DE69920216T2

DE69920216T2 - Biologisches material zur herstellung pharmazeutischer zusammensetzungen zur behandlung von säugetieren

Info

Publication number: DE69920216T2
Application number: DE69920216T
Authority: DE
Inventors: Bruce Acres; Stephane Paul
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1998-10-22
Filing date: 1999-10-20
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2019-10-21
Also published as: JP2002528466A; AU754505B2; EP1084246B1; US20050221435A1; WO2000024896A3; ATE276364T1; PT1084246E; CA2344207A1; ES2228115T3; EP1084246A2; AU754505C; WO2000024896A2; DE69920216D1; AU6344499A; DK1084246T3; FR2784997A1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentherapie, welche auf die spezifische Immuntherapie angewendet wird, insbesondere im Rahmen von Behandlungen von Erkrankungen, bei denen das dafür verantwortliche Agens ein pathogener Organismus, wie insbesondere ein bakterielles, parasitäres oder virales Agens, ist, oder im Rahmen der Behandlung von Krebs. Insbesondere betrifft die Erfindung den Transfer von Nukleinsäuresequenzen, die die Gesamtheit oder einen Teil von Antikörpern kodieren, in Tumorzellen oder Zellen, die durch ein pathogenes Agens infiziert sind, derart, dass die durch diese Nukleinsäuresequenzen genetisch modifizierten Zellen auf ihrer Oberfläche diese Antikörper exprimieren und insbesondere Antikörper, die in der Lage sind, sich an ein Polypeptid, das auf der Oberfläche einer zytotoxischen Effektorzelle oder eines T-Helferlymphozyten vorhanden ist und an dem Prozess der Aktivierung einer solchen Zelle beteiligt ist, zu binden.
Seit langem wurde die Gentherapie vorgeschlagen, um Störungen oder Leiden, die im Rahmen der genetisch bedingten Erkrankungen beobachtet werden, zu korrigieren. Diese Erkrankungen erklären sich insbesondere durch eine Dysfunktion der Expression von speziellen Genen oder durch die Expression von mutierten, nicht funktionsfähigen Polypeptiden in wenigstens einem Zelltyp. Die Gentherapie besteht in diesem Falle darin, in spezielle Zielzellen, die entnommen, dann in den menschlichen Körper zurückgegeben werden, oder direkt in die betroffenen Organe die genetische Information, die in der Lage ist, den beobachteten Fehler zu korrigieren, zu transferieren. Es könnte sich beispielsweise im Falle der Mukoviszidose um das Gen handeln, welches das CFTR-Protein kodiert, oder im Falle der Duchenne-Muskeldystrophie um das Gen handeln, welches Dystrophin kodiert. Im Rahmen dieses Ansatzes wird die genetische Information entweder in vitro in eine aus dem Organ entnommene Zelle, wobei die modifizierte Zelle dann in den Organismus zurückgegeben wird (ex vivo-Verfahren), oder direkt in vivo in das geeignete Gewebe eingeführt. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die Ausführung von Gentherapieprotokollen, um in den Zielzellen die Expression eines Proteins, welches ein therapeutisches Interesse aufweist, durch Einführung der entsprechenden genetischen Information zu erhalten.
Gleichwohl beschränkt der Vorteil dieses Therapietyps sich nicht auf die Behandlung von rein genetisch bedingten Erkrankungen und kann gleichfalls die Beseitigung von Tumoren oder von pathogenen Agentien, wie bakteriellen oder viralen Agentien, oder von durch solche pathogene Agentien infizierten Zellen erlauben oder in Ermangelung dessen deren Fortschreiten oder Weiterentwicklung verzögern.
Die gegen ein spezifisches Antigen gerichtete Immunantwort kann in zwei unterschiedliche Kategorien eingeteilt werden, wobei die eine die Antikörper (Immunantwort vom humoralen Typ), die andere die zytotoxischen Effektorzellen, wie beispielsweise die Makrophagen, die zytotoxischen Lymphozyten (CTL) oder die Killerzellen (NK), wie auch die T-Helferlymphozyten, insbesondere die CD4-TL, (Immunantwort vom zellulären Typ) einsetzt. Die beiden Arten von Antworten unterscheiden sich insbesondere darin, dass die Antikörper die Antigene in ihrer dreidimensionalen Form erkennen, wohingegen beispielsweise die T-Lymphozyten Peptidabschnitte der Antigene erkennen, die assoziiert sind mit Glycoproteinen, die durch die Gene des Haupthistokompatibilitätskomplexes (oder MHC), insbesondere die Gene des Haupthistokompatibilitätskomplexes vom Typ I, die ubiquitär auf der Oberfläche der Zellen exprimiert werden, oder die Gene des Haupthistokompatibilitätskomplexes vom Typ II, die auf spezifische Weise auf der Oberfläche der Zellen, die an der Präsentation der Antigene beteiligt sind (APC), exprimiert werden, kodiert werden.
Gemäß einem ersten Aspekt ist die Immunantwort vom zellulären Typ dadurch gekennzeichnet, dass die T-Zellen vom CD4+-Typ (T-"Helfer"-Zellen infolge eines wohlbekannten Aktivierungsphänomens (für eine zusammenfassende Übersicht siehe Alberola-Ila, 1997, Annu. Rev. Immunol., 15, 125-154) Zytokine produzieren, die ihrerseits die Proliferation von APC-Zellen, die in der Lage sind, diese Zytokine zu produzieren; die zelluläre Differenzierung der B-Lymphozyten, welche in der Lage sind, spezifische Antikörper zu produzieren; und die Stimulation der zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) induzieren. Gemäß einem zweiten Aspekt der zellulären Immunantwort werden die zytotoxischen Effektorzellen, wie beispielsweise die Lymphozyten vom CD8+-Typ (CTL), a) nach Wechselwirkung mit Antigen-Peptiden, die gebunden sind auf und präsentiert werden durch die Glycoproteine, die die ubiquitären Zellen tragen und die durch die zu dem MHC I-System gehörenden Gene kodiert werden, und b) gegebenenfalls durch die durch die CD4+-Zellen produzierten Zytokine aktiviert. Die so aktivierten CTL sind dann in der Lage, die Zellen, die das Antigen-Peptid exprimieren, zu zerstören.
In dem besonderen Falle der Krebserkrankungen haben Hellstrom et al. (1969, Adv. Cancer Res. 12, 167-223) gezeigt, dass die Abwehr des Organismus in Hinblick auf Tumore insbesondere auf der Immunantwort beruht, die die T- Lymphozyten, insbesondere die zytotoxischen T-Lymphozyten einsetzt. Gleichwohl haben zahlreiche Arbeiten gezeigt, dass die Mehrzahl dieser spezifischen oder nicht-spezifischen Immuneffektoren unwirksam ist, um die Beseitigung oder das Anhalten des Fortschreitens eines Tumors zu ermöglichen. Dies ist der Grund, aus welchem es wünschenswert ist, über eine Methode zur Stimulation der Immunantwort, welche gegen die Tumore gerichtet ist, und insbesondere der Antwort, welche die zytotoxischen CTL-Lymphozyten eingreifen lässt, verfügen zu können, um über wirksamere Methoden zur Verhütung oder zur. Behandlung der krebsartigen Zustände verfügen zu können. In gleicher Weise ist gezeigt worden, dass das Immunsystem häufig unwirksam ist in Fällen von Infektionen, insbesondere viralen Infektionen, siehe beispielsweise den Fall der auf das HIV (Human Immunodeficiency Virus) zurückzuführenden Infektionen.
Gemäß einer ersten Alternative war vorgeschlagen worden, die bereits wohlbekannten Gentherapieverfahren anzupassen und in die Zielzellen, insbesondere die Krebszellen, immunstimulatorische Gene (Immuntherapie), die in der Lage sind, eine zellvermittelte Immunantwort in Hinblick auf den Tumor zu induzieren oder zu aktivieren, Gene, die die Zytokine kodieren (Colombo et al., 1994, Immunology Today, 15, 48-51), zytotoxische Gene, welche den Zellen, die sie exprimieren, eine Toxizität verleihen, beispielsweise das tk-Gen des Herpes simplex-Virus vom Typ I (HSV-1) oder Anti-Onkogene, wie beispielsweise das mit dem Retinoblastom assoziierte Gen oder p53, oder Polynukleotide, die in der Lage sind, die Aktivität eines Onkogens zu hemmen, wie beispielsweise Antisinn-Moleküle oder Ribozyme, die in der Lage sind, die für die Onkogene spezifischen mRNAs abzubauen, zu transferieren. Indessen fehlt in der Hauptzahl der Fälle den so modifizierten Zellen die Spezifität gegenüber dem Tumor und sie erlauben keinen zufriedenstellenden therapeutischen Ansatz.
Es ist gleichfalls ein anderer Ansatz vorgeschlagen worden, der die Vorteile der Gentherapie und den Einsatz von spezifischen Antikörpern verbindet. Während der letzten Jahre wurden zahlreiche Tumorantigene charakterisiert, die insbesondere die Identifizierung von Antikörpern, insbesondere von monoklonalen Antikörpern, die für diese Antigene spezifisch sind, erlaubt haben. Außerdem wurde die in vitro-Produktion von Antikörpern, von Antikörperfragmenten oder von Derivaten von Antikörpern, wie chimären Antikörpern, durch Gentechnologie in eukaryotischen Zellen beschrieben ( EP 120 694 oder EP 125 023 ). So wurden zahlreiche therapeutische Strategien vorgeschlagen, beispielsweise für die Behandlung oder Verhütung von B-Lymphomen (Yefenof et al., 1993, Current Opinion in Immunology, 5, 740-744), beruhend auf der Verabreichung von therapeutischen Antikörpern, welche spezifisch die Tumoranti gene ansteuern, an den Patienten, um das kausale Agens der Erkrankung zu neutralisieren. Unglücklicherweise haben sich diese Antikörper, obgleich sie für den Nachweis und die Diagnostik der Krebserkrankungen sehr nützlich sind, aus therapeutischer Sicht als nicht zufriedenstellend erwiesen, denn sie führen beispielsweise zu begrenzten Immunreaktionen, welche einzig gegen immundominante Epitope oder gegen Antigene, die eine große Variabilität aufweisen, gerichtet sind.
Die Internationale Patentanmeldung (WO 94/29446) beschreibt die intrazelluläre Expression von Antikörper kodierenden DNA-Sequenzen. Dieser Ansatz erlaubt, eine Gentherapie in Betracht zu ziehen, welche auf dem zielgerichteten Ansteuern von zellulären Komponenten, die durch die Impfmethoden nicht zugänglich sind, beruht, und ist dadurch gekennzeichnet, dass der beschriebene Ansatz nicht die Entwicklung einer Immunantwort mit einbezieht, intrazellulär wirkt und folglich keine wirksame Behandlung von Tumoren erlaubt.
Die Internationale Patentanmeldung (WO 98/31808) betrifft im Gegensatz dazu die in vivo-Expression von Genen, welche Antikörper oder Antikörperfragmente kodieren, durch Zellen, welche in der Lage sind, die Antikörper in den Blutkreislauf des Säugetiers, welches die durch das den Antikörper kodierende Gen genetisch modifizierten Zellen trägt, zu sekretieren. Der Vorteil dieser Erfindung beruht auf der Möglichkeit, über lange Zeit ein Antikörpergrundniveau in dem behandelten Patienten aufrechtzuerhalten.
Wir haben jetzt gezeigt, dass es möglich ist, die zelluläre Immunantwort umzudirigieren, indem auf der Oberfläche von Zielzellen, insbesondere Tumorzellen oder Zellen, die durch ein pathogenes Agens infiziert sind, die Gesamtheit oder einen Teil eines Antikörpers exprimiert wird, welcher in der Lage ist, an ein auf der Oberfläche von zytotoxischen Effektorzellen oder T-Helferlymphozyten vorhandenes Polypeptid zu binden. Wir haben insbesondere gezeigt, dass gemäß der Erfindung diese genetisch modifizierten Zielzellen es erlauben, die Aktivierung der zytotoxischen Effektorzellen oder von T-Helferlymphozyten zu dirigieren, die zytotoxische Wirkung dieser Zellen, insbesondere aktivierten Zellen, hinsichtlich der Zielzellen zu erhöhen, die zellvermittelte Immunantwort, welche von Natur aus in Hinblick auf Tumorzellen oder infizierte Zellen, seien sie genetisch modifiziert oder nicht, erfolgt, zu dynamisieren. Dies kann beispielsweise durch die Lyse und die Beseitigung der Zielzellen, der benachbarten Zellen und schließlich durch die Beseitigung des Tumors oder der Infektion zum Ausdruck kommen.
Die Erfindung betrifft an erster Stelle ein biologisches Material für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche für die Behandlung von Säugetieren bestimmt sind, umfassend:

– wenigstens eine Nukleinsäuresequenz, die wenigstens ein Gen von therapeutischem Interesse und Elemente, die die Expression des Gens in vivo in Zielzellen, die dazu bestimmt sind, durch die Nukleinsäuresequenz genetisch modifiziert zu werden, sicherstellen, enthält;
– wenigstens eine Säugetierzelle, welche von Natur aus keine Antikörper produziert und in vitro genetisch durch wenigstens eine vorangegangene Nukleinsäuresequenz modifiziert worden ist,

Mit "Nukleinsäuresequenz" soll ein doppelsträngiges oder einzelsträngiges, lineares oder zirkuläres, aus der Natur isoliertes oder synthetisch hergestelltes DNA- und/oder RNA-Fragment bezeichnet werden, welches eine präzise Aneinanderreihung von modifizierten oder nicht-modifizierten Nukleotiden bezeichnet, die erlaubt, ein Nukleinsäurefragment oder eine Nukleinsäureregion ohne Einschränkung hinsichtlich der Größe zu definieren. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise handelt es sich um eine Nukleinsäure, die aus der Gruppe bestehend aus einer cDNA, einer genomischen DNA, einer Plasmid-DNA, einer mRNA ausgewählt wird.
Gemäß der Erfindung umfasst die "Nukleinsäuresequenz" wenigstens ein "Gen von therapeutischem Interesse" und Elemente für die Expression des Gens von Interesse. Ein solches "Gen von therapeutischem Interesse" kodiert insbesondere die Gesamtheit oder einen Teil eines nativen transmembranständigen Antikörpers oder ein Derivat eines solchen Antikörpers, insoweit als der Antikörper, das Antikörperfragment oder -derivat auf der Oberfläche der genetisch modifizierten Säugetier-Zielzelle exprimiert wird und der Antikörper in der Lage ist, an ein auf der Oberfläche einer zytotoxischen Effektorzelle oder eines T-Helferlymphozyten vorhandenes und an dem Prozess der Aktivierung einer solchen Zelle beteiligtes Polypeptid zu binden. Mit Antikörper "fragment" sollen insbesondere die Fragmente F(ab)₂, Fab', Fab, sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology, 159, 5821-5833; Bird et al., 1988, Science, 242, 423-426) eines nativen Antikörpers und mit "Derivat" beispielsweise ein chimäres Derivat eines solchen Antikörpers bezeichnet werden (siehe beispielsweise die chimären Maus/Mensch-anti-CD3-Antikörper in Arakawa et al., 1996, J. Biochem., 120, 657-662, oder die Immuntoxine, wie das SFv-Toxin von Chaudary et al., 1989, Nature 339, 394-397). Mit "transmembranständiger Antikörper" soll ein Antikörper bezeichnet werden, bei dem wenigstens die funktionale Region, die in der Lage ist, dessen spezifisches Antigen zu erkennen und daran zu binden, auf der Oberfläche der Zielzellen exprimiert wird, um diese Erkennung und Bindung zu erlauben. Insbesondere bestehen die Antikörper gemäß der Erfindung aus Fusionspolypeptiden, umfassend die Aminosäuren, welche diese funktionale Region definieren, und eine Aminosäuresequenz (transmembranständiges Polypeptid), welche die Verankerung innerhalb der Membranlipiddoppelschicht der Zielzelle oder auf der äußeren Oberfläche dieser Doppelschicht erlaubt. Die Nukleinsäuresequenzen, die zahlreiche transmembranständige Polypeptide kodieren, sind in der Literatur beschrieben. Gemäß einem bevorzugten Fall der Erfindung wird das transmembranständige Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Glycoprotein, einem Lipoprotein, einem Rezeptor, wie der Gesamtheit oder einem Teil der weiter oben in der Anmeldung erwähnten Komplexe (beispielsweise CD4, Fc, gp160 von HIV), und insbesondere aus der Gruppe bestehend aus dem Glycoprotein des Tollwut-Virus (Französische Patentanmeldung Nr. FR 97 09152 ), CD4 (Weijtens et al., 1998, Gene Therapy, 5, 1195-1203), gp160, Fc. Gemäß einem ganz und gar vorteilhaften Fall wird die die schwere Kette des Antikörpers kodierende Nukleinsäuresequenz mit der Nukleinsäuresequenz, die ein solches transmembranständiges Polypeptid kodiert, fusioniert werden.
Mit "Elemente, welche die Expression des Gens in vivo sicherstellen" sollen die Elemente bezeichnet werden, die erforderlich sind, um die Expression des Gens nach seinem Transfer in eine Zielzelle sicherzustellen. Es handelt sich insbesondere um Promotorsequenzen und/oder Regulationssequenzen, welche in der Zelle wirksam sind, und gegebenenfalls die Sequenzen, die erforderlich sind, um die Expression des Polypeptids auf der Oberfläche der Zielzellen zu erlauben. Der eingesetzte Promotor kann ein viraler, ubiquitärer oder gewebespezifischer Promotor oder ferner ein synthetischer Promotor sein. Als Beispiel kann man die Promotoren, wie die Promotoren der Viren RSV (Rous-Sarkom-Virus), MPSV, SV40 (Simian Virus), CMV (Zytomegalievirus) oder des Vakziniavirus, die Promotoren des muskuläre Kreatinkinase, Actin, "pulmonary surfactant" kodierenden Gens aufführen. Es ist außerdem möglich, eine für einen gegebenen Zelltyp spezifische oder unter definierten Bedingungen aktivierbare Promotorsequenz zu wählen. Die Literatur liefert eine große Anzahl von Infor mationen, welche sich auf solche Promotorsequenzen beziehen. Außerdem kann die Nukleinsäure wenigstens zwei Sequenzen, die gleich oder verschieden sind, welche eine transkriptionelle Promotoraktivität aufweisen, und/oder wenigstens zwei Gene, die gleich oder verschieden sind, welche bezogen aufeinander aneinander angrenzend, entfernt, in der gleichen Richtung/Orientierung oder in umgekehrter Richtung/Orientierung angeordnet sind, umfassen, insoweit als die Funktion des transkriptionellen Promotors oder die Transkription der Gene nicht beeinträchtigt werden. Ebenso ist es bei dieser Art von Nukleinsäurekonstrukt möglich, "neutrale" Nukleinsäuresequenzen oder Introns einzuführen, die die Transkription nicht stören und vor dem Translationsschritt gespleißt werden. Solche Sequenzen und deren Verwendungen sind in der Literatur (WO 94/29471) beschrieben. Die Nukleinsäure könnte gleichfalls Sequenzen umfassen, die für den intrazellulären Transport, für die Replikation und/oder für die Integration, für die Transkription oder die Translation erforderlich sind. Solche Sequenzen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt. Außerdem können die gemäß der Erfindung einsetzbaren Nukleinsäuren gleichfalls Nukleinsäuren, die derart modifiziert worden sind, dass es ihnen nicht möglich ist, sich in das Genom der Zielzelle zu integrieren, oder Nukleinsäuren, die mit Hilfe von Agentien, wie beispielsweise Spermin, stabilisiert sind, sein, insofern als diese keine Auswirkung auf die Wirksamkeit der Transfektion haben.
Gemäß einer ersten Ausführungsweise der Erfindung ist die Nukleinsäuresequenz eine nackte DNA- oder RNA-Sequenz, d.h. frei von einer jeglichen Verbindung, welche deren Einführung in die Zellen (Nukleinsäuresequenztransfer) erleichtert. Um ihre Einführung in die Zielzellen zu begünstigen, um die genetisch modifizierten Zellen der Erfindung zu erhalten, kann diese Nukleinsäuresequenz gleichwohl in Form eines Vektors vorliegen und insbesondere in Form eines viralen Vektors, wie beispielsweise eines adenoviralen Vektors, retroviralen Vektors, eines von einem Poxvirus abgeleiteten Vektors, insbesondere von einem Vakziniavirus oder dem modifizierten Ankara-Virus ("Modified Virus Ankara"; MVA) abgeleiteten Vektors, oder eines nicht-viralen Vektors, wie beispielsweise eines Vektors, bestehend aus wenigstens einer solchen Nukleinsäuresequenz, welche komplexiert oder konjugiert ist mit wenigstens einem Trägermolekül oder einer Trägersubstanz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer amphiphilen kationischen Substanz, insbesondere einem kationischen Lipid, einem kationischen oder neutralen Polymer, einer polaren protischen Verbindung, insbesondere ausgewählt aus Propylenglycol, Polyethylenglycol, Glycerol, Ethanol, 1-Methyl-L-2-pyrrolidon oder deren Derivaten, und einer polaren aprotischen Verbindung, insbesondere ausgewählt aus Dimethylsulfoxid (DMSO), Diethylsulfoxid, Di-n-propylsulfoxid, Dimethylsulfon, Sulfolan, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetramethylharnstoff, Acetonitril oder deren Derivaten.
Außerdem können solche Vektoren darüber hinaus Targeting-Elemente umfassen, welche erlauben können, den Transfer von Nukleinsäuresequenzen in Richtung auf bestimmte Zelltypen oder bestimmte besondere Gewebe (Tumorzellen, Zellen des Lungenepithels, hämopoetische Zellen, Muskelzellen, Nervenzellen...) zu dirigieren. Sie können gleichfalls erlauben, den Transfer eines Wirkstoffs in Richtung bestimmter bevorzugter intrazellulärer Kompartimente, wie beispielsweise des Kerns und der Mitochondrien, zu dirigieren. Es kann sich außerdem um Elemente handeln, die das Eindringen in das Innere der Zelle oder die Lyse der Endosomen vereinfachen. Solche Targeting-Elemente sind in der Literatur umfänglich beschrieben. Es kann sich beispielsweise um die Gesamtheit oder einen Teil von Lectinen, Peptide, insbesondere das Peptid JTS-1 (siehe Patentanmeldung WO 94/40958), Oligonukleotide, Lipide, Hormone, Vitamine, Antigene, Antikörper, spezifische Liganden von Membranrezeptoren, Liganden, die in der Lage sind, mit einem Antiliganden zu reagieren, fusogene Peptide, Peptide von nukleärer Lokalisation oder eine Kombination solcher Verbindungen handeln. Es kann sich insbesondere um Galactosylreste handeln, welche erlauben, den Rezeptor der Asialoglycoproteine spezifisch auf die Oberfläche der Leberzellen zu dirigieren, um Liganden, welche mit Rezeptoren, wie Rezeptoren von Wachstumsfaktoren, Rezeptoren von Zytokinen, Lectinen, Adhäsionsproteinen wechselwirken können, es kann sich gleichfalls um ein Antikörperfragment, wie das Fab-Fragment, ein fusogenes INF-7-Peptid, welches sich von der Untereinheit HA-2 des Hämagglutinins des Influenza-Virus ableitet (Plank et al., 1994, J.Biol. Chem. 269, 12918-12924), ein nukleäres Lokalisationssignal, welches sich von dem T-Antigen des SV40-Virus oder dem EBNA-1-Protein des Epstein-Barr-Virus ableitet, handeln.
Gemäß der Erfindung ist der auf der Oberfläche der Zielzellen exprimierte Antikörper in der Lage, sich an ein Polypeptid zu binden, das auf der Oberfläche einer zytotoxischen Effektorzelle oder eines T-Helferlymphozyten, insbesondere eines CD4-T-Helferlymphozyten, vorhanden und an dem Prozess der Aktivierung einer solchen Zelle beteiligt ist, und insbesondere an einen Rezeptor, welcher direkt an einem solchen Prozess beteiligt ist. Wie zuvor beschrieben wurde, ist dieses Phänomen der Aktivierung der zytotoxischen Effektorzellen oder von T-Helferlymphozyten ein entscheidender Faktor für die zellvermittelte Immunreaktion. Gleichwohl empfiehlt sich, anzumerken, dass es im Rahmen der Ausführung der Erfindung nicht unabdingbar ist, dass der Pro zess der Aktivierung nach der Anheftung durch den gemäß der Erfindung auf der Oberfläche der Zielzellen exprimierten Antikörpers stattfindet. Tatsächlich kann dieser Antikörper gemäß der Erfindung sich gleichfalls an die Peptide binden, wie sie definiert wurden, die aber auf zytotoxischen Efffektorzellen oder Helferlymphozyten, die bereits aktiviert sind, vorhanden sind. Mit "zytotoxischen Effektorzellen" sollen die Makrophagen, die zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) und die Killerzellen (NK) wie auch die sich davon ableitenden Zellen, wie beispielsweise die LAK (²Versteeg, 1992, Immunology Today, 13, 244-247; Brittende et al., 1996, Cancer 77, 1226-1243; Poplack et al., 1976, Blood 48, 809-816), bezeichnet werden. Mit "T-Helferlymphozyten" sollen insbesondere die CD4-Zellen bezeichnet werden, die nach Aktivierung die Sekretion von Aktivierungsfaktoren für die Effektorzellen der Immunantwort erlauben (siehe weiter oben). Die Polypeptide und insbesondere die Rezeptoren, die auf der Oberfläche von diesen Zellen exprimiert werden und die an der Aktivierung von solchen Zellen beteiligt sind, bestehen insbesondere aus der Gesamtheit oder einem Teil des TCR-Komplexes, insbesondere TCR-α, TCR-β oder CD3, der Gesamtheit oder einem Teil der Komplexe CD8, CD4, CD28, LFA-1, 4-1BB (Melero et al., 1998, Eur. J. Immunol., 28, 1116-1121), CD47, CD2, CD1, CD9, CD45, CD30, CD40, der Gesamtheit oder einem Teil der Rezeptoren von Zytokinen (Finke et al., 1998, Gene Therapy, 5, 31-39), wie IL-7, IL-4, IL-2, IL-15 oder GM-CSF, der Gesamtheit oder einem Teil des Rezeptorkomplexes der NK-Zellen, wie beispielsweise Vα14NKT (Kawano et al., 1998, Immunology, 95, 5690-5693), NKAR, Nkp46 (Pessino et al., 1998, J. Exp. Med., 188, 953-960), Nkp44, der Gesamtheit oder einem Teil der Rezeptoren von Makrophagen, wie beispielsweise dem Fc-Rezeptor (Deo et al., 1997, Immunology Today, 18, 127-135). Gemäß einer besonderen Ausführungsweise ist es gleichfalls möglich, in Betracht zu ziehen, die zytotoxischen Effektorzellen oder die T-Helferlymphozyten genetisch, insbesondere in vivo, derart zu modifizieren, dass sie auf ihrer Oberfläche ein Polypeptid exprimieren, das natürlicherweise durch diese Zellen nicht exprimiert wird und in der Lage ist, den Prozess der Aktivierung solcher Zellen zu induzieren, durch die Einführung von Nukleinsäuresequenzen, welche das ein solches Polypeptid kodierende Gen umfassen, in diese Zellen. Gemäß der Erfindung ist es dann möglich, eine Nukleinsäuresequenz auszuwählen, die ein Gen von therapeutischem Interesse enthält, welches die Gesamtheit oder einen Teil eines Antikörpers, welcher auf der Oberfläche der Zielzellen des zu behandelnden Patienten exprimiert werden kann, kodiert, wobei der Antikörper in der Lage ist, an ein solches Polypeptid, welches natürlicherweise durch diese zytotoxischen Effektorzellen oder T-Helferlymphozyten nicht exprimiert wird, zu binden.
Die Erfindung beruht insbesondere auf der Möglichkeit, die Gene zu klonieren, die die Gesamtheit oder einen Teil eines Antikörpers kodieren, und den Antikörper in Zellen nach einem Transfer der Gene in die Zellen ausgehend von Vektoren, wie sie zuvor beschrieben worden sind, zu exprimieren. Die Literatur schlägt eine große Anzahl von Beispielen für Gene vor, die Antikörper kodieren, welche in der Lage sind, mit solchen Polypeptiden oder Rezeptoren zu reagieren. Es liegt im Vermögen des Fachmanns auf diesem Gebiet, die Nukleinsäuresequenzen zu erhalten, die solche Antikörper kodieren. Es können beispielsweise die Gene aufgeführt werden, die die leichte und schwere Kette des Antikörpers YTH 12.5 (anti-CD3) (Routledge et al., 1991, Eur. J. Immunol. 21, 2717-2725), von anti-CD3 gemäß Arakawa et al., 1996, J. Biochem., 120, 657-662) kodieren. Die Nukleinsäuresequenzen von solchen Antikörpern sind ausgehend von Datenbanken, welche durch die Fachleute auf diesem Gebiet üblicherweise verwendet werden, leicht identifizierbar.
Es ist gleichfalls möglich, ausgehend von Hybridomen, die bei der ATCC verfügbar sind und die für Polypeptide, die auf der Oberfläche von zytotoxischen Effektorzellen oder von T-Helferlymphozyten vorhanden sind und an dem Prozess der Aktivierung solcher Zellen beteiligt sind, spezifische Antikörper sekretieren, (beispielsweise ein Hybridom, welches Gg2b-κ-Immunglobuline, welche gegen die Rezeptoren des TCR gerichtet sind, sekretiert) die Nukleinsäuresequenzen, die die schweren und/oder leichten Ketten dieser unterschiedlichen Antikörper kodieren, durch Amplifizierungsmethoden, wie die RT-PCR, mit Hilfe von spezifischen Oligonukleotiden oder die Techniken, die cDNA-Banken einsetzen (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning. A laboratory manual. C.S.H. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), zu klonieren. Die so klonierten Sequenzen stehen dann für ihre Klonierung in Vektoren zur Verfügung. Gemäß einem bevorzugten Fall der Erfindung wird die die schwere Kette des Antikörpers kodierende Nukleinsäuresequenz durch homologe Rekombination mit der Nukleinsäuresequenz, welche ein transmembranständiges Polypeptid, wie das Tollwut-Glycoprotein (diese molekularbiologischen Techniken werden in der französischen Patentanmeldung Nr FR 97 09152 perfekt beschrieben) oder gp160 (Polydefkis et al., 1990, J. Exp. Med., 171, 875-887), kodiert, fusioniert.
Unter den Säugetier-Zielzellen, die die Erfindung sich vornimmt, zu eliminieren oder deren Weiterentwicklung zu beschränken, kann man insbesondere die Tumorzellen, die durch ein virales pathogenes Agens infizierten Zellen oder die durch ein bakterielles pathogenes Agens infizierten Zellen aufführen. Gemäß der Erfindung erlaubt die Expression der Gesamtheit oder eines Teils ei nes Antikörpers, der in der Lage ist, sich an ein Polypeptid, das auf der Oberfläche einer zytotoxischen Effektorzelle oder eines T-Helferlymphozyten vorhanden ist und an dem Prozess der Aktivierung einer solchen Zelle beteiligt ist, zu binden, auf der Oberfläche dieser Zellen, die zytotoxische Immunantwort in Richtung eines gegebenen Ziels zu dirigieren und insbesondere diese Antwort auf die Ebene eines Tumors oder eines Infektionsherds zu dirigieren.
Als "virales pathogenes Agens" kann man beispielsweise das Virus HIV, EBV, CMV, das Hepatitis-Virus und die Papillomaviren aufführen. Als "parasitäres pathogenes Agens" kann man beispielsweise Leishmania lesmaniae und Plasmodium falciparum aufführen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsweise betrifft die Erfindung ein biologisches Material, das aus wenigstens einer Zielzelle, wie insbesondere einer Tumorzelle oder einer durch ein virales pathogenes Agens infizierten Zelle, die natürlicherweise keine Antikörper produziert, in einer Form, die deren Verabreichung in den Organismus eines humanen oder tierischen Säugetiers wie auch gegebenenfalls deren vorab erfolgende Kultivierung erlaubt, gebildet wird, wobei die Zelle in vitro genetisch modifiziert worden ist durch wenigstens eine Nukleinsäuresequenz, welche wenigstens ein Gen enthält, welches die Gesamtheit oder einen Teil eines auf der Oberfläche der Zielzelle exprimierten Antikörpers kodiert, und wobei der Antikörper in der Lage ist, sich an ein Polypeptid zu binden, das auf der Oberfläche einer zytotoxischen Effektorzelle oder eines T-Helferlymphozyten, wie jenen, die zuvor beschrieben worden sind, vorhanden ist. Die Zielzelle stammt insbesondere entweder von dem zu behandelnden Säugetier oder von einem anderen Säugetier als jenem, das behandelt werden muss. In diesem letzteren Falle empfiehlt es sich, anzumerken, dass die Zielzelle eine Behandlung durchlaufen haben wird, die diese mit dem zu behandelnden Säugetier verträglich macht. Gemäß einem bevorzugten Fall soll "Säugetier" ein humanes Säugetier bezeichnen.
Ein solches biologisches Material ist, wenn es an einen Patienten verabreicht wird und insbesondere auf intratumoralem Wege verabreicht wird, in der Lage, bei diesem eine zellvermittelte Immunantwort zu induzieren, die zu der Produktion von Zytokinen und zur zytotoxischen Wirkung der Effektorzellen führen kann, die nicht nur durch die Beseitigung der verabreichten Zellen, sondern gleichfalls durch die Beseitigung der benachbarten Zellen, die die Antigene, insbesondere tumorspezifische, präsentieren, welche in der Lage sind, durch die aktivierten zytotoxischen Effektorzellen erkannt zu werden, zum Ausdruck kommen.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung eines biologischen Materials, wie oben beschrieben, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche für die Behandlung oder die Verhütung von Krebserkrankungen oder von viralen Infektionen bestimmt ist. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, welche wenigstens ein Gen von therapeutischem Interesse und Elemente, welche die Expression des Gens in vivo in durch eine solche Nukleinsäuresequenz genetisch modifizierten Zielzellen sicherstellen, enthält, wobei das Gen von therapeutischem Interesse die Gesamtheit oder einen Teil eines Antikörpers, welcher auf der Oberfläche der Zielzelle exprimiert wird und in der Lage ist, sich an ein Polypeptid zu binden, welches auf der Oberfläche einer zytotoxischen Effektorzelle oder eines T-Helferlymphozyten vorhanden und an dem Prozess der Aktivierung einer solchen Zelle beteiligt ist, kodiert, für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die für die Behandlung eines Säugetiers durch Gentransfer bestimmt sind.
Für das Ausführen der im Rahmen der Erfindung erwähnten Behandlung des Säugetiers ist es möglich, über pharmazeutische Zusammensetzungen zu verfügen, welche ein biologisches Material, wie zuvor beschrieben, welches vorteilhafterweise mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Vehikel für die Verabreichung an den Menschen oder das Tier kombiniert ist, umfassen. Die Verwendung von solchen Trägern wird in der Literatur beschrieben. Dieser pharmazeutisch annehmbare Träger oder dieses pharmazeutisch annehmbare Vehikel ist vorzugsweise isotonisch, hypotonisch oder weist eine geringe Hypertonie auf und hat eine relativ niedrige Ionenstärke, wie beispielsweise eine Saccharoselösung. Außerdem kann die Zusammensetzung Lösemittel, wässrige oder teilweise wässrige Vehikel, wie beispielsweise steriles pyrogenfreies Wasser, und Dispersionsmedien enthalten. Der pH dieser pharmazeutischen Zusammensetzungen wird geeigneterweise gemäß den herkömmlichen Techniken eingestellt und gepuffert.
Gemäß einer Variante betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche insbesondere ein biologisches Material, wie beschrieben, und eine proteinartige Verbindung, welche natürlicherweise für die Aktivierung der zytotoxischen Effektorzellen oder von T-Helferlymphozyten verantwortlich oder an dieser Aktivierung beteiligt ist, umfasst. Spezieller wird eine solche Verbindung aus einem Zytokin ("The cytokine Handbook", 2. Aufl., Hrsg. A.W. Thomson, Ac. Press, Harcourt Brace & Company), einem Chemokin (Rollins et al., 1997, Blood, 90, 909-928; Devalaraja et al., 1999, TIPS, 20, 151-156) oder einer jeglichen anderen Verbindung, welche die Costimulation der zytotoxischen Effektorzellen erlaubt, (beispielsweise die Gesamtheit oder ein Teil eines anti-CD28-Antikörpers; Stefan et al., 1997, Cancer Research, 59(8), 1961-1967) bestehen. Die Verbindung wird bevorzugt IL2 sein. In einer Ausführungsvariante könnte das erfindungsgemäße biologische Material außerdem eine DNA-Sequenz umfassen, die die Expression einer an der Aktivierung der zytotoxischen Effektorzellen oder von T-Helferlymphozyten beteiligten Verbindung sicherstellt. In diesem Falle kann diese Sequenz in der zuvor beschriebenen Nukleinsäuresequenz enthalten sein oder in einer Nukleinsäuresequenz enthalten sein, die von jener, die das Gen von therapeutischem Interesse enthält, unabhängig ist (WO 95/09241).
Gemäß einer ersten Möglichkeit kann das Arzneimittel direkt in vivo oder durch einen ex vivo-Ansatz, der darin besteht, Zielzellen aus dem zu behandelnden Säugetier zu entnehmen, diese in vitro gemäß der Erfindung zu transfizieren und diese dem Säugetier wieder zu verabreichen, verabreicht werden.
Das erfindungsgemäße biologische Material kann in vivo insbesondere in injizierbarer Form, insbesondere auf intratumoralem Wege verabreicht werden. Man kann gleichfalls eine Injektion auf intratrachealem, intranasalem, epidermalem, intravenösem, intraarteriellem, intramuskulärem, intrapleuralem, intrazerebralem Wege durch eine Spritze oder ein jegliches anderes äquivalentes Mittel in Betracht ziehen. Gemäß einer anderen Ausführungsweise kann man Systeme einsetzen, welche für die Behandlung der Atemwege oder der Schleimhäute angepasst sind, wie die Inhalation, Instillation oder die Vernebelung, auf topischem Wege, durch orale Verabreichung oder ein jegliches anderes Mittel oder eine jegliche andere Maßnahme, welche den Fachleuten auf diesem Gebiet bestens bekannt sind und auf die Erfindung angewendet werden können. Die Verabreichung kann mittels einer Einheitsdosis oder einer, ein- oder mehrmals nach einem bestimmten Zeitintervall, wiederholten Dosis erfolgen. Der Verabreichungsweg und die Dosierung, die am besten geeignet sind, variieren abhängig von verschiedenen Parametern, wie beispielsweise dem Individuum oder der Krankheit, die zu behandeln sind, oder ferner von der zu transferierenden Nukleinsäure oder dem Zielorgan/-gewebe.
Die Erfindung betrifft gleichfalls eine Säugetierzelle, die natürlicherweise keine Antikörper produziert, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie genetisch modifiziert ist durch wenigstens eine Nukleinsäuresequenz, die wenig stens ein Gen von therapeutischem Interesse und Elemente, welche die Expression des Gens in der Zelle sicherstellen, enthält, wobei das Gen von therapeutischem Interesse die Gesamtheit oder einen Teil eines Antikörpers, der auf der Oberfläche der genetisch modifizierten Zelle exprimiert wird, kodiert, und dass der Antikörper in der Lage ist, sich an ein Polypeptid, das auf der Oberfläche einer zytotoxischen Effektorzelle oder eines T-Helferlymphozyten vorhanden und an dem Prozess der Aktivierung einer solchen weiter oben beschriebenen Zelle beteiligt ist, zu binden.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Zelle, wie oben beschrieben, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man in eine Säugetierzelle, welche von Natur aus keine Antikörper produziert, durch ein jegliches geeignetes Mittel oder eine jegliche geeignete Maßnahme wenigstens eine Nukleinsäuresequenz einschleust, die wenigstens ein Gen von therapeutischem Interesse und Elemente, welche die Expression des Gens in der Zelle sicherstellen, enthält, wobei das Gen von therapeutischem Interesse die Gesamtheit oder einen Teil eines Antikörpers, der auf der Oberfläche der genetisch modifizierten Zelle exprimiert wird, kodiert, und dass der Antikörper in der Lage ist, sich an ein Polypeptid, das auf der Oberfläche einer zytotoxischen Effektorzelle oder eines T-Helferlymphozyten vorhanden und an dem Prozess der Aktivierung einer solchen Zelle beteiligt ist, zu binden, dann dass man unter diesen Zellen jene, die durch die genannte Nukleinsäuresequenz genetisch modifiziert worden sind, selektiert.
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne sie auf irgendeine Weise zu beschränken.
Legende der Figuren:
1: Proliferationstest an Splenozyten aus der Maus (2.10⁵ Zellen/Vertiefung), die mit P815-Zellen, ausgestattet mit den TR310- und H57-597-Antikörpern, aktiviert wurden. Nachweis während 5 Tagen. Achtstündige Markierung mit tritiummarkiertem Thymidin Die Ergebnisse sind als Menge von eingebautem tritiummarkiertem Thymidin ausgedrückt (10³ cpm).
2: Analyse der Expression der verschiedenen Antikörper nach Infektion von BHK21-Zellen mit den verschiedenen rekombinanten Viren durch Durchflusszytometrie. A-B-C entsprechen den mit den Viren MVATG14205, MVATG14240 bzw. MVATG14237 ausgeführten Infektionen. (T: negative Markierung mit Hilfe eines negativen Vergleichsantikörpers; m anti-rat IgG: Markierung mit Hilfe eines Mäuse-Antikörpers, der gegen die IgG aus der Ratte gerichtet ist; r anti-hamster IgG: Markierung mit Hilfe eines Ratten-Antikörpers, der gegen die IgG aus dem Hamster gerichtet ist).
2A: Analyse der Expression des Antikörpers TR310.
2B: Analyse der Expression des Antikörpers KT3.
2C: Analyse der Expression des Antikörpers H57-597.
3: Modell P815 (geringe Immunogenität; H2d; CMH1; ICAM1; CD48). Proliferationstest an mit mit den verschiedenen rekombinanten MVA-Viren infizierten Zellen aktivierten Mäuse-Splenozyten (2.10⁵ Zellen/Vertiefung). A-B entspricht dem Inkontaktbringen von 2.10⁵ Splenozyten mit 20000 bzw. 2000 der unterschiedlichen P815-Zellen. P815/TR310, P815/H57-597 und P815/R2: P815, ausgestattet mit den Antikörpern TR310, H57-597 bzw. einem Vergleichsantikörper; P815/MVATG14205, P815/MVATG14237, P815/MVATG14240: P815, infiziert mit den verschiedenen rekombinanten MVA-Viren; Con A und IL-2: positive Vergleichsproben, welche der Stimulation von Splenozyten mit rekombinantem Concanavalin A oder Interleukin-2 entsprechen; Zellen: Splenozyten allein. Es ist der Infektionsprozentsatz mit den verschiedenen rekombinanten MVA-Viren angegeben.
4: Modell B16F0 (nicht-immunogen; H2b) Proliferationstest an mit mit den verschiedenen rekombinanten MVA-Viren infizierten Zellen aktivierten Mäuse-Splenozyten (2.10⁵ Zellen/Vertiefung). A-B-C entspricht dem Inkontaktbringen von 2.10⁵ Splenozyten mit 20000, 10000 oder 2000 der verschiedenen B16F0-Zellen. B16F0/MVATG14205, B16F0/MVATG14237, B16F0/MVATG14240: B16F0, infiziert mit den verschiedenen rekombinanten MVA-Viren; Con A: positive Vergleichsprobe, welche der Stimulation von Splenozyten mit Concanavalin A entspricht; Zellen: Splenozyten allein. Es ist der Infektionsprozentsatz mit den verschiedenen rekombinanten MVA-Viren angegeben.
Beispiel 1
1 – Methoden
1-1 Konstruktion der rekombinanten MVA-Viren
Um die Klonierung der Nukleinsäuresequenzen, die verschiedene Antikörper, die aufgrund ihrer Fähigkeit, die T-Lymphozyten zu aktivieren, ausgewählt worden waren, kodieren, zu ermöglichen, wurden drei verschiedene Hybridome ausgewählt:

– Hybridom TR310 (Ratte-anti-Mäuse-Vb7 (IgG2b); ATCC HB-219; L. Weissman; Fusion Maus-Myelome/Ratten-Splenozyten).
– Hybridom H57-597 (Hamster-anti-Mäuse-TCRab (IgG); ATCC HB-218; Kubo et al., 1989, J. Immunology, 142: 2736-2742; Fusion Mäuse-Myelome/Hamster-Splenozyten).
– Hybridom KT3 (Ratte-anti-Mäuse-CD3e (IgG2a); Tomonari et al., 1988, Immunogenetics, 28: 455-458; Fusion Mäuse-Myelome/Ratten-Splenozyten).

Die Klonierung der Sequenzen, die die Gesamtheit der unterschiedlichen schweren und leichten Ketten von diesen Antikörpern kodieren, wurde gemäß zwei unterschiedlichen Methoden ausgehend von den Gesamt-RNAs, die aus den 3 Hybridomen extrahiert wurden, ausgeführt:

a) durch RT-PCR mit Hilfe von spezifischen Oligonukleotiden (Bca BEST^TM RNA PCRKit, Takara Shuzo Co., Ltd.; Frohman et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8998-9002), die derart definiert wurden, dass sie auf der Höhe der konservierten Regionen der konstanten 3'- und variablen 5'-Sequenzen, die die entsprechenden Immunglobuline kodieren, hybridisieren (siehe C.A. Kettleborough et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23: 206-211). Insbesondere wurden diese Sequenzen mit Hilfe der folgenden, in GeneBank verfügbaren Informationen definiert: Hybridom TR310 und KT3 (schwere und leichte Ketten aus der Ratte): – schwere Kette vom gamma-Typ: anti-Acetylcholinrezeptor-Antikörper-Gen aus der Ratte, umgelagerte Ig gamma-2a-Kette, VDJC-Region, vollständige kodierende Sequenz (cds). Autor: Agius, M.A., und Bharati, S. 1993. Aufnahmenummer in GeneBank = L22654. – leichte Kette vom kappa-Typ: anti-Acetylcholinrezeptor-Antikörper-Gen aus der Ratte; kappa-Kette, VJC-Region, vollständige kodierende Sequenz (cds). Autor: Agius, M.A., und Bharati, S. 1993. Aufnahmenummer in GeneBank = L22653. Hybridom H57-597: (schwere und leichte Kette aus dem Hamster): – schwere Kette vom gamma-Typ: IgG-schwere Kette-mRNA aus Cricetulus migratorius, vollständige kodierende Sequenz (cds). Autor: Whitters, M.J., und Collins, M. 1995. Immunogenetics. 42(3): 227-228. Aufnahmenummer in GeneBank = U17166. – leichte Kette vom lambda-Typ: Immunglobulin lambda (IgL)-Kette-mRNA aus Mus musculus, vollständige kodierende Sequenz (cds). Autor: Reidl, L.S., Kinoshita, C.M., und Steiner, L.A. 1992. J. Immunol. 149: 471-480. Aufnahmenummer in GeneBank = M94349.
b) durch Konstruktionen von cDNA-Banken in pBluescript (Universal Riboclone System, Promega, Madison, USA; Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning. A laboratory manual. C.S.H. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) und Screenen dieser Banken mit den amplifizierten Fragmenten gemäß a).

Die so isolierten Ketten werden durch Rekombination in ein rekombinantes MVA-Virus, welches die Nukleinsäuresequenz, welche die Transmembranregion des Tollwut-Virus (Modified Vaccinia Ankara; Antoine et al., 1998, Virology, 244: 365-396, und französische Patentanmeldung Nr. FR 97 09152 ) kodiert, umfasst, subkloniert, um rekombinante Viren zu erhalten, die in der Lage sind, funktionsfähige Antikörper zu exprimieren, die in der Lage sind, ihr spezifisches Antigen zu erkennen und an dieses zu binden, und auf transmembranständige Weise auf der Oberfläche der rekombinierten Zellen exprimiert werden.
1-2 In vitro-Untersuchung der Wirkung der Antikörper TR310 und H57-597 auf die Proliferation von Mäuse-Splenozyten.
Splenozyten aus der Maus (Stamm DBA/2) wurden mit P815HT-Tumorzellen aus der Maus (Stamm C57/B16; Acres et al., 1993, J. Immunother. 14: 136-143) in Gegenwart des einen oder anderen der beiden Antikörper (TR310 und H57-597), die ausgehend von den entsprechenden Hybridomüberständen gereinigt wurden, 1 h bei 37°C stimuliert. Die Anwesenheit von Rezeptoren für Immunglobuline vom Fc-Typ auf der Oberfläche der P815HT-Zellen erlaubt die Bedeckung dieser Zellen mit den Antikörpern. Nach 5 Tagen Inkubation der P815-Zellen, die auf ihrer Oberfläche die ausgewählten Antikörper präsentieren, mit den Splenozyten wird die Proliferation der T-Lymphozyten durch einen Einbautest von tritiummarkiertem Thymidin gemessen (Gimmi et al., 1996, Nat. Med. 12: 1367-1371).
Außerdem wurden während dieser Untersuchung mehrere Parameter analysiert:

a) Anzahl von P815-Zellen, die auf ihrer Oberfläche die ausgewählten, für die Stimulation notwendigen Antikörper präsentieren;
b) etwaige Costimulation mit Hilfe von rekombinantem humanem IL-2 am Tag 4 (100 ng/ml, entsprechend 50 IE/ml; R&Dsystems).

1-3 Untersuchung der Th (T-Helfer)-Antwort, welche mit der Stimulation der Splenozyten durch die verschiedenen Antikörper (TR310 und H57-597), die auf der Oberfläche der P815-Zellen präsentiert werden, verbunden ist.
Um diese Antwort auszuwerten, wurden die Überstände aus dem vorangegangenen, in Gegenwart von rekombinantem humanem IL-2 ausgeführten Proliferationstest am Tag 4 oder 5 abgenommen. Die Anwesenheit von IL-4 (Antwort vom Th2-Typ) oder von IFNγ (Antwort vom Th1-Typ) in den Überständen wurde mit Hilfe von spezifischen Kits, die im Handel erhältlich sind, gemäß den Empfehlungen des Lieferanten (Kit Quantikine, R%D systems) gemessen.
2 – Ergebnisse
2-1 In vitro-Untersuchung der Wirkung der Antikörper TR310 und H57-597 auf die Proliferation von Splenozyten aus der Maus.
2 – 1 – 1 – Kontrollen
Parallel zu dieser Untersuchung wurde gleichfalls eine bestimmte Anzahl von Vergleichsproben analysiert.
Es handelt sich insbesondere darum, die Wirkungen zu messen, die unter identischen Bedingungen wie in dem Test im eigentlichen Sinne beobachtet werden, von:
RPMI-CT: negative Vergleichsprobe, welche nur das Medium umfasst.
spleno: negative Vergleichsprobe, welche nur die Splenozyten-Zellen umfasst.
spleno + P815 +/- IL-2: negative Vergleichsprobe, welche die Splenozyten-Zellen + die nicht ausgestatteten P815-Zielzellen in Gegenwart oder in Abwesenheit (+/-) von IL-2 (100 ng/ml), welches am Tag 4 zugesetzt wurde, umfasst.
spleno + P815/R2 +/- IL-2: negative Vergleichsprobe, welche die Splenozyten-Zellen + die P815-Zielzellen, die auf ihrer Oberfläche einen neutralen Antikörper (der nicht in der Lage ist, die Aktivierung der Lymphozyten zu aktivieren) tragen, +/- IL-2 (100 ng/ml), welches am Tag 4 zugesetzt wurde, umfasst.
spleno + ConA: positive Vergleichsprobe, welche der Stimulation der Splenozyten aus der Maus mit Hilfe von Concanavalin A (10 μg/ml), das ein starkes Mitogen für die Maus ist, entspricht.
spleno + PHA-P: positive Vergleichsprobe, welche der Stimulation der Splenozyten aus der Maus mit Hilfe von Phytohämagglutinin A (1 μg/ml), das ein starkes humanes Mitogen ist, entspricht.
2 – 1 – 2 – Test
P815/TR310 (20000/2000/200)+/-IL-2: Auswertung der Stimulation von Splenozyten aus der Maus durch P815-Zielzellen, die auf ihrer Oberfläche einen TR310-Antikörper tragen (2.10⁴, 2.10³, 2.10² Zellen/Test), in Gegenwart oder in Abwesenheit von rekombinantem humanem IL-2 ab Tag d + 4.
P815/H57-597 (20000/2000/200)+/-IL-2: Auswertung der Stimulation von Splenozyten aus der Maus durch P815-Zielzellen, die auf ihrer Oberfläche einen H57-597-Antikörper tragen (2.10⁴, 2.10³, 2.10² Zellen/Test), in Gegenwart oder in Abwesenheit von rekombinantem humanem IL-2 ab Tag d + 4.
Die erhaltenen Stimulationsergebnisse sind in der 1 aufgeführt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Präsentation von T-Lymphozyten "aktivierenden" Antikörpern auf der Oberfläche der P815-Zielzellen die Aktivierung und die Proliferation von Splenozyten aus der Maus (sichtbar gemacht durch den Einbau von tritiummarkiertem Thymidin) erlaubt. Das Hinzufügen von rekombinantem humanem Interleukin-2 scheint diese Antikörper-abhängige Stimulation nicht zu amplifizieren. Außerdem haben wir gleichfalls gezeigt, dass die Aktivierung der Lymphozyten, wie sie gemessen wird, von der Lyse der P815-Zielzellen begleitet wird.
2-2 Untersuchung der Th (T-Helfer)-Antwort, welche mit der Stimulation der Splenozyten durch die verschiedenen Antikörper (TR310 und H57-597) verbunden ist.
Die beobachteten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt, die die Messwerte aus den quantitativen Bestimmungen von IL-4 und IFNγ nach der Aktivierung von Splenozyten aus der Maus durch die auf der Oberfläche von P815-Mäusetumorzellen vorhandenen TR310- und H57-597-Antikörper angibt.
Diese quantitativen Bestimmungen zeigen, dass die TR310- und H57-597-Antikörper im Kontext einer Membranpräsentation die 2 Arten von Th1- und Th2-Antworten induzieren (Tabelle 1). Die Antikörper TR310 und H57-597 sind folglich in der Lage, wenn sie auf der Oberfläche von Tumorzellen präsentiert werden, eine Antwort vom Th1-"Helfer"-Typ, aber auch Th2-"Helfer"-Typ zu aktivieren, indem sie an ihren Membranrezeptor, der auf der Oberfläche der CD4+-T-Zellen vorhanden ist, binden. Die Sekretion dieser Zytokine erlaubt insbesondere, die gegen die Tumorzellen gerichtete Immunantwort zu erhöhen.
Beispiel 2
1 – Methoden:
1-1 Konstruktion der rekombinanten MVA-Viren
Es wurden drei rekombinante MVA-Viren konstruiert (MVATG14205, welches den Ratten-Antikörper TR310 (anti-V beta 7 aus der Maus) exprimiert; MAVTG14237, welches den Hamster-Antikörper H57-597 (anti-TCR alpha/beta aus dem Hamster) exprimiert, und MVATG14240, welches den Ratten-Antikörper KT3 (anti-CD3 epsilon aus der Ratte) exprimiert). Die Expressionskassetten wurden in die Deletion II des MVA (Modified Virus Ankara) eingeführt, wie in der Patentanmeldung WO 9903885 beschrieben. Die leichte Kette von jedem Antikörper wurde unter die Kontrolle des early-late-p7.5-Vakziniavirus-Promotors (Goebel et al., 1990, Virology, 179, 247-266) gestellt. Die die schwere Kette von jedem Antikörper kodierende Sequenz wurde unter die Kontrolle des early-late-pH5R-Vakziniavirus-Promotors (Goebel et al., 1990, Virology, 179, 247-266) gestellt. Um die Selektion der rekombinanten MVA-Viren zu vereinfachen, wird das Selektionsgen GPT (Xanthinguaninphosphoribosyltransferase) von E. coli eingesetzt. Das C-terminale Ende der schweren Kette von jedem Antikörper wird außerdem mit der Transmembran- und intrazytoplasmatischen Domäne des Tollwut- Glycoproteins fusioniert, um die Verankerung der Antikörper in der Plasmamembran zu ermöglichen.
1-2 Auswertung der Expression der verschiedenen Antikörper nach Infektion von embryonalen Hühnerzellen (CEP) mit den verschiedenen rekombinanten MVA-Viren.
Die Expression wird durch Western-Blot unter Berücksichtigung der Maßgaben des Kits "ECL^TM Western Blotting" von Amersham Life Science (Vereinigtes Königreich) analysiert. Dafür werden embryonale Hühnerzellen mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 1 mit den verschiedenen rekombinanten MVA-Viren infiziert. Die gleichen Zellen werden gleichfalls mit dem Kontrollvirus MVAN33 infiziert. Nach 24 h Infektion werden die Zellen mit PBS gewaschen, dann einer Beschallung in dem Abscheidungspuffer unterworfen. Die Suspension wird dann 3 min bei 95°C denaturiert, bevor sie auf einem 13%-igen Polyacrylamidgel aufgetrennt wird. Die so aufgetrennten Proteine werden dann auf eine PVDF-Membran (porablot; Macherey-Nagel) transferiert. Die Expression der Antikörper TR310 und KT3 wird nach Hybridisierung mit Hilfe eines Mäuse-Antikörpers, welcher gegen die IgG der Ratte gerichtet und an HRPO (Meerrettich-Peroxidase; 10 μg/ml) gebunden ist, analysiert. Die Expression des Antikörpers H57-597 wird nach Hybridisierung mit Hilfe eines Ratten-Antikörpers, welcher gegen die IgG des Hamsters gerichtet und an HRPO gebunden ist, analysiert.
1-3 Analyse der Expression der verschiedenen Antikörper nach Infektion von BHK21-Zellen mit den verschiedenen rekombinanten Viren durch Durchflusszytometrie.
Die Expression wird durch FACS nach Infektion von BHK21 (Baby Hamster Kidney)-Zellen mit einer MOI von 1 mit den verschiedenen rekombinanten MVA-Viren analysiert. Nach 12 h Infektion werden die Zellen abgelöst, dann analysiert. Der Nachweis der Antikörper TR310 und KT3 erfolgt nach Inkubation mit einem Mäuse-Antikörper, welcher gegen die IgG der Ratte gerichtet und an FITC gebunden ist (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (Pennsylvania, USA)). Der Nachweis des Antikörpers H57-597 erfolgt mit Hilfe eines Ratten-Antikörpers, der gegen die IgG des Hamsters gerichtet und an FITC gebunden ist (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (Pennsylvania, USA)). Die infizierten Zellen wurden gleichfalls mit einem Vergleichsantikörper inkubiert.
1-4 In vitro-Untersuchung der Funktionsfähigkeit der verschiedenen rekombinanten MVA-Viren.
Die Funktionsfähigkeit der rekombinanten MVA-Viren wird getestet, indem Proliferationstests an Splenozyten der Maus ausgeführt wurden. Splenozyten der Maus (Stamm DBA/2) werden mit P815HT- oder B16F0-Mäuse-Tumorzellen, welche mit den 3 rekombinanten MVA-Viren infiziert waren, stimuliert. Dafür werden P815HT- und B16F0-Zellen mit einer MOI von 1 20 h mit den Viren MVATG14205, MVATG14237, MVATG14240 und MVAN33 (Negativkontrolle) infiziert. Für das P815HT-Modell werden die Zellen gleichfalls mit 10 μg/ml der Antikörper TR310 und H57-597, welche ausgehend von Hybridomüberständen gereinigt worden sind, in Kontakt gebracht. Die infizierten oder ausgerüsteten Zellen werden dann 1 h mit Mitomycin C (Sigma; 50 μg/ml) behandelt, um deren Teilung zu stoppen. Nach 5 h Inkubation unter den verschiedenen Bedingungen für P815- und B16F0-Zellen und die Mäuse-Splenozyten wird die Proliferation der T-Lymphozyten durch einen Einbautest von tritiummarkiertem Thymidin gemessen.
2 – Ergebnissen
2-1 Konstruktion der rekombinanten MVA
Die rekombinanten MVA-Viren (MVATG14205; MVATG14237 und MVATG14240) werden durch homologe Rekombination in embryonalen Hühnerzellen mit Hilfe der verschiedenen Transferplasmide (pTG14205; pTG14237 und pTG14240) und eines Wildtyp-MVA-Virus MVAN33, wie in der Patentanmeldung WO 9903885 beschrieben, erzeugt.
2-2 Auswertung der Expression der verschiedenen Antikörper nach Infektion von embryonalen Hühnerzellen (CEP) mit den verschiedenen rekombinanten MVA-Viren.
Die Expression der verschiedenen Antikörper (TR310, H57-597 und KT3) wird durch Western-Blot nach Infektion von CEP mit den rekombinanten Viren analysiert. Die beobachteten Ergebnisse zeigen, dass es eine Expression von Immunglobulin vom Typ IgG aus der Ratte in den mit den Viren MVATG14205 und MVATG14240 infizierten Zellen gibt. Nach Infektion mit MVATG14237 gibt es gleichfalls eine Expression eines Immunglobulins vom Typ IgG aus dem Hamster. Diese Ergebnisse werden durch das Vorhandensein einer spezifischen Bande, die bei ungefähr 60 kDa wandert und der schweren Kette des Immunglobulins entspricht, enthüllt. Nach Infektion von CEP durch das Kontrollvirus MVAN33 konnte keinerlei spezifische Bande beobachtet werden.
2-3 Analyse der Expression der verschiedenen Antikörper nach Infektion von BHK21-Zellen mit den verschiedenen rekombinanten Viren durch Durchflusszytometrie.
Die Expression und der Zusammenbau der drei Antikörper werden durch Durchflusszytometrie ausgewertet (2). BHK21-Zellen werden mit einer MOI von 1 mit den 3 rekombinanten Viren infiziert. Die Analyse durch FACS hat erlaubt, die Expression von oberflächlichem IgG des Hamsters (H57-597) und der Ratte (TR310 und KT3) nach Inkubation der infizierten Zellen mit spezifisch gegen IgG der Ratte und des Hamsters gerichteten Antikörpern nachzuweisen. Diese Analyse hat gleichfalls erlaubt, die Expression der leichten Kette vom kappa-Typ in den mit den Viren MVATG14205 und MVATG14240 infizierten BHK21-Zellen nachzuweisen. Diese Ergebnisse erlauben, zu zeigen, dass die Infektion von BHK21-Zellen durch die verschiedenen rekombinanten Viren die Expression von korrekt umgelagerten membranständigen Immunglobulinen mit sich bringt.
2-4 In vitro-Untersuchung der Funktionsfähigkeit der verschiedenen rekombinanten MVA-Viren.
Die Funktionsfähigkeit der rekombinanten MVA-Viren wird getestet, indem Proliferationstests an Splenozyten aus der Maus ausgeführt werden. Dafür werden zwei Arten von Mäuse-Modellen eingesetzt, die P815HT-Zellen (3) und die B16F0-Zellen (4). Diese 2 Arten von Zellen werden mit den rekombinanten Viren infiziert, um auf deren Oberfläche transmembranständige Antikörper, die gegen die Gesamtheit oder einen Teil des TCR/CD3-Komplexes aus der Maus gerichtet sind, zu exprimieren. Wir haben die Proliferation gemessen, die durch das Inkontaktbringen von infizierten P815HT- und B16F0-Zellen mit naiven Mäuse-Splenozyten eines ähnlichen Haplotyps induziert wird. Zunächst werden P815HT-Zellen (schwach immunogen; H2d; welche CMHI, ICAMI und CD48 exprimieren) mit den 3 rekombinanten Viren und einem Kontrollvirus MVAN33 infiziert. Parallel dazu werden die gleichen P815HT-Zellen mit den Antikörpern TR310 und H57-597 inkubiert, um sie mit Antikörpern über das Zwischenglied ihres Fc-Rezeptors auszustatten. Für das Virus MVATG14205 (Stimulation der Vbeta 7-Zellen aus der Maus) ist die durch infizierte P815-Zellen induzierte Stimulation geringfügig höher als jene, die mit den ausgerüsteten Zellen erhalten wird. Außerdem bleibt das Proliferationsniveau sehr gering, wie bei der Spezifität des Antikörpers erwartet wird. Bei den Viren MVATG14237 und MVATG14240 ist der mit den infizierten Zellen erhaltene Index deutlich höher als jener, der mit den ausgerüsteten Zellen erhalten wird. Die mit den durch die 3 Viren infizierten Zellen erhaltenen Indices sind sehr deutlich höher als jene, die mit starken mitogenen Agentien, wie Concanavalin A oder Interleukin-2, erhalten werden. Schließlich haben wir in allen Fällen eine zur Anzahl von infizierten Zellen, die mit den Splenozyten in Kontakt gebracht worden sind, proportionale Dosis-Wirkung nachweisen können. Mit nichtinfizierten, mit einem Vergleichs-Antikörper ausgerüsteten oder mit einem Kontrollvirus infizierten P815HT-Zellen konnte keinerlei Stimulation nachgewiesen werden.
Auf gleiche Weise wurden die B16F0-Zellen in der gleichen Art von Experment eingesetzt (4). Diese B16F0-Zellen aus der Maus sind nicht-immunogen und weisen keinerlei Costimulationsmolekül auf. Wir haben so eine starke Proliferation von naiven Splenozyten nach Kontakt mit infizierten Zellen nachgewiesen. Auf gleiche Weise induzieren die mit MVATG14205 infizierten Zellen eine Proliferation, die geringer ist als bei den Zellen, die mit den Viren MVATG14237 und MVATG14240 infiziert waren. Bei diesen beiden Letzteren ist der mit 20000 Zellen erhaltene Proliferationsindex vergleichbar mit jenem, der mit Con A erhalten wird. In diesem Modell scheint die Menge von infizierten Zellen gleichfalls einen Einfluss auf den erhaltenen Proliferationsindex zu haben (Dosis-Wirkung).
Als Schlussfolgerung erweist sich sehr deutlich, dass die 3 rekombinanten Viren funktionsfähig sind. Die Expression der Antikörper TR310, H57-597 und KT3 auf der Oberfläche von Zellen erlaubt, gemäß der Erfindung eine starke Proliferation von naiven T-Zellen zu induzieren. Diese Stimulation ist auf vorteilhafte weise bedeutender als jene, die mit Zellen erhalten wird, die mit den gleichen Antikörpern durch das Zwischenglied eines Rezeptors vom Fc-Typ ausgestattet sind, aber gleichfalls als jene, die mit starken mitogenen Agentien, wie ConA, erhalten wird.

Claims

Biologisches Material für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche für die Behandlung von Säugetieren bestimmt sind, umfassend wenigstens eine Nukleinsäuresequenz, umfassend: (i) ein Gen, welches einen Antikörper oder ein Antikörperfragment fusioniert mit der Transmembrandomäne eines Transmembranpolypeptids kodiert, und (ii) Elemente, welche die Expression des Gens in vivo in Zielzellen, welche dazu bestimmt sind, durch die genannte Nukleinsäuresequenz genetisch modifiziert zu werden, sicherstellen; dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder das Antikörperfragment auf der Oberfläche der Zielzelle exprimiert wird und in der Lage ist, an einen Rezeptor, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Rezeptor des TCR-Komplexes, insbesondere TCR-α, TCR-β oder CD3, CD8, CD4, CD28, LFA-1, 4-1BB, CD47, CD2, CD9 CD45, CD40, den Rezeptoren von Zytokinen, wie IL-7, IL-4, IL-2, IL-15 oder GM-CSF, dem Va14NKT, NKAR, dem Fc-Rezeptor, zu binden.
Biologisches Material für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche für die Behandlung von Säugetieren bestimmt sind, umfassend wenigstens eine Zielzelle, welche von Natur aus keine Antikörper produziert, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielzelle in vitro durch wenigstens eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in Anspruch 1 definiert wird, modifiziert ist.
Biologisches Material nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz in Form einer nackten DNA- oder RNA-Sequenz vorliegt.
Biologisches Material nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz ein Vektor ist, welcher den Transfer des Gens in die Zielzellen erlaubt.
Biologisches Material nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein viraler Vektor ist.
Biologisches Material nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der virale Vektor ein adenoviraler Vektor, retroviraler Vektor, ein Poxvirus, insbesondere abgeleitet von dem Vacciniavirus oder dem Modified Virus Ankara (MVA), ist.
Biologisches Material nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor aus wenigstens einer genannten Nukleinsäuresequenz besteht, welche komplexiert oder konjugiert ist mit wenigstens einem Trägermolekül oder einer Trägersubstanz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer amphiphilen kationischen Substanz, insbesondere einem kationischen Lipid, einem kationischen oder neutralen Polymer, einer protischen polaren Verbindung, welche insbesondere unter Propylenglycol, Polyethylenglycol, Glycerol, Ethanol, 1-Methyl-L-2-pyrrolidon oder deren Derivaten ausgewählt wird, und einer aprotischen polaren Verbindung, welche insbesondere unter Dimethylsulfoxid (DMSO), Diethylsulfoxid, Di-n-propylsulfoxid, Dimethylsulfon, Sulfolan, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetramethylharnstoff, Acetonitril oder deren Derivaten ausgewählt wird.
Biologisches Material nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Transmembranpolypeptid aus der Gruppe bestehend aus einem Glycoprotein, einem Lipoprotein, einem Membranrezeptor ausgewählt wird.
Biologisches Material nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Transmembranpolypeptid aus der Gruppe bestehend aus dem Glycoprotein des Tollwutvirus, gp160 und CD4 ausgewählt wird.
Biologisches Material nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielzelle eine Säugetier-Tumorzelle, eine durch ein virales pathogenes Agens infizierte Säugetierzelle oder eine durch ein bakterielles pathogenes Agens infizierte Säugetierzelle ist.
Biologisches Material nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es in einer Form vorliegt, welche dessen Verabreichung in den Organismus eines Säugetiers wie auch gegebenenfalls dessen vorab erfolgende Kultivierung erlaubt.
Biologisches Material nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielzellen von dem zu behandelnden Säugetier stammen.
Biologisches Material nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielzellen von einem anderen Säugetier als jenem, welches zu behandeln ist, stammen und eine Behandlung, welche diese kompatibel oder verträglich macht, durchlaufen haben.
Biologisches Material nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem wenigstens eine DNA-Sequenz umfasst, welche die Expression einer Verbindung, welche an der Aktivierung der zytotoxischen Effektorzellen oder von T-Helfer-Lymphozyten beteiligt ist, sicherstellt.
Verwendung eines biologischen Materials nach einem der Ansprüche 1 bis 13 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche für die Behandlung oder die Verhütung von Krebserkrankungen oder von viralen Infektionen bestimmt ist.
Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, umfassend: (i) ein Gen, welches einen Antikörper oder ein Antikörperfragment fusioniert mit der Transmembrandomäne eines Transmembranpolypeptids kodiert, und (ii) Elemente, welche die Expression des Gens in vivo in Zielzellen, welche dazu bestimmt sind, durch die genannte Nukleinsäuresequenz genetisch modifiziert zu werden, sicherstellen; dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder das Antikörperfragment in der Lage ist, an einen Rezeptor, der ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus der Gesamtheit oder einem Teil des TCR-Komplexes, zu binden, für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche für die Behandlung eines Säugetiers durch Gentransfer bestimmt sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein biologisches Material nach einem der Ansprüche 1 bis 14, vorteilhafterweise in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Vehikel umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17, welche ein biologisches Material nach einem der Ansprüche 11 bis 13 und eine Verbindung, welche von Natur aus für die Aktivierung der zytotoxischen Effektorzellen oder von T-Helfer-Lymphozyten verantwortlich ist, umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ein Zytokin oder ein Chemokin ist.
Nicht-germinale Säugetierzelle, welche von Natur aus keine Antikörper produziert, dadurch gekennzeichnet, dass sie genetisch modifiziert ist durch wenigstens eine Nukleinsäuresequenz, umfassend: (i) ein Gen, welches einen Antikörper oder ein Antikörperfragment fusioniert mit der Transmembrandomäne eines Transmembranpolypeptids kodiert, und (ii) Elemente, welche die Expression des Gens in vivo in Zielzellen, welche dazu bestimmt sind, durch die genannte Nukleinsäuresequenz genetisch modifiziert zu werden, sicherstellen; dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder das Antikörperfragment in der Lage ist, an einen Rezeptor, der ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus der Gesamtheit oder einem Teil des TCR-Komplexes, zu binden.
Verfahren zur in vitro-Herstellung einer Zelle nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man in eine nicht-germinale Säugetierzelle, welche von Natur aus keine Antikörper produziert, durch ein jegliches geeignetes Mittel oder eine jegliche geeignete Maßnahme wenigstens eine Nukleinsäuresequenz einschleust, umfassend: (i) ein Gen, welches einen Antikörper oder ein Antikörperfragment fusioniert mit der Transmembrandomäne eines Transmembranpolypeptids kodiert, und (ii) Elemente, welche die Expression des Gens in vivo in Zielzellen, welche dazu bestimmt sind, durch die genannte Nukleinsäuresequenz genetisch modifiziert zu werden, sicherstellen; dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder das Antikörperfragment in der Lage ist, an einen Rezeptor, der ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus der Gesamtheit oder einem Teil des TCR-Komplexes zu binden, dann dadurch, dass man unter diesen Zellen jene, die durch die genannte Nukleinsäuresequenz genetisch modifiziert worden sind, selektiert.