. 최대, 펩티드에서 4 곳 이상의 위치에서 동시에 치환될 수 없을 것이다.
본 문서에서 명시한 바와 같이 아미노산 서열로 필수적으로 구성된 펩티드는, 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II의 분자에 결합하는 능력이 비변형 펩티드에 비하여 상당히 변경되거나 또는 부정적으로 영향받음 없이 하나 또는 두 개의 비앵커 아미노산(앵커 모티프에 대해서는 아래 참조)이 교환되도록 할 수 있다. 또 다른 구현에서는, 본 문서에서 명시된 바와 같이 아미노산 서열로 필수적으로 구성된 펩티드에 있어서, 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II의 분자에 결합하는 능력이 비변형 펩티드에 비하여 상당히 변경되거나 또는 부정적으로 영향받음 없이 하나 또는 두 개의 아미노산이 그에 대한 보존적 교환 파트너(다음을 참조)와 교환될 수 있다.
T 세포 수용체와 상호작용하는 데에 상당히 기여를 하지 않는 아미노산 잔기들은 이와 결합됨으로써 T 세포의 반응성에 상당한 영향을 주지 않고 관련된 MHC와의 결합을 제거하지 않는 다른 아미노산과의 교체에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 주어진 조건 외에도, 본 발명의 펩티드는 아미노산 서열 또는 그 한 부분 또는 주어진 변이체를 포함하는(발명자들이 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다고 일컫는) 어떠한 펩티드가 될 수도 있다.
더 긴(신장된) 펩티드도 적합할 수 있다. 대개 길이가 8 내지 11개의 아미노산이지만, MHC 클래스 I 에피톱이 더 긴 펩티드로부터 처리되는 펩티드 또는 실제 에피톱을 포함하는 단백질에 의해 생성될 가능성이 있다. 실제 에피톱이 양측에 있는 장기는 처리 동안 실제 에피톱을 노출하는데 필요한 단백질 분해에 의한 분할에 상당한 영향을 주지 못하는 잔기이다.
본 발명의 펩티드는 아미노산을 최대 4개까지 연장할 수 있는데 즉, 1, 2, 3 및 4개의 아미노산이 4:0과 0:4 사이에서 일체의 조합으로 양쪽 어디로든 추가될 수 있다. 본 발명에 따른 신장의 조합은 표 4에서 찾을 수 있다:
[표 4]
본 발명의 펩티드들의 신장에 대한 조합
Figure pct00014
연장/신장을 위한 아미노산은 해당 단백질의 원래 서열의 펩티드나 기타 모든 아미노산일 수 있다. 연장은 펩티드의 안정성이나 가용성 강화를 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 에피톱은 자연적으로 발생하는 종양 관련 또는 종양 특정 에피톱과 동일하거나 또는 실질상 동일한 항원적 활동력을 가지고 있는 한, 참조 펩티드와 비교 시 4개 이하의 다른 잔기를 가지고 있는 에피톱을 포함할 수 있다.
대체의 구현에서, 펩티드는 한쪽 또는 양쪽으로 4개 이상의 아미노산, 바람직하게는 총 30개의 아미노산 길이만큼 연장된다. 이는 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 초래할 수 있다. MHC 클래스 II에 대한 결합은 당업계에서 알려진 방법으로 시험할 수 있다.
따라서, 본 발명은 MHC 클래스 I 에피톱의 펩티드와 변이체를 제공하며 여기서 펩티드 또는 변이체는 전체 길이가 8 내지 100 사이이며, 바람직하게는 8 내지 30 사이이며, 가장 바람직하게는 8 내지 14 사이이며, 이는 즉 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개의 아미노산이다. 신장된 클래스 II 결합 펩티드의 경우 그 길이는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개 또는 23개의 아미노산일 수도 있다.
물론, 본 발명에 따른 펩티드 또는 변이체는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II의 분자에 결합하는 능력을 갖게 된다. 펩티드 또는 변이체의 MHC 복합체에 대한 결합은 당업계의 방법에 의해 시험할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 특이적 펩티드의 T 세포가 치환 펩티드에 대해 시험될 때, 치환 펩티드가 배경에 상대적으로 세포 용해의 최대 증가의 절반을 달성할 때의 펩티드 농도는 약 1 mM 이하, 바람직하게 약 1 μM 이하, 더 바람직하게 약 1 nM 이하, 여전히 더 바람직하게 약 100 pM 이하, 가장 바람직하게는 약 10 pM 이하이다. 치환 펩티드가 하나 이상, 최소 2개, 보다 바람직하게 3개의 개별 T 세포에 의해 인식되는 것 또한 바람직하다.
본 발명의 특히 바람직한 구현에서 펩티드는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228에 따라 구성된 군으로부터 선택된 본 발명에 따른 단일 또는 조합의 펩티드이다.
"본질적으로 구성되는"이란 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228에 따른 서열 또는 변이체 외에도 본 발명에 따른 펩티드는 N- 및/또는 C-말단에 추가적으로 위치하고 있는 아미노산이 MHC 분자 에피톱에 대한 에피톱으로 기능하는 펩티드의 한 부분을 반드시 형성하지 않는 아미노산들을 포함하는 것을 의미해야 한다.
그럼에도 불구하고, 이러한 추가된 아미노산은 본 발명에 따르면 세포 내로 효율적인 펩티드의 도입에 중요한 역할을 할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현에서, 펩티드는 예를 들면 NCBI, GenBank Accession-number X00497에서 유도된 것처럼 HLA-DR 항원 결합 불변 사슬(p33, 다음의 "Ii")의 80개 N-말단 아미노산을 포함하고 있는 융합 단백질의 일부이다. 다른 융합에서는, 본 발명의 펩티드는 항체에 의해 특이적으로 표적화 될 수 있도록 여기서 설명된 상기 항체나 그 기능적 일부 특히 항체의 서열에 대해 또는 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체에 대해 또는 그 안으로 융합될 수 있다.
추가적으로, 펩티드 또는 변이체는 안정성 및/또는 MHC 분자와의 결합성을 높여 더 강한 면역 반응을 일으킬 수 있도록 변형될 수 있다. 펩티드 서열의 최적화를 위한 방법은 이 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들면 반대 펩티드 결합 또는 비-펩티드 결합을 도입하는 것이 있다.
반대 펩티드 결합에서는 아미노산 잔기가 펩티드(-CO-NH-) 연결로 결합되어 있지 않으나 펩티드 결합이 반대로 되어있다. 이러한 역-인버스 펩티드 모방형 물질은 이 분야에서 잘 알려진 방법으로 생성될 수 있으며, 이 방법의 예는 이 문헌의 참조 문헌으로 포함된 Meziere 등(Meziere et al., 1997)에 설명되어 있다. 이 방법은 백본의 변경을 포함하지만, 곁사슬의 방향을 바꾸지 않는 유사펩티드를 만드는 것을 포함한다. Meziere 등(Meziere et al., 1997)은 MHC 결합과 T 조력 세포 반응에서 이 유사 펩티드가 유용하다는 것을 보여준다. CO-NH 대신에 NH-CO 결합을 포함하고 있는 레트로 역위 펩티드는 단백질 가수 분해에 대한 저항력이 훨씬 높다.
비-펩티드 결합의 예는 -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO-이다. 미국 특허 번호 4,897,445는 기본 과정을 거쳐 합성된 폴리펩티드와 아미노 알데히드와 아미노산을 NaCNBH3 존재 하에 반응을 시켜 생성된 비-펩티드 결합을 포함한 폴리펩티드 사슬의 비펩티드 결합(-CH2-NH)을 위한 고체상 합성의 방법을 제공한다.
위에서 묘사된 서열로 이루어진 펩티드는 안정성, 생물가용성, 및/또는 펩티드의 결합을 증가 시키기 위해 추가적인 화학 기을 아미노 및 또는 카복시 말단에 결합할 수도 있다. 예를 들면, 카보벤족실, 단실, 또는 t-부틸옥시카보닐 기 등 소수성 기가 펩티드의 아미노 말단에 추가될 수 있다. 마찬가지로, 아세틸 기 또는 9-플루오레닐메톡시-카보닐-기가 펩티드의 아미노 말단에 위치할 수도 있다. 또한, 소수성 기, t-부틸옥시카보닐, 또는 아미도 기 또한 펩티드의 카르복시 말단에 추가될 수 있다.
또한, 이 발명의 펩티드는 입체적 배치를 변화시키기 위해 생성될 수도 있다. 예를 들면, 펩티드의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 D-이성질체가 보통의 L-이성질체 대신에 사용될 수도 있다. 더 나아가서, 본 발명의 펩티드의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 비자연적으로 발생하는 아미노산 잔기와 치환될 수도 있다. 이와 같은 변화는 안정성, 생물가용성, 및/또는 본 발명의 펩티드의 결합을 증가시킬 수 있다.
유사하게, 이 발명의 펩티드 또는 변이체는 특정한 아미노산을 펩티드 생성 전 또는 후에 반응시킴으로써 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예는 이 분야에서 잘 알려져 있으며 예를 들어, 이 문헌의 참조 문헌에 포함되어 있는 R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004(Lundblad, 2004)에 잘 묘사되어 있다. 아미노산의 화학 변형은 아실화, 아미딘화, 리신의 피리독실화, 환원성 알킬화 반응, 아미노산의 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰화(TNBS)에 의한 트라이니트로벤질화, 카르복실 기의 아미드 변형 및 퍼포민산에 의한 설피드릴 변형, 시스틴의 시스테릭산으로의 산화, 머큐리얼 유도체 생성, 다른 티올 화합물과 다이설피드 생성, 말레이미드와의 반응, 요오드화 아세트산 또는 요오드 아세트 아미드에 의한 카르복시메틸레이션 및 시안산 염에 알칼리성 산도에서의 의한 카르바밀화를 포함하지만 이에 국한 되지 않은 변형을 언급한다. 이에 관해서, 더 광대한 단백질의 화학 변형에 대한 방법론에 대해서는 당업자는 Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan 등 (John Wiley & Sons NY 1995-2000)(Coligan et al., 1995)의 15장을 참조하길 바란다.
간단히 말하면, 예를 들어 단백질의 아르기닌 잔기는 흔히 페닐글리옥산, 2,3-부탄디온 및 1,2-사이클로헥산디온과 같은 이웃자리 디카르보닐 화합물과의 반응에 근거하여 부가물을 형성한다. 다른 예는 메틸글로옥살과 아르기닌 잔기와의 반응이다. 시스테인은 리신과 히스티딘과 같은 다른 친핵성 부위의 동시 변형 없이 변형시킬 수 있다. 그 결과 다수의 시약들이 시스테인 변형에 사용 가능하다. Sigma-Aldrich(http://www.sigma-aldrich.com)와 같은 회사들의 웹사이트에서는 특정 시약에 관한 정보를 제공하고 있다.
단백질에서 이황화 결합의 선택적 환원 또한 흔하게 나타난다. 단백질에서 이황화 결합은 생물약제의 열 처리 동안 형성되어 산화될 수 있다. 우드워드의 시약 K는 특정 글루탐산 잔기의 변형에 사용될 수 있다. N-(3-(디메틸아미노)프로필)-N'-에틸카르보디이미드를 사용하여 리신 잔기와 글루탐산 잔기 사이의 분자 내 가교를 형성할 수 있다. 예를 들어, 디메틸피로카보네이트는 단백질에서 히스티딘 잔기의 변형을 위한 시약이다. 히스티딘은 4-히드록시-2-노네날을 사용하여 변형시킬 수 있다. 리신 잔기와 다른 α-아미노기의 작용은, 예를 들어, 펩티드의 표면 결합 또는 단백질/펩티드들의 가교에 유용하다. 리신은 폴리(에틸렌)글리콜의 부착 부위이며 단백질의 당화에서 중요 변형 부위이다. 단백질에서 메티오닌 잔기는 예를 들어 이오도아세트아미드, 브로모에틸아민 및 클로르아민 T를 사용하여 변형시킬 수 있다.
테트라니트로메탄 및 N-아세틸이미다졸은 티로신 잔기의 변형에 사용할 수 있다. 디티로신의 형성을 통한 가교 형성은 과산화 수소/구리 이온으로써 성취할 수 있다.
트립토판의 변형에 대한 최근의 연구에서는 N-브로모숙신이미드, 브롬화 2-키드록시-5-니트로벤질 또는 3-브로모-3-메틸-2-(2-니트로페닐메르 캅토)-3H-인돌(BPNS-스카톨)이 사용된 바 있다.
PEG를 이용한 치료 단백질과 펩티드의 성공적인 변환은 히드로겔 준비시 사용되는 단백질을 글루타르알데히드, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트 및 포름알데히드와 교차 결합하는 동시 순환 반감기의 증가를 시키는 것과 흔히 관련되어 있다. 면역 치료를 위한 알레르겐의 화학적 변형은 종종 칼륨 시안산염의 카바밀화와 관련이 있다.
펩티드 또는 변이체, 여기에서 펩티드는 변환되었거나 또는 비-펩티드 결합을 포함하는 것이 본 발명 구현에서 바람직하다. 일반적으로 펩티드와 변이체(적어도 펩티드 링크를 아미노산 잔기 사이에 포함하는 것들)는 고체상 펩티드 합성의 Fmoc-폴리아미드 모드에 의해 합성될 수 있으며, 이는 Lukas 등(Lukas et al., 1981) 그리고 여기에 인용된 참조문헌에 공개되어 있다. 일시적인 N-말단 기 보호는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)에 의해 제공된다. 이렇게 염기 불안정한 보호 기의 반복적인 절단은 N, N-디메틸포름아미드의 20% 피페리딘를 이용하여 이루어진다. 곁사슬 기능은 부틸 에테르(세린, 트레오닌 및 티로신의 경우), 부틸 에스테르(글루탐산 및 아스파르트산의 경우), 부틸옥시카보닐 변이체(리신과 히스티딘의 경우), 트라이틸 변이체(아르기닌의 경우) 그리고 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐 유도체(아르기닌의 경우)로서 보호될 수 있다. 글루타민 또는 아스파라긴이 C-말단의 잔기인 경우, 4,4'-디메톡시벤즈히드릴이 사용되어 곁사슬 아미도 기능을 보호한다. 고체형 보조는 디메틸아크릴아미드(백본-모노머), 비스아크릴로일에틸렌 디아민(가교 결합) 및 아크릴로일사르코신 메틸 에스테르(기능 작용제)의 3개의 모노머로 만들어진 폴리디메틸-아크릴아미드 중합체에 기반을 둔다. 펩티드 대 레진 절단 가능 연결 작용제로 사용되는 것은 산-불안정 4-히드록시메틸-페녹시아세트산 유도체이다. 모든 아미노산 유도체는 역 N, N-디사이클로헥실-카보다이이미드/1-히드록시벤조트리아졸에 의한 커플링 과정에 의해 추가되는 아스파라진과 글루타민을 제외하고 미리 생성된 대칭의 무수물 유도체로서 추가된다. 모든 커플링과 탈보호 반응은 닌히드린, 트리니트로벤젠 술폰산 또는 이소틴 실험 과정에 의해 모니터링된다. 합성 완료 시에, 펩티드는 레진 기반에서 50% 스캐빈저 믹스를 포함한 95% 트리플루오로아세트산에 의한 곁사슬 보호 기 제거와 동시에 절단된다. 일반적으로 사용되는 스캐빈저로는 에탄디티올, 페놀, 아니솔 및 물을 포함하고, 정확한 선택은 합성되는 펩티드에 포함되어 있는 아미노산에 따라 결정된다. 펩티드의 합성에 있어서 고체상과 액체상 방법의 결합 또한 가능하다(예를 들면, (Bruckdorfer et al., 2004) 및 이 문헌에 인용된 참고문헌 참조).
트리플루오로아세트산은 진공 상태에서 증발된 후 디에틸에테르에 의한 분사슬에 의해 제거되어 조펩티드를 생성한다. 존재하는 일체의 스캐빈저는 수용액 상태에서 냉동건조에 의한 간단한 추출 과정에 의해 제거되어 스캐빈저가 없는 조펩티드를 생성한다. 펩티드 합성의 시약은 일반적으로 예를 들면 칼바이오켐-노바바이오켐(노팅힐)(Calbiochem-Novabiochem(Nottingham)로부터 입수할 수 있다.
정제는 재결정화, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 및 (보통) 예를 들면 아세토니트릴/물 구배 분리를 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 등의 단일 방법 또는 이의 결합 방법에 의해 수행할 수 있다.
펩티드의 분석은 박막 크로마토그래피, 전기 영동법, 특히 모세관 전기 영동법, 고체상 추출법(CSPE), 고성능 역단계 액체 크로마토그래피, 산성 가수분해 후 아미노산 분석 및 고속 원자 폭격(FAB) 질량 분석법 및 MALDI와 ESI-QTOF 질량 분석법 등에 의해 이루어질 수 있다.
과다 제시된 펩티드를 선택하기 위해, 중간 샘플 제시는 물론 복제 변이를 보여주는 제시 프로필이 계산된다. 이 프로필은 관심 대상의 종양 개체 샘플을 정상 조직 샘플의 베이스라인에 병치된다. 그런 다음, 이 프로필 각각에 대해 선형 혼합효과 모형의 p-값을 계산하고(Pinheiro et al., 2015) 오류 발견율(Benjamini and Hochberg, 1995)에 대한 복수의 검사를 조절함으로써 과다 제시 점수에 통합될 수 있다.
질량 분석에 의한 HLA 리간드의 동정 및 상대적 정량화를 위해, 충격동결된 조직 샘플에서 얻은 HLA를 정제하고 HLA-연관 펩티드를 확인했다. 확인된 펩티드는 분리하여 그 서열을 온라인 나노-전기분무-이온화(nanoESI) 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS) 실험에 의해 식별했다. 골수종 샘플로부터 기록된 자연 TUMAP의 분절 패턴을 동일한 서열을 가진 상응하는 합성 참조 펩티드의 분절 패턴과 비교하여, 얻어진 펩티드 서열을 확인했다. 이 펩티드는 원발성 종양의 HLA 분자의 리간드로서 직접 식별되기 때문에, 그 결과는 골수종 환자로부터 얻은 원발성 암 조직에 대해 식별된 펩티드의 자연적 처리와 제시에 대한 직접적 증거를 제공한다.
발견 파이프라인 XPRESIDENT v2.1(예를 들어 전체가 여기에 포함되는 US 2013-0096016을 참고)은 몇 가지 다른 비암성 조직 및 기관에 비해 암 조직에 대한 HLA-제한 펩티드 수준의 직접적인 상대적 정량화를 기준으로 관련된 과다 제시된 펩티드 백신 후보의 식별과 선택을 허용한다. 이는 서열 식별, 스펙트럼 집락화, 전화 이온 계수화, 정체 시간 정렬, 상태 디컨볼루션 및 정상화에 필요한 알고리즘을 조합시킨 독점 데이터 분석 파이프라인에 의해 처리하여 획득한 LC-MS 데이터를 사용한 비표지 차등 정량화의 개발에 의해 성취되었다.
펩티드와 샘플 각각에 대한 오류 측정치 등 제시 수준이 확립되었다. 종양 조직에 배타적으로 제시된 펩티드 그리고 종양에서 과다제시된 펩티드 대비 비암성 조직 및 기관이 식별된 바 있다.
골수종 샘플로의 HLA-펩티드 복합체를 정제했으며, HLA-관련 펩티드를 분리하여 LC-MS에 의해 분석했다(실시예 참조). 본 출원에 포함된 모든 TUMAP는 이러한 접근 방식으로써 원발성 골수종 샘플 상에서 식별하여 골수종에 대한 제시를 확인했다.
복수의 골수종 및 정상 조직에 대해 식별된 TUMAP를 비표지 LC-MS 데이터에 대한 이온-계수화를 사용하여 정량화했다. 이 방법은 펩티드의 LC-MS 신호 영역이 샘플에 과다한 존재와 상관관계가 있음을 가정한다. 다양한 LC-MS 실험에서 펩티드의 모든 정량적 신호들을 LS-MS 실험을 중심 경향에 근거하여 정상화하고 샘플 당 평균화하여 제시 프로필이라 부르는 막대 도표에 통합시켰다. 이 제시 프로필은 단백질 데이터베이스 검색, 스펙트럼 군락화, 충전 상태 디컨벌루션(방전) 및 시간 성격 및 정체 정상화와 같은 다른 분석 방법들을 통합시킨다.
본 발명은 암/종양, 바람직하게는 본 발명의 펩티드를 과도하게 또는 배타적으로 제시하는 골수종의 치료에 유용한 펩티드를 제공한다. 이 펩티드들은 인간 골수종 샘플 및/또는 PC 샘플의 HLA 분자에 의해 자연적으로 제시되는 것으로 질량 분석법에 의해 나타났다.
펩티드가 유래하는 소스 유전자/단백질("전장 단백질" 또는 "기저 단백질"로도 지정됨)의 다수는 소스 유전자에 대한 고도의 종양 연관을 표출하는 정상 조직과 비교해서 암에서 고도로 과발현되는 것으로 나타났다 - 본 발명과 관련하여 "정상 조직"은 소스 유전자와의 높은 정도의 종양 연관성을 발휘하는 종양-상응 유형의 건강한 혈장 세포 또는 기타 정상 조직 세포를 의미한다. 게다가 펩티드 자체는 종양 조직에서 강력히 과다제시된다 - 본 발명과 관련하여 "종양 조직"은 정상 조직상의 것이 아니라 골수종을 앓는 환자의 샘플을 의미한다.
HLA-결합된 펩티드는 면역계 특히 T 림프구에 의해서 인식된다. T 세포는 인식된 HLA/펩티드 복합체를 제시하는 세포, 예를 들어 유도된 펩티드를 제시하는 골수종의 세포를 파괴할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 T 세포 반응을 자극할 수 있으며/거나 과다 제시되는 것으로 나타났으므로, 본 발명에 따른 항체 및/또는 TCR, 예를 들어 가용성 TCR의 생산에 사용될 수 있다. 더욱이 해당되는 MHC와 복합된 펩티드는 본 발명에 따른 항체 및/또는 TCR 특히 sTCR의 생산에도 사용될 수 있다. 해당 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있으며 해당 문헌에서도 찾을 수 있다. 그러므로, 본 발명의 펩티드는 환자의 종양 세포를 파괴할 수 있는 면역 반응을 생성하는데 유용하다. 환자의 면역 반응은 설명된 펩티드의 직접적인 투여 또는 면역성을 강화할 수 있는 제제(즉, 보조제)와 섞인 적당한 전조 물질(예를 들면, 연장된 펩티드, 단백질, 또는 이러한 펩티드를 인코딩하는 핵산)을 환자에게 투여하는 것으로 유도될 수 있다. 이런 치료 백신에서 생긴 면역 반응은 본 발명의 표적 펩티드가 비교가능한 복사 수로 정상 조직에서는 나타나지 않고, 환자의 정상 세포에 대한 기피되는 자기 면역 반응의 위험을 배제하기 때문에 종양 세포에 아주 특이적일 수 있다.
본 설명은 또한 알파 사슬 및 베타 사슬("알파/베타 TCR")를 구성하는 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이다. 또한 MHC 분자에 의해 제시될 경우 TCR 및 항체에 결합할 수 있는 HAVCR1-001 펩티드가 제공된다. 본 설명은 또 본 설명의 TCR 및 펩티드의 발현을 위한 핵산, 벡터 및 숙주 세포 그리고 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
"T 세포 수용체"(약자로 TCR)란 용어는 알파 폴리펩티드 사슬(알파 사슬) 및 베타 폴리펩티드 사슬(베타 사슬)로 구성되는 이종이합체 분자를 칭하며 이종이합체 수용체는 HLA 분자에 의해 제시되는 펩티드 항원에 결합할 수 있다. 이 용어는 또한 소위 감마/델타 TCR도 포함한다.
한 구현에서 이 설명은 여기서 설명한 TCR 생산 방법을 제공하며 이 방법은 TCR의 발현 촉진에 적합한 조건 하에서 TCR을 발현할 수 있는 숙주 세포의 배양으로 구성된다.
다른 양상에서 본 발명은 본 설명에 따른 방법에 관한 것으로, 충분한 수량의 항원을 항원 제시 세포와 접촉시킴으로써 상기 항원이 적절한 항원 제시 세포 또는 인공 항원 제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자에 로딩되거나 항원/클래스 I 또는 II MHC 복합체 단량체를 사합체화함으로써 상기 항원이 클래스 I 또는 II MHC 사합체에 로딩된다.
알파/베타 TCR의 알파 및 베타 사슬 그리고 감마/델타 TCR의 감마 및 베타 사슬은 일반적으로 각각 두 개의 "도메인" 즉, 가변 및 불변 도메인을 갖는 것으로 간주된다. 가변 도메인은 가변 영역(V) 및 결합 영역(J)의 연속으로 구성된다. 가변 도메인은 선도 구역(L)도 포함할 수 있다. 베타 및 델타 사슬도 다양성 구역(D)을 포함할 수 있다. 알파 및 베타 불변 도메인은 알파 및 베타 사슬을 세포막에 고정시키는 C-말단 막횡단(TM) 도메인도 포함할 수 있다.
감마/델타 TCR에 대하여, 여기서 사용된 "TCR 감마 가변 도메인"이란 용어는 선도 영역(L) 없는 TCR 감마 V(TRGV) 구역의 연속을 지칭하며, TCR 감마 불변 도메인이란 용어는 세포의 TRGC 구역이나 C-말단 각추 TRGC 서열을 지칭한다. 마찬가지로 "TCR 델타 가변 도메인"이란 용어는 선도 영역(L)이 없는 TCR 델타 V(TRDV) 영역 및 TCR 델타 D/J(TRDD/TRDJ) 영역의 연속을 지칭하며 "TCR 델타 불변 도메인"이란 용어는 세포의 TRDC 영역 또는 C-말단 절단 TRDC 서열을 지칭한다.
본 설명의 TCR은 바람직하게는 결합 친화성(KD)이 약 100 μM 이하, 약 50 μM 이하, 약 25 μM 이하, 또는 약 10 μM 이하로서 HAVCR1-001 펩티드-HLA 분자 복합체에 결합한다. 더욱 바람직하기로는 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 25 nM 이하의 결합 친화성을 갖는 고친화성 TCR이다. 본 발명의 TCR에 대한 바람직한 결합 친화성 범위의 비제한적 실례에는 약 1 nM에서 약 10 nM; 약 10 nM에서 약 20 nM; 약 20 nM에서 약 30 nM; 약 30 nM에서 약 40 nM; 약 40 nM에서 약 50 nM; 약 50 nM에서 약 60 nM; 약 60 nM에서 약 70 nM; 약 70 nM에서 약 80 nM; 약 80 nM에서 약 90 nM; 그리고 약 90 nM에서 약 100 nM이 포함된다.
본 설명의 TCR과 관련하여 여기서 사용되는, "특이적 결합" 및 이의 문법적 변이들은 HAVCR1-001 펩티드-HLA 분자 복합체의 결합 친화성(KD)이 100 μM 이하인 TCR을 의미한다.
본 발명의 알파/베타 이종이합체는 그 불변 도메인 사이에 개입된 이황화 결합이 있을 수 있다. 이 유형의 바람직한 TCR에는 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열이 있는 것들을 포함하지만 단 TRAC의 Thr 48을 TRBC1이나 TRBC2의 Ser 57은 시스테인 잔기에 의해 교체되고, 상기 시스테인은 TRAC 불변 도메인 서열과 TCR의 TRBC1이나 TRBC2 불변 도메인 서열 사이에 이황화 결합을 형성한다.
위에서 언급된 도입된 사슬사슬간 결합의 유무와 무관하게, 본 설명의 알파/베타 이종이량체 TCR은 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1이나 TRBC2 불변 도메인 서열을 가질 수 있으며, TCR의 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1이나 TRBC2 불변 도메인 서열은 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1이나 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이의 기본 이황화 결합에 의해 연결될 수 있다.
본 설명의 TCR은 방사선핵종, 형광단 및 비오틴 구성된 군으로부터 선택된 검출가능한 라벨을 포함할 수 있다. 본 설명의 TCR은 방사성핵종과 같은 치료적으로 활성인 제제, 화학요법 제제 또는 독소에 결합할 수 있다.
한 구현에서, 알파 사슬에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖고/거나 베타 사슬에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 본 발명의 TCR이 돌연변이되지 않은 TCR에 비해 변형된 글리코실화를 갖는다.
한 구현에서, TCR 알파 사슬 및/또는 TCR 베타 사슬에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 TCR의 HAVCR1-001 펩티드-HLA 분자 복합체에 대한 결합 친화성 및/또는 결합 반감기가 돌연변이되지 않은 TCR 알파 사슬 및/또는 돌연변이되지 않은 TCR 베타 사슬을 포함하는 TCR의 그것보다 적어도 2배이다. 종양 특이적 TCR의 친화성-강화 및 그 착취는 최적의 TCR 친화성에 대한 창의 존재에 의존한다. 그러한 창의 존재는 HLA-A2-제약된 병원체는, HLA-A2-제약된 종양 관련 자가-항원에 비해 KD 값이 일반적으로 약 10배라는 관찰에 근거한다. 종양 항원이 면역원성의 잠재성을 갖더라도, 종양이 개인 자신의 세포로부터 발생하기 때문에, 돌연변이된 단백질이나 변형된 번역 처리를 갖는 단백질만이 면역계에 의해 이물질로 보여지는 것으로 현재 알려져 있다. 상향조절되거나 과발현된 항원(소위 자가-항원)이 종양에 대해 기능적 면역 반응을 반드시 유도하지는 않을 것이다. 이러한 항원에 대해 반응성이 높은 TCR을 발현하는 T 세포는 자가-항원에 대해 낮은 친화성의 TCR을 가진 T 세포만 남는다는 의미로 알려진 중추 관용의 과정에서 흉선 내에서 부정적으로 선택되었을 것이다. 그러므로 본 발명의 TCR 또는 변이체의 HAVCR1-001에 대한 친화성은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 강화시킬 수 있다.
본 설명은 또한 본 발명에 따른 TCR의 식별 및 분리 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 HLA-A*02-음성의 건강한 공여자로부터 PBMC를 A2/HAVCR1-001 단량체로써 배양, PBMC를 사합체-파이코에리스린(PE)으로써 배양 그리고 형광 유세포 분리(FACS)-캘리버 분석에 의한 고결합성 T 세포의 분리를 포함한다.
본 설명은 또한 본 설명에 따른 TCR의 식별 및 분리에 관한 것으로, 상기 방법은 T 세포가 마우스 TCR 결핍을 보상하는 방대한 TCR 수집물을 발현하는 전체 인간 TCR飡 유전자 자리들(1.1 및 0.7 Mb)로써 유전자이전 마우스의 획득, HAVCR1-001 에 의한 마우스의 면역접종, 유전자전이 마우스로부터 얻어진 PBMC의 사합체-홍조(PE)에 의한 배양, 그리고 형광 유세포 분리(FACS)-캘리버 분석에 의한 고결합성 T 세포의 분리를 포함한다.
한 양태에 있어서, 본 설명의 TCR을 발현하는 T 세포를 취득하기 위해, 본 발명의 TCR-알파 및/또는 TCR-베타 사슬을 인코딩하는 핵산을 감마 레트로바이러스 또는 렌티바이러스와 같은 발현 벡터로 클로닝한다. 이 재조합 바이러스를 생성한 다음 항원 특이성 및 기능적 결합성과 같은 기능성에 대해 검사한다. 다음 최종 생성물의 일정 부분을 사용하여 표적 T 세포 군락(일반적으로 환자 PBMC로부터 정화됨)을 형질도입하며, 이는 확장된 다음 환자에게 주입한다.
다른 양태에 있어서, 본 설명의 TCR을 발현하는 T 세포를 취득하기 위해, TCR RNA은 당업계에서 알려진 기법으로 예를 들어 시험관 내 전사 시스템에서 합성한다. 다음, 시험관 내에서 합성된 TCR RNA를 건강한 공여자로부터 얻은 원발성 CD8+ T 세포에 전기천공에 의해 도입함으로써 종양 특이적 TCR-알파 및/또는 TCR-베타 사슬을 재발현한다.
발현의 증가를 위해, 본 설명의 TCR을 인코딩하는 핵산은 강력한 프로모터에 작동가능하게 연관시킬 수 있으며, 이는 레트로바이러스 긴 말단 반복(LTR), 거대세포 바이러스(CMV), 마우스 줄기세포 바이러스(MSCV) U3, 포스포글리세르산 인산화효소(PGK), β-액틴, 유비퀴틴 그리고 원숭이 바이러스 40(SV40)/CD43 복합 프로모터, 연장 인자(EF)-1a 및 비장 병소 형성 바이러스(SFFV) 프로모터 등이다. 바람직한 구현에서, 이 프로모터는 발현 중인 핵산에 대해 이종이다.
강력한 프로모터 외에도, 본 설명의 TCR 발현 카세트에는 이식 유전자 발현을 강화시킬 수 있는 추가의 요소들이 포함될 수 있으며, 이는 렌티바이러스성 구성의 핵 전위를 촉진하는 중앙 폴리퓨린 트랙(cPPT)(Follenzi et al., 2000) 그리고 RNA 안정성의 증가를 통해 이식 유전자 발현의 수준을 증가시키는 wPRE(우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소)(Zufferey et al., 1999) 등을 포함한다.
본 발명의 TCR의 알파 및 베타 사슬은 별개의 벡터에 위치한 핵산에 의해 인코딩할 수 있거나 동일한 벡터에 의한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩할 수 있다.
고수준의 TCR 표면 발현의 성취는 도입된 TCR의 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬이 고수준으로 전사되는 것을 요구한다. 이를 위해서는, 본 설명의 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬이 단일 벡터에서 비시스트로닉 구성으로 클로닝될 수 있으며, 이는 이러한 장애물을 극복할 수 있는 것으로 나타난 바 있다. TCR-알파 및 TCR-베타 사슬 사이에 있는 바이러스성 내부 리보좀 엔트리 부위(IRES)를 사용하는 경우 두 사슬의 발현 조정을 초래하는데, 이는 번역 동안 2개의 단백질로 분해되는 단일 전사물로부터 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬이 생성됨으로써 동일한 몰 비율의 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬이 생성되도록 보장하기 때문이다(Schmitt et al. 2009).
본 설명의 TCR을 인코딩하는 핵산은 코돈의 최적화를 통해 숙주 세포의 발현을 증가시킬 수 있다. 유전 부호의 중복성으로 인해 일부 아미노산은 하나보다 많은 코돈에 의해 인코딩이 가능하지만, 특정 코돈은 다른 것보다 덜 '최적'인데 이는 tRNA는 물론 다른 인자의 짝짓기에 대한 상대적 가용도 때문이다(Gustafsson et al., 2004). 각 핵산이 포유류 유전자 발현을 위해 최적의 코돈에 의해 인코딩되도록 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자 서열의 변형은 물론 mRNA 불안정성 모티프 또는 잠적 스플라이스 부위의 제거는 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자 발현을 유의하게 강화시키는 것으로 나타났다(Scholten et al., 2006).
더욱이 도입된 TCR 사슬에 따라 내인성 TCR 사슬 사이의 틀린 짝짓기는 자가 면역에 대해 상당한 위험을 제기하는 특이성의 획득을 초래할 수 있다. 예를 들어, 혼합 TCR 이합체의 형성은 제대로 짝짓기된 TCR 복합체의 형성에 가용한 CD3 분자의 수를 감소시킬 수 있으며, 그리하여 도입된 TCR를 발현하는 세포의 기능적 결합성을 유의하게 감소시킬 수 있다(Kuball et al., 2007).
잘못된 짝짓기를 감소시키려면, 본 설명의 도입된 TCR 사슬의 C-말단 도메인을 변형하여 사슬간 친화성을 촉진시킬 수 있는 반면, 내인 TCR과 도입된 사슬의 짝짓기 능력을 감소시킬 수 있다. 이러한 전략에는 인간 TCR-알파 및 TCR-베타 C-말단 도메인의 상응하는 마우스 도메인에 의한 교체(마우스 C-말단 도메인); 도입된 TCR의 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬 모두에 제2 시스테인 잔기를 도입하여 C-말단 도메인에서 제2 사슬간 이황 결합의 생성(시스테인 변형); TCR-알파 및 TCR-베타 사슬 C-말단 도메인에서 상호작용하는 장기들의 교환(놉-인-홀(knob-in-hole)); 그리고 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬의 가변 도메인을 CD3ζ에 대한 직접 융합(CD3ζ융합)이 포함될 수 있다(Schmitt et al. 2009).
한 구현에서는, 숙주 세포를 본 설명의 TCR을 발현하도록 공학적으로 조작한다. 바람직한 구현에서는, 이 숙주 세포가 인간 T 세포 또는 T 전구세포이다. 일부 구현에서는 T 세포 또는 T 전구 세포를 암 환자로부터 얻는다. 다른 구현에서는 T 세포 또는 T 전구 세포를 건강한 공여자로부터 얻는다. 본 설명의 숙주 세포는 치료하려는 환자에 대해 동종이거나 자가일 수 있다. 한 구현에서, 이 숙주는 감마/델타 T 세포 변형을 통해 알파/베타 TCR을 발현한다.
"약학적 조성물"이란 의학적 환경에서 인간에게 투여하는데 적합한 성분이다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 무균이며 GMP 지침에 따라 생산된다.
약학적 조성물은 유리 형태 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 된 펩티드를 포함한다(상기 내용도 참조). 여기서 사용되는 것처럼, "약학적으로 허용가능한 염"은 펩티드가 산 또는 제제의 염기 염을 만들며 변형되는 공개된 펩티드의 유도체를 언급한다. 예를 들면, 산성 염은 적당한 산과의 반응을 가진 자유 염기(일반적으로 중성 NH2 기가 있는 약물의 중성 형태)로부터 제조된다. 산성 염을 준비할 때 적당한 산은 예를 들면, 염산, 브롬화 수소산, 황산, 질산 인산과 같은 같은 무기산뿐만 아니라 초산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 수산, 말산, 말론산, 호박산, 말레산, 푸마르산, 주석산, 구연산, 벤조산, 계피산, 맨델릭산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산같은 유기산을 포함한다. 반대로, 펩티드에서 나타날 수 있는 산성 잔기의 염기 염의 준비는 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼슘, 트리메틸아민과 같은 약학적으로 허용가능한 염기를 사용한다.
특별히 바람직한 약학적 조성물의 구현은 초산(아세트산염), 삼불화 초산 또는 염산(염화물)의 염으로의 펩티드를 가진다.
바람직하게는, 이 본 발명의 약제는 백신과 같은 면역요법제이다. 이는 환자의 영향을 받은 기관에 직접적으로 투여될 수 있거나 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v.로서 전체적으로 투여되거나 또는 환자에게서 또는 나중에 환자에게 투여될 인간 세포주에 생체 외로 적용될 수도 있거나 또는 나중에 환자에게 다시 투여될 선택된 면역 세포의 부분 집단에 시험관 내로 사용될 수도 있다. 만약 핵산이 시험관 내에서 세포에 투여 되면, 인터루킨-2와 같은 면역 유도 시토카인과 함께 발현되는 것이 유용할 수도 있다. 펩티드는 상당히 순도가 높을 수도 있고, 또는 면역 유도 보조제(아래 참조)와 결합되어 있거나 또는 면역-유도 시토카인과 함께 합성체로 사용되거나, 또는 리포좀과 같은 적당한 전달 체계와 함께 투여될 수도 있다. 펩티드는 또한 키홀 임펫 헤모시아닌(KLH) 또는 만난과 같은 적절한 운반체와 접합시킬 수도 있다(WO 95/18145 및 문헌 (Longenecker et al., 1993) 참고). 펩티드는 표지를 붙일 수도 있으며 융합 단백질일 수 있고 하이브리드 분자일 수도 있다. 본 발명에서 그 서열이 제공된 펩티드는 CD4 또는 CD8 T 세포를 자극할 것으로 기대된다. 그러나 CD8 세포의 자극은 CD4 보조 T 세포에 의해 제공되는 도움이 존재할 때 더 효율적이다. 그러므로 CD8 T 세포를 자극하는 MHC 클래스 I 에피톱의 경우, 융합 파트너 또는 하이브리드 분자의 섹션은 CD4-양성 T 세포를 자극하는 에피톱을 적절하게 제공한다. CD4-와 CD8-자극 에피톱은 이 분야에서 잘 알려졌고 본 발명에서 식별된 것들을 포함한다.
한 양태에서, 이 백신은 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228을 명시하는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 펩티드 그리고 적어도 하나의 추가적인 펩티드 바람직하게는 2개 내지 50개이고, 더 바람직하게는 2개 내지 25개이며, 보다 더 바람직하게는 2개 내지 20개이고 가장 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 펩티드를 포함한다. 펩티드는 하나 또는 그 이상의 특정한 TAA에서 유도되었고 이는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 변이체를 인코딩하는 핵산(예를 들면 폴리뉴클레오티드)에 대한 정보를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이의 결합될 수 있으며, 한 가닥 및/또는 이중 사슬로 되어 있을 수 있고, 또는 본래의 형태일 수도 또는 예를 들면 포스포로티오에이트 백본을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드의 안정화된 형으로 되어 있을 수도 있으며, 펩티드를 코딩하는 한 인트론을 포함할 수도 또는 그렇지 않을 수도 있다. 물론, 단지 자연적으로 일어나는 아미노산 잔기로 이루어진 그리고 자연적으로 일어나는 펩티드 결합에 의해 결합이 된 펩티드만이 폴리뉴클레오티드에 의해서 인코딩될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터에 대한 설명을 제공한다.
특히 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드를 벡터를 예를 들면 보완 응집성 말단을 이용하여 연결하는 여러 가지 방법이 개발되었다. 예를 들면, 보완 동종중합체 트랙트가 DNA 분절에 추가되어 이를 벡터 DNA에 삽입할 수 있다. 벡터와 DNA 분절은 이후 보완 동종중합체 꼬리와 함께 수소 결합을 이용하여 재조합 DNA 분자를 생성할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 제한 부위를 포함하는 합성된 연결부위는 DNA 분절과 벡터를 결합하는 다른 방법을 제시한다. 여러 가지의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 합성 연결부위는 상업적으로 International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA를 비롯한 곳에서 구입이 가능하다.
본 발명에서 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 변형하는 바람직한 방법은 다음의 Saiki RK 등에 의하여 공개된 폴리머라아제 연쇄 반응을 이용한다(Saiki et al., 1988). 이 방법은 예를 들면 적당한 제한 부위를 만들어 적당한 벡터로 DNA를 도입하는데 사용하거나 또는 당업계에서 알려져 있는 DNA를 다른 유용한 용도를 위해 변형하는 데에 사용될 수도 있다. 만약 바이러스 벡터가 사용된다면, 수두 벡터 또는 아데노바이러스 벡터가 바람직하다.
DNA(또는 레트로 바이러스 벡터일 경우, RNA)는 그 후 적당한 숙주에서 발현되며 이는 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 가지고 있는 폴리펩티드를 생성한다. 따라서, 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 인코딩하는 DNA는 알려진 기술과 여기에서 배울 수 있는 것을 고려하여 적절히 수정하여 적절한 숙주 세포를 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 생성하도록 형질전환을 시키는 데 사용된다. 이러한 기법은 예를 들어 다음에 공개되어 있다: 미국 특허 번호 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 및 4,810,648.
본 발명의 화합물을 만드는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA(또는 레트로바이러스 벡터일 경우, RNA)는 많은 종류의 다른 DNA 서열과 결합되어, 적절한 숙주로의 도입을 유도할 수 있다. 동반 DNA는 숙주의 특성, DNA를 숙주로 도입하는 방법 및 에피솜 유지 또는 통합이 필요한 지에 따라 결정될 것이다.
보통, DNA는 발현을 위한 올바른 방향 및 올바른 리딩 프레임에 맞추어 플라스미드와 같은 발현 벡터로 삽입된다. 필요할 경우, DNA는 바람직한 숙주에 의해 인식되는 적당한 전사 조절 제어 뉴클레오티드 서열(그러나, 이 제어는 대부분의 경우 발현 벡터 내에 이미 존재한다)에 연결될 수도 있다. 벡터는 그 후 숙주로 기본적인 기술을 통해 도입된다. 보통, 모든 숙주가 벡터에 의해 형질전환되지 않는다. 따라서, 형질전환된 세포를 선택하는 것이 필요할 것이다. 하나의 선택 기술은 형질전환된 세포에서 선택이 가능한 특성(예: 항생제 내성)을 코딩하는 DNA 서열을 필요한 제어 요소와 함께 발현 벡터에 통합시키는 것이다.
다른 방법으로는, 이러한 선택이 가능한 특성이 다른 벡터에 있을 수도 있으며, 이는 바람직한 숙주 세포를 동시-형질전환하는 데에 사용된다.
본 발명의 재조합 DNA에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 문서에서 기술된 내용을 고려하여 당업자가 이미 알고 있는 적절한 상태에서 충분한 시간 동안 배양되어 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하며, 이는 후에 회복된다.
박테리아(예를 들면, 에스케리치아 콜라이(E. coli)와 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 효모(예를 들면 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 사상균류(예를 들면 아스퍼길러스 스피시즈(Aspergillus spec.)), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충 세포 등의 많은 발현 체계가 알려져 있다. 바람직하게는, 그 체계는 ATCC Cell Biology Collection에서 구할 수 있는 CHO 세포 등의 포유류 세포로 구성될 수 있다.
구조성 발현을 위한 전형적인 포유류 세포 벡터 플라스미드는 CMV 또는 SV40 촉진제와 적당한 폴리 A 꼬리 및 네오마이신과 같은 저항성 마커를 포함한다. 하나의 예는, Pharmacia, Piscataway, NJ, USA 에서 구할 수 있는 pSVL이다. 유도가능 포유류 발현 벡터의 예는 pMSG이며 이 또한 Pharmacia에서 구할 수 있다. 유용한 효소 플라스미드 벡터는 pRS403-406과 pRS413-416이며 이는 대부분 Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA에서 구할 수 있다. 플라스미드 pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406은 효소 통합 플라스미드(YIps)이며 이는 효소 선택 마커 HIS3, TRP1, LEU2와 URA3를 통합한다. 플라스미드 pRS413-416은 효소 동원체 플라스미드(Ycps)이다. (예를 들면 Sigma-Aldrich로부터 입수한) CMV 프로모터 기반 벡터는 일시적인 또는 안정된 발현, 세포질 발현 또는 분비, 및 FLAG, 3xFLAG, c-myc 또는 MAT 등의 다양한 조합으로 N-말단 또는 C-말단 표지 등을 제공한다. 이러한 융합 단백질은 재조합 단백질의 검출, 정제와 분석을 가능하게 한다. 이중 표지 융합은 검출 시 유연성을 제공한다.
강한 인간 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터 조절 영역은 구성 단백질 발현 수준을 높게는 COS 세포에서 1mg/L까지 작동한다. 좀 더 효능이 약한 세포주에서는, 단백질 수준이 전형적으로 약 0.1mg/L 정도이다. SV40 복제 원점이 있음으로써 SV40, 복제를 가능하게 하는 COS 세포에서 DNA 복제의 수준이 높은 결과를 낳는다. CMV 벡터는 예를 들면 박테리아 세포에서의 복제를 위한 pMB1 원점, 박테리아에서 암피실린 저항 선택을 위한 b-락타마아제 유전자, hGH poly A, 및 f1 원점을 포함할 수 있다. 프리프로트립신 리더(PPT) 서열을 포함하는 벡터는 FLAG 융합 단백질을 ANTI-FLAG 항원, 레진, 및 플레이트를 사용하여 정제하기 위한 배양 배지로 분비하도록 방향을 정할 수가 있다. 다른 벡터와 발현 체계는 여러 가지의 숙주 세포 사용에 대해 널리 알려져 있다.
다른 구현에서는 본 발명의 2개 이상 펩티드나 펩티드 변이체가 인코딩됨으로써 연속적인 순서로 발현된다("염주 모양" 구조와 유사). 그렇게 함으로써 펩티드나 펩티드 변이체는 예를 들어 LLLLLL과 같은 링커 아미노산의 퍼짐에 의해 함께 연결 또는 융합될 수 있으며 또한 그 사이에 추가의 펩티드 없이 연결될 수 있다. 이러한 구성들은 암 요법에서도 사용할 수 있으며 MHC I 및 MHC II 모두가 연관되는 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 벡터 구축물에 의해 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 원핵 세포이거나 진핵 세포일 수 있다. 박테리아 세포가 몇몇의 상황에서 바람직한 원핵 숙주 세포일 수 있으며, 보통 Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA에서 구할 수 있는 에스케리치아 콜라이 균주 DH5, 그리고 American Type Culture Collection(ATCC), Rockville, MD, USA(No ATCC 31343)에서 RR1이 입수가능하다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 효소, 곤충, 포유류 세포를 포함하고, 생쥐, 쥐, 원숭이 또는 인간 섬유아세포와 대장 세포주 등의 척추 동물이 바람직하다. 효모 숙주 세포는 YPH499, YPH500 및 YPH501를 포함하며, 이는 대부분 Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA에서 구입이 가능하다. 바람직한 포유류 숙주 세포는 ATCC에서 구입이 가능한 CCL61로 알려져 있는 중국 햄스터 난소 세포, CRL 1658로 알려져 있는 스위스 생쥐 배아 세포 NIH/3T3, CRL 1650 세포로 알려져 있는 원숭이 신장-유도 COS-1 세포와 293 세포로 알려져 있는 인간 배아 신장 세포를 들 수 있다. 바람직한 곤충 세포는 Sf9 세포이며 이는 배큘로바이러스 발현 벡터에 의해 세포로 감염될 수 있다. 발현을 위한 적당한 숙주 세포의 선택에 대한 개관은 예를 들면 Paulina Balbas and Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols," Part One, Second Edition, ISBN 978-1- 58829-262-9 및 당해 분야의 숙련자에게 알려진 다른 문헌에서 찾을 수 있다.
적당한 세포 숙주를 본 발명의 DNA 구축물로 형질전환하는 것은 보통 사용되는 벡터의 유형이 따라 결정되는 잘 알려진 방법으로 완성된다. 원핵 숙주 세포의 형질전환에 대해서는 예를 들면 Cohen 등의 (Cohen et al., 1972) 그리고 (Green and Sambrook, 2012)를 참조한다. 효모 세포의 형질전환은 Sherman 등에 설명되어 있다(Sherman et al., 1986). Beggs의 방법(Beggs, 1978) 또한 유용하다. 척추 동물 세포와 관련하여 이러한 세포를 감염시키는 시약, 예를 들면 칼슘 인산염과 DEAE-덱스트란 또는 리포좀 제제는 Stratagene Cloning Systems 또는 Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA에서 입수할 수 있다. 전기 천공법 역시 형질전환 및/또는 세포를 감염시키는 데에 유용하며 이는 효소 세포, 박테리아 세포, 곤충세포 및 척추동물 세포 형질전환에 잘 알려져 있다.
성공적으로 형질전환된 세포, 즉 본 발명의 DNA 구조를 가지고 있는 세포는 잘 알려진 PCR과 같은 기술로 식별된다. 다른 방법으로는, 상청액에 존재하는 단백질은 항생제를 사용함으로써 검출될 수 있다.
본 발명의 특정한 숙주 세포, 예를 들면 박테리아, 효소 및 곤충 세포와 같은 세포는 본 발명의 펩티드의 준비에 유용하다는 것을 알 수 있을 것이다. 그러나, 다른 숙주 세포 또한 특정한 치료 방법에 유용할 수도 있다. 예를 들면, 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포는 적당한 MHC 분자에 로딩이 되도록 하는 본 발명의 펩티드를 발현하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
바람직한 구현에서, 숙주 세포는 항원 제시 세포이며, 특히 수지상 세포 또는 항원 제시 세포이다. 전립선산 인산효소(PAP)를 함유하는 재조합 융합 단백질로 로딩된 APC는 무증상 또는 최소한의 증상 전이성 HRPC(Sipuleucel-T)의 치료에 대해 미국 식품안전청(FDA)에서 2010년 4월 29일에 승인된 바 있다(Rini et al., 2006; Small et al., 2006).
본 발명의 다른 양태는 펩티드 또는 그 변이체를 생산하는 방법, 숙주 세포를 배양하고 펩티드를 숙주 세포 또는 배지에서 분리하는 것을 포함한 생산 방법을 제공한다.
다른 구현에서는 본 발명의 펩티드, 핵산 또는 벡터 발현이 의학에서 사용된다. 예를 들면, 펩티드 또는 그의 변이체는 정맥 내(i.v.) 투여, 피부 하(s.c.) 투여, 피부 내(i.d.) 투여, 복강 내(i.p.) 투여, 근육 내(i.m.) 투여를 포함한다. 펩티드 투여의 바람직한 방법은 s.c., i.d., i.p., i.m., 및 i.v. 투여를 포함한다. DNA 투여의 바람직한 방법은 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v.투여를 포함한다. 펩티드 또는 DNA의 50 ㎍ 내지 1.5 mg, 바람직하게는 125 ㎍ 내지 500 ㎍의 용량이 각각의 펩티드 또는 DNA에 따라서 투여될 수 있다. 이러한 범위의 용량이 이전의 임상실험에서 성공적으로 사용된 바 있다(Walter et al., 2012).
면역 접종에 사용된 폴리뉴클레오티드는 상당히 순도가 높거나 적당한 벡터 또는 전달 체계에 포함되어 있을 수 있다. 핵산은 DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 이러한 핵산을 설계하고 도입하는 방법은 이 업계에 잘 알려져 있다. 개요는 예를 들어 Teufel 등(Teufel et al., 2005)이 제공하고 있다. 폴리뉴클레오티드 백신은 만들기가 쉽지만, 이들 벡터의 면역 반응을 유도하는 동작 모드는 완전히 이해가 되지 않았다. 적당한 벡터와 전달 체계는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노 연관 바이러스 또는 한 개 이상의 바이러스를 포함하는 혼성체 등의 바이러스 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 비-바이러스 전달 체계는 양이온 지질과 양이온 중합체를 포함하고 있으며 DNA 전달 분야에서 잘 알려져 있다. "유전자-총(gene-gun)"을 통한 것과 같은 물리적 전달 또한 사용될 수 있다. 펩티드 또는 핵산에 의해 인코딩된 펩티드는 융합 단백질이 될 수도 있고, 예로서는 위에서 언급한 각각의 반대 CDR을 위한 T 세포를 유도하는 에피톱을 들 수 있다.
본 발명의 약제는 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 보조제는 면역 반응을 비특이적으로 향상시키거나 강력하게 하는 물질을 언급한다(예: 항원에 대한 CD80-양성 T 세포 및 조력 T(TH) 세포에 의해서 중재된 면역 반응). 따라서 본 발명에서 보조제는 유용한 약제 구성이라고 할 수 있다. 적당한 보조제는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, 플라젤린 또는 플라젤린에서 유도된 TLR5 리간드, FLT3 리간드, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(ALDARA: 등록상표), 레스퀴미드, ImuFact IMP321, IL-2, IL-13, IL-21과 같은 인터루킨, 인터페론 알파 또는 베타, 또는 이들의 페길화된 유도체, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, 주브이뮨(JuvImmune), LipoVac, MALP2, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드 IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, 유중수형과 수중유형 에멀전, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel 벡터 시스템, PLG와 덱스트란 극미립자, 탈락토페린, SRL172, 비로솜(Virosomes) 및 다른 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타글루칸, Pam3Cys, 사포닌에서 유도된 아퀼라스 QS21 스틸물론, 마이코박테리아 추출물과 합성 세균의 세포 벽 모방제, 및 다른 리비의 데톡스(Ribi's Detox), 쿠일(Quil), 또는 수퍼포스(Superfos)와 같은 독점 보조제 등이 있다. Freund's 또는 GM-CSF와 같은 보조제가 바람직하다. 몇몇 면역적 보조제(예: MF59)는 수지상 세포에 특이적이고, 그 제조 방법은 이전에 묘사된 바 있다(Allison and Krummel, 1995). 또한, 시토카인도 사용될 수 있다. 몇몇 시토카인은 수지상 세포의 림포이드 조직으로의 이동에 영향을 주는 것에 직접적으로 연관된 바 있으며(예: TNF-), 이는 수지상 세포의 더 효율적인 T 림프구에 대한 항원 제시 세포로의 성장을 가속시키고(예: GM-CSF, IL-1 및 IL-4)(미국 특허 번호 5,849,589, 여기에 그 전문이 참조 문헌으로 포함됨) 면역보조제의 역할을 한다(예: IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-알파, IFN-베타)(Gabrilovich et al 1996).
CpG 면역자극 올리고뉴클레오티드는 백신 세팅에서 보조제의 효율성을 높이는 것으로 나타났다. 이 이론에 국한하지 않고, CpG 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 수용체(TLR), 특히 TLR9를 통해 선천(비적응) 면역 반응을 활성화시킨다. CpG에 의해 유도된 TLR9의 활성화는 펩티드 또는 단백질 항원, 살아 있거나 죽은 바이러스, 수지상 세포 백신, 자가 세포 백신 및 예방적 및 치료적 백신의 다당류 접합체를 포함한 넓은 종류의 항원에 대한 항원 특이적 체액성 및 세포성 반응을 향상시킨다. 더 중요하게 이는 수지상 세포의 성숙 및 차별화를 향상시키고 이는 TH1 세포의 활성화를 향상시키며 강한 세포독성 T 림프구(CTL) 생성을 CD4 T 세포의 도움이 없을 때에도 향상시킨다. TLR9 자극에 의해 일어난 TH1 바이러스는 보통 TH2 바이러스를 촉진시키는 alum 또는 비완성된 프로인트 보조제(Freund's adjuvant(IFA))와 같은 백신 보조제가 존재할 때도 유지된다. CpG 올리고뉴클레오티드는 다른 보조제와 함께 제조되거나 함께 투여될 시 또는 특히 항원이 상대적으로 약할 때 강한 반응을 얻어 내기 위해 필요한 미세입자, 나노입자, 지질 에멀전 또는 비슷한 제약으로 되어 있을 경우 더 큰 보조제 활동을 보인다. 그들은 또한 면역 반응을 가속화시키고, 몇몇의 연구에서 보여진 바 있듯이 CpG가 없을 때 백신 전체 용량이 일으키는 항체 반응 수준으로 항원의 용량을 약 두 배 정도 줄일 수 있도록 한다(Krieg, 2006). 미국 특허 번호 6,406,705 B1는 CpG 올리고뉴클레오티드, 비핵산 보조제 및 항원 특이 면역 반응을 일으키는 항원의 결합 사용에 대해 묘사한다. CpG TLR9 길항제는 Mologen(Berlin, Germany)에 의해 만들어진 dSLIM(double Stem Loop Immunomodulator)이며 이는 본 발명의 제약 조성의 바람직한 성분이다. RNA 결합 TLR 7, TLR 8 및/또는 TLR 9 등의 다른 TLR 결합 분자 또한 사용이 가능하다.
다른 유용한 보조제의 예는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 화학적으로 변형된 CpGs(예: CpR, Idera), Poly(I:C)와 같은 dsRNA 유사체 및 그 유도체(예: 앰프리젠(AmpliGen, 힐토놀(Hiltonol, poly-(ICLC), poly(IC-R), poly(I:C12U), 비-CpG 박테리아 DNA 또는 RNA 및 사이클로포스아미드, 수니티닙, 베바시주맙(Bevacizumab, 셀레브렉스, NCX-4016, 실데나필, 타달라필, 바르데나필, 소라페닙, 테모졸로마이드, 템시롤리무스, XL-999, CP-547632, 파조파닙, VEGF 트랩, ZD2171, AZD2171, 안티-CTLA4와 같은 면역활성적인 작은 분자 및 항체 및 면역계의 주요 구조를 표적화하는 다른 항체(예: anti-CD-40, anti-TGFbeta, anti-TNFalpha 수용체) 및 SC58175가 있으며 이는 치료적으로 또는 보조제의 역할을 할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 보조제와 첨가제의 양과 농도는 특별히 다른 실험할 필요 없이 숙련된 기술자에 의해서 쉽게 결정될 수 있다.
바람직한 보조제들은 이미퀴모드, 레시퀴모드, GM-CSF, 사이클로포스파마이드, 수리티닙, 베바시주맙, 인터페론-알파, CpG, 올리고뉴클레오티드 및 유도체 폴리-(I:C) 및 유도체, RNA, 실데나필, 그리고 PLG 또는 비로솜 미립자 제제이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니-자극 인자(GMCSF, 사르가라모스팀), 사이클로포스파미드, 이미퀴모드, 레시퀴모드 및 인테페론 알파와 같은 콜로니 자극 인자로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니 자극 인자(GMCSF, 사르가라모스팀), 사이클로포스파미드, 이미퀴모드 및 레시퀴모드로 구성되는 군에서 선택된다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 사이클로포스파미드, 이미퀴모드 또는 레시퀴모드이다. 훨씬 더 바람직한 보조제는 Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poly-ICLC(Hiltonol: 등록상표) 및 anti-CD40 mAB 또는 이들의 조합들이다.
이 조성물은 피하, 피부내, 근육내 비경구 투약 또는 경구 투약에 사용된다. 이를 위해, 펩티드 그리고 선택적으로 다른 분자들을 약학적으로 허용되는, 바람직하게는 수용성 운반체에 용해 또는 현탁한다. 추가로, 이 조성물은 완충제, 결합제, 발파제, 희석제, 향미료, 윤활제 등과 같은 부형제를 함유할 수 있다. 또한 펩티드는 시토카인 같은 면역 자극 물질과 같이 투여될 수도 있다. 이러한 성분에 사용될 수 있는 방대한 부형제 목록은 예를 들어 다음에서 확인할 수 있다: A. Kibbe, 약학적 부형제 핸드북 (Kibbe, 2000). 이러한 조성물은 선종성 또는 암성 질병의 예방, 방지 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 예시적 제제는 예를 들어 EP2113253에서 찾을 수 있다.
본 발명에 따른 백신에 의해 일어나는 면역 반응이 다른 세포 단계 및 다른 개발 단계에서 암을 공격한다는 것을 인지하는 것이 중요하다. 더욱이 암과 연관된 다른 신호전달 경로가 공격을 받는다. 이것은 단 하나 또는 몇몇 표적만을 다루며 종양으로 하여금 공격에 쉽게 적응하도록 유발할 수 있는(종양 탈출) 백신에 비해 이점으로 작용한다. 더욱이, 모든 개별 종양들이 같은 항원의 패턴을 발현하는 것은 아니다. 그러므로 몇몇 종양 연관 펩티드들의 조합은 모든 개별 종양이 적어도 표적의 일부를 갖도록 한다. 이 조성물은 각 종양이 몇 개의 항원을 발현할 것으로 기대되며 종양 성장 및 유지에 필요한 몇 개의 독립적 경로를 다루도록 설계되었다. 그리하여 백신은 보다 큰 환자 모집단을 위해 "기성품"으로 쉽게 사용이 가능하다. 이는 백신으로 치료할 환자의 사전 선택을 HLA 형결정으로 제약될 수 있고, 항원 발현을 위해 어떠한 추가의 바이오마커 평가를 요구하지 않음을 의미하지만, 효능에 중요한 몇몇 표적들이 유도된 면역 반응에 의해 동시적으로 공격되도록 계속 보장한다(Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).
여기서 사용된 "골격(scaffold)"이란 용어는 (예: 항원성) 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 언급한다. 한 구현에서, 골격은 그것이 부착되는 객체(예: (제2) 항원 결합 모이어티)를 표적 부위, 예를 들어 특이한 유형의 종양 세포 또는 항원성 결정인자를 갖는 종양 간질(예: 당장의 용도에 따른 펩티드와 MHC의 복합체)로 향하도록 지시할 수 있다. 또 다른 구현에서 골격은 그 표적 항원, 예를 들어 T 세포 수용체 복합체 항원을 통해 신호전달을 활성화할 수 있다. 골격은 항체 및 그 단편, 항체 중사슬 변수 영역 및 항체 연쇄 변수 영역을 포함하는 항체의 도메인에 결합하는 항원, 적어도 하나의 앙키린 반복 모티프 및 단일 도메인 항원 결합(SDAB) 분자를 포함하는 결합 단백질, 압타머, (가용성) TCR 그리고 동종 또는 자가 T 세포와 같은 (변형된) 세포를 포함하지만 이로써 제한되지는 않는다. 어떤 분자가 표적에 결합하는 골격인지 평가하기 위해, 결합 검정을 수행할 수 있다.
"특이적" 결합이란 그 골격이 다른 자연적으로 발생하는 펩티드-MHC-복합체보다 관심 대상의 펩티드-MHC-복합체에 더 잘 결합하며, 그 정도는 특정 표적이 포함된 세포를 줄일 수 있는 활성 분자로 무장한 골격이 특정 표적이 없는 다른 세포는 죽일 수 없으며 다른 펩티드-MHC 복합체를 제시하는 것을 의미한다. 교차-반응성 펩티드-MHC의 펩티드가 자연적으로 발생하지 않는다면, 즉 인간 HLA-펩티돔으로부터 유래되지 않는다면, 다른 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 관련이 없다. 표적 세포 살해의 평가 검사는 당업계에 잘 알려져 있다. 이 검사는 변경되지 않는 펩티드-MHC 제시를 가진 표적 세포(일차 세포 또는 세포주) 또는 자연적으로 발생되는 펩티드-MHC 수준이 도달되는 정도로 펩티드가 포함된 세포를 사용하여 수행해야 한다.
각 골격은 라벨이 제공하는 신호의 존재나 부재를 판단함으로써 결합된 골격이 검출 가능하도록 제공하는 라벨링을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이 골격은 형광 염료나 일체의 다른 해당되는 세포 마커 분자를 사용하여 라벨링이 가능하다. 그러한 마커 분자는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 형광 라벨링은(예를 들어 형광 염료에 의해 제공되는) 형광이나 레이저 스캐닝 현미경 또는 유세포 분석에 의해 결합된 압타머의 가시화를 제공할 수 있다.
각 골격은 IL-21, 항CD3, 항CD28와 같은 제2 활성 분자와 접합될 수 있다.
폴리펩티드 골격에 대한 추가 정보는 예를 들어 WO 2014/071978A1의 배경 부분과 거기에 인용된 참조 문헌을 참조한다.
본 발명은 또한 압타머에 관한 것이다. 압타머란(예를 들어 WO 2014/191359 및 여기에 인용된 문헌을 참조) 정의된 삼차원적 구조로 접힐 수 있으며 특정 표적 구조를 인지할 수 있는 짧은 단일 가닥 핵산 분자이다. 이것은 표적 요법의 개발에 필요한 적합한 대안인 것으로 보여진 바 있다. 압타머는 높은 친화성 및 특이성으로써 다양한 복합체 표적에 선택적으로 결합하는 것으로 나타난 바 있다.
세포 표면에 위치한 분자를 인지하는 압타머가 지난 십 년 동안 동정된 바 있으며 진단 및 치료 접근 방식을 개발하기 위한 수단을 제공한다. 압타머가 독성 및 면역원성을 거의 소유하지 않는 것으로 나타난 바가 있으므로, 생존의학적 용도를 위한 유력한 후보이다. 정말로 압타머, 예를 들어 전립선 특이적 막-항원을 인지하는 압타머는 표적 대상의 요법을 위해 성공적으로 사용되어 왔으며 또한 생체 모델에서의 이종이식에 기능적인 것으로 나타난 바 있다. 더욱이 특이적 종양 세포주를 인지하는 압타머가 동정된 바 있다.
DNA 압타머는 다양한 암 세포 그리고 특히 고형 종양으로부터 유래하는 것들을 위한 광범위 인지 성질을 밝히기 위해 선택가능한 반면에, 비종양형성의 그리고 원발성의 건강한 세포는 인지되지 않는다. 동정된 압타머가 특이적 종양 아형을 인지할 뿐만 아니라 일련의 종양과 상호작용한다면, 이로 인해 압타머는 소위 광범위 진단 및 치료에 적용될 수 있다.
더욱이 유세포 분석을 사용한 세포 결합 거동의 조사에 의하면 압타머는 나노몰 범위에서 매우 양호하고 뚜렷한 친화성을 드러내는 것으로 나타났다.
압타머는 진단 및 치료 목적으로 유용하다. 더욱이 일부 압타머는 종양 세포에 의해 섭취되며 그리하여 종양 세포 안으로의 siRNA와 같은 항암제의 표적 인도를 위한 분자 부형제로서 기능이 가능함을 보여줄 수 있다.
압타머는 세포와 조직과 같은 복합체 표적 그리고 바람직하게는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228 사이의 어느 것에 따른 서열로 구성되며 본 발명에 따른 펩티드와 MHC 분자와의 복합체에 대하여, cell-SELEX(지수적 증식에 의한 리간드의 체계적 진화) 기법을 사용하여 선택이 가능하다.
본 발명의 펩티드는 MHC/펩티드 복합체에 대한 특정 항체를 생성하고 개발하는데 사용될 수 있다. 이들은 병변 조직에 치료, 독성 물질 표적화 또는 방사능 물질로 사용될 수 있다. 이런 항체의 또 다른 사용은 PET 같은 이미지 목적을 위해 병변 조직의 방사성 핵종을 표적화할 수도 있다. 이 사용은 작은 전이를 검출하거나 병변 조직의 크기와 정확한 위치를 결정하는데 도움이 될 수 있다.
그러므로 본 발명의 다른 양태는 HLA-제한 항원과 복합되는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II와 특이적으로 결합하는 재조합 항체의 생산 방법을 제공하는 것으로, 이 방법은 상기 HLA 제한 항원과 복합체를 형성하는 가용성 형태의 MHC 클래스 I 또는 II 분자로써 상기 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II를 발현하는 세포를 포함하는 유전자 조작된 비인간 포유동물의 면역화; 상기 비인간 포유동물의 세포를 생산하는 항체로부터 mRNA 분자의 분리; 상기 mRNA 분자에 의해 인코딩된 단백질 분자를 표시하는 파지 디스플레이 라이브러리의 생산; 및 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 적어도 하나의 파지의 분리를 포함하며 상기 적어도 하나의 파지는 상기 HLA-제한 항원과 복합되는 상기 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II와 특이적으로 결합하는 상기 항체를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태는 HLA 제한 항원과 복합되는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것으로 이 항체는 바람직하게는 다클론 항체, 단클론 항체, 양특이성 항체 및/또는 키메라 항체이다.
그러한 항체 및 단일 사슬 클래스 I 주조직적합 복합체의 생산을 위한 해당 방법들은 물론 이러한 항체의 생산을 위한 다른 도구들은 WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 및 출판물(Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003)에 공개되어 있으며, 이들은 본 발명의 목적을 위해 그 전문이 참조문헌에 명백히 포함되어 있다.
바람직하게는 항체는 20 나노몰 미만, 복합체에 대해서 바람직하게는 10 나노몰 미만의 결합 친화력으로써 복합체와 결합하는데, 이는 또한 본 발명의 맥락에서 "특이적"으로 간주된다.
본 발명은 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228에 대해 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 동일한) 그 변이체 또는 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하는 그 변이체에 관한 것으로, 상기 펩티드는 기저 전장 폴리펩티드가 아니다.
본 발명은 또한 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228에 대해 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 동일한) 그 변이체에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 변이체는 전체 길이가 8 내지 100, 바람직하게는 8 내지 30 그리고 가장 바람직하게는 8 내지 14인 아미노산이다.
본 발명은 또한 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II의 분자에 결합하는 능력을 갖는 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 필수적으로 구성된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 (화학적으로) 변형되고/거나 비펩티드 결합을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 펩티드는 융합 단백질의 일부이며 특히 HLA-DR 항원 연관 불변 사슬(Ii)에 융합되거나 또는 펩티드는 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체와 같은 항체에(또는 안으로) 융합된다.
본 발명은 또한 본 발명이 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것으로, 단 펩티드가 완전한 (전부) 인간 단백질은 아니다.
본 발명은 또한 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합인 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 의학에서의 특히 골수종의 치료에서의 사용을 위한 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 또는 전에 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항원 제시 세포 그리고 바람직하게는 수지상 세포인 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 숙주 세포의 배양과 상기 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드의 분리를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 충분한 수량의 항원을 항원 제시 세포와 접촉시킴으로써 항원이 적합한 항원 제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 항원 제시 세포가 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228을 포함하는 상기 펩티드 또는 상기 변이체 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 활성화된 T 세포에 관한 것으로, 상기 T 세포는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
본 발명은 또한 표적 세포가 본 발명에 따른 일체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자에서 그 표적 세포를 죽이는 방법에 관한 것으로, 그 방법은 본 발명에 따른 효과적인 수의 T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 설명한 일체의 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포, 또는 본 발명에 따른 활성화된 세포 독성 T 림프구를 약제로서 또는 약제의 제조 시 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로 상기 약제가 암에 대해 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로 상기 약제가 백신이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로 상기 약제가 암에 대해 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로, 상기 암세포는 골수종 세포 또는 기타 고형이나 혈액 종양의 세포이다.
본 발명은 또한 골수종의 진단 및/또는 예후에 사용할 수 있는 여기서 "표적"으로 부르는, 본 발명에 따른 펩티드에 근거한 특정 마커 단백질 및 바이오마커에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암 치료를 위해 이러한 신규 표적들의 사용에 관한 것이다.
용어 "항체" 또는 "항체들"은 여기에서 광범위한 의미로 사용되며, 다클론 및 단클론 항체를 둘 다 포함한다. 무손상 또는 "온전한" 면역글로불린 분자 외에도, "항체"란 용어에는 그러한 면역글로불린 분자들의 단편(예: CDRs, Fv, Fab 및 Fc 단편) 또는 중합체 그리고 면역글로불린 분자의 인간화 버전이 포함되는데, 단 이들은 본 발명에 따른 바람직한 물성들(예: 골수종 마커 (폴리)펩티드의 특이적 결합, 암 마커 유전자를 발현하는 골수종 세포로 증가된 수준의 독소 인도 및/또는 골수종 마커 폴리펩티드의 활성도 억제)의 어느 것이라도 발현한다.
가능한 한, 본 발명의 항체는 상용 소스에서 구입해야 한다. 본 발명의 항체는 잘 알려진 방법을 통해서 만들어 질 수도 있다. 당업자는 골수종 마커 플리펩티드 또는 이들의 단편이 본 발명의 항체 생성에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 항체를 생성하는 데에 사용될 폴리펩티드는 자연적인 원천에서 부분적으로 또는 완전히 정화될 수 있으며, 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들어질 수도 있다.
예를 들어, 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228에 따른 펩티드와 같은 본 발명에 따른 펩티드를 인코딩하는 cDNA 또는 그 변이체나 단편은 원핵 세포(예, 박테리아) 또는 진핵 세포(예, 효모, 곤충 또는 포유류 세포)에서 발현될 수 있으며, 재조합 단백질은 그 후 정화되고 본 발명에 따른 항체 생성에 사용되는 골수종 마커 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론 또는 다클론 항체 제조에 사용될 수 있다.
당업자는 두 개 이상의 다른 단클론 또는 다클론 항체의 조합의 생성을 의도하는 사용(예: ELISA, 면역조직화학, 생체 내 이미징, 면역 독소 요법)에 요구되는 특이성 및 친화성을 갖는 항체의 획득 가능성을 최대화함을 인식할 것이다. 이 항체들은 그 항체들이 사용되는 목적에 의거하여 알려진 방법에 의해 바라는 활성도에 대해 시험된다(예: ELISA, 면역조직화학, 면역요법 등; 항체의 생성과 시험에 관한 추가 지침은 다음을 참고한다(예: Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). 예를 들어, 항체는 ELISA 검정, 웨스턴 블롯, 포르말린 고정 폐암 면역조직화학 염색 또는 동결 조직 절개에서 시험할 수 있다. 치료 또는 생체 내 진단용을 위한 항체는 초기의 시험관 내 특성화 이후, 알려진 임상 시험 방법에 따라 시험한다.
"단클론 항체"라는 용어는 여기서 실질적으로 균등질 항체 개체군에서 획득이 된 것을 언급한다. 즉, 이 개체군이 포함하는 각각의 항체는 자연적으로 일어날 수 있는 소수의 변이체를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 여기서 특히 중사슬 및/또는 경사슬의 한 부분이 특정한 종 또는 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에서 유도된 항체의 서열과 상응하거나 일치하고, 사슬의 나머지 부분은 다른 종 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에서 유도된 항체, 및 이러한 항체의 단편의 서열과 상응하거나 일치하고, 희망하는 상반되는 활동성을 보여주는 "키메릭(chimeric)" 항체를 포함한다(미국 특허 번호 4,816,567, 전문이 여기에 포함됨).
본 발명의 단클론 항체는 하이브리도마 방법을 사용하여 준비될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 생쥐 또는 다른 적당한 숙주 동물이 보통 면역성을 주는 작용제에 의해 면역되어, 면역성을 주는 작용제에 특정적으로 결합하는 항체를 생산하거나 이를 생산할 수 있는 능력을 가지고 있는 림프구를 유도해 낸다. 다른 방법으로는, 림프구는 시험관 내에서 면역될 수도 있다.
단클론 항체는 미국 특허번호 4,816,567에 설명된 것과 같은 재조합 DNA 방법들에 의해서도 만들어질 수 있다. 본 발명의 단클론 항체를 인코딩하는 DNA는 손쉽게 격리되고 전통적인 방법을 사용하여 염기 서열 분석이 가능하다(예, 마우스 유래 항체의 중사슬 및 경사슬을 인코딩하는 유전자에 특정하게 결합할 수 있는 능력이 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써).
시험관 내 방법 또한 1가의(monovalent) 항체를 준비하는 데에 적당하다. 이 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 항체를 절편화시켜 항체의 단편을 특히 여기서는 Fab 단편을 생산할 수 있다. 예를 들면, 파파인을 사용하여 절편화가 이루어질 수 있다. 파파인 소화의 예는 WO 94/29348 및 미국 특허 번호 4,342,566에 설명되어 있다. 항체의 파파인 소화는 보통 각각 하나의 항원 결합 위치 및 남은 Fe 단편을 포함한 Fab 단편의 동일한 두 개의 항원 결합 단편을 생산한다. 펩신 처리는 F(ab')2 단편 및 pFc' 단편을 생산한다.
항체 단편도, 이가 다른 서열과 붙어 있든 그렇지 않든 간에, 이 단편의 활동력이 변경되지 않은 항체 또는 항체 단편에 비교할 시, 현저하게 바뀌거나 또는 손상이 된지 않는 한, 삽입, 삭제, 치환, 또는 특정한 위치의 또는 특정한 아미노산 잔기의 다른 선택된 변경을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 이황화물 결합의 능력이 있는 아미노산의 제거/추가, 생물적 생명의 증가, 분비 특징의 변화 등의 추가적인 특성을 제공할 수 있다. 어떤 경 우에도, 항체 단편은 결합성, 결합 도메인에서의 결합 조정 등의 생물작용 성질을 소유하고 있어야 한다. 항체의 기능적인 또는 활동적인 범위는 단백질의 특정한 지역의 돌연변이 생성, 발현 및 이 발현된 폴리펩티드의 실험에 의해 확인될 수 있다. 이러한 방법은 이 분야의 기술자가 손쉽게 알 수 있는 기술이며 이는 항체 단편을 인코딩하는 핵산의 위치-특정 돌연변이 생성을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체를 더욱 포함할 수 있다. 인간화된 형태의 비-인간(예, 쥐과 동물) 항체는 최소의 비-인간 면역글로불린 항체에서 유도된 서열을 포함하는 키메릭 면역글로불린항체, 면역글로불린 사슬 또는 이들의 단편(Fv, Fab, Fab' 또는 다른 항체의 항원 결합의 결과)이다. 인간화된 항체는 보완 결정 영역(complementary determining region(CDR))의 잔기가 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여 항체)의 CDR의 잔기로 바뀐 요구되는 특이성, 친화력 및 수용력을 가진 인간 면역글로불린(수납 항체) 이다. 몇몇의 예에서는, 인간 면역글로불린의 Fv 구조(FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 인간화된 항체는 수납 항체 또는 수입된 CDR 또는 구조 서열의 어디에서도 찾을 수 없는 서열을 포함하기도 한다. 보통, 인간 항체는 변이성 도메인을 적어도 하나 또는 거의 대부분 두 개를 포함하며, 모든 또는 실질상 모든 CDR 범위는 비-인간 면역글로불린에 상응하고 모든 또는 실질상 모든 구조 범위는 인간 면역글로불린 일치 서열이다. 인간화된 항체는 이상적으로 적어도 보통 인간 면역글로불린의 면역글로불린 불변 범위(Fc)의 한 부분 또한 포함할 것이다.
이 분야에서 비인간 항체를 인간화하는 방법은 잘 알려져 있다. 보통, 인간화된 항체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 비-인간 근원에서 이에 도입된다. 이 비-인간 아미노산 잔류들은 종종 "수입" 잔기라고 일컬어지며, 이는 대개 "수입" 변수 도메인에서 출처한다. 인간화는 본질적으로 설치류의 CDRs 또는 상응하는 인간 항체 서열의 CDR 서열을 인간의 것으로 교체하는 것으로 실행될 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화된" 항체는 키메릭 항체이며(US 4,816,567), 온전한 인간 변수 도메인보다 훨씬 적게 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 대체된다. 실제적으로, 인간화된 항체는 보통 몇몇의 CDR 잔기 및 가능하게는 몇몇의 구조 잔기가 이 설치류의 유사한 영역의 잔기와 치환된 인간 항체이다.
면역되었을 때, 내생의 면역글로불린 생성이 없는 중에 전체 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자 변형 동물(예, 생쥐)이 사용될 수 있다. 예를 들면, 키메릭 배선 돌연변이 생쥐의 항체의 중사슬 결합 영역 유전자 동형 삭제는 내생 항체 생산의 완전한 억제 결과를 가져온다. 이러한 배선 돌연변이 생쥐로의 인간 배선 면역글로불린 유전자 정렬 이입은 항원이 존재할 때 인간 항체 생산의 결과를 낳을 것이다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리에서도 생산될 수 있다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체에 의해서 피험자에게 투여된다. 보통, 적당한 약학적으로 허용가능한 염이 제형을 등장 상태로 만들기 위해 제형에 사용된다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는, 링거 용액(Ringer's solution) 및 포도당 용액이 있다. 이 용액의 pH값은 바람직하게는 약 5 내지 약 8 사이이며, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5 사이이다. 더 많은 담체는 항체를 포함하는 세포간질이 막, 리포좀 또는 미세입자와 같은 형태로 되어 있는 고체 소수성 중합체 반투성의 세포간질과 같은 지속적인 방출 준비를 포함한다. 예를 들어, 투여 방법 및 투여되는 항체의 농도에 따라 어떤 담체가 더 바람직한지는 이 분야의 당업자에게는 명백할 것이다.
항체는 피험자, 환자 또는 세포에 주사(예, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내), 또는 주입과 같은 혈액으로서의 전달이 효율적으로 이루어질 수 있는 다른 방법으로 투여될 수 있다. 항체는 국소뿐만이 아니라 전신의 치료 효과를 얻기 위해 종양 내 또는 종괴 주위의 방법으로도 투여될 수도 있다. 국소 또는 정맥내 주사가 바람직하다.
항체 투여의 효율적인 용량과 스케줄은 경험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정을 내리는 것은 이 분야의 기술 중의 하나다 이 분야의 당업자는 투여되는 항체의 용량은 예를 들어 이 항체를 받는 대상, 투여 방법, 사용되는 특정한 항체의 종류 및 투여되는 다른 약들에 따라 달라진 다는 것을 이해할 것이다. 단독으로 사용될 시 전형적인 항체의 일일 용량은 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg로 다를 수 있으며, 위에 언급된 요인을 고려할 때 이보다 더 높을 수도 있다. 바람직하게는 골수종의 치료를 위한 항체의 투여 후, 이 분야의 당업자들에게 알려진 다양한 방법으로 이 치료 항체의 효능을 평가할 수 있다. 예를 들면, 크기, 수, 및/또는 치료를 받고 있는 대상의 폐암의 분포 등이 표준 종양 영상 기술을 이용하여 모니터될 수 있다. 항체의 투여가 없을 경우 일어 날 수 있는 종양의 성장을 정지시켜, 종양을 오그라들게 하고, 또는 새로운 종양의 성장을 예방하는 치료의 목적으로 투여된 항체는 효과있는 폐암의 치료라고 할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 특이적 펩티드-MHC 복합체를 인식하는 가용성 T 세포 수용체(sTCR)의 생산 방법을 제공하는 것이다. 이러한 가용성 T 세포 수용체는 특이적 T 세포 클론으로부터 생성 가능하며, 그 친화력은 상보결정 부위를 표적으로 하는 돌연변이유발성에 의해 증가시킬 수 있다. T 세포 수용체 선택의 목적 상, 파지 디스플레이를 사용할 수 있다(US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). 파지 디스플레이 동안 T 세포 수용체의 안정화 목적 상 그리고 약물로서의 실용적인 용도의 경우, 알파 및 베타 사슬은, 예를 들어 비정상적 이황화 결합, 기타 공유 결합(단일-사슬 T 세포 수용체) 또는 이합체화 도메인에 의해 연결될 수 있다 (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T 세포 수용체는 표적 세포에 대한 특정 기능의 실행을 목적으로 독소, 약물, 시토카인(예를 들어, US 2013/0115191 참고), 그리고 항-CD3 도메인과 같은 작용기 세포를 모집하는 도메인 등과 연결될 수 있다. 더욱이 이것은 입양 전달에 사용되는 T 세포에서 발견될 수 있다. 추가 정보는 WO 2004/033685A1 및 WO 2004/074322A1에서 찾을 수 있다. sTCR의 조합은 WO 2012/056407A1에 설명되어 있다. 이 생산에 관한 추가 방법들은 WO 2013/057586A1에 공개되어 있다.
그 밖에, 본 발명의 펩티드 및/또는 TCR 또는 항체 또는 다른 결합하는 분자는 병리학자에 의한 생검 샘플에 근거하는 암의 진단을 확인하는데 사용이 가능하다.
항체 또는 TCR은 생체 내의 진단 분석에 사용될 수도 있다. 보통, 항체는 방사성핵종으로 라벨이 되고(예, 111 In, 99 Tc, 14 C, 131 I, 3 H, 32 P 또는 35 S) 면역 섬광 조형술을 사용하여 그 종양이 국소화될 수 있다. 하나의 구현에서는, 항체 또는 그 단편은 상기 언급된 단백질들로 구성된 군으로부터 선택된 단백질에 대한 두 개 또는 그 이상의 표적의 세포외 도메인에 결합을 하고 친화성 값(Kd)은 1x10 μM보다 낮다.
진단의 용도로 사용되는 항체는 여러 가지의 영상 방법으로 검출될 수 있는 적당한 프로브로 라벨이 될 수 있다. 프로브의 검출 방법은 형광, 광학, 공초점 및 전자 현미경, 자기 공명 단층 촬영 영상 및 분광기 형광 투시법, 전산화 단층 촬영과 양전자 방사 단층 촬영기를 포함하지만 이에 국한되지 않는 방법을 들 수 있다. 적당한 프로브는 플루오레세인, 로다민, 에오신과 다른 형광체, 방사성 동위 원소, 금, 가돌리늄과 다른 란탄계열 원소, 상자성체의 이온, 플루오르-18 및 다른 양전자 방출 방사성 핵종 등을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 것을 들 수 있다. 또한, 프로브는 두 개의 또는 그 이상의 기능을 가지고 있을 수 있으며, 여기에 나열된 하나 이상의 방법으로 검출될 수 있다. 이러한 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 여기에 나열된 프로브로 라벨이 될 수 있다. 이렇게 항체와 프로브를 연결하는 것으로는 이 분야에서 잘 알려진 것들 중에 프로브의 공유원자 연결, 프로브의 항체로의 편입, 및 프로브의 결합을 위한 킬레이트 화합물의 공유원자 연결 등을 들 수 있다. 면역조직 화학을 위해서, 질병 조직 샘플은 신선하거나 냉동되었거나 또는 파라핀에 포매되어 포르말린과 같은 방부제로 고정되어 있을 수 있다. 고정되었거나 포매되어 있는 샘플을 포함하고 있는 조직 절편은 라벨된 1차 항체와 2차 항체와 접촉되며 여기서 그 항체는 원위치 단백질 발현의 검출을 위해 사용된다.
본 발명의 다른 양태는 활성화된 T 세포와 항원 적재된 적당한 항원 제시 세포의 표면에서 T 세포를 항원이 본 발명의 펩티드라고 할 때 항원 특정 방식으로서 활성화시키는 데 충분한 시간 동안에 발현되는 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자의 접촉을 포함하는 시험관 내의 방법으로 생성하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 충분한 양의 항원이 항원 제시 세포와 함께 사용된다.
바람직하게는, 포유류 세포는 TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있거나, 감소된 수준 또는 기능을 가지고 있다. TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있는 적당한 세포로는 T2, RMA-S 및 초파리 세포를 들 수 있다. TAP이란 항원 처리에 관련된 트랜스포터를 일컷는다.
인간 펩티드 적재 결핍 세포주 T2는 Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA의 카탈로그 번호 CRL 1992에서 구입이 가능하고, 초파리 세포주 Schneider 2는 ATCC의 카탈로그 번호 CRL 19863에서 구입이 가능하며, 생쥐 RMA-S 세포주는 Ljunggren 등에서 묘사가 된 바 있다 (Ljunggren and Karre, 1985).
바람직하게는, 숙주 세포는 감염전에 실질적으로 MHC 클래스 I 분자를 발현하지 않는다. 자극기 세포는 B7.1, B7.2, ICAM-1 및 LFA 3과 같은 T 세포를 위한 공동-자극 신호의 제공에 중요한 분자를 발현하는 것 또한 바람직하다. 다수의 MHC 클래스 II 분자의 핵산 서열 및 동시자극 분자의 서열은 GenBank와 EMBL 데이터베이스에서 공개적으로 제공된다.
MHC 클래스 I 에피톱이 항원으로 사용되는 경우, T 세포는 CD8-양성 CTL이다.
만약 항원 제시 세포가 이러한 에피톱을 발현하도록 감염되었다면, 바람직하게는 그 세포는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228 또는 이의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 상기 펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.
T 세포를 시험관 내에서 생성하는 몇몇의 다른 방법도 사용될 수 있다. 예를 들어, 자가 종양-침윤 림프구를 CTL 생성에 사용할 수 있다. Plebanski 등(Plebanski et al., 1995)은 T 세포의 준비에 자기 말초 혈액(PLB) 림프구를 사용했다. 수지상 세포를 펩티드 또는 폴리 펩티드로 펄스시키거나, 또는 재조합 바이러스에 의한 감염에 의해 자가 조직 T 세포의 생산이 가능하다. 또한, B 세포는 자가 조직 T 세포의 생산에서 사용할 수 있다. 또한, 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄스된 또는 재조합된 바이러스에 의해 감염된 대식 세포가 자가 조직 T 세포의 준비 시 사용될 수 있다. S. Walter 등(Walter et al., 2003)은 인공 항원 제시 세포(aAPCs)를 사용하는 시험관 내 T 세포의 프라이밍을 묘사하며, 이는 역시 선택된 펩티드에 대해 T 세포를 생성하는 적절한 방법일 수 있다. 본 발명에서, aAPC는 미리 생성된 MHC:펩티드 복합체를 폴리스티렌 입자(마이크로 비드)의 표면과 커플링을 시키고 바이오틴-스트렙트아비딘 생화학을 이용함으로써 생성되었다. 이 체계는 aAPC의 정확한 MHC 밀도를 제어할 수 있도록 허용하며, 이는 항원-특정 T 세포 반응을 혈액 샘플에서 높은 효율성으로 고- 또는 저-결합력을 선택적으로 유도해낼 수 있게 한다. MHC:펩티드 합성체를 제외하고, aAPC는 그들의 표면에 커플된 항-CD28 항원과 같은 동시-자극 활동을 가지고 다른 단백질을 운반해야 한다. 더욱이 이러한 aAPC 기반 체계는 종종 예를 들면, 인터루킨-12와 같은 시토카인 등 적당한 용해 요소의 첨가를 요구한다.
동종이계 세포는 T 세포의 준비에 역시 사용될 수 있으며 방법은 WO 97/26328에 더 자세하게 묘사되어 있으며, 여기에 참조 문헌으로 포함되어 있다. 예를 들어, 초파리 세포와 T2 세포에 추가적으로, CHO 세포, 배큘로바이러스-감염 곤충 세포, 박테리아, 효모, 백시니아-감염된 표적 세포 등과 같은 다른 세포들도 항원을 제시하는 데에 사용될 수 있다. 추가적으로 식물 바이러스가 사용될 수도 있으며(예를 들면, Porta 등(Porta et al., 1994)), 이들은 외부 펩티드의 제시를 위한 카우피 모자이크바이러스의 높은 수확 체계로서 개발을 묘사한다.
이 실험의 펩티드에 대해 활성화된 T 세포는 치료에서 유용하다. 따라서, 본 발명의 더 나아간 양태은 앞서 말한 발명의 방법으로 획득할 수 있는 활성화된 T 세포에 대한 내용을 제공한다.
위에서 말한 방법으로 생성된 활성화된 T 세포는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
바람직하게는, T 세포는 그의 TCR을 HLA/펩티드-합성체(예, 결합)와 상호작용을 함으로서 이런 세포를 인식한다. 이 T 세포는 효율적인 활성화된 T 세포의 수가 투여되었을 시 발명의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자의 표적 세포를 죽이는 데 유용하다. 환자에게 투여된 T 세포는 위에서 묘사된 바와 같이 환자에게 유도되고 활성화된다(즉, 이는 자가 조직 T 세포다). 다른 방법으로는, T 세포는 환자에게 유도가 안 되고, 다른 개인에서 유도된다. 물론, 이 개인이 건강한 개인인 것이 바람직하다. 발명자들이 말하는 "건강한 개인"이라고 함은 개인이 전체적으로 좋은 건강을 가지고 있으며, 바람직하게는 충분한 면역 체계를 가지고 있으며, 더 바람직하게는, 손쉽게 실험되고 검출될 수 있는 어떤 질병도 겪고 있지 않다는 것이다.
생체 내에서, 본 발명에 따른 CD4-양성 T 세포는 종양 세포(이들은 가끔 MHC 클래스 II를 발현하기도 한다)이거나 또는 종양을 감싸고 있는 간질성 세포(종양 세포)(이는 가끔 MHC 클래스 II를 또한 발현하기도 한다)(Dengjel et al., 2006).
본 발명의 T 세포는 활성적인 치료 구성의 성분으로 사용될 수도 있다. 따라서, 발명은 본 발명의 아미노산 서 열을 가지고 있는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자의 표적 세포를 죽이고 환자에게 위에 정의된 바처럼 효율적인 T 세포의 수를 투여하는 방법을 제공한다.
본 발명자는 "비정상적으로 발현되는"이라는 구절에 의해, 폴리펩티드가 정상 수준에 비교했을 때 과발현되거나 또는 유전자가 종양이 유도된 조직에서는 침묵적이지만(silent) 종양에서는 발현되는 것도 의미한다. 발명자는 "과발현"이라는 구절에 의해, 폴리펩티드가 정상 조직에서 존재하는 수준의 적어도 1.2배 이상으로 존재하는 것을 말하고, 바람직하게는 적어도 2배, 더 바람직하게는 적어도 5배 또는 10배로 존재하는 것을 의미한다.
T 세포는 예를 들면 위에서 묘사된 바와 같은 방법으로 얻어질 수 있다. 흔히 T 세포의 입양 전송이라고 불리는 것에 대한 프로토콜은 이 업계에서 잘 알려져 있다. 리뷰는 다음에서 찾을 수 있다(Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).
본 발명의 다른 양태에는 그 핵산이 클로닝되어 숙주 세포 바람직하게는 T 세포로 도입되는 T 세포 수용체를 생성하기 위해 MHC와 복합체가 되는 펩티드의 사용이 포함된다. 이러한 조작된 T 세포는 그리하여 암 치료를 위해 환자로 이전할 수 있다.
본 발명의 모든 분자 즉, 펩티드, 핵산, 항체, 발현 벡터, 세포, 활성화된 T 세포, T 세포 수용체 또는 이를 인코딩하는 핵산은 면역 반응을 피할 수 있는 성질을 가진 세포에 의해 특징지어지는 질병의 치료에 유용하다. 따라서 본 발명에 포함되어 있는 어떤 분자든지 약제로 사용되거나 약제를 만드는 데에 사용될 수 있다. 이 분자는 단독으로 사용될 수도 있고, 어떤 알려진 분자와 함께 결합하여 사용될 수도 있다.
본 발명은 다음을 포함한 키트(kit)를 포함한다:
(a) 위에 묘사된 바와 같은 약학적 조성물을 용액 또는 동결건조된 형태로 포함하고 있는 용기;
(b) 임의적으로 희석제 또는 동결건조된 제형을 위한 재구성 용액을 포함하는 제2 용기; 및
(c) 임의적으로(i) 용액의 사용 또는(ii) 동결건조된 제형의 재구성 및/또는 사용을 위한 지시.
이 키트는 하나 이상의 (iii) 완충제, (iv) 희석제, (v) 필터, (vi) 주사바늘 또는 (vii) 주사기를 더욱 포함할 수 있다. 그 용기는 바람직하게 병, 바이알, 주사기 또는 시험관이며; 다용도 용기일 수 있다. 약학적 조성물은 바람직하게는 동결건조된다.
본 발명에 사용되는 키트는 바람직하게는 동결건조되어 있는 약제를 적당한 용기와 이들의 재구성 및/또는 사용에 관한 지침서를 함께 포함한다 적당한 용기는 예를 들면, 병, 바이알(예: 듀얼 챔버 바이알), 주사기(듀얼 챔버 주사기 등) 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리나 플라스틱과 같은 다양한 재질로서 형성할 수 있다. 바람직하게는 키트 및/또는 용기는 재구성 및/또는 사용에 대한 사용법을 표시하는 지시 내용을 그 용기 상에 또는 그와 연관하여 포함한다. 예를 들어, 라벨 상에서 동결건조된 제형을 상기 펩티드 농도로 재구성해야 한다고 지시할 수 있다. 라벨은 또한 약제가 피하투여가 가능한지 아니면 유용한지를 보여줄 수도 있다.
제형을 포함한 용기는 재구성된 약제의 반복된 투여를 가능하게 하는 다용도 바이알일 수 있다(예: 2 내지 6회의 투여). 키트는 또한 적당한 희석제(예: 중탄산 용액)를 포함하는 제2 용기를 포함할 수도 있다.
희석제와 동결건조된 약제를 섞었을 때, 재구성된 제형의 최종 펩티드 농도가 바람직하게는 적어도 0.15 mg/mL/펩티드(=75 ㎍)이며 바람직하게는 3 mg/mL/펩티드(=1500 ㎍)를 넘지 않아야 한다. 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 패키지 삽입 및 사용 설명서 등의 사용자의 입장에서 필요한 것을 더 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 키트는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 포함하는 하나의 용기를 다른 제품과 함께 또는 단독으로 포함 하거나(예: 다른 화합물들 또는 이 다른 화합물들의 약학적 조성물) 각각의 조성물을 각자 다른 용기에 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 키트는 다음과 같은 제2 화합물 또는 그들의 약학적 조성물과 함께 투여될 수 있는 약학적 조성물을 포함한다: 보조제(예: GM-CSF), 화학요법제, 자연 생성물, 호르몬 또는 길항제, 항혈관신생 제제 또는 억제제, 괴사유도제 또는 킬레이터. 키트의 조성물은 미리 혼합되어 있을 수도 있고 또는 각각의 조성물이 각각 따로 용기에 담겨 있을 수도 있다. 키트의 조성물은 하나 또는 그 이상의 액체 용액에 제공될 수도 있고, 바람직하게는 수용액, 더욱 바람직하게는 무균 수용액에 제공된다. 키트의 조성물은 적당한 용해제를 첨가함으로써 액체로 바뀔 수 있는 고체로 제공될 수도 있고, 바람직하게는 이는 다른 용기에 담겨 제공된다.
치료 키트의 용기는 바이알, 실험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 고체나 액체를 담을 수 있는 다른 어떤 용기 일 수 있다. 보통, 하나 이상의 구성물이 있을 경우, 키트는 제2 물약병 또는 다른 용기를 포함하고, 이는 각각의 복용을 가능하게 한다. 키트는 약학적으로 허용가능한 액체를 포함하고 있는 용기를 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 치료 키트는 현재 키트의 조성물인 발명의 제제를 투여할 수 있는 기구를 포함한다(예: 하나 또는 그 이상의 바늘, 주사기, 안약 투입제, 피펫 등).
본 제형은 구강(경구), 비강, 안약 형태의, 피하의, 피내, 근육내, 혈관내 또는 경피 등 어떠한 투여 형태로든 펩티드 투여에 적당한 약제이다. 바람직하게는, 그 투여는 s.c.이며, 가장 바람직하게 i.d. 투여는 주입 펌프에 의할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 골수종으로부터 분리되었으므로, 본 발명의 약제는 바람직하게는 골수종의 치료에 사용된다.
본 발명은 또한 사전선별된 TUMAP의 창고에서 선택된 적어도 하나의 펩티드로 이루어진 약학적 조성물의 제조를 포함하는 개별 환자를 위한 개인화 약학적 조성물의 생산 방법에 관한 것으로, 그 약학적 조성물에 사용되는 상기 적어도 하나의 펩티드는 개별 환자의 적합성을 위해 선택된다. 한 구현에서 이 약학적 조성물은 백신이다. 이 방법은 TCR 분리와 같은 하류 용도를 위한 T 세포 클론의 생산 또는 가용성 항체 및 다른 치료 옵션에도 적응할 수 있다.
"개인화 약학"이란, 활성적으로 개인화된 암 백신 및 자가 환자 조직을 사용하는 적응적 세포 세포 요법을 포함하는 한 명의 개별 환자의 치료를 위해서만 사용되는 그러한 개별 환자를 위해 구체적으로 맞춤화된 요법을 의미해야 한다.
여기에서 사용되는 용어 "창고"란 특정한 종양 유형에서 면역 원성 및/또는 과다 제시에 대해 사전선별된 펩티드의 군 또는 조합을 지칭해야 한다. 용어 "창고"는 백신에 포함된 특정 펩티드가 사전 제조되어 물리적 시설에 보관되었음을 함축하는 의도가 아니다(그러나 그러한 가능성은 고려된다). 생산된 각 개인화된 백신을 위해 펩티드들이 새로 제조될 수 있거나 사전 제조되어 저장될 수 있음이 명백히 고려된다. 창고(예: 데이터베이스의 형태로서)는 다양한 HLA-A HLA-B 및 HLA-C 대립형질을 갖는 췌장암 환자들의 골수종 세포에서 고도로 과발현된 종양 연관된 펩티드들로 구성된다. 이는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 펩티드 또는 신장된 MHC 클래스 I 펩티드를 포함할 수 있다. 창고는 몇몇 골수종들로부터 수집된 종양 연관 펩티드 외에도, HLA-A*02 및 HLA-A*24 마커 펩티드를 포함할 수 있다. 이 펩티드들은 TUMAP에 의해 유도된 T 세포 면역성의 크기에 대한 정량적인 비교를 허용하므로 백신의 항종양 반응을 이끌어내는 용량에 관한 중요한 결론을 도출할 수 있다. 둘째, 어떤 환자에서 "자가" 항원으로 유래한 TUMAP에 대한 인체의 백신-유도 T 세포 반응이 관찰되지 않는 경우, 이것은 "비-자가" 항원으로부터 유래한 중요한 양성 대조 펩티드로서 기능한다. 그리고 셋째로, 이것은 환자의 면역능력 상태에 대한 결론의 도출을 가능케 한다.
창고의 TUMAP는 유전자 발현 분석, 질량 분석 및 T 세포 면역학(XPresident: 등록상표)이 조합된 통합 기능적 유전체 접근방식을 사용하여 동정된다. 이 접근 방식은 정상 조직에서 발현되지 않거나 최소한으로만 발현되는 것이 아닌 고비율의 종양에서 실제로 존재하는 TUMAP만을 추가 분석을 위해 선택한다는 것을 보증한다. 초기 펩티드 선택을 위해, 환자의 골수종 샘플 그리고 건강한 공여자의 샘플들을 단계적 접근 방식으로 분석했다:
1. 악성 물질로부터의 HLA 리간드를 질량 분석법으로 동정했다.
2. 전장 유전체 전령 리보핵산(mRNA)의 발현 분석을 사용하여 다양한 정상 기관 및 조직과 비교하여 골수종에서 과발현되는지 평가했다.
3. 동정된 HLA 리간드들을 유전자 발현 데이터와 비교했다. 단계 2에서 검출된 종양 조직 상에 과다 제시되거나 선택적으로 제시된 바람직하게는 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자들에 의해 인코딩된 펩티드들은 멀티-펩티드 백신의 적절한 TUMAP 후보로서 간주되었다.
4. TUMAP로서 동정된 펩티드의 관련성을 지지하는 추가 증거를 동정하기 위해 문헌 연구를 수행했다.
5. mRNA 수준에서의 과발현의 타당성은 단계 3에서 종양 조직으로부터 선택된 TUMAP의 재검출 그리고 건강한 조직에 대한 검출의 결여(낮은 빈도)에 의해 확인되었다.
6. 선택된 펩티드에 의한 생체 내 T 세포 반응의 유도가 가능한지 여부를 평가하기 위해, 건강한 공여자는 물론 골수종 환자의 인간 T 세포를 사용하여 시험관 내 면역원성 검사를 수행했다.
한 측면에서는, 펩티드들이 창고에 포함되기 전에 면역원성에 대해 사전선별된다. 제한이 아니라 한 예로서, 펩티드/MHC 복합체 및 항-CD28 항체가 로딩된 인공 항원 제시 세포를 가진 건강한 공여자의 CD8+ T 세포를 반복적으로 자극하는 시험관 내 T 세포 초회감작을 포함하는 방법을 사용하여 창고에 포함된 펩티드의 면역원성을 결정한다.
이 방법은 희귀한 암과 드문 발현 프로필을 갖는 환자에 대해 선호된다. 현재 개발되고 있는 고정된 성분을 갖는 멀티-펩티드 칵테일과 대비할 때, 창고는 종양에서 항원의 실제 발현과 백신과의 훨씬 더 높은 정합을 허용한다. 선택된 하나의 또는 몇몇 "재고(off-the-shelf)" 펩티드들의 조합을 다중표적 접근 방식으로 각 환자에 대해 사용한다. 이론상으로, 예를 들어 50개 라이브러리로부터 선택된 5개의 다른 항원 펩티드 선택에 근거한 접근방법은 이미 약 1700만 가지의 가능한 약품(DP) 성분을 초래할 것이다.
한 양태에서, 이 펩티드는 여기서 또는 다음에 설명된 본 발명에 따른 방법에 근거하여 백신의 포함 여부가 선택된다.
HLA 표현형, 전사체학 및 펩티도믹스 데이터는 환자의 종양 물질과 혈액 샘플로부터 수집하여 "창고"와 환자 고유의(즉 돌연변이된) TUMAP를 포함하는 각 환자에 대해 가장 적절한 펩티드를 동정한다. 환자 종양에서 선택적으로 발현되거나 과발현되는 펩티드를 선택하게 되며, 이는 가능한 경우 환자의 개별 PBMC로써 시험했을 때 강한 시험관 내 면역원성을 나타낸다.
바람직하게는 백신에 포함된 펩티드는, (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드들(TUMAP)의 동정; (b) (a)에서 동정된 펩티드를 위에 설명된 펩티드들의 창고(데이터베이스)와 비교; 및 (c) 그 환자에서 동정된 종양 연관 펩티드와 상관관계가 있는 창고(데이터베이스)로부터 적어도 하나의 펩티드 선택을 포함하는 방법에 의해 동정된다. 예를 들어, 종양 샘플에 의해 제시된 TUMAP는 다음에 의해 동정된다: (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질의 동정을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교; 그리고 (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 동정하기 위해, 발현 데이터를 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과 상관관계 결정. 바람직하게는 종양 샘플로부터 분리된 MHC 분자의 결합된 펩티드를 용출시키고 용출된 리간드의 서열결정에 의해 MHC 리간드의 서열을 동정한다. 바람직하게는 종양 샘플과 정상 조직은 같은 환자로부터 얻는다.
창고(데이터베이스) 모델을 사용하는 펩티드의 선택 외에 또는 그 대안으로서, TUMAP를 새 환자에서 동정한 다음 백신에 포함시킬 수 있다. 한 예로서, 후보 TUMAP 환자에서, (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질의 동정을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교; 그리고 (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 동정하기 위해, 발현 데이터를 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과 상관관계의 결정에 의해 동정할 수 있다. 다른 예로서, 개별 환자의 조직에 상응하는 정상 샘플에 대해 종양 샘플에서 고유한 돌연변이를 포함하는 단백질을 동정할 수 있으며, 돌연변이를 특이적으로 표적하는 TUMAP를 동정할 수 있다. 예를 들어, 종양 및 상응하는 정상 조직의 유전체에 대한 염기서열은 전체 유전체의 염기서열 결정에 의해 결정할 수 있다. 유전자의 단백질-코딩 영역에서 비동의 돌연변이의 발견을 위해, 유전체 DNA 및 RNA를 종양 조직으로부터 추출하고, 정상의 돌연변이 되지 않은 유전체의 종자계 DNA는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 추출한다. 이러한 응용 NGS 접근방법은 단백질 코딩 영역의 염기서열 재결정으로 제약된다(신유전체 염기서열 재결정). 이 목적을 위해, 업체가 공급하는 표적 강화 키트를 사용한 다음 예를 들어 HiSeq2000(Illumina)에 의해 염기서열 결정에 의해 인간 샘플의 엑손 DNA를 포착한다. 그 밖에, 유전자 발현의 직접 정량화 그리고 돌연변이된 유전자가 환자의 종양에서 발현된다는 검증을 위해 종양 mRNA에 대한 염기 서열을 결정한다. 그에 따른 수백만의 서열 판독값은 소프트웨어 알고리즘을 통해 처리된다. 그 출력 목록에는 돌연변이와 유전자 발현이 포함된다. 종양-특이적 체세포 돌연변이는 PBMC-유래 생식세포의 변종과 비교하여 결정한 다음 우선순위화 된다. 다음에는 새로 동정된 펩티드를 위에 설명한 창고의 면역원성에 대해 시험할 수 있으며, 적절한 면역원성을 소유하는 후보 TUMAP를 선택하여 백신에 포함시킨다.
하나의 예시적 구현에서, 백신에 포함되는 펩티드는 다음에 의해 동정된다:
(a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양 연관 펩티드(TUMAP)를 위에 설명한 방법으로 동정한다;
(b) 상응하는 정상 조직과 비교하여 종양에서 면역원성과 과다제시에 대해 사전선별된 펩티드들의 창고를 이용하여 상기 (a)에서 동정된 펩티드와 비교한다;
(c) 환자에서 동정된 종양 연관 펩티드와 상관관계가 있는 적어도 하나의 펩티드를 창고에서 선택한다; 그리고
(d) 임의적으로 상기 (a)에서 새로 동정된 적어도 하나의 펩티드를 선택하고 그 면역원성을 확인한다.
하나의 예시적 구현에서, 백신에 포함되는 펩티드는 다음에 의해 동정된다:
(a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양 연관 펩티드(TUMAP)를 위에 설명하는 방법으로 동정한다; 그리고
(b) 상기 (a)에서 새로 동정된 적어도 하나의 펩티드를 선택하고 그 면역원성을 확인한다.
개인화된 펩티드 기반 백신을 위한 펩티드들이 선택되면, 백신이 생산된다. 백신은 20-40% DMSO 바람직하게는 약 33% DMSO와 같은 약 30-35% DMSO에 용해된 개별 펩티드들로 구성된 액체 제형이다.
제품에 포함되는 펩티드는 각각 DMSO에 용해한다. 단일 펩티드 용액의 농도는 제품에 포함시킬 펩티드의 수에 따라 선택해야 한다. 단일 펩티드-DMSO 용액들을 동등한 비율로 혼합하여 제품에 포함시킬 모든 펩티드가 포함된 용액을 만드는데 그 농도는 펩티드 당 ~2.5mg/ml이다. 그런 다음, 주사제용으로 33% DMSO에서 펩티드 당 0.826mg/ml의 농도를 얻기 위해 혼합된 용액을 1:3의 비율로 물로 희석한다. 희석시킨 용액을 0.22 ㎛ 멸균 필터를 통해 여과시킨다. 최종 벌크 용액을 얻는다.
최종 벌크 용액을 바이알에 채워 사용 시까지 -20 ℃에서 보관한다. 1개의 바이알에는 각 펩티드를 0.578 mg씩 포함하는 700 μL의 용액이 들어 있다. 여기서 500 μL(펩티드 당 약 400 ㎍)를 피내 주사로 투여하게 된다.
암 치료에 유용함에 덧붙여, 본 발명의 펩티드는 진단으로도 유용하다. 펩티드가 골수종 샘플에서 생성되고 이런 펩티드가 정상 조직에서는 존재하지 않거나 더 낮은 수준으로 존재한다는 것이 결정되었기 때문에, 이런 펩티드는 암의 존재의 진단에 사용될 수 있다.
주장되는 펩티드의 혈액 샘플 내 조직 생체 검사에서의 존재는 암의 진단 시 병리학자를 도울 수 있다. 항체, 질량 분석, 또는 이 분야에 다른 알려진 방법의 수단을 통한 특정 펩티드의 탐지는 조직 샘플이 악성 또는 염증이 있는지 또는 일반적으로 병들어 있는지 또는 골수종의 바이오마커로서 사용가능한지 병리학자에게 알려줄 수 있다. 펩티드의 군의 존재는 병변 조직의 분류 또는 하위 분류를 가능하게 한다.
병변 조직 샘플의 펩티드의 탐지는 특히 만약 T 림프구가 작용 기전에 참여하는 것으로 알려져 있거나 기대할 때, 면역계를 포함한 치료의 이익에 대한 결정을 내릴 수 있게 한다. MHC 발현의 손실은 감염된 악성 세포가 면역 감시를 탈출하는 과정에서 잘 설명되는 기전이다. 펩티드의 존재는 이 기전이 분석된 세포에서 악용되지 않는 것을 보여준다.
본 발명의 펩티드는 펩티드 또는 MHC 분자에 합성된 펩티드에 대한 T 세포 반응 또는 항체 반응 같은 펩티드에 대한 림프구 반응을 분석하는데 사용될 수 있다. 이런 림프구 반응은 추가 치료 단계에서 결정을 내릴 때 전조 마커로 사용될 수 있다. 이런 반응은 또한 림프구 반응을 여러 방법으로, 예를 들면, 단백질 백신, 핵산, 자가 조직 물질, 림프구의 양자 면역 전송을 유도하는 것을 목표로 하는 면역치료의 접근 방식에서 대리 마커로 사용될 수 있다. 유전자 치료 설정에서, 펩티드에 대한 림프구 반응은 부작용의 평가에서 고려할 수 있다. 림프구 반응의 모니터링은 이식 요법의 후속 시험을 위한 중요한 도구가 될 수도 있다(예를 들면, 이식편대숙주 및 숙주대이식편병의 검출).
표적 세포 상에서 HLA 발현의 손실이나 하향조절은 T 세포 기반의 면역요법의 효과를 심하게 방해할 수 있으므로, 본 발명자들은 HV의 골수로부터 유래된 자가 조혈 세포 및 현장 세포와 비교하여 원발성 골수종 세포에 대한 HLA 클래스 I 및 II 표면 분자 수를 정량화한다. MM 환자(n = 20)에서 HLA 클래스 I 발현은 416,000 ± 54,500의 CD38+CD138+ 골수종 세포에 대한 평균 발현 수준에 대해 이질성인 것으로 나타났으며, 이는 자가 정상 CD19+CD20+ B세포(198,5000 ± 20,500, P = 0.001), CD3+ T 세포(167,500 ± 15,500, P = 0.0002) 및 CD34+CD38- HPC(204,000 ± 32,500, P = 0.002, 도 1a)에 비해 유의하게 더 높은 것으로 나타났다. 그 밖에 원발성 MM 세포에 대한 HLA 클래스 I 발현 또한 HV의 CD38+CD138+ 혈장 세포의 그것보다 유의하게 더 높은 것으로 나타났다(n = 15, 291,500 ± 25,500, P < 0.05; 도 1c). MM 환자의 정상 B세포, T 세포 및 HPC는 HV의 상응하는 세포 모집단을 비교했을 때 HLA 클래스 I 발현에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다(보조 도 1b). 골수종 세포에 대한 HLA-DR 발현 수준은 HLA 클래스 I 수준보다 전반적으로 훨씬 낮은 것으로 나타났다. 골수종 세포에서의 평균 HLA-DR 표면 분자 수(27,000 ± 7,000)는 자가 HPC(35,000 ± 5,000) 및 T 세포(18,000 ± 13,000) 또는 HV의 혈장 세포(39,500 ± 5,000)에 비해 유의한 차이를 보이지 않았다(도 1b 및 도 1d). MM 환자 CD19+CD20+ B세포의 HLA-DR 발현(104,000 ± 7,000)은 골수종 세포에 비해 유의하게 더 높았다(P < 0.0001). 골수종 세포에서의 HLA 표면 발현과 성별, 연령, 병기, 위험 분류 또는 이전 요법과 같은 환자 특성과의 상관관계는 관찰되지 않았다.
10명의 골수종 환자와 5개 MCL의 HLA 클래스 I 리간돔을 매핑한 결과, 본 발명자들은 7,574개 출처 단백질을 표시하는 총 17,583개의 다른 펩티드를 확인했으며, 이는 최대 가능한 커버리지의 >80% 획득을 나타낸다(도 2a). 원발성 골수종 샘플의 고유한 펩티드 확인의 평균 수는 1,059 ID 그리고 MCL은 2,243 ID였다. 전체적으로 이 연구에서 20개의 다른 HLA-A 및 HLA-B 동종 이형에 의해 제약되는 펩티드가 확인되었으며 이는 백인 인구의 99.3%를 차지하는 것이다([52]에 따라 계산됨).
본 발명자들은 대조 샘플로 45개의 HV 유래 샘플(30개 PBMC, 10개 BMNC 및 4개 과립구의 검체)의 HLA 클래스 I 리간돔을 분석했으며 7,729가지 출처 단백질을 표시하는 총 20,171개의 다른 펩티드를 확인하였다. HV 코호트에서 HLA 동종이형의 분포는 MM 샘플 코호트에서 HLA-A 및 HLA-B 대립유전자의 >80%를 차지했다[53]. HLA 클래스 II 리간돔의 분석을 7명의 MM 환자 및 5개의 MCL를 대상으로 수행했다. 1,743가지의 출처 단백질을 표시하는 총 6,076개의 고유한 펩티드가 확인되었다. HLA 클래스 II HV 코호트(13개 PBMC, 5개 BMNC, 5개 과립구 검체)는 889가지의 출처 단백질을 표시하는 2,899개의 다른 펩티드를 생산했다.
골수종 관련 항원을 확인하기 위해, 본 발명자들은 MM 샘플 및 HV 코호트의 HLA 리간돔을 출처 단백질 수준으로 비교적으로 분석했다. HLA 리간드 출처 단백질의 중복 분석 결과 2,412가지 단백질(매핑 대상 MM HLA 출처 프로테오솜의 31.8%에 상응)이 MM 샘플의 HLA 리간돔에서 독점적으로 표시되는 것으로 확인되었다. 이러한 MM 독점적 출처 단백질 가운데, 68.3%가 MCL 샘플에서 전적으로 확인된 반면, 단백질의 13.2%는 MCL 및 원발성 MM 샘플 모두에서 제시되는 것으로 나타났다. 골수종 독점적 출처 단백질의 18.5%의 일부는 원발성 MM 샘플로 제약되는 것으로 나타났다(도 2b). 널리 제시되는 종양 관련 항원을 확인하기 위해, 골수종 독점적 출처 단백질을 MM 샘플 코호트에서 표시의 빈도에 따라 순위를 매겼다(도 2c). 항원 확인의 엄중성을 통계적으로 평가 및 최적화하기 위해, 본 발명자들은 가상실험에서 무작위화 가상 리간돔을 시뮬레이션했으며 가양성 TAA의 결과적 수를 여러 표시 빈도에서 계산했다(도 2d). 본 발명자들은 HLA 클래스 I 종양 관련 항원("TAA") 정의에 대한 빈도 임계값을 골수종 독점적 항원 제시의 >25%로 설정했으며, 58개 TAA 및 4.1%의 추정된 오류 발견율(FDR)을 산출했다. 이러한 빈번히 제시되는 골수종 관련 항원의 신규 패널은 197개의 고유한 HLA 클래스 I 리간드에 의해 표시되었으며, 매핑된 골수종 HLA 리간드 출처 프로테옴의 0.8%를 구성한다. 이러한 항원의 KEGG 경로 분석[54] 그리고 그 생물학적 기능(GO Term BP FAT, [55])에 대한 기능적 주석 클러스터링에서는 어떠한 통계적으로 유의한 과다제시된 경로나 기능적 클러스터가 동정되지 않았다. 뚜렷한 것은 원 암유전자 MMSET가 MM 환자 리간돔의 33%에서 표시를 보이는 TAA로서 확인되었으며 3가지 다른 HLA 리간드에 의해 표시되는 것으로 나타났다(ASNPSNPRPSK (HLA-A*30:01)(서열 식별 번호 17), KAMEAASSL (A*02:01)(서열 식별 번호 82), SLLEQGLVEA (A*02:01)(서열 식별 번호 177)). 더욱이 MMSET는 종양유전적 전위 t(4;14)를 갖는 2명의 환자 모두에서 검출되었지만 이러한 이상이 없는 환자에서는 6명 중 단 1명(17%)에서만 검출되었다.
HLA 클래스 I 리간돔에서 확립된 골수종 관련 항원의 표시
본 발명자들의 방대한 HLA 리간돔 데이터세트에 근거하여, 발명자들은 다른 샘플 코호트 내에서 확립된 골수종 관련 항원의 제시를 조사했다. 본 발명자들은 이전에 묘사된 골수종 환원의 25개 중 22개(88%)를 표시하는 73개의 다른 HLA 리간드를 확인했다[42]. 본 발명자들은 22개의 검출 가능한 항원 가운데 9개(41%)가 MM 샘플에서 독점적으로 제시되고, 10/22(45.5%)의 MM 및 HV 샘플 모두에서 표시되며, 22개 중 3개(13.6%)는 HV 유래 샘플에서 독점적으로 제시됨을 발견했다(도 3a). 주시할 것은 9개 중 7개(77.8%)의 MM 독점적 항원은 MCL에서만 검출이 가능했다. 이러한 MM 독점적 항원 HLA 리간드의 9개 중 2개(22.2%)에서만 원발성 MM 환자 샘플에서 검출되었다(도 3b). 참고로 새로 정의된 골수종 항원의 58개 중 7개(12.1%)에서만 MCL 상에서 제시를 독점적으로 보인 반면, 대다수인 58개 중 51개(87.9%)의 항원이 원발성 MM 환자 샘플에서도 제시되었으며 이는 임상적 표적 항원의 잠재성을 강조한다(도 3c).
더욱이 HLA 리간돔에서 출처 단백질 제시의 비감독 클러스터링은 MCL의 클러스터가 원발성 MM 샘플로부터 뚜렷이 구별됨을 드러냈다(보조 도 2).
HLA 클래스 II 리간돔의 분석은 잠재적으로 상승효과가 있는 백신 후보를 동정한다
CD4+ T 세포의 종양 통제에 대한 직접적인 연구가 확립되므로 [56], 본 발명자들은 더욱 HLA 클래스 II 항원의 동정을 목표로 했다. HLA 클래스 II 리간드 출처 단백질의 중복 분석에 의해 1,135개의 골수종 독점적 항원이 확인되었다(도 4a). HLA 클래스 II 리간돔의 프로필 비교 결정을 통해 FDR <5%에서 MM 독점적 제시를 보여주는 67개 HLA 클래스 II 리간드에 의해 표시되는 단일 항원(TFRC)이 확인되었다(도 4b, 도 4c). IFNγ-ELISPOT에 의한 가장 풍부한 TFRC 펩티드(NSVIIVDKNGRLV)(서열 식별 번호 237)의 기능적 특성화는 MM 환자 5명 중 2명에서 기억 T 세포 반응을 드러냈다.
CD4+ T 세포는 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응의 유도 및 유지에서 중심적 역할을 수행하므로[57 ~ 59], 본 발명자들은 HLA 클래스 I TAA로부터 유래한 잠재적으로 상승효과가 있는 HLA 클래스 II 제약 펩티드를 확인하는 제2 접근 방식을 이행했다. 1,135개의 HLA 클래스 II 제시된 MM 독점적 단백질을 사용한 58개의 HLA 클래스 I 항원에 대한 중복 분석을 통해 31개 펩티드에 의해 표시되는 6개의 클래스를 거치는 항원이 확인되었다(도 4의 D 및 E; 보조 표 5). 상승 효과가 있는 HLA 클래스 II의 기능적 특성화는 검사된 펩티드 5개 중 3개에 대해 골수종 환자에서 펩티드 특이적 T 세포 반응을 드러냈다(도 4의 E).
MM 샘플의 HLA 클래스 I 및 II 리간돔에 대한 전체적 비교는 HLA 클래스 II 제시된 단백질의 80%(1,622개)가 HLA 클래스 I에서도 제시됨을 밝혔다(도 4의 F). 각 HLA 클래스에서 상위 500개의 가장 빈번히 제시되는 단백질에 대한 주석 클러스터링 DAVID를 사용하는 GO Term CC 클러스터링[55])을 수행하여 이들 단백질로부터 유래하는 구획을 동정했다. 클래스 I에 제시된 항원은 핵 단백질은 물론 리보솜, 세포골격 및 수포 유래 단백질에 대해서도 고도로 풍부한 클러스터를 보여주었다. 뚜렷한 것은 수포 유래 단백질의 경우 더 높은 순위와 거의 3배 더 높은 강화에도 불구하고, 이러한 패턴이 두 가지 HLA 클래스 모두에 제시된 단백질의 클러스터링에 요약되었다. HLA 클래스 II 제시된 항원은 혈장 막, 수포 유래 및 리소솜 단백질에 대한 중간 정도의 강화를 보여주었다(보조 표 6).
HLA 클래스 I TAA 는 골수종 환자에서 자발적 T 세포 반응에 의해 표적화된다 .
MMSET로부터 유래된 2개의 HLA-A*02 리간드를 포함하여 11개 HLA-A*02 및 2개 HLA-B*07 제한 펩티드의 패널에서 신규 골수종 항원의 기능적 특성화를 실시했다(도 5a). 골수종 관련 펩티드를 MM 환자와 HV로부터 획득한 PBMC를 사용하여 12일 회상 IFNγ-ELISPOT 측정에서 평가했다. 본 발명자들은 골수종 환자에서 11개 중 5개 A*02 리간드 및 2개 중 1개 B*07 리간드에 대해 IFNγ 분비를 관찰했으며 이는 도 5c에 예시적으로 나와 있다. MMSET로부터 유래한 두 펩티드(P1 및 P2)는 MM 환자 16명 중 2명(13%) 및 8명 중 1명(13%)에서 각각 특이적 T 세포 인지를 보여주었다. 중요하게도 10명의 HLA 일치 건강한 대조 샘플에서는 어떠한 골수종 펩티드 특이적 IFNγ 분비도 관찰되지 않았다(도 5b). 뚜렷하게도 T 세포 반응은 원발성 골수종 샘플(13개 중 10개)에서 확인된 골수종 관련 펩티드에서만 관찰되었으며 MCL에서만 확인된 13개 중 3개의 펩티드의 경우 절대 관찰되지 않았다. MM 환자에서 ELISPOT에 의해 검출된 펩티드 특이적 T 세포 반응의 빈도는 MM 환자의 동종이형 일치 리간돔에서 해당 펩티드의 표시 빈도와 일반적으로 같은 범위였다(도 5a). 분석에 가용한 세포 수의 제한으로 인해, 상응하는 항원을 발현하는 표적 세포를 통한 추가의 제어는 수행할 수 없었다. 그러므로 본 발명자들은 T 세포의 반응성이 합성 펩티드 배치에 포함된 불순물에 대항하는 점을 배제할 수 없다. 실제로 합성 펩티드는 불순물, 예를 들어 보호기로 변형된 펩티드를 포함하며 또한 이러한 펩티드가 면역원성이라는 것이 잘 알려져 있다. 그러나 현재 이 연구에서 모든 ELISPOT에 사용된 양성 조직(HV 독점적 HLA 리간드)으로부터 유래한 HLA-A*02 및 -B*07 제한된 대조 펩티드는 유의한 방출을 절대 초래하지 않았다(도 5c).
항원 특이적 T 세포는 MM 환자 또는 MV 의 미접촉 T 세포로부터 실험관 내에서 유도할 수 있다
항원 특이적 T 세포 반응이 시험관 내에서 비접촉 T 세포로부터 유도 가능 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 한 명의 건강한 개인 및 한 명의 MM 환자로부터 CD8+ T 세포를 분리했다. 본 발명자들은 다음의 MMSET 유래 펩티드 SLLEQGLVEA(서열 식별 번호 177) (P2)를 사용하여 aAPC 프라이밍을 수행했다. HV 유래 CD8+ T 세포를 사용하여, 0.403% P2-사합체 양성 CD8+ T 세포의 모집단이 시험관 내 프라이밍 이후 검출되었다. 어떠한 사합체 양성 T 세포 모집단 >0.1%도 생체 외에서 검출이 가능하지 않았다. P2에 대한 이전의 T 세포 활성도(12일 기억 IFNγ-ELISPOT 및 생체 외 사합체 염색에 의해 검출됨) 없이 MM 환자의 T 세포의 프라이밍 이후, 본 발명자들은 작은 모집단에 해당되는 0.236% P2-사합체 양성 CD8+ T 세포의 유도를 검출했다(도 5e). 중요한 것은 관련 없는 A*02 대조 펩티드를 포함하는 A*02 사합체로써 수행된 대조 염색을, 관련 있는 염색에 사용된 것과 같은 웰로부터 유래된 세포에 대해 병행하여 수행했으며, 어떠한 특이적 사합체 양성 T 세포 모집단도 생성되지 않았다(도 5d).
골수종 환자 및 건강한 자원자의 골수에서 여러 다른 세포 모집단에 대한 HLA 표면 발현의 정량화는, 악성종양 혈장 세포에 대한 HLA 손실 또는 하향조절은 물론 심지어 이전 요법을 받은 환자에서도 전혀 관심의 대상이 아님을 잘 보여주었다. 이러한 세포 모집단의 HLA 리간드에 대한 비교 분석에 의해 뚜렷한 항원 시그내처를 밝혔으며 골수종 연관 항원의 패널을 확인했다.
중요한 것은, 확립된 골수종 항원의 상당한 비율이 원발성 골수종에서 단지 빈번하지 않게 제시되거나 또는 최적 수준 미만의 골수종 특이성을 보여주는 것으로 나타났다. 주목할 것은, 이러한 항원의 대부분이 원발성 샘플이 아니라 골수종 세포주에서 선택적으로 검출되었으며, 이것은 병리생리학적으로 관련있는 항원의 선택은 원발성 종양 샘플의 분석에 근거해야 함을 지시한다.
중요한 예외는 확립된 골수종 관련 단백질인 MMSET였으며, 이것은 불량한 예후 t(4;14) 골수종 환자의 요법을 위한 표적으로 현재 조사되고 있다[73 ~ 76]. MMSET 유래 펩티드가 t(4;14) 골수종 샘플에서 빈번하게 확인되었지만, 본 발명자들은 한 명의 t(4;14) 음성 환자 및 한 명의 t(4;14) 음성 MCL(U266)의 HLA 리간돔에서도 MMSET 펩티드를 검출했다. 놀랍게도 ELISPOT에 의한 기능적 특성화의 결과 이러한 MMSET 유래 에피톱을 표적으로 하는 기억 T 세포 반응은 HV가 아닌 골수종 환자에서만 유일하게 발견됨을 드러냈다. 이것은 MM 환자에서 생체 내 항-MMSET T 세포 반응의 골수종 의존 프라이밍을 시사하며, 이는 이 항원의 병리생리학적 관련성을 강조하는 것이다. HLA 리간돔 데이터에 따라 본 발명자들은 이러한 T 세포 반응이 t(4;14) 골수종 환자에게 제한되지 않음을 발견했다. 시험관 내 프라이밍의 결과는 MMSET 특이적 CD8+ T 세포 반응은 건강한 개인의 그리고 중요하게도 정도는 제한되지만 골수종 환자에서도 비접촉 T 세포로부터 유도될 수 있음을 시사한다. 적은 분자 또는 siRNA에 의한 MMSET의 억제에 초점을 맞추는 현재의 전략으로써[77, 78], 본 발명자의 골수종 독점적 MMSET 유래 T 세포 에피톱에 대한 확인은 T 세포 기반의 면역요법에 의한 MMSET 표적화를 위한 새로운 옵션을 제공한다. 중요한 것은 본 발명자들이 돌연변이 상태와 관계없이 MMSET 제시 및 면역 인식을 관찰했으므로, 이러한 치료 전략을 t(4;14) 골수종에 반드시 제한시킬 필요는 없다는 것이다. 이것은 유전자 발현과 HLA 제한 항원 제시 사이의 왜곡된 상관관계는 물론 질병의 과정에 걸쳐 발생하는 게놈 가소성 그리고 골수종 세포에서의 t(4;14)의 아클론성 분포에 의해 설명될 수 있다[72, 79].
이상을 종합하면 본 발명자들의 발견 내용은 HLA 리간돔학에 의해 인도되는 항원 확인이 어떻게 신규 MM 관련 T 세포 에피톱을 집어내고 환자 코호트에서 항원 분배 패턴의 직접적 평가를 허용할 수 있는지 예시한다. 본 발명자들의 MMSET에 대한 발견 내용과 병행하여, 본 발명자들의 연구는 골수종 또는 일반적인 암과 과거에 관련되지 않았던 신규 항원의 방대한 패널을 잘 보여준다. 본 발명자들은 MMSET와 유사하게 골수종 환자에서 이러한 표적의 상당한 비율에 대해 이미 존재하는 T 세포 반응을 검출했으며, 이는 관련 있는 MM 관련 항원의 높은 강화를 지시한다. 결론적으로 본 발명자들의 리간돔 중심의 연구는 다발성 골수종에서 미래의 항원 특이적 T 세포 면역요법의 설계를 안내할 수 있다.
이제 본 발명은 그 바람직한 구현을 설명하는 다음의 실시예에서 그리고 동반되는 도면을 참조하여 묘사될 것이나, 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 여기에 인용된 모든 참조 문헌들은 그 전문이 포함된다.
도 1은 골수종 환자 및 HV의 골수 세포에서 HLA 클래스 I 및 II 표면 발현을 보여준다. HLA 표면 발현의 정량화는 염주 기반의 유세포 분석법을 사용하여 수행했다. 자가 CD34+CD38- 조혈 전구 세포들, CD19+CD20+ B세포 및 CD3+ T 세포와 비교한 CD38+CD138+ 원발성 골수종 세포에서의 (A) HLA 클래스 I 그리고 (B) HLA-DR 발현. HV의 골수 유래 혈장 세포와 비교한 원발성 MM 세포에서의 (C) HLA 클래스 I 그리고 (D) HLA-DR 발현. 약어: MM, 다발성 골수종; HV, 건강한 자원자; n.s., 유의하지 않음; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.
도 2는 골수종 관련 항원에 대한 HLA 리간돔 비교 프로파일링 및 확인을 보여준다. (A) MM 환자에서 HLA 클래스 I 리간드 출처 단백질 확인의 포화 분석. 10명의 MM 환자에서 고유한 HLA 리간드 출처 단백질 확인 수는 누계 HLA 리간드 출처 단백질 확인의 함수로서 표시. 다른 출처 단백질 확인의 최대 획득가능한 수의 견실 계산(R2=0,99)을 위해 지수 회귀분석 허용(파선). 점선은 본 발명자들의 MM 환자 코호트에서 성취된 출처 프로테옴 범위를 묘사한다. (B) 원발성 MM 샘플(n=10), MCL(n=5) 그리고 HV 샘플(합계 n=45: PBMC(n=30), BMNC(n=10), 과립구(n=5))에서 HLA 클래스 I 리간드 출처 단백질의 중복 분석. (C) MM 및 HV 리간돔에서 HLA 제한된 제시의 빈도에 근거한 HLA 리간드 출처 단백질의 비교 프로파일링. 해당 출처 단백질의 HLA 제한된 제시(x축)에 대한 MM/HV 양성의 빈도는 y축에 표시된다. 왼쪽에 있는 상자는 골수종 관련 항원의 하위세트를 강조표시하여 골수종 샘플의 >25%에서 MM 독점적 제시를 보여준다. (D) 여러 임계값에서 가양성 골수종 항원 분화에 대한 통계적 평가. MM 및 HV 코호트의 분석에 근거하여 확인된 원래 TAA의 수를 무작위 가상 TAA와 비교했다. 두 개의 원래 코호트에서 단백질 확인 전체로부터 무작위 가중 샘플링에 근거하여 가상 MM 및 HV 샘플을 가상으로 생성했다. 이러한 정의된 크기의 무작위화 가상 리간돔(n = 957개 단백질, 이것은 모든 분석한 샘플에서 단백질 확인의 평균 수임)을 사용하여 15개 MM 대 45개 HV 샘플의 시뮬레이션 코호트에 근거하여 TAA를 정의했다. 단백질 무작위화의 과정, 코호트 조립 및 TAA 확인을 1,000회 반복했으며, 그에 따른 가장 TAA의 평균값을 계산하여 여러 임계값에 대해 그래프를 작성했다. 선택된 TAA 임계값의 상응하는 허위 발견율은 x축 아래에 나열된다. 약어: ID, 확인; MM, 다발성 골수종; MCL, 골수종 세포주; HV, 건강한 자원자; PBMC, 말초 단핵 혈액 세포; BMNC, 골수 단핵 세포; TAA, 종양 관련 항원; FDR, 허위 발견율.
도 3은 MM 및 HV의 HLA 리간돔에서 확립된 골수종 관련 항원의 표시를 보여준다. (A) HLA 클래스 I 리간돔에서 이전에 묘사한 MM 관련 항원의 표시. 막대는 원발성 MM 샘플, MCL 및 HV의 HLA 클래스 I 리간드에 의한 각 항원의 상대적 표시[%]를 나타낸다. 파선은 MM 관련의 정도에 따라 항원을 4군으로 나눈다(MM 및 MCL 독점적, MCL 독점적, 혼합 제시, HV 독점적). (B,C) MCL(흰색) 및 MM+MCL(음영)에서 (B) 이전에 묘사한 항원 그리고 (C) 리간돔 정의된 종양 관련 항원에 대한 골수종 독점적 항원 제시의 분포. 약어: MM, 다발성 골수종; MCL, 골수종 세포주; HV, 건강한 자원자.
도 4는 상승 효과가 있는 HLA 클래스 II 제한 골수종 관련 항원의 확인을 보여준다. 원발성 MM샘플(n=7), MCL(n=5) 및 HV 샘플(총 n=23: PBMC(n=13), BMNC(n=5), 과립구(n=5))의 HLA 클래스 II 리간드 출처 단백질의 중복 분석. (B) 제2도에 묘사된 바와 같은 여러 임계값에서 가용성 골수종 항원 확인의 통계적 분석. 무작위화된 가상 리간돔 크기는 266개의 단백질로 설정되었으며 TAA는 12개 MM 대 23개 HV 샘플로 이루어진 시뮬레이션된 코호트에 근거하여 정의되었다. (C) MM 및 HV 리간돔에서 HLA 제한 제시의 빈도에 근거한 HLA 클래스 II 리간드 출처 단백질의 비교 프로파일링. 해당 출처 단백질의 HLA 제한된 제시(x축)에 대한 MM/HV 양성의 빈도는 y축에 표시된다. (D) HLA 클래스 I TAA(n=58) 및 HLA 클래스 II MM 독점적 항원(n=1135)의 중복 분석. (E) HLA 클래스 I TAA, 상승효과의 잠재성이 가능한 HLA 클래스 II 리간드 출처 단백질의 비교 프로파일링. (F) MM 샘플의 전체 HLA 클래스 I 및 II 리간드 출처 프로테옴을 구성하는 중복 분석. 약어: MM, 다발성 골수종; MCL, 골수종 세포주; HV, 건강한 자원자; PBMC, 말초 단핵 혈액 세포; BMNC, 골수 단핵 세포; TAA, 종양 관련 항원; FDR, 허위 발견율; rep., 표시.
도 5는 골수종 관련 항원의 기능적 특성화를 보여준다. (A) IFNγ-ELISPOT 측정에서 골수종 환자의 T 세포에 의한 상응하는 HLA 제한 및 면역 인식의 빈도를 갖는 골수종 관련 T 세포 에피톱. (B) HV PBMC를 사용한 IFNγ-ELISPOT에서 평가된 골수종 관련 T 세포 에피톱의 예. 빈번히 인식되는 펩티드 BRLF109-117 YVLDHLIVV (A*02)(서열 식별 번호 229) 및 EBNA3247-255 RPPIFIRRL(서열 식별 번호 230) (B*07을 양성 대조로 사용. 양성 종양 유래 펩티드 KLFEKVKEV(서열 식별 번호 231) (HLA-A*02) 및 KPSEKIQVL (B*07) (서열 식별 번호 232)을 음성 대조로 사용). (C) MM 환자 PBMC(n=3)를 사용하는 IFNγ-ELISPOT에서 평가된 골수종 관련 T 세포 에피톱의 예. 결과는 면역반응성 펩티드에 대해서만 나와 있다. 빈번히 인식되는 펩티드 5개 EBV[BRLF109-117 YVLDHLIVV (A*02) (서열 식별 번호 229), EBNA3471-479 RLRAEAQVK (A*03) (서열 식별 번호 233), EBNA3247-255 RPPIFIRRL (B*07) (서열 식별 번호 230), BZLF1190-197 RAKFKQLL (B*08) (서열 식별 번호 234), EBNA6162-171 AEGGVGWRHW (B*44) (서열 식별 번호 235)]를 함유하는 EBV 에피톱 혼합물이 양성 대조로 사용되었다. 양성 종양 유래 펩티드 KLFEKVKEV(서열 식별 번호 231) (HLA-A*02) 및 KPSEKIQVL (B*07) (서열 식별 번호 232)가 음성 대조로 사용되었다. (D,E) (D) 건강한 개인 및 (E) 골수종 환자로부터 유래된 T 세포를 사용하여 3주기의 aAPC 기반 시험관 내 프라이밍을 실시한 후 CD8+ T 세포의 사합체 염색: 첫째 열: P2-aAPCs (SLLEQGLVEA, A*02(서열 식별 번호 177))로 프라이밍한 CD8+ T 세포의 P2-사합체 염색; 둘째 열: CD8+ T 세포의 생체 외 P2-사합체 염색; 셋째 열: 관련 없는 A*02 제한 대조 펩티드(KAMEAASSL, A*02(서열 식별 번호 82))를 함유하는 A*02-사합체로써 첫째 열에서 묘사된 T 세포와 동일한 모집단으로부터 유래한 CD8+ T 세포에서의 대조 염색. 넷째 열: 양성 대조 CMV-aAPC (NLVPMVATV, A*02 (서열 식별 번호 236))로 프라이밍한 CD8+ T 세포의 사합체 염색. 약어: MM, 다발성 골수종; UPN, 단일 환자 번호; neg, 음성; pos., 양성.
도 6a 및 도 6b는 펩티드 서열 식별 번호 107 및 177의 골수종 이외의 조직 상에서의 제시를 보여준다. A) 이 펩티드에 대해 시험 결과 음성인 정상 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포 샘플, 15개 혈관, 10개 골수, 13개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 25개 대장, 24개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 3개 난소, 13개 췌장, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 4개 전립선, 7개 타액선, 9개 골격근, 11개 피부, 9개 소장, 11개 비장, 8개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 5개 갑상선, 16개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁. MM 외에도 이 펩티드 다음에서도 제시되는 것으로 나타났다: 1개 세포주(흑색종), 1개 정상 조직(비장), 5개 암 샘플(1개 AML, 2개 담낭암, 1개 간세포 암종, 1개 흑색종). B) 이 펩티드에 대해 시험 결과 음성인 정상 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포 샘플, 15개 혈관, 10개 골수, 9개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 23개 대장, 24개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 10개 신경, 3개 난소, 13개 췌장, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 9개 골격근, 11개 피부, 8개 소장, 11개 비장, 8개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 5개 갑상선, 15개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁. MM 외에도 이 펩티드 다음에서도 제시되는 것으로 나타났다: 6개 세포주(5개 백혈병, 1개 신장암), 4개 뇌, 1개 중추 신경, 2개 결장, 1개 말초 신경, 1개 전립선, 1개 소장, 1개 비장, 1개 기관, 1개 담관암, 12개 뇌암, 2개 유방암, 3개 결장암, 4개 식도암, 3개 담낭암, 4개 두경부암, 2개 신장암, 2개 간암, 19개 폐암, 2개 NHL, 1개 AML, 8개 난소암, 2개 전립선암, 1개 직장암, 4개 피부암, 2개 방광암, 6개 자궁암.
실시예
재료 및 방법
환자, 혈액 및 골수 샘플
진단 시 또는 요법 이전의 재발 시 MM 환자로부터 얻은 골수 단핵 세포(BMNC) 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 그리고 건강한 자원자(HV)의 PBMC, BMNC 및 과립구를 밀도 구배 원심분리(Biocoll, Biochrom GmbH)와 적혈구 용해(EL buffer, Qiagen)에 의해 분리했다. 사전 동의는 헬싱키 선언 약정에 의거하여 얻었다. 이 연구는 현지 윤리 위원회(142/2013BO2)의 지침에 따라 수행했다. 환자의 특성은 표 1에 제공된다. HLA 검사는 독일 튀빙겐의 혈액종양과에서 실행했다.
골수종 세포주( MCL )
HLA 리간돔 분석을 위해, 골수종 세포주(MCL: U266, RPMI8226, JJN3, LP-1, MM.1S)를 10%/20% 우태 혈청, 100 IU/L 페니실린, 100 mg/L 스트렙토마이신 및 2 mmol/L 글루타민으로 보충된 권장 세포 배지(RPMI1640, Gibco / IMDM, Lonza)에서 37?C 및 5% CO2 하에서 배양했다. MCL RPMI8226, JJN3, MM.1S 및 LP-1은 튀빙겐 혈액종양과로부터 얻었다.
HLA 표면 발현의 정량화
MM 환자 그리고 CD38+CD138+ 골수종 세포/혈장 세포, CD19+CD20+ B세포, CD3+ T 세포 및 CD34+CD38- 조혈 전구 세포(HPC)를 포함한 HV 골수 세포에 대한 HLA 발현은 이전에 설명한 대로 제조사의 설명에 따라 QIFIKIT 염주 기반 정량적 유세포 측정(Dako)을 사용하여 분석했다[12]. 간단히 말하면, 샘플을 pan-HLA 클래스 I 특이적 단클론 항체(mAb) W6/32, HLA-DR 특이적 mAb L243(자체 생산된) 또는 IgG 동형 대조(BioLegend)로 각각 염색했다. 표면 표지자 염색은 직접 라벨링된 CD138, 항-κ 항-λ CD19, CD20 (BioLegend) 및 CD38, CD3 그리고 CD34 (BD) 항체로 실행했다. LSR Fortessa(BD)로 유세포 분석 직전에 7-AAD(BioLegend)를 활성 표지자로 첨가했다.
원발성 샘플 및 MCL 로부터 HLA 리간드의 분리
HLA 클래스 I 및 II 분자를 pan-HLA 클래스 I 특이적 mAb W6/32, pan-HLA 클래스 II 특이적 mAb Tu 9 및 HLA-DR 특이적 mAB L243(자체 생산)을 사용하여 설명된 표준 면역친화성 정제에 의해 분리했다[44].
HLA 리간드의 LC - MS / MS 에 의한 분석
HLA 리간드 추출물은 이전에 설명된 대로 5회 기술적 반복 실험으로 분석했다[13]. 간단히 말하면, 펩티드 샘플을 50 5cm PepMap RSLC 컬럼(Thermo Fisher) 그리고 2.4~32.0%의 아세토니트릴 기울기 범위를 사용하여 90분에 걸쳐 나노플로 HPLC(RSLCnano, ThermoFisher)로 분리했다. 용출된 펩티드는 상위 5개 CID(충돌 유도 분리) 분절 방법을 사용해 온라인 연결 LTQ Orbitrap XL 질량 분석기(Thermo Fisher)로 분석했다.
데이터베이스 검색 및 스펙트럼 주석
데이터 처리는 이전에 설명된 바와 같이 수행했다[13]. 간단히 말하면, Mascot 검색 엔진(Mascot 2.2.04; Matrix Science, London, UK)을 실행하여 효소 제한 없이 Swiss-Prot 데이터베이스(20,279개의 검토된 단백질 서열, 2013년 9월)에 구성원 인간 프로테옴을 검색했다. 돌연변이가 가능한 HLA 리간드의 검색은, COSMIC 데이터베이스(http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/)에 나열된 단일 아미노산 변이체(SAV)를 함유하는 단백질과 연결된 인간 프로테옴이 포함된 데이터베이스를 실행하여 이루어졌다(http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/). 2개 이상의 혈액학적 기원의 샘플에서 설명된 재발성 SAV만 포함되었다. 산화된 메티오닌은 동적 변형으로서 허용했다. 허위 발견율은 Percolator 알고리즘을 사용하여 추정했으며[45] 5%로 설정했다. 펩티드 길이는 HLA 클래스 I은 8-12개의 아미노산으로, HLA 클래스 II는 12-25 아미노산으로 각각 제한되었다. 단백질 추론은 사용 불가능하도록 하여 펩티드의 복수 단백질 주석을 가능하게 했다. HLA 주석은 SYFPEITHI[46] 또는 확장된 자체 데이터베이스를 사용하여 수행했다. 펩티드 확인 및 HLA 주석에 대한 실험적 검증은 하위세트의 펩티드에 대한 질량 분광 분석 및 기능적 특성화에 의해 수행했다.
펩티드 및 HLA 펩티드 단량체 합성
전자동 펩티드 합성기 EPS221(Abimed) 그리고 9-플루오레닐메틸-옥시카르보닐/tert-부틸(Fmoc/tBu) 전략을 사용하여 펩티드를 합성했다[47]. 합성 펩티드는 LC-MS/MS 확인 그리고 기능적 실험의 검증에 사용되었다. 비오티닐화 재조합 HLA 분자 및 형광 MHC-펩티드-사합체는 이전에 설명한 바와 같이 생성했다[48].
펩티드 특이적 T 세포의 증폭
MM 환자와 HV로부터 PBMC는 이전에 설명된 바와 같이 배양했다[12, 13]. 간단히 말하면, CD8+ T 세포 자극을 위해 PBMC를 펩티드당 1 ?g/ml으로 펄스하여 12일 동안 배양했으며 제0일 및 제1일에는 IL-4과 IL-7을 그리고 제3일, 제6일, 제7일 및 제9일에는 IL-2를 각각 첨가했다. 양성 조직(HV 독점적 HLA 리간드)에서 유래된 HLA-A*02(KLFEKVKEV) (서열 식별 번호 231) 및 B*07(KPSEKIQVL) (서열 식별 번호 232) 제한 대조 펩티드를 음성 대조로 사용했다. 펩티드 자극된 PBMC는 제12일에 ELISPOT 분석법에 의해 분석했다. CD4+ T 세포 자극을 위해, 다음의 2가지 변형을 제외하고는 CD8+ T 세포와 동일하게 배양을 수행했다. 펄스는 10 ?g/ml의 HLA 클래스 II 펩티드로 실행했으며 IL-4 또는 IL-7은 첨가하지 않았다.
IFN γ- ELISPOT 분석
IFNγ-ELISPOT 분석은 이전에 설명된 바와 같이 실행했다[49]. 간단히 말하면, 96웰 니트로셀룰로스 플레이트(Millipore)를 1 mg/ml IFNγ mAb(Mabtech)로 코팅한 다음 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양했다. 플레이트를 10% 인간 혈청을 사용하여 37 ℃에서 2시간 동안 차단시켰다. 2.5 x 105 세포/웰의 사전 자극된 PBMC를 1 ?g/ml(HLA 클래스 I) 또는 2.5 ㎍/ml(HLA 클래스 II) 펩티드로 펄스한 다음 24-26시간 동안 배양했다. 판독은 제조사의 설명에 따라 수행했다. 양성 대조로 PHA를 사용했다. 양성 조직(HV 독점적 HLA 리간드)에서 유래된 HLA-A*02(KLFEKVKEV)(서열 식별 번호 231) 및 B*07(KPSEKIQVL)(서열 식별 번호 232) 제한 대조 펩티드가 음성 대조 역할을 했다. 점의 계수에는 ImmunoSpot S5 분석기를 사용했다(CTL). T 세포 반응은 >10 점/웰이 계수되고 평균 웰당 점의 수가 음성 대조 웰의 평균 점의 수에 비해 적어도 3배 더 큰 경우 양성으로 간주했다(암 면역유도 프로그램(CIP) 지침에 따름[50]).
펩티드 특이적 T 세포의 aAPC 프라이밍
인공 항원 제시 세포(aAPC)의 생성을 위해, 1 ml당 4 06의 스트렙타비딘 코팅된 폴리스티렌 입자(Bangs Laboratories)를 200 pM 비오티닐화 MHC-펩티드 단량체 및 20 nM 항인간 비오티닐화 CD28 항체가 포함된 PBE(PBS/BSA/ETDA, Gibco/Sigma Aldrich/Lonza)에 다시 현탁시킨 다음 실온에서 30분 동안 배양시켰다. 세척 후, aAPC는 사용 전까지 4 ℃에서 보관했다[51]. MM 환자 및 HV의 CD8+ T 세포를 자기 세포 분리장치(Miltenyi Biotec)를 사용하여 양성 선택에 의해 농축시켰다. 자극은 5 ng/ml 인간 IL-12(PromoKine)로 보완된 200 μL T 세포 배지에 1 x 106 T 세포 및 2 x 105 aAPC가 포함된 96웰 플레이트에서 개시했다. 65 U/μL IL-2(R&D Systems)를 제5일에 첨가했다. aAPC 자극은 총 3주기 동안 제10일에 반복했다.
사합체 염색
펩티드 특이적 CD8+ T 세포의 빈도는 항CD8 (Biolegend) 및 HLA:펩티드-사합체-PE로 이전에 설명된 바와 같이 염색하여 FACS Canto II 세포측정기(BD Bioscience)에서 결정했다[51]. CMV pp65 A*02 펩티드 NLVPMVATV(서열 식별 번호 236)를 포함하는 사합체를 염색하여 양성 대조로 사용했으며, 무관련 비프라이밍 A*02 제한 대조 펩티드를 포함하는 사합체를 염색하여 음성 대조로 사용했다. 펩티드 특이적 CD8+ T 세포의 빈도가 생존 가능한 세포의 > 0.1%이며 음성 대조에서 펩티드 특이적 CD8+ T 세포의 빈도보다 3배 이상이면 성공적인 프라이밍으로 간주했다.
소프트웨어 및 통계적 분석
유세포 측정 데이터 분석은 FlowJo 7.2(Treestar)를 사용하여 수행했다. TAA 허위 발견율의 분석에서 그리고 TA 안정기 회귀 분석에서 가상 리간돔의 생성 및 가상 TAA(종양 관련 항원)의 정의를 위해 자체 생성된 R 및 Python 스크립트를 사용했다. 표준 R heatmap .2 스크립트를 HLA 리간드 출처 단백질의 비감독 클러스터 분석을 위해 사용했다. 통계 분석에는 GraphPad Prism 6.0(GraphPad Software)을 사용했다. HLA 표면 발현의 통계적 분석은 비대응 t-검정에 근거했다.
프로테아솜 억제제 요법 동안 HLA 클래스 I 리간드의 제시
본 발명자들은 프로테아솜 억제제 요법 동안 HLA 클래스 I 리간드 제시를 정량적으로 평가했다. 17.9 ± 1.1%의 MM.1S 리간드 그리고 11.2 ± 0.7%의 U266 리간드(3회의 생물학적 반복 실험에 대한 평균 ± 표준 편차)가 포함된 카르필조밉으로 처리 후 HLA 클래스 I 리간돔의 상당한 가소성이 관찰되었으며, 그 결과는 가짜 처리된 대조군과 비교하여 t24h에서 유의한 조절을 나타냈다(배수 변화 ≥4, Benjamini-Hochberg 보정 후 Po0.01). 간단히 말해서, 배양된 MCL(MM.1S 및 U266) 그리고 원발성 골수종 샘플을 카르필조밉(100 nM, Kyprolis(등록상표), Onyx Pharmaceuticals, Inc.등으로부터 입수 가능)을 프로테아솜 억제제로 한 예로서 1시간 동안 배양한 다음, PBS(Gibco)에서 3번 세척하고 나서 24 또는 48시간 동안 추가로 재배양했다. 대조군은 부형제 대조(포도당 5%)와 함께 1시간 동안 배양한 다음 동일한 세척 그리고 24 또는 48시간 동안의 배양을 수행했다. 실험은 표시된 경우 3회 생물학적 반복 실험으로 실행했다. 그 결과는 다음 표에 나와 있다.
[표 5A]
MM.1S 세포 상에 검출된 골수종 관련 펩티드들 그리고 카르필조밉 처리 후의 조절
Figure pct00015
Figure pct00016
[표 5B]
U266 세포 상에 검출된 골수종 관련 펩티드들 그리고 카르필조밉 처리 후의 조절
Figure pct00017
Figure pct00018
다음에는 MM.1S 모델을 사용하여 모든 시점 및 조건에 걸쳐 정량적 정보를 얻을 수 있는 31개 중 14개 골수종 펩티드의 과다를 종단적으로 추적했다. 이러한 표적의 대부분(14개 중 10개, 71.4%)에서, t24h에서의 조절 최고치 이후 t48h에서 기준선을 향하는 점진적 하락이 관찰되었다. 14개 중 4개의 펩티드(28.6%)에서만 t48h에서까지 꾸준한 조절이 나타났으며, 이 중 3개는 처리 후 점진적 하향 조절을 나타냈다.
다른 것들 중에서는, 서열 식별 번호 42가 3회 중 2회의 생물학적 반복 실험에서 카르필조밉 처리 후 24시간 시점에 MM.1 세포 상에서 유의한 상향 조절을 나타냈다. 반대로 MM.1S에서는 카르필조밉 처리 후 서열 식별 번호 107 및 서열 식별 번호 228에 대해 어떠한 유의한 조절도 발견되지 않았다.
참조문헌 목록
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
SEQUENCE LISTING <110> Immatics Biotechnologies GmbH <120> Novel cell epitopes and combination of cell epitopes for use in the immunotherapy of myeloma and other cancers <130> I32848WO <140> PCT/EP2016/064317 <141> 2016-06-21 <150> GB 1511191.7 <151> 2015-06-25 <150> US 62/184,500 <151> 2015-06-25 <160> 237 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ala Ser Pro Val Val Ala Glu Tyr 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Glu Asn Ala Pro Ser Lys Glu Val Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Glu Gln Glu Ile Ala Arg Leu Val Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Phe Ile Gln Ala Gly Ile Phe Gln Glu Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala His Ser Glu Gln Leu Gln Ala Leu 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Ile Ile Leu Glu Ala Val Asn Leu Pro Val Asp His 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala 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Phe Leu Val Asn His Asp Phe Ser 1 5 10 15 <210> 214 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 214 Val Pro Val Gly Gly Leu Ser Phe Leu Val Asn His Asp Phe Ser Pro 1 5 10 15 <210> 215 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 215 Val Pro Val Gly Gly Leu Ser Phe Leu Val Asn His Asp Phe Ser Pro 1 5 10 15 Leu <210> 216 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 216 Val Pro Val Gly Gly Leu Ser Phe Leu Val Asn His Asp Phe Ser Pro 1 5 10 15 Leu Glu <210> 217 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 217 Val Thr Asp Gly Lys Glu Val Leu Leu 1 5 <210> 218 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 218 Tyr His Ala Pro Pro Leu Ser Ala Ile Thr Phe 1 5 10 <210> 219 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 219 Tyr Ile Leu Asp Pro Lys Gln Ala Leu 1 5 <210> 220 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 220 Tyr Leu Phe Ala Val Asn Ile Lys Leu 1 5 <210> 221 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 221 Tyr Leu Tyr Ile Thr Lys Val Leu Lys 1 5 <210> 222 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 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Val 1 5 <210> 232 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 232 Lys Pro Ser Glu Lys Ile Gln Val Leu 1 5 <210> 233 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 233 Arg Leu Arg Ala Glu Ala Gln Val Lys 1 5 <210> 234 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 234 Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu 1 5 <210> 235 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 235 Ala Glu Gly Gly Val Gly Trp Arg His Trp 1 5 10 <210> 236 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 236 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 <210> 237 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 237 Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg Leu Val 1 5 10

Claims (39)

  1. 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228에 대해 88% 이상 상동성인 이의 변이체 서열을 포함하는 펩티드로서, 상기 변이체는 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합하고/거나 상기 변이체 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하고, 상기 펩티드는 전장 폴리펩티드가 아닌, 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 MHC 클래스 I 또는 II의 분자에 결합하는 능력을 보유하고, 상기 MHC와 결합 시 CD4 및/또는 CD8 T 세포에 의해 인식될 수 있는, 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228 중 어느 하나에 따른 아미노산의 연속적인 신장을 포함하는, 펩티드 또는 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체가 갖는 전체 길이는 8 ~ 100개, 바람직하게는 8 ~ 30개, 더욱 바람직하게는 8 ~ 16개의 아미노산이고, 가장 바람직하게는 상기 펩티드가 서열 식별 번호 1 ~서열 식별 번호 228중 어느 하나에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되는, 펩티드 또는 변이체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 변형되고/거나 비펩티드 결합을 포함하는, 펩티드 또는 변이체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 융합 단백질의 일부이고 특히 HLA-DR 항원-연관 불변사슬(Ii)의 N-말단 아미노산을 포함하는, 펩티드 또는 변이체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 인코딩하고 임의적으로 이종 프로모터 서열에 연계된 핵산.
  8. 제7항에 따른 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제7항에 따른 핵산 또는 제8항에 따른 발현 벡터를 포함하고, 바람직하게는 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포인, 재조합 숙주 세포.
  10. 의학에서의 사용을 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제7항에 따른 핵산, 제8항에 따른 발현 벡터 또는 제9항에 따른 숙주 세포.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 생산하는 방법으로서,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 제시하거나 제7항에 따른 핵산을 발현하거나 제8항에 따른 발현 벡터를 포함하는 제9항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드 또는 이의 변이체를 분리하는 단계
    를 포함하는 방법.
  12. 활성화 T 림프구를 생산하는 시험관 내 방법으로서,
    T 세포를 적절한 항원 제시 세포의 표면에 발현된 항원-로딩된 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자 또는 항원 제시 세포를 모방하는 인공 구축물과 상기 T 세포를 항원 특이적 방식으로 활성화하는데 충분한 시간 동안 시험관 내에서 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 항원은 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드인, 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하는 세포를 선택적으로 인식하는, 제12항에 따른 방법에 의해 생산되는 활성화 T 림프구.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하는 표적 세포를 환자에서 괴사시키는 방법으로서,
    제13항에 정의된 효과적인 수의 활성화 T 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 항체, 특히 가용성 또는 막 결합된 항체로서,
    제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 바람직하게는 MHC 분자에 결합 시 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 특이적으로 인식하고, 임의적으로 면역 자극 도메인 또는 독소와 같은 추가의 효과기 기능을 보유하는, 항체.
  16. 암의 치료 또는 암에 대한 약제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제7항에 따른 핵산, 제8항에 따른 발현 벡터, 제9항에 따른 세포, 제13항에 따른 활성화 T 림프구 또는 제15항에 따른 항체의 용도.
  17. 제16항에 있어서, 상기 암이 폐암, 뇌암, 간세포암, 신장암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 전립선암, 백혈병, 유방암, 메르켈 세포 암종, 흑색종, 난소암 및 식도암, 및 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228 중 어느 하나의 펩티드가 유래하는 단백질의 과발현을 보여주는 기타 종양들의 군으로부터 선택되는, 용도.
  18. (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제7항에 따른 핵산, 제8항에 따른 발현 벡터, 제10항에 따른 세포, 제13항에 따른 활성화 T 림프구 또는 제15항에 따른 항체를 용액 또는 동결건조된 형태로 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 용기;
    (b) 임의적으로 희석제 또는 동결건조된 제형을 위한 재구성 용액을 포함하는 제2 용기;
    (c) 임의적으로 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드; 및
    (d) 임의적으로 (i) 용액의 사용 또는 (ii) 동결건조된 제형의 재구성 및/또는 사용을 위한 설명
    을 포함하는 키트.
  19. 제18항에 있어서, 하나 이상의 (iii) 완충제, (iv) 희석제, (v) 필터, (vi) 주사바늘 또는 (vii) 주사기를 추가로 포함하는 키트.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 펩티드가 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228로 구성된 군으로부터 선택되는 키트.
  21. 개인화 항암 백신의 생산 방법으로서,
    (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양 연관 펩티드(TUMAP)를 동정하는 단계;
    (b) 정상 조직과 비교하여 종양에서 면역원성 및/또는 과다제시에 대해 사전선별된 펩티드들의 창고를 이용하여 상기 (a)에서 동정된 펩티드와 비교하는 단계;
    (c) 환자에서 동정된 TUMAP와 일치하는 하나 이상의 펩티드를 창고로부터 선택하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계에 근거한 개인화 백신을 배합하는 단계
    를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 TUMAP가
    (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질의 동정을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교함; 및
    (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 동정하기 위해, 상기 발현 데이터와 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과의 상관관계를 결정함
    에 의해 동정되는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 종양 샘플로부터 분리된 MHC 분자로부터 결합된 펩티드를 용출시키고 용출된 리간드를 서열결정함에 의해 MHC 리간드의 서열을 동정하는 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직을 동일한 환자로부터 얻는 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 창고에 포함된 펩티드들이 다음 단계들에 근거하여 동정되는 방법:
    (aa) 정상 조직과 비교하여 악성 조직에서 과발현된 유전자의 동정을 포함하는, 마이크로어레이 또는 서열결정-기반의 발현 프로필결정과 같은 고도의 병렬 방법에 의한 게놈-전체 전령 리보핵산(mRNA) 발현 분석을 수행하는 단계,
    (ab) 상기 (aa) 단계에서 검출된 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자에 의해 인코딩된 펩티드를 선택하는 단계, 및
    (ac) 건강한 공여자 또는 상기 환자의 인간 T 세포를 사용하는 시험관 내 면역원성 검정을 포함하는 선택된 펩티드에 의한 생체 내 T 세포 반응의 유도를 결정하는 단계; 또는
    (ba) 질량 분광분석 방법을 사용하여 상기 종양 샘플로부터 HLA 리간드를 동정하는 단계,
    (bb) 정상 조직과 비교하여 악성 조직에서 과발현된 유전자의 동정을 포함하는, 마이크로어레이 또는 서열결정-기반의 발현 프로필결정과 같은 고도의 병렬 방법에 의한 게놈-전체 전령 리보핵산(mRNA) 발현 분석을 수행하는 단계,
    (bc) 동정된 HLA 리간드와 상기 유전자 발현 데이터를 비교하는 단계,
    (bd) 상기 (bc) 단계에서 검출된 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자에 의해 인코딩된 펩티드를 선택하는 단계,
    (be) 종양 조직 상에서 상기 (bd) 단계로부터 선택된 TUMAP 및 건강한 조직 상에서 결여되거나 덜 빈번한 검출을 재검출하고 mRNA 수준에서 과발현의 타당성을 확인하는 단계, 및
    (bf) 건강한 공여자 또는 상기 환자의 인간 T 세포를 사용하는 시험관 내 면역원성 검정을 포함하는 선택된 펩티드에 의한 생체 내 T 세포 반응의 유도를 결정하는 단계.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 창고에 포함된 펩티드의 면역원성을, 시험관 내 면역원성 검정, 개별 HLA 결합에 대한 환자 면역 모니터링, MHC 멀티머 염색, ELISPOT 검정 및/또는 세포내 시토카인 염색을 포함하는 방법으로 결정하는 방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 창고가 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228로 구성된 군으로부터 선택된 복수의 펩티드를 포함하는 방법.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 정상의 상응하는 조직에 대해 종양 샘플에 고유한 하나 이상의 돌연변이를 개별 환자로부터 동정하고, 백신에 포함시키거나 세포 요법의 생성을 위해 상기 돌연변이와 상관관계가 있는 펩티드를 선택함을 추가로 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이가 전체 유전체 서열결정에 의해 동정되는 방법.
  30. HLA 리간드에 반응성인 T 세포 수용체, 바람직하게는 가용성 또는 막-결합된 T 세포 수용체로서, 상기 리간드가 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 동일성을 갖는, T 세포 수용체.
  31. 제30항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228에 대해 88% 이상 동일한, T 세포 수용체.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228 중 어느 하나로 구성되는, T 세포 수용체.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 수용체가 가용성 분자로 제공되고 임의적으로 면역 자극 도메인 또는 독소와 같은 추가의 효과기 기능을 보유하는, T 세포 수용체.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 TCR을 인코딩하고 임의적으로 이종 프로모터 서열에 연계된 핵산.
  35. 제34항에 따른 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터.
  36. 제34항에 따른 핵산 또는 제15항에 따른 항체를 인코딩하는 핵산 또는 제35항에 따른 발현 벡터를 포함하고, 바람직하게는 T 세포 또는 NK 세포인, 재조합 숙주 세포.
  37. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 수용체의 생산 방법으로서,
    제36항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    상기 숙주 세포 및/또는 그 배양 배지로부터 상기 T 세포 수용체를 분리하는 단계
    를 포함하는 방법.
  38. 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물:
    (a) 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;
    (b) 상기 (a)에 따른 펩티드 및/또는 펩티드-MHC 복합체와 반응성인 T 세포 수용체;
    (c) 상기 (a)에 따른 펩티드 및 HLA-DR 항원-연관 불변사슬(Ii)의 N-말단 아미노산 1 ~ 80을 포함하는 융합 단백질;
    (d) 상기 (a) ~ (c) 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터;
    (e) 상기 (d)의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포;
    (f) T 세포를 적절한 항원 제시 세포의 표면에 발현된 상기 (a)에 따른 펩티드와 상기 T 세포를 항원 특이적 방식으로 활성화하는데 충분한 시간 동안 시험관 내에서 접촉시키는 것을 포함하는 방법 및 이러한 활성화 T 세포를 자가 조직 또는 다른 환자에게 이전하는 방법에 의해 얻어지는 활성화 T-림프구;
    (g) 상기 (a)에 따른 펩티드 및/또는 펩티드-MHC 복합체 및/또는 상기 (a)에 따른 펩티드를 제시하는 세포에 대해 반응성이며 예를 들어 면역-활성화 도메인 또는 독소와의 융합에 의해 잠재적으로 변형되는 항체 또는 가용성 T 세포 수용체;
    (h) 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 및/또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 228로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드와 MHC 분자의 복합체를 인식하는 압타머;
    (i) 상기 (a) ~ (h) 중 어느 하나에 따른 접합된 또는 라벨링된 펩티드 또는 골격 및 약학적으로 허용가능한 담체, 및 임의적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 안정제.
  39. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 바람직하게는 MHC 분자에 결합된 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 특이적으로 인식하는 압타머.
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