JP4627950B2 - 変異HIVgag/pol、SIVgagおよびSIVenv遺伝子を持つ分子クローン - Google Patents
変異HIVgag/pol、SIVgagおよびSIVenv遺伝子を持つ分子クローン Download PDFInfo
- Publication number
- JP4627950B2 JP4627950B2 JP2001546906A JP2001546906A JP4627950B2 JP 4627950 B2 JP4627950 B2 JP 4627950B2 JP 2001546906 A JP2001546906 A JP 2001546906A JP 2001546906 A JP2001546906 A JP 2001546906A JP 4627950 B2 JP4627950 B2 JP 4627950B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gag
- hiv
- gene
- vector
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims abstract description 53
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 34
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 34
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 212
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 175
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 158
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 74
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 68
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 58
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 36
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 claims description 25
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 claims description 23
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 claims description 22
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 20
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 claims description 18
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 claims description 15
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 11
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 claims 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 17
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 14
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 abstract description 8
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 22
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 20
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 20
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 18
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 17
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 16
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 15
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 15
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 14
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 11
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 239000000306 component Substances 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 7
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 4
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 101710149136 Protein Vpr Proteins 0.000 description 4
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 4
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 description 3
- 101710201961 Virion infectivity factor Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101100082606 Plasmodium falciparum (isolate 3D7) PDEbeta gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 210000000608 photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 2
- 108010089520 pol Gene Products Proteins 0.000 description 2
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 108700001624 vesicular stomatitis virus G Proteins 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 108700026215 vpr Genes Proteins 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 208000012124 AIDS-related disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 241000713704 Bovine immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000014249 Classic phenylketonuria Diseases 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 description 1
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 108700023863 Gene Components Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 229940033332 HIV-1 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000650854 Homo sapiens Small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing protein alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010070875 Human Immunodeficiency Virus tat Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 108700020121 Human Immunodeficiency Virus-1 rev Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 208000000563 Hyperlipoproteinemia Type II Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N L-Histidinol Natural products OCC(N)CC1=CN=CN1 ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N L-histidinol Chemical compound OC[C@@H](N)CC1=CNC=N1 ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 208000002678 Mucopolysaccharidoses Diseases 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 101150010237 PDEbeta gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 description 1
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 1
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 206010045261 Type IIa hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 210000003489 abdominal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 201000009628 adenosine deaminase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 229940038444 antibody-based vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000036556 autosomal recessive T cell-negative B cell-negative NK cell-negative due to adenosine deaminase deficiency severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003986 cell retinal photoreceptor Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000008358 core component Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 201000001386 familial hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004980 monocyte derived macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 206010028093 mucopolysaccharidosis Diseases 0.000 description 1
- 208000025919 mucopolysaccharidosis type 7 Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 108700004028 nef Genes Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 230000010411 postconditioning Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 108010030416 proteoliposomes Proteins 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001116 retinal neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000000880 retinal rod photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 108700004030 rev Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098213 rev gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000028597 toxin metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 101150024249 vpr gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026222 vpu Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
技術分野
本発明は、いずれかのSIVまたはHIV制御因子に非依存的に発現されることが可能な、変異HIV-1 gag/polおよびSIV gag遺伝子配列を含む核酸に関する。本発明はまた、いずれかのSIVまたはHIV制御因子に非依存的に発現されることが可能な、変異SIV env遺伝子配列を含む核酸にも関する。本発明の好ましい核酸は、感染性ウイルス粒子を産生することが可能である。
本発明はまた、変異HIV-1 gag、HIV-1 polおよび/またはSIV gag遺伝子配列を含む、ベクター、ベクター系および宿主細胞にも関する。本発明はまた、これらの核酸および/またはベクターまたはベクター系を含む、宿主細胞にも関する。本発明はまた、遺伝子治療に、またはワクチンとして使用するための、これらの核酸、ベクター、ベクター系および/または宿主細胞の使用にも関する。
背景
最近まで、遺伝子治療プロトコルは、しばしば、ネズミ白血病ウイルス(MLV)などのレトロウイルス由来のベクターに頼ってきた。これらのベクターは、形質導入する遺伝子が、標的細胞のゲノムに組み込まれ、それが長期間発現するために望ましい特徴であるため、有用である。しかし、これらのレトロウイルスベクターは、分裂性細胞にのみ形質導入することが可能であり、これは、肝細胞、筋線維、造血幹細胞、およびニューロンなどの非増殖性細胞におけるin vivo遺伝子トランスファーのための使用を制限する。
【0002】
レンチウイルスは、分裂性および非分裂性細胞両方を感染させることが可能なレトロウイルス種である。これらは、動物モデルにおいて、多様な非分裂性細胞(例えば、ニューロンおよびマクロファージ)で、長期間遺伝子発現(6ヶ月まで)を提供するのに非常に効率的であることが立証されている。例えば、Amadoら(Science 285: 674-676(1999年7月))を参照されたい。最適遺伝子トランスファー系は、非増殖性細胞のゲノムに組み込まれることが可能な、HIV、または他のレンチウイルスに基づくベクターを含むであろうことが提唱されてきている。レトロウイルスは、標的細胞ゲノムに組み込まれるため、反復形質導入は不要である。したがって、in vivo遺伝子輸送が可能なアデノウイルスベクターと対照的に、注入ウイルス抗原に対する体液性反応に関連する問題を避けることが可能である。例えばNaldiniら(Science, 272: 263-267(1996), p. 263)を参照されたい。
【0003】
HIVおよび他のレンチウイルスは、必須構造遺伝子(env、gag、およびpol)に加え、制御遺伝子(tatおよびrev)およびアクセサリー遺伝子(vpr、vif、vpu、およびnef)を含む、複雑なゲノムを有する。HIVは、ヒト細胞に効率的に感染し、そしてその遺伝子を発現するよう進化してきており、そしてその組込み前複合体が、標的細胞の核の無傷な膜を横切ることが可能であるため、マクロファージなどの非分裂性細胞を感染させることが可能である。この複合体は、ウイルスDNAに加え、酵素インテグラーゼ、vpr遺伝子の産物、およびマトリックスと称されるgag遺伝子にコードされるタンパク質を含む。マトリックスタンパク質は、組込み前複合体が、核内に通過し、宿主DNAにアクセスするのを可能にする。レンチウイルスは、真に静止した細胞(G0状態の細胞)に効率的に形質導入できない。しかし、ネズミレトロウイルスベクターと異なり、HIVに基づくベクターは、分裂性細胞を感染させることが可能なのに加え、造血幹細胞などの非分裂性細胞において、そしてニューロン、網膜光受容器、筋肉、および肝細胞などの最終分化細胞において、療法遺伝子の有効でそして持続的な形質導入および発現を達成することが可能である。例えばAmadoら(1999年7月)およびKlimatchevaら(Frontiers in Bioscience 4: d481-496(1999年6月))、およびそれらに引用される参考文献を参照されたい。
【0004】
レンチウイルスベクターは、効率的な遺伝子輸送ビヒクルでありうるが、その起源のため、安全性の懸念がある。したがって、この分野では、複製適格(competent)レンチウイルス(RCL)の発生を防ぐため、内蔵の安全性特徴を持つベクターおよび産生系の開発に注意が向けられてきている。例えば、ほとんどの実験室適用において、レンチウイルスベクターは、一般的に、一過性の系で生成され、この系では、細胞株を3つの別個の構築物:パッケージング構築物、トランスファー構築物、およびエンベロープコード構築物でトランスフェクションする。パッケージング構築物は、ベクターパッケージングに必要な要素(envを除く)およびベクター粒子を生成するのに必要な酵素を含む。トランスファー構築物は、ベクターが標的細胞を感染させるのに必要な、そして療法(またはレポーター)遺伝子のトランスファーに必要な、遺伝子シス作用配列を含む。レンチウイルスenv遺伝子は、一般的に、パッケージング構築物から削除され、そしてその代わり、第三のベクター、「envコードベクター」に、異なるウイルスのエンベロープ遺伝子が供給されるが、ベクターがCD4+ T細胞を感染させることが意図されるのが望ましい場合、レンチウイルスenv遺伝子を用いることも可能である。一般的に用いられるエンベロープ遺伝子は、非常に多様な細胞を感染させることが可能であり、そしてさらに、粒子に安定性を与え、そしてベクターが濃縮されて高力価になることを可能にする、水疱性口内炎ウイルスのG糖タンパク質(VSV-G)をコードするものである(例えばNaldiniら(Science 272: 263-267(1996))およびAkkinaら(J. Virol. 70: 2581(1996))を参照されたい)。3つの別個の構築物を使用することおよびそれらの間の重複配列が存在しないことは、レンチウイルス(トランスファー)ベクター産生中の組換えの可能性を最小限にする。さらに、レンチウイルス(トランスファー)ベクター自体によって、ウイルスタンパク質はまったく発現されないため、これらのベクターは、動物モデルにおいて、ベクターを発現している細胞に対する有効な免疫反応(アデノウイルスに基づくベクターに独特の問題)をまったく誘発しない。例えばAmadoら(Science 285: 674-676(1999年7月))および該文献に引用される参考文献を参照されたい。Naldiniら(Science 272: 263-267(1996))もまた参照されたい。
【0005】
初期のパッケージングプラスミドは、envを除く大部分のHIV遺伝子を含んだ。安全性を改善する努力の中で、続くHIVベクターが産生され、このベクターでは、パッケージングプラスミドはすべてのアクセサリー遺伝子を欠いていた。この方法は、効率的なベクター産生を干渉せず、そして潜在的なRCLが、ヒトにおけるHIVの効率的な複製に必要なアクセサリー遺伝子を欠いているため、系の安全性を有意に増加させる。これらのベクターは、in vivoで、増殖抑止細胞株およびニューロンに形質導入することが可能であるが、マクロファージには効率的に形質導入しないことが報告されている。アクセサリー遺伝子vprは、これらのHIVベクターを用いて、これらの細胞をHIVに感染させるのに必要であると考えられている。Zuffereyら(Nature Biotechnol. 15: 871-875(1997))を参照されたい。対照的に、本明細書において後で論じられるように、HIVに基づく本発明のレンチウイルスベクターは、ヒトマクロファージおよび試験した他の細胞を感染させるのを可能にするために、いずれかのHIVアクセサリー遺伝子も必要としない。
【0006】
肝細胞の効率的な形質導入のためのvprまたはvifの必要性もまた、報告されている。例えばKafriら(Nature Genet. 17: 314(1997))を参照されたい。これらの結果は、効率的なレンチウイルス仲介遺伝子トランスファーのためのアクセサリー遺伝子の必要性が、標的として選択された細胞の種類に応じることを示し、レンチウイルスベクターの将来の適用は、必要に応じ、異なるアクセサリー遺伝子を含むベクター構築物を伴う可能性があることを示唆する。
【0007】
Zuffreyら(1997)は、病原性遺伝子、env、vif、vpr、vpu、およびnefが欠失した、HIVベクター系を記載する。この多重弱毒ベクターは、培養中の増殖抑止細胞および単球由来マクロファージに形質導入する能力を維持し、そして成人ニューロン中に、in vivoで遺伝子を効率的に輸送することが可能であった。Zuffereyら(1997)およびNaldiniら(1996)に記載されるパッケージングプラスミドは、GagおよびPolに加え、RevおよびTatをコードする。
【0008】
制御遺伝子tatの非存在下で、ビリオンにパッケージングされるように操作されたレンチウイルスもまた、記載されてきている。例えば、Kimら(J. Virol. 72: 811-816(1998))およびMiyoshiら(J. Virol. 72: 8150-8157(1998))を参照されたい。これらのベクターにおいて、tat遺伝子は、パッケージングプラスミドから除去されている。Kimらは、連続5' LTRプロモーターが、強い構成的プロモーターに置き換えられている限り、tatは必要でないと述べている。これはまた、HIV療法のため、他の利点も有する。構成的HCMVプロモーターでHIV-1 LTRを置き換えると、ベクター産生に影響を与えないであろうため、療法剤としてのTatトランスドミナント変異体またはTat活性化反応要素デコイなどの抗Tat分子の使用が可能になる(p. 814、第2欄を参照されたい)。tat遺伝子の除去は、ありうるRCLに貢献する可能性がある必須病原性因子を除去する。Kimら(1998)は、tat、vif、vpr、vpuおよびnefを含まないベクター系を記載する。好ましいベクター系には、rev遺伝子が含まれ、著者らは、「RREと共に、この系において、効率的なRNA取り扱いのため必要である」と述べている(p. 811、第2欄)。しかし、Kimらはまた、CTEを用いたRev非依存的構築物も構築した。Kimらは、rev/RRE構成要素は、Mason-Pfizerサルウイルス(MPMV)構成的輸送要素(CTE)などの配列を用いることによって除去し、それにより、すべてのアクセサリータンパク質を除去することが可能であるが、これは力価の有意な減少につながると述べている。
【0009】
Srinivasakumarら(J. Virol. 71: 5841-5848(1997))は、Rev依存的またはRev非依存的方式いずれかで、高レベルのHIV-1構造タンパク質を構成的に発現する安定HIV-1パッケージング細胞株を生成することを記載する。これらの細胞株を用いて、ハイグロマイシンB耐性遺伝子を発現しているHIV-1ベクターを用いることによって、遺伝子トランスファーを評価し、そしてベクター力価に対する、Rev、Tat、およびNefの影響を研究した。Rev非依存的細胞株は、MPMV CTEを含むgag-polおよびenv発現ベクターを用いることによって、生成した。この論文は、とりわけ、4つのプラスミド:HIV-1構造遺伝子発現のためにRev同時発現を必要とする、CMV gagpol-RREおよびpCMVenv、並びに前記同時発現を必要としない、pCMV gagpol-CTEおよびpCMVenv-CTEの構築を記載する。Rev含有およびRev非依存的パッケージング細胞株を生成するため、CMT3細胞に、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いて、Gag、Gag-Pol、およびEnvを発現するベクターをトランスフェクションした。
【0010】
MPMV CTEを含むHIVベクター(pTR167-CTE)およびRev非依存的方式で、HIV構造タンパク質を発現するパッケージング細胞株を生成することによって、著者らは、完全にRevなしで機能するHIVベクター系を得ることが可能であった。この系から得られるベクターの力価は、Revを含む平行系から得られるものと、本質的に同一であった。著者らは、この文脈において、CTEは、以前に、Rev依存的構築物を用いた一過性発現アッセイで観察されたものと同様に、完全にRev-RRE機能の代理となるようであると述べている。これは、数周期のHIV複製を測定した場合の状況と対照的である。こうした場合、CTE含有ウイルス由来の力価は、常に、RevおよびRREを利用したウイルスに比較し、少なくとも1対数単位、減少した(Srinivasakumarら、p. 5847を参照されたい)。
【0011】
著者らは、Revの非存在下で働くHIVベクター系を有する利点は、Rev機能に対する細胞内免疫のための輸送ビヒクルとして、このベクターを用いる可能性が開かれることだと述べる。Rev M10またはRREデコイなどの、HIV複製に劇的な阻害効果を持つRevアンタゴニストをコードする遺伝子を、HIVベクターに導入し、そして通常、HIVに感染可能である細胞に入れることが可能である。「抗Rev」遺伝子の発現は、HIV感染を低下させると期待されるであろう。残ったいずれかのHIV複製も、ベクターLTRの活性化(tatによる)を導き、そして感染性ウイルスに由来するタンパク質によってパッケージングされるであろう、ベクター由来RNAを生成するはずである。このシナリオでは、野生型ウイルスは、以前に免疫されていない細胞に、ベクター粒子を伝播させることが可能なヘルパーとして作用するであろう。さらなるベクター伝播のため、この種のスキームは、伝統的なレトロウイルスベクターに基づくものより、in vivoでHIV感染を調節するのにより有効であるであろう。著者らは、モデル系において、このアプローチを現在試験していると述べている(Srinivasakumarら、p. 5847を参照されたい)。
【0012】
安全な系の追求における別の発展は、いわゆる自己不活性化(SIN)ベクターである。例えば、Yuら(Proc Natl Acad Sci USA 83: 3194-8(1986))およびMiyoshiら(J. Virol. 72: 8150(1998))を参照されたい。Yuらの論文において、レトロウイルス由来ベクター、SINベクターは、哺乳動物細胞に全遺伝子を形質導入するため、設計された。YuらのSINベクターは、3'長末端反復配列(LTR)中の299塩基対の欠失を含み、この欠失は、エンハンサーおよびプロモーター機能をコードする配列を含む。こうしたベクター由来のウイルスを用いてNIH 3T3細胞を感染させる際、欠失は、5’LTRに移動し、感染細胞において、プロウイルスの転写不活性化を生じる。SINベクターを介した、細胞へのハイブリッド遺伝子(ヒトメタロチオネイン促進c-fos)の導入は、再編成と関連せず、そしてある場合ではカドミウムによって誘導される、真のmRNA転写物の形成を導く。Miyoshiらに記載されるベクターもまた、欠失3'(下流)LTRを含む。上流LTR内の配列は、その下でウイルスゲノムが発現するプロモーターとして働く。下流LTRに導入された欠失は、逆転写中、上流LTRに移動する。この欠失はLTRプロモーターを不活性化し、そしてベクターRNAの産生を除去する。トランスファーされる遺伝子(または遺伝子類)(例えばレポーターまたは療法遺伝子)は、レンチウイルスベクターに挿入される外因性ウイルスプロモーターまたは細胞プロモーターから発現される。SINベクターの重要な安全性の特徴は、LTRのプロモーター活性の不活性化が、宿主ゲノムへの(トランスファーベクターの)挿入変異誘発の可能性を減少させることである。さらに、(トランスファー)ベクターRNAの発現が排除されるため、標的細胞におけるRCL産生の可能性は、さらに最小になる。SINベクターは、哺乳動物細胞における遺伝子の制御された発現を研究するため設計された遺伝子トランスファー実験で、特に有用であるはずである。組み込まれたプロウイルスの両LTRにエンハンサーおよびプロモーター配列が欠けていることもまた、細胞オンコジーンを活性化する可能性を最小にするはずであり、そしてヒト遺伝子治療で用いられるべき、より安全な代替法を提供する可能性がある。安全性および特異性を増進する他の修飾には、一時的にあるいは組織または細胞特異性を持って、遺伝子発現を制御する、特定の内部プロモーターの使用を含む。
【0013】
ヒト研究において、安全性を改善する他の戦略は、サル免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、またはウマ感染性貧血ウイルスなどの非ヒトレンチウイルスを使用することであろう。これらのうち、ネコ免疫不全ウイルス由来のベクターは、非分裂ヒト細胞に効率的に形質導入するように、操作されてきている。例えばPoeschlaら(Nature Med. 4: 354-357(1998))およびWO 99/15641を参照されたい。さらに、Whiteら(J. Virol. 73: 2832-2840(1999年4月))は、パッケージング構築物およびトランスファー構築物間の組換えの見込みを減少させることによって安全性を改善する試みの中で、ヒトおよびサル免疫不全ウイルス要素を用いたレンチウイルスベクターを記載する。
【0014】
効率的なパッケージング株の開発は、VSV-GエンベロープおよびいくつかのHIVタンパク質の発現が、細胞に毒性であるため、困難であることが立証されている。最近、パッケージング遺伝子およびVSV-Gの発現、およびしたがってベクターの産生を、随意に行わせることが可能であるように、プロデューサー株が設計されてきている。Kafriら(J. Virol. 73-576-584(1999))。この細胞株は、毒性遺伝子の発現を停止した際、スケールアップしたベクター産生のため、拡大することが可能である。この細胞株は、RCLを生成することなく、高力価ベクターを産生する。HIVベクターで形質導入された造血幹細胞を、Donahueら(Blood 92(suppl. 1), 要旨4648.5(1988))に記載されるように、アカゲザル(rhesus macaque)に移植し、少なくとも14ヶ月追跡調査した。その時点で、方法は安全であることが立証され;研究中のすべての動物は、循環HIVまたはベクターの証拠もなく、健康なままであった。Amadoら(Science 285: 674-676(1999年7月))を参照されたい。
【0015】
多くの遺伝子治療プロトコルが、造血幹細胞を用いて、遺伝されるいくつかの代謝、感染性、または悪性疾患を正すために設計されてきている。この細胞は、自己再生し、そして血液および免疫系の成熟細胞すべてに分化する能力を有する。これらの系に影響を与える多くの疾患は、幹細胞に療法遺伝子を安定導入することによって、治療することが可能である可能性がある。最近、レンチウイルスベクターは、非常に原始的なヒト幹細胞への効率的な遺伝子トランスファーを仲介することによって、多くの造血細胞系譜を持つSCIDマウス骨髄の安定な長期再構築に貢献する、ex vivo幹細胞刺激(ネズミレトロウイルスベクターを用いる際に必要である)の必要性をバイパスすることが示された。例えばMiyoshiら(Science 283: 682(1992))を参照されたい。同様に、レンチウイルス形質導入幹細胞を用いた自家移植のアカゲザルモデルにおいて、多細胞系譜遺伝子発現が見られ、通常、ネズミレトロウイルスでの形質導入に不十分である最小幹細胞刺激の条件下で、初期血液細胞前駆細胞が形質導入されることが示唆された。Donahueら(Blood 92(suppl. 1), 要旨4648.5(1999))およびAmadoら(Science 285: 674-676(1999年7月))を参照されたい。
【0016】
HIV感染において、HIVに対して設計されたレンチウイルスベクターの別の利点は、ウイルスがベクターのパッケージングに必要な要素をすべて供給するため、感染患者において、HIVに動態化される可能性があることである。これらの動態化ベクターがHIVエンベロープを含む場合、これらは、その遺伝子(例えばHIVに対する耐性を与えるように、あつらえて設計した遺伝子)を、効率的にCD4+ T細胞にトランスファーし、該T細胞をその後のHIV感染から保護することが可能である。レンチウイルスベクターはまた、HIVに感染したCD4+ T細胞においてのみ、その遺伝子を効率的に発現するように、設計することも可能である(いわゆるtat誘導性ベクター)。これらのベクターにおいて、tatおよびrevを含むすべてのHIV遺伝子は除去され;組込み、発現、およびパッケージングに必要なシス作用配列が保持され、そして発現は、(Tatによる活性化を必要とする)HIV LTRの活性に依存する。この系において、ベクター発現は、HIV感染に際して効率的に誘導されることが示されてきている。さらに、HIVに対する耐性を与える遺伝子の非存在下で、許容細胞株におけるこのベクターの安定組込みは、HIV複製の阻害を生じた。HIV阻害の機構は、完全には解明されていないが、予備的な結果は、このベクターが、逆転写のレベルで、HIVと競合することを示唆する。Anら(J. Virol., 印刷中)、およびAmadoら(Science 285: 674-676(1999))を参照されたい。
【0017】
静止細胞の遺伝子成分の修飾が、疾患過程の防止または逆転を生じる可能性がある、いくつかの他の潜在的な医学的適用が、探求され始めている。例えば、レンチウイルスベクターが、ラットおよびマウス網膜へのベクターの直接注入によって、安定でそして長期の遺伝子トランスファーを仲介することが可能であるという知見が、網膜色素変性症の治療のための遺伝子治療の概念を支持してきている。網膜のこの変性疾患は、盲目への緩慢な進行を生じる、光受容器細胞死によって特徴付けられる。桿体光受容器のcGMPホスホジエステラーゼβサブユニット(PDEβ)遺伝子における変異は、ヒトにおいて、そしてこの疾患のrdマウスモデルにおいて、網膜色素変性症の常染色体劣性型を導く。先の研究は、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス仲介PDEP網膜下遺伝子トランスファーが光受容器細胞死の遅延を生じることを示している。最近の研究は、rdマウスモデルを用いて、ネズミPDEβ遺伝子を含むレンチウイルスベクターを注入した目の50%までで、光受容器を救出することが可能であることを立証した。アデノウイルスベクターで以前得られた短期発現と対照的に、この研究におけるPDEβ発現は、少なくとも24週間持続した。この知見は、現在、有効な治療を欠く疾患における遺伝子治療の潜在的な成功に注意を向けさせる。Takahashiら(J. Virol., 73: 7812-7816(1999年9月))およびAmadoら(Science, 285: 674-676(1999))を参照されたい。
【0018】
天然では、HIV-1のgag、pol、およびenvの発現は、ウイルスRevタンパク質の存在に依存する。この依存は、少なくとも部分的に、スプライシングされないmRNAおよび部分的にスプライシングされたmRNA内に位置する、負に作用する配列(阻害または不安定性要素(INS))の存在のためである。これらのmRNAにおけるRevとRev応答配列(RRE)の陽性相互作用は、阻害配列の負の影響を打ち消す。
【0019】
上述の参考文献のいずれも、その発現をRev非依存的にするように、阻害/不安定性領域が変異されている、gagおよび/またはpol遺伝子で、該文献に記載されるgagおよび/またはpol遺伝子を置き換えることが可能であることを解説も示唆もしない。さらに、本明細書に記載される特定のHIV-1 gag/polまたはSIV gag変異遺伝子の開示はない。
【0020】
本発明のgag/polクローンは、米国特許出願第07/858,747号、1992年3月27日提出、(発明者、G. PavlakisおよびB. Felber)表題「mRNAから阻害/不安定性領域を除去する方法」に最初に記載され、そして後に、1993年3月29日、PCT出願PCT/US93/02908として提出された同時係属(「CIP」)出願、並びに米国特許第5,972,596号および第5,965,726号に記載されたように、遺伝子から阻害/不安定性領域を除去する方法を用いて、作成した。CIP適用の開示は、1993年10月14日、国際公報第WO 93/20212号として公表された(これらの特許および特許出願の開示は、その全体が、特に本明細書に援用される)。この方法はまた、Schwartzら(J. Virol. 66: 7176-7182(1992))にも記載される。
【0021】
Schneiderら(J. Virol. 71: 4892-4903(1997))は、gag、プロテアーゼおよびpol遺伝子内のさらなるINSを同定しそして性質決定して、そして同様の方式で変異させることによって、特許出願およびSchwartzらに記載される研究を拡大する。Schneiderらは、完全に変異されたHIV-1 gag遺伝子を含むが、部分的にしか変異されていないHIV-1 pol遺伝子を含む、核酸構築物を開示する。
【0022】
Schneiderらは、損なわれていないまたはほぼ損なわれていないp55gag領域を含む発現ベクターが、他のいずれかのHIVタンパク質の非存在下で、哺乳動物細胞において、未成熟ウイルス粒子の産生を可能にすることを立証する。プロテアーゼ領域におけるさらなる変異の導入は、Gag/プロテアーゼの効率的な産生を可能にし、これは、Pr55gag前駆体のプロセシングおよびレンチウイルス様円錐形コア構造を持つ成熟Gag粒子の産生を生じた。
【0023】
Schneiderらは、Rev非依存的発現ベクターが、これらのRNAの効率的なRev-RRE依存救出を支持することが不能な多くの細胞株において、Gagタンパク質の効率的な発現を可能にすることを開示する。Schneiderらはまた、gag/pol領域が、env領域よりも保存されているため、gag/pol発現ベクターが、HIV-1に対するワクチン接種アプローチに重要である可能性があり、そしてHIVに対する有効な免疫反応および感染に対する保護に重要である可能性があることも開示する。彼らはまた、HIVおよび他のレンチウイルスが静止細胞を感染させることが可能であるため、多くの細胞における効率的なHIV遺伝子発現はまた、非分裂性細胞またはゆっくり分裂する細胞においてレンチウイルスベクターを用いる、可能な遺伝子トランスファー実験のためにも興味深いとも述べている。
【0024】
Pavlakisら(Natl Conf Hum Retroviruses Relat Infect(第2版)(1995), 91)は、Rev非依存的Gag発現ベクターが、ヒトおよびマウス細胞において、いずれかの他のHIVタンパク質の非存在下で、ウイルス粒子を生じることが可能であり、そしてpol領域中のさらなる変異が、プロテアーゼの発現およびp55 gag前駆体のプロセシングを可能にしたと述べる。マウス筋肉中のTATおよびRev非依存的Gag発現ベクターの直接DNA注入は、ELISAおよび抗gag抗体反応によって検出されるGag発現を生じた。いくつかのRevおよびTat非依存的Gag発現カセットを、レトロウイルスベクターに挿入し、そしてHIV-1のドミナントネガティブ阻害剤であるGagまたはGag断片を発現する細胞株を構築した。
【0025】
Shiverら(1996)は、HIV-1 gag(p55 gag)またはenv(gp120またはgp160)をコードする変異遺伝子いずれかをコードする変異プラスミドDNAを用いた、マウスおよび非ヒト霊長類のDNAワクチン接種の結果を記載する。gagおよびenvワクチンレシピエントは共に、抗原特異的細胞傷害性およびヘルパーTリンパ球(CTL、Th)反応を示した。結果は、DNAワクチンが、マウスおよび非ヒト霊長類両方で、リンパ腺中に汎発する、長期生存T細胞反応を引き出したことを立証したと述べられている。
【0026】
発明の概要
本発明は、図1に示される変異HIV-1 gag/pol遺伝子の核酸配列(SEQUENCE ID NO: 1)を含む核酸、並びにこれらの核酸を含むベクターおよびベクター系に関する。
【0027】
本発明はまた、図3に示される変異SIV gag遺伝子の核酸配列を含む核酸、並びにこれらの核酸を含むベクターおよびベクター系にも関する。
本発明はまた、図17に示される変異SIV env遺伝子を含む核酸、並びにこれらの核酸を含むベクターおよびベクター系にも関する。
【0028】
本発明はまた、核酸により産生される産物、例えばmRNA、タンパク質、および感染性ウイルス粒子にも関する。
本発明はまた、これらの核酸および/またはその発現産物を含む組成物にも関する。
【0029】
本発明はまた、これらの核酸、ベクター系またはウイルス粒子を含む宿主細胞にも関する。
本発明はまた、これらの核酸、ベクター系、宿主細胞、発現産物および/または組成物を使用して、mRNA、タンパク質、および/または感染性ウイルス粒子を産生すること、および/または抗体および/または細胞傷害性またはヘルパーTリンパ球を誘導することにも関する。
【0030】
本発明はまた、好ましくはヒトにおいて、発現後、例えばワクチンとして、免疫療法および免疫予防法で使用するための、または遺伝子治療において使用するための、これらの核酸構築物、ベクター、ベクター系および/または宿主細胞の使用にも関する。本発明の核酸構築物は、レンチウイルスベクターまたは他の発現ベクターを含んでもまたはそれらのベクターに取り込まれていてもよいし、あるいは組織細胞に直接注入し、コードされるタンパク質またはタンパク質断片の効率的な発現を生じてもよい。これらの構築物はまた、例えばin situでの標的遺伝子との相同組換えによって、in vivoまたはin vitro遺伝子置換に用いてもよい。
【0031】
発明を実施する様式
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、どちらも、例示および説明のみのものであり、そして請求されるような本発明の限定ではないことを理解すべきである。本明細書に取り込まれ、そして本明細書の一部を構成する、付随する図は、本発明の態様を例示し、そして説明と共に、本発明の原理を説明するのに役立つ。
【0032】
本発明の1つの側面は、Rev非依存的方式で、HIV-1のGagおよび/またはPolをコードするベクターを含む。本明細書に記載される、こうしたベクターの例は、Rev非依存的方式で、HIV-1の完全GagおよびPolをコードし、そしてまたカナマイシン耐性を与える遺伝子も含む、プラスミドpCMVgagpolBNkanである。このプラスミドはTatおよびRev非依存的であり、そして、遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変することなく、gag/pol mRNAに存在する阻害/不安定性配列を除去することによって、生成した。
【0033】
本発明のgag/polクローンは、阻害/不安定性領域が除去されたHIVのgag/pol領域のDNA構築物である。該構築物は、遺伝子治療に、またはワクチンとして使用するための、新種のレンチウイルスベクターの構成要素として有用であると期待される。
【0034】
本発明のgag、polまたはgag/pol配列は、Revを含むHIVのいずれかの他の制御および構造タンパク質の非存在下で、ヒトおよび他の哺乳動物細胞において、高発現されることが可能である。gag/pol配列を、VSV Gタンパク質またはHIVエンベロープタンパク質などのエンベロープタンパク質をコードする配列と(例えば同一ベクター中でまたは別の発現ベクター中で)組み合わせると、ヒト細胞へのトランスフェクション後、感染性ウイルスが産生される。非HIVエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を、例えばHIV gag/pol遺伝子の存在下で用いる場合、産生されるウイルス粒子は、HIVタンパク質GagおよびPolのみを含むであろう。
【0035】
本明細書に記載されるRev非依存的pCMVgagpolBNkan構築物に例示されるような、本発明のgag、polまたはgag/pol配列に基づくレンチウイルスベクターまたはベクター系を、in vivo(例えば高力価ベクターの非経口接種)またはex vivo(例えば患者細胞のin vitro形質導入後、形質導入された細胞の患者への再注入)で、遺伝子治療に用いることが可能である。これらの方法は、すでに、認可された、異なる遺伝子治療プロトコルに用いられている。
【0036】
本発明のHIV gag/polクローンおよびSIV gagクローンは、本明細書に参考文献として援用される、1992年3月27日出願された米国特許出願第07/858,747号に、そしてまた、関連する米国特許第5,972,596号および第5,965,726号に記載されるように、遺伝子から阻害/不安定性領域を除去する方法を用いて作成した。この方法は、INSの正確な位置の同定またはその機能メカニズムの知識を必要としない。一般的に、変異は、mRNAにコードされるアミノ酸配列が変化しないようなものであるが、変異遺伝子にコードされるタンパク質が、非変異遺伝子にコードされるタンパク質に実質的に類似である、保存的および非保存的アミノ酸置換もまた、想定される。変異遺伝子は、合成(例えば化学合成によって合成されたもの)であっても、半合成(例えばゲノムDNA、cDNA、またはPCR増幅DNAと合成DNAとの組み合わせ)であっても、または組換え的に産生されてもよい。遺伝子はまた、所望により、イントロンを含まなくてもよい。本発明の核酸はまた、望ましい機能(例えばGagまたはPolの抗原性、粒子形成(Gag)または酵素活性(Pol))を保持するこれらの遺伝子のRev非依存的断片も含んでもよいし、またはコードされるタンパク質が、特定の状況で望ましくない機能を喪失するように変異されている、Rev非依存的変異体もまた含んでもよい。後者の場合、例えば、遺伝子を修飾して、逆転写酵素またはインテグラーゼタンパク質の活性部位に(アミノ酸レベルで)変異をコードして、逆転写または組込みを防いでもよい。gag遺伝子のRev非依存的断片は、本明細書に参考文献として援用される、1992年3月27日に出願された米国特許出願第07/858,747号に、そしてまた、関連する米国特許第5,972,596号および第5,965,726号に記載される。
【0037】
in vivoで細胞において、Rev制御タンパク質の非存在下で、HIV GagおよびPolタンパク質を産生することが可能であるのに加え、本発明のHIV gag/polクローンおよびSIV gagクローンはまた、CTEまたはCTE様要素(本明細書において、集合的に、RNA輸送要素(RTE)と称される)などのいずれかの付加的シス作用輸送要素の非存在下で、HIV GagおよびPolタンパク質を産生することも可能である。実験は、SIV gagに対する本発明の変異ベクターが、CTEを付加するものより、はるかに優れていることを示す(Qiuら(J Virol. 73: 9145-52(1999))を参照されたい)。
【0038】
ヒト細胞へのトランスフェクション後、RNAおよびタンパク質産生レベル両方で、これらのベクターにコードされるタンパク質の発現を監視することが可能である。RNAレベルは、当該技術分野に知られる方法、例えばノーザンブロット、S1マッピングまたはPCR法によって、定量化する。タンパク質レベルもまた、当該技術分野に知られる方法、例えばウェスタンブロットまたはELISAまたは蛍光検出法によって、定量化することが可能である。迅速非放射性ELISAプロトコルを用いて、gagタンパク質を検出することが可能である(DUPONTまたはCOULTER gag抗原捕捉アッセイ)。
【0039】
遺伝子治療において、および/またはワクチンとして使用するための、本発明のgag/pol遺伝子に基づく少なくとも3種類のレンチウイルスベクター、すなわち
a)複製周期を持たない(すなわちゼロ複製系)
b)1周期の複製を有する
c)完全複製系を有する
レンチウイルスベクターが想定される。
【0040】
複製周期を持たない系では、gag/pol遺伝子、または別個のgagおよびpol遺伝子、あるいはこれらの遺伝子の断片を、適切な転写単位、例えばCMVプロモーターおよびBGHポリ(A)部位を用いて発現した。これは、ワクチン目的のためのgag/pol単位(あるいはgagまたはpolまたはそれらの断片(類))の発現を可能にするであろう。この発現は、適切な変異(類)、例えばミスセンス変異が導入されていれば、いずれかの機能的なレトロウイルス酵素の産生を伴わずに達成することが可能である。ゼロ複製系では、ウイルスストックが目的の細胞または動物に投与されるであろう。例えば、パッケージングベクターPCMVgagpolBNKan、トランスファー構築物pmBCwCNluciまたはpmBCmCNluci、およびエンベロープ含有ベクターpHCMV-Gを用いた典型的な系でウイルスストックを生成し、そして用いると、ゼロ複製系が得られる。こうした系によって産生されるウイルス粒子は、細胞を感染させることが可能であり、そして逆転写されたトランスファー構築物DNAが核に入るが、ウイルス構造タンパク質のコード領域が存在しないため、ウイルス発現および複製はまったくないであろう(0周期)。細胞をin vivoで同じ3つのDNAでトランスフェクションすると、これらは核に入り、ウイルスタンパク質を発現し、感染性ウイルス粒子を産生し、そして外に出て、そして別の単数または複数の細胞を感染させるであろう(1周期)。3つのプラスミドのin vivo輸送は、より低い発現を生じる可能性があるため、少なくとも2つの異なる態様が想定される。第一の態様では、2つのプラスミド、例えば図5に示されるMV1およびpHCMV-Gなどのエンベロープ発現プラスミドを用いることが可能である。HIV、SIV、または他のレトロウイルス由来の機能するエンベロープをコードする他のプラスミドもまた、用いることが可能である。2つのプラスミドによるトランスフェクションは、新規細胞を感染させ、そしてその細胞に組み込まれることが可能な、感染性ウイルスを生じる(1周期)。感染細胞は、gagpolを生じるが、ウイルス増殖は、envがないため、不可能である。
【0041】
複製1周期の系では、少なくとも2つのさらなる態様が想定される。第一の方法において、遺伝子の組み合わせ、例えばgag/pol遺伝子、envコード遺伝子、および好ましくはレポータータンパク質をコードする遺伝子、あるいは目的の他のポリヌクレオチドまたはタンパク質を、in vivoで、目的の細胞に輸送する。典型的な系に関して、上に論じられたように、in vivoで同じ3つのDNAを用いて細胞をトランスフェクションした場合、これらは核に入り、ウイルスタンパク質を発現し、感染性ウイルス粒子を作成し、放出され、そして別の単数または複数の細胞を感染させるであろう(1周期)。
【0042】
別の態様において、3' LTRに欠失を有し、そして3' LTRプロモーターの代わりに異種プロモーター(例えばCMVプロモーター、または誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーター)を用いた、トランスファーベクターを用いることによって、同じ結果(すなわち複製1周期のみ)を得ることが可能である。3' LTR中の変異は、逆転写および組込みに際して、このLTRを不活性にする。これは、組み込まれたプロウイルスの5' LTRおよび3' LTRがどちらも出発(トランスファー)構築物の3' LTRに由来するためである。(これはレトロウイルスすべての公知の特性であり、そして自己不活性化ベクター(SIN)を作成するのに用いられてきている)。入ってくるLTRプロモーターを不活性化したいと望むいくつかの理由があるが、そのうちの1つは、組み込まれたプロウイルス中の目的の遺伝子発現のため、異なる組織特異的または制御プロモーターを使用することである。SINベクターでは、細胞へのトランスフェクションおよび感染性ウイルスの回収後に、in vitroで作成されたウイルスストックを使用する場合、複製周期はないであろうことに注目されたい。in vivoで、DNAを用いて細胞をトランスフェクションする場合、1周期の複製があるであろう。機能するgag、pol、またはenvがDNA混合物中に含まれない場合、感染はまったくないであろう(すなわち感染性ウイルスは作成されないであろう)。
【0043】
完全複製Rev非依存的系は、まだ構築されてきていないが、Rev非依存的gag/polおよびenv配列を用いて、機能する系を構築することが可能であると期待される。望ましい場合、Revを置き換えて、そして感染性ウイルスを生じることが可能である、CTE要素(例えばZolotukhinら(J. Virol. 68: 944-7952(1994))を参照されたい)などの余分の転写後調節要素が含まれる。完全複製系は、1つの片に、LTR、パッケージングシグナル、gag/pol、スプライシング部位、env、tat、1以上のCTEまたはCTE様要素(最適結果のために望ましい場合)、およびLTRを含むべきである。Tatは、少なくとも非許容細胞において、この構築物で必要であると考えられる。こうした系を図5に示す(構築物MV2)。この系では、目的の細胞または動物(好ましくはヒト)は、その後、増殖するウイルスストックに感染するであろう。CTEまたはCTE様要素(構築物MV2中にRTE(RNA輸送要素)として示される)は、発現を改善することが示されているため、そして多くのレトロウイルスが、転写後調節要素の存在を必要とするため、CTEまたはCTE様要素が望ましい。CTEおよびCTE様要素のいくつかの種類があり、そしてこれらの要素は、Rev-RRE経路と異なる経路を介して働くようである。例えばTaberneroら(J. Virol. 71: 95-101(1997))を参照されたい。また、CTEおよびHIV RRE/Revを置き換えることが可能な、新種の転写後調節要素を記載する、PavlakisおよびNappiのPCT/US99/11082、1999年5月22日提出、1999年12月2日にWO 99/61596として公表(そして本明細書に援用される)を参照されたい。Pavlakis-Nappi要素は、CTEと同じ方式では働かず、そしていずれかの配列または構造相同性も持たない。
【0044】
好ましい態様において、本発明のレンチウイルス系は、以下の3つの構成要素を含む:
1.構造タンパク質(HIV envを除く)およびベクター粒子を生成するのに必要な酵素などの、ベクターパッケージングに必要な要素をコードする核酸配列を含む、パッケージングベクターであって、少なくとも本発明の変異HIVまたはSIV gag/pol遺伝子を含む、前記ベクター;
2.標的細胞を感染させるベクターに必要な、そして目的の療法またはレポーターまたは他の遺伝子(類)のトランスファーに必要な、遺伝子シス作用配列を含む、トランスファーベクターであって、キャプシド形成シグナルおよび目的の遺伝子(類)または目的の遺伝子(類)を挿入するためのクローニング部位を含む、前記ベクター;および
3.意図されるレシピエント細胞にウイルス粒子を標的化するのに必要な要素をコードする配列、好ましくは水疱性口内炎のG糖タンパク質(VSV-G)または広宿主性(amphotrophic)MuLVまたはレンチウイルスenvをコードする遺伝子を含むベクター。
【0045】
パッケージングベクターにおいて、HIV-1 LTRプロモーターの代わりに、CMVプロモーターまたは他の強い高効率プロモーターを用いると、いずれかの他のウイルスタンパク質もまったく存在しなくても、gag、pol、またはgag/polの高発現を達成することが可能である。HIV-1 LTRプロモーターの他のプロモーターとの交換は、パッケージングベクターまたは他のベクターにおいて、恒常性発現が望ましい場合、そしてまた、HIV-1プロモーターが弱い、マウス細胞などの他の哺乳動物細胞における発現のため、有益である。本発明の配列を含むベクターは、HIV-1 Gag/Pol、HIV-1 Gag、HIV-1 Pol、およびSIV Gagタンパク質のRev非依存的産生に用いることが可能である。特定の態様において、異種プロモーターの存在はまた、トランスファーベクターおよびエンベロープコードベクターを用いる場合、こうしたベクターにおいても望ましいであろう。
【0046】
目的の遺伝子(類)は、達成しようと求める効果に応じて、選択する。遺伝子治療目的のため、治療するかまたは予防することが望ましい状態に対して活性である遺伝子産物をコードする、少なくとも1つの療法遺伝子があるであろう。あるいは、またはさらに、検出可能産物をコードすることによって、マーカーとして作用する遺伝子があってもよい。療法遺伝子は、例えば、アンチセンスRNA、リボザイム、標的タンパク質のトランスドミナントネガティブ変異体、毒素、条件的毒素、抗体またはヘルパーT細胞または細胞傷害性T細胞を誘導する抗原、一本鎖抗体または腫瘍抑制タンパク質をコードしてもよい。例えばWO 98/17816を参照されたい。
【0047】
レンチウイルスベクターで使用するための目的の遺伝子の、さらにより広範囲のリストは、例えば、WO 99/04026の10ページ20行目から、12ページ7行目に記載される。Klimatchevaら(1999)の表2もまた、遺伝子治療向きの障害および標的細胞のリストと共に、他者が用いたいくつかのレンチウイルスベクターを提供する。このリストは、遺伝子/代謝不全、ウイルス感染および癌を含む。アデノシンデアミナーゼ欠損、家族性高コレステロール血症、嚢胞性線維症、VII型ムコ多糖症、IおよびII型糖尿病、古典的フェニルケトン尿症およびゴシェ病などの遺伝する遺伝的欠損は、関与する遺伝子が既知である、単一遺伝子欠損を構成するため、レンチウイルスベクター仲介遺伝子治療によって克服することが可能であると位置付けされる疾患である。ウイルス病もまた、レンチウイルス遺伝子輸送の適切な標的を構成すると位置付けられる。特に、HIV感染の治療に、いくつかの遺伝子治療アプローチが提唱されてきており、そしてこれらの戦略のいくつかでは、ヒトにおいて、第I相研究が、最近、始まっている。該論文は、予備研究が、HIV複製に対するアンチセンスRNA、リボザイムおよびトランス-ドミナントタンパク質輸送のための欠損ネズミオンコウイルスを扱ってきていると述べる。
【0048】
いずれのベクターにおいても、しかし好ましくはトランスファーベクターにおいて、挿入される遺伝子は、例えばピコルナウイルスRNA由来の内部リボソーム進入部位(IRES)を有してもよい。IRESは、同一プロモーターから2つのタンパク質を発現したいと望む状況で用いられるであろう。例えば、目的の1つのタンパク質およびマーカー遺伝子、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)、または例えばWO 99/04026のp. 58に記載されるようなマーカー遺伝子および薬剤耐性遺伝子(例えばホタル(firefly)ルシフェラーゼ遺伝子およびネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子)である。IRESを用いて、2つのタンパク質の発現が調整される。別個のプロモーターの調節下に、さらなる単数または複数の遺伝子もまた、存在してもよい。こうした遺伝子は、例えば選択可能マーカー、または上に列挙される療法剤の中のものであってもよい、さらなる療法剤をコードしていてもよい。この遺伝子の発現は、恒常性であってもよく;選択可能マーカーの場合、これは、トランスフェクションに成功したパッケージング細胞、または特に高力価のレトロウイルスベクター粒子を産生するパッケージング細胞を選択するのに有用である可能性がある。あるいは、またはさらに、選択可能マーカーは、レンチウイルスベクターでの感染に成功し、そしてそれ自体のゲノムに組み込まれたプロウイルスを有する細胞を選択するのに有用である可能性がある。
【0049】
遺伝子治療を実行する1つの方法は、患者から細胞を抽出し、抽出された細胞をレンチウイルスベクターに感染させ、そして細胞を患者に再び導入することである。患者に細胞を再び導入する前に、選択可能マーカーを用いて、感染または形質導入細胞を濃縮するか、あるいは感染したかまたは形質導入された細胞のみを陽性選択する手段を提供することが可能である。この方法は、療法が成功する見込みを増加させる可能性がある。選択可能マーカーは、例えば、薬剤耐性遺伝子、代謝酵素遺伝子、または当該技術分野に知られる、いずれかの他の選択可能マーカーであってもよい。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒性物質、例えばヒスチジノール、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、メトトレキセートなどに対する耐性を与えるタンパク質、および細胞表面マーカーをコードする。
【0050】
しかし、レンチウイルスベクターの多くの遺伝子治療適用には、マーカー遺伝子発現に関する選択は、可能ではないか必要ではない可能性があることが明らかであろう。実際、選択マーカーの発現は、in vitro研究には好都合であるが、異質の(foreign)マーカータンパク質に対して向けられる細胞傷害性Tリンパ球(CTL)が不適切に誘導されるため、in vivoでは有害である可能性がある。また、in vivo適用では、いずれかの内部プロモーターも持たないベクターが好ましい可能性がある。内部プロモーターの存在は、例えば、パッケージング細胞株から得ることが可能な形質導入力価および組み込まれたベクターの安定性に影響を与える可能性がある。したがって、1つまたは2つまたはそれ以上の療法遺伝子をコードする、二シストロン性または多シストロン性であってもよい単一の転写単位ベクターが、in vivoでの使用のため設計される好ましいベクターである可能性がある。例えばWO 98/17816を参照されたい。
【0051】
本発明に使用するのに適した宿主またはプロデューサー細胞は当該技術分野に公知である。多くのレンチウイルスはすでに複製不全ゲノムおよびパッケージング構成要素に分けられている。まだ分けられていないものに関しては、分ける技術が利用可能である。プロデューサー細胞は、Gag、PolおよびEnvタンパク質などのベクターゲノムにコードされないウイルス構成要素をコードする。gag、polおよびenv遺伝子は、一過性にプロデューサー細胞に導入してもよいし、または細胞ゲノムに安定して組み込み、パッケージング細胞株を生じてもよい。その後、トランスフェクションまたは形質導入によって、レンチウイルスベクターゲノムをパッケージング細胞株に導入して、レンチウイルスベクター粒子を産生するのに必要なDNA配列すべてを有する安定細胞株を生成する。別のアプローチは、レンチウイルスベクター粒子を産生するのに必要な異なるDNA配列、例えばenvコード構築物、gag-polコード構築物およびトランスファー構築物を、一過性三重トランスフェクションによって、同時に細胞に導入することである。
【0052】
Klimatchevaら(1999)、および該文献に引用される参考文献に同定される標的細胞には、嚢胞性線維症のための気道上皮細胞;網膜色素変性症のための網膜光受容器細胞;造血障害、鎌形赤血球貧血、β-サラセミア、リソソーム貯蔵障害、ムコ多糖症、および重症複合免疫不全症候群のための、赤血球、マクロファージ、およびリンパ球の前駆体;ゴシェ病のための骨髄細胞およびマクロファージ;家族性高コレステロール血症のための肝細胞;HIV感染のためのTリンパ球およびマクロファージ;パーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性疾患のための脳組織、ニューロン、およびグリア細胞;心臓血管疾患のための内皮細胞および心筋細胞;並びに癌のための多様な組織(例えば肝臓または脳)中の癌細胞が含まれる。他の疾患のための標的細胞が、当業者に明らかであろう。
【0053】
少なくとも1つの本発明の核酸配列、ベクター、ベクター系、あるいは形質導入またはトランスフェクション宿主細胞および生理学的に許容しうるキャリアーを含むワクチンおよび薬剤組成物もまた、本発明の一部である。
【0054】
本明細書において、用語「形質導入」は、一般的に、例えばこの場合、レンチウイルスによる、感染を介した宿主への遺伝子成分のトランスファーを指す。用語「トランスフェクション」は、一般的に、細胞質膜を横断し、そして遺伝子成分のある程度を細胞核に輸送する、特定のトランスフェクション剤(例えばリン酸カルシウム、DEAEデキストラン、脂質配合物、金粒子、および他の微小粒子)の使用を介した、細胞への単離遺伝子成分のトランスファーを指す。
【0055】
本明細書に記載されるものに類似の系は、本明細書に記載されるHIVおよび/またはSIV遺伝子に加え、レンチウイルスの要素を用いて、産生することが可能である。
【0056】
薬剤組成物
本発明の薬剤組成物は、薬学的におよび/または治療的に有効な量の、少なくとも1つの本発明の核酸構築物、ベクター、ベクター系、ウイルス粒子/ウイルスストック、または宿主細胞(すなわち剤)を含む。本発明の1つの態様において、単位用量あたりの本発明の剤の有効量は、目的の遺伝子の検出可能な発現を引き起こすのに十分な量である。本発明の別の態様において、単位用量あたりの剤の有効量は、治療される異常の有害な影響(症状の重症度、期間、または度合いを含む)に対して予防する、治療するまたは保護するのに十分な量である。単位用量あたりの剤の有効量は、当該技術分野に公知であるように、とりわけ、接種される哺乳動物の種、該哺乳動物の体重、および選択された接種措置に応じる。予防または治療に最も適した療法剤の投薬量もまた、投薬型、選択される特定の剤、および治療下の特定の患者の生理学的特性で異なるであろう。用量は、少なくとも1回投与される。続く用量は、示されるように、投与されてもよい。
【0057】
本発明の組成物を投与された個体の反応を監視するため、mRNAまたはタンパク質発現レベルを測定してもよい。多くの場合、こうした個体から得られる血清または血漿中の発現レベルを評価すれば十分であろう。別の用量を投与するか、または個体に投与される組成物の量を変化させるかの決定は、少なくとも部分的に、発現レベルに基づく可能性がある。
【0058】
用語「単位用量」は、接種材料に関する場合、哺乳動物のための単位投薬量として適した、物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な希釈剤と関連して、望ましい効果を産生する、計算された、あらかじめ決定された量の活性成分(例えば核酸、ウイルスストックまたは宿主細胞)を含む。細胞または動物に投与されるウイルスストックの力価は、適用および輸送の種類(例えばin vivoまたはex vivo)に応じるであろう。ウイルスストックは、遠心分離などの方法を用いて濃縮してもよい。ex vivoで投与される力価は、好ましくは、0.001から1感染単位/細胞の範囲である。ウイルスストックを生成する別の方法は、ウイルスを発現する安定細胞株と標的細胞を同時培養することである。この方法を用いると、細胞を長期に渡って感染させることが可能であり、そして細胞が多コピーのベクターに感染する見込みがあるため、伝統的なレトロウイルスベクターを用いた際、より優れた結果が達成されている。
【0059】
核酸構築物、ベクター、ベクター系、ウイルスストック、あるいはex vivoで形質導入またはトランスフェクションされている細胞のin vivo投与では、用量は、用量漸増によって決定され、上部用量は、許容し得ない副作用の開始によって制限される。予備出発用量は、当該技術分野に知られる方法によって、動物モデルにおいて、レンチウイルスベクターを用いた実験から推定してもよいし、または既知のレトロウイルス(例えばアデノウイルス)用量との比較から推定してもよい。一般的に、最初は少ない投薬量を用い、そして必要に応じ、その状況下で最適効果に達するまで、少ない増分で増加させるであろう。典型的な投薬量は、108からおよそ5x1015粒子までの範囲である。
【0060】
接種材料は、典型的には、水性薬剤組成物を形成する、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水およびそれらに匹敵するものなどの生理学的に許容しうるキャリアー中の溶液として調製される。
【0061】
本発明の剤は、一般的に、生理学的に許容しうるキャリアーまたはその代わりにビヒクルと共に投与する。生理学的に許容しうるキャリアーは、投与に際して不都合な生理学的反応を引き起こさないもの、およびその中で核酸がその活性を保持するように十分に可溶性であり、薬学的または治療的に有効な量の化合物を輸送するものである。薬学的または療法的に有効な量および本発明の剤の投与法は、個々の患者、治療される適応症、および一般の当業者に明らかな他の判断基準に基づいて異なる可能性がある。治療的に有効な量の本発明の核酸は、有意な副作用を引き起こすことなく、治療される異常の有害な影響の重症度、度合いまたは期間を予防するかまたは減弱するのに十分なものである。特定の適用に有用な投与経路(類)は、一般の当業者に明らかである。
【0062】
本発明の剤の投与経路には、限定されるわけではないが、非経口、および罹患部位への直接注入が含まれる。非経口投与経路には、限定されるわけではないが、静脈内、筋内、腹腔内および皮下が含まれる。本発明の剤の投与経路は、典型的には、非経口であり、そして好ましくは、骨髄内、CSF内、筋内、皮下、皮内、眼内、頭蓋内、鼻内、およびそれらに匹敵するものである。例えば、処方および投与経路の例として、WO 99/04026を参照されたい。
【0063】
本発明は、非経口投与に適した上述の剤の組成物を含み、限定されるわけではないが、薬学的に許容しうる無菌等張溶液を含む。こうした溶液には、限定されるわけではないが、鼻、静脈内、筋内、腹腔内、皮下、あるいは関節または他の領域への直接注入のための生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水が含まれる。
【0064】
本発明の剤をレシピエント哺乳動物、好ましくはヒトに提供する際、投与される投薬量は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、全身の医学的状態、以前の病歴およびそれらに匹敵するものなどの要因に応じて異なるであろう。
【0065】
本発明の薬剤組成物の投与は、「予防」または「療法」目的いずれのためであってもよい。予防的に提供される場合、組成物は、いずれかの症状にも先立って提供される。組成物の予防的投与は、治療される異常のいずれかの続く有害な影響(症状の重症度、期間、または度合いを含む)も予防するかまたは改善するように働く。療法的に提供される際、組成物は、治療される異常の症状開始時に(またはそれからまもなく)提供される。
【0066】
すべての療法、予防および診断使用のため、本発明の1以上の剤と共に抗体および他の必要な試薬、並びに適切な装置および付属物は、容易に入手可能であり、そして容易に使用できるように、キットの形で提供してもよい。
【0067】
イムノアッセイが関与する場合、こうしたキットは、標的分子に特異的な抗体などの受容体が結合するであろう、膜(例えばニトロセルロース)、ビーズ、球体、試験管、ロッドなどの固体支持体を含んでもよい。こうしたキットはまた、標識化抗体などの第二の受容体も含んでもよい。こうしたキットは、サンドイッチアッセイに用いて、毒素を検出することが可能である。競合アッセイのためのキットもまた、想定される。
【0068】
産業上利用可能性
本発明の変異遺伝子は、天然宿主細胞または生物において、あるいは異なる細胞または生物において、発現させてもよい。該変異遺伝子は、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたはミニ染色体などのベクターに導入し、そして当該技術分野に公知の方法によって、宿主細胞または生物に挿入してもよい。一般的に、該変異遺伝子またはこれらの変異遺伝子を含む構築物は、哺乳動物細胞(例えばヒト(例えばHeLa)、サル(例えばCos)、ウサギ(例えばウサギ網状赤血球)、ラット、ハムスター(例えばCHOおよびベビーハムスター腎臓細胞)またはマウス細胞(例えばL細胞))、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または細菌細胞(例えば大腸菌(E. coli))を含む、真核または原核いずれの、いずれかの細胞で利用することも可能である。これらの変異遺伝子をクローン化し、そして/または発現させるのに利用することが可能なベクターは、変異遺伝子を複製し、そして/または発現させることが望ましい宿主細胞において、変異遺伝子を複製し、そして/または発現させることが可能なベクターである。例えば、多様な種類の宿主細胞に適したベクターの例に関しては、F. Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley-Interscience(1992))およびSambrookら(1989)を参照されたい。こうした遺伝子の天然プロモーターは、遺伝子を挿入する宿主に適合する強いプロモーターで置き換えてもよい。これらのプロモーターは誘導性であってもよい。これらの変異遺伝子を含む宿主細胞を用いて、酵素調製、薬剤、診断試薬、ワクチンおよび療法剤に有用なタンパク質を多量に発現させることが可能である。
【0069】
変異遺伝子または変異遺伝子を含む構築物はまた、in vivoまたはin vitro遺伝子治療に用いることが可能である。例えば、本発明の変異遺伝子は、in situでmRNAを生じ、究極的に、発現されるタンパク質の量を増加させるであろう。こうした遺伝子には、ウイルス遺伝子および/または細胞遺伝子が含まれる。こうした変異遺伝子は、例えば、ワクチンおよび/または遺伝子治療の開発に有用であると期待される。
【0070】
変異gag、env、およびpol遺伝子をコードする構築物および/または構築物を用いることによって作成されるタンパク質は、例えば、AIDSおよびAIDS関連疾患の診断試薬、ワクチンおよび療法の産生に用いることが可能である。HIV-1 gag遺伝子の阻害/不安定性要素は、宿主における低ウイルス産生状態の確立に関与する可能性がある。HIV-1および他のレンチウイルスは、免疫系によって一掃されない、慢性活性感染を引き起こす。レンチウイルスゲノムからの阻害/不安定性配列要素の完全な除去は、恒常的な発現を生じる可能性がある。これは、ウイルスが不顕性の感染を確立し、そして免疫系監視を逃れるのを妨げることが可能である。阻害配列要素を除去することによって、全gag/pol遺伝子の発現を増加させるのに成功したことにより、いずれかの負の要素も持たないレンチウイルスを産生することが可能であると示唆される。こうしたレンチウイルスは、弱毒ワクチンに向かう新規のアプローチを提供する可能性がある。
【0071】
例えば、高レベルのGagを発現するベクターは、ヒトにおける発現後、免疫療法および免疫予防法に用いることが可能である。こうしたベクターには、レトロウイルスベクターが含まれ、そしてまた、例えばWolffら(Science 247: 1465-1468(1990))、Wolffら(Human Molecular Genetics 1(6): 363-369(1992))およびUlmerら(Science 259: 1745-1749(1993))に記載される技術を用いて、gagの十分な発現を生じる、筋細胞または他の受容細胞へのDNAの直接注入が含まれる。さらに、gag構築物は、ヒトへの導入後、HIV発現のトランスドミナント阻害に用いることが可能である。この適用のため、例えば、高レベルのp55gagまたはp37gagを発現する適切なベクターまたはDNA分子は、例えばTronoら(Cell 59: 113-120(1989))に記載されるように、トランスドミナントgag変異体を生成するよう修飾されるであろう。ベクターは、ヒトに導入され、gagトランスドミナント阻害および産生されるgagタンパク質による免疫刺激を組み合わせた機構によって、HIV産生の阻害を生じるであろう。さらに、本発明のgag構築物は、レンチウイルスgagタンパク質の発現に基づき、新規レトロウイルスベクターの生成に用いることが可能である。レンチウイルスは、非分裂性細胞の標的化および効率的な感染を可能にする可能性がある、ユニークな特性を有する。類似の適用は、高レベルのenvを発現するベクターに関して期待される。
【0072】
SIVの類似の阻害/不安定性要素の同定は、このウイルスが、これらの仮説を試験するのに好適なモデルであることを示す。感染性HIVの生成につながるであろう再編成事象の可能性をさらに最小限にするため、同様に修飾したSIVを、HIVの代わりに用いることが可能である。
【0073】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を説明するが、いかなる方法においてもその範囲を限定するとは解釈されるべきではない。先の開示および以下の実施例の教示の特定の修飾および変化は当業者には明らかであろうし、これらは本発明の精神および範囲により含まれると意図される。
【0074】
実施例 1
Rev- 非依存的 HIV-1 Gag/Pol 分子クローン
図1は、Rev-非依存的HIV-1 gag/pol分子クローンのDNA配列を示す。示されるこのDNA配列はHIV-1の完全GagおよびPolをコードして、プロモーターに対して機能可能に連結されているときにはRev-非依存的様式で発現されうる。Rev-非依存的gag配列は米国特許番5,972,596および5,965,726に記載されており、Rev-非依存的pol配列は米国特許番号5,972,596および5,965,726に記載される方法を使用して阻害/不安定配列を除去することにより生成された。報告によれば、その他はヒト細胞に対するコドンの使用を最適化することによりRev-非依存的gag配列をつくった(例えば、WO 98/34640参照)。
【0075】
図2は、pCMVgagpolBNkanにおける野生型および変異pol領域の配列のアライメントを示す。図中の位置#1はプラスミドpCMVgagpolBNkanにおける位置2641である。
【0076】
gag、polおよびenv領域中のINSの除去は、HIV-1のRev制御因子の非存在下にて高レベルの真正HIV-1構造タンパク質を発現させる。
実施例 2
Rev- 非依存的 SIV Gag 分子クローン
図3は、Rev-非依存的SIVgag分子クローン、SIVgagDX、のDNA配列を示す。図4は、野生型(WT)および変異型(SIVgagDX)配列の比較を示す。野生型SIV配列は、サル(マカーク)免疫不全ウイルス分離体239由来であり、クローンラムダsiv239-1(GenBank寄託番号M33262)である。
【0077】
実施例 3
Rev- 非依存的 SIV Env 分子クローン
図16は、いずれかのSIVあるいはHIV制御因子を独立して発現させることができる変異レンチウイルスenv遺伝子配列を含むベクターの例である、“env-コーディング”ベクターCMVkan/R-R-SIVenvCTEの説明図を示し、図17はそのDNA配列を示す。“CMV”はサイトメガロウイルスプロモーターを意味する;“SRV-CTE”はサルレトロウイルス1型の構成的輸送要素(CTE)を意味する;“全-STOP”は全3つのリーディングフレームにおいて翻訳停止を与える配列を意味する;“BGHターミネーター”はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを意味する。その他の転写後調節要素は望ましいSRV-CTEに代わって使用でき、例えばPavlakis and Nappiにより記載されたもので、1999年5月22日に出願され、1999年12月2日にWO 99/61596として公開されたPCT/US99/11082であり、(および本明細書中に援用される)。
【0078】
先に上で言及したように、レンチウイルスenv遺伝子をコードするそのようなベクターは、ベクターがCD4+T細胞に感染することが望まれるなら使用してもよい。また先に上で言及したように、CTE要素(すなわち、ベクターCMVkan/R-R-SIVenvCTEの場合におけるSRV-CTE)は、CTEおよびHIV RRE/Revを置換することができる、Pavlakis-Nappi要素などの、もう一つの転写後調節要素で置換することができる。1999年5月22日に出願され、1999年12月2日にWO 99/61596として公開された(および本明細書中に参考文献として援用される)Pavlakis and Nappi、PCT/US99/11082を参照。
【0079】
実施例 4
レンチウイルスベクター系
図5は、本明細書中で例示されるRev-非依存的レンチウイルスベクター系の準備段階のいくつかの成分の概略図であり、使用されうるパッケージング構築物および3つの異なるトランスファーベクターを含む。本明細書中で例示されるレンチウイルス系では、パッケージング構築物はカナマイシン耐性遺伝子も含有する。本明細書中で例示されるレンチウイルス系はベクターpHCMV-Gも含有し、それは図5に示す。
【0080】
図5に示されるパッケージング構築物において、“CMV”はサイトメガロウイルスプロモーターを意味し、“Gag”はビリオンコアの成分を生成するgag遺伝子を意味し、“Pro”は“プロテアーゼ”を意味し、“RT”は“逆転写酵素”を意味し、“Int”は“インテグラーゼ”を意味し、“BGHポリ(A)”はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを意味する。プロテアーゼ、逆転写酵素、およびインテグラーゼ遺伝子は“pol”遺伝子を含む。トランスファー構築物1において、“LTR”はHIVプロモーターを含有するHIVの“長い末端反復配列”を意味する;“mSD”は構築物中に存在するためRNA転写物のスプライシングが起きない“変異スプライスドナー部位”を意味する;“Ψ”はエンキャプシデーション(encapsidation)シグナルを意味する;“wGA”はエンキャプシデーションに必要であると信じられている配列を含有する野生型gag遺伝子の部分を意味する;“X”は部分的gag遺伝子配列のATGコドンが変異を受けるためこの遺伝子の翻訳が起こらないことを示す;“CMV”はサイトメガロウイルスプロモーターを意味し、ルシフェラーゼはレポーター遺伝子として使用される。ルシフェラーゼは目的のいずれかの遺伝子で置換することができる。もう一つのHIV LTRはトランスファー構築物1の3'末端に存在する。トランスファー構築物1、2、あるいは3などの構築物におけるこのLTRとプロモーター-エンハンサー欠損HIV LTRとの置換は、組み込み後のLTRの不活性化をもたらす。トランスファー構築物2はトランスファー構築物1と似ており、差異はgag遺伝子の変異部分(“mGa”と意味する)がgag遺伝子の野生型部分の代わりに使用されることである。トランスファー構築物3(pm2BCwCNluci)は5'スプライス部位に様々な変異を有しており、未処理のATGコドンを有しているため変異gag遺伝子の部分的翻訳が起こる。トランスファー構築物3はまた、5' LTRプロモーターの代わりに5' CMVプロモーターも有している。この構築物はHIV Tatタンパク質の存在と独立して発現する。LTRプロモーターから発現するトランスファー構築物は部分的にTatタンパク質に依存している。293細胞において、有意な発現はTatの非存在下で達せられる。例えば、Valentin et al., Proc. Natl Acad. Sci. U S A. 95:8886-91(1988)を参照せよ。
【0081】
実施例 5
パッキング構築物 pCMVgagpolBNkan
図6は、パッキング構築物pCMVgagpolBNKanの概略図マップを示す。ヌクレオチドの番号付けはHXB2R配列のものであり(Genbank寄託番号K03455およびM38432)、ここでは+1は転写の開始である。
【0082】
HIV-1 gag/pol領域における配列は、全てのINSを除去するために変異させた。gagの始まりからpol中のBsrGI部位までの断片および断片KE [KpnI(3700)- EcoRI(4194)]は、先にSchneider et al., J Virol. 71: 4892-4903(1997)および米国特許番号5,972,596および5,965,726に記載される変異をさせた。
【0083】
pCMVgagpolBNkanを生成するため、HIV-1 pol領域内の3つの断片を変異させた。それらは断片BP [BsrGI(2207)-PflMI(3032)]、断片PK [PflMI(3032)-KpnI(3700)]および断片EN [EcoRI(4194)-NdeI(4668)]である。変異生成は、Ho et al., Gene 77: 51-59(1989)により記載される方法の修正版およびDNAシャッフリング(Zhao and Amold, Nucl. Acid Res. 25(6), 1307-1308(1997))を使用して行った。3つの断片の完全配列にわたって伸びる16のオリゴヌクレオチドを設計した。断片BPに対応する6つのオリゴ、断片PKに対応する6つのオリゴ、および断片ENに対応する4つのオリゴ(オリゴヌクレオチドは長さ130から195塩基の範囲であった;隣接するオリゴは20ヌクレオチドまで重なった)。各々の断片は2つのステップで組み合わせた:
1)PCR;反応は最終量50μlにおいて各々10 pmolの精製巨大(big)オリゴ、各々0.2 mMのdNTPおよび2.5 u pfu DNAポリメラーゼ酵素(Stratagene)を含む標準pfu緩衝液中で行った。PCRプログラムは:96℃で3分間の後、94℃で1分間、55℃で1分間、および72℃で1分とサイクル毎に+5秒を50サイクル、および最後に72℃で7分間、であった。PCRの後、巨大オリゴヌクレオチドは組み立てた変異断片から除去した。
【0084】
2)第二のステップでは、各々の変異断片の5'および3'末端に配置させる30 merプライマーを用いて組み立てた産物を特異的に増幅させた。1マイクロリットルの組み立てたPCR産物は、最終量50μlにおいて各々50 pmolのプライマー、1×pfu緩衝液、各々0.2 mMのdNTPおよび2.5 u pfu DNAポリメラーゼ酵素を用いた25サイクルの反応においてテンプレートとして使用した。PCRプログラムは:96℃で3分間で、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で45秒を10サイクルの後、さらに94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で45秒とサイクル毎に+20秒を14サイクル、および最後に72℃で7分間、であった。このプログラムは、正確なサイズの単一のPCR産物を与えた。増幅BP、PKおよびEN断片は、PCR-scriptTM Amp SK(+) Cloning Kit(Stratagene)を使用してPCR-scriptTMベクター中で別々にクローン化した。クローンを無作為に選択して配列決定した。Schneider et alにより以前に変異化された断片KEと共に正確なBP、PKおよびEN断片を、p55AM 1 -R5(先にSchneider et al., J. Virol. 71: 4892-4903(1997)に記載された)のBsrGIおよびKpnI部位の間に結合して、完全変異gagpol ORFを産生した。完全変異gag/polを含有する新規プラスミドはpLTRgagpolBNと名付けた。BNはBsrGIおよびNdeIの間の断片の修飾を表す。次に、変異gag/polをサイトメガロウイルス主要後期プロモーター(major late promoter)(GenBank寄託番号X17403)およびカナマイシン耐性遺伝子を含有するCMVkanベクター中でクローン化して、pCMVgagpoIBNkanとした。プラスミドバックボーンは、Vical Inc.により提供され、Hartikkca et al., Hum Gene Ther. 7:1205-17(1996)に記載されるpVR1332由来である。
【0085】
様々なプラスミドバックボーンを使用して、例えばDNA注入の場合において、例えばin vivoで良好な発現を提供できることが理解される。
実施例 6
トランスファーベクター pmBCwCNluci および pmBCmCMluci の構造
HIV-1配列BC、BssHII(257)からClaI(376)、は主要スプライスドナー部位およびエンキャプシデーションシグナルを含有する。6つのオリゴ(33から46塩基)を設計して、スプライスドナー部位およびgagのAUG開始コドンに変異を導入した。pCMVgagpolBNの構築物に関するセクションに記載するように、BC断片を組み立てて、増幅して配列決定をした。
【0086】
変異BC断片およびClaI(376)およびNsi(793)の間の野生型gagの断片をp55RREのBssHIIおよびNsiの間に配置して(Schneider et al., J. Virol. 71:4892-4903(1997))、pmBCwCNを生成した。同時に、p55BM1-10SD+由来の変異gagのClaI(376)およびNsiI部位の間の断片を使用して、pmBCmCNを生成した。(p55BM1-10SD+は、Schneider et al.(1997)に記載されるp55BM1-10と似ているが、さらにgagの上流の未処理のスプライスドナーおよびエンキャプシデーション部位を含有する。)pmBCwCNおよびpmBCmCNにおけるgagおよびRREの3'部分を含有するNsiIおよびXhoIの間の領域は、pHR'-CMVluci(D. Trono由来のベクター)由来のCMVプロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子を含有するClaI-XhoI断片と置換されて、pmBCwCNluciおよびpmBCmCNluciを生成する(それらは各々トランスファー構築物1および2として、図5において示され、図7および8において概略的に描かれる)。これらのプラスミドの配列は、各々図10および11に示す。これらのプラスミドの様々な版も、標準的な法により、エンキャプシデーション部位の領域、最初のスプライスドナー部位、およびイニシエーターgag AUGにおける変更を有してつくられた。例えば、(図5でトランスファー構築物3として示される)トランスファー構築物pm2BcwCNluciは、5'スプライス部位領域において様々な変異を有しており、未処理のATGを有する。トランスファー構築物1および2(mBCwCN frag)、トランスファー構築物3(m2BCwCN frag)、HXB2およびNL43のBssHII-Cla I領域における配列の比較は、図12に示す。
【0087】
実施例 7
ウイルス粒子の調製
レンチウイルス粒子は、3つのプラスミド:pCMVgagpolBNkan、pmBCwCNluciあるいはpmBCmCNluci(トランスファーベクター)およびpHCMV-G(Yee et al., Proc. Nad. Acad. Sci., USA, 91:9564-9568(1994)エンベロープVSV-G(水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質)をコードするプラスミド)、の組み合わせを用いた293ヒト腎臓細胞の一過性コトランスフェクションにより生成した。
【0088】
トランスフェクションの前日に、293細胞を106細胞/プレートの濃度で60 mmプレート上にまいた。プラスミドDNAは、以下の割合:3μgのパッケージング構築物、6μgのトランスファー構築物および100 ng VSV-Gエンコーディング構築物、pHCMV-G、においてCa-リン酸沈殿法によりトランスフェクションした。[LTRプロモーターは、293細胞においてTatの非存在下で効率の穏やかな減少を伴って発現させることができることに注目すべきである。トランスファー構築物は、mRNA開始部位がLTR R領域の開始点であるような方法で、LTRプロモーターをCMV(例えば、図5のトランスファー構築物3を参照)あるいはその他のプロモーターに置換した後は、完全にTat独立性とすることができる。] ウイルス粒子の調製についての本実験では、500 ngのTat発現プラスミドはトランスフェクションに含まれる。
【0089】
細胞はトランスフェクションの翌日に洗浄して、さらに48時間DMEM培地に保存した後、上清を回収した。上清は1,200 rpmで7分間回転させて、あらゆる浮遊細胞を除去した。pCMVgagpolBNkanは、効率的に細胞から放出される高レベルのGagタンパク質を産生し(図13)、また完全HIV-1の発現の際に見出されるものと同様なレベルの逆転写酵素活性により判断されるような高レベルの機能的Polも産生する(図14)。
【0090】
トランスフェクションされた293細胞の上清を使用して、いくつかのヒト細胞株(293、Jurkat、U937)および非分裂性ヒト初代マクロファージを形質導入した。
【0091】
実施例 8
細胞形質導入
形質導入は、標的細胞をレトロウイルスを含有する1-2 mlの上清と共に37℃で3-4時間インキベートすることで行った。上清に存在するレトロウイルスの量は、(ELISAにより測定した)p24含有量により正規化した。同量のp24 gagタンパク質を細胞の感染のために使用した。このように、様々な調製物の産生における違いを最小化した。
【0092】
形質導入に使用したマクロファージは、プラスチックへの接着により健常なドナーの末梢血から単離した。細胞はRPMI+20%牛胎児血清(FCS)+10%ヒト血清(HS)中で培養した。1週間後、非接着細胞をPBSで洗い流し、マクロファージをヒト血清の非存在下でさらに1-2週間培養し続けた。細胞は形質導入の前にPBSで2-4回洗浄した。
【0093】
細胞は形質導入後(初代マクロファージについて7日間)48時間で回収し、形質導入効率は培地由来の細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性を測定することで決定した。293、Jurkat、U973および初代マクロファージにおける形質導入実験の結果は、図15A-Dに示す。これらの結果は、Rev-非依存的gag-HIV-1基本レトロウイルスベクターが(A)293細胞、(B)ヒトリンパ系細胞、(C)ヒト骨髄性細胞(U937)、ならびに(D)初代ヒトマクロファージなどの非分裂性細胞における高い形質導入効率を示すことを説明する。
【0094】
実施例 9
免疫学的予防あるいは免疫療法における本発明の核酸の使用
生後の遺伝子療法において、新規の遺伝的情報は、身体から標的細胞を取り出すること、それらに新規の遺伝的情報を運ぶウイルスベクターを感染させること、そしてそれらを身体に再移植すること、などの間接的な手段;あるいはリポソーム内にDNAの製剤を封入すること;ウイルスエンベロープ受容体タンパク質を含有するプロテオリポソーム内にDNAを取り込むこと;DNAをリン酸カルシウム共沈殿すること;およびポリリジン-糖蛋白キャリア複合体にDNAをカップリングすること、などの直接的な手段により組織に導入された。さらに、リン酸カルシウム沈殿物の形成を伴う、あるいは伴わない直接的な肝臓内への注入の後のクローン化ウイルスDNA配列のin vivoでの感染力も記載された。安定性を亢進させる要素を含有するmRNA配列はまた、陽イオン脂質小胞を用いて、Xenopus laevisの胚において効率的に翻訳されることも示した。例えば、J.A. Wolff, et al., Science 247:1465-1468(1990)および本明細書中に引用される参考文献を参照。
【0095】
最近、純粋RNAあるいはDNAの骨格筋への直接接種が、筋細胞内での顕著な遺伝子発現を引き起こすことも示された。J.A. Wolff, et al., Science 247:1465-1468(1990)。粒子-加速(particle-acceleration)(N. -S. Yang, et al. Proc. Nafl. Acad. Sci. USA 87:9568-9572(1990); S.R. Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730(1991))あるいはウイルス形質導入などによるその他の手段により、RNAあるいはDNAを筋細胞に導入させることでも、DNAあるいはRNAを安定して維持および発現させるはずである。Wolff et al.において報告される実験では、RNAあるいはDNAベクターを使用して、マウス骨格筋細胞、特に大腿四頭筋の細胞内でレポーター遺伝子を発現させた。タンパク質発現は容易に検出され、これらの効果には特別な輸送系は必要とされなかった。ポリヌクレオチド発現は、接種液の組成および量および接種の方法が記載されるプロトコールから修飾されるときにも得られた。例えば、レポーター酵素活性は、10から100μlの低張、等張、および高張のスクロース溶液、Opti-MEM、あるいは2 mMのCaCl2を含有するスクロース溶液を用いて観察されたこと、そしてまた10-から100-μlの注入が1分間以内の代わりにポンプで20分間にわたり行われたときにも観察されたことが報告された。
【0096】
レポーター遺伝子によりコードされるタンパク質由来の酵素活性もまた、RNAあるいはDNAベクターを用いて注入した腹部筋肉内において検出され、その他の筋肉がポリヌクレオチドを取り込んで発現できることを示した。低量のレポーター酵素もまた、RNAおよびDNAベクターを用いて接種したその他の組織(肝臓、脾臓、皮膚、肺、脳および血液)において検出された。筋肉内に接種したプラスミドDNAもまた、ヒトでない霊長類の筋肉内で安定して発現することが示された。S. Jiao et al., Hum. Gene Therapy 3:21-33(1992)。
【0097】
ヒト筋肉内にin situで直接に遺伝子をトランスファーすることは、いくつかの可能性のある臨床的適応を有しうることが提案された。筋肉は、筋肉が関与する疾患状態に加えて、主に関与しない疾患状態を緩和するであろう導入遺伝子の異種発現にとって潜在的に適した組織である。例えば、筋肉組織は、循環毒素代謝を免疫化する、血液内に分泌する、あるいは排泄することのできるタンパク質の異種発現のために使用できた。くり返し利用できるRNAおよび組織の使用は、遺伝子トランスファーの可逆型にとって有用であり、従来の医薬的治療と非常に同じように投与されうる。J.A. Wolff, et al., Science 247:1465-1468(1990)およびS. Jiao et al., Hum. Gene Therapy 3:21-33(1992)を参照せよ。
【0098】
抗原をコードする遺伝子の細胞内発現は、ワクチンの開発に対する代替的なアプローチを提供しうることが、J.A. Wolff, et al.上記により提案された。この仮説は、BALB/cマウスの大腿四頭筋に接種されたインフルエンザA核タンパク質をコードするプラスミドDNAが、ウイルスの肺力価の減少、質量損失の抑制、および生存率の上昇により評価されるように、インフルエンザA核タンパク質-特異的細胞傷害性T細胞(CTL)の生成、インフルエンザAウイルスの異種株のその後の攻撃に対する防御をもたらした、という最近の報告により支持された。J. B. Ulmer et al., Science 259:1745-1749(1993)。
【0099】
それゆえ、ウイルス抗原をコードするRNAあるいはDNAベクターの直接接種を抗原の内因性発現のために使用して、自己-複製薬剤あるいはアジュバントを必要とせずに、免疫系に対する提示のためのウイルス抗原を生成させることができ、抗原-特異的CTLの生成およびウイルスの同種あるいは異種株のその後の攻撃に対する防御をもたらすようである。
【0100】
マウスおよびヒトの両方におけるCTLは、保存的内在性ウイルスタンパク質由来のエピトープを認識することができ、ウイルスに対する免疫反応において重要であると考えられている。保存的ウイルスタンパク質由来のエピトープを認識することにより、CTLは交叉株(cross-strain)防御を提供しうる。保存的ウイルス抗原に特異的なCTLは、一般的に株-特異的な抗体とは対照的に、様々なウイルスの株に反応できる。
【0101】
従って、ウイルス抗原をコードするRNAあるいはDNAの直接的な接種は、直接的なペプチド輸送あるいはウイルスベクターのいくつかの制限がないという有利性を有する。(J.A. Ulmer et al., 上記、および本明細書中の考察および参考文献を参照せよ。)さらに、DNAの接種後の発現タンパク質に対する高力価の抗体の生成は、これが、保存的抗原を標的とするCTLワクチンと別々にするあるいは組み合わせて、保存的あるいは非保存的抗原を標的とする抗体-ベースのワクチンの作製を容易で効果的な手段であり得る、ことを示す。これらはまた、組み合わせワクチンの生成のために、従来のペプチドワクチンと共に使用されうる。さらに、タンパク質発現はDNA接種後に維持されるので、BおよびT細胞の記憶の持続性を亢進することもでき、それにより長寿命ホルモンおよび細胞-媒介免疫が生じうる。
【0102】
1.HIV-1 に対する免疫学的予防あるいは免疫療法のためのワクチン
変異gag、polあるいはgag/pol配列は、CMVあるいはRSVなどの強力な構成的プロモーター、あるいはHIV-1などの誘導性プロモーターを使用して、発現ベクター内に挿入されるであろう。
【0103】
ベクターは、ヒト組織への直接的なDNAの接種;培養(ex vivo)において初代ヒト細胞へのDNAのエレクトロポレーションあるいはトランスフェクション、所望される特性のための細胞の選択および身体へのそのような細胞の再導入、(前記の選択は、前もって選択された適するゲノム領域に対する注入DNAの成功した同種組換えのために存在することができる);gag遺伝子を含有する感染性粒子の生成、ex vivoでの細胞の感染および身体へのそのような細胞の再導入;あるいはin vivoでの前記の粒子による直接的な感染、などのいくつかの技術の一つを使用して、医薬的に許容可能なキャリアにおいて動物あるいはヒトに導入されるであろう。
【0104】
免疫系の効率的な刺激を導く実質的なレベルのタンパク質が産生されるであろう。
本発明のもう一つの態様において、記載される構築物は修飾されて、ウイルス粒子の形成に関与することができない変異Gagタンパク質を発現するであろう。そのようなGagタンパク質は野生型Gagタンパク質と同程度に免疫系を刺激するであろうが、HIV-1産生の増加には寄与できないであろうと期待される。この修飾は、免疫療法および免疫学的予防のためのより安全なベクターをもたらすはずである。
【0105】
実施例 10
トランスドミナント( TD ) -TD-Gag-TD Rev あるいは Td Gag-Pro-TD Rev 遺伝子を使用した HIV-1 発現の阻害
DNAの直接的接種あるいはレトロウイルスベクター以外のベクターの使用により、細胞中にて構成的な高レベルなトランスドミナントGag(TDgag)が可能になるであろう。さらに、B.K. Felber et al., Science 239:184-187(1988)により採用されるアプローチにより、HIV-1 TDgagをコードするレトロウイルスベクター、例えばマウス-由来レトロウイルスベクター、が生成され、それはレトロウイルスベクターによるヒト細胞の感染を干渉しないであろう。Felber, et al., 上記のアプローチでは、プロモーターおよびポリAシグナルの部分を含有するHIV-1 LTRの断片は、有害な効果を伴わずにマウスレトロウイルスベクター内に組み込むことができ、転写的にサイレントのままでいることができることが示された。Tatタンパク質の存在はHIV-1 LTRからの転写を刺激し、HIV-1 LTRと結合する遺伝子の高レベルの発現をもたらした。
【0106】
ハイブリッドTDGag-TDRevあるいはTd Gag-Pro-TDRev遺伝子の生成およびヒト細胞中の発現ベクターの導入は、HIV-1発現を阻害するであろう2つのタンパク質を効率的に産生するであろう。同じベクターにおける2つのTDタンパク質の組み込みは、ウイルス複製に対する各々の効果を増幅することが期待される。B.K. Felber et al. 上記に記載されるものと同様な内容におけるHIV-1プロモーターの使用は、感染細胞において高レベルのGagおよびRev発現を可能にするであろう。感染の非存在下では、発現は実質的には低いであろう。あるいは、その他の強力なプロモーターの使用により、そのようなタンパク質の構成的な発現が与えられるであろう。このアプローチは非常に有益でありうる、なぜなら高い免疫原性のgagを産生するからであり、それは感染ウイルスの産生に関与できるのではなく、実際はそのような産生に拮抗する。これはAIDSに対する効率的な免疫学的予防あるいは免疫療法として使用できる。
【0107】
トランスドミナント変異体の例は、Trono et al., Cell 59:112-120(1989)に記載される。
1.トランスドミナント Gag 変異タンパク質をコードする構築物の生成
例えば、Trono et al. 上記に記載されるように、トランスドミナント変異体として働くことができるGag変異タンパク質は、高い構成的レベルでトランスドミナントGagタンパク質を産生するために、ベクターp37M1-10Dあるいはp55M1-13P0を修飾することにより生成されるであろう。
【0108】
トランスドミナントGagタンパク質は免疫系を刺激して、感染ウイルスの産生を阻害するであろうが、感染ウイルスの産生には寄与しないであろう。
このアプローチの付加的な安全性は、それをヒトの応用により受け入れやすくさせる。
【0109】
参考文献
【0110】
【表1】
【0111】
【0112】
【0113】
【0114】
【0115】
【0116】
当業者は、1または複数の阻害/不安定性配列を含有するmRNAをコードするいずれかの遺伝子を本発明の例示した方法あるいはその機能的な同等物にしたがって修飾できることを理解するだろう。
【0117】
遺伝子工学、ウィルス学、免疫学、医薬、および関連する分野における当業者にとって明らかな、本発明を実施するための上気した態様の修飾は、以下の請求の範囲に含まれることを意図する。
【0118】
本出願全体において上述した引用した全ての参考文献は、その全体を参考文献として援用する。
【図面の簡単な説明】
【図1】 変異HIV-1 gag/pol分子クローンのDNA配列(SEQ ID NO: 1)。gagpolターミネーターは、SEQ ID NO: 1の位置4305-4397に位置する。
【図2】 pCMVgagpolBNkanにおける野生型(SEQ ID NO: 2)および変異pol領域(SEQ ID NO: 3)の配列の比較。図中の位置#1は、プラスミドpCMVgagpolBNkan中の位置2641である。比較は、位置1872のgagイニシエーターATGから開始する。
【図3】 変異SIV gag分子クローン(SIVgagDX)のDNA配列(SEQ ID NO: 4)。
【図4】 サル(マカク(macaque))免疫不全ウイルス単離体239、クローンラムダsiv 239-1(GenBankアクセッション番号M33262)由来の野生型SIV配列(SEQ ID NO: 17)と、SIVgagDX中の変異SIV gag DNA配列(SEQ ID NO: 18)の比較。コンセンサス配列は、SEQ ID NO: 5で示される。
【図5】 レンチウイルス系の試料型のいくつかの構成要素の概略図。BGHポリ(A):ウシ成長ホルモン・ポリ(A)シグナル;MSD:変異スプライシング・ドナー部位;Ψ:キャプシド形成シグナル;SD、スプライシング・ドナー部位;SA、スプライシング・アクセプター部位;「X」は、この遺伝子の翻訳が生じないように、部分的gag遺伝子配列のATGコドンが変異していることを示す。
【図6】 パッケージング構築物pCMVgagpolBNkanの概略図。
【図7】 トランスファー構築物1:pmBCwCNluciの概略図。矢印によって示されるように、パッケージングシグナル、CMVプロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子のコード領域に、5'および3' HIV-1 LTRが隣接し、このLTRがプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを提供する。3つの連続する矢印は、それぞれ、LTRのU5、R、およびU3領域を示す。LTRの転写部分は黒で示す。いくつかの制限エンドヌクレアーゼ切断部位もまた示す。
【図8】 トランスファー構築物1:pmBCmCNluciの概略図。記号は上述のとおり。
【図9】 パッケージング構築物pCMVgagpolBNkanのDNA配列(SEQ ID NO: 6)。相補鎖位置7814〜7002の翻訳物を、SEQ ID NO: 7に示す。
【図10】 トランスファー構築物1:pmBCwCNluciのDNA配列(SEQ ID NO: 8)。
【図11】 トランスファー構築物1:pmBCmCNluciのDNA配列(SEQ ID NO: 9)。
【図12】 野生型HIV-1分子クローンHXB2(SEQ ID NO: 12)およびNL4-3(SEQ ID NO: 13)、並びにトランスファー構築物におけるBssHII(711)からClaI(830)の領域のヌクレオチド配列。Gagタンパク質の翻訳イニシエーターシグナル(ATG)を下線で示す。pmBCwCNluciおよびpmBCmCNluci(トランスファー構築物1および2)は、配列mBCwCN(SEQ ID NO: 10)を含む。トランスファー構築物3は、配列m2BCwCN(SEQ ID NO: 11)を含む。配列mBCwCNと対照的に、m2BCwCNは、5'スプライシング部位領域に異なる変異を有し、そして無傷のGag ATGを有する。コンセンサス配列は、SEQ ID NO: 14に示す。
【図13】 pCMVgagpolBNkan(図ではpCMVBNKanと示す)での一過性トランスフェクションに際し、細胞から放出されるgagタンパク質のレベルを示す棒グラフ。
【図14】 Rev非依存的gag-pol HIV-1ベクターpCMVgagpolBNkan(図ではpCMVBNKanと示す)からの逆転写酵素活性を示す棒グラフ。
【図15】 PCMVgagpolBNkan Rev非依存的gag-HIV-1に基づくレトロウイルスベクターで形質導入された細胞において検出されるp24 Gagタンパク質のナノグラムあたりのルシフェラーゼ量を示す棒グラフ。結果は、PCMVgagpolBNkanを用いると、Rev非依存的gag-HIV-1に基づくレトロウイルスベクターが(A)293細胞、(B)ヒトリンパ球細胞、(C)ヒト骨髄球細胞(U937)と共に、(D)初代ヒトマクロファージなどの非分裂性細胞において、高い形質導入効率を示すことを示す。
【図16】 SIVエンベロープコードベクターCMVkan/R-R-SIVenvCTEの概略図。
【図17】 変異SIV env遺伝子を含むSIVエンベロープコードベクターCMVkan/R-R-SIVenvCTEのDNA配列(SEQ ID NO: 15)。翻訳物は、SEQ ID NO: 16として示す。相補鎖位置6547〜5732の翻訳物を、SEQ ID NO: 7に示す。
Claims (18)
- 図1に示されるgag/pol遺伝子のコード配列を有するHIV−1 gag/pol遺伝子を含む、核酸構築物。
- HIV又はSIV 5’ LTR、パッケージングシグナル、図1に示される配列を含むgag/pol遺伝子、5’スプライシング部位、3’スプライシング部位、env遺伝子、tat遺伝子、機能的なRNA輸送要素及び3’ HIV又はSIV LTRを含む核酸構築物であって、機能的なGag、Pol及びEnvビリオン構成要素を産生することが可能な、前記核酸構築物。
- 請求項1又は2記載の核酸構築物を含むベクター。
- 請求項1又は2記載の核酸構築物を含む形質転換宿主細胞。
- 細胞が真核細胞である、請求項4記載の形質転換宿主細胞。
- 細胞がヒト細胞である、請求項5記載の宿主細胞。
- 細胞が原核細胞である、請求項4記載の形質転換宿主細胞。
- 細胞が大腸菌である、請求項7記載の宿主細胞。
- レンチウイルス発現系であって:
(a)図1に示されるヌクレオチド配列を有するHIV−1 gag/pol遺伝子を含む、パッケージングベクター;
(b)トランスファーベクター;及び
(c)エンベロープコードベクター
を含む、前記系。 - 請求項9記載のレンチウイルス発現系を含む、形質転換宿主細胞。
- 細胞が真核細胞である、請求項10記載の形質転換宿主細胞。
- 細胞がヒト細胞である、請求項11記載の宿主細胞。
- レンチウイルス粒子を作製する方法であって、宿主細胞において、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子の存在下で、図1に示されるHIV Gag及びHIV Polをコードするヌクレオチド配列を含むベクターから、HIV Gag及びHIV Polを発現させることを含む、前記方法。
- Rev/RRE、及び任意にTat、の非存在下で機能することが可能であり、且つ感染性ウイルス粒子を産生することが可能なレンチウイルス発現系であって:
(a)阻害/不安定性領域を除去するよう変異しているHIV−1 gag/pol遺伝子を含む、パッケージングベクター;
(b)トランスファーベクター;及び
(c)env遺伝子が阻害/不安定性領域を除去するように変異しているエンベロープコードベクター;
を含む、前記系。 - 請求項14記載のレンチウイルス発現系を含む、形質転換宿主細胞。
- 細胞が真核細胞である、請求項15記載の形質転換宿主細胞。
- 細胞がヒト細胞である、請求項16記載の形質転換宿主細胞。
- Rev/RRE、及び任意にTat、の非存在下で感染性レンチウイルス粒子を作製する方法であって、宿主細胞において、阻害/不安定性領域を除去するよう変異しているHIV−1 gag/pol遺伝子から、HIV Gag及びHIV Polを発現させ、そしてenv遺伝子が阻害/不安定性領域を除去するように変異しているエンベロープコードベクターから、エンベロープタンパク質を発現させることを含む、前記方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US17303699P | 1999-12-23 | 1999-12-23 | |
US60/173,036 | 1999-12-23 | ||
PCT/US2000/034985 WO2001046408A2 (en) | 1999-12-23 | 2000-12-22 | Molecular clones with mutated hiv gag/pol, siv gag and siv env genes |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003517839A JP2003517839A (ja) | 2003-06-03 |
JP2003517839A5 JP2003517839A5 (ja) | 2008-02-28 |
JP4627950B2 true JP4627950B2 (ja) | 2011-02-09 |
Family
ID=22630264
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001546906A Expired - Lifetime JP4627950B2 (ja) | 1999-12-23 | 2000-12-22 | 変異HIVgag/pol、SIVgagおよびSIVenv遺伝子を持つ分子クローン |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP2128256B1 (ja) |
JP (1) | JP4627950B2 (ja) |
AT (1) | ATE438714T1 (ja) |
AU (1) | AU785133B2 (ja) |
CA (1) | CA2395269C (ja) |
DE (1) | DE60042702D1 (ja) |
ES (2) | ES2329648T3 (ja) |
WO (1) | WO2001046408A2 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2487300A (en) | 1998-12-31 | 2000-07-31 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
US6656706B2 (en) * | 1999-12-23 | 2003-12-02 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Molecular clones with mutated HIV gag/pol, SIV gag and SIV env genes |
US7211659B2 (en) | 2001-07-05 | 2007-05-01 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding antigenic HIV type C polypeptides, polypeptides and uses thereof |
JP2005524409A (ja) * | 2002-05-08 | 2005-08-18 | ファルマシア・イタリア・エス・ピー・エー | キメラ逆転写酵素及びテロメラーゼ阻害剤を同定する方法 |
TW200613554A (en) | 2004-06-17 | 2006-05-01 | Wyeth Corp | Plasmid having three complete transcriptional units and immunogenic compositions for inducing an immune response to HIV |
GB201501523D0 (en) * | 2015-01-30 | 2015-03-18 | Univ Plymouth | Differential immune response modulation |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6174666B1 (en) * | 1992-03-27 | 2001-01-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA |
EP1080201B1 (en) * | 1998-05-22 | 2008-01-23 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Novel post-transcriptional regulatory elements and uses thereof |
US6602705B1 (en) * | 1998-12-31 | 2003-08-05 | Chiron Corporation | Expression of HIV polypeptides and production of virus-like particles |
HUP0201019A2 (en) * | 1999-04-26 | 2002-08-28 | Leuven K U Res & Dev | Synthetic gene for expressing active retroviral protein in eukaryotes |
-
2000
- 2000-12-22 ES ES00989415T patent/ES2329648T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 EP EP09010047.0A patent/EP2128256B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 WO PCT/US2000/034985 patent/WO2001046408A2/en active Application Filing
- 2000-12-22 AU AU25923/01A patent/AU785133B2/en not_active Expired
- 2000-12-22 CA CA2395269A patent/CA2395269C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 JP JP2001546906A patent/JP4627950B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 EP EP00989415A patent/EP1246913B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 DE DE60042702T patent/DE60042702D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 AT AT00989415T patent/ATE438714T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-12-22 ES ES09010047T patent/ES2420842T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE438714T1 (de) | 2009-08-15 |
CA2395269A1 (en) | 2001-06-28 |
AU2592301A (en) | 2001-07-03 |
WO2001046408A9 (en) | 2002-11-07 |
EP2128256A3 (en) | 2009-12-23 |
ES2329648T3 (es) | 2009-11-30 |
EP1246913B1 (en) | 2009-08-05 |
WO2001046408A3 (en) | 2001-12-13 |
CA2395269C (en) | 2015-12-08 |
DE60042702D1 (de) | 2009-09-17 |
WO2001046408A2 (en) | 2001-06-28 |
ES2420842T3 (es) | 2013-08-27 |
EP1246913A2 (en) | 2002-10-09 |
EP2128256A2 (en) | 2009-12-02 |
EP2128256B1 (en) | 2013-06-26 |
AU785133B2 (en) | 2006-10-05 |
JP2003517839A (ja) | 2003-06-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7608422B2 (en) | Simian immunodeficiency virus (SIV) molecular clone encoding mutant gag gene lacking inhibitory/instability regions | |
JP3967374B2 (ja) | 同調的インビボ遺伝子発現 | |
AU729231B2 (en) | Synthetic HIV genes | |
US20080064106A1 (en) | Lentiviral LTR-deleted vector | |
AU2002303934A1 (en) | Molecular clones with mutated HIV gag/pol, SIV gag and SIV env genes | |
US20030229214A1 (en) | Vaccines comprising synthetic genes | |
KR20000070865A (ko) | 합성 HIV gag 유전자 | |
JP2002512804A (ja) | ヌクレオチド配列の導入のためのトリプレックス構造のdna配列の利用 | |
CA2258568A1 (en) | Vaccines comprising synthetic genes | |
JP2004502445A (ja) | 抗原性hivc型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびその使用 | |
JP2018183165A (ja) | レンチウイルスパッケージ化のための非サブタイプbのgagタンパク質の使用 | |
CZ2003784A3 (cs) | Zlepšené podmíněně se replikující vektory, způsoby jejich produkce a jejich použití | |
US20040033595A1 (en) | Conditionally replicating vectors for inhibiting viral infections | |
JP4627950B2 (ja) | 変異HIVgag/pol、SIVgagおよびSIVenv遺伝子を持つ分子クローン | |
US7749973B2 (en) | Methods of gene transfer to astrocytes with mokola virus pseudotyped lentivirus vectors | |
AU773015B2 (en) | Lentiviral vectors | |
US20220228169A1 (en) | Small ruminant lentivirus vector | |
US20060067948A1 (en) | Viral vectors | |
US20030087225A1 (en) | Synthetic HIV genes | |
AU2002249393A1 (en) | Viral vectors | |
MXPA98006842A (en) | Synthetic genes of | |
AU2002258639A1 (en) | Improved conditionally replicating vectors for inhibiting viral infections |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071221 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20071221 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080519 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080818 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080825 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081119 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090218 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090515 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090522 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090818 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090818 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100118 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100419 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100426 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100720 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100720 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101012 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101109 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131119 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4627950 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |