ES2329648T3

ES2329648T3 - Clones moleculares con genes mutados gag/pol de vih, gag de vis y env de vis.

Info

Publication number: ES2329648T3
Application number: ES00989415T
Authority: ES
Inventors: George N. Pavlakis
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2009-11-30
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: JP4627950B2; ATE438714T1; CA2395269A1; AU2592301A; WO2001046408A9; EP2128256A3; EP1246913B1; WO2001046408A3; CA2395269C; DE60042702D1; WO2001046408A2; ES2420842T3; EP1246913A2; EP2128256A2; EP2128256B1; AU785133B2; JP2003517839A

Abstract

Un sistema de expresión lentiviral que es capaz de funcionar en ausencia de Rev, Tat y cualquier elemento de transporte de ARN vírico que comprende lo siguiente: (a) un vector de empaquetamiento que contiene un gen gag/pol de VIH-1 que se ha mutado para eliminar las regiones inhibidoras/de inestabilidad; (b) un vector de transferencia; y (c) un vector que codifica envuelta.

Description

Clones moleculares con genes mutados gag/pol de VIH, gag de VIS y env de VIS.

I. Campo técnico

La invención se refiere a sistemas de vector y células hospedadoras que comprenden secuencias de gen gag de VIH-1, pol de VIH-1 y/o gag de VIS mutadas. La invención también se refiere a células hospedadoras que comprenden estos sistemas de vector.

II. Antecedentes

Hasta hace poco, los protocolos de terapia génica han dependido con frecuencia de vectores obtenidos de retrovirus, tales como virus de la leucemia murina (MLV). Estos vectores son útiles debido a que los genes que transducen se integran en el genoma de las células diana, una característica deseable para la expresión a largo plazo. Sin embargo, estos vectores retrovirales pueden transducir solamente células en división, lo que limita su uso para transferencia génica in vivo en células que no están proliferando, tales como hepatocitos, miofibras, células madre hematopoyéticas y neuronas.

Los lentivirus son un tipo de retrovirus pueden infectar células tanto en división como que no están en división. Se ha demostrado que son extremadamente eficaces proporcionando expresión génica a largo plazo (durante hasta 6 meses) en una diversidad de células que no están en división (tales como neuronas y macrófagos) en modelos animales. Véase, por ejemplo, Amado et al., Science 285: 674-676 (julio de 1999). Se ha propuesto que el sistema de transferencia génica óptimo incluiría un vector basado en VIH, u otros lentivirus, que pueda integrarse en el genoma de células que no están en proliferación. Debido a que los retrovirus se integran en el genoma de las células diana, la transducción repetida es innecesaria. Por lo tanto, al contrario que un vector adenoviral capaz de suministro génico in vivo, se pueden evitar problemas relacionados con la respuesta humoral a antígenos virales inyectados. Véase, por ejemplo, Naldini et al., Science, 272: 263-267 (1996), pág. 263.

El VIH y otros lentivirus tienen un genoma complejo que, además de los genes estructurales esenciales (env, gag y pol), contiene genes reguladores (tat y rev) y accesorios (vpr, vif, vpu y nef). El VIH ha evolucionado para infectar de forma eficaz y expresar sus genes en células humanas y es capaz de infectar células que no están en división tales como macrófagos debido a que su complejo de preintegración puede atravesar la membrana intacta del núcleo en la célula diana. Este complejo contiene, además del ADN vírico, la enzima integrasa, el producto del gen vpr y una proteína codificada por el gen gag denominada matriz. La proteína matriz permite que el complejo de preintegración pase al interior del núcleo para acceder al ADN hospedador. Los lentivirus no pueden transducir de forma eficaz células verdaderamente quiescentes (células en estado G_{0}). Sin embargo, a diferencia de vectores retrovirales murinos, además de ser capaces de infectar células en división, los vectores basados en VIH pueden conseguir una transducción y expresión eficaz y sostenida de genes terapéuticos en células que no están en división, tales como células madre hematopoyéticas y en células diferenciadas de manera terminal tales como neuronas, fotorreceptores retinianos, músculo y células hepáticas. Véase, por ejemplo, Amado et al. (julio de 1999) y Klimatcheva et al., Frontiers in Bioscience 4: d481-496 (julio de 1999) y las referencias citadas en esos documentos.

Aunque los vectores lentivirales pueden ser vehículos de suministro génico eficaces, existen preocupaciones de seguridad debido a su origen. Por lo tanto, el ámbito ha centrado su atención en el desarrollo de vectores y sistemas de producción con características de seguridad incorporadas para evitar la emergencia de lentivirus con capacidad de replicación (RCL). Por ejemplo, en la mayoría de las aplicaciones de laboratorio, los vectores lentivirales se crean generalmente en un sistema transitorio en el que una línea celular se transfecta con tres construcciones separadas: una construcción de empaquetamiento, una construcción de transferencia y una construcción de codificación de envuelta. La construcción de empaquetamiento contiene los elementos necesarios para el empaquetamiento del vector (excepto para env) y las enzimas requeridas para generar partículas de vector. La construcción de transferencia contiene secuencias genéticas que actúan en cis necesarias para que el vector infecte la célula diana y para la transferencia del gen terapéutico (o indicador). El gen env de lentivirus generalmente se deleciona de la construcción de empaquetamiento y, en su lugar, se suministra el gen de envuelta de un virus diferente en un tercer vector, "el vector que codifica env", aunque se puede usar el gen env de lentivirus si se desea que el vector tenga por objeto infectar células T CD4^{+}. Un gen de envuelta usado de manera común es el que codifica la glucoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), que puede infectar una amplia diversidad de células y, además, otorga estabilidad a la partícula y permite que el vector se concentre en títulos altos (véase, por ejemplo, Naldini et al., Science 272: 263-267 (1996) y Akkina et al. J. Virol. 70: 2581 (1996). El uso de tres construcciones separadas y la ausencia de secuencias solapantes entre las mismas minimiza la posibilidad de recombinación durante la producción del vector de lentivirus (transferencia). Además, debido a que no se expresan proteínas virales por el propio vector lentiviral (transferencia), no desencadenan ninguna respuesta inmune eficaz contra células que expresan el vector en modelos animales (un problema particular con vectores basados en adenovirus). Véase, por ejemplo, Amado et al., Science 285: 674-676 (julio de 1999) y las referencias citadas en ese documento. Véase también Naldini et al. Science 272: 263-267 (1996).

Los plásmidos de empaquetamiento iniciales contenían la mayoría de los genes de VIH excepto env. En un intento de mejorar la seguridad, se han producido vectores posteriores de VIH en los que el plásmido de empaquetamiento está desprovisto de todos los genes accesorios. Este proceso no interfiere con la producción eficaz de vector y aumenta significativamente la seguridad del sistema debido a que los potenciales RCL carecen de los genes accesorios necesarios para la replicación eficaz de VIH en seres humanos. Aunque estos vectores pueden transducir las líneas celulares con crecimiento detenido y neuronas in vivo, se ha descrito que no transducen de forma eficaz macrófagos. Se cree que el gen accesorio vpr es necesario para la infección por VIH de las células usando estos vectores de VIH. Véase, Zufferey et al., Nature Biotechnol. 15: 871-875 (1997). Por el contrario, como se analiza más adelante en este documento, los vectores lentivirales basados en VIH de la presente invención no necesitan ningún gen accesorio de VIH para tener la capacidad de infectar macrófagos humanos y las demás células ensayadas.

También se ha descrito el requisito de vpr o vif para la traducción eficaz de células hepáticas. Véase, por ejemplo, Kafri et al., Nature Genet. 17: 314 (1997). Estos resultados indican que el requisito de genes accesorios para la transferencia génica mediada por lentivirus eficaz depende del tipo de la célula seleccionada como diana, sugiriendo que las aplicaciones futuras de vectores lentivirales pueden implicar construcciones de vector con genes accesorios diferentes, si fuera necesario.

Zufferey et al., (1997) describen un sistema de vector de VIH en el que los genes de virulencia env, vif, vpr, vpu y nef se han delecionado. Este vector atenuado múltiples veces conservó la capacidad de transducir células con el crecimiento detenido y macrófagos obtenidos de monocitos en cultivo y pudo suministrar de forma eficaz genes in vivo al interior de neuronas adultas. Los plásmidos de empaquetamiento que describieron Zufferey et al. (1997) y Naldini et al. (1996) codifican Rev y Tat además de Gag y Pol.

Los vectores lentivirales modificados por ingeniería genética para empaquetarse en viriones en ausencia del gen regulador tat también se han descrito. Véase, por ejemplo, Kim et al., J. Virol. 72: 811-816 (1998) y Miyoshi et al. J. Virol. 72: 8150-8157 (1998). En estos vectores, se ha retirado el gen tat del plásmido de empaquetamiento. Kim et al. indican que tat no es necesario siempre que el promotor LTR 5' en serie esté sustituido con un promotor constitutivo fuerte. También tienen otras ventajas para la terapia del HIV-1. La sustitución de la LTR de VIH-1 con un promotor de HCMV constitutivo permite el uso de moléculas anti-Tat tales como mutantes transdominantes de Tat o señuelos de elemento de respuesta de activación de Tat como agentes terapéuticos, ya que no afectarán a la producción del vector. (Véase pág. 814, col. 2). La retirada del gen tat elimina un factor de virulencia esencial que podría contribuir a un posible RCL. Kim et al. (1998) describen un sistema de vector que no contiene tat, vif, vpr, vpu y nef. El sistema de vector preferido incluye el gen rev que, como indican los autores "con RRE, se requiere para el manejo eficaz de ARN en este sistema". (pág. 811, col. 2). Sin embargo, Kim et al. también construyeron construcciones independientes de Rev usando CTE. Kim et al. indican que los componentes rev/RRE se podrían eliminar mediante el uso de una secuencia tal como el elemento de transporte constitutivo (CTE), del virus de mono Mason-Pfizer (MPMV) eliminando de este modo todas las proteínas accesorias, pero esto conduce a una reducción de título significativa.

Srinivasakumar et al., J. Virol. 71:5841-5848 (1997) describen la generación de líneas de empaquetamiento de VIH-1 estables que expresan constitutivamente altos niveles de proteínas estructurales de VIH-1 de un modo dependiente de Rev o independiente de Rev. Estas líneas celulares se usaron para evaluar la transferencia génica mediante el uso de un vector de VIH-1 que expresa el gen de resistencia a higromicina B y para estudiar los efectos de Rev, Tat y Nef sobre el título del vector. Las líneas celulares independientes de Rev se crearon mediante el uso de vectores de expresión de gag-pol y env que contienen el CTE de MPMV. Este artículo describe la construcción de cuatro plásmidos, entre otros: gagpol-RRE de pCMV y pCMVenv, que requiere la co-expresión de Rev para la expresión del gen estructural de VIH-1 y pCMV gagpol-CTE y pCMVenv-CTE, que no lo requieren. Para crear líneas celulares de empaquetamiento que contienen Rev e independientes de Rev, se transfectaron células CMT3 con vectores que expresan Gag, Gag-Pol y Env, usando un procedimiento de transfección con fosfato cálcico.

Mediante la creación de un vector de VIH que contenía el CTE de MPMV (pTR167-CTE) y una línea celular de empaquetamiento que expresaba las proteínas estructurales de VIH de un modo independiente de Rev, los autores fueron capaces de obtener un sistema de vector de VIH que funciona completamente sin Rev. El titulo del vector obtenido a partir de este sistema era esencialmente igual que el obtenido de un sistema paralelo que contenía Rev. Los autores indican que, en este contexto, el CTE parecía sustituir completamente las funciones de Rev-RRE de modo similar a lo que se observó previamente en ensayos de expresión transitoria con construcciones dependientes de Rev. Esto es al contrario que situaciones en las que se midieron varias rondas de replicación de VIH. En estos casos, los títulos de virus que contenía CTE siempre se redujeron en al menos una unidad logarítmica en comparación con virus que utilizan Rev y el RRE. (Véase, Srinivasakumar et al., pág. 5847).

Los autores afirman que las ventajas de tener un sistema de vector de VIH que trabaja en ausencia de Rev abre la posibilidad de usar el mismo como un vehículo de suministro para inmunización intracelular contra la función Rev. Los genes que codifican antagonistas de Rev que tienen efectos inhibidores espectaculares sobre la replicación de VIH, tales como señuelos de Rev M10 o RRE, se podrían introducir un vector de VIH y poner en células que normalmente se pueden infectar por VIH. Se esperaría que la expresión del gen "anti-Rev" amortiguara la infección por VIH. Cualquier replicación residual de VIH debe conducir a la activación del vector LTR (por Tat) y crear un ARN obtenido de vector que se empaquetaría por proteínas obtenidas del virus infeccioso. En este escenario, el virus de tipo silvestre actuaría como un auxiliar que podría permitir la propagación de las partículas de vector a células previamente no inmunizadas. Debido a la propagación adicional del vector, es probable que este tipo de esquema fuera más eficaz en la modulación de la infección por VIH in vivo que una basada en vectores de retrovirus tradicionales. Los autores afirman que actualmente están ensayando esta estrategia en sistemas de modelo. (Véase, Srinivasakumar et al., pág. 5847).

Otro desarrollo en la búsqueda de un sistema seguro es el denominado vector auto-inactivante (SIN). Véase, por ejemplo, Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA 83: 3194-8 (1986) y Miyoshi et al., J. Virol. 72: 8150 (1998). En Yu et al., se diseñó un vector SIN obtenido de retrovirus para la introducción por transducción de genes completos en células de mamífero. El vector SIN de Yu et al. contiene una deleción de 299 pares de bases en la repetición terminal larga (LTR) 3', que incluye secuencias que codifican las funciones de potenciador y promotor. Cuando se usaron virus obtenidos de tales vectores para infectar las células NIH 3T3, la deleción se transfirió a la LTR 5', dando como resultado la inactivación transcripcional del provirus en la célula infectada. La introducción de un gen híbrido (c-fos promovido por metalotioneína humana) en células por un vector SIN no se asoció con redisposiciones y condujo a la formación de un transcrito auténtico de ARNm, que, en algunos casos, se indujo por cadmio. El vector descrito en Miyoshi et al. también contiene una deleción en una LTR 3' (cadena abajo). Una secuencia dentro de la LTR cadena arriba sirve como un promotor bajo el que se expresa el genoma viral. La deleción introducida en la LTR cadena abajo se transfiere a la LTR cadena arriba durante la transcripción inversa. Esta deleción inactiva el promotor de LTR y elimina la producción de ARN de vector. El gen (o los genes) a transferir (por ejemplo, un gen indicador o terapéutico) se expresa a partir de un promotor viral o celular exógeno que se inserta en el vector del lentivirus. Una característica de seguridad importante de vectores SIN es que la inactivación de la actividad del promotor de la LTR reduce la posibilidad de mutagénesis de inserción (del vector de transferencia) en el genoma del hospedador. Además, debido a que se elimina la expresión del ARN del vector (de transferencia), el potencial de producción de RCL en la célula diana se minimiza adicionalmente. Los vectores SIN deben ser particularmente útiles en experimentos de transferencia génica diseñados para estudiar la expresión regulada de genes en células de mamífero. La ausencia de secuencias de potenciador y promotor en ambas LTR del provirus integrado también debe minimizar la posibilidad de activar oncogenes celulares y puede proporcionar una alternativa más segura a usar en terapia génica humana. Otras modificaciones para mejorar la seguridad y especificidad incluyen el uso de promotores internos específicos que regulan la expresión génica, temporalmente o con especificidad tisular o celular.

Otras estrategias para mejorar la seguridad en estudios humanos serían usar lentivirus no humanos tales como el virus de la inmunodeficiencia del simio, virus de inmunodeficiencia bovina o virus de anemia infecciosa equina. De estos, los vectores obtenidos del virus de inmunodeficiencia felina se han modificado por ingeniería genética para transducir de forma eficaz células humanas que no están en división. Véase, por ejemplo, Poeschla et al., Nature Med. 4: 354-357 (1998) y el documento WO 99/15641. Además, White et al., J. Virol. 73: 2832-2840 (abril de 1999) describieron vectores lentivirales que usan elementos de virus de inmunodeficiencia humanos y de simio en un intento de mejorar la seguridad reduciendo la probabilidad de recombinación entre construcciones de empaquetamiento y construcciones de transferencia.

Se ha demostrado que el desarrollo de líneas de empaquetamiento eficaces supone un desafío debido a que la expresión de la envuelta de VSV-G y varias proteínas de VIH es tóxica para las células. Más recientemente se ha diseñado una línea productora en la que la expresión de genes de empaquetamiento y VSV-G y, por lo tanto, la producción de vector, se puede activar a voluntad. Kafri et al., J. Virol. 73-576-584 (1999). La línea celular se puede expandir para la producción de vector a escala aumentada cuando la expresión de genes tóxicos está desactivada. Esta línea celular produce un vector con título alto sin generar RCL. Se transplantaron células madre hematopoyéticas transducidas con un vector de VIH en macacos rhesus como se describe por Donahue et al. Blood 92 (supl. 1), resumen 4648.5 (1998) con al menos un seguimiento de 14 meses. En este momento, se demostró que el procedimiento es seguro; todos los animales en el estudio habían permanecido sanos sin evidencia de VIH circulante o vector. Véase, Amado et al., Science 285: 674-676 (julio de 1999).

Se han diseñado muchos protocolos de terapia génica para corregir varias enfermedades hereditarias metabólicas, infecciosas o malignas mediante el uso de la célula madre hematopoyética. Esta célula tiene la capacidad de auto-renovarse y diferenciarse en todas las células maduras de los sistemas sanguíneo e inmune. Se podrían tratar potencialmente muchas enfermedades que afectan a estos sistemas por la introducción estable de genes terapéuticas en células madre. Recientemente, se demostró que los vectores lentivirales evitan la necesidad de estimulación de células madre ex vivo (que es necesaria cuando se usan vectores retrovirales murinos), por la mediación de la transferencia génica eficaz en células madre humanas muy primitivas que contribuyeron a reconstitución estable, a largo plazo de médula ósea de ratón SCID con muchos linajes hematopoyéticos. Véase, por ejemplo, Miyoshi et al., Science 283: 682 (1999). De manera similar, en un modelo de macaco rhesus de trasplante autólogo con células madre transducidas por lentivirus, se observó expresión génica de multilinaje, sugiriendo la transducción de un progenitor de célula sanguínea temprano en condiciones de estimulación mínima de células madre, normalmente insuficiente para la transducción con retrovirus murinos. Véase, Donahue et al., Blood 92 (supl. 1), resumen 4648.5 (1999) y Amado et al., Science 285: 674-676 (julio de 1999).

En la infección por VIH, otra ventaja de los vectores lentivirales diseñados contra VIH es un potencial de movilizarse por VIH en el paciente infectado, debido a que el virus suministra todos los elementos necesarios para el empaquetamiento del vector. Si estos vectores movilizados contenían la envuelta de VIH, pudieron transferir de forma eficaz sus genes (por ejemplo, genes diseñados a medida para otorgar resistencia contra VIH) en células T CD4^{+} protegiendo las mismas de infección posterior por VIH. Los vectores lentivirales también se pueden diseñar para expresar de forma eficaz sus genes solamente en células T CD4^{+} que están infectadas por VIH (denominados vectores inducibles por tat). En estos vectores, todos los genes de VIH, incluyendo tat y rev, se han eliminado; las secuencias que actúan en cis requeridas para la integración, expresión y el empaquetamiento se conservan y la expresión depende de la actividad de la LTR de VIH (que requiere la transactivación por Tat). Se ha demostrado que en este sistema, la expresión de vector se induce de forma eficaz después de la infección con VIH. Además, en ausencia de genes que otorgan resistencia contra VIH, la integración estable de este vector en líneas celulares permisivas dio como resultado la inhibición de la replicación del VIH. Aunque no se ha aclarado completamente el mecanismo de la inhibición de VIH, los resultados preliminares sugieren que este vector compite con el VIH al nivel de transcripción inversa. Véase, An et al., J. Virol., en prensa, y Amado et al., Science 285: 674-676 (1999).

Se están comenzando a explorar varias potenciales aplicaciones médicas adicionales, donde la modificación del material genético de células quiescentes podría dar como resultado la prevención o inversión de un proceso patológico. Por ejemplo, la observación de que los vectores lentivirales pueden mediar la transferencia génica estable y a largo plazo por inyección directa de vector en la retina de rata y de ratón ha prestado un respaldo a la noción de terapia génica para el tratamiento de retinitis pigmentosa. Esta enfermedad degenerativa de la retina está caracterizada por muerte celular de fotorreceptores, dando como resultado una progresión lenta hasta ceguera. Las mutaciones en el gen de la subunidad \beta de cGMP fosfodiesterasa (PDE\beta) de fotorreceptores de conos conduce a una forma autosómica recesiva de retinitis pigmentosa en seres humanos y en el modelo de ratón rd de la enfermedad. Los estudios previos han mostrado que la transferencia génica subretiniana del PDEP mediada por adenovirus y virus adenoasociados da como resultado un retraso en la muerte celular de fotorreceptores. Mediante el uso del modelo de ratón rd un estudio reciente ha demostrado que los fotorreceptores se podrían rescatar en el hasta el 50% de los ojos inyectados con un vector de lentivirus que contiene el gen de PDE\beta murino. Al contrario de la expresión a corto plazo que se ha obtenido previamente con vectores de adenovirus, la expresión de PDE\beta en este estudio persistió durante al menos 24 semanas. Esta observación indica el éxito potencial de la terapia génica en una enfermedad que actualmente carece de tratamiento eficaz. Véase, Takahashi et al., J. Virol., 73: 7812-7816 (septiembre de 1999) y Amado et al. Science, 285: 674-676 (1999).

En la naturaleza, la expresión de gag, pol y env de VIH-1 depende de la presencia de la proteína Rev viral. Esta dependencia, al menos en parte, se debe a la presencia de secuencias que actúan negativamente (elementos inhibidores o de inestabilidad [INS]) localizadas dentro de ARNm no cortados y empalmados y parcialmente cortados y empalmados. La interacción positiva de Rev con el elemento de respuesta a Rev [RRE] en estos ARNm contrarresta los efectos negativos de las secuencias inhibidoras.

Ninguna de las anteriores referencias describe o sugiere que los genes gag y/o pol descritos en ese documento se pueden sustituir con los genes gag y/o pol en los que la inhibición/inestabilidad se ha mutado para convertir su expresión en independiente de Rev. Además, no existe ninguna descripción de los genes mutados específicos gag/pol de VIH-1 o gag de VIS descritos en ese documento.

El clon gag/pol de la invención se preparó mediante el uso del método para eliminar regiones inhibidoras/de inestabilidad de un gen como se describió por primera vez en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 07/858.747, presentada el 27 de marzo de 1992, (inventores, G. Pavlakis y B. Felber) titulada "Método para Eliminar Regiones Inhibidoras/de Inestabilidad de ARNm" y descrita más adelante en una Solicitud de Continuación Parcial ("CIP"), presentada como Solicitud PCT PCT/US93/02908 el 29 de marzo de 1993 y las Patentes de Estados Unidos Nº 5.972.596 y 5.965.726. La descripción de la Solicitud CIP se publicó como Publicación Internacional Nº WO 93/20212 el 14 de octubre de 1993.

El método también se describió en Schwartz et al., J. Virol. 66: 7176-7182 (1992).

Schneider et al., J. Virol. 71: 4892-4903 (1997), ampliaron el trabajo descrito en las solicitudes de patente y en Schwartz et al. identificando y caracterizando INS adicionales dentro de genes gagprotestante y pol y mutando los mismos de un modo similar. Schneider et al. describen construcciones de ácido nucleico que contienen genes gag de VIH-1 completamente mutados, pero solamente genes pol de VIH-1 parcialmente mutados.

Schneider et al. demuestran que los vectores de expresión que contienen una región p55^{gag} intacta o prácticamente intacta permite la producción de partículas virales inmaduras en células de mamífero en ausencia de cualquier otra proteína de VIH. La introducción de mutaciones adicionales en la región proteasa permitió la producción eficaz de Gag/proteasa, que dio como resultado el procesamiento del precursor de Pr55^{gag} y la producción de partículas de Gag maduras con una estructura central cónica similar a lentivirus.

Schneider et al. describen que los vectores de expresión independientes de Rev permiten la expresión eficaz de proteínas Gag en muchas líneas celulares que no son capaces de respaldar el rescate eficaz dependiente de Rev-RRE de estos ARN. Schneider et al. también describen que los vectores de expresión de gag/pol puedan ser importantes para estrategias de vacunación contra VIH-1, ya que la región de gag/pol está más conservada de lo que está la región de env y puede ser importante para una respuesta inmune eficaz contra VIH y para protección contra infección. También afirman que la expresión génica de VIH eficaz en muchas células también es de interés para posibles experimentos de transferencia génica mediante el uso de vectores lentivirales en células que no están en división o que se dividen lentamente, ya que el VIH y los demás lentivirus son capaces de infectar células quiescentes.

Pavlakis et al., Natl Conf Hum Retroviruses Relat Infect (2ª). (1995), 91, afirman que los vectores de expresión de Gag independientes de Rev eran capaces de producir partículas virales en células humanas y de ratón en ausencia de cualquier proteína de VIH y que las mutaciones adicionales en la región de pol permitieron la expresión de la proteasa y el procesamiento del precursor de gag de p55. La inyección directa de ADN de vectores de expresión de Gag independientes de TAT y Rev en músculo de ratón dio como resultado la expresión de Gag detectada por ELISA y respuesta de anticuerpos anti-gag. Se insertaron varios casetes de expresión de Gag independientes de Rev y Tat en vectores retrovirales y se construyeron líneas celulares que expresan Gag o fragmentos Gag que son inhibidores negativos dominantes de VIH.

Shiver et al. (1996) describen los resultados de la vacunación de ADN de ratones y primates no humanos con ADN plasmídico mutado que codifica genes mutados que codifican gag de VIH-1 (gag de p55) o env (gp120 o gp160). Ambos receptores de la vacuna de gag y env mostraron respuestas de linfocitos T auxiliares y citotóxicos (CTL, Th) específicas de antígeno. Se afirma que los resultados demuestran que las vacunas de ADN provocaron respuestas de células T a largo plazo tanto en ratones como en primates no humanos que se diseminaron por el sistema
linfático.

III. Sumario de la invención

La invención proporciona un sistema de expresión lentiviral que es capaz de funcionar en ausencia de Rev, Tat y cualquier elemento de transporte de ARN viral que comprende lo siguiente:

(a) un vector de empaquetamiento que comprende un gen gag/pol de VIH-1 que se ha mutado para eliminar regiones inhibidoras/de inestabilidad;

(b) un vector de transferencia; y

(c) un vector que codifica la envuelta.

El gen gag/pol de VIH-1 mutado puede ser el mostrado en la Figura 1 (SECUENCIA ID Nº: 1).

La invención también se refiere a células hospedadoras que comprenden el sistema de vector.

La invención también proporciona un proceso para preparar una partícula lentiviral en ausencia de Rev, Tat o cualquier elemento de transporte de ARN viral que comprende expresar Gag de VIH y Pol de VIH en una célula hospedadora de un gen gag/pol de VIH-1 que se ha mutado para eliminar regiones inhibidoras/de inestabilidad y que expresa una proteína de envuelta de un gen que codifica la envuelta cuya expresión es independiente de Rev, Tat o cualquier elemento del transporte de ARN viral.

Además, la invención proporciona un proceso para preparar una partícula lentiviral que comprende expresar Gag de VIH y Pol de VIH en una célula hospedadora de un vector que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican Gag de VIH y Pol de VIH correspondientes a la Sec ID Nº: 1 en presencia de un gen que codifica una proteína de envuelta.

Los sistemas de vector y las células hospedadoras se pueden usar para inmunoterapia e inmunoprofilaxis, por ejemplo, como una vacuna o en terapia genética después de la expresión, preferiblemente en seres humanos. Las construcciones de ácido nucleico incorporadas en vectores lentivirales se pueden inyectar directamente en células tisulares dando como resultado la expresión eficaz de la proteína o el fragmento proteico codificados.

IV. Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Secuencia de ADN de clon molecular de gag/pol de VIH-1 mutado (SECUENCIA ID Nº: 1). El terminador de gagpol se localiza en las posiciones 4305-4397 de la SECUENCIA ID Nº: 1.

Figura 2. Comparación de la secuencia de la región pol de tipo silvestre y mutada en pCMVgagpolBNkan. La posición Nº 1 en la figura es la posición 2641 en el plásmido pCMVgagpolBNkan. La comparación comienza en la posición 1872 del iniciador de gag ATG.

Figura 3. Secuencia de ADN de un clon molecular de gag de VIS mutado (SIVgagDX).

Figura 4. Comparación de la secuencia de ADN de gag de VIS mutada en SIVgagDX con la secuencia de VIS de tipo silvestre del aislado 239 de virus de la inmunodeficiencia de Simio (macaco), clon lambda de vis 239-1 (Acceso de GenBank Nº M33262).

Figura 5. Diagrama esquemático de algunos componentes de versiones de muestra de un sistema lentiviral. Poli(A) de BGH: señal poli (A) de hormona de crecimiento bovina; MSD: sitio de ayuste 5' mutado; \psi: señal de encapsidación; SD, sitio de ayuste 5', SA, sitio de ayuste 3'; "X" indica que el codón ATG de la secuencia del gen gag parcial está mutado de tal forma que no tiene lugar la traducción de este gen.

Figura 6. Diagrama esquemático de la construcción de empaquetamiento pCMVgagpolBNkan.

Figura 7. Diagrama esquemático de la construcción de transferencia 1: pmBCwCNIuci. La señal de empaquetamiento, el promotor de CMV y la región codificante para el gen de luciferasa están flanqueados por las LTR de VIH-1 5' y 3', que proporcionan promotor y señales de poliadenilación, como se indica por las flechas. Tres flechas consecutivas indican las regiones U5, R y U3 de la LTR, respectivamente. Las porciones transcritas de las LTR se muestran en negrita. También se indican algunos sitios de escisión por endonucleasa de restricción.

Figura 8. Diagrama esquemático de la construcción de transferencia 1: pmBCmCNIuci. Los símbolos son como anteriormente.

Figura 9. Secuencia de ADN de la construcción de empaquetamiento pCMVgagpolBNkan.

Figura 10. Secuencia de ADN de la construcción de transferencia 1: pmBCwCNIuci.

Figura 11. Secuencia de ADN de la construcción de transferencia 1: pmBCmCNIuci.

Figura 12. Secuencia de nucleótidos de la región BssHII (711) a Clal (830) en los clones moleculares de VIH-1 de tipo silvestre HXB2 y NL4-3 y en las construcciones de transferencia. La señal de iniciador de la traducción para la proteína Gag (ATG) está subrayada. pmBCwCNIuci y pmBCmCNIuci (construcciones de transferencia 1 y 2) contienen la secuencia mBCwCN. La construcción de transferencia 3 contiene la secuencia m2BCwCN. A diferencia de la secuencia mBCwCN, m2BCwCN tiene diferentes mutaciones en la región de sitio de empalme 5' y tiene un ATG de Gag intacto.

Figura 13. Gráfico de barras que muestra los niveles de proteína gag que se libera de las células después de la transfección transitoria con pCMVgagpolBNkan (indicado con pCMVBNKan en la figura).

Figura 14. Gráfico de barras que muestra la actividad de transcriptasa inversa del vector de VIH-1 de gag-pol independiente de Rev pCMVgagpolBNkan (indicado como pCMVBNKan en la figura).

Figura 15. Gráficos de barras que muestran la cantidad de luciferasa por nanogramo de proteína Gag p24 detectada en células transducidas con vectores retrovirales basados en gag de VIH-1 independientes de Rev PCMVgagpolBNkan. Los resultados muestran que con PCMVgagpolBNkan, los vectores retrovirales basados en gag de VIH-1 independientes de Rev presentan una alta eficacia de transducción en (A) células 293, (B) células linfoides humanas, (C) células mieloides humanas (U937), así como (D) células que no están en división tales como macrófagos humanos primarios.

Figura 16. Diagrama esquemático del vector que codifica la envuelta de VIS CMVkan/R-R-SIVenvCTE.

Figura 17. Secuencia de ADN del vector que codifica la envuelta de VIS CMVkan/R-R-SIVenvCTE que contiene un gen de env de VIS mutado.

V. Modos para realizar la invención

Se tiene que entender que tanto para la anterior descripción general como la siguiente descripción detallada son solamente ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. Los dibujos adjuntos, que se incorporan en y constituyen una parte de la memoria descriptiva, ilustran una realización de la invención y, junto con la descripción sirven para explicar los principios de la invención.

Un aspecto de la descripción comprende vectores que codifican el Gag y/o Pol de VIH-1 de un modo independiente de Rev. Un ejemplo de un vector de este tipo que se describe en este documento es el plásmido pCMVgagpolBNkan, que codifica el Gag y Pol completo de VIH-1 de un modo independiente de Rev y también contiene un gen que otorga resistencia a kanamicina. Este plásmido es independiente de Tat y Rev y se generó eliminando las secuencias inhibidoras/de inestabilidad presentes en el ARNm de gag/pol sin alterar la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas por los genes.

El clon de gag/pol de la descripción es una construcción de ADN de la región de gag/pol de VIH que tiene eliminadas las regiones inhibidoras/de inestabilidad. Se espera que la construcción sea útil como un componente en un nuevo tipo de vector de lentivirus para el uso en terapia génica o como una vacuna.

Las secuencias de gag, pol o gag/pol se pueden expresar en gran medida en células humanas y en otras de mamífero en ausencia de cualquier otra proteína reguladora y estructural de VIH, que incluye Rev. Cuando las secuencias de gag/pol se combinan con una secuencia que codifica una proteína de envuelta, tal como la proteína VSV G o la proteína de envuelta de VIH (por ejemplo, en un mismo vector o en otro vector de expresión), se produce virus infeccioso después de la introducción por transfección en células humanas. Cuando se usa un gen que codifica una proteína no de envuelta de VIH, por ejemplo, en presencia del gen gag/pol de VIH, las partículas de virus producidas contendrían solamente las proteínas de VIH Gag y Pol.

Los vectores de lentivirus o sistemas de vector basados en las secuencias de gag, pol o gag/pol de esta descripción, como se ilustra por la construcción independiente de Rev pCMVgagpolBNkan, se pueden usar para terapia génica in vivo (por ejemplo, inoculación parenteral de un alto título de vector) o ex vivo (por ejemplo, transducción in vitro de células de pacientes seguido de reinfusión en el paciente de las células transducidas). Estos procedimientos ya se han usado en diferentes protocolos de terapia génica aprobados.

El clon de gag/pol de VIH y el clon de gag de VIS de la descripción se prepararon usando el método para eliminar regiones inhibidoras/de inestabilidad de un gen tal como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 07/858.747, presentada del 27 de marzo de 1992, y también en las Patentes de Estados Unidos relacionadas Nº 5.972.596 y 5.965.726. Este método no requiere la identificación de la localización exacta o el conocimiento del mecanismo de función del INS. Generalmente, las mutaciones son tales que la secuencia de aminoácidos codificada por el ARNm no está modificada, aunque también se pueden considerar sustituciones de aminoácidos conservativas y no conservativas cuando la proteína codificada por el gen mutado es sustancialmente similar a la proteína codificada por el gen no mutado. Los genes mutados pueden ser sintéticos (por ejemplo, sintetizados por síntesis química), semisintéticos (por ejemplo, una combinación de ADN genómico, ADNc o ADNc amplificado por PCR y ADN sintético) o producirse recombinantemente. Los genes opcionalmente también pueden no contener intrones. Los ácidos nucleicos de la invención también pueden contener fragmentos independientes de Rev de estos genes que conservan la función deseada (por ejemplo, para antigenicidad de Gag o Pol, formación de partículas (Gag) o actividad enzimática (Pol)), o también pueden contener variantes independientes de Rev que se han mutado de tal forma que la proteína codifica pierde una función que es indeseada en ciertas circunstancias. En el último caso, por ejemplo, el gen puede estar modificado para codificar mutaciones (a nivel aminoacídico) en el sitio activo de la transcriptasa inversa o proteínas integrasa para evitar la transcripción inversa o la integración. Se describen fragmentos independientes de Rev del gen gag en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 07/858.747, presentada el 27 de marzo de 1992 y también en las Patentes de Estados Unidos relacionadas Nº 5.972.596 y 5.965.726.

Además de ser capaz de producir las proteínas Gag y Pol de VIH en ausencia de una proteína reguladora de Rev en una célula in vivo, el clon de gag/pol de VIH y el clon de gag de VIS de la descripción también son capaces de producir las proteínas Gag y Pol de VIH en ausencia de cualquier elemento de transporte que actúa en cis añadido, tal como CTE o elementos similares a CTE (denominados en este documento colectivamente Elementos de Transporte de ARN (RTE)). Los experimentos indican que los vectores mutados de la descripción para gag de VIS son muy superiores a los que añaden CTE (véase Qiu et al., J Virol. 73: 9145-52 (1999)).

La expresión de las proteínas codificadas por estos vectores después de la transfección en células humanas se puede controlar tanto a nivel de producción de ARN como de proteína. Los niveles de ARN se cuantifican por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transferencia de Northern, mapeo de S1 o métodos de PCR. Los niveles de proteína también se pueden cuantificar por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transferencia de western o ELISA o métodos de detección fluorescentes. Se puede usar un protocolo ELISA no radioactivo rápido para detectar la proteína gag (ensayo de captura de antígeno de gag DUPONT o COULTER).

Se consideran al menos tres tipos de vectores lentivirales basados en los genes gag/pol de la descripción para el uso en la terapia génica y/o como una vacuna, es decir, vectores lentivirales que tienen:

a) ninguna ronda de replicación (es decir, un sistema de replicación cero)

b) una ronda de replicación

c) un sistema de replicación completa

Para un sistema sin ninguna ronda de replicación, un gen gag/pol o genes separados de gag y pol o fragmentos de estos genes, se expresan usando unidades de transcripción apropiadas, por ejemplo, un promotor de CMV y un sitio poli(A) de BGH. Esto permitirá la expresión de la unidad gag/pol (o gag o pol o fragmento o fragmentos de los mismos) con propósitos de vacuna. Esta expresión se puede conseguir sin la producción de cualquier enzima retroviral funcional, suponiendo que se han introducido la mutación o las mutaciones apropiadas, por ejemplo, una mutación sin sentido. En un sistema de replicación cero, se administrará una solución madre de virus a las células o animales de interés. Por ejemplo, si se crea y usa una solución madre de virus con el sistema ilustrado mediante el uso del vector de empaquetamiento PCMVgagpolBNKan, la construcción de transferencia pmBCwCNIuci o pmBCmCNIuci, y el vector que contiene envuelta pHCMV-G, se obtiene un sistema de replicación cero. Las partículas de virus producidas por tal sistema pueden infectar células y el ADN de construcción de transferencia transcrito de forma inversa entrará en el núcleo, pero, ya que las regiones codificantes para proteínas estructurales virales no están presentes, no habrá expresión de virus ni replicación (0 rondas). Si se transfectan células in vivo con los mismos 3 ADN, entrarán en el núcleo, expresarán proteínas virales, prepararán partículas de virus infecciosas y saldrán e infectarán otra célula o células (1 ronda). Ya que el suministro in vivo de tres plásmidos puede dar como resultado una menor expresión, se consideran al menos dos realizaciones diferentes. En la primera, se pueden usar dos plásmidos, por ejemplo, MV1 mostrado en la Figura 5 y un plásmido de expresión de envuelta tal como pHCMV-G. También se pueden usar otros plásmidos que codifican envueltas funcionales de VIH, VIS u otros retrovirus. La transfección por los dos plásmidos da como resultado virus infeccioso que puede infectar e integrarse en nuevas células (1 ronda). Las células infectadas producen gagpol pero la propagación del virus no es posible en ausencia de env.

Para un sistema con una ronda de replicación, se consideran al menos dos realizaciones adicionales de la descripción. En el primer método, una combinación de los genes, por ejemplo, un gen gag/pol, un gen que codifica env y, preferiblemente, un gen que codifica una proteína indicadora u otro polinucleótido o proteína de interés, se suministran a las células de interés in vivo. Como se ha analizado anteriormente para el sistema ilustrado, si se transfectan células in vivo con los mismos 3 ADN, entrarán en el núcleo, expresarán proteínas virales, prepararán partículas de virus infecciosas, se liberarán e infectarán otra célula o células (1 ronda).

En otra realización de la descripción, se puede obtener el mismo resultado (es decir, solamente una ronda de replicación) mediante el uso de vectores de transferencia que tienen deleciones en la LTR 3' y en los que se usa un promotor heterólogo (por ejemplo, el promotor de CMV o un promotor inducible o promotor específico de tejidos) en lugar del promotor de LTR 3'. Las mutaciones en la LTR 3' la convierten en inactiva después de la transcripción inversa e integración. Esto es debido a que el provirus integrado obtiene tanto su LTR 5' como su LTR 3' de la LTR 3' de la construcción de partida (transferencia). (Esta es una propiedad bien conocida de todos los retrovirus y se ha usado para preparar vectores auto-inactivantes (SIN)). Existen varias razones por las que se desea inactivar el promotor de LTR de entrada, una de las cuales es usar un promotor específico de tejido o regulado diferente para la expresión de un gen de interés en el provirus integrado. Obsérvese que, con los vectores de SIN, si se usa una solución madre viral preparada in vitro después de la transfección en células y recogida de virus infecciosos, no habrá ronda de replicación. Si se transfectan células con los ADN in vivo, habrá una ronda de replicación. Si no se incluyen gag, pol o env funcionales en la mezcla de ADN no habrá ninguna infección en absoluto (es decir, no se prepararán virus infecciosos).

Hasta ahora no se ha construido un sistema independiente de Rev-completamente replicante, aunque se espera que se pueda construir un sistema funcional mediante el uso de secuencias gag/pol y env independientes de Rev. Si se desea, se incluyen elementos de control post-transcripcional adicionales tales como el elemento CTE, que puede sustituir Rev y proporcionar virus infecciosos (véase, por ejemplo, Zolotukhin et al., J. Virol.68: 944-7952 (1994)). El sistema de replicación incompleta debe ser de una pieza, conteniendo la LTR, la señal de empaquetamiento, gag/pol, sitio de corte y empalme, env, tat, un o más CTE o elementos similares a CTE (si se desea para resultados óptimos) y LTR. Tat se piensa que se requiere en esta construcción, al menos en células no permisivas. Un sistema de este tipo se ilustra en la Figura 5, (construcción MV2). En este sistema, una célula o un animal de interés (preferiblemente ser humano) se infectarían con solución madre de virus que después se propaga. Los CTE o elementos similares a CTE (ilustrados en la construcción MV2 como RTE (Elementos de Transporte de ARN)) son deseables ya que se ha demostrado que mejora la expresión y ya que muchos retrovirus requieren la presencia de elementos de control post-transcripcional. Existen varios tipos de CTE y elementos similares a CTE y estos elementos parecen trabajar mediante una ruta diferente a la ruta de Rev-RRE. Véase, por ejemplo, Tabernero et al., J Virol. 71: 95-101 (1997). Véase también, Pavlakis y Nappi, PCT/US99/11082, presentado el 22 de mayo de 1999, publicado como documento WO 99/61596 el 2 diciembre de 1999 (e incorporada en este documento como referencia), que describe un nuevo tipo de elemento de control post-transcripcional que es capaz de sustituir CTE y RRE/Rev de VIH. El elemento de Pavlakis-Nappi no trabaja del mismo modo que el CTE y no tiene ninguna homología de secuencia o estructura.

En una realización preferida, un sistema lentiviral de la invención comprende los siguientes tres componentes:

1.: un vector de empaquetamiento que contiene secuencias de ácido nucleico que codifica los elementos necesarios para el empaquetamiento de vector tales como proteínas estructurales (excepto por env de VIH) y las enzimas requeridas para generar partículas de vector, comprendiendo el vector de empaquetamiento al menos un gen gag/pol de VIH que se ha mutado para eliminar regiones inhibidoras/de inestabilidad,

2.: un vector de transferencia que contiene secuencias que actúan en cis genéticas necesarias para que el vector infecte la célula diana y para transferir el gen terapéutico o indicador u otros genes de interés, comprendiendo el vector de transferencia la señal de encapsidación y el gen o los genes de interés o un sitio de clonación para insertar el gen o los genes de interés; y

3.: un vector que contiene secuencias que codifican un elemento necesario para dirigir la partícula viral a la célula receptora pretendida, preferiblemente el gen que codifica la glucoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) o MuLV anfótropo o env lentivirales.

Mediante el uso del promotor de CMV u otro promotor fuerte, de alta eficacia, en lugar del promotor de LTR de VIH-1 en el vector de empaquetamiento, se puede conseguir una alta expresión de gag, pol, o gag/pol en ausencia total de cualquier otra proteína viral. La sustitución del promotor de LTR de VIH-1 con otros promotores es beneficiosa en el vector de empaquetamiento u otros vectores si se desea expresión constitutiva y también para la expresión en otras células de mamífero, tales como células de ratón, en las que el promotor de VIH-1 es débil. Los vectores que contienen las secuencias de la descripción se pueden usar para la producción independiente de Rev de Gag/Pol de VIH-1, Gag de VIH, Pol de VIH y proteínas Gag de VIS. En ciertas realizaciones, la presencia de promotores heterólogos también se deseará en el vector de transferencia y en el vector que codifica la envuelta, cuando se usan tales vectores.

El gen o los genes de interés se eligen de acuerdo con el efecto que se pretende conseguir. Para propósitos de terapia génica habrá al menos un gen terapéutico que codifica un producto génico que es activo frente a la afección que se desea tratar o prevenir. Alternativamente o adicionalmente puede haber un gen que actúe como un marcador codificando un producto detectable. Los genes terapéuticos pueden codificar, por ejemplo, un ARN antisentido, un ribozima, un mutante negativo transdominante de una proteína diana, una toxina, una toxina condicional, un antígeno que induce anticuerpos o células T auxiliares o células T citotóxicas, un anticuerpo de cadena única o una proteína supresora de tumor. Véase, por ejemplo, el documento WO 98/17816.

Se describe una lista incluso más extensa de genes de interés para el uso en vectores lentivirales, por ejemplo, en el documento WO 99/04026 página 10, línea 20 a la página 12, línea 7. La Tabla 2 de Klimatcheva et al. (1999) también proporciona una lista de trastornos y células diana para terapia génica así como varios vectores lentivirales usados por otros. Esta lista incluye deficiencias genéticas/metabólicas, infección viral y cáncer. Los defectos genéticos hereditarios tales como deficiencia de adenosina desaminasa, hipercolesterolemia familiar, fibrosis quística, mucopolisacaridosis de tipo VII, diabetes de tipo I y II, fenilcetonuria clásica y enfermedad de Gaucher son enfermedades que se enumeran como posibles de superar por terapia génica mediada por vector lentiviral debido a que constituyen deficiencias de un solo gen para las que se conocen los genes implicados. Las enfermedades virales también se enumeran como constituyen dianas apropiadas para suministro génico lentiviral. En particular, se han propuesto varias estrategias de terapia génica para el tratamiento de infección por VIH, y para algunas de estas estrategias se han comenzado recientemente estudios de fase I en seres humanos. El artículo indica que los estudios preliminares han tratado con oncovirus murinos defectuosos para el suministro de ARN antisentido, ribozimas y proteínas transdominantes contra replicación de VIH.

En cualquiera de los vectores, pero preferiblemente en el vector de transferencia, un gen insertado podría tener un sitio interno de entrada de ribosoma (IRES), por ejemplo, de ARN de picornavirus. Un IRES se usará en circunstancias en las que se desea expresar dos proteínas por el mismo promotor. Por ejemplo, una proteína de interés y un gen marcador, por ejemplo, proteína verde fluorescente (GFP) o un gen marcador y un gen de resistencia a fármacos (por ejemplo, el gen de luciferasa de luciérnaga y el gen de neomicina fosfotransferasa) como se describe en la página 58 del documento WO 99/04026, por ejemplo. Mediante el uso de un IRES se coordina la expresión de las dos proteínas. Un gen o genes adicionales pueden estar también presentes bajo el control de un promotor separado. Un gen de este tipo puede codificar, por ejemplo, un marcador de selección o un agente terapéutico adicional que puede estar entre los agentes terapéuticos que se han enumerado anteriormente. La expresión de este gen puede ser constitutiva; en el caso de un marcador de selección, esto puede ser útil para seleccionar células de empaquetamiento transfectadas de forma exitosa o células de empaquetamiento que están produciendo títulos particularmente elevados de las partículas de vector retroviral. Alternativamente o adicionalmente, el marcador de selección puede ser útil para seleccionar células que se han infectado de forma exitosa con el vector lentiviral y tienen el provirus integrado en su propio genoma.

Un modo de realizar terapia génica es extraer células de un paciente, infectar las células extraídas con un vector lentiviral y reintroducir las células de nuevo en el paciente. Se puede usar un marcador de selección para proporcionar un medio para enriquecer en células infectadas o transducidas o para seleccionar de forma positiva solamente las células que se han infectado o transducido, antes de reintroducir las células en el paciente. Este procedimiento puede aumentar las probabilidades de éxito de la terapia. Los marcadores de selección pueden ser, por ejemplo, genes de resistencia a fármacos, genes de enzima metabólica u cualquier otro marcador de selección conocido en la técnica. Los genes de selección típicos codifican proteínas que otorgan resistencia a antibióticos y otras sustancias tóxicas, por ejemplo, histidinol, puromicina, higromicina, neomicina, metotrexato, etc. y marcadores de superficie celular.

Sin embargo, será evidente que para muchas aplicaciones de terapia génica de vectores lentivirales, la selección para la expresión de un gen marcador no será posible o necesaria. De hecho, la expresión de un marcador de selección, aunque conveniente para estudios in vitro, podría ser perjudicial in vivo debido a la inducción inapropiada de linfocitos T citotóxicos (CTL) dirigidos contra la proteína marcadora extraña. Además, es posible que para aplicaciones in vivo sean preferibles vectores sin ningún promotor interno. La presencia de promotores internos puede afectar, por ejemplo, a títulos de transducción que se pueden obtener por una línea celular de empaquetamiento y la estabilidad del vector integrado. Por tanto, los vectores de una sola unidad de transcripción, que pueden ser bi-cistrónicos o poli-cistrónicos, que codifican el uno o más genes terapéuticos, pueden ser el vector preferido diseñado para el uso in vivo. Véase, por ejemplo, el documento WO 98/17816.

En la técnica se conocen bien células hospedadoras o productoras adecuadas para el uso en la invención. Muchos lentivirus ya se han dividido en genomas defectuosos en replicación y componentes de empaquetamiento. Para los que no tienen la tecnología es posible realizar esto. La célula productora codifica los componentes virales no codificados por el genoma del vector tales como las proteínas Gag, Pol y Env. Los genes gag, pol y env se pueden introducir en la célula productora de forma transitoria o se pueden integrar de manera estable en el genoma de la célula para proporcionar una línea celular de empaquetamiento. Después, el genoma de vector lentiviral se introduce en la línea de células de empaquetamiento por transfección o transducción para crear una línea celular estable que tenga todas las secuencias de ADN requeridas para producir una partícula de vector lentiviral. Otra estrategia es introducir las diferentes secuencias de ADN que se requieren para producir una partícula de vector lentiviral, por ejemplo, la construcción que codifica env, la construcción que codifica gag-pol y la construcción de transferencia en la célula simultáneamente por transfección triple transitoria.

Las células diana identificadas por Klimatcheva et al. (1999), y las referencias citadas en ese documento incluyen células epiteliales de vías respiratorias para fibrosis quística; células fotorreceptoras retinianas para retinitis pigmentosa; progenitores para eritrocitos, macrófagos y linfocitos para trastornos hematopoyéticos, anemia de células falciformes, \beta-talasemia, trastornos de almacenamiento lisosómico, mucopolisacaridosis y síndrome de inmunodeficiencia combinada grave; células de médula ósea y macrófagos para enfermedad de Gaucher; células hepáticas para hipercolesterolemia familiar; linfocitos T y macrófagos para infección por VIH; tejido cerebral, neuronas y células gliales para enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Parkinson y Alzheimer; células endoteliales y miocitos cardiacos para enfermedades cardiovasculares, y células cancerosas en diversos (por ejemplo, hígado o cerebro) para cáncer. Las células diana para otras enfermedades serán evidentes para el especialista en la técnica.

Las vacunas y composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una de las secuencias de ácido nucleico, vectores, sistemas de vector o células hospedadoras transducidas o transfectadas de la descripción y un vehículo fisiológicamente aceptable también se describen.

Como se usa en este documento, el término "transducción" se refiere generalmente a la transferencia de material genético al hospedador por infección, por ejemplo, en este caso, por el vector lentiviral. El término "transfección" se refiere de forma general a la transferencia de material genético aislado a células mediante el uso de agentes de transfección específicos (por ejemplo, fosfato cálcico, DEAE Dextrano, formulaciones lipídicas, partículas de oro y otras micropartículas), que atraviesan la membrana citoplasmática y suministran algo del material genético al núcleo celular.

Se pueden producir sistemas similares a los descritos en este documento mediante el uso de elementos de lentivirus además de los genes de VIH y/o VIS descritos en este documento.

Composiciones Farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas de las descripción contienen una cantidad farmacéutica y/o terapéuticamente eficaz de al menos una construcción de ácido nucleico, vector, sistema de vector, solución madre de partícula viral/virus o célula hospedadora (es decir, agentes) de la descripción. En una realización de la descripción, la cantidad eficaz de un agente de la invención por dosis unitaria es una cantidad suficiente para provocar la expresión detectable del gen de interés. En otra realización de la descripción, la cantidad eficaz de agente por dosis unitaria es una cantidad suficiente para prevenir, tratar o proteger contra efectos perjudiciales (que incluyen gravedad, duración o alcance de los síntomas) de la afección que se está tratando. La cantidad eficaz de agente por dosis unitaria depende, entre otras cosas, de la especie de mamífero inoculado, el peso corporal del mamífero y el régimen de inoculación elegido, como se conoce bien en la técnica. La dosificación de los agentes terapéuticos que será más adecuada para la profilaxis o el tratamiento también variará con la forma de administración, el agente particular elegido y las características fisiológicas del paciente particular en tratamiento. La dosis se administra al menos una vez. Las dosis posteriores se pueden administrar como se indica.

Para controlar la respuesta de individuos a los que se ha administrado las composiciones de la descripción, se pueden determinar los niveles de ARNm o expresión de proteína. En muchos casos, será suficiente evaluar el nivel de expresión en suero o plasma obtenido de un individuo de este tipo. Las decisiones con respecto a si administrar otra dosis o cambiar la cantidad de la composición administrada al individuo se puede basar al menos parcialmente en los niveles de expresión.

La expresión "dosis unitaria" como concierne a los inóculos se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para mamífero, conteniendo cada una unidad una cantidad predeterminada de material activo (por ejemplo, ácido nucleico, solución madre de virus o célula hospedadora) calculada para producir el efecto deseado en asociación con el diluyente requerido. Los títulos de las soluciones madre de virus a administrar a una célula animal dependerán de la aplicación y del tipo de suministro (por ejemplo, in vivo o ex vivo). Las soluciones madre de virus se pueden concentrar usando métodos tales como centrifugación. Los títulos a administrar ex vivo están preferiblemente en el intervalo de 0,001 a 1 unidad infecciosa/célula. Otro método para generar soluciones madre de virus es co-cultivar líneas celulares estables que expresan el virus con las células diana. Este método se ha usado para conseguir mejores resultados cuando se usan vectores retrovirales tradicionales debido a que las células se pueden infectar a lo largo de un periodo de tiempo más prolongado y tienen la probabilidad de infectarse con múltiples copias de vector.

Para la administración in vivo de construcciones de ácido nucleico, vectores, sistemas de vector, soluciones madre de virus o células que se han transducido o transfectado ex vivo la dosis se tienen que determinar por aumento de escala de dosis, limitándose la dosis superior por la aparición de efectos adversos inaceptables. Las dosis de partida preliminares se pueden extrapolar de experimentos que usan vectores lentivirales en modelos animales, mediante métodos conocidos en la técnica o se pueden extrapolar por comparaciones con dosis retrovirales (por ejemplo, adenovirales) conocidas. Generalmente se usarán dosis pequeñas inicialmente y, si es necesario, se aumentarán por incrementos pequeños hasta que se alcance el efecto óptimo en las circunstancias. Las dosificaciones ejemplares están dentro del intervalo de 10^{8} hasta aproximadamente 5 x 10^{15} partículas.

Los inóculos se preparan típicamente como una solución en un vehículo fisiológicamente aceptable tal como solución salina, solución salina tamponada con fosfato y similares para formar una composición farmacéutica acuosa.

Los agentes de la descripción se administran generalmente con un soporte o vehículo farmacéuticamente aceptable para los mismos. Un vehículo fisiológicamente aceptable es uno que no provoca una reacción física adversa después de la administración y una en la que los ácidos nucleicos son suficientemente solubles para conservar su actividad para suministrar una cantidad farmacéuticamente o terapéuticamente eficaz del compuesto. La cantidad farmacéuticamente o terapéuticamente eficaz y el método de administración de un agente de la descripción se pueden variar basándose en el paciente individual, la indicación que se está tratando y otros criterios evidentes para el especialista habitual en la técnica. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico es una suficiente para prevenir o atenuar la gravedad, el alcance o la duración de los efectos perjudiciales de la afección que se está tratando sin provocar efectos secundarios adversos significativos. La vía o las vías de administración útiles en una aplicación particular son evidentes para el especialista habitual en la técnica.

Las vías de administración de los agentes de la descripción incluyen, pero sin limitación, parenteral e inyección directa en un sitio afectado. Las vías de administración parenterales incluyen, pero sin limitación intravenosa, intramuscular, intraperitoneal y subcutánea. La vía de administración de los agentes de la descripción típicamente es parenteral y preferiblemente en es la médula ósea, LCR, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intraocular, intracraneal, intranasal y similares. Véase, por ejemplo, el documento WO 99/04026 para ejemplos de formulación y vías de administración.

La presente invención incluye composiciones de los agentes que se han descrito anteriormente, adecuados para administración parenteral que incluyen, pero sin limitación, soluciones isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables. Tales soluciones incluyen, pero sin limitación, solución salina y solución salina tamponada con fosfato para inyección nasal, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea o directa en una articulación u otra área.

Al proporcionar los agentes de la presente descripción a un mamífero receptor, preferiblemente un ser humano, la dosificación administrada variará dependiendo de factores tales como la edad, peso, altura, sexo, estado médico general, historial médico previo y similares del mamífero.

La administración de las composiciones farmacéuticas de la descripción con propósito "profiláctico" o "terapéutico". Cuando se proporcionan de forma profiláctica, las composiciones se proporcionan antes de cualquier síntoma. La administración profiláctica de la composición sirve para prevenir o mitigar cualquier efecto perjudicial posterior (que incluye gravedad, duración o alcance de síntomas) de la afección que se está tratando. Cuando se proporciona terapéuticamente, la composición se proporciona con (o brevemente después) la aparición de un síntoma de la afección que se está tratando.

Para todos los usos terapéuticos, profilácticos y de diagnóstico, se puede proporcionar uno o más de los agentes de la descripción así como anticuerpos y otros reactivos necesarios y dispositivos y accesorios apropiados en forma de kit para estar disponibles de forma sencilla y usarse de manera fácil.

Cuando están implicados inmunoensayos, tales kits pueden contener un soporte sólido, tal como una membrana (por ejemplo, nitrocelulosa), una perla, esfera, tubo de ensayo, barra, etcétera, a la que se unirá un receptor tal como un anticuerpo específico para la molécula diana. Tales kits también pueden incluir un segundo receptor, tal como un anticuerpo marcado. Tales kits se pueden usar para ensayos de tipo sándwich para detectar toxinas. También se consideran kits para ensayos competitivos.

VI. Aplicabilidad industrial

Los genes mutados de la descripción se pueden expresar en la célula u organismo hospedador nativo o en una célula u organismo diferente. Los genes mutados se pueden introducir en un vector tal como un plásmido, cósmido, fago, virus o mini-cromosoma e insertarse en una célula u organismo hospedador mediante métodos bien conocidos en la técnica. En general, los genes o las construcciones mutadas que contienen estos genes mutados se pueden utilizar en cualquier célula eucariota o procariota, que incluyen células de mamífero (por ejemplo, células humanas (por ejemplo, HeLa), de mono (por ejemplo, Cos), de conejo (por ejemplo, reticulocitos de conejo), de rata, de hámster (por ejemplo, células CHO y de riñón de cría de hámster) o células de ratón (por ejemplo, células L), células vegetales, células de levadura, células de insecto o células bacterianas (por ejemplo, E. coli). Los vectores que se pueden utilizar para clonar y/o expresar estos genes mutados son los vectores que son capaces de replicar y/o expresar los genes mutados en la célula hospedadora en la que se desea que los genes mutados se repliquen y/o expresen. Véase, por ejemplo, F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1992) y Sambrook et al. (1989) para ejemplos de vectores apropiados para diversos tipos de células hospedadoras. Los promotores nativos para genes se pueden sustituir con promotores fuertes compatibles con el hospedador en el que se inserta el gen. Estos promotores pueden ser inducibles. Las células hospedadoras que contienen estos genes mutados se pueden usar para expresar grandes cantidades de la proteína útiles en preparaciones enzimáticas, farmacéuticos, reactivos de diagnóstico, vacunas y terapéuticos.

Los genes mutados o las construcciones que contienen los genes mutados también se pueden usar para terapia génica in vivo o in vitro. Por ejemplo, un gen mutado producirá un ARNm in situ para aumentar finalmente la cantidad de proteína expresada. Tal gen incluye genes víricos y/o genes celulares. Un gen mutado de este tipo se espera que sea útil, por ejemplo, en el desarrollo de una vacuna y/o terapia genética.

Las construcciones y/o proteínas preparadas mediante el uso de construcciones que codifican los genes gag, env y pol mutados se podrían usar, por ejemplo, en la producción de reactivos de diagnóstico, vacunas y terapias para SIDA y enfermedades relacionadas con SIDA. Los elementos inhibidores/de inestabilidad en el gen gag de VIH-1 pueden estar implicados en el establecimiento de un estado de baja producción de virus en el hospedador. El VIH-1 y otros lentivirus provocan infecciones activas crónicas que no se aclaran por el sistema inmune. Es posible que la retirada completa de los elementos de secuencia inhibidora/de inestabilidad del genoma lentiviral diera como resultado expresión constitutiva. Esto podría evitar que el virus estableciese una infección latente y que escapara a la supervisión del sistema inmune. El éxito al aumentar la expresión del gen gag/pol entero por eliminación del elemento de secuencia inhibidora sugiere que se podrían producir lentivirus sin ningún elemento negativo. Tales lentivirus podrían proporcionar una estrategia novedosa frente a vacunas atenuadas.

Por ejemplo, los vectores que expresan altos niveles de Gag se pueden usar en inmunoterapia e inmunoprofilaxis, después de la expresión en seres humanos. Tales vectores incluyen vectores retrovirales y también incluyen la inyección directa de ADN en células musculares u otras células receptoras, dando como resultado la expresión eficaz de gag, mediante el uso de la tecnología descrita, por ejemplo, en Wolff et al., Science 247: 1465-1468 (1990), Wolff et al., Human Molecular Genetics 1(6): 363-369 (1992) y Ulmer et al., Science 259: 1745-1749 (1993). Además, las construcciones de gag se podrían usar en inhibición transdominante de la expresión de VIH después de la introducción en seres humanos. Para esta aplicación, por ejemplo, los vectores o moléculas de ADN apropiadas que expresan altos niveles de p55^{gag} o p37^{gag} se modificarían para generar mutantes de gag transdominantes como se describe, por ejemplo, en Trono et al., Cell 59: 113-120 (1989). Los vectores se introducirían en seres humanos, dando como resultado la inhibición de la producción de VIH debido a los mecanismos combinados de la inhibición transdominante de gag y de la inmunoestimulación por la proteína gag producida. Además, las construcciones gag de la descripción se podrían usar en la generación de nuevos vectores retrovirales basándose en la expresión de proteínas gag lentivirales. Los lentivirus tienen características únicas que pueden permitir la detección e infección eficaz de células que no están en división. Se esperan aplicaciones similares para vectores que expresan altos niveles de env.

La identificación de elementos inhibidores/de inestabilidad similares en VIS indica que este virus es un modelo conveniente para ensayar esta hipótesis. El VIS modificado de manera similar se podría usar en lugar de VIH en un intento de minimizar adicionalmente la posibilidad de acontecimientos de redisposición que conducirían a la generación de VIH infeccioso.

Los siguientes ejemplos ilustran ciertas realizaciones de la presente invención, pero no se deben considerar limitantes de su alcance de ningún modo.

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Ejemplo 1

Clon Molecular de Gag/Pol de VIH-1 Independiente de Rev

La Figura 1 muestra la secuencia de ADN de un clon molecular de gag/pol de VIH-1 independiente de Rev. Esta secuencia de ADN mostrada codifica el Gag y Pol completo de VIH-1 y se puede expresar de un modo independiente de Rev cuando está unido operativamente a un promotor. La secuencia de gag independiente de Rev se describió en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.972.596 y 5.965.726 y la secuencia pol independiente de Rev se generó eliminando las secuencias inhibidoras/de inestabilidad mediante el uso de los métodos descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.972.596 y 5.965.726. Otros han preparado como se ha descrito secuencias de gag independientes de Rev optimizando el uso de codón para células humanas (véase, por ejemplo, el documento WO 98/34640).

La Figura 2 muestra un alineamiento de la secuencia de la región pol de tipo silvestre y mutada en pCMVgagpolBNkan. La posición Nº 1 en la figura es la posición 2641 en el plásmido pCMVgagpolBNkan.

La eliminación de INS en regiones gag, pol y env permite la expresión de niveles altos de proteínas estructurales de VIH-1 auténticas en ausencia del factor regulador de Rev de VIH-1.

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Ejemplo 2

Clon Molecular de Gag de VIS Independiente de Rev

La Figura 3 muestra la secuencia de ADN de un clon molecular de gag de VIS independiente de Rev, SIVgagDX. La Figura 4 muestra la comparación de las secuencias de tipo silvestre (WT) y mutantes (SIVgagDX). La secuencia de VIS de tipo silvestre es del aislado 239 del virus de la inmunodeficiencia de Simio (macaco), clon lambda vis 239-1 (Nº de Acceso de GenBank M33262).

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Ejemplo 3

Clon Molecular de Env de VIS Independiente de Rev

La Figura 16 muestra un diagrama esquemático y la Figura 17 muestra la secuencia de ADN del vector "que codifica env" CMVkan/R-R-SIVenvCTE, que es un ejemplo de un vector que comprende una secuencia génica de env lentiviral mutada que es capaz de expresarse independientemente de cualquier factor regulador de VIS o VIH. "CMV" indica el promotor de citomegalovirus; "SRV-CTE" indica el elemento de transporte constitutivo (CTE) del Retrovirus de Simio de Tipo 1; "todo-STOP" indica una secuencia que proporciona terminaciones de la traducción en las tres fases de lectura; "terminador de BGH" indica la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Se pueden usar otros elementos de control post-transcripcionales en lugar del SRV-CTE, por ejemplo, el descrito por Pavlakis y Nappi, documento PCT/US99/11082 presentado el 22 de mayo de 1999, que se publicó como el documento WO 99/61596 el 2 de diciembre de 1999 (y que se incorpora en este documento como referencia).

Como se ha mencionado previamente anteriormente, un vector de este tipo que codifica un gen env lentiviral se puede usar si se desea que el vector infecte células T CD4^{+}. Como también se ha mencionado previamente, el elemento CTE (es decir, el elemento SRV-CTE en el caso del vector CMVkan/R-R-SIVenvCTE), se puede sustituir con otro elemento de control post-transcripcional, tal como el elemento de Pavlakis-Nappi, que sea capaz de sustituir CTE y RRE/Rev de VIH. Véase Pavlakis y Nappi, documento PCT/US99/11082, presentado el 22 de mayo de 1999, que se publicó como el documento WO 99/61596 el 2 diciembre de 1999 (y que se incorpora en este documento como referencia).

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Ejemplo 4

Sistema de Vector Lentiviral

La Figura 5 es un esquema de algunos de los componentes de una versión preliminar del sistema de vector lentiviral independiente de Rev ilustrado en este documento, que incluye la construcción de empaquetamiento y tres vectores de transferencia diferentes que se pueden usar. En el sistema lentiviral ilustrado en este documento, la construcción de empaquetamiento también contiene el gen para resistencia a kanamicina. El sistema lentiviral ilustrado en este documento también contiene el vector pHCMV-G, que se muestra en la Figura 5.

En la construcción de empaquetamiento mostrada en la Figura 5, "CMV" indica el promotor de citomegalovirus, "Gag" indica el gen gag, que genera componentes del centro del virión, "Pro" indica "proteasa" "RT" indica "transcriptasa inversa", "Int" indica "integrasa" y "poli (A) de BGH" indica la señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina. Los genes de proteasa, transcriptasa inversa e integrasa comprenden el gen "pol". En la construcción de transferencia 1, "LTR" indica la "repetición terminal larga" de VIH, que contiene un promotor de VIH; "mSD" indica "sitio de ayuste 5' mutado", que está presente en la construcción de tal forma que no tiene lugar el corte y empalme del transcrito de ARN; "\psi" indica la señal de encapsidación; "wGA" indica parte del gen gag de tipo silvestre que contiene secuencias que se piensa que son necesarias para la encapsidación; "X" indica que el codón ATG de la secuencia del gen gag parcial está mutado de tal forma que no tiene lugar la traducción de este gen; "CMV" indica el promotor de citomegalovirus y la luciferasa se usa como un gen indicador. La luciferasa se puede sustituir con cualquier gen de interés. Otra LTR de VIH está presente en el extremo 3' de la construcción de transferencia 1. La sustitución de esta LTR en construcciones tales como la construcción de transferencia 1, 2 ó 3 con una LRT de VIH delecionada en promotor/potenciador conduce a la inactivación de la LTR después de la integración. La construcción de transferencia 2 es similar a la construcción de transferencia 1, siendo la diferencia que una parte mutada del gen gag (indicada como "mGa") se usa en lugar de la parte de tipo silvestre del gen gag. La construcción de transferencia 3 (pm2BCwCNIuci) tiene diferentes mutaciones en el sitio de empalme 5' y tiene un codón ATG intacto de tal forma que tiene lugar la traducción de parte del gen gag mutado. La construcción de transferencia 3 también tiene un promotor de CMV 5' en lugar de un promotor de LTR 5'. Esta construcción se expresa independientemente de la presencia de la proteína Tat de VIH. Las construcciones de transferencia expresadas por el promotor de LTR son parcialmente dependientes de la proteína Tat. En células 293 se puede conseguir la expresión significativa en ausencia de Tat. Véase, por ejemplo, Valentin et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 95: 8886-91 (1988).

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Ejemplo 5

Generación de Construcción de Empaquetamiento pCMVgagpol BNkan

La Figura 6 muestra un mapa esquemático de la construcción de empaquetamiento pCMVgagpolBNKan. La numeración de nucleótidos es la de la secuencia HXB2R (Número de Acceso de GenBank K03455 y M38432), donde +1 es el inicio de la transcripción.

La secuencia en la región de gag/pol de VIH-1 se mutó para eliminar todos los INS. El fragmento desde el comienzo de gag hasta el sitio BsrGI en pol, y el fragmento KE [Kpnl(3700)-EcoRI(4194)] se mutaron previamente como se describe en Schneider et al., J Virol. 71: 4892-4903 (1997) y en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.972.596 y 5.965.726.

Para generar pCMVgagpolBNkan, se mutaron tres fragmentos dentro de la región de pol de VIH-1. Son el fragmento BP [BsrGI(2207)-PflMI(3032)], el fragmento PK [PflMI(3032)-Kpnl(3700)] y el fragmento EN [EcoRI(4194)-Ndel(4668)]. La mutagénesis se realizó mediante el uso de una versión modificada del método descrito por Ho et al., Gene 77: 51 -59 (1989) y barajado de ADN (Zhao y Arnold, Nucl. Acid Res. 25(6), 1307-1308 (1997). Se diseñaron dieciséis oligonucleótidos que se extienden sobre toda la secuencia de los tres fragmentos. Seis oligonucleótidos se correspondieron al fragmento BP, seis al fragmento PK y cuatro al fragmento EN (los oligonucleótidos variaron de 130 a 195 bases de longitud; los oligonucleótidos adyacentes se solaparon en veinte nucleótidos). Cada fragmento se ensambló en dos etapas:

1) PCR; la reacción se realizó en tampón pfu convencional con 10 pmol de cada oligo grande purificado, 0,2 mM de cada dNTP y 2,5 u de enzima de ADN polimerasa de pfu (Stratagene) en un volumen final de 50 \mul. El programa de PCR fue: 3 min a 96ºC seguido de 50 ciclos de 1 min a 94ºC, 1 min a 55ºC y 1 min + 5 s/ciclo a 72ºC, terminado por 7 min a 72ºC. Después de la PCR, se eliminaron los oligonucleótidos grandes del fragmento mutado ensamblado.

2) La segunda etapa fue para amplificar específicamente los productos ensamblados con cebadores de oligómero de 30 unidades localizados en el extremo 5' y 3' de cada fragmento mutado. Se usó un microlitro del producto de PCR ensamblado como molde en una reacción de PCR de 25-ciclos con 50 pmol de cada cebador, tampón pfu 1x, 0,2 mM de cada dNTP y 2,5 u de ADN polimerasa de pfu en un volumen final de 50 \mul. El programa de PCR fue: 3 min a 96ºC, 10 ciclos de 30 s a 94ºC, 30 s a 55ºC, 45 s a 72ºC, seguido de otros 14 ciclos de 30 s a 94ºC, 30 s a 55ºC, 45 s + 20 s/ciclo a 72ºC y finalmente 7 min a 72ºC. Este programa dio un único producto de PCR del tamaño correcto. Los fragmentos BP, PK y EN amplificados se clonaron individualmente en el vector PCR-script^{TM} mediante el uso del kit de clonación PCR-script^{TM} Amp SK(+) (Stratagene). Los clones se seleccionaron aleatoriamente y se secuenciaron. Los fragmentos correctos de BP, PK y EN junto con el fragmento KE mutado previamente por Schneider et al. se ligaron entre el sitio BsrGI y KpnI de p55AM1-R5 (que se describió previamente en Schneider et al., J. Virol. 71: 4892-4903 (1997)) para producir una ORF de gagpol completamente mutada. El nuevo plásmido que contenía el gag/pol completamente mutado se denominó pLTRgagpolBN. BN indica la modificación del fragmento entre BsrGI y NdeI. Después, el gag/pol mutado se clonó en un vector CMVkan que contenía el promotor tardío principal de citomegalovirus (Nº de Acceso de GenBank X17403) y el gen de resistencia a kanamicina, dando como resultado pCMVgagpolBNkan. La cadena principal del plásmido procede de pVR1332 proporcionado por Vical Inc. y descrito en Hartikka et al., Hum Gene Ther. 7: 1205-17 (1996).

Se entiende que se pueden usar diferentes esqueletos plasmídicos, por ejemplo, para proporcionar una buena expresión in vivo, por ejemplo, en el caso de inyección de ADN.

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Ejemplo 6

Construcción de Vectores de Transferencia pmBCwCNIuci y pmBCmCNIuci

La secuencia de VIH-1 BC, entre BssHII (257) y Clal (376), contiene el sitio de ayuste 5' principal y la señal de encapsidación. Se diseñaron seis oligonucleótidos (de 33 a 46 bases) para introducir mutaciones en el sitio de ayuste 5' y el codón de inicio AUG de gag. El fragmento BC se ensambló, amplificó y secuenció como se describe en la sección referente a la construcción de pCMVgagpolBN.

El fragmento BC mutado y un fragmento de tipo silvestre de gag entre Clal (376) y Nsi (793) se puso entre los sitios de BssHII y Nsi de p55RRE (Schneider et al., J. Virol. 71: 4892-4903 (1997)) para generar pmBCwCN. En paralelo, el fragmento entre los sitios Clal (376) y Nsil del gag mutado de p55BM1-10SD+ se usó para generar pmBCmCN. (p55BM1-10SD+ es similar a p55BM1-10, que se describe en Schneider et al. (1997), pero contiene además el sitio de ayuste 5' intacto y el sitio de encapsidación cadena arriba de gag). La región entre Nsil y Xhol que contiene la parte 3' de gag y RRE en pmBCwCN y pmBCmCN se sustituyó por un fragmento de Clal-Xhol que contenía el promotor de CMV y el gen de luciferasa de pHR'-CMVIuci (vector de D. Trono) para generar pmBCwCNIuci y pmBCmCNIuci (que se muestran como construcciones de transferencia 1 y 2 en la Figura 5 y se ilustran esquemáticamente en las Figuras 7 y 8, respectivamente). Las secuencias de estos plásmidos se muestran en las Figuras 10 y 11, respectivamente. También se han creado diferentes versiones de estos plásmidos, por procedimientos convencionales, con variaciones en la región del sitio de encapsidación, el primer sitio de ayuste 5' y el AUG de gag iniciador. Por ejemplo, la construcción de transferencia pm2BcwCNIuci (que se muestra como la construcción de transferencia 3 en la Figura 5) tiene diferentes mutaciones en el sitio de empalme 5' y tiene un ATG intacto. Una comparación de las secuencias en la región BssHII-ClaI de las construcciones de transferencia 1 y 2 (fragmento m2BCwCN), construcción de transferencia 3 (fragmento m2BCwCN), HXB2 y NL43 se muestra en la Figura 12.

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Ejemplo 7

Preparación de Partículas Virales

Se generaron partículas lentivirales por co-transfección transitoria de células de riñón humano 293 con una combinación de tres plásmidos: pCMVgagpolBNkan, pmBCwCNIuci o pmBCmCNIuci (vector de transferencia) y pHCMV-G (Yee et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 9564-9568 (1994), un plásmido que codifica VSV-G de envuelta (glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular).

El día antes de la transfección, 293 células se sembraron a una densidad de 10^{6} células/placa en una placa de 60 mm. El ADN plasmídico se introdujo por transfección por el método de precipitación de fosfato cálcico en las siguientes proporciones: 3 \mug de construcción de empaquetamiento, 6 \mug de construcción de transferencia y 100 ng de construcción que codifica VSV-G, pHCMV-G. [Obsérvese que el promotor de LTR se puede expresar en células 293 en ausencia de Tat con una disminución moderada en la eficacia. Las construcciones de transferencia pueden ser Tat completa e independientemente de la sustitución del promotor de LTR con un CMV (véase, por ejemplo, construcción de transferencia 3 en la Figura 5) u otro promotor de tal modo que el sitio de inicio del ARNm está al comienzo de la región R de LTR]. En los presentes experimentos para la preparación de partículas víricas se incluyeron 500 ng de un plásmido de expresión de Tat en la transfección.

Las células se lavaron el día después de la transfección y se mantuvieron en medio DMEM durante otras 48 horas antes de que se recogieran los sobrenandantes. Los sobrenadantes se centrifugaron a 1.200 rpm durante 7 min para eliminar cualquier célula flotante. pCMVgagpolBNkan produce altos niveles de proteína Gag que se libera de manera eficaz de las células (Figura 13), y también produce niveles de Pol funcional como se calcula por los niveles de la actividad de transcriptasa inversa similares a los observados después de la expresión de VIH-1 completo
(Figura 14).

Los sobrenadantes de células transfectadas 293 se usaron para transducir varias líneas celulares humanas (293, Jurkat, U937) y macrófagos primarios humanos que no están en división.

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Ejemplo 8

Transducción Celular

La transducción se realizó incubando durante 3-4 horas a 37ºC las células diana con 1-2 ml de sobrenadante que contenía los vectores retrovirales. La cantidad de vector retroviral presente en el sobrenadante se normalizó por contenido de p24 (medido por ELISA). Se usaron cantidades iguales de proteína gag de p24 para la infección de las células. De este modo se minimizaron las diferencias en la producción de las diferentes preparaciones.

Los macrófagos usados para la transducción se aislaron de la sangre periférica de donantes sanos por adherencia a plástico. Las células se cultivaron en RPMI + suero fetal de ternero al 20% (FCS) + suero humano al 10% (HS). Después de 1 semana, las células no adherentes se eliminaron por lavado con PBS y los macrófagos se mantuvieron en cultivo durante otras 1-2 semanas en ausencia de suero humano. Las células se lavaron 2-4 veces con PBS antes de la transducción.

Las células se recogieron 48 horas después de la transducción (siete días para macrófagos primarios) y la eficacia de transducción se determinó midiendo la actividad de luciferasa en los extractos celulares de los cultivos. Los resultados de los experimentos de transducción en 293 Jurkat, U937 y macrófagos primarios son como se muestra en la Figura 15A-D. Estos resultados demuestran que los vectores retrovirales basados en gag de VIH-1 independiente de Rev presentan una alta eficacia de transducción en (A) células 293, (B) células linfoides humanas, (C) células mieloides humanas (U937), así como (D) células que no están en división tales como macrófagos humanos primarios.

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Ejemplo 9

Uso de Ácidos Nucleicos de la Descripción en Inmunoprofilaxis o Inmunoterapia

En la terapia génica postnatal, se ha introducido nueva información genética en tejidos por medios indirectos tales como la eliminación de células diana del cuerpo, la infección de las mismas con vectores virales que llevan la nueva información genética y reimplantando las mismas en el cuerpo; o por medios directos tales como encapsulación de formulaciones de ADN en liposomas; captura de ADN en proteoliposomas que contienen proteínas de receptor de envuelta viral; co-precipitación de ADN con fosfato cálcico; y acoplamiento de ADN a un complejo de vehículo de polilisina-glucoproteína. Además, también se ha descrito la infectividad in vivo de secuencias de ADN víricas clonadas después de la inyección intrahepática directa con o sin formación de coprecipitados de fosfato cálcico. También se ha demostrado que las secuencias de ARNm que contienen elementos que mejoran la estabilidad se traducen de manera eficaz en embriones de Xenopus laevis, con el uso el vesículas lipídicas catiónicas. Véase, por ejemplo, J. A. Wolff, et al., Science 247: 1465-1468 (1990) y las referencias citadas en ese documento.

Recientemente también se ha demostrado que la inyección de ARN o ADN puro directamente en músculo esquelético da como resultado la expresión significativa de genes dentro de las células musculares. J. A. Wolff, et al. Science 247: 1465-1468 (1990). Al forzar el ARN o el ADN introducido en las células musculares por otros medios tales como por aceleración de partículas (N. S. Yang, et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 87: 9568-9572 (1990); S. R. Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2726-2730 (1991)) o por transducción vírica también puede permitir que el ADN o el ARN se mantenga y exprese de manera estable. En los experimentos descritos en Wolff et al., se usaron vectores de ARN o ADN para expresar genes indicadores en células de músculo esquelético de ratón, específicamente células de los músculos cuádriceps. La expresión de proteínas se detectó de forma sencilla y no se requirió para estos efectos ningún sistema de suministro especial. También se obtuvo la expresión polinucleotídica cuando la composición y el volumen del fluido de inyección y el método de inyección se modificaron a partir del protocolo descrito. Por ejemplo, la actividad de la enzima indicadora se describió que se había observado con de 10 a 100 \mul de soluciones de sacarosa hipotónica, isotónica e hipertónica, Opti-MEM o soluciones de sacarosa que contenían CaCI_{2} 2 mM y también se ha observado cuando las inyecciones de 10 a 100 \mul se realizaron a lo largo de 20 min con una bomba en lugar en
1 min.

También se detectó la actividad enzimática de la proteína codificada por el gen indicador en el músculo abdominal indicado con los vectores de ARN o ADN, indicando que otros músculos pueden captar y expresar polinucleótidos. También se detectaron bajas cantidades de enzima indicadora en otros tejidos (hígado, bazo, piel, pulmón, cerebro y sangre) inyectados con los vectores de ARN y ADN. También se ha demostrado que el ADN plasmídico inyectado por vía intramuscular se expresa de manera estable en músculo de primate no humano. S. Jiao et al., Hum. Gene Therapy 3: 21-33 (1992).

Se ha propuesto que la transferencia directa de genes en músculo humano in situ puede tener varias aplicaciones clínicas potenciales. El músculo potencialmente es un tejido adecuado para la expresión heteróloga de un transgén que modificaría patologías en las que el músculo no está implicado principalmente, además de aquellas en las que lo está. Por ejemplo, el tejido muscular se podría usar para la expresión heteróloga de proteínas que pueden inmunizar, secretarse a la sangre o aclarar un metabolito tóxico circulante. El uso de ARN y un tejido que se puede acceder de forma repetitiva puede ser útil para un sitio de transferencia génica reversible, administrándose de manera muy similar a tratamientos farmacéuticos convencionales. Véase J. A. Wolff, et al., Science 247: 1465-1468 (1990) y S. Jiao et al., Hum. Gene Therapy 3: 21-33 (1992).

Se ha propuesto por J. A. Wolff et al., anteriormente, que la expresión intracelular de genes que codifican antígenos puede proporcionar estrategias alternativas al desarrollo de vacunas. Esta hipótesis se ha respaldado por un informa reciente de que el ADN plasmídico que codifica nucleoproteína de influenza A inyectado en el cuádriceps de ratones BALB/c dio como resultado la generación de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de nucleoproteína de influenza A y protección de una exposición posterior con una cepa heteróloga del virus de influenza A, como se mide por títulos pulmonares víricos disminuidos, inhibición de pérdida de masa y supervivencia aumentada. J. B. Ulmer et al., Science 259: 1745-1749 (1993).

Por lo tanto, parece que la inyección directa de vectores de ARN o ADN que codifican el antígeno vírico se pueden usar para expresión endógena del antígeno para generar el antígeno vírico para la presentación al sistema inmune sin la necesidad de agentes de auto-replicación o adyuvantes, dando como resultado la generación de CTL específicos de antígeno y la protección contra una exposición posterior con una cepa homóloga o heteróloga de virus.

Los CTL tanto en ratones como seres humanos son capaces de reconocer epítopos obtenidos de proteínas víricas internas conservadas y se piensa que son importantes en la respuesta inmune contra virus. Mediante el reconocimiento de epítopos de proteínas víricas conservadas, los CTL pueden proporcionar protección inter-cepa. Los CTL específicos para antígenos víricos conservados pueden responder a diferentes cepas de virus, a diferencia de anticuerpos, que generalmente son específicos de cepa.

Por tanto, la inyección directa de ARN o ADN que codifica el antígeno vírico tiene la ventaja de carecer de algunas de las limitaciones de suministro de péptido directo o vectores víricos. Véase J. A. Ulmer et al., anteriormente, y los análisis y las referencias en ese documento). Además, la generación de alto título de anticuerpos para proteínas expresadas después de la inyección del ADN indica que esto puede ser un medio fácil y eficaz de preparar vacunas basadas en anticuerpos dirigidas contra antígenos conservados o no conservados, de manera separada o en combinación con vacunas de CTL dirigidas contra antígenos conservados. Las mismas también se pueden usar con vacunas peptídicas tradicionales, para la generación de vacunas de combinación. Además, debido a que la expresión de proteínas se mantiene después de la inyección de ADN, la persistencia de la memoria de células B y T se pueden mejorar, suscitando de este modo una inmunidad humoral y mediada por células a largo plazo.

1. Vectores para la inmunoprofilaxis o inmunoterapia contra VIH-1

Las secuencias gag, pol o gag/pol mutadas se insertarán en vectores de expresión que usan un promotor constitutivo fuerte tal como CMV o RSV o un promotor inducible tal como VIH-1.

El vector se introducirá en animales o seres humanos en un vehículo farmacéuticamente aceptable mediante el uso de una de varias técnicas tales como inyección de ADN directamente en tejidos humanos; electroporación o transfección del ADN en células humanas primarias en cultivo (ex vivo), selección de células para propiedades deseadas y reintroducción de tales células en el cuerpo (dicha selección puede ser para la recombinación homóloga exitosa del ADN de entrada con una región genómica preseleccionada apropiada); generación de partículas infecciosas que contienen el gen gag, infección de células ex vivo y reintroducción de tales células en el cuerpo; o infección directa por dichas partículas in vivo.

Se producirán niveles sustanciales de proteína que conducen a una estimulación eficaz del sistema inmune.

En otra realización de la invención, las construcciones descritas se modificarán para expresar proteínas Gag mutadas que son incapaces de participar en la formación de partícula de virus. Se espera que tales proteínas Gag estimularán el sistema inmune en el mismo alcance que la proteína Gag de tipo silvestre, pero son incapaces de contribuir a la producción aumentada de VIH-1. Esta modificación dará como resultado vectores más seguros para inmunoterapia e inmunoprofilaxis.

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Ejemplo 10

Inhibición de Expresión de VIH-1 mediante el Uso de Genes Transdominantes (TD)-TD-Gag-TD Rev o Td Gag-Pro-TD Rev

La inyección directa de ADN o el uso de vectores diferentes a vectores retrovirales permitirá el alto nivel constitutivo de Gag transdominante (TDgag) en las células. Además, la estrategia adoptada por B. K. Felber et al., Science 239: 184-187 (1988) permitirá la generación de vectores retrovirales, por ejemplo, vectores retrovirales obtenidos de ratón, que codifican TDgag de VIH-1, que no interferirán con la infección de células humanas por los vectores retrovirales. En la estrategia de Felber, et al., anteriormente, se mostró que los fragmentos de la LTR de VIH-1 que contienen el promotor y parte de la señal poliA se pueden incorporar sin efectos perjudiciales en vectores retrovirales de ratón y permanecer silenciosos en cuanto a la transcripción. La presencia de proteína Tat estimuló la transcripción de la LTR de VIH-1 y dio como resultado el alto nivel de expresión de genes vinculados a la LTR de VIH-1.

La generación de genes híbridos TDgag-TDRev o TDgag-pro-TDRev y la introducción de vectores de expresión en células humanas permitirán la producción eficaz de dos proteínas que inhibirán la expresión de VIH-1. La incorporación de dos proteínas TD en el mismo vector se espera que amplifique los efectos de cada uno en la replicación vírica. El uso del promotor de VIH-1 en un aspecto similar al descrito en B. K. Felber, et al., anteriormente permitirá el alto nivel de expresión de Gag y Rev en células infectadas. En ausencia de infección, la expresión será sustancialmente menor. Alternativamente, el uso de otros promotores fuertes permitirá expresión constitutiva de tales proteínas. Esta estrategia podría ser altamente beneficiosa, debido a que la producción de un gag altamente inmunógeno, que no es capaz de participar en la producción de virus infeccioso pero que, de hecho, antagoniza tal producción. Esto se puede usar como una estrategia inmunoprofiláctica o inmunoterapéutica eficaz contra SIDA.

Los ejemplos de mutantes transdominantes se describen en Trono et al., Cell 59: 112-120 (1989).

1. Generación de construcciones que codifican proteínas mutantes Gag transdominantes

Las proteínas mutantes Gag que pueden actuar como mutantes transdominantes, como se describe, por ejemplo, en Trono et al., anteriormente, se generarán modificando el vector p37M1-10D o p55M1-13P0 para producir proteínas Gag transdominantes a altos niveles constitutivos.

La proteína Gag transdominante estimulará el sistema inmune e inhibirá la producción de virus infeccioso, pero no contribuirá a la producción de virus infeccioso.

La seguridad añadida de esta estrategia hace que sea más aceptable para aplicación humana.

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VII. Referencias

Patente de Estados Unidos Nº 5.972.596 expedida el 26 de octubre de 1999 (Pavlakis y Felber)

Patente de Estados Unidos Nº 5.965.726 expedida el 12 de octubre de 1999 (Pavlakis y Felber)

Documento WO 98/17816 Lentiviral Vectors (Kingsman & Kingsman) (Oxford Biomedica Ltd)

Documento WO 98/34640 (Shiver, J. W., Davies, M-E M., Freed, D. C., Liu, M. A. y Perry, H. C. - Merck & Co., Inc.)

Documento WO 98/46083 Use of Lentiviral Vectors for Antigen Presentation in Dendritic Cells (Wong-Staal, Li; Kan-Mitchell) (Univ. of Cal.)

Documento WO 99/04026 Lentiviral Vectors (Chen, Gasmi, Yee y Jolly) (Chiron)

Documento WO 99/15641 Non-Primate Lentiviral Vectors and Packaging Systems (Poeschia, Looney y Wong-Staal) (Univ. of Cal.)

Documento WO 99/30742 Therapeutic Use of Lentiviral Vectors (Naldini y Song)

WO 99/51754 Infectious Pseudotyped Lentiviral Vectors Lacking Matrix Protein and Uses Thereof (Goettlinger, Reil y Bukovsky) (Dana Farber Cancer Inst Inc)

Documento PCT/US99/11082 Post-Transcriptional Regulatory Elements and Uses Thereof (Pavlakis y Nappi), presentado el 22 de mayo de 1999, publicado como documento WO 99/61596 el 2 de diciembre de 1999

Akkina, R. K., Walton, R. W., Chen, M. L., Li, Q-X, Planelles, V y Chen, I.S.Y., "High-efficiency gene transfer into CD34^{+} cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G", J. Virol. 70: 2581-2585 (1996)

Amado, R. G. & Chen, I.S.Y., "Letinviral vectors-the promise of gene therapy within reach?", Science 285: 674-676 (julio de 1999)

Donahue, R. E., An, D. S., Wersto, R. P., Agricola, B. A., Metzger, M. E. y Chen, I.S.Y., "Transplantation of immunoselected CD34^{+} cells transduced with a EGFP-expressing lentiviral vector in non-human primates", Blood92 (supl. 1): 383b, Resumen Nº 4648.5 (1998)

Fox, J. L., "Researchers wary of fear-based ban on lentivirus gene therapy, "Nature Biotechnology 16: 407-408 (1998)

Goldman, M. J., Lee, P. S., Yang, J. S. & Wilson, J. M., "Lentiviral vectors for gene therapy of cystic fibrosis", Hum Gene Ther. 8, 2261 -2268 (1997)

Hartikka J, Sawdey M, Cornefert-Jensen F, Margalith M, Barnhart K, Nolasco M, Vahlsing HL, Meek J, Marquet M, Hobart P, Norman J, y Manthorpe M., "An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle", Hum Gene Ther. 7: 1205-17 (1996)

Kafri, T., Blomer, U., Peterson, D. A., Gage, F. H. & Verma, I. M., "Sustained expression of genes delivered directly into liver and muscle by lentiviral vectors", Nat Genet. 17, 314-317 (1997)

Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L, Gage, F. G. y Verma, I. M., "A packaging cell line for lentivirus vectors", J. Virol. 73: 576-584 (1999)

Kim, V. N., Mitrophanous, K., Kingsman, S. M., y Kingsman, A. J., "Minimal Requirement for a Lentivirus Vector Based on Human Immunodeficiency Virus Type 1", J. Virol. 72: 811 -816 (1998)

Klimatcheva, E., Rosenblatt, JD. y Planelles, V., "Lentiviral vectors and gene therapy", Frontiers in Bioscience 4: d481-496 (junio de 1999)

Miyoshi, H., Takahashi, M., Gage, F. H. & Verma, I. M., "Stable and efficient gene transfer into the retina using an HIV-based lentiviral vector", Proc Natl Acad Sci USA. 94: 10319-10323 (1997)

Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., y Verma, I. M., "Development of self-inactivating lentivirus vector", J Virol. 72: 8150-8157 (1998)

Miyoshi, H., Smith, K. A., Mosier, D. E., Verma, I. M. y Torbett, B. E., "Transduction of human CD34^{+} cells that mediate long-term engraftment of NOD/SCID mice by HIV vectors", Science 283: 682-686 (1999)

Naldini, L, Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H., Verma, I. M. & Trono, D., "In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector", Science. 272, 263-267 (1996)

Naviaux, R. K, Costanzi, E., Haas, M. y Verma, I., "The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses", J. Virol. 70: 5701-5705 (1996)

Pavlakis, G. N., Schneider, R.; Song, S., Nasioulas, G., Zolotukhin, A., Felber, B.K., Trauger, R., Cox, J., y Manthorpe, M., "Use of simple Rev-independent HIV-1 gag expression vectors in gene therapy and gene vaccine applications", Natl Conf Hum Retroviruses Relat Infect (2ª), 29 de enero- 2 de febrero (1995); 91.

Poeschia, E. M., Wong-Staal, F. & Looney, D. J., "Efficient transduction of nondividing human cells by feline immunodeficiency virus lentiviral vectors, "Nature Med. 4: 354-357 (1998)

Qiu, J. T., R. Song, M. Dettenhofer, C. Tian, T. August, B. K. Felber, G.N. Pavlakis y X. F. Yu, "Evaluation of novel human immunodeficiency virus type 1 Gag DNA vaccines for protein expression in mammalian cells and induction of immune responses", J Virol. 73: 9145-52 (nov. de 1999)

Reynolds, P. N. y Curiel, D. T., "Viral vectors show promise in Colorado", Nature Biotechnology 16: 422-423 (1998)

Schneider, R., Campbell, M., Nasioulas, G., Felber, B. K., y Pavlakis, G. N., Inactivation of the human immunodeficiency virus type 1 inhibitory elements allows Rev-independent expression of Gag and Gag/protease and particle formation´´, J. Virol. 71: 4892-4903 (1997)

Schwartz, S., M. Campbell, G. Nasioulas, J. Harrison, B. K. Felber y G. N. Pavlakis, "Mutational inactivation of an inhibitory sequence in human immunodeficiency virus type-1 results in Rev-independent gag expression", J. Virol. 66: 7176-7182 (1992)

Shiver, J. W., Yasutomi, Y., Free, D. C., Davies, M.-E., Perry, H. C., Pavlakis, G. N., Letvin, N. L., y Liu, M. A., "DNA Vaccine-Mediated Cellular Immunity Against HIV-1 gag and env", presentada en la Conference on Advances in AIDS Vaccine Development: 8º Annual Meeting of the National Cooperative Vaccine Development Groups for AIDS (NCVDGs) el 11-15 de febrero de 1996.

Soneoka, Y., Cannon, P. M., Ransdale, E. E., Griffiths, J. C., Romano, G., Kingsman, S. M. y Kingsman, A. J., "A transient three-plasmid expression system for the production of high titer retroviral vectors",Nuc. Acids Res. 23: 628-633 (1995).

Srinivasakumar, N., Chazal, N., Helga-Maria, C, Prasad, S., Hammarskjold, M.-L, y Rekosh, D., "The Effect of Viral Regulatory Protein Expression on Gene Delivery by Human Immunodeficiency Virus Type 1 Vectors Produced in Stable Packaging Cell Lines", J. Virol., 71: 5841-5848 (1997)

Sutton, R. E., Wu, H. T., Rigg, R., Bohnlein, E. & Brown, P. O., "Human immunodeficiency virus type 1 vectors efficiently transduce human hematopoietic stem cells", J. Virol. 72, 5781-5788 (1998)

Tabernero, C, A. S. Zolotukhin, J. Bear, R. Schneider, G. Karsenty y B. K. Felber, "Identification of an RNA sequence within an intracisternal-A particle element able to replace Rev-mediated posttranscriptional regulation of human immunodeficiency virus type 1", J Virol. 71: 95-101 (1997) (véase también mi mensaje de correo electrónico)

Takahashi, M.; Miyoshi, H.; Verma, I. M.; Gage, F. H., "Rescue from photoreceptor degeneration in the rd mouse by human immunodeficiency virus vector-mediated gene transfer", J. Virol. 73: 7812-7816 (sep. 1999)

Uchida, N., Sutton, R. E., Friera, A. M., He, D., Reitsma, M. J., Chang, W. C., Veres, G., Scollay, R. & Weissman, I. L., "HIV, but not murine leukemia virus, vectors mediate high efficiency gene transfer into freshly isolated G0/G1 human hematopoietic stem cells", Proc. Natl Acad. Sci. USA. 95, 11939-11944 (1998)

Valentin, A., W. Lu, M. Rosati, R. Schneider, J. Albert, A. Karlsson y G. N. Pavlakis. "Dual effect of interleukin 4 on HIV-1 expression: Implications for viral phenotypic switch and disease progression", Proc. Natl Acad. Sci. USA. 95: 8886-91 (1998)

White, S. M., Renda, M, Nam, N-Y, Klimatcheva, E., Hu, Y, Fisk, J, Halterman, M, Rimel, B. J., Federoff, H, Pandya, S., Rosenblatt, J. D. y Planelles, V, "Lentivirus vectors using human and simian immunodeficiency virus elements"J. Virol. 73: 2832-2840 (abr. 1999)

Wolff, J. A. y Trubetskoy, V. S., "The Cambrian period of nonviral gene delivery", Nature Biotechnology 16: 421-422 (1998)

Zolotukhin, J., Valentin, A., Pavlakis, G. N. y Felber, B. K. "Continuous propagation of RRE(-) and Rev(-)RRE(-) human immunodeficiency virus type 1 molecular clones containing a cis-acting element of Simian retrovirus type 1 in human peripheral blood lymphocytes", J. Virol. 68: 7944-7952 (1994)

Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L. y Trono, D., "Multiply Attenuated Lentiviral Vector Achieves Efficient Gene-Delivery In Vivo", Nature Biotechnology 15: 871-875 (1997)

Zufferey, R., Dull, T., Mandel, R.J., Bukovsky, A., Quiroz, D., Naldini, L. & Trono, D., "Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery", J. Virol. 72: 9873-9880 (1998)

Claims

1. Un sistema de expresión lentiviral que es capaz de funcionar en ausencia de Rev, Tat y cualquier elemento de transporte de ARN vírico que comprende lo siguiente:

(a) un vector de empaquetamiento que contiene un gen gag/pol de VIH-1 que se ha mutado para eliminar las regiones inhibidoras/de inestabilidad;

(b) un vector de transferencia; y

(c) un vector que codifica envuelta.

2. Un sistema de expresión lentiviral de la reivindicación 1, en el que el gen gag/pol de VIH-1 tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1.

3. Un sistema de expresión lentiviral de la reivindicación 1 ó 2, en el que el vector de empaquetamiento comprende un promotor de CMV que controla la expresión del gen gag/pol.

4. Una célula hospedadora transformada que comprende el sistema de expresión lentiviral de la reivindicación 1, 2 ó 3.

5. Una célula hospedadora transformada de la reivindicación 4, en la que dicha célula es un eucariota.

6. La célula hospedadora de la reivindicación 5, en el que dicha célula es una célula humana.

7. Un proceso para preparar una partícula lentiviral en ausencia de Rev, Tat o cualquier elemento de transporte de ARN vírico que comprende expresar Gag de VIH y Pol de VIH en una célula hospedadora de un gen gag/pol de VIH-1 que se ha mutado para eliminar regiones inhibidoras/de inestabilidad y expresar una proteína de envuelta de un gen que codifica envuelta cuya expresión es independiente de Rev, Tat o cualquier elemento de transporte de ARN vírico.

8. Un proceso para preparar una partícula lentiviral que comprende expresar Gag de VIH y Pol de VIH en una célula hospedadora de un vector que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican Gag de VIH y Pol de VIH que corresponden a la Sec ID Nº 1 en presencia de un gen que codifica una proteína de envuelta.

9. Un sistema de expresión lentiviral que es independiente de Rev y Tat que comprende lo siguiente:

(a) un vector de empaquetamiento que comprende un gen gag/pol de VIH o un gen gag de VIH y gen pol de VIH, que se ha mutado para eliminar regiones inhibidoras/de inestabilidad, en el que el vector de empaquetamiento es capaz de producir Gag y Pol de VIH en ausencia de cualquier Elemento Transportador de ARN;

(b) un vector de transferencia; y

(c) un vector que codifica envuelta.

10. Un sistema de expresión lentiviral de la reivindicación 9, en el que el vector de empaquetamiento comprende un promotor de CMV que controla la expresión de los genes gag/pol, o gag y pol.