DE10163755A1

DE10163755A1 - Tumor-Peptidantigene aus humanem CD19-Protein

Info

Publication number: DE10163755A1
Application number: DE2001163755
Authority: DE
Inventors: Matthias Theobald; Anne Cellary
Original assignee: IMMUGENICS AG
Current assignee: IMMUGENICS AG
Priority date: 2001-12-27
Filing date: 2001-12-27
Publication date: 2004-01-08
Also published as: WO2003055907A1; AU2002360062A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein B-Zell-Malignom-assoziiertes Oligopeptid, das von CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten (ZTL) als Peptidantigen erkannt wird und das eine ZTL-induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumor- oder Leukämiezellen herbeiführt. Die Oligopeptide weisen Aminosäuresequenzen auf, die Teilsequenzen des humanen CD19-Proteins entsprechen. Jedes Oligopeptid stellt ein Epitop für CD8-positive ZTL dar und ist dazu geeignet, eine auf humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante A2 (kurz: A2) eingeschränkte (restringierte Immunantwort von CD8-positiven ZTL Tumor- und Leukämiezellen zu induzieren.

Description

Die Erfindung betrifft ein B-Zell-Malignom-assoziiertes Oligopeptid, das von CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten (ZTL) als Peptidantigen erkannt wird und das eine ZTL-induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumor- oder Leukämiezellen herbeiführt.
CD8-positive ZTL stellen Effektorzellen des zellulären Immunsystems dar. Ihre Funktion besteht in der spezifischen Eliminierung von infizierten oder entarteten körpereigenen Zellen. Die ZTL erkennen unter anderem tumorspezifische oder tumorassoziierte Peptidantigene (TAA), die an Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Moleküle der Klasse I gebunden und auf der Oberfläche der entarteten Zellen präsentiert sind. Die Erkennung der Peptidantigene im Kontext von MHC Klasse I-Molekülen erfolgt durch spezifische membranständige T-Zellrezeptoren (TZR) der ZTL. Nach Erkennung wird die betreffende Zelle abgetötet, indem die ZTL die Zielzellen lysieren und/oder den programmierten Zelltod (Apoptose) dieser Zielzellen induzieren oder Cytokine freisetzen.
Die Erkennung von Zielzellen durch ZTL wird durch die Expression des CD8-Korezeptors auf ZTL erleichtert. Der CD8-Korezeptor bindet an konservierte Regionen der α2- und α3-Domänen des MHC Klasse I-Moleküls und trägt damit zur Stabilisierung des TZR-Peptid-MHC-Komplexes bei.
Zu den tumorassoziierten Peptidantigenen, die im Kontext von MHC Klasse I-Molekülen auf der Oberfläche von Tumorzellen präsentiert werden, gehört das humane CD19-Protein, das nicht nur von normalen B-Zellen, sondern auch bei B-lymphoiden Neoplasien (malignen hämatologischen Systemerkrankungen) z.B. Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL) einschließlich Burkitt-Lymphom und CLL sowie akuten lymphatischen Leukämien unterschiedlicher Differenzierungsstadien exprimiert wird. Die aus der zellulären Prozessierung des CD19-Proteins resultierenden Oligopeptide können im Kontext von MHC Klasse I Molekülen der Allelvariante A2, Subtyp A2.1 (kurz: A2.1, das häufigste MHC-Klasse I -Allel in der kaukasischen Bevölkerung), auf der Zelloberfläche präsentiert werden und repräsentieren attraktive Zielstrukturen für CD8-positive ZTL. Das CD19-Protein wird während der gesamten B-Zell-Ontogenese vom frühen B-Zell-Progenitor bis zum reifen B-Zell-Stadium exprimiert, mit Ausnahme der terminal differenzierten Plasmazellen, die CD19 auf der Zelloberfläche nicht mehr exprimieren.
Voraussetzung für die Entwicklung immuntherapeutischer Verfahren zur Behandlung von bösartigen Tumorerkrankungen ist die Identifizierung immunogener Tumorantigene. Solche Tumorantigene können unter bestimmten Voraussetzungen als Impfstoff zur Induktion von T-Zellen im allgemeinen und von Tumor-reaktiven T-Zellen im besonderen eingesetzt werden mit dem Ziel, daß diese T-Zellen die Remission und Eradikation eines bestimmten Tumors herbeiführen. Im Fall von Melanomen sind bereits einige Peptidantigene bekannt, die auf diese Weise zur Immuntherapie innerhalb klinischer Prüfungen verwendet werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, B-Zell-Tumorassoziierte Peptidantigene bereitzustellen, die von CD8-positiven ZTL erkannt werden und eine ZTL-induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumor- oder Leukämiezellen herbeiführen Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Oligopeptids, das (a1) die im Sequenzprotokoll Nr. 1 dargestellte Aminosäuresequenz KAWQPGWTV aufweist, die den Aminosäurepositionen 105 bis 113 des humanen CD19-Proteins (gemäß Stamenkovic and Seed, 1988) entspricht, oder das eine durch Aminosäure-Substitution, – Deletion, -Insertion, -Addition, -Inversion und/oder durch chemische oder physikalische Modifikation einer oder mehrerer Aminosäuren davon ableitbare Aminosäuresequenz aufweist, die ein funktionelles Äquivalent zu der Aminosäuresequenz KAWQPGWTV darstellt, oder das (a2) die im Sequenzprotokoll Nr.2 dargestellte Aminosäuresequenz EIWEGEPPCV aufweist, die den Aminosäurepositionen 165 bis 174 des humanen CD19-Proteins (gemäß Stamenkovic and Seed, 1988) entspricht, oder das eine durch Aminosäure-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition, -Inversion und/oder durch chemische oder physikalische Modifikation einer oder mehrerer Aminosäuren davon ableitbare Aminosäuresequenz aufweist, die ein funktionelles Äquivalent zu der Aminosäuresequenz KAWQPGWTV darstellt, und das (b) ein Epitop für CD8-positive ZTL darstellt, und (c) dazu geeignet ist, eine auf humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante A2 (kurz: A2) eingeschränkte (restringierte) Immunantwort von CD8-positiven ZTL gegen Tumor- und Leukämiezellen zu induzieren.
Eine äquivalente Lösung besteht in der Bereitstellung eines zu diesem erfindungsgemäßen Oligopeptid analogen retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids, das anstelle der -CO-NH-Peptidbindungen Nichtpeptidbindungen wie z.B. -NH-CO-Bindungen aufweist (vgl. Meziere et al. 1997).
Mit den Oligopeptiden CD19 105-113 und CD19 165-174 werden erstmals Peptidantigene bereitgestellt, deren Aminosäuresequenz aus dem humanen CD19-Protein stammt (vgl. Stamenkovic I. and Seed B., 1988). Die Oligopeptide CD19 105-113 und CD19 165-174 und ihre Dertvate stellen 8-Zell-assoziierte Tumorantigene für ZTL dar und liefern damit die molekulare Grundlage für eine CD19-spezifische Immuntherapie maligner B-lymphoider System-Erkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Oligopeptide (CD19105-113 und CD19165-174 und deren Derivate) können in der aktiven und passiven Immunisierung von Patienten mit bösartigen lymphohämopoetischen Neoplasien, bei denen das CD19 Epitop 105-113 und/oder das CD19 Epitop 165-174 im Kontext von A2.1 präsentiert wird/werden, eingesetzt werden, um die Induktion, Generierung und Expandierung von CD19 105-113 und/oder CD19 165-174 spezifischen zytotoxischen 7-Lymphozyten herbeizuführen, die in der Lage sind, die Tumor- oder Leukämiezellen der betreffenden Patienten spezifisch abzutöten und dadurch eine Heilung zu vermitteln.
Im Zuge der vorliegenden Erfindung zeigte sich überraschenderweise, daß CD8-positive ZTL das CD 19-Protein auf der Oberfläche von malignen B-lymphoiden Zellen spezifisch erkennen und diese abtöten, während bei normalen B-Zellen keine ZTL-induzierte Lyse auftritt. Für die Oligopeptide CD19 105-113 und CD19 165-174 und deren Derivate ergibt sich daraus der Vorteil eines vernachlässigbar geringen Risikos eines unerwünschten Angriffs auf Normalzellen.
Die Derivate des Oligopeptids CD19 105-113 und des Oligopeptids CD19 165-174 und auch die davon abgeleiteten retro-inversen Peptide oder Pseudopeptide haben gegenüber dem jeweils ursprünglichen Oligopeptid selbst den Vorteil, daß damit eine potentielle funktionelle Selbsttoleranz (gegenüber dem CD19 105-113 bzw. dem CD19 165-174 Oligopeptid) auf T-Zellebene umgangen werden kann. Während das CD19 105-113 bzw. das CD19 165-174 Oligopeptid aufgrund der (geringen) Expression in einigen Normalgeweben u. U. in dem betreffenden Organismus (Patientenkörper) ein sogenanntes Tolerogen darstellt und für die organismuseigenen (patienteneigenen) ZTL nicht immunogen ist, werden die Derivate dieser Oligopeptide (CD19 105-113 und CD19 165-174) im Regelfall als Antigene erkannt und induzieren die Aktivierung und Expandierung von ZTL. Diese Derivat-induzierten ZTL weisen in der Regel eine hohe Kreuzreaktivität gegenüber der betreffenden CD19 105-113 bzw. CD19 165-174 Wildtypsequenz auf und induzieren infolgedessen auch die Lyse und/oder Apoptose von solchen (Tumor-)Zellen, die CD19 105-113 und/oder CD19 165-174 (im Kontext von A2, insbesondere von A2.1) auf ihrer Oberfläche präsentieren.
Besonders bevorzugte Derivate des CD19 105-113 bzw. des CD19 165-174 Oligopeptids sind solche, die natürlicherweise in anderen Säuge- oder Wirbeltieren vorkommen, z.B. CD19 105-113- bzw. CD19 165-174 -Homologe aus der Maus. Die CD19-(Protein-) und Peptid-Homologe und die dafür kodierenden Nukleinsäuren können relativ leicht, nämlich direkt und mit geläufigen Isolationsverfahren aus dem jeweiligen Organismus gewonnen werden.
Die Oligopeptide CD19 105-113 und CD19 165-174 und deren Derivate sowie die retro-inversen Peptide oder Pseudopeptide können mittels gängiger Peptidsyntheseverfahren hergestellt werden, und die für diese Oligopeptide kodierenden Nukleotidsequenzen können mit bekannten chemischen oder mit molekularbiologischen Verfahren gewonnen werden.
Es besteht zudem die Möglichkeit, aus den vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Oligopeptiden, einem flexiblem Linker und einer schweren Kette des HLA-Moleküls ein Fusionsprotein zu konstruieren, und zwar derart, daß das Oligopeptid dazu befähigt (in der Lage bzw. geeignet) ist, die Peptid-Bindungsfurche des HLA-Moleküls zu besetzen. Diese Fusionsproteine und dafür kodierende Polynukleotide eignen sich insbesondere als (Wirkstoff von einem) Diagnostikum oder Therapeutikum oder Prophylaktikum oder allgemein für eine Detektion und/oder Manipulation von T-Zellen, die eines der in den Sequenzprotokollen Nr. 1 und Nr. 2 dargestellten CD-19-Oligopeptide erkennen. Die Erfindung betrifft deshalb auch ein Fusionsprotein, welches aus einem der vorstehend beschriebenen Oligopeptide, aus einer schweren Kette des HLA-Moleküls und aus einem flexiblem Linker besteht und derart konstruiert ist, daß das Oligopeptid geeignet (in der Lage bzw. befähigt) ist, die Peptid-Bindungsfurche des HLA-Moleküls zu besetzen, und welches zur Verwendung bzw. für den Einsatz als Diagnostikum oder Therapeutikum oder Prophylaktikum oder allgemein für eine Detektion und/oder Manipulation von T-Zellen, die eines der in den Sequenzprotokollen Nr.1 und Nr.2 dargestellten CD19-Oligopetide erkennen, geeignet ist. Die für dieses Fusionsprotein kodierende Polynukleotide sind ebenfalls Gegenstand vorliegender Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Oligopeptide (CD19 105-113 und CD19 165-174 und deren Derivate) sowie die retro-inversen Peptide oder Pseudopetide und die vorstehend beschriebenen Fusionsproteine eignen sich sowohl zur in-vivo-Induktion von T-Lymphozyten im Patienten als auch zur in-vitro-Induktion und -Expansion entsprechend reaktiver patienteneigener oder patientenfremder T-Lymphozyten.
Für eine in-vivo-Induktion und -Expansion von T-Lymphozyten im Patienten kommen verschiedene Verfahren in Betracht, beispielsweise (a) die Injektion des CD19 105-113 und/oder CD19 165-174 Oligopeptids und/oder eines oder mehrerer Derivate eines oder beider dieser Oligopeptide und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopetids und/oder eines vorstehend beschriebenen Fusionsproteins – als reines Peptid oder zusammen mit Adjuvantien oder mit Cytokinen oder in einem geeigneten Freisetzungssystem wie z.B. Liposomen, (b) die Injektion einer oder mehrerer mindestens für das CD19 105-113 und/oder das CD19 165-174 Oligopeptid oder deren Derivate und/oder für eines der retro-inversen Peptide oder Pseudopetide und/oder für eines der Fusionsproteine kodierenden Nukleinsäuren – in "nackter" oder komplexierter Form oder in Form von viralen oder nichtviralen Vektoren oder zusammen mit Freisetzungssystemen wie kationischen Lipiden oder kationischen Polymeren, (c) die Beladung von Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs mit dem CD19 105-113 und/oder dem CD19 165-174 Oligopeptid oder deren Derivaten oder dazu analogen retro-inversen Peptiden oder Pseudopeptiden, (d) die Beladung von Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs mit dem CD19-Protein oder Homologen anderer Spezies, so daß infolgedessen das CD19 105-113 und/oder das CD19 165-174 Oligopeptid und/oder Derivate eines oder beider dieser Oligopeptide auf den jeweiligen Zellen präsentiert wird, oder (e) die Transfektion oder Infektion von Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs mit den mindestens für das CD19 105-113 und/oder das CD19 165-174 Oligopeptid oder deren Derivate oder für ein davon abgeleitetes retro-inverses Peptid oder Pseudopetid oder für ein vorstehen beschriebenes Fusionsprotein kodierenden Nukleinsäuren (wiederum entweder in "nackter" oder komplexierter Form oder in Form von vitalen oder nichtvitalen Vektoren).
Im Fall einer in-vitro-Induktion und -Expansion werden die in-vitro gewonnenen T-Lymphozyten anschließend dem Patienten per Infusion oder Injektion o. ä Verfahren zugeführt.
Die Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung des CD19 105-113 und/oder des CD19 165-174 Oligopeptids und/oder deren Derivate und/oder dazu analoger retro-inverser Peptide oder Pseudopeptide und/oder der vorstehen beschriebenen Fusionsproteine und/oder wenigstens eines Polynukleotids, das mindestens für das CD19 105-113 und/oder das CD19 165-174 Oligopeptid und/oder ein Derivat eines oder beider dieser Oligopeptide kodiert, zur Herstellung von Diagnostika – insbesondere MHC-Tetramere oder MHC-Dimere oder andere Strukturen, an die wenigstens ein solches erfindungsgemäßes Oligopeptid oder retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung assoziiert ist – und/oder Prophylaktika und/oder Therapeutika (insbesondere Impfstoffe) für den Nachweis und/oder die Beeinflussung und/oder Generierung und/oder Expandierung und/oder Steuerung des Aktivierungs- und Funktionszustands von T-Zellen, insbesondere CD8-positiven ZTL.
Als Therapeutika und/oder Prophylaktika kommen insbesondere Impfstoffe oder Injektionen oder Infusionslösungen in Betracht, die als Wirkstoff (a) das CD19 105-113 und/oder das CD19 165-174 Oligopeptid und/oder wenigstens ein Derivat eines dieser Oligopeptide und/oder wenigstens ein zu einem dieser Oligopeptide oder zu deren Derivate analoges retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid und/oder wenigstens eines der vorstehend beschriebenen Fusionsproteine enthalten, und/oder die (b) eine Nukleinsäure enthalten, die mindestens für das CD19 105-113 und/oder das CD19 165-174 Oligopeptid oder mindestens für ein Derivat eines dieser Oligopeptide kodiert, und/oder die (c) in-vitro erzeugte T-Lymphozyten, welche spezifisch gegen das CD19 105-113 und/oder das CD 19 165-174 Oligopeptid und/oder deren Derivate) und/oder gegen ein zu einem dieser Oligopeptide oder zu einem Derivat dieser Oligopeptide analoges retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid gerichtet sind, enthalten.
Zur Herstellung der Diagnostika oder auch der Therapeutika oder auch der Prophylaktika eignen sich insbesondere auch rekombinante DNS- oder RNS-Vektormoleküle, die ein oder mehrere Polynukleotid(e) enthalten, welche für mindestens das CD19 105-113 und/oder das CD19 165-174 Oligopeptid und/oder für mindestens ein Derivat eines dieser Oligopeptide kodieren, und die in Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs transkribierbar bzw. exprimierbar sind. Die Erfindung umfaßt deshalb auch solche rekombinanten DNS- oder RNS-Vektormoleküle und Wirtszellen, die diese Vektormoleküle enthalten.
Als Diagnostikum oder Therapeutikum oder Prophylaktikum oder allgemein für eine Defektion und/oder Manipulation von CD19 105-113 und/oder das CD19 165-174 überexprimierenden Zellen können erfindungsgemäß auch polyklonale, monoklonale oder rekombinante Antikörper eingesetzt werden, die gegen das CD19 105-113 und/oder das CD19 165-174 Oligopeptid und/oder gegen ein Derivat eines dieser Oligopeptide und/oder gegen ein zu einem dieser Oligopeptide oder deren Derivate analoges retroinverses Peptid oder Pseudopeptid und/oder gegen ein vorstehend beschriebenes Fusiosnprotein gerichtet sind oder die mit einem Komplex aus einem der betreffenden Oligopeptide bzw. dessen Derivate bzw, dazu retro-inversen Peptid(en) und/oder Pseudopeptid(en) und HLA-A2 reagieren.
Die Verwendung des CD19 105-113 und/oder des CD19 165-174 Oligopeptids und/oder eines Derivates dieser Oligopeptide und/oder eines zu einem dieser Oligopeptide oder zu einem Derivat dieser Oligopeptide analogen retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids oder eines Fusionsproteins für die Herstellung polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter Antikörper gegen ein solches erfindungsgemäßes Oligopeptid bzw. retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid und der/die betreffende(n) Antikörper an sich sind folglich ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
Als Diagnostikum oder Therapeutikum oder Prophylaktikum oder allgemein für eine Detektion und/oder Manipulation von CD19 105-113 und/oder CD19 165-174 überexprimierenden Zellen können erfindungsgemäß auch polyklonale, monoklonale oder rekombinante A2-restringierte T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalente Moleküle eingesetzt werden, die spezifisch für das CD19 105-113 undloder das CD19 165-174 Oligopeptid und/oder ein Derivat eines dieser Oligopeptide und/oder für dazu analoge retro-inverse Peptide oder Pseudopeptide und/oder für ein vorstehend beschriebenes Fusionsprotein sind. Die T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenten Moleküle können autologen, allogenen oder xenogenen Ursprungs sein. Zum Gegenstand vorliegender Erfindung gehört folglich vorrangig auch:

– die Verwendung des CD19 105-113 und/oder des CD19 165-174 Oligopeptids und/oder eines Derivates eines dieser Oligopeptide und/oder dazu analoger retroinverser Peptide oder Pseudopeptide oder die Verwendung von Polynukleotiden mit einer Nukleotidsequenz, die mindestens für das CD19 105-113 und/oder das CD19 165-174 Oligopeptid und/oder ein Derivat dieser Oligopeptide kodiert, zur Herstellung polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter A2-restringierter T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenter Moleküle mit Spezifität für ein solches erfindungsgemäßes Oligopeptid bzw. retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid,
– der/die betreffende(n) T-Zellrezeptor(en) an sich und dazu funktionell äquivalente Moleküle,
– sowie Polynukleotide, die für diese T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenten Moleküle kodieren,
– Expressionsvektoren mit der Fähigkeit zur Expression dieser T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenten Moleküle.

Die Erfindung umfaßt außerdem Reagenzien zur in-vivo- oder in-vitro-Aktivierung von T-Zellen, insbesondere CD8-positiven ZTL, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie unter Verwendung des CD19 105-113 und/oder des CD19 165-174 Oligopeptids und/oder wenigstens eines Derivates eines dieser Oligopetide und/oder wenigstens eines dazu analogen retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids oder wenigstens eines vorstehend beschriebenen Fusionsproteins und/oder unter Verwendung wenigstens eines Polynukleotids, das mindestens für das Oligopeptid oder dessen Derivate) kodiert und/oder unter Verwendung des CD19-Proteins oder dazu Homologen anderer Spezies, hergestellt sind. Bei diesen Reagenzien kann es sich insbesondere um Therapeutika, und dabei vor allem um Impfstoffe handeln.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Herstellungs- und Anwendungsbeispielen mit Figuren näher erläutert. Die verwendeten Abkürzungen bedeuten:
A2: humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante "A2"
A2.1: humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante "A2", Subtyp "A2.1 "
A2K^b: A2.1/K^b= MHC Klasse I-Molekül aus α₁- und α₂-Domäne von A2 und α₃-Domäne von K^b
ALL: akute lymphatische Leukämie
AML: akute myeloische Leukämie
APS: Ammoniumpersulfat
APZ: antigenpräsentierende Zelle
ATCC: American Type Culture Collection
ATP: Adenosin-5'-triphosphat
B-ALL: B-Zell-ALL
bkgd: unspezifische Fluoreszenzintensität
bp: Basenpaare
BSA: Rinderserumalbumin
C-terminal: Carboxyl-terminal
CD: Differenzierungscluster
CD8: humaner CD8α/β-Korezeptor
CDR: komplementaritätsbestimmende Region
CLL: chronisch lymphatische Leukämie
CML: chronisch myeloische Leukämie
CMV: Cytomegalievirus
Con A: Concanavalin A
DMSO: Dimethylsulfoxid
DNA: Desoxyribonukleinsäure
DSMZ: Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
DTT: Dithiothreitol
DZ: dendritische Zellen
E:T: Effektor- zu Zielzell-Verhältnis
EBV: Epstein-Barr-Virus
EDTA: Ethylendiamintetraacetat
ER: Endoplasmatisches Retikulum
FACS: Fluoreszenz-aktivierter Zell-Sortierer
FCS: fötales Kälberserum
FITC: Fluoreszein-Isothiocyanat
Flu M1: A/PR/8/34 Influenza Virus-Matrixprotein M1
G-418: Geneticin (Neomycin-Antibiotikum)
GM-CSF: Granulozyten-Makrophagen-colony stimulating factor
HBV pol: Hepatitis B Virus-Polymerase
HEPES: N-(2-Hydroxyethyl)piperizan-N'-ethansulfonsäure
HLA: humanes Leukozyten-Antigen
HLA-A2.1: humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante "A2", Subtyp "A2.1"
HPLC: Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
IFA: inkomplettes Freundsches Adjuvans
IFN: Interferon
Ig: Immunglobulin
IL: Interleukin
kb: Kilobasenpaare
K^b: H-2K^b
kDa: kilo Dalton
LB: Luria-Bertani
LCL: lymphoblastoide Zellinie
LMP: low molecular mass polypeptide
LPS: Lipopolysaccharid
MHC: Haupthistokompatibilitätskomplex
Mio: Million
mut: mutiert
N-terminal: Amino-terminal
OD: optische Dichte
PBMC: mononukleäre Zellen des peripheren Bluts
PBS: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PG-E₂: Prostaglandin E₂
PHA: Phytohämagglutinin
PMSF: Phenylmethylsulfonylfluorid
PVDF: Polyvinylidendifluorid
Rad: radiation absorbed dose
RP: reverse phase
SDS: Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
SL: spezifische Lyse
SV-40: Simian Virus-40
TAA: tumorassoziierte(s) Antigen(e)
TAP: Transporter assoziiert mit Antigenprozessierung
TBE: Tris-Borsäure-EDTA
TE: Tris-EDTA
TEMED: N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
TFA: Trifluoressigsäure
TIL: Tumor-infiltrierende Lymphozyten
TNF-α: Tumor Nekrosis Faktor-α
Tris: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
TZR: T-Zellrezeptor
u: internationale Einheiten (units)
Upm: Umdrehungen pro Minute
VSV-N: Vesikuläres Stomatitis-Virus-Nukleoprotein
v/v: Volumen pro Volumen
wt: Wildtyp
w/v: Masse pro Volumen
ZTL: zytotoxische T-Lymphozyten
Abkürzungen für Aminosäuren:
A: Alanin
C: Cystein
D: Aspartat
E: Glutamat
F: Phenylalanin
G: Glycin
H: Histidin
I: Isoleucin
K: Lysin
L: Leucin
M: Methionin
N: Asparagin
P: Prolin
Q: Glutamin
R: Arginin
S: Serin
T: Threonin
V: Valin
W: Tryptophan
Y: Tyrosin
Die Figuren zeigen:
1 Bindung selektierter synthetischer CD19-Peptide. Die relative A2.1-Bindungsaffinität (angegeben als % Inhibition) wurde bestimmt durch die Fähigkeit des jeweiligen Peptids, die A2.1-Bindung des Peptids p53 264-272 zu inhibieren. Dies wurde anhand der Inhibition der p53-spezifischen ZTL-Lyse von p53 264-272-beladenen EA2-Zielzellen durch CD19-Peptide unterschiedlicher Konzentration gemessen. Die Inhibitionswerte für die Peptide Flu M1 58-66 und VSV-N 52-59 wurden aus 6 unabhängigen Experimenten gemittelt.
2 A2.1-restringierte Immunogenität synthetischer CD19-Peptide in A2K^b- oder CD8 × A2K^b-transgenen Mäusen. Die Immunogenität wurde anhand der lytischen Aktivität der in diesen Mäusen durch Peptid-Immunisierung induzierten ZTL in einem 4-stündigen Zytotoxizitätstest überprüft. Als Zielzellen wurden mit 2 μg Peptid beladene oder unbeladene T2 bzw. T2A2K^b-Zellen eingesetzt. Dargestellt sind repräsentative spezifische Lysen individueller ZTL-Kulturen aus durchschnittlich 4 immunisierten Mäusen.
3 H-2^b-restringierte Immunogenität synthetischer CD19-Peptide in A2K^b- oder CD8 × A2K^b-transgenen Mäusen. Die Immunogenität wurde anhand der lytischen Aktivität der in diesen Mäusen durch Peptid-Immunisierung induzierten ZTL in einem 4-stündigen Zytotoxizitätstest überprüft. Als Zielzellen wurden mit 2 μg Peptid beladene oder unbeladene EL4-Zellen eingesetzt. Die Daten repräsentieren die spezifischen Lysen der in 2 ausgewählten ZTL-Kulturen.
4 CD19.105-spezifische ZTL-Linien: Effizienz der Peptiderkennung und Peptidspezifität. Aus A2.1- und CD8 × A2K^b-transgenen Mäusen wurden durch wiederholte in vitro-Stimulation mit dem CD19.105-Peptid bzw. dem Peptid Flu M1 die CD 19-reaktiven ZTL-Linien A2 19.105 (❚) und CD8 × A2K^b 19.105 (☐) Si sowie die Flu M1 58-66-spezifische ZTL-Linie CD8 × A2K^b Flu M1 58-66 etabliert und in einem 4-stündigen Zytotoxizitätstest unter den angegebenen E:T-Verhältnissen getestet. Zielzellen waren: bei den angegebenen Peptidkonzentrationen inkubierte T2-Zellen (obere Graphik), CD 19.105-beladene (•), Flu M1 58-66-beladene (Δ) und unbeladene (❍) T2-Zielzellen (untere Graphiken).
5 CD19.165-spezifische ZTL-Linien: Effizienz der Peptiderkennung und Peptidspezifität. Aus A2.1- und CD8 × A2K^b-transgenen Mäusen wurden durch wiederholte in vitro-Stimulation mit dem CD19.165-Peptid bzw. dem Peptid FluM 1 die CD19-reaktiven ZTL-Linien A2 19.165 (☐) und CD8 × A2K^b 19.165 (❚) sowie die Flu M1 58-66-spezifische ZTL-Linie CD8 × A2K^b Flu M1 58-66 etabliert und in einem 4-stündigen Zytotoxizitätstest unter den angegebenen E:T-Verhältnissen getestet. Zielzellen waren: bei den angegebenen Peptidkonzentrationen inkubierte T2-Zellen (obere Graphik), CD 19.165-beladene (•), Flu M1 58-66-beladene (Δ), HuWT p53.264-272 beladene (☐) und unbeladene (❍) T2-Zielzellen (untere Graphiken).
6 ZTL-Erkennung von EA2 bzw. EA2K^b CD19-Transfektanten. Die A2.1-restringierten und CD19.105-spezifischen ZTL A2 und CD8 × A2K^b 19.105 sowie die allo-A2.1-reaktiven ZTL CD8 also A2 und die Flu M1 58-66-spezifischen ZTL CD8 × A2 Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E:T-Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen folgende Zielzellen getestet: EA2 (☐), CD19-transfizierte EA2 cl 24 (•), mit dem Hygromycin-Resistenzgen transfizierte EA2K^b Hygro (Δ) sowie CD19-transfizierte EA2K^b cl 74 (☗);
7 ZTL-Erkennung von EA2 bzw. EA2K^b CD19-Transfektanten. Die A2.1-restringierten und CD19.165-spezifischen ZTL A2 und CD8 × A2K^b 19.165 sowie die allo-A2.1-reaktiven ZTL CD8 allo A2 und die Flu M1 58-66-spezifischen ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E:T-Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen folgende Zielzellen getestet: EA2 (☐), CD19-transfizierte EA2 cl 24 (•), EA2K^b (Δ) sowie CD19-transfizierte EA2K^b cl 74 (☗);
8 CD19-Expression von EA2 und EA2K^b CD19-Transfektanten. EA2 und EA2K^b -Zellen sowie CD19-transfizierte EA2 und EA2K^b-Zellen (EA2 cl 24-Zellen und EA2K^b cl 74) wurden bezüglich ihrer CD19-Expression nach Antikörper-Markierung im FACS analysiert. Die Fluoreszenz-Intensitäten der mit dem antihu-CD19 direkt FITC-konjugierten Antikörper (CD19) sowie einem anti-hu-CD8 direkt FITC-konjugierten Antikörper gefärbten Zellen (bkgd) sind dargestellt. Die Fluoreszenz-Intensität ist als CD19-Expression angegeben.
9 ZTL-Erkennung der CD19-exprimierenden A2-positiven EBV-transformierten B-lymphoiden Zellinien SV, JY und LG2. ZTL A2 19.105, ZTL CD8 × A2K^b 19.105, ZTL CD8 × A2K^b 19.165, ZTL CD8 allo A2 und ZTL A2 Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E: T-Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen die Zellinien SY (•), JY (☗), LG 2 (❚) sowie EA2 (❍) getestet.
10: ZTL-Erkennung einer CD19-exprimierenden A2-positiven Leukämie-Zellinie. ZTL CD8 × A2K^b 19.105, ZTL CD8 allo A2 und ZTL A2 Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E:T-Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen die Zielzelle BV173 (☗) (prä-B-ALL) getestet. Die Zielzelle wurde wie dargestellt (❚) mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper PA2.1 behandelt.
11 ZTL-Erkennung CD19-exprimierender A2-positiver Tumor-Zellinien. ZTL CD8 × A2K^b 19.105, ZTL CD8 allo A2 und ZTL A2 Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E:T-Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen die Zielzellen ST 486 (☗) (Burkitt-Lymphom), UoC-B11 (☗) (Prä-B-ALL), U 937 (•) (histiozytisches Lymphom) und EA2 (❍) getestet.
12 ZTL-Erkennung von CD19-exprimierenden A2-negativen und A2-positiven Tumor-Zellinien. ZTL CD8 × A2K^b 19.105, ZTL CD8 allo A2 und ZTL A2 Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E:T-Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen die A2-negative Zielzelle Ramos (❍) (Burkitt-Lymphom), die A2-positive Zellinie Ramos-A2 (☐) und Ramos-A2 nach Beladen mit dem Peptid 19.105 (❚) (10 μM) getestet.
13 ZTL-Erkennung von A2.1-positiven transformierten lymphohämopoetischen Zellen. ZTL A2 19.105, ZTL CD8 × A2K^b 19.105, CD8 allo-A2.1-reaktive ZTL und ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E:T-Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen folgende Zielzellen getestet: Con A-Blasten (☐, PHA-Blasten (Δ) und LPS-Blasten A2K^b (❍). Sämtliche Zielzellen wurden wie dargestellt (❚, ☗, •) mit dem Peptid CD19.105 beladen (10 μM).
14 ZTL-Erkennung von A2.1-positiven ruhenden lymphohämopoetischen Zellen. ZTL A2 19.105, ZTL CD8 × A2K^b 19.105, ZTL CD8 allo A2 und ZTL CD8 × A2K^b Flu M1 wurden als Effektor-Zellen unter den angegebenen E:T-Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen ruhende T-Zellen (☐), B-Zellen (❍) und die gleichen Zellen beladen mit dem CD19.105-Peptid (10 μM) (❚, •) getestet.
15 Für das CD19- Protein kodierende Plasmid pA71d.
16 Für das Molekül A2.1 kodierendes Plasmid pSV2-A2.1.
A) In den Beispielen erwähnte Materialien
(1) Mäuse
Transgene Mäuse, die das humane MHC Klasse I-Transgen HLA-A2.1 (A2.1) exprimieren, wurden mit fachüblichen Methoden in den C57BL/6-Hintergrund eingekreuzt (Irwin et al., 1989). Hierfür wurden folgende Stämme verwendet:

1) A2.1/K^b (A2K^b)-transgene Mäuse – sie sind homozygot für ein chimäres MHC Klasse I-Transgen, das sich aus den humanen α₁- und α₂-Domänen von A2.1 und aus der α₃-Domäne von H-2K^b der Maus zusammensetzt, sowie für das H-2^b-Gen.
2) huCD8α/β(CD8)-transgene Mäuse – sie sind homozygot für die α- und β-Kette des humanen CD8-Korezeptors.
3) [huCD8α/β × A2.1/K^b)_F1 (CD8 × A2K^b)-transgene Mäuse – sie exprimieren heterozygot das chimäre A2K^b-Molekül und zusätzlich die α- und β-Kette des humanen CD8. Außerdem sind sie homozygot für H-2^b.
4) A2.1-transgene Mäuse (([A2.1 × C57BL/6] × C57BL/6)_F1-transgen) – sie exprimieren die α₁-, α₂- und α₃-Domänen des humanen A2.1-Moleküls heterozygot und sind homozygot für H-2^b.
5) C57BL/6-Mäuse – sie besitzen den H-2^b-Phänotyp

(2) Synthetische Peptide
Synthetische Peptide wurden vom "Scripps Research Institute" und von SNPE (Neosystem laboratoire, Straßburg, Frankreich) bezogen. Die Reinheit der vom "Scripps Research Institute" mit dem automatischen Peptid-Synthese-Gerät 430A (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisierten Peptide betrug mindestens 70 %, die Reinheit der von SNPE synthetisierten Peptide mindestens 75 %. Reinheit und korrekte Aminosäurezusammensetzung aller Peptide wurde durch HPLC-Analyse sowie massenspektrometrisch überprüft. Lyophilisierte und entsalzte Peptide vom "Scripps Research Institute" wurden nach Mengenkontrolle in Abhängigkeit von der Peptidsequenz zu 10 mg/ml in DMSO, H₂O oder in Gemischen aus 0,1%iger NaOH und H₂O gelöst. Nichtentsalzte Peptide von SNPE wurden grundsätzlich in DMSO zu 10 mg/ml gelöst. Die Lagerung erfolgte in Aliquots bei –20 bis –80°C. Zusätzlich zu den in Tab. 1 dargestellten Peptiden wurde ein Peptid, das die Residuen 128-140 des Hepatitis B-Virus Core-Proteins repräsentiert (TPPAYRPPNAPIL), synthetisiert.
(3) Antikörper
Für die Blockade von A2.1 wurde der von der Hybridom-Zellinie PA2.1 (ATCC HB-117) produzierte monoklonale Antikörper verwendet.
Zur HLA-Typisierung von Tumor-Zellinien und von A2-transgenen Mäusen wurde der von der Maus-Hybridom-Linie BB7.2 (ATCC HB-82) produzierte monoklonale Antikörper eingesetzt.
Zur Detektion von monoklonalen Antikörpern der Maus in der Durchflußzytometrie wurde ein FITC-konjugierter polyklonaler Sekundär-Antikörper (Ziege anti-Maus IgG F(ab)₂-Fragment; 1:30-Verdünnung; Jackson [Dianova], Hamburg) eingesetzt.
Die Analyse der CD19-Expression auf humanen Zellen wurde mit einem monoklonalen FITC-konjugierten, gegen humanes CD19 gerichteten Antikörper (Maus anti-Human IgG; 1:10-Verdünnung; Pharmingen) durchgeführt.
Für die Isotypkontrolle wurde ein monoklonaler, FITC-konjugierter Antikörper gegen humanes CD8 eingesetzt (Maus anti-Human IgG; 1:5-Verdünnung; Becton & Dickinson).
Die Analyse der murinen CD19-Expression erfolgte mittels FITC-konjugiertem monoklonalen Antikörper gegen murines CD19 (Maus anti-Maus IgG; 1:10-Verdünnung; Pharmingen).
Alle Antikörper wurden in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Bio Whittaker, Walkersville, MA) verdünnt.
(4) Zellen, Zellinien und Transfektanten
Sämtliche Zellen und Zellinien wurden in RPMI 1640 (Biowhittaker, Verviers, Belgien) in Gegenwart von 10 % hitzeinaktiviertem (30 min, 56°C) FCS (PAA Laboratories, Linz, Österreich), 1 % 0,2 M L-Glutamin (Biowhittaker) und 50 μg/ml Gentamycin (Gibco BRL, Eggenstein) kultiviert. Zur Propagation von Zellen und ZTL-Linien aus der Maus wurde dem Medium zusätzlich (3-Mercaptoethanol in einer Endkonzentration von 5 × 10^–5 M zugesetzt. Zur Kultivierung Neomycin-transfizierter Zellen wurde dem Medium Geneticin (G-418) (Gibco BRL) in einer effektiven Konzentration von 280–560 μg/ml zugegeben. Zur Kultivierung Hygromycin-transfizierter Zellen wurde dem Medium Hygromycin B (Merck) in einer effektiven Konzentration von 800 μg/ml zugesetzt. Alle Zellen wurden bei 37°C und 5 % CO₂ in Wasserdampf-gesättigter Atmosphäre in Zellkulturflaschen oder 24-Loch-Platten (ZTL) (Corning Costar, Bodenheim) kultiviert.
(4.1) Zellen: Zur Gewinnung von mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMZ) wurde das Blut eines gesunden A2-positiven Spenders mit PBS (Biowhittaker, Walkersville, MA) im Verhältnis 1:3 verdünnt und mit dem gleichen Volumen Ficoll (Seromed Biochrom, Berlin) unterschichtet. Nach Zentrtfugation (1500 Upm, 5°C, 7 min) wurden die PBMZ aus der Interphase isoliert und gewaschen.
Con A- und PHA-aktivierte Lymphoblasten wurden mit fachüblichen Verfahren (vgl. Theobald et al., 1995) durch 3-tägige Stimulation von A2-positiven PBMZ mit Con A (10 μg/ml) und PHA (1,5 % w/v) (Gibco BRL, Eggenstein) generiert.
(LPS)-aktivierte Lymphoblasten wurden durch 3-tätige Stimulation von Milzzellen aus A2K^b-transgenen Mäusen mit 25 μg/ml LPS (Sigma, Deisenhofen) und 7 μg/ml Dextransulfat (Pharmacia Biotech, Dänemark) gewonnen.
Die Gewinnung ruhender T- und B-Zellen erfolgte nach negativer Selektion von A2-positiven PBMZ mit Antikörper-beschichteten "beads" (Dynal, Hamburg). Zur Isolierung von T-Zellen wurden die PBMZ nach Anweisung des Herstellers mir anti-CD 19- und anti-CD14-"beads" inkubiert, zur Isolierung von B-Zellen nüt anti-CD2- und anti-CD14-"beads".
(4.2) Zellinien und Transfektanten: Für die hier beschriebenen Untersuchungen wurden die nachfolgend aufgelisteten, gemäß (4.1) hergestellten oder im Stand der Technik bekannten und jederzeit erhältlichen Zellinien und Transfektanten eingesetzt:

– die humane A2.1-positive T2-Zellinie ist ein B/T-Zellhybridom der Fusionspartner 721.147 (EBV-transformierte B-Zellinie) und CEM (T-Zellinie) (Salter und Cresswell, 1986),
– T2-Zellen, die gemäß Theobald et al., 1995, mit dem A2K^b-Gen transfiziert wurden (T2A2K^b),
– die Thymom-Zellinie EL4 aus der C57BL/6-Maus (Theobald et al., 1995),
– EL4-Zellen, die mit A2.1 bzw. A2.1K^b transfiziert waren (EA2) (Theobald et al., 1995),
– Jurkat-Zellen (humane T-Zell-Leukämie), die mit A2.1 transfiziert waren (JA2) (Theobald et al., 1995),
– die humane Leukämie-Linie UoC-B11 (Prä-B-ALL, A2-positiv) (Zhou et al., 1995)
– die humane A2-positive Burkitt-Lymphom-Zellinie ST 486
– die A2-positive Zellinie Prä-B-ALL BV173 (DSM ACC 20; DSMZ, Braunschweig, Deutschland),
– die A2-positive histiozytische Lymphom-Zellinie U-937 (ATCC CRL-1593; Rockville, MA, USA),
– die EBV-transformierte lymphoblastoide und A2-positive Zellinie LG-2
– die EBV-transformierte lymphoblastoide, A2-positive Zellinie SY (GSF, München)
– die EBV-transformierte lymphoblastoide, A2-positive Zellinie JY (Terhorst et al., 1979)
– die A2-negative Burkitt-Lymphom-Zellinie Ramos
– Ramos-Zellen, die mit A2.1 transfiziert waren

Sämtliche aufgeführten Zellen dienten als Zielzellen im Zytotoxizitätstest.
B) In den Beispielen verwendete Methoden
(1) Transfektion
(1.1) Molekularbiologische Methoden
Um Säugerzellen mit dem CD19-Gen stabil zu transfizieren, wurde das Plasmid p71d gemäß 15 eingesetzt, in den die humane CD19-cDNA (Tedder et al., 1989) kloniert wurde. Für die Klonierung war ein zweiter Vektor, A#63d, der die Expressionskassette lieferte, notwendig. Der Expressionsvektor A71d und der Vektor A#63d wurden freundlicherweise von Dr. Ashok Venkitaraman (LMB; Cambridge, UK) zur Verfügung gestellt. Dabei kontrollierte der vollständige Promoter des humanen Cytomegalievirus die Expression des nachgeschalteten Gens. A71d enthält zusätzlich eine Sequenz, die für eine Hygromycinresistenz unter Kontrolle des SV40 Promoters kodiert und somit eine Selektion von Transfektanten mit Hygromycin erlaubt.
Die Klonierung der CD19-cDNA in den Expressionsvektor A71d umfasste vier Schritte

1. Die CD19-cDNA wurde aus dem Plasmid pSP65 mit der Restriktionsendonuklease EcoRI (MBI Fermentas) ausgeschnitten. Als Ergebnis wurde ein 2.1 kb großes Fragment erhalten.
2. Das CD19-DNA-Fragment wurde in die EcoRI-Seite des vorbereiteten Vektors A#63d kloniert. Diese Klonierung musste zuerst im Vektor A#63d erfolgen, da der Expressionsvektor A71d zwei EcoRI-Schnittstellen besitzt, wodurch vier Insertionsmöglichkeiten für das CD19-DNA-Fragment entstehen würden.
3. Zur Isolierung der CD19-DNA aus dem Vektor A#63d wurde dieser einer Mlu USall-Restriktion (Böhringer, Mannheim) unterworfen. Hierbei wurde ein 4.7 kbp langes Fragment ausgeschnitten, bestehend aus der CD19-DNA und Expressionskassette. Die Expressionskassette enthielt einen CMV-Promoter und eine Polyadenylierungssequenz.
4. Das CMV-CD19-poly A-Fragment wurde in die M1u/Sal-Schnittstelle des Expressionsvektors A71d ligiert. Zur Ligation des DNA-Fragmentes und Vektor-DNA wurden 10–100 μg Fragment und Plasmid-Vektor in 2–3 Ansätzen in einem Molaritätsverhältnis 1:1 bis 9:1 zusammengegeben. Außerdem enthielt der Ligationsansatz 2 μl Ligase-Puffer (10-fach konzentriert) und 1U T4-Ligase (Gibco, Eggersheim). Die Inkubation erfolgte bei 16°C.

Für die Transformation von Escherichia coli mit Plasmid-DNA wurden mir dem Fachmann geläufigen Verfahren kompetente Zellen des E. coli-Stamms DH5α hergestellt. Zu den kompetenten Bakterienzellen wurde DNA gegeben und nach 15-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zellen einem Hitzeschock für 90 Sekunden bei 42°C ausgesetzt. Nach Zugabe von SOC-Medium (20 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl, Glucose-Lösung 2M 1 ml, MgCl₂/SO₄-Lösung 1 ml, ad H₂O 1000 ml, pH 7,0) wurde der Ansatz für 60 min bei 37 °C inkubiert und schließlich auf LB-Agarplatten (1,5 % w/v Japan-Agar; Merck, Darmstadt) in Gegenwart von 100 μg/ml Ampicillin (Boehringer Mannheim, Mannheim) ausplattiert und für 10–15 Stunden bei 37°C bebrütet. Einzelkolonien wurden gepickt, in LB-Medium mit Ampicillin ausgesät und bei 37°C schüttelnd (220 Upm) inkubiert (Vorkultur). Anschließend wurden die Zellen geerntet und einer Plasmid-Präparation unterzogen. Die Präparation erfolgte mit einem "QIAprep Spin Miniprep Kit" nach Angaben des Herstellers (Qiagen, Hilden). Plasmid-tragende Transformanten wurden durch Restriktionsanalyse mit geeigneten Restriktionsendonukleasen und nachfolgende Agarose-Gelelektrophorese identifiziert. Als Gelmaterial wurde 0,6–2 %ige Agarose (w/v) verwendet, die in TAE-Puffer (Tris-Base, 0,5 M Na₂-EDTA, Eisessig 96%, H₂O) angesetzt wurde. Die positiven Transformanten wurden anschließend in größerem Maßstab (Hauptkultur) in Ampicillin-haltigem LB-Medium über Nacht bei 37 °C kultiviert. Nach der Zellernte wurden die Plasmide mit einem "QIAGEN Plasmid Maxi Kit" nach Herstelleranweisung präpariert (Qiagen). Nach erneuter analytischer Restriktion und Agarose-Gelelektrophorese wurde die Konzentration der DNA und die Reinheit der Präparation durch photometrische Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm in Quartzküvetten ermittelt. Für die Elektroporation wurde die DNA linearisiert. Das Plasmid pA71d wurde mit EcoRI (MBI Fermentas) geschnitten. Zur Kontrolle der Restrtktion wurden die Proben gelelektrophoretisch analysiert. Um die Restriktionsendonukleasen aus den DNA-Lösungen zu eliminieren, wurde eine Extraktion durchgeführt. Dazu wurden die Proben mit einem Volumen PhenoUChloroform/Isoamylalkohol (24:24:1, v/v/v; Roth, Karlsruhe) versetzt und nach guter Durchmischung zentrifugiert (14000 Upm, 4 min, Raumtemperatur). Die DNA-haltige wäßrige Oberphase wurde isoliert und einer erneuten Extraktion unterzogen. Zur Fällung der DNA wurde die DNA-Lösung mit 1/10 Volumen Na-Acetat (3 M) und nach Durchmischung mit 2 Volumen Ethanol (96 %, v/v, –20°C) versetzt. Im Anschluß an eine einstündige Inkubation bei –20°C wurden die Proben für 20 min bei 4°C abzentrtfugiert und mit etwa 2 Volumen Ethanol (70 %, v/v, –20°C) kurz gewaschen. Nach Trocknen des DNA-Pellets an der Luft wurde die DNA in TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM Na₂-EDTA, pH 8) gelöst und bei –20°C gelagert.
(1.2) Transfektionsmethoden
Für die stabile Transfektion von Säugerzellen wurde DNA von hoher Reinheit eingesetzt, die einen OD-Quotienten 260/280 nm von mindestens 1,8 aufwies.
Elektroporation: Zur Transfektion der Suspensions-Zellinie EA2 mit dem pA71d-Plasmid wurden 10 Mio EA2-Zellen gewaschen, in 0,5 ml RPMI 1640 (Biowhittaker, Verviers, Belgien) und 1 % FCS (PAA Laboratories, Linz, Österreich) resuspendiert und in 4 mm-Küvetten (BioRad Laboratories, München) pipettiert. 30 μg linearisierte DNA des pA71d-Plasmids wurde zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden bei 1200 μFarad und 350 Volt für 2 ms in einem "Gene Pulser" (Fischer, Heidelberg) elektroporiert. Anschließend wurden die Zellen in 96-Loch-Platten seriell mit Zellkulturmedium (s. 2.4), verdünnt und für 24 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ unter Wasserdampfsättigung kultiviert. Es folgte die Zugabe von Hygromycin (Gibco BRL, Eggenstein) in einer effektiven finalen Konzentration von 800 μg/ml. Wöchentlich wurde ein Wechsel des Selektionsmediums durchgeführt. Nach etwa 2–3 Wochen wurden die hygromycinresistenten Transfektanten-Klone zunächst in 24-Loch-Platten, später in Zellkulturflaschen überführt, bis sie schließlich auf die Expression von CD19 überprüft wurden.
(2) Durchflußrytometrie
Die A2.1-Expression von Zellen, Zellinien und Transfektanten wurde im Fluoreszenz-aktivierten Zell-Sortierer (FACS) (Becton Dickinson, San Jose, CA) gemessen. Jeweils 0,5 Mio Zellen wurden abzentrtfugiert und mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper BB7.2 (oder RPMI 1640, 10 % FCS, s. 2.4) in einem Volumen von 50 μl markiert (Lustgarten et al., 1997). Nach einstündiger Inkubation auf Eis wurden die Ansätze zweimal mit PBS (Biowhittaker, Walkersville, MA) gewaschen und die Zellen anschließend mit einem FITC-konjugierten Sekundär-Antikörper (Ziege anti-Maus IgG F_ab-Fragment; 50 μl einer 1:30-Verdünnung in PBS) gegengefärbt. Nach 25 min Inkubation auf Eis wurden die Proben zweimal mit PBS gewaschen und schließlich in PBS und 1 % Formalin fixiert. Die Fluoreszenz-Aktivität der im Vorwärtsstreulicht selektierten Zellpopulationen wurde im FACS ermittelt.
Zur Untersuchung der CD19-Expression wurden 0,5 Mio. abzentrifugierte Zellen mit dem FITC-konjugierten anti-CD19-Antikörper in einem Volumen von 50 μl markiert, eine Stunde lang inkubiert und zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde die Fluoreszenz-Aktivität im FACS ermittelt.
Ebenso wurde verFahren, wenn der FITC-konjugierten anti-CD8-Antikörper als Isotyp-Kontrolle eingesetzt wurde.
(3) Bestimmung der Peptidbindungs-Affinität für HLA-A2.1s
Ein Kompetitionstest wurde angewandt, um die Bindung der CD19-Peptide an A2.1 zu ermitteln. EA2-Zellen wurden mit 0,01 μg des A2.1-bindenden Peptids p53 264-272 (Theobald et al., 1995) und 3 oder 10 μg CD19-Peptid beladen. Das Peptid 58-66 des A/PR/8/34 Influenza Virus Matrix-Proteins M1 (Flu M1 58-66) (Theobald et al., 1995) diente als Positivkontrolle, das H-2K^b-bindende Peptid 52-59 des Vesikulären Stomatitis Virus-Nukleoproteins (VSV-N 52-59) (Theobald et al., 1995) als Negativkontrolle. Die A2.1-restrtngierten und p53 264-272-spezifischen ZTL (CD8 ×) A2 264 wurden bei verschiedenen Effektor- zu Zielzelt (E:T)-Verhältnissen auF ihre lytische Aktivität gegenüber peptidbeladenen und unbeladenen EA2-Zielzellen in einem 4-stündigen Zytotoxizitätstest untersucht (Theobald et al., 1995). Die prozentuale Inhibition der ZTL (CD8 ×) A2 264-vermittelten spezifischen Lyse (SL) von p53 264-272-beladenen EA2-Zellen durch die Test-Peptide wurde bei einem E:7-Verhältnis von 3:1 nach folgender Formel berechnet:
(4) Immunisierung A2.1-transgener Mäuse und Induktion peptidspezifischer sowie alloreaktiver ZTL
Zur Generierung A2.1-restrtngierter peptidspezifischer ZTL wurden 8–12 Wochen alten A2.1-transgenen Mäusen 100 μg des jeweiligen Test-Peptids sowie 120 μg HBV core 128-140 (ein I-A^b-bindendes synthetisches T-Helfer-Peptid) (Theobald et al., 1995), emulgiert in 100 μl inkomplettem Freundschen Adjuvans (IFA; Difco Laboratortes, Detroit, USA), subkutan in den Schwanzansatz injiziert (Theobald et a1., 1995). Nach etwa 10 Tagen wurde die Mi1z entnommen, zerrieben und die Milrzellsuspension zweimal gewaschen (1500 Upm, 5°C, 7 min). Die Milzzellen wurden zu 7 Mio/ml/Loch in eine 24-Lochplatte ausgesät. Als Stimulatorzellen wurden mit 3000 Rad (¹³²Cäsium) bestrahlte LPS-aktivierte B-Zellblasten, beladen mit 5 μg/ml des jeweiligen Test-Peptids und 10 μg/m1 humanem β₂-Mikroglobulin, nach zweimaligem Waschen zu 3 Mio/mULoch dazugegeben (Theobald et al., 1995). Die LPS-Blasten wurden durch dreitägige Stimulation von Milzzellen (1 Mio/ml) aus A2.1-transgenen Mäusen mit 25 μg/ml LPS (Salmonella typhosa) und 7 μg/ml Dextransulfat (Pharmacia Biotech, Freiburg) gewonnen. Die Ansätze aus Effektor- und Stimulatorzellen wurden für 6 Tage inkubiert (I° Kulturen) und einem Zytotoxizitätstest unterzogen.
Allo-A2.1-reaktive I° ZTL wurden generiert, indem Milzzellen aus CD8-transgenen Mäusen zu 7 Mio/ml/Loch (Effektorzellen) zusammen mit bestrahlten Milzzellen aus A2.1-transgenen Mäusen zu 6 Mio/ml/Loch (Stimulatorzellen) für 6 Tage inkubiert wurden.
(5) Etablierung von ZTL-Liniens
Polyklonale peptidspezifische ZTL-Linien mit Spezifität für CD19.105 und CD19.165 (ZTL A2 19.105 und CDS × A2K^b 19.165) und für Flu M1 58-66 (ZTL CD8 × A2K^b Flu M1, ZTL CD8 × A2 FLU M1 und A2 FLU M1) wurden durch wöchentliche Restimulation der Effektorzellen mit peptidbeladenen Stimulatorzellen etabliert. Als Stimulatorzellen dienten JA2-Zellen, die mit 20000 Rad bestrahlt, anschließend in RPMI 1640 (Biowhittaker, Verviers, Belgien) mit 5 μg/m1 des jeweiligen Peptids und 10 μg/ml humanem β₂-Mikroglobulin für etwa 40 min beladen und schließlich zweimal gewaschen wurden. Die Effektorzellen wurden zusammen mit 0,5 Mio JA2-Zellen und 6 Mio mit 3000 Rad bestrahlten C57BL/6-Milzzellen in einem Gesamtvolumen von 2 ml/Loch in eine 24-Loch-Platte ausgesät. Den Ansätzen wurde 2 % (v/v) Überstand aus dem Kulturmedium Con A-aktivierter Milzzellen (TCGF) von Lewis-Ratten zugegeben (Theobald et al., 1995).
Allo-A2.1-reaktive ZTL-Linien wurden durch intraperitoneale Immunisierung von CD8-transgenen Mäusen mit 20 Mio JA2-Zellen/Maus induziert. Nach drei Wochen wurden die Milzzellen isoliert und in vitro (7 Mio/ml/Loch) mit bestrahlten JA2-Zellen (0,5 Mio/ml/Loch) oder Milzzellen (6 Mio/ml/Loch) A2.1-transgener Mäuse stimuliert. Durch wiederholte wöchentliche in vitro-Restimulation mit JA2-Zellen in Gegenwart von bestrahlten C57BL/6-Milzzellen (6 Mio/ml/Loch) und 2–5 % TCGF wurden schließlich a11o-A2.1-reaktive ZTL-Linien generiert.
(6) Zytotoxizitätstest
Die lytische Reaktivität von Effektorzellen gegenüber verschiedenen Zielzellen wurde in einem ⁵¹Cr-Freisetzungstest überprüft (Theobald et al., 1995). Als Zielzellen für Peptidtitrationstests wurden T2-Zellen eingesetzt. 1–5 Mio Zielzellen wurden für 60–90 min mit 150 μCi Na (⁵¹Cr) O₄ (1 mCi/ml) (NEN Life Science, Belgien) markiert. Vor dieser Markierung wurde den Zellen bei Peptidtitrationstests 2 μl Peptidlösung unterschiedlicher Konzentration und 15 μl FCS (PAA Laboratories, Linz, Österreich) oder FCS ohne Peptid zugegeben. Die markierten Zielzellen wurden viermal gewaschen und die Zellzahl auf 0,1 Mio/ml eingestellt. Die Effektorzellen wurden mit Zellkulturmedium seriell 1:3 verdünnt und zu 0,1 ml/Loch in 96-Loch-Platten ausgesät. Insgesamt wurden fünf verschiedene E:7-Verhältnisse getestet. Anschließend wurden 0,1 ml/Loch der Zielzellsuspension zu den Effektorzellen gegeben und die Ansätze für 4–6 Stunden inkubiert. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert (1300 Upm, 5°C, 9 min), der Überstand (0,1 ml/Loch) abgenommen und die ⁵¹Cr-Freisetzung mit einem Gamma "Counter" (Canberra Packard, Dreieich) gemessen. Die prozentuale spezifische Lyse (SL) wurde nach folgender Formel berechnet:
Die maximale ⁵¹Cr-Freisetzung entsprach der gesamten ⁵¹Cr-Inkorporation durch die Zielzellen, die spontane ⁵¹Cr-Freisetzung entsprach der Zielzell-Lyse in Abwesenheit von Effektorzellen und betrug in der Regel weniger als 10 % der maximalen ⁵¹Cr-Freisetzung. Die Werte für spontane und maximale Lysen wurden aus jeweils vier, die für experimentelle Lysen aus zwei Ansätzen gemittelt.
C) Beispiele
Beispiel 1
Experimentelle Gewinnung der Oligopeptide CD19.105-113 und CD10.165-174
(1.1) Selektion potentiell A2.1-bindender CD19-Peptide
Anhand der bekannten Aminosäuresequenz des CD19-Proteins wurden 8mere, 9mere, 10mere und 11mere bestimmt, die Teilsequenzen dieses CD19-Polypeptids darstellen und die die folgenden Kriterien erfüllen:

1) Sie weisen als sogenannte prtmäre Ankeraminosäuren, das sind Aminosäuren innerhalb des Peptids, die mit Residuen der Bindungstasche des MHC Klasse I- Moleküls interagieren und die sich bei endogen prozessierten und im Kontext von MHC Klasse I-Molekülen präsentierten Peptide an Position 2 und am C-Terminus des Epitops befinden, an Position 2 klassischerweise die Aminosäuren L, M, I, V oder T, und nichtklassischerweise die Aminosäuren A, Q oder K auf und am C-Terminus klassischerweise die Aminosäuren V, L oder I und nichtklassischerweise die Aminosäuren A, M oder T (Theobald et al., 1995).
2) Die betreffenden CD19-Peptide sollten möglichst nicht homolog zu den korrespondierenden CD19-Peptiden der Maus sein.

Insgesamt wurden 35 CD19-Peptide selektiert (siehe 1).
(1.2) Bindung selektierter synthetischer CD19-Peptide an A2.1
Die anhand ihrer theoretischen Bindungsstärke selektierten CD19-Peptide wurden auf ihre tatsächliche Bindungsaffinität für A2.1 untersucht. Hierfür wurde in einem kompetitiven Bindungstest, der in der Publikation von Theobald et al. (1995) näher beschrieben ist, funktionell die Fähigkeit der CD19-Peptide getestet, die A2.1-Bindung des konkurrierenden synthetischen Peptids p53 264-272 zu inhibieren. Diese Inhibition wurde anhand der Abnahme der durch eine A2.1-restringierte p53 264-272-spezifische ZTL-Linie vermittelte Lyse von EA2-Zellen gemessen, die mit p53 264-272-Peptid und dem individuellen CD19-Testpeptid beladen waren. Die Bindungsergebnisse sind in 1 zusammengefaßt dargestellt. Bindung an A2.1 zeigte das Influenza Virus Matrix-Peptid M1 (Flu M1 58-66) (Theobald et al., 1995), während das H-2K^b-bindende Peptid VSV-N 52-59 (Theobald et al., 1995) als Negativkontrolle keinerlei A2.1-Bindungsaktivität aufwies. Die CD19-Peptide wurden nach ihrer Bindungsstärke in 4 Gruppen eingeteilt. Von insgesamt 35 getesteten Peptiden hatten 7 eine hohe Bindungsaktivität (mindestens 80 % Inhibition bei 10 μg Testpeptid), 9 eine mittlere (40-79 % Inhibition), 12 eine schwache (10–39 %) und 7 keine Bindungsaktivität (< 10 % oder keine Dosisabhängigkeit der Inhibition). Die beobachtete Inhibition war dosisabhängig, da für alle A2.1-bindenden Peptide die Inhibitionswerte bei 10 μg deutlich über denen bei 3 μg lagen.
Insgesamt zeigten 46 % aller selektierten Peptide eine starke oder intermediäre A2.1-Bindung, nur 20 % konnten nicht an A2.1 binden.
Beispiel 2
Experimenteller Nachweis der Eignung der CD19-Oligopeptide zur Erzeugung einer spezifischen, ZTL vermittelten Immunität
(2.1) Immunogenität A2.1-bindender synthetischer CD19-Peptide in A2.1-transgenen Mäusen
Ein Hindernis bei der Erkennung von humanen MHC Klasse I-Molekülen durch Maus-T-Zellen ist die Unfähigkeit von Maus-CD8, mit HLA-Molekülen wie A2.1 zu interagieren. Zur Umgehung bzw. Behebung dieses Hindernisses wurden zwei Strategien anagewendet. Die eine Strategie bestand in der Konstruktion des chimären Moleküls A2.1/K^b (A2K^b), das sich aus den humanen α1- und α2-Domänen von A2.1 und aus der α3-Domäne von Maus-K^b, die für die Interaktion mit CD8 wesentlich ist, zusammensetzt. In A2K^b-transgenen Mäusen induzierte ZTL mit Restriktion für das A2K^b-Transgen erkennen dieselben Peptidantigene, die auch in A2.1-positiven Menschen immunogen sind.
Die andere Strategie zur Verstärkung der A2.1-restringierten Antwort bestand in der Erzeugung einer doppelt-transgenen Maus "CD8 × A2.1/K^b" durch Kreuzung einer A2K^b-transgenen mit einer huCD8α/β-transgenen Maus. Die Expression der α- und β-Kette des huCD8-Moleküls ermöglicht den generierten ZTL, mit der α3-Domäne des A2.1-Moleküls humaner Zellen zu interagieren.
Mit den gemäß Beispiel 1 gewonnenen stark oder intermediär bindenden Peptiden (s. 1) wurden A2- und CD8 × A2K^b-transgene Mäuse immunisiert, um CD19-Peptid-reaktive ZTL zu gewinnen. 9 bis 11 Tage nach der Immnunisierung wurden Milzzellen der betreffenden Mäuse in vitro mit Peptid-beladenen syngenen LPS-Blasten stimuliert und 6 Tage danach auf eine A2.1-restrtngierte peptidspezifische ZTL-Antwort in einem Zytotoxizitätstest untersucht. Die Ergebnisse sind in 2 zusammengefaßt dargestellt. Für die Positivkontrolle Flu M1 58-66 war die Induktion A2.1-restringierter ZTL bereits bekannt (Theobald et al., 1995). Eine A2.1-restringierte und peptidspezifische ZTL-Antwort wurde für die stark bindenden Peptide CD19 165-174, 105-113, 10-18, für die intermediär bindenden Peptide CD19 299-308, 150-158 sowie für die schwach bindenden Peptide CD19 299-307 und 296-304 nachgewiesen. Die Höhe der Lyse war vom E:T-Verhältnis abhängig. Die ZTL waren peptidspezifisch, da sie mit dem entsprechendem Peptid beladene Zellen lysierten, nicht aber Zellen, die mit irrelevanten A2.1-bindenden Peptiden beladen waren (4 und 5).
Durch CD19.105 und CD19.165 induzierte ZTL waren A2.1-restringiert, da mit den entsprechenden Peptiden beladene A2.1-negative EL4-Zellen (H-2^b) der Maus nicht erkannt wurden (3).
(2.2) CD19-spezifische ZTL: Peptidspezifität und Effizienz der Peptiderkennung
A2.1-restringierte und für CD19.105 und CD19.165 spezifische ZTL wurden im folgenden näher untersucht.
Nach Immunisierung von A2.1- und CD8 × A2K^b-transgenen Mäusen mit den Peptiden CD19.105 und CD19.165 wurden die Milzzellen mit Peptid-beladenen LPS-Blasten aus A2.1-transgenen Mäusen stimuliert (I° Kultur) und nach wiederholter Restimulation im Zytotoxizitätstest gegen T2-Zielzellen, inkribiert bei unterschiedlichen Konzentrationen an synthetischen Peptiden CD19.105 und CD19.165, getestet (4 und 5 oben).
Die halbmaximale Lyse der Zielzellen durch ZTL A2 und CD8 × A2K^b CD19.105 lag bei einer Peptidkonzentration von 1 nM. Im Vergleich dazu erkannten ZTL A2 und CD8 × A2K^b CD19.165 ihre mit Peptid beladenen Zielzellen fast um den Faktor 100 schlechter. Aus dem Unterschied in der Effizienz der Peptiderkennung kann abgeleitet werden, daß das Peptid CD19.105 ZTL mit einer höheren Affinität zu induzieren vermag als das Peptid CD19.165.
Beide ZTL-Linien waren peptidspezifisch, da T2-Zellen beladen mit dem jeweiligen Peptid effizient lysiert wurden, während unbeladene oder mit den irrelevanten Peptiden Flu M1 58-66 bzw. p53.264-272 des humanen Wildtyps des p53-Proteins beladene T2-Zielzellen nicht erkannt wurden (4 und 5, untere Grafiken). Flu M1 58-66-präsentierende T2-Zellen wurden jedoch von einer CD8 × A2K^b T-Zell-Population mir Spezifität für Flu M1 58-66 lysiert.
Im Endergebnis wurden hoch-avide A2.1-restringierte ZTL-Populationen mit Spezifität für CD19.105 und CD19.165 generiert.
Beispiel 3
Charakterisierung von CD19-transfizierten Zelliniens
Um zu bestimmen, ob die Peptide CD19.105 und CD19.165 tatsächlich endogen prozessiert und im Kontext von A2.1-Molekülen CD19-exprimierender Tumorzellen präsentiert werden, wurden CD19-negative Tumorzellinien (EA2, EA2K^b) transfiziert. Die Erkennung der resultierenden CD19-exprimierenden Transfektanten durch CD19.105 und CD19.165 – spezifische ZTL stellt ein Indiz für die endogene Produktion der Peptide CD19.105 und CD19.165 dar.
Für die Transfektion mit dem CD19-Gen wurden die Tumor-Zellinien EA2 und EA2K^b ausgewählt, mit den Genen für A2.1 bzw. A2.1K^b transfizierte EL4-Zellinien EL4 ist eine Thymom-Linie der Maus mit fehlender CD19-Expression.
Durch Elektroporation der Zellinien EA2 bzw. EA2K^b mit dem Plasmid p71d, welches für das CD19-Protein und die Hygromycin-Resistenz kodiert (15), wurden Transfektanten generiert, die CD19 unter der Kontrolle des CMV-Promoters konstitutiv überexprimierten. Die Expression von CD19 wurde durchflußzytometrisch analysiert (8). Während die parentalen Zellinien keine CD19-Expression zeigten, exprimierten die mit dem CD19-Gen transfizierten Zellen deutliche Mengen an CD19 (8).
Für eine effektive Präsentation der CD19-Peptide ist u. a. eine hinreichende Expression von A2 Voraussetzung. Die durchflußzytometrische Analyse der CD19-Transfektanten ergab eine vergleichbare A2-Expression der EA2 cl 24 und EA2K^b cl 74 Zellinien sowie der parentalen Zellen (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 4
Erkennung von CD19-Transfektanten durch CD19.105 und CD19.165-spezifische ZTL
Zur Überprüfung der natürlichen Prozessierung und A2.1-Präsentation der Peptide CD19.105 und CD19.165 wurden die CD19-Transfektanten auf ihre Erkennung durch A2.1-restringierte CD19.105 und CD19.165-spezifische ZTL getestet. Die EA2 und EA2K^b Transfektanten EA2 cl 24 und EA2K^b cl 74 wurden von den CD19.105 und CD19.165-reaktiven ZTL A2 und CD8 × A2K^b effizient lysiert, während die parentalen Zellinien EA2 und EA2K^b sowie die nur mit dem Resistenzgen für Hygromycin transfizierte Zellinie EA2K^b Hygro nicht erkannt und folglich nicht lysiert wurden (6 und 7). Als Positivkontrolle diente die ZTL-Linie CD8 all A2. Sowohl die CD19-Transfektanten als auch die parentalen und hygromycintransfizierten Zellen wurden durch die allo-A2.1-reaktiven Effektorzellen lysiert (6 und 7). Da diese alloreaktiven ZTL peptidspezifisch waren, d. h. A2.1-Moleküle nur im Kontext mit (prozessierten) Selbst-Peptiden (nicht jedoch Signalpeptiden) erkannten (Ergebnisse nicht dargestellt), konnten auf diese Weise mögliche Defizite z. B. im Transportsystem der untersuchten Zellen quasi ausgeschlossen werden. Als Negativkontrolle fungierte die A2.1-restringierte ZTL-Linie CD8 × A2K^b Flu M1, die keine der getesteten Zellinien lysierte (6 und 7).
Alle in diesen Experimenten verwendeten CD19-Transfektanten wurden mit dem p71d-Expressionsplasmid transfiziert (15). Dieses kodiert für das CD19-Protein und zusätzlich für die Hygromycin-Resistenz, die als Selektionsmarker fungiert. Die Vermutung lag nahe, daß die Peptide CD19.105 und CD19.165 endogen prozessiert und im Kontext von A2.1 präsentiert wurden und damit das Epitop für die CD19-reaktiven ZTL repräsentierten. Da es sich bei diesen ZTL um Populationen handelte, war allerdings die Anwesenheit von T-Zell-Subpopulationen mit Spezifität für Peptide, die aus der Hygromycin-Resistenz prozessiert wurden, nicht auszuschließen. Gegen eine Lyse der CD19-Transfektanten durch potentielle Subpopulationen mit Spezifität fiür die Hygromycin-Resistenz sprach jedoch die fehlende Erkennung der EA2K^b Hygro-Kontrollen durch CD19.165-peptidspezifische ZTL, die, wie die CD19-Transfektanten auch, Hygromycin-Resistenz exprimieren (6). Ein weiteres deutliches Indiz für CD19.105 und CD19.165 als T-Zellepitope war die Lyse von verschiedenen CD19 exprimierenden Tumorzellen (s. Beispiel 5), während im Gegensatz dazu EA2-Zellen keine detektierbare CD19-Expression zeigten und nicht erkannt wurden. Demnach handelt es sich bei den CD19-Oligopeptiden auch nicht um Epitope aus anderen prozessierten Selbstproteinen.
Die hier gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Peptide CD19.105 und CD19.165 tatsächlich endogen prozessiert und im Kontext von A2.1 präsentiert werden.
Beispiel 5
Verwendung von CD19.105 und CD19.165-spezifischen ZTL zur spezifischen Erkennung und Lyse von humanen Tumorzellen
(5.1) CD19-Protein-E ×pression von humanen Tumor-Zellinien
Zum Nachweis, daß CD19.105 und CD19.165-spezifische ZTL nicht nur CD19-Transfektanten effizient lysieren sondern auch nicht-transfizierte A2-positive maligne transformierte Zellinien, wurden humane Tumor-Zellinien eingesetzt, die CD19 exprimieren. Hierfür müssen die Tumorzellen in der Lage sein, das Antigen zu prozessieren und dieses über das Molekül A2.1 den ZTL zu präsentieren. Die A2- und CD19-Expression der humanen Tumor-Zellinien wurde durchflußzytometrisch analysiert. Außer der Lymphom-Zellinie Ramos exprimierten alle im Experiment verwendeten humanen Tumor-Zellinien A2.1. Die CD19-Expression wurde für sämtliche humanen Zellinien bestätigt (Daten nicht gezeigt).
(5.2) Erkennung von CD19-exprimierenden A2-positiven humanen Tumor-Zellinien durch CD19.105 und CD19.165-spezifische ZTL
CD19-Protein exprimierende und A2-positive humane Tumor-Zellinien wurden im folgenden als Zielzellen für CD19.105- und CD19.165-spezifische ZTL verwendet um nachzuweisen, daß nicht nur CD19-transfizierte, sondern auch nicht-transfizierte Tumorzellen effizient lysiert werden.
Die in CD8 × A2K^b und A2-transgenen Mausstämmen generierten CD19-peptidspezifischen ZTL mit Spezifität für die Peptide CD19.105 und CD19.165 lysierten die EBV-transformierten B-lymphoiden Zellinien N, SY und LG-2 (9). Die ZTL-Linie A2 CD19.105 zeigte lytische Aktivität gegenüber den oben genannten transformierten Zellinien, während die CD19-negative Zellinie EA2 nicht erkannt wurde. Die ZTL-Linie CD8 × A2K^b CD19.105 erkannte neben den A2-positiven prä-ALL-Zellinien BV 173 (10) und UoCB11 (11) das histiozytische Lymphom U937 sowie die Burkitt-Lymphom-Zellinien ST486 und Ramos A2 (11 und 12).
Die lytische Aktivität der ZTL CD8 × A2K^b CD19.105 gegenüber BV 173- Zielzellen konnte mit dem pA2.1 Antikörper um 10% blockiert werden (10).
Als Positivkontrolle fungierte die A2.1-alloreaktive ZTL-Linie CD8 allo A2, die alle A2-positiven Zielzellen erkannte. Auf Seite der ZTL-Linie CD8 × A2K^b Flu M1 58-66 fand sich keine lytische Aktivität gegenüber den humanen^`Tumor-Zellinien (9-12).
(5.3) A2-negative CD19-exprimierende humane Tumor-Zellinien werden nicht von A2-restringierten CD19-reaktiven ZTL lysiert
Zur Kontrolle der Erkennung von A2-positiven Tumor-Zellinien durch ZTL mit Spezifität für CD19.105 wurde eine Zielzelle verwendet, die in der durchflußzytometrischen Analyse keinen A2-Phänotyp aufwies, jedoch CD19 exprimierte (Daten nicht gezeigt). Sie wurde sowohl von der CD19.105-spezifischen ZTL-Linie CD8 × A2K^b CD19.105 als auch von der A2.1-alloreaktiven ZTL-Linie CD8 allo A2 nicht lysiert, wohingegen die mit A2.1-transfizierte Zellinie Ramos A2 mit und ohne Peptidbeladung von beiden ZTL-Linien erkannt wurde (12).
Diese Befunde zeigen, daß ZTL mit Spezifität für CD19.105 A2-positive Tumorzellen, die endogen CD19 exprimieren, spezifisch, A2-restringiert und effizient erkannten und lysierten.
Beispiel 6
Verwendung von CD19-spezifischen ZTL zur selektiven Erkennung und Lyse von humanen Normalzellen
(6.1) CD19-Protein-Expression von aktivierten oder ruhenden Zellen lymphohämopoetischen Ursprungs
Für eine potentielle, CD19-spezifische ZTL-vermittelte Immuntherapie ist es wünschenswert, daß Normalzellen nicht lysiert werden. Allerdings wird das CD19– Protein sowohl von normalen B-Zellen als auch bei malignen B-Zell-assoziierten hämatologischen Erkrankungen exprimiert Durchflußzytometrische Analysen haben gezeigt, dass sowohl ruhende als auch aktivierte B-Zellen eines A2-positiven Spenders CD19 exprimieren, und mit LPS.aktivierte B-Zell-Blasten aus der A2K^b-Maus murines CD19 exprimieren. Ruhende und aktivierte T-Zellen weisen keine CD19-Expression auf.
Alle verwendeten Normalzellen wurden bezüglich ihrer A2-Expression durchflußzytometrisch analysiert (Daten nicht gezeigt).,
(6.2) Zytolytische Reaktivität CD19.105-spezifischer ZTL gegenüber aktivierten oder ruhenden Zellen lymphohämopoetischen Ursprungs
Ruhende und aktivierte lymphohämopoetische Zellen wurden im folgenden als Zielzellen für A2-restringierte ZTL mit Spezifität für CD19.105 eingesetzt. A2-positive PHA- und Con A-transformierte Blasten wurden von ZTL CD8 × A2K^b CD19.105 und ZTL A2 CD19.105 überraschenderweise nicht lysiert, obwohl sie CD19 auf ihrer Oberfläche exprimierten. LPS-aktivierte Blasten der A2K^b Maus wurden wie erwartet nicht erkannt, da sie das murine CD19 auf ihrer Oberfläche tragen (13).
Normale, ruhende B- und T-Zellen wurden ebenfalls nicht von CD19.105-spezifischen ZTL lysiert, obwohl dies bei den CD19-positiven B-Zellen zu erwarten wäre (14). Die als Positivkontrolle dienenden allo-A2.1-reaktiven ZTL erkannten alle Zelltypen, hingegen war bei den als Negativkontrolle fungierenden Flu M1-spezifischen ZTL keine Lyse zu beobachten (13 und 14).
Bei allen Zelltypen konnte ZTL-Erkennung durch exogenes Peptid CD19.105 rekonstituiert werden, was eine hinreichende A2-Expression bestätigte (13 und 14).
Beispiel 7
Herstellung von A2.1-restringierten T-Zellrezeptoren, die spezifisch sind für die erfindungsgemäßen Oligopeptide CD19.105 und CD19.165
A2.1-transgene Mäuse werden mit den erfindungsgemäßen Oligopeptiden CD19.105 und CD19.165 immunisiert. Nach 10 Tagen wird die Milz entnommen. Die Milzzellen werden mit zuvor hergestellten, A2.1-positiven Antigen-präsentierenden Zellen, die mit dem erfindungsgemäßen Oligopeptid beladen sind, in vitro stimuliert. Die Herstellung dieser 2.1-positiven Antigen-präsentierenden Zellen erfolgte mit den im Stand der Technik bekannten und dem Fachmann geläufigen Techniken. Nach mehrwöchiger Kultur werden die T-Zellen auf ihre Peptid- und Tumorerkennung, Peptidspezifität und A2.1-Restriktion überprüft. Nach erfolgreicher Testung wird die T-Zellinie kloniert. Die resultierenden T-Zellklone werden erneut hinsichtlich Peptid- und Tumorerkennung, Peptidspezifität und A2.1-Restriktion getestet.
Von einem T-Zeltklon mit positivem Testergebnis wird die Gesamt-mRNA präpariert. Mittels RT-PCR werden die T-Zellrezeptor α- und β-Ketten amplifiziert. Die jeweiligen Ketten werden zunächst in bakterielle Plasmide kloniert und sequenziert. Die Ketten werden partiell humanisiert, indem die konstanten Maus-Regionen durch die homologen humanen Regionen ersetzt werden. Anschließend erfolgt die Klonierung der resultierenden Konstrukte in geeignete retrovirale Vektoren.
Periphere Blut-Lymphozyten eines A2.1-positiven Krebspatienten, dessen Tumor- oder Leukämiezellen hdm2-Protein überexprimieren, werden entnommen, mit den Vektoren für α- und β-Kette des T-Zellrezeptors in vitro transduziert und die Genexpression auf Proteinebene untersucht. T-Zellrezeptor-exprimierende T-Lymphozyten werden auf ihre Fähigkeit zur Lyse von Tumorzellen analysiert. Nach erfolgreicher Testung werden die genmodifizierten Lymphozyten in den Patienten transfundiert und sollen dort die Abtötung der entarteten Zellen und damit die Heilung bewirken.
Alternativ werden CD19-spezifische α/β-T-Zellrezeptorketten in Vektoren kloniert, die die Fähigkeit besitzen, in vivo Patienten-T-Zellen zu infizieren. Diese infizierten T-Zellen exprimieren CD19-spezifische T-Zellrezeptoren und sind damit in der Lage, CD19-exprimierende Tumorzellen der Patienten zu erkennen und abzutöten.
Literaturverzeichnis

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

B-Zell-Tumor-assoziiertes Oligopeptid, das von CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten (ZTL) als Peptidantigen erkannt wird und eine ZTL-induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumor- oder Leukämiezellen herbeiführt, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligopeptid (a1) die Aminosäuresequenz KAWQPGWTV gemäß Sequenzprotokoll Nr.1 aufweist, die den Aminosäurepositionen 105 bis 113 des humanen CD19-Proteins entspricht, oder das eine durch Aminosäure-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition, -Inversion und/oder durch chemische oder physikalische Modifikation einer oder mehrerer Aminosäuren davon ableitbare Aminosäuresequenz aufweist, die ein funktionelles Äquivalent zu der Aminosäuresequenz KAWQPGWTV darstellt, oder das es (a2) die Aminosäuresequenz EIWEGEPPCV gemäß Sequenzprotokoll Nr.2 aufweist, die den Aminosäurepositionen 165 bis 174 des humanen CD19-Proteins entspricht, oder das eine durch Aminosäure-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition, -Inversion und/oder durch chemische oder physikalische Modifikation einer oder mehrerer Aminosäuren davon ableitbare Aminosäuresequenz aufweist, die ein funktionelles Äquivalent zu der Aminosäuresequenz KAWQPGWTV darstellt, und das es (b) ein Epitop für CD8-positive ZTL darstellt und (e) dazu geeignet ist, eine auf humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante A2 (kurz: A2) eingeschränkte (restringierte) Immunantwort von CD8-positiven ZTL gegen Tumor- und Leukämiezellen zu induzieren.
Retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es einem Oligopeptid gemäß Anspruch 1 entspricht, bei dem anstelle der -CO-NH-Peptidbindungen -NH-CO-Bindungen oder andere Nichtpeptidbindungen ausgebildet sind.
Fusionsprotein welches aus einem Oligopeptid nach Anspruch 1 oder 2, einer schweren Kette des HLA-Moleküls und einem flexiblem Linker besteht und derart konstruiert ist, daß das Oligopeptid geeignet und befähigt ist, die Peptid-Bindungsfurche des HLA-Moleküls zu besetzen.
Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die mindestens für ein Oligopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
Verwendung eines Oligopeptids nach Anspruch 1 und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 2 und/oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 3 und/oder eines Polynukleotids nach Anspruch 4 zur Herstellung von Diagnostika und/oder Therapeutika und/oder Prophylaktika für den Nachweis und/oder die Beeinflussung und/oder Generierung und/oder Expandierung und/oder Steuerung des Aktivierungs- und Funktionszustands von T-Zellen, insbesondere CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten.
Reagenz zur in-vivo- oder in-vitro-Aktivierung von T-Zellen, insbesondere CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz unter Verwendung wenigstens eines Oligopeptids nach Anspruch 1 und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 2 und/oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 3 und/oder eines Polynukleotids nach Anspruch 4 hergestellt ist.
Rekombinantes DNS- oder RNS-Vektormolekül, das mindestens ein oder mehrere Polynukleotid(e) nach Anspruch 4 enthält und das in Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs exprimierbar ist.
Wirtszelle, die ein Polynukleotid gemäß Anspruch 4 oder ein Vektormolekül gemäß Anspruch 7 enthält.
Verwendung wenigstens eines Oligopeptids nach Anspruch 1 und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 2 und/oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 3 für die Herstellung polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter Antikörper gegen das/die betreffende(n) Oligopeptide(e) oder gegen einen Komplex aus dem/den betreffenden Oligopeptid(en) und HLA-A2.
Antikörper, der spezifisch mit wenigstens einem Oligopeptid nach Anspruch 1 und/oder einem retro-inversen Peptid oder Pseudopeptid gemäß Anspruch 2 und/oder einem Fusionsprotein nach Anspruch 3 oder mit einem Komplex aus dem/den betreffenden Oligopeptid(en) und HLA-A2 reagiert.
Oligopeptid nach Anspruch 1 oder 2 und/oder Fusionsprotein nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es kovalent oder nicht kovalent an MHC Klasse I-Tetramere oder MHC Klasse I-Dimere oder an pharmazeutisch geeignete Träger oder sonstige Strukturen gebunden vorliegt.
Retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es kovalent oder nicht kovalent an MHC Klasse I-Tetramere oder MHC Klasse I-Dimere oder an pharmazeutisch geeignete Träger oder sonstige Strukturen gebunden vorliegt.
Verwendung wenigstens eines Oligopeptids gemäß Anspruch 1 und/oder eines retroinversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 2 und/oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 3 oder eines Polynukleotids gemäß Anspruch 4 zur Herstellung polyklonaler oder monoklonaler oder rekombinanter A2-restringierter T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenter Moleküle gegen das /die betreffenden(n) Oligopeptid(e).
T-Zellrezeptor oder dazu funktionell äquivalentes Molekül, der/das spezifisch mit wenigstens einem Oligopeptid gemäß Anspruch 1 und/oder einem retro-inversen Peptid oder Pseudopeptid gemäß Anspruch 2 und/oder einem Fusionsprotein nach Anspruch 3 reagiert
Polynukleotid, das für einen T-Zellrezeptor gemäß Anspruch 14 kodiert.
Expressionsvektor, der die Fähigkeit besitzt, einen T-Zellrezeptor gemäß Anspruch 14 zu exprimieren.
Wirtszelle, die ein Polynukleotid gemäß Anspruch 15 oder einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 16 enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von CD19-Protein-assoziierten Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Oligopeptid und/oder mindestens ein retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid und/oder mindestens ein Fusionsprotein und/oder mindestens ein Polynukleotid und/oder mindestens ein T-Zellrezeptor und/oder mindestens ein Vektormolekül und/oder mindestens eine Wirtszelle und/oder mindestens ein Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.
Arzneimittel zur Behandlung von CD19-Protein-assoziierten Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein Oligopeptid und/oder mindestens ein retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid und/oder mindestens ein Fusionsprotein und/oder mindestens ein Polynukleotid und/oder mindestens ein T-Zellrezeptor und/oder mindestens ein Vektormolekül und/oder mindestens eine Wirtszelle und/oder mindestens ein Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält.
Verwendung eines Arzneimittels nach Anspruch 19 zur Behandlung von CD19-Protein-assoziierten Erkrankungen.