CN108883136A - Vcn增强子组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了改良的基因治疗方法和组合物。在特定实施例中，基因治疗包括具有增大的疗效的造血干细胞和祖细胞组合物以及其制作和使用方法。在其它特定实施例中，本发明设想用于增大人类造血干细胞和祖细胞(HSPC)的转导效率和载体拷贝数(VCN)的组合物和方法，以产生改良的基因治疗组合物。在各个实施例中，本发明部分设想经慢病毒载体转导的HSPC群体。在各个实施例中，本发明设想治疗受试者的镰状细胞病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所设想的造血细胞群体。在各个实施例中，本发明设想一种包括增加前列腺素EP受体信号传导的试剂和星形孢菌素(staurosporine)的试剂盒。

Description

VCN增强子组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年11月3日提交的美国临时申请第62/417,097号、于2016年4月8日提交的美国临时申请第62/320,238号以及于2016年2月12日提交的美国临时申请第62/294,627号在35U.S.C.§119(e)下的权益,所述申请中的每一个申请通过引用方式整体并入本文中。
技术领域
整体而言本发明部分地涉及改良的基因治疗组合物以及产生所述组合物的方法。
背景技术
基因治疗具有引领人类医学新时代的巨大潜力。基因治疗方法将允许治疗尚未通过标准医疗实践解决的病状。然而，食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)仍尚未批准任何人类基因治疗产品用于销售。当前基因治疗是实验性的并且在临床试验中取得的结果有好有坏。Ginn等人，《基因医学杂志(J Gene Med)》2013年以及Naldini等人，《自然综述(Nature Review)》2015年。
在1999年，基因治疗因18岁的Jesse Gelsinger的死亡而遭受重创。那时Jesse正在参与针对鸟氨酸转羧基酶缺乏症(OTCD)的基因治疗试验。在开始治疗4天后，他死于多器官衰竭。他的死被认为是由对腺病毒载体的重度免疫反应触发的。Sibbald等人，《加拿大医学协会杂志(CMAJ)》2001年。
另一次重大打击是在2003年1月，当时FDA向在血液干细胞中使用逆转录病毒载体的所有基因治疗试验发出临时暂停。FDA在得知接受法国基因治疗试验治疗的又一个儿童已经患上白血病类症状之后采取了此行动。Hacein-Bey-Abina等人，《科学(Science)》2003年。这个儿童以及在2002年8月已经患上类似病状的另一个儿童两者已经被基因治疗成功治疗，所述基因治疗针对X连锁重度联合免疫缺陷疾病(X-SCID)，也被称为“气泡男孩综合症”。FDA的生物反应调节剂咨询委员会(BRMAC)于2003年2月底汇合以讨论可能的措施，所述措施可以允许针对危及生命的疾病的治疗的多个逆转录病毒基因治疗试验采取适当的安全措施继续进行。在2003年4月，FDA放松了针对在血液干细胞中使用逆转录病毒载体的基因治疗试验的禁令。
然而，最近，几个小组已经在对抗几种疾病中实施了相当成功的基因治疗试验。在2008年，来自伦敦大学学院眼科学研究所以及Moorfields眼科医院NIHR生物医学研究中心的英国研究人员宣布了针对治疗Leber's先天性黑内障，一种遗传性失明的成功基因治疗临床试验。结果显示实验性治疗是安全的而且可以提高视力(Maguire等人，《新英格兰医学杂志(N Engl J Med.)》第358卷，第21期，第2240页(2008年))。
在2009年，一组法国科学家报告使用造血干细胞调节的基因治疗成功地治疗了X连锁肾上腺脑白质营养不良(ALD)。Cartier等人，《科学(Science)》2009年。将自体干细胞从患者除去，进行离体基因校正，并且然后在他们已经接受了清髓性治疗之后，将所述自体干细胞重新注入患者。在历时24到30个月的随访期间，检测到多克隆重组，其中粒细胞、单核细胞以及T淋巴细胞和B淋巴细胞的9％到14％表达ALD蛋白质。这些结果有力地表明在患者中转导了造血干细胞。在注入基因校正细胞之后的14到16个月开始，两名患者的进行性脑脱髓鞘停止。
在2011年，Neurologix公司在其针对晚期帕金森病(Pd)的试验性基因治疗NLX-P101的2阶段试验中宣布了阳性结果。与接受假手术的对照受试者相比，接受了NLX-P101的研究参与者在停药运动评分方面取得了统计学上显著且临床上有意义的改良。在试验中，这个益处在一个月处出现，并且在整个六个月盲法研究期间几乎持续不变。结果还证明了针对NLX-P101的阳性安全分布，并且未报道关于基因治疗或外科手术的严重不良事件。试验征选的患者患有中期到晚期PD而且未充分响应当前疗法。
基因治疗领域的最新进展已经产生了罹患如β地中海贫血和镰状细胞贫血等血红蛋白病的患者将受益于新型治疗方法的希望。Cavazzana-Calvo等人，《自然(Nature)》2010年。经改性的携带β珠蛋白基因的慢病毒载体的造血细胞(HSC)的移植已经导致血红蛋白病症的几个小鼠模型的长期修复，例如Imren等人，《美国国家科学院院刊(Proc Natl AcadSci USA)》，2002年，第99卷，第22期：第14380页到14385页；Malik等人，《纽约科学学院学报(Ann NY Acad Sci)》，2005年；第1054卷：第238页到249页，May等人，《自然(Nature)》，2000年；第406卷，第6791期：第82页到86页；Pawliuk等人，《科学(Science)》，2001年；第294卷，第5550期：第2368页到2371页。
尽管注入遗传修饰的自体细胞的主要优点是避免GVHD和免疫抑制移植前病状的风险以及解决兼容供体缺乏，当前疗法面临至少三个实质性的警告：针对有毒清髓的要求(Dunbar等人，《人类基因治疗(Hum Gene Ther)》，1998年；第9卷，第17期，第2629页到2640页)；当前基因转移方法不能够转导超过一部分造血干细胞(HSC)(Santoni de Sio和Naldini，《分子生物学方法(Methods Mol Biol)》，2009年；第506卷，第59页到70页)；转导的HSC的载体拷贝数量常常位于针对疗效的较低端处；并且可用的各种体内选择策略遭受次优功效和安全性(Beard等人，《临床研究杂志(J Clin Invest)》，2010年；第120卷，第7期，第2345页到2354页；Cometta等人，《癌症基因治疗(Cancer Gene Ther)》，2006年；第13卷，第9期，第886页到895页；Milsom等人《癌症研究(Cancer Res)》，2008年；第68卷，第15期，第6171页到6180页)。
当前，在研究和临床小组中使用大量的方案将慢病毒基因治疗载体引入靶细胞。历史上，已经在各种细胞类型中使用不同策略实现高效基因转移。然而，这些涉及使用佐剂治疗的策略中的大部分，例如聚阳离子、阳离子脂质体、凝聚胺对细胞有毒，限制其与像造血干细胞和祖细胞等主要来源的敏感靶细胞一起使用。
已知造血干细胞和祖细胞非常难以有效转导，并且因此，低效转导是阻止HSC基基因治疗进入临床的主要限制性因素之一。低效转导还增加发展基因治疗的费用，因为需要大量载体以产生必需量的已转导细胞。因此，不仅会增大造血干细胞的转导效率并且祖细胞提供定量临床益处，而且它会减小产生药产品所需要的病毒的量并且因此减小临床试验的成本。
发明内容
本文设想改良的基因治疗。在特定实施例中，基因治疗包括具有增大的疗效的造血干细胞和祖细胞组合物以及其制作和使用方法。在其它特定实施例中，本发明设想用于增加人类造血干细胞和祖细胞(HSPC)的转导效率和VCN的组合物和方法以产生改良的基因治疗组合物。
在各个实施例中，本发明部分设想一种经过慢病毒载体转导的造血干细胞和祖细胞(HSPC)群体，其中所述HSPC的至少50％被转导并且其中所述HSPC具有约0.5到5的平均载体拷贝数(VCN)。
在特定实施例中，所述慢病毒载体以约10到约30的感染复数(MOI)转导所述HSPC。
在特定实施例中，所述慢病毒载体以约10到约25的感染复数(MOI)转导所述HSPC。
在特定实施例中，所述慢病毒载体以约10到约20的感染复数(MOI)转导所述HSPC。
在一些实施例中，所述MOI是约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30。
在特定实施例中，所述HSPC包括CD34+细胞或CD133+细胞。
在某些实施例中，所述HSPC包括CD34+CD38LoCD90+CD45RA-细胞。
在其它实施例中，所述细胞的至少75％已被转导。
在其它实施例中，所述细胞的至少90％已被转导。
在特定实施例中，所述平均VCN是至少1.0。
在特定实施例中，所述平均VCN是至少1.5。
在特定实施例中，所述平均VCN是至少2.0。
在特定实施例中，所述平均VCN是至少2.5。
在某些实施例中，所述细胞群体的活力是至少75％。
在其它实施例中，所述细胞群体的活力是至少85％。
在其它实施例中，所述细胞群体的活力是至少95％。
在进一步实施例中，所述造血细胞群体的内毒素水平是至多5.0EU/mL。
在某些实施例中，所述造血细胞群体的内毒素水平是至多0.5EU/mL。
在其它实施例中，所述细胞群体包括至少1×106个HSPC细胞。
在特定实施例中，所述细胞群体包括至少1×107个HSPC细胞。
在特定实施例中，所述细胞群体包括至少1×108个HSPC细胞。
在一些实施例中，所述细胞群体包括至少1×109个HSPC细胞。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽。
在进一步实施例中，所述慢病毒载体包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子或其转录活性片段，其可操作地连接于编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸。
在某些实施例中，所述慢病毒载体编码腺苷脱氨酶。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码腺苷脱氨酶的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
在某些实施例中，所述慢病毒载体编码白细胞介素2受体γ。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码白细胞介素2受体γ的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码三肽基肽酶1。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码三肽基肽酶1的多核苷酸。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码α-L艾杜糖醛酸酶。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码α-L艾杜糖醛酸酶的多核苷酸。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶的多核苷酸。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括人类β-珠蛋白LCR的一个或多个元件。
在一些实施例中，所述人类β-珠蛋白LCR包括来自所述人类β-珠蛋白LCR的DNaseI超敏感位点2、3和4。
在特定实施例中，所述慢病毒载体进一步包括人类β-珠蛋白3'增强子元件。
在其它实施例中，所述目的基因编码抗镰状蛋白或珠蛋白基因。
在特定实施例中，所述目的基因编码人类β-珠蛋白蛋白质、人类δ-珠蛋白蛋白质、人类γ-珠蛋白蛋白质、人类βA-T87Q-珠蛋白蛋白质、人类βA-G16D/E22A/T87Q-珠蛋白蛋白质或人类βA-T87Q/K95E/K120E-珠蛋白蛋白质。
在特定实施例中，所述慢病毒载体是AnkT9W载体、T9Ank2W载体、TNS9载体、lentiglobin HPV569载体、lentiglobin BB305载体、BG-1载体、BGM-1载体、d432βAγ载体、mLARβΔγV5载体、GLOBE载体、G-GLOBE载体、βAS3-FB载体、V5载体、V5m3载体、V5m3-400载体、G9载体以及BCL11A shmir载体。
在各个实施例中，本发明部分设想一种造血细胞群体，其包括经慢病毒转导的造血干细胞和祖细胞(HSPC)，其中所述造血细胞群体包括至少85％HSPC，其中所述HSPC的至少50％被转导，其中所述HSPC具有约0.5到约5.0的平均载体拷贝数(VCN)，其中所述细胞群体的活力是至少75％，其中所述造血细胞群体的内毒素水平是约0.5EU/mL到约5.0EU/mL，并且其中所述造血细胞群体包括至少1×106个HSPC。
在各个实施例中，本发明部分设想一种造血细胞群体，其包括经慢病毒转导的CD34+CD38LoCD90+CD45RA-细胞，其中所述CD34+CD38LoCD90+CD45RA-细胞的至少50％被转导，其中所述CD34+CD38LoCD90+CD45RA-细胞具有约0.5到约5.0的平均VCN，其中所述造血细胞群体的活力是至少75％，其中所述造血细胞群体的内毒素水平是约0.5EU/mL到约5.0EU/mL，并且其中所述造血细胞群体包括至少1×106个CD34+细胞。
在各个实施例中，本发明部分设想一种造血细胞群体，其包括经慢病毒转导的CD34+细胞，其中所述CD34+细胞的至少50％被转导，其中所述CD34+细胞具有约0.5到约5.0的平均载体拷贝数(VCN)，其中所述造血细胞群体的活力是至少75％，其中所述造血细胞群体的内毒素水平是约0.5EU/mL到约5.0EU/mL，并且其中所述造血细胞群体包括至少1×106个CD34+细胞。
在特定实施例中，所述慢病毒载体以约10到约30的感染复数(MOI)转导所述HSPC。
在特定实施例中，所述慢病毒载体以约10到约25的感染复数(MOI)转导所述HSPC。
在特定实施例中，所述慢病毒载体以约10到约20的感染复数(MOI)转导所述HSPC。
在一些实施例中，所述MOI是约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30。
在某些实施例中，所述细胞的至少75％已被转导。
在其它实施例中，所述细胞的至少90％已被转导。
在特定实施例中，所述平均VCN是至少1.0。
在特定实施例中，所述平均VCN是至少1.5。
在特定实施例中，所述平均VCN是至少2.0。
在特定实施例中，所述平均VCN是至少2.5。
在一些实施例中，所述细胞群体的活力是至少85％。
在某些实施例中，所述细胞群体的活力是至少95％。
在进一步实施例中，所述造血细胞群体的内毒素水平是至多5.0EU/mL。
在一些实施例中，所述造血细胞群体的内毒素水平是至多0.5EU/mL。
在进一步实施例中，所述细胞群体包括至少1×107个HSPC细胞。
在其它实施例中，所述细胞群体包括至少1×108个HSPC细胞。
在某些实施例中，所述细胞群体包括至少1×109个HSPC细胞。
在某些实施例中，所述细胞来源是脐带血、骨髓或动员后外周血。
在一些实施例中，所述细胞来源是动员后外周血。
在其它实施例中，所述慢病毒载体衍生自选自由以下组成的组的慢病毒：人类免疫缺陷病毒(HIV；包含HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
在其它实施例中，所述慢病毒载体衍生自HIV慢病毒。
在其它实施例中，所述慢病毒载体衍生自HIV-1慢病毒。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括：a)5'长末端(LTR)；b)RNA输出元件；c)慢病毒中央多聚嘌呤区(cPPT)；d)可操作地连接于目的基因的启动子；以及e)SIN 3'LTR。
在一些实施例中，与野生型5'LTR相比，经修饰5'LTR进一步包括缺失。
在特定实施例中，所述5'LTR的启动子被选自由以下组成的组的异源启动子替换：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子在进一步实施例中，所述RNA输出元件包括乙型肝炎病毒转录后调节元件(PRE)或人类免疫缺陷病毒(HIV)rev反应元件(RRE)。
在某些实施例中，所述3'LTR包含多腺苷酸化序列。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽。
在进一步实施例中，所述慢病毒载体包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子或其转录活性片段，其可操作地连接于编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸。
在某些实施例中，所述慢病毒载体编码腺苷脱氨酶。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码腺苷脱氨酶的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
在某些实施例中，所述慢病毒载体编码白细胞介素2受体γ。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码白细胞介素2受体γ的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码三肽基肽酶1。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码三肽基肽酶1的多核苷酸。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码α-L艾杜糖醛酸酶。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码α-L艾杜糖醛酸酶的多核苷酸。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶的多核苷酸。
在某些实施例中，所述启动子包括人类β-珠蛋白LCR的一个或多个元件。
在一些实施例中，所述人类β-珠蛋白LCR包括来自所述人类β-珠蛋白LCR的DNaseI超敏感位点2、3和4。
在特定实施例中，所述慢病毒载体进一步包括人类β-珠蛋白3'增强子元件。
在其它实施例中，所述目的基因编码抗镰状蛋白或珠蛋白基因。
在特定实施例中，所述目的基因编码人类β-珠蛋白蛋白质、人类δ-珠蛋白蛋白质、人类γ-珠蛋白蛋白质、人类βA-T87Q-珠蛋白蛋白质、人类βA-G16D/E22A/T87Q-珠蛋白蛋白质或人类βA-T87Q/K95E/K120E-珠蛋白蛋白质。
在特定实施例中，所述慢病毒载体是AnkT9W载体、T9Ank2W载体、TNS9载体、lentiglobin HPV569载体、lentiglobin BB305载体、BG-1载体、BGM-1载体、d432βAγ载体、mLARβΔγV5载体、GLOBE载体、G-GLOBE载体、βAS3-FB载体、V5载体、V5m3载体、V5m3-400载体、G9载体以及BCL11A shmir载体。
在特定实施例中，经本文中所设想的载体和组合物转导的细胞包括以下β-珠蛋白等位基因：βE/β0、βc/β0、β0/β0、βE/βE、βC/β+、βE/β+、β0/β+、β+/β+、βC/βC、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS。
在特定实施例中，经本文中所设想的载体和组合物转导的细胞包括以下β-珠蛋白等位基因：βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βC/β+、β0/β+或β+/β+。
在特定实施例中，经本文中所设想的载体和组合物转导的细胞包括以下β-珠蛋白等位基因：βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS。
在各个实施例中，本发明部分设想一种组合物，其包括本文中所设想的造血细胞群体。在各个实施例中，本发明部分设想一种药物组合物，其包括本文中所设想的造血细胞群体和药学上可接受的载体。
在各个实施例中，本发明部分设想一种培养物，其包括：造血干细胞或祖细胞；培养基；慢病毒载体；以及星形孢菌素或其模拟物或衍生物。
在特定实施例中，所述培养物进一步包括增加前列腺素EP受体信号传导的试剂。
在某些实施例中，所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由以下组成的组：PGA2；PGB2；PGD2；PGE1；PGE2；PGF2；PGI2；PGH2；PGJ2；以及其衍生物和模拟物。
在特定实施例中，所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由以下组成的组：15d-PGJ2；δ12-PGJ2；2-羟基十七碳三烯酸(HHT)；凝血恶烷A2；凝血恶烷B2；伊洛前列素；曲前列环素；曲伏前列素；卡前列素氨丁三醇；他氟前列腺素；拉坦前列素；比马前列素；异丙基乌诺前列酮；氯前列烯醇；奥斯特凡(Oestrophan)；苏泊凡(Superphan)；迷索前列醇；布他前列素；亚油酸；13(s)-HODE；LY171883；米德酸；二十碳三烯酸；环氧二十碳三烯酸；ONO-259；Cay1039；PGE2受体激动剂；16,16-二甲基PGE2；19(R)-羟基PGE2；16,16-二甲基PGE2对(对乙酰胺基苯甲酰胺基)苯酯；11-脱氧-16,16-二甲基PGE2；9-脱氧-9-亚甲基-16,16-二甲基PGE2；9-脱氧-9-亚甲基PGE2；硫前列酮；PGE2丝氨醇酰胺；PGE2甲酯；16-苯基四去甲PGE2；15(S)-15-甲基PGE2；以及15(R)-15-甲基PGE2。
在其它实施例中，所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由前列腺素E2(PGE2)或16,16-二甲基PGE2组成的组。
在特定实施例中，所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂是PGE2。
在特定实施例中，所述造血干细胞或祖细胞是CD34+细胞或CD133+细胞。
在一些实施例中，所述造血干细胞或祖细胞在聚阳离子聚合物存在下转导。
在其它实施例中，所述聚阳离子聚合物是聚凝胺、硫酸鱼精蛋白、聚乙烯亚胺或聚乙二醇/聚-L-赖氨酸嵌段共聚物。
在特定实施例中，所述慢病毒载体衍生自选自由以下组成的组的慢病毒：人类免疫缺陷病毒(HIV；包含HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
在特定实施例中，所述慢病毒载体衍生自HIV慢病毒。
在特定实施例中，所述慢病毒载体衍生自HIV-1慢病毒。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽。
在进一步实施例中，所述慢病毒载体包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子或其转录活性片段，其可操作地连接于编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸。
在某些实施例中，所述慢病毒载体编码腺苷脱氨酶。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码腺苷脱氨酶的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
在某些实施例中，所述慢病毒载体编码白细胞介素2受体γ。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码白细胞介素2受体γ的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码三肽基肽酶1。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码三肽基肽酶1的多核苷酸。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码α-L艾杜糖醛酸酶。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码α-L艾杜糖醛酸酶的多核苷酸。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶的多核苷酸。
在某些实施例中，所述启动子包括人类β-珠蛋白LCR的一个或多个元件。
在一些实施例中，所述人类β-珠蛋白LCR包括来自所述人类β-珠蛋白LCR的DNaseI超敏感位点2、3和4。
在特定实施例中，所述慢病毒载体进一步包括人类β-珠蛋白3'增强子元件。
在其它实施例中，所述目的基因编码抗镰状蛋白或珠蛋白基因。
在特定实施例中，所述目的基因编码人类β-珠蛋白蛋白质、人类δ-珠蛋白蛋白质、人类γ-珠蛋白蛋白质、人类βA-T87Q-珠蛋白蛋白质、人类βA-G16D/E22A/T87Q-珠蛋白蛋白质或人类βA-T87Q/K95E/K120E-珠蛋白蛋白质。
在特定实施例中，所述慢病毒载体是AnkT9W载体、T9Ank2W载体、TNS9载体、lentiglobin HPV569载体、lentiglobin BB305载体、BG-1载体、BGM-1载体、d432βAγ载体、mLARβΔγV5载体、GLOBE载体、G-GLOBE载体、βAS3-FB载体、V5载体、V5m3载体、V5m3-400载体、G9载体以及BCL11A shmir载体。
在各个实施例中，本发明部分设想一种转导造血细胞群体的方法，其包括：在包括星形孢菌素的培养基中培养所述细胞，洗涤所述细胞以基本上除去所述星形孢菌素，以及将所述细胞与慢病毒接触。
在特定实施例中，所述方法进一步包括在存在增加前列腺素EP受体信号传导的试剂的情况下培养所述细胞。
在某些实施例中，所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由以下组成的组：PGA2；PGB2；PGD2；PGE1；PGE2；PGF2；PGI2；PGH2；PGJ2；以及其衍生物和模拟物。
在进一步实施例中，所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由以下组成的组：15d-PGJ2；δ12-PGJ2；2-羟基十七碳三烯酸(HHT)；凝血恶烷A2；凝血恶烷B2；伊洛前列素；曲前列环素；曲伏前列素；卡前列素氨丁三醇；他氟前列腺素；拉坦前列素；比马前列素；异丙基乌诺前列酮；氯前列烯醇；奥斯特凡(Oestrophan)；苏泊凡(Superphan)；迷索前列醇；布他前列素；亚油酸；13(s)-HODE；LY171883；米德酸；二十碳三烯酸；环氧二十碳三烯酸；ONO-259；Cay1039；PGE2受体激动剂；16,16-二甲基PGE2；19(R)-羟基PGE2；16,16-二甲基PGE2对(对乙酰胺基苯甲酰胺基)苯酯；11-脱氧-16,16-二甲基PGE2；9-脱氧-9-亚甲基-16,16-二甲基PGE2；9-脱氧-9-亚甲基PGE2；硫前列酮；PGE2丝氨醇酰胺；PGE2甲酯；16-苯基四去甲PGE2；15(S)-15-甲基PGE2；以及15(R)-15-甲基PGE2。
在特定实施例中，所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由前列腺素E2(PGE2)或16,16-二甲基PGE2组成的组。
在特定实施例中，所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂是PGE2。
在一些实施例中，所述造血细胞群体在聚阳离子聚合物存在下转导。
在特定实施例中，所述聚阳离子聚合物是聚凝胺、硫酸鱼精蛋白、聚乙烯亚胺或聚乙二醇/聚-L-赖氨酸嵌段共聚物。
在进一步实施例中，所述慢病毒载体衍生自选自由以下组成的组的慢病毒：人类免疫缺陷病毒(HIV；包含HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
在某些实施例中，所述慢病毒载体衍生自HIV慢病毒。
在特定实施例中，所述慢病毒载体衍生自HIV-1慢病毒。
在其它实施例中，逆转录病毒载体是慢病毒载体，所述慢病毒载体包括：a)5'长末端(LTR)；b)Psi(Ψ)包装信号；c)RNA输出元件；d)慢病毒中央多聚嘌呤区(cPPT)；e)可操作地连接于目的多核苷酸的启动子；以及f)SIN 3'LTR。
在某些实施例中，与野生型5'LTR相比，经修饰5'LTR进一步包括缺失。
在一些实施例中，5'LTR的启动子被选自由以下组成的组的异源启动子替换：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。
在一些实施例中，所述RNA输出元件包括乙型肝炎病毒转录后调节元件(PRE)或人类免疫缺陷病毒(HIV)rev反应元件(RRE)。
在某些实施例中，所述3'LTR包含多腺苷酸化序列。
在某些实施例中，所述慢病毒载体编码腺苷脱氨酶。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码腺苷脱氨酶的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
在某些实施例中，所述慢病毒载体编码白细胞介素2受体γ。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码白细胞介素2受体γ的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码三肽基肽酶1。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码三肽基肽酶1的多核苷酸。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码α-L艾杜糖醛酸酶。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码α-L艾杜糖醛酸酶的多核苷酸。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶的多核苷酸。
在某些实施例中，所述启动子包括人类β-珠蛋白LCR的一个或多个元件。
在一些实施例中，所述人类β-珠蛋白LCR包括来自所述人类β-珠蛋白LCR的DNaseI超敏感位点2、3和4。
在特定实施例中，所述慢病毒载体进一步包括人类β-珠蛋白3'增强子元件。
在其它实施例中，所述目的基因编码抗镰状蛋白或珠蛋白基因。
在特定实施例中，所述目的基因编码人类β-珠蛋白蛋白质、人类δ-珠蛋白蛋白质、人类γ-珠蛋白蛋白质、人类βA-T87Q-珠蛋白蛋白质、人类βA-G16D/E22A/T87Q-珠蛋白蛋白质或人类βA-T87Q/K95E/K120E-珠蛋白蛋白质。
在特定实施例中，所述慢病毒载体是AnkT9W载体、T9Ank2W载体、TNS9载体、lentiglobin HPV569载体、lentiglobin BB305载体、BG-1载体、BGM-1载体、d432βAγ载体、mLARβΔγV5载体、GLOBE载体、G-GLOBE载体、βAS3-FB载体、V5载体、V5m3载体、V5m3-400载体、G9载体以及BCL11A shmir载体。
在特定实施例中，所述启动子能够在小神经胶质细胞中操作。
在进一步实施例中，所述启动子包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子或其转录活性片段。
在某些实施例中，目的多核苷酸编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽。
在一些实施例中，所述造血细胞群体转导至少约2小时。
在某些实施例中，所述造血细胞群体转导至少约24小时。
在一些实施例中，所述造血细胞群体转导约2小时到约24小时。
在其它实施例中，所述造血细胞包括造血干细胞或祖细胞。
在特定实施例中，所述造血细胞包括CD34+细胞或CD133+细胞。
在一些实施例中，所述造血细胞群体被选择用于转导前的CD34+或CD133+表达。
在各个实施例中，本发明部分设想一种治疗受试者的血红蛋白病的方法，其包括向所述受试者施用本文中所设想的细胞群体。
在各个实施例中，本发明部分设想一种改善受试者的血红蛋白病的至少一种症状的方法，其包括向所述受试者施用本文中所设想的细胞群体或本文中所设想的组合物。
在特定实施例中，所述受试者的所述β-珠蛋白等位基因是βE/β0、βC/β0、β0/β0、βE/βE、βC/β+、βE/β+、β0/β+、β+/β+、βC/βC、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS。
在各个实施例中，本发明部分设想一种治疗受试者的地中海贫血的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文中所设想的造血细胞群体或本文中所设想的组合物。
在某些实施例中，所述地中海贫血是α-地中海贫血。
在其它实施例中，所述地中海贫血是β-地中海贫血。
在特定实施例中，所述受试者的所述β-珠蛋白等位基因是βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βC/β+、β0/β+或β+/β+。
在各个实施例中，本发明部分设想一种治疗受试者的镰状细胞病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文中所设想的造血细胞群体或本文中所设想的组合物。
在进一步实施例中，所述受试者的所述β-珠蛋白等位基因是βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS。
在各个实施例中，本发明部分设想一种治疗受试者的β-地中海贫血的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文中所设想的造血细胞群体或本文中所设想的组合物。
在其它实施例中，所述受试者的所述β-珠蛋白等位基因是βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βC/β+、β0/β+或β+/β+。
在某些实施例中，所述造血干细胞群体通过静脉内途径、髓内途径或骨内途径施用。
在特定实施例中，所述造血干细胞群体静脉内施用。
在各个实施例中，本发明部分设想一种试剂盒，其包括增加前列腺素EP受体信号传导的试剂和星形孢菌素。
在进一步实施例中，所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由以下组成的组：PGA2；PGB2；PGD2；PGE1；PGE2；PGF2；PGI2；PGH2；PGJ2；以及其衍生物和模拟物。
在其它实施例中，所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由以下组成的组：15d-PGJ2；δ12-PGJ2；2-羟基十七碳三烯酸(HHT)；凝血恶烷A2；凝血恶烷B2；伊洛前列素；曲前列环素；曲伏前列素；卡前列素氨丁三醇；他氟前列腺素；拉坦前列素；比马前列素；异丙基乌诺前列酮；氯前列烯醇；奥斯特凡(Oestrophan)；苏泊凡(Superphan)；迷索前列醇；布他前列素；亚油酸；13(s)-HODE；LY171883；米德酸；二十碳三烯酸；环氧二十碳三烯酸；ONO-259；Cay1039；PGE2受体激动剂；16,16-二甲基PGE2；19(R)-羟基PGE2；16,16-二甲基PGE2对(对乙酰胺基苯甲酰胺基)苯酯；11-脱氧-16,16-二甲基PGE2；9-脱氧-9-亚甲基-16,16-二甲基PGE2；9-脱氧-9-亚甲基PGE2；硫前列酮；PGE2丝氨醇酰胺；PGE2甲酯；16-苯基四去甲PGE2；15(S)-15-甲基PGE2；以及15(R)-15-甲基PGE2。
在进一步实施例中，所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由前列腺素E2(PGE2)或16,16-二甲基PGE2组成的组。
在某些实施例中，所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂是PGE2。
在某些实施例中，所述试剂盒进一步包括聚阳离子聚合物。
在特定实施例中，所述聚阳离子聚合物是聚凝胺、硫酸鱼精蛋白、聚乙烯亚胺或聚乙二醇/聚-L-赖氨酸嵌段共聚物。
附图说明
图1示出了在两种MOI处转导的经星形孢菌素治疗的hCD34+细胞的代表性体外分析。(A)如由BLAM试验测量，经星形孢菌素治疗的细胞中含有载体的细胞的百分比比对照组高1.5倍。(B)LNGFR染色数据表明经星形孢菌素治疗的转基因的表达增加1.5倍。(C)VCN分析表明与对照组样本相比，经星形孢菌素治疗的平均VCN增加2倍。
图2示出了增加星形孢菌素暴露导致干细胞潜能降低。(A)在3种不同浓度的星形孢菌素中暴露24小时的细胞显示出>50％的CFC形成物缩减。(B)在星形孢菌素中暴露2小时的细胞保留菌落形成能力并且并未与对照组治疗的细胞显著不同。
图3A示出了经星形孢菌素治疗之后，已转导的hCD34+细胞的七个细胞批次的VCN。在媒剂(DMSO)或指定浓度的星形孢菌素存在下将七个细胞批次经LVV转导。细胞批次由先天性转导能力分组(低平均VCN<0.5，中等0.5<平均VCN<1，高平均VCN>1)，每个圆点是独立的复本。
图3B在最左边面板示出了图3A的VCN数据的条形图并且在最右边面板示出了显示平均VCN的图表。
图4示出了星形孢菌素治疗促进长期NSG再生细胞的转导。(A)体外分析揭示了800nM星形孢菌素治疗的情况下药品的VCN增强。(B)对来自移植后4个月NSG小鼠的BM的VCN分析表明在经400nM星形孢菌素转导β倍，经800nM星形孢菌素转导4倍之前，在暴露于增加量的星形孢菌素的情况下的改进的平均体内VCN；相对于0.08％DMSO(媒剂)。
图5显示星形孢菌素治疗并不影响经移植的hCD34+细胞的移植或分化能力。(A)星形孢菌素治疗并不影响已转导的hCD34+细胞在异种移植背景下的移植。(B)维持了移植细胞的骨髓以及(C和D)淋巴分化能力。
图6A示出了移植前药品的插入位点分析。在基因本体内定位经识别的插入位点，以检查经每个治疗的整合概况。
图6B示出了将插入位点定量为针对移植前药品的全部读取的百分比。所有移植前样本展示多克隆性。
图6C示出了移植后四个月收获的移植后骨髓的插入位点分析。将前10个插入位点定量为全部读取的百分比。经星形孢菌素治疗的细胞示出了与经媒剂治疗的细胞类似的多克隆插入位点概况。
图7示出了与使用硫酸鱼精蛋白(媒剂)的标准转导病状相比，在星形孢菌素治疗存在下转导的分散造血细胞群体和表现型干细胞(CD34+CD38LoCD90+CD45RA-)两者显示出增大的转导效率。
图8示出了与对照组相比，在星形孢菌素、PGE2或PGE2和星形孢菌素存在下转导的hCD34+细胞显示增大的VCN。
具体实施方式
A.概述
本发明的各种说明性实施例设想基因治疗以及产生和使用所述基因治疗的方法，所述基因治疗包括具有增大的疗效的造血干细胞和祖细胞组合物。
基因治疗部分地依赖治疗基因和相应的蛋白质的充分表达。影响基因表达的因素之一是拷贝数，或细胞中存在多少治疗基因的拷贝。病毒，如逆转录病毒，例如慢病毒、腺病毒以及腺相关病毒常常使用基因治疗载体将治疗基因引入细胞；被称为转导的过程。造血干细胞和祖细胞的低效病毒转导是限制基因治疗的范围和基因治疗对许多疾病和病症的适用性的比较重要的因素之一，这些疾病和病症将受益于衍生自造血系统的基因修饰细胞。不良病毒转导显示为低载体拷贝数(VCN)和/或已转导细胞的低百分比。因此，使用病毒载体将治疗性转基因递送到造血干细胞和祖细胞的基因治疗的一个显著问题是低效病毒转导，所述低效病毒转导可以导致低于治疗水平的药品。低效转导还导致商品成本较高，例如它增加慢病毒生产的成本，因为转导越低效，需要的慢病毒就越多。
本文设想的基于造血干细胞和祖细胞的基因治疗以及其产生和使用方法解决了困扰所属领域的这些问题和其它问题。
特定的示例性实施例设想经过逆转录病毒载体转导的造血细胞群体，其中与经过所属领域中现有的方法和组合物转导的细胞群体相比，所述细胞群体包括增加的数量或百分比的已转导的造血干细胞和祖细胞。在另一个实施例中，与经过所属领域中现有的方法和组合物转导的细胞群体的VCN相比，经过逆转录病毒载体转导的造血细胞群体包括增加的VCN。
其它示例性实施例设想包括已转导造血细胞的组合物、药物组合物和细胞培养物。
某些实施例设想包括造血细胞群体、逆转录病毒、单独星形孢菌素、或与增加前列腺素EP受体信号传导的试剂的组合以及或模拟物或其衍生物。
在特定实施例中，设想了用于转导造血细胞的方法，所述方法包括经过逆转录病毒接触造血细胞并且在单独星形孢菌素或与增加前列腺素EP受体信号传导的试剂的组合以及或模拟物或其衍生物存在下培养造血细胞和逆转录病毒。
在特定实施例中，设想了治疗具有单基因病症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用本文中设想的基于造血细胞的基因治疗中的任何一种。
除非明确相反地指出，否则本文中设想的各个实施例将采用在所属领域的技术范围内的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学以及细胞生物学的常规方法，其中出于说明的目的在下文描述了许多方法。在文献中全面解释了这些技术。参见，例如Sambrook等人，《分子克隆：实验指南(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》(第3版，2001年)；Sambrook等人，《分子克隆：实验指南(MolecularCloning:A Laboratory Manual)》(第2版，1989年)；Maniatis等人，《分子克隆：实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(1982年)；Ausubel等人，《现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)》(John Wiley and Sons，更新于2008年7月)；《简短分子生物学方案∶来自现代分子生物学实验技术的方法概略(ShortProtocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology)》，Greene出版社。Associates and Wiley-Interscience；Glover，《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)》，第I卷&第II卷(IRL出版社，牛津，1985年)；Anand，《复杂基因组分析技术(Techniques for the Analysis of ComplexGenomes)》，(学术出版社，纽约，1992年)；《转录与翻译(Transcription andTranslation)》(B.Hames&S.Higgins编辑，1984年)；Perbal，《分子克隆实践指南(APractical Guide to Molecular Cloning)》(1984年)；Harlow和Lane，《抗体(Antibodies)》，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约，1998年)《免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)》Q.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach和W.Strober编辑，1991年)；《免疫学年评(Annual Review of Immunology)》，以及期刊中的专论，如Advances in Immunology。
B.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。尽管可以在本发明的实践或测试中使用与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但是本文中描述组合物、方法和材料的优选实施例。为了本发明的目的，下文定义以下术语。
本文使用的冠词“一”指的是冠词的语法对象中的一个或超过一个(即至少一个或一个或多个)。举例来说，“一个元件”意指一个元件或一个或多个元件。
替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。
术语“和/或”应理解为意指替代方案中的一个或两个。
如本文中所用，术语“约”或“大约”是指与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比，变化高达30％、25％、20％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在特定实施例中，术语“约”或“大约”当放在一个数值前时表示该值加或减15％、10％、5％或1％的范围。
如本文中所用，术语“基本上”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度是参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在一个实施例中，“基本上相同”是指某个数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度产生的作用，例如生理作用，与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度产生的作用大致相同。
在本说明书通篇中，除非上下文另外要求，否则“包括(comprise/comprises/comprising)”应理解为暗指包含所述步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其它步骤或要素或任何其它组步骤或要素。如本文中所用，术语“包含”和“包括”在使用时是同义的。“由……组成”打算包含并且限于短语“由……组成”之后的任何事物。因此，短语“由……组成”指示所列要素为需要或必需的，并且不能存在其它要素。“基本上由……组成”打算包含短语后所列的任何要素，并且限于不干扰或影响本发明中规定的所列要素的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列要素是必不可少的或必选的，而且不能存在显著影响所列要素的活性或作用的其它要素。
贯穿本说明书提及“一个实施例”、“一实施例”、“特定实施例”、“相关实施例”、“某一实施例”、“其它实施例”或“另一实施例”或其组合是指结合实施例描述的特定特征、结构或特征包含于本发明的至少一个实施例中。因此，贯穿本说明书中的各处出现的前述短语不一定全部参考同一实施例。
另外，在一个或多个实施例中，具体特点、结构或特性可以任何适合方式组合。还应理解，在一个实施例中对一个特征的正面叙述用作在一个特定实施例中排除所述特征的基础。
“转染”是指通过非病毒性方法将裸DNA引入细胞中的过程。
“感染”是指使用病毒载体将外来DNA引入细胞中的过程。
“转导”是指使用病毒载体将外来DNA引入细胞的基因组中。
“载体拷贝数”或“VCN”是指载体或其一部分在细胞的基因组中的拷贝数。可以从细胞群体或从单独的细胞集落确定平均VCN。确定VCN的示例性方法包含聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和流式细胞术(flow cytometry)。
“转导效率”是指经过至少一个载体拷贝转导的细胞的百分比。例如，如果1×106个细胞暴露于病毒并且经过确定，0.5×106个细胞在其基因组中具有至少一个病毒拷贝，那么转导效率是50％。确定转导效率的示例性方法包含PCR和流式细胞术。在各个实施例中，使用短语“慢病毒载体阳性细胞的数量”或“慢病毒载体阳性细胞百分比”来表示转导效率。
如本文所用，术语“逆转录病毒”是指将其基因组RNA逆转录成线性双链DNA拷贝并且随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中的RNA病毒。逆转录病毒是常见的基因递送工具(Miller，2000年，《自然(Nature)》第357卷，第455页到460页)。一旦病毒整合到宿主基因组中，所述病毒被称为“原病毒”。原病毒充当RNA聚合酶II的模板并指导由病毒编码的RNA分子的表达。
说明性逆转录病毒包含但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murineleukemia virus，M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Moloney murine sarcoma virus，MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(Harvey murine sarcoma virus，HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(murinemammary tumor virus，MuMTV)、长臂猿白血病病毒(gibbon ape leukemia virus，GaLV)、猫白血病病毒(feline leukemia virus，FLV)、泡沫病毒(spumavirus)、弗云德鼠白血病病毒(Friend murine leukemia virus)、鼠干细胞病毒(Murine Stem Cell Virus，MSCV)以及劳氏肉瘤病毒(RSV)和慢病毒。
如本文所用，术语“慢病毒”是指复杂逆转录病毒组(或属)。说明性慢病毒包含，但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包含HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施例中，基于HIV的载体主链(即，HIV顺式作用序列元件)是优选的。
可以在实践本发明时使用逆转录病毒载体，并且更具体地说慢病毒载体。因此，如本文中所用的术语“逆转录病毒”或“逆转录病毒载体”意指分别包含“慢病毒”和“慢病毒载体”。
术语“载体”在本文中用以指能够转移或输送另一个核酸分子的核酸分子。转移后的核酸通常连接到载体核酸分子，例如插入载体核酸分子中。载体可以包含在细胞中直接自主复制的序列，或可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包含例如质粒(例如DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包含例如复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。
如所属领域的技术人员将清楚，术语“病毒载体”普遍用于指包含病毒衍生的核酸元件的核酸分子(例如转移质粒)，所述病毒衍生的核酸元件典型地促进核酸分子转移或整合到细胞的基因组中，或指介导核酸转移的病毒颗粒。除了核酸之外，病毒颗粒典型地将包含各种病毒组分并且有时还包含宿主细胞组分。
术语病毒载体可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或指转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要衍生自病毒的结构和/或功能遗传元件。术语“逆转录病毒载体”是指含有主要衍生自逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。术语“慢病毒载体”是指含有主要衍生自慢病毒的结构和功能遗传元件或其包含LTR的部分的逆转录病毒载体或质粒。术语“杂交体(hybrid)”是指含有例如慢病毒的逆转录病毒的序列和非慢病毒性病毒序列两者的载体、LTR或其它核酸。在一个实施例中，杂交载体是指包括例如慢病毒的逆转录病毒的序列用于逆转录、复制、整合和/或包装的载体或转移质粒。
在特定实施例中，术语“慢病毒载体”和“慢病毒表达载体”可以用于指慢病毒转移质粒和/或感染性慢病毒颗粒。在本文提及如克隆位点、启动子、调节元件、异源核酸等元件时，应理解，这些元件的序列以RNA形式存在于本发明的慢病毒颗粒中并且以DNA形式存在于本发明的DNA质粒中。
在原病毒的每一端是被称为“长末端重复序列”或“LTR”的结构。术语“长末端重复序列(LTR)”是指位于逆转录病毒DNA的末端处的碱基对结构域，所述碱基对结构域在其天然序列情形下是直接重复序列并且含有U3、R和U5区。LTR通常提供对于逆转录病毒基因的表达(例如基因转录物的启动、起始和多腺苷酸化)和病毒复制基本的功能。LTR含有众多调节信号，包含转录控制元件、多腺苷酸化信号和病毒基因组的复制和整合所需的序列。将病毒性LTR分成被称作U3、R和U5的三个区域。U3区含有增强子和启动子元件。U5区是引物结合位点与R区之间的序列并且含有多腺苷酸化序列。R(重复序列)区由U3区和U5区侧接。LTR由U3、R和U5区构成并且出现在病毒基因组的5'和3'两端。与5'LTR相邻的是基因组逆转录所需的序列(tRNA引物结合位点)和将病毒RNA高效包装到颗粒中所需的序列(Psi位点)。
如本文所用，术语“包装信号”或“包装序列”是指病毒RNA插入到病毒衣壳或颗粒中所需的位于逆转录病毒基因组内的序列，参见例如Clever等人，1995年，《病毒学杂志(J.of Virology)》，第69卷，第4期；第2101页到2109页。若干逆转录病毒载体使用病毒基因组的衣壳化所需要的最小包装信号(也称为psi[Ψ]或[Ψ+]序列)。因此，如本文所用，术语“包装序列”、“包装信号”、“psi”和符号“Ψ”用于参照在病毒颗粒形成期间逆转录病毒RNA链的衣壳化所需要的非编码序列。
在各个实施例中，载体包括经修饰的5'LTR和/或3'LTR。常常对3'LTR进行修饰以通过使病毒变成复制缺陷型来提高慢病毒或逆转录病毒系统的安全性。所属领域的技术人员能够通过与参考LTR进行比较来确定LTR是否经过修饰。如本文所用，术语“复制缺陷型”是指病毒不能完全、有效复制，使得不产生感染性病毒粒体(例如复制缺陷型慢病毒后代)。术语“复制胜任型”是指野生型病毒或突变病毒能够复制，使得病毒的病毒复制能够产生感染性病毒粒体(例如复制胜任型慢病毒后代)。
“自我失活”(Self-inactivating，SIN)载体是指复制缺陷型载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体，其中称为U3区的右(3')LTR增强子-启动子区已经过修饰(例如通过缺失和/或取代)以防止病毒转录超过第一轮病毒复制。这是因为右(3')LTR U3区在病毒复制期间用作左(5')LTR U3区的模板，并且因此病毒转录物无法在无U3增强子-启动子的情况下制得。在本发明的另一个实施例中，对3'LTR进行修饰，使得U5区例如被异源或合成poly(A)序列、一个或多个隔离子元件和/或诱导型启动子取代。应注意，对LTR的修饰，如对3'LTR、5'LTR或3'LTR和5'LTR两者的修饰，也包含于本发明中。
通过用异源启动子取代5'LTR的U3区增强了额外安全性，以在病毒颗粒产生期间驱动病毒基因组的转录。可以使用的异源启动子的实例包含例如病毒猿猴病毒40(SV40)(例如早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)以及单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)(胸苷激酶)启动子。典型启动子能够以Tat非依赖性方式驱动高水平的转录。此取代降低了重组以生成复制胜任型病毒的可能性，因为在病毒产生系统中不存在完全U3序列。在某些实施例中，异源启动子可以是诱导型的，使得病毒基因组的全部或部分的转录将仅在存在一个或多个诱导因子时发生。诱导因子包含但不限于一种或多种化合物或培养宿主细胞的生理条件，例如温度或pH。
在一些实施例中，病毒载体包括TAR元件。术语“TAR”是指位于慢病毒(例如HIV)LTR的R区中的“反式活化应答”遗传元件。此元件与慢病毒反式活化子(tat)遗传元件相互作用以增强病毒复制。然而，在5'LTR的U3区被异源启动子取代的实施例中不需要此元件。
“R区”是指逆转录病毒LTR内从加帽基团(capping group)开始(即，转录开始)处开始并且在poly A区开始之前立即结束的区域。R区还定义为由U3区和U5区侧接。R区在逆转录期间在允许初生DNA从基因组的一端转移到另一端方面起一定作用。
如本文所用，术语“FLAP元件”是指其序列包含逆转录病毒，例如HIV-1或HIV-2的中心多嘌呤段和中心终止序列(cPPT和CTS)的核酸。在一些实施例中，术语“FLAP元件”和“cPPT/FLAP”可互换使用，是指前述FLAP元件。在美国专利第6,682,907号和Zennou等人，2000年，《细胞(Cell)》，第101卷，第173页中描述了合适的FLAP元件。在HIV-1逆转录期间，中央多聚嘌呤区(cPPT)处正链DNA的中央起始和中央终止序列(central terminationsequence，CTS)处的中央终止导致形成三链DNA结构：HIV-1中央DNA瓣。虽然不希望受任何理论束缚，但DNA瓣可以充当慢病毒基因组细胞核导入的顺式活性决定因子，和/或可以增加病毒的滴度。在特定实施例中，逆转录病毒或慢病毒载体主链在载体中的所关注异源基因的上游或下游包括一个或多个FLAP元件。例如，在特定实施例中，载体包含FLAP元件。在一个实施例中，本发明的载体包括由HIV-1分离的FLAP元件。
在一个实施例中，逆转录病毒或慢病毒转移载体包括一个或多个导出元件。术语“导出元件”是指调节将RNA转录物从细胞的细胞核输送到细胞质的顺式作用的转录后调节元件。RNA导出元件的实例包含但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)rev反应元件(RRE)(参见例如Cullen等人，1991年，《病毒学杂志(J.Virol.)》第65卷，第1053页；和Cullen等人，1991年，《细胞(Cell)》第58卷，第423页)和乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)。通常，RNA导出元件被放置在基因的3'UTR内，并且可以以一个或多个拷贝形式插入。
在特定实施例中，病毒载体中异源序列的表达通过将转录后调节元件、高效多腺苷酸化位点和任选地转录终止信号并入到载体中而增加。各种转录后调节元件可以增强异源核酸在蛋白质处的表达，例如土拔鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE；Zufferey等人，1999年，《病毒学杂志(J.Virol.)》，第73卷，第2886页)；存在于B型肝炎病毒(HPRE)中的转录后调节元件(Huang和Yen，1995年，《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》，第5卷，第3864页)；等(Liu等人，1995年，《基因与发育(Genes Dev.)》，第9卷，第1766页)。在特定实施例中，本发明的载体缺乏或不包括转录后调节元件(PTE)，如WPRE或HPRE，因为在一些实例中这些元件增加了细胞转化的风险和/或不会实质上或显著地增加mRNA转录物的量或增加mRNA稳定性。因此，在一些实施例中，本发明的载体缺乏或不包括WPRE或HPRE作为附加的安全措施。
在特定实施例中，载体包括编码待表达的多肽的多核苷酸的多腺苷酸化序列3′。如本文所用，术语“polyA位点”或“polyA序列”表示通过RNA聚合酶II导引初生RNA转录物的终止和多腺苷酸化两者的DNA序列。多腺苷酸化序列可以通过将polyA尾添加到编码序列的3′端而提升mRNA的稳定性，并且因此有助于增加翻译效率。切割和多腺苷酸化由RNA中的poly(A)序列指导。哺乳动物mRNA前体(pre-mRNA)的核心poly(A)序列具有两个侧接在切割-多腺苷酸化位点上的识别元件。典型地，几乎不变的AAUAAA六聚物位于富含U或GU残基的较为可变的元件上游20到50个核苷酸处。新生转录物的切割发生在这两个元件之间并耦联以将多达250个腺苷加入5'切割产物。在特定实施例中，核心poly(A)序列是理想的polyA序列(例如AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)。在特定实施例中，poly(A)序列是SV40polyA序列、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-珠蛋白polyA序列(rβgpA)或所属领域中已知的另一种合适的异源或内源性polyA序列。
在某些实施例中，逆转录病毒或慢病毒载体进一步包括一个或多个隔离子元件。隔离子元件可以有助于保护例如治疗性多肽等慢病毒表达的序列免受整合位点效应的影响，所述整合位点效应可以由存在于基因组DNA中的顺式作用元件介导并且导致转移序列的表达失调(即，位置效应；参见例如Burgess-Beusse等人，2002年，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA)》，第99卷，第16433页；和Zhan等人，2001年，《人类遗传学(Hum.Genet.)》，第109卷，第471页)。在一些实施例中，转移载体包括一个或多个隔离子元件3′LTR，并且在原病毒整合到宿主基因组中后，原病毒凭借复制3′LTR在5′LTR和/或3′LTR处包括所述一个或多个隔离子。适用于本发明的隔离子包含但不限于鸡β-珠蛋白隔离子(参见Chung等人，1993年，《细胞(Cell)》，第74卷，第505页；Chung等人，1997年，《美国国家科学院院刊(PNAS)》第94卷，第575页；和Bell等人，1999年，《细胞(Cell)》第98卷，第387页，通过引用并入本文)。隔离子元件的实例包含但不限于来自人类β-珠蛋白基因座的隔离子，如鸡HS4。
根据某些特定实施例，病毒载体主链序列的大部分或全部衍生自慢病毒，例如HIV-1。然而，应理解，可以使用许多不同来源的慢病毒序列，并且可以容许某些慢病毒序列有许多取代和改变而不削弱转移载体执行本文中所述的功能的能力。此外，多种慢病毒载体是所属领域中已知的，参见Naldini等人，(1996a，1996b和1998年)；Zufferey等人，(1997年)；Dull等人，1998年，美国专利第6,013,516号和第5,994,136号，所述专利申请中的许多适用于产生本发明的病毒载体或转移质粒。
如本文所用，术语“试剂”涵盖有机小分子、星形孢菌素、前列腺素、cAMP增强子、Wnt路径促效剂、cAMP/PI3K/Akt路径促效剂、Ca2+第二信使路径促效剂、氧化氮(NO)/血管紧张素信号传递促进剂以及无机化学品，包含但不限于所有模拟物和其衍生物。
“小分子”、“有机小分子”或“小分子化合物”是指分子量小于约5kD、小于约4kD、小于约3kD、小于约2kD、小于约1kD或小于约0.5kD的低分子量化合物。在特定实施例中，小分子可以包含核酸、肽、肽模拟物、类肽、其它小有机化合物或药物等。化学和/或生物混合物，如真菌、细菌或藻类提取物等的文库在所属领域中是已知的并且可以用本发明的任何试验筛选。用于合成分子文库的方法的实例可以见于(Carell等人，1994a；Carell等人，1994b；Cho等人，1993年；DeWitt等人，1993年；Gallop等人，1994年；Zuckermann等人，1994年)中。
“模拟物”或“衍生物”涉及与另一种化学物质在结构和功能方面类似的分子，常常由于单个元件或群组而在结构上不同，但是如果它保留与亲本化学品相同的功能，则可以通过对超过一个群组(例如，2个、3个或4个群组)进行修饰来区别。这种修饰对于所属领域的技术人员来说是常规的，并且包含例如额外的或被取代的化学部分，如酸的酯或酰胺，保护基，如用于醇或硫醇的苯甲基，和用于胺的叔丁氧羰基。还包含对烷基侧链的修饰，如烷基取代基(例如甲基、二甲基、乙基等)；对侧链的饱和度或不饱和度的修饰和经修饰的基团，如经取代的苯基和苯氧基的添加。衍生物还可以包含缀合物，如生物素或抗生物素蛋白部分；酶，如辣根过氧化物酶等；并且包含放射性标记、生物发光、化学发光或荧光部分。此外，可以将各部分加入本文中所述的试剂以改变其药物动力学特性，如增加体内或离体半衰期或增加其细胞渗透特性以及其它期望特性。还包含前药，已知前药能增强药物的多种所期望的性质(例如溶解性、生物可用性、制造等)(关于示例性EP促效剂前药，参见例如WO/2006/047476，所述关于这类促效剂的公开通过引用并入)。如本文中所用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)或DNA。多核苷酸包含单链和双链重组的、合成的或分离的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸是指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))。如此处所用，术语“多聚核糖核苷酸”或“核糖核酸”也指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))以及抑制性RNA，包含但不限于siRNA、shRNA、piRNA、miRNA或微小RNA，以及嵌入微小RNA主链(shmir)中的shRNA。优选地，本发明的多核苷酸包含具有本文所述的任何参考序列(参见，例如序列表)的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸或变异体，典型地其中变异体维持参考序列的至少一个生物活性。在各种说明性实施例中，设想了病毒载体和转移质粒多核苷酸序列以及包括上述的组合物。在特定实施例中，设想了编码一个或多个治疗性多肽和/或其它目的基因的多核苷酸。在特定实施例中，设想了编码治疗性多肽的多核苷酸，所述治疗性多肽包含但不限于如本文其它地方所论述的珠蛋白多肽、抗镰状珠蛋白多肽、腺苷脱氨酶多肽、白细胞介素2受体γ多肽、三肽基肽酶1多肽、α-L艾杜糖醛酸酶多肽、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶多肽或ATP结合盒亚家族D(ALD)成员1(ABCD1)多肽。
如本文中所用，术语“多核苷酸变异体”和“变异体”等是指与参考多核苷酸序列呈现相当大的序列同一性的多核苷酸或在下文所定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语包含多核苷酸，其中与参考多核苷酸相比已经将一个或多个核苷酸添加或缺失或用不同核苷酸置换。在这点上，在所属领域中充分理解，可以对参考多核苷酸进行包含突变、添加、缺失和置换的某些改变，由此改变的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物功能或活性。
如本文中所用，术语“分离的”意指例如多核苷酸、多肽、细胞等材料大体上或基本上不含通常以其天然状态伴随其的组分。在特定实施例中，术语“所获得的”或“衍生的”在使用时与分离的同义。例如，如本文中所用，“分离的多核苷酸”是指从以天然存在状态侧接其的序列中纯化的多核苷酸，例如DNA片段，它已经从通常与所述片段相邻的序列中移出。
描述多核苷酸的定向的术语包含：5'(通常是具有游离磷酸酯基的多核苷酸的末端)和3'(通常是具有游离羟基(OH)的多核苷酸的末端)。可以按5'到3'定向或3'到5'定向标注多核苷酸序列。
术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，DNA序列5'AGTCATG3'的互补链是3'TCAGTAC 5'。后一序列通常写成反向互补序列，5'端在左并且3'端在右，5'C A T G A C T 3'。与其反向互补序列相等的序列被称为回文序列。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可以存在“完全的”或“全部的”互补性。
如本文中所用的术语“核酸盒”或“表达盒”是指可以表达RNA并且随后表达多肽的载体内的基因序列。在一个实施例中，核酸盒含有一个或多个目的基因，例如一个或多个目的多核苷酸。在另一个实施例中，核酸盒含有一个或多个表达控制序列，例如启动子、增强子、poly(A)序列以及一个或多个目的基因，例如一个或多个目的多核苷酸。载体可以包括一、二、三、四、五个或更多个核酸盒。根据位置和序列将核酸盒定向在载体内，使得盒中的核酸可以转录成RNA，并且当需要时翻译成蛋白质或多肽，经历转化的细胞的活性所需要的适当翻译后修饰，并且通过靶向适当胞内区室或分泌到胞外区室中而易位到适当区室以获得生物活性。优选地，盒具有其适合于插入到载体中的3'和5'端，例如其在每个端处具有限制性核酸内切酶位点。在优选实施例中，核酸盒含有用于治疗、预防或改善遗传病症的治疗基因的序列。盒可以以单一单位的形式移出并插入到质粒或病毒载体中。
如本文所用，术语“一个或多个目的多核苷酸”是指插入到期望待表达的表达载体中的一个或多个多核苷酸，例如编码多肽的多核苷酸(即，目的多肽)。在优选实施例中，载体和/或质粒包括一个或多个目的多核苷酸，例如编码珠蛋白多肽的多核苷酸、抗镰状珠蛋白多肽、腺苷脱氨酶多肽、白细胞介素2受体γ多肽、三肽基肽酶1多肽、α-L艾杜糖醛酸酶多肽、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶多肽或ATP结合盒亚家族D(ALD)成员1(ABCD1)多肽。在某些实施例中，目的多核苷酸编码在治疗、预防或改善造血系统疾病或病症时提供治疗作用的多肽，所述多肽可被称为“治疗性多肽”，例如珠蛋白基因。参见例如美国专利6,051,402和7,901,671，所述专利的完整公开和权利要求具体通过引用并入本文。
在某些其它实施例中，目的多核苷酸编码在治疗、预防或改善肾上腺脑白质营养不良或肾上腺脊髓神经病时提供治疗作用的多肽，所述多肽可被称为“治疗性多肽”，例如ABCD1基因。参见例如美国专利5，869，039和6，013，769，所述专利的完整公开和权利要求具体通过引用并入本文。
如本文中所用的术语“珠蛋白”是指能够共价或非共价地结合血红素部分并且可以因此输送或储存氧的所有蛋白质或蛋白质亚基。术语珠蛋白包含脊椎动物和无脊椎动物血红蛋白、脊椎动物和无脊椎动物肌红蛋白或其变体的亚基。术语不包含血蓝蛋白。珠蛋白的实例包含α-珠蛋白或其变异体、β-珠蛋白或其变异体、γ-珠蛋白或其变异体以及δ-珠蛋白或其变异体。
在一个实施例中，目的多核苷酸是编码为血红蛋白病的治疗提供治疗功能的多肽的转基因，例如α-珠蛋白、γ-珠蛋白、β-珠蛋白或抗镰状β-珠蛋白，例如β-珠蛋白A-T87Q。目的多核苷酸和由其编码的多肽包含编码野生型多肽的多核苷酸以及其功能变异体和片段两者。在特定实施例中，功能变异体具有相应的野生型参考多核苷酸或多肽序列的至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在某些实施例中，功能变异体或片段具有相应的野生型多肽的生物活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或至少110％或更多。适用于示例性实施例中的代表性多核苷酸序列包含但不限于编码α-珠蛋白、β-珠蛋白、β-珠蛋白A-T87Q、抗镰状珠蛋白、γ-珠蛋白以及δ珠蛋白的多核苷酸。
多核苷酸，不管编码序列本身的长度，都可以与其它DNA序列组合，使得其总长度可以显著变化，所述其它DNA序列如启动子和/或增强子、非翻译区(untranslated region，UTR)、Kozak序列、多腺苷酸化信号、额外限制酶位点、多克隆位点、内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site，IRES)、重组酶识别位点(例如LoxP、FRT和Att位点)、终止密码子、转录终止信号以及编码自切割多肽的多核苷酸、表位标签，如本文其它地方所公开或所属领域中已知的。因此设想可以利用几乎任何长度的多核苷酸片段，总长度优选地受预期重组DNA方案的制备和使用便利性限制。
术语“表达控制序列”是指包括能够指导、增加、调节或控制可操作地连接的多核苷酸的转录或表达的一个或多个启动子、增强子或其它转录控制元件或其组合的多核苷酸序列。在特定实施例中，本发明的载体包括对特定细胞、细胞类型或细胞谱系，例如靶细胞，具有特异性的一个或多个表达控制序列；也就是说，可操作地连接到对特定细胞、细胞类型或细胞谱系具有特异性的表达控制序列的多核苷酸的表达是在靶细胞中而不是在其它非靶细胞中表达的。载体中的对细胞具有特异性的所述一个或多个表达控制序列中的每一个表达控制序列可以在相同或不同的细胞类型中表达，这取决于所期望的治疗。在优选实施例中，载体包括对造血细胞，例如造血干细胞或祖细胞具有特异性的一个或多个表达控制序列。在其它优选实施例中，载体包括对造血细胞和/或红系细胞具有特异性的一个或多个表达控制序列。
如本文所用，术语“启动子”是指RNA聚合酶所结合到的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。术语“增强子”是指含有能够提供增强的转录的序列并且在一些情况下可以独立于其相对于另一个控制序列的定向起作用的一段DNA。增强子可以与启动子和/或其它增强子元件协作地或叠加地起作用。术语“启动子/增强子”是指含有能够提供启动子和增强子功能两者的序列的一段DNA。
在特定实施例中，载体包括外源、内源或异源控制序列，如启动子和/或增强子。“内源”控制序列是天然地与基因组中的指定基因连接的控制序列。“外源”控制序列是借助于遗传操纵(即，分子生物技术)与基因并接定位使得所述基因的转录通过所连接的增强子/启动子导引的控制序列。“异源”控制序列是来自与所遗传操纵的细胞不同的物种的外源序列。“合成”控制序列可以包括一个多个内源和/或外源序列和/或在体外或通过计算机模拟确定的序列的元件，所述元件为特定基因治疗提供最佳启动子和/或增强子活性。
术语“可操作地连接”是指其中所描述的组分处于允许其以其预期方式起作用的关系的并接。在一个实施例中，所述术语是指核酸表达控制序列(如启动子，和/或增强子或其它表达控制序列)与第二多核苷酸序列，例如目的多核苷酸之间的功能性连接，其中所述表达控制序列对应于第二序列导引核酸的转录。
如本文所用，术语“组成型表达控制序列”是指不断地或连续地引起可操作地连接的序列转录的启动子、增强子或启动子/增强子。组成型表达控制序列可以是允许在多种细胞和组织类型中表达的“遍在”启动子、增强子或启动子/增强子，或允许分别在多种限定细胞和组织类型中表达的“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子、增强子或启动子/增强子。说明性普遍存在的表达控制序列包含但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒猿猴病毒40(SV40)(例如早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自牛痘病毒的H5、P7.5和P11启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长反应1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)、真核翻译起始因子4A1(eukaryotic translation initiationfactor 4A1，EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDaβ成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人类ROSA 26基因座(Irions等人，(2007年)《自然·生物技术(Nature Biotechnology)》第25卷，第1477到1482页)、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子以及β-肌动蛋白启动子。
在特定实施例中，可能期望使用细胞、细胞类型、细胞谱系或组织特异性表达控制序列来实现所期望的多核苷酸序列的细胞类型特异性、谱系特异性或组织特异性表达(例如，仅在细胞类型、细胞谱系或组织的子集中或在具体发展阶段期间表达编码多肽的特定核酸)。
组织特异性启动子的说明性实例包含但不限于：B29启动子(B细胞表达)、runt转录因子(CBFa2)启动子(干细胞特异性表达)、CD14启动子(单核细胞性细胞表达)、CD43启动子(白细胞和血小板表达)、CD45启动子(造血细胞表达)、CD68启动子(巨噬细胞表达)、CYP450 3A4启动子(肝细胞表达)、肌间线蛋白启动子(肌肉表达)、弹性蛋白酶1启动子(胰腺腺泡细胞表达)、内皮糖蛋白(endoglin)启动子(内皮细胞表达)、成纤维细胞特异性蛋白1启动子(FSP1)启动子(成纤维细胞的细胞表达)、粘连蛋白(fibronectin)启动子(成纤维细胞的细胞表达)、fms相关酪氨酸激酶1(FLT1)启动子(内皮细胞表达)、胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)启动子(星形胶质细胞表达)、胰岛素启动子(胰腺β细胞表达)、整合素α2b(ITGA2B)启动子(巨核细胞)、细胞内粘附分子2(ICAM-2)启动子(内皮细胞)、干扰素β(IFN-β)启动子(造血细胞)、角蛋白5启动子(角化细胞表达)、肌红蛋白(MB)启动子(肌肉表达)、成肌分化1(MYOD1)启动子(肌肉表达)、肾病蛋白(nephrin)启动子(足细胞表达)、骨γ-羧基谷氨酸蛋白2(OG-2)启动子(成骨细胞表达)、3-含氧酸辅酶A转移酶2B(Oxct2B)启动子(单倍体精细胞表达)、表面活性蛋白B(SP-B)启动子(肺表达)、突触蛋白启动子(神经元表达)、维斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白(Wiskott-Aldrich syndrome protein，WASP)启动子(造血细胞表达)。
在一个实施例中，载体包括选自由以下组成的群组的一个或多个造血细胞或组织特异性启动子和/或增强子：人类β-珠蛋白启动子；人类β-珠蛋白LCR；以及人类α-珠蛋白HS40增强子和锚蛋白-1启动子，其可操作地连接到编码珠蛋白多肽的多核苷酸。
在另一个实施例中，本发明的载体包括在小神经胶质细胞(microglial cell)中有活性的启动子，其可操作地连接到编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸。在某些实施例中，所述启动子包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子或其转录活性片段。
如本文所用，“条件表达”可以指任何类型的条件表达，包含但不限于诱导型表达；阻抑型表达；在具有特定生理、生物或疾病状态的细胞或组织中的表达；等。此定义不打算排除细胞类型或组织特异性表达。本发明的某些实施例提供了目的多核苷酸的条件表达，例如通过使细胞、组织、生物体等经历导致多核苷酸表达或导致由目的多核苷酸编码的多核苷酸的表达增加或减弱的处理或条件来对控制进行表达。
诱导型启动子/系统的说明性实例包含但不限于类固醇诱导型启动子，如用于编码糖皮质激素或雌激素受体的基因的启动子(通过用相应激素处理而诱导)；金属硫蛋白启动子(通过用各种重金属处理而诱导)；MX-1启动子(通过干扰素诱导)；“GeneSwitch”米非司酮可调节系统(Sirin等人，2003年，《基因(Gene)》，第323卷，第67页)；二甲氨基二硫代甲酸铜(cumate)诱导型基因开关(WO 2002/088346)；四环素依赖性调节系统等。
条件表达还可以通过使用位点特异性DNA重组酶实现。根据某些实施例，载体可以包括用于由位点特异性重组酶介导的重组的至少一个(典型地两个)位点。如本文中所用，术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”包含参与涉及一个或多个(例如二、三、四、五、七、十、十二、十五、二十、三十、五十等)重组位点的重组反应的切除型或整合型蛋白质、酶、辅因子或相关蛋白质，所述可以是野生型蛋白质(参见Landy，(1993年)《生物技术新见(CurrentOpinion in Biotechnology)》第3卷，第699页到707页)或其突变体、衍生物(例如含有重组蛋白序列的融合蛋白或其片段)、片段以及变异体。适用于本发明的特定实施例中的重组酶的说明性实例包含但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1和ParA。
载体可以包括用于多种位点特异性重组酶中的任何一种的一个或多个重组位点。应理解，除了例如逆转录病毒载体或慢病毒载体的载体的整合所需的任何一个或多个位点之外，还需要用于位点特异性重组酶的靶位点。如本文所用，术语“重组序列”、“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指重组酶所识别并且结合的特定核酸序列。
例如，用于Cre重组酶的一个重组位点是loxP，所述loxP是34个碱基对的序列，所述序列包括侧接8个碱基对的核心序列的两个13个碱基对的反向重复序列(充当重组酶结合位点)(参见Sauer,B.，(1994年)《生物技术新见(Current Opinion in Biotechnology)》第5卷，第521到527页的图1)。其它示例性loxP位点包含但不限于：lox511(Hoess等人，1996年；Bethke和Sauer，1997年)、lox5171(Lee和Saito，1998年)、lox2272(Lee和Saito，1998年)、m2(Langer等人，2002年)、lox71(Albert等人，1995年)以及lox66(Albert等人，1995年)。
适合FLP重组酶的识别位点包含但不限于：FRT(McLeod等人，1996年)、F1、F2、F3(Schlake和Bode，1994年)、F4、F5(Schlake和Bode，1994年)、FRT(LE)(Senecoff等人，1988年)、FRT(RE)(Senecoff等人，1988年)。
识别序列的其它实例是attB、attP、attL和attR序列，所述序列由重组酶λ整合酶，例如phi-c31识别。SSR介导仅异型位点attB(长度是34bp)与attP(长度是39bp)之间的重组(Groth等人，2000年)。分别针对细菌和噬菌体基因组上的噬菌体整合酶的连接位点而命名的attB和attP两者都含有很可能与同源二聚体结合的不完美反向重复序列(Groth等人，2000年)。产物位点attL和attR对进一步介导的重组实际上是惰性的(Belteki等人，2003年)，使得反应不可逆。对于催化插入，已经发现，与attP位点插入到基因组attB位点中相比，携有attB的DNA更容易插入到基因组attP位点中(Thyagarajan等人，2001年；Belteki等人，2003年)。因此，典型策略通过同源重组将携有attP的“对接位点”安置到限定基因座中，所述基因座然后与携有attB的进入序列搭配用于插入。
如本文所用，“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指促进直接内部核糖体进入到顺反子(蛋白质编码区)的起始密码子，如ATG)，由此导致基因的帽非依赖性翻译的元件。参见例如Jackson等人，(1990年)《生化科学趋势(Trends Biochem Sci)》第15卷，第12期，第477页到483页，以及Jackson和Kaminski，(1995年)《RNA》第1卷，第10期，第985页到1000页。在特定实施例中，载体包含编码一种或多种多肽的一个或多个目的多核苷酸。在特定实施例中，为了实现所述多种多肽中的每一种多肽的高效翻译，多核苷酸序列可以通过编码自我裂解多肽的一个或多个IRES序列或多核苷酸序列隔开。
如本文所用，术语“Kozak序列”是指极大地促进mRNA与核糖体的小亚基的初始结合并且增加翻译的短核苷酸序列。共有Kozak序列是(GCC)RCCATGG，其中R是嘌呤(A或G)(Kozak，(1986年)《细胞(Cell)》，第44卷，第2期，第283页到292页，和Kozak，(1987年)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》第15卷，第20期，第8125页到8148页)。在特定实施例中，本发明所设想的载体包括具有共有Kozak序列并且编码所期望的多肽的多核苷酸。
在某些实施例中，载体包括选择基因，选择基因又称为可选标记。典型的选择基因编码的蛋白质：(a)赋予对例如氨苄青霉素(ampicillin)、新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、博莱霉素(Zeocin)、杀稻瘟菌素(Blastocidin)或四环素等抗生素或其它毒素的抗性，(b)补充营养缺陷型缺乏(auxotrophicdeficiencies)，或(c)供应不能从复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。可以使用任何数目的选择系统来回收转化后的细胞系。这些选择基因包含但不限于分别可以用于tk-细胞或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，(1977年)《细胞(Cell)》第11卷，第223页到232页)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，(1990年)《细胞(Cell)》第22卷，第817页到823页)基因。
在各个实施例中，载体用于增加、建立和/或维持一种或多种多肽的表达。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物和其变异体和合成模拟物。因此，这些术语应用于一个或多个氨基酸残基为合成非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物，如相应天然存在的氨基酸的化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物。多肽的说明性实例包含但不限于适用于特定实施例的组合物和方法的珠蛋白多肽。此外，参见例如美国专利6，051，402；7，901，671；以及9，068，199，所述专利的完整公开和权利要求具体地说通过引用以其整体并入本文。
多肽的说明性实例还包含ABCD1多肽。此外，参见例如美国专利5，869，039；6，013，769；8，858，928以及9，061，031，所述专利的完整公开和权利要求具体地说通过引用以其整体并入本文。
多肽的进一步说明性实例包含但不限于珠蛋白多肽、抗镰状珠蛋白多肽、腺苷脱氨酶多肽、白细胞介素2受体γ多肽、三肽基肽酶1多肽、α-L艾杜糖醛酸酶多肽、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶多肽或ATP结合盒亚家族D(ALD)成员1(ABCD1)多肽。
本文中所设想的特定实施例还包含多肽“变异体”。所述叙述多肽“变异体”是指通过至少一个氨基酸残基的增加、缺失、截短、修饰和/或取代而区别于参考多肽并保留生物活性的多肽。在某些实施例中，多肽变异体通过一个或多个取代而区别于参考多肽，所述一个或多个取代可以是保守的或非保守的，如所属领域中已知。
在某些实施例中，变异体多肽包含与参考多肽的相应序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性或相似性的氨基酸序列。在某些实施例中，氨基酸增加或缺失发生在参考多肽的C端和/或N端处。
如上文所指出，本发明的多肽可以以不同方式改变，包含氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于这种操控的方法在所属领域中通常已知。例如，参考多肽的氨基酸序列变异体可以通过DNA中的突变制备。用于突变诱发和核苷酸序列改变的方法在所属领域中众所周知。参见例如Kunkel(1985年)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)》第82卷，第488页到492页；Kunkel等人，(1987年)《酶学方法(Methods in Enzymol)》，第154卷，第367页到382页；美国专利第4，873，192号；Watson,J.D.等人，(1987年)《基因分子生物学(Molecular Biology of the Gene)》，第四版，加利福尼亚州门洛帕克的本杰明-卡明斯公司(Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.)以及其中所引用的参考文献。关于不影响目的蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可能存在于Dayhoff等人，(1978年)蛋白序列和结构图集(Atlas of Protein Sequence and Structure)(《国家生物医学研究基础(Natl.Biomed.Res.Found.)》，华盛顿(Washington,D.C.))的模型中。
“宿主细胞”包含经过本发明的重组载体或多核苷酸体内、离体或体外转染、感染或转导的细胞。宿主细胞可以包含包装细胞、生产细胞和经病毒载体感染的细胞。在特定实施例中，向需要治疗的受试者施予经本发明的病毒载体感染的宿主细胞。在某些实施例中，术语“靶细胞”与宿主细胞可互换使用并且是指所期望的细胞类型的转染、感染或转导的细胞。在优选实施例中，靶细胞是干细胞或祖细胞。在某些优选实施例中，靶细胞是体细胞、例如成体干细胞、祖细胞或分化细胞。在特定优选实施例中，靶细胞是造血细胞，例如造血干细胞或祖细胞。另外的治疗性靶细胞在下文中进行讨论。
在特定实施例中，靶细胞是原代细胞。如本文中所用的术语“原代细胞”在所属领域中是已知的，是指已经从组织分离并已经建立用于体外或离体生长的细胞。相应的细胞已经经历了非常少的，如果有的话，群体倍增，因此与传代细胞系相比，它们更能代表它们所衍生的组织的主要功能组分，因此代表了体内状态的更具代表性的模型。从各个组织获得样品的方法和建立原代细胞系的方法在所属领域中是众所周知的(参见例如Jones和Wise，《分子生物学方法(Methods Mol Biol.)》1997年)。用于在本发明的方法中使用的原代细胞衍生自例如血液、淋巴瘤和上皮肿瘤。在一个实施例中，原代细胞是造血干细胞或祖细胞。
术语“干细胞”是指这样一种细胞，它是未分化细胞，能够(1)长期自我更新，或能够生成初始细胞的至少一个相同拷贝，(2)在单细胞水平下分化成多个，并且在一些情况下，仅一个特殊的细胞类型；以及(3)实现组织的体内功能性再生。根据干细胞的发育潜力将干细胞细分为全能、亚全能、多能以及寡能/单能。“自我更新”是指细胞具有产生未改变的子细胞并生成特殊的细胞类型(效力)的独特能力。自我更新可以通过两种方式实现。不对称细胞分裂产生一个与亲代细胞相同的子细胞和一个与亲代细胞不同的子细胞，所述与亲代细胞不同的子细胞是祖细胞或分化细胞。不对称细胞分裂并不增加细胞的数量。对称细胞分裂产生两个相同的子细胞。细胞的“增殖”或“扩增”是指对称分裂的细胞。
如本文中所用，术语“祖代(progenitor)”或“祖细胞(progenitor cell)”是指具有自我更新并分化成多个成熟细胞的能力的细胞。许多祖细胞沿着单一谱系分化，但可能具有相当广泛的增殖能力。
造血干细胞(HSC)产生定向(committed)造血祖细胞(hematopoietic progenitorcell，HPC)，所述祖细胞能够在生物体的整个生命周期中生成整个成熟血细胞库。术语“造血干细胞”或“HSC”是指产生生物体的所有血细胞类型的多能干细胞，包含骨髓(例如单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)和淋巴谱系(例如T细胞、B细胞、NK细胞)以及所属领域中已知的其它细胞(参见Fei,R.等人，美国专利第5,635,387号；McGlave等人，美国专利第5,460,964号；Simmons,P.等人，美国专利第5,677,136号；Tsukamoto等人，美国专利第5,750,397号；Schwartz等人，美国专利第5,759,793号；DiGuisto等人，美国专利第5,681,599号；Tsukamoto等人，美国专利第5,716,827号)。当移植到被致死性照射过的动物或人类中时，造血干细胞和祖细胞可以重建(repopulate)红细胞、嗜中性粒细胞-巨噬细胞、巨核细胞以及淋巴造血细胞池。
大规模病毒颗粒产生通常为实现合理病毒滴度所必需。病毒颗粒通过将转移载体转染到包括病毒结构和/或辅助基因，例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因或其它逆转录病毒基因的包装细胞系中而产生。
如本文所用，术语“包装载体”是指不具有包装信号并且包括编码一种、两种、三种、四种或更多种病毒结构和/或辅助基因的多核苷酸的表达载体或病毒载体。典型地，包装载体包含于包装细胞中，并且通过转染、转导或感染引入到细胞中。用于转染、转导或感染的方法为所属领域的技术人员所熟知。特定实施例中所设想的逆转录病毒/慢病毒转移载体可以通过转染、转导或感染引入到包装细胞系中以生成生产细胞或细胞系。可以通过标准方法将包装载体引入到人类细胞或细胞系中，所述方法包含例如磷酸钙转染、脂质体转染或电穿孔。在一些实施例中，包装载体与显性可选标记，如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟素、博莱霉素、胸苷激酶、DHFR、GIn合成酶或ADA一起引入到细胞中，随后在适当药物存在下选择并且分离克隆。可选标记基因可以实体地连接到由包装载体，例如IRES或自我断裂病毒肽，编码的基因。
病毒包膜蛋白(env)确定了最终可以被由细胞系生成的重组逆转录病毒感染和转化的宿主细胞的范围。在慢病毒，如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIV的情况下，env蛋白包含gp41和gp120。优选地，如先前已经所描述，由本发明的包装细胞表达的病毒env蛋白编码于与病毒gag和pol基因分开的载体上。
可以用于本发明中的逆转录病毒衍生的env基因的说明性实例包含但不限于：MLV包膜、10A1包膜、BAEV、FeLV-B、RD114、SSAV、埃博拉(Ebola)、仙台(Sendai)、FPV(禽瘟疫病毒)和流感病毒包膜。类似地，可以利用编码来自RNA病毒(例如小RNA病毒科(Picornaviridae)、杯状病毒科(Calciviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、双RNA病毒科(Birnaviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)的RNA病毒)以及来自DNA病毒(肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、环状病毒科(Circoviridae)、微小病毒科(Parvoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxyiridae)和虹彩病毒科(Iridoviridae))的包膜的基因。代表性实例包含FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、狂犬病、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10以及EIAV。
在其它实施例中，用于假型化本发明病毒的包膜蛋白包含但不限于以下病毒中的任何一种：A型流感如H1N1、H1N2、H3N2和H5N1(禽流感)、B型流感、C型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、轮状病毒、诺瓦克病毒组(Norwalk virus group)的任何病毒、肠溶腺病毒、微小病毒、登革热(Dengue fever)病毒、猴痘、单链负义病毒目(Mononegavirales)、狂犬病毒属(Lyssavirus)如狂犬病病毒、拉各斯蝙蝠病毒(Lagos bat virus)、莫科拉病毒(Mokola virus)、杜文黑基病毒(Duvenhagevirus)、欧洲蝙蝠病毒(European bat virus)1与2和澳大利亚蝙蝠病毒(Australian batvirus)、短暂热病毒属(Ephemerovirus)、水泡病毒属(Vesiculovirus)、水泡性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒如单纯疱疹病毒1和2型、水痘带状疱疹、巨细胞病毒、埃-巴二氏病毒(EBV)、人疱疹病毒(HHV)、人疱疹病毒6和8型、人免疫缺陷病毒(HIV)、乳头瘤病毒、鼠γ疱疹病毒、沙粒病毒如阿根廷(Argentine)出血热病毒、玻利维亚(Bolivian)出血热病毒、Sabia相关出血热病毒、委内瑞拉(Venezuelan)出血热病毒、拉沙热病毒(Lassa fevervirus)、马丘波病毒(Machupo virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、布尼亚病毒科如克里米亚-刚果(Crimean-Congo)出血热病毒、汉坦病毒(Hantavirus)、导致出血热与肾综合征的病毒、立夫特山谷(Rift Valley)热病毒、丝状病毒科(丝状病毒)包含埃博拉出血热和马堡(Marburg)出血热、黄病毒科包含卡依萨努森林病(Kaysanur Forest disease)病毒、鄂木斯克(Omsk)出血热病毒、导致蜱传脑炎的病毒、和副粘病毒科如亨德拉病毒(Hendra virus)和尼帕病毒(Nipah virus)、重型天花和轻型天花(天花)、甲病毒(alphavirus)如委内瑞拉马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)、西尼罗病毒(West Nile virus)、任何导致脑炎的病毒。
在一个实施例中，设想了包装细胞，所述包装细胞产生经过VSV-G糖蛋白假型化的重组逆转录病毒，例如慢病毒。
如本文所用，术语“假型”或“假型化”是指病毒包膜蛋白已经被另一个具有优选特征的病毒的病毒包膜蛋白取代的病毒。例如，HIV可以经水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白假型化，所述包膜蛋白允许HIV感染更广泛范围的细胞，因为HIV包膜蛋白(由env基因编码)通常使病毒靶向CD4+呈现细胞。在优选实施例中，慢病毒包膜蛋白经VSV-G假型化。在一个实施例中，包装细胞产生经VSV-G包膜糖蛋白假型化的重组逆转录病毒，例如慢病毒。
如本文所用，术语“包装细胞系”关于不含有包装信号但稳定或瞬时表达为正确包装病毒颗粒所需的病毒结构蛋白和复制酶(例如gag、pol和env)的细胞系使用。在特定实施例中，可以采用合适的细胞系来制备本发明的包装细胞。一般来说，细胞是哺乳动物细胞。在特定实施例中，用于产生包装细胞系的细胞是人类细胞。可以使用的合适的细胞系包含例如CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞以及211A细胞。在优选实施例中，包装细胞是293细胞、293T细胞、293F细胞或A549细胞。
如本文所用，术语“生产细胞系”是指能够产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系，所述细胞系包括包装细胞系和包括包装信号的转移载体构建体。感染性病毒颗粒和病毒储备溶液的产生可以使用常规技术执行。制备病毒储备溶液的方法在所属领域中是已知的并且由例如Y.Soneoka等人(1995年)《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》第23卷，第628页到633页；和N.R.Landau等人(1992年)《病毒学杂志(J.Virol.)》第66卷，第5110页到5113页说明。感染性病毒颗粒可以使用常规技术从包装细胞收集。例如，如所属领域中已知，感染性颗粒可以通过细胞溶解或收集细胞培养物的上清液而收集。任选地，所收集的病毒颗粒在必要时可以经纯化。合适的纯化技术是所属领域的技术人员众所周知的，例如Kutner等人，《BMC生物技术(BMC Biotechnol)》，2009年；第9卷:第10页。doi:10.1186/1472-6750-9-10；Kutner等人《自然实验手册(Nat.Protoc.)》2009年；第4卷，第4期，第495到505页。doi:10.1038/nprot.2009.22。
“提高”或“促进”或“增加”或“扩大”一般是指与通过媒剂或对照分子/组合物转导的细胞的数量相比，本文中所设想的组合物和/或方法引起、导致或产生更高数量的已转导细胞的能力。在一个实施例中，与现有的转导组合物和方法相比，经过本文中所设想的组合物和方法转导的造血干细胞或祖细胞包括增加数量的已转导细胞。细胞转导的增加可以使用所属领域中已知的方法确定，如报告基因分析(reporter assay)、RT-PCR以及细胞表面蛋白质表达。转导的“增加的”或“提高的”量典型地是“统计显著”量，并且可以包含通过媒剂、对照组合物或其它转导方法转导的细胞的数量的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如500、1000倍)(包含在这些数之间并大于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加量。
“减少”或“降低”或“减轻”或“减小”或“减量”一般是指与经过根据本发明的组合物和/或方法转导的细胞相比，造成相对较少的已转导细胞的组合物或方法。转导的细胞的“减少量”或“减小的”量典型地是“统计显著”量，并且可以包含通过根据本发明的组合物和/或方法产生的已转导细胞(参考反应)的数量的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如500、1000倍)(包含在这些数之间并大于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的减少量。
“维持(maintain)”或“保持”或“维持(maintenance)”或“没变化”或“基本上没变化”或“没有显著减少”一般是指与由媒剂、对照分子/组合物引起的反应或特定细胞中的反应相当的生理反应。相当的反应是与参考反应并无显著不同或可测量不同的反应。
在以下描述中，阐述某些具体细节以便提供对本文中所设想的本发明的各种说明性实施例的透彻理解。然而，所属领域的技术人员应理解，特定的说明性实施例没有这些细节也能实践。另外，应理解，本申请对衍生自本文中所述的结构和取代基的各种组合的单独的载体或载体组的公开程度就如同每个载体或每组载体单独地阐述一样。因此，特定载体结构或特定取代基的选择在本发明的范围内。
C.试剂
本文中所设想的各个实施例源自以下意外发现：通过使细胞在体外、离体或体内与本文中所设想的逆转录病毒和增加转导效率或VCN的一种或多种试剂接触，转导效率和/或VCN显著增加。在各个实施例中，通过使细胞在体外、离体或体内与逆转录病毒、星形孢菌素单独地或与刺激前列腺素EP受体信号传导途径的一种或多种试剂组合地，以及任选地与一种或多种聚阳离子聚合物或肽接触，转导效率显著增加。
1.星形孢菌素
出人意料的是，本发明人已经发现，通过在逆转录病毒和星形孢菌素以及其模拟物和衍生物存在下培养细胞，包括造血干细胞和祖细胞的细胞群体的转导效率和/或VCN可能增加。
星形孢菌素是一种在星形孢链霉菌(Streptomyces staurospores)中产生的生物碱，最初在1977年作为抗真菌剂。星形孢菌素是一种广谱蛋白激酶抑制剂，抑制以下激酶：如例如蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)、磷酸化酶激酶、核糖体蛋白S6激酶、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGF-R)激酶以及Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(Ca/CaM PKII)。对PKC的抑制效力最强(IC50＝2.7nM)，但是对其它蛋白激酶的抑制效力则要低几倍。星形孢菌素对一些哺乳动物肿瘤细胞系展现强烈的细胞毒性，诱导细胞凋亡，并专门在细胞分裂后立即阻止裂殖酵母细胞伸长。
在一个实施例中，通过在逆转录病毒和星形孢菌素以及其模拟物和衍生物存在下培养细胞，包括造血干细胞和祖细胞的细胞群体的转导效率和/或VCN可能增加。
在各个实施例中，在逆转录病毒和星形孢菌素存在下培养细胞群体。
2.前列腺素EP受体信号传导途径激动剂
出人意料的是，本发明人还已经发现，通过在逆转录病毒、星形孢菌素以及刺激前列腺素EP受体信号传导途径的一种或多种试剂以及其模拟物和衍生物存在下培养细胞，包括造血干细胞和祖细胞的细胞群体的转导效率和/或VCN可能增加。
在特定实施例中，包括造血干细胞或祖细胞的细胞群体通过在逆转录病毒存在下在星形孢菌素和刺激前列腺素EP受体信号传导途径的一种或多种试剂，即前列腺素EP受体信号传导途径激动剂存在下培养所述细胞来转导。
刺激前列腺素EP受体信号传导的试剂包含但不限于小分子，或各自通过引用以其整体并入本文中的WO 2007/112084和WO 2010/108028中所公开的那些化合物。如本文中所用，术语“刺激前列腺素EP受体信号传导”、“激活前列腺素EP受体信号传导”或“增加前列腺素EP受体信号传导”一般是指，与不存在所述一种或多种试剂的情况下前列腺素EP受体下游的细胞信号传导活性相比，试剂能够增加与所述一种或多种试剂接触的细胞中的前列腺素EP受体下游的细胞信号传导活性。可以用于测量前列腺素EP受体信号传导途径的激活或刺激的试验是所属领域中已知的，并且描述于例如通过引用以其整体并入本文中的WO2010/108028中。
刺激前列腺素EP受体信号传导途径的试剂的说明性实例包含但不限于小分子，例如有机小分子、前列腺素、Wnt途径激动剂、cAMP/PI3K/AKT途径激动剂、Ca2+第二信使途径激动剂、一氧化氮(NO)/血管紧张素信号传导激动剂以及选自由以下组成的群组的已知能刺激前列腺素信号传导途径的其它化合物：美贝维林(Mebeverine)、氟氢缩松(Flurandrenolide)、阿替洛尔(Atenolol)、吲哚洛尔(Pindolol)、加波沙朵(Gaboxadol)、犬尿酸(Kynurenic Acid)、肼酞嗪(Hydralazine)、噻苯咪唑(Thiabendazole)、荷包牡丹碱(Bicuclline)、维沙米可(Vesamicol)、黄夹次甙甲(Peruvoside)、丙咪嗪(Imipramine)、氯磺丙脲(Chlorpropamide)、1,5-五亚甲基四唑、4-氨基吡啶、二氮嗪(Diazoxide)、苯磷硫胺(Benfotiamine)、12-甲氧基十二碳烯酸、N-甲酰基-Met-Leu-Phe、加拉明(Gallamine)、IAA94、氯烯雌醚(Chlorotrianisene)以及这些化合物的衍生物。
在特定实施例中，刺激前列腺素途径的试剂是天然存在的或合成的化学分子或多肽，所述化学分子或多肽与EP受体结合和/或相互作用，典型地用于激活或增加与前列腺素EP受体相关联的下游信号传导途径中的一个或多个途径。
在一个实施例中，刺激前列腺素途径的试剂选自由以下组成的群组：PGA2；PGB2；PGD2；PGE1(前列地尔(Alprostadil))；PGE2；PGF2；PGI2(依前列醇(Epoprostenol))；PGH2；PGJ2；以及其衍生物和模拟物。
刺激前列腺素途径的额外的说明性的试剂包含但不限于15d-PGJ2；δ12-PGJ2；2-羟基十七碳三烯酸(HHT)；凝血恶烷(TXA2和TXB2)；PGI2模拟物，例如伊洛前列素和曲前列环素；PGF2模拟物，例如曲伏前列素、卡前列素氨丁三醇、他氟前列腺素、拉坦前列素、比马前列素、异丙基乌诺前列酮、氯前列烯醇、奥斯特凡和苏泊凡；PGE1模拟物，例如11-脱氧PGE1、迷索前列醇和布他前列素；以及科里醇(Corey alcohol)-A[[3aα,4α,5β,6aα]-(-)-[六氢-4-(羟甲基)-2-氧代-2H-环戊并/b/呋喃-5-基][1,1′-联苯]-4-甲酸酯]；科里醇-B[2H-环戊并[b]呋喃-2-酮,5-(苯甲酰氧基)六氢-4-(羟甲基)[3aR-(3aα,4α,5β,6aα)]]；以及科里二醇((3aR,4S,5R,6aS)-六氢-5-羟基-4-(羟甲基)-2H-环戊并[b]呋喃-2-酮)。
在一个实施例中，试剂是前列腺素EP受体配体，包含但不限于前列腺素E2(PGE2)，以及其“模拟物”或“衍生物”。前列腺素一般是指衍生自含有20个碳原子的脂肪酸的激素样分子，包含5碳环，如本文所述并且是所属领域中已知的。
PGE2“模拟物”或“衍生物”的说明性实例包含但不限于16,16-二甲基PGE2、16-16二甲基PGE2对(对乙酰胺基苯甲酰胺基)苯酯、11-脱氧-16,16-二甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基-16,16-二甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基PGE2、9-酮基氟前列醇(Fluprostenol)、5-反式PGE2、17-苯基-ω-三去甲PGE2、PGE2丝氨醇酰胺、PGE2甲酯、16-苯基四去甲PGE2、15(S)-15-甲基PGE2、15(R)-15-甲基PGE2、8-异-15-酮基PGE2、8-异PGE2异丙酯、20-羟基PGE2、诺氯前列素(nocloprost)、硫前列酮、布他前列素、15-酮基PGE2以及19(R)羟基PGE2。
本文中还设想了与PGE2具有类似结构的前列腺素模拟物或衍生物，所述前列腺素模拟物或衍生物在9-位置处由卤素(参见例如通过引用以其整体并入本文的WO 2001/12596)，以及2-脱羧基-2-一元膦酸基前列腺素衍生物，如通过引用以其整体并入本文的美国公开号2006/0247214中所描述的那些衍生物取代。
在一些实施例中，化合物是并非基于PGE2的配体。在某些实施例中，并非基于PGE2的配体选自由EP1激动剂、EP2激动剂、EP3激动剂以及EP4激动剂组成的群组。
在特定实施例中，前列腺素EP受体选自EP1、EP2、EP3和EP4。
并非基于PGE2的EP1激动剂的说明性实例包含但不限于ONO-DI-004和ONO-8713。并非基于PGE2的EP2激动剂的说明性实例包含但不限于CAY10399、ONO_8815Ly、ONO-AE1-259和CP-533，536。并非基于PGE2的EP2激动剂的额外实例包含WO 2007/071456中所公开的咔唑和芴，其中关于这类试剂的公开内容通过引用并入本文中。并非基于PGE2的EP3激动剂的说明性实例包含但不限于AE5-599、MB28767、GR 63799X、ONO-NT012以及ONO-AE-248。I并非基于PGE2的EP4激动剂的说明性实例包含但不限于ONO-4819、APS-999Na、AH23848以及ONO-AE 1-329。并非基于PGE2的EP4激动剂的额外实例可以见于WO 2000/038663；美国专利第6,747,037号；和美国专利第6,610,719号中，这些专利中关于这类激动剂的公开内容各自通过引用并入。
在一个实施例中，刺激前列腺素EP受体信号传导途径的试剂是Wnt激动剂。Wnt激动剂的说明性实例包含但不限于Wnt多肽和糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂。适用作刺激前列腺素EP受体信号传导途径的化合物的wnt多肽的说明性实例包含但不限于Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt7c、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt8c、WntlOa、WntlOb、Wntl1、Wntl4、Wntl5或Wntl5以及其生物活性片段。
适用作刺激前列腺素EP受体信号传导途径的试剂的GSK3抑制剂与GSK3α或GSK3β结合并降低其活性。GSK3抑制剂的说明性实例包含但不限于BIO(6-溴靛红-3'-肟)、LiCl或其它GSK-3抑制剂，如在美国专利6,057,117和6,608,063；以及美国申请2004/0092535和2004/0209878中举例说明的；ATP竞争性选择性GSK-3抑制剂CHIR-911和CHlR-837(分别还被称为CT-99021和CT-98023)。凯龙公司(Chiron Corporation)(加利福尼亚州爱莫利维尔(Emeryville,CA))。
在另一个实施例中，刺激前列腺素EP受体信号传导途径的试剂增加cAMP/P13K/AKT第二信使途径的信号传导并且选自由以下组成的群组：二丁酰基cAMP(DBcAMP)、佛波酯(phorbol ester)、毛喉素(forskolin)、斯凯瑞蓝(sclareline)、8-溴-cAMP、霍乱毒素(CTx)、氨茶碱、2,4二硝基苯酚(DNP)、去甲肾上腺素、肾上腺素、异丙基肾上腺素、异丁基甲基黄嘌呤(isobutylmethylxanthine，IBMX)、咖啡因、茶碱(二甲基黄嘌呤)、多巴胺、咯利普兰(rolipram)、伊洛前列素、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide，PACAP)和血管活性肠多肽(vasoactive intestinalpolypeptide，VIP)以及这些试剂的衍生物。
在又另一个实施例中，刺激前列腺素EP受体信号传导途径的试剂增加Ca2+第二信使途径的信号传导并且选自由以下组成的群组：Bapta-AM、芬地林(Fendiline)、尼卡地平(Nicardipine)以及这些试剂的衍生物。
在另一个实施例中，刺激前列腺素EP受体信号传导途径的试剂增加NO/血管紧张素信号传导途径的信号传导并且选自由以下组成的群组：L-Arg、硝普钠(SodiumNitroprusside)、钒酸钠、缓激肽(Bradykinin)以及其衍生物。
在一个实施例中，提供一种改良转导效率和/或增加VCN的方法，所述方法包括与逆转录病毒和星形孢菌素以及选自由以下组成的群组的增加前列腺素EP受体信号传导的一种或多种试剂一起培养细胞群体：前列腺素PGE2；PGD2；PGI2；亚油酸；13(s)-HODE；LY171883；米德酸；二十碳三烯酸；环氧二十碳三烯酸；ONO-259；Cay1039；aPGE2受体激动剂；16,16-二甲基PGE2；19(R)-羟基PGE2；16,16-二甲基PGE2对(对乙酰胺基苯甲酰胺基)苯酯；11-脱氧-16,16-二甲基PGE2；9-脱氧-9-亚甲基-16,16-二甲基PGE2；9-脱氧-9-亚甲基PGE2；布他前列素；硫前列酮；PGE2丝氨醇酰胺；PGE2甲酯；16-苯基四去甲PGE2；15(S)-15-甲基PGE2；15(R)-15-甲基PGE2；BIO；8-溴-cAMP；毛喉素；Bapta-AM；芬地林；尼卡地平；硝苯地平(Nifedipine)；哌迷清(Pimozide)；毒毛旋花子甙元(Strophanthidin)；毛花洋地黄苷(Lanatoside)；L-Arg；硝普钠；钒酸钠；缓激肽；美贝维林；氟氢缩松；阿替洛尔；吲哚洛尔；加波沙朵；犬尿酸；肼酞嗪；噻苯咪唑；荷包牡丹碱；维沙米可；黄夹次甙甲；丙咪嗪；氯磺丙脲；1,5-五亚甲基四唑；4-氨基吡啶；二氮嗪；苯磷硫胺；12-甲氧基十二碳烯酸；N-甲酰基-Met-Leu-Phe；加拉明；IAA 94；以及氯烯雌醚。
在特定实施例中，改良转导效率和/或增加VCN的方法包括与逆转录病毒和星形孢菌素以及作为前列腺素EP受体的配体的一种或多种试剂一起培养细胞群体，所述一种或多种试剂选自由以下组成的群组：PGE2、16,16-二甲基PGE2、16-16二甲基PGE2对(对乙酰胺基苯甲酰胺基)苯酯、11-脱氧-16,16-二甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基-16,16-二甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基PGE2、9-酮基氟前列醇、5-反式PGE2、17-苯基-ω-三去甲PGE2、PGE2丝氨醇酰胺、PGE2甲酯、16-苯基四去甲PGE2、15(S)-15-甲基PGE2、15(R)-15-甲基PGE2、8-异-15-酮基PGE2、8-异PGE2异丙酯、20-羟基PGE2、诺氯前列素、硫前列酮、布他前列素、15-酮基PGE2以及19(R)羟基PGE2。
在特定实施例中，刺激前列腺素EP受体途径的试剂是PGE2或16,16-二甲基PGE2。
在一个实施例中，刺激前列腺素EP受体途径的试剂是PGE2。
在各个实施例中，在逆转录病毒、星形孢菌素以及刺激前列腺素EP受体信号传导途径的一种或多种试剂存在下培养细胞群体。
3.聚阳离子聚合物
在特定实施例中，在逆转录病毒、刺激前列腺素EP受体信号传导途径的试剂、星形孢菌素以及聚阳离子聚合物存在下培养包括造血干细胞或祖细胞的造血细胞群体以增加转导效率和/或VCN。
“聚阳离子聚合物”是指带电荷的聚合物，其重复单元携带正电荷，其中重复单元上的正电荷源于质子化的氮部分。适用于本文中所设想的特定实施例的聚阳离子聚合物的说明性实例包含但不限于聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚(乙二醇)-聚(L-赖氨酸)嵌段共聚物(poly(ethylene glycol)-poly(L-lysine)block copolymer，PEG-PLL)、1,5-二甲基-,5-二氮杂-十一碳-甲基-聚甲溴化物(聚凝胺)、聚阳离子肽，例如聚-L-赖氨酸，以及硫酸鱼精蛋白。
D.病毒载体
逆转录病毒载体和慢病毒载体经过测试发现，它们是用于将目的基因，例如编码治疗性多肽的基因稳定引入广泛范围的靶细胞的基因组中的合适的递送媒剂。本文中所设想的特定实施例将改良的基因治疗载体的转导效率和/或VCN提供给细胞群体，对受试者施用所述细胞群体以提供基因治疗。
在一个实施例中，载体是转移载体。虽然技术人员应了解，这类转移载体可以使用各种不同的病毒载体产生，但是在特定实施例中，转移载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体，部分地因为慢病毒载体能够将转基因在体外和体内两者中高效递送、整合到非分裂细胞中并长期表达。所属领域中已知各种慢病毒载体，参见Naldini等人(1996a、1996b和1998)；Zufferey等人(1997)；Dull等人，1998；美国专利第6,013,516号和第5,994,136号，所述慢病毒载体中的任何载体可以用于产生本文中所设想的转移载体。
一般来说，这些载体是基于质粒或基于病毒的，并被配置成携带用于将编码治疗性多肽的核酸转移到宿主细胞中所必需的序列。
在说明性实施例中，逆转录病毒载体是慢病毒载体。因此，载体可以衍生自人类免疫缺陷-1(HIV-1)、人类免疫缺陷-2(HIV-2)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、Jembrana病病毒(Jembrana Disease Virus，JDV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)等。结合本发明的大多数方面，基于HIV的载体主链(即，HIV顺式作用序列元件和HIV gag、pol和rev基因)一般是优选的，因为基于HIV的构建体对人类细胞的转导最有效。
尽管特定的说明性实施例包含用于校正例如血红蛋白病的造血系统病症的载体、组合物和方法的更详细描述，但是本文中所设想的实施例不应视为受本公开的限制。所属领域的技术人员容易了解，本文中所说明的原理可以应用于其它系统中的基因治疗，例如神经系统，包含眼睛、中枢神经系统以及外周神经系统；循环系统；肌肉系统；骨骼系统；器官，包含皮肤、心脏、肺、胰、肝、肾、肠等。
在一个实施例中，逆转录病毒载体包括表达控制序列，所述表达控制序列指导目的多核苷酸，例如珠蛋白基因在特定细胞类型或细胞谱系中的表达。细胞类型或细胞谱系表达控制序列的使用提供了将多核苷酸表达限制在单个谱系中的所期望的细胞分化阶段的安全优势；并且因此，本发明的载体减轻了不需要的细胞类型中多肽的异位表达所要处理的问题。
在一个非限制性实例中，表达控制序列可以是如本文其它地方所公开的普遍存在的表达控制序列。
在另一个非限制性实例中，表达控制序列可以是干细胞特异性表达控制序列，它指导目的多核苷酸在胚胎干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、心脏干细胞、肾干细胞或造血干细胞中的干细胞特异性表达。
在又另一个非限制性实例中，表达控制序列可以是细胞类型或细胞谱系特异性表达控制序列，它指导目的多核苷酸在造血干细胞、造血祖细胞、骨髓细胞、淋巴细胞、血栓形成谱系、肥大细胞、红细胞生成谱系细胞、粒细胞生成谱系细胞以及单核细胞生成谱系细胞中的表达。
在特定实施例中，本文中所设想的载体在一种或多种或所有造血细胞中表达多核苷酸，例如目的基因，所述造血细胞包含但不限于造血干细胞、造血祖细胞、骨髓祖细胞、淋巴祖细胞、血栓形成性祖细胞、红细胞祖细胞、粒细胞生成性祖细胞、单核细胞生成性祖细胞、原巨核细胞、幼巨核细胞、巨核细胞、凝血细胞/血小板、原成红细胞、嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞、正染性成红细胞、多染性红细胞、红细胞(RBC)、嗜碱性前髓细胞、嗜碱性髓细胞、嗜碱性后髓细胞、嗜碱粒细胞、嗜中性前髓细胞、嗜中性髓细胞、嗜中性后髓细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性前髓细胞、嗜酸性髓细胞、巨噬细胞、树突状细胞、成淋巴细胞、前淋巴细胞、自然杀伤(natural killer，NK)细胞、小淋巴细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、浆细胞以及淋巴树突状细胞。
在优选实施例中，载体在一个或多个红系细胞中表达多核苷酸，例如目的基因，所述红系细胞例如原成红细胞、嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞、正染性成红细胞、多染性红细胞以及红细胞(RBC)。
在一个实施例中，载体包括可操作地连接于目的基因，例如珠蛋白的造血细胞启动子、增强子或启动子/增强子。
合适的细胞类型或细胞谱系特异性表达控制序列包含但不限于造血细胞表达控制序列，如例如造血干细胞启动子和造血祖细胞启动子。在期望目的基因在一个或多个红系细胞中表达的实施例中，合适的造血细胞表达控制序列可以包含但不限于红系细胞特异性启动子和任选地红系细胞特异性增强子、人类β-珠蛋白启动子、人类β-珠蛋白LCR或人类α-珠蛋白HS40增强子以及锚蛋白-1启动子。
在一个实施例中，合适的细胞类型或细胞谱系特异性表达控制序列包含但不限于在小神经胶质细胞中有活性的启动子。在某些实施例中，所述启动子包括MND启动子或其转录活性片段，所述MND启动子或其转录活性片段可操作地连接于目的基因，例如ABCD1。
细胞类型或细胞谱系表达控制序列的使用提供了将多核苷酸表达限制在单个谱系中的所期望的细胞分化阶段的安全优势；并且因此，本文中所设想的载体减轻了不需要的细胞类型中多肽的异位表达所要处理的问题。在一个实施例中，载体包括一个或多个LTR，和可操作地连接于目的基因的表达控制序列。在相关实施例中，表达控制序列是选自由以下组成的群组的红系细胞特异性表达控制序列：人类β-珠蛋白启动子；人类β-珠蛋白LCR；以及人类α-珠蛋白HS40增强子和锚蛋白-1启动子。
在各个实施例中，载体设计将以治疗、预防或改善特定造血系统疾病、病症或病状为目标。例如，本发明设想用于基因治疗血红蛋白病的载体，所述载体包括选自由以下组成的群组的目的基因：人类α-珠蛋白、人类β-珠蛋白、人类δ-珠蛋白以及人类γ-珠蛋白，或其生物活性变异体或片段。在一个实施例中，珠蛋白基因选自由以下组成的群组：野生型人类β-珠蛋白基因、包括内含子序列的一个或多个缺失的有缺失的人类β-珠蛋白基因以及编码至少一个抗镰状氨基酸残基的突变型人类β-珠蛋白基因。
在特定实施例中，其中待治疗病状是血红蛋白病，例如地中海贫血或镰状细胞病，目的基因可以是抗镰状蛋白。如本文中所用，“抗镰状蛋白”是指预防或逆转会导致镰状细胞病状中红细胞镰状化的病理事件的多肽。在本发明的一个实施例中，使用本发明的已转导细胞向具有血红蛋白病状的受试者递送抗镰状蛋白。抗镰状蛋白还包含包括抗镰状氨基酸残基的突变型β-珠蛋白基因。
在优选实施例中，一种此类珠蛋白变异体是编码密码子87处的苏氨酸到谷氨酰胺突变(βA-T87Q)的人类βA-珠蛋白基因或人类βA-珠蛋白基因(珠蛋白多肽的成熟形式已经通过N端甲硫氨酸的切割进行加工，成熟珠蛋白多肽的密码子87是苏氨酸；全长非切割珠蛋白多肽的密码子88是苏氨酸)。其它抗镰状氨基酸残基是所属领域中已知的并且可以适用于本发明中。例如，参见美国专利6,051,402；美国专利5,861,488；美国专利6,670,323；美国专利5,864,029；美国专利5,877,288；以及Levasseur等人，《血液(Blood)》第102卷：第4312页到4319页(2003年)，所述专利通过引用并入本文。
在某些实施例中，使用包括红细胞特异性表达控制序列的载体治疗、预防或改善远远超出血红蛋白病的大量病症。红血细胞前体是有用的细胞群体，在所述细胞群体中表达能被分泌到循环中并因此得以全身递送的多肽。这种体内蛋白质递送的实例是人类因子IX，所述人类因子IX是乙型血友病患者中缺失的凝血因子，参见例如A.H.Chang等人，《分子治疗(Molecular Therapy)》(2008)，所述通过引用并入本文。
在一个实施例中，经本发明的载体转导的细胞可以用作针对体外、离体或体内蛋白质分泌的“厂”。例如，包括红系细胞特异性表达控制序列的载体可以用于从分化自HSC或分化自胚胎干细胞的红系细胞进行蛋白质的大规模体外生产。
可以以此方式表达的目的多核苷酸包含但不限于：腺苷脱氨酶、在溶酶体贮积病中受影响的酶、载脂蛋白E、脑源性神经营养因子(brain derived neurotropihic factor，BDNF)、骨形态生成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)、骨形态生成蛋白6(BMP-6)、骨形态生成蛋白7(BMP-7)、心营养素1(CT-1)、CD22、CD40、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、CCL1-CCL28、CXCL1-CXCL17、CXCL1、CXCL2、CX3CL1、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)、多巴胺、促红细胞生成素、因子IX、因子VIII、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、雌激素、FAS-配体、成纤维细胞生长因子1(FGF-1)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、成纤维细胞生长因子4(FGF-4)、成纤维细胞生长因子5(FGF-5)、成纤维细胞生长因子6(FGF-6)、成纤维细胞生长因子1(FGF-7)、成纤维细胞生长因子1(FGF-10)、Flt-3、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(granulocyte macrophage stimulating factor，GM-CSF)、生长激素、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、干扰素α(IFN-a)、干扰素β(IFN-b)、干扰素γ(IFNg)、胰岛素、胰高血糖素、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素9(IL-9)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素11(IL-11)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素13(IL-13)、白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素17(IL-17)、白细胞介素19(IL-19)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、巨噬细胞炎症蛋白3a(MIP-3a)、巨噬细胞炎症蛋白3b(MIP-3b)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、神经营养因子3(NT-3)、神经营养因子4(NT-4)、甲状旁腺激素、血小板衍生生长因子AA(platelet derived growth factorAA，PDGF-AA)、血小板衍生生长因子AB(PDGF-AB)、血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)、血小板衍生生长因子CC(PDGF-CC)、血小板衍生生长因子DD(PDGF-DD)、RANTES、干细胞因子(stem cell factor，SCF)、基质细胞衍生因子1(SDF-1)、睾酮、转化生长因子α(transforming growth factor alpha，TGF-a)、转化生长因子β(TGF-b)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-a)、Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt7c、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt8c、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt14、Wnt15或Wnt16、音猬因子(Sonic hedgehog)、沙漠刺猬因子(Desert hedgehog)以及印度刺猬因子(Indian hedgehog)。
在一个实施例中，本发明的载体包括至少一个经过修饰或未经过修饰的逆转录病毒LTR，例如慢病毒LTR、β-珠蛋白启动子以及β-珠蛋白基因座控制区(locus controlregion，LCR)，所述逆转录病毒LTR可操作地连接于目的多核苷酸，例如编码珠蛋白多肽。LTR的合适的修饰包含但不限于：用异源启动子取代5'LTR，所述异源启动子例如巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、胸苷激酶启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子；以及如本文其它地方所论述的3'LTR的一个或多个修饰、增加和/或缺失。
在特定实施例中，多核苷酸的红细胞特异性表达使用人类β-珠蛋白启动子、包括来自人类β-珠蛋白LCR的DNase I超敏感位点2、3和4中的一个或多个的β-珠蛋白LCR和/或人类β-珠蛋白3'增强子元件来实现。
在各个实施例中，本文中所设想的载体包括选自由以下组成的群组的一个或多个元件：Psi包装序列(Ψ+)、中央多聚嘌呤区/DNA瓣(cPPT/FLAP)、逆转录病毒输出元件、转录后调节元件、一个或多个隔离子元件、多腺苷酸化序列、可选标记以及细胞自杀基因，如本文其它地方所论述。
在各个实施例中，本文中所设想的载体包括可在造血细胞中操作的启动子，其可操作地连接于编码提供血红蛋白病治疗的多肽的基因。载体可以具有一个或多个LTR，其中任一LTR包括一个或多个修饰，如一个或多个核苷酸取代、添加或缺失。载体可以进一步包括一种或多种辅助元件以增加转导效率(例如，cPPT/瓣)、病毒包装(例如Psi(Ψ)包装信号、RRE)和/或增加治疗性基因表达的其它元件(例如poly(A)序列)。
在一个实施例中，载体包括左(5')逆转录病毒LTR、Psi包装序列(Ψ+)、中央多聚嘌呤区/DNA瓣(cPPT/FLAP)、逆转录病毒输出元件、β-珠蛋白启动子、β-珠蛋白基因座控制区(LCR)和任选地可操作地连接于目的多核苷酸的3'β-珠蛋白增强子，以及包括一个或多个隔离子元件或多腺苷酸化序列的右(3')逆转录病毒LTR。在特定实施例中，载体是慢病毒载体，所述慢病毒载体包括左(5')HIV-1LTR、Psi包装序列(Ψ+)、HIV-1中央多聚嘌呤区/DNA瓣(cPPT/FLAP)、rev反应元件(RRE)、β-珠蛋白启动子、β-珠蛋白基因座控制区(LCR)和任选地可操作地连接于目的多核苷酸的3'β-珠蛋白增强子，以及包括一个或多个隔离子元件和兔β-珠蛋白polyA序列(rβgpA)的右(3')逆转录病毒LTR。
在各个实施例中，本文中所设想的载体包括可在小神经胶质细胞中操作的启动子，其可操作地连接于编码提供肾上腺脑白质营养不良和/或肾上腺脊髓神经病治疗的多肽的基因。载体可以具有一个或多个LTR，其中任一LTR包括一个或多个修饰，如一个或多个核苷酸取代、添加或缺失。载体可以进一步包括多种增加转导效率的辅助元件中的一种辅助元件(例如，cPPT/瓣)、病毒包装(例如Psi(Ψ)包装信号、RRE)和/或增加治疗性基因表达的其它元件(例如poly(A)序列)。
在特定实施例中，本文中所设想的转移载体包括左(5')逆转录病毒LTR；中央多聚嘌呤区/DNA瓣(cPPT/FLAP)；逆转录病毒输出元件；可操作地连接于编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸的在小神经胶质细胞中具活性的启动子；以及右(3')逆转录病毒LTR。
在某实施例中，本文中所设想的慢病毒载体包括：左(5')HIV-1LTR；Psi(Ψ)包装信号；cPPT/FLAP；RRE；可操作地连接于编码人类ABCD1多肽的多核苷酸的MND启动子；右(3')自我失活(SIN)HIV-1LTR；以及兔β-珠蛋白多腺苷酸化序列。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽。
在进一步实施例中，所述慢病毒载体包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子或其转录活性片段，其可操作地连接于编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸。
在某些实施例中，所述慢病毒载体编码腺苷脱氨酶。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码腺苷脱氨酶的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
在某些实施例中，所述慢病毒载体编码白细胞介素2受体γ。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码白细胞介素2受体γ的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码三肽基肽酶1。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码三肽基肽酶1的多核苷酸。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码α-L艾杜糖醛酸酶。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码α-L艾杜糖醛酸酶的多核苷酸。
在特定实施例中，所述慢病毒载体编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
在某些实施例中，所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶的多核苷酸。
在某些实施例中，所述启动子包括人类β-珠蛋白LCR的一个或多个元件。
在一些实施例中，所述人类β-珠蛋白LCR包括来自人类β-珠蛋白LCR的DNase I超敏感位点2、3和4。
在特定实施例中，所述慢病毒载体进一步包括人类β-珠蛋白3'增强子元件。
在其它实施例中，所述目的基因编码抗镰状蛋白或珠蛋白基因。
在特定实施例中，所述目的基因编码人类β-珠蛋白蛋白质、人类δ-珠蛋白蛋白质、人类γ-珠蛋白蛋白质、人类-珠蛋白蛋白质、人类β-珠蛋白蛋白质或人类β-珠蛋白蛋白质。
在特定实施例中，慢病毒载体是AnkT9W载体、T9Ank2W载体、TNS9载体、lentiglobin HPV569载体、lentiglobin BB305载体、BG-1载体、BGM-1载体、d432βAγ载体、mLARβΔγV5载体、GLOBE载体、G-GLOBE载体、βAS3-FB载体、V5载体、V5m3载体、V5m3-400载体、G9载体以及BCL11A shmir载体，参见例如美国专利公开号20150307867；Arumugam和Malik，《血液学(Hematology)》美国血液学会教育计划(Am Soc Hematol Educ Program)，2010年；第2010卷，第1期：第445页到450页；Hoban等人，《血液(Blood)》，2016年，第127卷：第839页到848页；Scott和DeFrancesco，《自然生物技术(Nature Biotechnology)》，第34卷，第600页到607页(2016年)；Finotti等人，《血液医学杂志(Journal of BloodMedicine)》，2015年：第6卷，第69页到85页；Pestina等人，《分子治疗(MolecularTherapy)》，2009年；第17卷，第2期：第245页到252页，所述文献中的每一个通过引用以其整体并入本文中，以及在特定实施例中，在其中公开并提到的载体细节。
技术人员将了解，可以从本发明的现有实施例制定许多其它不同实施例，使得治疗性转基因或目的基因在靶细胞类型或除造血谱系以外的细胞谱系中表达，例如神经元谱系。
E.组合物和配制品
本文中所设想的配制品和组合物可以包括以下各物的组合：任何数目的已转导或未转导细胞或其组合、病毒载体、多肽、多核苷酸以及增加转导效率和/或VCN的一种或多种试剂，例如单独星形孢菌素或与增加前列腺素信号传导的一种或多种试剂组合、聚阳离子聚合物以及聚阳离子肽，如本文所描述，在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液(例如培养基)中配制，用于单独地或与一种或多种其它治疗模式组合向细胞、组织、器官或动物给药。
本文中所设想的特定离体和体外配制品和组合物可以包括以下各物的组合：已转导或非转导细胞或其组合、病毒载体和增加转导效率和/或VCN的一种或多种试剂，例如单独星形孢菌素或与增加前列腺素信号传导的一种或多种试剂组合、聚阳离子聚合物以及聚阳离子肽，如本文所描述，在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液(例如培养基)中配制，用于单独地或与一种或多种其它治疗模式组合向细胞、组织、器官或动物给药。
本文中所设想的特定体内配制品和组合物可以包括以下各物的组合：病毒载体和增加转导效率和/或VCN的一种或多种试剂，例如单独星形孢菌素或与增加前列腺素信号传导的一种或多种试剂组合、聚阳离子聚合物以及聚阳离子肽，如本文所描述，在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液(例如培养基)中配制，用于单独地或与一种或多种其它治疗模式组合向细胞、组织、器官或动物给药。
在某些实施例中，本文中所设想的组合物包括细胞群体，所述细胞群体包括治疗有效量的已转导细胞，如本文所描述，与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂(例如药学上可接受的细胞培养基)一起配制。
在某些其它实施例中，本发明提供组合物，所述组合物包括逆转录病毒载体和增加转导效率和/或VCN的一种或多种试剂，例如单独星形孢菌素或与增加前列腺素信号传导的一种或多种试剂组合、聚阳离子聚合物以及聚阳离子肽，如本文所描述，与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂(例如药学上可接受的细胞培养基)一起配制。
在特定实施例中，组合物包括细胞群体，所述细胞群体包括干细胞或祖细胞、逆转录病毒载体以及增加转导效率和/或VCN的一种或多种试剂，例如单独星形孢菌素或与增加前列腺素信号传导的一种或多种试剂组合、聚阳离子聚合物以及聚阳离子肽，如本文所描述，与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂(例如药学上可接受的细胞培养基)一起配制。在相关实施例中，细胞群体包括造血干细胞和祖细胞。在一个实施例中，细胞群体包括CD34+细胞。在一个实施例中，细胞群体是CD34+选择细胞。
在优选实施例中，细胞群体包括具有以下β-珠蛋白等位基因：βE/β0、βC/β0、β0/β0、βE/βE、βC/β+、βE/β+、β0/β+、β+/β+、βC/βC、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS中的一个等位基因的CD34+细胞。
在优选实施例中，细胞群体包括具有以下β-珠蛋白等位基因：βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βc/β+、β0/β+或β+/β+中的一个等位基因的CD34+细胞。
在优选实施例中，细胞群体包括具有以下β-珠蛋白等位基因：βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS中的一个等位基因的CD34+细胞。
本文中所设想的药物组合物包括根据本文中所述的方法产生的已转导细胞和药学上可接受的载体。
在其他实施例中，如本文所述，药物组合物包括逆转录病毒载体以及增加转导效率和/或VCN的一种或多种试剂∶单独星形孢菌素或与增加前列腺素信号传导的一种或多种试剂组合，并且任选地聚阳离子聚合物以及聚阳离子肽。在一个实施例中，如本文所述，药物组合物包括逆转录病毒载体和星形孢菌素、增加前列腺素信号传导的一种或多种试剂，并且任选地聚阳离子聚合物以及聚阳离子肽。
在一个实施例中，如本文所述，药物组合物包括逆转录病毒载体和星形孢菌素、和任选地聚阳离子聚合物，以及聚阳离子肽。
短语“药学上可接受的”是指当施用于人时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和组合物。在特定实施例中，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其它公认的药典中列出用于动物，更具体地说人类。
术语“载体”是指与治疗细胞一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。药物载体的说明性实例可以是无菌液体，如细胞培养基、水和油，包含石油、动物、植物或合成来源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。还可以使用盐水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液作为液体载体，特别是用于可注射溶液。在特定实施例中，合适的药物赋形剂包含淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻谷、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。除非任何常规媒体或试剂与活性成分不相容，否则设想将其用于治疗组合物中。还可以将补充性活性成分并入到组合物中。
在一个实施例中，包括载体的组合物适合肠胃外给药，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌肉内给药。药学上可接受的载体包含无菌水溶液、细胞培养基或分散液。这类媒体和试剂用于药学活性物质的用途是所属领域中众所周知的。除非任何常规媒体或试剂都与已转导细胞不相容，否则设想将其用于药物组合物中。
在特定实施例中，本文中所设想的组合物包括经过基因修饰的造血干细胞和/或祖细胞和药学上可接受的载体，例如药学上可接受的细胞培养基。本文中所设想的包括基于细胞的组合物的组合物可以通过肠内或肠胃外给药方法单独施用或与其它合适的化合物组合施用以实现所期望的治疗目标。
药学上可接受的载体必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使其适合对正待治疗的人类受试者给药。它应该进一步维持或增加组合物的稳定性。药学上可接受的载体可以是液体或固体，并且考虑到计划的给药方式，当与组合物的其它组分组合时，将药学上可接受的载体选择成能提供所期望的松密度(bulk)、稠度等。例如，药学上可接受的载体可以是，但不限于结合剂(例如预胶凝的玉米淀粉、聚乙烯吡咯啶酮或羟丙基甲基纤维素等)，填充剂(例如乳糖和其它糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯、钙磷酸氢等)，润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶态二氧化硅、硬脂酸、硬脂酸金属盐、氢化植物油、com淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、醋酸钠等)，崩解剂(例如淀粉、羟基乙酸淀粉钠等)，或湿润剂(例如月桂基硫酸钠等)。其它适合本文中所设想的组合物的药学上可接受的载体包含但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等。
这种载体溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂。如本文中所用的术语“缓冲剂”是指其化学组成能中和酸或碱但不引起pH显著改变的溶液或液体。本文中所设想的缓冲剂的实例包含但不限于杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco's phosphatebuffered saline，PBS)、林格氏溶液(Ringer's solution)、5％右旋糖水溶液(D5W)、生理盐水(normal/physiologic saline)(0.9％NaCl)。
药学上可接受的载体和/或稀释剂可以按足够将治疗组合物的pH维持在约7的量存在。替代性地，治疗组合物具有在约6.8到约7.4的范围内的pH，例如6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3和7.4。在仍然另一个实施例中，治疗组合物具有约7.4的pH。
本文中所设想的组合物可以包括无毒的药学上可接受的培养基。组合物可以是悬浮液。如本文中所用的术语“悬浮液”是指非贴壁条件，其中细胞不附着于固体支撑物。例如，可以搅拌或搅动维持呈悬浮液状的细胞并使其不粘附到支撑物，如培养皿。
在特定实施例中，在悬浮液中配制本文中所设想的组合物，其中造血干细胞和/或祖细胞分散于静脉内(IV)软管等中可接受的液体培养基或溶液内，例如盐水或无血清培养基。可接受的稀释剂包含但不限于水、PlasmaLyte、林格氏溶液、等张氯化钠(盐水)溶液、无血清细胞培养基以及适合低温储存的培养基，例如培养基。
在某些实施例中，药学上可接受的载体基本上不含人类或动物来源的天然蛋白质，并且适合于储存包括细胞群体的组合物，例如造血干细胞和祖细胞。治疗组合物旨在施用于人类患者，并且因此基本上不含细胞培养组分，如牛血清白蛋白、马血清和胎牛血清。
在一些实施例中，在药学上可接受的细胞培养基中配制组合物。此类组合物适合施用于人类受试者。在特定实施例中，药学上可接受的细胞培养基是无血清培养基。
与含有培养基的血清相比，无血清培养基具有几个优点，包含组成简化且更明确，污染程度降低，潜在感染物来源消除，并且成本更低。在各个实施例中，无血清培养基是无动物成分的，并且可以任选地是无蛋白质的。任选地，培养基可以含有生物药学上可接受的重组蛋白。“无动物成分”培养基是指其中组分来源于非动物来源的培养基。重组蛋白置换非动物培养基中的原生动物蛋白且营养获自合成、植物或微生物来源。相比之下，“无蛋白质”培养基被定义为基本上不含蛋白质。
特定组合物中所用的无血清培养基的说明性实例包含但不限于QBSF-60(质量生物公司(Quality Biological,Inc.))、StemPro-34(生命技术公司(Life Technologies))和X-VIVO 10。
在优选实施例中，包括造血干细胞和/或祖细胞的组合物在PlasmaLyte中配制。
在各个实施例中，包括造血干细胞和/或祖细胞的组合物在冻存培养基中配制。例如，可以在解冻后使用含冻存剂的冻存培养基维持高细胞活力结果。特定组合物中所用的冻存培养基的说明性实例包含但不限于CryoStor CS10、CryoStor CS5和CryoStor CS2。
在一个实施例中，组合物在包括50:50PlasmaLyte A:CryoStor CS10的溶液中配制。
在特定实施例中，组合物基本上不含支原体、内毒素和微生物污染。相对于内毒素而言，“基本上不含”意指每剂细胞的内毒素低于FDA对生物制剂所允许的内毒素，即5EU/kg体重/天的总内毒素，对平均70kg的人来说，就是350EU/总细胞剂量。在特定实施例中，包括经本文中所设想的逆转录病毒载体转导的造血干细胞或祖细胞的组合物含有约0.5EU/mL到约5.0EU/mL，或约0.5EU/mL、1.0EU/mL、1.5EU/mL、2.0EU/mL、2.5EU/mL、3.0EU/mL、3.5EU/mL、4.0EU/mL、4.5EU/mL或5.0EU/mL。
在某些实施例中，设想适合递送病毒载体系统(即，病毒介导的转导)的组合物和配制品，包含但不限于逆转录病毒(例如慢病毒)载体。
用于离体递送的示例性配制品还可以包含使用所属领域中已知的各种转染剂，如磷酸钙、电穿孔、热休克以及各种脂质体配制品(即，脂质介导的转染)。脂质体，如下文更详细地描述，是包裹一部分含水流体的脂质双层。DNA自发地与阳离子脂质体的外表面缔合(借助于其电荷)，并且这些脂质体将与细胞膜相互作用。
在特定实施例中，本文中所设想的组合物可以包括一种或多种多肽、多核苷酸、包括其的载体、如本文所描述的增加转导效率和/或VCN的试剂以及已转导细胞等，在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中配制，用于单独地或与一种或多种其它治疗模式组合向细胞或动物给药。还将理解，期望时，组合物也可以与其它试剂组合施用，所述其它试剂如例如细胞因子、生长因子、激素、小分子或各种药学活性剂。对于在特定实施例中还可以包含在组合物中的其它组分几乎没有限制，只要额外的试剂不会不利地影响组合物递送预期基因治疗的能力即可。
在特定实施例中，药学上可接受的赋形剂和载体溶液的配制品是所属领域的技术人员众所周知的，正如开发合适的给药和治疗方案以在各种治疗方案中使用本文中所述的特定组合物同样是众所周知的，包含例如肠内和肠胃外，例如血管内、静脉内、动脉内、骨内和髓内给药和配制品。技术人员将理解，本文中所设想的特定实施例可以包括其它配制品，如制药领域众所周知并且例如在以下文献中所述的配制品：《雷明顿：医药科学和实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》，第20版，马里兰州巴尔的摩：利平科特威廉姆斯和维尔金斯出版社(Lippincott Williams&Wilkins)，2005年，所述通过引用以其整体并入本文中。
F.细胞培养组合物
如本文通篇所论述，在特定实施例中，本文中所设想的组合物和方法适用于离体和体内基于细胞的基因治疗。在特定实施例中，组合物可以包括培养中的细胞，即，细胞培养组合物。细胞培养组合物可以包括包括造血干细胞或祖细胞的细胞群体、合适的细胞培养基、单独星形孢菌素或与增加前列腺素信号传导的一种或多种试剂组合，并且任选地一种或多种聚阳离子聚合物。在特定实施例中，经培养的细胞是造血干细胞或祖细胞或具有以下β-珠蛋白等位基因：βE/β0、βC/β0、β0/β0、βE/βE、βC/β+、βE/β+、β0/β+、β+/β+、βC/βC、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS的CD34+细胞。
在特定实施例中，经培养的细胞是造血干细胞或祖细胞或具有以下β-珠蛋白等位基因：βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βC/β+、β0/β+或β+/β+的CD34+细胞。
在特定实施例中，经培养的细胞是造血干细胞或祖细胞或具有以下β-珠蛋白等位基因：βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS的CD34+细胞。
在一个实施例中，细胞培养组合物包括包括造血干细胞或祖细胞的细胞群体、适合于人类给药的细胞培养基、单独星形孢菌素或与增加前列腺素信号传导的一种或多种试剂组合，并且任选地一种或多种聚阳离子聚合物。
在一个实施例中，细胞培养组合物包括包括经基因修饰的造血干细胞或祖细胞的细胞群体、适合于人类给药的细胞培养基以及单独星形孢菌素或与增加前列腺素信号传导的一种或多种试剂组合，并且任选地一种或多种聚阳离子聚合物。
在一些实施例中，细胞培养基是药学上可接受的细胞培养基。
本文中所设想的包括已转导的造血干细胞或祖细胞的细胞培养组合物可以全身性地或通过定向注射向有需要的受试者施用，以便实现所期望的基因治疗。
G.转导方法
本文中所设想的方法和组合物显著增加了靶细胞的转导效率(transductionefficiency，TE)和载体拷贝数(VCN)。不希望受任何特定理论束缚，设想本文中所设想的组合物和方法可以用于增加VCN并用显著更少的病毒转导显著更多的细胞，从而将治疗细胞的基因组中的原癌基因的基因组改变和/或插入激活的风险降到最低，同时增加所产生的药品的治疗功效。因此，本文中所设想的组合物和方法不仅能产生更安全的基因治疗，而且能产生更稳健并且治疗上更有效的药品。
使用逆转录病毒或慢病毒载体，借助于病毒感染而不是通过转染来递送一个或多个基因或其它多核苷酸序列被称为转导。在一个实施例中，逆转录病毒载体通过感染和原病毒整合而转导到细胞中。在某些实施例中，细胞，例如靶细胞被转导，如果它包括通过使用病毒或逆转录病毒载体的感染递送到细胞的基因或其它多核苷酸序列。在特定实施例中，转导的细胞在其细胞基因组中包括通过逆转录病毒或慢病毒载体递送的一种或多种基因或其它多核苷酸序列。
在特定实施例中，经过病毒载体转导的宿主细胞或靶细胞表达治疗性多肽并被施用给受试者以治疗和/或预防疾病、病症或病状。
感染性病毒颗粒和病毒储备溶液的产生可以使用常规技术执行。制备病毒储备溶液的方法在所属领域中是已知的并且由例如Y.Soneoka等人(1995年)《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》，第23卷，第628页到633页；和N.R.Landau等人(1992年)《病毒学杂志(J.Virol.)》，第66卷，第5110页到5113页说明。
在特定实施例中，基于HIV 1型(HIV-1)的病毒颗粒可以通过在生产细胞中共表达病毒体包装元件和转移载体而生成。这些细胞可以用多种质粒瞬时转染。典型地，采用三到五个质粒，但数量可以更大，这取决于慢病毒组分被分解成单独单元的程度。例如，一个质粒可以编码衍生自HIV-1的病毒体的核心和酶组分。这个质粒被称为包装质粒。另一个质粒典型地编码一个或多个包膜蛋白，最常是水泡性口炎病毒的G蛋白(VSV G)，因为它的稳定性高并且向性广泛。这种质粒可以被称为包膜表达质粒。然而另一个质粒编码待转移到靶细胞的基因组，即载体本身，并被称为转移载体。包装质粒可以通过已知技术引入人类细胞系中，所述已知技术包含磷酸钙转染、脂质体转染或电穿孔。通过这种技术和其变异体，可以生成具有数百万转导单位/毫升(TU/mL)的滴度的重组病毒。在超速离心法后，可以获得约108TU/mL、109TU/mL、1010TU/mL、1011TU/mL、1012TU/mL或约1013TU/mL的浓缩储备液。
感染性病毒颗粒可以使用常规技术从包装细胞收集。例如，如所属领域中已知，感染性颗粒可以通过细胞溶解或收集细胞培养物的上清液而收集。任选地，所收集的病毒颗粒在必要时可以经纯化。合适的纯化技术是所属领域的技术人员众所周知的，例如Kutner等人，《BMC生物技术(BMC Biotechnol)》，2009年；第9卷，第10页。doi:10.1186/1472-6750-9-10；Kutner等人《自然实验手册(Nat.Protoc.)》2009年；第4卷，第4期，第495页到505页。doi:10.1038/nprot.2009.22。
使用所属领域中众所周知的技术，病毒可以用于在体内、离体或体外感染细胞。例如，当离体转导细胞，例如动员后外周血细胞、骨髓细胞、CD34+细胞或造血干细胞或祖细胞时，载体颗粒可以与细胞一起孵育，使用感染复数(MOI)通常大约在1到50之间的剂量，这也对应于每105个细胞1×105到50×105个转导单位的病毒载体。当然，这包含对应于以下MOI的载体量：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45和50MOI以及在这些值之间的所有整数值。
病毒还可以通过直接注射到需要治疗的细胞、组织或器官而体内递送到受试者。直接注射要求感染复数(MOI)大约在1到100之间，这也对应于每105个细胞1×105到100×105个转导单位的病毒载体。当然，这包含对应于以下MOI的载体量：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、50、65、70、75、80、85、90、95和100MOI以及在这些值之间的所有整数值。
在特定实施例中，慢病毒载体以约10到约25的MOI使用来转导细胞群体。
在特定实施例中，慢病毒载体以约10到约20的MOI使用来转导细胞群体。
在一些实施例中，慢病毒载体以以下MOI使用来转导细胞群体：约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30。
病毒还可以根据病毒滴度(TU/mL)递送，所述病毒滴度可以例如通过使用市售p24滴度分析来测量，这是针对p24病毒外壳蛋白的ELISA。下式可以用于计算p24的pg/mL：每个慢病毒物理颗粒(physical particle，PP)存在大约2000个p24分子：(2×103)×(24×103Da的p24/PP)，48×106/阿伏加德罗常数(Avogadro)＝(48×106)/(6×1023)＝8×10-17g的p24/PP，大约是1PP/1×10-16g的p24，1×104PP/pg p24。A包装相当合理的VSV-G假型化慢病毒载体将具有1TU/1000个物理颗粒(PP)到1TU/100PP(或更小)的范围内的感染指数。因此，范围是大约10到100TU/pg p24。TU/mL正是通过这种转换获得的。
根据以往的经验，直接注射的慢病毒的量由总TU确定，并且可以根据可能注射到位点的体积和待注射的组织类型而变化。例如，骨髓注射位点可能仅允许注射极小体积的病毒，因此高滴度制剂将是优选的，每次注射可以使用以下TU：约1×106到1×107、约1×106到1×108、1×106到1×109、约1×107到1×1010、1×108到1×1011、约1×108到1×1012或约1×1010到1×1012或更大。然而，全身递送可以适应大得多的TU，可以递送1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014或1×1015的负荷。
本文中所设想的组合物和方法提供体外、离体和体内造血细胞的高转导效率和高VCN，所使用的病毒滴度低于上文所公开的在不存在本文所提供的组合物和方法的情况下获得类似转导效率时的病毒滴度。
本文中所设想的某些实施例源自以下意外发现：通过使造血细胞在体外、离体或体内与逆转录病毒和星形孢菌素，以及任选地聚阳离子聚合物接触，转导效率和/或VCN显著增加。
用于已转导的造血细胞的说明性最终星形孢菌素浓度包含但不限于约100nM到约1000nM、约110nM到约800nM、约200nM到约800nM、约400nM到约800nM、约200nM到约400nM、约200nM到约500nM、或约100nM、约200nM、约300nM、约400nM、约500nM、约600nM、约700nM、约800nM、约900nM、或约1000nM或更大，以及其任何介于中间的浓度。
在一个实施例中，聚阳离子聚合物是硫酸鱼精蛋白或聚凝胺。
在一个实施例中，聚阳离子聚合物是硫酸鱼精蛋白。硫酸鱼精蛋白或聚凝胺可以用于约5μg/mL到约15μg/mL、约5μg/mL到约10μg/mL、或约5μg/mL、约6μg/mL、约7μg/mL、约8μg/mL、约9μg/m、约10μg/mL、约11μg/mL、约12μg/mL、约13μg/mL、约14μg/mL或约15μg/mL或更大的最终浓度。
本文中所设想的某些实施例源自以下意外发现：通过使造血细胞在体外、离体或体内与逆转录病毒和星形孢菌素以及刺激前列腺素EP受体信号传导途径的一种或多种试剂以及任选地聚阳离子聚合物接触，转导效率和/或VCN显著增加(参见例如WO 2007/112084和WO2010/108028)。
在一个实施例中，试剂是前列腺素EP受体配体，包含但不限于前列腺素E2(PGE2)，以及其“模拟物”或“衍生物”。
在一个实施例中，刺激前列腺素EP受体信号传导途径的试剂是PGE2。
用于已转导的造血细胞的说明性最终前列腺素EP受体信号传导途径的激动剂的浓度包含但不限于约10μM到约200μM、约10μM到约100μM、约50μM到约100μM、或约10μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM、约60μM、约70μM、约80μM、约90μM、或约100μM或更大，以及其任何介于中间的浓度。
在特定实施例中，可以在单独星形孢菌素存在下(与单独星形孢菌素接触)，将造血细胞培养约10分钟到约72小时、约30分钟到约72小时、约30分钟到约48小时、约30分钟到约24小时、约30分钟到约12小时、约30分钟到约8小时、约30分钟到约6小时、约30分钟到约4小时、约30分钟到约2小时、或约1小时到约2小时的持续时间；可随后清洗细胞，使得它们基本上不含星形孢菌素；并且可随后在逆转录病毒、以及任选地刺激前列腺素EP受体信号传导途径的一种或多种试剂以及任选地聚阳离子聚合物存在下培养经清洗的细胞。
在特定实施例中，可以在单独星形孢菌素存在下(与单独星形孢菌素接触)，将造血细胞培养约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约5小时、约6小时、或任何介于中间的持续时间的持续时间；可随后清洗细胞，使得它们基本上不含星形孢菌素；并且可随后在逆转录病毒、以及任选地刺激前列腺素EP受体信号传导途径的一种或多种试剂以及任选地聚阳离子聚合物存在下培养经清洗的细胞。
在另一个实施例中，造血细胞可以在与增加转导效率和/或VCN的一种或多种试剂一起培养之前、在与增加转导效率和/或VCN的一种或多种试剂一起培养期间或在与增加转导效率和/或VCN的一种或多种试剂一起培养之后，与逆转录病毒一起培养，持续本文所公开的以上时间段中的任一个。
在某些实施例中，设想造血细胞可以在与逆转录病毒一起培养之前，与星形孢菌素一起培养，所述造血细胞经清洗并且与逆转录病毒接触持续本文所公开的以上时间段中的任一个。
在一个实施例中，设想造血细胞可以在与逆转录病毒一起培养之前，与星形孢菌素一起培养，所述造血细胞经清洗并且与逆转录病毒接触，以及任选地在刺激前列腺素EP受体信号传导途径的一种或多种试剂以及任选地聚阳离子聚合物存在下培养，持续本文所公开的以上时间段中的任一个。
如全文所公开的，本文中所设想的组合物和方法意外使得众所周知难以转导并且典型地具有低VCN的造血细胞的转导效率和VCN增加。
在各个实施例中，本文中所设想的组合物和方法将转导效率增加到至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％，包含任何介于中间的百分比。
在各个实施例中，本文中所设想的组合物和方法将平均VCN增加到至少约0.5到至少约5.0、至少约0.5到至少约3、至少约0.5到至少约1.0、至少约1.0到至少约5.0、至少约1.0到至少约3.0、或至少约0.5、至少约1.0、至少约1.5、至少约2.0、至少约2.5、至少约3.0、至少约3.5、至少约4.0、至少约4.5或至少约5.0。
在各个实施例中，经本文中所设想的组合物和方法转导的造血细胞具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％的转导效率以及至少约0.5、至少约1.0、至少约1.5、至少约2.0、或至少约2.5的平均VCN。
在特定实施例中，转导效率增加表示，与只经过载体转导的造血细胞相比，经过本文中所设想的组合物和方法转导的造血细胞存在至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍或更多倍富集。
在特定实施例中，平均VCN增加表示，与只经过载体转导的造血细胞相比，经过本文中所设想的组合物和方法转导的造血细胞的VCN存在至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍或更多倍富集。
在转导之后，已转导细胞可以在适合其维持、生长或增殖的条件下培养。在特定实施例中，已转导细胞在移植之前培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天。
在转导之前、在转导期间和/或在转导之后，细胞可以在促进干细胞或祖细胞扩增的条件下培养。可以使用所属领域中已知的任何方法。在某些实施例中，在转导之前、在转导期间或在转导之后，在促进干细胞或祖细胞扩增的一种或多种生长因子存在下培养细胞。促进干细胞或祖细胞扩增的生长因子的实例包含但不限于胎肝酪氨酸激酶(Flt3)配体、干细胞因子以及白细胞介素6和11，它们已被证实能促进鼠造血干细胞的自我更新。其它生长因子包含音猬因子，它通过激活骨形态生成蛋白4而诱导原始造血祖细胞增殖；Wnt3a，它刺激HSC的自我更新；脑源性神经营养因子(BDNF)；表皮生长因子(EGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNF)；转化生长因子-β(TGF-β)；成纤维细胞生长因子(FGF，例如碱性FGF、酸性FGF、FGF-17、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-8b、FGF-8c、FGF-9)；粒细胞集落刺激因子(GCSF)；血小板衍生生长因子(PDGF，例如PDGFAA、PDGFAB、PDGFBB)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophagecolony stimulating factor，GMCSF)；干细胞因子(SCF)；基质细胞衍生因子(stromalcell derived factor，SCDF)；胰岛素样生长因子(IGF)；血小板生成素(thrombopoietin，TPO)或白细胞介素-3(IL-3)。在特定实施例中，在转导之前、在转导期间或在转导之后，在促进干细胞或祖细胞扩增的一种或多种生长因子存在下培养细胞。
在特定实施例中，本文中所设想的组合物和方法适用于任何细胞类型的转导。适合与本文中所设想的组合物和方法一起使用的细胞可以从任何动物，优选哺乳动物，例如非人类灵长类动物或人类，更优选从人类获得，并且可以将其移植到任何动物中，优选哺乳动物，更优选人类。
某些实施例设想细胞群体的分离和转导。如本文中所用，术语“细胞群体”是指可以由任何数目和/或任何组合的如本文其它地方所述的同质或异质细胞类型构成的多个细胞。例如针对造血干细胞或祖细胞的转导，细胞群体可以从脐带血、胎盘血、骨髓或外周血分离或获得。细胞群体可以包括待转导的靶细胞类型的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。在某些实施例中，造血干细胞或祖细胞可以使用所属领域中已知的方法从异质细胞群体分离或纯化。
经过本文中所设想的组合物和方法转导的优选的靶细胞类型包含造血细胞，例如人类造血细胞。
在优选实施例中，本文中所设想的组合物和方法用于增加造血干细胞或祖细胞的转导效率和/或VCN。
用于获得经过本文中所设想的方法和组合物转导的造血细胞的说明性来源包含但不限于脐带血、骨髓或动员后外周血。
适合用本文中所设想的方法和组合物转导的造血细胞的说明性实例包含CD34+细胞。如本文中所用的术语“CD34+细胞”是指在其细胞表面上表达CD34蛋白的细胞。如本文中所用的“CD34”是指常常充当细胞-细胞粘附因子的细胞表面糖蛋白(例如唾液粘蛋白(sialomucin)蛋白质)。CD34+是造血干细胞和祖细胞两者的细胞表面标记。
适合用本文中所设想的方法和组合物转导的造血干细胞或祖细胞的额外说明性实例包含CD34+CD38LoCD90+CD45RA-造血细胞、CD34+、CD59+、Thyl/CD90+、CD38Lo/-C-kit/CD117+和Lin(-)造血细胞以及CD133+造血细胞。
存在各种方法以表征造血层级结构。一种表征方法是SLAM密码。SLAM(信号传导淋巴细胞激活分子Signaling lymphocyte activation molecule)家族是超过10个的一组分子，其基因大部分衔接地位于1号染色体(小鼠)的单个基因座中，都属于免疫球蛋白基因超家族的一个子集，并且最初被认为参与了T细胞刺激。这个家族包含CD48、CD150、CD244等，CD150是创始成员，并且因此也被称为slamF1，即SLAM家庭成员1。用于造血层级结构的特征SLAM密码是造血干细胞(HSC)-CD150+CD48-CD244-；多能祖细胞(multipotent progenitorcell，MPP)-CD150-CD48-CD244+；谱系限制型祖细胞(lineage-restricted progenitorcell，LRP)-CD150-CD48+CD244+；共同髓系祖细胞(common myeloid progenitor，CMP)-lin-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32中；粒细胞-巨噬细胞祖细胞(granulocyte-macrophageprogenitor，GMP)-lin-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32高；以及巨核细胞-红细胞祖细胞(megakaryocyte-erythroid progenitor，MEP)-lin-SCA-1-c-kit+CD34-CD16/32低。
在特定实施例中，经本文中所设想的载体和组合物转导的CD34+细胞具有以下β-珠蛋白等位基因：βE/β0、βC/β0、β0/β0、βE/βE、βC/β+、βE/β+、β0/β+、β+/β+、βC/βC、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS。
在特定实施例中，经本文中所设想的载体和组合物转导的CD34+细胞具有以下β-珠蛋白等位基因：βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βC/β+、β0/β+或β+/β+。
在特定实施例中，经本文中所设想的载体和组合物转导的CD34+细胞具有以下β-珠蛋白等位基因：βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS。
H.基因治疗方法
还提供了包括较高比例的已转导细胞的药品，其中每个细胞中的治疗基因的拷贝数也较高，用于治疗上更有效的基因治疗。如本文中所用，术语“药品”是指使用本文中所设想的组合物和方法产生的经过基因修饰的细胞。在特定实施例中，药品包括经过基因修饰的造血干细胞或祖细胞，例如CD34+细胞。不希望受任何特定理论束缚，增加药品中的治疗基因的量可以允许对相应基因在体内没有表达或有极少表达的受试者进行治疗，从而显著扩大将基因治疗带给受试者的机会，对这些受试者来说，基因治疗以前不是一种可行的治疗选择。
本文中所设想的已转导细胞和相应的逆转录病毒载体提供了改良的基因治疗方法。如本文中所用，术语“基因治疗”是指将基因引入细胞的基因组中。在各个实施例中，本发明的病毒载体包括表达治疗性转基因的造血表达控制序列，所述治疗性转基因编码多肽，所述多肽为被诊断患有或疑似有单基因疾病、病症或病状或适合造血干细胞治疗的疾病、病症或病状的受试者提供治愈、预防或改善益处。
在一个优选实施例中，已转导细胞包括发育成脑小神经胶质细胞(巨噬细胞)的潜力。在特定实施例中，造血干细胞经本文中所设想的载体转导，并且对需要治疗肾上腺脑白质营养不良或肾上腺脊髓神经病的个体给药。造血干细胞是脑小神经胶质细胞的来源，因此在这类实施例中是优选的。
在特定实施例中，已转导的造血干细胞或祖细胞包括具有表达治疗性转基因的造血表达控制序列的病毒载体，所述治疗性转基因编码多肽，所述多肽为被诊断患有或疑似有单基因疾病、病症或病状或造血系统的疾病、病症或病状的受试者提供治愈、预防或改善益处。
在某些实施例中，本文中所设想的载体、病毒颗粒和/或已转导细胞用于治疗、预防和/或改善受试者的单基因疾病、病症或病状或造血系统的疾病、病症或病状，例如血红蛋白病。
如本文中所用，“血细胞生成”是指从祖细胞形成并发育血细胞以及从干细胞形成祖细胞。血细胞包含但不限于红细胞或红血细胞(RBC)、网织红细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、巨核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱粒细胞、B细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞、凝血细胞以及白细胞。
如本文中所用，术语“血红蛋白病”或“血红蛋白病状”是指一组多种遗传性血液病症，其涉及由血红蛋白的结构和/或合成的改变而引起的异常血红蛋白分子的存在。正常情况下，血红蛋白由四个蛋白质亚基组成：两个β-珠蛋白亚基和两个α-珠蛋白亚基。这些蛋白质亚基中的每个亚基与称为血红素的含铁分子连接(结合)；每个血红素在其中心含有铁分子，可以与氧分子结合。红血细胞内的血红蛋白与肺中的氧分子结合。然后这些细胞穿过血流并将氧递送到整个身体的组织。
血红蛋白A(HbA)是出生后就存在的正常血红蛋白的名称。血红蛋白A是具有两个α链和两个β链(α2β2)的四聚体。血红蛋白A2是出生后在红细胞中发现的血红蛋白的次要组分，由两个α链和两个δ链(α2δ2)组成。血红蛋白A2一般包括总红细胞血红蛋白的不到3％。血红蛋白F是胎儿发育期间的主要血红蛋白。分子是两个α链和两个γ链(α2γ2)的四聚体。
最常见的血红蛋白病包括镰状细胞病、β-地中海贫血和α-地中海贫血。
在特定实施例中，本文中所设想的组合物和方法为具有镰状细胞病的受试者提供基因治疗。术语“镰状细胞贫血”或“镰状细胞病”在本文中被定义成包含由红血细胞镰状化引起的任何症状性贫血病状。镰状细胞病(SCD)的常见形式镰状细胞贫血βS/βS由血红蛋白S(HbS)引起。HbS通过将β-珠蛋白中第6位的谷氨酸(E)替换为缬氨酸(V)而生成，记为Glu6Val或E6V。将谷氨酸替换为缬氨酸引起异常的HbS亚基粘在一起并形成长的刚性分子，使红血细胞弯曲成镰状(新月形)。镰状细胞过早死亡，可以导致红血细胞缺乏(贫血)。此外，镰状细胞是刚性的，并且可以阻塞小血管，引起严重的疼痛和器官损伤。
β-珠蛋白基因中的额外突变也会在β-珠蛋白中引起其它异常，导致其它类型的镰状细胞病。β-珠蛋白的这些异常形式常常用字母表中的字母或有时用名称来表示。在这些其它类型的镰状细胞病中，一个β-珠蛋白亚基被替换为HbS，而其它β-珠蛋白亚基被替换为不同的异常变异体，如血红蛋白C(HbC；β-珠蛋白等位基因记为βC)或血红蛋白E(HbE；β-珠蛋白等位基因记为βE)。
在血红蛋白SC(HbSC)病中，β-珠蛋白亚基被HbS和HbC替换。HbC是由β-珠蛋白基因突变引起的，并且是在具有HbC病(α2βC 2)的人中发现的主要血红蛋白。当氨基酸赖氨酸替换β-珠蛋白中第6位的氨基酸谷氨酸时，产生HbC，记为Glu6Lys或E6K。HbC病相对良性，产生轻度溶血性贫血和脾肿大。HbSC病的严重程度是可变的，但它可能与镰状细胞贫血一样严重。
当β-珠蛋白中第26位的氨基酸谷氨酸被氨基酸赖氨酸替换时，引起HbE，记为Glu26Lys或E26K。具有HbE病的人具有轻度溶血性贫血和轻度脾肿大。HbE在东南亚极为常见，并且在一些地区，频率与血红蛋白A不相上下。在一些情况下，HbE突变与HbS一起存在。在这些情况下，人可能具有与镰状细胞贫血相关联的较严重的体征和症状，如疼痛发作、贫血和脾脏功能异常。
当产生血红蛋白S和β-地中海贫血的突变一起发生时，引起被称为血红蛋白镰状-β-地中海贫血(HbSBetaThal)的其它病状。将镰状细胞病与β-zero(β0；预防β-珠蛋白产生的基因突变)地中海贫血相结合的突变导致严重疾病，而与β-plus(β+；减少β-珠蛋白产生的基因突变)地中海贫血相结合的镰状细胞病较轻微。
如本文中所用，“地中海贫血”是指以血红蛋白的产生有缺陷为特征的遗传性病症。地中海贫血的实例包含α-和β-地中海贫血。
在特定实施例中，本文中所设想的组合物和方法为具有β-地中海贫血的受试者提供基因治疗。β-地中海贫血是由β-珠蛋白链中的突变引起的，并且可以以重型或轻型发生。已发现β-珠蛋白基因中近400个突变引起β-地中海贫血。大多数突变涉及β-珠蛋白基因内或附近的单个DNA构建块(核苷酸)的变化。其它突变在β-珠蛋白基因中插入或缺失少量核苷酸。如上文所指出，减少β-珠蛋白产生的β-珠蛋白基因突变导致一种被称为β-plus(β+)地中海贫血的病状。阻止细胞产生任何β-珠蛋白的突变导致β-zero(β0)地中海贫血。在重型β-地中海贫血中，儿童在出生时是正常的，但在出生后的第一年期间就会出现贫血。轻型β-地中海贫血产生小的红血细胞。如果您只从一位父母收到缺陷基因，就会发生轻型地中海贫血。患有这种形式的病症的人是所述疾病的携带者并且通常没有症状。
HbE/β-地中海贫血是由HbE和β-地中海贫血的组合(βE/β0、βE/β+)引起的，并且产生比HbE性状或β-地中海贫血性状更严重的病状。所述病症表现为中度严重的地中海贫血，属于中间型地中海贫血的范畴。HbE/β-地中海贫血在具有东南亚背景的人中最常见。
在特定实施例中，本文中所设想的组合物和方法为具有α-地中海贫血的受试者提供基因治疗。α-地中海贫血是世界范围内相当常见的血液病。每年都有成千上万患有HbBart综合征和HbH病的婴儿出生，特别是在东南亚。地中海国家、北非、中东、印度和中亚的人们也经常发生α-地中海贫血。α-地中海贫血典型地由涉及HBA1和HBA2基因的缺失引起。这两种基因都提供了生产被称为α-珠蛋白的蛋白质的说明，所述α-珠蛋白是血红蛋白的组分(亚基)。人们在每个细胞中有两个拷贝的HBA1基因和两个拷贝的HBA2基因。不同类型的α-地中海贫血是由于HBA1和HBA2等位基因中的一些或全部发生丢失所致。
α-地中海贫血的最严重的形式Hb Bart综合征是由于所有四个α-珠蛋白等位基因都丢失所致。HbH病是由四个α-珠蛋白等位基因中的三个丢失引起的。在这两种病状下，α-珠蛋白的缺乏阻止细胞制造正常的血红蛋白。相反，细胞产生异常形式的血红蛋白，称为血红蛋白Bart(Hb Bart)或血红蛋白H(HbH)。这些异常的血红蛋白分子无法有效地将氧携带到人体组织。Hb Bart或HbH取代正常的血红蛋白会引起贫血和其它与α-地中海贫血相关联的严重的健康问题。
α-地中海贫血的两种额外变异体与减少量的α-珠蛋白有关。因为细胞仍然产生一些正常的血红蛋白，所以这些变异体往往导致很少或没有健康问题。四个α-珠蛋白等位基因丢失两个导致α-地中海贫血性状。具有α-地中海贫血性状的人可能有异常小的淡红色血细胞和轻度贫血。在α-地中海贫血沉默携带者中发现一个α-珠蛋白等位基因丢失。这些个体通常没有地中海贫血相关的体征或症状。
在优选实施例中，本文中所设想的基因治疗方法用于治疗、预防或改善选自由以下组成的群组的血红蛋白病：血红蛋白C病、血红蛋白E病、镰状细胞贫血、镰状细胞病(SCD)、地中海贫血、β-地中海贫血、重型地中海贫血、中间型地中海贫血、α-地中海贫血、血红蛋白Bart综合征以及血红蛋白H病。
在优选实施例中，本文中所设想的基因治疗方法用于治疗、预防或改善具有选自由以下组成的群组：βE/β0、βC/β0、β0/β0、βE/βE、βC/β+、βE/β+、β0/β+、β+/β+、βC/βC、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS的β-珠蛋白基因分型的受试者的血红蛋白病。
在各个实施例中，通过直接注射将逆转录病毒载体体内给药到需要基因治疗的受试者的细胞、组织或器官。在各种其它实施例中，细胞经本发明的载体体外或离体转导，以及任选地经扩展的离体。随后将已转导细胞给药到需要基因治疗的受试者。
适合在本文中所设想的基因治疗方法中转导和给药的细胞包含但不限于干细胞、祖细胞以及如本文其它地方所述的分化细胞。在某些实施例中，已转导细胞是如本文其它地方所述的造血干细胞或祖细胞。
用于本文中所设想的基因治疗组合物和方法中的优选细胞包含自体/同基因(“自身”)细胞。
在特定实施例中，用作基因治疗来源的细胞具有以下β-珠蛋白等位基因：βE/β0、βC/β0、β0/β0、βE/βE、βC/β+、βE/β+、β0/β+、β+/β+、βC/βC、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS。
在特定实施例中，用作基因治疗来源的细胞具有以下β-珠蛋白等位基因：βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βC/β+、β0/β+或β+/β+。
在特定实施例中，用作基因治疗来源的细胞具有以下β-珠蛋白等位基因：βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS
如本文中所用的“受试者”包含表现出可用基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和本文其它地方公开的方法治疗的单基因疾病、病症或病状的症状的任何动物。在优选实施例中，受试者包含表现出可用基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和本文其它地方公开的方法治疗的造血系统的疾病、病症或病状的症状的任何动物，所述疾病、病症或病状例如血红蛋白病。适合受试者(例如患者)包含实验动物(如小鼠、大鼠、兔或天竺鼠)、农畜和家畜或宠物(如猫或狗)。包含非人类灵长类动物，并且优选地人类患者。
典型的受试者包含表现出可通过基因治疗调节的一种或多种生理活性的异常量(比“正常”或“健康”受试者低或高的量)的动物。
如本文所用，“治疗(treatment/treating)”包含对疾病或病理学病状的症状或病变的任何有益或理想作用，并且甚至可以包含所治疗疾病或病状的一个或多个可测量标记的最小降低。治疗可以任选地涉及疾病或病状的症状的减少或改善，或延迟疾病或病状的进展。“治疗”不一定表示疾病或病状或其相关症状完全根除或治愈。
如本文所用，“预防(prevent)”和类似词语，如“预防(prevented)”、“预防(preventing)”等，表示用于预防、抑制疾病或病状出现或复发或降低疾病或病状出现或复发的可能性的方法。还指的是延迟疾病或病状发作或复发或延迟疾病或病状的症状出现或复发。如本文所用，“预防”和类似词语还包含在疾病或病状发作或复发之前降低疾病或病状的强度、影响、症状和/或负荷。
如本文所用，术语“量”是指病毒或已转导的治疗细胞实现有益的或所期望的预防性或治疗性结果、包含临床结果的“有效的量”或“有效量”。
“预防有效量”是指病毒或已转导的治疗细胞有效实现所期望的预防结果的量。典型地但未必，因为预防性剂量在疾病之前或在疾病的较早阶段用于受试者，所以预防有效量小于治疗有效量。
病毒或已转导的治疗细胞的“治疗有效量”可以根据以下因素而不同：如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及干细胞和祖细胞在个体中引起所期望的反应的能力。治疗有效量还是病毒或转导的治疗细胞的任何毒性或有害效果被治疗有益效果超过的量。术语“治疗有效量”包含对“治疗”受试者(例如患者)有效的量。
不希望受任何特定理论束缚，与现有方法相比，本发明的载体、组合物和方法所提供的重要优点是，可以通过施用包括高百分比的已转导细胞的细胞群体来实现基因治疗的高功效。
已转导细胞可以作为骨髓或脐带血移植的一部分在经历过或未经历过骨髓消融治疗的个体中施用。在一个实施例中，将本发明的已转导细胞在骨髓移植物中施用给经历过化学消融性或放射消融性骨髓治疗的个体。
在一个实施例中，向受试者静脉内递送一定剂量的已转导细胞。在优选实施例中，向受试者静脉内施用已转导的造血干细胞。
在一个说明性实施例中，提供给受试者的已转导细胞的有效量是至少2×106细胞/kg、至少3×106细胞/kg、至少4×106细胞/kg、至少5×106细胞/kg、至少6×106细胞/kg、至少7×106细胞/kg、至少8×106细胞/kg、至少9×106细胞/kg、或至少10×106细胞/kg、或更大细胞/kg，包含所有介于中间的细胞剂量。
在另一个说明性实施例中，提供给受试者的已转导细胞的有效量是约2×106细胞/kg、约3×106细胞/kg、约4×106细胞/kg、约5×106细胞/kg、约6×106细胞/kg、约7×106细胞/kg、约8×106细胞/kg、约9×106细胞/kg、或约10×106细胞/kg、或更大细胞/kg，包含所有介于中间的细胞剂量。
在另一个说明性实施例中，提供给受试者的已转导细胞的有效量是约2×106细胞/kg到约10×106细胞/kg、约3×106细胞/kg到约10×106细胞/kg、约4×106细胞/kg到约10×106细胞/kg、约5×106细胞/kg到约10×106细胞/kg、2×106细胞/kg到约6×106细胞/kg、2×106细胞/kg到约7×106细胞/kg、2×106细胞/kg到约8×106细胞/kg、3×106细胞/kg到约6×106细胞/kg、3×106细胞/kg到约7×106细胞/kg、3×106细胞/kg到约8×106细胞/kg、4×106细胞/kg到约6×106细胞/kg、4×106细胞/kg到约7×106细胞/kg、4×106细胞/kg到约8×106细胞/kg、5×106细胞/kg到约6×106细胞/kg、5×106细胞/kg到约7×106细胞/kg、5×106细胞/kg到约8×106细胞/kg、或6×106细胞/kg到约8×106细胞/kg、包含所有介于中间的细胞剂量。
剂量必然会出现一些变化，这取决于所治疗受试者的病状。负责投与的人员将在任何情况下确定个别个体的合适剂量。
在各个实施例中，本文中所设想的载体、组合物和方法使用离体基因治疗和自体移植提供改良的基因治疗方法。在一个优选实施例中，已转导细胞如干细胞或祖细胞，例如造血干细胞或祖细胞，或CD34+细胞。在特定实施例中，在增加逆转录病毒、例如慢病毒的转导效率和VCN的一种或多种试剂存在下，用本文中所设想的载体转导造血干细胞或祖细胞，并向需要治疗血红蛋白病的受试者施用已转导细胞。
在特定实施例中，在增加逆转录病毒、例如慢病毒的转导效率和VCN的一种或多种试剂存在下，用本文中所设想的载体转导造血干细胞或祖细胞，并向需要治疗肾上腺脑白质营养不良或肾上腺脊髓神经病的受试者施用已转导细胞。
在特定实施例中，在增加逆转录病毒、例如慢病毒的转导效率和VCN的一种或多种试剂存在下，用本文中所设想的载体转导造血干细胞或祖细胞，并向需要治疗ADA-SCID、X-SCID、巴藤病、MPSI或MPSII的受试者施用已转导细胞。
在一个优选实施例中，将病毒载体系统引入造血干细胞或祖细胞中，以便在红系细胞或红系前体细胞中表达高水平的一种或多种治疗性蛋白质。本文中所设想的逆转录病毒载体，包含慢病毒载体，包括目的多核苷酸，包含例如珠蛋白基因或编码抗镰状蛋白的基因。在一个实施例中，在本发明的逆转录病毒载体中表达的珠蛋白基因是β-珠蛋白、δ-珠蛋白或γ-珠蛋白。在另一个实施例中，人类β-珠蛋白基因是野生型人类β-珠蛋白基因或人类βA-珠蛋白基因。在另一个实施例中，人类β-珠蛋白基因包括内含子序列的一个或多个缺失或是编码至少一个抗镰状氨基酸残基的突变型人类β-珠蛋白基因。抗镰状氨基酸可以衍生自人类δ-珠蛋白或人类γ-珠蛋白。在另一个实施例中，突变型人类β-珠蛋白基因编码密码子87处的苏氨酸到谷氨酰胺突变(βA-T87Q)。
在另一个实施例中，突变型人类β-珠蛋白基因编码以下突变中的一个或多个或所有：密码子87处的苏氨酸到谷氨酰胺突变(βA-T87Q)、密码子120处的赖氨酸到谷氨酸突变(βA-K120E)以及密码子95处的赖氨酸到谷氨酸突变(βA-K95E)。在另一个实施例中，突变型人类β-珠蛋白基因编码以下突变中的一个或多个或所有：密码子87处的苏氨酸到谷氨酰胺突变(βA-T87Q)、密码子16处的甘氨酸到天冬氨酸突变(βA-G16D)以及密码子22处的谷氨酸到丙氨酸突变(βA-E22A)。
在另一个优选实施例中，经本文中所设想的方法和组合物转导的造血干细胞或祖细胞所产生的药品用于基因治疗中，包含用于治疗血红蛋白病的基因治疗。在特定实施例中，所生成的药品在红系细胞中产生足够稳定水平的基因表达，例如以便治疗红细胞特异性疾病。在特定实施例中，药品用于治疗血红蛋白病，包含例如镰状细胞病(SCD)。在另一个优选实施例中，药品用于治疗地中海贫血，包含但不限于β-地中海贫血。
在另一个优选实施例中，经本文中所设想的方法和组合物转导的造血干细胞或祖细胞所产生的药品表达足够稳定水平的ABCD1以治疗肾上腺脑白质营养不良和/或肾上腺脊髓神经病。
在另一个实施例中，经本文中所设想的方法和组合物转导的造血干细胞或祖细胞所产生的药品表达足够稳定水平的腺苷脱氨酶以治疗ADA-SCID；足够稳定水平的白细胞介素2受体γ以治疗X-SCID；足够稳定水平的三肽基肽酶1以治疗巴藤病；足够稳定水平的α-L艾杜糖醛酸酶以治疗粘多糖贮积症I型(MPSI)；或足够稳定水平的艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶以治疗粘多糖贮积症II型(MPSII)。
所属领域的普通技术人员将能够使用常规方法以确定本文中所设想的包括已转导细胞和/或增加转导效率或VCN的一种或多种试剂的组合物的适当的给药途径和正确剂量的有效量。所属领域的普通技术人员还应当知道，在某些治疗中，可能需要多次施用本发明的药物组合物来实现治疗。
用于治疗适合用基于造血干细胞和祖细胞的基因治疗治疗的受试者的主要方法之一是输血。因此，本文中所设想的组合物和方法的主要目标之一是减少输血的数量或消除输血的需要。
在特定实施例中，药品施用一次。
在某些实施例中，药品在1年、2年、5年、10年或更久的一段时间内施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。
本说明书中所引用的所有公开、专利申请和授权专利都通过引用并入本文中，其引用的程度如同每个个别公开、专利申请或授权专利经特定并且独立地指示通过引用并入一般。
尽管已经出于清楚理解的目的通过说明和实例相当详细地描述了前述发明，但根据本发明的传授内容，本领域一般技术人员将容易地显而易见，可以在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下对其作出某些改变和修改。提供以下实例仅作为说明并且不具有限制性。所属领域的技术人员将容易识别出多种可以被改变或修改以产生基本类似结果的非关键参数。
实例
实例1
有效性测定
载体拷贝数(VCN)和转导效率
将经洗涤细胞再悬浮于2mL干细胞生长培养基(Stem Cell Growth Medium，SCGM)+细胞因子中并转移到标准12孔非贴壁组织培养板。将细胞在标准加湿组织培养孵育器(5％CO2)中再保持6天，然后进行载体拷贝数(VCN)分析或单细胞巢式PCR以测定转导效率。VCN和单细胞巢式PCR测定均通过qPCR进行，使用对载体和内源性对照基因具有特异性的引物和探针。VCN通过载体信号的量除以内源性对照基因的量来确定。对于单细胞巢式PCR测定，计数含有内源性对照基因阳性细胞的孔和含有载体和内源性对照基因均阳性的标记细胞的孔，并计算标记细胞的比例或转导效率。
甲基纤维素测定
将经洗涤细胞再悬浮于200μL SCGM中，然后转移到补充有细胞因子的甲基纤维素(例如，Methocult M4434 Classic)的3mL等分试样。然后使用钝的16号针头将1.1mL转移到平行的35mm组织培养皿。将培养皿在标准加湿组织培养孵育器中保持12-16天，并对集落的大小、形态和细胞组成进行评分。然后挑取单个集落用于随后的VCN分析，或合并整个35mm培养皿的内容物，并且然后进行VCN分析。
用于评定病毒进入的BlaM测定
在F108、PGE2和编码β-内酰胺酶-Vpr融合蛋白的病毒存在下，转导细胞2小时。在转导之后，对细胞进行洗涤并与荧光β-内酰胺酶底物一起孵育30-60分钟。通过流式细胞术分析β-内酰胺酶切割：未切割的底物是GFP+，并且荧光β-内酰胺酶的切割产生太平洋蓝+信号。β-内酰胺酶切割表示慢病毒进入细胞。此外，参看Cavrois等人《自然·生物技术》2002年。
长期造血干细胞(Long-term Hematopoietic Stem Cell，LT-HSC)的转导
将经慢病毒转导的HSC移植到NOD/SCIDγ(NSG)小鼠中以评定候选化合物对人类长期造血干细胞的病毒转导的影响。将已转导细胞洗涤并再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并且移植到亚骨髓消融的成年NSG小鼠的尾静脉中，残余毒性极小。根据标准IACUC动物护理指南，将小鼠圈养在无病原体的环境中。在移植后4个月，从两个股骨收获骨髓(BM)，并通过用抗hCD45抗体(BD#561864)染色，然后进行流式细胞术分析来分析人类细胞的VCN和移植。
实例2
星形孢菌素增加人类CD34+细胞中的病毒进入和随后的VCN。
将hCD34+细胞在含有细胞因子的培养基中培养48小时，并且然后在200nM星形孢菌素存在的情况下在37℃下培养2小时。在星形孢菌素孵育之后，将细胞洗涤并且经含有LNGFR BLAM的LVV转导2小时或24小时。然后对经转导2小时的细胞进行用于BLAM测定的染色和流式分析以便定量病毒进入。相比于媒剂处理的对照，星形孢菌素治疗导致含有LVV的细胞量增加大约50％。图1A。对转导完整24小时的细胞的额外分析表明在星形孢菌素治疗情况下VCN增加2倍以及随后如通过流式细胞术测定的转基因表达(LNGFR)增加1.5倍。图1B和图1C。
实例3
在星形孢菌素存在下转导的hCD34+细胞的干细胞潜能
将hCD34+细胞在200nM、400nM或800nM星形孢菌素或媒剂(DMSO)存在的情况下在37℃孵育2小时或24小时。对于2小时孵育，随后将细胞洗涤并在转导培养基中培养剩余的24小时。在培养之后，细胞被铺板到甲基纤维素中以进行CFC形成。在星形孢菌素情况下所有三种测试剂量的短孵育时间，2小时，不影响hCD34+细胞形成集落的能力。图2B。这指示2小时星形孢菌素暴露并不影响经培养细胞的干细胞潜能。相比而言，以所有三种测试剂量暴露于星形孢菌素24小时影响集落形成。图2A。在所测试的最高剂量800nM下，存在很少保留集落形成潜能的hCD34+细胞，并且在较低剂量下，CFC形成减少>50％。这些数据指示长期星形孢菌素暴露减小经培养hCD34+细胞的干细胞潜能。
实例4
星形孢菌素治疗改进低转导细胞批次的转导
在经LVV转导之前用星形孢菌素(200nM、400nM或800nM)处理七种独特细胞批次2小时。这七种细胞批次被预期分类为低、中等或高转导细胞批次。低转导细胞批次在此被定义为在经媒剂处理的转导中具有平均VCN<0.5，中等转导细胞批次在此被定义为具有平均0.5<VCN<1，并且高转导细胞批次在此被定义为具有平均VCN>1。随着星形孢菌素浓度增加，存在低转导细胞批次和中等转导细胞批次中平均VCN增加的趋势。图3A和图3B。在高转导细胞批次中由星形孢菌素治疗平台驱动的VCN提高以及增加星形孢菌素的量并不提供额外益处。图3A和图3B。在较低转导细胞批系中VCN提高更大。在用800nM星形孢菌素处理的培养物中，平均VCN在低转导细胞批次中增加2.3倍，在中等转导细胞批次中增加1.5倍，并且在高转导细胞批次中增加1.2倍。在具有不同转导能力的细胞批次中调平平均VCN的属性可以帮助控制细胞批次与标准化药品VCN之间的变化。
实例5
星形孢菌素治疗增加长期NSG再生细胞的转导
用400nM或800nM星形孢菌素或媒剂处理hCD34+细胞2小时，并且然后经LVV转导。在转导之后，细胞被洗涤并注入经白消安处理的NSG小鼠中。保持药品的等分试样以进行体外分析。药品的VCN通过合并集落测定并且相比于经媒剂处理的细胞在800nM星形孢菌素治疗的情况下展示了平均VCN的大约2倍的改进。图4A。在这种细胞批次中，400nM星形孢菌素治疗并不明显改进药品的平均VCN。图4A。在体内4个月之后，NSG小鼠被处死并且收集BM并分析植入的hCD34+细胞的VCN。相比于药品VCN，跨体内所有组的平均VCN整体减少，指示短期祖细胞而非长期干细胞的较高转导。图4B。还存在用星形孢菌素处理的组中的增加的平均VCN以及阳性剂量依赖性效应(在400nM星形孢菌素情况下3倍改进以及在800nM星形孢菌素情况下4倍改进)，指示星形孢菌素治疗产生对关于经媒剂处理的细胞的长期干细胞的增加的转导。当含有短期再生细胞和长期再生细胞的混合物的药品的VCN提高为大约2倍时，长期干细胞的这种增加的转导增强3到4倍，指示对长期再生干细胞的星形孢菌素治疗增强的转导比对短期组细胞的程度更大。
实例6
在转导之前短期暴露于星形孢菌素并不影响移植细胞的植入或分化能力
移植后四个月收获的骨髓(BM)被随后分析用于hCD34+细胞的植入。用识别各种细胞表面标记(CD45、CD33、CD3、CD19)的抗体混合物给细胞染色并通过流式细胞术分析。所有组表明对hCD34+细胞的可比较级植入(-30-40％)，并且不存在星形孢菌素治疗的统计学显著效应。另外，不管哪种处理(400nM或800nM星形孢菌素)，骨髓(CD33+)或淋巴(CD3+或CD19+)细胞的比例都没有显著差异。图5A到图5D。这些数据指示，使用星形孢菌素作为VCN增强子既不影响转导的hCD34+细胞的移植能力，也不影响移植的细胞的分化潜能。图5B。
实例7
星形孢菌素处理的hCD34+细胞是多克隆
对实例5种制造的hCD34+移植物进行调适道德非限定性插入位点分析方法(Zhou等人，(2015年)《人类基因疗法(Hum Gene Ther Methods)》，第26卷，第1期：第4页到12页)以分析多克隆性。在基因区域内定位经识别的插入位点，以检查慢病毒整合概况。星形孢菌素治疗并不呈现偏斜转导的细胞的整合概况。图6A。还将插入位点定量为全部读取的百分比。针对每个治疗示出前10个克隆。所有移植前样本展示多克隆性。图6B。
还对移植后四个月收获的骨髓(BM)进行调适的非限定性插入位点分析方法以分析植入的细胞的克隆性是否受星形孢菌素治疗的影响。插入位点针对每个组合并并且被定量为全部读取的百分比。针对每个治疗示出前10个克隆。经星形孢菌素治疗的细胞具有与经媒剂治疗的细胞类似的多克隆插入位点概况。图6C。
实例8
星形孢菌素治疗增加散装hCD34+移植物和hCD34+CD38LoCD90+CD45RA-表型干细胞的
转导
用抵抗表型HSC(CD34+CD38LoCD90+CD45RA-细胞)的细胞表面标记的抗体对解冻的hCD34+细胞进行染色并且使用Sony细胞分选仪进行分选。对于每个散装细胞样本，从前向散射和侧向散射门分选约20,000个细胞。另外，从每个CD34+CD38LoCD90+CD45RA-细胞(表型HSC)样本分选10,000到16,000个细胞。分选的HSC是CFSE标记的并且然后用散装CD34+载体细胞进行混合。细胞制备被预刺激，并且然后用400nM或800nM星形孢菌素处理2小时，并且然后经LVV转导。在转导之后，将细胞培养额外4天以便从分析中排除伪转导。
在培养之后，细胞被单细胞分选到96个孔板中并且通过单细胞PCR测定进行分析以便分析转导效率，慢病毒载体阳性细胞的百分比。经过标准转导程序转导的散装细胞和CD34+CD38LoCD90+CD45RA-细胞的转导效率相等。用两种浓度的星形孢菌素处理的散装细胞和CD34+CD38LoCD90+CD45RA-细胞的转导效率也相等并且高于使用标准转导方案转导的细胞的转导效率。图7。
实例9
PGE2和星形孢菌素增加经LVV转导的hCD34+细胞的VCN
用星形孢菌素处理hCD34+细胞两小时。然后细胞经LVV转导并且在硫酸鱼精蛋白(标准)、PGE2或媒剂存在下进行培养。在转导之后，洗涤细胞并在MethoCult中培养14天。
在14天MethoCult培养之后，收集合并的集落并分析VCN。示出了平均VCN数据。在转导中加入星形孢菌素引起VCN增加3倍；加入星形孢菌素胜过加入PGE2，并且与单独用PGE2或星形孢菌素处理相比，PGE2和星形孢菌素的组合意外引起VCN增加。图8。
总体而言，在以下权利要求书中，所使用的术语不应理解为将权利要求书限制于本说明书和权利要求书中所公开的特定实施例，而应理解为包含所有可能的实施例以及这份权利要求书所有权获得的等效物的全部范围。因此，权利要求书不受本公开限制。

Claims (190)

1.一种造血细胞群体，包括经过慢病毒载体转导的造血干细胞和祖细胞(HSPC)，其中所述HSPC的至少50％被转导并且其中所述HSPC具有约0.5到5的平均载体拷贝数(VCN)。
2.根据权利要求1所述的群体，其中所述慢病毒载体以约10到约30的感染复数(MOI)转导所述HSPC。
3.根据权利要求1所述的群体，其中所述慢病毒载体以约10到约25的感染复数(MOI)转导所述HSPC。
4.根据权利要求1所述的群体，其中所述慢病毒载体以约10到约20的感染复数(MOI)转导所述HSPC。
5.根据权利要求1所述的群体，其中所述慢病毒载体以如下MOI转导所述HSPC：约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30。
6.根据权利要求1所述的造血细胞群体，其中所述HSPC包括CD34+细胞或CD133+细胞。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的造血细胞群体，其中所述HSPC包括CD34+CD38LoCD90+CD45RA-细胞。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞的至少75％已被转导。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞的至少90％已被转导。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的造血细胞群体，其中所述平均VCN是至少1.0。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的造血细胞群体，其中所述平均VCN是至少1.5。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的造血细胞群体，其中所述平均VCN是至少2.0。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的造血细胞群体，其中所述平均VCN是至少2.5。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞群体的活力是至少75％。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞群体的活力是至少85％。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞群体的活力是至少95％。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的造血细胞群体，其中所述造血细胞群体的内毒素水平是至多5.0EU/mL。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的造血细胞群体，其中所述造血细胞群体的内毒素水平是至多0.5EU/mL。
19.根据权利要求1到18中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞群体包括至少1×106个HSPC细胞。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞群体包括至少1×107个HSPC细胞。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞群体包括至少1×108个HSPC细胞。
22.根据权利要求1到21中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞群体包括至少1×109个HSPC细胞。
23.根据权利要求1到22中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子或其转录活性片段，其可操作地连接于编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸。
25.根据权利要求1到22中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体编码腺苷脱氨酶。
26.根据权利要求1到22中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码腺苷脱氨酶的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
27.根据权利要求1到22中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体编码白细胞介素2受体γ。
28.根据权利要求1到22中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码白细胞介素2受体γ的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
29.根据权利要求1到22中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体编码三肽基肽酶1。
30.根据权利要求1到22中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码三肽基肽酶1的多核苷酸。
31.根据权利要求1到22中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体编码α-L艾杜糖醛酸酶(iduronidase)。
32.根据权利要求1到22中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码α-L艾杜糖醛酸酶的多核苷酸。
33.根据权利要求1到22中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
34.根据权利要求1到22中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶的多核苷酸。
35.根据权利要求1到22中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体是AnkT9W载体、T9Ank2W载体、TNS9载体、lentiglobin HPV569载体、lentiglobin BB305载体、BG-1载体、BGM-1载体、d432βAγ载体、mLARβΔγV5载体、GLOBE载体、G-GLOBE载体、βAS3-FB载体、V5载体、V5m3载体、V5m3-400载体、G9载体或BCL11A shmir载体。
36.一种造血细胞群体，包括经慢病毒转导的造血干细胞和祖细胞(HSPC)，其中所述造血细胞群体包括至少85％HSPC，其中所述HSPC的至少50％被转导，其中所述HSPC具有约0.5到约5.0的平均载体拷贝数(VCN)，其中所述细胞群体的活力是至少75％，其中所述造血细胞群体的内毒素水平是约0.5EU/mL到约5.0EU/mL，并且其中所述造血细胞群体包括至少1×106个HSPC。
37.一种造血细胞群体，包括经慢病毒转导的CD34+CD38LoCD90+CD45RA-细胞，其中所述CD34+CD38LoCD90+CD45RA-细胞的至少50％被转导，其中所述CD34+CD38LoCD90+CD45RA-细胞具有约0.5到约5.0的平均VCN，其中所述造血细胞群体的活力是至少75％，其中所述造血细胞群体的内毒素水平是约0.5EU/mL到约5.0EU/mL，并且其中所述造血细胞群体包括至少1×106个CD34+细胞。
38.一种造血细胞群体，包括经慢病毒转导的CD34+细胞，其中所述CD34+的至少50％被转导，其中所述CD34+细胞具有约0.5到约5.0的平均载体拷贝数(VCN)，其中所述造血细胞群体的活力是至少75％，其中所述造血细胞群体的内毒素水平是约0.5EU/mL到约5.0EU/mL，并且其中所述群体包括至少2×106个CD34+细胞。
39.根据权利要求36到38中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体以约10到约30的感染复数(MOI)转导所述HSPC。
40.根据权利要求36到38中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体以约10到约25的感染复数(MOI)转导所述HSPC。
41.根据权利要求36到38中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体以约10到约20的感染复数(MOI)转导所述HSPC。
42.根据权利要求36到38中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体以如下感染复数(MOI)转导所述HSPC：约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30。
43.根据权利要求36到42中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞的至少75％已被转导。
44.根据权利要求36到43中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞的至少90％已被转导。
45.根据权利要求36到44中任一项所述的造血细胞群体，其中所述平均VCN是至少1.0。
46.根据权利要求36到45中任一项所述的造血细胞群体，其中所述平均VCN是至少1.5。
47.根据权利要求36到46中任一项所述的造血细胞群体，其中所述平均VCN是至少2.0。
48.根据权利要求36到47中任一项所述的造血细胞群体，其中所述平均VCN是至少2.5。
49.根据权利要求36到48中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞群体的活力是至少85％。
50.根据权利要求36到49中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞群体的活力是至少95％。
51.根据权利要求36到50中任一项所述的造血细胞群体，其中所述造血细胞群体的内毒素水平是至多5.0EU/mL。
52.根据权利要求36到51中任一项所述的造血细胞群体，其中所述造血细胞群体的内毒素水平是至多0.5EU/mL。
53.根据权利要求36到52中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞群体包括至少1×107个HSPC。
54.根据权利要求36到53中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞群体包括至少1×108个HSPC细胞。
55.根据权利要求36到54中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞群体包括至少1×109个HSPC。
56.根据权利要求36到55中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞的来源是脐带血、骨髓或动员后外周血。
57.根据权利要求36到56中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞的来源是动员后外周血。
58.根据权利要求36到57中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体衍生自选自由以下组成的组的慢病毒：人类免疫缺陷病毒(HIV；包含HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
59.根据权利要求36到58中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体衍生自HIV慢病毒。
60.根据权利要求36到59中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体衍生自HIV-1慢病毒。
61.根据权利要求36到60中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽。
62.根据权利要求36到61中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子或其转录活性片段，其可操作地连接于编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸。
63.根据权利要求36到60中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体编码腺苷脱氨酶。
64.根据权利要求36到60中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码腺苷脱氨酶的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
65.根据权利要求36到60中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体编码白细胞介素2受体γ。
66.根据权利要求36到60中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码白细胞介素2受体γ的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
67.根据权利要求36到60中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体编码三肽基肽酶1。
68.根据权利要求36到60中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码三肽基肽酶1的多核苷酸。
69.根据权利要求36到60中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体编码α-L艾杜糖醛酸酶。
70.根据权利要求36到60中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码α-L艾杜糖醛酸酶的多核苷酸。
71.根据权利要求36到60中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
72.根据权利要求36到60中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶的多核苷酸。
73.根据权利要求36到60中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体是AnkT9W载体、T9Ank2W载体、TNS9载体、lentiglobin HPV569载体、lentiglobin BB305载体、BG-1载体、BGM-1载体、d432βAγ载体、mLARβΔγV5载体、GLOBE载体、G-GLOBE载体、βAS3-FB载体、V5载体、V5m3载体、V5m3-400载体、G9载体或BCL11A shmir载体。
74.根据权利要求36到72中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体包括：
a)5'长末端(LTR)；
b)RNA输出元件；
c)慢病毒中央多聚嘌呤区(cPPT)；
d)可操作地连接于目的基因的启动子；以及
e)SIN 3'LTR。
75.根据权利要求74所述的造血细胞群体，其中与野生型5'LTR相比，经修饰5'LTR进一步包括缺失。
76.根据权利要求74到75中任一项所述的造血细胞群体，其中所述5'LTR的启动子被选自由以下组成的组的异源启动子替换：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RousSarcoma Virus，RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子
77.根据权利要求74到76中任一项所述的造血细胞群体，其中所述RNA输出元件包括乙型肝炎病毒转录后调节元件(PRE)或人类免疫缺陷病毒(HIV)rev反应元件(RRE)。
78.根据权利要求74到77中任一项所述的造血细胞群体，其中所述3'LTR包括多腺苷酸化序列。
79.根据权利要求74到78中任一项所述的造血细胞群体，其中所述启动子包括人类β-珠蛋白LCR的一个或多个元件。
80.根据权利要求79所述的造血细胞群体，其中所述人类β-珠蛋白LCR包括来自所述人类β-珠蛋白LCR的DNase I超敏感位点2、3和4。
81.根据权利要求74到80中任一项所述的造血细胞群体，其中所述慢病毒载体进一步包括人类β-珠蛋白3'增强子元件。
82.根据权利要求74到80中任一项所述的造血细胞群体，其中所述目的基因编码抗镰状蛋白或珠蛋白基因。
83.根据权利要求82所述的造血细胞群体，其中所述目的基因编码人类β-珠蛋白蛋白质、人类δ-珠蛋白蛋白质、人类γ-珠蛋白蛋白质、人类βA-T87Q-珠蛋白蛋白质、人类βA-G16D/E22A/T87Q-珠蛋白蛋白质或人类βA-T87Q/K95E/K120E-珠蛋白蛋白质。
84.根据权利要求1到83中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞的所述β-珠蛋白等位基因是βE/β0、βC/β0、β0/β0、βE/βE、βC/β+、βE/β+、β0/β+、β+/β+、βC/βC、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS。
85.根据权利要求1到83中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞的所述β-珠蛋白等位基因是βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βC/β+、β0/β+或β+/β+。
86.根据权利要求1到83中任一项所述的造血细胞群体，其中所述细胞的所述β-珠蛋白等位基因是βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS。
87.一种组合物，包括根据权利要求1到86中任一项所述的造血细胞群体。
88.一种药物组合物，包括根据权利要求1到86中任一项所述的造血细胞群体和药学上可接受的载体。
89.一种培养物，包括：造血干细胞或祖细胞；培养基；慢病毒载体；以及星形孢菌素或其模拟物或衍生物。
90.根据权利要求89所述的培养物，其中所述慢病毒载体以约10到约30的MOI存在。
91.根据权利要求89所述的培养物，其中所述慢病毒载体以约10到约25的MOI存在。
92.根据权利要求89所述的培养物，其中所述慢病毒载体以约10到约20的MOI存在。
93.根据权利要求89所述的培养物，其中所述慢病毒载体以如下MOI存在：约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30。
94.根据权利要求89到93中任一项所述的培养物，其中所述培养物进一步包括增加前列腺素EP受体信号传导的试剂。
95.根据权利要求94所述的培养物，其中所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由以下组成的组：PGA2；PGB2；PGD2；PGE1；PGE2；PGF2；PGI2；PGH2；PGJ2；以及其衍生物和模拟物。
96.根据权利要求94到95中任一项所述的培养物，其中所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由以下组成的组：15d-PGJ2；δ12-PGJ2；2-羟基十七碳三烯酸(HHT)；凝血恶烷A2；凝血恶烷B2；伊洛前列素(Iloprost)；曲前列环素(Treprostinil)；曲伏前列素(Travoprost)；卡前列素氨丁三醇(Carboprost tromethamine)；他氟前列腺素(Tafluprost)；拉坦前列素(Latanoprost)；比马前列素(Bimatoprost)；异丙基乌诺前列酮(Unoprostone isopropyl)；氯前列烯醇；奥斯特凡(Oestrophan)；苏泊凡(Superphan)；迷索前列醇(Misoprostol)；布他前列素(Butaprost)；亚油酸；13(s)-HODE；LY171883；米德酸(Mead Acid)；二十碳三烯酸；环氧二十碳三烯酸；ONO-259；Cay1039；PGE2受体激动剂；16,16-二甲基PGE2；19(R)-羟基PGE2；16,16-二甲基PGE2对(对乙酰胺基苯甲酰胺基)苯酯；11-脱氧-16,16-二甲基PGE2；9-脱氧-9-亚甲基-16,16-二甲基PGE2；9-脱氧-9-亚甲基PGE2；硫前列酮；PGE2丝氨醇酰胺；PGE2甲酯；16-苯基四去甲PGE2；15(S)-15-甲基PGE2；以及15(R)-15-甲基PGE2。
97.根据权利要求94到96中任一项所述的培养物，其中所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由前列腺素E2(PGE2)或16,16-二甲基PGE2组成的组。
98.根据权利要求94到97中任一项所述的培养物，其中所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂是PGE2。
99.根据权利要求94到98中任一项所述的培养物，其中所述造血干细胞或祖细胞是CD34+细胞或CD133+细胞。
100.根据权利要求94到99中任一项所述的培养物，其中所述造血干细胞或祖细胞在聚阳离子聚合物存在下转导。
101.根据权利要求100所述的培养物，其中所述聚阳离子聚合物是聚凝胺、硫酸鱼精蛋白、聚乙烯亚胺或聚乙二醇/聚-L-赖氨酸嵌段共聚物。
102.根据权利要求94到101中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体衍生自选自由以下组成的组的慢病毒：人类免疫缺陷病毒(HIV；包含HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
103.根据权利要求94到102中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体衍生自HIV慢病毒。
104.根据权利要求94到103中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体衍生自HIV-1慢病毒。
105.根据权利要求94到101中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽。
106.根据权利要求94到101中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子或其转录活性片段，其可操作地连接于编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸。
107.根据权利要求94到101中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体编码腺苷脱氨酶。
108.根据权利要求94到101中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码腺苷脱氨酶的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
109.根据权利要求94到101中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体编码白细胞介素2受体γ。
110.根据权利要求94到101中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码白细胞介素2受体γ的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
111.根据权利要求94到101中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体编码三肽基肽酶1。
112.根据权利要求94到101中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码三肽基肽酶1的多核苷酸。
113.根据权利要求94到101中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体编码α-L艾杜糖醛酸酶。
114.根据权利要求94到101中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码α-L艾杜糖醛酸酶的多核苷酸。
115.根据权利要求94到101中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
116.根据权利要求94到101中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶的多核苷酸。
117.根据权利要求94到101中任一项所述的培养物，其中所述慢病毒载体是AnkT9W载体、T9Ank2W载体、TNS9载体、lentiglobin HPV569载体、lentiglobin BB305载体、BG-1载体、BGM-1载体、d432βAγ载体、mLARβΔγV5载体、GLOBE载体、G-GLOBE载体、βAS3-FB载体、V5载体、V5m3载体、V5m3-400载体、G9载体或BCL11A shmir载体。
118.一种转导造血细胞群体的方法，其包括：在包括星形孢菌素的培养基中培养所述细胞，洗涤所述细胞以基本上除去所述星形孢菌素，以及将所述细胞与慢病毒接触。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述慢病毒载体以约10到约30的MOI存在。
120.根据权利要求118所述的方法，其中所述慢病毒载体以约10到约25的MOI存在。
121.根据权利要求118所述的方法，其中所述慢病毒载体以约10到约20的MOI存在。
122.根据权利要求118所述的方法，其中所述慢病毒载体以如下MOI存在：约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30。
123.根据权利要求118到122中任一项所述的方法，进一步包括在存在增加前列腺素EP受体信号传导的试剂的情况下培养所述细胞。
124.根据权利要求123所述的方法，其中所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由以下组成的组：PGA2；PGB2；PGD2；PGE1；PGE2；PGF2；PGI2；PGH2；PGJ2；以及其衍生物和模拟物。
125.根据权利要求123到124中任一项所述的方法，其中所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由以下组成的组：15d-PGJ2；δ12-PGJ2；2-羟基十七碳三烯酸(HHT)；凝血恶烷A2；凝血恶烷B2；伊洛前列素；曲前列环素；曲伏前列素；卡前列素氨丁三醇；他氟前列腺素；拉坦前列素；比马前列素；异丙基乌诺前列酮；氯前列烯醇；奥斯特凡；苏泊凡；迷索前列醇；布他前列素；亚油酸；13(s)-HODE；LY171883；米德酸；二十碳三烯酸；环氧二十碳三烯酸；ONO-259；Cay1039；PGE2受体激动剂；16,16-二甲基PGE2；19(R)-羟基PGE2；16,16-二甲基PGE2对(对乙酰胺基苯甲酰胺基)苯酯；11-脱氧-16,16-二甲基PGE2；9-脱氧-9-亚甲基-16,16-二甲基PGE2；9-脱氧-9-亚甲基PGE2；硫前列酮；PGE2丝氨醇酰胺；PGE2甲酯；16-苯基四去甲PGE2；15(S)-15-甲基PGE2；以及15(R)-15-甲基PGE2。
126.根据权利要求123到125中任一项所述的方法，其中所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由前列腺素E2(PGE2)或16,16-二甲基PGE2组成的组。
127.根据权利要求123到126中任一项所述的方法，其中所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂是PGE2。
128.根据权利要求123到127中任一项所述的方法，其中所述造血细胞群体在聚阳离子聚合物存在下转导。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述聚阳离子聚合物是聚凝胺、硫酸鱼精蛋白、聚乙烯亚胺或聚乙二醇/聚-L-赖氨酸嵌段共聚物。
130.根据权利要求123到129中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体衍生自选自由以下组成的组的慢病毒：人类免疫缺陷病毒(HIV；包含HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
131.根据权利要求123到130中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体衍生自HIV慢病毒。
132.根据权利要求123到131中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体衍生自HIV-1慢病毒。
133.根据权利要求123到129中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽。
134.根据权利要求123到129中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子或其转录活性片段，其可操作地连接于编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸。
135.根据权利要求123到129中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体编码腺苷脱氨酶。
136.根据权利要求123到129中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码腺苷脱氨酶的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
137.根据权利要求123到129中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体编码白细胞介素2受体γ。
138.根据权利要求123到129中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包括可操作地连接于编码白细胞介素2受体γ的多核苷酸的延伸因子1α启动子。
139.根据权利要求123到129中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体编码三肽基肽酶1。
140.根据权利要求123到129中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码三肽基肽酶1的多核苷酸。
141.根据权利要求123到129中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体编码α-L艾杜糖醛酸酶。
142.根据权利要求123到129中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码α-L艾杜糖醛酸酶的多核苷酸。
143.根据权利要求123到129中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
144.根据权利要求123到129中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包括延伸因子1α启动子或包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代(MND)的启动子，其可操作地连接于编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶的多核苷酸。
145.根据权利要求123到129中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体是AnkT9W载体、T9Ank2W载体、TNS9载体、lentiglobin HPV569载体、lentiglobin BB305载体、BG-1载体、BGM-1载体、d432βAγ载体、mLARβΔγV5载体、GLOBE载体、G-GLOBE载体、βAS3-FB载体、V5载体、V5m3载体、V5m3-400载体、G9载体或BCL11A shmir载体。
146.根据权利要求94到116中任一项所述的培养物或根据权利要求123到132中任一项所述的方法，其中逆转录病毒载体是慢病毒载体，所述慢病毒载体包括：
a)5'长末端(LTR)；
b)Psi(Ψ)包装信号；
c)RNA输出元件；
d)慢病毒中央多聚嘌呤区(cPPT)；
e)可操作地连接于目的多核苷酸的启动子；以及
f)SIN 3'LTR。
147.根据权利要求146所述的培养物或方法，其中与野生型5'LTR相比，经修饰5'LTR进一步包括缺失。
148.根据权利要求146或权利要求147所述的培养物或方法，其中所述5'LTR的启动子被选自由以下组成的组的异源启动子替换：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。
149.根据权利要求146到148中任一项所述的培养物或方法，其中所述RNA输出元件包括乙型肝炎病毒转录后调节元件(PRE)或人类免疫缺陷病毒(HIV)rev反应元件(RRE)。
150.根据权利要求146到149中任一项所述的培养物或方法，其中所述3'LTR包括多腺苷酸化序列。
151.根据权利要求146到150中任一项所述的培养物或方法，其中所述启动子包括人类β-珠蛋白LCR的一个或多个元件。
152.根据权利要求146到151中任一项所述的培养物或方法，其中所述人类β-珠蛋白LCR包括来自所述人类β-珠蛋白LCR的DNase I超敏感位点2、3和4。
153.根据权利要求146到152中任一项所述的培养物或方法，其中所述慢病毒载体进一步包括人类β-珠蛋白3'增强子元件。
154.根据权利要求146到153中任一项所述的培养物或方法，其中所述目的多核苷酸编码抗镰状蛋白或珠蛋白基因。
155.根据权利要求154所述的培养物或方法，其中所述目的基因编码人类β-珠蛋白蛋白质、人类δ-珠蛋白蛋白质、人类γ-珠蛋白蛋白质、人类βA-T87Q-珠蛋白蛋白质、人类βA-G16D/E22A/T87Q-珠蛋白蛋白质或人类βA-T87Q/K95E/K120E-珠蛋白蛋白质。
156.根据权利要求146到150中任一项所述的培养物或方法，其中所述启动子能够在小神经胶质细胞中操作。
157.根据权利要求156所述的培养物或方法，其中所述启动子包括骨髓增生肉瘤病毒增强子、负调控区缺失、d1587rev引物结合位点被取代的启动子或其转录活性片段。
158.根据权利要求156到157中任一项所述的培养物或方法，其中所述目的多核苷酸编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽。
159.根据权利要求146到158中任一项所述的方法，其中所述造血细胞群体转导至少约2小时。
160.根据权利要求146到159中任一项所述的方法，其中所述造血细胞群体转导至少约24小时。
161.根据权利要求146到160中任一项所述的方法，其中所述造血细胞群体转导约2小时到约24小时。
162.根据权利要求146到161中任一项所述的方法，其中所述造血细胞包括造血干细胞或祖细胞。
163.根据权利要求146到162中任一项所述的方法，其中所述造血细胞包括CD34+细胞或CD133+细胞。
164.根据权利要求146到163中任一项所述的方法，其中所述造血细胞群体被选择用于转导前的CD34+表达或CD133+表达。
165.一种治疗受试者的血红蛋白病的方法，包括向所述受试者施用根据权利要求1到60和73到86中任一项所述的细胞群体。
166.一种改善受试者的血红蛋白病的至少一种症状的方法，包括向所述受试者施用根据权利要求1到60和73到86中任一项所述的细胞群体或根据权利要求87或88所述的组合物。
167.根据权利要求166所述的方法，其中所述受试者的所述β-珠蛋白等位基因是βE/β0、βC/β0、β0/β0、βE/βE、βC/β+、βE/β+、β0/β+、β+/β+、βC/βC、βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS。
168.一种治疗受试者的地中海贫血的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到60和73到86中任一项所述的造血细胞群体或根据权利要求87或88所述的组合物。
169.根据权利要求168所述的方法，其中所述地中海贫血是α-地中海贫血。
170.根据权利要求168所述的方法，其中所述地中海贫血是β-地中海贫血。
171.根据权利要求168所述的方法，其中所述受试者的所述β-珠蛋白等位基因是βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βC/β+、β0/β+或β+/β+。
172.一种治疗受试者的镰状细胞病的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到60和73到86中任一项所述的造血细胞群体或根据权利要求87或88所述的组合物。
173.根据权利要求172所述的方法，其中所述受试者的所述β-珠蛋白等位基因是βE/βS、β0/βS、βC/βS、β+/βS或βS/βS。
174.一种治疗受试者的β-地中海贫血的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到60和73到86中任一项所述的造血细胞群体或根据权利要求87或88所述的组合物。
175.根据权利要求174所述的方法，其中所述受试者的所述β-珠蛋白等位基因是βE/β0、βC/β0、β0/β0、βC/βC、βE/βE、βE/β+、βC/βE、βC/β+、β0/β+或β+/β+。
176.一种治疗受试者的肾上腺脑白质营养不良或肾上腺脊髓神经病的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到62中任一项所述的造血细胞群体或根据权利要求87或88所述的组合物。
177.一种治疗受试者的ADA-SCID的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到60和63到64中任一项所述的造血细胞群体或根据权利要求87或88所述的组合物。
178.一种治疗受试者的X-SCID的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到60和65到66中任一项所述的造血细胞群体或根据权利要求87或88所述的组合物。
179.一种治疗受试者的巴藤病(Batten's disease)的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到60和67到68中任一项所述的造血细胞群体或根据权利要求87或88所述的组合物。
180.一种治疗受试者的MPS I的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到60和69到70中任一项所述的造血细胞群体或根据权利要求87或88所述的组合物。
181.一种治疗受试者的MPS II的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到60和71到72中任一项所述的造血细胞群体或根据权利要求87或88所述的组合物。
182.根据权利要求165到181中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞群体通过静脉内途径、髓内途径或骨内途径施用。
183.根据权利要求165到182中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞群体静脉内施用。
184.一种试剂盒，包括增加前列腺素EP受体信号传导的试剂和星形孢菌素。
185.根据权利要求184所述的试剂盒，其中所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由以下组成的组：PGA2；PGB2；PGD2；PGE1；PGE2；PGF2；PGI2；PGH2；PGJ2；以及其衍生物和模拟物。
186.根据权利要求184到185中任一项所述的试剂盒，其中所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由以下组成的组：15d-PGJ2；δ12-PGJ2；2-羟基十七碳三烯酸(HHT)；凝血恶烷A2；凝血恶烷B2；伊洛前列素；曲前列环素；曲伏前列素；卡前列素氨丁三醇；他氟前列腺素；拉坦前列素；比马前列素；异丙基乌诺前列酮；氯前列烯醇；奥斯特凡；苏泊凡；迷索前列醇；布他前列素；亚油酸；13(s)-HODE；LY171883；米德酸；二十碳三烯酸；环氧二十碳三烯酸；ONO-259；Cay1039；PGE2受体激动剂；16,16-二甲基PGE2；19(R)-羟基PGE2；16,16-二甲基PGE2对(对乙酰胺基苯甲酰胺基)苯酯；11-脱氧-16,16-二甲基PGE2；9-脱氧-9-亚甲基-16,16-二甲基PGE2；9-脱氧-9-亚甲基PGE2；硫前列酮；PGE2丝氨醇酰胺；PGE2甲酯；16-苯基四去甲PGE2；15(S)-15-甲基PGE2；以及15(R)-15-甲基PGE2。
187.根据权利要求184到186中任一项所述的试剂盒，其中所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂选自由前列腺素E2(PGE2)或16,16-二甲基PGE2组成的组。
188.根据权利要求184到187中任一项所述的试剂盒，其中所述增加前列腺素EP受体信号传导的试剂是PGE2。
189.根据权利要求184到188中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括聚阳离子聚合物。
190.根据权利要求189所述的试剂盒，其中所述聚阳离子聚合物是聚凝胺、硫酸鱼精蛋白、聚乙烯亚胺或聚乙二醇/聚-L-赖氨酸嵌段共聚物。
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