DE10360456A1

DE10360456A1 - Tumorantigene und deren Verwendung

Info

Publication number: DE10360456A1
Application number: DE10360456A
Authority: DE
Inventors: Oliver Gires; Markus Münz; Martina Schaffrik
Original assignee: VAECGENE BIOTECH GmbH; Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: VAECGENE BIOTECH GmbH; Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 2003-12-22
Filing date: 2003-12-22
Publication date: 2005-07-28
Also published as: WO2005061537A2; US20070009501A1; WO2005061537A3; EP1697408A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Tumorantigene des Plattenepithelkarzinoms, Nukleinsäuren, die diese kodieren, sowie Antikörper, die gegen diese gerichtet sind. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Erzeugung Antigen präsentierender Zellen und T-Zellen, die für solche Antigene spezifisch sind. Zuletzt umfasst die Erfindung diagnostische und therapeutische Verfahren zum Nachweis/zur Behandlung eines Plattenepithelkarzinoms, insbesondere eines Plattenepithelkarzinoms im HNO-Bereich.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Tumorantigene des Plattenepithelkarzinoms, Nukleinsäuren, die diese kodieren, sowie Antikörper, die gegen diese gerichtet sind. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Erzeugung Antigen präsentierender Zellen und T-Zellen, die für solche Antigene spezifisch sind. Zuletzt umfasst die Erfindung diagnostische und therapeutische Verfahren zum Nachweis bzw. zur Behandlung eines Plattenepithelkarzinoms, insbesondere eines Plattenepithelkarzinoms im HNO-Bereich.
Karzinomzellen unterscheiden sich von gesundem Epithel sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene in ihrem Expressionsmuster. Die Überexpression bestimmter Proteine oder die Bildung mutierter oder post-translational veränderter Proteine in Tumorzellen kann zu einer Immunantwort führen. Diese geht einher mit der Aktivierung spezifischer T- und B-Lymphozyten und der Bildung spezifischer Antikörper.
Solche Tumor-spezifische Antikörper eignen sich prinzipiell als diagnostische Marker zum Nachweis einer Tumorerkrankung. Da solche Antikörper auch schon in frühen Tumorstadien im Serum von Patienten vorhanden sein können, eignen sie sich ebenfalls als Biomarker zur Krebsfrüherkennung.
Da eine menschliche Zelle unter Umständen bis zu 100.000 und mehr unterschiedliche Proteine bildet, sind Tumor-spezifische Antikörper aus dem Serum von Krebspatienten ein geeignetes Mittel, um immunogene Tumor-assoziierte Antigene zu identifizierten.

Es wurde eine Technologie entwickelt (AMIDA für autoantibody-mediated identification of antigens), die solche Antikörper nutzt, um per Immunpräzipitierung und anschließender zweidimensionaler (2D) Gelelektrophorese aus dem Lysat von Tumorzellen ausschließlich diejenigen Proteine zu isolieren, gegen die spezifische Antikörper existieren. Diese Technologie wird in der PCT-Anmeldung Nr. WO 03/025568 beschrieben, auf deren Inhalt vollinhaltlich Bezug genommen wird.

Man weiß, dass in jedem Menschen ein individuelles Set an Autoantikörpern vorhanden ist, dessen Entstehung und Bedeutung nicht bekannt ist. Normalerweise verursachen diese Antikörper keinerlei Symptome. Um Proteine, die von diesen 'natürlichen' Autoantikörpern erkannt werden von Tumor-spezifschen Proteine unterscheiden zu können, führten die Erfinder AMIDA zu Kontrollzwecken auch mit Immunglobulinen von Nicht-Tumorpatienten durch. Hierbei sind zwei verschiedene Verfahren zu unterscheiden:

1. Das Proteinlysat stammt von einer etablierten humanen Karzinomzelllinie (allogenes Verfahren). Dieses Lysat wird mit dem Serum eines Tumorpatienten oder mit gepoolten Immunglobulinen der Subklasse G (IgGs) von 100 Nicht-Tumorpatienten (käuflich zu erwerben von der Firma SIGMA in Deisenhofen) inkubiert.
2. Das Proteinlysat stammt von einer Tumorbiopsie (autologes Verfahren). Das Lysat wird mit Serum desselben Patienten oder mit gepoolten Seren von 100 Nicht-Tumorpatienten wie unter 1. inkubiert.

Beiden Verfahren gemeinsam ist, dass nach der Inkubation des Lysats mit einem Serum eine Immunpräzipitierung und eine Auftrennung der präzipitierten Proteine in der 2D-Gelelektrophorese durchgeführt werden. Im Vergleich der sich auf den 2D-Gelen ergebenden Proteinmuster von Tumorpatienten und Nicht-Tumorpatienten können so exklusiv solche Proteine identifiziert werden, gegen die ausschließlich in Seren von Tumorpatienten Antikörper vorhanden sind. Per definitionem ist somit jedes differentiell gebildete und per AMIDA isolierte Protein ein Tumor-assoziiertes Antigen, das sich prinzipiell als diagnostischer Marker zum Nachweis einer Tumorerkrankung eignet.

Die Erfinder haben nach diesem Prinzip AMIDA mit verschiedenen Tumorproben durchgeführt, die von Patienten mit Tumoren des Kopf-Halsbereichs, des Darms und der Lunge gewonnen worden waren. Eines der von den Erfindern isolierten Proteine ist Cytokeratin 8 (CK8), das bereits als Tumorantigen beschrieben wurde. Ebenso wurden CK8-spezifische Antikörper bei Patienten mit Hepatozellulären Karzinomen, bei Ösophaguskarzinomen und bei hepatischen Autoimmunerkrankungen beschrieben. Da die Erfinder CK8 aus dem Serum eines Tumorpatienten isoliert hatten, fragten sie nach der Häufigkeit solcher Antkörper bei weiteren Tumorpatienten und auch bei Nicht-Tumoraptienten. Zur Quantifizierung dieser Antikörper verwendeten die Erfinder ein Nachweisverfahren, bei dem eingefärbte Kügelchen (beads) mit rekombinanten CK8-Protein beschichtet wurden. Diese beads wurden mit Seren von Tumor- und Nichttumorpatienten inkubiert. Die an die CK8-beads gebundenen Antikörper wurden mit einem Fluoresceingekoppelten Zweitantikörper (mouse anti-human IgG) nachgewiesen und in einem Bio-Plex Messgerät quantifiziert. In 2 ist dargestellt, dass Tumorpatienten signifikant mehr CK8-Antikörper in ihrem Serum haben als Nicht-Tumorpatienten.

Das Targeting von Zellen in vivo und in vitro mit immunologischen Werkzeugen wie T-Zellen und Antikörpern ist also zusammenfassend sehr stark von der Kenntnis von möglichst spezifischen Proteinen auf Zielzellen abhängig.

Die Identifikation molekularre Diagnostika zur Früherkennnung von Tumoren ist aufgrund der hohen Mortalität, die durch Krebs verursacht wird, eine besondere Herausforderung geworden. Demgemäss haben Protein-Ansätze eine starke Wiederbelebung erfahren und sind von anerkannter Bedeutung bezüglich der Target-Protein-Identifizierung (HANASH, 2003). Targets, d. h. krankheitsspezifische Marker, sind für Antikörper-basierte Ansätze, DNA- oder Proteinvakzinierung und für die Erzeugung antigenspezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten von Nutzen. In vivo ist die humorale Immunreaktion eine der Waffen unseres Immunsystems, um pathogene und transformierte Zellen zu bekämpfen.

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Tumorantigene bereitzustellen, die als verbesserte diagnostische Marker in der Tumorerkennung eingesetzt werden können. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, basierend auf diesen Tumorantigenen neue und verbesserte Therapien zur Bekämpfung von Tumorerkrankungen, insbesondere jedoch des Plattenepithelkarzinoms, bereitzustellen.

Diese Aufgaben werden durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Einmal isoliert und charakterisiert, können die erfindungsgemäßen Tumorantigene vielfach verwendet werden: u.a. können (i) Antigen-präsentierende Zellen (APCs), wie bspw. dendritische Zellen oder B-Zellen, damit beladen und so zur Aktivierung spezifischer T-Zellen verwendet werden. (ii) Es lassen sich monoklonale und bispezifische Antikörper herstellen, die für die Diagnose einer Erkrankung und die Therapie von Patienten von großem Nutzen sind. (iii) Die Antigene können als Peptide bzw. als DNA-Vakzine eingestzt werden. Die vorliegende Erfindung beruht u.a. auf dem oben erwähnten AMIDA-Verfahren zur Identifizierung von Antigenen, die mit Krankheiten assoziiert sind, bei denen es zur Ausbildung einer humoralen Immunantwort und damit zur Bildung spezifischer Antikörper kommt. Dieses Verfahren basiert auf der durch autologe, allogene oder xenogene Antikörper vermittelten Präzipitation von Antigenen aus Zelllysaten oder Bakterien-, Parasiten- und/oder Virenpräparaten mit autologen, allogenen und/oder xenogenen Seren, Aszites oder Pleuralflüssigkeiten. Die Induktion einer Immunantwort, die einher geht mit der Produktion von Antikörpern, ist somit die einzige Grundvoraussetzung für die Anwendung von AMIDA. Das Verfahren eignet sich somit insbesondere zur Identifizierung von Tumorantigenen, aber auch für solche Antigene, die mit Autoimmunkrankheiten oder bakteriellen, viralen und parasitären Infektionen assoziiert sind.

Unter dem Begriff „Antigene", wie er in dieser Beschreibung verwendet wird, sind Strukturen zu verstehen, gegen die ein Organismus Antikörper bildet, da sie seinem Immunsystem fremd sind. Die Kenntnis von möglichst spezifischen Antigenen ist eine wichtige Voraussetzung für die Diagnose und die Immuntherapie von Tumorpatienten und Personen, die z.B. an einer Autoimmunkrankheit oder einer chronischen Infektion leiden. Derartige Antigene, die für die jeweilige Krankheit mehr oder minder spezifisch sind, ermöglichen den Nachweis und das Targeting in vivo und in vitro von Tumorzellen, von Zellen, die Ziel einer Autoimmunreaktion sind, sowie auch von infizierten Zellen und infektiösen Organismen.

Die Schwerpunkte der Erfindung liegen also im diagnostischen Nachweis von Antigenen bzw. von Autoantikörpern gegen diese mithilfe der erfindungsgemäßen Tumarorantigene und in der Nutzung der Antigene zu Therapiezwecken.

Die Erfindung stellt ein neues und viel versprechendes Werkzeug zur Therapie und Diagnose einer Vielzahl von Erkrankungen bereit und kann auch zur Entwicklung neuer Therapien dieser Erkrankungen einen entscheidenden Beitrag leisten.

Unter den durch die Erfinder identifizierten Antigenen befinden sich 27 bislang nicht als Tumorantigene bekannte Proteine. Diese Proteine sind in Tabelle 1 gelistet.

Tabelle 1: 27 Antigene wurden per AMIDA aus Tumorbiopsien isoliert, die von Patienten mit Tumorerkrankung des Kopf-Halsbereichs und aus Karzinomzelllinien isoliert wurden.

Die vollständigen Sequenzinformationen zu SEQ ID NO: 1–27 befinden sich in der Sequenzübersicht am Ende der Beschreibung.

Erfindungsgemäß werden u.a. folgende Methoden angewandt:

– mit geeigneten Methoden werden Antikörper, die eines oder mehrere der in Tabelle 1 aufgeführten Antigene erkennen, nachgewiesen. Als Quelle dieser Autoantikörper dient Vollblut oder Derivate hiervon wie Serum oder Plasma eines menschlichen Individuums.
– mit geeigneten Methoden werden die Antigene selbst nachgewiesen und quantifiziert. Beide Ausführungsformen dienen bevorzugt dem Nachweis einer Tumorerkrankung bei einem menschlichen Individuum.
– Kombinationen der in Tabelle 1 aufgeführten Antigene und/oder der diese Antigene erkennenden Autoantikörper werden zum Nachweis einer Tumorerkrankung verwendet.
– Kombination eines oder mehrerer der in Tabelle 1 aufgeführten Antigene und/oder Autoantikörper gegen diese Antigene werden mit weiteren Tumormarkern verwendet. Bei diesen 'weiteren Tumormarkern' kann es sich um bereits bekannte Marker (wie PSA, CEA etc.), aber auch um Marker handeln, die zukünftig entdeckt werden und die eine diagnostische Aussagekraft besitzen oder erst in Kombination mit einem oder mehreren der in Tabelle 1 enthaltenen Antigene oder Autoantikörper gegen diese Antigene erlangen.

Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein immunogenes Plattenepithelkarzinom-Antigen, das zumindest eines der Proteine der SEQ ID NO: 1–27 oder Variante hiervon umfasst, wobei die Variante ein oder mehrere Additionen, Insertionen, Substitutionen und/oder Deletionen im Vergleich zum jeweiligen Protein der SEQ ID NO: 1–27 umfasst, und wobei die immunogene Aktivität der Variante der Aktivität des jeweiligen unmodifizierten Protein von SEQ ID NO: 1–27 im wesentlichen gleich ist.

Der Begriff "immunogene Aktivität", wie hierin verwendet, betrifft die immunogene Funktion der erfindungsgemäßen Proteinen. Wie oben erwähnt, werden die erfindungsgemäßen Tumorartigene in verschiedenen Formen des Plattenepithekarzinoms überexprimiert und sind deswegen ein bedeutendes Target bzw. Ziel für die Immun-basierte anti-Krebstherapie sowie den Nachweis bzw. die Frühererkennung entsprechender Erkrankungen. Somit werden die wie hierin vorstehend offenbarten Tumorantigene in einem solchem Umfang betrachtet, in dem sie zur Induktion einer Immunreaktion in Säugetieren, vorzugsweise Menschen, in der Lage sind, um so als Therapeutikum zu dienen. Der Begriff immunogene Aktivität betrifft insbesondere die immunogene Funktion der erfindungsgemäßen Proteinen Immunreaktionen hervorzurufen, insbesondere Immunreaktionen, die von zytotoxischen T-Zellen vermittelt werden.

Die Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung umfassen ebenfalls alle Sequenzen, die sich von den hierin offenbarten Sequenzen durch Aminosäureinsertionen, -deletionen und -substitutionen unterscheiden.

Aminosäure- „Substitutionen" sind vorzugsweise das Ergebnis des Ersetzens einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, das heißt konservative Aminosäure-Ersetzungen. Aminosäure-Substitutionen können auf der Grundlage einer Ähnlichkeit in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilie und/oder der amphipatischen Natur der einbezogenen Reste vorgenommen werden. Beispielsweise schließen unpolare (hydrophobe) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein; polare neutrale Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein; positiv geladene (basische) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein; und negativ geladene (saure) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein.

"Insertionen" oder "Deletionen" bewegen sich typischerweise im Bereich von 1–3 Aminosäuren. Die erlaubte Variation kann experimentell bestimmt werden, indem systematisch Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in einem Protein unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken vorgenommen und die sich ergebenden rekombinanten Varianten bezüglich ihrer immunologischen Aktivität untersucht werden. Dazu ist für den Fachmann nicht mehr als die Durchführung von Routineexperimenten erforderlich.

Der Begriff „Variante" umfasst auch Peptidfragmente der erfindungsgemäßen Tumorantigene, wie sie beispielsweise zum Pulsen von APC verwendet werden können.

Solche Peptidfragmente weisen vorzugsweise 5–50, besonders bevorzugt 7–20 und am meisten bevorzugt 8–15 Aminosäurereste auf.

Es wird grundsätzlich in dieser Anmeldung bevorzugt, dass die Varianten der erfindungsgemäßen Proteine zumindest 50%, besonders bevorzugt zumindest 70%, am meisten bevorzugt zumindest 80% Sequenzidentität zu den Peptiden von SEQ ID NO: 1–27 zeigen.

Als besonders bevorzugtes Tumorantigen hat sich das Tumorantigen KIAA1273/TOB3 (SEQ ID NO: 15) erwiesen, von bisher unbekannter Funktion, das eine ausgezeichnete Eignung als Tumormarker aufweist. KIAA1273/TOB3 zeigte eine äußerst starke Überexpression in Kopf- und Hals-Karzinomen, während KIAA1273/TOB3 in gesunden Schleimhäuten lediglich in Zellen der Basalmembran in sehr niedriger Konzentration exprimieri wurde. Damit ist KIAA1273/TOB3 ein neuer Marker für Kopf- und Halskarzinome.

Gemäß eines zweiten Aspektes betrifft die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, die für eines oder mehrere der Proteine von Anspruch 1 kodiert.

Der Begriff "Nukleinsäuresequenz" betrifft ein Heteropolymer aus Nukleotiden oder die Sequenz dieser Nukleotide. Die Begriffe "Nukleinsäure" und "Polynukleotid" werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Heteropolymer von Nukleotiden.

Der Begriff „isoliert" wie hierin in Bezug auf Nukleinsäuren verwendet betrifft eine natürlich vorkommende Nukleinsäure, die mit den beiden Sequenzen, von denen sie (eine am 5'Ende und eine am 3'Ende) im natürlich vorkommenden Genom des Organismus, aus dem sie gewonnen wird, umgeben ist, nicht unmittelbar benachbart ist.

Beispielsweise kann eine isolierte Nukleinsäure ohne Einschränkung ein rekombinantes DNA-Molekül irgendeiner Länge sein, vorausgesetzt, dass die Nukleinsäuresequenzen, die normalerweise dieses rekombinante DNA-Molekül in einem natürlich vorkommenden Genom unmittelbar flankieren, entfernt sind oder fehlen. Somit schließt eine isolierte Nukleinsäure ohne Einschränkung eine rekombinante DNA ein, die als getrenntes Molekül existiert (beispielsweise eine cDNA oder ein genomisches DNA-Fragment erzeugt durch PCR oder Behandlung mit einer Restriktionsendonuklease) unabhängig von anderen Sequenzen, ebenso wie rekombinante DNA, die in einen Vektor, ein sich autonom replizierendes Plasmid, ein Virus (beispielsweise ein Retrovirus, Adenovirus oder Herpesvirus) oder in die genomische DNA eines Prokaryonten oder Eukaryonten eingebaut ist. Zusätzlich kann eine isolierte Nukleinsäure ein rekombinantes DNA-Molekül einschließen, das Teil eines Hybrids oder einer Fusions-Nukleinsäuresequenz ist.

Der Begriff „isoliert" schließt ebenfalls jede nicht-natürlich vorkommende Nukleinsäure ein, weil nicht-natürlich vorkommende Nukleinsäuresequenzen in der Natur nicht zu finden sind und in einem natürlich-vorkommenden Genom keine unmittelbar benachbarten Sequenzen aufweisen. Beispielsweise wird eine nicht-natürlich vorkommende Nukleinsäure wie beispielsweise eine gentechnisch erzeugte Nukleinsäure als eine isolierte Nukleinsäure angesehen. Eine gentechnisch erzeugte Nukleinsäure kann unter Verwendung herkömmlicher Klonierungstechniken oder chemischer Nukleinsäuresynthesetechniken hergestellt werden. Isolierte nicht-natürlich vorkommende Nukleinsäuren können von anderen Sequenzen unabhängig sein oder in einen Vektor, ein sich autonom replizierendes Plasmid, einen Virus (beispielsweise einen Retrovirus, Adenovirus oder Herpesvirus) oder in die genomische DNA eines Prokaryonten oder Eukaryonten eingebaut sein. Zusätzlich kann eine nicht-natürlich vorkommende Nukleinsäure ein Nukleinsäuremolekül einschließen, das Teil eines Hybrids oder einer Fusionsnukleinsäuresequenz ist.

Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung schließen ebenfalls ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, ein Polynukleotid, das an das Komplement der offenbarten Nukleotidsequenzen unter moderat stringenten oder stringenten Bedingungen hybridisiert; ein Polynukleotid, das eine Allel-Variante irgendeines oben beschriebenen Polynukleotids ist; ein Polynukleotid, das ein Spezies-Homolog irgendwelcher der hierin offenbarten Proteine kodiert; oder ein Polynukleotid, das ein Polypeptid kodiert, das eine zusätzliche spezifische Domäne oder eine Trunkierung bzw. Verkürzung der offenbarten Proteine aufweist.

Die Stringenz der Hybridisierung, wie hierin verwendet, betrifft Bedingungen, unter denen Polynukleotid-Doppelstränge stabil sind. Wie dem Fachmann bekannt ist, ist die Stabilität eines Doppelstranges eine Funktion der Natriumionenkonzentration und der Temperatur (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)). Die Stringenzniveaus, die zur Hybridisierung verwendet werden, können vom Fachmann leicht abgewandelt werden.

Der Begriff schwach stringente Hybridisierung bezeichnet Bedingungen, die einer Hybridisierung in 10% Formamid, 5 × Denharts Lösung, 6 × SSPE, 0,2% SDS bei 42°C, gefolgt von Waschen in 1 × SSPE, 0,2% SDS bei 50°C äquivalent sind. Denhart's Lösung und SSPE sind dem Fachmann genauso wie andere geeignete Hybridisierungspuffer wohl bekannt.

Eine moderat stringente Hybridisierung bedeutet Bedingungen, die es der DNA erlauben, an eine komplementäre Nukleinsäure zu binden, die ungefähr 60% Identität, vorzugsweise ungefähr 75% Identität, besonders bevorzugt ungefähr 85% Identität zu dieser DNA aufweist; wobei eine Identität von mehr als ungefähr 90% zu dieser DNA besonders bevorzugt wird. Moderat stringente Bedingungen sind vorzugsweise Bedingungen, die eine Hybridisierung in 50% Formamid, 5 × Denharts Lösung, 5 × SSPE, 0,2% SDS bei 42°C gefolgt von Waschen in 0,2 × SSPE, 0,2% SDS bei 65°C äquivalent sind.

Hochstringente Hybridisierung bedeutet Bedingungen, die die Hybridisierung nur von solchen Nukleinsäuresequenzen ermöglichen, die in 0,018 M NaCl bei 65°C stabile Doppelstränge bilden (d.h., wenn ein Doppelstrang in 0,018 M NaCl bei 65°C nicht stabil ist, ist er unter den hierin betrachteten hochstringenten Bedingungen nicht stabil).

Weiterhin können Nukleinsäure-Hybridisierungstechniken verwendet werden, um eine Nukleinsäure zu identifizieren und zu gewinnen, die im Umfang der vorliegenden Erfindung liegt. Kurz gesagt kann jede Nukleinsäure mit einer gewissen Homologie zu einer in dieser Erfindung dargelegten Sequenz oder einem Fragment hiervon, als Sonde zur Identifizierung einer ähnlichen Nukleinsäure durch Hybridisierung unter moderat stringenten bis hochstringenten Bedingungen verwendet werden. Solche ähnlichen Nukleinsäuren können dann isoliert, sequenziert und analysiert werden, um zu bestimmen, ob sie im Umfang der wie hierin beschriebenen Erfindung liegen.

Die Erfindung betrifft auch ein immunogenes Antigen, das von einer wie oben definierten Nukleinsäure kodiert wird.

Gemäß eines dritten Aspektes umfasst die Erfindung Vektoren, die eine oder mehrere der wie oben definierten Nukleinsäuren umfassen.

Bevorzugt handelt es sich hierbei um einen Expressionsvektor, der eine oder mehrere der Nukleinsäuresequenzen wie hierin oben definiert und eine oder mehrere regulatorische Sequenzen umfasst. Dieser Expressionsvektor umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Regulationssequenzen. Der Begriff "Expressionsvektor" betrifft im Allgemeinen ein Plasmid oder einen Phagen oder ein Virus oder einen Vektor zum Exprimieren eines Polypeptids aus einer DNA (RNA) Sequenz. Ein Expressionsvektor kann eine Transkriptionseinheit umfassen, die eine Anordnung des Folgenden aufweist: (1) ein genetisches Element oder Elemente mit einer regulatorischen Rolle in der Genexpression, beispielsweise Promotoren und/oder Enhancer, (2) eine Struktursequenz oder kodierende Sequenz, die in mRNA transkribiert und in ein Protein translatiert wird und (3) geeignete Transkriptionsstart- und -terminationssequenzen. Struktureinheiten, die zur Verwendung in Hefen oder eukaryontischen Expressionssystemen vorgesehen sind, schließen vorzugsweise eine Leadersequenz ein, die die extrazelluläre Sekretion eines translatierten Proteins durch einen Wirt ermöglicht. Ein rekombinantes Protein kann alternativ, wenn es ohne eine Leader- oder Transportsequenz exprimiert wird, einen N-terminalen Methionin-Rest einschließen. Dieser Rest kann oder kann nicht anschließend von dem exprimierten rekombinanten Protein abgespalten werden, um das Endprodukt bereitzustellen.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Wirte, beispielsweise Wirtszellen bereit, die so transformiert wurden, dass sie die erfindungsgemäßen Polynukleotide enthalten. Der Begriff „Transformation" bzw. „Transformierung" bedeutet die Einführung von DNA in eine geeignete Wirtszelle, so dass die DNA replizierbar ist, entweder als extrachromosomales Element oder durch Chromosomenintegration in Abhängigkeit des verwendeten Expressionsvektors.

Beispielsweise können solche Wirtszellen Nukleinsäuren der Erfindung, eingeführt in die Wirtszelle unter Verwendung bekannter Transformationsverfahren, stabil oder transient enthalten. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Wirtszellen bereit, die gentechnisch verändert wurden, so dass sie die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung exprimieren, wobei sich solche Polynukleotide in funktioneller Verbindung mit einer Regulationssequenz befinden, die für die Wirtszelle heterolog ist, und die die Expression der Polynukleotide in der Zelle steuert.

Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Wirtszelle, wie beispielsweise eine Pflanzenzelle, eine Säugetierzelle oder eine niedere eukaryontische Wirtszelle, wie beispielsweise eine Hefezelle sein oder kann eine Insektenzelle sein, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle sein, beispielsweise ein Bakterium sein. Die Einführung des rekombinanten Konstruktes in die Wirtszelle kann durch Kalziumphosphattransfektion, die DEAE, Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation bewirkt werden (Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)).

Die am meisten bevorzugten Zellen sind solche, die das spezielle Protein normalerweise nicht exprimieren oder die das Protein auf einem niedrigen endogenen Niveau bzw. Konzentration exprimieren. Die erfindungsgemäßen Proteine können in Säugetierzellen, Hefen, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle geeigneter Promotoren exprimiert werden. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit prokaryontischen und eukaryontischen Wirten und die entsprechenden Verfahren sind bei Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor, New York (1989) beschrieben.

Die Säugetierzelle ist bevorzugt eine CHO, COS, HeLa, 293T, HEH oder BHK-Zelle.

Bakterielle Zellen umfassen Streptokokken, Staphylokokken, E. coli, Streptomyces und Bacillus subtilis -Zellen. E. coli und Bacillus subtilis werden bevorzugt. Ebenfalls können Pilzzellen verwendet werden, wie beispielsweise Hefezellen (von Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia) und Aspergilluszellen. Als Insektenzellen werden Drosophila S2 und Spodoptera Sf9 Zellen bevorzugt. Als Pflanzenzellen können Zellen von N. tabacum oder Arabidopsis thaliana verwendet werden.

Gemäß eines vierten Aspektes stellt die vorliegende Erfindung einen Antikörper oder Aptamer bereit, die gegen ein oder mehrere Epitope eines Proteins nach Anspruch 1 gerichtet sind.

Der Begriff „Antikörper", wie er hierin verwendet wird betrifft intakte Antikörper ebenso wie Antikörperfragmente, die eine gewisse Fähigkeit beibehalten, selektiv an ein Epitop zu binden. Derartige Fragmente schließen ohne Einschränkung Fab, F(ab')₂, rekombinante „single chain" Antikörper und Fv Antikörperfragmente ein. Der Begriff „Epitop" betrifft jede Antigendeterminante auf einem Antigen, an die das Paratop eines Antikörpers bindet. Epitop-Determinanten bestehen üblicherweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppen von Molekülen (beispielsweise Aminosäure- oder Zuckerreste) und weisen üblicherweise dreidimensionale strukturelle Eigenschaften ebenso wie spezielle Ladungseigenschaften auf.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können unter Verwendung irgend eines bekannten Verfahrens hergestellt werden. Beispielsweise kann das reine erfindungsgemäße Protein oder ein Bruchstück hiervon bereit gestellt und als Immunogen verwendet werden, um in einem Tier eine solche Immunreaktion hervorzurufen, dass spezifische Antikörper erzeugt werden.

Die Herstellung polyklonaler Antikörper ist dem Fachmann gut bekannt. Siehe beispielsweise Green et al, Production of Polyclonal Antisera, in Immunochemical Protocols (Manson, Herausgeber), Seiten 1 – 5 (Humana Press 1992) und Coligan et al, Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters, in Current Protocols In Immunology, Abschnitt 2.4.1 (1992). Zusätzlich sind dem Fachmann verschiedene Techniken der Immunologie zur Aufreinigung und Konzentration von polyklonalen Antikörpern bekannt, ebenso wie von monoklonalen Antikörper (Coligan et al, Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994).

Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern ist dem Fachmann ebenfalls vertraut. Siehe beispielsweise Köhler & Milstein, Nature 256: 495 (1975); Coligan et al., Abschnitte 2.5.1–2.6.7; und Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Seite 726 (Cold Spring Harbor Pub. 1988). Kurz gesagt können monoklonale Antikörper gewonnen werden, indem Mäusen eine Zusammensetzung die das erfindungsgemäße Protein einschließt injiziert wird, danach das Vorliegen einer Antikörperproduktion durch Untersuchung einer Serumprobe verifiziert wird, die Milz zur Gewinnung von B-Lymphozyten entfernt und die B-Lymphozyten mit Myelomazellen zur Erzeugung von Hybridomas fusioniert werden, die Hybridomas geklont werden, die positiven Klone, die einen monoklonalen Antikörper gegen das Protein erzeugen, selektiert werden und die Antikörper aus den Hybridoma-Kulturen isoliert werden. Monoklonale Antikörper können aus Hybridoma-Kulturen durch eine Vielzahl von wohl etablierten Techniken isoliert und aufgereinigt werden. Derartige Isolierungstechniken schließen eine Affinitätschromatographie mit Protein-A oder G-Sepharose, Größenausschluss-chromatographie und Ionenaustauschchromatographie ein. Siehe beispielsweise Coligan et al., Abschnitte 2.7.1–2.7.12 und Abschnitt „Immunglobulin G (IgG)", in Methods In Molecular Biology, Band 10, Seiten 79–104 (Humana Press 1992).

Der Begriff „Antikörper" im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass der jeweilige Antikörper aufgrund seiner Antigen-Spezifität eine im Rahmen der Behandlung der jeweiligen Erkrankung erwünschte Stimulation des Immunsystems des Patienten hervorruft oder unterstützt.

Insbesondere sind immunstimulierende Antikörper im Sinne der vorliegenden Erfindung solche, die eine T-Zell-Aktivierung hervorrufen. Besonders ist dabei eine Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen (CTL, engl. "cytotoxic T lymphocytes", sogenannte T-Killerzellen) vorteilhaft.

Der Begriff "Antikörper" umfasst i. S. der vorliegenden Erfindung sowohl polyklonale Antikörper als auch monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper (single chain antibodies), humanisierte Antikörper, die alle in gebundener oder löslicher Form vorliegen können sowie auch Fragmente der vorgenannten Antikörper. Neben den Fragmenten von erfindungsgemäßen Antikörpern in Alleinstellung können erfindungsgemäße Antikörper auch in rekombinanter Form als Fusionsproteine mit anderen (Protein)-Bestandteilen auftreten. Fragmente als solche oder Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern als Bestandteile von Fusionsproteinen werden typischerweise durch die Methoden enzymatischer Spaltung, der Protein-Synthese oder die dem Fachmann geläufigen Rekombinations-Methoden hergestellt. Als Antikörper werden nach der vorliegenden Erfindung also sowohl polyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper oder Fragmente davon, single chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper bezeichnet.

Bei den polyklonalen Antikörpern handelt es sich um heterogene Mischungen von Antikörpermolekülen, die aus Seren von Tieren hergestellt werden, die mit einem Antigen immunisiert worden sind. Zum Gegenstand der Erfindung gehören aber auch polyklonale monospezifische Antikörper, die nach Aufreinigung der Antikörper (bspw. über eine Säule, die mit Peptiden eines spezifischen Epitops beladen sind) erhalten werden. Ein monoklonaler Antikörper enthält eine im wesentlichen homogene Population von Antikörpern, die spezifisch gegen Antigene gerichtet sind, wobei die Antikörper im wesentlichen gleiche Epitop-Bindungsstellen aufweisen. Monoklonale Antikörper können – wie oben angesprochen – durch die im Stand der Technik bekannten Verfahren erhalten werden (z. B. Köhler und Milstein, Nature, 256, 495–397, (1975); US-Patent 4,376,110; Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring, Harbor Laboratory (1988); Ausubel et al., (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Die in den vorgenannten Literaturstellen enthaltene Beschreibung wird durch diese Bezugnahme in die Offenbarung der vorliegenden Erfindung einbezogen.

Auch lassen sich gentechnisch manipulierte erfindungsgemäße Antikörper nach Verfahren, wie in den vorgenannten Druckschriften beschrieben, herstellen. Kurz gesagt, werden dazu Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zellyse mit Guanidiniumthiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopropanol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannter Weise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Reversen Transkriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die synthetisierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation beispielsweise durch "site directed mutagenesis", Einführung von Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustausche in geeignete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren insertiert und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimieri werden. Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe-Vektoren, wie pBR322, pUC18/19, pACYC1S4, Lambda oder Hefe-mu-Vektoren zur Klonierung der Gene und die Expression in Bakterien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisiae.

Erfindungsgemäße Antikörper können einer der folgenden Immunglobulin-Klassen angehören: IgG, IgM IgE, IgA und ggf. einer Unterklasse der vorgenannten Klassen, wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen, wie beispielsweise IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 oder IgGM. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgG1/k oder IgG2b/k. Ein Hybridom-Zellklon, der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper produziert, kann in vitro, in situ oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung von großen Titern an monoklonalen Antikörpern erfolgt vorzugsweise in vivo oder in situ.

Bei den erfindungsgemäßen chimären Antikörpern handelt es sich um Moleküle, die verschiedene Bestandteile enthalten, wobei diese sich aus verschiedenen Tierarten ableiten (z. B. Antikörper, die eine variable Region, die aus einem Mäuse-monoklonalen Antikörper abgeleitet ist und eine konstante Region eines humanen Immunglobulins aufweisen). Chimäre Antikörper werden vorzugsweise eingesetzt, um einerseits die Immunogenizität bei der Anwendung zu reduzieren und andererseits die Ausbeuten bei der Produktion zu erhöhen, z. B. ergeben murine monoklonale Antikörper höhere Ausbeuten aus Hybridom-Zellinien, führen aber auch zu einer höheren Immunogenizität beim Menschen, sodass human/murine chimäre bzw. vollständig humanisierte Antikörper vorzugsweise eingesetzt werden. Noch mehr bevorzugt ist ein monoklonaler Antikörper, der die hypervariablen, Komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR, engl. "complementarity defining region") eines murinen monoklonalen Antikörpers mit den übrigen Bereichen eines humanen Antikörpers in sich vereinigt. Ein derartiger Antikörper wird humanisierter Antikörper genannt. Chimäre Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus dem Stand der Technik bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Sci. USA 81: 3273–3277 (1984); Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 6851–6855 (1984); Boulianne et al. Nature 312: 643–646 (1984); Cabilly et al., EP-A-125023; Neuberger et al., Nature 314: 268–270 (1985); Taniguchi et al., EP-A-171496; Morrion et al., EP-A-173494; Neuberger et al., WO 86/01533; Kudo et aL, EP-A-184187; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066–1074 (1986); Robinson et al., WO 87/02671; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 84: 3439–3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci UA 84: 214218 (1987); Better et al., Science 240: 1041–1043 (1988) und Harlow und Line, Antibodies: A Laboratory Manual, supra. Diese Literaturstellen sind durch Bezugnahme hierin mit aufgenommen.

Die Bezeichnung "Antikörper" soll sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente derselben einschließen. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei Antigen-komplementären Bindungsstellen, wie Antikörperteile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle, wie Fv-, Fab- oder F(ab')2-Fragmente oder Einzelstrangfragmente, genannt (s.o.). Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente, wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂, Fab und F(ab')₂,-Fragmente entbehren eines Fc-Fragments, wie etwa in einem intakten Antikörper vorhanden, sodass sie im Blutkreislauf schneller transportiert werden können und vergleichsweise weniger nichtspezifische Gewebsbindung als intakte Antikörper aufweisen. Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung hergestellt, indem Enzyme, wie z. B. Papain (zur Herstellung von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab')₂, Fragmenten) verwendet werden oder durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden.

Derartige Antikörper können beispielsweise zur Behandlung von Krebszellen oder von mit einem pathogenen Erreger befallenen Zellen verwendet werden, indem diese gegen eine Oberflächendeterminante einer Tumorzelle oder eines Erregers gerichtet werden und gemäß einer bevorzugten Ausführungsform an den Antikörper ein Toxin, beispielsweise Ricin oder Pseudomonas-Toxine, gekoppelt werden; zusammenfassend dargestellt z. B. in Valera (1994) Blood 83: 309 bis 317; Vitetta et al. (1993) Immunol. Today 14: 252 bis 259. Immunstimulierende Antikörper im Sinne der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt. Besonders bevorzugte immunstimulatorische Antikörper sind mehrfach spezifisch, insbesondere bispezifisch, und/oder mehrfach-, insbesondere trifunktionell. Insbesondere bei bispezifischen Antikörpern sind rekombinante Antikörpermoleküle zu nennen, die durch rekombinante Techniken hergestellt werden, beispielsweise scFv-Moleküle (sog. "single chain antibodies"), Diabodies usw. Der grundsätzliche Aufbau bispezifischer Antikörper und Immunkonjugate ist beispielsweise in van Spriel et al. (2000) Immunol. Today 21: 391–397, dargestellt. Bispezifische Antikörper können selbstverständlich auch durch bekannte Hybridom-Techniken hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung multivalenter und bispezifischer Antikörper-Fragmente sind einem Fachmann bekannt und z.B. in Tomlinson und Holliger (2000) Meth. Enzymol. 326: 461 ff., beschrieben. Ein besonders bevorzugtes Beispiel eines bispezifischen Antikörpers ist ein trifunktioneller bispezifischer Antikörper, an dessen Fc-Teil, das heißt, der Teil des Antikörpers, der nicht direkt an der Antigenbindung beteiligt ist, akzessorische Immunzellen binden können (s. Zeidler et al.: British Journal of Cancer 2000, Journal of Immunology 1999).

Hinsichtlich der Art und Weise der Verabreichung des erfindungsgemäßen Antikörpers bestehen keinerlei Einschränkungen. Daher kann der Antikörper intraperitoneal, systemisch (intravenös oder intraarteriell, intramuskulär, intradermal, subkutan, intratumoral) oder aber auch selektiv in bzw. über ein definiertes Organ verabreicht werden. Als Beispiel einer selektiven Applikation in ein oder über ein Organ kann die Verabreichung über das Knochenmark (als immunologisches Organ) oder über einen superselektiven Katheter in ein das jeweilige Organ versorgendes Gefäß (Arterie) bzw. die direkt intratumoral Applikation genannt werden. Ein spezifisches Beispiel einer derartigen Applikation mittels Katheter kann diejenige in die A. hepatica zur selektiven Applikation in die Leber bzw. zur systemischen Verabreichung nach Durchlaufen des Organs angegeben werden. Weitere Beispiele der organspezifischen Applikation sind diejenigen in die Leber über die Pfortader, in die Niere über die Nierenarterie, intrathekale Applikation bei cerebralen Tumoren, in den Colon-Bereich über Mesentarialgefäße, in den Pankreas über den Truncus coeliacus und die A. mesenteria superior und in Tumoren an Gliedmaßen über die entsprechenden Arterien. Des weiteren kann auch eine direkte Applikation in einen Tumor erfolgen.

Dem gemäß wird erfindungsgemäß auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die mindestens einen wie vorstehend definierten Antikörper gemäß obiger Definition umfasst. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eignet sich insbesondere zur Behandlung der vorstehend aufgeführten Erkrankungen. Gegebenenfalls liegen die pharmakologisch wirksamen Bestandteile der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in Verbindung mit einem oder mehreren Trägern und/oder Hilfsstoffen vor, wie nachstehend genauer dargelegt wird.

In der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung bzw. bei der erfindungsgemäßen Verwendung wird der Antikörper vorteilhafterweise in geeigneten Formulierungen bereitgestellt. Derartige Formulierungen sind einem Fachmann bekannt und enthalten neben den therapeutisch bzw. immunstimulatorisch wirkenden Substanzen einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder pharmazeutisch verträgliche Vehikel. Entsprechende Wege zur geeigneten Formulierung und Herstellung derartiger Formulierungen sind beispielsweise bei "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980) offenbart, das vollinhaltlich Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung ist. Für die parenterale Verabreichung kommen als Trägerstoffe beispielsweise steriles Wasser, sterile Kochsalzlösung, Polyalkylenglykole, hydrierte Naphthalene und insbesondere biokompatible Lactidpolymere, Lactid/Glykolidcopolymere oder Polyoxyethylen-/Polyoxypropylencopolymere in Betracht. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen können Füllsubstanzen oder Substanzen, wie Laktose, Manitol, Substanzen zur kovalenten Anknüpfung von Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol an erfindungsgemäße immunstimulatorische Antikörper, Komplexierung mit Metallionen oder Einschluss von Materialen in oder auf besondere Präparationen von Polymerverbindungen, wie z.B. Polylaktat, Polyglykolsäure, Hydrogel oder auf Liposomen, Mikroemulsionen, Mizellen, unilamerare oder multilamelare Vehikel, Erythrozyten-Fragmente oder Spheroblasten, enthalten. Die jeweiligen Ausführungsformen der pharmazeutischen Zusammensetzungen werden abhängig vom physikalischen Verhalten, beispielsweise in Hinblick auf die Löslichkeit, die Stabilität, Bioverfügbarkeit oder Abbaubarkeit gewählt. Kontrollierte oder konstante Freisetzung der erfindungsgemäßen Wirkstoffkomponenten schließt die Formulierung auf Basis lipophiler Depots ein (z.B. Fettsäuren, Wachse oder Öle). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden auch Beschichtungen erfindungsgemäßer pharmazeutischer Zusammensetzungen bzw. Arzneimittel, enthaltend die therapeutisch wirksamen Substanzen, nämlich Beschichtungen mit Polymeren offenbart (z.B. Polyoxamere oder Polyoxamine). Weiterhin können erfindungsgemäße therapeutisch wirksame Substanzen oder Zusammensetzungen protektive Beschichtungen, z.B. Protease-Inhibitoren oder Permeabilitäts-Verstärker, aufweisen. Bevorzugte Träger sind typischerweise wässrige Trägermaterialien, wobei Wasser zur Injektion (WFI) oder Wasser, gepuffert mit Phosphat, Zitrat, HEPES oder Acetat usw. verwendet wird und der pH typischerweise auf 5,0 bis 8,0 (vorzugsweise 6,5 bis 7,5) eingestellt wird. Der Träger bzw. das Vehikel wird zusätzlich vorzugsweise Salzbestandteile enthalten, z.B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder andere Komponenten, welche die Lösung bspw. isotonisch machen. Weiterhin kann der Träger bzw. das Vehikel neben den vorstehend genannten Bestandteilen zusätzliche Komponenten, wie humanes Serumalbumin (HSA), Polysorbat 80, Zucker oder Aminosäuren usw., enthalten.

Die Art und Weise der Verabreichung und die Dosierung des erfindungsgemäßen Arzneimittels bzw. der pharmazeutischen Zusammensetzungen hängen von der Art der zu bekämpfenden Erkrankung, ggf. deren Stadium, dem anzusteuernden Antigen wie auch dem Körpergewicht, dem Alter und dem Geschlecht des Patienten ab.

Die Konzentration der wirksamen Komponenten in den erfindungsgemäßen Formulierungen kann innerhalb eines weiten Bereichs variiert werden. Erfindungsgemäße Dosen des Antikörpers schwanken im Bereich von etwa 1 μg bis etwa 10 mg.

Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann alternativ zum oben erwähnten Antikörper ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Proteine, eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, einen wie oben definierten Vektor, eine wie unten definierte APC oder T-Zelle und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.

Gemäß eines fünften Aspektes betrifft die vorliegende Erfindung eine Hybridoma, die einen monoklonalen Antikörper produziert, der eine Bindungsspezifität für ein Protein nach Anspruch 1 aufweist.

Gemäß eines sechsten Aspektes umfasst die Erfindung ein ex vivo-Verfahren zur Erzeugung einer Population autologer oder allogener Antigen präsentierender Zellen (APCs), die zum Induzieren einer effektiven Immunreaktion gegen ein erfindungsgemäßes Protein in der Lage sind, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellen von autologen oder allogenen APCs;
b) In-Berührung-Bringen der APCs mit einer wirksamen Menge eines Peptidfragmentes eines erfindungsgemäßen Proteins unter Bedingungen, die eine Endozytose, Prozessierung und -Präsentation der Peptidfragmente durch diese APCs ermöglichen, und
c) Isolieren der die entsprechenden Peptide präsentierenden APCs.

Alternativ umfasst ein ex vivo-Verfahren zur Herstellung gentechnisch erzeugter APCs, die zum Induzieren einer wirksamen Immunreaktion gegen ein erfindungsgemäßes Protein in der Lage sind, die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen einer Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes Protein oder Peptidfragment hiervon kodiert,
b) Transfizieren der APCs mit der Nukleinsäure und
c) Auswählen von APCs, die die Peptidfragmente präsentieren.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleinsäure in Schritt a) in einem Expressionsvektor bereitgestellt.

Gemäß einem siebten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Antigen präsentierende Zelle (APC), die nach einem der oben genannten Verfahren gewinnbar ist.

Gemäß einer Ausführungsform ist diese APC eine dendritische Zelle oder eine B-Zelle.

Ein achter Aspekt der Erfindung betrifft ein ex vivo Verfahren zum Nachweis und zur Gewinnung von T-Zellen, die für ein erfindungsgemäßes Protein spezifisch sind, das die folgenden Schritt umfasst:

a) Bereitstellen von Säugetier-, insbesondere humanen, T-Zellen oder PBMC's,
b) Co-Kultivieren der Zellen mit einer APC gemäß des siebten Aspektes der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die eine Aktivierung von T-Zellen ermöglichen, und
c) Bestimmen des Vorliegens einer spezifischen Aktivität der T-Zellen gegen eine solche APC, und
d) wahlweise Selektion und Kultivierung/Expansion solcher T-Zellen, die in Schritt c) eine Spezifität für eine solche, oben definierte APC zeigten.

Der Begriff Aktivierung wie hierin verwendet ist als Stimulierung von T-Zellen definiert. Der Cokultivierungsschritt, der in b) durchgeführt wird, ist notwendig, um spezifische T-Zellen zu aktivieren und damit selektieren. Dies kann beispielsweise durch direkte Aufbringung der Proteine der vorliegenden Erfindung auf eine Probe, bevorzugt eine Blutprobe, die vom Patienten gewonnen wurde, durchgeführt werden. So können mononukleäre Periphärblutzellen (peripheral blood mononuclear cells = PBMC), die die T-Zellen enthalten und die einfach aus Patientenblutproben hergestellt werden können, APC's (beispielsweise B-Zellen) bereitstellen, die durch die erfindungsgemäßen Peptide gepulst werden.

Alternativ können die gepulsten APC's getrennt hergestellt werden, bevor sie in Schritt b) angewendet werden, und zwar einfach indem APC's, vorzugsweise autologe APC's, mit den erfindungsgemäßen Proteinen gemäß in der Technik bekannter Verfahren gepulst und dann die Probe mit den APC's cokultiviert wird. Diese APC's sind vorzugsweise so ausgewählt, dass sie das geeignete MHC Klasse I-Molekül exprimieren.

Die T-Zellen, deren Aktivität durch das erfindungsgemäße Verfahren bestimmt werden kann, sind vorzugsweise zytotoxische T-Zellen, besonders bevorzugt CD8+ T-Zellen.

Die Aktivität der T-Zellen im obigen Schritt c) kann durch Verfahren bestimmt werden, die per se in der Technik bekannt sind. Weitere Informationen sind beispielsweise in Immunology, 5. Ausgabe, 2001, zu finden.

Gemäß einer Ausführungsform kann diese Bestimmung mittels eines ⁵¹Cr-Freisetzungs-Assays durchgeführt werden. Insbesondere kann die T-Zellfunktion durch ein ⁵¹Cr-Freisetzungs-Assay unter Verwendung eines T-Zell-Bioassays bestimmt werden, der auf dem Abtöten einer Zielzelle durch eine zytotoxische T-Zelle basiert. Dieser Assay basiert auf der Aufnahme von radioaktiv markiertem Natriumchromat, Na₂ ⁵¹CrO₄, durch lebende Zellen, die dieses Natriumchromat nicht wieder spontan freisetzen. Wenn diese markierten Zellen getötet werden, wird das radioaktive Chromat freigesetzt und seine Gegenwart im Überstand der Gemische aus Zielzellen und zytotoxischen T-Zellen kann gemessen werden. Ein Beispiel von Zielzellen sind T2-Zellen, die mit einem oder mehreren der erfindungsgemäßen Proteinen gepulst wurden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bestimmung in Schritt c) durch Messen der Menge der Zytokine in den T-Zellen durchgeführt. Zu diesem Zweck können die nachfolgenden Verfahren verwendet werden:
Zunächst können die Zytokine durch intrazelluläres Zytokin-Staining bzw. -Färben gemessen werden.

Der Ansatz des intrazellulären Zytokin-Färbens beruht auf der Verwendung von Stoffwechselgiften, die den Proteinexport aus der Zelle hemmen. Dann akkumuliert das Zytokin innerhalb des endoplasmatischen Retikulums und des vesikulären Netzwerks der Zelle. Wenn die Zellen anschließend fixiert und durch Verwendung milder Tenside permeabel gemacht werden, können Antikörper Zugang zu diesen intrazellulären Kompartimenten erlangen und sind dazu in der Lage, das Zytokin nachzuweisen.

Alternativ werden die Zytokine extrazellulär durch einen ELISPOT-Assay gemessen. Der ELISPOT-Assay ist eine Modifikation eines ELISA-Antigen-Einfang-Assays. Er stellt einen exzellenten Ansatz zur Messung der Häufigkeit von T-Zell-Reaktionen dar. Populationen von T-Zellen werden mit dem interessierenden Antigen stimuliert und man lässt sie dann sich auf Kunststoffplatten absetzen, die mit Antikörpern beschichtet sind und die gegen das zu untersuchende Zytokin gerichtet sind. Alle von der T-Zelle sezernierten Zytokine werden durch den Antikörper auf dieser Kunststoffplatte eingefangen. Nach einer definierten Zeitspanne werden die Zellen entfernt und ein zweiter Antikörper für das Zytokin wird der Platte zugesetzt, so dass sich ein Kreis von gebundenem Zytokin zeigt, der die Position jeder aktivierten T-Zelle umgibt, wobei jeder Fleck gezählt wird und die Kenntnis der Anzahl der T-Zellen, die der Platte ursprünglich zugesetzt wurden, eine einfache Berechnung der Häufigkeit von T-Zellen ermöglicht, die das spezielle Zytokin sezernieren.

Das Verfahren zur Generierung spezifischer T-Zellinien ist ausführlich bei Moosmann et al., B cells immortalized by a mini-Epstein-Barr virus encoding a foreign antigen efficiently reactivate specific cytotoxic T cells, Blood, 1. September 2002, Vol. 100, Nr. 5, beschrieben.

Gemäß eines achten Aspektes betrifft die Erfindung T-Zellen, die durch das oben erklärte Verfahren gewinnbar sind.

Bei einem neunten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine diagnostische Zusammensetzung, die ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Proteine, einen wie oben definierten Antikörper oder eine erfindungsgemäße T-Zelle, umfasst.

Diese Zusammensetzung kann beispielsweise in From eines Test-Kits angeboten werden, mit dem z.B. über den erfindungsgemäßen Antikörper die entsprechenden Tumorantigene in einer Probe (z.B. Biopsie) nachgewiesen werden, oder mit dem über die erfindungsgemäßen Tumorantigene die Autoantikörper eines zu untersuchenden Patienten nachgewiesen werden, oder die gegen ein erfindungsgemäßes Antigen gerichteten T-Zellen z.B. mit Hilfe spezifischer Tetramere bestimmt werden.

Gemäß eines zehnten Aspektes betrifft die Erfindung die Verwendung der oben genannten Zusammensetzungen in Diagnose oder Therapie eines Plattenepithelkarzinoms, insbesondere eines Plattenepithelkarzinoms im HNO-Bereich, z.B. des Kopf-Hals-Bereichs.

Soweit nichts anderes angegeben ist, weisen alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe die hierin verwendet werden die Bedeutung auf, die ihnen üblicherweise vom Fachmann auf dem Gebiet zugeordnet werden. Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und andere Referenzen, die hierin erwähnt wurden, sind durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit aufgenommen. Im Falle eines Konfliktes entscheidet die vorliegende Beschreibung einschließlich der Definitionen. Zusätzlich sind die Materialien und Verfahren und Beispiele nur veranschaulichend und sollen nicht als einschränkend aufgefasst werden.

Die Erfindung wird nunmehr durch Beispiele und die begleitenden Abbildungen veranschaulicht, die Folgendes darstellen:

1: Prinzip der autologen Version von AMIDA. Durch den Schritt der Immunpräzipitierung werden ausschließlich solche Proteine isoliert, gegen die in Seren von Tumorpatienten und Nicht-Tumorpatienten Autoantikörper vorhanden sind. Autoantikörper, die nur in Seren von Patienten vorhanden sind, können zum Nachweis einer Tumorerkrankung verwendet werden. Bei der allogenen Version wird das Zelllysat aus einer etablierten Tumorzelllinie gewonnen. Verglichen werden dann allogene Seren von Tumorpatienten mit solchen von Nicht-Tumorpatienten.
2: CK8-spezifische Antikörper sind im Blut der meisten Tumorpatienten (orange) gegenüber Nicht-Tumorpatienten (grün) signifikant erhöht. Quantifiziert in einem modifizierten ELISA-System (und berechnet als 'relative Lichteinheiten') ergibt sich eine Sensitivität des Tests von 83,3% und eine Spezifität von 89,5%.
3: KIAA1937 wird in allen untersuchten Karzinomen des Kopf-Halsbereichs (T232–T246) exprimiert. Dem gegenüber ist eine Expression in fast allen gesunden Kontrollgewebe (N1, N2, N4–9) nicht nachweisbar. GHD-1 ist die Karzinomzelllinie die zur Identifizierung von KIAA1937 als Tumorantigen diente. Sie entstand aus einem Hypopharynxkarzinom und wurde im Labor der Erfinder etabliert.
4: KIAA1273/TOB3 mRNA Expression in gesunder Schleimhaut und in Karzinomen. Kryosektionen gesunder Schleimhaut (a and b) und Karzinomproben (c–h) wurden durch in situ Hybridisierung unter Verwendung einer markierten KIAA1273/TOB3/AAA-ATPase KIAA1273/TOB3 komplementären anti-Sense RNA (AAA-ATPase KIAA1273/TOB3 AS) und als Kontrolle einer markierten KIAA1273/TOB3/AAA-ATPase KIAA1273/TOB3 Sense RNA (AAA-ATPase KIAA1273/TOB3 S) durchgeführt. Gesunde Schleimhaut färbte schwach mit der komplementären RNA in Zellen der Basalmembranschicht, wohingegen Karzinomzellen eine starke und spezifische Färbung zeigten.
Identifizierung tumorassoziierter Antigene unter Verwendung von AMIDA
Seren von Patienten, die unter einem Plattenepithelkarzinom der oberen Luft- und Speisewege leiden, wurden zusammen mit Proben der autologen Tumoren gesammelt und einem AMIDA-Screeningverfahren unterworfen, wie in 1 schematisch dargestellt ist. Krebszellbiopsien wurden zu Einzell-Suspensionen verarbeitet und eine definierte Zellzahl wurde lysiert, um Rohprotein-Zubereitungen oder Membran-assoziierte Protein-Fraktionen zu erhalten. Potentielle Tumor-assoziierte Antigene (TAAs) wurden durch Immunpräzipitationen (IP) mit immobilisierten autologen Serumantikörpern über Nacht gewonnen und durch 2DE, wie in den experimentellen Verfahren der oben genannten PCT-Anmeldung beschrieben (WO 03/025568), aufgetrennt. Als Kontrolle wurden autologe Leukozyten als Protein-Referenz parallel mit dem Tumormaterial verarbeitet. Serumantikörper, die an Sepharose A-Kügelchen gekoppelt waren, wurden desgleichen verarbeitet und dienten als zweite Negativkontrolle. Zusätzlich wurde ein AMIDA „Screen" allogen durchgeführt. Dazu dienten zwei etablierte HNO-Karzinomzelllinien als Proteinquelle. Die Proteine wurden mit immoblisierten Antikörper gemäß der allogenen AMIDA Variante (s.o.) immunpräzipitiert und in einer 2DE aufgetrennt. Als Kontrolle wurden die Proteine ebenfalls mit gepoolten IgGs 100 gesunder Spender immunpräzipitiert. Eine Analyse von 2DE Proteinmustern und die Unterscheidung unterschiedlicher Proteinspots wurde mit der Imagemaster 2DE Software (1 und 2) durchgeführt. Tumor-IP-spezifische Proteinspots wurden ausgeschnitten, einem in-Gel tryptischen Verdau unterworfen und die sich ergebenen Peptide durch MALDI-TOF Massenspektrometrie untersucht. Insgesamt sechs Plattenepithelkarzinome der oberen Luft- und Speisewege wurden unabhängig voneinander in einem autologen AMIDA Verfahren untersucht, und die IgGs von 8 Karzinompatienten in einem allogenen AMIDA Verfahren gegen zwei Tumorzelllinien getestet. Die Kombination beider Variationen des AMIDA Verfahrens erlaubte die Identifizierung von 27 potentiellen Tumor-assozierten Antigenen (siehe Tabelle 1).
In situ hybridisation- Gefrorene Gewebsschnitte (5 μm) wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert und in PBS gewaschen, in Ethanol dehydratisiert bzw. dehydriert und bei –70°C aufbewahrt. Nach dem Auftauen, einer Inaktivierung endogener alkalischer Phosphatase mit HCl (0.2 N), und Verdau mit Proteinase K (10 μg/mL), wurden die Objektträger mit 0.1 M Glycin/0.05 M PBS und 4 % Paraformaldehyd bei RT behandelt. Waschschritte mit PBS wurden zwischen jeder Behandlung durchgeführt. Darauf wurden Schnitte mit 0.1 M Triethanolamin/0.25 % Essigsäureanhydrid permeabilisiert, mit 2 × SSC gewaschen und in Prähybridisierungspuffer (5 h, RT, 50% deioniziertes Formamid, 4 × SSC, 5 × Denhardt's, 25 μg/ml Lachssamen DNA, 0.1 % SDS, 50 μg/ml t-RNA, 5 % Dextransulfat) inkubiert. KIAA1273/TOB3 cDNA wurde durch PCR unter Verwendung des Vorwärts-Primers 5'-CGATGGTACCGATCCTGGGTGCAGATGCAGCTGGAAG-3' und des Rückwärts-Primers 5'-ATCGCTCGAGCTACAACAGGGGGTGCCCTGGGGG-3' mit dem RZPD Klon IRALp96201117 als Matrize amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in den pDrive Vektor (Qiagen, Hilden, Germany) kloniert. pDrive-KIAA1273/TOB3 wurde durch BamHI oder alternativ HindIII Digestion für eine in vitro Transkription linerarisiert, um Sense- und Antisense-DIG-markierte RNA-Sonden zu erzeugen, unter Verwendung des DIG RNA Labeling Kit (Roche, Mannheim, Germany), einschließlich der T7 and SP6 RNA Polymerasen. Die sich ergebenden Sonden wurden in Prähybridisierungspuffer zur Hybridisierung der Schnitte über Nacht bei 70°C verdünnt. Nach stringentem Waschen (2 × SSC und 0.2 × SSC), wurden die Schnitte weiter mit T1 Puffer gewaschen (0.5 M Maleinsäure, 750 mM NaCl, pH 7.5), und in T2 Puffer (T1 Puffer + 1 % Blockierungsreagens, 1 h, RT) inkubiert. Danach wurden die Schnitte (1 h, RT) mit einem alkalische Phosphatase-konjugierten anti-DIG Antikörper (Roche, Mannheim, Germany) inkubiert. Die Signale wurden mit Nitroblautetrazolium (NBT) und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) als Substrate (Roche, Mannheim, Germany) visualisiert. Die Reaktion wurde durch Waschen der Objektträger in PBS-Puffer gestoppt. Für jeden Test wurden Kontrollexperimente unter Verwendung von DIG-markierten Sense-RNA Sonden parallel durchgeführt.
KIAA1273/TOB3 wird spezifisch in Karzinomzellen exprimiert
Das AMIDA-Screening ermöglichte die Isolierung und Identifizierung von KIAA1273/TOB3 (KIAA1273/TOB3, SEQ ID NO: 15) und die Überprüfung seiner Tumorspezifität. Es wurde eine schwache KIAA1273/TOB3 mRNA Expression in der Basalmembranschicht gesunder Schleimhaut beobachtet, wohingegen höher differenzierte Epithelien KIAA1273/TOB3 mRNA nicht exprimierten (4a). Im scharfen Kontrast hierzu exprimierten Karzinomzellen von Hals- und Kopf-Proben große Mengen der mRNA für KIAA1273/TOB3 (4c, e, g). Somit wurde KIAA1273/TOB3 de novo in Karzinomzellen der oberen Luft- und Speisewege exprimiert. KIAA1273/TOB3 ist ein neu identifiziertes Mitglied der TIS21/PC3/BTGI/-TOB-Familie, die ein vermeintliches AAA-ATPase Motiv enthält, mit unbekannter Funktion (Parng, C., et al.) und durch das Proto-Onkogen c-Myc in seiner Expression reguliert wird. Möglicherweise resultiert die KIAA1273/TOB3 Überexpression aus einer direkten Beeinflussung der c-myc Regulierung in Krebszellen, da c-myc ebenfalls häufig in Tumoren überexprimiert vorliegt.
Sequenzübersicht für SEQ ID NO: 1–27: AHNAK nucleoprotein
Heat shock cognate protein 70
Vimentin
c-NAP1
Mutant keratin 9
Kruppel-type zink finger protein ZNF-70
Similar to RPS2
Elongin A2
Tropomyosin alpha
ATP synthase beta chain (NP_001677)
Small ribosomal protein 4
Nebulin

Similar to serine protease
Complement component C1r
KIAA1273/TOB3=KIAA1273/TOB3
KIAA1937

cDNA FLJ25393

Unknown protein

Hyp. 41.3kD protein
Cytidine deaminase
Growth factor receptor-bound protein 2
TGF-beta receptor interacting protein 1
Paraspekle protein 1 alpha isoform

Heterogenous nuclear ribonucleoprotein H
Profilin II
Literaturstellen:

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Claims

Immunogenes Plattenepithelkarzinom-Antigen, das zumindest eines der Proteine der SEQ ID NO: 1–27 oder Varianten hiervon umfasst, wobei die Varianten ein oder mehrere Additionen, Insertionen, Substitutionen und/oder Deletionen im Vergleich zum jeweiligen Protein der SEQ ID NO: 1–27 umfassen, und wobei die immunogene Aktivität der Variante der Aktivität des jeweiligen unmodifizierten Protein von SEQ ID NO: 1–27 im wesentlichen gleich ist.
Isolierte Nukleinsäure, die für eines oder mehrere der Proteine von Anspruch 1 kodiert.
Isolierte Nukleinsäure, die ein Transkriptionsprodukt der Nukleinsäure von Anspruch 2 ist.
Isolierte Nukleinsäure, die an die Nukleinsäuren nach Anspruch 2 oder 3 unter moderat stringenten Bedingungen selektiv hybridisiert.
Immunogenes Antigen, das von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 bis 4 kodiert wird.
Vektor, der ein oder mehrere der Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 2–4 umfasst.
Expressionsvektor, der eine oder mehrere der Nukleinsäuresequenzen nach einem der Ansprüche 2–4 und eine oder mehrere regulatorische Sequenzen umfasst.
Vektor nach Anspruch 6 oder 7, der ein Plasmid ist.
Wirtszelle, die mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 6–8 transformiert wurde.
Wirtszelle nach Anspruch 9, die eine eukaryontische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 10, die eine Säugetierzelle, Pflanzenzelle, Hefezelle oder eine Insektenzelle ist.
Säugetierzelle nach Anspruch 11, die eine CHO, COS, HeLa, 293T, HEH oder BHK Zelle ist
Wirtszelle nach Anspruch 9, die eine prokaryontische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, die E. coli oder Bacillus subtilis ist.
Antikörper oder Aptamer, der gegen ein oder mehrere Epitope eines Proteins nach Anspruch 1 gerichtet ist.
Antikörper nach Anspruch 15, wobei der Antikörper aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem polyklonalen Antikörper, einem monoklonalen Antikörper, einem humanisierten Antikörper, einem chimären Antikörper und einem synthetischen Antikörper besteht.
Antikörper nach Anspruch 15 oder 16, der an ein toxisches und/oder nachweisbares Mittel gebunden ist.
Hybridoma, die einen monoklonalen Antikörper produziert, der eine Bindungsspezifität für ein Protein nach Anspruch 1 aufweist.
Ex vivo-Verfahren zur Erzeugung einer Population autologer oder allogener Antigen präsentierender Zellen (APCs), die zum Induzieren einer effektiven Immunreaktion gegen ein Protein nach Anspruch 1 in der Lage sind, das die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen von autologen oder allogenen APCs; b) In-Berührung-Bringen der APCs mit einer wirksamen Menge eines Peptidfragmentes eines Proteins nach Anspruch 1 unter Bedingungen, die eine Endozytose, Prozessierung und – Präsentation der Peptidfragmente durch diese APCs ermöglicht, und c) Isolieren der die entsprechenden Peptide präsentierenden APCs.
Ex vivo-Verfahren zur Herstellung gentechnisch erzeugter APCs, die zum Induzieren einer wirksamen Immunreaktion gegen ein Protein nach Anspruch 1 in der Lage sind, das die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer Nukleinsäure, die für ein Protein nach Anspruch 1 oder Peptidfragment hiervon kodiert, b) Transfizieren der APCs mit der Nukleinsäure und c) Auswählen von APCs, die die Peptidfragmente präsentieren.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Nukleinsäure in Schritt a) in einem Expressionsvektor bereitgestellt wird.
APC, die durch das Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 19 bis 21 gewinnbar ist.
APC nach Anspruch 22, die eine dendritische Zelle oder eine B-Zelle ist.
Ex vivo Verfahren zum Nachweis und zur Gewinnung von T-Zellen, die für ein Protein nach Anspruch 1 spezifisch sind, das die folgenden Schritt umfasst: a) Bereitstellen von Säugetier-, insbesondere humanen, T-Zellen oder PBMC's, b) Co-Kultivieren der T-Zellen mit einer APC nach Anspruch 22 oder 23 unter Bedingungen, die eine Aktivierung der T-Zellen ermöglichen, und c) Bestimmen des Vorliegens einer spezifischen Aktivität der T-Zellen gegen eine APC nach Anspruch 22 oder 23, d) wahlweise Selektion und Kultivierung/Expansion solcher T-Zellen, die in Schritt c) eine Spezifität für eine APC nach Anspruch 22 oder 23 zeigten.
T-Zellen, die durch das Verfahren nach Anspruch 24 gewinnbar sind.
Diagnostische Zusammensetzung, die ein oder mehrere der Proteine nach Anspruch 1, einen Antikörper nach einem oder mehreren der Ansprüche 15–17 oder eine T-Zelle nach Anspruch 25 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer der Proteine nach Anspruch 1, eine oder mehrere der Nukleinsäuren nach Anspruch 2–4, einen Vektor nach Anspruch 6–8, einen monoklonalen Antikörper nach einem oder mehreren der Ansprüche 15–17, eine APC nach Anspruch 22 oder 23 oder eine T-Zelle nach Anspruch 25 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 27, die eine Vakzine ist.
Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 27 oder 28 in der Therapie eines Plattenepithelkarzinoms, insbesondere eines Plattenepithelkarzinoms im HNO-Bereich.