CN103717240A - 用于肾上腺脑白质营养不良症和肾上腺脊髓神经病的基因治疗载体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含逆转录病毒载体、转导细胞的组合物，以及使用其进行基因治疗的方法。具体地，本发明涉及慢病毒载体和用这些载体转导的细胞，以向患有肾上腺脑白质营养不良症和/或肾上腺脊髓神经病的个体提供基因治疗。

Description

用于肾上腺脑白质营养不良症和肾上腺脊髓神经病的基因治疗载体

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)本申请要求2011年6月10日递交的第61/495,857号美国临时申请的权益，其通过引用全部并入本文。

关于序列表的申明

伴随本申请的序列表以文本格式提供以替代纸件副本，其通过引用并入本说明书中。含有所述序列表的文本名为BLBD_003_01WO_ST25.txt。创建于2012年6月8日的该文本文件为8KB，在递交本说明书的同时通过EFS-Web进行了电子提交。

背景

技术领域

本发明总体涉及基因治疗载体。具体地，本发明涉及提供用于肾上腺脑白质营养不良症和肾上腺脊髓神经病基因治疗的慢病毒载体。

相关技术描述

幼年的大脑肾上腺脑白质营养不良症(CCALD)极为稀少，有时快速恶化，在男孩中未治疗的x-连锁的遗传神经障碍(发病的中间年龄为7岁；范围为3-15岁)在诊断后平均5年内导致植物人状态，最终导致死亡。

CCALD最初通常表现为阿狄森氏症(Addison’s disease)，但其诊断通常基于注意力、思维力、专心力和其他大脑功能的“突然”下降，伴随着磁共振成像(MRI)上大脑髓鞘脱失的验证性发现。在髓鞘脱失以前，患者大脑的MRI是正常的，没有神经发育的异常。临床过程开始可能是“缓慢的”，但随着脑部髓磷脂丢失的扩散会变得快速恶化和不可逆转。术语“缓慢的”和“突然”相对而言是指髓鞘脱失期间并不真正被知道，但快速降低的认知力和运动能力会在任何时候发生且由于未知的原因。的确，MRI改变先于症状，且当很少有该疾病的临床表现的时候可能随着大范围髓鞘脱失而极为异常。x-连锁的肾上腺脑白质营养不良症(ALD)在美国的发病率为约1:21,000男性出生人数，其中35%为发展中的CCALD；每年约35-40个男孩被诊断为CCALD。该疾病的原因是ATP结合盒,D亚家族(ALD),成员1(ABCD1)基因的突变，导致肾上腺脑白质营养不良症蛋白(ALDP)基因产物的机能失调或缺失。ALDP位于细胞的过氧化物酶体，其参与从很长链的脂肪酸(VLCFA)(链长>20个碳)到较短脂肪酸的降解，所述脂肪酸用于维持细胞的结构和功能。

CCALD临床表现的中枢神经系统(CNS)病理生理学还未得到充分了解，但髓鞘脱失是由于无法代谢的VLCFA局部累积而导致的，因为有缺陷的ALDP无法支持大脑小神经胶质细胞中的过程。该疾病的快速恶化期是由于炎症导致，可能通过VLCFA由于细胞蛋白的酰化导致，其加速了髓磷脂的丢失。CCALD的快速恶化期会导致男孩数月内从正常功能之严重残疾的恶化。

唯一可提供的治疗是进行同种异体造血干细胞移植(HCT)以支持产生功能性ALDP的细胞。由于大脑小神经胶质细胞源自骨髓，完全匹配的相关供体人干细胞移植，使用产生功能性ALDP的细胞，可潜在地或阻止髓鞘脱失的发展。然而，由于同种异体HCT要花费12-18个月时间来稳定病情，且由于疾病发展的特性，疾病一经诊断发现就应该尽快进行移植。由于需要前置时间来发现相关的或不相关的匹配骨髓干细胞供体，常常使其成为问题。使用同种异体干细胞也会出现移植失败和发展为急性或慢性移植物抗宿主疾病(GvHD)的风险。这些并发症会导致死亡，且当使用不相关的供体作为同种异体造血干细胞来源时增加了发生率。

替代物的另一来源是使用匹配的，更通常为部分匹配的脐带血细胞移植物。使用脐带血干细胞(CBSCs)的问题是，移植失败的风险和延长的移植时间需要延长的输血支持。的确，所有形式的同种异体HCT均涉及10-15%的移植相关是死亡率，以及高达30%的慢性移植物抗宿主疾病发病率。

因此，本领域需要更加安全和有效的肾上腺脑白质营养不良症治疗。本发明提供了解决这些和其他问题的方案。

发明概述

因此，本说明书中各处出现的词语“在一个实施方案中”或“在一实施方案中”不一定都是至同样的实施方案。而且，在一个或多个实施方案中，具体特征、结构或特性可以任何合适的方式进行组合。

在各种实施方案中，本发明部分地预期了，载体，其包括：左端(5’)逆转录LTR；中心聚嘌呤区/侧翼DNA(cPPT/FLAP)；逆转录输出元件；在小神经胶质细胞中具有活性的启动子，可操作地连接至编码ATP结合盒、D亚家族、成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸；和右端(3’)逆转录LTR；其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

在具体实施方案中，所述载体为慢病毒载体。

在相关的实施方案中，所述慢病毒为HIV。

在更具体的的实施方案中，所述慢病毒为HIV-1。

在某些实施方案中，所述5'LTR的启动子被异源启动子替换。

在其他实施方案中，所述异源启动子为巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。

在其他具体实施方案中，所述异源启动子为CMV启动子。

在进一步的实施方案中，所述5'LTR或3'LTR为慢病毒LTR。

在其他实施方案中，所述5'LTR和3'LTR为慢病毒LTR。

在某些具体实施方案中，所述慢病毒为HIV-1。

在具体实施方案中，所述3'LTR包含一个或多个修饰。

在某些具体实施方案中，所述3'LTR包含一个或多个缺失。

在其他实施方案中，所述3'LTR为自我失活的(SIN)LTR。

在一些实施方案中，所述逆转录输出元件为Rev响应元件(RRE)。

在进一步的实施方案中，所述cPPT/FLAP来自HIV-1。

在某些实施方案中，所述启动子包含骨髓瘤病毒增强子、阴性控制区缺失的，dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子或其具有转录活性的片段。

在具体实施方案中，所述编码ABCD1多肽的多核苷酸为cDNA。

在相关的实施方案中，所述cDNA包含优化的Kozak序列。

在某些实施方案中，所述优化的Kozak序列为(GCC)RCCATGG，其中R为嘌呤(A或G)。

在具体实施方案中，所述多核苷酸编码人ABCD1多肽.

在各种实施方案中，本发明部分地预期了，慢病毒载体，其包含：左端(5')LTR；cPPT/FLAP；RRE;MND启动子，可操作地连接至编码人ABCD1多肽的多核苷酸；右端(3')LTR；和聚腺苷酸化序列；其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

在具体实施方案中，所述慢病毒载体包含Psi(Ψ)包装信号。

在某些实施方案中，所述聚腺苷酸化序列为牛生长素聚腺苷酸化或信号兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列。

在某些具体实施方案中，所述慢病毒载体包含HIV-1的5'LTR或3'LTR。

在其他实施方案中，所述3'LTR为SIN LTR。

在各种实施方案中，本发明部分地预期了，慢病毒载体，其包含：左端(5')HIV-1LTR；Psi(Ψ)包装信号；cPPT/FLAP；RRE；MND启动子，可操作地连接至编码人ABCD1多肽的cDNA；右端(3')自我失活的(SIN)HIV-1LTR；和兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列；其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

在各种实施方案中，本发明部分地预期了，哺乳动物细胞，其包含本文描述的前述载体中任何一种载体。

在具体实施方案中，本发明部分地预期了，包装细胞，其包含：编码gag的第一多核苷酸，编码pol的第二多核苷酸，编码env的第三多核苷酸，以及本文描述的前述载体中任何一种载体。

在某些实施方案中，本发明部分地预期了，生产细胞，其包含本文描述的前述载体中任何一种载体。

在其他实施方案中，本发明部分地预期了，由所述生产细胞产生的载体颗粒。

在各种具体实施方案中，本发明部分地预期了，载体，其包含至少一个LTR；中心聚嘌呤区/侧翼DNA(cPPT/FLAP)；逆转录输出元件；和在小神经胶质细胞中具有活性的启动子，可操作地连接至编码ATP结合盒、D亚家族、成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸；其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

在各种确定的实施方案中，本发明部分地预期了，载体，其包含至少一个LTR；cPPT/FLAP；RRE；MND启动子，其可操作地连接至编码人ABCD1多肽的多核苷酸；和聚腺苷酸化序列；其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

在各种其他实施方案中，本发明部分地预期了，载体，其包含至少一个SIN HIV-1LTR；Psi(Ψ)包装信号；cPPT/FLAP；RRE；MND启动子，可操作地连接至编码人ABCD1多肽的cDNA；和兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列；其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

在各种实施方案中，本发明部分地预期了，用所述载体转导的宿主细胞。在具体实施方案中，所述宿主细胞为胚胎干细胞、成体干细胞或祖细胞。

在某些实施方案中，所述细胞为造血干细胞。

在具体实施方案中，本发明还部分地预期了，本发明所述的病毒载体在基因治疗中的用途。

在优选的实施方案中，所述基因治疗治疗或防止肾上腺脑白质营养不良症或肾上腺脊髓神经病。

在各种其他实施方案中，本发明部分地预期了，治疗肾上腺脑白质营养不良症或肾上腺脊髓神经病的方法，其包括将用本发明所述的载体转导的细胞给予到个体。

在具体实施方案中，所述为胚胎干细胞、成体干细胞或祖细胞。

在某些实施方案中，所述为造血干细胞。

序列标识符简要说明

SEQ ID NO:1为编码人ABCD1的cDNA序列。

SEQ ID NO:2为编码人ABCD1的cDNA序列。

SEQ ID NO:3为MND启动子多核苷酸序列。

附图说明

图1所示为用于临床前和临床研究的MND-ALD载体构建体的示意图。在用于高水平表达的MND启动子控制下，所有载体均具有人ABCD-1cDNA。对于pLBP100和pLBP140的安全修饰包括：gag编码区中的2个终止密码子、HIV LTR右侧的U3中的400bp缺失和兔β-球蛋白polyA(rβgppA)信号。HIV LTR，人免疫缺陷1型病毒长末端重复；Ψ+，包装信号；cPPT/flap，中心聚嘌呤区，RRE，Rev-响应元件；ppt，多嘌呤序列。通过引入突变(mut6)但具有功能的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(ΔWPRE)，pLBP140不同于pLBP100载体。

图2所示为用pLBP100和pLBP140慢病毒载体进行转导，以及实验中的短期液体和甲基纤维素培养。

图3所示为用pLBP100和pLBP140慢病毒载体进行转导，然后进行短期液体和甲基纤维素培养或长期在辅助性MS5基质上培养。

图4所示为转导正常人CD34+细胞后，骨髓祖细胞(CFU-GM;图4A)和红祖细胞(BFU-E;图B)的数目。使用pLBP100(p100)或pLBP140(p140)包括4个单独实验进行转导。

图5所示为LTC-IC频率。有限稀释后，5周基质共培养并转入甲基纤维素培养计数次级CFC，用L-Calc^TM程序以95%的置信区间估计频率。

图6所示为短期祖细胞中的载体整合效率。(A)在液体培养中于7、14、28、31和35天细胞的载体拷贝数(VCN)。(B)第14天合并的CFC培养物的平均VCN。(C)百分比载体阳性骨髓细胞集落。显示了分析的阳性和总集落数目。

图7所示为在短期相对于长期(LTC-IC)祖细胞的载体整合效率。(A)第14天合并的CFC培养物的平均VCN。(B)百分比载体阳性骨髓细胞集落。显示了分析的阳性和总集落数目。

图8所示为通过流式细胞术计算的转导细胞中的ALD蛋白(ALDP)表达。(A1和A2)直方图显示了来自不同实验针对模拟物、pLBP100和pLBP140转导细胞的PE荧光性。(B)于7天(expts.072010和091410)、14天(实验081010)和28天(实验080610)的百分比ALDP阳性细胞。(C)超过模拟物对照的MFI比率，显示在ALDP+细胞中ALDP表达的相对水平。

图9所示为MND-ALD载体构建体的示意图。所述载体具有在用于高水平表达的MND启动子控制下的人ABCD-1cDNA。HIV LTR，人免疫缺陷1型病毒长末端重复；Ψ+，包装信号；cPPT/flap，中心聚嘌呤区，RRE，Rev-响应元件；ppt，多嘌呤序列。所述载体不含WPRE序列。

图10所示为在不同MOI下用p100和p140转导的4496细胞中，模拟物相对于VCN的VLCFA校正比率。

发明详述

A.概述

本发明总体上涉及用于肾上腺脑白质营养不良症和肾上腺脊髓神经病的更安全和有效的病毒载体和转导细胞治疗。不受任何具体理论的束缚，申请人考虑了患有ALD男孩的造血干细胞另外为正常的，因为小神经胶质细胞源自骨髓，在患者个体的造血干细胞中对于有缺陷的ABCD1基因添加正常ABCD1cDNA能够使得在脑部小神经胶质细胞中的ALDP水平正常化。因此，使用本发明载体将正常ABCD1cDNA的体内基因转移至自体CD34+造血干细胞，然后在骨髓消融后进行移植可导致CNS功能的稳定和与ALD致死效应相关的血浆VLCFA水平下降。

因此，本发明的组合物和方法能代表在治疗患有ALD的男孩方面巨大的医疗进步，因为其允许以大大降低的造血细胞移植失败风险和消除急性和慢性GvHD的方式进行快速治疗。由于快速CNS恶化的可能和在疾病稳定而允许HCT以前的12-18个月等候，在该人群中时间是极为关键的因素。

除非另有具体说明，本发明的实施将在本领域技术内使用常规的分子生物学方法和重组DNA技术，为了说明目的其中的许多在以下进行了描述。这类技术在文献中被充分描述。参见例如，Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989);Maniatis etal.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);DNA Cloning:APractical Approach,vol.I&II(D.Glover,ed.);Oligo核苷酸Synthesis(N.Gait,ed.,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,eds.,1985);转录and Translation(B.Hames&S.Higgins,eds.,1984);AnimalCell Culture(R.Freshney,ed.,1986);A Practical Guide to MolecularCloning(B.Perbal,ed.,1984).

本文引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用全部并入本文。

B.定义

除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所述技术领域的普通技术人员通常所理解的同样的含义。为本发明的目的，对下列术语作如下定义。

如本文所用，术语“逆转录病毒”是指将其基因组RNA逆转录为线性双链DNA拷贝，随后将其基因组DNA共价整合值宿主基因组内的RNA病毒。逆转录病毒属于逆转录病毒科(Retroviridae)，其由多个非二十面体的包膜病毒组成，该病毒包括2个拷贝的具有短二聚化区的单链RNA基因组。逆转录病毒为用于基因递送的常用工具(Miller,2000,Nature.357:455-460)。一旦病毒被整合至宿主基因组内，其被称为“前病毒”。所述前病毒作为RNA聚合酶II的模板，并指导编码结构蛋白和产生新病毒粒子所需的酶的RNA分子的表达。

示例性逆转录病毒包括，但不限于：莫洛尼小鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼小鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维小鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、小鼠乳腺瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫科动物白血病病毒(FLV)、泡沫病毒属、Friend小鼠白血病病毒、小鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))以及慢病毒。

如本文所用，术语“慢病毒”是指一组(或属)的复合的逆转录病毒。示例性逆转录病毒包括，但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV1型和HIV2型)、韦斯那-梅迪(visna-maedi)病毒(VMV)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫科动物免疫缺陷病毒(FIV)、牛科动物免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施方案中，优选基于HIV的载体骨架(即HIV顺式作用序列元件)。

逆转录病毒载体且更具体地慢病毒载体可用于实施本发明。因此，术语“逆转录病毒”或“逆转录病毒载体”,如本文所用，旨在分别包括“慢病毒”和“慢病毒载体”。

本文所用术语“载体”是指能够转移或运输另一种核酸分子的核酸分子。被转移的核酸通常连接至，例如，插入至所述载体核酸分子。载体包括可指导细胞中自主复制的序列，或可包括足以允许整合至宿主细胞DNA的序列。有用的载体包括例如，质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如，复制缺陷性逆转录病毒和慢病毒。

对本领域技术人员来说很显然的是，术语“病毒载体”广泛用于指包含通常促进核酸分子转移或整合至细胞基因组内的病毒来源核酸元件的核酸分子(例如，转移质粒)，或者指介导核酸转移的病毒粒子。病毒粒子通常包括除核酸外的各种病毒组件且有时还有宿主细胞组件。

术语病毒载体可指能够将核酸转移至细胞内的病毒或病毒粒子，或者可指被转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒包含主要源自病毒的结构和/或功能性基因元件。术语“逆转录病毒载体”是指包含主要源自逆转录病毒的结构和功能性基因元件的病毒载体或质粒。术语“慢病毒载体”是指包含结构和功能性基因元件(包括主要源自慢病毒的LTR)的病毒载体或质粒。术语“杂合子”是指包含逆转录病毒如慢病毒序列和非慢病毒序列的载体、LTR或其他核酸。在一个实施方案中，杂合载体是指载体或转移质粒，其包含用于逆转录、复制、整合和/或包装的逆转录病毒如慢病毒的序列和甲病毒亚基因组启动子序列、非结构蛋白和/或聚合酶是被位点。

在具体实施方案中，术语“慢病毒载体”、“慢病毒表达载体”可用于指慢病毒转移质粒和/或感染性慢病毒粒子。当本文提到诸如克隆位点、启动子、调控元件、异源核酸等元件时，应理解，这些元件的序列是在本发明的慢病毒粒子中以RNA形式存在，且在本发明的DNA质粒中以DNA形式存在。

在前病毒的每个末端是称为“长末端重复”或“LTRs”的结构。术语“长末端重复(LTR)”是指位于逆转录病毒DNA末端的碱基对结构域，在其天然序列中为正向重复并含有U3、R和U5区。LTRs通常提供作为逆转录病毒基因表达(例如，基因转录的促进、启动和聚腺苷酸化)和病毒复制基础的功能。LTR含有许多调控信号，包括转录控制元件、聚腺苷酸化信号和用于病毒基因组复制和整合所需的序列。所述病毒LTR分为3个区，称为U3、R和U5。U3区包含增强子和启动子元件。U5区是位于引物结合位点和R区之间的序列，其包含聚腺苷酸化序列。R(重复)区侧接有U3和U5区。LTR由U3、R和U5区组成，其在病毒基因组的5'和3'端均出现。邻近5'LTR的是基因组逆转录所需的序列(tRNA引物结合位点)和将病毒RNA有效包装到粒子内所需的序列(Psi位点)。

如本文所用，术语“包装信号”或“包装序列”是指位于逆转录病毒基因组内的序列，其为将病毒RNA插入至病毒衣壳或粒子内所需的序列，参见例如，Clever et al.,1995.J.of Virology,Vol.69,No.4;pp.2101–2109。一些逆转录病毒载体使用病毒基因组衣壳化所需的最小包装信号(也称为psi[Ψ]序列)。因此，如本文所用，术语“包装序列”、“包装信号”、“psi”和符号“Ψ”均用于指病毒粒子形成过程中逆转录病毒RNA链衣壳化所需的非编码序列。

在各种实施方案中，载体包括修饰的5'LTR和/或3'LTR。通常通过使病毒为复制缺陷型来对3'LTR进行修饰以提高慢病毒或逆转录病毒系统的安全性。如本文所用，术语“复制缺陷型”是指不能完整和有效复制的病毒，从而没有产生感染性病毒(例如，复制缺陷型慢病毒子代)。术语“复制型”是指能够复制的野生型病毒或突变的病毒，从而病毒复制能够产生感染性病毒粒子(例如，复制型慢病毒子代)。

“自失活”(SIN)载体是指复制缺陷型载体,例如，逆转录病毒或慢病毒载体，其中已知为U3区的右侧(3')LTR增强子-启动子区被修饰(例如，通过缺失或取代)，以阻止病毒进行超过第一轮病毒复制以外的转录。这是因为在病毒复制期间右侧(3')LTR U3区被用作左侧(5')LTR U3区的模板，因此，没有U3增强子-启动子，所述病毒转录无法进行。在本发明又一个实施方案中，所述3'LTR被修饰，从而U5区被取代，例如，用理想的poly(A)序列。应指出，对LTRs进行修饰，从而对3'LTR、5'LTR或者3'和5'LTRs二者的修饰均包括在本发明内。

通过用异源启动子取代5'LTR的U3区，以在产生病毒粒子期间启动病毒基因组的转录，另外提供了提高的安全性。可使用的异源启动子实例包括例如，病毒性猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期的)、巨细胞病毒(CMV)(例如，即刻早期的)、莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)和单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。典型的启动子能够以非Tat依赖性的方式启动高水平的转录。该取代降低了重组以产生复制型病毒的可能性，因为在病毒产生系统中没有完整的U3序列。

在一些实施方案中，病毒载体包含TAR元件。术语“TAR”是指位于慢病毒(例如，HIV)LTRs的R区的“反式激活响应”基因元件。该元件与慢病毒反式激活蛋白(tat)基因元件相互作用以促进病毒复制。然而，在其中5'LTR的U3区被异源启动子取代的实施方案中，不需要该元件。

“R区”是指逆转录病毒LTR内的区，其开始于封端基团的起始(即转录的起始)，并随即结束于poly A位点的起始之前。R区也定义为侧接有U3和U5区。R区在逆转录期间的作用是使新复制的DNA从基因组的一端转移至另一端。

如本文所用，术语“FLAP元件”是指其序列包括逆转录病毒例如，HIV-1或HIV-2的中心聚嘌呤区和中央终止序列(cPPT和CTS)的核酸。合适的FLAP元件描述于美国专利第6,682,907号和Zennou,et al.,2000,Cell,101:173。在HIV-1逆转录期间，正链DNA在中心聚嘌呤区(cPPT)的中央起始和在中央终止序列(CTS)的中央终止导致形成3链DNA结构：HIV-1中央DNA侧翼。尽管不希望受到任何理论的束缚，所述侧翼DNA可作为慢病毒基因组核输入的顺式作用决定子和/或可增加所述病毒的滴度。在具体实施方案中，所述逆转录病毒或慢病毒载体骨架包括在载体中的目标异源基因上游或下游的一个或多个FLAP元件。例如，在具体的实施方案中，转移质粒包括FLAP元件。在一个实施方案中，本发明的载体包括分离自HIV-1的FLAP元件。

在一个实施方案中，逆转录病毒或慢病毒转移载体包括一个或多个输出元件。术语“输出元件”是指顺式作用转录后调控元件，其调控将RNA转录物从细胞核运输至细胞质中。RNA输出元件的实例包括但不限于，人免疫缺陷病毒(HIV)Rev响应元件(RRE)(参见例如，Cullen et al.,1991.J.Virol.65:1053；以及Cullen et al.,1991.Cell58:423)，和B型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)。通常，RNA输出元件位于基因的3'UTR内，可作为一个或多个拷贝被插入。

在具体实施方案中，通过将转录后调控元件和有效的聚腺苷酸化位点以及任选的转录终止信号整合至所述载体，增加了病毒载体中异源序列的表达。多种转录后调控元件能够增加异源核酸在蛋白上的表达，例如，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE;Zufferey et al.,1999,J.Virol.,73:2886)；存在于B型肝炎病毒(HPRE)中的转录后调控元件(Huanget al.,Mol.Cell.Biol.,5:3864)；等等(Liu et al.,1995,Genes Dev.,9:1766)。所述转录后调控元件通常位于异源核酸序列的3'端。该结构导致了mRNA转录物的合成，其5'部分包括所述异源核酸编码序列，而其3'部分包括所述转录后调控元件序列。在优选的实施方案中，本发明的载体缺少或不包括转录后调控元件如WPRE或HPRE，因为在一些情况下这些元件增加了细胞转化的风险和/或不能实质上或明显地增加mRNA转录物的量或增加mRNA的稳定性。因此，在一些实施方案中，本发明的载体缺少或不包括WPRE或HPRE作为附加的安全措施。

指导异源核酸转录物的有效终止和聚腺苷酸化的元件，增加了异源基因表达。转录终止信号通常发现于聚腺苷酸化信号的下游。术语“polyA位点”或“polyA序列”如本文所用，是指通过RNA聚合酶II来指导新的RNA转录物的终止和聚腺苷酸化的DNA序列。重组转录物的有效聚腺苷酸化是可取的，因为缺少poly A尾的转录物不稳定且会快速降解。可用于本发明的载体中的polyA信号的示例性实例包括，理想的polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA AGTAAA)、牛生长素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白polyA序列(rβgpA)，或本领域已知的其他合适的异源或内源polyA序列。

在某些实施方案中，逆转录病毒或慢病毒载体还包括绝缘子(insulator element)。绝缘子有助于保护慢病毒-表达的序列如治疗性多肽免于整合位点效应，其可由基因组DNA中存在的顺式作用元件介导，并导致被转移序列的去调控表达(即位置效应，参见例如，Burgess-Beusse etal.,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,99:16433;and Zhan et al.,2001,Hum.Genet.,109:471)。在一些实施方案中，转移载体包括在一个或两个LTR中或其他地方如整合至细胞基因组的载体的区内的绝缘子。用于本发明的合适绝缘子包括但不限于，鸡β-球蛋白绝缘子(参见Chung et al.,1993.Cell74:505;Chung et al.,1997.PNAS94:575;以及Bell et al.,1999.Cell98:387，其通过引用并入本文)。绝缘子的实例包括但不限于，来自β-球蛋白位点如鸡HS4的绝缘子。

根据本发明某些具体实施方案，大多数或所有的病毒载体骨架序列均源自慢病毒,例如HIV-1。然而，应理解，许多不同来源的慢病毒序列均可使用，在一些慢病毒序列中许多取代和改变可被接纳而不损害转移载体发挥本文所描述的功能的能力。而且，许多慢病毒载体为本领域所知，参见Naldini et al.,(1996a,1996b,和1998);Zufferey et al.,(1997);Dullet al.,1998,美国专利第6,013,516号和第5,994,136号，其中任何一个均可适用于制备本发明的病毒载体或转移质粒。

如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)或DNA。多核苷酸包括单链和双链的多核苷酸。优选地，本发明的多核苷酸包括与本文所描述序列中任一序列具有至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多核苷酸或变异体(参见例如，序列表)，通常其中所述变异体保留所述参考序列的至少一个生物学活性。在各种示例性实施方案中，本发明部分地预期了病毒载体和转移质粒多核苷酸序列以及含有其的组合物。在具体实施方案中，本发明提供了编码治疗性多肽的多核苷酸。

如本文所用，术语“多核苷酸变异体”和“变异体”等是指表现出与参考多核苷酸序列或多核苷酸具有大量序列同一性的多核苷酸，其在下文定义的严格条件下与参考序列杂交。这些术语包括，相比参考的多核苷酸，其中一个或多个核苷酸已被增加或缺失或者用不同核苷酸取代的核苷酸。就此而言，本领域熟知可对参考多核苷酸进行一些包括突变、增加、缺失和取代的改变，由此改变的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物学功能或活性。

如本文所用，术语“分离的”是指基本上或实质上脱离在天然状态下伴随其的组分的物质。如本文所用，例如“分离的多核苷酸”是指已经由天然状态下连接于其侧面的序列进行了纯化的多核苷酸，例如，已经从正常地邻近该片段的序列上脱离的DNA片段。

描述多核苷酸方向的术语包括：5'(通常为具有游离磷酸基的多核苷酸末端)和3'(通常为具有游离羟基(OH)的多核苷酸末端)。多核苷酸序列可解释为在5'至3'方向，或3'至5'方向。

术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对原则相关联的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，DNA序列5'A G T C A T G3'的互补链为3'T C AG T A C5'。后者的序列通常写为5'端在左侧而3'端在右侧的反向互补序列，5'C A T G A C T3'。等于其反向互补序列的序列被称为回文结构序列。互补性可为“部分的”其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对原则匹配。或者，核酸之间也可有“完全的”或“全部的”互补性。

如本文所用，术语“核酸盒”是指载体中可表达RNA和随后产生蛋白的基因序列。所述核酸盒含有目的基因。所述核酸盒在载体内按位置和顺序取向，从而所述盒中的核酸在必要时可被转录为RNA，翻译为蛋白或多肽，经过针对转化细胞中所需活性的适当转录后修饰，然后通过靶向合适的胞内空间或分泌至胞外空间而被移位至用于生物活性的合适空间。优选地，所述盒具有适应易于插入至载体内的3'和5'端,例如，其在每端均具有限制性内切酶位点。在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸盒含有用于治疗肾上腺脑白质营养不良症或肾上腺脊髓神经病的治疗基因的序列。所述盒可作为单个单位移除而插入至质粒或病毒载体。

多核苷酸包括目标多核苷酸。如本文所用，术语“目标多核苷酸”是指插入至期望被表达的表达载体中的多核苷酸，例如编码多肽(即目标多肽)的多核苷酸。在某些实施方案中，所述目标多核苷酸编码在治疗或预防疾病或失调中提供治疗效果的多肽，其可称为“治疗性多肽,”例如，ATP结合盒，D亚家族(ALD)，成员1(ABCD1)基因。目标多核苷酸和由其编码的多肽包括编码野生型多肽的多核苷酸及其功能变异体和片段。在具体实施方案中，功能变异体与对应的野生型参考多核苷酸或多肽序列具有至少80%、至少90%、至少95%或至少99%的同一性。在某些实施方案中，功能变异体或其片段具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%对应野生型多肽的生物活性。适用于本发明的代表性多核苷酸序列包括但不限于，在SEQ ID NOs:1-2中陈述的人ACBD1cDNA。

无论编码序列本身的长度，本发明的多核苷酸均可与其他DNA序列组合，如启动子和/或增强子、非翻译区(UTRs)、Kozak序列、聚腺苷酸化信号、另外iad限制酶位点、多个克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如，LoxP、FRT和Att位点)、终止密码子、转录终止信号和编码自切割多肽的多核苷酸、表位标记，如本文其他地方所公开的或本领域已知的，从而它们的总长度可很大地变化。因此，预期了可使用几乎任何长度的多核苷酸片段，优选其总长度限于在计划中的重组DNA草案中易于制备和使用。

如本文所用，术语“启动子”是指RNA聚合酶结合的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。术语“增强子”是指含有能够提供增强转录的序列的DNA片段，在一些情况下能不依赖于其相对于另一控制序列的方向而起作用。增强子能够与启动子和/或其他增强子元件合作地或附加地发挥作用。术语“启动子/增强子”是指含有能够提供启动子和增强子功能的序列的DNA片段。在一个实施方案中，本发明的载体包括骨髓瘤病毒增强子，阴性控制区缺失的dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子(Challitaet al.,J Virol.69(2):748-55(1995);SEQ ID NO:3)。

在具体实施方案中，本发明非载体包括外源、内源或异源控制序列如启动子和/或增强子。“内源”控制序列是天然连接至基因组内给定基因的序列。“外源”控制序列是通过基因操作(即分子生物技术)而与基因并列的序列，从而所述基因的转录由连接的增强子/启动子指导。“异源”控制序列是来自与接受遗传操作的细胞不同物种的外源序列。

术语“可操作地连接的”是指并列连接，其中所描述元件的关系为允许它们以期望的方式发挥功能。在一个实施方案中，所述术语是指核酸表达控制序列(如启动子和/或增强子)和第二多核苷酸序列如目标多核苷酸之间的功能性连接，其中所述表达控制序列指导对应于所述第二序列的核酸的转录。

如本文所用，术语“组成型启动子”是指不断地或连续地允许可操作地连接的序列转录的启动子。组成型启动子可为允许在众多类型的细胞和组织中表达的“广谱表达型启动子”，或允许在限制的细胞和组织种类中表达的“组织特异性启动子”。示例性广谱表达型启动子包括但不限于，巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、病毒性猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、H5、P7.5，以及来自牛痘病毒的P11启动子、延长因子1-α(EF1a)启动子、早期生长响应1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、真核生物翻译起始因子4A1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDa-β、成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人ROSA26位点(Irions et al.,NatureBiotechnology25,1477-1482(2007))、泛激素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子和β-肌动蛋白启动子。

在具体实施方案中，可取的是使用组织特异性启动子以获得期望的多核苷酸序列的细胞类型特异性、种系特异性或组织特异性表达(例如，在细胞类型或组织的亚群中或在发育的特定阶段中，表达编码多肽的具体核酸)。组织特异性启动子的示例性实例包括但不限于：B29启动子(B细胞表达)、runt转录因子(CBFa2)启动子(干细胞特异性表达)、CD14启动子(单细胞表达)、CD43启动子(白血球和血小板表达)、CD45启动子(造血细胞表达)、CD68启动子(巨噬细胞表达)、CYP4503A4启动子(肝细胞表达)、肌间线蛋白启动子(肌肉表达)、弹性蛋白酶1启动子(胰腺腺泡细胞表达)、内皮素启动子(内皮细胞表达)、成纤维细胞特异性蛋白1启动子(FSP1)启动子(成纤维细胞表达)、纤连蛋白启动子(成纤维细胞表达)、fms-相关的酪氨酸激酶1(FLT1)启动子(内皮细胞表达)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(星形细胞表达)、胰岛素启动子(胰腺β细胞表达)、整合蛋白、α-2b(ITGA2B)启动子(巨核细胞)、细胞间粘附分子2(ICAM-2)启动子(内皮细胞)、干扰素β(IFN-β)启动子(造血细胞)、角蛋白5启动子(角化细胞表达)、肌红蛋白(MB)启动子(肌肉表达)、成肌分化1(MYOD1)启动子(肌肉表达)、肾病蛋白(nephrin)启动子(足细胞表达)、骨γ-羧基谷氨酸蛋白2(OG-2)启动子(成骨细胞表达)、3-酮酸CoA转移酶2B(Oxct2B)启动子,(单倍体精子细胞表达)、表面活性蛋白B(SP-B)启动子(肺部表达)、突触蛋白启动子(神经细胞表达)、Wiskott-Aldrich综合征蛋白(WASP)启动子(造血细胞表达)。

在一个实施方案中，本发明的载体包括在小神经胶质细胞中表达期望的多肽，例如ABCD1的组织特异性启动子和/或增强子，例如MND启动子(SEQ ID NO:3)。

如本文所用，“条件表达”可指任何类型的条件表达，包括但不限于，可诱导的表达、可抑制的表达、在具有特定生理学的、生物学的或疾病状态等的细胞或组织中的表达。该定义并非旨在排除细胞或组织特异性表达。本发明某些实施方案提供目标多核苷酸的条件表达，例如，通过使细胞、组织、器官等接受处理或者导致多核苷酸被表达或导致由目标多核苷酸编码的多核苷酸表达增加或降低的条件，来控制表达。

可诱导的启动子/系统的示例性实例，包括但不限于，类固醇-可诱导的启动子如编码糖皮质激素或雌激素受体基因的启动子(可通过用相应激素处理诱导)、金属硫蛋白启动子(可通过用各种重金属处理诱导)、MX-1启动子(可通过干扰素诱导)、“基因开关(GeneSwitch)”米非司酮-调控系统(Sirin et al.,2003,Gene,323:67)、Cumate诱导的基因开关(WO2002/088346)、四环素依赖性调控系统，等等。

条件表达也可通过使用位点特异性DNA重组酶来实现。根据本发明的某些实施方案，所述载体包括至少一个(通常为两个)位点，其用于通过位点特异性重组酶来介导重组。如本文所用，术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”包括分割的或整合的蛋白、酶、辅助因子或相关蛋白，所述蛋白涉及一个或多个重组位点(例如，2、3、4、5、7、10、15、20、30、50个等)的重组反应，其可为野生型蛋白(see Landy,Current Opinion inBiotechnology3:699-707(1993))，或者其突变体蛋白或衍生物(例如，含有重组蛋白序列或其片段的融合蛋白)、其片段和突变体。适用于本发明的具体实施方案的重组酶的示例性实例，包括但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1和ParA。

所述载体可包括针对众多位点特异性重组酶中任一种的一个或多个重组位点。应理解，针对位点特异性重组酶的靶位点不包含于载体整合所需的任何位点，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体。如本文所用，术语“重组序列”、“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指重组酶识别并与之结合的特定核酸序列。

例如，重组酶的一个重组位点是loxP，其为34个碱基对序列，包括两个13个碱基对反向重复序列(作为重组酶结合位点)侧接于8个碱基对的核心序列(参见，Sauer,B.,Current Opinion in Biotechnology5:521-527(1994)的图1)。其他示例性loxP位点包括但不限于：lox511(Hoess et al.,1996;Bethke and Sauer,1997)、lox5171(Lee and Saito,1998)、lox2272(Leeand Saito,1998)、m2(Langer et al.,2002)、lox71(Albert et al.,1995)和lox66(Albert et al.,1995)。

针对FLP重组酶的合适识别位点包括但不限于：FRT(McLeod,et al.,1996)、F1、F2、F3(Schlake and Bode,1994)、F4、F5(Schlake and Bode,1994)、FRT(LE)(Senecoff et al.,1988)、FRT(RE)(Senecoff et al.,1988)。

识别序列的其他实例为attB、attP、attL和attR序列，其通过重组酶λ整合酶例如phi-c31被识别。

SSR仅在异型位点attB(长度34bp)和attP(长度39bp)之间介导重组(Groth et al.,2000)。attB和attP分别以针对噬菌体整合酶在细菌和噬菌体基因组上的结合位点来命名，二者均含有易于被

同源二聚体结合的不完整反向重复序列(Groth et al.,2000)。产物位点attL和R有效地对于进一步

-介导的重组无活性(Belteki et al.,2003)，使该反应不可逆。对于催化插入已发现，相比attP位点插入之基因组attB位点，带有attB的DNA更易于插入至基因组attP位点(Thyagarajan et al.,2001;Belteki et al.,2003)。因此，通过同源重组将带有attP的“接合位点”结合至指定位点的典型策略位置，然后其伴随用于插入的带有attB的输入序列。

如本文所用，“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指促进内部核糖体直接进入至起始密码子如顺反子(蛋白编码区)的ATG的元件，从而导致基因的不依赖于帽结构的翻译。参见例如，Jackson et al.,1990.TrendsBiochem Sci15(12):477-83)，以及Jackson and Kaminski.1995.RNA1(10):985-1000。在具体实施方案中，本发明预期的所述载体包括编码一个或多个多肽的一个或多个目标多核苷酸。为了实现多个多肽中每个的有效翻译，所述多核苷酸序列可被一个或多个IRES序列或编码自我切割多肽的多核苷酸序列分离。

如本文所用，术语“Kozak序列”是指大大促进mRNA起始结合至核糖体小亚基上并增加翻译的短核苷酸序列。保守Kozak序列为(GCC)RCCATGG，其中R为嘌呤(A或G)(Kozak,1986.Cell.44(2):283-92，以及Kozak,1987.Nucleic Acids Res.15(20):8125-48)。在具体实施方案中，本发明预期的所述载体包括具有保守Kozak序列且编码期望的多肽例如ABCD1的多核苷酸。

在具体实施方案中，载体包括编码待表达多肽的多核苷酸的聚腺苷酸化序列3′端。聚腺苷酸化序列通过将polyA尾加入至编码序列的3′端可促进mRNA的稳定性，因此有助于增加翻译效率。识别的聚腺苷酸化位点包括理想的polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA AGTAAA)、牛生长素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白polyA序列(rβgpA)，或本领域已知的其他合适的异源或内源polyA序列。

在某些实施方案中，载体包括选择基因，也称为可选择标记。典型的选择基因编码如下蛋白：(a)赋予对抗生素或其他毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、潮霉素、氨甲喋呤、博莱霉素、杀稻瘟菌素或四环素，(b)补足营养缺陷型的缺陷，或(c)提供不能自复合培养基获得的必需营养物，例如用于芽孢杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。任何数目的选择系统均可用于恢复转化的细胞系。这些包括但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.,1977.Cell11:223-232)和腺嘌呤转磷酸核糖基酶(Lowy et al.,1990.Cell22:817-823)基因，其可分别用于tk-或aprt-细胞。

“宿主细胞”包括在体内或体外用本发明的载体或多核苷酸转染或感染的细胞。宿主细胞可包括包装细胞、生产细胞和用病毒载体感染的细胞。在具体实施方案中，将用本发明病毒载体感染的宿主细胞给予至有治疗需要的个体。

大规模病毒粒子制备通常需要达到合理的病毒滴度。病毒粒子的制备是通过将转移载体转染至包含病毒结构和/或附件基因例如，gag,pol,env,tat,rev,vif,vpr,vpu,vpx或nef基因或其他逆转录病毒基因的包装细胞系。

如本文所用，术语“包装载体”是指表达载体或病毒载体，其缺少包装信号且包含编码1、2、3、4或更多个病毒结构和/或附件基因的多核苷酸。通常，所述包装载体被包含于包装细胞，且通过转染、转导或感染被引入至所述细胞。转染、转导或感染的方法为本领域技术人员所熟知。可通过转染、转导或感染将本发明的逆转录病毒/慢病毒转移载体引入至包装细胞系，以产生生产细胞或细胞系。通过标准方法可将本发明的包装载体引入至人细胞或细胞系，包括例如，磷酸钙转染、脂质转染或电穿孔。在一些实施方案中，将所述包装载体和显性选择标记如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博莱霉素、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA一起引入至所述细胞，然后在合适的药物存在下选择并分离克隆。通过包装载体，例如通过IRES或自我切割病毒肽，选择标记基因可物理连接至编码基因。

病毒包膜蛋白(env)决定宿主细胞的范围，其最终被所述细胞系产生的重组逆转录病毒感染或转化。在慢病毒的情况下，如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIV，所述env蛋白包括gp41和gp120。优选地，本发明包装细胞表达的所述病毒env蛋白编码于来自病毒的gag和pol基因的单独载体，如此前所描述。

可用于本发明的源自逆转录病毒的env基因示例性实例，包括但不限于：MLV包膜、10A1包膜、BAEV、FeLV-B、RD114、SSAV、埃博拉病毒、仙台病毒、FPV(禽疫病毒)和流感病毒包膜。类似地，也可使用来自RNA病毒(例如，RNA病毒家族的小RNA病毒科、杯状病毒科、星状病毒科、披盖病毒科、黄病毒科、冠状病毒科、副黏液病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科，布尼亚病毒科、沙粒病毒科、呼肠病毒科、双核糖核酸病毒科，逆转录病毒科)以及来自DNA病毒(肝病毒科、环病毒科、小DNA病毒、乳多空病毒科、腺病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科和虹彩病毒科)的基因编码包膜。代表性实例包括，FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、Rabies、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10、EIAV。

在其他实施方案中，用于对本发明的病毒假型化的包膜蛋白包括但不限于下述任一种病毒：流感A如H1N1、H1N2、H3N2和H5N1(禽流感)、流感B、流感C病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒、轮状病毒、诺瓦克病毒组的任何病毒、肠道腺病毒、细小病毒、登革热病毒、猴痘病毒、单股反链病毒、狂犬病毒属如狂犬病毒、拉各斯蝙蝠病毒、莫科拉病毒、杜文海格病毒、欧洲蝙蝠病毒1&2和澳大利亚蝙蝠病毒、流行热病毒、水泡病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒如单纯疱疹病毒1型和2型、水痘带状疱疹、巨细胞病毒、Epstein-Bar病毒(EBV)、人疱疹病毒(HHV)、人疱疹病毒6型和8型、人免疫缺陷病毒(HIV)、乳突瘤病毒、鼠γ疱疹病毒、沙粒病毒如阿根廷出血热病毒、玻利维亚出血热病毒、萨比亚(Sabia)相关的出血热病毒、委内瑞拉出血热病毒、拉沙热病毒、马秋博病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、布尼亚科病毒如克里米亚-刚果出血热病毒、汉坦病毒、肾综合征出血热病毒、里夫特裂谷热病毒、丝状病毒科(丝状病毒)包括埃博拉出血热和马尔堡出血热、黄病毒科包括科萨努尔森林病病毒、鄂木斯克出血热病毒、森林脑炎病毒和副黏液病毒科如亨德拉病毒和尼帕病毒、重型天花和轻型天花(痘疮)、甲病毒如委内瑞拉马脑炎病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、SARS-相关的冠状病毒(SARS-CoV)、西尼罗河病毒、任何导致脑炎的病毒。

在一个实施方案中，本发明提供了包装细胞，其产生重组的逆转录病毒，例如用VSV-G glyco蛋白假型化的慢病毒。

如本文所用，术语“假型”或“假型化”是指其病毒包膜蛋白已经用另一种具有可取特征的病毒的包膜蛋白取代的病毒。例如，HIV可用疱疹性口炎病毒G-蛋白(VSV-G)包膜蛋白来假型化，所述包膜蛋白允许HIV感染众多类型细胞，因为HIV包膜蛋白(由env基因编码)通常使病毒靶向CD4+呈递细胞。在本发明的一个优选实施方案中，用VSV-G来使慢病毒包膜蛋白假型化。在一个实施方案中，本发明提供了包装细胞，其产生重组的逆转录病毒例如用VSV-G包膜糖蛋白假型化的慢病毒。

如本文所用，术语“包装细胞系”是指不含包装信号但能稳定或瞬时表达正确包装病毒粒子所需的病毒结构蛋白和复制酶(例如，gag、pol和env)的细胞系。任何合适的细胞系均可用于制备本发明的包装细胞。通常，所述细胞为哺乳动物细胞。在具体实施方案中，用于制备所述包装细胞系的细胞为人细胞。可使用的合适细胞系包括例如，CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC1细胞、BSC40细胞、BMT10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。在优选的实施方案中，所述包装细胞为293细胞、293T细胞或A549细胞。在另一个优选实施方案中，所述细胞为A549细胞。

如本文所用，术语“生产细胞系”是指能产生重组逆转录病毒粒子的细胞系，包括包装细胞系和包含包装信号的转移载体构建体。可使用常规技术制备感染性病毒粒子和病毒母液。制备病毒母液的方法为本领域所熟知，描述于例如，Y.Soneoka et al.(1995)Nucl.Acids Res.23:628-633，以及N.R.Landau et al.(1992)J.Virol.66:5110-5113。可使用常规技术从包装细胞收集感染性病毒粒子。例如，如本领域所知，可通过细胞溶解来收集感染性病毒粒子，或收集细胞培养物上清液。任选地，如需要可将收集的病毒粒子纯化。合适的纯化技术为本领域技术人员所熟知。

使用逆转录病毒或慢病毒载体通过病毒感染而非转染来递送基因或其他多核苷酸序列称为“转导”。在一个实施方案中，通过感染和前病毒整合将逆转录病毒载体转导至细胞。在某些实施方案中，如果细胞包含使用病毒或逆转录病毒载体通过感染递送至其中的基因或其他多核苷酸序列，则所述细胞被转导。在具体实施方案中，转导细胞在其细胞基因组内包括通过逆转录病毒或慢病毒载体递送的基因或其他多核苷酸序列。

在具体实施方案中，将用本发明病毒载体转导的表达治疗性多肽例如ABCD1多肽的宿主细胞给予至个体，以治疗和/或预防疾病、障碍或病症，例如肾上腺脑白质营养不良症或肾上腺脊髓神经病。可用于本发明某些实施方案的其他有关使用病毒载体进行基因治疗的方法，可参见例如，Kay,M.A.(1997)Chest111(6Supp.):138S-142S;Ferry,N.and Heard,J.M.(1998)Hum.Gene Ther.9:1975-81;Shiratory,Y.et al.(1999)Liver19:265-74;Oka,K.et al.(2000)Curr.Opin.Lipidol.11:179-86;Thule,P.M.and Liu,J.M.(2000)Gene Ther.7:1744-52;Yang,N.S.(1992)Crit.Rev.Biotechnol.12:335-56;Alt,M.(1995)J.Hepatol.23:746-58;Brody,S.L.and Crystal,R.G.(1994)Ann.N.Y.Acad.Sci.716:90-101;Strayer,D.S.(1999)Expert Opin.Investig.Drugs8:2159-2172;Smith-Arica,J.R.andBartlett,J.S.(2001)Curr.Cardiol.Rep.3:43-49;以及Lee,H.C.et al.(2000)Nature408:483-8。

如本文所用，除非上下文中另有清楚的说明，“治疗”和类似词语如“被治疗”、“进行治疗”等，是指用于获得益处或期望的结果包括或优选临床结果的途径。治疗可任选地涉及减轻或缓解疾病或病症的症状，或者延迟所述疾病或病症的进展。

如本文所用，除非上下文中另有清楚的说明，“预防”和“被预防”、“进行预防”等，是指用于预防、抑制或降低疾病或病症发生或复发可能性的途径。其也指延迟疾病或病症发作或复发，或者疾病或病症症状发生或复发。如本文所用，“预防(prevention)”和类似词语也包括在疾病或病症症状发作或复发前，降低疾病或病症的强度、效应、症状和/或负担。

如本文所用，“有效量”或“治疗上有效量”转导的宿主细胞或物质是指足以影响期望的生物学效应如包括临床结果的有益结果的用量。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理学上相容的溶剂、分散介质、涂料、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸附剂等，包括药学上可接受的细胞培养基。在一个实施方案中，所述载体适于肠胃外给予。所述载体可适于血管内(例如，静脉内或动脉注射)、腹膜内或肌肉内给予。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于即时制备无菌注射溶液和分散液的无菌粉。将这些介质和药剂用作药用活性物质为本领域熟知。除了目前为止与所述转导细胞不相容的，预期了任何常规媒介和药剂均可用于本发明药物组合物。

本文所用的冠词“一(a/an)”和“所述(the)”是指一个或多于一个(即，至少一个)的所述冠词的语法客体。举例来说。“(a)一元件”是指一个或多于一个的元件。

使用可选择的/或者(alternative)(例如，“或”)应理解为指一个、两个或替代物的任何组合。如本文所用，术语“包括(include)”和“包含(comprise)”作为同义词使用。

如本文所用，术语“约(about)”或“大约(approximately)”是指，相对于参考的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、容积、大小、用量、重量或长度，数量、水平、数值、数目、频率、百分比、容积、大小、用量、重量或长度变化的幅度为15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在一个实施方案中，术语“约”或“大约”是指数量、水平、数值、数目、频率、百分比、容积、大小、用量、重量或长度的范围，约为参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、容积、大小、用量、重量或长度的±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%或±1%。

在整个说明书中，除非上下文另有说明，“包括/包含(comprise/comprises/comprising)”应理解为指包含所指的步骤或成分(element)或者步骤或成分的组，但不排除任何其他步骤或成分或者步骤或成分的组。“由…组成(consisting of)”是指包括且限于所列的物质。因此，词语“由…组成”是指所列的成分是必需的或必要的，且不存在其他成分。“基本上由…组成”是指包括所列的成分，且限于不干扰或有助于本文针对所列成分指定的活性或作用的其他成分。因此，词语“基本上由…组成”表示所列成分是必须的或必要的，但没有其他任选的成分，而根据它们是否影响所列成分的活性或作用可以存在或不存在。

整个本说明书中所提到的“一个实施方案”或“一实施方案”是指与所述实施方案关联描述的具体特征、结构或特性被包含于至少一个本发明的实施方案中。因此，在整个本说明书各处中出现的词语“在一个实施方案中”或“在一实施方案中”不一定均指同样的实施方案。而且，所述具体特征、结构或特性可以合适方式组合到一个或多个实施方案中。

在以下描述中，陈述了一些具体细节以提供对本发明实施方案的充分理解。然而，本领域技术人员应理解，本发明可在没有这些细节下实施。此外，应理解本申请公开的来自本文描述的结构和替代物的各种组合的单个载体或载体的组，其程度同样为如同每个载体或载体的组被单独地陈述。因此，具体载体或具体替代物的选择处在本公开的范围内。

C.病毒载体

已经检测了逆转录病毒和慢病毒载体，并发现其为用于将目的基因稳定地导入至众多类型靶细胞的基因组内合适的递送载体。通过包含FLAP、RRE和HPRE或WPRE序列，许多载体设计已经被优化为最大的转导效率和转基因表达。具体地，本领域技术人员通常通过包含转录后调控序列来增加转基因表达。出人意料的是，本发明人已经发现，包含WPRE序列没有明显增加表达或

该结构(configuration)导致合成mRNA转录物，其5'部分包含异源核酸编码序列且其3'部分包含转录后调控元件序列。在优选的实施方案中，本发明的载体缺少或不包含转录后调控元件如WPRE或HPRE，因为在一些情况下这些元件增加了细胞转化的风险和/或没有实质上或明显地增加mRNA转录物的量或增加mRNA的稳定性。因此，在一些实施方案中，本发明的载体缺少或不包括WPRE或HPRE作为附加的安全措施。

本发明还提供了转移载体，其可用于实施本发明的方法。

尽管本领域技术人员应理解，可使用各种不同病毒载体来制备这类转移载体，在具体实施方案中，所述转移载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体，部分由于慢病毒载体能够提供在体外和体内将转基因有效地递送、整合和长期表达至非分裂态的细胞中。各种慢病毒载体为本领域所熟知，参见Naldini et al.,(1996a,1996b,and1998);Zufferey et al.,(1997);Dull et al.,1998，美国专利第6,013,516号和第5,994,136号，其中任一种均可适于制备本发明的转移载体。通常，这些载体为基于质粒的或基于病毒的载体，且被构建为携带有用于将编码治疗性多肽的核酸转移至宿主细胞的基本序列。

所述慢病毒基因组和前病毒DNA包括在逆转录病毒中发现的3个基因：gag、pol和env，其侧接有两个长末端重复(LTR)序列。Gag基因编码gene内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白；pol基因编码RNA-指导的DNA聚合酶(逆转录酶)，一种蛋白酶和整合酶；env基因编码病毒包膜糖蛋白。5'和3'LTR's作用为分别促进病毒粒RNA的转录和聚腺苷酸化。慢病毒具有的其他基因包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx。邻近5'LTR的是逆转录基因组(tRNA引物结合位点)和病毒有效衣壳化所需的序列。RNA进入粒子(Psi位点)。

在进一步的实施方案中，所述慢病毒载体为HIV载体。因此，所述载体可源自人免疫缺陷-1(HIV-1)、人免疫缺陷-2(HIV-2)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫科动物免疫缺陷病毒(FIV)、牛科动物免疫缺陷病毒(BIV)、Jembrana病病毒(JDV)、马感染性贫血病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)等。基于HIV的载体骨架(即HIV顺式作用序列元件和HIV gag、pol和rev基因)通常优选与本发明的大多数方面相关在于，基于HIV的构建体在转导人细胞中最有效。

在各种实施方案中，本发明的载体包括在小神经胶质细胞中可操作地连接至编码多肽的基因的启动子，所述多肽提供肾上腺脑白质营养不良症和/或肾上腺脊髓神经病治疗。所述载体可具有一个或多个LTR，其中每个LTR包含一个或多个修饰，如一个或多个核苷酸取代、添加或缺失。所述载体还可包括多个附加元件中的一个以增加转导效率(例如，cPPT/FLAP)、病毒包装(例如，Psi(Ψ)包装信号，RRE)和/或增加治疗基因表达的其他元件(例如，poly(A)序列)，除了本发明的载体不包含WPRE或HPRE以外。

在具体实施方案中，本发明的转移载体包括左端(5’)逆转录LTR；中心聚嘌呤区/侧翼DNA(cPPT/FLAP)；逆转录输出元件；在小神经胶质细胞中具有活性的启动子，可操作地连接至编码ATP结合盒、D亚家族、成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸；以及右端(3’)逆转录LTR；其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

在具体实施方案中，本发明的转移载体包括左端(5’)逆转录LTR；逆转录输出元件；在小神经胶质细胞中具有活性的启动子，可操作地连接至编码ATP结合盒、D亚家族、成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸；右端(3’)逆转录LTR；以及poly(A)序列，其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。在另一个具体实施方案中，本发明提供了慢病毒载体，其包括：左端(5')LTR；cPPT/FLAP；RRE；MND启动子，其可操作地连接至编码人ABCD1多肽的多核苷酸(例如，SEQ ID NO:1-2)；右端(3')LTR；以及聚腺苷酸化序列；其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

在某些实施方案中，本发明提供了慢病毒载体，其包括：左端(5')HIV-1LTR；Psi(Ψ)包装信号；cPPT/FLAP；RRE；MND启动子，可操作地连接至编码人ABCD1多肽的cDNA；右端(3')自我失活的(SIN)HIV-1LTR；以及兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列；其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

在另一个实施方案中，本发明提供了载体，其包括：至少一个LTR；中心聚嘌呤区/侧翼DNA(cPPT/FLAP)；逆转录输出元件；以及在小神经胶质细胞中具有活性的启动子，可操作地连接至编码ATP结合盒、D亚家族、成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸；其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

在具体的实施方案中，本发明提供了载体，其包括：至少一个LTR；cPPT/FLAP；RRE；MND启动子，其可操作地连接至编码人ABCD1多肽的多核苷酸；以及聚腺苷酸化序列；其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

在某些实施方案中，本发明提供了至少一个SIN HIV-1LTR；Psi(Ψ)包装信号；cPPT/FLAP；RRE；MND启动子，可操作地连接至编码人ABCD1多肽的cDNA；以及兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列，其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

本领域技术人员应理解，由本发明现有的实施方案可生成许多其他实施方案，从而所述治疗性转基因在小神经胶质细胞中的缺少WPRE或HPRE元件的逆转录病毒载体内表达。

D.组合物和制剂

本发明还包括药物组合物，其包括根据本文描述的方法制备的转导细胞和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，所述载体适于肠胃外给予。所述载体可适于静脉内、腹膜内或肌肉内给予。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于即时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉。将这些介质和药剂用作药用活性物质为本领域熟知。

本发明的组合物可包括一个或多个多肽、多核苷酸、包含其的载体、转导细胞等，如本文所述，配制成药学上可接受的或生理学上可接受的溶液用于单独地或组合一种或多种其他形式的治疗来给予至细胞或动物。还应理解，如需要，本发明的组合物可与其他药剂一起给予，例如，其他蛋白、多肽、小分子或各种药用活性剂。对于也可包含于所述组合物中的其他组分没有实质上的限制，只要所添加的药剂对于将组合物递送至期望的基因治疗的能力不产生不良影响。

在本发明的药物组合物中，药学上可接受的赋形剂和载体溶液的配制为本领域技术人员所熟知，作为合适的配给剂量和质量方案的发展，将本文描述的特定组合物用于各种治疗方案，包括例如，经口、肠胃外、静脉内、鼻内和肌肉内给和配制。

在某些情况下，可取的是将本发明公开的组合物经肠胃外、静脉内、肌肉内或甚至腹膜内给予，如例如美国专利第5,543,158号、第5,641,515号和第5,399,363号(其各自明确地通过引用全部并入本文)。可通过在水中恰当地与表面活性剂如羟丙基纤维素混合，制备作为游离碱或药学上可接受的盐的活性化合物溶液。也可在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中以及在油类中制备分散剂。在存储和使用的正常条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

适于注射使用的药物剂型包括无菌水溶液或分散液和用于即时制备注射用溶液或分散液的无菌粉剂(美国专利第5,466,468号，其通过引用明确地全部并入本文)。在所有情况下，该形式应为无菌的且达到易于注射程度存在。其应该在生产和储存条件下是稳定的，且被保存为抗微生物如细菌和真菌的感染作用。所述载体可为溶剂或分散介质，其含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油。应维持合适的流动性，例如，通过使用包衣如卵磷脂，通过维持在分散时所需的粒径，以及通过使用表面活性剂。通过各种抗菌剂和抗真菌剂例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等，可有助于防止微生物作用。在许多情况下，优选包括等渗剂例如，糖或氯化钠。通过在所述组合物中使用延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可制备延迟吸收的可注射组合物。

对于在水溶液中经肠胃外给予，例如，如需要应对该溶液进行适当缓冲，首先与足够的盐或葡萄糖一起等渗地补充液体稀释剂。这些特定的水溶液尤其适于经静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给予。就此而言，鉴于本文的公开，本领域技术人员应了解可使用无菌水介质。例如，可将一剂量溶解于1ml等渗的NaCl溶液，加入至1000ml的皮下输注液或者在建议的输注位置进行注射(参见例如，Remington:The Science andPractice of Pharmacy,20th Edition.Baltimore,MD:Lippincott Williams&Wilkins,2000)。根据受治疗个体的状况，剂量上需要发生一些变化。无论如何，负责给药的人应确定针对单个个体的合适剂量。而且，针对人给药，制剂应满足无菌、产热原性，以及FDA的制剂标准所要求的通用安全性和纯度标准。

无菌注射溶液的制备，可按照要求通过以所需量将活性化合物掺入至含有上述所列的各种其他成分的合适溶剂中，然后过滤除菌。通常，分散液的制备为，通过将各种无菌活性成分掺入至含有基本分散介质和所需的上述所列的其他成分的无菌载体中，以制备分散液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上任何其他来自此前的其无菌过滤溶液的所需成分的粉剂。

本文公开的组合物可配制为中性或盐的形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成的)，且其与无机酸如盐酸或磷酸或者有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与游离羧基形成的盐衍生自无机碱如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。配制时溶液应以与剂型相容的形式且以治疗上有效的量来给予。所述制剂易于以各种剂型如注射溶液、药物释放胶囊等给予。

如本文所用，“载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、赋形剂、包衣料、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗和延迟吸收剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。将这类介质和药剂用于药物活性物质为本领域所熟知。除了与所述活性成分不相容的任何常规介质和药剂，预期了将其应用于所述治疗组合物。也可将补充性活性成分掺入至所述组合物。

词语“药学上可接受的”是指当给予至人体时不产生过敏反应或类似不良反应的分子实体和组合物。制备包含蛋白作为活性成分的含水组合物为本领域所熟知。通常，这类组合物被制备为可注射的溶液机票悬浮液；也可制备适于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。所述制剂也可被乳化。

在某些实施方案中，所述组合物可通过鼻内喷洒、吸入和/或其他气雾剂递送载体来递送。通过鼻喷气雾剂直接将基因、多核苷酸和肽组合物递送至肺部的方法，描述于例如，美国专利第5,756,353号和第5,804,212号(其各自通过引用明确地全部并入本文)。Likewise,the delivery of drugsusing intranasal microparticle resins同样，使用鼻内微粒树脂(Takenaga etal.,1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利第5,725,871，其通过引用明确地全部并入本文)递送药物也为药学领域所熟知。同样，以聚四氟乙烯承载基质形式的转化粘液质药物递送描述于美国专利第5,780,045(其通过引用明确地全部并入本文)。

在某些实施方案中，可通过使用脂质体、纳米胶囊、微粒子、微球体、脂质粒子、囊泡任选地与CPP多肽等混合来进行递送，以将本发明的组合物引入至合适的宿主细胞。具体地，本发明的组合物可配制为用于包封在脂质粒子、脂质体、囊泡、纳米球、纳米颗粒等内进行递送。可使用常规技术来进行这类递送载体的配制和使用。本发明的制剂和组合物可包括一种或多种抑制剂和/或激活剂，其包含任何数目多肽、多核苷酸和小分子的组合的，如本文所述，配制为药学上可接受的或生理学上可接受的溶液(例如，培养基)用于给予至细胞或动物，单独给予或者与一种或多种其他治疗形式组合给予。还应理解，如需要，本发明的组合物可与其他药剂例如细胞、其他蛋白或多肽或各种药用活性剂组合来给予。

在具体实施方案中，本发明的制剂或组合物包括与任何数目多肽、多核苷酸和小分子的组合接触的细胞，如本文所述。

在某些方面，本发明提供了适于递送病毒载体系统(即病毒介导的转导)包括但不限于，逆转录病毒(例如，慢病毒)载体的制剂或组合物。

用于间接体内递送的示例性制剂也可报考使用本领域已知的转染剂，如磷酸钙、电穿孔、热休克和各种脂质体制剂(即脂质介导的转染)。如下面进一步详细描述，脂质体为包裹着一部分含水流体的脂双层。DNA自动附着于阳离子脂质体(由于其电荷)的外表面，且这些脂质体将与细胞相互作用。

在某些方面，本发明提供了药学上可接受的组合物，其包括治疗有效量的一种或多种多核苷酸或多肽，如本文所述，与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂(例如，药学上可接受的细胞培养基)一起配制。

本发明的具体实施方案可包括其他制剂如药学领域熟知的制剂，其描述于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition.Baltimore,MD:Lippincott Williams&Wilkins,2000。

E.基因治疗方法

所述逆转录病毒载体提供改善的肾上腺脑白质营养不良症和肾上腺脊髓神经病基因治疗的方法。如本文所用，术语“基因治疗”是指将基因引入至细胞基因组。在各种实施方案中，本发明的病毒载体包括表达编码多肽的治疗性转基因的启动子，所述多肽为诊断或怀疑患有肾上腺脑白质营养不良症或肾上腺脊髓神经病的个体提供有疗效的、预防性的或改善性的益处。所述病毒能在体内、间接体内或体外感染和转导细胞。在间接体内和在体外的实施方案中，所述转导细胞可给予至需要治疗的个体。本发明预期了本发明的载体系统、病毒粒子和转导细胞可用于治疗、预防和/或缓解患者个体的肾上腺脑白质营养不良症或肾上腺脊髓神经病。

在各种实施方案中，所述逆转录病毒载体通过直接注射给予至需要体内基因治疗的个体的细胞、组织或器官。在各种其他实施方案中，用本发明的载体在体外或间接体内转导细胞。然后将所述转导细胞给予至患有肾上腺脑白质营养不良症或肾上腺脊髓神经病的个体。

适于在本发明的基因治疗方法中用于转导和给予的细胞，包括但不限于，干细胞、祖细胞和分化的细胞。在某些实施方案中，所述转导细胞为骨髓干细胞、脐带干细胞或间充质干细胞。

在各种实施方案中，优选使用干细胞，因为当给予至体内特定的生态位它们具有分化为合适的细胞类型的能力。术语“干细胞”是指未分化的细胞，其能够(1)长期自我更新，或具有产生至少一个拷贝相同的原代细胞的能力，(2)在单个细胞水平分化为多个细胞，且在一些情况下仅为一种特化的细胞类型，以及(3)在体内功能性再生组织。根据其发展潜力将干细胞进一步分为全能干细胞、多能干细胞(pluripotent)、专能干细胞(multipotent)和寡/单能噶细胞。“自我更新”是指具有产生未改变的子细胞和产生特定细胞类型(潜力)的独特能力的细胞。可以两种方式实现自我更新。不对称的细胞分裂产生一个与亲本细胞相同的子细胞，和一个不同于亲本细胞的子细胞，其为祖细胞或分化的细胞。不对称的细胞分裂不增加细胞的数目。对称的细胞分裂产生两个相同的子细胞。细胞的“增殖”或“扩增”是指对称的细胞分裂。

如本文所用，术语“多能性”是指形成身体或体细胞(即胚体)的所有谱系的细胞的能力。例如，胚胎干细胞是一种能够从三个胚层即外胚层、中皮层和内皮层形成细胞的多能干细胞。如本文所用，术语“专能干细胞”是指成体干细胞形成一种谱系的多个细胞类型的能力。例如，造血干细胞能够形成血细胞谱系的所有细胞例如，淋巴性能和骨髓细胞。

如本文所用，术语“祖细胞(progenitor)”或“源祖细胞(progenitor cell)”是指具有自我更新和分化为多个成熟细胞的能力的细胞。许多祖细胞沿着单个谱系分化，但可具有非常广泛的增殖能力。

造血干细胞(HSCs)产生定向造血祖细胞(HPCs)，其能够在生物体的整个寿命期中产生全部类型的成熟血细胞。术语“造血干细胞”或“HSC”是指产生生物体的全部血细胞类型的专能干细胞，所述血细胞类型包括骨髓细胞(例如，单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树状细胞)和淋巴细胞谱系(例如，T-细胞、B-细胞、NK-细胞)和其他本领域已知的细胞(参见Fei,R.,etal.,美国专利第5,635,387号；McGlave,et al.,美国专利第5,460,964号；Simmons,P.,et al.,美国专利第5,677,136号；Tsukamoto,et al.,美国专利第5,750,397号；Schwartz,et al.,美国专利第5,759,793号；DiGuisto,et al.,美国专利第5,681,599号；Tsukamoto,et al.,美国专利第5,716,827号)。当被植入至受到致命辐照的动物或人，造血干细胞和祖细胞能够再生红细胞、中性粒细胞-巨噬细胞、巨核细胞和淋巴造血细胞库。

在优选的实施方案中，所述转导细胞为分离自骨髓、脐带血或末梢循环的造血干细胞和/或祖细胞。在具体的优选实施方案中，所述转导细胞为分离自骨髓、脐带血或末梢循环的造血干细胞。

本发明的细胞可为自体的/自体同源的(“自身”)或非自体的(“非自身”例如，同种异体的、同基因的或异基因的)。如本文所用，“自体的”是指来自相同个体的细胞。如本文所用，“同种异体的”是指相同物种的细胞，其遗传上与相比的细胞不同。如本文所用，“同基因的”是指不同个体的细胞，其遗传上与相比的细胞相同。如本文所用，“异基因的”是指与相比的细胞为不同物种的细胞。在优选的实施方案中，本发明的细胞为同种异体的。

如本文所用，“个体”包括任何表现出肾上腺脑白质营养不良症或肾上腺脊髓神经病症状的任何动物，其可用本发明其他地方公开的基因治疗载体、基于细胞的治疗法和方法进行治疗。合适的个体(例如，患者)包括实验动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物(如猫或狗)。包括非-人灵长类和优选地，人患者。典型的个体包括表现出异常量(比“正常”或“健康”个体更低或更高的量)的一种或多种生理活性的动物，所述生理活性可通过基因治疗进行调控。

如本文所用，“治疗”或“进行治疗”包括对疾病或病理学状况的症状或病理学的任何有益或期望的效果，且甚至可包括处于治疗中的疾病或病症的一个或多个可测量标记上的最小减少。治疗可任选地涉及减轻或缓解疾病或病症的症状，或者延迟所述疾病或病症的进展。治疗可任选地包括减少或缓解疾病或病症的症状，或者延缓所述疾病或病症的进展。“治疗”不一定表示完全根除或治愈疾病或病症或其相关症状。

如本文所用，“预防”和类似词语如“被预防”、“进行预防”等，是指用于预防、抑制或降低疾病或病症发生或复发可能性的途径。其也指延迟疾病或病症发作或复发，或者疾病或病症症状发生或复发。如本文所用，“预防(prevention)”和类似词语也包括在疾病或病症症状发作或复发前，降低疾病或病症的强度、效应、症状和/或负担。

术语“量”是指“有效用量”或“有效量”的病毒或转导的治疗细胞，以获得有益或期望的预防性或治疗性结果，包括临床结果。

“预防上有效量”是指病毒或转导的治疗细胞的用量可有效地获得期望的预防性结果。由于预防性剂量在疾病之前或早期应用于个体，通常而非必需地，所述预防上有效量少于治疗上有效量。

“治疗上有效量”的病毒或转导的治疗细胞可根据下述因素而改变：如疾病状态、年龄、性别和个体体重以及所述干细胞和祖细胞的能力，以在个体中产生期望的响应。治疗上有效量也是病毒或转导的治疗细胞的治疗性有益效果超过其任何毒性或有害作用的用量。术语“治疗上有效量”包括对“治疗”个体(例如，患者)有效的用量。

在一个优选实施方案中，本发明提供了具有发展为脑部小神经胶质细胞的潜力的转导细胞。在具体实施方案中，用本发明的载体转导造血干细胞并给予至需要治疗肾上腺脑白质营养不良症或肾上腺脊髓神经病的个体。造血干细胞为脑部小神经胶质细胞的来源，因此是优选的。

所述转导细胞可作为骨髓移植中的一部分给予至经历或没有经历骨髓消融治疗的个体。在一个实施方案中，本发明的转导细胞在骨髓移植中给予至经历化学消融或放射消融骨髓治疗的个体。在优选的实施方案中，所述个体为年轻的男性。

在一个实施方案中，将一个剂量的转导细胞通过静脉注射递送至个体。在优选的实施方案中，将转导的造血干细胞通过静脉注射给予至个体。

在具体实施方案中，患者在单个静脉注射剂量中接受一个剂量的转导的造血干细胞，其为约1×10⁵细胞/kg、约5×10⁵细胞/kg、约1×10⁶细胞/kg、约2×10⁶细胞/kg、约3×10⁶细胞/kg、约4×10⁶细胞/kg、约5×10⁶细胞/kg、约6×10⁶细胞/kg、约7×10⁶细胞/kg、约8×10⁶细胞/kg、约9×10⁶细胞/kg、约1×10⁷细胞/kg、约5×10⁷细胞/kg、约1×10⁸细胞/kg或更多。在某些实施方案中，患者接受一个剂量的转导的造血干细胞，其为约1×10⁵细胞/kg至约1×10⁸细胞/kg，约1×10⁶细胞/kg至约1×10⁸细胞/kg，约1×10⁶细胞/kg至约9×10⁶细胞/kg，约2×10⁶细胞/kg至约8×10⁶细胞/kg，约2×10⁶细胞/kg至约8×10⁶细胞/kg，约2×10⁶细胞/kg至约5×10⁶细胞/kg，约3×10⁶细胞/kg至约5×10⁶细胞/kg，约3×10⁶细胞/kg至约4×10⁸细胞/kg,，或任何中间剂量的细胞/kg。

可使用现有技术中的方法用细胞因子刺激转导细胞以进行扩增。在各种实施方案中，根据需要患者个体在几天、几个月或几年的时间内给予了1、2、3、4、5或更多个剂量，以维持或增加治疗。

在具体实施方案中，用包含在小神经胶质细胞中具有活性的启动子例如MND启动子的本发明的载体转导了造血干细胞，所述启动子可操作地连接至编码多肽例如ABCD1的基因，所述造血干细胞可用于治疗、预防或缓解患者个体的肾上腺脑白质营养不良症和/或肾上腺脊髓神经病。

下面本发明通过以下实施例来更充分地描述本发明。然而，本发明可以不同的形式体现，且不应该解释为仅限于本文所述的实施方案；而是，提供这些实施方案以便本公开充分而彻底，并充分地将本发明的范围传达给本领域技术人员。

实施例

实施例1

比较用具有或没有WPRE的ABCD1慢病毒载体对正常的人造血干细胞进行的基因转导

实验概述：

慢病毒载体包含可操作地连接至编码人ACBD1的cDNA的MND启动子，且WPRE元件(见图1；CG1711MND-ALD)载体在商业发展上不可获得。因此，申请人开展了载体研制项目以鉴定合适的慢病毒载体以用于将来的临床试验。作为载体研制项目的结果，制备了商业上可接受的载体，且没有改变可操作地连接至MND启动子的ABCD-1基因。出人意料的是，从所述载体中移除WPRE没有改变人的造血细胞的转导效率和转基因表达。使用短期和长期祖细胞分析，针对造血细胞进行了下述系列实验，以比较两种MND-ALD载体，即pLBP100(见图1和SEQ IDNO:1;移除了WPRE)和pLBP140(见图1；具有功能性WPRE)，其针对WPRE的存在而不同。

慢病毒载体构建体

所有慢病毒载体在MND启动子的控制下，含有正常的人ATP结合盒、D亚家族(ALD)、成员1(ABCD1)cDNA。图1和表1概括了CG1711、pLBP100和pLBP140MND-ALD载体中的不同组件和它们的位置。

表1:载体概要

转导

用5-质粒(pLBP100或pLBP140载体、HPV275-gag-pol、ψN15–VSV-G env、p633–rev、HPV601-tat)通过磷酸钙转染293T细胞制备慢病毒pLBP100和pLBP140的上清液。超速离心后得到浓缩的pLBP100，重悬于SCGM (CellGenix Inc., Germany GMBH)培养基，于<-70℃冷藏保存于一次性使用的冷冻小瓶中。对转导的3T3细胞进行流式细胞术分析以确定感染性滴度。

在4个分别的实验中进行pLBP100和pLBP140 慢病毒载体转导人造血干细胞的比较，其概述于表2中。所进行的实验过程和分析分别说明于图2和3。

表2:  实验概要

将新鲜人骨髓(BM) CD34⁺细胞(Lonza, Walkersville, MD)或者新鲜的或冷冻保存的人G-CSF流动的周边血液(mPB) CD34⁺细胞(AllCells, LLC,Emeryville, CA)洗涤并以1×10⁶细胞/mL的细胞浓度培养于添加人重组的IL-3 (60 ng/ml)、Flt-3L (100 ng/ml)、TPO (100 ng/ml)和SCF (100 ng/ml)(Peprotech)的SCGM中达18小时。

然后移除细胞，洗涤并以2×10⁶细胞/mL细胞浓度重悬于平底96-孔的孔板中单个(实验080610)或一式三份(实验072010、081010和091410)200 μL体积添加有同样浓度的细胞因子和8 μg/ml加入了病毒的硫酸鱼精蛋白的SCGM(模拟物对照)或pLBP100或pLBP140)上清液中，MOI为8.6-25(1.7-5.0×10⁷TU/ml最终滴度)。在实验080610中，在涂覆有20μg/mL纤维连接蛋白(Takara Bio Inc,Shiga,Japan)的96-孔板中于4℃转导过夜。

短期祖细胞分析

加入病毒24小时后，洗涤所述细胞，然后(1)重悬于添加相同浓度细胞因子的SCGM培养基，进一步孵育21天以上，或者(2)1-培养于MethoCult H4434培养基(Stem Cell Technologies)，用于集落形成细胞(CFCs)。

在第14天对总骨髓细胞(CFU-GM)和红系细胞(BFU-E)集落计数，将所述细胞悬浮于PBS中并洗涤，用DNEASy试剂盒(QIAGEN)(1-2×10⁶活细胞)制备基因组DNA。

长期培养启动细胞(LTC-IC)分析

将小鼠骨髓基质细胞系MS-5接种到8个96孔板中的添加有10%胎牛血清的α-培养基，当它们几乎汇合时用γ射线辐照(30Gy)。

辐照2天后，在预建立的MS-5基质层以16-孔的不同每孔稀释接种在200μL的StemSpan SFEM(无血清培养基,Stem Cell Technologies公司，加拿大温哥华)中的人CD34+test细胞(16孔中每孔为2000细胞，16孔中每孔为1000细胞，16孔中每孔为500细胞，16孔中每孔为250细胞，16孔中每孔为125细胞，16孔中每孔为62细胞，16孔中每孔为31细胞，16孔中每孔为16细胞，16孔中每孔为8细胞)。在MS-5饲养细胞上整体培养另外的100,000个CD34+细胞达5周。每周用100μL新鲜StemSpan SFEM替换100μL培养基。5周后，收获培养物，然后将整个内容物接种于Methocult^TMGF+H4434(12孔板上每孔500μL甲基纤维素)达14天的集落生长。选取单个集落，并提取DNA用于随后的PCR分析，使用针对载体中gag序列的引物和针对基因组序列(Epo基因)的引物，以便在提取后具有证明基因组DNA存在的阳性对照(SOP#GTX/RE/PBM/M-023and LTGC/RE/PBM/M-07)。使用L-calc软件的1.1版(Stem Cell Technologies)计算LTC-IC的频率和95%置信区间。

载体拷贝数(VCN)的确定

由制备的DNA通过定量(实时)PCR(QPCR)确定每个细胞的平均VCN，所述DNA从甲基纤维素培养物中的液体培养基或合并的集落细胞制备，然后稀释并在PBS中洗涤。在带有ABI试剂和96孔板的ABI Prism7000序列检测系统上进行QPCR。

用于定量所述载体的人gag探针和引物：

GAG-F(正向引物)5’ggagctagaacgattcgcagtta3’

GAG-R(反向引物)5’ggttgtagctgtcccagtatttgtc3’

GAG-P(探针，反义的)5'-(FAM)-acagccttctgatgtctctaaaaggccagg-(TAMRA)-3'

用于定量基因组DNA以归一化的人β-肌动蛋白探针和引物：

探针：5’VIC-cctggcctcgctgtccaccttcca-TAMRA

正向-5’tccgtgtggatcggcggctcca3’

反向-5’ctgcttgctgatccacatctg3’。

使用1x

Universal Master Mix分析1/100的洗脱基因组DNA(约50-100ng)，每个引物0.72uM且在25ul反应中0.35uM探针，使用绝对定量程序和默认的热循环程序。

通过流式细胞术进行转基因表达

在固定的且透性化的细胞(Fix&Perm Reagents A and B,cat.Nos.GAS001&GAS002,Invitrogen)进行ABCD1(ALDP)蛋白的表达，使用小鼠抗-人ALDP(ABCD1)单克隆抗体(克隆1D6,Lot#LV1383343,Chemicon)，然后用缀合有大鼠抗-小鼠IgG1mAb(克隆A85-1,BDPharmingen)的PE染色。将小鼠IgG1单克隆抗体克隆MOPC-21(BioLegend)用作同种型对照。

统计分析

分析每个实验内群组的数值比较，使用双尾的非参数Mann-WhitneyU-检测(GraphPad Prism v.3.0)。其中样品具有足够的大小(n=≥3)。在p值低于0.05时确定群组之间的显著度。

结果:

对祖细胞频率的影响

图4中比较了所有4个实验中功能性骨髓细胞(CFU-GM)和红系细胞(BFU-E)祖细胞产率，表明加入pLBP100或pLBP140上清液进行一式三份转导在第一组实验(实验072010、081010和091410)中没有明显效果。在第一组实验(实验080610)中，比较了6组用于单独转导的甲基纤维素培养物，观察到随着加入pLBP100后骨髓祖细胞的明显增加，而在用pLBP100处理后观察到红系细胞集落产率明显降低，用pLBP140转导后则进一步降低。

用两种慢病毒载体转导后更加原始的LTC-IC的频率平均更低(图5)，但由于95%置信区间的重叠，这些差异不明显(p>0.05)。

通过载体PCR的转导效率

对从维持在液体培养基中35天以上的细胞分离的基因组DNA进行实时PCR分析，在第二组实验中相比pLBP140，pLBP100显示在所有时间点更高的估计载体拷贝数(VCN)(图6A)。

这也反映在，对于生长于甲基纤维素培养物中的合并的CFC具有更高的平均VCN和来自同样实验的百分比载体阳性骨髓细胞集落(图6B和C)。然而，在第一组实验的一式三份实验比较中，显示在合并的集落的VCN或检测为载体阳性的百分比集落中无明显差异。

图7显示5-周LTC-IC后两个载体组的平均VCN和百分比载体阳性骨髓性能集落降低，pLBP100转导细胞再次具有更高的VCN(1.1相对于0.4拷贝)和阳性集落比例(51%相对于35%)。

通过流式细胞术进行ALDP转基因表达

用抗-ALDP抗体进行细胞内染色的细胞荧光特性的实例显示于图8A1和8A2的直方图中，其中测定了百分比阳性(基于大于0.5%的分别的模拟物对照而测定)和中位荧光强度值(MFI)比率，其如图8B和8C所示。在实验072010和080610中，相比pLBP140组，对于pLBP100的实验中具有更高平均百分比的表达细胞转基因表达水平发生变化。然而，在实验091410中观察到相反的结果，且在实验081010中观察到相当的水平。一式三份的实验中统计比较表明在百分比ALDP⁺细胞或MFI(p>0.05)中无明显区别。

结论：

在4个单独的实验之间进行比较，使用2个制备的潜伏期pLBP100慢病毒载体和3个制备的含有pLBP140载体的WPRE，且涉及转导源自骨髓或GCSF-流动的周围血液的正常人CD34+细胞。在实验080610中，除了骨髓细胞的增加和红系祖细胞减少，对于早期的祖细胞或更原始的LTC-IC，所述上清液无明显的毒性。根据平均VCN或者含有骨髓细胞集落或LTC-IC的载体比率，对于pLBP140存在更低的转导效率的倾向，但对于有足够样品大小的实验(n=3)没有统计上的显著性。两个载体的转基因表达水平产生了混合的结果，其中来自pLBP100的两个实验显示了更高百分比的ALDP⁺细胞，相比pLBP140一个实验显示更低的百分比。这些差异没有统计上的显著性。

总之，看来将WPRE加入至MND-ALD载体并没有益处。因此，相比含有WPRE的载体，本发明的载体提供了增加的安全性和相同的优异功效。而且，该结果表明本发明的载体非常适于进一步发展和临床应用。

实施例2

评估在ALD-缺乏性原代人成纤维细胞中对ALD蛋白缺乏的功能性校正作用

实验概述

极长链脂肪酸(VLCFA)尤其是C26链的积累，通常被称为ALD的生化“标志”。参见Hubbard,Mol Genet.Metab.97:212-220(2009)。用含有ABCD1cDNA的逆转录病毒载体转导缺陷性细胞可恢复功能性ALD蛋白(ALDP)水平，并导致VLCFA水平降低。这在不同的细胞群体包括来自ALD患者的原代成纤维细胞系中得以显示。

采用肯尼迪克里格研究所(Kennedy Krieger Institute)(Baltimore,MD)研发的C26:0lyso-PC分析(LPC分析)，通过液相色谱-质谱联用测量VLCFA。该方法被研制用于新生儿血斑筛查，对血浆和培养的皮肤成纤维细胞也有效。在该实施例中，将所述C26:0lyso-PC分析用于证明用于证明对ALD患者成纤维细胞的生化缺陷的功能性校正。该实验的目的是比较载体pLBP100(p100)和pLBP140(p140)在载体-修饰的ALD-缺陷性成纤维细胞中降低VLCFA水平的效率。

细胞系

原代人成纤维细胞GM04496和AG01440获自卡瑞尔细胞库(CoriellCell Repository)(Camden,NJ,USA)。所述GM04496细胞为未转化的人成纤维细胞，其分离自具有ABCD1基因未知突变的ALD-阴性患者。AG01440细胞为正常的人成纤维细胞。使细胞生长于含有15%FBS(HyClone FBS,GIBCO Life Technologies)的DMEM(GIBCO LifeTechnologies,Carlsbad,CA)中，其于37℃、5%CO2下的潮湿培养箱中。

TF-1细胞(

Number CRL-2003^TM)为来自骨髓红白血病的人成纤维细胞系。使细胞生长于含有10%FBS的RPMI-1640(GIBCO LifeTechnologies)中。

用于产生慢病毒载体的293T细胞(斯坦福大学)含有10%FBS的DMEM中。

转导方案并接种用于Lyso-PC分析

将近汇合的细胞于培养基+8ug/ml聚凝胺(海地镁溴铵，Sigma,StLouis MO)中的病毒上清液转导14-16小时。第二天更换新鲜培养基。最早在转导后3天，将大多数细胞按一式三份接种至12-孔板(2份用于脂质提取，一份用于蛋白分析)(Falcon#35-3043)。相同数目的正常-对照细胞(293T、AG01440或TF-1)也被接种或成球。用1X HBSS缓冲液(GIBCO LifeTechnologies)洗涤细胞单层两次，并于-20℃原位冷冻。所述冷冻方法首先在肯尼迪克里格研究院被检测，并确定与收获新鲜细胞单层相当。剩余的细胞保存于培养物中。

基因组DNA分离和载体拷贝数(VCN)确定

将接种用于LPC分析后的所述剩余细胞保存于培养物中，用于基因组DNA收获直到至少转导后9天用于DNA分离和VCN分析。脂质和蛋白提取在肯尼迪克里格研究院完成。

结果:

4496细胞和各种正常和阴性对照的Lyso-PC分析

接种4496细胞和正常的成纤维细胞1440细胞用于分析。通过免疫染色和流式细胞术，TF-1细胞和293细胞中检测到ALDP。因此，这些细胞也作为可选的阳性(即正常的ALDP-表型)对照来分析，用于C26:0LPC基线水平。样品以4个独立的分析中进行测量。

C26:0LPC的基线水平在具有正常表型的细胞中范围为3–50pmol/mg蛋白，且所述4496细胞在每个分析中具有提高的水平。总之，正常细胞中的C26:0LPC水平相比4496细胞，存在至少5-倍差异(比率低于0.2)。该比率类似于患者血液筛检中报告的结果。

比较用p100和p140转导的4496细胞

用p100和p140转导了4496细胞。如上所述分析细胞的VLCFA和VCN。LysoPC分析的结果如表3所示。针对模拟物转导细胞，将重复的孔进行平均和归一化。相对于VCN，对模拟物的VLCFA校正比率如图10所示。由于VCN降低至≤1拷贝，所述细胞群被预期为未转导细胞的和每个细胞具有1或2个载体-拷贝的细胞的混合物；因此，预期VLCFA会降低(图10)。

表3:用Lenti-D p100和LVVp140转导的4496细胞中的C26:0LPC结果

相比模拟物-txd4496细胞，确立了0.2的比率作为具有正常表型的细胞水平。对于两种载体，当VCN≥～1.5时，4496细胞中的VLCFA积累被校正值正常细胞的水平。对于两种载体，在VCN1.0-0.6时，校正存在降低的趋势。

结论:

在肯尼迪克里格研究所进行C26:0lyso-PC分析(Hubbard2009)，通过液相-质谱联用方法测量VLCFA，证实了ALD-患者细胞系GM04496细胞的积累C26的生化缺陷。用p100和p140转导后，细胞为ALDP表达阳性，如流式细胞术所证明(数据未显示)，平均VCN≥1.5的细胞显示完全校正VLCFA积累至具有正常表型的细胞。当比较p100和p140转导的细胞时获得了相同的结果，支持了缺少WPRE序列的p100的效力。

以上描述的各种实施方案可进行组合以提供进一步的实施方案。本说明书中提到的和/或在所述申请记录表中所列举的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物，均通过引用全部并入本文。如需要可对实施方案的各个方面进行修改，以便利用所述各专利、申请和出版物的构思来提供进一步的实施方案。

基于上述详细描述可对所述实施方案进行这些和其他的改变。一般来说，在所附权利要求书中，所用的术语不应该用来将权利要求限制于本发明说明书和权利要求书公开的具体实施方案，而应解释为包括所有可能的实施方案以及这些权利要求所享有的全部保护范围。因此，所附权利要求书不受限于所述公开。

Claims (41)

1.载体，其包括：

(a)左端(5’)逆转录LTR；

(b)中心聚嘌呤区/侧翼DNA(cPPT/FLAP)；

(c)逆转录输出元件；

(e)在小神经胶质细胞中具有活性的启动子，其可操作地连接至编码ATP结合盒、D亚家族、成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸；和

(f)右端(3’)逆转录LTR；

其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

2.根据权利要求1所述的载体，其中所述载体为慢病毒载体。

3.根据权利要求2所述的载体，其中所述慢病毒为HIV。

4.根据权利要求2所述的载体，其中所述慢病毒为HIV-1。

5.根据权利要求1所述的载体，其中所述5'LTR的启动子被异源启动子替换。

6.根据权利要求5所述的载体，其中所述异源启动子为巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。

7.根据权利要求5所述的载体，其中所述异源启动子为CMV启动子。

8.根据权利要求1所述的载体，其中所述5'LTR或3'LTR为慢病毒LTR。

9.根据权利要求1所述的载体，其中所述5'LTR和3'LTR为慢病毒LTR。

10.根据权利要求8或9所述的载体，其中所述慢病毒为HIV-1。

11.根据权利要求10所述的载体，其中所述3'LTR包含一个或多个修饰。

12.根据权利要求10所述的载体，其中所述3'LTR包含一个或多个缺失。

13.根据权利要求10所述的载体，其中所述3'LTR为自我失活的(SIN)LTR。

14.根据权利要求1所述的载体，其中所述逆转录输出元件为Rev响应元件(RRE)。

15.根据权利要求1所述的载体，其中所述cPPT/FLAP来自HIV-1。

16.根据权利要求1所述的载体，其中所述启动子包括骨髓瘤病毒增强子、阴性控制区缺失的，dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子或其具有转录活性的片段。

17.根据权利要求1所述的载体，其中所述编码ABCD1多肽的多核苷酸为cDNA。

18.根据权利要求17所述的载体，其中所述cDNA包括优化的Kozak序列。

19.根据权利要求18所述的载体，其中所述优化的Kozak序列为(GCC)RCCATGG，其中R为嘌呤(A或G)。

20.根据权利要求1所述的载体，其中所述多核苷酸编码人ABCD1多肽。

21.慢病毒载体，包含：

(a)左端(5')LTR；

(b)cPPT/FLAP；

(c)RRE;

(d)MND启动子，其可操作地连接至编码人ABCD1多肽的多核苷酸；

(e)右端(3')LTR；和

(f)聚腺苷酸化序列；

其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

22.根据权利要求21所述的慢病毒载体，包含Psi(Ψ)包装信号。

23.根据权利要求21所述的慢病毒载体，其中所述聚腺苷酸化序列为牛生长素聚腺苷酸化或信号兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列。

24.根据权利要求21所述的慢病毒载体，其中所述5'LTR或3'LTR来自HIV-1。

25.根据权利要求21所述的慢病毒载体，其中所述3'LTR为SINLTR。

26.慢病毒载体，包含：

(a)左端(5')HIV-1LTR；

(b)Psi(Ψ)包装信号；

(c)cPPT/FLAP；

(d)RRE；

(e)MND启动子，其可操作地连接至编码人ABCD1多肽的cDNA；

(f)右端(3')自我失活的(SIN)HIV-1LTR；和

(g)兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列；

其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

27.哺乳动物细胞，包含根据权利要求1-26中任一项所述的载体。

28.包装细胞，包含：编码gag的第一多核苷酸，编码pol的第二多核苷酸，编码env的第三多核苷酸，以及根据权利要求1-26中任一项所述的载体。

29.生产细胞，包含根据权利要求1-26中任一项所述的载体。

30.由权利要求29所述的生产细胞产生的载体颗粒。

31.载体，包含：

(a)至少一个LTR；

(b)中心聚嘌呤区/侧翼DNA(cPPT/FLAP)；

(c)逆转录输出元件；和

(e)在小神经胶质细胞中具有活性的启动子，其可操作地连接至编码ATP结合盒、D亚家族、成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸；

其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

32.载体，包含：

(a)至少一个LTR；

(b)cPPT/FLAP；

(c)RRE；

(d)MND启动子，其可操作地连接至编码人ABCD1多肽的多核苷酸；和

(e)聚腺苷酸化序列；

其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

33.载体，包含：

(a)至少一个SIN HIV-1LTR；

(b)Psi(Ψ)包装信号；

(c)cPPT/FLAP；

(d)RRE；

(e)MND启动子，可操作地连接至编码人ABCD1多肽的cDNA；和

(f)兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列；

其中所述载体不包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

34.用根据权利要求31-33中任一项所述的载体转导的宿主细胞。

35.根据权利要求34所述的转导的宿主细胞，其中所述细胞为胚胎干细胞、成体干细胞或祖细胞。

36.根据权利要求35所述的转导的宿主细胞，其中所述细胞为造血干细胞。

37.根据权利要求31-33中任一项所述的病毒载体在基因治疗中的用途。

38.根据权利要求37所述的用途，其中所述基因治疗治疗或防止肾上腺脑白质营养不良症或肾上腺脊髓神经病。

39.治疗肾上腺脑白质营养不良症或肾上腺脊髓神经病的方法，包括将用根据权利要求31-33中任一项所述的载体转导的细胞给予到个体。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述细胞为胚胎干细胞、成体干细胞或祖细胞。

41.根据权利要求39所述的方法，其中所述细胞为造血干细胞。

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