DE19720152A1 - Retrovirales Vektorsystem zur Optimierung des Gentransfers und der Genexpression in primären humanen T-Lymphozyten - Google Patents

Retrovirales Vektorsystem zur Optimierung des Gentransfers und der Genexpression in primären humanen T-Lymphozyten

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Description

Die Erfindung betrifft ein retrovirales Vektorsystem zur Optimierung des Gentransfers und der Genexpression in primären humanen T-Lymphozyten. Mit Hilfe dieses Systems soll die klinische Anwendbarkeit genetisch modifizierter T-Lymphozyten verbessert werden. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Der Transfer von Immunzellen mit Antitumor-Aktivität in Krebspatienten ist das Prinzip der adoptiven Immuntherapie. Das Verfahren ist jedoch nicht nur für maligne Erkrankungen anwendbar, sondern auch für diverse Infektionskrankheiten. Verschiedene Immunzellen können eine Tumorregression vermitteln
  • - Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK)
  • - Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TIL) und
  • - in vitro sensitivierte, von cytotoxischen T-Zellen abgeleitete Lymphozyten (IVS).
In klinischen Versuchen mit LAK- und TIL-Populationen, die den Patienten entnommen, in vitro vermehrt und anschließend zurückgegeben wurden, konnten bei einem Teil der Patienten therapeutische Effekte beobachtet werden. Der Nachteil bei der Arbeit mit LAK-Zellen besteht darin, daß diese zwar cytolytisch aktiv sind, aber nicht von der Antigenpräsentation auf MHC-Molekülen abhängig sind und daher unspezifisch nicht nur mit den Zielzellen reagieren.
Die Tumor-infiltrierenden Lymphozyten sind in ihrem Einsatz beschränkt durch ihre ausschließliche Spezifität für den Originaltumor, zudem treten bei vielen Krebserkrankungen keine tumorspezifischen Lymphozyten auf.
Die Effizienz der Lymphozyten-vermittelten Tumortherapie wird durch die genetische Manipulierung von cytotoxischen T-Zellen erhöht, um sie so mit der gewünschten Spezifität auszustatten bzw. an die Zielzellen heranzuführen. Eine Möglichkeit der "Umprogrammierung" von T-Zellen zu tumorspezifischen cytotoxischen T-Lymphozyten ist die Transfektion von T-Zellen von Krebspatienten mit einem chimären Gen, das die Erkennungsdomäne eines tumorspezifischen Antikörpers und die Aktivierungsfunktion des T-Zell-Rezeptors in einer Polypeptidkette vereint (Brocker et al., European Journal of Immunology 1993, Vol. 23. 1435-39, Stancovski et al., J. Immunol. 1993, Vol. 151 (11) S. 6577-82). Dieses chimäre Molekül wird unabhängig vom normalen T-Zell-Rezeptor auf der Zelloberfläche exprimiert und erlaubt der T-Zelle eine MHC- unabhängige, spezifische Erkennung und Cytolyse der Tumorzelle. Mit T-Zellinien und im Mausmodell konnte die Wirksamkeit dieses immunologischen Prinzips bereits gezeigt werden.
Die klinische Einsetzbarkeit dieses therapeutischen Ansatzes sowie anderer Strategien, die auf der genetischen Modifizierung von humanen T-Zellen beruhen, wird jedoch beschränkt durch die geringe Gentransfereffizienz und Genexpression in primären humanen T-Lymphozyten.
Die Erfindung hat daher das Ziel, den Transfer und die Expression therapeutischer Gene in primären humanen T- Lymphozyten zu optimieren, um ein solides Protokoll für die klinische Anwendung genetisch modifizierter primärer humaner T-Zellen zu schaffen. Auf dieser Basis soll die Entwicklung von Therapeutika ermöglicht werden.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1 und 17 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß der Transfer und die Expression therapeutischer Gene in primären humanen T- Lymphozyten durch ein neues, in zweierlei Hinsicht optimiertes System verbessert werden:
  • 1. Das therapeutische Gen steht unter der Kontrolle des viralen SV-40-early-gene-Promotors bzw. der T-Zell­ spezifischen Promotoren für die humanen Gene I1-2 und MHC I, die zu einer verlängerten und verstärkten Expression dieses Gens in primären, humanen T-Zellen führen, in einem retroviralen Ausgangsvektor.
  • 2. Der retrovirale Vektor mit dem therapeutischen Gen gemäß Anspruch 1 wird in einer Verpackungslinie produziert, die murines B7.1 an der Zelloberfläche trägt. Die Modifizierung der Verpackungslinie erfolgte durch Transfektion mit dem nichtviralen eukaryontischen Expressionsvektor pBEH-pac 18/B7.
Als retrovirale Ausgangsvektoren sind verschiedene Vektoren geeignet, besonders bevorzugt sind die retroviralen Vektoren pLXSN, pSFlN und MFG.
Als therapeutisches Gen sind die verschiedensten Gene denkbar, als bevorzugte Ausführungsform besteht das therapeutische Gen aus der cDNA eines single chain Antikörpers (scFv) und der Zeta-Kette des T-Zell-Rezeptors in einem chimären Gen vereint.
Der scFvCD19 ist gemäß der Erfindung ein rekombinanter anti- CD19 single chain-Antikörper, der die extrazelluläre Domäne des Pan-B-Zell-Markers CD19 erkennt.
Der scFvCD19 besteht aus der cDNA der variablen Region der schweren und leichten Kette eines monoklonalen Antikörpers HD37, der die extrazelluläre Domäne des Antigens CD19 erkennt. Diese variablen Bereiche sind über einen Peptidlinker verbunden und am C-Terminus befindet sich ein myc-tag, das die Detektion des Genprodukts durch monoklonale anti-myc Antikörper gewährleistet.
Der single chain Antikörper hat folgende bevorzugte Sequenz:
scFvCD19 Sequenz
Von besonderer Bedeutung für die verbesserte Transfer­ effizienz ist die Modifizierung der Verpackungslinie. Nach Transfektion mit dem eukaryontischen Expressionsplasmid pBEH-pac18/B7, das murines B7.1 codiert, exprimiert die Verpackungszellinie zu nahezu 100% sehr stark (Mean 1250) mB7.1 auf der Zelloberfläche (siehe Abb. 3). Der Vergleich der Transfereffizienzen mit einem retroviralen Vektor, der in einer derart modifizierten Verpackungszellinie produziert wurde, zeigt eine mehr als Verdopplung der Ausbeute an transfizierten primären, humanen T-Zellen 5 Tage nach der Transfektion (Abb. 2 zeigt dies am Beispiel der Transfektion des chimären Konstruktes CD19/cTCR).
Die erfindungsgemäßen chimären Konstrukte (siehe Abb. 1) unter Kontrolle verschiedener Promotoren wurden ferner bezüglich Transfer-effizienz und Expressionsdauer getestet.
Im ersten Konstrukt stand das interessierende Gen unter Kontrolle der viralen 5'LTR, im zweiten unter Kontrolle des SV40-early-gene Promotors. Die Methoden zum Nachweis von Transfer und Expression waren FACS, RT-PCR und genomische PCR.
Die Integration des viralen Konstrukts wurde mittels genomischer PCR nachgewiesen. In beiden Fällen wurde der Nachweis erbracht, und zwar für die Dauer von 14 Tagen.
Die Produktion von mRNA wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Dabei zeigten beide Fälle ein Signal nach 5 Tagen, nach 14 Tagen jedoch nur noch das Konstrukt unter Kontrolle des SV40-Promotors.
Zum Nachweis der Expression des chimären Proteins auf der Oberfläche der T-Zellen dient das FACS. Bei dem Konstrukt unter LTR-Kontrolle zeigten 32% der Zellen nach 5 Tagen ein positives Signal, bei dem unter SV40-Promotor 40%. Nach 14 Tagen waren nur noch 4% der Zellen mit dem LTR- kontrollierten Gen positiv, jedoch noch 38% der Zellen mit dem SV40-kontrolliertem Gen.
Die Resultate zeigen, daß die Expression unter Kontrolle des SV40-Promotors länger andauert als bei dem LTR- kontrollierten Gen. Damit bestätigt sich, daß die Wahl des Promotors einen Einfluß auf die Expression der chimären Konstrukte hat.
Analoge Experimente mit weiteren Promotorkonstrukten, insbesondere dem T-Zell-spezifischen IL2-Promotor und dem MHCI-Promotor, zeigen analoge Ergebnisse hinsichtlich Expressionsdauer und -stärke.
Die Erfindung soll nachfolgend an Beispielen näher erläutert werden.
Beispiel I
  • 1. Die cDNA der variablen Regionen der schweren und leichten Kette des anti-CD19-Antikörpers wird mittels RT-PCR aus der mRNA des Hybridoms HD37, das monoklonale Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne des CD19-Antigens produziert, hergestellt.
  • 2. Anschließend werden diese cDNA-Regionen in dem Vektor pOBE über den Yol-Linker verbunden, so daß ein vollständiger Single-chain-Antikörper (scFv) entsteht.
  • 3. Die cDNA des scFv wird dann in dem Vektor PWW hinter den humanen Immunglobulin-Leader kloniert. Anschließend wird das scFv-Leader-Konstukt in dem Vektor pGemmyc vor die Zeta-Kette des T-Zell-Rezeptor-CD3-Komplexes kloniert, die ein myc-tag, eine CD8α-hinge-Region sowie die transmembrane und intrazelluläre Domäne der Zeta-Kette des TCR/CD3-Komplexes enthält.
  • 4. Dieses chimäre Konstrukt CD19/cTCR wird im folgenden in den retroviralen Vektor pLXSV40N (Derivat des Ausgangsvektors PLXSN) kloniert, wo es unter der Kontrolle des viralen SV40-early-gene-Promotors steht. Der Vektor enthält außerdem das Neomycin-Resistenzgen, um die Selektion mit G418 zu ermöglichen.
  • 5. Als Verpackungszellinie wird die Linie FlyRD18 verwendet. Diese Verpackungszellinie hat den Vorteil, daß sie wesentlich höhere (10-100fach) Virustiter erzeugt als bislang verwendete Linien (Cosset et al., Journ. Virol. 69: 7430-36, 1995). Die von dieser Linie produzierten Viren sind auch in humanem Serum stabil, was für klinische Anwendungen, bei denen humanes Serum im Kulturmedium verwendet werden muß, sehr wichtig ist. Die Verpackungszellinie wird mittels der Kalziumphosphat- Methode mit dem nichtviralen, eukaryontischen Expressionsvektor pBEH-pac18/B7 transfiziert, der die cDNA für murines B7.1 unter der Kontrolle des viralen SV40- early-gene-Promotors sowie das Puromycin-Selektionsgen enthält. Die Klone werden durch die Zugabe von Puromycin ins Kulturmedium selektioniert und anschließend mittels FACS-Analyse auf mB7.1-Expression getestet. Das mB7.1- Molekül wird auf 99% der Verpackungszellen sehr stark exprimiert (Mean 1250) - siehe Abb. 3. Der retrovirale Vektor pLXSV40N-CD19/cTCR (siehe Abb. 1) wird mit der Kalziumphosphat-Methode in die Verpackungslinie transfiziert, wo er in infektiöse Viruspartikel verpackt wird. Die positiven Klone werden mit G418 selektioniert und mit an sich üblichen Verfahren auf Virusproduktion getestet (Virustiterbestimmung).
  • 6. Aus dem peripheren Blut von Patienten mit B-Zell-Lymphomen werden nach gängigen Verfahren T-Lymphozyten isoliert, diese werden 2 Tage mit einem PHA-haltigen Medium stimuliert und dann expandiert. Anschließend werden die Patienten-T-Zellen für 2 Tage mit der Verpackungs­ zellinie, die mB7.1 exprimiert und infektiöse, replikationsinkompetente Viren mit dem retroviralen Vektor pLXSV40N-CD19/cTCR produziert, kokultiviert.
  • 7. Die transfizierten Patienten-T-Zellen werden in vitro mittels G418-Selektion angereichert und im FACS auf Expression des chimären Konstrukts getestet (siehe Abb. 2).
  • 8. Nachdem in einem in vitro-Cytotoxizitäts-Assay die prinzipielle Fähigkeit der transfizierten Patientenzellen, maligne B-Zellen abzutöten, getestet wurde, werden sie dem Patienten bevorzugt intravenös zurückgegeben. Damit steht für die Therapie von B-Zell-Lymphomen ein sich nach antigener Stimulation durch die malignen Zellen selbst vermehrendes Therapeutikum zur Verfügung, das potentiell nur geringe Nebenwirkungen aufweist.
Beispiel II
Für die Therapie von Patienten mit Mamma-, Ovarial- und Pankreaskarzinomen wird ein chimäres Konstrukt verwendet, das als scFv-Einheit einen single chain-Antikörper enthält, der die extrazelluläre Domäne des Antigens ErbB2 erkennt, das auf diesen Karzinomen überexprimiert wird (siehe Abb. 1).
Der Ablauf ist in bei diesem therapeutischen Ansatz analog Beispiel I.

Claims (17)

1. Retrovirales Vektorsystem zur Optimierung des Gentransfers und der Genexpression in primären humanen T-Lymphozyten umfassend:
  • - einen retroviralen Ausgangsvektor,
  • - die cDNA eines therapeutischen Gens,
  • - die Promotoren: immediate-early-gene-Promotor des SV40-Virus bzw. die humanen Promotoren des I1-2- bzw. MHC I-Gen zur verbesserten Genexpression in primären humanen T- Lymphozyten,
  • - ein Selektionsgen und
  • - eine modifizierte retrovirale Verpackungslinie zum verbesserten Transfer in primäre humane T-Lymphozyten.
2. Vektorsystem nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Maus-Sarcoma-Virus-Derivat als retroviralen Ausgangsvektor.
3. Vektorsystem nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch das MoMIV-Derivat pSFIN als retroviralen Ausgangsvektor.
4. Vektorsystem nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Derivat des Vektors MFG als retroviralen Ausgangsvektor.
5. Vektorsystem nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß als therapeutisches Gen die cDNA eines Gens scFv, das gegen tumorassoziierte Antigene gerichtet ist, eingesetzt wird.
6. Vektorsystem nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß der scFv ein rekombinanter anti-CD19 single chain-Antikörper ist, der die extrazelluläre Domäne des Antigens CD19 erkennt.
7. Vektorsystem nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß der scFv aus der cDNA der variablen Region der schweren und leichten Kette eines monoklonalen Antikörpers besteht, der die extrazelluläre Domäne des Antigens CD19 erkennt, daß diese variablen Bereiche über einen Peptidlinker miteinander verbunden sind und daß sich am C-Terminus ein myc-tag befindet, das die Detektion des Genprodukts durch monoklonale anti-myc-Antikörper gewährleistet.
8. Vektorsystem nach Anspruch 1 und 5-7, dadurch gekennzeichnet, daß der scFv folgende Sequenz aufweist:
scFvCD19 Sequenz
9. Vektor nach Anspruch 1 und 5-8, dadurch gekennzeichnet, daß das therapeutische Gen ein chimäres Gen aus einem Ig-leader, einem scFv gemäß Anspruch 6 bis 8, einer hinge-Region aus der α-Kette des CD8-Moleküls und der transmembranen und intrazellulären Domäne der ζ-Kette des T-Zell-Rezeptor-CD3- Komplexes darstellt und folgende Sequenz aufweist:
CD19/cTCR Sequenz
10. Vektor nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß das chimäre Gen und/oder das Resistenzgen unter der Kontrolle des viralen SV40 early-gene-Promotors steht.
11. Vektor nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß das chimäre Gen unter der Kontrolle des humanen I1-2-Promotors steht.
12. Vektor nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß das chimäre Gen unter der Kontrolle des humanen MHC I Promotors steht.
13. Vektor nach Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß das Selektionsgen das Puromycin-, Neomycin- oder Hygromycin­ resistenzgen ist.
14. Vektorsystem nach Anspruch 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor in einer der Verpackungslinien FLYRD18, GP+envAm12, PA-317 bzw. ΦNX-A in Viruspartikel verpackt wird.
15. Vektorsystem nach Anspruch 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß die Verpackungslinie durch Transfektion mit dem eukryontischen, nichtviralen Expressionsvektor pBEH-pac18/B7 murines B7.1 an der Zelloberfläche exprimiert.
16. Vektorsystem nach Anspruche 1-15, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressionsvektor pBEH-pac18/B7 die cDNA des murinen B7.1-Moleküls unter der Kontrolle des viralen SV40-early-gene- Promotors sowie das Selektionsgen Puromycin enthält.
17. Verfahren zur Anwendung des Vektorsystems nach Anspruch 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß primäre humane T-Lymphozyten aus dem Blut von Patienten isoliert werden und in vitro stimuliert werden, der retrovirale Transfer des Vektors erfolgt und sie anschließend, bevorzugt durch intravenöse Injektion wieder in den Patienten zurückgegeben werden.
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