JP6143231B2 - 副腎脳白質ジストロフィおよび副腎脊髄神経障害のための遺伝子療法ベクター - Google Patents

Description

関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１１年６月１０日に出願された米国仮出願第６１／４９５，８５７号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

配列表に関する記述
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称はＢＬＢＤ＿００３＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは８ＫＢであり、２０１２年６月８日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。

本発明は、一般には、遺伝子療法ベクターに関する。特に、本発明は、副腎脳白質ジストロフィおよび副腎脊髄神経障害に対する遺伝子療法を提供するレンチウイルスベクターに関する。

小児期大脳副腎脳白質ジストロフィ（ＣＣＡＬＤ）は、少年（発症年齢の中央値は７歳であり、３〜１５歳にわたる）における、非常にまれな、時には急速に進行するＸ連鎖遺伝性の神経障害であり、治療しないと植物状態に至り、最終的には診断後５年の中央値で死亡する。

ＣＣＡＬＤは、多くの場合、最初はアジソン病として現れるが、診断は通常磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）における大脳の脱髄の確証的な所見を伴う注意力、思考力、集中力、および他の大脳機能の「突然の」低下に基づいて行われる。脱髄する前は患者の脳のＭＲＩは正常であり、神経発生的な異常はない。臨床経過は、初めは「遅い」場合があるが、脳内のミエリンの広範にわたる損失を伴って急速に進行性かつ不可逆的になる可能性がある。「遅い」および「突然の」という用語は、脱髄の本当の持続時間は分からず、認知機能および運動機能の急速な低下はいかなる時点でも、また理由不明で起こり得るという点で相対的である。実際に、ＭＲＩの変化は症状に先行し、疾患の臨床症状発現がほとんどない時点で、広範にわたる脱髄を伴い、病勢盛んであるように異常である場合がある。米国におけるＸ連鎖副腎脳白質ジストロフィ（ＡＬＤ）の発生率はおよそ男児出生２１，０００件に対して１件であり、約３５％がＣＣＡＬＤを発生しており、毎年約３５〜４０人の少年がＣＣＡＬＤと診断されている。疾患の原因はＡＴＰ結合性カセット、サブファミリーＤ（ＡＬＤ）、メンバー１（ＡＢＣＤ１）遺伝子の突然変異であり、それにより副腎脳白質ジストロフィタンパク質（ＡＬＤＰ）遺伝子産物が機能不全になるまたはそれが欠ける。ＡＬＤＰは、細胞のペルオキシソームに局在化し、そこで非常に長鎖の脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）（炭素＞２０個の鎖長）の、細胞の構造および機能を維持するために使用される短い脂肪酸への分解に関与する。

ＣＣＡＬＤの中枢神経系（ＣＮＳ）の症状発現の病態生理はよく分かっていないが、欠陥のあるＡＬＤＰは脳小膠細胞におけるそのプロセスを支持しないために代謝することができないＶＬＣＦＡが局所的に蓄積することによって脱髄が生じる。疾患の急速進行相は、おそらくミエリンの損失を増大させるＶＬＣＦＡによる細胞タンパク質のアシル化によって引き起こされる炎症によって引き起こされる。ＣＣＡＬＤの急速進行相の結果、数カ月以内に正常な機能が劣化して著しい障害をもった少年になり得る。

利用可能な治療は、機能的ＡＬＤＰを産生する細胞を供給するための同種異系の造血幹細胞移植（ＨＣＴ）のみである。脳小膠細胞は骨髄に由来するので、機能的ＡＬＤＰを産生する細胞を使用した、完全に適合する血縁ドナーヒト幹細胞移植により、脱髄の進行を潜在的に改善するまたは停止させることができる。しかし、同種異系のＨＣＴにより疾患を安定化するためには１２〜１８カ月を要し、また疾患が進行性であるので、移植は診断されたらできるだけ早く行うべきである。これは、血縁または非血縁の適合する骨髄幹細胞ドナーを見つけるために必要なリードタイムに起因して問題がある時がある。同種異系の幹細胞を使用することにより、グラフト不全のリスクならびに急性および慢性の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の発生も生じる。これらの合併症は死亡に至る可能性があり、また、非血縁ドナーを同種異系の造血幹細胞の供給源として利用する場合にはその発生率が上昇する。

ＡＬＤＰ交換の別の供給源は、適合する、より一般には、部分的に適合する臍帯血細胞移植を使用することである。臍帯血幹細胞（ＣＢＳＣ）の使用は、グラフト不全のリスクがあり、生着までの時間が長く、それにより長期にわたる輸血支持が必要になり、問題がある。実際に、同種異系のＨＣＴの全形態に、１０〜１５％の移植に関連する死亡率のリスク、および３０％に至るまでの慢性移植片対宿主病のリスクが伴う。

したがって、当技術分野において、より安全かつより効率的な副腎脳白質ジストロフィ療法の必要性がある。本発明は、これらおよび他の問題に対する解決策を提供する。

したがって、本明細書全体を通して種々の箇所における「一実施形態では」または「ある実施形態では」という句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているのではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性を任意の適切な様式で１つまたは複数の実施形態に組み合わせることができる。

種々の実施形態では、本発明は、一部において、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、中心ポリプリントラクト（ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）／ＤＮＡフラップ（ＤＮＡ ｆｌａｐ）（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、レトロウイルス輸送エレメント（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｅｘｐｏｒｔ ｅｌｅｍｅｎｔ）と、ＡＴＰ結合性カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、小膠細胞において活性なプロモーターと、右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないベクターを意図している。

特定の実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターである。

関連する実施形態では、レンチウイルスはＨＩＶである。

より詳細な実施形態では、レンチウイルスはＨＩＶ−１である。

ある特定の実施形態では、５’ＬＴＲのプロモーターは異種プロモーターと置き換えられている。

さらなる実施形態では、異種プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。

追加的な特定の実施形態では、異種プロモーターはＣＭＶプロモーターである。

別の実施形態では、５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲはレンチウイルスＬＴＲである。

他の実施形態では、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲはレンチウイルスＬＴＲである。

いくつかの特定の実施形態では、レンチウイルスはＨＩＶ−１である。

特定の実施形態では、３’ＬＴＲは１つまたは複数の修飾を含む。

いくつかの特定の実施形態では、３’ＬＴＲは１つまたは複数の欠失を含む。

さらなる実施形態では、３’ＬＴＲは自己不活性化（ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）（ＳＩＮ）ＬＴＲである。

いくつかの実施形態では、レトロウイルス輸送エレメントはｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）である。

さらなる実施形態では、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰはＨＩＶ−１由来である。

ある特定の実施形態では、プロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｅｎｈａｎｃｅｒ， ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ ｄｅｌｅｔｅｄ， ｄｌ５８７ｒｅｖ ｐｒｉｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）（ＭＮＤ）プロモーターまたは転写的に活性なその断片を含む。

特定の実施形態では、ＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。

関連する実施形態では、ｃＤＮＡは最適化されたコザック配列を含む。

ある特定の実施形態では、最適なコザック配列は（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧであり、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である。

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードする。

種々の実施形態では、本発明は、一部において、左側の（５’）ＬＴＲと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ＲＲＥと、ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、右側の（３’）ＬＴＲと、ポリアデニル化配列とを含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないレンチウイルスベクターを意図している。

特定の実施形態では、レンチウイルスベクターはプシー（Ψ）パッケージングシグナルを含む。

ある特定の実施形態では、ポリアデニル化配列はウシ成長ホルモンポリアデニル化配列またはシグナルウサギβ−グロビンポリアデニル化配列である。

いくつかの特定の実施形態では、レンチウイルスベクターはＨＩＶ−１由来の５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲを含む。

さらなる実施形態では、３’ＬＴＲはＳＩＮ ＬＴＲである。

種々の実施形態では、本発明は、一部において、左側の（５’）ＨＩＶ−１ＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ＲＲＥと、ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、右側の（３’）自己不活性化（ＳＩＮ）ＨＩＶ−１ＬＴＲと、ウサギβ−グロビンポリアデニル化配列とを含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないレンチウイルスベクターを意図している。

種々の実施形態では、本発明は、一部において、本明細書に記載の前述のベクターのいずれか１つによるベクターを含む哺乳動物細胞を意図している。

特定の実施形態では、本発明は、一部において、ｇａｇをコードする第１のポリヌクレオチド、ｐｏｌをコードする第２のポリヌクレオチド、ｅｎｖをコードする第３のポリヌクレオチド、および本明細書に記載の前述のベクターのいずれか１つによるベクターを含むパッケージング細胞を意図している。

ある特定の実施形態では、本発明は、一部において、本明細書に記載の前述のベクターのいずれか１つによるベクターを含む産生細胞を意図している。

さらなる実施形態では、本発明は、一部において、産生細胞によって産生されるベクター粒子を意図している。

種々の特定の実施形態では、本発明は、一部において、少なくとも１つのＬＴＲと、中心ポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、レトロウイルス輸送エレメントと、ＡＴＰ結合性カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、小膠細胞において活性なプロモーターとを含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないベクターを意図している。

種々の特定の実施形態では、本発明は、一部において、少なくとも１つのＬＴＲと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ＲＲＥと、ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、ポリアデニル化配列とを含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないベクターを意図している。

種々のさらなる実施形態では、本発明は、一部において、少なくとも１つのＳＩＮ ＨＩＶ−１ＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ＲＲＥと、ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、ウサギβ−グロビンポリアデニル化配列とを含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないベクターを意図している。

種々の実施形態では、本発明は、一部において、ベクターを用いて形質導入された宿主細胞を意図している。特定の実施形態では、宿主細胞は、胚性幹細胞、体性幹細胞、または前駆細胞である。

ある特定の実施形態では、細胞は造血幹細胞である。

特定の実施形態では、本発明は、さらに、一部において、遺伝子療法における本発明のウイルスベクターの使用を意図している。

好ましい実施形態では、遺伝子療法により、副腎脳白質ジストロフィまたは副腎脊髄神経障害を治療または予防する。

種々の他の実施形態では、本発明は、一部において、副腎脳白質ジストロフィまたは副腎脊髄神経障害を治療する方法であって、被験体に、本発明のベクターを用いて形質導入された細胞を投与することを含む方法を意図している。

特定の実施形態では、細胞は、胚性幹細胞、体性幹細胞、または前駆細胞である。

ある特定の実施形態では、細胞は造血幹細胞である。

配列識別子の簡単な説明
配列番号１はヒトＡＢＣＤ１をコードするｃＤＮＡ配列である。

配列番号２はヒトＡＢＣＤ１をコードするｃＤＮＡ配列である。

配列番号３は、ＭＮＤプロモーターのポリヌクレオチド配列である。
一実施形態において、例えば、以下の項目が提供される。
（項目１）
（ａ）左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、
（ｂ）中心ポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、
（ｃ）レトロウイルス輸送エレメントと、
（ｅ）ＡＴＰ結合性カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、小膠細胞において活性なプロモーターと、
（ｆ）右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲと、
を含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないベクター。
（項目２）
レンチウイルスベクターである、項目１に記載のベクター。
（項目３）
前記レンチウイルスがＨＩＶである、項目２に記載のベクター。
（項目４）
前記レンチウイルスがＨＩＶ−１である、項目２に記載のベクター。
（項目５）
前記５’ＬＴＲのプロモーターが異種プロモーターと置き換えられている、項目１に記載のベクター。
（項目６）
前記異種プロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである、項目５に記載のベクター。
（項目７）
前記異種プロモーターがＣＭＶプロモーターである、項目５に記載のベクター。
（項目８）
前記５’ＬＴＲまたは前記３’ＬＴＲがレンチウイルスＬＴＲである、項目１に記載のベクター。
（項目９）
前記５’ＬＴＲおよび前記３’ＬＴＲがレンチウイルスＬＴＲである、項目１に記載のベクター。
（項目１０）
前記レンチウイルスがＨＩＶ−１である、項目８または９に記載のベクター。
（項目１１）
前記３’ＬＴＲが１つまたは複数の修飾を含む、項目１０に記載のベクター。
（項目１２）
前記３’ＬＴＲが１つまたは複数の欠失を含む、項目１０に記載のベクター。
（項目１３）
前記３’ＬＴＲが自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲである、項目１０に記載のベクター。（項目１４）
前記レトロウイルス輸送エレメントがｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）である、項目１に記載のベクター。
（項目１５）
前記ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰがＨＩＶ−１由来である、項目１に記載のベクター。
（項目１６）
前記プロモーターが、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターまたは転写的に活性なその断片を含む、項目１に記載のベクター。
（項目１７）
ＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、項目１に記載のベクター。
（項目１８）
前記ｃＤＮＡが、最適化されたコザック配列を含む、項目１７に記載のベクター。
（項目１９）
前記最適なコザック配列が（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧであり、Ｒがプリン（ＡまたはＧ）である、項目１８に記載のベクター。
（項目２０）
前記ポリヌクレオチドがヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードする、項目１に記載のベクター。
（項目２１）
（ａ）左側の（５’）ＬＴＲと、
（ｂ）ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、
（ｃ）ＲＲＥと、
（ｄ）ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、
（ｅ）右側の（３’）ＬＴＲと、
（ｆ）ポリアデニル化配列と、
を含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないレンチウイルスベクター。
（項目２２）
プシー（Ψ）パッケージングシグナルを含む、項目２１に記載のレンチウイルスベクター。
（項目２３）
前記ポリアデニル化配列がウシ成長ホルモンポリアデニル化配列またはシグナルウサギβ−グロビンポリアデニル化配列である、項目２１に記載のレンチウイルスベクター。
（項目２４）
前記５’ＬＴＲまたは前記３’ＬＴＲがＨＩＶ−１由来である、項目２１に記載のレンチウイルスベクター。
（項目２５）
前記３’ＬＴＲがＳＩＮ ＬＴＲである、項目２１に記載のレンチウイルスベクター。（項目２６）
（ａ）左側の（５’）ＨＩＶ−１ＬＴＲと、
（ｂ）プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、
（ｃ）ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、
（ｄ）ＲＲＥと、
（ｅ）ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、
（ｆ）右側の（３’）自己不活性化（ＳＩＮ）ＨＩＶ−１ＬＴＲと、
（ｇ）ウサギβ−グロビンポリアデニル化配列と、
を含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないレンチウイルスベクター。
（項目２７）
項目１から２６までのいずれか一項に記載のベクターを含む哺乳動物細胞。
（項目２８）
ｇａｇをコードする第１のポリヌクレオチド、ｐｏｌをコードする第２のポリヌクレオチド、ｅｎｖをコードする第３のポリヌクレオチド、および項目１から２６までのいずれか一項に記載のベクターを含むパッケージング細胞。
（項目２９）
項目１から２６までのいずれか一項に記載のベクターを含む産生細胞。
（項目３０）
項目２９に記載の産生細胞によって産生されるベクター粒子。
（項目３１）
（ａ）少なくとも１つのＬＴＲと、
（ｂ）中心ポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、
（ｃ）レトロウイルス輸送エレメントと、
（ｅ）ＡＴＰ結合性カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、小膠細胞において活性なプロモーターと
を含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないベクター。
（項目３２）
（ａ）少なくとも１つのＬＴＲと、
（ｂ）ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、
（ｃ）ＲＲＥと、
（ｄ）ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、
（ｅ）ポリアデニル化配列と
を含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないベクター。
（項目３３）
（ａ）少なくとも１つのＳＩＮ ＨＩＶ−１ＬＴＲと、
（ｂ）プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、
（ｃ）ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、
（ｄ）ＲＲＥと、
（ｅ）ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、
（ｆ）ウサギβ−グロビンポリアデニル化配列と
を含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないベクター。
（項目３４）
項目３１から３３までのいずれか一項に記載のベクターを用いて形質導入された宿主細胞。
（項目３５）
胚性幹細胞、体性幹細胞、または前駆細胞である、項目３４に記載の形質導入された宿主細胞。
（項目３６）
造血幹細胞である、項目３５に記載の形質導入された宿主細胞。
（項目３７）
遺伝子療法における、項目３１から３３までのいずれか一項に記載のウイルスベクターの使用。
（項目３８）
前記遺伝子療法により副腎脳白質ジストロフィまたは副腎脊髄神経障害を治療または予防する、項目３７に記載の使用。
（項目３９）
副腎脳白質ジストロフィまたは副腎脊髄神経障害を治療する方法であって、被験体に、項目３１から３３までのいずれか一項に記載のベクターを用いて形質導入された細胞を投与することを含む、方法。
（項目４０）
前記細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞、または前駆細胞である、項目３９に記載の方法。（項目４１）
前記細胞が造血幹細胞である、項目３９に記載の方法。

図１は、前臨床試験および臨床試験において使用したＭＮＤ−ＡＬＤベクター構築物の概略マップを示す。全てのベクターが、高レベルの発現のためにＭＮＤプロモーターの制御下にあるヒトＡＢＣＤ−１のｃＤＮＡを有する。ｐＬＢＰ１００およびｐＬＢＰ１４０に対する安全性修飾は、ｇａｇコード領域内の２つの終止コドン、右側のＨＩＶ ＬＴＲのＵ３内に４００ｂｐの欠失、およびウサギβ−グロビンポリＡ（ｒβｇｐｐＡ）シグナルを含む。ＨＩＶ ＬＴＲはヒト免疫不全１型ウイルスの長い末端反復であり、Ψ＋はパッケージングシグナルであり、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰは中心ポリプリントラクトであり、ＲＲＥはＲｅｖ応答性エレメントであり、ｐｐｔはポリプリントラクトである。ｐＬＢＰ１４０は、ｐＬＢＰ１００ベクターとは、突然変異しているが（ｍｕｔ６）機能的なウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ΔＷＰＲＥ）が導入されていることによって異なる。 図２は、実験におけるｐＬＢＰ１００レンチウイルスベクターおよびｐＬＢＰ１４０レンチウイルスベクターを用いた形質導入ならびに短期の液体培養およびメチルセルロース（ｍｅｔｈｙｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）培養を示す。 図３は、ｐＬＢＰ１００レンチウイルスベクターおよびｐＬＢＰ１４０レンチウイルスベクターを用いた形質導入、その後の短期の液体培養およびメチルセルロース培養または支持ＭＳ５間質における長期の培養を示す。 図４は、正常なヒトＣＤ３４＋細胞を形質導入した後の骨髄系前駆体（ＣＦＵ−ＧＭ；図４Ａ）および赤血球前駆体（ＢＦＵ−Ｅ；図４Ｂ）の数を示す。形質導入は、ｐＬＢＰ１００（ｐ１００）またはｐＬＢＰ１４０（ｐ１４０）のいずれかを使用して実施し、４つの別々の実験を伴った。 図５は、ＬＴＣ−ＩＣの頻度を示す。限界希釈および５週間の間質共培養の後、Ｌ−Ｃａｌｃ（商標）プログラムを使用した、９５％信頼区間での二次的ＣＦＣの計数および頻度の推定のためにメチルセルロース培養に移した。 図６は、短期前駆体へのベクター組み込みの効率を示す。（Ａ）液体培養中７日、１４日、２８日、３１日および３５日の時点の細胞におけるベクターのコピー数（ＶＣＮ）。（Ｂ）プールした１４日目のＣＦＣ培養物からの平均ＶＣＮ。（Ｃ）パーセントベクター陽性骨髄系コロニー。分析された陽性コロニー数および総コロニー数が示されている。 図６は、短期前駆体へのベクター組み込みの効率を示す。（Ａ）液体培養中７日、１４日、２８日、３１日および３５日の時点の細胞におけるベクターのコピー数（ＶＣＮ）。（Ｂ）プールした１４日目のＣＦＣ培養物からの平均ＶＣＮ。（Ｃ）パーセントベクター陽性骨髄系コロニー。分析された陽性コロニー数および総コロニー数が示されている。 図７は、短期前駆体対長期（ＬＴＣ−ＩＣ）前駆体のベクター組み込みの効率を示す。（Ａ）プールした１４日目のＣＦＣ培養物からの平均ＶＣＮ。（Ｂ）パーセントベクター陽性骨髄系コロニー。分析された陽性コロニー数および総コロニー数が示されている。 図８は、フローサイトメトリーによる、形質導入された細胞におけるＡＬＤタンパク質（ＡＬＤＰ）発現を示す。（Ａ１およびＡ２）異なる実験からのモック形質導入細胞、ｐＬＢＰ１００形質導入細胞およびｐＬＢＰ１４０形質導入細胞についてのＰＥ蛍光を示すヒストグラム。（Ｂ）７日（実験０７２０１０および０９１４１０）、１４日（実験０８１０１０）および２８日（実験０８０６１０）の時点のパーセントＡＬＤＰ陽性細胞。（Ｃ）ＡＬＤＰ＋細胞の中でＡＬＤＰ発現の相対レベルを示すモック対照に対する比としてのＭＦＩ。 図８は、フローサイトメトリーによる、形質導入された細胞におけるＡＬＤタンパク質（ＡＬＤＰ）発現を示す。（Ａ１およびＡ２）異なる実験からのモック形質導入細胞、ｐＬＢＰ１００形質導入細胞およびｐＬＢＰ１４０形質導入細胞についてのＰＥ蛍光を示すヒストグラム。（Ｂ）７日（実験０７２０１０および０９１４１０）、１４日（実験０８１０１０）および２８日（実験０８０６１０）の時点のパーセントＡＬＤＰ陽性細胞。（Ｃ）ＡＬＤＰ＋細胞の中でＡＬＤＰ発現の相対レベルを示すモック対照に対する比としてのＭＦＩ。 図８は、フローサイトメトリーによる、形質導入された細胞におけるＡＬＤタンパク質（ＡＬＤＰ）発現を示す。（Ａ１およびＡ２）異なる実験からのモック形質導入細胞、ｐＬＢＰ１００形質導入細胞およびｐＬＢＰ１４０形質導入細胞についてのＰＥ蛍光を示すヒストグラム。（Ｂ）７日（実験０７２０１０および０９１４１０）、１４日（実験０８１０１０）および２８日（実験０８０６１０）の時点のパーセントＡＬＤＰ陽性細胞。（Ｃ）ＡＬＤＰ＋細胞の中でＡＬＤＰ発現の相対レベルを示すモック対照に対する比としてのＭＦＩ。 図９は、ＭＮＤ−ＡＬＤベクター構築物の概略マップを示す。ベクターは高レベルの発現のためにＭＮＤプロモーターの制御下にあるヒトＡＢＣＤ−１のｃＤＮＡを有する。ＨＩＶ ＬＴＲはヒト免疫不全１型ウイルスの長い末端反復であり、Ψ＋はパッケージングシグナルであり、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰは中心的なポリプリントラクトであり、ＲＲＥはＲｅｖ応答性エレメントであり、ｐｐｔはポリプリントラクトである。ベクターはＷＰＲＥ配列を含有しない。 図１０は、ｐ１００およびｐ１４０を種々のＭＯＩで用いて形質導入した４４９６細胞におけるモックに対するＶＬＣＦＡ補正の比対ＶＣＮを示す。

Ａ．概要
本発明は、一般に、副腎脳白質ジストロフィおよび副腎脊髄神経障害に対するより安全かつより効率的なウイルスベクターおよび形質導入細胞療法を対象とする。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、出願人らは、ＡＬＤの少年の造血幹細胞は他の点では正常であり、また、小膠細胞は骨髄起源であるので、被験体の造血幹細胞において欠陥のあるＡＢＣＤ１遺伝子に正常なＡＢＣＤ１のｃＤＮＡを補充することにより、脳小膠細胞におけるＡＬＤＰレベルを正常化することができることを意図している。したがって、本発明のベクターを使用して正常なＡＢＣＤ１のｃＤＮＡを自己由来のＣＤ３４＋造血幹細胞にｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子移入し、その後、骨髄アブレーション後に移植することにより、ＣＮＳ機能の安定化およびＡＬＤの致死的影響に関連する血漿ＶＬＣＦＡレベルの低下をもたらすことができる。

したがって、本発明の組成物および方法は、それにより、造血生着不全のリスクを有意に減少させ、また急性ＧｖＨＤおよび慢性ＧｖＨＤを排除しながら急速に治療することが可能になるので、ＡＬＤの少年の治療における大幅な医学的進歩を示す可能性がある。急速なＣＮＳの悪化およびＨＣＴを用いて疾患の安定化がみられるまでに１２〜１８カ月の待ち時間の潜在性があるので、時間はこの集団において非常に核心的なものである。

本発明の実施では、特に反対のことが示されなければ、分子生物学の従来の方法および当技術分野の技術の範囲内の組換えＤＮＡ技法が用いられ、その多くが例示のために下に記載されている。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ． Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ． Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ編、１９８４年）を参照されたい。

本明細書において引用されている全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Ｂ．定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の目的に関して、以下の用語が下で定義されている。

本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状の二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノム内に共有結合により組み込むＲＮＡウイルスを指す。レトロウイルスは、短い二量体形成領域を有する一本鎖ＲＮＡゲノムの２つのコピーを保有する非正二十面体の、エンベロープを有する多数のウイルスで構成されるＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科に属する。レトロウイルスは遺伝子を送達するための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ． ３５７巻：４５５〜４６０頁）。ウイルスが宿主ゲノムに組み込まれたら、そのウイルスは「プロウイルス」と称される。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型としての機能を果たし、新しいウイルス粒子を産生するために必要な構造タンパク質および酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を導く。

例示的なレトロウイルスとしては、これだけに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））およびレンチウイルスが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または属）を指す。例示的なレトロウイルスとしては、これだけに限定されないが、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型、およびＨＩＶ２型を含めたヒト免疫不全ウイルス）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。一実施形態では、ＨＩＶに基づくベクターの骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が好ましい。

レトロウイルスベクター、より詳細にはレンチウイルスベクターを本発明の実施において使用することができる。したがって、「レトロウイルス」または「レトロウイルスベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それぞれ「レンチウイルス」および「レンチウイルスベクター」を包含するものとする。

「ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を移行または運搬することができる核酸分子を指すために使用される。移行される核酸は、一般に、ベクター核酸分子と連結している、例えば、それに挿入されている。ベクターは、細胞における自律複製を導く配列を含んでもよく、宿主細胞のＤＮＡへの組み込みを可能にするために十分な配列を含んでもよい。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、コスミド、細菌性人工染色体、およびウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損性のレトロウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。

当業者には明らかになる通り、「ウイルスベクター」という用語は、広く使用されており、一般には核酸分子の移行または細胞のゲノムへの組み込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、移行プラスミド）、または核酸の移行を媒介するウイルス粒子のいずれかを指す。ウイルス粒子は、一般には、種々のウイルスの構成成分を含み、時には核酸（複数可）に加えて宿主細胞の構成成分も含む。

ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞内に移行することができるウイルスもしくはウイルス粒子、または移行された核酸自体のいずれかを指す場合がある。ウイルスベクターおよび移行プラスミドは、主にウイルスに由来する構造的遺伝エレメントおよび／または機能的遺伝エレメントを含有する。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的遺伝エレメントおよび機能的遺伝エレメントを含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含めた構造的遺伝エレメントおよび機能的遺伝エレメントを含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「ハイブリッド」という用語は、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスの配列と非レンチウイルスのウイルス配列の両方を含有するベクター、ＬＴＲまたは他の核酸を指す。一実施形態では、ハイブリッドベクターとは、逆転写、複製、組み込みおよび／またはパッケージングのためのレトロウイルス、例えば、レンチウイルスの配列、ならびにアルファウイルスサブゲノムプロモーター配列、非構造タンパク質、ならびに／あるいはポリメラーゼ認識部位を含むベクターまたは移行プラスミドを指す。

特定の実施形態では、「レンチウイルスベクター」、「レンチウイルス発現ベクター」という用語は、レンチウイルス移行プラスミドおよび／または感染性レンチウイルス粒子を指すために使用することができる。本明細書において、クローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸などのエレメントに言及している場合、これらのエレメントの配列は、本発明のレンチウイルス粒子ではＲＮＡ形態で存在し、本発明のＤＮＡプラスミドではＤＮＡ形態で存在することが理解されるべきである。

プロウイルスの各末端は「長い末端反復」または「ＬＴＲ」と称される構造である。「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、それらの天然の配列の状況では、直接反復であり、Ｕ３領域、Ｒ領域およびＵ５領域を含有する、レトロウイルスのＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指す。ＬＴＲにより、一般に、レトロウイルスの遺伝子の発現（例えば、促進、開始および遺伝子転写物のポリアデニル化）およびウイルス複製の基礎をなす機能がもたらされる。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナルおよびウイルスのゲノムの複製および組み込みのために必要な配列を含めた多数の調節シグナルを含有する。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と称される３つの領域に分けられる。Ｕ３領域はエンハンサーエレメントおよびプロモーターエレメントを含有する。Ｕ５領域はプライマー結合部位とＲ領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含有する。Ｒ（反復）領域にはＵ３領域およびＵ５領域が隣接する。Ｕ３領域、Ｒ領域およびＵ５領域で構成されるＬＴＲは、ウイルスのゲノムの５’末端および３’末端の両方に出現する。５’ＬＴＲにはゲノムの逆転写のために必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）および粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なパッケージングのために必要な配列（プシー部位）が近接している。

本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスカプシドまたは粒子内へのウイルスＲＮＡの挿入のために必要な、レトロウイルスのゲノム内に位置する配列を指す。例えば、Ｃｌｅｖｅｒら、１９９５年 Ｊ． ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６９巻、４号；２１０１〜２１０９頁を参照されたい。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスのゲノムのキャプシド形成のために必要な最小のパッケージングシグナル（プシー［Ψ］配列とも称される）を使用する。したがって、本明細書で使用される場合、「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「プシー」という用語および「Ψ」という符号は、ウイルス粒子形成の間のレトロウイルスのＲＮＡ鎖のキャプシド形成のために必要な非コード配列への言及に使用される。

種々の実施形態では、ベクターは、修飾された５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲを含む。３’ＬＴＲの修飾は、多くの場合、ウイルスを複製欠損性にすることによってレンチウイルス系またはレトロウイルス系の安全性を改善するために行われる。本明細書で使用される場合、「複製欠損性」という用語は、完全な、有効な複製ができず、したがって、感染性ビリオンが産生されない（例えば、複製欠損性レンチウイルス後代）ウイルスを指す。「複製コンピテント」という用語は、複製することができ、したがって、ウイルスのウイルス複製により感染性ビリオン（例えば、複製コンピテントレンチウイルス後代）を産生することができる野生型ウイルスまたは変異体ウイルスを指す。

「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターとは、１回目のウイルス複製を越えてウイルスが転写されることを防ぐために、Ｕ３領域として公知の右側の（３’）ＬＴＲのエンハンサー−プロモーター領域が修飾された（例えば、欠失または置換によって）複製欠損性ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを指す。これは、ウイルス複製の間に右側の（３’）ＬＴＲのＵ３領域が左側の（５’）ＬＴＲのＵ３領域の鋳型として使用され、したがって、ウイルスの転写物はＵ３エンハンサー−プロモーターなしでは生じ得ないことに起因する。本発明の別の実施形態では、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が、例えば、理想的なポリ（Ａ）配列に置き換わるように修飾されている。ＬＴＲに対する修飾、例えば、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’ＬＴＲと５’ＬＴＲの両方に対する修飾なども、本発明に包含されることに留意するべきである。

５’ＬＴＲのＵ３領域を、ウイルス粒子の産生の間にウイルスのゲノムの転写を駆動するための異種プロモーターで置き換えることによって、さらなる安全性の増強がもたらされる。使用することができる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性のシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔに依存しない様式で高レベルの転写を駆動することができる。この置き換えにより、ウイルス産生系に完全なＵ３配列が存在しないので、複製コンピテントウイルスが生成される組換えの可能性が低下する。

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＴＡＲエレメントを含む。「ＴＡＲ」という用語は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）のＬＴＲのＲ領域に位置する「トランス活性化反応」遺伝エレメントを指す。このエレメントは、レンチウイルスのトランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝エレメントと相互作用して、ウイルス複製を増強する。しかし、このエレメントは、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターで置き換えられている実施形態では必要ない。

「Ｒ領域」とは、レトロウイルスＬＴＲ内の、キャップ形成基の開始点（すなわち、転写の開始点）で始まり、ポリＡトラクトの開始点の直前で終わる領域を指す。Ｒ領域は、Ｕ３領域およびＵ５領域と隣接しているとも定義される。Ｒ領域は、逆転写の間に新生ＤＮＡをゲノムの一方の末端から他方の末端まで移行させることにおいて役割を果たす。

本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰエレメント」という用語は、その配列がレトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の中心ポリプリントラクトおよび中心終結配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。適切なＦＬＡＰエレメントは米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕら、２０００年、Ｃｅｌｌ、１０１巻：１７３頁に記載されている。ＨＩＶ−１の逆転写の間、中心ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）にあるプラス鎖ＤＮＡの中心開始点および中心終結配列（ＣＴＳ）にある中心終結点により、３本鎖ＤＮＡ構造：ＨＩＶ−１中心ＤＮＡフラップの形成が導かれる。いかなる理論に縛られることも望むものではないが、ＤＮＡフラップは、レンチウイルスのゲノム核内移行のシス活性決定因子として働く可能性があり、かつ／またはウイルスの力価を増大させる可能性がある。特定の実施形態では、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの骨格は、ベクター内の、目的の異種遺伝子の上流または下流の１つまたは複数のＦＬＡＰエレメントを含む。例えば、特定の実施形態では、移行プラスミドはＦＬＡＰエレメントを含む。一実施形態では、本発明のベクターは、ＨＩＶ−１から単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。

一実施形態では、レトロウイルス移行ベクターまたはレンチウイルス移行ベクターは、１つまたは複数の輸送エレメントを含む。「輸送エレメント」という用語は、核から細胞の細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ輸送エレメントの例としては、これだけに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えばＣｕｌｌｅｎら、１９９１年 Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５巻：１０５３頁；Ｃｕｌｌｅｎら、１９９１年 Ｃｅｌｌ ５８巻：４２３頁を参照されたい）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられる。一般に、ＲＮＡ輸送エレメントは遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つまたは多数のコピーとして挿入することができる。

特定の実施形態では、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節エレメント、および効率的なポリアデニル化部位、および場合によって、転写終結シグナルをベクターに組み入れることによって増大する。種々の転写後調節エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９９年、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７３巻：２８８６頁）；Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、５巻：３８６４頁）；および同様のもの（Ｌｉｕら、１９９５年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、９巻：１７６６頁）により、タンパク質における異種核酸の発現が増大し得る。転写後調節エレメントは、一般に、異種核酸配列の３’末端に位置づけられる。この構成により、５’部分に異種核酸コード配列を含み、３’部分に転写後調節エレメント配列を含むｍＲＮＡ転写物の合成がもたらされる。いくつかの場合には、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントにより、細胞の形質転換のリスクが増大し、かつ／またはｍＲＮＡ転写物の量が実質的にもしくは有意に増大しない、またはｍＲＮＡの安定性が増大しないので、好ましい実施形態では、本発明のベクターはこれらのエレメントを欠くまたはそれを含まない。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、追加的な安全対策としてＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを欠くまたはそれを含まない。

異種核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を導くエレメントにより、異種性の遺伝子発現が増大する。転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見いだされる。「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を導くＤＮＡ配列を指す。ポリＡ尾部を欠く転写物は不安定であり、急速に分解されるので、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。本発明のベクターに使用することができるポリＡシグナルの実例としては、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当技術分野で公知の別の適切な異種性または内在性のポリＡ配列が挙げられる。

ある特定の実施形態では、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターは、インスレーターエレメントをさらに含む。インスレーターエレメントは、レンチウイルスにより発現された配列、例えば、治療用ポリペプチドを、ゲノムＤＮＡ内に存在するシス作用性エレメントによって媒介され、移行した配列の調節解除された発現をもたらす可能性がある組み込み部位の影響（すなわち、位置の影響；例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅら、２００２年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９９巻：１６４３３頁；Ｚｈａｎら、２００１年、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．、１０９巻：４７１頁を参照されたい）から保護することに寄与し得る。いくつかの実施形態では、移行ベクターはＬＴＲの一方または両方、または、細胞のゲノムに組み込むベクターの領域内の他の場所にインスレーターエレメントを含む。本発明において使用するための適切なインスレーターとしては、これだけに限定されないが、ニワトリβ−グロビンインスレーターが挙げられる（参照により本明細書に組み込まれるＣｈｕｎｇら、１９９３年 Ｃｅｌｌ ７４巻：５０５頁；Ｃｈｕｎｇら、１９９７年 ＰＮＡＳ ９４巻：５７５頁；およびＢｅｌｌら、１９９９年 Ｃｅｌｌ ９８巻：３８７頁を参照されたい）。インスレーターエレメントの例としては、これだけに限定されないが、ニワトリＨＳ４などのβ−グロビン遺伝子座由来のインスレーターが挙げられる。

本発明の特定の実施形態によると、ウイルスベクターの骨格配列の大部分または全ては、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかし、レンチウイルスの配列の多くの異なる供給源を用いることができ、特定のレンチウイルスの配列における多数の置換および変更を、移行ベクターの本明細書に記載の機能を行う能力を損なうことなく適応させることができることが理解されるべきである。さらに、種々のレンチウイルスベクターが当技術分野で公知であり、そのいずれも本発明のウイルスベクターまたは移行プラスミドを作製するために適合させることができる。Ｎａｌｄｉｎｉら、（１９９６年ａ、１９９６年ｂ、および１９９８年）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、（１９９７年）；Ｄｕｌｌら、１９９８年、米国特許第６，０１３，５１６号；および同第５，９９４，１３６号を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドは一本鎖ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の参照配列（例えば、配列表を参照されたい）のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたは変異体を包含し、一般には変異体が参照配列の少なくとも１つの生物活性を維持することが好ましい。種々の例示的な実施形態では、本発明は、一部において、ウイルスベクターおよび移行プラスミドのポリヌクレオチド配列、ならびにそれを含む組成物を意図している。特定の実施形態では、本発明は、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列、または参照配列と下で定義されているストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、参照ポリヌクレオチドと比較して１つまたは複数のヌクレオチドが付加もしくは欠失している、または異なるヌクレオチドに置き換えられているポリヌクレオチドを包含する。この点について、参照ポリヌクレオチドに、変更されたポリヌクレオチドに参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性が保持される突然変異、付加、欠失および置換を含めた特定の変更を行うことができることが当技術分野ではよく理解されている。

本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、そのネイティブな状態では通常それに付随する構成成分を実質的にまたは基本的に含まない材料を意味する。例えば、「単離されたポリヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、天然に存在する状態で隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、通常はその断片に近接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。

ポリヌクレオチドの方向を説明する用語としては、５’（通常、ポリヌクレオチドの遊離ホスフェート基を有する末端）および３’（通常、ポリヌクレオチドの遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有する末端）が挙げられる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の方向または３’から５’の方向にアノテートされ得る。

「相補的な」および「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ＡＧＴＣＡＴＧ３’の相補鎖は３’ＴＣＡＧＴＡＣ５’である。後者の配列は多くの場合、逆相補体として左側に５’末端、右側に３’末端の５’ＣＡＴＧＡＣＴ３’と書かれる。その逆相補体と等しい配列は、パリンドローム配列であると言える。相補性は、塩基対合規則に従って核酸の塩基の一部のみがマッチする場合、「部分的」であり得る。または、核酸間には「完全な」または「全体的な」相補性があり得る。

「核酸カセット」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ、その後、タンパク質を発現させることができるベクター内の遺伝子配列を指す。核酸カセットは、目的の遺伝子を含有する。核酸カセットは、ベクター内で位置的におよび逐次的に方向付けられ、したがって、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要な場合にはタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換された細胞における活性のために必要な適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画にターゲティングされるまたは細胞外区画に分泌されることによって生物活性に適した区画にトランスロケーションされ得る。カセットは、ベクターへの迅速な挿入に適した３’末端および５’末端を有することが好ましく、例えば、カセットは、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。本発明の好ましい実施形態では、核酸カセットは、副腎脳白質ジストロフィまたは副腎脊髄神経障害を治療するために使用する治療用遺伝子の配列を含有する。カセットは、単一の単位としてプラスミドまたはウイルスベクターから除去することおよびそれに挿入することができる。

ポリヌクレオチドとは目的のポリヌクレオチドを包含する。本明細書で使用される場合、「目的のポリヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチド、例えば、発現することが望まれる発現ベクターに挿入された、ポリペプチド（すなわち、目的のポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを指す。ある特定の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、「治療用ポリペプチド」と称することができる、疾患または障害の治療または予防における治療効果をもたらすポリペプチド、例えば、ＡＴＰ結合性カセット、サブファミリーＤ（ＡＬＤ）、メンバー１（ＡＢＣＤ１）遺伝子をコードする。目的のポリヌクレオチド、およびそれにコードされるポリペプチドは、野生型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにその機能的変異体および断片の両方を包含する。特定の実施形態では、機能的な変異体は、対応する野生型参照ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、機能的な変異体または断片は、対応する野生型ポリペプチドの生物活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を有する。本発明において使用するために適した代表的なポリヌクレオチド配列としては、これだけに限定されないが、配列番号１〜２に記載のヒトＡＣＢＤ１のｃＤＮＡが挙げられる。

本発明のポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、他のＤＮＡ配列、例えば、本明細書の他の箇所で開示されているまたは当技術分野で公知のプロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、およびＡｔｔ部位）、終結コドン、転写終結シグナル、および自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどと組み合わせることができ、したがって、それらの全体の長さは相当に変動してよい。したがって、ほぼどんな長さのポリヌクレオチド断片も用いることができ、全長は調製の容易さおよび意図された組換えＤＮＡプロトコールにおける使用によって限定されることが好ましいことが意図されている。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。「エンハンサー」という用語は、転写の増強をもたらすことができ、いくつかの場合には別の制御配列に対するそれらの方向とは独立して機能することができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサーエレメントと協同的または相加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方をもたらすことができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。一実施形態では、本発明のベクターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含む（Ｃｈａｌｌｉｔａら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ６９巻（２号）：７４８〜５５頁（１９９５年）；配列番号３）。

特定の実施形態では、本発明のベクターは、外因性、内在性、または異種性の制御配列、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどを含む。「内在性の」制御配列とは、ゲノム内の所与の遺伝子と天然に連結している制御配列である。「外因性の」制御配列とは、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子の近位に配置され、したがってその遺伝子の転写が、連結したエンハンサー／プロモーターによって導かれるような制御配列である。「異種性の」制御配列は、遺伝的に操作される細胞とは異なる種由来の外因性の配列である。

「作動可能に連結した」という用語は、記載されている構成成分が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある近位を指す。一実施形態では、この用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、および／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的のポリヌクレオチドとの間の機能的な連結を指し、発現制御配列により、第２の配列に対応する核酸の転写が導かれる。

本明細書で使用される場合、「構成的プロモーター」という用語は、作動可能に連結した配列の転写を継続的または連続的に可能にするプロモーターを指す。構成的プロモーターは、多種多様な細胞および組織の型における発現を可能にする「遍在するプロモーター」であってもよく、制限された種類の細胞および組織の型の発現を可能にする「組織特異的プロモーター」であってもよい。例示的な遍在するプロモーターとしては、これだけに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス性のシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５プロモーター、Ｐ７．５プロモーター、およびＰ１１プロモーター、伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５巻、１４７７〜１４８２頁（２００７年））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、およびβ−アクチンプロモーターが挙げられる。

特定の実施形態では、組織特異的プロモーターを使用して、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、系列特異的、または組織特異的な発現を実現すること（例えば、ポリペプチドをコードする特定の核酸をある細胞型もしくは組織のサブセットにおいてのみ、または特定の発生段階にのみ発現させること）が望ましい場合がある。組織特異的プロモーターの実例としては、これだけに限定されないが、Ｂ２９プロモーター（Ｂ細胞での発現）、ｒｕｎｔ転写因子（ＣＢＦａ２）プロモーター（幹細胞に特異的な発現）、ＣＤ１４プロモーター（単核球細胞での発現）、ＣＤ４３プロモーター（白血球および血小板での発現）、ＣＤ４５プロモーター（造血細胞での発現）、ＣＤ６８プロモーター（マクロファージでの発現）、ＣＹＰ４５０ ３Ａ４プロモーター（肝細胞での発現）、デスミンプロモーター（筋肉での発現）、エラスターゼ１プロモーター（膵腺房細胞での発現、エンドグリンプロモーター（内皮細胞での発現）、線維芽細胞に特異的なタンパク質１プロモーター（ＦＳＰ１）プロモーター（線維芽細胞での発現）、フィブロネクチンプロモーター（線維芽細胞での発現）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ１）プロモーター（内皮細胞での発現）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（星状膠細胞での発現）、インスリンプロモーター（膵ベータ細胞での発現）、インテグリン、アルファ２ｂ（ＩＴＧＡ２Ｂ）プロモーター（巨核球）、細胞内接着分子２（ＩＣＡＭ−２）プロモーター（内皮細胞）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）プロモーター（造血細胞）、ケラチン５プロモーター（ケラチノサイトでの発現）、ミオグロビン（ＭＢ）プロモーター（筋肉での発現）、筋分化１（ＭＹＯＤ１）プロモーター（筋肉での発現）、ネフリンプロモーター（有足細胞での発現）、骨ガンマ−カルボキシグルタミン酸タンパク質２（ＯＧ−２）プロモーター（骨芽細胞での発現）、３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ２Ｂ（Ｏｘｃｔ２Ｂ）プロモーター、（一倍体−精子細胞での発現）、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）プロモーター（肺での発現）、シナプシンプロモーター（ニューロンでの発現）、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳＰ）プロモーター（造血細胞での発現）が挙げられる。

一実施形態では、本発明のベクターは、所望のポリペプチド、例えばＡＢＣＤ１を小膠細胞において発現させる組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、ＭＮＤプロモーター（配列番号３）を含む。

本明細書で使用される場合、「条件発現」とは、これだけに限定されないが、誘導性発現；抑圧可能な発現；特定の生理的、生物学的、または疾患の状態を有する細胞または組織における発現などを含めた任意の種類の条件発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織に特異的な発現を排除するものではない。本発明のある特定の実施形態は、例えば、細胞、組織、生物体などを、ポリヌクレオチドの発現を引き起こす処理もしくは条件、または目的のポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現の増大または減少を引き起こす処理または条件に供することによって発現が制御される、目的のポリヌクレオチドの条件発現を提供する。

誘導性プロモーター／系の実例としては、これだけに限定されないが、ステロイド誘導性プロモーター、例えば、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなど（対応するホルモンで処理することによって誘導される）、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（種々の重金属で処理することによって誘導される）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導される）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン調節可能系（Ｓｉｒｉｎら、２００３年、Ｇｅｎｅ、３２３巻：６７頁）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられる。

条件発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって実現することもできる。本発明のある特定の実施形態によると、ベクターは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための部位を少なくとも１つ（一般には２つ）含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質であってよい、１箇所または複数箇所の組換え部位（例えば、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、７箇所、１０箇所、１２箇所、１５箇所、２０箇所、３０箇所、５０箇所など）が関与する組換え反応に関与する切除的または統合的なタンパク質、酵素、補因子または関連するタンパク質（Ｌａｎｄｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３巻：６９９〜７０７頁（１９９３年）を参照されたい）、またはその突然変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含有する融合タンパク質）、断片、および変異体を包含する。本発明の特定の実施形態において使用するために適したリコンビナーゼの実例としては、これだけに限定されないが、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが挙げられる。

ベクターは、多種多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための１箇所または複数箇所の組換え部位を含んでよい。部位特異的リコンビナーゼの標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みのために必要な任意の部位（複数可）に加えたものであることが理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「組換え配列」、「組換え部位」または「部位特異的な組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識し、結合する特定の核酸配列を指す。

例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための１つの組換え部位は、８塩基対のコア配列と隣接した１３塩基対の逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位としての機能を果たす）を２つ含む３４塩基対の配列であるｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ， Ｂ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５巻：５２１〜５２７頁（１９９４年）の図１を参照されたい）。他の例示的なｌｏｘＰ部位としては、これだけに限定されないが、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓら、１９９６年；ＢｅｔｈｋｅおよびＳａｕｅｒ、１９９７年）、ｌｏｘ５１７１（ＬｅｅおよびＳａｉｔｏ、１９９８年）、ｌｏｘ２２７２（ＬｅｅおよびＳａｉｔｏ、１９９８年）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒら、２００２年）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔら、１９９５年）、およびｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔら、１９９５年）が挙げられる。

ＦＬＰリコンビナーゼのために適切な認識部位としては、これだけに限定されないが、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６年）、Ｆ_１、Ｆ_２、Ｆ_３（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４年）、Ｆ_４、Ｆ_５（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４年）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８年）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８年）が挙げられる。

認識配列の他の例は、ａｔｔＢ配列、ａｔｔＰ配列、ａｔｔＬ配列、およびａｔｔＲ配列であり、これらはリコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えばフィーｃ３１によって認識される。φＣ３１ＳＳＲは、ヘテロタイプの部位ａｔｔＢ（長さ３４ｂｐ）とａｔｔＰ（長さ３９ｂｐ）の間の組換えのみを媒介する（Ｇｒｏｔｈら、２０００年）。ａｔｔＢおよびａｔｔＰは、それぞれ、細菌ゲノムおよびファージゲノムに対するファージインテグラーゼの付着部位に対して名づけられ、どちらも、φＣ３１ホモ二量体が結合する可能性がある不完全な逆方向反復を含有する（Ｇｒｏｔｈら、２０００年）。産物の部位であるａｔｔＬおよびａｔｔＲは、さらなるφＣ３１媒介性組換えに対して有効に不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３年）、それにより反応が不可逆的になる。挿入を触媒するために、ゲノムのａｔｔＰ部位へのａｔｔＢを有するＤＮＡの挿入が、ゲノムのａｔｔＢ部位へのａｔｔＰ部位の挿入よりも容易であることが見いだされている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら、２００１年；Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３年）。したがって、典型的な戦略では、相同組換えによってａｔｔＰを有する「ドッキング部位」を定義済みの遺伝子座に位置づけ、次いでそれを挿入のために、ａｔｔＢを有する入ってくる配列とパートナーにする。

本明細書で使用される場合、「配列内リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」とは、ＡＴＧなどの開始コドンへのシストロン（タンパク質をコードする領域）の直接配列内リボソーム進入を促進し、それにより、キャップに依存しない遺伝子の翻訳を導くエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９０年Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５巻（１２号）：４７７〜８３頁）およびＪａｃｋｓｏｎおよびＫａｍｉｎｓｋｉ． １９９５年 ＲＮＡ １巻（１０号）：９８５〜１０００頁を参照されたい。特定の実施形態では、本発明によって意図されているベクターは、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の目的のポリヌクレオチドを含む。複数のポリペプチドのそれぞれの効率的な翻訳を実現するために、ポリヌクレオチド配列を１つまたは複数のＩＲＥＳ配列または自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離することができる。

本明細書で使用される場合、「コザック配列」という用語は、ｍＲＮＡのリボソームの小サブユニットへの最初の結合を著しく容易にし、翻訳を増大させる短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスコザック配列は（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧであり、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ、１９８６年 Ｃｅｌｌ． ４４巻（２号）：２８３〜９２頁、およびＫｏｚａｋ、１９８７年 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５巻（２０号）：８１２５〜４８頁）。特定の実施形態では、本発明によって意図されているベクターは、コンセンサスコザック配列を有するポリヌクレオチドおよび所望のポリペプチド、例えば、ＡＢＣＤ１をコードするポリヌクレオチドを含む。

特定の実施形態では、ベクターは、発現させようとするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’側にあるポリアデニル化配列を含む。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端にポリＡ尾部を付加することによってｍＲＮＡの安定性を促進し、したがって、翻訳の効率の上昇に寄与し得る。認識されるポリアデニル化部位としては、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当技術分野で公知の別の適切な異種性または内在性のポリＡ配列が挙げられる。

ある特定の実施形態では、ベクターは、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、メトトレキセート、ゼオシン、ブラストサイジン、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地からは入手不可能な重大な栄養分を供給するタンパク質をコードする（例えば、バチルス属のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞株を回収することができる。それらとしては、これだけに限定されないが、それぞれｔｋ細胞またはａｐｒｔ細胞において使用することができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７年 Ｃｅｌｌ １１巻：２２３〜２３２頁）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙら、１９９０年 Ｃｅｌｌ ２２巻：８１７〜８２３頁）が挙げられる。

「宿主細胞」とは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトするまたは感染させる細胞を包含する。宿主細胞は、パッケージング細胞、産生細胞、およびウイルスベクターを感染させる細胞を含んでよい。特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターを感染させた宿主細胞を、療法を必要とする被験体に投与する。

妥当なウイルス力価を実現するためには、多くの場合、大規模なウイルス粒子産生が必要である。ウイルス粒子は、移行ベクターをウイルスの構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、ｔａｔ遺伝子、ｒｅｖ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、ｖｐｒ遺伝子、ｖｐｕ遺伝子、ｖｐｘ遺伝子、またはｎｅｆ遺伝子または他のレトロウイルスの遺伝子を含むパッケージング細胞系にトランスフェクトすることによって産生される。

本明細書で使用される場合、「パッケージングベクター」という用語は、パッケージングシグナルを欠き、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のウイルスの構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたはウイルスベクターを指す。一般には、パッケージングベクターはパッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、形質導入または感染によって細胞に導入される。トランスフェクション、形質導入または感染のための方法は当業者に周知である。本発明のレトロウイルス／レンチウイルス移行ベクターを、トランスフェクション、形質導入または感染によってパッケージング細胞系に導入して、産生細胞または産生細胞株を生成することができる。本発明のパッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔を含めた標準の方法によってヒト細胞または細胞株に導入することができる。いくつかの実施形態では、パッケージングベクターを、優性選択マーカー、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎ合成酵素またはＡＤＡなどと一緒に細胞に導入し、その後、適切な薬物の存在下でクローンを選択し、単離することができる。選択マーカー遺伝子は、コード遺伝子に、パッケージングベクターによって、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断性ウイルスペプチドによって物理的に連結させることができる。

ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）により、細胞株から生成される組換えレトロウイルスによって最終的に感染させ、形質転換することができる宿主細胞の範囲が決定される。レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＶなどの場合では、ｅｎｖタンパク質としてはｇｐ４１およびｇｐ１２０が挙げられる。以前に記載されている通り、本発明のパッケージング細胞によって発現されるウイルスｅｎｖタンパク質は、ウイルスのｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子とは別のベクター上にコードされることが好ましい。

本発明において使用することができるレトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の実例としては、これだけに限定されないが、ＭＬＶエンベロープ、１０Ａ１エンベロープ、ＢＡＥＶ、ＦｅＬＶ−Ｂ、ＲＤ１１４、ＳＳＡＶ、Ｅｂｏｌａ、Ｓｅｎｄａｉ、ＦＰＶ（家禽ペストウイルス）、およびインフルエンザウイルスエンベロープが挙げられる。同様に、ＲＮＡウイルス（例えば、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科のＲＮＡウイルス）由来のエンベロープならびにＤＮＡウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ科、およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ科）由来のエンベロープをコードする遺伝子を利用することができる。代表例としては、ＦｅＬＶ、ＶＥＥ、ＨＦＶＷ、ＷＤＳＶ、ＳＦＶ、狂犬病、ＡＬＶ、ＢＩＶ、ＢＬＶ、ＥＢＶ、ＣＡＥＶ、ＳＮＶ、ＣｈＴＬＶ、ＳＴＬＶ、ＭＰＭＶ、ＳＭＲＶ、ＲＡＶ、ＦｕＳＶ、ＭＨ２、ＡＥＶ、ＡＭＶ、ＣＴ１０、ＥＩＡＶが挙げられる。

他の実施形態では、本発明のウイルスをシュードタイピングするためのエンベロープタンパク質としては、これだけに限定されないが、以下のウイルスのいずれかが挙げられる：Ａ型インフルエンザ、例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ）など、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群の任意のウイルス、腸内アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目、リッサウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、ドゥベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｂａｔ ｖｉｒｕｓ）１＆２およびオーストラリアコウモリウイルス（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｂａｔ ｖｉｒｕｓ）など、エフェメロウイルス、ベシクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型および８型など、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、アレナウイルス、例えば、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス（Ｓａｂｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）など、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄｉａｅ科、例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候群を伴う出血熱を引き起こすウイルス、リフトバレー熱ウイルスなど、エボラ出血熱およびマールブルグ出血熱を含めたＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科（フィロウイルス）、キャサヌール森林病（Ｋａｙｓａｎｕｒ Ｆｏｒｅｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎を引き起こすウイルスを含めたＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科ならびにＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ヘンドラウイルスおよびニパーウイルスなど、大痘瘡、小痘瘡（天然痘）、アルファウイルス、例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、西ナイルウイルス、任意の脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｌｔｉｓ）を引き起こすウイルスなど。

一実施形態では、本発明は、組換えレトロウイルス、例えば、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質でシュードタイピングされたレンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。

「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を保有する別のウイルスのウイルスエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質を用いてシュードタイピングすることができ、これにより、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によりコードされる）は通常ウイルスをＣＤ４＋提示細胞にターゲティングするので、ＨＩＶがより広い範囲の細胞に感染することが可能になる。本発明の好ましい実施形態では、レンチウイルスのエンベロープタンパク質はＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされている。一実施形態では、本発明は、組換えレトロウイルス、例えば、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質を用いてシュードタイピングされたレンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。

本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞系」という用語は、パッケージングシグナルを含有しないが、ウイルス粒子の正しいパッケージングに必要であるウイルスの構造タンパク質および複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を安定にまたは一過性に発現する細胞株への言及において使用される。本発明のパッケージング細胞を調製するために、任意の適切な細胞株を使用することができる。一般に、細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、パッケージング細胞系を作製するために使用される細胞はヒト細胞である。使用することができる適切な細胞株としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ−２細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、および２１１Ａ細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、パッケージング細胞は２９３細胞、２９３Ｔ細胞、またはＡ５４９細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞はＡ５４９細胞である。

本明細書で使用される場合、「産生細胞株」という用語は、パッケージング細胞系およびパッケージングシグナルを含む移行ベクター構築物を含む、組換えレトロウイルス粒子を産生することができる細胞株を指す。感染性のウイルス粒子およびウイルスストック溶液の作製は、従来の技法を用いて行うことができる。ウイルスストック溶液を調製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｙ． Ｓｏｎｅｏｋａら（１９９５年）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３巻：６２８〜６３３頁、およびＮ． Ｒ． Ｌａｎｄａｕら（１９９２年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６巻：５１１０〜５１１３頁によって例示されている。感染性ウイルス粒子はパッケージング細胞から従来の技法を用いて収集することができる。例えば、感染性粒子は、当技術分野で公知の通り、細胞溶解、または細胞培養物の上清を収集することによって収集することができる。場合によって、収集されたウイルス粒子は、所望であれば精製することができる。適切な精製技法は当業者に周知である。

レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを使用し、トランスフェクションではなくウイルス感染によって遺伝子（複数可）または他のポリヌクレオチド配列を送達することは、「形質導入」と称される。一実施形態では、感染およびプロウイルスの組み込みによってレトロウイルスベクターを細胞に形質導入する。ある特定の実施形態では、細胞は、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを使用して感染によって細胞に送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む場合に「形質導入される」。特定の実施形態では、形質導入された細胞は、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターによって送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列をその細胞のゲノム内に含む。

特定の実施形態では、治療用ポリペプチド、例えば、ＡＢＣＤ１ポリペプチドを発現する、本発明のウイルスベクターを用いて形質導入された宿主細胞を被験体に投与して、疾患、障害、または状態、例えば、副腎脳白質ジストロフィまたは副腎脊髄神経障害を治療および／または予防する。本発明のある特定の実施形態に従って利用することができる遺伝子療法におけるウイルスベクターの使用に関する他の方法は、例えば、Ｋａｙ， Ｍ． Ａ．（１９９７年）Ｃｈｅｓｔ １１１巻（補遺６）：１３８Ｓ〜１４２Ｓ頁；Ｆｅｒｒｙ， Ｎ．およびＨｅａｒｄ， Ｊ． Ｍ．（１９９８年）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９巻：１９７５〜８１頁；Ｓｈｉｒａｔｏｒｙ， Ｙ．ら（１９９９年）Ｌｉｖｅｒ １９巻：２６５〜７４頁；Ｏｋａ， Ｋ．ら（２０００年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｌｉｐｉｄｏｌ． １１巻：１７９〜８６頁；Ｔｈｕｌｅ， Ｐ． Ｍ．およびＬｉｕ， Ｊ． Ｍ．（２０００年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７巻：１７４４〜５２頁；Ｙａｎｇ， Ｎ． Ｓ．（１９９２年）Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２巻：３３５〜５６頁；Ａｌｔ， Ｍ．（１９９５年）Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ． ２３巻：７４６〜５８頁；Ｂｒｏｄｙ， Ｓ． Ｌ．およびＣｒｙｓｔａｌ， Ｒ． Ｇ．（１９９４年）Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７１６巻：９０〜１０１頁；Ｓｔｒａｙｅｒ， Ｄ． Ｓ．（１９９９年）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇ． Ｄｒｕｇｓ ８巻：２１５９〜２１７２頁；Ｓｍｉｔｈ−Ａｒｉｃａ， Ｊ． Ｒ．およびＢａｒｔｌｅｔｔ， Ｊ． Ｓ．（２００１年）Ｃｕｒｒ． Ｃａｒｄｉｏｌ． Ｒｅｐ． ３巻：４３〜４９頁；Ｌｅｅ， Ｈ． Ｃ．ら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ ４０８巻：４８３〜８頁に見いだすことができる。

「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および同様の単語、例えば、「治療される（ｔｒｅａｔｅｄ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などは、本明細書で使用される場合、文脈からそうでないことが明らかでない限り、好ましくは臨床結果を含めた有益なまたは所望の結果を得るための手法を示す。治療は、場合によって、疾患もしくは状態の症状の軽減もしくは改善、または疾患もしくは状態の進行の遅延を伴ってよい。

「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」および同様の単語、例えば、「予防される（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」などは、本明細書で使用される場合、文脈からそうでないことが明らかでない限り、疾患または状態の発生または再発を予防するため、阻害するため、またはその可能性を低下させるための手法を示す。この単語は、疾患もしくは状態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは状態の症状の発生もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用される場合、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」および同様の単語は、疾患または状態が発症または再発する前に、疾患または状態の強さ、影響、症状および／または負荷を軽減することも包含する。

形質導入された宿主細胞または物質の「有効量」または「治療有効量」とは、本明細書で使用される場合、所望の生物学的効果、例えば、臨床結果を含めた有益な結果などに影響を及ぼすために十分な量である。

「薬学的に許容される担体」とは、本明細書で使用される場合、薬学的に許容される細胞培養培地を含めた生理的に適合性の任意のかつ全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを包含する。一実施形態では、担体は、非経口投与に適している。担体は、血管内投与（例えば、静脈内投与または動脈内投与）、腹腔内投与または筋肉内投与に適するものであってよい。薬学的に許容される担体としては、滅菌水溶液または滅菌注射用溶液もしくは分散物を即時調製するための分散物および滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質へのそのような媒体および作用物質の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または作用物質が形質導入された細胞と適合しない場合を除く限りでは、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が意図されている。

冠詞「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、本明細書では、その冠詞の文法上の目的語の１つ、または１つより多く（すなわち少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「ａｎ（１つの）エレメント」とは、１つのエレメントまたは１つより多いエレメントを意味する。

選択肢（例えば、「ｏｒ（または）」）の使用は、その選択肢のいずれか一方、その両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は同義に使用される。

本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％だけ変動する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さに関して±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲を指す。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、本明細書全体を通して、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、明記されているステップもしくはエレメントまたはステップもしくはエレメントの群を包含するが、任意の他のステップもしくはエレメントまたはステップもしくはエレメントの群を排除するものではないと理解されたい。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とは、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という句に続くいかなるものも含み、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という句は、列挙されているエレメントが必要または必須であること、および他のエレメントは存在してはならないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、この句の後に列挙されている任意のエレメントを包含し、列挙されているエレメントに関する本開示に明記されている活性または作用に干渉または寄与しない他のエレメントに限定されるものとする。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という句は、列挙されているエレメントが必要または必須であるが、他のエレメントは任意選択ではなく、それらが列挙されているエレメントの活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて存在するかもしれないし、存在しないかもしれないことを示す。

本明細書全体を通して「一実施形態」または「ある実施形態」との言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に包含されることを意味する。したがって、本明細書全体を通して種々の箇所において出現する「一実施形態では」または「ある実施形態では」という句は、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているのではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性を任意の適切な様式で組み合わせて１つまたは複数の実施形態にすることができる。

以下の説明において、特定の詳細は、本発明の種々の実施形態の徹底的な理解をもたらさすために記載されている。しかし、当業者には、これらの詳細なしで本発明を実施することができることが理解されよう。さらに、本明細書に記載の構造および置換基の種々の組み合わせに由来する個々のベクター、またはベクターの群が、各ベクターまたはベクターの群が個別に記載されているのと同じ程度に本出願により開示されていることが理解されるべきである。したがって、特定のベクター構造または特定の置換基の選択は本開示の範囲内である。

Ｃ．ウイルスベクター
レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは試験され、目的の遺伝子を広範囲の標的細胞のゲノムに安定に導入するための適切な送達ビヒクルであることが見いだされている。最大の形質導入の効率および導入遺伝子の発現のために、ＦＬＡＰ配列、ＲＲＥ配列、およびＨＰＲＥ配列またはＷＰＲＥ配列を含めることによって多くのベクター設計が最適化されている。特に、当業者は、多くの場合、導入遺伝子の発現を増大させるために転写後調節配列を含める。驚いたことに、本発明者らは、ＷＰＲＥ配列を含めることでは発現が有意に増大しないことを発見した。

この構成により、５’部分に異種核酸コード配列を含み、３’部分に転写後調節エレメント配列を含むｍＲＮＡ転写物の合成がもたらされる。好ましい実施形態では、いくつかの場合には、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントにより細胞の形質転換のリスクが増大し、かつ／または、ｍＲＮＡ転写物の量が実質的にもしくは有意に増大しない、またはｍＲＮＡの安定性が増大しないので、本発明のベクターはこれらのエレメントを欠くまたはそれを含まない。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、追加的な安全対策としてＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを欠くまたはそれを含まない。

本発明は、本発明の方法を実施するために使用することができる移行ベクターをさらに提供する。

そのような移行ベクターは種々の異なるウイルスベクターを使用して作製することができることが当業者には理解されるが、特定の実施形態では、レンチウイルスベクターがｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのどちらにおいても非分裂細胞への導入遺伝子の効率的な送達、組み込みおよび長期発現をもたらすことができることに一部起因して、移行ベクターはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。種々のレンチウイルスベクターが当技術分野で公知であり、いずれも本発明の移行ベクターを作製するために適合させることができる。Ｎａｌｄｉｎｉら、（１９９６年ａ、１９９６年ｂ、および１９９８年）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、（１９９７年）；Ｄｕｌｌら、１９９８年、米国特許第６，０１３，５１６号；および同第５，９９４，１３６号を参照されたい。一般に、これらのベクターは、プラスミドに基づくかウイルスに基づき、治療用ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞内に移行させるために必須な配列を有するように構成されている。

レンチウイルスのゲノムおよびプロウイルスのＤＮＡは、レトロウイルスに見いだされる３つの遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含み、これらは２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列と隣接している。ｇａｇ遺伝子は内部の構造タンパク質（マトリックスタンパク質、カプシドタンパク質およびヌクレオカプシドタンパク質）をコードし、ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼおよびインテグラーゼをコードし、ｅｎｖ遺伝子はウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’ＬＴＲ’および３’ＬＴＲは、それぞれビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進する機能を果たす。レンチウイルスはｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆおよびｖｐｘを含めた追加的な遺伝子を有する。ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）およびウイルスＲＮＡを粒子内に入れる効率的なキャプシド形成に必要な配列（プシー部位）が５’ＬＴＲに近接する。

別の実施形態では、レンチウイルスベクターはＨＩＶベクターである。したがって、ベクターは、ヒト免疫不全−１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全−２（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）などに由来してよい。本発明の大部分の態様に関して、ＨＩＶに基づく構築物がヒト細胞の形質導入において最も効率的であるという点で、ＨＩＶに基づくベクターの骨格（すなわち、ＨＩＶのシス作用性配列エレメントならびにＨＩＶのｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｒｅｖ遺伝子）が一般に好ましい。

種々の実施形態では、本発明のベクターは、副腎脳白質ジストロフィおよび／または副腎脊髄神経障害に対する療法を提供するポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結した、小膠細胞において作動可能なプロモーターを含む。ベクターは、１つまたは複数のＬＴＲを有してよく、ＬＴＲのいずれかが１つまたは複数の修飾、例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失などを含む。本発明のベクターはＷＰＲＥもＨＰＲＥも含まないことを除いては、ベクターは、形質導入の効率を上昇させるための１つ以上の補助的なエレメント（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスのパッケージング（例えば、プシー（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）、および／または治療用遺伝子の発現を増大させる他のエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列）をさらに含んでよい。

特定の実施形態では、本発明の移行ベクターは、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、中心ポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、レトロウイルス輸送エレメントと、ＡＴＰ結合性カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、小膠細胞において活性なプロモーターと、右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まない。

特定の実施形態では、本発明の移行ベクターは、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、レトロウイルス輸送エレメントと、ＡＴＰ結合性カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、小膠細胞において活性なプロモーターと、右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲと、ポリ（Ａ）配列とを含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まない。
別の特定の実施形態では、本発明は、左側の（５’）ＬＴＲと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ＲＲＥと、ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１〜２）に作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、右側の（３’）ＬＴＲと、ポリアデニル化配列とを含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないレンチウイルスベクターを提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、左側の（５’）ＨＩＶ−１ＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ＲＲＥと、ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、右側の（３’）自己不活性化（ＳＩＮ）ＨＩＶ−１ＬＴＲと、ウサギβ−グロビンポリアデニル化配列とを含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないレンチウイルスベクターを提供する。

別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＬＴＲと、中心ポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、レトロウイルス輸送エレメント、ＡＴＰ結合性カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、小膠細胞において活性なプロモーターとを含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないベクターを提供する。

特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＬＴＲと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ＲＲＥと、ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、ポリアデニル化配列とを含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないベクターを提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＳＩＮ ＨＩＶ−１ＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、ＲＲＥと、ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、ウサギβ−グロビンポリアデニル化配列を提供し、ベクターはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まない。

ＷＰＲＥエレメントまたはＨＰＲＥエレメントを欠くレトロウイルスベクター内の治療用導入遺伝子が小膠細胞において発現されるように、現存する本発明の実施形態から多くの他の異なる実施形態を適合させることができることが当業者には理解されよう。

Ｄ．組成物および製剤
本発明は、本明細書に記載の方法に従って作製された形質導入された細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物をさらに含む。一実施形態では、担体は非経口投与に適している。担体は、静脈内投与、腹腔内投与または筋肉内投与に適していてよい。薬学的に許容される担体としては、滅菌水溶液または分散物、および滅菌注射用溶液または分散物を即時調製するための滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質へのそのような媒体および作用物質の使用は当技術分野において周知である。

本発明の組成物は、細胞または動物に投与するために薬学的に許容されるまたは生理的に許容される溶液中に、単独で、または１つまたは複数の他の療法のモダリティと組み合わせて製剤化された本明細書に記載の１つまたは複数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、形質導入された細胞などを含んでよい。所望であれば、本発明の組成物は、例えば他のタンパク質、ポリペプチド、小分子または種々の薬学的に活性な作用物質などの他の作用物質とも組み合わせて投与することができることも理解されよう。同様に組成物に含めることができる他の構成成分に対する限定は、追加的な作用物質が意図された遺伝子療法を送達する組成物の能力に悪影響を及ぼさないのであれば、実質的に存在しない。

本発明の医薬組成物では、薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の処方は、本明細書に記載の特定の組成物を、例えば、経口的、非経口的、静脈内、鼻腔内、および筋肉内への投与および処方を含めた種々の治療レジメンにおいて使用するための適切な投薬および治療レジメンの開発と同様に当業者に周知である。

ある特定の状況では、本明細書に開示されている組成物を、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；同第５，６４１，５１５号および同第５，３９９，３６３号（そのそれぞれの全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）に記載の通り、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、またはさらには腹腔内に送達することが望ましい。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中に調製することができる。分散物をグリセロール、液体ポリエチレングリコール、ならびにそれらの混合物中に、および油中に調製することもできる。通常の保管および使用の条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を予防するために防腐剤を含有する。

注射による使用に適した医薬形態としては、滅菌水溶液または分散物、および滅菌の注射可能な溶液または分散物を即時調製するための滅菌粉末が挙げられる（米国特許第５，４６６，４６８号、その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）。全ての場合において、形態は滅菌されているべきであり、また、容易に注射可能である程度まで流体であるべきである。形態は製造および保管の条件下で安定であるべきであり、また、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、ならびに／または植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散の場合では必要な粒度を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって容易にすることができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することによってもたらすことができる。

水溶液中で非経口投与するためには、例えば、溶液は、必要であれば適切に緩衝されているべきであり、液体希釈剤は最初に十分な食塩水またはグルコースを用いて等張性にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することができる滅菌水性媒体は本開示を考慮すれば当業者に公知になろう。例えば、１投与量を、等張性のＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解させ、皮下注入用流体１０００ｍｌに添加するか、提唱された注入部位に注射することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００年を参照されたい）。治療されている被験体の状態に応じて、投与量にいくらかの変動が必ず生じる。いずれにしても、投与に関与する人が個々の被験体に対する適切な用量を決定する。さらに、ヒトに投与するためには、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｓｔａｎｄａｒｄｓにより必要とされる滅菌、発熱性、および一般的な安全性および純度の標準に適うべきである。

滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙されている種々の他の成分を含む適切な溶媒中に組み入れ、その後、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散物は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒および上に列挙されているものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、活性成分の粉末と、それに加えて任意の追加的な所望の成分を、予め滅菌濾過したその溶液から得る真空乾燥および凍結乾燥技法である。

本明細書に開示されている組成物は、中性の形態または塩の形態に製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基と形成される）が挙げられ、これは、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される。遊離のカルボキシル基と形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることができる。製剤化の際、溶液を投与製剤と適合する様式および治療的に有効な量で投与する。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセル剤などの種々の剤形で容易に投与される。

本明細書で使用される場合、「担体」とは、任意のかつ全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁物、コロイドなどを包含する。薬学的に活性な物質へのそのような媒体および作用物質の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または作用物質が活性成分と適合しない場合を除く限りでは、治療用組成物におけるその使用が意図されている。補足的な活性成分も組成物に組み入れることができる。

「薬学的に許容される」という句は、ヒトに投与された際にアレルギー性または同様の不都合な応答を生じさせない分子実体および組成物を指す。タンパク質を活性成分として含有する水性組成物の調製は当技術分野ではよく理解されている。一般には、そのような組成物は、液体の溶液または懸濁物のいずれかとしての注射剤として調製され、注射前に液体での溶液、または液体での懸濁物に適した固体形態も調製することができる。調製物は乳化されていてもよい。

ある特定の実施形態では、組成物は、鼻腔内噴霧、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達することができる。遺伝子、ポリヌクレオチド、およびペプチド組成物を経鼻エアロゾル噴霧によって肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および同第５，８０４，２１２号（そのそれぞれの全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）に記載されている。同様に、鼻腔内微小粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、１９９８年）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号、その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）を使用した薬物の送達も、製薬技術分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）に記載されている。

ある特定の実施形態では、送達は、本発明の組成物を適切な宿主細胞に導入するために、リポソーム、ナノカプセル、微小粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞を、場合によって、ＣＰＰポリペプチドなどと混合して使用することによって起こり得る。具体的には、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、ナノ粒子などのいずれかに封入して送達するために製剤化することができる。そのような送達ビヒクルの製剤化および使用は、公知かつ従来の技法を用いて行うことができる。本発明の製剤および組成物は、細胞または動物に投与するために、単独で、または１つまたは複数の他の療法のモダリティと組み合わせて、薬学的に許容されるまたは生理的に許容される溶液（例えば、培養培地）中に製剤化された、本明細書に記載の任意の数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および小分子の組み合わせで構成される１つまたは複数の抑制因子および／または活性化因子を含んでよい。所望であれば、本発明の組成物は、他の作用物質、例えば、細胞、他のタンパク質またはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な作用物質などとも組み合わせて投与することができることも理解されよう。

特定の実施形態では、本発明による製剤または組成物は、本明細書に記載の任意の数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および小分子の組み合わせと接触した細胞を含む。

ある特定の態様では、本発明は、これだけに限定されないが、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクターを含めたウイルスベクター系を送達するため（すなわち、ウイルス媒介性形質導入）に適した製剤または組成物を提供する。

ｅｘ ｖｉｖｏ送達のための例示的な製剤は、当技術分野で公知の種々のトランスフェクション薬剤、例えば、リン酸カルシウム、電気穿孔、熱ショックおよび種々のリポソーム製剤（すなわち、脂質媒介性トランスフェクション）などの使用も含んでよい。下でより詳細に説明されている通り、リポソームは、水性流体の画分が閉じ込められた脂質二重層である。ＤＮＡは、自発的にカチオン性リポソームの外面と会合し（その電荷によって）、これらのリポソームは細胞膜と相互作用する。

ある特定の態様では、本発明は、１種または複数種の薬学的に許容される担体（添加物）および／または希釈剤（例えば、薬学的に許容される細胞培養培地）と一緒に製剤化された治療有効量の本明細書に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む薬学的に許容される組成物を提供する。

本発明の特定の実施形態は、他の製剤、例えば、製薬技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版 Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００年に記載されているものなどを含んでよい。

Ｅ．遺伝子療法の方法
レトロウイルスベクターにより、副腎脳白質ジストロフィおよび副腎脊髄神経障害の遺伝子療法の改善された方法がもたらされる。本明細書で使用される場合、「遺伝子療法」という用語は、遺伝子を細胞のゲノムに導入することを指す。種々の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、副腎脳白質ジストロフィまたは副腎脊髄神経障害を有すると診断された被験体またはそれを有する疑いがある被験体に治癒的、予防的、または改善的な利益をもたらすポリペプチドをコードする治療用導入遺伝子を発現させるプロモーターを含む。ウイルスを細胞にｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで感染させ、形質導入することができる。ｅｘ ｖｉｖｏにおける実施形態およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける実施形態では、次いで、形質導入された細胞を、療法を必要とする被験体に投与することができる。本発明は、本発明のベクター系、ウイルス粒子、および形質導入された細胞を使用して、被験体における副腎脳白質ジストロフィまたは副腎脊髄神経障害を治療、予防、および／または改善することができることを意図している。

種々の実施形態では、レトロウイルスベクターを、遺伝子療法を必要とする被験体の細胞、組織、または器官にｉｎ ｖｉｖｏで直接注射することによって投与する。種々の他の実施形態では、細胞に、本発明のベクターを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで形質導入する。次いで、形質導入された細胞を副腎脳白質ジストロフィまたは副腎脊髄神経障害を有する被験体に投与する。

本発明の遺伝子療法の方法における形質導入および投与に適した細胞としては、これだけに限定されないが、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、形質導入された細胞は骨髄幹細胞、臍帯幹細胞、または間葉系幹細胞である。

種々の実施形態では、幹細胞を使用することが好ましく、これは、幹細胞がｉｎ ｖｉｖｏで特定の生物学的ニッシェに投与されると適切な細胞型に分化する能力を有するためである。「幹細胞」という用語は、（１）長期にわたって自己再生できること、または元の細胞と同一のコピーを少なくとも１つ生成することができること、（２）単一細胞レベルで、多数の、またいくつかの例ではただ１つの特殊化した細胞型に分化することができること、および（３）ｉｎ ｖｉｖｏで組織の機能的再生をすることができる未分化細胞である細胞を指す。幹細胞は、それらの発生上の能力に従って、全能性、多能性、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）および少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）／単能性に細分類される。「自己再生」とは、変更されていない娘細胞を産生する独特の能力および特殊化した細胞型を生成する独特の能力（潜在力）を有する細胞を指す。自己再生は、２つのやり方で実現することができる。非対称細胞分裂により、親の細胞と同一である娘細胞が１つと、親の細胞とは異なり、前駆細胞または分化細胞である娘細胞が１つ産生される。非対称細胞分裂では細胞の数は増大しない。対称細胞分裂により、同一の娘細胞が２つ産生される。細胞の「増殖」または「拡大」とは、対称的に分裂する細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、細胞の、体または体質（すなわち、胚本体（ｅｍｂｒｙｏ ｐｒｏｐｅｒ））の全ての系列を形成する能力を意味する。例えば、胚性幹細胞は、３つの胚葉、外胚葉、中胚葉、および内胚葉のそれぞれから細胞を形成することができる多能性幹細胞の一種である。本明細書で使用される場合、「多分化能」という用語は、成体幹細胞の、１つの系列の多数の細胞型を形成する能力を指す。例えば、造血幹細胞は、血液細胞系列の全ての細胞、例えば、リンパ系細胞および骨髄性細胞を形成することができる。

本明細書で使用される場合、「前駆体」または「前駆細胞」という用語は、自己再生する能力、およびより成熟した細胞に分化する能力を有する細胞を指す。多くの前駆細胞は単一の系列に沿って分化するが、かなり大規模な増殖能力を有する可能性がある。

造血幹細胞（ＨＳＣ）は、生物体の生存期間にわたって成熟血液細胞のレパートリー全体を生成することができる拘束された造血前駆細胞（ＨＰＣ）を生じさせる。「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、骨髄系列（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系列（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、および当技術分野で公知のその他の系列を含めた、生物体の血液細胞の種類の全てを生じさせる多分化能幹細胞を指す（Ｆｅｉ， Ｒ．ら、米国特許第５，６３５，３８７号；ＭｃＧｌａｖｅら、米国特許第５，４６０，９６４号；Ｓｉｍｍｏｎｓ， Ｐ．ら、米国特許第５，６７７，１３６号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、米国特許第５，７５０，３９７号；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、米国特許第５，７５９，７９３号；ＤｉＧｕｉｓｔｏら、米国特許第５，６８１，５９９号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、米国特許第５，７１６，８２７号を参照されたい）。致死的に放射線照射した動物またはヒトに移植すると、造血幹細胞および前駆細胞は赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球およびリンパ系の造血細胞プールを再配置させることができる。

好ましい実施形態では、形質導入される細胞は、骨髄、臍帯血、または末梢循環から単離された造血幹細胞および／または前駆細胞である。特に好ましい実施形態では、形質導入される細胞は、骨髄、臍帯血、または末梢循環から単離された造血幹細胞である。

本発明の細胞は、自己由来／自源性（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）（「自己」）であっても非自己由来（「非自己」、例えば、同種異系、同系または異種）であってもよい。「自己由来」とは、本明細書で使用される場合、同じ被験体由来の細胞を指す。「同種異系」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞とは遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。「同系」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞と遺伝的に同一である、異なる被験体の細胞を指す。「異種」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞とは異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、本発明の細胞は同種異系のものである。

「被験体」とは、本明細書で使用される場合、本明細書の他の箇所で開示されている遺伝子療法ベクター、細胞に基づく治療薬、および方法を用いて治療することができる副腎脳白質ジストロフィまたは副腎脊髄神経障害の症状を示す任意の動物を包含する。適切な被験体（例えば、患者）としては、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、農場動物、および家畜動物または愛玩動物（例えば、ネコまたはイヌなど）が挙げられる。非ヒト霊長類、および好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な被験体としては、遺伝子療法によって調節することができる１つまたは複数の生理的活性の量が異常である（「正常な」または「健康的な」被験体よりも少量または多量である）動物が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、疾患または病的状態の症状または病態に対する任意の有益なまたは望ましい効果を包含し、また、治療されている疾患または状態の１種または複数種の測定可能なマーカーの最低限の減少でさえ含んでよい。治療は、場合によって、疾患もしくは状態の症状の軽減もしくは改善、または疾患もしくは状態の進行の遅延を含んでよい。「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、必ずしも疾患もしくは状態、またはそれに付随する症状の完全な根絶もしくは治癒を示すものではない。

本明細書で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」および同様の単語、例えば、「予防される（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」などは、疾患または状態の発生または再発を予防するため、阻害するため、またはその可能性を低下させるための手法を指す。この用語は、疾患もしくは状態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは状態の症状の発生もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用される場合、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」および同様の単語は、疾患または状態が発症または再発する前に、疾患または状態の強さ、影響、症状および／または負荷を軽減することも包含する。

本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含めた有益なまたは所望の予防結果または治療結果を実現するためのウイルスまたは形質導入された治療用細胞の「有効な量（ａｎ ａｍｏｕｎｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」または「有効量（ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」を指す。

「予防有効量」とは、所望の予防結果を実現するために有効なウイルスまたは形質導入された治療用細胞の量を指す。必ずではないが一般には、予防的な用量は疾患の前に、または疾患のより早い段階で被験体に用いられるので、予防有効量は治療有効量よりも少ない。

ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の「治療有効量」は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに、幹細胞および前駆細胞の個体における所望の応答を引き出す能力などの要因に応じて変動してよい。治療有効量は、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞のいかなる毒性の影響または有害な影響よりも治療的に有益な影響が上回る量でもある。「治療有効量」という用語は、被験体（例えば、患者）を「治療する」ために有効な量を包含する。

好ましい一実施形態では、本発明は、脳小膠細胞に発生する潜在性を有する形質導入された細胞を提供する。特定の実施形態では、造血幹細胞を、本発明のベクターを用いて形質導入し、副腎脳白質ジストロフィまたは副腎脊髄神経障害に対する療法を必要とする個体に投与する。造血幹細胞は脳小膠細胞を起源とし、したがって好ましい。

形質導入された細胞は、骨髄切除療法を受けた個体または受けていない個体において骨髄移植片の一部として投与することができる。一実施形態では、骨髄移植片中の本発明の形質導入された細胞を、化学的切除（ｃｈｅｍｏａｂｌａｔｉｖｅ）または放射線切除（ｒａｄｉｏａｂｌａｔｉｖｅ）骨髄療法を受けた個体に投与する。好ましい実施形態では、被験体は若年男性である。

一実施形態では、ある用量の形質導入された細胞を被験体の静脈内に送達する。好ましい実施形態では、形質導入された造血幹細胞を被験体に静脈内投与する。

特定の実施形態では、患者は、１ｋｇ当たり細胞約１×１０^５個、１ｋｇ当たり細胞約５×１０^５個、１ｋｇ当たり細胞約１×１０^６個、１ｋｇ当たり細胞約２×１０^６個、１ｋｇ当たり細胞約３×１０^６個、１ｋｇ当たり細胞約４×１０^６個、１ｋｇ当たり細胞約５×１０^６個、１ｋｇ当たり細胞約６×１０^６個、１ｋｇ当たり細胞約７×１０^６個、１ｋｇ当たり細胞約８×１０^６個、１ｋｇ当たり細胞約９×１０^６個、１ｋｇ当たり細胞約１×１０^７個、１ｋｇ当たり細胞約５×１０^７個、１ｋｇ当たり細胞約１×１０^８個、またはそれ以上の用量の形質導入された造血幹細胞を１回の単回静脈内用量で受ける。ある特定の実施形態では、患者は、１ｋｇ当たり細胞約１×１０^５個〜１ｋｇ当たり細胞約１×１０^８個、１ｋｇ当たり細胞約１×１０^６個〜１ｋｇ当たり細胞約１×１０^８個、１ｋｇ当たり細胞約１×１０^６個〜１ｋｇ当たり細胞約９×１０^６個、１ｋｇ当たり細胞約２×１０^６個〜１ｋｇ当たり細胞約８×１０^６個、１ｋｇ当たり細胞約２×１０^６個〜１ｋｇ当たり細胞約８×１０^６個、１ｋｇ当たり細胞約２×１０^６個〜１ｋｇ当たり細胞約５×１０^６個、１ｋｇ当たり細胞約３×１０^６個〜１ｋｇ当たり細胞約５×１０^６個、１ｋｇ当たり細胞約３×１０^６個〜１ｋｇ当たり細胞約４×１０^８個、または間の任意の１ｋｇ当たりの細胞数の用量の形質導入された造血幹細胞を受ける。

形質導入された細胞を拡大させるために、当技術分野における既存の方法を用いてサイトカインで刺激することができる。種々の実施形態では、必要に応じて療法を維持するまたは増大させるために、被験体に１、２、３、４、５、またはそれ以上の用量を数日、数カ月、または数年にわたって投与する。

特定の実施形態では、造血幹細胞を、被験体における副腎脳白質ジストロフィおよび／または副腎脊髄神経障害を治療、予防または改善するために用いることができるポリペプチド、例えば、ＡＢＣＤ１をコードする遺伝子に作動可能に連結した、小膠細胞において活性なプロモーター、例えば、ＭＮＤプロモーターを含む本発明のベクターを用いて形質導入する。

ここで、本発明を以下の実施例によってより詳細に説明する。しかし、本発明は多くの異なる形態で具体化されてよく、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全なものになるよう、また本発明の範囲が当業者に完全に伝わるように提供される。

（実施例１）
ＷＰＲＥを伴うまたは伴わないＡＢＣＤ１レンチウイルスベクターを使用した、正常なヒト造血幹細胞における遺伝子形質導入の比較
実験の概要：
ヒトＡＣＢＤ１をコードするｃＤＮＡに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、ＷＰＲＥエレメント（図１参照；ＣＧ１７１１ ＭＮＤ−ＡＬＤ）ベクターとを含むレンチウイルスベクターは、商業的開発のためには入手不可能である。結果として、出願人らは、今後の臨床試験に進めるための適切なレンチウイルスベクターを同定するためにベクター開発プログラムを行った。ベクター開発プログラムの結果として商業的に許容されるベクターが作出され、ＭＮＤプロモーターに作動可能に連結したＡＢＣＤ−１遺伝子は変更しなかった。驚いたことに、ベクターからＷＰＲＥを除去することにより、ヒト造血細胞における形質導入の効率および導入遺伝子の発現は変更されなかった。造血細胞に対する以下の一連の実験は、ＷＰＲＥの存在に関して異なる２種のＭＮＤ−ＡＬＤベクター、ｐＬＢＰ１００（図１および配列番号１参照；ＷＰＲＥが除去されている）およびｐＬＢＰ１４０（図１参照；機能性ＷＰＲＥを有する）を比較するために短期および長期の前駆体アッセイを用いて実施した。

レンチウイルスベクター構築物
レンチウイルスベクターは全て、ＭＮＤプロモーターの制御下にある正常なヒトＡＴＰ結合性カセット、サブファミリーＤ（ＡＬＤ）、メンバー１（ＡＢＣＤ１）のｃＤＮＡを含有した。図１および表１に、ＣＧ１７１１ ＭＮＤ−ＡＬＤベクター、ｐＬＢＰ１００ ＭＮＤ−ＡＬＤベクターおよびｐＬＢＰ１４０ ＭＮＤ−ＡＬＤベクターの種々の構成成分およびそれらの位置が要約されている。

形質導入
レンチウイルスのｐＬＢＰ１００およびｐＬＢＰ１４０の上清を、５−プラスミド（ｐＬＢＰ１００ベクターまたはｐＬＢＰ１４０ベクター、ＨＰＶ２７５−ｇａｇ−ｐｏｌ、ΨＮ１５−ＶＳＶ−Ｇ ｅｎｖ、ｐ６３３−ｒｅｖ、ＨＰＶ６０１−ｔａｔ）を用いた２９３Ｔ細胞のリン酸カルシウムトランスフェクションによって作製した。超遠心後に濃縮ｐＬＢＰ１００を得、ＳＣＧＭ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｙ ＧＭＢＨ）培地に再懸濁させ、使い捨てのクライオバイアル中、＜−７０℃で凍結保存した。形質導入された３Ｔ３細胞のフローサイトメトリー分析から感染力価を決定した。

ヒト造血幹細胞の形質導入についてのｐＬＢＰ１００レンチウイルスベクターとｐＬＢＰ１４０レンチウイルスベクターの比較を、表２に要約されている４つの別々の実験の間で実施した。実施した実験についての手順およびアッセイはそれぞれ図２および図３に例示されている。

新鮮なヒト骨髄（ＢＭ）ＣＤ３４^＋細胞（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）または新鮮なもしくは凍結保存されたヒトＧ−ＣＳＦ動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４^＋細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、ＬＬＣ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を洗浄し、ヒト組換えＩＬ−３（６０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＳＣＧＭ中、１ｍＬ当たり細胞１×１０^６個の細胞濃度で１８時間培養した。

次いで、細胞を取り出し、洗浄し、単一の（実験０８０６１０）または３連の（実験０７２０１０、０８１０１０および０９１４１０）平底９６ウェルのウェルプレート中２００μＬ体積に、ＳＣＧＭ（モック対照）、または同じ濃度のサイトカイン、およびウイルスを添加した８μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンを補充した８．６〜２５のＭＯＩ（最終的な力価１．７〜５．０×１０^７ＴＵ／ｍｌ）のｐＬＢＰ１００またはｐＬＢＰ１４０の上清中１ｍＬ当たり細胞２×１０^６個の濃度で再懸濁させた。実験０８０６１０では、２０μｇ／ｍＬのレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を用いて予めコーティングした９６ウェルプレートにおいて４℃で一晩のインキュベーションを伴って形質導入を実施した。

短期の前駆体アッセイ
ウイルスを添加した２４時間後に、細胞を洗浄し、（１）同じ濃度のサイトカインを補充したＳＣＧＭ培地に再懸濁させ、さらに２１日間インキュベートしたか、または（２）コロニー形成細胞（ＣＦＣ）のためにＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｈ４４３４培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１−培養した。

全ての骨髄系コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）および赤血球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）を１４日目に計数し、細胞をＰＢＳに懸濁させ、洗浄し、ＤＮＥＡＳｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してゲノムＤＮＡを調製した（生存細胞１〜２×１０^６個）。

長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイ
９６ウェルプレート８個に、１０％ウシ胎仔血清を補充したアルファ培地中のマウス骨髄間質細胞系ＭＳ−５を播種し、ほぼコンフルエントになったところでガンマ線照射した（３０Ｇｙ）。

照射した２日後に、予め樹立したＭＳ−５間質層に、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（無血清培地、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）２００μＬ中のヒトＣＤ３４＋試験細胞を、種々の希釈、希釈当たり１６ウェル（１６ウェル中の１ウェル当たり細胞２０００個、１６ウェル中の１ウェル当たり細胞１０００個、１６ウェル中の１ウェル当たり細胞５００個、１６ウェル中の１ウェル当たり細胞２５０個、１６ウェル中の１ウェル当たり細胞１２５個、１６ウェル中の１ウェル当たり細胞６２個、１６ウェル中の１ウェル当たり細胞３１個、１６ウェル中の１ウェル当たり細胞１６個、１６ウェル中の１ウェル当たり細胞８個）で播種した。さらなるＣＤ３４＋細胞１００，０００個をＭＳ−５フィーダー細胞上で５週間にわたりバルクで培養した。毎週、培地１００μＬを新鮮なＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ１００μＬと交換した。５週間後に、培養物を収集し、次いで、コロニーを１４日間成長させるために全内容物をＭｅｔｈｏｃｕｌｔ（商標）ＧＦ＋Ｈ４４３４に播いた（１２ウェルプレートのウェル当たりメチルセルロース５００μＬ）。次いで、個々のコロニーを選び出し、その後のベクターのｇａｇ配列を対象とするプライマーおよび抽出後のゲノムＤＮＡの存在を証明する陽性対照を有するためにゲノム配列（Ｅｐｏ遺伝子）を対象とするプライマーを使用したＰＣＲ分析のためにＤＮＡを抽出した（ＳＯＰ＃ＧＴＸ／ＲＥ／ＰＢＭ／Ｍ−０２３およびＬＴＧＣ／ＲＥ／ＰＢＭ／Ｍ−０７）。ＬＴＣ−ＩＣの頻度および９５％信頼区間を、Ｌ−ｃａｌｃソフトウェア、バージョン１．１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して計算した。

ベクターのコピー数（ＶＣＮ）の決定
ＰＢＳで希釈し洗浄した後の、液体培養物またはメチルセルロース培養物中にプールしたコロニー細胞由来のＤＮＡの調製物に対する定量的（リアルタイム）ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）から細胞当たりの平均ＶＣＮを決定した。ＱＰＣＲはＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍで、ＡＢＩ試薬および９６ウェル−プレートを使用して実施した。

ベクターを定量化するために使用したヒトｇａｇプローブおよびプライマー：

正規化するためのゲノムＤＮＡを定量化するために使用したヒトベータアクチンプローブおよびプライマー：

溶出したゲノムＤＮＡ（およそ５０〜１００ｎｇ）の１／１００を、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎプログラムおよび初期設定のサーマルサイクリングプログラムを用い、２５μｌの反応において１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、０．７２μＭの各プライマーおよび０．３５μＭのプローブを使用してアッセイした。

フローサイトメトリーによる導入遺伝子の発現
ＡＢＣＤ１（ＡＬＤＰ）タンパク質の発現を、固定し透過処理した細胞（Ｆｉｘ＆Ｐｅｒｍ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ＡおよびＢ、ｃａｔ番号ＧＡＳ００１＆ＧＡＳ００２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、マウス抗ヒトＡＬＤＰ（ＡＢＣＤ１）モノクローナル抗体（クローン１Ｄ６、ロット番号ＬＶ１３８３３４３、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用し、その後、ＰＥとコンジュゲートしたラット抗マウスＩｇＧ１ ｍＡｂ（クローンＡ８５−１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて染色して実施した。マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体クローンＭＯＰＣ−２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）をアイソタイプ対照として使用した。

統計分析
各実験内の群の値の比較を、両側ノンパラメトリックマンホイットニーＵ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．３．０）を使用して十分なサンプルサイズ（ｎ＝≧３）で分析した。群間の有意性を０．０５未満のｐ値で決定した。

結果：
前駆細胞の頻度に対する影響
機能的な骨髄系前駆体（ＣＦＵ−ＧＭ）および赤血球前駆体（ＢＦＵ−Ｅ）の収率を図４における４つの実験全てについて比較し、実験の第１のセット（実験０７２０１０、０８１０１０および０９１４１０）における３連の形質導入についてｐＬＢＰ１００の上清またはｐＬＢＰ１４０の上清を添加することの有意な影響は示されなかった。単一の形質導入について６セットのメチルセルロース培養物を比較した実験の第２のセット（実験０８０６１０）については、ｐＬＢＰ１００を添加すると骨髄系前駆体の有意な増大が観察されたが、ｐＬＢＰ１００で処理した後に赤血球コロニーの収率には有意な減少が見られ、ｐＬＢＰ１４０を用いて形質導入した後にさらに減少した。

より原始的なＬＴＣ−ＩＣの頻度は、２つのレンチウイルスベクターを用いた形質導入後には平均して低かったが（図５）、９５％信頼区間が重複したのでこれらの差は有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。

ベクターＰＣＲによる形質導入の効率
液体培養物中で３５日にわたって維持した細胞から単離されたゲノムＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析により、実験の第２のセットにおいて、全ての時点で、ｐＬＢＰ１００についての推定ベクターのコピー数（ＶＣＮ）がｐＬＢＰ１４０と比較して多いことが示された（図６Ａ）。

これは、メチルセルロース培養物中で成長しているプールしたＣＦＣについての平均ＶＣＮが多いことおよび同じ実験からのパーセントベクター陽性骨髄系コロニーにも反映された（図６ＢおよびＣ）。しかし、実験の第１のセットの３連の実験の間での比較では、プールしたコロニーのＶＣＮまたはベクターについて陽性の試験コロニーのパーセントに有意差は示されなかった。

図７は、ベクター群のどちらについても５週間のＬＴＣ−ＩＣ後に平均ＶＣＮおよびパーセントベクター陽性骨髄系コロニーが減少し、再度、ｐＬＢＰ１００を用いて形質導入された細胞がより高いＶＣＮ（１．１コピー対０．４コピー）および陽性コロニーの割合（５１％対３５％）を有することを示す。

フローサイトメトリーによるＡＬＤＰ導入遺伝子の発現
抗ＡＬＤＰ抗体を使用して細胞内染色した細胞の蛍光プロファイルの例が図８Ａ１および図８Ａ２のヒストグラムに示されており、それからパーセント陽性（それぞれのモック対照の０．５％を超えたもので決定）および蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値の比を決定し、それが図８ＢおよびＣに示されている。導入遺伝子の発現のレベルは、実験間で変動し、実験０７２０１０および０８０６１０では、発現している細胞の平均パーセントがｐＬＢＰ１００についてｐＬＢＰ１４０群と比較して高かった。しかし、実験０９１４１０では逆のことが観察され、実験０８１０１０では匹敵するレベルであった。３連の実験間での統計比較により、パーセントＡＬＤＰ^＋細胞にもＭＦＩにも有意差は示されなかった（ｐ＞０．０５）。

結論：
前臨床的なｐＬＢＰ１００レンチウイルスベクターの調製物２つおよびｐＬＢＰ１４０ベクターを含有するＷＰＲＥの調製物３つを使用し、骨髄またはＧＣＳＦ動員末梢血に由来する正常なヒトＣＤ３４^＋細胞の形質導入を伴う４つの別々の実験間の比較を実施した。実験０８０６１０における骨髄系前駆体の増大および赤血球前駆体の減少は例外として、初期の前駆体またはより原始的なＬＴＣ−ＩＣのいずれについても上清の有意な毒性はなかった。平均ＶＣＮまたはベクターを含有する骨髄系コロニーまたはＬＴＣ−ＩＣの割合によるとｐＬＢＰ１４０について形質導入の効率が低い傾向があったが、これは、十分なサンプルサイズ（ｎ＝３）のこれらの実験に関しては統計的に有意ではなかった。２つのベクターによりもたらされた導入遺伝子の発現のレベルにより、ｐＬＢＰ１００由来のＡＬＤＰ^＋細胞のパーセントが高いことを示す２つの実験とパーセントがｐＬＢＰ１４０と比較して低いことを示す１つの実験を伴う混在する結果が生じた。これらの差は統計的に有意ではなかった。

全体的に、ＷＰＲＥをＭＮＤ−ＡＬＤベクターに加えることの利点はないと思われる。したがって、本発明のベクターは、ＷＰＲＥを含有するベクターと比較して増大した安全性および同等の優れた有効性を提供する。さらに、結果は、本発明のベクターがさらなる開発および臨床的な適用によく適合することを示している。

（実施例２）
ＡＬＤ欠損初代ヒト線維芽細胞におけるＡＬＤタンパク質欠乏の機能的補正の評価
実験の概要
非常に長鎖の脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）、特にＣ２６鎖の蓄積は、多くの場合、ＡＬＤの生化学的「特徴」と称される。Ｈｕｂｂａｒｄ、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． Ｍｅｔａｂ． ９７巻：２１２〜２２０頁（２００９年）。欠損細胞にＡＢＣＤ１のｃＤＮＡを含有するレトロウイルスベクターを用いて形質導入することにより、機能的なＡＬＤタンパク質（ＡＬＤＰ）レベルが回復し、ＶＬＣＦＡのレベルが低下する。これは、ＡＬＤ患者由来の初代線維芽細胞株を含めた種々の細胞集団において示されている。

Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｋｒｉｅｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）において開発されたＣ２６：０ ｌｙｓｏ−ＰＣアッセイ（ＬＰＣアッセイ）では、液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分光測定によってＶＬＣＦＡを測定する。この方法は、新生児の血斑のために開発され、血漿および培養した皮膚線維芽細胞に対して検証もされた。本実施例では、Ｃ２６：０ ｌｙｓｏ−ＰＣアッセイを用いて、ＡＬＤ患者の線維芽細胞における生化学的欠損の機能的補正を実証した。この実験の目的は、ベクターにより改変されたＡＬＤ欠損線維芽細胞におけるＶＬＣＦＡレベルの低下におけるベクターｐＬＢＰ１００（ｐ１００）およびｐＬＢＰ１４０（ｐ１４０）の有効性を比較することであった。

細胞株
初代ヒト線維芽細胞であるＧＭ０４４９６およびＡＧ０１４４０をＣｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）から入手した。ＧＭ０４４９６細胞は、ＡＢＣＤ１遺伝子の未知の突然変異を有するＡＬＤ陰性患者から単離された形質転換されていないヒト線維芽細胞である。ＡＧ０１４４０細胞は正常なヒト線維芽細胞である。細胞を、加湿したインキュベーターの中で、１５％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を伴うＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中、３７℃、５％ＣＯ２で成長させた。

ＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｕｍｂｅｒ ＣＲＬ−２００３（商標））は骨髄赤白血病に由来するヒトリンパ芽球株である。細胞を、１０％ＦＢＳを伴うＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で成長させた。

レンチウイルスベクターを作製するために使用する２９３Ｔ細胞（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を、１０％ＦＢＳを伴うＤＭＥＭ中で成長させた。

形質導入プロトコールおよびＬｙｓｏ−ＰＣアッセイのためのプレーティング
サブコンフルエントの細胞に、培地＋８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ Ｂｒｏｍｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）中のウイルスの上清を用いて１４〜１６時間にわたって形質導入した。次の日に新鮮な培地と交換した。早ければ形質導入の３日後に、大多数の細胞を１２ウェルプレートに３連でプレーティングした（脂質抽出用に２つの反復およびタンパク質分析用に１つの反復（Ｆａｌｃｏｎ＃３５−３０４３））。同等数の正常な対照細胞（２９３Ｔ、ＡＧ０１４４０またはＴＦ−１）もプレーティングまたはペレットにした。細胞の単層を１×ＨＢＳＳ緩衝液（ＧＩＢＣＯ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２回洗浄し、ｉｎ ｓｉｔｕ、−２０℃で凍結させた。凍結方法は最初にＫｅｎｎｅｄｙ Ｋｒｉｅｇｅｒにおいて検定し、新鮮な細胞単層を収集することに匹敵することが決定された。残りの細胞を培養物中で保持した。

ゲノムＤＮＡの単離およびベクターのコピー数（ＶＣＮ）の決定
ＬＰＣアッセイのためにプレーティングした後に残った細胞を、ＤＮＡを単離し、ＶＣＮを分析するためのゲノムＤＮＡを収集するために、形質導入の少なくとも９日後まで培養物中で保持した。脂質およびタンパク質の抽出をＫｅｎｎｅｄｙ Ｋｒｉｅｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて完了した。

結果：
４４９６細胞および種々の正常対照および陰性対照のＬｙｓｏ−ＰＣ分析
４４９６細胞および正常な線維芽細胞１４４０細胞を分析のためにプレーティングした。ＴＦ−１細胞および２９３細胞において、免疫染色およびフローサイトメトリーによってＡＬＤＰが検出可能であった。したがって、これらの細胞も、Ｃ２６：０ＬＰＣのベースラインレベルについての代替の陽性（すなわち、正常なＡＬＤＰ−表現型）対照としてアッセイした。試料を４つの独立した分析でアッセイした。

Ｃ２６：０ＬＰＣのベースラインレベルは、正常な表現型を有する細胞においてタンパク質１ｍｇ当たり３〜５０ｐｍｏｌにわたり、各分析において４４９６細胞のレベルは上昇していた。全体的に、通常の細胞におけるＣ２６：０ＬＰＣのレベルには、４４９６と比較して少なくとも５倍の差異（０．２を下回る比）が存在した。この比は、患者の血斑について報告された結果と同様であった。

ｐ１００を用いて形質導入された４４９６細胞とｐ１４０を用いて形質導入された４４９６細胞の比較
４４９６細胞に、ｐ１００およびｐ１４０を用いて形質導入した。細胞を、本明細書に記載の通りＶＬＣＦＡおよびＶＣＮについて分析した。ＬｙｓｏＰＣアッセイ結果は表３に示されている。２連のウェルを平均し、モック形質導入された細胞に対して正規化した。モックに対するＶＬＣＦＡ補正の比対ＶＣＮが図１０に示されている。ＶＣＮが≦１コピーまで減少すると、細胞集団は、形質導入されていない細胞と、細胞当たり１つまたは２つのベクターコピーを有する細胞の混合物であることが予想され、したがって、ＶＬＣＦＡは減少することが予想される（図１０）。

０．２の比を、モック形質導入された４４９６細胞と比較した正常な表現型を有する細胞のレベルとして確立した。ＶＣＮが≧約１．５である場合、両方のベクターについて、４４９６細胞におけるＶＬＣＦＡの蓄積が通常の細胞のレベルまで補正される。ＶＣＮが１．０〜０．６では両方のベクターで補正の減少の傾向が存在する。

結論：
Ｃ２６：０ｌｙｓｏ−ＰＣアッセイをＫｅｎｎｅｄｙ Ｋｒｉｅｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて実施し（Ｈｕｂｂａｒｄ ２００９年）、液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分光光度法によってＶＬＣＦＡを測定し、ＡＬＤ患者の細胞株ＧＭ０４４９６細胞におけるＣ２６の蓄積の生化学的欠損が確認された。ｐ１００およびｐ１４０を用いて形質導入した後、細胞はフローサイトメトリーによって実証された通りＡＬＤＰ発現について陽性であり（データは示していない）、平均ＶＣＮが≧１．５である細胞は、正常な表現型を有する細胞のレベルまでのＶＬＣＦＡ蓄積の完全な補正を示した。ｐ１００を用いて形質導入された細胞とｐ１４０を用いて形質導入された細胞を比較した場合に同等の結果が得られ、これにより、ＷＰＲＥ配列を欠くｐ１００の有効性が裏付けられる。

上記の種々の実施形態を組み合わせて別の実施形態をもたらすことができる。本明細書において参照され、かつ／または本出願データシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。必要であれば、実施形態の態様を、種々の特許、出願および刊行物の概念を用いるように改変して、さらに別の実施形態をもたらすことができる。

これらおよび他の変化は、上記の発明の詳細な説明を踏まえて実施形態に行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、可能性のある実施形態の全てをそのような特許請求の範囲に権利が与えられる等価物の全範囲と一緒に包含するものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示により限定されない。

Claims (17)

1. ５’から３’に
   （ａ）左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、
   （ｂ）中心ポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、
   （ｃ）レトロウイルス輸送エレメントと、
   （ｄ）ＡＴＰ結合性カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、小膠細胞において活性な、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、およびｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターと、
   （ｅ）右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲと、
   を含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）もＢ型肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント（ＨＰＲＥ）も含まないベクター。
2. レンチウイルスベクターである、請求項１に記載のベクター。
3. 前記レンチウイルスがＨＩＶである、請求項２に記載のベクター。
4. 前記レンチウイルスがＨＩＶ−１である、請求項２に記載のベクター。
5. 前記５’ＬＴＲのプロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターからなる群より選択された異種プロモーターと置き換えられている、請求項１に記載のベクター。
6. 前記３’ＬＴＲが自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲである、請求項１に記載のベクター。
7. 前記ＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項１に記載のベクター。
8. 前記ｃＤＮＡが、最適化されたコザック配列を含む、請求項７に記載のベクター。
9. ５’から３’に
   （ａ）左側の（５’）ＬＴＲと、
   （ｂ）ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、
   （ｃ）ＲＲＥと、
   （ｄ）ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、
   （ｅ）右側の（３’）ＬＴＲと、
   （ｆ）ポリアデニル化配列と、
   を含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）もＢ型肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント（ＨＰＲＥ）も含まないレンチウイルスベクター。
10. プシー（Ψ）パッケージングシグナルをさらに含む、請求項９に記載のレンチウイルスベクター。
11. 前記ポリアデニル化配列がウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルまたはウサギβ−グロビンポリアデニル化配列である、請求項９に記載のレンチウイルスベクター。
12. ５’から３’に
    （ａ）左側の（５’）ＨＩＶ−１ＬＴＲと、
    （ｂ）プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、
    （ｃ）ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、
    （ｄ）ＲＲＥと、
    （ｅ）ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、
    （ｆ）右側の（３’）自己不活性化（ＳＩＮ）ＨＩＶ−１ＬＴＲと、
    （ｇ）ウサギβ−グロビンポリアデニル化配列と、
    を含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）もＢ型肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント（ＨＰＲＥ）も含まないレンチウイルスベクター。
13. ５’から３’に
    （ａ）左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲと、
    （ｂ）中心ポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、
    （ｃ）レトロウイルス輸送エレメントと、
    （ｄ）ＡＴＰ結合性カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、ＭＮＤプロモーターと
    （ｅ）右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲと、
    （ｆ）ポリアデニル化（ポリＡ）配列と、
    を含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）もＢ型肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント（ＨＰＲＥ）も含まないベクター。
14. ５’から３’に
    （ａ）左側の（５’）ＨＩＶ−１ＬＴＲと、
    （ｂ）プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、
    （ｃ）ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰと、
    （ｄ）ＲＲＥと、
    （ｅ）ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに作動可能に連結したＭＮＤプロモーターと、
    （ｆ）右側の（３’）自己不活性化（ＳＩＮ）ＨＩＶ−１ＬＴＲと、
    （ｇ）ポリアデニル化（ポリＡ）配列と、
    を含み、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）もＢ型肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント（ＨＰＲＥ）も含まないレンチウイルスベクター。
15. 請求項１、９、１２、１３、および１４のいずれか一項に記載のベクターを含む哺乳動物細胞。
16. ｇａｇをコードする第１のポリヌクレオチドと、ｐｏｌをコードする第２のポリヌクレオチドと、ｅｎｖをコードする第３のポリヌクレオチドと、請求項１、９、１２、１３、および１４のいずれか一項に記載のベクターとを含む産生細胞。
17. 請求項１、９、１２、１３、および１４のいずれか一項に記載のベクターを含むベクター粒子。