WO2003029282A2 - Tumor-peptidantigene aus humanem prdi-bf1-protein - Google Patents

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WO2003029282A2
WO2003029282A2 PCT/EP2002/010701 EP0210701W WO03029282A2 WO 2003029282 A2 WO2003029282 A2 WO 2003029282A2 EP 0210701 W EP0210701 W EP 0210701W WO 03029282 A2 WO03029282 A2 WO 03029282A2
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Matthias Theobald
Carina Lotz
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Immugenics Ag
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the invention relates to a tumor-associated oligopeptide which is recognized as a peptide antigen by CD8-positive cytotoxic T-lymphocytes (ZTL) and which causes ZTL-induced lysis and / or apoptosis of tumor cells, in particular cells of multiple myeloma,
  • ZTL cytotoxic T-lymphocytes
  • CD8-positive ZTL represent effector cells of the cellular immune system. Their function consists in the specific elimination of infected or degenerate cells of the body.
  • the ZTL recognize, among other things, tumor-specific or tumor-associated peptide antigens (TAA), which are bound to major histocompatibility complex (MHC) molecules of class I and are presented on the surface of the degenerate cells.
  • TAA tumor-specific or tumor-associated peptide antigens
  • MHC major histocompatibility complex
  • the recognition of the peptide antigens in the context of MHC class I molecules is carried out by specific membrane-bound T cell receptors (TZR) of the ZTL. After detection, the cell in question is killed by the ZTL. lyse the target cells and / or induce programmed cell death (apoptosis) of these target cells or release cytokines.
  • the detection of target cells by ZTL is facilitated by the expression of the CD 8 coreceptor on ZTL.
  • the CD8 coreceptor binds to conserved regions of the ⁇ 2 and ⁇ 3 domains of the MHC class I molecule and thus helps to stabilize the TCR-peptide-MHC complex.
  • the PRDI-BFl protein is involved in the terminal differentiation of B cells, so that plasma cells and their neoplasms, namely cells of multiple myeloma, show an overexpression of PRDI-BFl.
  • plasma cells and their neoplasms namely cells of multiple myeloma
  • PRDI-BFl For the murine homolog of PRDI-BFl (Blimp-1), various normal tissues were examined for RNA expression. Weak expression was detected in bone marrow, spleen and lymphocytes, as well as in the brain, lungs, heart, kidneys, skin and testis. The results of recent studies indicate that PRDI-BFl is also involved in the differentiation of myeloid cells.
  • the oligopeptides resulting from the cellular processing of the PRDI-BFl protein can be found in the context of MHC class I molecules of the allele variant A2, subtype A2.1 (short: A2.1; the most common MHC class I allele in the Caucasian population) are presented on the cell surface and represent attractive target structures for CD8-positive ZTL. They can consequently be used under certain conditions as a vaccine for inducing T cells in general and tumor-reactive T cells in particular with the aim that these T cells bring about the remission and eradication of multiple myeloma cells. In the case of melanoma, some peptide antigens are already known, which are used in this way for immunotherapy in clinical trials.
  • the object of the present invention is to provide tumor-associated, in particular multiple-myeloma-associated peptide antigens which are recognized by CD8-positive ZTL and which bring about a ZTL-induced lysis and / or apoptosis of tumor cells, in particular multiple-myeloma cells.
  • oligopeptide which (a 1) is one of the amino acid sequences shown in sequence listing 1 to 30 has, which corresponds to the amino acid positions of the human PRDI-BF1 protein indicated in the relevant sequence listing, or that (a 2) by amino acid substitution, deletion, insertion, addition, inversion and / or by chemical or physical modification one or more amino acids which can be derived from one of these amino acid sequences, and which (b) is an epitope for CD8-positive ZTL and (c) is suitable for the detection of a human leukocyte antigen of the molecular group "MHC class I", allele variant A2 ( in short: A2) to induce a restricted (restricted) immune response of CD8-positive CTL against multiple myeloma cells and other tumor cells.
  • MHC class I molecular group
  • allele variant A2 in short: A2
  • An equivalent solution consists in providing a retro-inverse peptide or pseudopeptide analogous to this oligopeptide according to the invention, which instead of the -CO-NH peptide bonds non-peptide bonds such as e.g. - Has NH-CO bonds (see Meziere et al. 1997).
  • oligopeptide antigens are provided for the first time, the amino acid sequence of which comes from the human PRDI-BFl protein.
  • the PRDI-BFl oligopeptides according to sequence protocols 1 to 30 and their derivatives represent quantitatively tumor-associated ZTL epitopes, in particular associated with multiple myeloma cells, and thus provide the molecular basis for a PRDI-BFl -specific immunotherapy for malignant diseases, in particular the Multiple myeloma.
  • the oligopeptides according to the invention can be used in particular in the active and passive immunization of patients with multiple myeloma, in whom the epitopes corresponding to these oligopeptides are presented in the context of A2.1 in order to induce, generate and expand cytotoxic T-lymphocytes which are specific for the relevant PRDI-BFl amino acid sequences and which are able to specifically kill the multiple myeloma cells of the patients concerned and thereby heal them convey.
  • PRDI-BFl is only slightly expressed in resting B cells, T cells and in mononuclear cells of the peripheral blood and is therefore not susceptible to killing by PRDI-BFl -specific cells, ie not a suitable one Is the point of attack.
  • PRDI-BFl -specific cells ie not a suitable one Is the point of attack.
  • the derivatives of the oligopeptides shown in the sequence protocols 1 to 30 and / or also the retro-inverse peptides or pseudopeptides derived therefrom have the advantage over the respective original oligopeptide itself in that a potential functional self-tolerance (with respect to the corresponding original oligopeptides) on T- Cell level can be bypassed. While the PRDI-BFl - oligopeptides according to sequence listing 1 to 30 may be due to the (low) expression in some normal tissues.
  • the derivatives of these oligopeptides are generally recognized as antigens and induce the activation and expansion of CTL.
  • These derivative-induced CTLs generally have a high cross-reactivity with the relevant PRDI-BFl oligopeptide wild-type sequence (s) and consequently also induce the lysis and / or apoptosis of such (tumor) cells, the PRDI-BFl oligopeptides present on their surface according to sequence listing 1 to 30 (in the context of A2, in particular of A2.1).
  • Particularly preferred derivatives of the oligopeptides shown in sequence protocols 1 to 30 are those which naturally occur in other mammals or vertebrates, for example corresponding homologues from the mouse.
  • These PRDI-BF1 oligopeptide homologs and the nucleic acids coding for them can be obtained from the respective organism relatively easily, namely directly and with common isolation processes.
  • the PRDI-BF1 oligopeptides and their derivatives as well as the retro-inverse peptides or pseudopeptides shown in the sequence protocols 1 to .30 can be produced by means of common peptide synthesis methods, and the nucleotide sequences coding for these oligopeptides can be obtained with known chemical or molecular biological methods.
  • a fusion protein from the above-described oligopeptides according to the invention, a flexible linker and a heavy chain of the HLA molecule, in such a way that the oligopeptide is capable (capable or suitable) of the peptide -Filling the binding fears of the HLA molecule.
  • These fusion proteins and polynucleotides encoding them are particularly suitable as an (active ingredient of) a diagnostic or therapeutic or prophylactic or in general for the detection and / or manipulation of T cells which are one of the PRDI shown in sequence listing 1 to 30, in particular 1-4 Detect -BFl -Oligopeptides.
  • the invention therefore also relates to a fusion protein which consists of one of the above-described oligopeptides, a heavy chain of the HLA molecule and a flexible linker and is constructed in such a way that the oligopeptide is suitable (able or capable of testing the peptide To occupy binding fears of the HLA molecule, and which for use or for use as a diagnostic or therapeutic or prophylactic or in general for the detection and / or manipulation of T cells which one of the sequence protocols 1 to 30, in particular 1- PRDI-BF1 oligonucleotides shown in Figure 4.
  • the polynucleotides coding for this fusion protein are also the subject of the present invention.
  • oligopeptides and their derivatives shown in the sequence protocols 1 to 30 and the retro-inverse peptides or pseudopeptides and the fusion proteins are suitable both for the in vivo induction of T lymphocytes in the patient and for in vitro induction and expansion reactive patient's own or non-patient T lymphocytes.
  • Various methods can be considered for in vivo induction and expansion of T lymphocytes in the patient, for example (a) the injection of one of the PRDI-BF1 oligopeptides shown in sequence listing 1 to 30 and / or one or more derivatives thereof Oligopeptides and / or a retro-inverse peptide or pseudopeptide and / or a fusion protein as a pure peptide or together with adjuvants or with cytokines or in a suitable release system such as liposomes, (b) the injection of a nucleic acid necessary for one of those in the sequence listing 1 to 30 shown PRDI-BFl oligopeptides or their derivatives and / or encoded for one of the retro-inverse peptides or pseudopeptides and / or for one of the fusion proteins - in "naked” or complexed form or in the form of viral or non-viral vectors or together with release systems such as cationic lipids or cationic polymers, (c) the loading of auto
  • the invention therefore also relates to the use of the PRDI-BFl oligopeptides shown in sequence protocols 1 to 30 and / or their derivatives and / or retro-inverse peptides or pseudopeptides and / or fusion proteins and / or a fusion protein and / or a polynucleotide which is at least for one of the PRDI-BFl oligopeptides shown in the sequence protocols 1 to 30, for the production of diagnostics - in particular MHC tetramers or MHC dimers or other structures to which at least one such oligopeptide or retro-inverse peptide or pseudopeptide by covalent or non-covalent binding is associated - and / or prophylactic and / or therapeutic (in particular vaccines) for the detection and / or influencing and / or generation and / or expansion and / or control of the activation and functional state
  • Suitable therapeutic agents and / or prophylactic agents are, in particular, vaccines or injections or infusion solutions which contain as active ingredient (a) one of the PRDI-BFl oligopeptides shown in sequence listing 1 to 30 and / or at least one derivative of one of these oligopeptides and / or at least one contain a retro-inverse peptide or pseudopeptide analogous to one of these oligopeptides or their derivatives and / or at least one of the fusion proteins described above, and / or which contain (b) a nuclear acid which is suitable for at least one of the PRDI shown in sequence listing 1 to 30 -BFl oligopeptides or at least for a derivative of one of these oligopeptides and / or the (c) in vitro generated T lymphocytes which specifically against one of the PRDI-BFl oligopeptides shown in sequence listing 1 to 30 and / or their Derivative (s) and / or against a retro- analogous to one of these oligo
  • Recombinant DNA or RNA vector molecules which contain one or more polynucleotide (s) which are suitable for.
  • the diagnostic agents or also the therapeutic agents or the prophylactic agents encode at least one of the PRDI-BFl oligopeptides shown in sequence protocols 1 to 30 and / or for at least one derivative of one of these oligopeptides, and which can be transcribed or expressed in cells of autologous, allogeneic, xenogeneic or microbiological origin.
  • the invention therefore also encompasses those recombinant DNA or RNA vector molecules and host cells which contain these vector molecules.
  • polyclonal, monoclonal or recombinant antibodies can also be used as a diagnostic or therapeutic or prophylactic or generally for the detection and / or manipulation of cells which overexpress one of the PRDI-BF1 oligopeptides shown in the sequence protocols 1 to 30, which against at least one of the PRDI-BFl oligopeptides shown in the sequence protocols 1 to 30 and / or against at least one derivative of this oligopeptide and / or against at least one retro-inverse peptide or pseudopeptide or fusion protein analogous to this oligopeptide or its derivative, or which are directed with react a complex of one of the oligopeptides in question or its derivatives or retro-inverse peptide (s) and / or pseudopeptide (s) and HLA-A2.
  • polyclonal, monoclonal or recombinant A2-restricted T cell receptors can also be used as a diagnostic or therapeutic or prophylactic or in general for the detection and / or manipulation of cells which overexpress at least one of the PRDI-BF1 oligopeptides shown in sequence protocols 1 to 30 or, to this end, functionally equivalent molecules can be used which are specific for one of those shown in sequence listing 1 to 30 PRDI-BFl oligopeptides and / or for a derivative of one of these oligopeptides and / or for analogous retro-inverse peptides or pseudopeptides or for a fusion protein described above.
  • the T cell receptors or molecules functionally equivalent to them can be of autologous, allogeneic or xenogeneic origin.
  • the subject matter of the present invention therefore also primarily includes:
  • T cell receptor per se and functionally equivalent molecules
  • the invention also encompasses reagents for in-vivo or in-vitro activation of T cells, in particular CD8-positive CTLs, which are characterized in that they are prepared using at least one of the PRDI-BFl shown in sequence listing 1 to 30.
  • Oligopeptides and / or at least one derivative of one of these oligopeptides and / or at least one retro-inverse peptide or pseudopeptide or fusion protein analogous thereto and / or using at least one polynucleotide which is at least for one of the oligopeptides shown in the sequence protocols 1 to 30 or their derivative (e) and / or retro-inverse peptides or pseudopeptides or fusion proteins analogous thereto and / or using at least one of the PRDI-BFl oligopeptides shown in sequence protocols 1 to 30 or homologues of other species are produced.
  • These reagents can in particular be therapeutic agents, and above all vaccines.
  • A2 human leukocyte antigen of the molecular group A2 human leukocyte antigen of the molecular group
  • A2K b A2.1 K MHC class I molecule from ⁇ and ⁇ 2 domain from A2 and ⁇ 3 domain from K b
  • HLA-A2.1 human leukocyte antigen of the molecular group "MHC class I" HLA-A2.1 human leukocyte antigen of the molecular group "MHC class I"
  • Fig. 1 Binding of selected synthetic PRDI-BFl peptides.
  • the relative A2.1 binding affinity was determined by the ability of the respective peptide to inhibit the A2.1 binding of peptide p53 264-272. This was measured based on the inhibition of p53-specific CTL lysis of p53 264-272-loaded T2 target cells by PRDI-BFl peptides of different concentrations. The inhibition values for the peptides FluMl and VSV-N were averaged from 6 independent experiments.
  • Fig. 2 A2.1-restricted immunogenicity of synthetic PRDI-BFl peptides in A2K b or CDS x A2 (K b ) -tg mice.
  • the immunogenicity was checked in a 4-hour cytotoxicity test based on the lyrical activity of the CTL induced in these mice by peptide immunization.
  • the target cells used were peptide-loaded or unloaded T2A2K cells or T2 cells (for checking the immunogenicity of PRDI-BFl 377-386) with 0.2 ⁇ g. Representative specific lyses of individual CTL cultures from an average of 2 immunized mice are shown.
  • Fig. 3 H-2 b -restricted immunogenicity of synthetic PRDI-BFl peptides in A2K b or CD8 x A2 (K b ) -tg mice.
  • the immunogenicity was checked on the basis of the lytic activity of the ZTL induced by peptide immunization in these mice in a 4-hour cytotoxicity test.
  • EL-4 cells loaded or unloaded with 0.2 ⁇ g peptide were used as target cells. Representative specific lyses of individual CTL cultures from an average of 2 immunized mice are shown.
  • Fig. 4 Peptide specificity and A2.1 restriction of the ZTL lines CD8 x A2K b 377 (A), CD8 x A2K b 402p (B) and CD8 x A2K b 401 (C), which by repeated in vitro stimulation with the relevant peptide were established.
  • T2 cells were analyzed with FluMl 58-66 peptide ( ⁇ ), the relevant peptide: PRDI-BFl 377-386 in (A), PRDI-BFl 402-410 in (B) and PRDI-BFl 401- 410 in (C) (•), as well as PRDI-BFl 402-410A in (B) or PRDI-BFl 402-410 in (C) ( ⁇ ) or no peptide (O) and load in a 6-hour 51 Cr Release test used as target cells at the given E: T ratios.
  • peptide-loaded (A) and unloaded ( ⁇ ) EL-4 cells were used.
  • Fig. 5 ZTL lines CDS x A2K b 377 (A), CD8 x A2K b 402p (B) and CD8 x A2K b 401 (C): efficiency in peptide recognition.
  • Fig. 6 PRDI-BFl RNA expression of multiple myeloma cell lines.
  • Cytoplasmic RNA from the multiple myeloma cell lines L363, MC-CAR, U266, IM9, OPM-2 and NCI-H929 was reverse transcribed in cDNA and amplified with PRDI-BFl or ß-actin-specific primers in a subsequent PCR reaction.
  • the PCR products were electrophoresed in a 1.6% EtBr-containing agarose gel.
  • EL-4 acted as a negative control.
  • the arrows mark the 390bp ( ⁇ -actin PCR amplificate) and the 540b ⁇ gel band (PRDI-BFl PCR amplificate).
  • Fig. 7 PRDI-BFl RNA expression from the osteosarcoma cell lines Saos-2 and U2OS.
  • Cytoplasmic RNA from Saos-2 and U2OS was reverse transcribed in cDNA and amplified with PRDI-BFl or ß-actin-specific primers in a subsequent PCR reaction.
  • the PCR products were electrophoresed in a 1.6% EtBr-containing agarose gel, EL-4 acted as a negative control, L363 as a positive control.
  • the arrows mark the 390bp ( ⁇ -actin PCR amplificate) and the 540bp gel band (PRDI-BF 1 PCR amplificate).
  • Figure 8 ZTL detection of PRDI-BFl overexpressing plasmacytoma cell lines.
  • ZTL CD8 x A2K b 402p, CD8 x A2K 401 and CD8 x A2K b 377 were used as effector cells under the specified E: T ratios in a 6-hour cytotoxicity test against the A2.1-positive target cells Saos-2 (O), U266 ( •), OPM-2 ( ⁇ ), MC-CAR (A) and the A2.1 negative target cell NCI-H929 ( ⁇ ) tested.
  • the ZTL lines CD8 allo A2 and CD8 x A2K b FluMl served as controls.
  • Fig. 9 PRDI-BFl RNA expression of normal cells.
  • Cytoplasmic RNA from monocytes, T cells and B cells was reverse transcribed in cDNA and amplified with PRDI, BFL or ⁇ -actin-specific primers in a subsequent PCR reaction.
  • the PCR products were electrophoresed in a 1.6% EtBr-containing agarose gel.
  • EL-4 acted as a negative control, L363 and NCI-H929 as a positive control.
  • the arrows mark the 390bp ( ⁇ -actin PCR amplificate) and the 540bp gel band (PRDI-BFl PCR amplificate).
  • Fig. 10 Lack of substantial recognition of resting lymphohemopoietic cells.
  • ZTL CD8 x A2K b 402p. A), CD8 x A2K b 401 (B), CD8 x A2K b 377 (C) were used as effector cells in a 6-hour 51 Cr release test at the given E: T ratios against resting B cells (O) and same cells loaded with PRDI-BFl 402-410 (•) in (A, B, D, E) and PRDI-BFl 377-386 ( ⁇ ) tested in (C, D, E).
  • the ZTL lines CD8 x A2K b FluMl (D) and CD8 allo A2 (E) served as controls.
  • Fig. 11 Lack of substantial recognition of resting lymphohemopoietic cells.
  • ZTL CD8 x A2K b 402p (A), CD8 x A2K b 401 (B), CD8 x A2K b 377 (C) were used as effector cells in a 6-hour 51 Cr release test at the given E: T ratios against resting T- Cells (O) and the same cells loaded with PRDI-BFl 402-410 (•) tested in (A, B, D, E) and PRDI-BFl 377-386 ( ⁇ ) in (C, D, E).
  • the ZTL lines CD8 x A2K b FluMl (D) and CD8 allo A2 (E) served as controls.
  • Fig. 12 Lack of substantial recognition of activated mature dendritic cells (DC).
  • ZTL CD8 x A2K 402p (A), CD8 x A2K b 377 (B) were used as effector cells in a 6-hour 51 Cr release test at the indicated E: T ratios against activated mature DC (O) and the same cells were loaded with PRDI -BFl 402-410 (•) tested in (A, C and D) and PRDI-BFl 377-386 ( ⁇ ) in (B, C and D).
  • the ZTL lines CD8 x A2K b FluMl (C) and CD8 allo A2 (D) served as controls.
  • Tg mice expressing the human MHC class I Tg HLA-A2.1 (A2.1) were crossed into the C57BL / 6 background using standard methods (Irwin et al., 1989). The following strains were used for this:
  • A2.1 K b (A2K b ) -Tg mice they are homozygous for a chimeric MHC class I Tg, which is derived from the human cd and ⁇ 2 domains of A2.1 and from the ⁇ 3 domain composed of H-2K b of the mouse, and for the H-2 b gene.
  • A2.1-Tg mice (([A2.1 x C57BL / 6] x C57BL / 6) F1 -Tg) - they express the ⁇ , ⁇ 2 and ⁇ 3 domains of the human A2.1 molecule heterozygously and are homozygous for H-2 b .
  • Synthetic peptides were obtained from SNPE (Neosystem beneficiary, France). The purity of the synthesized peptides was at least 75%, that of the peptides PRDI-BFl 401 and PRDI-BFl 402 at least 97%. The purity and correct amino acid composition of all peptides was checked by HPLC analysis and mass spectrometry. The peptides were dissolved in DMSO or H 2 O at 10 mg / ml. Storage took place in aliquots at -20 to -80 ° C. In addition, a peptide representing residues 128-140 of the hepatitis B virus core protein (TPPAYRPPNAPIL) was synthesized. (3) Antibodies
  • Mouse hybridoma line BB7.2 (ATCC HB-82) produced monoclonal antibodies.
  • FITC-conjugated polyclonal secondary antibody For the detection of mouse monoclonal antibodies in flow cytometry, a FITC-conjugated polyclonal secondary antibody (goat anti-mouse IgG
  • PBMZ peripheral blood mononuclear cells
  • the blood of a healthy A2-positive donor was diluted 1: 3 with PBS (Biowhittaker, Walkersville, MA) and with the same volume of Ficoll (Seromed Biochrom, Berlin) sub-layered. After centrifugation (1400 rpm, 21 ° C., 20 min), the PBMZ were isolated from the interphase and washed. The resting T and B cells were obtained after negative selection of A2-positive PBMZ with antibody-coated "beads" (Dynal, Hamburg).
  • the PBMZ were labeled with anti-CD 19- and incubated anti-CD 14 "beads", for the isolation of B cells with anti-CD2 and anti-CD 14 "beads” and for the isolation of monocytes with anti-CD2 and anti-CD 19 "beads”.
  • Dendritic cells were generated using standard methods from PBMC from an A2 positive donor. After incubating the PBMZ for 45 min at 37 ° C.
  • the human A2.1 positive T2 cell line is a B / T cell hybridoma of the fusion partners 721.147 and CEM (Salter and Cresswell, 1986),
  • T2A2K b T2 cells transfected with the A2K b gene according to Theobald et al., 1995 (T2A2K b ),.
  • the A2-negative cell line plasmacytoma NCI-H929 (CRL-9068, ATCC, VA, USA). All cells listed served as target cells with I cytotoxicity test.
  • A2.1 expression of cells and cell lines was measured in the fluorescence-activated cell sorter (FACS) (Becton Dickinson, San Jose, CA). In each case 0.5 Mo cells were centrifuged off and labeled with the anti-A2.1 monoclonal antibody BB7.2 (or RPMI 1640, 10% FCS, see 2.4) in a volume of 50 ⁇ l (Lustgarten et al., 1997).
  • FACS fluorescence-activated cell sorter
  • a competition test was used to determine the binding of the PRDI-BFl peptides to A2.1.
  • T2 cells were loaded with 0.01 or 0.003 ⁇ g of the A2.1 -binding peptide p53 264-272 (Theobald et al., 1995) and 3 or 10 ⁇ g PRDI-BFl peptide.
  • VSV-N 52-59 Vesicular Stomatitis Virus nucleoprotein
  • the A2.1-restricted and p53 264-272-specific ZTL A2 264 clone 46 were tested at various effector to target cell (E: T) ratios for their lyrical activity towards peptide-loaded and unloaded T2 target cells in a 4-hour cytotoxicity test ( see Chapter B 6) (Theobald et al., 1995).
  • E: T effector to target cell
  • the percentage inhibition of the ZTL A2 264-mediated specific lysis (SL) of p53 264-272-loaded T2 cells by the test peptides was calculated at an E: T ratio of 3: 1 using the following formula:
  • % Inhibition 100 - ⁇ (% SL T2 plus peptide 264 plus test peptide -% SL T2) x 100
  • mice 8 ⁇ g-old A2.1-Tg mice were given 100 ⁇ g of the respective test peptide and 120 ⁇ g HBV core 128-140 (an I-binding synthetic T helper peptide) (Theobald et al., 1995) emulsified in
  • LPS-activated B cell blasts loaded with 5 ⁇ g / ml of the respective test peptide and 10 ⁇ g / ml human ß 2 microglobulin, were added to 3 Mo / ml / well after washing twice (Theobald et al., 1995).
  • the LPS blasts were obtained by stimulating malt cells (1 Mo / ml) from A2.1-Tg mice with 25 ⁇ g / ml LPS (Salmonella typhosa) and 7 ⁇ g / ml dextran sulfate (Pharmacia Biotech, Freiburg) for three days.
  • the effector and stimulator cell batches were incubated for 6 days (1 ° cultures) and subjected to a cytotoxicity test.
  • Polyclonal peptide-specific ZTL lines with specificity for PRDI-BFl 377-386, 402- 410 and 401-410 (ZTL CD8 x A2K b 377, CD8 x A2K b 402p, CD8 x A2K b 401) and for Flu Ml 58-66 ( ZTL CD8 x A2K b Flu Ml) were established by weekly restimulation of the effector cells with peptide-loaded stimulator cells.
  • JA2 cells which were irradiated with 20,000 rads, were used as stimulator cells, then loaded in RPMI 1640 (Biowhittaker, Verviers, Belgium) with 5 ⁇ g / ml of the respective peptide and 10 ⁇ g / ml human ⁇ 2 -microglobulin for about 30 min and finally twice were washed.
  • the effector cells were seeded together with 0.5 Mo JA2 cells and 6 Mo with 3000 Rad irradiated C57BL / 6-Ml cells in a total volume of 2 ml / hole in a 24-hole plate. 2 -5% (v / v) supernatant from the culture medium Con A-activated mint cells (TCGF) from Lewis rats was added to the batches (Theobald et al., 1995).
  • Allo-A2.1-reactive CTL lines were induced by intraperitoneal immunization of CD8-Tg mice with 20 Mo JA2 cells / mouse. After three weeks, the spleen cells were isolated and stimulated in vitro (7 Mo / ml hole) with irradiated JA2 cells (0.5 Mo / ml / hole) or spleen cells (6 Mo / ml hole) A2.1-Tg mice. Repeated weekly in vz ' tro restimulation with JA2 cells in the presence of irradiated C57BL / 6 mint cells (6 Mo / ml hole) and 2-5% TCGF finally generated allo-A2.1-reactive ZTL lines. (5) RT-PCR
  • cytoplasmic RNA was isolated from cells and cell lines using the RNeasy Mni Kit ("RNeasy Mni Protocol for the Isolation of RNA from the Cytoplasm of Animal Cells", Quiagen, Hilden).
  • RNA determination The RNA concentration was determined photometrically by measuring the absorption (OD) at a wavelength of 260 nm
  • the RT reaction was carried out in a thermal cycler (Master Cycler gradient 5331, Eppendorf) at 55 ° C for 60 min and then 10 min at 65 ° C.
  • the cDNA products were then purified using the High Pure PCR Product Purification Kit (Röche) according to the manufacturer's instructions.
  • PCR reaction One tenth of the purified cDNA was primed with PRDI-BF1 (forward primer: 5 -CAC ACG GGA GAA AAG CCA CAT- 3 ⁇ and reverse primer: S-GAG GCA ACT TCA TGA GGG GTA GAT- 3 ⁇ ) and in parallel with ⁇ -actin-specific primers (forward primer; 5 "-CTG GCA CCA CAC CTT CTA CAA TT and reverse primer: 5 ⁇ -CTT CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT-3 ⁇ and 2.5U Taq Polymerase (Sigma) amplified in 1 x PCR buffer (Sigma) 0.25 mM dNTPs
  • the PCR reaction included a hot start (2 Mn 30 lake at 94 ° C), 40 cycles (denaturation: 30 lake 94 ° C, annealing: 1 Mn 65 ° C and elongation: 1 min 30 sea 72 ° C + 5 sec / cycle from cycle 11) and final
  • the lytic reactivity of effector cells towards different target cells was checked in a 51 Cr release test (Theobald et al., 1995). T2 cells were used as target cells for peptide titration tests. 1-5 Mo target cells were labeled with 150 ⁇ Ci Na ( 51 Cr) O 4 (1 mCi / ml) (NEN Life Science, Belgium) for 60-90 min. Before this labeling, 2 ⁇ l peptide solution of different concentrations and 15 ⁇ l FCS (PAA Laboratories, Linz, Austria) or FCS without peptide were added to the cells in peptide titration tests. The marked target cells were washed four times and the cell number set to 0.1 Mo / ml.
  • the effector cells were serially diluted 1: 3 with cell culture medium and seeded at 0.1 ml / well in 96-well plates. A total of five different E: T ratios were tested. Then 0.1 ml / well of the target cell suspension was added to the effector cells and the batches were incubated for 4-6 hours. The cells were then centrifuged off (1300 rpm, 5 ° C., 9 min), the supernatant (0.1 ml / hole) was removed and the 51 Cr release was measured using a gamma counter (Canberra Packard, Dreieich). The percentage specific lysis (SL) was calculated using the following formula:
  • the maximum 51 Cr release corresponded to the total 51 Cr incorporation by the target cells
  • the spontaneous 51 Cr release corresponded to the target cell lysis in the absence of effect lines and was generally less than 10% of the maximum 5 Cr release.
  • the values for spontaneous and maximum lysing were averaged from four approaches and those for experimental lysing from two approaches.
  • Example 1 Experimental extraction of the PRDI-BFl oligopeptides with the amino acid sequences shown in the sequence listing 1 to 30
  • the PRDI-BFl peptides shown in the sequence protocols 1 to 30 were selected (see FIG. 1), which show a strong or intermediate binding affinity to A2.1 (see example 1.2).
  • the partial sequences of the PRDI-BF1 protein with the gene bank accession number: A39564 corresponding to these oligopeptides are listed in Table 1. (1.2) Binding of selected synthetic PRDI-BFl peptides to A2.1
  • the PRDI-BFl peptides selected according to (1.1) based on their theoretical binding strength were examined for their actual binding affinity for A2.1.
  • a competitive binding test which was published in Theobald et al. (1995) is functionally tested, the ability of the PRDI-BFl peptides to inhibit A2, l binding of the competing synthetic peptide p53 264-272. This inhibition was measured based on the decrease in the A2.1-restricted p53 264-272-specific CTL clone-mediated lysis of T2 cells which were loaded with p53 264-272 peptide and the individual PRDI-BFl test peptide.
  • the binding results are summarized in FIG. 1.
  • the known A2.1-binding peptide Flu Ml 58-66 (cf. Theobald et al., 1995) served as a positive control and showed more than 80% inhibition at 3 ⁇ g and also at 10 ⁇ g, while the H-2K b -binding peptide VSV-N 52-59 (Theobald et al., 1995) as a negative control showed no A2.1 binding activity.
  • the PRDI-BFl peptides were divided into 4 groups according to their binding strength. Of a total of 61 peptides tested, 16 had high binding activity (at least 85% inhibition with 10 ⁇ g test peptide), 28 medium (40-84% inhibition), 10 weak (14-39%) and 7 no binding activity ( ⁇ 13% or no dose dependence of inhibition).
  • PRDI-BFl peptides were peptide 402-410 (SEQ ID NO. 1) and the two homologous peptides 747-755 (SEQ ED NO. 13) and 681-690 (SEQ ID NO. 19), both of which at 10 ug as well as at 3 ug showed 100% inhibition of the binding of the competing peptide p53 264-272.
  • Dose dependency for these peptides only became apparent at an E: T of 1: 1.
  • the 13 other strongly binding peptides including the peptides with the sequences according to SEQ ID NO. 2-4, 14, 16 and 18 showed a clear dose-dependent inhibition.
  • mice induced ZTL with restriction for the A2K b -Tg recognize the same peptide antigens that are also immunogenic in A2.1 positive humans.
  • the other strategy for enhancing the A2.1 restricted response was to create a double-Tg mouse "CDS x A2.1 / K b " by crossing an A2K b -Tg with a huCD8 ⁇ / ß-Tg mouse. Expression of the ⁇ and ⁇ chains of the huCD8 molecule enables the generated CTL to interact with the ⁇ 3 domain of the A2.1 molecule in human cells.
  • A2K b - and CDS x A2K b -Tg mice were immunized with the strong or intermediate binding peptides obtained according to Example 1 (see FIG. 1) in order to obtain PRDI-BFl peptide-reactive ZTL.
  • 9 to 11 days after the immunization mint cells of the mice in question were stimulated in vitro with peptide-loaded syngeneic LPS blasts and 6 days later were examined for an A2.1-restricted peptide-specific CTL response in a cytotoxicity test.
  • the results are summarized in Fig. 2.
  • the induction of A2.1-restricted ZTL was already known for the positive control Flu Ml 58-66 (Theobald et al., 1995).
  • ZTL induced by PRDI-BFl 401-410, 402-410, 377-386 were A2.1 restricted because the corresponding peptide-loaded A2.1 negative EL-4 cells (H-2 b ) of the mouse were not (Fig. 3).
  • oligopeptide 406-415 in addition to an A2.1-restricted, primarily an H-2 b- restricted ZTL response was induced, since in addition to PRDI-BFl 406-415-laden T2 cells, EL cells were also 4 cells that were loaded with this peptide were specifically recognized (FIG. 3).
  • PRDI-BFl 401-410-, 402-410- and 377-386-specific ZTL A2.1 restriction, peptide specificity and efficiency of peptide recognition
  • FIG. 4 AC The peptide specificity and A2.1 restriction of the established ZTL lines CD8 x A2K b 377, CD8 x A2K b 402p and CDS x A2K b 401 are shown in FIG. 4 AC. These ZTLs did not recognize unloaded or with the irrelevant peptide Flu Ml 58-66 - loaded T2 target cells. However, Flu Ml 58-66- presenting T2 cells were lysed from a CD8 x A2K b T cell population specific for Flu Ml 58-66 (not shown). The ZTL were A2.1 restricted because the corresponding peptide-loaded A2.1 negative EL-4 cells (H-2 b ) of the mouse were not recognized (FIG. 4 AC).
  • the ZTL CD8 x A2K b 402p also recognized the peptide variant 402-410 A, which has an amino acid substitution of cysteine for alanine at position 408 (FIG. 4B). If T2 cells were incubated at different concentrations of synthetic peptide 402-410 and 402-410A and used as target cells for CD8 x A2K b 402p in the cytotoxicity test, the ZTL line showed an approximately one log step more efficient detection of the peptide variant 402-410A (Fig. 5B). The ZTL line CD8 x A2K b 401 also showed cross-reactivity towards the peptide PRDI-BFl 402-410 shortened by an amino acid (FIG. 4C).
  • the peptide 402-410 was recognized by this ZTL line by one log level more efficiently than the peptide PRDI-BFl 401-410 used to propagate the ZTL (detection of PRDI-BFl 402-410 even at a peptide concentration of InM compared to 10 nM for PRDI-BFl 401-410) (Fig. 5C).
  • the efficiency of peptide recognition with an E: T ratio of 10: 1 is also shown in FIG. 5A.
  • the ZTL recognized the specific peptide PRDI-BFl 377-386 up to a peptide concentration of 1-10 nM.
  • PRDI-BFl - peptides represent MM-associated peptide antigens
  • various MM cell lines were first tested for the expression of PRDI-BFl RNA examined.
  • the cytoplasmic RNA was isolated, the polyA-RNA (mRNA) was transcribed into cDNA (reverse transcription) with an oligo-dT primer and amplified with PRDI-BFl -specific primers in a subsequent PCR reaction.
  • the cDNA was also amplified with ⁇ -actin-specific primers.
  • ß-actin Since ß-actin is constitutively expressed in all cells, a comparable ß-actin signal can be expected in all cells.
  • Both the ß-actin-specific primers and the PRDI-BFl -specific primers were chosen intron-spanning, so that due to the size of the PCR product between an RNA amplificate (PRDI-BFl: 540bp fragment; ß-actin: 390bp fragment ) and a possibly contaminating DNA-derived amplificate (PRDI-BFl: 950bp fragment; ß-actin: 830bp fragment).
  • PRDI-BFl RNA expression shows the PRDI-BFl RNA expression of the MM cell lines L363, MC-CAR, U266, IM9, OPM-2 and NCI-H929.
  • the MM cell lines show a strong PRDI-BFl expression (540 bp amplificate). All investigated cell lines show a comparable expression of ß-actin (390bp amplificate).
  • PRDI-BF1 RNA expression was also examined for the two osteosarcoma cell lines Saos-2 and U2OS (FIG. 7). For the U2OS cell line, the expression of PRDI-BFl RNA was already proven by Keller and Maniatis (1991).
  • U2OS express significantly more PRDI-BFl RNA than Saos-2. Both cell lines show a lower expression compared to the MM cell line L363, which served here as a positive control (FIG. 7). EL-4 acted as a negative control (Fig. 7) (3.2) Recognition of PRDI-BFl overexpressing MM cells by PRDI-BFl 401-410-, 402-410- and 377-386-specific ZTL
  • the A2-positive MM- Cell lines U266, OPM-2 and MC-CAR and the A2-negative MM cell line NCI-H929 (data on A2.1 expression in the flow cytometry not shown) in comparison with the A2-positive osteosarcoma cell line Saos-2 as target cells used for the ZTL CD8 x A2K b 377, CD8 x A2K b 402p and CD8 x A2K b 401 in the cytotoxicity test (Fig. 8).
  • the ZTL lines showed a selective and efficient lysis of the A2 + MM cell lines, the A2 * NCI-H929 cells were not lysed by any ZTL line (FIG. 8).
  • A2 + Saos-2 cells which showed a significantly lower PRDI-BFl expression in the RT-PCR (FIG. 7) were accordingly not recognized by the PRDI-BFl-specific CTL (FIG. 8).
  • the ZTL line CD8 allo A2 served as a positive control. Both the MM cell lines U266, OPM-2 and MC-CAR and Saos-2 cells were lysed by the allo-A2.1 -reactive effector cells, but not the A2 " cell line NCI-H929 (FIG. 8).
  • PRDI-BFl-specific ZTL-mediated immunotherapy it is desirable that normal cells are not lysed.
  • PRDI-BFl RNA is overexpressed in MM cells (see Example 3, (3.1)) and is known to be also expressed by some normal cells, including lymphohematopoietic cells.
  • FIG. 9 shows the PRDI-BF1 RNA expression for resting monocytes, T cells and B cells. In comparison to the two MM cell lines L363 and NCI-H929, these lymphohemopoetic cells have a significantly lower, but still substantial, amount of PRDI-BFl RNA, and EL-4 cells acted as a negative control.
  • Non-transformed lymphohemopoietic cells were subsequently used as target cells for A2.1-restricted CTLs with specificity for PRDI-BFl 401-410, 402-410 and 377-386. Resting B cells and T cells were not recognized by any of the PRDI-BFl-specific ZTL (FIGS. 10 and 11 AC), ZTL lysis could be achieved by adding peptide PRDI-BFl 402-410 for CD8 x A2K b 402p and CD8 x A2K b 401 and reconstituted by PRDI-BFl 377-386 for CDS x A2K b 377 (Fig. 10 and 11 AC), which confirmed a sufficient A2.1 expression of the target cells.
  • Example 5 Production of A2.1-restricted T cell receptors which are specific for a PRDI-BFI oligopeptide according to the invention with an amino acid sequence shown in the sequence listing 1 to 30
  • A2.1-Tg mice are immunized with a PRDI-BFl oligopeptide ⁇ according to the invention which has one of the amino acid sequences shown in the sequence listing 1-30.
  • the milk is removed after 10 days.
  • the mint cells are stimulated in vitro with previously produced, A2.1-positive antigen-presenting cells which are loaded with the oligopeptide according to the invention.
  • These A2.1-positive antigen-presenting cells were produced using the techniques known in the prior art and familiar to the person skilled in the art.
  • the T cells are checked for their peptide and tumor recognition, peptide specificity and A2.1 restriction. After successful testing, the T cell line is cloned. The resulting T cell clones are tested again for peptide and tumor recognition, peptide specificity and A2.1 restriction.
  • the total mRNA is prepared from a T cell clone with a positive test result.
  • the T-cell receptor ⁇ and ⁇ chains are amplified using RT-PCR.
  • the respective Chains are first cloned into bacterial plasmids and sequenced.
  • the chains are partially humanized by replacing the constant mouse regions with the homologous human regions.
  • the resulting constructs are then cloned into suitable retroviral vectors.
  • T-cell receptor-expressing T-lymphocytes are analyzed for their ability to lyse tumor cells. After successful testing, the gene-modified lymphocytes are transfused into the patient and are there to kill the degenerated cells and thus cause healing.
  • PRDI-BFl -specific ⁇ / ⁇ -T cell receptor chains are cloned into vectors which are due to infect patient T cells in vivo. These infected T cells express PRDI-BFl -specific T cell receptors and are therefore able to recognize and kill PRDI-BFl -expressing tumor cells of the patient.

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Abstract

Die Erfindung betrifft tumorassoziierte Oligopeptide, die von CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten (ZTL) aIs Peptidantigen erkannt werden, und die eine ZTL-induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumorzellen, insbesondere Zellen des Multiplen Myeloms herbeiführen. Die Oligopeptide weisen Arninosäuresequenzen auf, die Teilsequenzen des humanen PRDI-BF1-Proteins entsprechen. Jedes Oligopeptid stellt ein Epitop für CD8-positive ZTL dar und ist dazu geeignet, eine auf humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe 'MHC Klasse I', Allelvariante A2 (kurz: A2) eingeschränkte (restringierte) Immunantwort von CD8-positiven ZTL gegen Multiple- Myelom-Zellen und andere Tumorzellen zu induzieren.

Description

Tumor-Peptidantigene aus humanem PRDI-BFl-Protein
B e s c h r e i b u n g
Die Erfindung betriffl ein tumorassoziiertes Oligopeptid, das von CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten (ZTL) als Peptidantigen erkannt wird, und das eine ZTL- induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumorzellen, insbesondere Zellen des Multiplen Myeloms herbeiführt,
CD8-positive ZTL stellen Effektorzellen des zellulären Immunsystems dar. Ihre Funktion besteht in der spezifischen Eliminierung von infizierten oder entarteten körpereigenen Zellen. Die ZTL erkennen unter anderem tumorspezifische oder tumorassoziierte Peptidantigene (TAA), die an Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Moleküle der Klasse I gebunden und auf der Oberfläche der entarteten Zellen präsentiert sind. Die Erkennung der Peptidantigene im Kontext von MHC Klasse I-Molekülen erfolgt durch spezifische membranständige T-Zellrezeptoren (TZR) der ZTL. Nach Erkennung wird die betreffende Zelle abgetötet, indem die ZTL. die Zielzellen lysieren und/oder den programmierten Zelltod (Apoptose) dieser Zielzellen induzieren oder Zytokine freisetzen.
Die Erkennung von Zielzellen durch ZTL wird durch die Expression des CD 8- Korezeptors auf ZTL erleichtert. Der CD8-Korezeptor bindet an konservierte Regionen der α2- und α3 -Domänen des MHC Klasse I-Moleküls und trägt damit zur Stabilisierung des TZR-Peptid-MHC-Komplexes bei.
Die Identifizierung humaner, tumorassoziierter Peptidantigene sowie die Generierung tumorreaktiver T-Lymphozyten mit Spezifität für diese Antigene sind essentielle Voraussetzungen für die Etablierung immunologischer Strategien in der Therapie bösartiger, humaner Tumoren, insbesondere auch des Multiplen Myeloms. Bislang angewandte Behandlungsmethoden an Patienten mit Multiplem Myelom (Plasmozytom) sind wenig erfolgreich. Es existieren jedoch zunehmend klinische und experimentelle Studien, die darauf hinweisen, daß das Multiple Myelom durch eine ZTL-basierte Immuntherapie beeinflußbar ist, Da für eine Immuntherapie des Multiplen Myeloms derzeit nur wenige universelle Multiple-Myelom-assoziierte Peptidantigene beschrieben sind, besteht weiterhin der Bedarf nach der Identifizierung von Peptidantigenen, die sich aus einem Protein ableiten, das in Multiple-Myelom-Zellen (=malignen Plasmazellen) im Vergleich zu Normalzeiten überexprimiert wird.
Das PRDI-BFl Protein ist in die terminale Differenzierung von B-Zellen involviert, so daß Plasmazellen und deren Neoplasien, nämlich Zellen des Multiplen Myeloms, eine Überexpression von PRDI-BFl zeigen. Für das murine Homolog von PRDI-BFl (Blimp-1) wurden verschiedene Normalgewebe auf RNA-Expression untersucht. Dabei Wurde eine schwache Expression in Knochenmark, Milz und Lymphozyten nachgewiesen, ebenso in Gehirn, Lunge, Herz, Nieren, Haut und Testis. Die Ergebnisse jüngster Untersuchungen weisen darauf hin, daß PRDI-BFl auch in die Differenzierung von myeloiden Zellen involviert ist.
Die aus der zellulären Prozessierung des PRDI-BFl Proteins resultierenden Oligopeptide können im Kontext von MHC Klasse I Molekülen der Allelvariante A2, Subtyp A2.1 (kurz: A2.1; das häufigste MHC-Klasse I-Allel in der kaukasischen Bevölkerung), auf der Zelloberfläche präsentiert werden und repräsentieren attraktive Zielstrukturen für CD8-positive ZTL. Sie können folglich unter bestimmten Noraussetzungen als Impfstoff zur Induktion von T-Zellen im allgemeinen und von Tumor-reaktiven T-Zellen im besonderen eingesetzt werden mit dem Ziel, daß diese T-Zellen die Remission und Eradikation von Multiple-Myelom-Zellen herbeiführen. Im Fall von Melanomen sind bereits einige Peptidantigene bekannt, die auf diese Weise zur Immuntherapie innerhalb klinischer Prüfungen verwendet werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, tumorassoziierte, insbesondere Multiple-Myelom-assoziierte Peptidantigene bereitzustellen, die von CD8-positiven ZTL erkannt werden und eine ZTL-induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumorzellen, insbesondere Multiple-Myelom-Zellen herbeiführen.
Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Oligopeptids, das (a 1) eine der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Aminosäuresequenzen aufweist, die den in dem betreffenden Sequenzprotokoll angegebenen Aminosäurepositionen des humanen PRDI-BFl -Proteins entspricht, oder das (a 2) eine durch Aminosäure-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition, -Inversion und/oder durch chemische oder physikalische Modifikation einer oder mehrerer Aminosäuren von einer dieser Aminosäuresequenzen ableitbare Aminosäuresequenz aufweist, und das (b) ein Epitop für CD8-positive ZTL darstellt und (c) dazu geeignet ist, eine auf humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante A2 (kurz: A2) eingeschränkte (restringierte) Immunantwort von CD8-positiven ZTL gegen Multiple- Myelom-Zellen und andere Tumorzellen zu induzieren.
Eine äquivalente Lösung besteht in der Bereitstellung eines zu diesem erfindungsgemäßen Oligopeptid analogen retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids, das anstelle der -CO-NH-Peptidbindungen Nichtpeptidbindungen wie z.B. - NH-CO-Bindungen aufweist (vgl. Meziere et al. 1997).
Mit den Oligopeptiden gemäß der Sequenzprotokolle 1 bis 30 werden erstmals Peptidantigene bereitgestellt, deren Aminosäuresequenz aus dem humanen PRDI-BFl - Protein stammen. Die PRDI-BFl -Oligopeptide gemäß der Sequenzprotokolle 1 bis 30 und ihre Derivate stellen quantitativ tumorassoziierte, insbesondere an Multiple-Myelom- Zellen assoziierte ZTL-Epitope dar und liefern damit die molekulare Grundlage für eine PRDI-BFl -spezifische Immuntherapie maligner Erkrankungen, insbesondere des Multiplen Myeloms.
Die erfindungsgemäßen Oligopeptide (d.h. die in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Oligopeptide und deren Derivate) können insbesondere in der aktiven und passiven Immunisierung von Patienten mit Multiplem Myelom, bei denen die diesen Oligopeptiden entsprechenden Epitope im Kontext von A2.1 präsentiert werden, eingesetzt werden, um die Induktion, Generierung und Expandierung von zytotoxischen T-Lymphozyten herbeizuführen, die für die betreffenden PRDI-BFl - Aminosäuresequenzen spezifisch sind, und die in der Lage sind, die Multiple-Myelom- Zellen der betreffenden Patienten spezifisch abzutöten und dadurch eine Heilung zu vermitteln. Im Zuge der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß PRDI-BFl in ruhenden B- Zellen, T-Zellen und in mononukleären Zellen des peripheren Blutes nur gering exprimiert ist und deshalb für eine Abtötung durch PRDI-BFl -spezifische Zellen nicht suszeptibel, d.h. kein geeigneter Angriffspunkt ist. Für die in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Oligopeptide und deren Derivate ergibt sich daraus der Vorteil eines breiten Indikationsgebiets bei vernachlässigbar geringem Risiko eines unerwünschten Angriffs auf Normalzellen.
Die Derivate der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Oligopeptide und/oder auch die davon abgeleiteten retro-inversen Peptide oder Pseudopeptide haben gegenüber dem jeweils ursprünglichen Oligopeptid selbst den Vorteil, daß damit eine potentielle fünktionelle Selbsttoleranz (gegenüber den entsprechenden ursprünglichen Oligopeptiden) auf T-Zellebene umgangen werden kann. Während die PRDI-BFl - Oligopeptide gemäß der Sequenzprotokolle 1 bis 30 aufgrund der (geringen) Expression in einigen Normalgeweben u.U. in dem betreffenden Organismus (Patientenkörper) ein sogenanntes Tolerogen darstellen und für die organismuseigenen (patienteneigenen) ZTL nicht immunogen sind, werden die Derivate dieser Oligopeptide im Regelfall als Antigene erkannt und induzieren die Aktivierung und Expandierung von ZTL. Diese Derivatinduzierten ZTL weisen in der Regel eine hohe Kreuzreaktivität gegenüber der/den betreffenden PRDI-BFl -Oligopeptid- Wildtypsequenz(en) auf und induzieren infolgedessen auch die Lyse und/oder Apoptose von solchen (Tumor-)Zellen, die PRDI- BFl -Oligopeptide gemäß der Sequenzprotokolle 1 bis 30 (im Kontext von A2, insbesondere von A2.1) auf ihrer Oberfläche präsentieren.
Besonders bevorzugte Derivate der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Oligopeptide sind solche, die natürlicherweise in anderen Säuge- oder Wirbeltieren vorkommen, z.B. entsprechende Homologe aus der Maus. Diese PRDI-BF1- Oligopeptid-Homologe und die dafür kodierenden Nukleinsäuren können relativ leicht, nämlich direkt und mit geläufigen Isolationsverfahren, aus dem jeweiligen Organismus gewonnen werden. Die in den Sequenzprotokollen 1 bis .30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide und deren Derivate sowie die retro-inversen Peptide oder Pseudopeptide können mittels gängiger Peptidsyntheseverfahren hergestellt werden, und die für diese Oligopeptide kodierenden Nukleotidsequenzen können mit bekannten chemischen oder mit molekularbiologischen Verfahren gewonnen werden.
Es besteht zudem die Möglichkeit, aus den vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Oligopeptiden, einem flexiblem Linker und einer schweren Kette des HLA-Moleküls ein Fusionsprotein zu konstruieren, und zwar derart, daß das Oligopeptid dazu befähigt (in der Lage bzw. geeignet) ist, die Peptid-Bindungsfürche des HLA-Moleküls zu besetzen. Diese Fusionsproteine und dafür kodierende Polynukleotide eignen sich insbesondere als (Wirkstoff von einem) Diagnostikum oder Therapeutikum oder Prophylaktikum oder allgemein für eine Detektion und/oder Manipulation von T-Zellen, die eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30, insbesondere 1-4 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide erkennen. Die Erfindung betrifft deshalb auch ein Fusionsprotein, welches aus einem der vorstehend beschriebenen Oligopeptide, aus einer schweren Kette des HLA-Moleküls und aus einem flexiblem Linker besteht und derart konstruiert ist, daß das Oligopeptid geeignet (in der Lage bzw. befähigtest, die Peptid-Bindungsfürche des HLA-Moleküls zu besetzen, und welches zur Verwendung bzw. für den Einsatz als Diagnostikum oder Therapeutikum oder Prophylaktikum oder allgemein für eine Detektion und/oder Manipulation von T-Zellen, die eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30, insbesondere 1-4 dargestellten PRDI-BFl -Oligopetide erkennen, geeignet ist. Die für dieses Fusionsprotein kodierende Polynukleotide sind ebenfalls Gegenstand vorliegender Erfindung.
Die in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Oligopeptide und deren Derivate sowie die retro-inversen Peptide oder Pseudopeptide und die Fusionsproteine eignen sich sowohl zur in-vivo-Induktion von T-Lymphozyten im Patienten als auch zur in-vitro- Induktion und -Expansion entsprechend reaktiver patienteneigener oder patientenfremder T-Lymphozyten. Für eine in-vivo-Induktion und -Expansion von T-Lymphozyten im Patienten kommen verschiedene Verfahren in Betracht, beispielsweise (a) die Injektion eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide und/oder eines oder mehrerer Derivate dieser Oligopeptide und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids und/oder eines Fusionsproteins als reines Peptid oder zusammen mit Adjuvantien oder mit Cytokinen oder in einem geeigneten Freisetzungssystem wie z.B. Liposomen, (b) die Injektion einer Nukleinsäure, die für eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide oder deren Derivate und/oder für eines der retro-inversen Peptide oder Pseudopeptide und/oder für eines der Fusionsproteine kodiert - in "nackter" oder komplexierter Form oder in Form von viralen oder nichtviralen Vektoren oder zusammen mit Freisetzungssystemen wie kationischen Lipiden oder kationischen Polymeren, (c) die Beladung von Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs mit einer oder mehreren der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide oder deren Derivaten oder dazu analogen retro-inversen Peptiden oder Pseudopeptiden, (d) die Beladung von Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs mit wenigstens einem der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl - Oligopeptiden oder dazu Homologen oder retro-inversen Peptiden oder Pseudopeptiden anderer Spezies, so daß infolgedessen das/die betreffende(n) PRDI-BFl -Oligopeptid(e) und/oder dessen/deren Derivat(e) und/oder oder das/die retro-inverse(n) Peptid(e) oder Pseudopeptid(e) auf den jeweiligen Zellen präsentiert wird/werden, oder (e) die Transfektion oder Infektion von Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs mit den mindestens für eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide oder dessen Derivate oder davon abgeleitetes retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid oder Fusionsprotein kodierenden Nukleinsäuren (wiederum entweder in "nackter" oder komplexierter Form oder in Form von viralen oder nichtviralen Vektoren).
Im Fall einer in-vitro-Induktion und -Expansion werden die in-vitro gewonnenen T- Lymphozyten anschließend dem Patienten per Infusion oder Injektion o. ä Verfahren zugeführt. Die Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide und/oder deren Derivate und/oder dazu analoger retro-inverser Peptide oder Pseudopeptide und/oder Fusionsproteine und/oder eines Polynukleotids, das mindestens für eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide kodiert, zur Herstellung von Diagnostika - insbesondere MHC-Tetramere oder MHC-Dimere oder andere Strukturen, an die wenigstens ein solches erfindungsgemäßes Oligopeptid oder retro-inverses Peptid .oder Pseudopeptid durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung assoziiert ist - und/oder Prophylaktika und/oder Therapeutika (insbesondere Impfstoffe) für den Nachweis und/oder die Beeinflussung und/oder Generierung und/oder Expandierung und/oder Steuerung des Aktivierungs- und Funktionszustands von T-Zellen, insbesondere CD8- positiven ZTL.
Als Therapeutika und/oder Prophylaktika kommen insbesondere Impfstoffe oder Injektionen oder Infüsionslösungen in Betracht, die als Wirkstoff (a) eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide und/oder wenigstens ein Derivat eines dieser Oligopeptide und/oder wenigstens ein zu einem dieser Oligopeptide oder zu deren Derivate analoges retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid und/oder wenigstens eines der vorstehend beschriebenen Fusionsproteine enthalten, und/όder die (b) eine Nuklemsäure enthalten, die mindestens für eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide oder mindestens für ein Derivat eines dieser Oligopeptide kodiert, und/oder die (c) in-vitro erzeugte T- Lymphozyten, welche spezifisch gegen eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide und/oder deren Derivat(e) und/oder gegen ein zu einem dieser Oligopeptide oder zu einem Derivat dieser Oligopeptide analoges retro- inverses Peptid oder Pseudopeptid gerichtet sind, enthalten.
Zur Herstellung der Diagnostika oder auch der Therapeutika oder auch der Prophylaktika eignen sich insbesondere auch rekombinante DNS- oder RNS -Vektormoleküle, die ein oder mehrere Polynukleotid(e) enthalten, welche für mindestens eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl - Oligopeptide und/oder für mindestens ein Derivat eines dieser Oligopeptide kodieren, und die in Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs transkribierbar bzw. exprimierbar sind. Die Erfindung umfaßt deshalb auch solche rekombinanten DNS- oder RNS-Vektormoleküle und Wirtszellen, die diese Vektormoleküle enthalten.
Als Diagnostikum oder Therapeutikum oder Prophylaktikum oder allgemein für eine Detektion und/oder Manipulation von Zellen, die eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide überexprimieren, können erfindungsgemäß auch polyklonale, monoklonale oder rekombinante Antikörper eingesetzt werden, die gegen wenigstens eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellte PRDI-BFl - Oligopeptide und/oder gegen wenigstens ein Derivat dieses Oligopeptids und/oder gegen wenigstens ein zu diesem Oligopeptid oder dessen Derivat analoges retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid oder Fusionsprotein gerichtet sind, oder die mit einem Komplex aus einem der betreffenden Oligopeptide bzw. dessen Derivate bzw. dazu retro-inversen Peptid(en) und/oder Pseudopeptid(en) und HLA-A2 reagieren.
Die Verwendung eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl - Oligopeptide und/oder eines Derivates dieser Oligopeptide und/oder eines zu einem dieser Oligopeptide oder zu einem Derivat dieser Oligopeptide analogen retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids oder Fusionsproteins für die Herstellung polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter Antikörper gegen ein solches erfindungsgemäßes Oligopeptid bzw. retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid und der/die betreffende^) Antikörper an sich sind folglich ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
Als Diagnostikum oder Therapeutikum oder Prophylaktikum oder allgemein für eine Detektion und/oder Manipulation von Zellen, die wenigstens eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide überexprimieren, können erfindungsgemäß auch polyklonale, monoklonale oder rekombinante A2- restringierte T-Zellrezeptoren oder dazu funktioneil äquivalente Moleküle eingesetzt werden, die spezifisch für eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide und/oder für ein Derivat eines dieser Oligopeptide und/oder für dazu analoge retro-inverse Peptide oder Pseudopeptide oder für ein vorstehen beschriebenes Fusionsprotein sind. Die T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenten Moleküle können autologen, allogenen oder xenogenen Ursprungs sein. Zum Gegenstand vorliegender Erfindung gehört folglich vorrangig auch:
• die Verwendung wenigstens eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide und/oder Derivate eines dieser Oligopeptide und/oder dazu analoger retro-inverser Peptide oder Pseudopeptide oder die Verwendung von Polynukleotiden mit einer Nukleotidsequenz, die mindestens für eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide und/oder ein Derivat dieser Oligopeptide kodiert, zur Herstellung polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter A2-restringierter T-Zellrezeptoren oder dazu funktioneil äquivalenter Moleküle mit Spezifität für ein solches erfindungsgemäßes Oligopeptid bzw, retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid,
• der/die betreffende(n) T-Zellrezeptor(en) an sich und dazu funktionell äquivalente Moleküle,
• sowie Polynukleotide, die für diese T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenten Moleküle kodieren,
• Expressionsvektoren mit der Fähigkeit zur Expression dieser T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenten Moleküle.
Die Erfindung umfaßt außerdem Reagenzien zur in-vivo- oder in-vitro-Aktivierung von T-Zellen, insbesondere CD8-ρositiven ZTL, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie unter Verwendung wenigstens eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide und/oder wenigstens eines Derivates eines dieser Oligopetide und/oder wenigstens eines dazu analogen retro-inversen Peptids oder Pseudopeptide oder Fusionsproteins und/oder unter Verwendung wenigstens eines Polynukleotids, das mindestens für eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Oligopeptide oder deren Derivat(e) und/oder dazu analogen retro-inversen Peptide oder Pseudopeptide oder Fusionsproteine kodiert und/oder unter Verwendung wenigstens eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl -Oligopeptide oder dazu Homologen anderer Spezies hergestellt sind. Bei diesen Reagenzien kann es sich insbesondere um Therapeutika, und dabei vor allem um Impfstoffe handeln.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Herstellungs- und Anwendungsbeispielen mit Figuren näher erläutert.
Die verwendeten Abkürzungen bedeuten:
A2 humanes Leukozyten- Antigen der Molekülgruppe
"MHC Klasse I", Allelvariante "A2"
A2.1 humanes Leukozyten- Antigen der Molekülgruppe
"MHC Klasse I", Allelvariante "A2", Subtyp "A2.1"
A2Kb A2.1 K = MHC Klasse I-Molekül aus α und α2-Domäne von A2 und α3-Domäne von Kb
APZ antigenpräsentierende Zelle
ATCC American Type Culture Collection
ATP Adenosin-5 '-triphosphat bkgd unspezifische Fluoreszenzintensität
Blimp-1 B lymphocyte induced maturation protein 1 bp Basenpaare
PRDI-BFl positive regulatory domain I binding factor 1
BSA Rinderserumalbumin
C-terminal Carboxyl-terminal
CD Differenzierungscluster
CD8 humaner CD8α/ß-Korezeptor
CDR komplementaritätsbestimmende Region cDNA komplementäre DNA
CMV Cytomegalievirus
Con A Concanavalin A
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleosidtriphosphat
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
DTT Dithiothreitol
DZ dendritische Zellen
E:T Effektor-zu-Zielzell- Verhältnis
EBV Epstein-Barr- Virus
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ER Endoplasmatisches Retikulum EtBr Ethidiumbromid
FACS Fluoreszenz-aktivierter Zeil-Sortierer
FCS fötales Kälberserum
FITC Fluoreszein-Isothiocyanat
Flu Ml A PR/8/34 Influenza Virus-Matrixprotein Ml
G-418 Geneticin (Neomycin- Antibiotikum)
GM-CSF Granulozyten-Makrophagen-colony stimulatiήg factor
HBV pol Hepatitis B Virus-Polymerase
HEPES N-(2-Hydroxyethyl)piperizan-N'-ethansulfonsäure
HLA humanes Leukozyten-Antigen
HLA-A2.1 humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I"
Allelvariante "A2", Subtyp "A2.1"
IFA inkomplettes Freundsches Adjuvans
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin kb Kilobasenpaare
Kb H-2K kDa kilo Dalton
LCL lymphoblastoide Zellinie
LPS Lipopolysaccharid
MHC Haupthistokompatibilitätskomplex
Mio Million
MM Multiples Myelom mut mutiert
N-terminal Amino-terminal
OD optische Dichte
PBMC mononukleäre Zellen des peripheren Bluts
PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PCR Polymerasekettenreaktion
PG-E2 Prostaglandin E2
Rad radiation absorbed dose
RNA Ribonukleinsäure
RT Reverse Transkriptase
SL spezifische Lyse
TAA tumorassoziierte(s) Antigen(e)
TAP Transporter assoziiert mit Antigenprozessierung
Tg Transgen
TIL Tumor-infiltrierende Lymphozyten
TNF-α Tumor Nekrosis Faktor-α
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
TZR T-Zellrezeptor u internationale Einheiten (units)
Upm Umdrehungen pro Minute
VSV-N Vesikuläres Stomatitis-Virus-Nukleoprotein v/v Volumen pro Volumen wt Wildtyp w/v Masse pro Volumen
ZTL zytotoxische T-Lymphozyten
Abkürzungen für Aminosäuren:
A Alanin
C Cystein
D Aspartat
E Glutamat
F Phenylalanin
G Glycin
H Histidin
I Isoleucin
K Lysin
L Leucin
M Methionin
N Asparagin
P Prolin
Q Glutamin
R Arginin
S Serin
T Threonin
V Valin w Tryptophan
Y Tyrosin
Die Figuren zeigen:
Fig. 1: Bindung selektierter synthetischer PRDI-BFl Peptide. Die relative A2.1- Bmdungsaffinität (angegeben als % Inhibition) wurde bestimmt durch die Fähigkeit des jeweiligen Peptids, die A2.1-Bindung des Peptids p53 264-272 zu inhibieren. Dies wurde anhand der Inhibition der p53-spezifischen ZTL-Lyse von p53 264-272-beladenen T2- Zielzellen durch PRDI-BFl Peptide unterschiedlicher Konzentration gemessen. Die Inhibitionswerte für die Peptide FluMl und VSV-N wurden aus 6 unabhängigen Experimenten gemittelt. Fig. 2: A2.1 -restringierte Immunogenität synthetischer PRDI-BFl Peptide in A2Kb oder CDS x A2(Kb)-tg Mäusen. Die Immunogenität wurde anhand der lyrischen Aktivität der in diesen Mäusen durch Peptid-Immunisierung induzierten ZTL in einem 4-stündigen Zytotoxizitätstest überprüft. Als Zielzellen wurden mit 0,2μg Peptid-beladene oder unbeladene T2A2K Zellen oder T2 Zellen (zur Überprüfung der Immunogenität von PRDI-BFl 377-386) eingesetzt. Dargestellt sind repräsentative spezifische Lysen individueller ZTL-Kulturen aus durchschnittlich 2 immunisierten Mäusen.
Fig. 3: H-2b-restringierte Immunogenität synthetischer PRDI-BFl Peptide in A2Kb oder CD8 x A2(Kb)-tg Mäusen. Die Immunogenität wurde anhand der lytischen Aktivität der in diesen Mäusen durch Peptid-Immunisierung induzierten ZTL in einem 4-stündigen Zytotoxizitätstest überprüft. Als Zielzellen wurden mit 0,2μg Peptid-beladene oder unbeladene EL-4 Zellen eingesetzt. Dargestellt sind repräsentative spezifische Lysen individueller ZTL-Kulturen aus durchschnittlich 2 immunisierten Mäusen.
Fig. 4: Peptidspezifität und A2.1 -Restriktion der ZTL-Linien CD8 x A2Kb 377 (A), CD8 x A2Kb 402p (B) und CD8 x A2Kb 401 (C), die durch wiederholte in vitro Stimulation mit dem jeweilig relevanten Peptid etabliert wurden. Zur Überprüfung der Peptidspezifität wurden T2-Zellen mit FluMl 58-66 Peptid (♦), dem jeweilig relevanten Peptid: PRDI-BFl 377-386 in (A), PRDI-BFl 402-410 in (B) und PRDI-BFl 401-410 in (C) (•), sowie PRDI-BFl 402-410A in (B) bzw. PRDI-BFl 402-410 in (C) (■) oder keinem Peptid (O) beladen und in einem 6-stündigen 51Cr-Freisetzungstest bei den angegebenen E:T Verhältnissen als Zielzellen eingesetzt. Zur Überprüfung der Restriktion dienten peptidbeladene (A) und unbeladene (Δ) EL-4 Zellen.
Fig. 5: ZTL-Linien CDS x A2Kb 377 (A), CD8 x A2Kb 402p (B) und CD8 x A2Kb 401 (C): Effizienz in der Peptiderkennung. Dazu wurden T2 Zellen mit den angegebenen Peptidkonzentrationen von PRDI-BFl 377-386 in (A), PRDI-BFl 402-410 in (B) und PRDI-BFl 401-410 in (C) (•), sowie PRDI-BFl 402-410A in (B) bzw. PRDI-BFl 402-410 in (C) (■) inkubiert und als Zielzellen in einem 4 (B,C) und 6 (A) ständigen Zytotoxizitätstest bei einem E:T Verhältnis von 10: 1 getestet.
Fig. 6: PRDI-BFl RNA-Expression von Multiplen Myelom-Zellinien. Zytoplasmatische RNA von den Multiplen Myelom Zellinien L363, MC-CAR, U266, IM9, OPM-2 und NCI-H929 wurde in cDNA revers transkribiert und mit PRDI-BFl- oder ß-Actin- spezifischen Primern in anschließender PCR-Reaktion amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden in einem 1,6 %igen EtBr-haltigen Agarose Gel elektrophoretisch aufgetrennt. EL-4 fungierte als Negativkontrolle. Die Pfeile markieren die 390bp (ß-Actin PCR- Amplifikat) und die 540bρ Gelbande (PRDI-BFl PCR-Amplifikat).
Fig 7: PRDI-BFl RNA-Expression von den Osteosarkom-Zellinien Saos-2 und U2OS. Zytoplasmatische RNA von Saos-2 und U2OS wurde in cDNA revers transkribiert und mit PRDI-BFl- oder ß-Actin-spezifischen Primern in anschließender PCR-Reaktion amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden in einem 1,6 %igen EtBr-haltigen Agarose Gel elektrophoretisch aufgetrennt, EL-4 fungierte als Negativkontrolle, L363 als Positivkontrolle. Die Pfeile markieren die 390bp (ß-Actin PCR-Amplifikat) und die 540bp Gelbande (PRDI-BF 1 PCR-Amplifikat).
Fig. 8: ZTL-Erkennung von PRDI-BFl -überexprimißrenden Plasmozytom-Zellinien. ZTL CD8 x A2Kb 402p, CD8 x A2K 401 und CD8 x A2Kb 377 wurden als Effektorzellen unter den angegebenen E:T Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen die A2.1-positiven Zielzellen Saos-2 (O), U266 (•), OPM-2 (■), MC-CAR (A) und die A2.1 -negative Zielzelle NCI-H929 (Δ) getestet. Als Kontrolle dienten die ZTL-Linien CD8 allo A2 und CD8 x A2Kb FluMl. Fig. 9: PRDI-BFl RNA-Expression von Normalzellen. Zytoplasmatische RNA von Monozyten, T-Zellen und B-Zellen wurde in cDNA revers transkribiert und mit PRDI- BFl- oder ß-Actin-spezifischen Primern in anschließender PCR-Reaktion amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden in einem 1,6 %igen EtBr-haltigen Agarose Gel elektrophoretisch aufgetrennt. EL-4 fungierte als Negativkontrolle, L363 und NCI-H929 als Positivkontrolle. Die Pfeile markieren die 390bp (ß-Actin PCR-Amplifikat) und die 540bp Gelbande (PRDI-BFl PCR-Amplifikat).
Fig. 10: Fehlen substantieller Erkennung ruhender lymphohämopoetischer Zellen. ZTL CD8 x A2Kb 402p. (A), CD8 x A2Kb 401 (B), CD8 x A2Kb 377 (C) wurden als Effektorzellen in einem 6-stündigen 51Cr-Freisetzungstest bei den angegebenen E:T Verhältnissen gegen ruhende B-Zellen (O) und die gleichen Zellen beladen mit PRDI- BFl 402-410 (•) in (A, B, D, E) und PRDI-BFl 377-386 (■) in (C, D, E) getestet. Als Kontrolle dienten die ZTL-Linien CD8 x A2Kb FluMl (D) und CD8 allo A2 (E).
Fig. 11: Fehlen substantieller Erkennung ruhender lymphohämopoetischer Zellen. ZTL CD8 x A2Kb 402p (A), CD8 x A2Kb 401 (B), CD8 x A2Kb 377 (C) wurden als Effektorzellen in einem 6-stündigen 51Cr-Freisetzungstest bei den angegebenen E:T Verhältnissen gegen ruhende T-Zellen (O) und die gleichen Zellen beladen mit PRDI- BFl 402-410 (•) in (A, B, D, E) und PRDI-BFl 377-386 (■) in (C, D, E) getestet. Als Kontrolle dienten die ZTL-Linien CD8 x A2Kb FluMl (D) und CD8 allo A2 (E).
Fig. 12: Fehlen substantieller Erkennung aktivierter reifer dendritischer Zellen (DZ). ZTL CD8 x A2K 402p (A), CD8 x A2Kb 377 (B) wurden als Effektorzellen in einem 6- stündigen 51Cr-Freisetzungstest bei den angegebenen E:T Verhältnissen gegen aktivierte reife DZ (O) und die gleichen Zellen beladen mit PRDI-BFl 402-410 (•) in (A, C und D) und PRDI-BFl 377-386 (■) in (B, C und D) getestet. Als Kontrolle dienten die ZTL- Linien CD8 x A2Kb FluMl (C) und CD8 allo A2 (D). A) In den Beispielen erwähnte Materialien (1) Mäuse
Transgene (Tg) Mäuse, die das humane MHC Klasse I-Tg HLA-A2.1 (A2.1) exprimieren, wurden mit fachüblichen Methoden in den C57BL/6-Hintergrund eingekreuzt (Irwin et al., 1989). Hierfür wurden folgende Stämme verwendet:
1) A2.1 Kb (A2Kb)-Tg Mäuse - sie sind homozygot für ein chimäres MHC Klasse I- Tg, das sich aus den humanen cd- und α2-Domänen von A2.1 und aus der α3- Domäne von H-2Kb der Maus zusammensetzt, sowie für das H-2b-Gen.
2) huCD8α/ß (CD8)-Tg Mäuse - sie sind homozygot für die α- und ß-Kette des humanen CD8-Korezeptors.
3) [huCD8α/ß x A2.1/Kb]Fι (CD8 x A2Kb)-Tg Mäuse - sie exprimieren heterozygot das chimäre A2Kb-Molekül und zusätzlich die α- und ß-Kette des humanen CDS. Außerdem sind sie homozygot für H-2b.
4) A2.1-Tg Mäuse (([A2.1 x C57BL/6] x C57BL/6)F1-Tg) - sie exprimieren die α , α2- und α3-Domänen des humanen A2.1 -Moleküls heterozygot und sind homozygot für H-2b.
5) C57BL/6-Mäuse - sie besitzen den H-2b-Phänotyp.
(2) Synthetische Peptide
Synthetische Peptide wurden von SNPE (Neosystem laboratoire, Straßburg, Frankreich) bezogen. Die Reinheit der synthetisierten Peptide betrug mindestens 75 %, die der Peptide PRDI-BFl 401 und PRDI-BFl 402 mindestens 97%. Reinheit und korrekte Aminosäurezusammensetzung aller Peptide wurde durch HPLC-Analyse sowie massenspektrometrisch überprüft. Die Peptide wurden in DMSO oder H2O zu 10 mg/ml gelöst. Die Lagerung erfolgte in Aliquots bei -20 bis -80 °C. Zusätzlich wurde ein Peptid, das die Residuen 128-140 des Hepatitis B- Virus Core-Proteins repräsentiert (TPPAYRPPNAPIL), synthetisiert. (3) Antikörper
Zur HLA-Typisierung von Tumor-Zellinien und von A2-Tg Mäusen wurde der von der
Maus-Hybridom-Linie BB7.2 (ATCC HB-82) produzierte monoklonale Antikörper eingesetzt.
Zur Detektion von monoklonalen Antikörpern der Maus in der Durchflußzytometrie wurde ein FITC-konjugierter polyklonaler Sekundär- Antikörper (Ziege anti-Maus IgG
F(ab)2-Fragment; 1:30- Verdünnung; Jackson [Dianova], Hamburg) eingesetzt.
(4) Zellen, Zellinien und Transfektanten
Sämtliche Zellen und Zellinien wurden in RPMI 1640 (Biowhittaker, Verviers, Belgien) in Gegenwart von 10 % hitzeinaktiviertem (30 min, 56 °C) FCS (PAA Laboratories, Linz, Österreich), 1 % 0,2 M L-Glutamin (Biowhittaker) und 50 μg/ml Gentamycin (Gibco BRL, Eggenstein) kultiviert. Zur Propagation von Zellen und ZTL-Linien aus der Maus wurde dem Medium zusätzlich ß-Mercaptoethanol in einer Endkonzentration von 5 x 10'5 M zugesetzt. Zur Kultivierung Neomycin-transfizierter Zellen wurde dem Medium Geneticin (G-418) (Gibco BRL) in einer effektiven Konzentration von 280-560 μg/ml zugegeben. Alle Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 in Wasserdampf- gesättigter Atmosphäre in Zellkulturflaschen oder 24-Loch-Platten (ZTL) (Corning Costar, Bodenheim) kultiviert.
(4.1) Zellen: Zur Gewinnung von mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMZ) wurde das Blut eines gesunden A2-positiven Spenders mit PBS (Biowhittaker, Walkersville, MA) im Verhältnis 1:3 verdünnt und mit dem gleichen Volumen Ficoll (Seromed Biochrom, Berlin) unterschichtet. Nach Zentrifugation (1400 Upm, 21 °C, 20 min) wurden die PBMZ aus der Interphase isoliert und gewaschen. Die Gewinnung ruhender T- und B-Zellen erfolgte nach negativer Selektion von A2- positiven PBMZ mit Antikörper-beschichteten "beads" (Dynal, Hamburg). Zur Isolierung von T-Zellen wurden die PBMZ nach Anweisung des Herstellers mit anti-CD 19- und anti-CD 14- "beads" inkubiert, zur Isolierung von B-Zellen mit anti-CD2- und anti-CD 14- "beads" und zur Isolierung von Monozyten mit anti-CD2- und anti-CD 19-"beads". Dendritische Zellen (DZ) wurden mit fachüblichen Methoden aus PBMZ eines A2- positiven Spenders generiert. Nach Inkubation der PBMZ für 45 min bei 37 °C in einer 6-Loch-Platte (Corning Costar, Bodenheim) wurden nicht-adhärente Zellen abgespült und die adhärenten PBMZ in X-Vivo 15 (Biowhittaker, Verviers, Belgien) aufgenommen, das mit 1,5 % autologem hitzeinaktiviertem Plasma, 1000 U/ml EL-4 (PBH Strathmann Biotech, Hannover) und 800 U/ml GM-CSF ("Leucomax"; Sandoz, Nürnberg) supplementiert wurde (Jonuleit et al, 1997). An Tag 3 und 5 erfolgte ein teilweiser Mediumwechsel unter Zugabe von 1000 U/ml IL-4 und 1600 U/ml GM-CSF, jedoch ohne autologes Plasma. Die adhärenten PBMZ differenzierten zu nicht- adhärenten "Dendriphagen". An Tag 7 wurden diese unreifen DZ in X-Vivo 15 mit 1,5 % autologem Plasma ausgesät und mit 500 U/ml JX-4, 800 U/ml GM-CSF, 10 ng/ml TNF-α (Genz me, Cambridge, MA), 10 ng/ml IL-lß (PBH Strathmann Biotech), 1000 U/ml IL-6 (PBH Strathmann Biötech) und 1 μg/ml PG-E2 ("Minprostin E2"; Pharmacia Biotech, Freiburg) behandelt (Jonuleit et al., 1997). Die reifen DZ exprimierten an Tag 9 und 10 HLA-DR, CDS 8, CD80, CD83 und CD86.
Sämtliche aufgeführte Zellen dienten als Zielzellen im Zytotoxizitätstest ("ZTL- Erkermung").
(4.2) Zellinien und Transfektanten: Für die hier beschriebenen Untersuchungen wurden die nachfolgend aufgelisteten, gemäß (4.1) hergestellten oder im Stand der Technik bekannten und jederzeit erhältlichen Zellinien eingesetzt:
- die humane A2.1 -positive T2-Zellinie ist ein B/T-Zellhybridom der Fusionspartner 721.147 und CEM (Salter und Cresswell, 1986),
- T2-Zellen, die gemäß Theobald et al., 1995, mit dem A2Kb-Gen transfiziert wurden (T2A2Kb), .
- die Thymom-Zellinie EL-4 aus der C57BL/6-Maus (Theobald et al., 1 95),
- die humane T-Zell Leukämie-Linie Jurkat (Theobald et al., 1995),
- Jurkat-Zellen, die mit A2.1 transfiziert waren (JA2) (Theobald et al., 1 95), die konstitutiv A2.1-positive und p53-defektmutante Osteosarkom-Zellinie Saos-2 (Dittmer et al., 1993)
- die Osteosarkom-Zellinie U2OS (HTB-96; ATCC, VA, USA)
- die A2-positive Zellinie Plasmozytom OPM-2 (DSM ACC 50; DSMZ, Braunschweig, Deutschland)
- die A2-positive Zellinie Plasmozytom U266 (TIB- 196; ATCC, VA, USA)
- die A2-positive Zellinie Plasmozytom MC-CAR (CRL-8083 ; ATCC, VA, USA)
- die A2-ρositive Zellinie Plasmozytom L363 (DSM ACC 49; DSMZ, Braunschweig)
- die A2-positive Zellinie Plasmozytom IM9 (CCL- 159; ATCC, VA, USA)
- die A2-negative Zellinie Plasmozytom NCI-H929 (CRL-9068, ATCC, VA, USA) Sämtliche aufgeführten Zellen dienten als Zielzellen it I Zytotoxizitätstest.
B) In den Beispielen verwendete Methoden (1) Durchflußzytometrie
Die A2.1 -Expression von Zellen und Zellinien wurde im Fluoreszenz-aktivierten Zeil- Sortierer (FACS) (Becton Dickinson, San Jose, CA) gemessen. Jeweils 0,5 Mo Zellen wurden abzentrifugiert und mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper BB7.2 (oder RPMI 1640, 10 % FCS, s. 2.4) in einem Volumen von 50 μl markiert (Lustgarten et al., 1997). Nach einstündiger Inkubation auf Eis wurden die Ansätze zweimal mit PBS (Biowhittaker, Walkersville, MA) gewaschen und die Zellen anschließend mit einem FITC-konjugierten Sekundär-Antikörper (Ziege anti-Maus IgG Fa -Fragment; 50 μl einer 1:30-Verdünnung in PBS) gegengefärbt. Nach 25 min Inkubation auf Eis .wurden die Proben zweimal mit PBS gewaschen, und schließlich in PBS und 1 % Formalin fixiert. Die Fluoreszenz-Aktivität der im Vorwärtsstreulicht selektierten Zellpopulationen wurde im FACS ermittelt. (2) Bestimmung der Peptidbindungs-Affinität für HLA-A2.1
Ein Kompetitionstest wurde angewandt, um die Bindung der PRDI-BFl -Peptide an A2.1 zu ermitteln. T2-Zellen wurden mit 0,01 oder 0,003 μg des A2.1 -bindenden Peptids p53 264-272 (Theobald et al., 1995) und 3 oder 10 μg PRDI-BFl -Peptid beladen. Das A2.1- bindende Peptid 58-66 des A PR/8/34 Influenza Virus Matrix-Proteins Ml (Flu Ml 58- 66) (Theobald et al., 1995) diente als Positivkontrolle, das H-2K -bindende Peptid 52-59 des Vesikulären Stomatitis Virus-Nukleoproteins (VSV-N 52-59) (Theobald et al., 1995) als Negativkontrolle. Die A2.1 -restringierten und p53 264-272-spezifischen ZTL A2 264 Klon 46 wurden bei verschiedenen Effektor- zu Zielzell (E:T)- Verhältnissen auf ihre lyrische Aktivität gegenüber peptidbeladenen und unbeladenen T2-Zielzellen in einem 4-stündigen Zytotoxizitätstest (s. Kapitel B 6) untersucht (Theobald et al., 1995). Die prozentuale Inhibition der ZTL A2 264-vermittelten spezifischen Lyse (SL) von p53 264-272-beladenen T2-Zellen durch die Test-Peptide wurde bei einem E:T- Verhältnis von 3 : 1 nach folgender Formel berechnet:
% Inhibition = 100 - \(% SL T2 plus Peptid 264 plus Testpeptid - % SL T2) x 100
(% SL T2 plus Peptid 264 - % SL T2)]
(3) Immunisierung A2.1-Tg Mäuse und Induktion peptidspezifischer sowie alloreaktiver ZTL
Zur Generierung A2.1 -restringierter peptidspezifischer ZTL wurden 8-12 Wochen alten A2.1-Tg Mäusen 100 μg des jeweiligen Test-Peptids sowie 120 μg HBV core 128-140 (ein I- Anbindendes synthetisches T-Helfer-Peptid) (Theobald et al., 1995), emulgiert in
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100 μl inkomplettem Freundschen Adjuvans (TFA; Difco Laboratories, Detroit, USA), subkutan in den Schwanzansatz injiziert (Theobald et al., 1995). Nach etwa 10 Tagen wurde die Milz entnommen, zerrieben und die Milzzellsuspension zweimal gewaschen (1500 Upm, 5 °C, 7 min). Die Milzzellen wurden zu 7 Mio/ml/Loch in eine 24- Lochplatte ausgesät. Als Stimulatorzellen wurden mit 3000 Rad (132Cäsium) bestrahlte LPS-aktivierte B-Zellblasten, beladen mit 5 μg/ml des jeweiligen Test-Peptids und 10 μg/ml humanem ß2-Mikroglobulin, nach zweimaligem Waschen zu 3 Mo/ml/Loch dazugegeben (Theobald et al., 1995). Die LPS-Blasten wurden durch dreitägige Stimulation von Mlzzellen (1 Mo/ml) aus A2.1-Tg Mäusen mit 25 μg/ml LPS (Salmonella typhosa) und 7 μg/ml Dextransulfat (Pharmacia Biotech, Freiburg) gewonnen. Die Ansätze aus Effektor- und Stimulatorzellen wurden für 6 Tage inkubiert (1° Kulturen) und einem Zytotoxizitätstest unterzogen.
(4) Etablierung von ZTL-Linien
Polyklonale peptidspezifische ZTL-Linien mit Spezifität für PRDI-BFl 377-386, 402- 410 und 401-410 (ZTL CD8 x A2Kb 377, CD8 x A2Kb 402p, CD8 x A2Kb 401) und für Flu Ml 58-66 (ZTL CD8 x A2Kb Flu Ml) wurden durch wöchentliche Restimulation der Effektorzellen mit peptidbeladenen Stimulatorzellen etabliert. Als Stimulatorzellen dienten JA2-Zellen, die mit 20000 Rad bestrahlt, anschließend in RPMI 1640 (Biowhittaker, Verviers, Belgien) mit 5 μg/ml des jeweiligen Peptids und 10 μg/ml humanem ß2-Mkroglobulin für etwa 30 min beladen und schließlich zweimal gewaschen wurden. Die Effektorzellen wurden zusammen mit 0,5 Mo JA2-Zellen und 6 Mo mit 3000 Rad bestrahlten C57BL/6-Mlzzellen in einem Gesamtvolumen von 2 ml/Loch in eine 24-Loch-Platte ausgesät. Den Ansätzen wurde 2 -5 % (v/v) Überstand aus dem Kulturmedium Con A-aktivierter Mlzzellen (TCGF) von Lewis-Ratten zugegeben (Theobald et al., 1995).
Allo-A2.1 -reaktive ZTL-Linien wurden durch intraperitoneale Immunisierung von CD8- Tg Mäusen mit 20 Mo JA2-Zellen/Maus induziert. Nach drei Wochen wurden die Milzzellen isoliert und in vitro (7 Mo/ml Loch) mit bestrahlten JA2-Zellen (0,5 Mo/ml/Loch) oder Mlzzellen (6 Mo/ml Loch) A2.1-Tg Mäuse stimuliert. Durch wiederholte wöchentliche in vz'tro-Restimulation mit JA2-Zellen in Gegenwart von bestrahlten C57BL/6-Mlzzellen (6 Mo/ml Loch) und 2-5 % TCGF wurden schließlich allo-A2.1 -reaktive ZTL-Linien generiert. (5) RT-PCR
a) Isolation von zytoplasmatischer RNA: Zytoplasmatische RNA wurde nach Anweisung des Herstellers mit dem RNeasy Mni Kit ("RNeasy Mni Protocol for the Isolation of RNA from the Cytoplasm of Animal Cells", Quiagen, Hilden) aus Zellen und Zellinien isoliert. b) RNA-Bestimmung: Die RNA-Konzentration wurde photometrisch durch Messung der Absorption (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt, c) Reverse Transkription: In der Reversen Transkription (RT) Reaktion wurde 2μg RNA mit einem oligo-dT-V Primer (5' -TTT TTT TTT TTT TTT TTT(AGC)-3^) und 20U AMV-Reverse Transkriptase (Röche) in Gegenwart von 2U RNase- Inhibitor (Röche) und ImM Desoxynucleotidtriphosphaten (dNTPs) (Sigma,) in lx cDNA Synthesis Puffer (Röche) in Einzelstrang-cDNA umgeschrieben. Die RT Reaktion erfolgte in einem Thermocycler (Master Cycler gradient 5331, Eppendorf) bei 55°C für 60 min und anschließenden 10 min bei 65°C. Die Aufreinigung der cDNA-Produkte erfolgte im Anschluss mit dem High Pure PCR Product Purification Kit (Röche) nach Anweisung des Herstellers. d) PCR-Reaktion: Ein Zehntel der gereinigten cDNA wurde mit PRDI-BF1- spezifischen Primern (forward Primer: 5 -CAC ACG GGA GAA AAG CCA CAT- 3^ und reverse Primer: S-GAG GCA ACT TCA TGA GGG GTA GAT-3^) und parallel mit ß-Actin-spezifischen Primern (forward Primer; 5" -CTG GCA CCA CAC CTT CTA CAA T-T und reverse Primer: 5^-CTT CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT-3^ und 2,5U Taq-Polymerase (Sigma) in lx PCR Puffer (Sigma) 0,25 mM dNTPs amplifiziert. Die PCR-Reaktion umfasste einen Hotstart (2 Mn 30 See bei 94°C), 40 Zyklen (Denaturierung: 30 See 94°C, Annealing: 1 Mn 65°C und Elongation: 1 Min 30 See 72°C + 5 sec/Zyklus ab Zyklus 11) und abschliessende Elongation von 7 Mn bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden anschliessend in einem ETBr-haltigen 1,6 %igen (w/v) Agarosegel analysiert. Als Längenstandard diente ein lOObp Marker. (6) Zytotoxizitätstest
Die lytische Reaktivität von Effektorzellen gegenüber verschiedenen Zielzellen wurde in einem 51Cr-Freisetzungstest überprüft (Theobald et al., 1995). Als Zielzellen für Peptidtitrationstests wurden T2-Zellen eingesetzt. 1-5 Mo Zielzellen wurden für 60-90 min mit 150 μCi Na (51Cr) O4 (1 mCi/ml) (NEN Life Science, Belgien) markiert. Vor dieser Markierung wurde den Zellen bei Peptidtitrationstests 2 μl Peptidlösung unterschiedlicher Konzentration und 15 μl FCS (PAA Laboratories, Linz, Österreich) oder FCS ohne Peptid zugegeben. Die markierten Zielzellen wurden viermal gewaschen und die Zellzahl auf 0,1 Mo/ml eingestellt. Die Effektorzellen wurden mit Zellkulturmedium seriell 1:3 verdünnt und zu 0,1 ml/Loch in 96-Loch-Platten ausgesät. Insgesamt wurden fünf verschiedene E:T-Verhältnisse getestet, Anschließend wurden 0,1 ml/Loch der Zielzellsuspension zu den Effektorzellen gegeben und die Ansätze für 4-6 Stunden inkubiert. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert (1300 Upm, 5 °C, 9 min), der Überstand (0,1 ml/Loch) abgenommen und die 51Cr-Freisetzung mit einem Gamma- "Counter" (Canberra Packard, Dreieich) gemessen. Die prozentuale spezifische Lyse (SL) wurde nach folgender Formel berechnet:
(experimentelle Cr-Freisetzung - spontane Cr-Freisetzung) x 100 = % SL (maximale Cr-Freisetzung - spontane Cr-Freisetzung)
Die maximale 51 Cr-Freisetzung entsprach der gesamten 51 Cr-Inkorporation durch die Zielzellen, die spontane 51Cr-Freisetzung entsprach der Zielzell-Lyse in Abwesenheit von Effekt orzeilen und betrug in der Regel weniger als 10 % der maximalen 5 Cr- Freisetzung. Die Werte für spontane und maximale Lysen wurden aus jeweils vier, die für experimentelle Lysen aus zwei Ansätzen gemittelt. C Beispiele
Beispiel 1: Experimentelle Gewinnung der PRDI-BFl-Oligopeptide mit den in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Aminosäuresequenzen
(1.1) Selektion potentiell A2.1-bindender PRDI-BFl-Peptide
Anhand der bekannten Aminosäuresequenz des PRDI-BFl -Proteins wurden Smere,
9mere, lOmere und l lmere bestimmt, die Teilsequenzen dieses PRDI-BFl Polypeptids darstellen und die die folgenden Kriterien erfüllen:
1.) Sie weisen als sogenannte primäre Ankeraminosäuren, das sind Aminosäuren innerhalb des Peptids, die mit Resten der Bindungstasche des MHC Klasse I- Moleküls interagieren und die sich bei endogen prozessierten und im Kontext von MHC Klasse I-Molekülen präsentierten Peptide an Position 2 und am C-Terminus des Epitops befinden, an Position 2 klassischerweise die Aminosäuren L, M, I, V oder T und nichtklassischerweise die Aminosäuren A, Q oder K auf und am C- Terminus klassischerweise die Aminosäuren V, L oder I und nichtklassischerweise die Aminosäuren A, M oder T (Theobald et al., 1995).
2.) Die betreffenden PRDI-BFl Peptide sind bis auf die Peptide mit den SEQ BD NO 13- 16, 19, 20, 22, 23 und 29 nicht homolog zu den korrespondierenden Blimp-1 Peptiden der Maus,
Mt diesem Verfahren wurden die in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl Peptide selektiert (siehe Fig. 1), die eine starke oder intermediäre Bindungsaffmität zu A2.1 zeigen (siehe Bsp. 1.2). Die diesen Oligopeptiden entsprechenden Teilsequenzen des PRDI-BFl -Proteins mit der Gen Bank Accession Nummer: A39564 sind in Tabelle 1 aufgelistet. (1.2) Bindung selektierter synthetischer PRDI-BFl Peptide an A2.1
Die gemäß (1,1) anhand ihrer theoretischen Bindungsstärke selektierten PRDI-BFl Peptide wurden auf ihre tatsächliche Bindungsaffinität für A2.1 untersucht. Hierfür wurde in einem kompetitiven Bindungstest, der in der Publikation von Theobald et al. (1995) näher beschrieben ist, funktionell die Fähigkeit der PRDI-BFl Peptide getestet, die A2,l-Bindung des konkurrierenden synthetischen Peptids p53 264-272 zu inhibieren. Diese Inhibition wurde anhand der Abnahme der durch einen A2.1 -restringierten p53 264-272-spezifischen ZTL-Klon-vermittelte Lyse von T2-Zellen gemessen, die mit p53 264-272-Peptid und dem individuellen PRDI-BFl Testpeptid beladen waren. Die Bindungsergebnisse sind in Fig. 1 zusammengefaßt dargestellt, Das bekannte A2.1-bindende Peptid Flu Ml 58-66 (vgl. Theobald et al., 1995) diente als Positivkontrolle und zeigte bei 3μg und auch bei lOμg mehr als 80 % Inhibition, während das H-2Kb-bindende Peptid VSV-N 52-59 (Theobald et al., 1995) als Negativkontrolle keinerlei A2.1 -Bindungsaktivität aufwies. Die PRDI-BFl Peptide wurden nach ihrer Bindungsstärke in 4 Gruppen eingeteilt. Von insgesamt 61 getesteten Peptiden hatten 16 eine hohe Bindungsaktivität (mindestens 85 % Inhibition bei 10 μg Testpeptid), 28 eine mittlere (40-84 % Inhibition), 10 eine schwache (14-39 %) und 7 keine Bindungsaktivität (< 13 % oder keine Dosisabhängigkeit der Inhibition). Die am stärksten bindenden PRDI-BFl Peptide waren das Peptid 402-410 (SEQ ID NO. 1) und die beiden homologen Peptide 747-755 (SEQ ED NO. 13) und 681-690 (SEQ ID NO. 19), die sowohl bei 10 μg als auch bei 3 μg eine 100 %ige Inhibition der Bindung des konkurrierenden Peptids p53 264-272 zeigten. Dosisabhängigkeit zeigte sich für diese Peptide erst bei einer E:T von 1:1. Die 13 anderen stark bindenden Peptide inklusive der Peptide mit den Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 2-4, 14, 16 und 18 zeigten eine deutliche dosisabhängige Inhibition. Die Peptide mit den Sequenzen gemäß SEQ TD NO, 5-12, 15, 17 und 20-30 wiesen eine intermediäre Bindungsaktivität auf. Insgesamt zeigten 72 % aller selektierten Peptide eine starke oder intermediäre A2.1- Bindung, nur 11 % konnten nicht an A2.1 binden. Beispiel 2: Experimenteller Nachweis der Eignung der PRDI-BFl Oligopeptide 402-410, 401-410, 377-386 und 406-415 (SEQ NO. 1-4), zur Erzeugung einer spezifischen, ZTL-vermittelten Immunogenität
(2.1) Immunogenität A2.1-bindender synthetischer PRDI-BFl Peptide in A2.1-Tg Mäusen
Ein Hindernis bei der Erkennung von humanen MHC Klasse I-Molekülen durch Maus-T- Zellen ist die Unfähigkeit von Maus-CD8, mit HLA-Molekülen wie A2.1 zu interagieren. Zur Umgehung bzw. Behebung dieses Hindernisses wurden zwei Strategien anagewendet. Die eine Strategie bestand in der Konstruktion des chimären Moleküls A2.1/Kb (A2Kb), das sich aus den humanen ccl- und α2-Domänen von A2.1 und aus der α3-Domäne von Maus-Kb, die für die Interaktion mit CDS wesentlich ist, zusammensetzt. In A2Kb-Tg Mäusen induzierte ZTL mit Restriktion für das A2Kb-Tg erkennen dieselben Peptidantigene, die auch in A2.1-positiven Menschen immunogen sind.
Die andere Strategie zur Verstärkung der A2.1 -restringierten Antwort bestand in der Erzeugung einer doppelt-Tg Maus "CDS x A2.1/Kb" durch Kreuzung einer A2Kb-Tg mit einer huCD8α/ß-Tg Maus. Die Expression der α- und ß-Kette des huCD8-Moleküls ermöglicht den generierten ZTL, mit der α3 -Domäne des A2.1 -Moleküls humaner Zellen zu interagieren.
Mt den gemäß Beispiel 1 gewonnenen stark oder intermediär bindenden Peptiden (s. Fig. 1) wurden A2Kb- und CDS x A2Kb-Tg Mäuse immunisiert, um PRDI-BFl Peptid-reaktive ZTL zu gewinnen. 9 bis 11 Tage nach der Immunisierung wurden Mlzzellen der betreffenden Mäuse in vitro mit Peptid-beladenen syngenen LPS-Blasten stimuliert und 6 Tage danach auf eine A2.1 -restringierte peptidspezifische ZTL- Antwort in einem Zytotoxizitätstest untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 zusammengefaßt dargestellt. Für die Positivkontrolle Flu Ml 58-66 war die Induktion A2.1 -restringierter ZTL bereits bekannt (Theobald et al., 1995). Eine A2.1 -restringierte und peptidspezifische ZTL- Antwort wurde bislang für die stark bindenden Peptide 401-410 (SEQ ID NO. 2), 402-410 (SEQ ID NO. 1), 377-386 (SEQ ID NO. 3) und 406-415 (SEQ ID NO. 4) nachgewiesen, Die Höhe der Lyse war vom E:T- Verhältnis abhängig. Die ZTL waren peptidspezifisch, da sie mit dem entsprechenden Peptid-beladene Zellen lysierten, nicht aber Zellen, die mit irrelevanten A2.1 -bindenden Peptiden beladen waren.
Durch PRDI-BFl 401-410, 402-410, 377-386 induzierte ZTL waren A2.1 -restringiert, da mit dem entsprechenden Peptid -beladene A2.1 -negative EL-4-Zellen (H-2b) der Maus nicht erkannt wurden (Fig. 3), Für das Oligopeptid 406-415 wurde neben einer A2.1 -restringierten vornehmlich eine H-2b-restringierte ZTL- Antwort induziert, da ausser PRDI-BFl 406-415 -beladenen T2 Zellen auch EL-4 Zellen, die mit diesem Peptid beladen waren, spezifisch erkannt wurden (Fig. 3).
(2.2) PRDI-BFl 401-410-, 402-410- und 377-386-spezifische ZTL: A2.1- Restriktion, Peptidspezifität und Effizienz der Peptiderkennung
A2.1-restringierte und für PRDI-BFl 401-410-, 402-410- und 377-386-spezifische ZTL wurden im folgenden näher untersucht. Da bis zu diesem Zeitpunkt der Arbeit nur aus A2Kb-Tg Mäusen generierte PRDI-BFl 401-410- und 402-410-spezifische ZTL-Linien existierten, wurden CD8 x A2Kb-Tg Mäuse mit PRDI-BFl 401-410 und .402-410 immunisiert in der Absicht, ZTL mit höherer Avidität zu erhalten. Für den Nachweis der Immunogenität von PRDI-BFl 377-386 wurden bereits CD8 x A2Kb-Tg Mäuse verwendet (Fig. 2 und 3).
Nach Immunisierung von CD8 x A2Kb-Tg Mäusen mit PRDI-BFl 401-410 und 402-410 wurden die Mlzzellen mit Peptid-beladenen syngenen LPS-Blasten stimuliert (1° Kultur) und 6 Tage später im Zytotoxizitätstest gegen T2-Zielzellen, inkubiert mit PRDI-BFl 401-410 oder 402-410, getestet. Für beide Peptide wurden peptidspezifische ZTL induziert (Daten nicht gezeigt).
Durch wiederholte Restimulation von FZTL aus CD8 x A2Kb-Tg Mäusen mit Peptid- beladenen Stimulatorzellen wurden stabile ZTL-Linien mit Spezifität für PRDI-BFl 401- Ö
410, 402-410 und 377-386 generiert. Die Peptidspezifität und A2.1 -Restriktion der etablierten ZTL-Linien CD8 x A2Kb 377, CD8 x A2Kb 402p und CDS x A2Kb 401 sind in Fig.4 A-C dargestellt. Unbeladene oder mit dem irrelevanten Peptid Flu Ml 58-66 - beladene T2-Zielzellen wurden von diesen ZTL nicht erkannt. Flu Ml 58-66- präsentierende T2-Zellen wurden jedoch von einer CD8 x A2Kb T-Zell-Population mit Spezifität für Flu Ml 58-66 lysiert (ohne Fig.). Die ZTL waren A2.1 -restringiert, da mit dem entsprechenden Peptid -beladene A2.1 -negative EL-4-Zellen (H-2b) der Maus nicht erkannt wurden (Fig.4 A-C).
Die ZTL CD8 x A2Kb 402p erkannten neben dem Peptid 402-410 auch die Peptidvariante 402-410 A, die an Position 408 eine Aminosäuresubstitution von Cystein nach Alanin besitzt (Fig. 4B). Wurden T2-Zellen bei unterschiedlichen Konzentrationen an synthetischem Peptid 402-410 und 402-410A inkubiert und als Zielzellen für CD8 x A2Kb 402p im Zytotoxizitätstest eingesetzt, zeigte die ZTL Linie eine um ca. eine log- Stufe effizientere Erkennung der Peptidvariante 402-410A (Fig. 5B). Die ZTL Linie CD8 x A2Kb 401 zeigte ebenfalls Kreuzreaktivität gegenüber dem um eine Aminosäure verkürzten Peptid PRDI-BFl 402-410 (Fig. 4C). Das Peptid 402-410 wurde von dieser ZTL Linie um eine log-Stufe effizienter erkannt als das zur Propagation der ZTL verwendete Peptid PRDI-BFl 401-410 (Erkennung von PRDI-BFl 402-410 noch bei einer Peptidkonzentration von InM im Vergleich zu 10 nM für PRDI-BFl 401-410) (Fig. 5C). Für die ZTL CD8 x A2Kb 377 ist ebenfalls die Effizienz der Peptiderkennung bei einem E:T Verhältnis von 10: 1 in Fig, 5A dargestellt. Die ZTL erkannten das spezifische Peptid PRDI-BFl 377-386 bis zu einer Peptidkonzentration von 1-10 nM.
Im Endergebnis wurden A2.1 -restringierte ZTL-Populationen mit Spezifität für PRDI- BFl 401-410, 402-410 und 377-386 generiert. Beispiel 3: Verwendung von PRDI-BFl 401-410-, 402-410- und 377-386- spezifischen ZTL zur spezifischen Erkennung von Multiple-Myelom- Zellen
(3.1) PRDI-BFl -Expression in MM-Zellinien
Um zu bestimmen, ob das PRDI-BFl Protein tatsächlich in malignen Plasmazellen überexprimiert wird und damit endogen prozessierte und A2.1 -präsentierte PRDI-BFl - Peptide MM-assozierte Peptidantigene darstellen, wurden zunächst verschiedene MM- Zellinien auf die Expression von PRDI-BFl RNA untersucht. Dazu wurde die zytoplasmatische RNA isoliert, mit einem oligo-dT Primer die polyA-RNA (mRNA) in cDNA umgeschrieben (Reverse Transkription) und mit PRDI-BFl -spezifischen Primern in anschliessender PCR-Reaktion amplifiziert. Zur Kontrolle wurde die cDNA ebenfalls mit ß-Actin-spezifischen Primern amplifiziert. Da ß-Actin in allen Zellen konstitutiv exprimiert wird, ist in allen Zellen ein vergleichbares ß-Actin Signal zu erwarten. Sowohl die ß-Actin-spezifischen Primer als auch die PRDI-BFl -spezifischen Primer wurden Intron-überspannend gewählt, sodass aufgrund der Grosse des PCR-Produkts zwischen einem RNA-Amplifikat (PRDI-BFl: 540bp Fragment; ß-Actin: 390bp Fragment) und einem von eventuell kontaminierender DNA-abstammendem Amplifikat (PRDI-BFl: 950bp Fragment; ß-Actin: 830bp Fragment) unterschieden werden konnte. In Fig. 6 ist die PRDI-BFl RNA-Expression der MM-Zellinien L363, MC-CAR, U266, IM9, OPM-2 und NCI-H929 dargestellt. Im Gegensatz zur PRDI-BFl -negativen Zellinie EL-4 zeigen die MM-Zellinien eine starke PRDI-BFl -Expression (540bp Amplifikat). Alle untersuchten Zellinien zeigen eine vergleichbare Expression von ß-Actin (390bp Amplifikat). Die PRDI-BFl RNA-Expression wurde ebenfalls für die beiden Osteosarkom-Zellinien Saos-2 und U2OS untersucht (Fig. 7). Für die Zellinie U2OS wurde bereits von Keller und Maniatis (1991) die Expression von PRDI-BFl RNA nachgewiesen. U2OS exprimieren deutlich mehr PRDI-BFl RNA als Saos-2. Beide Zellinien zeigen eine geringere Expression im Vergleich zu der MM-Zellinie L363, die hier als Positivkontrolle diente (Fig.7). EL-4 fungierte als Negativkontrolle (Fig. 7) (3.2) Erkennung von PRDI-BFl-überexprimierenden MM-Zellen durch PRDI- BFl 401-410-, 402-410- und 377-386-spezifische ZTL
Um zu prüfen, ob die MM-Zellinien aufgrund ihrer starken Expression von PRDI-BFl suszeptibel sind für die Erkennung durch PRDI-BFl 401-410-, 402-410- und 377-386- spezifische ZTL, wurden die A2-positiven MM-Zellinien U266, OPM-2 und MC-CAR und die A2-negative MM-Zellinie NCI-H929 (Daten zur A2.1 -Expression in der Durchflußzytometrie nicht gezeigt) im Vergleich mit der A2-positiven Osteosarkom- Zellinie Saos-2 als Zielzellen für die ZTL CD8 x A2Kb 377, CD8 x A2Kb 402p und CD8 x A2Kb 401 im Zytotoxizitätstest eingesetzt (Fig. 8). Die ZTL Linien zeigten eine selektive und effiziente Lyse der A2+ MM-Zellinien, die A2* NCI-H929 Zellen wurden von keiner ZTL Linie lysiert (Fig. 8). A2+ Saos-2 Zellen, die eine deutlich geringere PRDI-BFl -Expression in der RT-PCR zeigten (Fig.7) wurden entsprechend von den PRDI-BFl-spezifischen ZTL nicht erkannt (Fig. 8). Als Positivkontrolle diente die ZTL Linie CD8 allo A2. Sowohl die MM-Zellinien U266, OPM-2 und MC-CAR als auch Saos-2 -Zellen wurden durch die allo-A2.1 -reaktiven Effektorzellen lysiert, nicht jedoch die A2" Zellinie NCI-H929 (Fig. 8). Als Negativkontrolle fungierte die A2.1 -restringierte ZTL-Linie CD8 x A2Kb FluMl, die keine der getesteten Zielzellen lysierte (Fig. 8). Die Ergebnisse deuten auf die endogene Prozessierung und A2.1 -Präsentation der PRDI- BFl Peptidantigene 401-410, 402-410 und 377-386 hin. Die spezifische Lyse von MM- Zellinien durch PRDI-BFl 401-410-, 402-410- und 377-386-spezifische ZTL und die fehlende Suszeptibilität von getesteten Tumorentitäten unterschiedlichen Ursprungs wie z.B. Mammakarzinomen, Kolorektal-Karzinomen und Hepatoblastomen gegenüber diesen ZTL (Daten nicht gezeigt) weisen darauf hin, dass PRDI-BFl -Peptidantigene als MM-assoziierte Tumorantigene dienen können. Beispiel 4: Verwendung von PRDI-BFl 401-410-, 402-410- und 377-386- spezifischen ZTL zur selektiven Erkennung von MM-Zellen
(4.1) PRDI-BFl-Expression von nicht-transformierten Zellen lympho- hämopoetischen Ursprungs
Für eine potentielle, PRDI-BFl -spezifische ZTL-vermittelte Immuntherapie ist es wünschenswert, daß Normalzellen nicht lysiert werden. PRDI-BFl RNA wird in MM- Zellen überexprimiert (siehe Beispiel 3, (3.1)) und wird bekanntermaßen auch von einigen Normalzellen, darunter auch lymphohämopoetischen Zellen, exprimiert. In Fig. 9 ist die PRDI-BFl RNA-Expression für ruhende Monozyten, T-Zellen und B- Zellen dargestellt. Diese lymphohämopoetischen Zellen weisen im Vergleich zu den beiden MM-Zellinien L363 und NCI-H929 eine wesentlich geringere, aber immer noch substantielle Menge an PRDI-BFl RNA auf, EL-4 Zellen fungierten als Negativkontrolle.
(4.2) Zytolytische Reaktivität PRDI-BFl 401-410-, 402-410- und 377-386- spezifischer ZTL gegenüber nicht-transformierten Zellen lymphohämopoetischen Ursprungs
Nicht transformierte lymphohämopoetische Zellen wurden im folgenden als Zielzellen für A2.1 -restringierte ZTL mit Spezifität für PRDI-BFl 401-410, 402-410 und 377-386 eingesetzt. Ruhende B-Zellen und T-Zellen wurden von keiner der PRDI-BFl- spezifischen ZTL erkannt (Fig. 10 und 11 A-C), ZTL-Lyse konnte durch Zugabe von Peptid PRDI-BFl 402-410 für CD8 x A2Kb 402p und CD8 x A2Kb 401 und von PRDI- BFl 377-386 für CDS x A2Kb 377 rekonstituiert werden (Fig. 10 u. 11 A-C), was eine hinreichende A2.1 -Expression der Zielzellen bestätigte. A2.1 -Expression wurde ebenfalls mit der allo-A2.1 -reaktiven ZTL Linie CD8 allo A2 bestätigt, die eine effiziente Lyse von B-Zellen und T-Zellen zeigten (Fig. 10 u. 11 E). Durch FluMl -spezifische ZTL erfolgte keine Erkennung (Fig 10 u. H D). Da neuere Untersuchungen zeigten, daß PRDI-BFl auch in die Differenzierung myeloider Zellen involviert ist (Chang et al., 2000), wurden Monozyten zu Dendritischen Zellen (DZ) in vitro differenziert und gleichermaßen als Zielzellen für PRDI-BFl 402- 410- und 377-386-spezifische ZTL eingesetzt. Für die ZTL CD8 x A2K 402p und CD8 x A2Kb 377 war keine lytische Aktivität gegen DZ zu beobachten (Fig. 12 A u. B), Beladung der DZ mit dem entsprechenden Peptid führte zur Rekonstitution der Lyse, was für eine hinreichende Expression von A2.1 Molekülen sprach (Fig. 12 A u. B). ZTL CD8 allo A2 diente auch hier als Positivkontrolle und zeigte eine effiziente Lyse der DZ (Fig. 12 D). Von seiten der ZTL CD8 x A2Kb Flu Ml fand sich keine lytische Aktivität (Fig. 12 C). Zusammenfassend deuten die Ergebnisse daraufhin, daß Normalzellen trotz substantieller Expression von PRDI-BFl -RNA für eine PRDI-BFl -spezifische ZTL-vermittelte Lyse nicht suszeptibel sind.
Beispiel 5: Herstellung von A2.1-restringierten T-Zellrezeptoren, die spezifisch für ein erfindungsgemäßes PRDI-BFl- Oligopeptid mit einer in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Aminosäuresequenzen sind
A2.1-Tg Mäuse werden mit einem erfindungsgemäßen PRDI-BFl Oligopeptid^ das eine der in den Sequenzprotokollen 1-30 dargestellten Aminosäuresequenzen aufweist, immunisiert. Nach 10 Tagen wird die Mlz entnommen. Die Mlzzellen werden mit zuvor hergestellten, A2.1 -positiven Antigen-präsentierenden Zellen, die mit dem erfindungsgemäßen Oligopeptid beladen sind, in vitro stimuliert. Die Herstellung dieser A2.1 -positiven Antigen-präsentierenden Zellen erfolgte mit den im Stand der Technik bekannten und dem Fachmann geläufigen Techniken. Nach mehrwöchiger Kultur werden die T-Zellen auf ihre Peptid- und Tumorerkennung, Peptidspezifität und A2.1- Restriktion überprüft. Nach erfolgreicher Testung wird die T-Zellinie kloniert. Die resultierenden T-Zellklone werden erneut hinsichtlich Peptid- und Tumorerkennung, Peptidspezifität und A2.1 -Restriktion getestet.
Von einem T-Zellklon mit positivem Testergebnis wird die Gesamt-mRNA präpariert. Mttels RT-PCR werden die T-Zellrezeptor α- und ß-Ketten amplifiziert. Die jeweihgen Ketten werden zunächst in bakterielle Plasmide kloniert und sequenziert. Die Ketten werden partiell humanisiert, indem die konstanten Maus-Regionen durch die homologen humanen Regionen ersetzt werden. Anschließend erfolgt die Klonierung der resultierenden Konstrukte in geeignete retrovirale Vektoren.
Periphere Blut-Lymphozyten eines A2.1 -positiven Krebspatienten, dessen Tumorzellen PRDI-BFl -Protein überexprimieren, werden entnommen, mit den Vektoren für α- und ß-Kette des T-Zellrezeptors in vitro trarisduziert und die Genexpression auf Proteinebene untersucht. T-Zellrezeptor-exprirnierende T-Lymphozyten werden auf ihre Fähigkeit zur Lyse von Tumorzellen analysiert. Nach erfolgreicher Testung werden die genmodifizierten Lymphozyten in den Patienten transfundiert und sollen dort die Abtötung der entarteten Zellen und damit die Heilung bewirken.
Alternativ werden PRDI-BFl -spezifische α/ß-T-Zellrezeptorketten in Vektoren kloniert, die die Fälligkeit besitzen, in vivo Patienten-T-Zellen zu infizieren. Diese infizierten T- Zellen exprimieren PRDI-BFl -spezifische T-Zellrezeptoren und sind damit in der Lage, PRDI-BFl -überexprimierende Tumorzellen der Patienten zu erkennen und abzutöten.
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Tabelle 1: Korrelation zwischen den in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFl Oligopeptiden und Teilsequenzen des PRDI- BFl -Proteins mit der Gen Bank Accession Nummer A39564
Figure imgf000037_0001

Claims

A n s p r ü c h e
1, Tumorassoziiertes Oligopeptid, das von CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten (ZTL) als Peptidantigen erkannt wird und eine ZTL-induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumorzellen, insbesondere Multiple-Myelom-Zellen herbeiführt, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligopeptid
(a 1) eine der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Aminosäuresequenzen aufweist, die einer Teilsequenz des humanen PRDI-BFl - Proteins entspricht, oder
(a 2) eine durch Aminosäure-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition, - Inversion und/oder durch chemische oder physikalische Modifikation einer oder mehrerer Aminosäuren von einer dieser Aminosäuresequenzen ableitbare Aminosäuresequenz aufweist, die ein fünktionelles Äquivalent zu einer der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 angeführten Aminosäuresequenzen darstellt, und das es
(b) ein Epitop für CD8-ρositive ZTL darstellt und
(c) dazu geeignet ist, eine auf humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante A2 (kurz: A2) eingeschränkte (restringierte) Immunantwort von CD8-positiven ZTL gegen Tumorzellen, insbesondere Multiple- Myelom-Zellen zu induzieren.
2. Tumorassoziiertes Oligopeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die in dem Sequenzprotokoll SEQ ID NO 1 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.
3. Tumorassoziiertes Oligopeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die in dem Sequenzprotokoll SEQ ID NO 2 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.
4. Tumorassoziiertes Oligopeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die in dem Sequenzprotokoll SEQ ID NO 3 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.
5. Tumorassoziiertes Oligopeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die in dem Sequenzprotokoll SEQ ID NO 4 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.
6. Retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es einem Oligopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 entspricht, bei dem anstelle der -CO-NH-Peptidbindungen -NH-CO-Bindungen oder andere Nichtpeptidbindungen ausgebildet sind.
7. Fusionsprotein welches aus einem Oligopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, einer schweren Kette des HLA-Moleküls und. einem flexiblem Linker besteht und derart konstruiert ist, daß das Oligopeptid geeignet und befähigt ist, die Peptid- Bindungsf rche des HLA-Moleküls zu besetzen.
8. Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die mindestens für ein Oligopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert.
9. Verwendung eines Oligopeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 6 und/oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 7 und/oder eines Polynukleotids nach Anspruch 8 zur Herstellung von Diagnostika und/oder Therapeutika und/oder Prophylaktika für den Nachweis und/oder die Beeinflussung und/oder Generierung und/oder Expandierung und/oder Steuerung des Aktivierungs- und Funktionszustands von T-Zellen, insbesondere CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten .
10. Reagenz zur in- vivo- oder in-vitro-Aktivierung von T-Zellen, insbesondere CD8- positiven zytotoxischen T-Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz unter Verwendung wenigstens eines Oligopeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 6 und/oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 7 und/oder eines Polynukleotids nach Anspruch 8 hergestellt ist.
11. Rekombinantes DNS- oder RNS-Vektormolekül, das mindestens ein oder mehrere Polynukleotid(e) nach Anspruch 8 enthält und das in Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs exprimierbar ist.
12. Wirtszelle, die ein Polynukleotid gemäß Anspruch 8 oder ein Vektormolekül gemäß Anspruch 11 enthält.
13. Verwendung wenigstens eines Oligopeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 6 und/oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 7 für die Herstellung polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter Antikörper gegen das/die betreffende^) Oligopeptide(e) oder gegen einen Komplex aus dem/den betreffenden Oligopeptid(en) und HLA-A2.
14. Antikörper, der spezifisch mit wenigstens einem Oligopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder einem retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 6 und/oder einem Fusionsprotein nach Anspruch 7 oder mit einem Komplex aus dem/den betreffenden Oligopeptid(en) und HLA-A2 reagiert.
15. Oligopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder Fusionsprotein nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es kovalent oder nicht-kovalent an MHC Klasse I-Tetramere oder MHC-Klasse I-Dimere oder pharmazeutisch geeignete Träger oder sonstige Strukturen gebunden vorliegt.
16. Retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es kovalent oder nicht-kovalent an MHC Klasse I-Tetramere oder MHC-Klasse I-Dimere oder pharmazeutisch geeignete Träger oder sonstige Strukturen gebunden vorliegt.
17. Verwendung wenigstens eines Oligopeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 6 und/oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 7 oder eines Polynukleotids gemäß Anspruch 8 zur Herstellung polyklonaler oder monoldonaler oder rekombinanter A2- restringierter T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenten Molekülen gegen das /die betreffenden(n) Oligopeptid(e).
18. T-Zellrezeptor oder dazu funktionell äquivalentes Molekül, der/das spezifisch mit wenigstens einem Oligopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder einem retro-inversen Peptid oder Pseudopeptid gemäß Anspruch 6 und/oder einem Fusionsprotein nach Anspruch 7 reagiert.
19. Polynukleotid, das für einen T-Zellrezeptor gemäß Anspruch 18 kodiert.
20. Expressionsvektor, der die Fähigkeit besitzt, einen T-Zellrezeptor gemäß Anspruch 18 zu exprimieren.
21. Wirtszelle, die ein Polynukleotid gemäß Anspruch 19 oder einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 20 enthält.
22. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von PRDI-BFl - Protein assoziierten Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Oligopeptid und/oder mindestens ein retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid und/oder mindestens ein Fusionsprotein und/oder mindestens ein Polynukleotid und/oder mindestens ein T-Zellrezeptor und/oder mindestens ein Vektormolekül und/oder mindestens eine Wirtszelle und/oder mindestens ein Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird,
23. Arzneimittel zur Behandlung von PRDI-BFl -Protein assoziierten Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein Oligopeptid und/oder mindestens ein retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid und/oder mindestens ein Fusionsprotein und/oder mindestens ein Polynukleotid und/oder mindestens ein T-Zellrezeptor und/oder mindestens ein Vektormolekül und/oder mindestens eine 'Wirtszelle und/oder mindestens ein Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält.
24. Verwendung eines Arzneimittels nach Anspruch 23 zur Behandlung von PRDI-BFl - Protein-assoziierten Erkrankungen.
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