JP2002512804A - ヌクレオチド配列の導入のためのトリプレックス構造のｄｎａ配列の利用 - Google Patents

ヌクレオチド配列の導入のためのトリプレックス構造のｄｎａ配列の利用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、中央開始シス型活性領域（ｃＰＰＴ）及び終結シス型活性領域（ＣＴＳ）を含んでいるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組換えベクターに関し、該ベクターは、予定ヌクレオチド配列（トランスジーンすなわち問題のヌクレオチド配列）、及びレトロウイルス又はレトロウイルス様起源の再転写調節信号、発現信号、パッケージング信号更に含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本出願は、細胞内にヌクレオチド配列を導入するための、３本鎖構造又は組織
（「トリプレックスＤＮＡ」と呼ばれる）を呈する可能性のあるＤＮＡ配列の利
用、ならびにこれらのトリプレックス配列を含有する組換えベクターを目的とし
ている。
【０００２】 従って本発明は、例えば、遺伝子導入動物又は植物或いは又組換え細胞系又は
細胞を創り出すための遺伝子療法又は遺伝子導入のプロトコールの枠内で使用す
ることのできる新しい手段の定義づけ及び供給を目的とする。これらの手段は、
ヌクレオチド配列特に治療上問題の配列をヒト又は動物の体内の標的細胞内に導
入できる新しいベクターの作製をも含んでいる。
【０００３】 これまでに知られている遺伝子療法のアプローチの重大な１つの制限は、治療
向けの遺伝子のベクター化にある。オンコウイルス、主としてＭｏＭＬＶ由来の
レトロウイルスベクターは、遺伝子導入のために広く用いられてきた。その利用
分野は、オンコウイルスが活発な分裂状態にある標的細胞の中にしか組込まれな
いという事実によって著しく制限されている。反対に、レンチウイルスは、レト
ロウイルスの中でも独特の分裂していない分化細胞に感染する能力を有し、新し
いベクターの開発のための有利なウイルス候補となっている。オンコウイルスが
もつ長所（免疫原性の不在、安定した組込み）を保ちながら、レンチウイルスは
、非有糸分裂の分化済み組織（脳、筋肉、肝臓、肺…）の in vivo 形質導入を
可能にし、かくして遺伝子療法において多数の応用分野を見い出すことができる
だろう。
【０００４】 レンチウイルスからレトロウイルスベクターを構築するさまざまな試みが報告
されたきた。この点において、ＨＩＶ レトロウイルスから実施された Poznansk
y M. et al (J. Viol 1991, 65, 532-6), Naldini et al (Science, 1996, 272,
p263-7) の研究及びＦＩＶ レトロウイルスから実施された Poeschia EM et al
(Nature Medecine, 1998, 4, p354-7) の研究が挙げられる。
【０００５】 発明人らは、感染した細胞の核内へのレトロウイルスゲノムの進入メカニズム
（核移入メカニズム）に関与する決定因子を追究した。
【０００６】 移入に不可欠な決定因子トリプレックスＤＮＡの同定により発明人らは、標的
細胞内への遺伝子又より一般的にはヌクレオチド配列（以下では「トランスジー
ン」という表現で呼称される）の導入のために利用可能な新しい手段、特にベク
ターを定義するに至った。発明人らは、特にレンチウイルスファミリーの１員で
あるＨＩＶレトロウイルス（「ヒト免疫不全症候群ウイルス」又はＨＩＶ）で研
究を行ない、標的細胞内のＨＩＶのプロウイルスＤＮＡの核移入の原因であるウ
イルス決定因子：中央トリプレックスＤＮＡを同定し分離した。このトリプレッ
クスＤＮＡは、標的細胞の核内のベクターゲノムの進入を可能にする核移入決定
因子として、ＨＩＶ１ゲノムの天然の状況以外でベクター内にて機能できること
が明らかになった。
【０００７】 核内へのレトロウイルス ＤＮＡの進入メカニズムは、レトロウイルスのファ
ミリー間で著しく異なっている。レンチウイルスゲノムは、核孔を横断してのそ
の前組込み複合体（線状ＤＮＡ及び結合するタンパク質）のアドレッシングとそ
の後の移行を介して間期核の核膜を横断する能力をもつ。かくして、これらのウ
イルスは、標的細胞の分裂が無い状態でも複製する能力をもつ。これらは特に分
化した組織マクロファージ及び、ＨＩＶの伝播、播種及び生理病理学の中心にあ
る細胞である樹状細胞を感染させる。逆に、オンコウイルス及びスプーマウイル
スは、核膜によって表わされる障壁を横断することができない。それらの前組込
み複合体は有糸分裂そして核膜の組織崩壊を待ってから分裂染色体にアクセスし
組込まれなくてはならない。
【０００８】 ＨＩＶ１ウイルスのＤＮＡの核移入の原因であるウイルス決定因子は、発明人
らによって研究された。ＨＩＶの前組込み複合体の核移入の分子メカニズムを同
定し機能的に理解することは、実際に重大な根本的利益を提供することになる。
発明人らは、レンチウイルスのレトロ転写に特定的な段階によって生成された線
状ＤＮＡ分子の中心にあるトレプレックスであるＤＮＡ構造がこの移入を支配す
ることになるＨＩＶ−１ゲノムの核移入に独自のメカニズムを同定した。
【０００９】 レンチウイルスレトロ転写の際に生成された線状ＤＮＡ分子の中心、特にＨＩ
Ｖレトロウイルス内に存在するトリプレックスＤＮＡ構造については、該発明人
により、異なる先行刊行物の中で記述されてきた（Charneau P. et al., J. Mol
. Biol. 1994, 241, 651-662; Charneau P. et al. Journal of Virology, 1991
年５月、p.2415-2421; Charneau P. et al. Journal of Virology, 1992, vol.6
6, p.2814-2820。
【００１０】 ウイルスレトロ転写の際にトリプレックスを形成するＤＮＡ構造は、シス型活
性中央開始領域すなわちポリプリン領域（ｃＰＰＴ）、及びシス型活性終結領域
（ＣＴＳ）を有するポリヌクレオチドであり、これらの領域は、ＨＩＶ又はその
他のレンチウイルスのゲノムの中心に存在するＰＰＴ領域によりその合成が開始
される１つのストランド+の転写の開始、及びレトロウイルスＬＴＲの上流側の
ＰＰＴ３′部位のレベルでその合成が開始される第２のストランド+の合成の中
断を可能にする（図１）。
【００１１】 トリプレックスＤＮＡ構造の形成は、ＣＴＳ配列により遮断された、レトロウ
イルスゲノム内部での逐時的に部分的に位置が変った結果である（Charneau et
al, J. Mol. Biol, 1994）。
【００１２】 ここで利用されている「トリプレックスＤＮＡ」という語は、ストランド間の
構造化に言及することなく、３本のストランドをもつＤＮＡ領域を意味する（変
位した自由なストランド又は、３重らせん又はＤ−ループなどを形成するストラ
ンド）。
【００１３】 レトロ転写の際にかくして形成されるトリプレックスＤＮＡ構造は、細胞の核
の中へのレトロウイルスゲノムの進入を可能にするか又は少なくともそれに貢献
し、このため非有糸分裂でない細胞の感染を可能にする。
【００１４】 標的細胞の核内のレトロウイルスの進入のために必要とされるこのメカニズム
の同定に基づいて、該発明人らは、トリプレックスＤＮＡ領域を内含するレンチ
ウイルスベクターを新規に産出した。ＨＩＶ−１ゲノムに由来し、シス型活性の
ｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列を含むＤＮＡフラグメントをＨＩＶベクター系内に導入
することで、ベクターＤＮＡの核移入率を刺激することにより細胞内の遺伝子の
形質導入は増大する。このトリプレックスをもつレンチウイルスベクターの生成
は、分裂しているか又は分裂していない細胞内での遺伝子の形質導入を著しく改
善させる。
【００１５】 本発明は、レトロ転写全般においてシス型活性のｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域、そ
して特に正常なレトロウイルスゲノム内に置かれた場合に結合させられ各々少な
くとも１０個のヌクレオチドを含有する２つのポリヌクレオチドを含む、合成に
より調製可能なレトロウイルス又はレトロウイルス様起源のヌクレオチド配列に
関する。
【００１６】 本発明に従ったヌクレオチド配列は、一方の側にはＨＩＶ１の場合「ｃＰＰＴ
」と呼ばれる短かいヌクレオチド配列（最小１０塩基対）そしてもう一方の側に
はＨＩＶ１の場合少なくとも１０塩基対の「ＣＴＳ」と呼ばれる配列を含んで成
る（問題のシス型活性配列がカッコ内に入った図１１Ｇを参照のこと）。２つの
シス型活性配列及び、レトロウイルスゲノムに由来しこれら２つのシス配列の間
に位置づけされた２つの配列は、天然のＨＩＶ１ゲノムの場合において約１２０
個のヌクレオチドに対応する。
【００１７】 本発明は同様に、一方ではＣＴＳ領域（ＨＩＶ１起源以外の使用ゲノムの起源
の場合においては同等の領域ではあるもののただし Charneau et al, J. Mol. B
iol., 1994によって公示されたＣＴＳ領域と同じ特性を有している領域）、そし
て他方ではＣＴＳの上流側にてＨＩＶ１の場合においては約９０〜１１０個好ま
しくは９９個のヌクレオチドを有する領域で構成されたＤＮＡの３本のストラン
ドを含むヌクレオチド配列にも関する。
【００１８】 本発明は、ＨＩＶ１のゲノムの中に天然に存在するポリヌクレオチド配列（或
いは天然又は合成の同等の配列）に結びつけられたｃＰＰＴ領域（「ポリプリン
領域」）に対応する２本鎖のＤＮＡフラグメント及び、最終的にレトロ転写後に
３本鎖の領域の終りを構成する高次構造を採用するヌクレオチド ＣＴＳ領域（
３′側）含むポリヌクレオチドにも関する。
【００１９】 この３本鎖の高次構造は、「トリプレックス配列」と呼ばれる。
【００２０】 一例を挙げると、トリプレックス配列はＨＩＶ１について図１１Ｆに、又図１
１Ｇに記されている配列である。in vivo でトリプレックスは、それが真核細胞
の核膜の侵入のために利用可能なベクター内に存在する場合、修飾又は形質導入
すべき細胞の核内のＤＮＡ移入を刺激する。
【００２１】 本発明は、レセプターである真核細胞の核内にトリプレックス配列が結びつけ
られているヌクレオチド配列を導入することを目的とする単独でか又はベクター
内に入った状態でのこのトリプレックス配列の利用に関する。
【００２２】 かくして、本発明の目的は、シス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス型
活性終結領域（ＣＴＳ）を有するポリヌクレオチドを含み、これらの領域がレト
ロウイルス又はレトロウイルス様起源のものであること及び、さらに規定のヌク
レオチド配列（トランスジーンすなわち問題の配列）及びレトロウイルス又はレ
トロウイルス様起源のレトロ転写、発現及びカプシド化調節シグナルが含まれる
ことを特徴とする組換えベクターにある。
【００２３】 利用された「ポリヌクレオチド」という語は、それが例えばｃＤＮＡといった
ようなＤＮＡであるかＲＮＡであるかに関わらず、１本鎖又は２本鎖又は３本鎖
の形をした全ての核酸配列のことを意味する。
【００２４】 一例を挙げると、本発明の目的は、内因性遺伝子の機能不良を補正するべく、
１つの生体の体細胞の中に欠損活性をモジュレート又は回復するヌクレオチド配
列を挿入するため、又は治療を目的として補足的機能特に１つの遺伝子の発現又
は活性の抑制機能の発現を可能にするための、治療を目的とした、特に体細胞遺
伝子治療プロトコールの枠内でのトランスジーンの導入を目的としている。
【００２５】 「治療の」という表現は、予防効果又は治ゆ効果を追求すること又は得ること
、或いは、患者の病的状態の改善又は安定化を追求すること又は得ることを意味
する。
【００２６】 従って本発明の枠内では、一例として、問題のヌクレオチド配列又はトランス
ジーンと呼ばれるヌクレオチド配列は、遺伝子又はその一部分又は遺伝子由来の
配列、例えばｃＤＮＡ又はＲＮＡでありうる。同様に、これは、アンチセンス配
列、所定の遺伝子の負の突然変異体配列又は遺伝子の転写、発現、活性化機能に
介入する配列であってもよく、さらには、プロドラッグ又は細胞障害性物質の活
性化のための適切な配列でもあり得る。
【００２７】 本発明の枠内のトランスジーン配列は、例えばそれが抗原提示細胞を形質転換
するために利用される場合、細胞又は体液性の免疫応答の、刺激又は誘発活性を
有することができる。
【００２８】 かくして、本発明は、例えばデュシェーヌ筋障害、膵線維症などを含む、１つ
の遺伝子の変化を有する遺伝病、神経変性疾患さらには自然に免疫系の応答低下
を導く悪性疾患といった後天性疾患のものといったようなさまざまな分野におけ
る遺伝子療法を目的として利用可能なベクターの調製に応用することができる。
本発明は同様に、例えばガンといったような疾病又はエイズといったような疾病
の場合においてＣＴＬの産生により病原性作用物質に対する応答を刺激するため
、又は自己免疫疾患において自らの抗原に対する応答を減少させるため免疫療法
での治療を考慮にすることをも可能にする。
【００２９】 本発明は同様に、予防用又は治療用の免疫原性組成物又はワクチンの作製を可
能にする手段又は免疫原性組成物の供給にも関する。
【００３０】 本発明に従ったトリプレックスＤＮＡを含有するレンチウイルスベクターは同
様に、胚性細胞又は細胞系内の遺伝子の形質導入による、遺伝子導入動物の構築
のためにも利用される。
【００３１】 本発明のベクターは、ウイルス又は非ウイルスの転写又は発現調節配列の制御
下で挿入されたトランスジーンを含有している。
【００３２】 トランスジーンは、細胞内のその発現の調節にとって適切な配列を含む発現の
カセットの中に内含され得る。
【００３３】 本発明の特に有利な第１の実施形態は、組換えベクターが、自ら含有するレト
ロウイルス由来の配列がレンチウイルスのゲノム由来のものであることを特徴と
しているようなものである。
【００３４】 本出願の枠内では、「誘導された」という語は、レトロウイルスのゲノム内に
収納された配列と同一のあらゆる配列、又は本発明のベクターの内部でのその挿
入を目的として自らレトロウイルスゲノム内で有する基本的機能を保存している
かぎりにおいて、突然変異、挿入、欠失、組換えにより修飾された全ての配列を
包含する。
【００３５】 かかる配列は、特にクローニング及び／又は増幅工程を含む、その起源生体か
らのヌクレオチド配列の同定及び分離を可能にするそれ自体既知のあらゆる手段
によってか又は利用可能なあらゆる技術に従った合成によって得ることができる
。
【００３６】 代替的には、本発明に従ったベクターは、レトロウイルス様起源の配列がレト
ロトランスポゾンに由来することを特徴とする。この点で、例として酵母のレト
ロトランスポゾンＴＹ１を挙げることができる（Heyman T et al）。
【００３７】 このように記述した組換えベクターは、例えば、場合によっては発現カセット
内に収納されたトランスジーン及びレトロウイルス又はレトロウイルス様の構成
により組換えられたプラスミドであり得る。
【００３８】 組換えベクターは同様に、レトロトランスポゾン、細菌の中に導入され得る繊
維状ファージ又はファージλといったようなファージ、又は、ＹＡＣといったよ
うな酵母を形質転換する能力をもつベクターであってもよい。
【００３９】 かかるベクターは、トリプレックスをもつレンチウイルスベクターを含むＡＡ
Ｖタイプのベクター又はアデノウイルスベクターによる形質導入又は感染又はト
ランスフェクションを含むそれ自体既知のあらゆる方法によって、細胞特に標的
細胞及び／又はカプシド化細胞を形質導入するために利用可能である。
【００４０】 このように定義したベクターは、選択されたレトロウイルス特にレンチウイル
スのゲノムの構造ポリペプチド又はレトロトランスポゾンの構造ポリペプチドを
コードする配列をもたらす付加的な単数又は複数のベクターによってトランス相
補されうる。
【００４１】 この点で、本発明のベクターは、ポリペプチドＧＡＧ、ＰＯＬ及びＥＮＶ又は
、ウイルス遺伝子が備わっておらず発現が探求をされているトランスジーンを有
する組換えベクターをベクター化することを目的としたレトロウイルス粒子の形
成を可能にするのに充分なこれらのポリペプチドの一部分をコードする配列をも
たらすことによって、トランス相補され得る。
【００４２】 本発明に従ったベクターは、トランスジーンすなわち問題の配列が転写及び発
現調節シグナルを含む発現カセット内に収納されていることによって特徴づけさ
れ得る。
【００４３】 一般的に言って、レトロウイルス又はレトロウイルス様タンパク質のトランス
相補のために利用されるベクター（単複）には、カプシド化シグナルが備わって
いない。
【００４４】 これに関しては、本発明に従った組換えベクターのトランス相補のために利用
可能な Goldman et al（1997）の技術に従って調製されるベクターを挙げること
ができる。
【００４５】 本発明は同様に、 ａ） レンチウイルスの核タンパク質又は機能的誘導ポリペプチド（ポリペプ
チドＧＡＧ）に対応するｇａｇポリペプチド、 ｂ） レンチウイルスのタンパク質ＰＴ、ＰＲＯ、ＩＮ又は機能的誘導ポリペ
プチド（ポリペプチドＰＯＬ）で構成されたｐｏｌ ポリペプチド、 ｃ） エンベロープポリペプチド又は機能的誘導ポリペプチド（ポリペプチド
ＥＮＶ）、 ｄ） 転写及び発現調節シグナルの制御下に置かれた規定のヌクレオチド配列
（トランスジーンすなわち問題の配列）、レトロウイルス又はレトロウイルス様
起源のレトロ転写、発現及びカプシド化を調節するシグナルを含む配列、及びシ
ス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス型活性終結領域（ＣＴＳ）を有し、
これらの領域がレトロウイルス又はレトロウイルス様起源のものであり、レトロ
ウイルス又はレトロウイルス様起源の前記調節シグナルと共に機能しうる配向で
挿入されているポリヌクレオチドを含む組換えヌクレオチド配列、 を含んで成る組換えレトロウイルスベクター粒子をも目的とする。
【００４６】 本発明は同様に、 ａ） レンチウイルスの核タンパク質又は機能的誘導ポリペプチド（ポリペプ
チドＧＡＧ）をコードするｇａｇ配列と呼ばれるヌクレオチド配列、 ｂ） レンチウイルスのタンパク質ＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮ及びＲＮ又は機能的誘
導ポリペプチド（ポリペプチドＰＯＬ）をコードするＰＯＬ配列と呼ばれるヌク
レオチド配列、 ｃ） ｇａｇ及びｐｏｌ配列の転写及び発現の調節シグナル、 ｄ） エンベロープポリペプチド又は機能的誘導ポリペプチド（ポリペプチド
ＥＮＶ）についてコードし、転写及び発現の調節シグナルの制御下に置かれてい
るｅｎｖ配列と呼ばれるヌクレオチド配列、 ｅ） 転写及び発現調節シグナルの制御下に置かれた規定のヌクレオチド配列
（トランスジーン）、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源のレトロ転写、
発現及びカプシド化を調節するシグナルを含む配列、及びシス型活性中央開始領
域（ｃＰＰＴ）及びシス型活性終結領域（ＣＴＳ）を有し、これらの領域がレト
ロウイルス又はレトロウイルス様起源のものであり、レトロウイルス又はレトロ
ウイルス様起源の調節シグナルと共に機能しうる配向で挿入されているポリヌク
レオチドを含む組換えヌクレオチド配列、 を含んで成る組換えレトロウイルスベクター粒子をもその目的としている。
【００４７】 １つの変形実施形態に従うと、本発明は、レトロウイルス又はレトロウイルス
様起源のシス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス型活性終結領域（ＣＴＳ
）を含むポリヌクレオチドを含むヌクレオチド配列において、これら２つの領域
の各々が内部ヌクレオチドの連鎖をとり囲んでおり、前記シス型活性領域ｃＰＰ
Ｔ及びＣＴＳが、レトロウイルス又はレトロウイルス様起源のレトロ転写調節シ
グナルと共に機能しうる配向でその内部で挿入されているヌクレオチド配列を目
的とする。
【００４８】 ポリペプチドＧＡＧ及びＰＯＬは、ウイルスプロテアーゼによって分割された
前駆物質に由来する核タンパク質のポリペプチドである。ポリペプチドＰＯＬは
、レトロウイルスの逆転写酵素（ＲＴ）、プロテアーゼ（ＰＲＯ）、インテグラ
ーゼ（ＩＮ）及びリボヌクレアーゼＨ（ＲＮ）を含む。場合によっては、レトロ
ウイルスのその他のタンパク質も同様にベクター粒子の構築のために利用される
。利用されているタンパク質又はポリペプチドという語は、問題のポリペプチド
のグリコシル化されていない形又はグリコシル化された形を網羅するという点を
指摘しておく。
【００４９】 レトロウイルスベクター粒子の構築のために利用される配列ｇａｇ、ｐｏｌ及
びｅｎｖは、場合によっては、例えば点突然変異といった突然変異によってか又
は単数又は複数のヌクレオチドの欠失又は挿入によって修飾されていてもよいし
、或いは、発現すべきトランスジーンをベクター化する能力をもつウイルス粒子
の産生のための機能的ポリペプチドの産生を可能にするかぎりにおいて、例えば
ＨＩＶ１及びＨＩＶ２、又はＨＩＶ１及びＣＡＥＶ（ヤギ関節炎脳炎ウイルス）
の中の異なるレトロウイルスに由来する組換えキメラに由来していてもよい。特
に、このように産生されたレトロウイルスの安全性を増大させるよう突然変異さ
れた配列が利用されることになるだろう。
【００５０】 有利には、本発明の組換えベクター又は組換えベクター粒子は、トランスジー
ンが非レトロウイルス起源の転写及び発現調節シグナルの制御下にあるようなも
のである。トランスジーンの発現を制御するために利用される可能性のあるプロ
モータは、例えば、Tripathy, SK et al.（PNAS 1994, 91, p11557-11561）の中
に記述されているＣＭＶのプロモータ、プロモータＰＧＫ又はＥＦ１αである。
【００５１】 しかしながら、本発明の１変形形態に従うと、トランスジーンは、先にレトロ
ウイルス又はレトロウイルス様起源のものであるとして同定された調節シグナル
の制御下、特にＬＴＲ配列の制御下に置くことが可能である。
【００５２】 本発明に従ったレトロウイルス構成を誘導するために利用されるレンチウイル
スは、例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２といったＨＩＶレトロウイルス又はこれら
２つのタイプとは異なる全ての分離株の中からか、又は例えばＣＡＥＶ（ヤギ関
節炎脳炎ウイルス）、ＥＩＡＶ（ウマ感染性貧血ウイルス）、ＶＩＳＮＡ、ＳＩ
Ｖ（サル免疫不全症ウイルス）又はＦＩＶ（ネコ免疫不全症ウイルス）の中から
選択できる。
【００５３】 本発明に従った特に有利なベクターは、ポリヌクレオチドが、ＨＩＶ−１レト
ロウイルス又はその他全てのレンチウイルスのゲノムのシス型活性中央開始領域
（ｃＰＰＴ）及び終結領域（ＣＴＳ）を含むＤＮＡ配列であることを特徴とする
ベクターである。
【００５４】 中央ＰＰＴつまりｃＰＰＴ配列は、レンチウイルスの内部で比較的保存されて
いる配列であり、図１１Ｈに一部が示されている数多くの残基によって同定され
る。これらの領域のうちの１つの内部での突然変異は、たとえ点突然変異であっ
ても、トリプレックスＤＮＡ構造の形式に結びつけられるそれらの機能的性質を
消し去る可能性がある。
【００５５】 ｃＰＰＴ配列の同定は、全てのレンチウイルスにおけるＬＴＲ３′の上流境界
部（５′）に位置づけされたポリプリン配列の、レンチウイルスにおけるゲノム
中央での反復が問題となっているという事実によって容易になっている。このｃ
ＰＰＴ配列は、ＨＩＶ−１ウイルスの場合のように正確な反復であってもよいし
或いはその他のレンチウイルスにおいてはわずかに修飾されている可能性もある
（図１Ｈ）。中央終結配列ＣＴＳは、ＨＩＶ−１ウイルスのケースにおいて特徴
づけられている（Charneau et al, 1994）。この配列は、ｃＰＰＴ配列の上流側
約１００ヌクレオチドのところにある。その他のレンチウイルスにおいては、こ
こでも又ｃＰＰＴ配列の下流側約１００ヌクレオチド（８０〜１２０ヌクレオチ
ド）のところにＣＴＳ候補配列が見られる。ＣＴＳ配列の確率の高い位置は、い
くつかのレンチウイルスにおいて図１１Ａ−１１Ｅ上に表わされている。
【００５６】 レンチウイルス ＥＩＡＶのＣＴＳ配列は、近年になって特徴づけられている
（Scott R. Stetor et al., Biochemistry 1998, 38, P3656-67）、これらの著
者によると、ＥＩＡＶにおいては、配列ｃＰＰＴ及びＣＴＳはそれぞれ５′ＡＡ
ＣＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＡ３′及び５′ＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＣ
ＡＡＡＡＴＣ３′である。
【００５７】 本発明の枠内で利用可能な好ましいポリヌクレオチドとしては、例えば、図１
１に表わされている配列、より精確に言うと、２つの領域ｃＰＰＴとＣＴＳの間
に含まれるこれらの領域の配列を内含する配列が挙げられる。
【００５８】 場合によっては、ｃＰＰＴ、内部ポリヌクレオチド（つまりＣＴＳ配列までｃ
ＰＰＴを結合させるポリヌクレオチド）及びＣＴＳ配列を含むヌクレオチド配列
は、点突然変異又はヌクレオチドの欠失又は挿入による突然変異を受ける可能性
がある。一例を挙げると、ＨＩＶ−１のｃＰＰＴ配列内で点突然変異が実施され
、細胞内に残留感染力が維持されていることを示した（Charneau et al, J. Vir
ol. 1992, 66, p.2814-2820）。
【００５９】 本発明は、起源である天然の相同なシス型活性ヌクレオチド配列と少なくとも
６０％の同一性をもつ、ｃＰＰＴ又はＣＴＳについて突然変異誘発を受けた全て
の配列を網羅している。キメラシス型活性配列の場合、この百分率は、キメラの
突然変異を受けた各々のヌクレオチド配列にあてはまる。
【００６０】 本発明に従ったトリプレックスＤＮＡを構築するためにＰＰＴ又はｃＰＰＴ又
はＣＴＳ領域のヌクレオチド配列の修飾を、導入することができる。これらの修
飾は、天然の配列の４０％にまで達し得る。
【００６１】 天然と呼ばれる配列に対する変異体ヌクレオチド配列の同一性は、完全トリプ
レックスＤＮＡのヌクレオチド配列との関係においてではなく厳密に個別にＣＴ
Ｓ又はｃＰＰＴとの関係において計算される。
【００６２】 ｃＰＰＴとＣＴＳの間に含まれる領域は、ＣＴＳとＰＰＴの間の起源のレトロ
ウイルスゲノム内に見出されるものであってもよいし又はトリプレックスＤＮＡ
が核内部に問題のヌクレオチド配列を導くことを可能にするポリヌクレオチドの
核移入においてその特性を保存することを条件として前述のものとは異なるもの
であってもよい１つのポリヌクレオチドによって構成されている。
【００６３】 本発明に従ったポリヌクレオチドは、複製ベクター又は非複製ベクターの中に
導入され得る。レトロウイルスベクターの場合、問題となるのは非複製タイプの
ベクターである。
【００６４】 レトロウイルスベクター粒子を大量に調製するためには、トリプレックスＤＮ
Ａ配列及びｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の配列を含むレトロウイルスゲノム
に対応するポリヌクレオチドが導入されたアデノウイルスタイプのベクターを利
用することが可能である。
【００６５】 これらのアデノウイルスのベクターは、場合によって、複製起点配列の導入に
より複製ベクターにすることができるものである。
【００６６】 図１１Ｇにおいて、ＨＩＶ−１のｃＰＰＴ及びＣＴＳ配列はカッコ内に入れら
れている。
【００６７】 いずれにせよ、標的細胞内のゲノムのレトロ転写の際にＤＮＡトリプレックス
を形成する能力を保っている突然変異を受けた配列が利用されることになる。
【００６８】 従って、本発明の特殊な一実施形態に従った組換えベクターは、レトロウイル
ス又はレトロトランスポゾンＬＴＲ配列の全部又は一部分、レトロウイルス部位
ＰＢＳ及びＰＰＴ３′末端、つまりベクター粒子内のベクターゲノムのカプシド
化に必要なレトロウイルス配列を含むことができる、ＬＴＲ配列は、一部分、特
にＵ３領域内で、欠失していてよい。
【００６９】 本発明に従った特定のベクターは、１９９８年４月１５日付でＩ−２００５と
いう番号でＣＮＣＭ（フランス国立パスツール研究所微生物培養収集機関）に寄
託されたプラスミドｐＴＲＩＰ．ＥＧＦＰである。このベクターの制限地図は、
図１０に表わされている。
【００７０】 本発明に従ったもう１つのベクターは、１９９９年４月２０日付でＣＮＣＭに
寄託されたプラスミドｐＴＲＩＰ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰである。このベク
ターは、図１４に表わされたプラスミドｐＴＲＩＰ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ
である。
【００７１】 本発明に従った特定の組換えのベクターは、配列ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖが
同様にレンチウイルス、特にＨＩＶＲＥＶ特にＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の配列
にも由来することを特徴とする。
【００７２】 本発明のもう１つの実施形態に従うと、配列ｇａｇ及びｐｏｌは、ＨＩＶＲＥ
Ｖから誘導されており、配列ｅｎｖは、ＨＩＶとは全く異なるＲＥＶ又は例えば
、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）といったようなウイルスに由来する。
【００７３】 一般的に、求められているトランスジーンの発現に応じて、トランスジーンを
発現したい宿主との関係におけるアンフォトロピックｅｎｖポリペプチドをコー
ドするｅｎｖ配列を利用することを選択するか又は反対に、エコトロピックｅｎ ｖ ポリペプチドをコードするｅｎｖ配列を選択することになる。ｅｎｖ配列の向
性は、特異的にヒトの向性であってよい。
【００７４】 本発明は同様に、転写及び発現調節シグナルの制御下に置かれた規定のヌクレ
オチド配列（トランスジーンすなわち問題の配列）、レトロ転写、発現及びカプ
シド化調節シグナル及びシス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス型活性終
結領域（ＣＴＳ）を有するポリヌクレオチドを含む組換えヌクレオチド配列を含
んで成る組換えベクター粒子をも目的とする。
【００７５】 本発明は同様に、転写及び発現調節シグナルの制御下に置かれた規定のヌクレ
オチド配列（トランスジーン）、レトロトランスポゾンのレトロ転写、発現及び
カプシド化を調節するシグナル及び、シス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及び
シス型活性終結領域（ＣＴＳ）を有するポリヌクレオチドを含む組換えヌクレオ
チド配列を含んで成る組換えベクター粒子において、前記領域がレトロトランス
ポゾンから誘導され、レトロトランスポゾンの調節シグナルと共に機能しうる配
向で挿入されている、組換えベクター粒子にも関する。
【００７６】 さらに、本発明は又 ａ） レトロトランスポゾンの核タンパク質又は機能的誘導ポリペプチドに対
応するポリペプチドＧＡＧ、 ｂ） レトロトランスポゾンのタンパク質ＰＴ、ＰＲＯ、ＩＮ又は機能的誘導
ポリペプチドに対応するポリペプチドＰＯＬ、 ｃ） ｇａｇ及びｐｏｌ配列の転写及び発現調節シグナル、 ｄ） 転写及び発現調節シグナルの制御下に置かれた規定のヌクレオチド配列
（トランスジーン）、レトロトランスポゾンのレトロ転写、発現及びカプシド化
を調節するシグナルを含む配列、及びシス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及び
シス型活性終結領域（ＣＴＳ）を有し、これらの領域がレトロトランスポゾン由
来のものであり、レトロトランスポゾンの調節シグナルと共に機能しうる配向で
挿入されているポリヌクレオチドを含む組換えヌクレオチド配列、 を含んで成る組換えレトロウイルスベクター粒子、 をも目的とする。
【００７７】 さらに、本発明は同様に、 ａ） レトロトランスポゾンの核タンパク質又は機能的誘導ポリペプチド（ポ
リペプチドＧＡＧ）をコードするｇａｇ配列と呼ばれるヌクレオチド配列、 ｂ） レトロトランスポゾンのタンパク質ＲＴ、ＰＲＯ及びＩＮ又は機能的誘
導ポリペプチド（ポリペプチドＰＯＬ）をコードするｐｏｌ配列と呼ばれるヌク
レオチド配列、 ｃ） ｇａｇ及びｐｏｌ配列の転写及び発現の調節シグナルの発現の結果とし
て得られるベクター粒子において、 エンベロープポリペプチド又は機能的誘導ポリペプチド（ポリペプチドＥＮＶ
）についてコードし、転写及び発現の調節シグナルの制御下に置かれているｅｎ ｖ 配列と呼ばれるヌクレオチド配列、 ｅ） 転写及び発現調節シグナルの制御下に置かれた規定のヌクレオチド配列
（トランスジーン）、レトロトランスポゾンのレトロ転写、発現及びカプシド化
を調節するシグナルを含む配列、及びシス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及び
シス型活性終結領域（ＣＴＳ）を有し、これらの領域がレトロトランスポゾン由
来のものであり、レトロトランスポゾンの調節シグナルと共に機能しうる配向で
挿入されているポリヌクレオチドを含む組換えヌクレオチド配列 を含んで成る組換えレトロウイルスベクター粒子をもその目的としている。
【００７８】 本発明は同様に、ａ） シス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス型活性
終結領域（ＣＴＳ）を有するポリヌクレオチドであって、これらの領域がレトロ
トランスポゾンから誘導されレトロトランスポゾンの調節シグナルと共に機能し
うる配向で挿入されているポリヌクレオチド、 ｂ） レトロトランスポゾンの核タンパク質又は機能的誘導ポリペプチド（ポ
リペプチド ＧＡＧ）に対応するポリペプチド、 ｃ） レトロトランスポゾンのタンパク質ＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮ又は機能的誘導
ポリペプチド（ポリペプチドＰＯＬ）に対応するｐｏｌポリペプチド、 ｄ） ウイルスエンベロープポリペプチド、 ｅ） 転写及び発現調節シグナルの制御下に置かれた規定のヌクレオチド配列
（トランスジーンすなわち問題の配列）、レトロ転写、発現及びカプシド化を調
節するシグナルを含んで成る組換えヌクレオチド配列、 を含んで成るレトロウイルス様組換え粒子をも目的とする。
【００７９】 本発明は例えば、ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチド及びレトロ
転写、発現及びカプシド化を調節するシグナルが例えば酵母レトロトランスポゾ
ンといったレトロトランスポゾンに由来する、前述のような組換えベクターに関
する。
【００８０】 一般にベクター粒子の構造ポリペプチドをコードする配列又はトランスジーン
の転写及び発現調節シグナルは、それらがレトロウイルス又はレトロウイルス様
起源のものでない場合、有利には、組織特異的発現を導く可能性のある、条件付
き又は誘発可能なシグナル。
【００８１】 同様に本発明の枠内に入るのは、前述の定義づけのうちの１つに従ったベクタ
ーと組換えられることを特徴とする組換え細胞である。組換えは、利用可能なあ
らゆる手段特にトランスフェクション又は感染、特にベクターによる形質導入又
はトランスフェクションによって実施され得る。
【００８２】 かくして、細胞は、一過的にトランスフェクションを受けることもできるし又
は反対に安定した形でトランスフェクションされることもある。ここで問題とな
っているのは、カプシド化細胞又は標的細胞、特にその中でトランスジーンの発
現による治療効果が求められているような細胞である。
【００８３】 きわめて興味深いことに、本発明のベクターを用いた形質導入のおかげでトラ
ンスジーンを発現できる組換え細胞は、非有糸分裂の分化された真核細胞である
。
【００８４】 しかしながら、本発明は同様に、非有糸分裂初代真核組換え細胞、或いは又有
糸分裂細胞の調製をも可能にする。
【００８５】 一例としては、肺細胞、脳細胞、上皮細胞、星状細胞、小グリア細胞、オリゴ
デンドロサイト及びニューロン、筋細胞、肝細胞、樹状細胞、神経細胞、骨髄細
胞、マクロファージ、線維芽細胞、リンパ球、造血細胞が挙げられる。
【００８６】 従って本発明は、前述のようなベクター又は前記指示事項に記載の組換え細胞
を含むことを特徴とする、治療目的の組成物を目的とする。
【００８７】 本発明は同様に、上述のようなベクター又は上述の細胞を含み、規定の宿主内
で免疫、細胞又は体液性応答を導く可能性のある免疫原性組成物にも関する。
【００８８】 従って、本発明は、レトロウイルス又はレトロウイルス様のｃＰＰＴ及びＣＴ
Ｓ領域を含む前述のようなポリヌクレオチドを提供し、特に規定の細胞内で ex vivo でのヌクレオチド配列（トランスジーン）の核移入を目的としたその利用
に門戸を開くものである。
【００８９】 その上、本発明は、問題のヌクレオチド配列又はトランスジーンに結びつけら
れた上述のようなポリヌクレオチドを利用可能にする。
【００９０】 最後に、本発明は、問題のポリヌクレオチド又はトランスジーンでの真核細胞
のトランスフェクション又は形質導入を目的とする、シス型活性中央開始領域（
ｃＰＰＴ）及びシス型活性終結領域（ＣＴＳ）を有しこれらの領域がレトロウイ
ルス又はレトロウイルス様起源のものであるポリヌクレオチドの利用に関する。
【００９１】 本発明は同様に、in vivo での形質導入のための本発明のポリヌクレオチド又
は組換えベクターの利用にも関する。
【００９２】 本発明のもう１つの特徴及び利点は、以下の実施例及び図面から明らかとなる
。
【００９３】 材料と方法 ベクタープラスミドの構築 プラスミドｐＴＲＩＰ−ＬａｃＺ及びｐＴＲＩＰ−ＥＧＦＰは、ｐＨＲ′ＣＭ
ＶｌａｃＺ構成に由来する（Naldini et al, 1996）。ｐＨＲ′ＣＭＶｌａｃＺ
のリポータ遺伝子ＬａｃＺは、自己螢光タンパク質ＥＧＦＰのＯＲＦによって置
換された。ＥＧＦＰ遺伝子は、忠実な熱安定性ポリメラーゼＰｆｕ（Stratagene
) を用いてプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Clotech)からＰＣＲにより増幅された
。 利用されたＰＣＲプライマの配列は以下のとおりである： Ｂam ＥＧＦＰ：５′cc gga tcc cca ccg gtc gcc acc３′ Ｘho ＥＧＦＰ：５′cc ctc gag cta gag tcg cgg ccg３′
【００９４】 ＰＣＲ増幅は、以下の条件下で３０サイクル実施された： − 変性 ９５℃、３０秒 − ハイブリダイゼーション ５０℃、１分 − 伸長 ７５℃、３０秒
【００９５】 制限部位 BamＨＩ及び Ｘhoｌには、それ自体 BamＨＩ及び ＸhoＩによって消
化されたベクターフラグメントｐＨＲ′ＣＭＶの中で配向された形で挿入するよ
うに、フラグメントＰＣＲ ＦＧＦＰがそれぞれ５′及び３′に付加された。組
換えＤＮＡの従来の技術（Maniatis et al, 1983）によるフラグメントＰＣＲ
ＦＧＦＰの挿入によってプラスミドｐＨＲ−ＥＧＦＰが生成された。
【００９６】 ＨＩＶ−１ゲノムの中央領域に対応し、ＨＩＶのレトロ転写中のトリプレック
スの形成を担うシス型活性ボックスを含む１８４ｂｐのフラグメントを、プロモ
ータＣＭＶの上流側でプラスミドｐＨＲ−ＥＧＦＰ及びｐＨＲ′ＣＭＶｉａｃＺ
のＣｌａｌ部位の中に挿入した。トリプレックス中央領域は、野生型トリプレッ
クス配列を含むＨＩＶ−１ ＬＡＩゲノムの完全プロウイルスプラスミドからＰ
ＣＲにより増幅されるか（ｐＢＲＵ３；Charneau et al, 1991）、又はシス型活
性終結配列ＣＴＳ内で突然変異を受けるか（ｐＣＴＳ：Charneau et al, 1994)
、或いはシス型活性中央開始配列内で突然変異を受けている（p225; Charneau et al, 1992）。 利用されたＰＣＲプライマの配列は以下の通りである： Ｎar/Ｅco ＴＲＩＰ+：５′gtc gtc ggc gcc gaa ttc aca aat ggc agt att c
at cc３′ ＮarＴＲＩＰ-：５′gtc gtc ggc gcc cca aag tgg atc tct gct gtc c３′
【００９７】 ＰＣＲ反応条件は、前述のものと同一であった。
【００９８】 連結の間に自らの上に再環状化したベクターを除去する目的で、競合連結／消
化Ｔ４／ＤＮＡリガーゼ／Ｃlal により、プラスミドｐＨＲＧＦＰ及びＰＨＲ′
ＣＭＶ ＬａｃＺのＣlal 部位に、Ｎarl によって消化されたフラグメントＰＣ
Ｒ Triplexを挿入した。部位ＥcoＲＩがプライマＰＣＲ５′Ｎar ＴＲＩＰ+の中
に導入された状態で、ＸhoＩ／ＥcoＲＩ消化によって、挿入の配向を分析した。
【００９９】 結果として得られたプラスミドは、トリプレックスの正しい配向ではｐＴＲＩ
Ｐ．ＥＧＥＰと命名され、非機能的な逆配向ではｐＴＲＩＰinv. ＥＧＦＰと命
名された。トリプレックスの突然変異を受けたバージョンを含むベクターは、Ｘ
が出発突然変異体ウイルスのコード（ＡＧ、Ｄ、ＣＴＳ又は２２５）に対応する
ものとして、ｐＴＲＩＰＸ．ＥＧＦＰ．と命名されている（Charneau et al J.
Mol. Biol, 1994, Charneau et al J. Virol 1992）。異なるプラスミドｐＴＲ
ＩＰ．ＥＧＦＰ又はｐＴＲＩＰＸ．ＥＧＦＰ．から出発して、遺伝子ＥＧＦＰを
、配向転換Ｘhol/ＢamＨＩによりＬacＺで置換した。結果として得たプラスミド
は、それぞれｐＴＲＩＰ．Ｚ，ｐＴＲＩＰinv.Ｚ,ｐＴＲＩＰ ＣＴＳ.Ｚ,ｐＴＲ
ＩＰ２２５.Ｚ．と命名されている。
【０１００】 ベクターＨＲluc 及びＴＲＩＰluc の構築 ベクターＲＨ ＧＦＰ及びＴＲＩＰ ＧＦＰのフラグメント Ｂam ＨＩ−ＥＧＦ
Ｐ−Ｘhol を、ルシフェラーゼをコードするプラスミドｐＧＥＭ−luc（Promega
)のフラグメント Ｂam ＨＩ−Ｌuc−Ｘhol によって置換した。
【０１０１】 非感染性ベクター粒子の産生 ＨＩＶベクターの産生は、Naldini et al. 1996中に記述されたプロトコール
の修正版に従って実施された。ＤＭＥＭ（ＩＣＮ）培地、ＦＶＳ１０％、ペニシ
リン、ストレプトマイシン中で培養されたヒト細胞２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）のリン
酸カルシウムでの一過的同時トランスフェクションによって、ベクター粒子を産
生した。１７５cm2の半集密性ボックスを、次の３つのプラスミドによって同時
にトランスフェクションさせた： ・ 水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＵ）ｐＭＤ．Ｇのエンベロープをコードする
プラスミド１５μg（Naldini et al. 1996）、 ・ カプシド化プラスミドｐＣＭＶ△Ｒ８.２（Naldini et al, 1996）又はｐ
ＣＭＶ△Ｒ８.９１（Zufferey et al, 1997）３０μg、 ・ 及び異なるベクタープラスミドｐＨＲ又はｐＴＲＩＰ３０μg。
【０１０２】 リン酸カルシウム／ＤＮＡの同時沈降物を２４時間細胞と接触した状態に放置
し、次に培地を、トランスフェクション後３日目まで２４時間毎に収集した。上
清の細胞デブリを低速遠心分離によって除去した。ベクター上清を−８０℃で冷
凍保存した。
【０１０３】 ベクター粒子の濃度 ベクター粒子を、偽似類型化するために非常に安定したエンベロープＶＳＶ−
Ｇを利用することにより、これらの粒子を超遠心法により濃縮することが可能と
なる。上述の方法に従って収集されたベクター上清を、３０ml入りの円錐底試験
管（Beckman）に入れて、ローターＳＷ２８（Beckman）内で＋４℃、１７０００
rpm で９０分超遠心分離に付した。その後ＰＢＳ１９０ｔμl中に沈渣物を取り
込み、２０００rpm で５分間遠心分離して再懸濁不能のデブリを除去し、アリコ
ートにし、−８０℃で冷凍した。
【０１０４】 培養中の細胞の形質導入 ＤＥＡＥデキストラン１０μg/ml の存在下で、超遠心分離を受けた又は受け
ていないベクター上清を添加することによってHela細胞（ＡＴＣＣ）を形質導入
した。Hela細胞を、ウシ胎児血清（ＦＶＳ）１０％を補足したＤＭＥＭ培地（Ｉ
ＣＮ）中で培養する。Hela細胞は感染の前夜に９６ウェルの平板にウェルあたり
２００００個の細胞の割合で展延され、その後最終的に２００μlの体積で形質
導入された。ベクター接種材料は、市販のＥＬＩＳＡ試験（DuPont）に従って計
算されたカプシドタンパク質濃度（ｐ２４）に従って標準化された。感染から２
４〜４８時間後の実験に従って、遺伝子導入効率を測定した。リポータ遺伝子Ｌ
ａｃＺを発現するベクターの形質導入率は、in situ でのＸＧal染色（Charneau
et al, 1992）、又は市販のキット（Boehringer) を供給業者の指示に従って用
いた光度測定反応によって顕示された。リポータ遺伝子ＥＧＦＰを発現するベク
ターの場合には、形質導入率は、ＦＩＴＣチャネル上で、螢光顕微鏡で生存細胞
を直接観察することによって定性的に評価された。マーカーＥＧＦＰを発現する
細胞数の定量化は、フラックス血球測定法（ＦＩＴＣチャネル）によって実施さ
れた。タンパク質ＥＧＦＰの秤量は、細胞抽出物上で螢光測定によって実施する
ことができた。９６ウェル付きの培養平板をＰＢＳで２度洗い流し、その後１０
０μlのＰＢＳ １％ ＮＰ４０により溶解させた。ＥＧＦＰ螢光は４７５nmの励
起フィルタ及び５１０nmの発光フィルタと共に平板螢光光度計を利用することに
よって読み取られた。
【０１０５】 遷移中のその細胞サイクルの中で停止させられたHela細胞Ｇ１/Ｓを、４μMの
アフィジコリン（Sigma）による形質導入に先立つ２４時間の予備処理を伴って
前述のものと同じ条件に従って調製した。これらの条件下では、９５％以上のト
リチウム標識チミジンの取込みが阻害されていた。
【０１０６】 初代細胞の ex vivo 形質導入 ラットの脊髄細胞の一次培養を以下の要領で調製した：すなわち１３〜１４日
目のラット胎児骨髄を、双眼ルーペ下で解剖した。全段階にわたり、組織は、グ
ルコース３.６mg/ml を補足した培地Ｌ１５（Gibco）中に維持した。神経細胞を
、３７℃で１５分間トリプシン（０.０５％、ｗ/ｖ）中でのインキュベーション
により解離させた。トリプシン消化を、ウシ胎児血清（ＦＶＳ）１０％の添加及
び低速遠心分離によって阻害した。細胞沈渣は、穏やかな機械的撹拌により、１
００μg/mlのデオキシリボヌクレアーゼｌ(Boehringer)を含むグルコース３.６m
g／mlの培地の中に取り上げられた。４％（ｗ/ｖ）のＢＳＡクッションを通して
低速遠心分離により細胞を収集した。
【０１０７】 ポリ−ＤＬ−オルニチン（６μg/ml)及びラミニン（３μg/ml）で被覆された
直径１２mｎのガラス小薄片を含む２４ウェルを有する平板内に脊髄細胞を入れ
た。補足物Ｂ２７．２％のＳＶＦ、０.５mMのＬ−グルタミン、２５μMのベータ
ーメルカプトエタノール及び２５μMのＬ−グルタミン酸塩を含む神経基底培地
中に、細胞培養を維持した。非神経細胞による培養のコロニー化を予防するため
、２４時間後に培養を１０μg/mlの５′フルオロデオキシウリジンで処理した。
【０１０８】 ラット脳内のＥＧＦＰの in vivo 形質導入 ＥＧＦＰマーカータンパク質を発現するベクターを、in vivo 実験のために利
用した。
【０１０９】 生後５週目のＳＤラットについて、ベクターＨＲ．ＥＧＦＰ又はＴＲＩＰ．Ｅ
ＧＦＰ２μlを用いたラット脳内注入を実施した。最初、Imagene ５００（Rhone
Merieux)を腹腔内注入することによってラットを眠らせた。５分あたり２μlの
速度で５μlのハミルトン針を用いて脳定位固定ガイドを用いて各半球の線条体
内に注入を行なった。注入から１週間以上後に、まずはＰＢＳそして次に２％の
パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）の灌流により、ラットを屠殺した。次に脳を採
取し、切断して、針が残した外傷により目に見える注入点を含む部分のみを保存
した。一晩中ＰＦＡ２％での後固定を行ない、その後、まずは２０％次に３０％
のスクロースでの凍結保護を施した。脳を次にtek 組織で被覆し、carboglace内
で凍結させ、−８０℃で保存した。クリオスタットを用いて１４μmの分類され
た切片を製作し、その後、共焦点顕微鏡で観察した。
【０１１０】 ベクターＨＲＩｕｃ及びＴＲＩＰ Ｉｕｃの in vitro 及び in vivoでの比較
。 Hela細胞を、形質導入の一日前に、９６ウェル平板にて１ウェルあたり細胞２
００００個の割合で展延させた。ＤＥＡＥ−デキストラン１０μg/ml の存在下
で同一条件で３回１ウェルあたりｐ２４ １ngといったように、調製物のｐ２４
含有量について標準化された同量のベクター粒子を用いて、形質導入を実施した
。形質導入から２日後に、ルシフェラーゼ活性を、Promega キット（メーカーの
指示に従う）及び Wallac マイクロプレート測定装置（Victor）を用いて測定し
た。
【０１１１】 ＳＤ ＯＦＡラット及びＣ５７Ｂ１６マウスの脳の線条体内のベクター注入を
実施した。ｐ２４を２５ng含むＨＲＩｕｃ又はＴＲＩＰ Ｉｎｃの調製物２μlを
注入した（ｎ＝４）。その４日後に動物を屠殺し、線条体を採取し、ルシフェラ
ーゼ活性を、前述のものと同じ技術により測定し、並行して合計タンパク質量を
測定した（Pierceキット)。
【０１１２】 例 １．基本的側面．前組込み複合体の核移入。 ＨＩＶ−１：中央トリプレックスの役目 ＨＩＶウイルスのレトロ転写メカニズムは、全く異なる２つの半分へのプラス
ストランド（ストランド+（brint+)）の合成により、オンコジーンレトロウイル
スのものと異なっている（図１）。下流側セグメントは、レンチウイルスゲノム
の特徴であるポリプリン領域の中央コピー（ｃＰＰＴ）で開始されている。上流
側プラスストランドの合成は、ゲノムの中央への逐時的ストランドの変位の後に
終結する。逆転写酵素によるストランドの変位の遮断は、ＨＩＶゲノムの新しい
シス型活性配列すなわちＣＴＳ（Central Termination Sequence）によって支配
されている。従ってレンチウイルスのレトロ転写の最終産物は、約１００個のヌ
クレオチド上にまたがったストランド中央構造（中央トリプレックス）を支持す
るＤＮＡである（Charneau et al. 1994）。ｃＰＰＴ又はＣＴＳの管理された突
然変異誘発は、プラスストランドの合成の中央での開始又は終結を取消す可能性
がある。両方の場合において、ＤＮＡに中央トリプレックスが無い突然変異体ウ
イルスは、複製にとって欠陥のあるものである。
【０１１３】 中央開始及び終結突然変異体の複製欠陥の分析により、レトロ転写の中央開始
又は終結突然変異体の複製サイクルが、ウイルスＤＮＡの合成の後及び核エンベ
ロープに向かってのレトロ転写複合体の経路指定の後の段階に際して中断すると
いうことが示された。感染を受けた細胞内に存在するウイルスＤＮＡの構造を分
析した場合、開始及び終結突然変異体の表現型が類似しているということに気が
つく。両方のケースにおいて、実際、レトロ転写されたＤＮＡの包括的量は、ｃ
ＰＰＴ又はＣＴＳの中の突然変異によって影響されない。その代り、組込まれて
いない線状ＤＮＡの蓄積が観察されると同時に、極くわずかのプロウイルスしか
組込まれないか、又は１個又は２個のＬＴＲをもつ環がごくわずかしか形成され
ないこともわかる。次に核／細胞質の分画化及び核の透過性付与の実験は、これ
らの線状ＤＮＡ分子が核に結びつけられていること、ただしその組込み及び／又
はその環状化が、核エンベロープの溶解の後にしか発生し得ず、このことは突然
変異体のウイルスＤＮＡがこのエンベロープの外部で保持されることをよく表わ
している、ということを示した。さらに全ビーズ上に固定化されたデオキシリボ
ヌクレアーゼｌによる感染を受けた細胞の精製された核のヌクレアーゼ攻撃実験
は、核膜の細胞質面での突然変異体線状ＤＮＡの蓄積をも実証している。最後に
、未変性トリプレックスが備わった又は備わっていない線状ＤＮＡ分子の組込み
能力の精確な定量化により、近年、中央トリプレックスが、in vitro での非相
同ＤＮＡ標的内への線状ＤＮＡの組込みに影響を及ぼさないということが示され
た。
【０１１４】 従ってレトロ転写の中央開始又は終結のための突然変異ウイルスの複製欠陥は
、それらの前組込み複合体の核移入、そしてより精確には、核孔を通しての転座
段階に関係するものである。レンチウイルス、そして特にＨＩＶウイルスは、間
期の細胞の核内へのウイルスゲノムの進入に不可欠な決定因子である、組込まれ
ていないＤＮＡ分子の中心にトリプレックスを作り出すことを目的とするレトロ
転写の独創的な戦略を開発した。このメカニズムは、その組込み部位へのＤＮＡ
のアクセスが有糸分裂中の核膜の崩壊によって左右されるその他全てのレトロウ
イルスからレンチウイルスを区別するものである。
【０１１５】 ２．トリプレックスの形成を担うシス型活性配列を含むレンチウイルスベクター
の生成 ２−１ レンチウイルスベタクの原理と利点 有効なレンチウイルスベクターの生成は、活性な核移入ひいては非有糸分裂細
胞の感染を担う決定因子がわかっていることを想定している。
【０１１６】 ＨＩＶ−１ゲノムの核移入におけるトリプレックスの関与を発見したことは、
効率の良いレンチウイルスベクターの構築のために重大な影響をもたらした。こ
こでは、レンチウイルスのレトロ転写の際にＤＮＡトリプレックスの形成を担う
シス型活性配列がベクター構成内部で保存されていることが想定されている。こ
の基本的研究のベクター学での応用は、レンチウイルスベクターの構成の中に中
央領域ｃＰＰＴ−ＣＴＳを付加しかくしてベクターゲノムのレトロ転写の際にト
リプレックスＤＮＡ構造を作り出すことから成る。ここで、オンコウイルス（一
般にはＭｏＭＬＶ）由来のベクターと同じ原理に基づくレンチウイルスベクター
の構築の数多くの試みが、少なくとも感染力価の面できわめて失望させられるも
のであることが判明したという点に留意されたい。これらのベクターは、置換用
ベクターである。すなわち、レトロウイルスゲノム全体は、２つのＬＴＲとカプ
シド化配列の間で、治療向けの遺伝子又はリポータ遺伝子により欠失させられ、
次に置換される（Miller et al. 89）。発明人によると、このタイプの構成は、
ウイルスＤＮＡの核移入のために中央領域ｃＰＰＴ−ＣＴＳが必要となることか
ら、レンチウイルスの場合には最適でない。しかしながら、オンコウイルス由来
のレトロウイルスベクターと同じ原理に基づいて構築されたものの、水疱性口内
炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）の非常に融合誘発性あるエンベロープにより偽似類型
化され超遠心分離により濃縮されたＨＩＶベクターは、ラットニューロン（Nald
ini et al, 1997; Blomer et al. 1997）、肝臓及び分化した筋肉（Kafri et al
, 1997）の in vivoでの形質導入を可能にする。しかしながら、ＣＦＴＲ遺伝子
（膵線維症）をコードするこれらのＨＩＶベクターによるヒトの肺上皮細胞の異
種移植片の相補実験は、非常に失望させられるものであることが明らかになった
。この組織中のベクターＤＮＡの主要部分は、組込まれなかった線状ＤＮＡの形
にとどまることになり、かくして核移入の欠陥の確率が高いことが明らかになる
（Goldman et al, 1997：「ベクターＤＮＡの核移入率に対する中央トリプレッ
クスの影響」の章を参照のこと）。
【０１１７】 ２．２ 「トリプレックスをもつ」ＨＩＶベクターの構築及び産生 ベクター系内でのトリプレックス構造の重要性をテストするため、発明人は、
Naldini et al.によって記述された構成を基礎にした。この系（図２）において
は、ＨＩＶベクター粒子は３つのプラスミドすなわちＨＩＶのエンベロープを除
いてウイルスタンパク質全体を発現するカプシド化プラスミド、エンベロープを
発現するプラスミドＶＳＶ−Ｇ及びＨＩＶのＬＴＲ、ＨＩＶのカプシド化２連シ
グナル及びＬａｃＺの発現カセットを含むベクタープラスミドｐＨＲ−ＣＭＶ
ＬａｃＺの一過的同時トランスフェクションによって産生される。最初に、リポ
ータ遺伝子ＬａｃＺは、in vivo での形質導入研究のためにより実用的であるＥ
ＧＦＰ（Ｅグリーン螢光タンパク質）の非常に螢光の強いバージョンをコードす
る遺伝子によって置換された。トリプレックスの形成を担うシス型活性配列ｃＰ
ＰＴ及びＣＴＳを含むＨＩＶ−１ ＬＡＩゲノムの中央領域は、ＰＣＲにより増
幅され、次に部位ＣｌａＩにおいてベクター構成ｐＨＲ−ＥＧＦＰの中に挿入さ
れた。正しい配向での野生型トリプレックスの挿入は、ベクターｐＴＲＩＰ−Ｅ
ＧＦＰを生成する。逆の配向では（非機能的）、ベクターｐＴＲＩＰinv−ＥＧ
ＦＰが生成される。
【０１１８】 ２．３ レンチウイルスベクターの調製物中のヘルパーウイルスの検出の高速 かつ感応性の高い試験「ベクター上清」内のヘルパー感染性ウイルスの不在 相同な配列を最低限有する独立した３つのプラスミドに基づくベクター粒子の
産生は、複製に対する応答能あるヘルパーウイルスを生成する確率を最小限にお
さえることを可能にする。その上、カプシド化構成は、ＨＩＶのエンベロープ及
び複製に結合する遺伝子と呼ばれる遺伝子全体（Ｖif、Ｖpr、Ｖpu、、Ｎef）に
ついて欠失させられた。カプシド化されたベクターゲノムは、もはや２個のＬＴ
Ｒ、カプシド化に必要な配列及びトリプレックス配列以外ＨＩＶを含んでいなか
った。しかしながら、各々のベクター株は感染性ヘルパーウイルスの存在につい
てテストされた。ＭＴ４細胞を、一晩中、マイクロプレート上で同一条件下で三
回感染させ、次に徹底的に洗浄し、接種材料を増幅する目的で５日間再度培養さ
せた。その後、指標細胞Ｐ４（Hela ＣＤ４ ＬＴＲ−ＬａｃＺ）を、産生された
感染性粒子を検出する目的で、３日間、ＭＴ４細胞及びその上清を用いて感染さ
せた。最後に、in situ でのＸ−gal 染色を実施した。この要領で、産生された
全ての感染性粒子は、青色シンシチウムの形で検出可能である。この感応性の高
いプロトコールは、ｐ２４ ０.２５ｐｇのＨＩＶ接種材料つまり約３２００個の
物理的粒子の検出を可能にする。ＨＩＶの場合、１０００さらには１００００個
のうち唯一１つの粒子が感染性をもつことが推定されることがわかっているため
、このプロトコールは恐らく唯一の感染性粒子の検出を可能にするはずであった
。
【０１１９】 ベクター上清は一貫して、ＨＩＶ感染性粒子を有していない。
【０１２０】 ２．４．in vitroでのベクターによる形質導入の効率に対するトリプレックス の効果 最初（図３）、Hela細胞の形質導入に対して中央トリプレックスの挿入がもつ
効果を測定した。野生型中央トリプレックス（ＴＲＩＰ ＧＦＰ）ベクターのト
ランスフェクション上清、この配列無しのベクター又は突然変異体トリプレック
ス配列（ＴＲＩＰ ＧＦＰ Ｄ）を用いて、Hela細胞を感染させた。突然変異体Ｄ
は、ストラント+の中央開始ひいては中央トリプレックスの形成を妨げるｃＰＰ
Ｔの突然変異体である（図３）。感染は、カプシドタンパク質ｐ２４の量に基づ
いて標準化された粒子を同量含む上清を用いて実施された。
【０１２１】 Hela細胞内のＧＦＰの形質導入は、野生型トリプレックスの存在下で増大させ
られ、非機能的なトリプレックスの存在下では基底の率まで戻された。
【０１２２】 この力価利得は、リポータ遺伝子ＬａｃＺを利用することによって定量化可能
である（図４）。これらの細胞は、タンパク質ｐ２４の量を基準にして標準化す
ることによって同一条件で３回形質導入された。形質導入は、Ｇ１/Ｓで細胞を
遮断するアフィジコリンで分裂が遮断された又はされていない細胞について実施
された。利用されたベクターは、ＨＲＺ（トリプレックス無し）、ＴＲＩＰ Ｚ
（トリプレックス有り）、ＴＲＩＰ Ｚ inv（ＴＲＰ配列は逆配向に配向され、
非機能的で、中央トリプレックスの形成を導かない）であった。
【０１２３】 図４Ａ： トリプレックスを含むベクターによるβgal の形質導入の利得は６
〜１０倍である。これは、トリプレックスが形成されない場合失なわれる（ＴＲ
ＩＰ Ｚinv）。
【０１２４】 図４Ｂ： βgal 形質導入に対するトリプレックスの効果は、細胞分裂とは無
関係である：分裂中の細胞又はアフィジコリンで遮断された細胞について類似の
結果が得られる。
【０１２５】 なお、Hela細胞については、ベクター粒子の産生の際に利用されたカプシド化
プラスミドが付属遺伝子Ｖif、Ｖpr、Ｖpu、Ｎef 内で欠失しているか否かに関
わらず同じ結果が得られる。
【０１２６】 ２．５ ex vivo でのベクターによる形質導入の効率に対するトリプレックス の効果 非有糸分裂初代細胞内でのＥＧＦＰの形質導入に対するトリプレックスの影響
が、その後測定された。ニューロンが富化されたラットの脊髄初代体外移植組織
が、超遠心分離されたベクターの上清を用いて形質導入された。形質導入は、カ
プシドタンパク質ｐ２４のng数に基づいて標準化された、同数の粒子を含む遠心
分離された１０μl未満のベクターを用いて実施された。
【０１２７】 図６： トリプレックス配列を有するベクターは、トリプレックスを伴わない
ベクターに比べはるかに多くのラット骨髄初代体外移植組織細胞を形質導入する
。
【０１２８】 ２．６ 脳内の in vivo 形質導入に対するトリプレックスの影響 次に in vivo でのＥＧＦＰの形質導入に対するトリプレックスの効果が、ラ
ットの脳内への直接注入によって測定された。同量のｐ２４タンパク質を含むト
リプレックスを伴う又は伴わないベクター上清を同じ量（２μl）だけ、線条体
内に注入した。トリプレックスを伴うベクタを注入したラットにおいては、形質
導入された細胞が多数検出されたのに対し（図７ａ）、針が残した外傷により目
に見える正確な注入点においてさえ、トリプレックスを伴わないベクターの注入
を受けたラットの脳内ではＥＧＦＰを発現する細胞はほとんど検出できなかった
。
【０１２９】 図７ｂでは、ルシフェラーゼリポータ遺伝子（ＨＲＬuc 及びＴＲＩ.Ｐ.Ｌuc
）を発現するＨＩＶベクター（トリプレックスＤＮＡ配列を伴う又は伴わない）
の構築により、脳内の遺伝子の形質導入に対する影響を正確に定量化することが
可能になった。In vitroで、８倍の増大がHela細胞内で観察された（図７−ｂ１
）。ラット（図７−ｂ２）又はマウス（図７−ｂ３）の脳の線条体内で in vivo
の直接的注入の後にも、類似の利点が得られる。
【０１３０】 ベクターゲノムの核移入に対するトリプレックスの影響 形質導入された細胞内のベクターＤＮＡの形態、すなわち線状ＤＮＡ、１個又
は２個のＬＴＲを有する環ならびに組込まれたプロウイルス全体を経時的に追跡
することを可能にするテストが、発明人によって完成された。このテストは、レ
トロウイルスＤＮＡの異なる形態を区別することを可能にするプローブの選択及
び切断の戦略に従った、ウイルスＤＮＡのサザン法による検出に基づいている（
図８参照）。感染を受けた細胞又はベクターにより形質導入された細胞の合計Ｄ
ＮＡは、細胞内に存在するベクターＤＮＡ又はレトロウイルスＤＮＡの全ての形
態（組込まれていない線状ＤＮＡ、１個又は２個のＬＴＲをもつ環状ＤＮＡ及び
組込まれたプロウイルスに共通の内部フラグメントを放出するような形で、１つ
又は２つの制限酵素によって消化される。ベクターの場合、選択される酵素はＥ
co ＮＩ及びＡva II である。プローブとして、Ｅco ＮＩ部位に正確にまたがる
ＰＣＲにより生成されたフラグメントを利用することによって、異なる形態のＤ
ＮＡに対応する複数のバンドが現われる。内部フラグメントは、細胞内に存在す
るベクター合計ＤＮＡを蛍光画像装置での定量化の後で計算することを可能にす
るはずである。１.１６kbのフラグメントは、組込まれていない線状ＤＮＡの遠
位フラグメントに対応し、３.３kbのもう１つのフラグメントは、組込まれてい
ない環に対応する。蛍光画像装置を用いたシグナルの定量化の後、核移入率は、
細胞質線状ＤＮＡとの関係において環形状の組込まれたウイルスＤＮＡ（核ウイ
ルスＤＮＡ）の百分率によって表わされる。第１の予備ブロットは、トリプレッ
クスが無いか又はそのＨＩＶ−１ゲノムの中央領域が逆に挿入されたベクターの
場合における核移入の欠陥に特徴的である細胞内ＤＮＡプロフィールを示した。
実際、線状ＤＮＡに対応するシグナルの強度は、感染から４８時間後の合計ＤＮ
Ａシグナルの強度と同等であった。換言すると、ＤＮＡベクターのプロセッシン
グは、組込まれていない線状の段階で大部分が遮断され、極くわずかな分子しか
組込まれない（図９）。逆に、トリプレックスを有するベクターの場合には、４
８時間の時点でほとんど線状ＤＮＡは存続しておらず、その大部分が、形質導入
細胞の核内に移入されてその後組込まれたということを表わしている。
【０１３１】 ２．８ ベクター構成内のＤＮＡトリプレックスの位置の効果の研究 全てのレンチウイルスにおいて、レトロ転写の際のトリプレックスの形成を担
うシス型活性配列ｃＰＰＴ及びＣＴＳが見い出される。あらゆる場合において、
このトリプレックスは、線状ＤＮＡゲノムの中心近くヌクレオチド数個のところ
にある。トリプレックスがこのように中央に位置することは、核孔を通しての転
座のこの決定因子の最適な機能にとって重要でありうる。ベクター構成が実現さ
れた時点で、リポータ遺伝子の転写単位のすぐ上流側で、トリプレックス配列を
挿入した。リポータ遺伝子のサイズに応じて、このトリプレックスは、ベクター
線状ＤＮＡゲノムの中心に対し多少の差こそあれ近いところにあった。ＥＧＦＰ
リポータ遺伝子の場合（０.７kb）、トリプレックスは構成の中心にきわめて近
く、一方ＬａｃＺ（３.１kb）の場合、それは、中心からさらに遠くにある（図
２）。両方の場合において、トリプレックスの存在は、ベクター上清の大きな力
価増加を誘発した。従って、ベクターゲノム上でのトリプレックスの位置に関し
て幾分かの「柔軟性」が存在する。しかしながら、ＥＧＦＰをコードするベクタ
ーは、ＬａｃＺをコードするものよりも有効であることが明らかにわかっている
。従って、理想的に置かれたトリプレックスにより補足的な力価増加が得られる
可能性がある。この仮定をテストするため、発明人らは、リポータ遺伝子に代っ
て、任意のサイズのフラグメントバンクをクローニングすることに着手し（部分
消化 Sau３Ａ）、クローニングされたフラグメントのサイズ分布は、標的細胞の
形質導入の前後に分析された。トリプレックスの中心的位置がその機能にとって
重要である場合、トリプレックスとの関係における対称的ベクターの構築の制約
も重要となるだろう。Ｕ３領域内にベクターの転写単位を挿入することによって
この障害を迂回することが可能である。レトロ転写の後、トランスジーンは、組
込まれる前にトリプレックスの両側で重複させられ、かくしてトリプレックスの
正確に中央の位置を遵守することになる。
【０１３２】 ２．９ 分化された異なる組織内の in vivo 導入 さまざまな遺伝病において、罹患した分化組織を有効かつ安定した形で形質導
入する「トリプレックス」レンチウイルスベクターの能力が研究される。ラット
又はマウスにおける脳内及び筋肉、肺上皮及び肝臓といった異なる組織内でのこ
れらのベクターの潜在性。ＥＧＦＰリポータ遺伝子を利用することによって、定
性応答を比較的迅速に得ることができる。これらの組織の形質導入率に対するト
リプレックスの影響の定量的測定が、ルシフェラーゼリポータ遺伝子を利用する
ことによって可能となる。なお、ヒト造血組織の全能株細胞を形質導入するこれ
らのベクターの能力は、精製されたＣＤ３４＋細胞からか又は全さい帯血細胞か
ら評価することができる。
【０１３３】 ２．１０ トリプレックスをもつＨＩＶベクターによる造血株細胞内の効率の 高い遺伝子導入 造血株細胞は、血液に関係する又は筋肉の又は神経学的な多数の遺伝子障害及
び感染症の治療にとってきわめて重要な標的である。これらの細胞内のＭｏＭＬ
Ｖといったようなオンコウイルス由来のレトロウイルスベクターによる遺伝子導
入に関する主たる問題点は、これらの細胞がごくわずかしか分裂せず、サイトカ
イン処理による有糸分裂の誘発には一般にその全能性の喪失が伴うという点にあ
る。図１６では、ベクターＴＲＩＰ−ＧＦＰによる株細胞ＣＤ３４内のＧＦＰ遺
伝子の形質導入の結果が、８５％以上の細胞におけるＧＦＰの発現を示している
。トリプレックス無しのベクターＨＲ−ＧＦＰによるＣＤ３４株細胞の形質導入
の効率はきわめて劣っている（Miyishi H et al., Science 1999, 283, p682-6
）。ＣＤ３４株細胞はその精製後直ちに形質導入されるため、そのクローン原性
能力は無傷のままにとどまっている。
【０１３４】 胎児細胞の形質導入のためのトリプレックス配列をもつレンチウイルスベクタ
ーの利用：遺伝子導入動物又は修飾された細胞系の構築への応用。レトロウイル
スベクターは潜在的に、卵（Rubenstein et al., 1986, PNAS, 83, p366〜368）
又はＥＳ細胞（Friedrick 及び Soriano, 1991, Genes Dev, 5, p1513〜1523）
の形質導入を介しての遺伝子導入動物の構築にとって有利な手段である。レンチ
ウイルスベクターの利用は、これらの全能細胞の形質導入の効率を増大させる可
能性がある。ベクターＴＲＩＰ−ＧＦＰによるマウスの胎児細胞の形質導入につ
いての我々の予備的結果は、ＧＦＰ遺伝子の高い導入効率のみならず、ＧＦＰト
ランスジーンの転写の完全な消失をも示している。一部のウイルス配列、特にプ
ライマ結合部位（ＰＢＳ）は、この発現消失に介入する疑いがもたれている。こ
の障害を回避するため、特異的組換え系 ＣＲＥ／Ｌｏｘに基づく、これらのウ
イルス配列のための自己欠失性ベクター（Choulike et al., 1996, J. VIROL, 7
0, p1792-98）が構築された。
【０１３５】 予防及び／又は治療的利用分野をもつ免疫原性組成物 新しい免疫化戦略： トリプレックスをもつレンチウイルスベクター 序 抗腫瘍及び抗ウイルス応答における細胞障害性Ｔリンパ球の役割が、数多くの
マウス実験系のみならず人間においても報告されている。異なるワクチン戦略が
、腫瘍又は感染作用因子に対する保護を与える細胞障害性応答を誘発することを
目的としている。レンチウイルスは、核孔を横断する能力をもち、その結果、は
るかにすぐれた細胞形質導入ベクターである。in vitro 及び／又は in vivo で
の細胞の形質導入は、その後特異的細胞免疫性を誘発することになる腫瘍及び／
又はウイルス抗原エピトープのこれらの細胞による提示を導くことができる。こ
れらの理由から、発明人らは、in vitro で形質導入された樹状細胞又はＨＬＡ
−Ａ２．１の発現により「ヒト化」されたマウスにおける in vivo での直接的
投与を利用することにより、組換えトリプレックスをもつレンチウイルスベクタ
ーの免疫原性能力を研究した（Pascolo S. et coll. 1997）。このＨＨＤマウス
「純枠ＨＬＡ−Ａ２．１」は、制限されたＨＬＡ−Ａ２．１細胞障害性応答の研
究にとって最高の動物モデルであり、免疫療法の前臨床研究を実施するために提
案された。我々の結果全体は、明らかに、腫瘍エピトープを含むトリプレックス
を伴うレンチウイルスベクターの免疫原性能力を明確に示しており、そのため、
トリプレックスを伴うレンチウイルスは、新しい免疫療法戦略となっている。
【０１３６】 初期研究：異なるワクチン戦略の比較 ＨＨＤマウスを利用することにより、異なるワクチン戦略が予め比較された。
任意に５つの腫瘍エピトープを選択して、発明人らは、ヒトにおいて臨床応用可
能な免疫化戦略を５つ比較した：すなわち、（ｉ）フロイントの不完全アジュバ
ンドでの合成ペプチド、（ii) リポペプチド、(iii) Ｃ末端でタンパク質Ｐ１に
対しエピトープが独立した形で融合されている酵母の組換え粒子Ｔｙ、（iv）そ
のＳ２前部分内でエピトープに融合したＢ型肝炎ウイルスの糖タンパク質をコー
ドする裸のＤＮＡの筋肉投与、（ｖ）骨髄細胞からの in vitro での拡張及び分
化の後のペプチドが充てんされた樹状細胞の静脈内注射。粒状構造（酵母の組換
えＴｙ）又はＢ型肝炎ウイルスの糖タンパク質Ｓをコードする組換え裸ＤＮＡ（
１９９５年４月２５日に公示された参考文献 ＷＯ９５/１１３０７号）の注入が
、細胞溶解応答誘発の最も効果的な戦略であることを考察した発明人らは、黒色
腫由来のポリエピトープモチーフ（全く異なる１０個のエピトープ）をこの糖タ
ンパク質内に挿入することによりテスト対象の全てのマウスにおいて同時に、エ
ピトープペプチド１０個のうち５個に対する細胞溶解応答を同時に誘発する可能
性を裏づけ報告した。
【０１３７】 Ｔｙ又は裸ＤＮＡ粒状抗原は、細胞障害性応答の効率の良い誘発戦略であるこ
とがわかった。しかしながら、粒子Ｔｙの大規模産生は困難である。その上、Ｂ
型肝炎ウイルスの糖タンパク質のＳ２前セグメント内への多重の疎水性エピトー
プの導入がＣＨＯ細胞による粒子の産生（現在の肝炎ワクチンの調製方法）の著
しい減少をひきおこすおそれもある。大規模に欠失を受けた偽似類型の形で産生
されているもののトリプレックス ＤＮＡ配列は保存している組換えレンチウイ
ルス（ＨＩＶ−１）は、分裂しない細胞の核膜を横断する能力をもち、上述のワ
クチン戦略に比べて潜在的により効率の良い新しいワクチン戦略となっている。
【０１３８】 材料、方法及び結果 遺伝子導入マウス ＨＨＤマウスは、分子ＨＬＡ−Ａ２．１のペプチド提示ドメイン（ａ１、ａ２
）がヒトβ２−マイクログロブリンにＮ末端で共有結合により結合させられてい
るようなモノカテナリー構成を発現する。分子ＨＬＡ−Ａ２．１のａ３ドメイン
及び細胞質内部分は、分子Ｈ−２Ｄb（Pascolo. et coll. 1997）の等価物で置
換される。これらのマウスは、エピトープペプチドの免疫原性及び異なるワクチ
ン戦略を比較研究することを可能にしている。
【０１３９】 ベクターＴＲＩＰ−ＭＥＬ−ＩＲＥＳ ＧＦＰの構築 まず最初に２−シストロンベクターＴＲＩＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰが構築された
。ベクターＴＲＩＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＥcoＲＩ部位は、Ｔ４ポリメラーゼＤ
ＮＡで満たされ、ベクターＴＲＩＰ−ＤeltaＥ−ＧＦＰを作り出す。次に、約１
.２kbのフラグメント ＢamＨｌ−ＢstＸｌ−ＳriaＢｌ−ＥcoＲｌ−ＩＲＥＳ−
ＥＧＦＰ−Ｘhol が、フラグメント ＢamＨｌ−ＥＧＦＰ−Ｘhol の代りにクロ
ーニングされた。ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Internal Ribosome Entry Site) を含む
フラグメントは、Dr Yongwon Choi（Rockfeller University, N.Y., USA）の無
償贈与物である。Ｋozacコンセンサス配列及び黒色腫ＣＴＬポリエピトープを含
むフラグメントが、pfu ポリメラーゼ及びオリゴヌクレオチド：５ＢglＭluＭel
：６′cc agatct acgcgt gcc acc atg gct ggt３′３ＲlＭel：５′ＣＧ ＧＡＡ
ＴＴＣ ＧＡＣ ＣＴＡ ＡＡＣ ＧＣＡ ＡＣＧ ＧＡＴ Ｇ３′を用いてマトリク
スｐＢＳ mel poly 上でＰＣＲにより生成された。その後、ＰＣＲ mel フラグ
メントが、ＢｇIII 及びＥcoＲＩによって消化され、ベクターＴＲＩＰ−Delta
Ｅ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの部位ＢamＨＩ及びＥcoＲＩにクローニングされ、ベクタ
ーＴＲＩＰ−ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを作り出した。
【０１４０】 トリプレックスを伴う又は伴わないレンチウイルスベクターＧＦＰによる樹状
細胞（ＣＤ）の in vitro 形質導入効率 ＩＬ４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下で遺伝子導入マウスＨＨＤの骨髄からマウス
ＣＤを得た。ヒトＣＤは、健康なハプロタイプ供与体ＨＬＡ−Ａ２．１（以下参
照）から得た。これらの細胞は、異なる濃度（５・１０5個の細胞に対してレン
チウイルスベクター７５、１５０及び３００ng−ｐ２４）を用いてトリプレック
スを伴う又は伴わないＬＶベクターによって形質導入された。
【０１４１】 ２日目、５日目及び１０日目にＦＡＣＳによりＣＤ内のＧＦＰの発現を測定し
た。細胞の形質導入効率に対応する螢光平均強度で表わした値は、トリプレック
スを有するレンチウイルスベクターがトリプレックスの無いレンチウイルスベク
ターに比べ、５〜７倍高いヒトＣＤの形質導入能力をもつことを示した。
【０１４２】 ベクターＴＲＩＰ−ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰにより形質導入されたヒト樹状
細胞を利用することによる初代ＣＴＬ応答の誘発 未成熟のヒトＣＤは、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ１３（ＩＤＭ、フランス、パリ）
の存在下で健康なハプロタイプ供与体 ＨＬＡ−Ａ２．１から得た。ＣＤ１、Ｃ
Ｄ４、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０．及びＣＤ８６に対するモノク
ローナル抗体によるこれらの細胞の免疫表現型決定は、９１％を上回るＣＤ純度
でのその未成熟な性質を示した。
【０１４３】 かくして得られたＣＤを、１・１０6個の細胞について１００ng ｐ２４／ベク
ターの濃度でベクターＴＲＩＰ−ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰにより形質導入させ
た。ＦＡＣＳによるＧＦＰの発現を測定することによってＴＲＩＰ−ＭＥＬ−Ｉ
ＲＥＳ−ＧＦＰによるＣＤの形質導入効率を検討した。予め形質導入されたＣＤ
により、同じ供与体に由来する単核細胞（ＣＭＮ）を刺激した。３回の刺激の後
、４時間の従来のＣＴＬ試験を利用して、４つのエピトープペプチドにより個別
に充てんされたＴ２細胞について、これらの細胞の細胞障害性活性をテストした
。以前の実験においてその免疫原性が高かったことから、エピトープペプチドＭ
age-３、gp１００．１５４、ＧｎＴＶ/ＮＡ１７/Ａ、Tyrosinase ３６８−Ｄを
選択した。
【０１４４】 特異的細胞障害性応答を、テスト対象の全てのエピトープに対して観察した。
各エピトープについて観察された溶解百分率は、図１２に表わされている。
【０１４５】 ベクターＴＲＩＰ−ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰによるＨＨＤマウスの直接的免
疫化 ＨＨＤマウスは、皮下（ＳＣ）、静脈内（ＩＶ）及び腹腔内（ＩＰ）でマウス
１匹あたりベクターＴＲＩＰ−ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを２.５μ／ｐ２４ず
つ投与して免疫化させた。免疫化から１１日目に、各マウスの脾細胞を、１０％
のＴＣＧＦの存在下での２日間を含めて６日間、黒色腫エピトープペプチドによ
り個別に刺激した。次にこれらの細胞の溶解活性を、対応するペプチドの充てん
を受けたＲＭＡＳ細胞上又はベクターＴＲＩＰ−ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰによ
り形質導入されたHela−ＨＨＤ細胞上でテストした。
【０１４６】 各々のマウスについて得られた結果は、ＲＭＡＳ細胞（表１）及び形質導入さ
れたHela−ＨＨＤ（表２）について特異的溶解という観点から表わされている。
最高の結果は、一定の与えられたマウスにおいて同時に誘発された応答の数と同
時に溶解の観点からみて、ベクターのＳＣ及びＩＰ投与の後に得られた。特記す
べき点は、ＩＰ投与により免疫化されたマウスの大部分が、全てのエピトープペ
プチドに対し細胞溶解応答を発生させるということである（図１３）。
【０１４７】
【表１】
【０１４８】
【表２】
【０１４９】 結論 結果は、きわめて効果的な免疫応答を誘発するトリプレックスを伴うレンチウ
イルスベクターの能力を実証している。それらの免疫原性能は、ヒト樹状細胞上
で in vitro で示されただけでなく、異なる投与様式に従って遺伝子導入マウス
ＨＬＡ−Ａ２．１のモデルにおいても評価された。注目すべきことに、特異的Ｃ
ＴＬ応答が、黒色腫のポリエピトープ内に含まれた２つのＣＴＬエピトープにつ
いて得られた。黒色腫の抗原に対する溶解百分率は同様に、ＨＢＶ偽似粒子での
ＤＮＡワクチン接種又は組換えワクチン、リポペプチドといったようなその他の
ワクチン戦略を用いて同じＨＨＤマウスで得られるものよりも高いものである。
従って、トリプレックスを伴うレンチウイルスベクターに基づくワクチン戦略は
、腫瘍又は感染性のさまざまな疾病に応用することができる。
【０１５０】 4- BIBLIOGRAPHIE Blomer U, Naldini L, Kafri T, Trono D, Verma IM, Gage FH. Highly efficie
nt and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector
. J Virol. 1997 Sep; 71(9): 6641-6649. Charneau P, F. Clavel. 1991. A single-stranded gap in human immunodefici
ency virus unintegrated linear DNA defined by a central copy of the poly
purine tract. J. Virol., vol. 65, N° 5, 2415-2421. Charneau P., Alizon M. and Clavel F. (1992). A second origin of plus str
and synthesis is required for optimal HIV replication. J. Virol. 66: 281
4-2820. Charneau P, G. Mirambeau, P. Roux, S. Paulous, H.Buc, F.Clavel. 1994. HIV-1 reverse transcription : a termination step at the center of the ge
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-Strand DNA Synthesis of the Yeast Retrotransposon Ty1 is Initiated at T
wo Sites, PPT1 Next to the 3' LTR and PPT2 Within the pol Gene. PPT1 is
sufficient for Ty1 Transposition. J. Mol. Biol., vol. 253, 291-303. Kafri T, Blomer U, Peterson DA, Gage FH, Verma IM. Sustained expression
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at brains injected with a lentiviral vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 1
996 Oct 15; 93(21): 11382-11388. Naldini L, Blomer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma IM, Tro
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by a lentiviral vector. Science. 1996 Apr 12; 272(5259): 263-267. Miller AD, Rosman GJ. Improved retroviral vectors for gene transfert and expression. BioTechni ques (1989), Vol 7, p 980-990. Pascolo S., N. Bervas, J.M. Ure, A.G. Smith, F.A. Lemonnier and B. Perar
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T lymphocytes from β2 microglobulin (β2m) HLA-A2.1 monochain transgeni
c, H-2Db, β2m double knockout mice. J. Exp. Med. 185, 2043-2051. Poeschla E.M., Wong Staal F., Looney D.J. Efficient transduction of nond
ividing human cells by feline immunodeficiency virus lentiviral vector -
Nature Medicine, vol. 4, n° 3: 354-357. Zufferey R, Nagy D, Mandel RJ, Naldini L, Trono D. Multiply attenuated l
entiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechno
l. 1997 Sep: 15(9): 871-875.
【図面の簡単な説明】
【図１】 レンチウイルスのレトロ転写 レンチウイルスゲノムのレトロ転写は、２つの全く異なる半分へのストランド + の合成という点で、オンコジーンレトロウイルスのものと異なっている。上流
セグメントは、レンチウイルスゲノムの特徴であるポリプリン領域（ｃＰＰＴ）
の中央コピーレベルで開始される。上流側ストランド+の合成は、ゲノムの中央
での逐時的ストランドの変位の後に終結する。逆転写酵素によるストランド変位
の遮断は、ＨＩＶゲノムシス型活性配列すなわちＣＴＳ（中央終結配列）によっ
て支配される。レンチウイルスのレトロ転写の最終産物は、ヌクレオチド約１０
０個の長さにわたり、３本鎖中央ＤＮＡ構造（中央トリプレックス）を支持する
線状ＤＮＡである。
【図２】 ＨＩＶベクター粒子産生のために利用されるプラスミド ベクター粒子は、トリプレックスの形成を担うシス型活性配列を含む（ｐＴＲ
ＩＰ）か又は含まない（ｐＨＲ）ベクタープラスミド、粒子の酵素及び構造タン
パク質をトランスで供給するカプシド化プラスミド（ｐＣＭＶ△Ｒ８.２又はｐ
ＣＭＶ△Ｒ８.９１、Naldini et al, 1996及び Zufferey et al, 1997）及びＶ
ＳＶウイルスのエンベロープの発現プラスミド（ＶＳＶ−Ｇ）という３つのプラ
スミドの同時トランスフェクションによって産生される。 Hela細胞内の同時トランスフェクションされたプラスミドに関連する部分のみ
が提示されている（Naldini et al ＰＮＡＳ １９９６年１０月、Zafferey et a
l Nature Biotech, 1997）。 カプシド化プラスミドｐＣＭＶ△Ｒ８.２又はｐＣＭＶ△８.９１は、ｇａｇ及
びｐｏｌ由来のタンパク質の発現を可能にする。 ｐＭＤ．Ｇは、ＶＳＶ非相同性エンベロープをコードする。ベクタープラスミ
ドｐＨＲ−ＴＲＩＰは、プラスミドｐＨＲ′ＣＭＶｌａｃＺ（Naldini et al）
に由来する：すなわち、野生型又は突然変異体トリプレックス配列が挿入され、
リポータ遺伝子 lacZ はＥＧＦＰで変更された又は変更されなかった。
【図３】 Hela細胞内のＥＧＦＰの形質導入に対するトリプレックスの影響、 ８チャンバ付き Labtek で培養された Hela 細胞が、自己螢光タンパク質ＥＧ
ＦＰを発現する異なるベクターによって形質導入される。感染は、接種材料あた
り２ngのＰ２４でカプシドタンパク質量（Dupont社 ＥＬＩＳＡキットＰ２４）
に従って標準化される。感染から４８時間後に、細胞をＰＢＳ ＰＦＡ１％で固
定し、mowiol状態に取付けて、その後螢光顕微鏡で観察した。トリプレックスを
伴わないもとのベクターについて（ＨＲ．ＥＧＦＰ、上）、トリプレックスを伴
うベクターについて（ＴＲＩＰ．ＥＧＦＰ、中）又は非機能的で突然変異を受け
たトリプレックス配列について（ＴＲＩＰ Ｄ．ＥＧＦＰ、下）、独立した３つ
のフィールドが示されている。右に示されているのは、ＨＩＶ−１のレトロ転写
酵素の阻害物質であるネビラピンの存在下での異なる形質導入である。
【図４】 トリプレックスを伴う又は伴わない、ＨＩＶベクターによるＥＧＦＰ遺伝子の
形質導入率の定量化、 トリプレックスを伴う又は伴わない２ngのＥＧＦＰベクターＰ２４により形質
導入されたHela細胞を、感染から４８時間後にトリプシン処理する。ＥＧＦＰの
発現について陽性の細胞の百分率を、フラックス血球計算法によって計算する（
ＦＩＴＣチャネル）。あらゆる場合において形質導入は、ＨＩＶ−１のレトロ転
写酵素の阻害物質であるネビラピンの存在下で阻害される。図４Ｃにおいては、
有糸分裂状態の細胞又は非有糸分裂細胞内のＧＦＰ（又はその他の問題の遺伝子
）の形質導入によって刺激されたベクター内のトリプレックスＤＮＡの存在が見
られる。この形質導入は、トリプレックス配列無しのベクターで得られる結果と
の関係において２０倍になっている（例えば Naldini et al, Science, 1996 参
照）。
【図５】 トリプレックスを伴うか又は伴わないＨＩＶベクターによるＬａｃＺ遺伝子の
形質導入率の定量化。 形質導入に対するトリプレックスの影響は、ＬａｃＺリポータ遺伝子を発現す
る異なるベクターによる、９６ウェルの平板で培養されたＨｅｌａ細胞の感染に
よって計算される。感染から４８時間後に、培養平板を溶解させ、ベーターガラ
クトシダーゼ活性を、発光反応キット（Boehringer）に従って測定する。各々の
形質導入は２ngのＰ２４で標準化された接種材料を用いて、同一条件下で三回実
施する。 上方パネル：増殖中のＨｅｌａ細胞 下方パネル：アフィジコリンにより環状に遮断されたＨｅｌａ細胞。 ＬａｃＺ遺伝子の形質導入は、トリプレックス配列無しのベクターと比べ、ト
リプレックス配列を含むベクターでは６倍となっている。
【図６ａ】 ラットの初代脊髄細胞内のＥＧＦＰ遺伝子の ex vivo 形質導入に対するトリ
プレックスの影響 ラットの脊髄の初代体外培養組織を、トリプレックスを伴う又は伴わない各々
のベクターについて３００ngのＰ２４で感染させ、前述の場合と同様に螢光顕微
鏡で観察する。
【図６ｂ】 ラットの初代脊髄細胞内のＥＧＦＰ遺伝子の ex vivo 形質導入に対するトリ
プレックスの影響 ラットの脊髄の初代体外培養組織を、トリプレックスを伴う又は伴わない各々
のベクターについて３００ngのＰ２４で感染させ、前述の場合と同様に螢光顕微
鏡で観察する。
【図７ａ１】 図７：ラットの脳内のルシフェラーゼ遺伝子及びＥＧＦＰ遺伝子の in vivo
形質導入に対するトリプレックスの影響 図７ａ１： 感染部位レベルでの形質導入 ＥＧＦＰ遺伝子の導入は、５０ngのＰ２４に対応する２０マイクロリットルの
ベクターをラットの脳の線条体に直接注入することによって実施される。 螢光顕微鏡での切片の観察は、トリプレックスの存在下でのＥＧＦＰの多大な
形質導入（左パネル）及び、トリプレックス不在でのきわめて低い形質導入（右
パネル）を示している。
【図７ａ２】 図７：ラットの脳内のルシフェラーゼ遺伝子及びＥＧＦＰ遺伝子の in vivo
形質導入に対するトリプレックスの影響 図７ａ２： 上述の実験を表わすもう１つの切片。
【図７ｂ１】 図７：ラットの脳内のルシフェラーゼ遺伝子及びＥＧＦＰ遺伝子の in vivo
形質導入に対するトリプレックスの影響 脳内の in vivoでの形質導入に対するトリプレックスの影響の定量化 図７ｂ１： in vitro でのＨｅｌａ細胞内のルシェファラーゼをコードする
遺伝子の形質導入に対するトリプレックスの影響。グラフは、発光測定により定
量化されたルシフェラーゼの産生を示す（Promega Ｒキット）。ベクター内のト
リプレックスの存在により、ルシフェラーゼの遺伝子の形質導入の８倍の増大を
得ることができる。
【図７ｂ２】 図７：ラットの脳内のルシフェラーゼ遺伝子及びＥＧＦＰ遺伝子の in vivo
形質導入に対するトリプレックスの影響 図７ｂ２： トリプレックスを伴うか又は伴わないルシフェラーゼをコードす
るベクターの注入後のラットの脳内のルシフェラーゼ活性の in vivoの定量化。
トリプレックスの存在は、ルシフェラーゼの形質導入を８倍刺激する。
【図７ｂ３】 図７：ラットの脳内のルシフェラーゼ遺伝子及びＥＧＦＰ遺伝子の in vivo
形質導入に対するトリプレックスの影響 図７ｂ３： マウスにおいて実施された、７−ｂ−２と同じ実験。
【図８Ａ】 ベクターＤＮＡの核移入速度の分析戦略 形質導入された細胞内でのベクターＤＮＡのレトロ転写、核移入及び組込み又
は環状化の反応速度を追跡できるようにする定量試験が完成された。この試験は
有利にも、感染を受けた細胞の核内のウイルスＤＮＡの核移入マーカーであるＬ
ＴＲ ２個を有する環のＰＣＲ増幅による検出に置換わるものである（Bukrinsky
et al, Nature 1993, 365, p666-669）。組込まれていない線状ベクターＤＮＡ
、１個又は２個のＬＴＲを有する環状ＤＮＡ及び組込まれたベクターＤＮＡは、
サザンブロットにより検出され、次のとおり制限消化戦略に従って Phospohorim
agerで定量化される：すなわち形質導入された細胞の合計ＤＮＡは、ＥcoＮＩ及
びＡvaII（ベクターゲノム内の２つのユニーク部位）により消化され、次に、正
確にＥcoＮＩ部位にまたがるＰＣＲによって生成されたＤＮＡプローブとハイブ
リッド形成させられる。このプローブは、異なるフラグメント、すなわち、全て
のベクターＤＮＡ形状に共通でありその Phosphoimager による定量化がレトロ
転写されたベクターＤＮＡの合計量を示す、０.７７kbの内部フラグメント、組
込みされていない線状ＤＮＡの量を特異的に示す１.１６kbの遠位フラグメント
と反応する。Ｘhol 酵素による補足的消化の後、１個又は２個のＬＴＲをもつ環
は、それぞれ１.４kb及び２kbで現われる。組込まれたベクターＤＮＡの量は、
組込まれていないベクターＤＮＡ、線状及び環状ＤＮＡに対応するシグナルを、
レトロ転写された合計ＤＮＡに対応するシグナルから差し引くことによって計算
される。核移入が無い場合、形質導入された細胞内のベクターＤＮＡの予想上の
プロフィールは、組込まれていない線状ＤＮＡの蓄積である。反対に、ベクター
線状ＤＮＡが細胞の核区画にアクセスしたならば、その線状ＤＮＡの主要な部分
は、細胞クロマチンの中に組込まれ、環状化される。
【図８Ｂ】 ベクターＤＮＡの核移入速度の分析戦略 形質導入された細胞内でのベクターＤＮＡのレトロ転写、核移入及び組込み又
は環状化の反応速度を追跡できるようにする定量試験が完成された。この試験は
有利にも、感染を受けた細胞の核内のウイルスＤＮＡの核移入マーカーであるＬ
ＴＲ２個を有する環のＰＣＲ増幅による検出に置換わるものである（Bukrinsky
et al, Nature 1993, 365, p666-669）。組込まれていない線状ベクターＤＮＡ
、１個又は２個のＬＴＲを有する環状ＤＮＡ及び組込まれたベクターＤＮＡは、
サザンブロットにより検出され、次のとおり制限消化戦略に従って Phospohorim
agerで定量化される：すなわち形質導入された細胞の合計ＤＮＡは、ＥcoＮＩ及
びＡvaII（ベクターゲノム内の２つのユニーク部位）により消化され、次に、正
確にＥcoＮＩ部位にまたがるＰＣＲによって生成されたＤＮＡプローブとハイブ
リッド形成させられる。このプローブは、異なるフラグメント、すなわち、全て
のベクターＤＮＡ形状に共通でありその Phosphoimager による定量化がレトロ
転写されたベクターＤＮＡの合計量を示す、０.７７kbの内部フラグメント、組
込みされていない線状ＤＮＡの量を特異的に示す１.１６kbの遠位フラグメント
と反応する。Ｘhol 酵素による補足的消化の後、１個又は２個のＬＴＲをもつ環
は、それぞれ１.４kb及び２kbで現われる。組込まれたベクターＤＮＡの量は、
組込まれていないベクターＤＮＡ、線状及び環状ＤＮＡに対応するシグナルを、
レトロ転写された合計ＤＮＡに対応するシグナルから差し引くことによって計算
される。核移入が無い場合、形質導入された細胞内のベクターＤＮＡの予想上の
プロフィールは、組込まれていない線状ＤＮＡの蓄積である。反対に、ベクター
線状ＤＮＡが細胞の核区画にアクセスしたならば、その線状ＤＮＡの主要な部分
は、細胞クロマチンの中に組込まれ、環状化される。
【図９ａ】 ベクターＤＮＡの核移入率の分析。 Ｈｅｌａ細胞内で形質導入から４８時間後のサザンブロットによる分析は、ト
リプレックスを伴わないベクターの場合（ＨＲ ＧＦＰ）又は非機能的で逆の配
位のトリプレックス配列を含むベクターの場合（ＴＲＩＰ、ＧＦＰinv) に標準
的核移入の欠如を示している。これらのベクターの場合、組込まれていない線状
ＤＮＡに対応するシグナルは合計ＤＮＡシグナルと等価であり、ベクターＤＮＡ
の主要な部分が組込まれることなく線状の形にとどまっていることを表わしてい
る。ベクターＴＲＩＰ．ＧＲＰの場合、線状ＤＮＡに対応するシグナルの強度は
、合計ＤＮＡシグナルよりもかなり低く、大きな割合のベクターＤＮＡが核内に
移入されそこに組込まれたことを表わしている。
【図９ｂ】 トリプレックスを伴う（ＴＲＩＰ−ＧＦＰ）か又はトリプレックス配列を伴わ
ない（ＨＲ−ＧＦＰ、ＴＲＩＰinv-ＧＦＰ）ベクターＤＮＡの核移入率の反応速
度論的分析。
【図９ｃ】 形質導入された細胞内のベクターＤＮＡの状態の定量化。 図９ｂに示されたサザンブロットの 蛍光画像装置での定量化は、形質導入か
ら４８時間後に、トリプレックスを伴わないベクターのＤＮＡの大部分が、組込
まれていない線状ＤＮＡの形をしており、ベクターＤＮＡのほとんどが組込まれ
たり環状化されないことを示している。トリプレックスを伴わないベクター（Ｈ
Ｒ−ＧＦＰ及びＴＲＩＰｉｎｖ−ＧＦＰ）は、標準的な核移入の欠如を示す。逆
に、ベクターＴＲＩＰ−ＧＦＰの場合、ＤＮＡの６０％以上が形質導入済み細胞
のゲノムの中に組込まれ、組込まれていない線状ＤＮＡの形で存続するベクター
ＤＮＡはほとんどない。ベクター内へのトリプレックス配列の導入は、ＨＲ−Ｇ
ＦＰベクターの核移入の欠如を野生レベルまで補足した。実際、ベクターＴＲＩ
Ｐ−ＧＦＰの場合に得られたベクターＤＮＡのプロフィールは、野生型ＨＩＶ−
１ウイルスのものに匹敵する。 この結果は、トリプレックス配列が、ＨＲ−ＧＦＰ構成の中に欠如している核
移入の唯一の決定因子であることを立証している。唯一ベクターＤＮＡの組込ま
れた形態のみが活性である。
【図１０】 ベクターｐＴＲＩＰ．ＥＧＦＰの制限地図。
【図１１Ａ】 ＣＡＥＶ、ＥＩＡＶ、ＶＩＳＮＡ、ＳＩＶAGM、ＨＩＶ−２ROD、ＨＩＶ−１LA I ウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチド配列。
【図１１Ｂ】 ＣＡＥＶ、ＥＩＡＶ、ＶＩＳＮＡ、ＳＩＶAGM、ＨＩＶ−２ROD、ＨＩＶ−１LA I ウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチド配列。
【図１１Ｃ】 ＣＡＥＶ、ＥＩＡＶ、ＶＩＳＮＡ、ＳＩＶAGM、ＨＩＶ−２ROD、ＨＩＶ−１LA II ウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチド配列。
【図１１Ｄ】 ＣＡＥＶ、ＥＩＡＶ、ＶＩＳＮＡ、ＳＩＶAGM、ＨＩＶ−２ROD、ＨＩＶ−１LA I ウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチド配列。
【図１１Ｅ】 ＣＡＥＶ、ＥＩＡＶ、ＶＩＳＮＡ、ＳＩＶAGM、ＨＩＶ−２ROD、ＨＩＶ−１LA I ウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチド配列。
【図１１Ｆ】 ＣＡＥＶ、ＥＩＡＶ、ＶＩＳＮＡ、ＳＩＶAGM、ＨＩＶ−２ROD、ＨＩＶ−１LA I ウイルスのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチド配列。
【図１１Ｇ】 ＨＩＶ１ウイルスのトリプレックスＤＮＡの配列を表わす。シス型活性のある
領域ｃＰＰＴ及びＣＴＳは、境界が示され太い大文字で印刷されている。
【図１１Ｈ】 一部のレンチウイルスにおけるｃＰＰＴ及びＰＰＴ３′配列の整列体を表わす
。上部のラインは、ＬＴＲ３′の上流側の全てのレトロウイルスに存在する配列
ＰＰＴ３′に対応する。下部ラインは、レンチウイルスにおけるｃＰＰＴと呼ば
れるＰＰＴ配列の内部反復に対応する。
【図１２】 有利な種類として、図１５にその配列が記述されているエピトープで構成され
た黒色腫のＣＴＬポリエピトープを有するトリプレックスベクターにより形質導
入されたヒト樹状細胞からのin vitro でのＣＴＬの産生を表わす。 これらの樹状細胞は、単核細胞（ＰＢＬｏ）と接触させられる。ＣＴＬ活性は
、対応する抗原ペプチドによる再刺激の後に測定される。 横座標軸上には、エフェクター細胞／標的細胞比が表わされている。
【図１３】 ベクターＴＲＩＰ、ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰでのマウスの免疫後の細胞障害
性応答。
【図１４】 ベクターｐＴＲＩＰ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの制限地図。 ベクターｐＴＲＩＰ−ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを含有する E. Coli菌株は１
９９９年４月２０日付でＣＮＣＭに寄託されており、受託番号Ｉ−２１８５を有
している。
【図１５】 ベクターＴＲＩＰ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰのポリエピトープ構成中に含ま
れる黒色腫に特異的なエピトープＣＴＬｓ ＨＬＡ Ａ２．１の配列。 ポリエピトープの配列の下線強調は、各エピトープを個別化することを目的とす
るものである。
【図１６Ａ】 トリプレックスを有するＨＩＶベクターによるＣＤ３４+株
細胞のきわめて効率の高い形質導入。 ＴＲＩＰ−ＧＦＰベクターによるＣＤ３４+造血株細胞内のＧＦＰ遺伝子の形
質導入のフラックス血球計算法ＦＡＣＳによる分析。ＴＲＩＰ−ＧＦＰベクター
により形質導入されたＣＤ３４+細胞の百分率は８５％を上回る。この効率は、
ＣＤ３４+細胞内でトリプレックスを伴わないＨＩＶベクター（ＨＲ−ＧＦＰ）
で以前に得られた形質導入率よりもはるかに高いものである。（Miyoshi H et a
l., Science 1999, 283, p682-6）。
【図１６Ｂ】 トリプレックスを有するＨＩＶベクターによるＣＤ３４+株
細胞のきわめて効率の高い形質導入。 ＴＲＩＰ−ＧＦＰベクターによるＣＤ３４+造血株細胞内のＧＦＰ遺伝子の形
質導入のフラックス血球計算法ＦＡＣＳによる分析。ＴＲＩＰ−ＧＦＰベクター
により形質導入されたＣＤ３４+細胞の百分率は８５％を上回る。この効率は、
ＣＤ３４+細胞内でトリプレックスを伴わないＨＩＶベクター（ＨＲ−ＧＦＰ）
で以前に得られた形質導入率よりもはるかに高いものである。（Miyoshi H et a
l., Science 1999, 283, p682-6）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/16 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 フィラ，ユゼイヤン フランス国、エフ−75013 パリ、リュ・ ドゥ・トルビアック 245 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 EA02 FA11 GA11 HA17 4B065 AA93X AA95Y AA97Y AB01 AC20 BA02 CA44 4C084 AA13 NA14 ZB072 ZB262 ZB322 ZB332 ZC552 4C087 AA01 AA02 AA03 BB65 CA04 NA14 ZB07 ZB26 ZB32 ZB33 ZC55 4H045 AA10 BA10 CA01 EA20 EA50

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 シス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス型活性終結領
    域（ＣＴＳ）を有するポリヌクレオチドを含み、これらの領域がレトロウイルス
    又はレトロウイルス様起源のものであること、並びに、さらに限定されたヌクレ
    オチド配列（トランスジーンすなわち問題の配列）及びレトロウイルス又はレト
    ロウイルス様起源のレトロ転写、発現及びカプシド化を調節するシグナルが含ま
    れることを特徴とする、組換えベクター。
  2. 【請求項２】 レトロウイルス由来の配列が、レンチウイルスのゲノムに由
    来することを特徴とする、請求項１記載のベクター。
  3. 【請求項３】 レトロウイルス様起源の配列がレトロトランスポゾンに由来
    することを特徴とする、請求項１記載のベクター。
  4. 【請求項４】 トランスジーンすなわち問題の配列が、転写及び発現調節シ
    グナルを含む発現カセット内に収納されていることを特徴とする、請求項１〜３
    のいずれか１項記載のベクター。
  5. 【請求項５】 シス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス型活性終結領
    域（ＣＴＳ）を有するポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルス粒子におい
    て、これらの領域がレトロウイルス又はレトロウイルス様起源のものであり、レ
    トロウイルス又はレトロウイルス様起源のレトロ転写調節シグナルと共に機能し
    うる配向で挿入されている、組換えレトロウイルス粒子。
  6. 【請求項６】 ａ） レンチウイルスの核タンパク質又は機能性誘導ポリペ
    プチド（ポリペプチドＧＡＧ）に対応するｇａｇポリペプチド、 ｂ） レンチウイルスのタンパク質ＰＴ、ＰＲＯ、ＩＮ又は機能性誘導ポリペ
    プチド（ポリペプチドＰＯＬ）からなるｐｏｌ ポリペプチド、 ｃ） エンベロープポリペプチド又は機能性誘導ポリペプチド（ポリペプチド
    ＥＮＶ）、 ｄ） 転写及び発現調節シグナルの制御下に置かれた限定されたヌクレオチド
    配列（トランスジーンすなわち問題の配列）、レトロウイルス又はレトロウイル
    ス様起源のレトロ転写、発現及びカプシド化を調節するシグナルを含む配列、及
    びシス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス型活性終結領域（ＣＴＳ）を有
    し、これらの領域がレトロウイルス又はレトロウイルス様起源のものであり、レ
    トロウイルス又はレトロウイルス様起源の前記調節シグナルと共に機能しうる配
    向で挿入されているポリヌクレオチドを含む組換えヌクレオチド配列 を含んで成る、組換えレトロウイルスベクター粒子。
  7. 【請求項７】 レトロ転写、発現及びカプシド化を調節するシグナルがレン
    チウイルス由来のものであり、ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチド
    がレンチウイルス由来のものであることを特徴とする、請求項５又は６記載の組
    換えベクター。
  8. 【請求項８】 レトロ転写、発現及びカプシド化を調節するシグナル及びｃ
    ＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチドがＨＩＶタイプのレトロウイルス
    特にＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２に由来することを特徴とする、請求項１〜７のい
    ずれか１項記載の組換えベクター。
  9. 【請求項９】 レトロ転写、発現及びカプシド化を調節するシグナル及びｃ
    ＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチドがレンチウイルスＣＡＥＶ、ＥＩ
    ＡＶ、ＶＩＳＮＡ、ＨＩＶ、ＳＩＶ又はＦＩＶの中から選択されたウイルスに由
    来することを特徴とする、請求項８記載の組換えベクター。
  10. 【請求項１０】 ポリヌクレオチドが、ＨＩＶ−１レトロウイルスのゲノム
    のシス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及び終結領域（ＣＴＳ）を含むＤＮＡ配
    列であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の組換えベクター
    。
  11. 【請求項１１】 ポリヌクレオチドが、図１１に表わされた配列の中から選
    ぶことのできる１つの配列のｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含んで成ること又は、適
    切な調節要素の制御下でのベクターのレトロ転写の際に該ポリヌクレオチドがト
    リプレックスの形成を可能にした時点で直ちに特に単数又は複数のヌクレオチド
    の欠失又は挿入による突然変異を受けた前記配列のうちの１つであることを特徴
    とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の組換えベクター。
  12. 【請求項１２】 Ｉ.２００５という番号で１９９８年４月１５日付けで、
    ＣＮＣＭに寄託されたプラスミドｐＴＲＩＰ.ＥＧＦＰであることを特徴とする
    、請求項１〜１１いずれか１項記載のベクター。
  13. 【請求項１３】 Ｉ.２１８５という番号で１９９９年４月２０日付けでＣ
    ＮＣＭに寄託されたプラスミドｐＴＲＩＰ．ＭＥＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰであるこ
    とを特徴とする、請求項１〜１１いずれか１項記載のベクター。
  14. 【請求項１４】 配列ｇａｇ、ｐｏｌ 及び ｅｎｖ がＨＩＶレトロウイル
    ス、特にＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の配列に由来することを特徴とする、請求項
    ５〜１１いずれか１項記載の組換えベクター。
  15. 【請求項１５】 配列ｇａｇ 及び ｐｏｌがＨＩＶレトロウイルスの配列に
    由来し、配列ｅｎｖがＨＩＶとは異なるレトロウイルス又はウイルスに由来する
    ことを特徴とする、請求項５〜１２のいずれか１項記載の組換えベクター。
  16. 【請求項１６】 配列ｅｎｖが、アンフォトロピックＥＮＶポリペプチドを
    コードすることを特徴とする、請求項１５記載の組換えベクター。
  17. 【請求項１７】 配列ｅｎｖがエコトロピックＥＮＶポリペプチドをコード
    することを特徴とする、請求項１５記載の組換えベクター。
  18. 【請求項１８】 配列ｅｎｖが、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に由来す
    ることを特徴とする請求項１５記載の組換えベクター。
  19. 【請求項１９】 転写及び発現を調節するシグナルの制御下に置かれた限定
    されたヌクレオチド配列（トランスジーン）、レトロ転写、発現及びカプシド化
    を調節するシグナル、及びシス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス型活性
    終結領域（ＣＴＳ）を有するポリヌクレオチドを含む組換えヌクレオチド配列を
    含んで成る組換えベクター粒子。
  20. 【請求項２０】 転写及び発現調節シグナルの制御下に置かれた限定された
    ヌクレオチド配列（トランスジーンすなわち問題の配列）、レトロトランスポゾ
    ンのレトロ転写、発現及びカプシド化を調節するシグナル、及びシス型活性中央
    開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス型活性終結領域（ＣＴＳ）を有するポリヌクレオ
    チドを含む組換えヌクレオチド配列を含んで成る組換えベクター粒子において、
    前記領域がレトロトランスポゾンに由来し、レトロトランスポゾンの調節シグナ
    ルと共に機能しうる配向で挿入されている、組換えベクター粒子。
  21. 【請求項２１】 ａ） シス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス型活
    性終結領域（ＣＴＳ）を有するポリヌクレオチドであって、これらの領域がレト
    ロトランスポゾンから誘導され、レトロトランスポゾンの調節シグナルと共に機
    能しうる配向で挿入されているポリヌクレオチド、 ｂ） レトロトランスポゾンの核タンパク質又は機能性誘導ポリペプチド（ポ
    リペプチドＧＡＧ）に対応するポリペプチド、 ｃ） レトロトランスポゾンのタンパク質ＲＴ、ＰＲＯ、ＩＮ又は機能性的誘
    導ポリペプチド（ポリペプチドＰＯＬ）に対応するｐｏｌポリペプチド、 ｄ） ウイルスエンベロープポリペプチド、 ｅ） 転写及び発現調節シグナルの制御下に置かれた限定されたヌクレオチド
    配列（トランスジーンすなわち問題の配列）、レトロ転写、発現及びカプシド化
    調節シグナルを含んで成る組換えヌクレオチド配列、 を含んで成る組換えレトロウイルス粒子。
  22. 【請求項２２】 ｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含むポリヌクレオチド及びレト
    ロ転写、発現及びカプシド化を調節するシグナルが酵母レトロトランスポゾンに
    由来することを特徴とする、請求項１、３又は１５のいずれか１項記載の組換え
    ベクター。
  23. 【請求項２３】 請求項１〜２２のいずれか１項記載のベクターで組換えら
    れていることを特徴とする組換え細胞。
  24. 【請求項２４】 分裂していない分化真核細胞であることを特徴とする、請
    求項２３記載の組換え細胞。
  25. 【請求項２５】 初代真核細胞又は不死化された細胞系であることを特徴と
    する、請求項２３記載の組換え細胞。
  26. 【請求項２６】 肺細胞、脳細胞、上皮細胞、星状細胞、小グリア細胞、オ
    リゴデンドロサイト及びニューロン、筋細胞、肝細胞、樹状細胞、神経細胞、骨
    髄株細胞、マクロファージ、線維芽細胞、造血細胞、リンパ球であることを特徴
    とする、請求項２４記載の細胞。
  27. 【請求項２７】 請求項１〜２２のいずれか１項記載のベクター又は請求項
    ２３〜２６のいずれか１項記載の組換え細胞を含んで成ることを特徴とする、治
    療目的の組成物。
  28. 【請求項２８】 請求項１〜２２のいずれか１項記載のベクター又は請求項
    ２３〜２６のいずれか１項記載の組換え細胞を含んで成ることを特徴とする、免
    疫原性組成物。
  29. 【請求項２９】 シス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス型活性終結
    領域（ＣＴＳ）を有し、これらの領域がレトロウイルス又はレトロウイルス様起
    源のものであるポリヌクレオチドの、組換えベクターの構築を目的とした利用。
  30. 【請求項３０】 シス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス型活性終結
    領域（ＣＴＳ）を有し、これらの領域がレトロウイルス又はレトロウイルス様起
    源のものであるポリヌクレオチドの、真核細胞内に ex vitro でヌクレオチド配
    列（トランスジーンすなわち問題のヌクレオチド配列）を核移入することを目的
    とした利用。
  31. 【請求項３１】 分裂していない分化細胞 ex vivo トランスフェクション
    又は形質導入を目的とした、請求項１〜２２いずれか１項記載の組換えベクター
    の使用。
  32. 【請求項３２】 不死化した細胞系又は初代細胞のex vivo でのトランスフ
    ェクション又は形質導入を目的とした、請求項１〜２２いずれか１項記載の組換
    えベクターの使用。
  33. 【請求項３３】 レトロウイルスゲノムに由来する約８０〜１２０個、好ま
    しくは９０〜１１０個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含んで成るポリ
    ヌクレオチドにおいて、前記ヌクレオチド配列が一方の側ではシス型活性中央開
    始ヌクレオチド配列、そしてもう一方の側ではシス型活性中央終結ヌクレオチド
    配列で挟まれているポリヌクレオチド。
  34. 【請求項３４】 レトロウイルスゲノムに由来するヌクレオチド配列がＨＩ
    Ｖゲノム、特にＨＩＶ−１ゲノムに由来する、約９８個のヌクレオチドを含むこ
    と、及びヌクレオチド配列ｃＰＰＴが少なくとも１０個のヌクレオチドを有し、
    シス型活性ヌクレオチド配列ＣＴＳが少なくとも１５個のヌクレオチドを有し、
    ヌクレオチド配列ｃＰＰＴ及びＣＴＳがＨＩＶ、好ましくはＨＩＶ−１のゲノム
    に由来することを特徴とする、請求項３３記載のポリヌクレオチド。
  35. 【請求項３５】 １本鎖又は２本鎖の形をしていることを特徴とする、請求
    項３３又は３４記載のポリヌクレオチド。
  36. 【請求項３６】 トリプレックスの形をしていることを特徴とする、請求項
    ３３又は３４記載のポリヌクレオチド。
  37. 【請求項３７】 シス型活性中央開始領域（ｃＰＰＴ）及びシス型活性終結
    領域（ＣＴＳ）を有し、これらの領域が、レトロウイルス又はレトロウイルス様
    のものであるポリヌクレオチドの、トランスジーンすなわち問題のポリヌクレオ
    チドでの真核細胞のトランスフェクション又は形質導入を目的とした使用。
  38. 【請求項３８】 in vivo での形質導入を目的とした、請求項１〜２２のい
    ずれか１項記載の組換えベクター又はポリヌクレオチドの使用。
  39. 【請求項３９】 in vivo での形質導入が、組織内への注入によって実施さ
    れる、請求項３８記載の組換えベクター又はポリヌクレオチドの使用。
  40. 【請求項４０】 トランスジーンすなわち問題のヌクレオチド配列と結合し
    た請求項３３又は３４記載のポリヌクレオチド。
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