CN104736167B

CN104736167B - 含有mhc i型启动子的慢病毒载体

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Publication number: CN104736167B
Application number: CN201380026705.4A
Authority: CN
Inventors: E·萨莉; C·伯奇
Original assignee: Sai Lafukedisi Co
Current assignee: Sai Lafukedisi Co
Priority date: 2012-05-23
Filing date: 2013-04-30
Publication date: 2018-07-27
Anticipated expiration: 2033-04-30
Also published as: WO2013174630A1; SG11201407732SA; JP5938143B2; ZA201408652B; KR20150014472A; US20140120132A1; US8951535B2; HK1211837A1; PL2678032T3; PT2678032E; EP2678032B1; CN104736167A; IL235705A0; CA2873473C; AU2013265586B2; EP2666477A1; CA2873473A1; EP2678032A1; BR112014028944A2; AU2013265586A1

Abstract

本发明涉及将来自MHC I型基因启动子的启动子序列插入慢病毒载体中以指导转基因的转录，所述转基因优选编码在哺乳动物细胞宿主(优选APC(DC))中表达的免疫原性多肽。本发明包括这些载体，制备载体的方法和使用载体的方法，包括医疗用途。

Description

含有MHC I型启动子的慢病毒载体

技术领域

本发明属于重组疫苗技术的领域并涉及慢病毒载体的改进，其可用作治疗性和预防性疫苗。包含MHC I型(MHCI)启动子的载体提供了优于其他载体的改进的特性。

背景

重组疫苗已随重组DNA技术的进步而发展，允许修饰病毒基因组以产生修饰的病毒。通过这种方式，已能够将遗传序列引入非致病性病毒，从而其编码待在感染后于靶细胞内表达的免疫原性蛋白质，以在其宿主内发展特定免疫应答。

此类疫苗构成了疫苗技术中的重大进步(Kutzler等,Nat Rev Genet,9(10):776-788,2008)。具体而言，其具有优于传统疫苗的优势：避免活(减毒的)病毒和消除与灭活疫苗制造相关联的风险。

采用经修饰的逆转录病毒(逆转录病毒载体)的基因递送在上世纪80年代早期由Mann等描述(Cell,33(1):153-9,1983)。最常用的致瘤性逆转录病毒基于莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MLV)。其基因组简单，多聚蛋白质Gag、Pol和Env从该基因组产生并且需要以反式形式进行病毒复制(Breckpot等，2007,Gene Ther,14(11):847-62；He等，2007,ExpertRev vaccines,6(6):913-24)。一般以顺式需要的序列是长末端重复序列(LTR)及其如下周边序列：整合所需的反向重复序列(IR或att位点)、包装序列Ψ、转运RNA结合位点(引物结合位点，PBS)，和涉及逆转录的一些其它序列(正链起始必需的LTR内的重复R以及多嘌呤序列(PPT))。为了生成复制缺陷型逆转录病毒载体，通常使gag、pol和env基因全部缺失，并且用表达盒替代。

源自慢病毒基因组的逆转录病毒载体(即慢病毒载体)已涌现为用于基因治疗和免疫治疗目的的有希望的工具，因为它们显示优于其它病毒系统的若干优势。具体而言，慢病毒载体本身无毒，并且不像其它逆转录病毒，慢病毒能够转导非分裂细胞，尤其是树突细胞(He等，2007,Expert Rev vaccines,6(6):913-24)，这允许通过内源性通路的抗原递呈。

慢病毒通过遗传组成相似性、复制的分子机制和与其宿主的生物相互作用连接。最为熟知的是其为长期亚临床感染后潜伏起始并缓慢发展的慢病综合征的病因；因此，其被称为“慢”病毒(Narayan等，1989,J Gen Virol,70(7):1617-39)。其基本构成与所用逆转录病毒相同但由于附属基因(例如vif、vpr、vpu、nef、tat和rev)的存在而更为复杂，所述附属基因在慢病毒的体内复制中起关键作用。

慢病毒代表逆转录病毒科(Retroviridae)的一个慢病毒属，其包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性脑炎病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。慢病毒可以无限地持续存在于其宿主内，并且在一生的感染期间以不同速度连续复制。病毒在其宿主内的持续复制取决于其避开宿主防御的能力。

重组整合型慢病毒载体的设计基于慢病毒的顺式与反式作用序列的分离。非分裂细胞中的有效转导需要慢病毒基因组中存在两种顺式作用序列：中心多嘌呤序列(cPPT)和中心终止序列(CTS)。这导致形成称为中心DNA“瓣(flap)”的三链DNA结构，该结构使基因进入非分裂细胞(包括树突细胞(DC))核内的效率最大化(Zennou等，2000,Cell,101(2)173-85；Arhel等，2007,EMBO J,26(12):3025-37)。

树突细胞对于抗原递呈而言具有重要作用，因为其构成了以递呈抗原和起始免疫应答为主要功能的抗原递呈细胞(APC)的主要类型。

为产生免疫应答，须由细胞将抗原蛋白加工成肽，所述肽通过主要组织相容性复合物蛋白(MHC)在细胞表面显示。循环的APC在引流淋巴结内将肽-MHC复合物递呈至T细胞，其在此处与T细胞受体相互作用并联合共刺激信号一起激活T细胞。

多项研究已显示，使用慢病毒载体的接种导致DC进行抗原呈递和抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL；CD8⁺T细胞)的强激活。因此，在过去的10年中对慢病毒载体进行了工程改造以用于基因转移和免疫治疗应用。

已通过移除LTR U3序列，产生完全不含原先在LTR中存在的病毒启动子和增强子序列的“自动失活”载体，从而改善了慢病毒载体的安全性。

可通过重组技术，在使用不同的DNA质粒对HEK 293T人培养细胞瞬时转染后生产含有慢病毒载体的慢病毒颗粒，所述质粒包括：

(i)包装质粒，其表达至少Gag、PolRev、Tat，并在一些情况下表达转移构建体的包装所必需的结构和酶蛋白；

(ii)转移质粒，其含有包装、逆转录和整合所必需的表达盒和HIV顺式作用因子；以及

(iii)编码包膜的质粒，在多数情况下是水泡性口炎病毒(VSV.G)的糖蛋白，该蛋白允许形成能够靶向多种细胞(尤其是主要组织相容性(MHC)抗原递呈细胞(APC)，包括DC)的混合颗粒(假型)。

该方法能够使转染的细胞瞬时生产慢病毒颗粒载体。然而，还可通过将包装基因、原病毒编码DNA和包膜基因稳定插入细胞基因组，使得细胞持续地生产慢病毒颗粒载体。这允许在不需要瞬时感染的条件下由细胞持续地生产慢病毒颗粒载体。当然，也可使用这些方法的组合，其中将一些DNA/质粒整合至细胞基因组而其他的通过瞬时转染提供。

非整合型慢病毒载体正被设计用于降低与插入诱变事件相联系的潜在癌发生的风险，特别用于疫苗接种目的：

在基于直接注射抗原编码整合型慢病毒载体的疫苗接种中，表达相关抗原的转导的细胞成为引发的免疫应答的靶标并在数天或数周内从接种疫苗的生物体中清除。

此外，自动失活的慢病毒载体中病毒启动子和增强子序列的3'LTR的U3区域的缺失限制了内源性启动子激活的可能性。该缺失直接体现了1998-1999年进行的SCID-X1基因治疗试验所获得的经验，该试验使用基于莫罗尼病毒的逆转录病毒载体针对患有罕见类型的X连锁(SCID-X1基因)严重免疫缺陷疾病的儿童进行(Cavazzana-Calvo等，2000,Science.,288(5466):669-72)。该试验期间，莫罗尼来源的逆转录病毒在非常靠近人LM02原癌基因处的整合导致9名儿童中的4名发展了白血病(Hacein-Bey-Abina等,2008,J.Clin.Invest.,118(9):3132-3142)。这表明，恶性肿瘤是病毒U3启动子/增强子接近LM02原癌基因的结果。

增强子是顺式作用序列，其可相隔一定距离作为转录激活因子起作用。其已被广泛用于病毒来源的载体，因为其似乎就在多种细胞类型(特别是DC)中获得转基因强表达而言最为有效(Chinnasamy，Chinnasamy等，2000,Hum Gene Ther 11(13):1901-9；Rouas等，2008,Cancer Gene Ther 9(9):715-24；Kimura等，2007,Mol Ther 15(7):1390-9；Gruh等，2008,J Gene Med 10(1)21-32)。然而，考虑到插入诱变的安全问题，应将这类转录增强子序列从慢病毒载体构建体中删除以破坏增强子邻近效应所产生的插入诱变风险。迄今为止，该增强子邻近效应是最常见的插入突变机制并且是基因转移后人或动物肿瘤发生事件的病例中描述的唯一效应。

因此，需要研发不包括病毒增强子的逆转录病毒，特别是慢病毒载体，其允许转基因编码的免疫原性肽足量表达，如果可能，表达量与使用CMV启动子时观察到的相当。

一项最近的研究报道了使用主要组织相容性复合物II型基因(MHC II型)(Kimura等，2007,MolTher 15(7):1390-9)和dectin-2基因(Lopes等，2008,J Virol 82(1):86-95)来源的DC特异性启动子代替病毒启动子。Lopes等使用的dectin-2基因启动子包含推定的增强子和腺病毒保守序列(腺病毒启动子中的反向末端重复)(Bonkabara等，2001,J.Immunology,167:6893-6900)。Kimura等使用的MHC II型基因启动子不含任何已知增强子。

然而，在没有增强子的情况下，发现MHC II型启动子无法在DC中提供足够的转基因表达。具体而言，与使用CMV启动子/增强子所观察到的免疫应答相反，包含MHC II型启动子的慢病毒载体未能在免疫活性C57BL/6小鼠中引起免疫反应。虽然在小鼠中注射后观察到了整合和持续的转基因表达，但通过MHC II型启动子转录的慢病毒载体无法刺激抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞应答，甚至在疫苗接种加强后也是如此。这些研究的作者因此总结，MHC II型启动子的采用仅对于基因替代治疗中需要持续表达的应用是有兴趣的，但在免疫治疗中并非如此。

因此，对于针对抗原诱导免疫应答，MHC II型启动子不是适当的慢病毒载体启动子。此外，dectin-2启动子具有树突细胞特异性，其无法消除整合至其他非表达细胞类型中的载体。而且，dectin-2启动子似乎含有增强子。因此，由于安全原因，dectin-2启动子不是良好的慢病毒载体启动子。

优选地，在免疫治疗中，慢病毒载体提供了有效的转基因表达，其引发所需的特异性免疫应答。这需要APC(如树突细胞)中的表达处于高水平。

还优选通过免疫应答除去慢病毒载体所转导的细胞以提供更高水平的安全性。即，针对转基因产生的免疫应答可在宿主中引发足以除去慢病毒载体转导细胞的免疫应答。转导细胞的除去消除了宿主中慢病毒载体的持续性，以及该载体可能的次级效应。为除去转导细胞，非树突细胞中的表达需要具有允许通过免疫应答来消除的水平。

同时，启动子应通过原初和记忆T细胞的激活中涉及的关键细胞(即树突细胞)使免疫刺激最大化并应使导致恶性肿瘤的干细胞中的插入诱变和基因毒性的风险最小化。因此，启动子应在树突和其他细胞中具有足够高的活性，但不含增强子。基于这些标准，由于强增强子的存在，病毒启动子(如CMV启动子)不是理想的。这些标准总结如下：

1.在抗原递呈细胞(包括树突细胞)中高表达以诱导最大的免疫应答；

2.在其他转导的细胞类型中以足够的水平表达，该表达水平足以供于通过诱导的免疫应答进行消除；以及

3.缺少增强子元件以避免插入效应。

因此，本领域中存在对于改良载体的需要。本发明满足了本领域中的这些需要。

发明内容

本发明包括包含慢病毒载体的组合物和使用所述载体的方法。在一个实施方式中，本发明包括一种慢病毒载体，其包含编码免疫原性多肽的转基因序列，该转基因序列受MHC I型启动子的转录控制；与转基因序列受CMV启动子的转录控制的载体相比，该载体针对编码的免疫原性多肽在体内诱导更强的CTL应答。

优选地，MHC I型启动子是HLA-A2启动子、HLA-B7启动子、HLA-Cw5启动子、HLA-E启动子或HLA-F启动子。

在多个实施方式中，启动子序列包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示启动子序列具有超过90％、优选超过95％、更优选超过99％相同性的多核苷酸序列。

在多个实施方式中，载体包含U3的启动子和增强子缺失的LTR、来自慢病毒的cPPT/CTS序列、Ψ(psi)序列和/或两条慢病毒LTR。

在优选实施方式中，慢病毒载体不含增强子。

转基因编码的免疫原性多肽包含来自HIV病毒的Gag、Pol和/或Nef蛋白的抗原。该抗原可以是至少一种肿瘤抗原。

本发明还包括包含本发明慢病毒载体的分离的宿主细胞。

本发明还包括用于生产慢病毒载体颗粒的方法。这类方法可包括以下步骤：使用慢病毒载体转染合适的宿主细胞；使用含病毒DNA序列的包装质粒载体转染宿主细胞，该DNA序列编码逆转录病毒的至少结构和整合酶蛋白；培养所述转染的宿主细胞以使所述慢病毒载体表达并包装成慢病毒载体颗粒；以及收获在培养的宿主细胞中表达和包装所形成的慢病毒载体颗粒。

本发明还包括包含本发明慢病毒载体的慢病毒载体颗粒。慢病毒载体颗粒可包含cPPT/CTS多核苷酸序列；U3的启动子和增强子缺失的LTR；和/或MHC I型启动子控制下的转基因序列。优选地，启动子序列包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5所示启动子序列具有超过90％、优选超过95％、更优选超过99％相同性的多核苷酸序列。

本发明还包括包含本发明慢病毒载体或慢病毒颗粒的组合物，用作药物或疫苗。

本发明还包括用于诱导T细胞应答的方法，包括给予患者慢病毒载体颗粒，所述慢病毒载体颗粒包含cPPT/CTS多核苷酸序列；U3的启动子和增强子缺失的LTR；和/或MHC I型启动子控制下的转基因序列。

附图简要说明

图1.MHCI和MCHII启动子的示意图。

MHC I型(MHCI)启动子显示保守的调控元件：κB(NF-κB结合位点)、ISRE(干扰素刺激应答元件)、SXY(SXY调控元件)、TATA(转录信号)和ATG(用于转基因转导的起始密码子)。MCHII启动子家族仅显示SXY、TATA和ATG调控元件。

图2.两种不同细胞类型中多种启动子驱动的GFP表达。

使用具有与绿色荧光蛋白(GFP)基因连接的多个启动子的慢病毒载体构建体来转导HEK293T和BDCM细胞，并评估启动子驱动GFP表达的能力。

图3A和B.多种干扰素对GDP表达的诱导

在多种干扰素分子存在的情况下，使用具有多个启动子的慢病毒载体来转导HEK293T和BDCM细胞。随后评估启动子驱动GFP表达的能力。显示了293T细胞(A)和BDCM细胞(B)中的MFI。还测试了减弱形式的MHCI和β2m启动子，其中去除了启动子中κB和ISRE调控序列，将其转化成MHCII样启动子。

图4.C57Bl/6j小鼠中的T特异性应答(中值)

使用1.10⁶TU的慢病毒载体免疫C57Bl/6j小鼠，其中HIV抗原表达受到所示启动子的驱动。免疫后12天，通过IFN-γELISPOT监测小鼠脾细胞中对HIV抗原的特异性T细胞应答。

发明详述

为确定存在的启动子是否符合如下标准：在树突细胞中高表达以诱导最大的免疫应答；在其他转导的细胞类型中以足够的水平表达，该表达水平足以供于通过诱导的免疫应答进行消除；以及缺少增强子元件以避免插入效应，对人基因启动子在慢病毒载体中的应用进行了研究。对人启动子在树突细胞和其他组织中的表达水平进行了分析。使用定量分析选择具有预期的高水平树突细胞表达并在所有组织中具有较高平均表达的启动子。还选择缺少增强子序列的启动子。

符合这些标准的一组启动子是MHC I型启动子。MHC I型启动子显示NF-Kb结合位点、干扰素刺激应答元件(ISRE)和SXY调控模块(SXY)的保守性。MHC I型启动子中这些元件的排列如图1所示。

MHC II型启动子被认为是抗原递呈细胞(包括树突细胞)特异性启动子。同样如图1所示，虽然MHC II型启动子含有SXY模块，其不含NF-Kb结合位点或ISRE(Van den Helsen等，1998,Immunogenetics,48:208-221)。因此，MHC II型启动子和MHC I型启动子截然不同。

另一个抗原递呈细胞特异性启动子dectin-2含有干扰素刺激应答元件(ISRE)；但不含SXY模块(Bonkabara等，2001,J.Immunology,167:6893-6900)。

人β2-微球蛋白(β2m)启动子与MHC I型启动子有一定的相似性，因为其包含ISRE，尽管是在单个NF-Kb结合位点的上游。

多种哺乳动物(人)MHC I型启动子的序列如下所示：

HLA-A2(MHC I):

attggggagtcccagccttggggattccccaactccgcagtttcttttctccctctcccaacctatgtagggtccttcttcctggatactcacgacgcggacccagttctcactcccattgggtgtcgggtttccagagaagccaatcagtgtcgtcgcggtcgcggttctaaagtccgcacgcacccaccgggactcagattctccccagacgccgagg

(SEQ ID NO:1)

HLA-B7(MHC I):

ggggaggcgcagcgttggggattccccactcccctgagtttcacttcttctcccaacttgtgtcgggtccttcttccaggatactcgtgacgcgtccccacttcccactcccattgggtattggatatctagagaagccaatcagcgtcgccgcggtcccagttctaaagtccccacgcacccacccggactcagag(SEQ ID NO:2)

HLA-Cw5(MHC I):

cactggggaggcgccgcgttgaggattctccactcccctcagtttcacttcttctcccaacctgcgtcgggtccttcttcctgaatactcatgacgcgtccccaattcccactcccattgggtgtcgggttctagagaagccaatcagcgtctccgcagtcccggtctaaagtccccagtcacccacccggactcagattctccccagacgccgag

(SEQ ID NO:3)

HLA-E(MHC I):

taagaactgctgattgctgggaaactctgcagtttcccgttcctctcgtaacctggtcatgtgtccttcttcctggatactcatgacgcagactcagttctcattcccaatgggtgtcgggtttctagagaagccaatcagcgtcgccacgactcccgactataaagtccccatccggactcaagaagttctcaggactcagagg(SEQ ID NO:4)

HLA-F(MHC I):

aggccccgaggcggtgtctggggttggaaggctcagtattgagaattccccatctccccagagtttctctttctctcccaacccgtgtcaggtccttcatcctggatactcataacgcggccccatttctcactcccattgggcgtcgcgtttctagagaagccaatcagtgtcgccgcagttcccaggttctaaagtcccacgcaccccgcgggactcatatttttcccagacgcggaggttggggtcatg(SEQ ID NO:5)

将MHCI启动子(HLA-A2、HLA-B7或HLA-E)插入慢病毒载体中。为进行比较，将广谱表达的EF1α和泛素(UBC)基因启动子也插入慢病毒载体中。EF1α和泛素启动子不含任何鉴定的增强子，且不含SXY模块、NF-Kb结合位点或ISRE。相反，作为代替，EF1α和泛素(UBC)启动子含有Sp1和Ap1结合位点。还制备了含CMV启动子的载体。还制备了含有MHCII启动子(HLA-DRα)或β2m启动子的载体。在这些载体中，启动子驱动绿色荧光蛋白(GFP)的表达。

为寻找树突细胞特异性表达，通过将壳体化质粒和提供VSV.G包膜的质粒共转染HEK 293T细胞来对载体进行包装，基本如Naldini等，1996,Science272:263-7中所述。随后使用不同载体的颗粒转导HEK 293T和BDCM细胞(树突样细胞系)。检测具有所有载体的HEK293T细胞中的表达。

具有CMV启动子、UBC启动子或EF1α启动子的载体显示在HEK 293T细胞中的表达高于BDCM细胞(图2)。然而，具有MHCII启动子(HLA-DRα)、MHCI启动子(HLA-A2、HLA-B7或HLA-E)或β2微球蛋白启动子(β2m)的载体显示在BDCM细胞中的表达高于HEK 293T细胞。因此，这些启动子都显示出树突细胞特异性过表达。

还评估了多种干扰素存在的情况下表达的诱导。结果如图3A和B所示。干扰素无法诱导MHCII启动子。然而，MHCI启动子可在全部两种细胞类型中被干扰素γ诱导并可在HEK293T细胞中被干扰素α诱导。与MHCI启动子类似，β2m启动子也可被干扰素诱导。除去ISRE和NF-Kb结合位点的截短的MHCI或β2m启动子(启动子-SXY-GFP)的诱导能力降低。因此，截短的HLA-A2、HLA-B7、HLA-E和β2m启动子在诱导能力方面与MHCII启动子类似。

随后，使用其中HIV抗原表达受多种启动子(病毒、广谱、MHCI、MHCII和β2m)驱动的慢病毒载体免疫小鼠。免疫后12天，通过IFN-γELISPOT监测小鼠脾细胞中特异性T细胞应答。如图4所示，使用具有MHCI启动子的慢病毒载体的免疫产生了最高特异性的T细胞应答。

如图4所示，使用MHCI启动子的T特异性应答高于CMV、EF1α、泛素或MHCII启动子，并且是使用EF1α或CMV启动子时的3倍以上。使用β2m启动子的T特异性应答与MHCI启动子类似。这些结果显示，对于在慢病毒载体中使用以使体内T特异性应答最大化而言，MHCI启动子出人意料地优于EF1α、泛素、CMV或MHCII启动子。

本发明包括包含MHC I型(MHCI)启动子的慢病毒载体，及其在宿主中诱导免疫应答的用途。

因此，本发明的主要目的是一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包含来自引导转基因转录的I型MHC基因启动子的启动子序列，其在宿主细胞中，优选在树突细胞(DC)中优选编码免疫原性多肽。

慢病毒载体

在本发明范围内，“慢病毒载体”指非复制型载体，其供于使用包含顺式作用慢病毒RNA或DNA序列的转基因转导宿主细胞，且需要以反式形式提供的慢病毒蛋白(例如Gag、Pol和/或Env)。慢病毒载体缺少功能性Gag、Pol和Env蛋白的表达。慢病毒载体可以RNA或DNA分子的形式存在，这取决于所述逆转录载体的产生或发展阶段。

慢病毒载体可以是重组DNA分子的形式，如质粒。慢病毒载体可以是慢病毒颗粒载体的形式，如慢病毒和其他蛋白质的复合物中的RNA分子。通常，对应于修饰或重组的慢病毒颗粒的慢病毒颗粒载体包含由两个单链RNA拷贝组成的基因组。这些RNA序列可通过从插入宿主细胞基因组的双链DNA序列(原病毒载体DNA)转录获得，或者可由转化的宿主细胞中质粒DNA(质粒载体DNA)的瞬时表达获得。

慢病毒载体来源于慢病毒，尤其是人免疫缺陷病毒(HIV-1或HIV-2)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性脑炎病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)，其经修饰以除去涉及致病性的遗传决定簇并导入对获得治疗效果有用的新决定簇。

这类载体基于顺式和反式作用序列的分离。为制备复制缺陷型载体，可删除反式作用序列(如gag、pol、tat、rev和env基因)并使用编码转基因的表达盒代替。

非分裂细胞中的有效整合与复制通常需要慢病毒基因组中心存在两种顺式作用序列：中心多嘌呤序列(cPPT)和中心终止序列(CTS)。这导致形成三链DNA结构，称为中心DNA“瓣(flap)”，其作为对核孔处的整合前复合物脱包被并将表达盒有效导入非分裂细胞(如树突细胞)的细胞核的信号。

在一个实施方式中，本发明包括包含称作cPPT/CTS序列的中心多嘌呤序列和中心终止序列的慢病毒载体，cPPT/CTS序列具体如欧洲专利申请EP 2 169 073所述。

其他序列通常以顺式形式存在，如载体原病毒DNA序列整合至宿主细胞基因组中所涉及的长末端重复(LTR)。如图1所示，可通过使LTR序列突变以获得载体，例如在所述LTR的结构域U3中突变(ΔU3)(Miyoshi H等，1998,J Virol.72(10):8150-7；Zufferey等，1998,J Virol 72(12):9873-80)。

优选地，载体不含增强子。在一个实施方式中，本发明包括包含LTR序列的慢病毒载体，优选具有移除了3’LTR中启动子和增强子序列的突变的U3区(ΔU3)。

还可整合包装序列Ψ(psi)以帮助多核苷酸序列壳体化至载体颗粒中(Kessler等，2007,Leukemia,21(9):1859-74；Paschen等，2004,Cancer ImmunolImmunother 12(6):196-203)。

在一个实施方式中，本发明包括包含慢病毒包装序列Ψ(psi)的慢病毒载体。

优选地，也可使其他功能序列(如转运RNA结合位点或引物结合位点(PBS)或土拨鼠转录后调控元件(WPRE))包含在本发明的慢病毒载体多核苷酸序列中以获得体内转基因更稳定的表达。

在一个实施方式中，本发明包括包含PBS的慢病毒载体。在一个实施方式中，本发明包括包含WPRE和/或IRES的慢病毒载体。

因此，在一个优选实施方式中，慢病毒载体包含至少一种cPPT/CTS序列、一种Ψ序列、一种(优选2种)LTR序列以及表达盒，所述表达盒包括受I型MHC启动子转录控制的转基因。

在多个实施方式中，慢病毒载体包括MHC I型启动子。优选地，MHC I型启动子是HLA-A2启动子、HLA-B7启动子、HLA-Cw5启动子、HLA-F或HLA-E启动子。在多个实施方式中，MHC I型启动子序列包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQID NO:5所示启动子序列具有超过90％、优选超过95％、更优选超过99％相同性的多核苷酸序列。

在多个实施方式中，与转基因序列受CMV启动子的转录控制的载体相比，包含MHCI型启动子的慢病毒载体针对编码的免疫原性多肽在体内诱导更强的CTL应答。

在多个实施方式中，与转基因序列受EF1α启动子的转录控制的载体相比，包含MHCI型启动子的慢病毒载体针对编码的免疫原性多肽在体内诱导更强的CTL应答。优选地，使用MHCI启动子的CTL应答比使用EF1α启动子高至少2倍或3倍。在本发明范围内，可使用实施例3中所述试验确定载体是否“与转基因序列受EF1α启动子的转录控制的载体相比，针对编码的免疫原性多肽在体内诱导更强的CTL应答”。也可使用提供相似结果的其他试验。

在多个实施方式中，与转基因序列受泛素启动子的转录控制的载体相比，包含MHCI型启动子的慢病毒载体针对编码的免疫原性多肽在体内诱导更强的CTL应答。在本发明范围内，可使用实施例3中所述试验确定载体是否“与转基因序列受泛素启动子的转录控制的载体相比，针对编码的免疫原性多肽在体内诱导更强的CTL应答”。也可使用提供相似结果的其他试验。

转基因

在本发明范围内，转基因指待用慢病毒载体转导的慢病毒载体中的核酸序列，其正常情况下不存在于细胞中。慢病毒载体用于将该序列导入转导的细胞中。术语“转基因”不包括促进转基因转导的那些载体序列。转基因可以是来自另一生物体的核酸序列。或者，转基因可以是来自相同生物体的核酸序列，但具有控制其表达的不同调控序列。转基因可以是正义或反义核酸分子。根据本发明的优选实施方式，转基因序列编码免疫原性多肽。

优选地，免疫原性多肽是病毒、细菌或真菌的。在一个实施方式中，免疫原性多肽是肿瘤抗原。在一个实施方式中，免疫原性多肽是变应原。

该免疫原性多肽优选包括来自感染性疾病病原的一个或多个表位，例如来自HIV的Gag、Pol和/或Nef蛋白的抗原。

本发明的转基因还可编码形成多表位的数个表位。

在特定实施方式中，这类表位来源于肿瘤中鉴定到的靶抗原，并可以获得针对其本身的细胞介导免疫应答的方式进行选择。靶抗原是在本领域中已有详细记录，可相对于数种肿瘤类型进行选择，且具体是黑色素瘤或癌中，包括肾癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病、骨髓瘤和淋巴瘤。

MHCI启动子

本发明包括将MHC I型(MHCI)启动子插入慢病毒载体中。如本文中所用，“MHC I型(MHCI)启动子”包括天然产生或合成的MHC I型启动子。术语“MHC I型启动子”不包括β2m启动子。

天然产生的MHCI启动子

天然产生的MHCI启动子的示例是HLA-A2、HLA-B7、HLA-Cw5、HLA-E、HLA-F基因启动子。这些天然产生的MHCI启动子一般由编码MHC I型蛋白的基因，或基因组数据库(如：NCBI多核苷酸数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/dna-rna)中推定为编码此类蛋白质的基因的启动子区克隆或复制。β2m和I型MHC蛋白都进入主要组织相容性复合物(MHC)。

这些基因编码的蛋白质发现于几乎所有细胞类型中。MHCI蛋白通常存在于白细胞的膜表面，此时其与β2-微球蛋白(β2m)相关联。这些相关联蛋白质的作用是将内源性来源的肽递呈至CD8+T细胞。因此，其在抗原特异性免疫应答的产生过程中起核心作用。因为多年来MHC I型蛋白已得到了广泛研究和描述，所以其基因已被成熟表征并可使用序列比对工具(如BLAST法)良好地检测(Altschul,S.F.等(1990).Basic local alignment searchtool.(局部比对搜索基本工具)J.Mol.Biol.215(3):403–410)。

MHC I型启动子也共有在抗原递呈细胞(包括树突细胞)中被强激活的能力，以及，在大多数其它人体组织中降低强度的能力。

本发明的MHC I型启动子还可含有调控元件，如一个或多个Sp1和ETs结合位点。在一个优选实施方式中，MHC I型启动子含有2个Sp1结合位点和1个Ets结合位点。在其他实施方式中，Ap1和/或Ap2位点也包含在MHC I型启动子中。

优选的启动子是人HLA-A2、HLA-B7、HLA-Cw5、HLA-E和HLA-F启动子。

合成的MHC I型启动子

MHC I型启动子也可以是合成的。合成的MHC I型启动子包括使用分子生物学技术组装MHC I型启动子的个体组分合成的启动子或者使用分子生物学技术由天然产生的MHCI型启动子衍生的启动子。

在多个实施方式中，合成的MHC I型启动子包含与MHC I型基因启动子(SEQ IDNO:1-5)的启动子序列具有超过90％、优选超过95％、更优选超过99％相同性的多核苷酸序列。

ISRE

MHC类基因的转录通常由两种主要调控元件介导：干扰素刺激应答元件(ISRE)和SXY模块(包括W/S、X1X2/位点α和Y/增强子B调控元件)(参见图1)。还参见Van den Elsen,Immunogenetics(1998)48:208-211。

这些调控启动子元件位于延伸自大约转录起始位点上游第-220至-95核苷酸的区域中。其介导MHC I型基因的组织特异性和细胞因子诱导的转录。

MHC I型基因启动子的ISRE通常含有干扰素调节因子(IRF)家族成员的结合位点。因此，MHC I型启动子的一个特性是结合干扰素调节因子(IRF)家族成员。这可通过例如凝胶迁移试验来验证。

NF-κB结合位点

在多数情况下存在另一种调控元件，增强子A(含有细胞核转录因子κB(NF-κB)的结合位点)。因此，MHC I型启动子的一个特性是结合细胞核转录因子κB(NF-κB)。这可通过例如凝胶迁移试验来验证。

SXY模块

除了ISRE，MHC I型启动子通常共有另一组保守的上游序列基序，由三种调控元件组成：S或W盒、X1/CREX2盒或位点α，以及Y盒或增强子B，其统称为SXY模块。该SXY模块通常与含有调节因子X(RFX；由RFX5、RFXB/ANK和RFXAP组成)、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)/激活转录因子(ATF)和作为增强体驱动这些基因反式激活的核因子Y(NFY)的多蛋白复合物协同地结合。因此，MHC I型启动子的一个特性是结合这些因子。这可通过例如凝胶迁移试验来验证。

相反地，MHC II型启动子不显示增强子A或ISRE元件(Van den Elsen,P.J等，1998,Immunogenetics.48:208-221)。此外，如使用从裸淋巴细胞综合征(BLS；一种由于RFX亚基之一或CIITA中发生突变产生的重症联合免疫缺陷)患者建立的细胞系进行的研究所示，发现MHC II型基因调控中的RFX和CIITA是至关重要的。此外，缺少CIITA或RFX亚基之一分别影响MHC增强体的功能和组装，导致缺少MHC II型且MHC I型转录水平下降(Van denElsen,P.J.等.2004,Current Opinion in Immunology,16:67-75)。

在一个实施方式中，本发明包括一种方法，该方法包括将MHC I型启动子插入慢病毒载体中以指导转基因的表达，所述转基因优选编码免疫原性多肽，最优选编码微生物抗原或治疗性蛋白质。该方法还可包括插入本文中所述任意其他核酸元件，如DNA瓣序列。

慢病毒颗粒载体的生产

本发明提供了生产慢病毒颗粒载体的方法，其优选不包括启动子系列而是含有I型MHC启动子。慢病毒颗粒载体(或慢病毒载体颗粒)包括与病毒蛋白质相关联的慢病毒载体。载体可以是整合型或非整合型。

代替现有技术载体中使用的病毒增强子序列以使用MHC I型启动子驱动基因表达能够提高逆转录病毒载体的安全性：

1)其降低与增强子序列有关的插入诱变的风险；以及

2)MHC I型启动子在多数(如果不是全部的)人细胞类型中被激活，从而一旦针对转基因产物的免疫应答被引发，即可通过免疫系统清除所有整合有载体的细胞(无论是何种细胞类型)。因此，一段时间后，人体可不含这类载体的任何复制物。

根据该方法的一个实施方式，颗粒载体在转化有DNA质粒的宿主细胞中获得。

这类DNA质粒可包括：

-细菌复制起点(如pUCori)；

-用于选择的抗生素抗性基因(如KanR)；且更具体地：

-含有与MHC I型启动子转录相关的至少一种转基因的慢病毒载体。

该方法允许产生根据本发明的重组载体颗粒，包括以下步骤：

i)使用慢病毒载体转染合适的宿主细胞；

ii)使用包装质粒载体转染所述宿主细胞，所述包装质粒载体含有编码反转录病毒(优选慢病毒)的至少结构和聚合酶(+/-整合酶)活性的病毒DNA序列，；这类包装质粒在本领域中已有描述(Dull等，1998,J Virol,72(11):8463-71；Zufferey等，1998,J Virol72(12):9873-80)。

iii)培养所述转染的宿主细胞以使所述慢病毒载体表达并包装成慢病毒载体颗粒；以及

iv)收获所述培养的宿主细胞中由步骤iii)的表达和包装所得到的慢病毒载体颗粒。

基于不同原因，制备获得的逆转录病毒颗粒的假型(即增加或代替特定颗粒包膜蛋白)可能是有帮助的。例如，具有不同的包膜蛋白以区分重组颗粒与天然颗粒或其他重组颗粒可能是有利的。在疫苗接种策略中，当免疫系统已经产生了针对慢病毒的免疫时，假型颗粒载体更有可能逃避该免疫系统。如果类似的颗粒载体的连续注射是使患者对疾病产生免疫所必需的，那么这是特别有帮助的。

为制备本发明的逆转录病毒颗粒的假型，还可使用编码病毒包膜蛋白(优选VSV-G包膜蛋白)的一种或数种包膜DNA质粒来转染宿主细胞。

合适的宿主细胞优选是人培养细胞系，例如HEK细胞系。

或者用于生产载体颗粒的方法可在宿主细胞中进行，其基因组已使用如下一种或多种组分稳定转化：慢病毒载体DNA序列、包装基因和包膜基因。这类DNA序列可被视作与本发明的原病毒载体类似，包含额外的启动子以允许载体序列转录并提高颗粒生产率。

在优选实施方式中，还对宿主细胞进行修饰，使其能够在培养基中以连续的方式生产病毒颗粒，同时整个细胞不发生溶胀或死亡。关于用于生产病毒颗粒的这类技术，可参见Strang等，2005,J Virol 79(3):1165-71；Relander等，2005,MolTher 11(3):452-9；Stewart等，2009,Gene Ther,16(6):805-14；和Stuart等，2011,Hum gene Ther(在版)。

本发明的一个目的由使用慢病毒颗粒载体转化的宿主细胞组成。

慢病毒颗粒载体可包括以下元件，如前文所定义：

-cPPT/CTS多核苷酸序列；以及

-MHC I型启动子控制下的转基因序列，和可选的上文所述其他元件中的一种。

在细胞中表达转基因的方法

本发明包括用于在细胞(优选非分裂细胞)中表达转基因的方法。该方法包括在允许转基因表达的条件下，使用本发明的慢病毒载体或慢病毒颗粒载体转导细胞。

细胞优选是哺乳动物细胞，特别是人细胞。特别优选人非分裂细胞。

转基因优选编码免疫原性多肽。该方法还可包括收获或分离所述多肽。

慢病毒载体或慢病毒颗粒载体优选包含I型MHC启动子。

在一个实施方式中，本发明包括一种表达转基因的方法，包括将MHC I型启动子插入慢病毒载体使其指导转基因的表达，并使用含有MHC I型启动子的载体转导细胞。

慢病毒载体的治疗性用途

本发明还涉及本发明的慢病毒载体，尤其是慢病毒颗粒载体形式，用于制备治疗性组合物或疫苗的用途，所述治疗性组合物或疫苗能够诱导或造成针对表位的免疫反应发生或增强，更特定地，所述表位是由存在于载体中的受MHCI型启动子转录控制的转基因编码的那些。

因此，本发明提供了用作药物或疫苗的载体。

这些载体优先用于感染性疾病的治疗或预防，特别是与病毒感染相关联的疾病，且更特别的是与逆转录病毒感染(如AIDS和其他免疫缺陷)相关联的疾病。

本发明还可用于针对肿瘤和癌症的治疗方案，特别可用于针对肿瘤的免疫治疗或疫苗接种治疗的方案。

由于本发明的载体更特异性地靶向树突细胞以获得细胞介导的免疫应答，特别是与这些细胞中的转基因表达的抗原相关联的CTL应答，其作为靶向缓慢或内源性病原微生物(如分枝杆菌或HIV病毒)的疫苗时其特别有用。

因此，本发明涉及包含前文所定义的慢病毒载体的免疫原性组合物。

本发明的免疫原性组合物优选包含载体和载体颗粒中的cPPT和CTS序列，以诱导或刺激载体基因组在靶细胞中的核输入。

逆转录期间，cPPT和CTS序列诱导称作DNA三链体的三链DNA结构的形成，其刺激DNA载体序列的核输入。优选地，该载体包含转基因以及逆转录病毒或逆转录病毒样来源逆转录、表达和壳体化的调控信号，该组合物能够诱导或刺激CTL(细胞毒性T淋巴细胞)和/或CD4对载体中存在的转基因序列所编码的一种或数种表位产生应答。

通过在载体中包括MHC I型启动子的方式显著地提高了转基因的表达。

因此，本发明的慢病毒载体能够诱导、提高记忆CTL应答的发生或通常与之相关联。换言之，通过诱导、刺激或参与细胞介导免疫应答(特别是CTL应答或记忆应答)的发生，它们可用于制备用于治疗过敏、自身免疫疾病、肿瘤疾病或感染性疾病的治疗性组合物。

本发明的慢病毒载体可用于治疗方法和诱导免疫应答的方法，包括向宿主给予慢病毒载体并在宿主中产生针对转基因的特异性免疫应答。这些宿主中产生的细胞和抗体可用作诊断试剂。

本发明的慢病毒载体可通过已知给药途径直接给予患者，包括系统性、局部或表皮、真皮内，例如瘤内给药途径。本发明还包括离体给药，例如靶细胞的离体转导，随后将经处理的细胞给予待治疗的患者。

在特定实施方式中，本发明的免疫原性组合物可直接给予患者，以可诱导、提高或在体内参与细胞介导的免疫应答(特别是CTL介导的免疫应答)的发生的方式给予。

在另一个实施方式中，免疫原性组合物可单次使用或重复给予后使用，使其能够产生长期记忆型细胞介导的应答。

本发明的组合物的一个特别优势是其可用于引发或刺激针对多种表位的细胞介导的免疫应答，所述表位由感兴趣的核苷酸序列或载体或载体颗粒中存在的转基因编码，且其还可用于引发或刺激针对某一基因整个序列产物的细胞介导的免疫应答，例如病原体基因或能够编码至少8至15个氨基酸(优选9至12个氨基酸)的所述基因的片段。

本发明还包括包含核苷酸序列的慢病毒载体，所述核苷酸序列编码诱导细胞应答的氨基酸序列的多个重复(至少2条相同序列)和/或含有至少2条不同序列(对应于不同病原体或肿瘤抗原的2个表位)的氨基酸序列。

因此，本发明包括可用于预防性和/或治疗性疫苗接种方案的组合物，其用于肿瘤的治疗且特别是用作抗癌或抗感染性疾病治疗。

具体而言，其可与佐剂、其他免疫原性组合物、化疗或任何其他治疗性处理联用。

因此，已经描述了本发明的不同实施方式，本领域技术人员应注意，本文所公开的内容仅是示例性的，且多种其他替代、调整或修改可包括在本发明的范围内。因此，本发明不限于本文所示特定实施方式。

实施例

实施例1.两种不同细胞类型中多种启动子驱动的GFP表达。

采用包括多种启动子的慢病毒载体构建形式来转导HEK293T(一种成纤维细胞系)和BDCM(一种树突细胞样细胞系)细胞，并通过流式细胞术评估所述启动子驱动GFP表达的能力。BDCM细胞中的MFI(平均荧光强度)以293T细胞中获得的MFI的％表示。

病毒(CMV)和广谱(UBC和EF1α)启动子似乎在BDCM中被抑制，而MHC I(HLA-A2、HLA-B7和HLA-E)和MHC II(HLA-DRα)启动子在该细胞类型中过表达。β2m启动子也在该细胞类型中过表达。

以每孔1×10⁵个细胞的密度将细胞接种在24孔板中的含10％FBS的完全培养基中。对于各细胞类型，通过使用300μl的病毒样品稀释物代替培养基的方式对3个孔的1×10⁵个细胞进行转导，使得百分比包括在5％至30％的细胞被转导。随后将细胞在37℃、5％CO₂下孵育2小时，并每孔加入1ml的完全培养基。转导后72小时，胰蛋白酶消化并重悬细胞，并使用FACScalibur流式细胞仪采用FL1通道检测GFP MFI。

实施例2.多种干扰素对GFP表达的诱导

在多种干扰素分子存在的情况下，使用包括多个启动子的慢病毒载体来转导HEK293T和BDCM细胞。随后评估启动子驱动GFP表达的能力。还测试了减弱形式的MHC-I和β2m启动子，HLA-A2-、HLA-B7-、HLA-E-和β2m-SXY启动子(其中κB和ISRE调控序列被去除的启动子，将其转化成MHCII样启动子)。

如图3所示，在293T或BDCM细胞中，干扰素都无法诱导MHCII启动子。然而，MHCI启动子可在全部两种细胞类型中被干扰素γ诱导并可在293T细胞中被干扰素α诱导。与MHCI启动子类似，β2m启动子也可被干扰素诱导。除去ISRE和NF-Kb结合位点的截短的MHCI或β2m启动子(启动子-SXY-GFP)的诱导能力降低。因此，截短的HLA-A2、HLA-B7、HLA-E和β2m启动子在诱导能力方面与MHCII启动子类似。

以每孔1×10⁵个细胞的密度将细胞接种在24孔板中的含10％FBS的完全培养基中。对于各细胞类型，通过使用300μl的病毒样品稀释物代替培养基的方式对12孔的1×10⁵个细胞进行转导，使得百分比包括在5％至30％细胞被转导。随后将细胞在37℃、5％CO₂下孵育2小时，并且向3个孔中加入1ml的完全培养基，向另3个孔中加入含650U/ml(最终500U)IFNγ的1ml完全培养基，向另3个孔中加入含650U/ml(最终500U)IFNα的1ml完全培养基，并向最后3个孔中加入含650U/ml(最终500U)IFNβ的1ml完全培养基，用于各载体转导。随后使板在37℃、5％CO₂下孵育。转导后72小时，胰蛋白酶消化并重悬细胞，并使用FACScalibur流式细胞仪采用FL1通道检测GFP MFI。

实施例3.C57Bl/6j小鼠中的T特异性应答(中值)

使用其中HIV抗原表达受多种启动子(病毒、广谱、MHCI和MHCII)驱动的1x 10⁶TU慢病毒载体免疫C57Bl/6j小鼠。免疫后12天，通过IFN-γELISPOT监测小鼠脾细胞中特异性T细胞应答。如图4所示，与使用的任何其他慢病毒载体相比，使用包括MHCI启动子的慢病毒载体免疫产生了较高特异性的T细胞应答，甚至当病毒启动子驱动抗原表达时也是如此。

从使用慢病毒载体免疫的小鼠脾中分离脾细胞。免疫后12天进行ELISPOT试验。使96孔组织培养板(密理博公司(Millipore))用50μl/孔的5μg/ml抗小鼠IFNγmAb(小鼠IFNγElispot对，BD生物科学法敏进公司(BD Biosciences Pharmingen))在4℃下被覆过夜。所述板用200μl DPBS/孔洗涤三次，并使用200μl/孔的DPBS/10％胎牛血清在37℃下封闭2小时。所述板用200μl DPBS/孔洗涤三次。以2.5、4.1或5.1×10⁵个细胞/孔向板中加入脾细胞(三个复孔)，并使用2μg/ml的刺激肽(对抗原特异)、伴刀豆球蛋白A(5μg/ml；原始)或单独的培养基刺激脾细胞。将板在37℃下孵育18小时，随后使用200μl/孔的DPBS/0.05％吐温20洗涤三次，并使用200μl/孔的DPBS洗涤三次。为进行检测，以50μl/孔加入2μg/ml抗小鼠IFNγ-生物素化单克隆抗体(BD法敏进公司(BD Pharmingen))，室温下反应2小时。洗涤板并加入100μl/孔的以1:2000在杜尔伯科(Dulbecco's)PBS中稀释的链酶亲和素-碱性磷酸酶(罗氏公司(Roche))，室温下反应90分钟。洗涤板后，加入60μl/孔的BCIP/NBT溶液(西格玛公司(Sigma))以显示斑点(分泌IFNγ的细胞)。将板在室温下孵育15-30分钟直至蓝斑点出现并随后使用自来水充分洗涤并空气干燥24小时。最后，使用Bioreader 2000(生物系统公司(Biosys))对斑点进行计数。

Claims

1.一种慢病毒载体，包含编码免疫原性多肽的转基因序列，所述转基因序列受MHC I型启动子的转录控制，所述慢病毒载体不含增强子。

2.如权利要求1所述的慢病毒载体，所述载体在体内诱导的针对编码的免疫原性多肽的CTL应答强于其中转基因序列受CMV启动子转录控制的载体。

3.如权利要求1所述的慢病毒载体，所述MHC I型启动子是HLA-A2启动子、HLA-B7启动子、HLA-Cw5启动子、HLA-F或HLA-E启动子。

4.如权利要求1所述的慢病毒载体，所述启动子的序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示启动子序列。

5.如权利要求1所述的慢病毒载体，所述慢病毒载体包含：U3的启动子和增强子缺失的LTR、来自慢病毒的cPPT/CTS序列、Ψ(psi)序列或两条慢病毒LTR。

6.如权利要求1所述的慢病毒载体，所述免疫原性多肽包含来自HIV病毒的Gag、Pol和/或Nef蛋白的抗原或至少一种肿瘤抗原。

7.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求1所述的慢病毒载体。

8.一种生产慢病毒载体颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

a)使用权利要求1所述的慢病毒载体转染合适的宿主细胞；

b)使用包含病毒DNA序列的包装质粒载体转染所述宿主细胞，所述病毒DNA序列编码逆转录病毒的至少结构和聚合酶活性；

c)培养转染的所述宿主细胞以使所述慢病毒载体表达并包装成慢病毒载体颗粒；以及

d)收获培养的所述宿主细胞中由步骤c)的表达和包装所得到的所述慢病毒载体颗粒。

9.一种慢病毒载体颗粒，其包含权利要求1所述的慢病毒载体。

10.一种慢病毒载体颗粒，其包含至少以下序列元件：

a)cPPT/CTS多核苷酸序列；

b)U3的启动子和增强子缺失的LTR；以及

c)受MHC I型启动子控制的转基因序列。

11.如权利要求10所述的慢病毒载体颗粒，所述启动子的序列包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示启动子序列。

12.包含cPPT/CTS多核苷酸序列，U3的启动子和增强子缺失的LTR，和受MHC I型启动子控制的转基因序列的药物组合物用于制备治疗性组合物或疫苗的用途，所述治疗性组合物或疫苗能够诱导或造成针对表位的免疫反应发生或增强，所述表位是由存在于载体中的受MHC I型启动子转录控制的转基因编码的表位。

13.如权利要求1所述的慢病毒载体或和权利要求10所述的慢病毒载体颗粒用于制备治疗性组合物或疫苗的用途，所述治疗性组合物或疫苗能够诱导或造成针对表位的免疫反应发生或增强，所述表位是由存在于载体中的受MHC I型启动子转录控制的转基因编码的表位。