ES2348868T3 - Vectores retrovirales terapeuticos para terapia genica. - Google Patents

Vectores retrovirales terapeuticos para terapia genica. Download PDF

Info

Publication number
ES2348868T3
ES2348868T3 ES03813391T ES03813391T ES2348868T3 ES 2348868 T3 ES2348868 T3 ES 2348868T3 ES 03813391 T ES03813391 T ES 03813391T ES 03813391 T ES03813391 T ES 03813391T ES 2348868 T3 ES2348868 T3 ES 2348868T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
globin
gene
human
vector according
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES03813391T
Other languages
English (en)
Inventor
Philippe Leboulch
Robert Pawliuk
Karen Westerman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Massachusetts Institute of Technology
Bluebird Bio Inc
Original Assignee
Massachusetts Institute of Technology
Genetix Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Massachusetts Institute of Technology, Genetix Pharmaceuticals Inc filed Critical Massachusetts Institute of Technology
Application granted granted Critical
Publication of ES2348868T3 publication Critical patent/ES2348868T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • A61K38/42—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/867—Retroviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/40—Vector systems having a special element relevant for transcription being an insulator

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Un vector lentiviral (SIN) de auto-inactivación que comprende: a) una LTR lentiviral izquierda (5'); b) un elemento de exportación retroviral, opcionalmente un elemento de respuesta inversa lentiviral (RRE); c) un promotor, o parte activa del mismo que tiene actividad promotora, y una región de control de locus (LCR), o parte activa del mismo que tiene actividad LCR, unido de forma operable a un gen de interés; y d) una LTR lentiviral derecha (3') que comprende las siguientes modificaciones 1) la región U3 de la LTR derecha (3') está modificada para incluir al menos un elemento aislante y 2) la región U5 de la LTR derecha (3') está modificada para sustituir toda o una parte de la región con una secuencia poli(A) ideal.

Description

Fundamento de la invención
Las hemoglobinopatías abarcan un número de anemias de origen genético en que hay disminución de la producción y/o aumento de la destrucción (hemólisis) de glóbulos rojos (RBCs). La sangre de seres humanos adultos normales contiene hemoglobina (denominada como HbA) que contiene dos pares de cadenas de polipéptido denominadas alfa y beta. La hemoglobina fetal (HbF), que produce RBCs normales, está presente en el nacimiento, aunque la proporción de HbF disminuye durante los primeros meses de vida y la sangre de un adulto normal contiene solo aproximadamente 2% de HbF. Hay defectos genéticos que dan por resultado la producción por el cuerpo de hemoglobinas anormales con una capacidad afectada concomitante para mantener la concentración de oxígeno. Entre estas anemias derivadas genéticamente se incluyen talasemia, enfermedad de Cooley y anemia falciforme.
La anemia falciforme (SCD) es una de las enfermedades recesivas autosómicas más comunes en el mundo. La SCD llegó a ser el primer trastorno genético para el que se identificó la mutación causante a nivel molecular: la sustitución de valina por ácido glutámico en el codón 6 de la �A-globina humana (Ingram (1957) Nature, 180:326). En homocigotos la hemoglobina anormal (Hb) [HbS(�2�S2)] se polimeriza en largas fibras por desoxigenación dentro de los glóbulos rojos (RBCs) que se vuelven deformes o “falciformados”, rígidos y adhesivos, provocando así la oclusión de la microcirculación, anemia, infarto y daño del órgano (Stamatoyannopoulos, et al. (eds) (1994) The Molecular Basis of Blood Diseases, Saunders, Filadelfia, ed. 2; 207-256; Nagel, et al. (2001) Disorders of Hemoglobin, Cambridge Univ. Press, Cambridge; 711756).
La �-globina humana es un fuerte inhibidor de la polimerización de HbS, en contraste con la �A-globina humana, que es eficaz solo a concentraciones muy altas (Bookchin et al. (1971) J. Mol. Biol. 60:263). Por lo tanto, se propuso la terapia génica de SCD por medio de la expresión forzada de �-globina o híbridos �/� en RBCs adultos después de la transferencia génica a células madre hematopoyéticas (HSCs) (McCune et al. (1994) PNAS USA 91:9852; Takekoshi et al. (1995) PNAS USA 92:3014; Miller et al. (1994) PNAS USA 91:10183; Emery et al. (1999) Hum. Gene Ther. 10:877; Rubin et al. (2000) Blood 95:3242; Sabatino et al. (2000) PNAS USA 97:13294; Blouin et al. (2000) Nat. Med. 6:177).
Aunque el descubrimiento de la región de control del locus (LCR) de la �globina humana constituyó una promesa de alcanzar altos niveles de expresión génica de globina (Tuan et al. (1985) PNAS USA 82:6384; Grosveld et al. (1987) Cell 51:975), la transferencia estable de los vectores onco-retrovirales murinos que abarcan mínimos elementos del núcleo de la LCR se probaron especialmente cambiantes (Gelinas et al. (1992) Bone Marrow Transplant 9:157; Chang et al. (1992) PNAS USA 89:3107; Plavec et al. (1993) Blood 81:1384; Leboulch et al. (1994) EMBO J 13:3065; Sadelain et al. (1995) PNAS USA 92:6728; Raftopoulos et al. (1997) Blood 90:3414; Kalberer et al. (2000) PNAS USA 97:5411). Para permitir la transferencia de LCR mayores y secuencias génicas de globina, una propuesta fue el uso de elementos de escisión de ARN y control de exportación que incluyen componentes del elemento que responde a Rev/R (RRE) del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) (Alkan et al. (31 de mayo de 2000) presentado en papel en el 3º American Society of Gene Therapy, Denver, CO), y un vector lentiviral basado en VIH que porta RRE que había dado por resultado una mejora sustancial de la �-talasemia en ratones transplantados (May et al. (2000) Nature 406:82). Este acercamiento no fue suficiente para la completa corrección, sin embargo, ya que la expresión génica permaneció heterocelular, y la cantidad de �Aglobina humana encontrada incorporada en los tetrámeros de Hb en un origen no talasémico era improbable que fuera una terapia de éxito para la SCD (May et al., supra). Por consiguiente, permanece una necesidad de un acercamiento de terapia génica que pueda tratar con éxito la SCD y otras hemoglobinopatías.
Iwakuma et al., Virology, 261, 1999, 120-132, describe vectores del vector lentiviral de auto-inactivación (SIN) que tienen una deleción de la región LTR U3 3’ (excepto para el sitio de unión de integración (attL), y sustitución de la región LTR U5 3’ con una secuencia poliA de bGH.
El documento WO02087341 describe vectores lentivirales SIN con modificaciones en las LTR 5’ y 3’, en particular en donde las regiones R se sustituyen por las del retrovirus no lentiviral (región R “híbrida”). El TAR lentiviral se elimina. La región LTR U3 3’ puede retener una secuencia att, y la región P puede comprender una secuencia poliA, junto con la región R “híbrida”. Resumen de la invención
La presente invención proporciona composiciones mejoradas para alcanzar la terapia génica en células hematopoyéticas y células precursoras hematopoyéticas, que incluyen eritrocitos, células troncales eritroides y células madre embrionarias no humanas. La invención proporciona además composiciones mejoradas para tratar trastornos relacionadas con las células hematopoyéticas.
La invención proporciona un vector de terapia génica mejorado optimizado para expresar altos niveles de una o más proteínas terapéuticas en las células eritroides o células precursoras eritroides. En una realización particular, el vector comprende un vector lentiviral optimizado que expresa una o más proteínas de anti-falciformación a niveles terapéuticos para tratar hemoglobinopatías. Los vectores lentivirales empleados en el sistema de reparto génico de la presente invención son altamente eficaces infectando e integrándose de una manera no tóxica en el genoma de las células eritroides, y manteniendo niveles terapéuticos de expresión génica específica de eritroides.
La invención proporciona un vector lentiviral de auto-inactivación (SIN) que comprende:
a) una LTR lentiviral izquierda (5’);
b) un elemento de exportación retroviral, opcionalmente un elemento de res
puesta inversa lentiviral (RRE);
c) un promotor, o parte activa del mismo que tiene actividad promotora, y una
región de control de locus (LCR), o parte activa de la misma que tiene acti
vidad LCR, unido de forma operable a un gen de interés; y
d) una LTR lentiviral derecha (3’) que comprende las siguientes modificacio
nes
1) la región U3 de la LTR derecha (3’) se modifica para incluir al menos un
elemento aislante y
2) la región U5 de la LTR derecha (3’) se modifica para sustituir toda o una
parte de la región con una secuencia poli(A) ideal.
El vector lentiviral de la invención puede comprender además un tracto de polipurina central/solapa de ADN (cPPT/FLAP), que incluye, por ejemplo, un cPPT/FLAP del VIH-1. En otra realización, el promotor de la LTR 5’ se sustituye con un promotor heterólogo, que incluye, por ejemplo, promotor citomegalovirus (CMV). En aún otra realización, el vector comprende un elemento aislante que comprende un aislante de un locus de �-globina, que incluye, por ejemplo, HS4 de pollo.
En otra realización de la invención, el vector incluye un módulo de ácido nucleico que comprende un gen suicida unido de forma operable a un promotor. En una realización particular, el gen suicida es HSV timidina quinasa (HSV-Tk). El vector puede incluir además un módulo de ácido nucleico que comprende un gen para la selección in vivo de la célula, tal como un gen para la selección in vivo, por ejemplo, un gen de metilguanina metiltransferasa (MGMT).
Los vectores lentivirales de la invención comprenden además un gen de interés, que incluye, por ejemplo, un gen de globina o un gen que codifica una proteína de anti-falciformación. En una realización, el gen de globina expresado en el vector retroviral de la invención es �-globina, �-globina o �-globina. En otra realización, el gen de �-globina humana es el gen de �-globina humana natural o gen de �A-globina humana. En otra realización, el gen de �-globina humana comprende una o más deleciones de secuencias del intrón o es un gen de �-globina humana mutado que codifica al menos un residuo de aminoácido anti-falciformación. Los aminoácidos anti-falciformación pueden derivarse a partir de la �-globina humana o la �-globina humana. En otra realización, el gen de �-globina humana mutado codifica una mutación de treonina a glu-
A-T87Q).
tamina en el codón 87 (�
Los vectores lentivirales de la invención pueden usarse en terapia génica, incluyendo para el tratamiento de hemoglobinopatías. La invención incluye además células huésped que comprenden, por ejemplo, las transfectadas con los vectores de la invención. En una realización, la célula huésped es una célula madre embrionaria no humana, una célula madre somática o una célula troncal.
También se describen en este documento métodos para usar los vectores optimizados anteriores para alcanzar altos niveles estables de expresión génica en células eritroides, por ejemplo, para tratar enfermedades específicas de eritroides. En una realización particular, los vectores de terapia génica son para usar en el tratamiento de hemoglobinopatías, que incluyen, por ejemplo, anemia falciforme (SCD). En otra realización, los vectores de terapia génica son para usar en el tratamiento de talasemias, que incluyen, aunque no están limitadas a, �-talasemia. Por lo tanto, la invención proporciona además:
-un método para alcanzar la expresión específica de eritroides de un gen de interés, que comprende introducir in vitro un vector de auto-inactivación como se define en este documento en una célula de eritrocito o un precursor de la misma, capaz de expresar el vector, y contar con la expresión del gen de interés;
-un vector lentiviral de auto-inactivación como se define en este documento para usar en el tratamiento de un proceso hemoglobinopático; y
-el uso de un vector lentiviral de auto-inactivación como se define en este documento en la fabricación de un medicamento para tratar un proceso hemoglobinopático. Breve Descripción de las Figuras
La Figura 1a muestra gráficamente que �A-T87Q y HbF son potentes inhibidores de la polimerización de HbS in vitro en contraste con HbA. La Figura 1b muestra un análisis de transferencia de Southern para la estabilidad proviral. Vía 1, control negativo NIH 3T3, vías 2-4, ADN de médula ósea, bazo y timo, respectivamente, procedente de un receptor C57B1/6 representativo de médula ósea transducida de A-T87Qglobina sacrificado 5 meses después del transplante; vías 5 y 6, ADN de colonias de 12 bazos de 2 días generadas usando médula ósea del receptor C57B1/6 primario sacrificado 5 meses después del transplante. La banda proviral de 7,5 Kb esperada y una banda endógena (EB) de 3,2 Kb se marcan en el margen izquierdo. Abajo: número de copias provirales promedio en ADN genómico aislado de la sangre de ratones C57B1/6 transducida de A-T87Q-globina 3 meses después del transplante (bar = SE). La cuantificación se llevó a cabo por densimetría y comparación de células NIH3T3 conocidas por contener una copia del provirus. La Figura 1c representa gráficamente el provirus de �A-T87Q-globina. La LTR de VIH, repetición terminal larga del virus tipo 1 de la inmunodeficiencia humana; �+, señal de empaquetamiento; cPPT/flap, tracto de polipurina central/solapa de ADN; RRE, elemento que responde a Rev; �P, promotor de �-globina (del sitio SnaB I a Cap); ppt, tracto de polipurina. Se indican el potenciador de �-globina 3’ (hasta el sitio Avr II corriente abajo), la deleción IVS2 de 372 bp, la mutación �A-T87Q (ACA Thr a CAG Gln) y los sitios hipersensibles DNasa I (HS)2 (Sma I a Xba I), HS3 (Sac I a Pvu II) y HS4 (Stu I a Spe I) de la LCR de �-globina.
La Figura 2 representa gráficamente resultados de un análisis de la expresión génica de �A-T87Q-globina humana en ratones receptores C57BL/6 5 meses después del transplante. La Figura 2a muestra los RBCs circulantes de los ratones receptores que se fijaron permeabilizados, se tintaron con un anticuerpo marcado con FITC que reconoce de forma específica la �-globina humana (Perkin-Elmer Wallac, Norton Ohio), y posteriormente se analizaron por FACS. Arriba: ratón representativo transplantado con células de médula ósea transducidas de modo simulado. Abajo: ratón
A-T87Q
representativo transplantado con médula ósea transducida con el lentivirus de �globina. La Figura 2b muestra los resultados del análisis de extensión del cebador del ARN de sangre periférica. Vías 1, 3, 5, 7 y 9: amplificación con cebadores específicos para ARNm endógeno de �-globina sencilla murina que genera un fragmento de ADN de 53 pares de bases (bp). Vías 2, 4, 6, 8 y 10: amplificación con cebadores específicos para el ARNm de �A-T87Q-globina humana que genera un fragmento de ADN de 90 bp. Vías 1 y 2: ratón transducido de forma simulada. Vías 3 y 4: ratón de control transgénico que expresa el 86% de ARNm de �-globina humana. Vías 5 a 10: tres receptores C57BL/6 de células de médula ósea transducida de �A-T87Q-globina (vías 5 y 6, ratón nº1; 7 y 8 ratón nº2; 9 y 10 ratón nº3). La Figura 2c representa gráficamente perfiles de HPLC de cadenas de globina extraídas de RBCs de un ratón transducido
A-T87Q
de forma simulada (arriba) y un receptor de médula ósea transducida de �forma simulada (arriba) y un receptor de médula ósea transducida de �A-T87Q-globina humana (abajo).
La Figura 3 representa gráficamente perfiles HPLC de Hb extraído de RBCs de ratones receptores de células de médula ósea SAD transducidas de forma simulada (Figura 3a), BERK transducidas de forma simulada (Figura 3b), SAD transducidas de �A-T87Q-globina (Figura 3c) y BERK transducidas de �A-T87Q-globina (Figura 3d).
La Figura 4 muestra el isoelectroenfoque de lisatos de RBC de ratones receptores 3 meses después del transplante que muestra las especies esperadas de Hb. Vías 1 y 2, sangre que deriva de médula transplantada SAD; vías 3 y 4, sangre que deriva de médula transplantada BERK; vías 1 y 3, transducción de forma simulada; vías 2 y 4, transducción con lentivirus de �A-T87Q-globina. �M, �-globina de ratón; �H, �-globina
SIN SAD S
humana; �, �-globina sencilla de ratón; �, �-globina SAD humana; �, �-globina
A-T87Q
falciforme humana; �, �A-T87Q-globina humana.
La Figura 5 muestra la corrección de la patología SCD. La Figura 5a muestra la microscopia óptica Nomarski de RBCs de ratones transplantados con o bien células de
A-T87Q
médula ósea de modo simulado (arriba) o BERK transducidas por lentivirus de �globina (abajo) bajo pO2 del 5% 3 meses después del transplante. La Figura 5b muestra la cuantificación del porcentaje de RBCs falciformes de receptores de médula ósea transducida de modo simulado y BERK o SAD transducida de �A-T87Q-globina en condiciones de 5% o 13% de oxigeno, respectivamente. Las barras de error indican SE; *, P =0,01; †, P =0,03. La Figura 5c muestra la relación entre el logaritmo del tiempo de demora recíproco (dt) de polimerización HbS y la concentración de Hb de los lisatos de RBC. Los cursos temporales de la polimerización de Hb en lisatos se llevaron a cabo a diversas concentraciones mediante el método de salto de temperatura. �, lisato de paciente SS homocigoto; �, lisato de un paciente de rasgo celular falciforme AS asintomático; �, lisato de un receptor ratón de médula SAD transducida de modo simulado; �, lisato de un receptor ratón de médula SAD transducida de �A-T87Q-globina; �, lisato de un receptor ratón de médula BERK transducida de modo simulado; �, lisato de un receptor ratón de médula BERK transducida de �A-T87Q-globina. La Figura 5d muestra gradientes de densidad continua Percoll-Larex de sangre de ratones receptores. Vía 1, gotas marcadoras de densidad; vías 2 y 6, controles C57BL/6; vías 3 y 7, controles SAD y BERK, respectivamente; vías 4 y 5, receptores C57BL/6 de médula ósea SAD transducida en modo simulado o transducida de �A-T87Q, respectivamente; vía 8, receptor C57BL/6 de médula ósea BERK transducida de �A-T87Q; vía 9, ratón BERK transgénico que expresa �-globina humana a ~100% de �S-globina. La Figura 5e muestra bazos de ratones (1) BERK y (2) C57BL/6 no transplantados o ratones C57BL/6 transplantados con médula ósea BERK o bien (3) transducida de �A-T87Q o (4) transducida en modo simulado.
La Figura 6 representa gráficamente un mapa de un vector que comprende una LTR derecha con un aislante doblete.
La Figura 7 representa gráficamente un mapa del vector SIN que comprende una deleción de 399 en la región LTR U3 derecha, que se ha sustituido por un aislante doblete, y una sustitución en la región U5 con una secuencia poli(A) ideal. El vector contiene además un gen de fusión GFP.
La Figura 8 representa gráficamente un mapa del vector SIN que comprende una deleción de 399 en la región LTR U3 derecha, que se ha sustituido por un aislante doblete, y una sustitución en la región U5 con una secuencia poli(A) ideal. Este vector contiene además BGT 9 (�-globina) con una deleción en el intrón 2.
La Figura 9 representa gráficamente un mapa de un vector que comprende una LTR derecha con un aislante de 42 bp.
La Figura 10 representa gráficamente un mapa del vector SIN que comprende una deleción de 399 en la región LTR U3 derecha, que se ha sustituido por un aislante de 42 bp, y una sustitución en la región U5 con una secuencia poli(A) ideal. El vector contiene además un gen de fusión GFP.
La Figura 11 representa gráficamente un mapa del vector SIN que comprende una deleción de 399 en la región LTR U3 derecha, que se ha sustituido por un aislante de 42 bp, y una sustitución en la región U5 con una secuencia poli(A) ideal. Este vector contiene además BGT 9 (�-globina) con una deleción en el intrón 2.
La Figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos de oligo OHPV nº 460/461, que incluye las posiciones de los sitios de restricción Cla I, Xba I y Pvu II, y el aislante de 42 bp.
La Figura 13 representa gráficamente el vector SIN y el análisis de títulos para el vector SIN. La Figura 13a representa gráficamente la organización del vector SIN, que incluye las modificaciones a la LTR. La Figura 13b muestra un esquema detallado de la modificación, en donde la región U3 de la LTR se sustituye con un aislante cHS4 y la región U5 se sustituye con una secuencia poliA ideal. La Figura 13c muestra una transferencia se Southern que examina el título para el vector SIN aislante que contiene �-globina.
La Figura 14 muestra un diagrama de un vector lentiviral que contiene el gen de �-globina humana y los resultados que demuestran el éxito de la expresión del gen de �-globina humana en ratones. La Figura 14A representa gráficamente el vector lentiviral de �-globina humana (�A). La Figura 14B muestra la proporción de RBCs de sangre periférica que expresa �-globina humana, como se evalúa mediante FACS después de tintar las células con un anticuerpo específico para la �-globina humana. La Figura 14C muestra la expresión de la �-globina humana en glóbulos rojos (RBCs) de ratones reconstituidos. La parte superior izquierda de la Figura 14C muestra el análisis FACS de RBCs a partir de receptores representativos de células de médula ósea THAL transducidas del lentivirus GFP, donde los RBC de un ratón no manipulado se usaron como un control negativo. La parte superior derecha y la inferior izquierda de la Figura 14C muestra los resultados del análisis FACS de RBCs a partir de receptores representativos de células de médula ósea THAL transducidas por el lentivirus de �globina a los 2 y 7 meses después del transplante. La parte inferior derecha de la Figura 14C muestra los resultados del análisis FACS de RBCs a partir de uno de los receptores secundarios transplantados con células de médula ósea a partir de un donante primario a los 6 meses después del transplante.
La Figura 15 muestra la mejora de parámetros hematológicos en ratones THAL que recibieron células de médula ósea THAL transducidas por lenti-�-globina. Los resultados mostrados son la media ± DE para ratones THAL control, no transplantados (n = 5), ratones B6 no manipulados normales (n = 5) y ratones THAL transplantados 6 meses antes con células transducidas por lenti-�-globina (n = 8) o células transducidas con lenti-GFP control (n = 6). Los cambios en todos los parámetros hematológicos vistos en los receptores THAL de células transducidas con lenti-�-globina fueron altamente significativos en comparación con los ratones THAL no transplantados o transplantados con (GFP) control (*, P < 0,001). Los valores para el número de RBC y conteo de reticulocitos en estos ratones corregidos alcanzaron niveles dentro del intervalo normal de los ratones B6 de control (P = 0,6 y 0,1, respectivamente). Descripción Detallada de la Invención
La presente invención proporciona composiciones mejoradas para la terapia génica, particularmente en el tratamiento de hemoglobinopatías. Los vectores lentivirales mejorados pueden usarse para repartir productos génicos terapéuticos a células madre embrionarias no humanas, células madres somáticas o células madre hematopoyéticas, que incluyen, aunque no están limitadas a, células troncales eritroides. Los vectores lentivirales mejorados pueden usarse para repartir genes terapéuticos a eritrocitos, proporcionando así una expresión sostenida de alto nivel de proteínas terapéuticas específicamente en células eritroides. La expresión puede ser permanente (por ejemplo, paneritroide).
1. Definiciones Como se usa en este documento, los siguientes términos y frases usadas para describir la invención tendrán los significados proporcionados posteriormente.
El término “retrovirus” se refiere a cualquier retrovirus conocido (por ejemplo, retrovirus tipo c, tal como el virus del sarcoma murino de Moloney (MoMSV), el virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus de tumor mamario murino (MuMTV), virus de la leucemia del gibón (GaLV), virus de la leucemia felina (FLV), espumavirus, Amigo, virus de la célula madre murina (MSCV) y virus del sarcoma de Rous (RSV)). “Retrovirus” incluye además virus de la leucemia de células T humanas, HTLV-1 y HTLV-2, y la familia lentiviral de retrovirus, tal como Virus de Inmunodeficiencia Humana, VIH-1, VIH-2, virus de inmunodeficiencia simia (VIS), virus de inmunodeficiencia felina (VIF), virus de inmunodeficiencia equina (VIE) y otras clases de retrovirus.
Los retrovirus son virus de ARN que utilizan la transcriptasa inversa durante su ciclo de replicación. El ARN genómico retroviral se convierte en ADN de doble hélice mediante transcriptasa inversa. Esta forma de ADN de doble hélice del virus es capaz de integrarse en el cromosoma de la célula infectada; una vez que está integrado, se denomina como un “provirus”. El provirus sirve como un molde para la ARN polimerasa II y dirige la expresión de moléculas de ARN que codifican las proteínas estructurales y enzimas necesarias para producir nuevas partículas virales.
En cada extremo de los provirus hay estructuras denominadas “repeticiones terminales largas” o “LTRs”. El término “repetición terminal larga (LTR)” se refiere a dominios de pares de bases localizadas en los extremos de los ADN retrovirales que, en su contexto natural de secuencia, son repeticiones directas y contienen regiones U3, R y U5. Las LTR generalmente proporcionan funciones fundamentales a la expresión de los genes retrovirales (por ejemplo, promoción, iniciación y poliadenilación de transcritos génicos) y a la replicación viral. La LTR contiene numerosas señales reguladoras que incluyen elementos de control transcripcional, señales de poliadenilación y secuencias necesarias para la replicación e integración del genoma viral. La LTR viral se divide en tres regiones denominadas U3, R y U5. La región U3 contiene los elementos potenciador y promotor. La región U5 es la secuencia entre el sitio de enlace del cebador y la región R y contiene la secuencia de poliadenilación. La región R (repetición) está flanqueada por las regiones U3 y U5. La LTR compuesta de regiones U3, R y U5, aparece en ambos extremos 5’ y 3’ del genoma viral. En una realización de la invención, el promotor dentro de la LTR, que incluye la LTR 5’, se sustituye con un promotor heterólogo. Ejemplos de promotores heterólogos que pueden usarse incluyen, por ejemplo, el promotor citomegalovirus (CMV).
El término “lentivirus” se refiere a un grupo (o género) de retrovirus que ocasiona una enfermedad de desarrollo lento. Los virus incluidos en este grupo incluyen VIH (virus de inmunodeficiencia humana; que incluye VIH tipo 1 y VIH tipo 2), el agente etiológico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida humana (SIDA); visna-maedi, que provoca encefalitis (visna) o neumonía (maedi) en las ovejas, el virus de artritis-encefalitis caprina, que provoca inmunodeficiencia, artritis y encefalopatía en cabras; virus de la anemia infecciosa equina, que provoca anemia hemolítica autoinmune y encefalopatía en caballos; virus de inmunodeficiencia felina (VIF), que provoca inmunodeficiencia en gatos; virus de inmunodeficiencia bovina (VIB), que provoca linfadenopatía, linfocitosis y posible infección del sistema central nervioso en el ganado; y virus de inmunodeficiencia simia (VIS), que provoca inmunodeficiencia y encefalopatía en primates sub-humanos. Las enfermedades provocadas por estos virus se caracterizan por un largo periodo de incubación y de curso prolongado. Normalmente, los virus infectan de forma latente a monocitos y macrófagos, desde los que se extienden a otras células. VIH, VIF y VIS infectan además fácilmente linfocitos T (es decir, células T).
El término “híbrido” se refiere a un vector, LTR u otra ácido nucleico que contiene tanto secuencias lentivirales como secuencias retrovirales no lentivirales.
El término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. El término “vector de expresión” incluye cualquier vector (por ejemplo, un plásmido, cósmico o cromosoma del fago) que contiene una construcción génica en una forma adecuada para la expresión por una célula (por ejemplo, unida a un promotor). En la presente memoria, “plásmido” y “vector” se usan de forma intercambiable, ya que un plásmido es una forma usada normalmente de un vector. Además, la invención pretende incluir otros vectores que sirven para funciones equivalentes.
El término “vector retroviral” se refiere a un vector que contiene elementos genéticos estructurales y funcionales que se derivan principalmente de un retrovirus.
El término “vector lentiviral” se refiere a un vector que contiene elementos genéticos estructurales y funcionales fuera de las LTRs que se derivan principalmente de un lentivirus.
El término “vector de auto-inactivación” se refiere a vectores en que la región potenciador-promotor de la LTR (3’) derecha, conocida como la región U3, se ha modificado (por ejemplo, por deleción o sustitución) para evitar la transcripción viral más allá de la primera vuelta de la replicación viral. Por consiguiente, los vectores son capaces de infectar y después integrarse en el genoma huésped solo una vez, y no pueden pasarse más. Esto es porque la región LTR U3 derecha (3’) se usa como un molde para la región LTR U3 izquierda (5’) durante la replicación viral y así, el transcrito viral no puede hacerse sin el potenciador-promotor U3. Si el transcrito viral no se hace, no puede procesarse o empaquetarse en viriones, por lo que el ciclo vital del virus finaliza. Por consiguiente, los vectores SIN reducen enormemente el riesgo de creación de virus capacitados para la replicación no deseados ya que la región LTR U3 derecha (3’) se ha modificado para evitar la transcripción viral más allá de la primera vuelta de replicación, eliminando por tanto la capacidad de pasar del virus.
El término “TAR” se refiere al elemento genético “de respuesta a la transactivación” localizada en la región R de las LTRs lentivirales (por ejemplo, VIH). Este elemento interactúa con el elemento genético trans-activador lentiviral (tat) para mejorar la replicación viral.
El término “región R” se refiere a la región dentro de las LTRs retrovirales que comienza al principio del grupo de terminación (es decir, el principio de la transcripción) y termina inmediatamente antes del principio del tracto poliA. La región R se define además como que está flanqueada por las regiones U3 y U5. La región R juega un importante papel durante la transcripción inversa permitiendo la transferencia de ADN naciente a partir de un extremo del genoma al otro.
El término “transfección” se refiere a la introducción de ADN extraño en células eucariotas. La transfección puede llevarse a cabo mediante una variedad de medios conocidos en la técnica que incluyen aunque no están limitados a co-precipitación fosfato de calcio-ADN, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por polibreno, electroporación, microinyección, fusión de liposoma, lipofección, fusión de protoplastos, infección retroviral y biolísticas.
El término “transducción” se refiere al reparto de un(os) gen(es) usando un vector viral o retroviral por medios de infección viral mejor que por transfección. En realizaciones preferidas, los vectores retrovirales se transducen mediante empaquetamiento de los vectores en viriones antes de contactar con una célula. Por ejemplo, un gen anti-VIH portado por un vector retroviral puede transducirse en una célula a través de infección e integración de provirus.
El término “promotor/potenciador” se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proporcionar las funciones tanto de promotor como de potenciador. Por ejemplo, las repeticiones terminales largas de retrovirus contienen las funciones tanto de promotor como de potenciador. El potenciador/promotor puede ser “endógeno” o “exógeno” o “heterólogo”. Un potenciador/promotor “endógeno” es uno que está unido de forma natural con un gen dado en el genoma. Un potenciador/promotor “exógeno” o “heterólogo” es uno que está situado en yuxtaposición a un gen por medio de manipulación genética (es decir, técnicas biológicas moleculares) de manera que la transcripción de ese gen está dirigido por el potenciador/promotor unido.
La expresión eficaz de secuencias de ADN recombinante en células eucariotas necesita la expresión de señales que dirigen la terminación eficaz y la poliadenilación del transcrito resultante. Las señales de terminación de la transcripción se encuentran generalmente corriente abajo de la señal de poliadenilación. El término “sitio poliA” o “secuencia poliA” como se usa en este documento denota una secuencia de ADN que dirige tanto la terminación como la poliadenilación del transcrito de ARN naciente. La poliadenilación eficaz del transcrito recombinante es deseable ya que los transcritos que carecen de una cola de poliA son inestables y se degradan rápidamente. La señal poliA utilizada en un vector de expresión puede ser “heteróloga” o “endógena”. Una señal poliA endógena es una que se encuentra de forma natural en el extremo 3’ de la región de codificación de un gen dado en el genoma. Una señal poliA heteróloga es una que está aislada de un gen y situada en 3’ de otro gen.
El término “elemento de exportación” se refiere a un elemento regulador posttranscripcional que actúa en cis, que regula el transporte de un transcrito de ARN del núcleo al citoplasma de una célula. Ejemplos de elementos de exportación de ARN incluyen, aunque no están limitados a, elemento de respuesta rev (RRE) del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) (véase por ejemplo, Cullen et al. (1991) J. Virol. 65:1053; y Cullen et al. (1991) Cell 58:423), y el elemento regulador posttranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis B (véase por ejemplo, Huang et al. (1995) Molec. and Cell. Biol. 15(7):3864; Huang et al. (1994) J. Virol. 68(5):3193; Huang et al. (1993) Molec. and Cell. Biol. 13(12):7476) y Patente de EE.UU. núm. 5.744.326). Generalmente, el elemento de exportación de ARN está situado dentro de la UTR 3’ de un gen, y puede insertarse como una o múltiples copias. Los elementos de exportación de ARN pueden insertarse en cualquiera o todos los vectores separados que generan las líneas celulares de empaquetamiento de la presente invención.
La frase “línea celular de empaquetamiento retroviral” se refiere a una línea celular (típicamente una línea celular de mamífero) que contiene las secuencias de codificación necesarias para producir partículas virales que carecen de la capacidad de empaquetar ARN y producen virus auxiliares capacitados para la replicación. Cuando la función de empaquetamiento se proporciona dentro de la línea celular (por ejemplo, en trans por medio de un vector plásmido), la línea celular de empaquetamiento produce retrovirus recombinante, haciéndose así una “línea celular productora retroviral”.
El término “módulo de ácido nucleico” como se usa en este documento se refiere a secuencias genéticas en el vector que pueden expresar un ARN, y posteriormente una proteína. El módulo de ácido nucleico contiene el gen de interés. El módulo de ácido nucleico está orientado posicional y secuencialmente en el vector de manera que el ácido nucleico en el módulo puede transcribirse en ARN, y cuando sea necesario, traducirse en una proteína o un polipéptido, bajo modificaciones posttraduccionales apropiadas necesarias para la actividad en la célula transformada, y puede translocarse al compartimiento apropiado para la actividad biológica marcando los compartimientos intracelulares apropiados o secreción en compartimientos extracelulares. Preferiblemente, el módulo tiene sus extremos 3’ y 5’ adaptados para la rápida inserción en un vector, por ejemplo, tiene sitios de endonucleasa de restricción en cada extremo. En una realización preferida de la invención, el módulo de ácido nucleico contiene la secuencia de un gen terapéutico usado para tratar un proceso hemoglobinopático. El módulo puede eliminarse e insertarse en un vector o plásmido como una unidad sencilla.
Como se usa en este documento, el término “gen de interés” se refiere al gen insertado en el polienlace de un vector de expresión. En una realización, el gen de interés codifica un gen que proporciona una función terapéutica para el tratamiento de una hemoglobinopatía.
El término “promotor” como se usa en este documento se refiere a un sitio de reconocimiento de una hebra de ADN a la que se enlaza la ARN polimerasa. El promotor forma un complejo de iniciación con ARN polimerasa para iniciar y conducir la actividad transcripcional. El complejo puede modificarse activando secuencias denominadas “potenciadores” o secuencias inhibidoras denominadas “silenciadores”.
Como se usa en este documento, el término “cis” se usa en referencia a la presencia de genes en el mismo cromosoma. El término “que actúa en cis” se usa en referencia al efecto de control de un gen regulador en un gen presente en el mismo cromosoma. Por ejemplo, los promotores, que afectan a la síntesis de ARNm corriente abajo son elementos de control que actúan en cis.
El término “gen suicida” se usa en este documento para definir cualquier gen que expresa un producto que es fatal para la célula que expresa el gen suicida. En una realización, el gen suicida actúa en cis en relación al gen de interés en el vector de la invención. Ejemplos de genes suicidas se conocen en la técnica, incluyendo HSV timidina quinasa (HSV-Tk).
El término “unido de forma operable” se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que los permite funcionar en su manera prevista. En una realización, el término se refiere a una unión funcional entre una secuencia de control de la expresión del ácido nucleico (tal como un promotor, o selección de sitios de enlace del factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de la expresión dirige la transcripción del ácido nucleico que corresponde a la segunda secuencia.
El término “transformación”, “transfección” y “transducción” se refiere a la introducción de un ácido nucleico, por ejemplo, un vector viral, en una célula receptora.
El término “seudotipo” o “seudotipado” como se usa en este documento, se refiere a un virus cuyas proteínas de envoltura viral se han sustituido con las de otro virus que posee características preferibles. Por ejemplo, VIH puede seudotiparse con proteínas de envoltura de la proteína G del virus de estomatitis vesicular (VSV-G), que permite al VIH infectar un intervalo más amplio de células porque las proteínas de envoltura del VIH (codificadas por el gen env) dirigen normalmente al virus a células que presentan CD4+. En una realización preferida de la invención, las proteínas de envoltura lentiviral están seudotipadas con VSV-G.
Como se usa en este documento, el término “empaquetamiento” se refiere al proceso de secuestrar (o empaquetar) un genoma viral en una cápside de proteínas, donde se forma una partícula de virión. Este proceso se conoce también como encapsidación. Como se usa en este documento, el término “señal de empaquetamiento” o “secuencia de empaquetamiento” se refiere a secuencias situadas en el genoma retroviral que se necesitan para la inserción del ARN viral en la cápside o partícula viral. Varios vectores retrovirales usan la señal de empaquetamiento mínima (denominada también como la secuencia psi [�]) necesaria para la encapsidación del genoma viral. Así, como se usa en este documento, los términos “secuencia de empaquetamiento”, “señal de empaquetamiento”, “psi” y el símbolo “�”, se usan en referencia a la secuencia no codificante necesaria para la encapsidación de las hebras de ARN retroviral durante la formación de la partícula viral.
Como se usa en este documento, el término “líneas celulares de empaqueta-miento” se usa en referencia a líneas celulares que no contienen una señal de empaquetamiento, aunque expresan de forma estable o transitoria proteínas estructurales virales y enzimas de replicación (por ejemplo, gag, pol y env) que son necesarias para el correcto empaquetamiento de partículas virales.
Como se usa en este documento, el término “incapaz de replicarse” se refiere a un virus que no es capaz de replicación eficaz, completa, ya que los viriones infecciosos no se producen (por ejemplo, descendencia lentiviral incapaz de replicarse). El término “capaz de replicarse” se refiere al virus natural o virus mutante que es capaz de replicación, ya que la replicación viral del virus es capaz de producir viriones infecciosos (por ejemplo, descendencia lentiviral capaz de replicarse).
Como se usa en este documento, el término “incorporar” se refiere a absorción
o transferencia de un vector (por ejemplo, ADN o ARN) en una célula de manera que el vector pueda expresar un producto génico terapéutico en la célula. La incorporación puede implicar, aunque no necesita, la integración del vector de expresión de ADN o replicación episomal del vector de expresión de ADN.
Como se usa en este documento, el término “expresión específica eritroide” o “expresión específica del glóbulo rojo” se refiere a la expresión génica que solo se da en eritrocitos o glóbulos rojos (RBCs), usada de forma intercambiable en este documento.
El término “reparto génico” o “transferencia génica” se refiere a métodos o sistemas para insertar de forma creíble ADN extraño en células diana, tal como en células musculares. Dichos métodos pueden dar por resultado la expresión transitoria o a largo plazo de genes. La transferencia génica proporciona un único acercamiento para el tratamiento de enfermedades adquiridas o heredadas. Un número de sistemas se han desarrollado para la transferencia génica en células de mamíferos. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. núm. 5.399.346. El vector lentiviral de la invención se optimiza para expresar proteínas de anti-falciformación a niveles terapéuticos en virtualmente todos los RBCs circulantes.
El término “célula madre” se refiere a la célula de la que se deriva una célula troncal. Las células madre se definen por su capacidad para auto-renovarse. Las células madre incluyen, por ejemplo, células madre embrionarias y células madre somáticas. Las células madre hematopoyéticas pueden general células hija de cualquiera de las estirpes hematopoyéticas. Las células madre con capacidad reconstituyente hematopoyética a largo plazo pueden distinguirse por un número de propiedades físicas y biológicas de las células diferenciadas y las células troncales (véase, por ejemplo, Hodgson, G.S. & Bradley, T.R., Nature, Vol. 281, págs. 381-382; Visser et al., J. Exp. Med., Vol. 59, págs. 1576-1590, 1984; Spangrude et al., Science, Vol. 241, págs. 5862, 1988; Szilvassy et al., Blood, Vol. 74, págs. 930-939, 1989; Ploemacher, R.E. & Brons, R.H.C., Exp. Hematol., Vol. 17, págs. 263-266, 1989).
El término “célula madre embrionaria” se usa en este documento para indicar una célula pluripotente, no diferenciada, derivada de un embrión no humano en etapa de blástula.
El término “célula madre somática” se usa en este documento para indicar células en el cuerpo que tienen la única capacidad de regenerarse a sí mismas y diferenciarse en muchos tipos diferentes de células. Ejemplos de células madre somáticas incluyen células madre sanguíneas, células madre musculares/óseas, células madre cerebrales y células madre hepáticas.
Como se usa en este documento, el término “progenitor” o “células troncales” se refiere a células que son los precursores de células de diferenciación. Muchas células troncales se diferencian a lo largo de una única estirpe, aunque pueden tener una capacidad proliferativa muy extensa. Ejemplos de células troncales incluyen, aunque no están limitados a, células madre pluripotentes, células madre totipotentes no humanas, células madre mieloides y células madre linfoides.
El término “globina” se usa en este documento para indicar todas las proteínas
o subunidades de proteínas que son capaces de enlazar de forma covalente o no covalente un resto hemo, y pueden, por lo tanto, transportar o almacenar oxígeno. Las subunidades de hemoglobinas de vertebrados e invertebrados, las mioglobinas de vertebrados e invertebrados o mutantes de los mismos, se incluyen mediante el término globina. Ejemplos de globinas incluyen �-globina o una variante de la misma, �globina o una variante de la misma, una �-globina o una variante de la misma y �globina.
Como se usa en este documento, “hematopoyesis” se refiere a la formación y desarrollo de células sanguíneas a partir de células troncales además de la formación de células troncales a partir de células mare. Las células sanguíneas incluyen aunque no están limitadas a eritrocitos o glóbulos rojos (RBCs), reticulocitos, monocitos, neutrófilos, megacariotas, eosinófilos, basófilos, células B, macrófagos, granulocitos, mastocitos, trombocitos y leucocitos.
Como se usa en este documento, el término “hemoglobinopatía” o “proceso hemoglobinopático” incluye cualquier trastorno que implique la presencia de una molécula anormal de hemoglobina en la sangre. Ejemplos de hemoglobinopatías incluyen, aunque no están limitadas a, enfermedad por la hemoglobina C, enfermedad falciforme de la hemoglobina (SCD), anemia falciforme y talasemias. Se incluyen además hemoglobinopatías en que una combinación de hemoglobinas anormales están presentes en la sangre (por ejemplo, células falciformes/enfermedad Hb-C).
El término “anemia falciforme” o “enfermedad de la célula falciforme” se define en este documento incluyendo cualquier trastorno anémico sintomático que resulta de la falciformación de los glóbulos rojos. Las manifestaciones de la enfermedad de la célula falciforme incluyen: anemia, dolor, y/o disfunción orgánica, tal como fallo renal, retinopatía, síndrome cardiaco agudo, isquemia, priapismo e ictus. Como se usa en este documento, el término “enfermedad de la célula falciforme” se refiere a una variedad de problemas clínicos que acompañan a la anemia falciforme, especialmente en aquellos sujetos que son homocigotos para la sustitución de células falciformes en HbS. Entre las manifestaciones constitutivas referidas en este documento para el uso del término de enfermedad de célula falciforme están retraso del crecimiento y desarrollo, una tendencia aumentada a desarrollar infecciones serias, particularmente debido a neumococos, marcado deterioro de la función del bazo, evitando la depuración eficaz de bacterias circulantes, con infartos recurrentes y eventual destrucción del tejido del bazo. También se incluyen en el término “enfermedad de células falciformes” episodios agudos de dolor musculoesquelético que afecta principalmente al área lumbar, abdomen, y diáfisis femoral, y que son similares en mecanismo y en gravedad a la enfermedad por descompresión. En adultos, dichos ataques se manifiestan normalmente como episodios ligeros o moderados de corta duración intercalados cada varias semanas o meses con ataques agónicos de 5 a 7 días de duración que llegan en un promedio de aproximadamente uno al año. Entre los sucesos conocidos para provocar dichas crisis están la acidosis, hipoxia y deshidratación, todas las cuales potencian la polimerización intracelular de HbS (J.H. Jandl, Blood: Textbook of Hematology, 2ªEd., Little, Brown and Company, Boston, 1996, págs. 544-545). Como se usa en este documento, el término “talasemia” abarca anemias hereditarias que se dan debido a mutaciones que afectan a la síntesis de hemoglobina. Así, el término incluye cualquier anemia sintomática que resulte de enfermedades talasémicas tal como �-talasemia o severa, talasemia principal, talasemia intermedia, �-talasemias tal como enfermedad de hemoglobina H.
Como se usa en este documento, “talasemia” se refiere a un trastorno hereditario caracterizado por la producción defectuosa de hemoglobina. Ejemplos de talasemias incluyen � y � talasemia. Las �-talasemias están provocadas por una mutación en la cadena beta de globina y pueden darse en una forma mayor o menor. En la forma mayor de �-talasemia, los niños son normales en el nacimiento, aunque desarrollan anemia durante el primer año de vida. La forma suave de �-talasemia produce glóbulos rojos pequeños. Las �-talasemias están provocadas por la deleción de un gen o genes de la cadena de globina.
Como se usa en este documento, “proteínas de anti-falciformación” incluyen proteínas que evitan o invierten los sucesos patológicos que llevan a la falciformación de eritrocitos en enfermedades de células falciformes. En una realización de la invención, el vector lentiviral de la invención se usa para repartir proteínas de antifalciformación a un sujeto con una enfermedad hemoglobinopática. Las proteínas de anti-falciformación incluyen además genes mutados de �-globina que comprenden residuos de aminoácidos de anti-falciformación.
Como se usa en este documento, el término “auto-inactivación” o “SIN”, usado de forma intercambiable en este documento, se refiere a un vector que se modifica, en donde la modificación reduce en gran medida la capacidad del vector de movilizarse una vez que se ha integrado en el genoma del receptor, aumentando así la seguridad del uso del vector como un vector de reparto genético.
Como se usa en este documento, el término “aislante” o “elemento aislante”, usado de forma intercambiable en este documento, se refiere a una secuencia de ADN exógeno que puede añadirse a un vector de la invención para evitar, sobre la integración del vector en un genoma huésped, que secuencias genómicas cercanas influyan en la expresión del(de los) trans-gen(es) integrado(s). De forma inversa, el elemento aislante evita que el vector integrado influya en la expresión de secuencias genómicas cercanas. Esto se consigue generalmente ya que el aislante se duplica en la integración del vector en el genoma, de manera que el aislante flanquea el vector integrado (por ejemplo, en la región LTR) y actúa para “aislar” la secuencia de ADN integrada. Aislantes adecuados para usar en la invención incluyen, aunque no están limitados a, el aislante �-globina del pollo (véase Chung et al. Cell (1993) 74:505; Chung et al.; PNAS (1997) 94:575; y Bell et al. Cell 1999 98:387). Ejemplos de elementos aislantes incluyen, aunque no están limitados a, un aislante procedente de un locus de �globina, tal como HS4 de pollo.
II. Vectores retrovirales y lentivirales
La presente invención proporciona composiciones mejoradas para tratar enfermedades hemoglobinopáticas usando vectores de reparto génico, basados en lentivirus, que alcanzan una expresión sostenida de alto nivel de genes terapéuticos transferidos en células eritroides o células troncales eritroides. El vector comprende un vector SIN de auto-inactivación. Se describen vectores lentivirales particulares de la invención por Pawliuk et al., (2001) Science 294:2368 e Imren et al. (2002) PNAS 99:14380.
Vectores lentivirales de la invención incluyen, aunque no están limitados a, virus de inmunodeficiencia humana (por ejemplo, VIH-1, VIH-2), virus de inmunodeficiencia felina (VIF), virus de inmunodeficiencia simia (VIS), virus de inmunodeficiencia bovina (VIB) y virus de anemia infecciosa equina (VAIE). Estos vectores pueden construirse y manipularse usando técnicas reconocidas en la técnica para aumentar su seguridad para el uso en terapia y para incluir elementos de expresión y genes terapéuticos adecuados, tal como los descritos posteriormente, que codifican proteínas terapéuticas para tratar enfermedades que incluyen, aunque no están limitadas a, hemoglobinopatías. En una realización de la invención, el vector lentiviral está basado en VIH-1.
En consideración de la toxicidad potencial de los lentivirus, los vectores pueden diseñarse por diferentes vías para aumentar su seguridad en aplicaciones de terapia génica. Por ejemplo, el vector puede hacerse más seguro separando los genes lentivirales necesarios (por ejemplo, gag y pol) en vectores separados como se describe, por ejemplo, en la Serie de Solicitudes de Patente de EE.UU. núm. 09/311.684. Así, el retrovirus recombinante puede construirse en la parte de la secuencia de codificación retroviral (gag, pol, env) en que se sustituye por un gen de interés que da el retrovirus incapaz de replicarse. El retrovirus incapaz de replicarse se empaqueta entonces en viriones mediante el uso de un virus de ayuda o una línea celular de empaquetamiento, mediante técnicas estándar. Los protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con dichos virus pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates (1989), Secciones 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio estándar.
Un pre-requisito principal para el uso de virus como vectores de reparto génico es asegurar la seguridad de su uso, particularmente con respecto a la posibilidad de la extensión de virus naturales en la población celular. Las líneas celulares de empaquetamiento en desarrollo, que producen solo retrovirus incapaces de replicarse, ha aumentado la utilidad de los retrovirus para la terapia génica, y los retrovirus defectuosos están bien caracterizados para el uso en la transferencia génica para propósitos de terapia génica (para una revisión, véase Miller, A.D. (1990) Blood 76:271). Por consiguiente, en una realización de la invención, las líneas celulares de empaquetamiento se usan para propagar vectores (vectores lentivirales) de la invención para aumentar el título del virus vector. El uso de líneas celulares de empaquetamiento se considera además una forma segura de propagar el virus, ya que el uso del sistema reduce la probabilidad de que se de la recombinación para generar virus naturales. Además, para reducir la toxicidad a las células que se provocaron por la expresión de proteínas de empaquetamiento, pueden usarse sistemas de empaquetamiento en que los plásmidos que codifican las funciones de empaquetamiento del virus se transfectan solo de forma transitoria, por ejemplo, mediante medios químicos.
En otra realización, el vector puede hacerse más seguro sustituyendo ciertas secuencias lentivirales con secuencias no lentivirales. Así, los vectores lentivirales de la presente invención pueden contener secuencias lentivirales génicas parciales (por ejemplo, partidas) y/o secuencias no lentivirales (por ejemplo, secuencias de otros retrovirus) mientras su función (por ejemplo, título viral, capacidad de infección, integración y capacidad para conferir altos niveles y duración de expresión génica terapéutica) no se reduzcan sustancialmente. Los elementos que pueden clonarse en el vector viral incluyen, aunque no están limitados a, promotor, señal de empaquetamiento, LTR(s), tractos de polipurina, RRE, etc.
En una realización, el vector lentiviral de la invención comprende una LTR retroviral (5’) izquierda; un elemento de exportación retroviral, opcionalmente un elemento de respuesta inversa lentiviral (RRE); un promotor o una parte activa de la misma, y una región de control de locus (LCR) o una parte activa de la misma, que se une de forma operable a un gen de interés; y una LTR retroviral (3’) derecha. Los vectores lentivirales de la invención pueden contener además un tracto de polipurina central (cPPT) o solapa de ADN. El cPPT/solapa de ADN se usa para aumentar los títulos virales y la eficacia de la transducción. En una realización particular, el cPPT/solapa de ADN es de VIH-1. En otra realización, el cPPT/solapa de ADN aumenta la eficacia de transfección en las HSCs.
En otra realización de la invención, la región LTR se modifica por sustitución del promotor LTR viral con un promotor heterólogo. En una realización, el promotor de la LTR 5’ se sustituye con un promotor heterólogo. Ejemplos de promotores heterólogos que pueden usarse incluyen, aunque no están limitados a, el promotor citomegalovirus (CMV) que es eficaz para la expresión de alto nivel.
Los vectores de la invención se han modificado para mejorar en la seguridad en el uso de los vectores como agentes de reparto génico en la terapia génica. La LTR 3’ del vector se modifica en las regiones U3 y U5, donde se crea un vector SIN. Dichas modificaciones contribuyen a un aumento en la seguridad del vector con propósitos de reparto génico. El vector SIN de la invención comprende una deleción en la LTR 3’ donde una parte de la región U3 se sustituye con un elemento aislante. El aislante evita que las secuencias potenciador/promotor en el vector influyan en la expresión de genes en el genoma cercano, y viceversa, para evitar que las secuencias genómicas cercanas influyan en la expresión de los genes en el vector. La LTR 3’ se modifica de manera que toda o una parte de la región U5 se sustituya con una secuencia poli(A) ideal.
Los vectores retrovirales de la invención pueden comprender además elementos que controlan la selección de la célula transducida. En una realización, el vector retroviral comprende un módulo de ácido nucleico que permite la selección in vivo de la célula transducida. Por ejemplo, el módulo de ácido nucleico podría contener los cADN para la metilguanina metiltransferasa (MGMT) o la glutatión-S-transferasa pi humana (GST pi) ambas de las que se han usado con éxito como marcadores de selección in vivo para células madre hematopoyéticas transducidas. Estos transgenes proporcionan quimioprotección a la combinación de O6-bencilguanina (BG) y 1,3-bis(2cloroetil)-1-nitrosourea (BCNU) o a células transducidas frente al tratamiento posttransplante con ciclofosfamida, respectivamente. En otra realización de la invención, el vector retroviral contiene un gen suicida unido de forma operable a un promotor. Ejemplos de genes suicidas incluyen, aunque no están limitados a, timidina quinasa (HSV-Tk) del virus del herpes simple (HSV).
La capacidad de infección de los retrovirus, que incluyen lentivirus, es dependiente de la interacción entre glicoproteínas presentadas en la superficie de la partícula viral y los receptores encontrados en la superficie de la célula diana. El VIH solo es capaz de infectar células T que presentan el receptor CD4+ en sus superficies celulares. Para maximizar la capacidad de infección de un sistema de reparto génico basado en VIH, el lentivirus puede seudotiparse para presentar una glicoproteína conocida para enlazar un intervalo más amplio que el tipo celular VIH. En una realización de la invención, el lentivirus recombinante está seudotipado con la proteína de recubrimiento G del virus de estomatitis vesicular (VSV-G). El seudotipado con VSV-G aumenta tanto el intervalo del huésped como la estabilidad física de las partículas virales, y permite su concentración a títulos muy altos por ultracentrifugado (Naldini et al. (1996), supra; Aiken (1997) J. Virol. 71:5871-5877; Akkina et al., supra; Reiser et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:15266-15271). En una realización preferida, el vector lentiviral de la invención se transduce en células madre hematopoyéticas (HSCs) después del seudotipado con VSV-G y concentración.
El promotor del vector lentiviral puede ser uno que está asociado de forma natural (es decir, como ocurre con una célula in vivo) o no natural con la región adyacente 5’ de un gen particular. Los promotores pueden derivarse de genomas eucariotas, genomas virales o secuencias sintéticas. Los promotores pueden seleccionarse para ser no específicos (activos en todos los tejidos), específicos de un tejido, regulados por procesos reguladores naturales, regulados por fármacos aplicados de forma exógena,
o regulados por estados fisiológicos específicos tal como los promotores que se activan durante una respuesta de fase aguda o los que se activan solo en células de replicación. Ejemplos no limitantes de promotores en la presente invención incluyen el promotor LTR retroviral, promotor temprano inmediato de citomegalovirus, promotor SV40, promotor de dihidrofolato reductasa, y citomegalovirus (CMV). El promotor puede seleccionarse también de aquellos que mostrados para expresarse de forma específica en los tipos de células seleccionadas que pueden encontrarse asociadas con enfermedades que incluyen, aunque no están limitadas a, hemoglobinopatías. En una realización de la invención, el promotor es específico de la célula de manera que la expresión génica está restringida a los glóbulos rojos. La expresión específica de los eritrocitos se alcanza usando la región del promotor de �-globina humana y la región de control del locus (LCR).
Los vectores lentivirales de la invención pueden también contener opcional-mente uno o más elementos que permiten la correcta expresión del módulo de ácido nucleico, es decir, gen terapéutico de interés. En una realización de la invención, el gen de interés es un gen que se usa para tratar o reducir los efectos perjudiciales de una enfermedad hemoglobinopática. Dichos genes incluyen aquellos que codifican proteínas de anti-falciformación que pueden usarse para tratar una hemoglobinopatía, en donde la proteína de anti-falciformación se usa para evitar o invertir los sucesos patológicos que llevan a la falciformación de los eritrocitos en enfermedades de células falciformes. Por ejemplo, un gen de globina, tal como gen de �-globina, �-globina o �globina, puede expresarse usando los vectores retrovirales de la invención para tratar hemoglobinopatías por medio de terapia génica. En una realización, la �-globina humana se usa para tratar a un sujeto que tiene una hemoglobinopatía, tal como enfermedad de células falciformes o talasemia.
Genes de �-globina adecuados para usar en la presente invención incluyen genes naturales y variantes. En una realización, el gen de �-globina es el gen de �Aglobina humana. Los genes de �-globina variantes incluyen aquellos genes que contienen adiciones/deleciones y versiones mutantes del gen que tienen características alteradas, que incluyen propiedades de anti-falciformación mejoradas. En una realización, el gen de �-globina comprende una o más deleciones de secuencias del intrón. En otra realización, la �-globina es un gen de �-globina humana mutante que codifica al menos un aminoácido de anti-falciformación. Los aminoácidos de anti-falciformación pueden identificarse usando programas de alineación estándar que alinean la �globina con �-globina y/o �-globina, derivando así los aminoácidos de antifalciformación de las secuencias de proteína de �-globina y/o �-globina. En otras realizaciones, el gen de �-globina humana es el gen de �A-globina humana que codifica
A-T87Q).
una mutación de treonina a glutamina en el codón 87 (�
Un experto en la técnica reconocerá que la selección del promotor para expresar el gen de interés dependerá del vector, el módulo de ácido nucleico, del tipo de célula a usarse como blanco y del efecto biológico deseado. Un experto en la técnica reconocerá además que en la selección de un promotor, los parámetros pueden incluir: alcanzar niveles suficientemente altos de expresión génica para alcanzar un efecto fisiológico; mantener un nivel crítico de expresión génica; alcanzar la regulación temporal de la expresión génica; alcanzar la expresión específica del tipo de célula; alcanzar la regulación farmacológica, endocrina, paracrina o autocrina de la expresión génica; y evitar niveles no apropiados o no deseados de expresión. Cualquier conjunto dado de requisitos de selección dependerá de las condiciones aunque puede determinarse fácilmente una vez que se determinen los requisitos específicos. En una realización de la invención, el promotor es específico de la célula de manera que la expresión génica está restringida a los glóbulos rojos. La expresión específica del eritrocito se alcanza usando la región del promotor de �-globina humana y la región de control del locus (LCR).
Las técnicas estándar para la construcción de vectores de expresión adecuados para usar en la presente invención son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden encontrarse en publicaciones tales como Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor, N.Y. Una variedad de estrategias están disponibles para ligar fragmentos de ADN, cuya elección depende de la naturaleza del extremo de los fragmentos de ADN y cuyas elecciones pueden hacerse fácilmente por el experto.
Los vectores de terapia génica de la presente invención, tal como los vectores lentivirales extraños, pueden usarse para expresar una variedad de proteínas terapéuticas en células eritroides transformadas. En una realización, el gen de interés a expresar en el vector es un gen que puede usarse para tratar una hemoglobinopatía, tal como el gen de �-globina humana o una variante del mismo. Se describen variantes de la �-globina humana en los ejemplos posteriores, e incluyen, por ejemplo, variantes de �-globina que incluyen una sustitución de treonina en la posición 87 con glutamina [�A87 Thr:Gln (�A-T87Q)]. El gen de interés puede obtenerse por inserción en el vector viral mediante una variedad de técnicas conocidas por un experto en la técnica.
Vectores particulares de la terapia génica de la invención incluyen, aunque no están limitados a, los vectores lentivirales mostrados en la Figura 1c, Figura 13 y Figura 14. Este vector lentiviral recombinante basado en VIH contiene, en una dirección 5’ a 3’, la LTR VIH adyacente 5’, una señal de empaquetamiento o �+, un tracto de polipurina central o solapa de ADN de VIH-1 (cPPT/FLAP), un elemento de respuesta Rev (RRE), el potenciador 3’ del gen de �-globina humana, un gen de interés, tal como la variante del gen de �-globina humana que contiene la mutación �A87 Thr:Gln, 266 bp del promotor de �-globina humana, 2,7 kb de la LCR fr �-globina humana, un tracto de polipurina (PPT) y la LTR VIH adyacente 3’. Las regiones LTR comprenden además una región U3 y U5, además de una región R. Las regiones U3 y U5 pueden modificarse juntas o de forma independiente para crear un vector que es auto-inactivante, aumentando así la seguridad del vector para el uso en el reparto génico. Las regiones U3 y U5 pueden modificarse adicionalmente para comprender un elemento aislante. En una realización de la invención, el elemento aislante es HS4 de pollo. El cADN del gen terapéutico de interés, tal como, por ejemplo, la �-globina humana, se amplifica por PCR a partir de un banco apropiado. El gen se clona en un plásmido, tal como pBluescript II KS (+) (Stratagene), que contiene un promotor deseado o elementos de control de la expresión génica, tal como el promotor de �-globina humana y elementos LCR. Después de la digestión de la enzima de restricción u otro método conocido por un experto en la técnica para obtener una secuencia de ADN deseada, el módulo de ácido nucleico que contiene el promotor y los elementos LCR y el gen terapéutico de interés se inserta entonces en un sitio de clonado apropiado del vector lentiviral, como se muestra en la Figura 1c.
La etapa de facilitar la producción de partículas virales infecciosas en las células puede llevarse a cabo usando técnicas convencionales, tal como técnicas de crecimiento en cultivo celular estándar. Si el experto lo desea, las disoluciones de reservas lentivirales pueden prepararse usando los vectores y métodos de la presente invención. Los métodos para preparar las disoluciones de reservas lentivirales se conocen en la técnica y se ilustran por, por ejemplo, Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, y N.R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113. En un método para producir una disolución de reservas en la presente invención, se transfectan células permisivas lentivirales (denominadas en este documento como células productoras) con el sistema de vectores de la presente invención. Las células se hacen crecer entonces en condiciones de cultivo celular adecuado, y las partículas lentivirales se recogen o bien de las células en sí mismas o del medio celular como se describe anteriormente. Líneas celulares productoras adecuadas incluyen, aunque no están limitadas a, la línea celular 293 del riñón embrionario humano, la línea celular NBL-6 dérmica equina y la línea celular Cf2TH del timo fetal canino.
La etapa de recogida de las partículas víricas infecciosas también puede llevarse a cabo usando técnicas convencionales. Por ejemplo, las partículas infecciosas pueden recogerse por lisis celular, o recogida del sobrenadante del cultivo celular, como se conoce en la técnica. Opcionalmente, las partículas de virus recogidas pueden purificarse si se desea. Las técnicas de purificación adecuadas son bien conocidas por los expertos en la técnica.
Otros métodos relacionados con el uso de vectores virales en la terapia génica pueden encontrarse en, por ejemplo, Kay, M.A. (1997) Chest 111 (Suplemento 6):138S-142S; Ferry, N. y Heard, J.M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory,
Y. et al. (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule, P.M. y Liu, J.M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N.S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S.L. y Crystal, R.G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716-90-101; Strayer, D.S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J.R. y Bartlett, J.S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:4349; y Lee, H.C. et al. (2000) Nature 408:483-8.
Los vectores lentivirales, como se describen anteriormente, pueden administrarse in vivo a sujetos mediante cualquier ruta adecuada, como bien se conoce en la técnica. El término “administración” se refiere a la ruta de introducción de un vector formulado en el cuerpo. Por ejemplo, la administración puede ser intravenosa, intramuscular, tópica, oral o mediante pistola génica o instrumentación de hipopulverizado.
Así, la administración puede dirigirse a un tejido diana o a través de reparto sistémico. La administración directamente al tejido diana puede implicar inyección, hipopulverizado, electroporación o la pistola génica. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/18759.
De forma alternativa, los vectores lentivirales de la invención pueden administrarse ex vivo o in vitro a células o tejidos usando técnicas de transfección estándar bien conocidas en la técnica.
Los vectores lentivirales de la invención pueden además transducirse en células huésped, que incluyen células madre embrionarias no humanas, células madre somáticas, o células troncales. Ejemplos de células huésped troncales que pueden transducirse por los vectores lentivirales de la invención, incluyen precursores de eritrocitos y células madre hematopoyéticas. En otra realización, la célula huésped es un eritrocito. Las células huésped transducidas pueden usarse como un método de alcanzar la expresión específica eritroide del gen de interés en el tratamiento de hemoglobinopatías.
Como se usa en este documento, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicidas, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. En una realización, el vehículo es adecuado para la administración parenteral. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para la administración directamente en una articulación afectada. El vehículo puede ser adecuado para administración intravenosa, intraperitoneal o intramuscular. Vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen disoluciones o dispersiones acuosas esterilizadas y polvos esterilizados para la preparación extemporánea de disoluciones
o dispersiones inyectables esterilizadas. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la invención. Compuestos activos adicionales pueden incorporarse también en las composiciones.
También se describen en este documento composiciones farmacéuticas de los vectores lentivirales de la invención. Dicha composición incluye un vector lentiviral en una cantidad terapéuticamente eficaz, suficiente para tratar o evitar (por ejemplo, mejorar los síntomas de una hemoglobinopatía), y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado terapéutico deseado, tal como el tratamiento o prevención de un proceso hemoglobinopático. Una cantidad terapéuticamente eficaz de vector lentiviral puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del vector lentiviral de provocar una respuesta deseada en el individuo. Los regímenes de las dosis pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad terapéuticamente eficaz es además una en que cualquier efecto tóxico o perjudicial del vector lentiviral está sobrepasado por los efectos terapéutica-mente beneficiosos. La toxicidad potencial de los vectores lentivirales de la invención pueden ensayarse usando ensayos basados en células o modelos animales reconocidos por la técnica y puede seleccionarse un modulador terapéuticamente eficaz que no muestra toxicidad significativa. Preferiblemente, una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector lentiviral es suficiente para tratar una hemoglobinopatía.
Pueden prepararse disoluciones inyectables esterilizadas incorporando el vector lentiviral en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se necesite, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo esterilizado que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios a partir de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esterilizados para la preparación de disoluciones inyectables esterilizadas, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y el secado por congelación que da un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una disolución filtrada previamente esterilizada del mismo.
Debe notarse que los valores de dosificación pueden variar con la gravedad de la enfermedad a aliviar. Tiene que entenderse además que para cualquier sujeto particular, pueden ajustarse regímenes de dosificación específicos con el tiempo según la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administre o supervise la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación expuestos en este documento son ejemplares solo y no pretenden limitar el alcance o práctica de la composición reivindicada.
La cantidad de vector viral en la composición puede variar según los factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, puede administrarse una única píldora, puede administrarse varias dosis divididas en el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente como se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en formas unitarias de dosificación por la facilidad de administración y uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa en este documento se refiere a unidades físicamente discretas apropiadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención se establece y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a alcanzar, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de composición de dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Una ventaja principal de los vectores retrovirales, que incluyen vectores lentivirales, es que son capaces de integrarse en el genoma de una célula huésped y, por lo tanto, capaces de la expresión a largo plazo de proteínas terapéuticas. Los vectores lentivirales se han usado con éxito para repartir genes exógenos tanto in vitro como in vivo a una gran variedad de poblaciones celulares en diversas especies, que incluyen neuronas del sistema nervioso central (Naldini et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388), células de la retina (Miyoshi et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10319-10323) y células pancreáticas (Giannokakis et al. (1999) Gene Ther. 6:15451551).
Se dan los siguientes ejemplos, de los que el ejemplo VI es ilustrativo de la invención. Ejemplos Materiales y Métodos Análisis p50 de la sangre total
En los experimentos con el modelo de ratón de SCD, las medidas p50 en la sangre total se llevaron a cabo usando un Hemoscan (Aminco, Silver Spring, MD). La concentración de HbS desoxigenado en equilibrio con el polímero (CSAT) se determinó usando el método p50 (R.E. Benesch et al. (1978) Analytical Biochem. 89:162) para diversas mezclas de HbS con hemoglobinas de ensayo (relación 1:1). p50 es la presión de oxígeno a la que la mitad de las moléculas de Hb están desoxigenadas, como se detecta de forma espectroscópica. Porque el polímero HbS tiene una afinidad al oxígeno mucho menos que la HbS en disolución, un salto repentino en p50 indica el comienzo de la formación del polímero, y la concentración de Hb a la que se da el salto da el valor CSAT, expresado en g/dl.
Construcción del vector y producción del virus
El gen de beta-globina humana que incluye su promotor y la secuencia potenciadora 3’ se clonó a partir de BGT9 (Pasceri, et al. (1998) Blood 92:653). Un fragmento de 374 bp se eliminó del intrón 2 y los sitios hipersensibles 2-4 se clonaron de BGT33 (Rubin, et al. (2000) Blood 95:3242). Las reservas de virus se generaron por transfección transitoria de las células 293T con el vector lentiviral recombinante junto con plásmidos separados que expresan VIH-1 Gag-Pol, Rev y Tat. La secuencia de ADN del vector se proporcionará bajo petición. Un litro de virus se concentró por ultracentrifugado a 25.000 rpm durante 90 minutos a 4ºC y la bolita viral se suspendió de nuevo en 300 �l de medio libre de suero (Life Technologies, Frederick, MD). La ausencia de retrovirus competente para la replicación (RCR) se verificó mediante ensayo de movilización como se describe (Pawliuk et al. (1994) Blood 84:2868). Los títulos virales se determinaron por análisis de transferencia de Southern. Análisis de ARN y ADN
En los experimentos del modelo de ratón de SCD, el análisis de transferencia de Southern se llevó a cabo usando métodos estándar (Pawliuk et al., supra). Un fragmento exónico marcado con 32P del gen de �-globina humana se usó como sonda. La cuantificación del número de copias del vector se consiguió por densitometría usando un phosphoimager con software ImageQuaTM (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). El ADN se digirió con Afl II y se sondó con un fragmento exónico del gen de �globina humana.
En los experimentos THAL, el ARN de �-globina humana en reticulocitos periféricos se cuantificó por ensayo de protección de RNasa como se describe en Leboulch et al. (1994) EMBO 13:3065. Un fragmento BamH1 de 1,6 kb del gen de �-globina humana, marcado con [32P]dCPT por cebado aleatorio, se usó como una sonda. Modelo del ratón THAL
Los ratones homocigotos con �-talasemia para una deleción del gen �-principal murino (C57BL/6 Hbbth-1/Hbbth-1) (Skow et al. (1983) Cell 34:1043) denominados en adelante como ratones THAL, y ratones de control C57BL/6(B6) se criaron a partir de reservas parentales obtenidas de The Jackson Laboratory. La identidad de los ratones THAL homocigotos se confirmó por análisis de isoelectroenfoque de lisatos RBC para detectar tetrámeros de Hb de migración lenta, de única característica que consisten en cadenas de globina menor, dos de � murina y dos de � murina.
Transducción y transplante de médula ósea
En los experimentos del modelo de ratón de SCD, los ratones donantes se inyectaron 4 días antes de la recogida de médula ósea con 150 mg/kg de 5-fluorouracilo (5-FU). Las células se pre-estimularon durante la noche en medio libre de suero (Life Technologies, Frederick, MD) suplementado con L-glutamina 200 mM, 6 ng/ml de interleuquina-3 murina, 10 ng/ml de interleuquina-6 humana, 10 ng/ml de interleuquina1� murina y 100 ng/ml de Factor de Célula Madre murina (Peprotech, Rocky Hill, NJ). Las células se expusieron a sobrenadantes virales concentrados en placas recubiertas de RetronectinTM (Biowhittaker, East Rutherford, NJ) durante 5-6 horas en presencia de 8 �g/ml de sulfato de protamina (Sigma, St. Louis, MO). Después de la infección, las células se cosecharon y se inyectaron, sin selección, en ratones receptores dando 1100 cGy (rayos � de 123Cs) de irradiación de todo el cuerpo (dosis divididas de 550 cGy durante 3 horas).
Para experimentos que usan ratones THAL, las células de médula ósea (24 x 106) de ratones THAL macho inyectados de forma intravenosa 4 días antes con 5fluorouracilo (100 mg/kg) se estimularon toda la noche en medio de Iscove suplementado con BSA al 1%, 10 �g/ml de insulina pancreática bovina y 200 �g/ml de transferrina humana (BIT; StemCell Technologies, Vancouver), 2-mercaptoetanol 10-4 M, glutamina 2 mM, 10 ng/ml de interleuquina-11 humana (IL-11, Genetics Institute, Cambridge, MA), 100 ng/ml de ligando flt3 humano (Immunex, Seattle, WA) y 300 ng/ml de factor de Steel murino (expresado en células COS y purificado en los Terry Fox Laboratories, Vancouver). Al día siguiente, las células cosechadas se hicieron bolitas y se volvieron a suspender en 0,9 ml del medio mencionado anteriormente que contiene la misma combinación de factor de crecimiento con lentivirus de GPF seudotipada con glicoproteína G de virus de estomatitis vesicular o �-globina a una concentración final de virus de 1,5 x 109 de unidades de infección/ml (título funcional medido por análisis de transferencia de Southern de células NIH 3T3 transducidas). La infección se llevó a cabo durante 5 h en placas de Petri recubiertas con fibronectina (5 �g/cm2, Sigma) en presencia de 5 �g/ml de sulfato de protamina. Después de la infección, se transplantaron 2 x 106 células, sin selección, por inyección intravenosa en cada receptor THAL hembra dando 900 cGy (110 cGy/min de rayos � de 37Cs) de irradiación de todo el cuerpo. Análisis FACS
Los RBC se lavaron en PBS, se fijaron, se permeabilizaron y se tintaron con un anticuerpo monoclonal marcado con FITC que reconoce de forma específica la HbA humana (PerkinElmer Wallac, Norton, OH). Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, San Diego, CA).
Análisis de la extensión de cebador
En los experimentos del modelo de ratón de SCD, el ARN total se extrajo de 100-200 l de sangre usando reactivo TRIzol (Life technologies, Frederick, MD). La extensión del cebador se llevó a cabo usando el conjunto Sistema de Extensión del Cebador – Transcriptasa Inversa de AMV (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. Los cebadores para la �A-globina humana [5’-CAGTAACGGCAG ACTTCTCCTC-3’] (SEQ ID NO:1) y la �única-globina de ratón [5’-TGATGTCTGTTTC TGGGGTTGTG-3’] (SEQ ID NO:2) generan productos de extensión de 90 bp y 53 bp respectivamente. Los productos de extensión se marcaron de forma radiactiva incluyendo 32P dCTP en la mezcla de reacción.
Las reacciones se llevaron a cabo usando 1 �g de ARN y marchando en un gel de poliacrilamida al 7% desnaturalizante. Las bandas radiactivas se cuantificaron por análisis en phosphoimager. Las medidas se corrigieron para el número de residuos de dPCT en los productos de extensión humanos (Rubin et al., supra) y de ratón (Papadea et al., supra). Análisis de proteína
En los experimentos del modelo del ratón de SCD, la cuantificación de las cadenas de �-globina y Hb por HPLC se llevó a cabo como se describe en Fabry et al. (1995) Blood 86:2419 y Papadea et al. (1996) Clin. Chem. 42:57. Falciformación de RBC
En los experimentos del modelo de ratón de SCD, la falciformación de eritrocitos se estudió como una función de PO2, de 0 a 150 mm de Hg. La sangre se diluyó con PBS (340 mOsm) que contenía glucosa 5 mM y 0,5 g/dl de albúmina de suero bovino. Las células se equilibraron con una mezcla de aire y nitrógeno a la PO2 deseada, durante 30 minutos a 37ºC en un agitador rotatorio, y se fijaron por la adición de formaldehído al 4% equilibrado a la misma PO2 y temperatura. La inversión de la falciformación se determinó después de la incubación de la suspensión celular totalmente desoxigenada por reoxigenación con aire a 0ºC durante una hora, antes de la fijación con la disolución de formaldehído equilibrada con aire a 0ºC. Las proporciones de células falciformes y no falciformes se determinaron por microscopia usando óptica de Nomarski.
Hematología
En los experimentos del modelo de ratón de SCD, los conteos de glóbulos rojos y la Hb total se midieron en un analizador CBC (CBC Technologies, Oxford, CT). Los reticulocitos se analizaron usando el sistema Sysmex SE 9000 (Sysmex Corp of Ame-rica, Long Grove, IL). Capacidad de concentración de orina
En los experimentos del modelo de ratón de SCD, a los ratones se les privó de agua durante 24 horas. Al final de este periodo, se recogió la orina en Parafilm y la osmolaridad se midió después de una dilución 1:10 con agua destilada usando un Microosmette (Precision Systems, Natick, MA). Gradientes de densidad de RBC
En los experimentos del modelo de ratón de SCD, los gradientes de densidad se llevaron a cabo como se describe anteriormente en Fabry et al. (1991) Blood
78:217.
Tiempo de retraso de la polimerización de HbS
En los experimentos del modelo de ratón de SCD, la formación de polímero sobre la desoxigenación de Hb purificada o hemolisatos libres de membrana se estudió midiendo el tiempo de retraso de polimerización con el método descrito por Adachi y Asakura (Adachi, et al. (1980) J. Mol. Biol. 144:467). En resumen, después de un salto de temperatura de 0ºC a 30ºC de las muestras desoxigenadas en una disolución de fosfato de potasio 1,80 M (pH 7,4) y de ditionita de sodio 2 mM, la turbidez inducida por la polimerización de HbS se grabó a 700 nm. El factor de probabilidad para la nucleación se derivó de la medida del tiempo de retraso llevada a cabo a diversas concentraciones de Hb. Análisis de la proteína globina
En los experimentos de ratón THAL, la proporción de RBCs que expresan proteína �-globina humana se evaluó por análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de RBCs que se han fijado y tintado con un anticuerpo antihumano biotinilado (Perkin-Elmer) y Estreptavidian-PE como se describe en Kalberer et al. (2000) PNAS 97:5411. Los lisatos de RBC de sangre recién recogida se analizaron por isoelectroenfoque usando el equipo de ensayo de Hb Resolve (Perkin-Elmer) como se describe en Fabry et al., (1992) PNAS 89:12155. La composición de la globina se determinó por HPLC con un disolvente de desnaturalización que separa las cadenas de globina y una columna C4 de poro grande Vydac (3.000 A) con un gradiente modificado de acetonitrilo/H2O/ácido trifluoroacético como se describe en Fabry et al.,
supra. La cantidad de cadenas de � globina no pareadas asociadas con membranas de RBC se determinó por análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida-Tritónurea como se describe en Rouyer-Fessard et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:19092. En resumen, después del lavado extensivo de los fantasmas de membrana, la carga de cantidades equivalentes de proteína y el tintado azul Coomassie del gel, las proteínas se analizaron por densitometría a 570 nm. La proporción de cadena de �-globina asociada a la membrana se expresó como un porcentaje de proteínas de la membrana total.
Parámetros hematológicos y gradiente de densidad de RBC
En los experimentos de ratón THAL, la sangre de la vena de la cola se usó para analizar los índices de RBC y conteos de reticulocitos usando el sistema Sysmex SE 9500 (Sysmex Corp. of America, Long Grove, IL). Los frotis de sangre se tintaron con azul de metileno para conteos manuales de reticulocitos para validar los conteos de reticulocitos con Sysmex en la mayoría de los casos y estos números correlacionaron bien. Los frotis de sangre se tintaron además con Wright-Giemsa usando un tintador automático. Los frotis se revisaron a ciegas por dos hematólogos independientes. Las densidades de RBC se examinaron en gradientes Percoll-Larex (Larex International, St. Paul), como se describe en Fabry et al. (1984) Blood 90:3332. El ensayo de la t de Student se usó para determinar si los parámetros hematológicos difirieron entre grupos de tratamiento. Histopatología
En los experimentos de ratón THAL, los hígados y bazos se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%. Los tejidos se fijaron con parafina. Se tintaron secciones de cinco micrómetros con hematoxilina-eosina y tinte de hierro Perls y posteriormente se examinaron por microscopia óptica. Ejemplo I: Construcción de la Variante Génica de �A-Globina Humana
Para tomar ventaja del hecho de que la �-globina es un fuerte inhibidor de la polimerización de HbS, el gen de �A-globina humana se mutó de tal manera que emulara la actividad de anti-falciformación de la �-globina. Una variante del gen de �Aglobina humana se mutó en el codón 87 para codificar una Glutamina [�A87 Thr:Gln (�A
T87Q)], que
se piensa que es responsable de la mayoría de la actividad de antifalciformación de la �-globina (Nagel et al. (1979) PNAS USA 767:670). Para estudiar la capacidad de anti-falciformación y la afinidad de enlace con el oxígeno de la variante del gen de �A-globina humana, se hicieron ratones transgénicos
A-T87Q
que expresaron las globinas humanas �y �, pero ni la globina � de ratón ni la � de ratón. Estos ratones tenían parámetros hematológicos normales y viabilidad, y la variante de �A-T87Q-globina extraída de los RBCs se encontró que era casi un inhibidor tan potente de la polimerización de HbS como la �-globina in vitro y mucho más que la
�A-globina, como se muestra en la Figura 1a. La Figura 1a muestra que HbA-T87Q y HbF son potentes inhibidores de la polimerización de HbS in vitro en contraste con HbA. Como se muestra en la Figura 1a, el análisis de sangre total de p50, la pO2 a la que el 50% de las moléculas de Hb están oxigenadas, mostró que la afinidad de enlace con el oxígeno de �A-T87QHb fue bien en el intervalo observado con �AHb de tipo natural en ratones: 31,1 ± 0,2 mm de Hg (error estándar = ES) frente a 32,7 ± 1,8 mm de Hg (ES), respectivamente.
La variante de �A-T87Q-globina se insertó entonces en un vector lentiviral que se optimizó por transferencia a HSCs y expresión específica de eritroides. El tracto de polipurina central/solapa de ADN de VIH-1 (Zennou et al. (2000) Cell 101:173) se incorporó en la construcción para aumentar los títulos virales y la transducción de HSCs después del seudotipado con la glicoproteína G del virus de estomatitis vesicular (VSV-G) y la concentración, como se muestra en la Figura 1c. El análisis de transferencia de Southern (Figura 1b) mostró títulos que alcanzan 1,5 x 109 unidades infecciosas por ml después del seudotipado con glicoproteína-G del virus de estomatitis vesicular (VSV-G) y concentración física. Se eligieron elementos LCR específicos en la base de resultados de integrantes sencillos en células eritroides evaluados por intercambio de módulo mediado por recombinasa (Bouhassira et al. (1997) Blood 90:3332). Ejemplo II: Análisis de Lentivirus de �A-T87Q-Globina
El lentivirus �A-T87Q-globina se analizó primero en ratones receptores C57BL/6 singénico normal, irradiado de forma letal, en ausencia de cualquier selección. La transferencia proviral fue estable con un número de copias promedio de 3,0 ± 0,5 (ES) por genoma de células sanguíneas nucleadas periféricas 3 meses después del transplante, como se muestra en la Figura 1b. A 10 meses después del transplante, todos los ratones que expresan proteína �A-T87Q-globina humana con hasta 99% (media 96 ± 0,9% (ES)) de sus RBCs tintando en positivo con un anticuerpo que reconoce específicamente la �-globina humana, en este caso, la variante �A-T87Q (Figura 2a). No se detectó expresión de �A-T87Q-globina humana en otras estirpes sanguíneas por tintado con anticuerpo. La proteína �A-T87Q-globina humana representó hasta 22,5% [media 16 ± 3,1% (ES)] de �-cadenas de ratón endógenas en receptores de médula ósea transducida por lentivirus de �A-T87Q-globina, como se determina por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Figura 2c). La discrepancia cuádruple entre el ARNm de �AT87Q-globina humana y los niveles de proteína es consistente con las diferencias observadas en ratones transgénicos para el gen de �A-globina (Alami et al. (1999) Blood Cells Mol. Dis. 25:110).
Los transplantes secundarios a largo plazo se llevaron a cabo también con médula ósea a partir de un receptor primario representativo matado 5 meses después del transplante. El análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de muestras de sangre periférica de receptores secundarios 4 meses después del transplante mostró que 87 ± 2,3 (ES) de los RBCs expresaron niveles altos de proteína
�A-T87Q-globina humana, demostrando así que se alcanzó la transducción de HSCs reales. El análisis de la variegación por efecto de posición sugirió que la expresión pan-celular fue el resultado de la expresión equilibrada a partir de la reconstitución de células madre policlonales con múltiples sitios de integración cromosómica más que la expresión independiente de la posición real.
Ejemplo III: Terapia Génica de Modelos de Ratón Usando Vectores Retrovirales
Análisis in vivo de lentivirus de �A-T87Q-globina
Para estudiar la eficacia del vector lentiviral de �A-T87Q-globina in vivo, se usaron dos modelos diferentes de ratón transgénico SCD: SAD (Trudel et al. (1991) EMBO J. 10:3157) y Berkeley (BERK) (Paszty et al. (1997) Science 278:876). Los ratones SAD expresan �-globina humana junto con una globina “súper S” resultante de mutaciones de dos puntos añadidas al gen de �S humano (Trudel et al., supra), mientras los ratones BERK, que expresan globulinas � humana y �S humana, no expresan ninguna globina murina por la rotura completa de los locus génicos de ratón de las globinas tanto � como � (Paszty et al., supra). El fenotipo de los ratones BERK es en global más severo que el de los ratones SAD, aunque algunas de las anormalidades hematológicas en los ratones BERK están provocadas por un síndrome �-talasémico asociado debido a la expresión por debajo de la óptima del gen �S humano transgénico (Nagel et al. (2001) Br. J. Haematol. 112:19).
A-T87Q
La médula ósea SAD y BERK se transdujo con el vector lentiviral de �globina y se transplantó en ratones receptores C57BL/6 singénicos irradiados de forma letal. La médula SAD transducida se transplantó además en receptores SAD singénicos irradiados de forma letal. Tres meses después del transplante, la reconstitución de los ratones C57BL receptores con médula ósea BERK o SAD donante se completó esencialmente para todos los ratones, como se determinó por cuantificación de Hb � única murina por HPLC (Figura 3).
La electroforesis por isoelectroenfoque de muestras de sangre de ratones 3 meses después del transplante muestra todas las especies esperadas de Hb, como se muestra en la Figura 4. La cantidad de �A-T87Q-globina expresada en los ratones transplantados, como se mide por HPLC de Hb, fue hasta 108% (media 75,5 ± 17,1% (ES)) y 51% (media 42,5 ± 5,5% (ES)) de la HbS transgénica para receptores de médula ósea BERK y SAD transducida por el lentivirus de �A-T87Q-globina, respectivamente, como se muestra en la Figura 3. Estos valores corresponden a hasta 52% y 12% de la Hb total de ratones BERK y SAD, respectivamente. La mayor cantidad de Hb que contiene �A-T87Q-globina observada en eritrocitos derivados de células de médula ósea transducida de ratones BERK en comparación con ratones SAD puede explicarse por la ausencia del ARNm de �-globulina murina y el fenotipo talasémico asociado de los
A-T87Q
ratones BERK, que favorece la translación de las especies de ARNm de �globina añadidas (Nagel et al, supra, 2001). Análisis in vivo de la inhibición de la polimerización
Para determinar si la �A-T87Q-globina fue capaz de inhibir la polimerización de HbS in vivo en modelos de ratón SCD transplantado, la morfología de los RBCs de ratones transplantados se analizó como una función de presión de oxígeno in vitro. El examen de las curvas de falciformación sigmoide obtenidas mostró un marcado cambio en la proporción de células falciformadas, como se muestra en la Figura 5a y 5b. Para receptores de médula BERK transducida por lentivirus de �A-T87Q-globina, la mayor diferencia se dio al 5% de pO2, con 80 ± 1,7% (ES) frente a 26 ± 7,5% (ES) (P = 0,01) de células falciformes para médula transducida de forma simulada o transducida por lentivirus de �A-T87Q-globina, respectivamente. En comparación, el análisis de RBCs de seres humanos con rasgo falciforme, que son heterocigóticos para el alelo �Sy asintomáticos, mostró ~40% de células falciformadas al 5% de pO2, con 81 ± 3% (ES) frente a 46 ± 11% (ES) (P = 0,03) de células falciformes para médula transducida de forma simulada y transducida por lentivirus de �A-T87Q-globina, respectivamente. El examen de los frotis de sangre periférica a pO2 ambiente mostró una disminución de ocho veces en la proporción de células falciformadas de forma irreversible (ISCs) en ratones transplantados con médula BERK transducida por lentivirus de �A-T87Q-globina con la desaparición completa de ISCs altamente deshidratados. Para ratones SAD, no pudieron detectarse ISCs después de la transducción por lentivirus de �A-T87Q-globina, como se muestra debajo en la Tabla 1. La Tabla 1 muestra la corrección de anormalidades hematológicas y el defecto de concentración de orina en los receptores de médula ósea BERK transducida por �A-T87Q-globina.
Tabla 1: Corrección de anormalidades hematológicas y defecto de concentración de orina en los receptores de médula ósea BERK transducida por �A-T87Q-globina
Ratones*
RBCs (106/�l) Hb (g/dl) Reticulocitos (%) ISCs† (%) Concentraciones de orina (mOsM) (número de ratones)
Controles C57BL/6 (n=3)
10,1 ± 0,3 15,0 ± 0,6 4,1 ± 0,6 - 3247 ± 500 (n = 22)
Controles BERK (n=3)
7,4 ± 0,6 9,4 ± 0,9 17,8 ± 0,6 16,0‡ 1452 ± 331 (n = 4)
BERK �A-T87Q (n=3)
10,1 ± 1,1§ 13,0 ± 0,4|| 5,8 ± 1,8¶ 2,0 # 3600 ± 381 (n = 2)**
Control SAD (n=4)
8,4 ± 0,6 13,0 ± 0,6 3,4 ± 1,2 2,6 # 3840 ± 175 (n = 3)
SAD �A-T87Q (n=3)
8,7 ± 0,1 13,7 ± 0,2 2,8 ± 0,1 0 3920 ± 326 (n = 3)
RBCs, glóbulos rojos; Hb, hemoglobina; ISCs, células falciformadas irreversiblemente. Valores mostrados con ES e importancia estadística establecida por el ensayo t de 5 Student. *n es el número de ratones para RBCs, Hb y reticulocitos.
A-T87Q
† Un total de 2000 RBCs se examinaron a partir de ratones control BERK y �
A-T87Q
BERK (n = 2) y 3000 RBCs se examinaron a partir de ratones control SAD y �
SAD (n = 2).
10 § P = 0,15 con corrección esencial de anisocitosis y poiquilocitosis. || P = 0,01. ¶ P = 0,05. # Solo ISCs hidratados. ‡ ISCs generalmente deshidratados. ** P = 0,01.
Los estudios cinéticos de la formación del polímero de HbS por turbidimetría de lisatos de RBC a partir de ratones transplantados mostraron polimerización de HbS 15 retrasada en lisatos a partir de ratones transplantados con o bien médula SAD o BERK
A-T87Q
transducida con o bien médula SAD o BERK transducida con el lentivirus de �globina (Figura 5c). El cambio en las cinéticas fue paralelo al que se observó con los lisatos de RBC a partir de pacientes SS homocigotos frente a heterocigotos AS asintomáticos.
20 La densidad de RBCs a partir de modelos de ratón SCD transplantados se examinó ya que la polimerización de HbS provoca densidad celular anormalmente alta (Blouin et al., supra; Nagel et al., supra, 2001). Mientras los RBCs de ratones SAD de control y transducidos de forma simulada tenían una mayor densidad que la de los ratones C57BL/6 singénicos, los ratones completamente reconstituidos con médula
25 SAD transducida con lentivirus de �A-T87Q-globina mostraron un cambio claro hacia lo normal (Figura 5d). En los RBCs BERK, el fenómeno se revirtió, porque el fenotipo talasémico asociado disminuyó la concentración de Hb corpuscular media, dando por resultado una menor densidad celular. La adición de �A-T87Q-globina curó parcialmente la talasemia y dio por resultado una mayor densidad celular, como se muestra en la Figura 5d.
A diferencia de los ratones SAD, los ratones BERK tienen alteraciones muy importantes de sus parámetros hematológicos, como una consecuencia tanto de SCD como de la talasemia asociada (Nagel et al., supra, 2001, Paszty et al., supra). En ratones transplantados con médula BERK transducida con lentivirus de �A-T87Q-globina, los conteos de RBC y reticulocito se corrigieron con mejora de la concentración de Hb, anisocitosis y poiquilocitosis (Tabla 1). Análisis in vivo de los síntomas asociados a SCD
La mejora de la esplenomegalia asociada a SCD y el defecto de la concentración de orina característica en ratones BERK se examinó usando terapia génica. Después del transplante de médula BERK transducida con lentivirus de �A-T87Q-globina, ambas características patológicas se corrigieron, mientras que no se observó efecto para los receptores de la médula BERK transducida de forma simulada (Tabla 1 y Figura 5e). Ejemplo IV: Análisis de la Variegación por Efecto de Posición
Para determinar si la expresión pancelular observada de la proteína A-T87Qglobina humana en los RBCs fue el resultado de la expresión independiente de la posición del gen de A-T87Q-globina transferido, la médula ósea de un receptor C587BI/6 primario representativo sacrificado 5 meses después del transplante se usó para general al día 12 colonias del bazo en ratones receptores secundarios. El análisis de transferencia de Southern se llevó a cabo en ADN genómico aislado de 20 colonias de bazo individuales después de la digestión con BamH I, que corta solo una vez en el provirus integrado. Diez clones distintos se observaron con un número de copias provirales promedio de 3,4 ± 0,3 (ES) (intervalo 2-5). El análisis de extensión del cebador de ARNm procedente de las colonias del bazo mostró una amplia variación en la cantidad de ARNm de A-T87Q-globina humana. Estos resultados sugieren que la expresión pancelular fue el resultado de la expresión equilibrada a partir de la reconstitución de células madre policlonales con múltiples sitios de integración cromosómica más que la expresión independiente de la posición real.
En resumen, los ejemplos anteriores demuestran que la integración cromosómica de una variante génica de globina de anti-falciformación en HSCs puede dar por resultado su expresión específica de eritroide, pancelular, a niveles suficientemente altos para corregir las características patológicas principales del SCD. Los ejemplos
A-T87Q
anteriores demuestran además que la optimización estructural del gen de �globina/lentivirus LCR por intercambio de módulos mediado por recombinación y la incorporación del tracto de polipurina central-solapa de ADN de VIH-1, dio por resultado títulos virales muy altos que dan múltiples sucesos de integración cromosómica por célula madre hematopoyética. Esta integración llevó a la expresión equilibrada que fue suficientemente alta y suficiente homogénea para proporcionar una protección total similar a la observada en los heterocigotos AS humanos asintomáticos.
Ejemplo V: Análisis In vivo de la Terapia Génica en el Modelo del Ratón de la Talasemia
Para probar la eficacia terapéutica de un vector lentiviral para el tratamiento de otras hemoglobinopatías, el vector lentiviral que contenía gen de �-globina humana natural se inyectó en la médula ósea de ratones THAL, un modelo murino usado para estudiar la �-talasemia. Los ratones THAL soportan una deleción homocigoto del gen
� principal de ratón y manifiestan una anemia microcítica, hipocrómica, con considerable anisocitosis, poiquilocitosis, reticulocitosis, la presencia de cuerpos de inclusión en una alta proporción de sus RBCs circulantes, y eritrocitos anormalmente deshidratados (Skow et al. (1983) Cell 34:1043).
El vector génico de globina lentiviral usado en los experimentos se muestra de forma esquemática en la figura 14A. Este vector se basa en el diseño previamente descrito en detalle anteriormente y probado de forma exitosa para la corrección de la anemia falciforme, excepto que ahora incorpora el gen de �-globina humano natural. El vector lentiviral contiene de forma notable segmentos específicos del promotor y LCR del gen de interés, es decir, �-globina humana, y además incorpora el tracto de polipurina central/solapa de ADN de VIH-1.
El virus recombinante seudotipado con glicoproteína-G del virus de estomatitis vesicular se produjo y posteriormente se concentró 1.000 veces en dos vueltas de ultracentrifugado como se describe anteriormente y en Pawliuk et al. (2001), supra. Un vector lentiviral que porta el gen que codifica GFP mejorado dirigido por el promotor 1
� del factor de elongación se generó además y se usó como un control en algunos de los siguientes experimentos. La ausencia de virus competente para la replicación se verificó por ensayo de movilización. Los títulos virales se determinaron funcionalmente por análisis cuantitativo de transferencia de Southern de las células NIH 3T3 transducidas con controles del número de copias proviral.
Como se muestra en la figura 14A, el vector contiene LTR VIH, repetición terminal larga tipo-1 de VIH; �+, señal de empaquetamiento; cPPT, tracto de polipurina central/solapa de ADN; RRE, elemento de respuesta Rev; E, exón; IVS, secuencia de intervención; �P, promotor de �-globina (del sitio SnaBI a Cap); HS, sitio hipersensible; ppt, tracto de polipurina. El potenciador de �-globina 3’ (hasta el sitio AvrII corriente abajo), la deleción IVS2 de 372 bp (indicada por el triángulo) y los sitios hipersensibles DNasa I, HS2 (SmaIa XbaI), HS3 (SacIa PvuII) y HS4 (StuIa SpeI) de la LCR.
El vector lentiviral [gen de �-globina/LCR] se optimizó para títulos virales y expresión génica de �-globina eligiendo segmentos específicos del gen de �-globina, su promotor, y la �-LCR de la base de resultados de los experimentos de ratón transgénico con copias integradas sencillas e intercambio de módulos mediado por la recombinación (Bouhassira et al. (1997) Blood 90:3332) en los mismos sitios de integración cromosómica en las líneas celulares eritroides. Además, el vector contiene el tracto de polipurina central/solapa de ADN de VIH-1 para la eficacia de transducción aumentada, como se muestra en la figura 14A. Después de la producción transitoria en células 293T en co-transfección con un plásmido que codifica la envoltura de glicoproteína-G del virus de estomatitis vesicular de seudotipado y la posterior concentración por ultracentrifugado, el vector lentiviral [gen de �-globina/LCR] alcanzó los títulos funcionales de 1,5 x 109 unidades infecciosas/ml, como se evalúa por el análisis de transferencia de Southern de las células NIH 3T3 transducidas con controles del número de copias proviral. Los títulos alcanzados fueron solo 5 veces menores que los obtenidos con un vector lentiviral similar que contiene solo el gen GFP dirigido por el promotor 1-� del factor de elongación.
En suma, el vector lentiviral incorporó diversos elementos para permitir la producción de virus estable, de título alto, que incluye un elemento de tracto de polipurina central/solapa de ADN y un elemento de respuesta rev de VIH. Después de la concentración, los preparados virales con títulos que exceden 109/ml se alcanzaron con un vector que porta un gen de �-globina humana no modificada y regiones extensas de la región de control del locus (LCR) que incluyen elementos de HS2, 3 y 4 sin ninguna evidencia de inestabilidad viral a través de engarce anormal. La posterior infección de células de médula ósea murina a alto MOI dio por resultado esencialmente transferencia génica al 100% para repoblar las células con múltiples integraciones provirales por célula transducida. Expresión paneritroide persistente de �-globina humana codificada por lentivirus en ratones THAL
Para asegurar que la expresión génica de la �-globina fue continua en RBCs murinos, se llevó a cabo el análisis FACS. La Figura 14B muestra los resultados del análisis FACs, con un anticuerpo específico para la cadena de �-globina humana, de RBCs de sangre periférica de ratones THAL irradiados de forma letal transplantados 7 meses antes con células de médula ósea THAL singénica transducidas con el vector lentiviral de [�-globina/LCR] o de GFP de control como se describe anteriormente. La proporción de RBCs de sangre periférica que expresan la �-globina humana se evaluó por FACS después de tintar las células con un anticuerpo específico para la �-globina humana. Los RBCs fueron de ratones THAL transplantados 7 meses antes con médula ósea expuesta al vector de lenti-�-globina. El título viral usado en el experimento 1 (E1), fue aproximadamente 2 x 108 unidades infecciosas/ml y en los experimentos 2 y 3 (E2, E3) fue aproximadamente 1,5 x 109 unidades infecciosas/ml. En todos los receptores ratón de células transducidas con los preparados del vector [�-globina/LCR] de título alto, aproximadamente el 95% de los RBCs fueron positivos para la proteína de �-globina humana (figura 14B). La reconstitución de alto nivel obtenida con los preparados de altos títulos virales se asoció con un número de copias proviral medio de aproximadamente 3 por célula transducida, como se evalúa por el análisis de transferencia de Southern de la médula ósea, timo y bazos con controles del número de copias proviral. Los análisis FACS a lo largo del tiempo mostraron que la reconstitución de los ratones con RBCs de �-globina+ humana fue rápida, con expresión pancelular observada tan pronto como 2 meses después del transplante, y estable a partir de entonces, incluso en ratones THAL transplantados de forma secundaria con células de médula cosechadas a partir de los receptores THAL primarios (se muestra en la figura 14C).
Experimentos de transplante similares con un preparado viral de menos títulos (2 x 108 unidades infecciosas/ml) dieron por resultado una menor proporción de RBCs que expresan la �-globina humana, indicando la transducción incompleta de HSCs donantes y variegación por efecto de posición de células con una única copia integrada (figura 14B). En resumen, la �-globina humana se expresó con éxito y continuamente en RBCs murinos usando el vector lentiviral [gen de �-globina/LCR]. Corrección in vivo del desequilibrio de �-globina en ratones THAL usando un vector lentiviral
La expresión de niveles terapéuticos de �-globina humana en los ratones THAL dio por resultado la corrección del desequilibrio de proteína �-globina en estos ratones. La proteína �-globina humana constituyó en promedio 32,4 ± 4% (27-39%) de todas las cadenas �-globina en los lisatos de RBC de los ratones THAL en los que la anemia se corrigió por transplante, lo que se confirmó adicionalmente por los resultados de los análisis de isoelectroenfoque de muestras sanguíneas de los ratones THAL transplantados. La cuantificación de �A humana se llevó a cabo por HPLC según los protocolos estándar. Se documentaron unas especies de Hb adicionales en todos los ratones corregidos, que concuerdan con la presencia del tetrámero de Hb que contiene dos cadenas de �-globina murina y dos cadenas de �-globina humana. El isoelectroenfoque de los lisatos de RBC de ratones primarios transplantados muestran las especies esperadas de Hb con las dos cadenas � murina y dos cadenas � humanas. Vías 1-4, receptores primarios, vías 5 y 6, receptores secundarios de células de médula ósea THAL transducidas por lenti-�-globina. La cuantificación del ARN de �-globina humana en las células sanguíneas periféricas por ensayo de protección de ARN mostró niveles de hasta 130% respeto al ARN de �-globina de ratón total. Como se observa anteriormente, los niveles de proteína de �-globina humana representan solo una fracción de aquellos del ARN codificado, presumiblemente por las diferencias intrínsecas en las constantes de asociación entre las cadenas de globina de ratón o humana para formar tetrámeros de Hb y/o competición diferencial para la traducción de la globina entre las especies de ARNm humano y de ratón (Alami et al. (1997) Blood Cells Mol Dis 25:110).
Los ratones THAL transplantados tenían además un aclaramiento completo del exceso de cadenas de �-globina unida a la membrana, que representa aproximadamente el 1% de las proteínas asociadas a la membrana de RBC en ratones normales (1,4 ± 0,7% en ratones THAL corregidos frente a 15,3 ± 1% en controles THAL transplantados de GFP). La expresión in vivo de �-globina humana en ratones THAL corrige los parámetros hematológicos y la morfología anormal de RBC en los receptores lentivirales
Los ratones THAL que muestran expresión eritroide pancelular de la �-globina humana, mostraron una marcada mejora en todos los índices de RBC, incluyendo la disminución del porcentaje de reticulocitos, aumento de RBCs, aumento de porcentaje de hematocrito y aumento de Hb (figura 15). En comparación con los valores anteriores al transplante, se dieron elevaciones significativas (P < 0,001) en el número de RBC (de 7 x 106 a 9,7 x 106 ± 0,9 por mm3), hematocrito (de 28 a 40 ± 2,3%) y concentración de Hb (de 8 a 12,4 ± 0,7 g/dl) con niveles de RBC elevándose a dentro del intervalo normal (sin diferencia significativa en comparación con ratones B6 normales, no manipulados) y justo debajo de los niveles normales para la concentración de hematocrito y Hb. Esta corrección de la anemia se reflejó además en una dramática reducción en los números de reticulocitos a partir de niveles de >20% a 3,4 ± 0,8%, alcanzando de nuevo el intervalo normal. No se dieron mejoras en ningún parámetro cuando los ratones THAL se transplantaron con médula ósea transducida con un vector de control GFP como se muestra en la figura 15.
Además, se realizó un análisis histológico en los ratones THAL lentivirales y control para examinar adicionalmente la morfología asociada con los parámetros hematológicos mejorados. Los descubrimientos a partir del examen morfológico de los frotis de sangre fueron compatibles con las mejoras hematológicas observadas. Los frotis de sangre de los animales experimentales y de control demostraron que la corrección de la característica de anemia de ratones THAL se asoció con una marcada reducción en la anisocitosis, poliquilocitosis y policromasia de RBC. Más del 75% de los RBCs eran normocrómicos y normocíticos tanto en los receptores primarios como secundarios. Los ratones de control transplantados con células de médula ósea transducidas por virus lenti-GFP permanecieron gravemente anémicas con marcada reticulocitosis y mantuvieron su morfología anormal de glóbulos rojos.
Para valorar adicionalmente la corrección de la anemia, se llevaron a cabo análisis de densidad de RBC. Los RBCs talasémicos tienen un concentración de hemoglobina media disminuida y por consiguiente, menor densidad en comparación con los RBCs normales (Fabry et al (1984), supra). En receptores THAL de médula transducida con lentivirus [gen de �-globina/LCR], la densidad de RBCs se estrechó dramáticamente hacia el intervalo normal. En suma, los cambios del fenotipo en los RBCs y la disminución en la acumulación de hemosiderina se observó en el bazo y el hígado de los ratones THAL transplantados. Inversión del fenotipo de la enfermedad de talasemia en ratones THAL receptores transducidos por �-globina humana
Los receptores de células de médula ósea transducida por lentivirus [gen de �globina/LCR] mostraron evidencia adicional de una marcada mejora en la eritropoyesis ineficaz. El peso del bazo para ratones tratados con B6, Thal/GPF y Thal/lenti-�A fue 110, 610 y 110 mg, respectivamente. Un aumento en el número de RBCs maduros se observó en la pulpa roja de los bazos de los ratones Thal/Lenti-vA en comparación con los ratones THAL no manipulados. Además, la relación de glóbulos rojos nucleados maduros/inmaduros se redujo de 20:80 en ratones Thal no manipulados a 40:60 en ratones Thal/lenti-�A. Estos valores correspondieron bien con la proporción de glóbulos rojos normocíticos normocrómicos circulantes. La pulpa roja en los ratones tratados con Lenti-�A solo se expandió de forma moderada, en comparación con la expansión evidente de la pulpa roja en los ratones THAL de control.
Los ratones THAL no tratados mostraron eritropoyesis extramedular significativa en el hígado, mientras que en los ratones THAL corregidos, la eritropoyesis extramedular fue de suave a moderada. No se observó eritropoyesis en los hígados de los ratones B6 normales. El tintado de hierro de Perls mostró disminución de acumulación de hierro en los receptores de médula transducida por lentivirus [gen de �globina/LCR], proporcionando así evidencia adicional de destrucción reducida de RBCs y eritropoyesis mejorada. El tintado de hierro de Perls se redujo marcadamente en el bazo y fue insignificante en el hígado de los ratones transplantados. En contraste, los ratones THAL tuvieron una acumulación pronunciada de hemosiderina tanto en el bazo como en el hígado. Los ratones B6 normales tuvieron hemosiderina suave solo en el bazo, y el hígado fue negativo.
En resumen, la expresión permanente paneritroide del gen de �-globina humana se observó en todos los ratones THAL transplantados con médula transducida con lentivirus [gen de �-globina/LCR], donde los ratones transplantados mostraron una casi completa corrección de todas las manifestaciones observables de la enfermedad. Estos experimentos demuestran que un vector basado en lentivirus puede repartir un módulo de expresión para la �-globina humana, en donde la expresión de la �-globina humana da por resultado una corrección continua, a largo plazo, de eritropoyesis ineficaz y casi la cura completa del fenotipo talasémico en un modelo de ratón para la �talasemia. Esta corrección fue posible en ausencia de preselección para células transducidas antes del transplante y se asoció con la reconstitución esencialmente completa por células madres genéticamente modificadas que dieron por resultado una expresión pancelular estable, de alto nivel, del gen de �-globina humana en células eritroides. Estos resultados constituyen un significativo avance sobre los resultados obtenidos anteriormente usando sistemas de reparto génico basado en retrovirus. Ejemplo VI: Construcción del Vector de Auto-Inactivación (SIN)
Para mejorar la seguridad, el vector lentiviral descrito en los Ejemplos anteriores se modificó para incluir un elemento aislante en la LTR derecha (3’) como sigue y como se muestra en las Figuras 6-13. Primero, las modificaciones a la LTR 3’ (derecha) del vector se hicieron por subclonación de la LTR 3’ en un plásmido Puc19 usando los sitios Kpn 1 y Eco R1, como se muestra en la Figura 7. Se hizo una deleción de 399 bp en la región U3 de la LTR derecha (desde el sitio Eco RV al sitio Pvu 2). La región R de la LTR 3’ no se alteró. La región U5 se sustituyó con una secuencia poliA ideal por digestión del plásmido de LTR con Hind 3 y Sal 1 (Figura 6). Esto eliminó una pequeña parte de la región R y U5. Esta región de las regiones R y U5 se sustituyó
con la parte final de R y una secuencia poliA ideal, eliminando así la región U5 sin cambiar la región R (Figura 6). El siguiente oligo (OPLB 12/13) se usó para conseguir esta sustitución: 5’-AAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAATGTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGTCGAC-3’ (SEQ ID NO:1) donde AAGCTT es el sitio de restricción Hind 3, GCCTTGAGTGCTTCA es el extremo de la región R, ATGTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG es la secuencia poliA, y GTCGAC denota el sitio de restricción Sal 1.
Los vectores SIN, que contienen un aislante de �-globina de pollo (cHS4), se hicieron por ligado de extremos romos en la deleción U3 EcoRV/Pvu II (véase Figuras 6 y 9). Ejemplos de las secuencias aislantes usadas incluyen un aislante doblete de 250 bp (insertado en la U3 despuntando los sitios Sal 1 y Not 1) (Figura 6), y una versión de 42 bp del aislante (insertado en la deleción U3 usando un oligo (OHPV 460/461) que había manipulado los sitios Cla 1 y Pvu II) (Figura 9). La LTR 3’ modificada se insertó entonces de nuevo en el vector usando el sitio Kpn 1 y despuntando el sitio EcoR1 en el vector al sitio Sal 1 desde el plásmido que contiene la LTR derecha modificada. Se hicieron dos versiones del vector SIN aislado que contiene o bien GFP
o �-globina (véase Figuras 7, 8, 10 y 11). Usando el vector SIN aislado GFP (doblete de 250 bp), se hizo el virus concentrado con un título de 9,5 x 109 TU/ml en células 3T3. La Figura 13c muestra que la sustitución del U5 derecho por una señal poli(A) más fuerte permite la incorporación del aislante cHS4 con una disminución mínima en títulos virales.
Equivalentes
Aunque la invención se ha descrito con referencia a sus realizaciones preferidas, otras realizaciones pueden alcanzar los mismos resultados. Los expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de establecer, usando no más que la experimentación de rutina, numerosos equivalentes a las realizaciones específicas descritas en este documento. Dichos equivalentes se considera que están dentro del alcance la esta invención y se abarcan en las siguientes reivindicaciones.
LISTADO DE SECUENCIA
<110> Genetix Pharmaceuticals, Inc. y Massachusetts Institute of Technology
<120> Vectores Retrovirales Terapéuticos para Terapia Génica
<130> IOI-028PC
<150> 60/433321
<151> 2002-12-13
<150> 60/475822
<151> 2003-06-04
<150> 60/513312
<151> 2003-10-21
<160> 2
<170> FastSEQ para la Versión Windows 4.0
<210> 1
<211> 50
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador de ADN
<400> 1 aagcttgcct tgagtgcttc aatgtgtgtg ttggtttttt gtgtgtcgac
<210> 2
<211> 61
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador de ADN
<400> 2
5
atcgatttgc tgccccctag cgggggaggg acgtaattac atccctgggt ctagacagct 60
g
61

Claims (26)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un vector lentiviral (SIN) de auto-inactivación que comprende: a) una LTR lentiviral izquierda (5’); b) un elemento de exportación retroviral, opcionalmente un elemento de res
    puesta inversa lentiviral (RRE);
    c) un promotor, o parte activa del mismo que tiene actividad promotora, y una región de control de locus (LCR), o parte activa del mismo que tiene actividad LCR, unido de forma operable a un gen de interés; y
    d) una LTR lentiviral derecha (3’) que comprende las siguientes modificaciones 1) la región U3 de la LTR derecha (3’) está modificada para incluir al menos un elemento aislante y 2) la región U5 de la LTR derecha (3’) está modificada para sustituir toda o una parte de la región con una secuencia poli(A) ideal.
  2. 2.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 1, en donde el lentivirus es VIH.
  3. 3.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 1, en donde el gen de interés es un gen que codifica una proteína de anti-falciformación o un gen de globina.
  4. 4.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 3, en donde el gen de globina es �-globina o �-globina humana.
  5. 5.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 4, en donde el gen de �-globina humana se selecciona de un gen de �-globina humana natural, un gen de �globina humana eliminado que comprende una o más deleciones de las secuencias del intrón, y un gen de �-globina humana mutado que codifica al menos un residuo aminoácido de anti-falciformación.
  6. 6. El vector de auto-inactivación según la reivindicación 5, en donde el gen de
    �-globina humana mutado comprende un residuo aminoácido de anti-falciformación derivado de la �-globina humana o de la �-globina humana.
  7. 7.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 5, en donde el gen de �-globina humana es el gen de �A-globina humana que codifica una mutación treonina a glutamina en el codón 87 (�A-T87Q) o un gen de �A-globina humana.
  8. 8.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 1, en donde el promotor comprende el promotor de �-globina humana, o una parte del mismo que tiene actividad promotora.
  9. 9.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 1, en donde la LCR comprende la LCR de �-globina humana, o una parte de la misma que tiene actividad LCR.
  10. 10. El vector de auto-inactivación según la reivindicación 1, que comprende al menos uno de los siguientes elementos:
    a) un tracto de polipurina central/solapa de ADN (cPPT/FLAP);
    b) el promotor de la LTR 5’ se sustituye con un promotor heterólogo; y
    c) el elemento de exportación retroviral es un elemento de respuesta inversa
    lentiviral (RRE).
  11. 11.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 10, en donde el cPPT/FLAP es de VIH-1.
  12. 12.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 10, en donde el promotor heterólogo es un promotor citomegalovirus (CMV).
  13. 13.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 1, que comprende además un módulo de ácido nucleico que comprende un gen suicida unido de forma operable a un promotor o un gen para la selección in vivo de la célula.
  14. 14.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 13, en donde el gen suicida es HSV timidina quinasa (HSV-Tk).
  15. 15.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 13, en donde el gen para la selección in vivo es metilguanina metiltransferasa (MGMT).
  16. 16.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 1, en donde el elemento aislante comprende un aislante a partir de un locus de �-globina.
  17. 17.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 16, en donde el elemento aislante comprende HS4 de pollo.
  18. 18.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 1, en donde el elemento aislante comprende el elemento aislante de 42 bp representado en la Figura 12 (SEQ ID NO:2).
  19. 19.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 1, para el uso en terapia génica.
  20. 20.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 19, en donde la terapia génica es para el tratamiento de una hemoglobinopatía.
  21. 21.
    El vector de auto-inactivación según la reivindicación 20, en donde la hemoglobinopatía es talasemia o anemia falciforme (SCD).
  22. 22.
    Una célula huésped que comprende el vector de auto-inactivación según la reivindicación 1, en donde si la célula huésped es una célula madre embrionaria, no es humana.
  23. 23. La célula huésped según la reivindicación 22, en donde la célula es una cé5 lula madre embrionaria, una célula madre somática o una célula troncal.
  24. 24.
    La célula huésped según la reivindicación 23, en donde la célula es un eritrocito.
  25. 25.
    Un método para alcanzar la expresión específica eritroide de un gen de interés, que comprende introducir in vitro un vector de auto-inactivación como se define
    10 en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 en una célula de eritrocito o un precursor de la misma, capaz de expresar el vector, y permitiendo la expresión del gen de interés.
  26. 26. Un vector lentiviral de auto-inactivación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para usar en el tratamiento de un proceso hemoglobinopático.
    15 27. El uso de un vector lentiviral de auto-inactivación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 en la fabricación de un medicamento para tratar un proceso hemoglobinopático.
ES03813391T 2002-12-13 2003-12-11 Vectores retrovirales terapeuticos para terapia genica. Expired - Lifetime ES2348868T3 (es)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43332102P 2002-12-13 2002-12-13
US433321P 2002-12-13
US47582203P 2003-06-04 2003-06-04
US475822P 2003-06-04
US51331203P 2003-10-21 2003-10-21
US513312P 2003-10-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2348868T3 true ES2348868T3 (es) 2010-12-16

Family

ID=32600914

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03813391T Expired - Lifetime ES2348868T3 (es) 2002-12-13 2003-12-11 Vectores retrovirales terapeuticos para terapia genica.

Country Status (9)

Country Link
US (6) US7901671B2 (es)
EP (1) EP1581056B1 (es)
AT (1) ATE474460T1 (es)
AU (1) AU2003296958A1 (es)
CY (1) CY1112327T1 (es)
DE (1) DE60333487D1 (es)
ES (1) ES2348868T3 (es)
HK (1) HK1082379A1 (es)
WO (1) WO2004054512A2 (es)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004054512A2 (en) 2002-12-13 2004-07-01 Genetix Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic retroviral vectors for gene therapy
WO2007109583A2 (en) 2006-03-17 2007-09-27 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and methods for prevention or treatment of neoplastic disease in a mammalian subject
US20090144270A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-04 Jack Thacher Leonard Methods for the prevention of diseases
GB0812191D0 (en) * 2008-07-03 2008-08-13 Greater Glasgow Health Board Modified cells and methods of monitoring their viability
ES2631458T3 (es) 2010-03-04 2017-08-31 Interna Technologies B.V. Molécula de ARNmi definida por su fuente y sus usos terapéuticos en el cáncer asociado a la EMT
CA2804599C (en) 2010-07-06 2023-01-31 Interna Technologies Bv Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway
EP2474617A1 (en) 2011-01-11 2012-07-11 InteRNA Technologies BV Mir for treating neo-angiogenesis
TR201819015T4 (tr) 2011-06-10 2019-01-21 Bluebird Bio Inc Adrenolökodi̇strofi̇ ve adrenomi̇yelonöropati̇ i̇çi̇n gen terapi̇ vektörleri̇
KR101958612B1 (ko) * 2011-09-23 2019-03-14 블루버드 바이오, 인코포레이티드. 개선된 유전자 치료 방법
EA032699B1 (ru) 2011-09-30 2019-07-31 Блубёрд Био, Инк. Способ повышения эффективности трансдукции кроветворных клеток лентивирусом
ES2886147T3 (es) 2011-12-22 2021-12-16 Interna Tech B V MiARN para el tratamiento del cáncer de cabeza y de cuello
US20150118265A1 (en) * 2012-03-13 2015-04-30 Anthrogenesis Corporation Modified erythrocyte precursor cells and uses thereof
JP2015529466A (ja) * 2012-09-14 2015-10-08 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 鎌状赤血球症の幹細胞遺伝子治療のためのレンチウイルスベクター
WO2014072357A1 (en) 2012-11-06 2014-05-15 Interna Technologies B.V. Combination for use in treating diseases or conditions associated with melanoma, or treating diseases or conditions associated with activated b-raf pathway
BR112015011995B1 (pt) 2012-11-27 2023-02-07 Children's Medical Center Corporation Método para a produção de uma célula progenitora hematopoiética tendo bcl11a diminuído ou para aumentar seus níveis de hemoglobina fetal, composição e uso das mesmas
BR112016011195A2 (pt) 2013-11-18 2017-09-19 Rubius Therapeutics Inc Células eritroides enucleadas e seus métodos de fabricação, composição farmacêutica e seu uso, uso de uma população de células eritroides, biorreator, mistura de células e dispositivo médico
KR20220150986A (ko) 2014-04-01 2022-11-11 루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨. 면역조절을 위한 방법 및 조성물
JP6514717B2 (ja) 2014-04-25 2019-05-15 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 異常ヘモグロビン症を治療するための組成物および方法
ES2763248T5 (es) * 2014-08-26 2023-06-22 Univ Leland Stanford Junior Injerto de células madre con una combinación de un agente dirigido a las células madre y modulación de señalización inmunoreguladora
KR20240123409A (ko) 2014-09-07 2024-08-13 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. 유전자 편집 항-바이러스 전달 벡터 면역 반응을 약화시키기 위한 방법 및 조성물
US10543257B2 (en) 2014-09-11 2020-01-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Lentiviral vector for treating hemoglobin disorders
EP3838296A1 (en) * 2015-01-21 2021-06-23 Cornell University Viral vectors for prophylaxis and therapy of hemoglobinopathies
US11572543B2 (en) 2015-05-08 2023-02-07 The Children's Medical Center. Corporation Targeting BCL11A enhancer functional regions for fetal hemoglobin reinduction
GB201600328D0 (en) 2016-01-08 2016-02-24 Univ Oslo Hf Anti-CD37 chimeric antigen receptors and immune cells expressing them
CN108883136A (zh) 2016-02-12 2018-11-23 蓝鸟生物公司 Vcn增强子组合物及其使用方法
RU2021103425A (ru) 2016-02-12 2021-02-25 Блубёрд Био, Инк. Композиции, повышающие число копий вектора (чкв), и способы их применения
US11446398B2 (en) 2016-04-11 2022-09-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
EP4035659A1 (en) 2016-11-29 2022-08-03 PureTech LYT, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
US11976293B2 (en) 2016-12-05 2024-05-07 The Regents Of The University Of California Optimized lentiviral vector for stem cell gene therapy of hemoglobinopathies
US20180193482A1 (en) 2017-01-07 2018-07-12 Selecta Biosciences, Inc. Patterned dosing of immunosuppressants coupled to synthetic nanocarriers
EP3574104A1 (en) 2017-01-30 2019-12-04 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant virus vectors for the treatment of glycogen storage disease
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
US11261441B2 (en) 2017-03-29 2022-03-01 Bluebird Bio, Inc. Vectors and compositions for treating hemoglobinopathies
WO2018218135A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 The Children's Medical Center Corporation Bcl11a guide delivery
WO2019056015A2 (en) 2017-09-18 2019-03-21 Children's Hospital Medical Center STRONG ISOLATOR AND ITS USES IN GENE ADMINISTRATION
CN111542336A (zh) 2017-10-13 2020-08-14 西莱克塔生物科技公司 用于减弱抗病毒转移载体igm应答的方法和组合物
JP2021501594A (ja) 2017-11-03 2021-01-21 インテアールエヌエー テクノロジーズ ビー．ヴイ．ＩｎｔｅＲＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｂ．Ｖ． ニューロンの欠損に関連する状態及び／又は疾患を処置及び／又は診断するため、或いはニューロンの再生／発生のための、ｍｉＲＮＡ分子、等価物、アンタゴミル、又はそれらの供給源
CN112384204B (zh) 2018-02-26 2023-03-14 安托瑞斯公司 致耐受性脂质体及其使用方法
US11344008B1 (en) * 2018-03-11 2022-05-31 Hai Xing Chen Production of human DNaseI in erythrocytes of transgenic non-human mammal using erythroid-specific promoter
WO2019241315A1 (en) 2018-06-12 2019-12-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
US20210386788A1 (en) 2018-10-24 2021-12-16 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
WO2020171889A1 (en) 2019-02-19 2020-08-27 University Of Rochester Blocking lipid accumulation or inflammation in thyroid eye disease
EP3935159A1 (en) 2019-03-08 2022-01-12 Obsidian Therapeutics, Inc. Human carbonic anhydrase 2 compositions and methods for tunable regulation
US20200325241A1 (en) 2019-04-11 2020-10-15 Massachusetts Institute Of Technology Novel chimeric antigen receptors and libraries
JP2022531201A (ja) 2019-04-28 2022-07-06 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド ウイルス導入ベクターに対する既存の免疫を伴う対象の処置のための方法
EP3966227A1 (en) 2019-05-07 2022-03-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation
CN114127305A (zh) 2019-05-23 2022-03-01 麻省理工学院 经由逆转录病毒表面展示的配体发现和基因递送
JP2022534741A (ja) 2019-05-28 2022-08-03 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド 減弱化された抗ウイルス導入ベクター免疫応答のための方法および組成物
US20230092895A1 (en) 2019-08-30 2023-03-23 Obsidian Therapeutics, Inc. Tandem cd19 car-based compositions and methods for immunotherapy
WO2021046451A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
CN113046392B (zh) * 2019-12-27 2023-04-07 深圳市禾沐基因生物技术有限责任公司 治疗β-球蛋白功能缺失的重组慢病毒载体及制备方法和应用
CA3217862A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Radius Pharmaceuticals, Inc. Animal model having homologous recombination of mouse pth1 receptor
AU2022301302A1 (en) 2021-07-01 2024-01-25 Indapta Therapeutics, Inc. Engineered natural killer (nk) cells and related methods
WO2023003844A1 (en) 2021-07-19 2023-01-26 2Seventy Bio, Inc. Vector manufacturing processes
AU2022325231A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions
WO2023019225A2 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions
EP4384544A1 (en) 2021-08-11 2024-06-19 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy
IL310691A (en) 2021-08-11 2024-04-01 Sana Biotechnology Inc Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy
EP4404956A1 (en) 2021-09-21 2024-07-31 Oslo Universitetssykehus HF Binding proteins for terminal deoxynucleotidyl transferase (tdt)
US20230141563A1 (en) 2021-10-12 2023-05-11 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses
WO2023114918A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd Antisense transfer vectors and methods of use thereof
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023158836A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered cd47 proteins and uses thereof
US20230357437A1 (en) 2022-03-09 2023-11-09 Selecta Biosciences, Inc. Immunosuppressants in combination with anti-igm agents and related dosing
WO2023173123A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells and compositions and uses thereof
CN114457119B (zh) * 2022-04-11 2022-08-12 中吉智药(南京)生物技术有限公司 慢病毒载体在制备治疗β-地中海贫血药物中的应用
WO2024007020A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Indapta Therapeutics, Inc. Combination of engineered natural killer (nk) cells and antibody therapy and related methods
WO2024026377A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Sana Biotechnology, Inc. Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors
WO2024050450A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Gigamune, Inc. Engineered enveloped vectors and methods of use thereof
WO2024151541A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Sana Biotechnology, Inc. Type-1 diabetes autoimmune mouse

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994023046A1 (en) * 1993-04-07 1994-10-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Dna sequence which acts as a chromatin insulator element to protect expressed genes from cis-acting regulatory sequences in mammalian cells
WO1996009385A1 (en) * 1994-09-19 1996-03-28 Massachusetts Institute Of Technology Anti-sickling beta-globin protein, compositions and methods for treating sickle cell disease
US6046036A (en) * 1996-10-25 2000-04-04 Advanced Research And Technology Institute DNA sequences encoding fusions of DNA repair proteins and uses thereof
US6531123B1 (en) * 1997-05-01 2003-03-11 Lung-Ji Chang Lentiviral vectors
US6136597A (en) * 1997-09-18 2000-10-24 The Salk Institute For Biological Studies RNA export element
WO2000023606A1 (en) * 1998-10-22 2000-04-27 Medical College Of Georgia Institute, Inc. Long terminal repeat, enhancer, and insulator sequences for use in recombinant vectors
AU2002311777A1 (en) * 2001-04-17 2002-10-28 Genetix Pharmaceuticals, Inc. Method of treating arthritis using lentiviral vectors in gene therapy
US20040033604A1 (en) 2001-04-20 2004-02-19 Gary Kobinger Recombinant lentiviral vectors pseudotyped in envelopes containing filovirus binding domains
US20030039636A1 (en) * 2001-05-01 2003-02-27 Genetix Pharmaceuticals, Inc. Novel self-inactivating (SIN) lentiviral vectors
JP2005504539A (ja) * 2001-10-02 2005-02-17 インスティテュット クレイトン ド ラ リシェルシュ 制限発現レンチウイルス性ベクターに関連する方法及び組成物並びにその応用
WO2004054512A2 (en) 2002-12-13 2004-07-01 Genetix Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic retroviral vectors for gene therapy

Also Published As

Publication number Publication date
EP1581056A2 (en) 2005-10-05
US10632212B2 (en) 2020-04-28
US7901671B2 (en) 2011-03-08
WO2004054512A3 (en) 2005-01-06
US20190038775A1 (en) 2019-02-07
HK1082379A1 (en) 2006-06-09
ATE474460T1 (de) 2010-08-15
US20110274669A1 (en) 2011-11-10
US10105451B2 (en) 2018-10-23
US20160022839A1 (en) 2016-01-28
US9068199B2 (en) 2015-06-30
US20120009161A1 (en) 2012-01-12
US20060057725A1 (en) 2006-03-16
US20200368370A1 (en) 2020-11-26
AU2003296958A1 (en) 2004-07-09
CY1112327T1 (el) 2015-12-09
EP1581056A4 (en) 2007-01-17
EP1581056B1 (en) 2010-07-21
DE60333487D1 (de) 2010-09-02
US11701435B2 (en) 2023-07-18
WO2004054512A2 (en) 2004-07-01
AU2003296958A8 (en) 2004-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2348868T3 (es) Vectores retrovirales terapeuticos para terapia genica.
Levasseur et al. Correction of a mouse model of sickle cell disease: lentiviral/antisickling β-globin gene transduction of unmobilized, purified hematopoietic stem cells
ES2747817T3 (es) Una hemoglobina fetal mejorada para la corrección génica de la anemia falciforme
DE68929122T2 (de) Rekombinante Retroviren
US8058061B2 (en) Vector encoding human globin gene and use thereof in treatment of hemoglobinopathies
EP2829285B1 (en) Recombinant lentiviral vector preparation
Scherr et al. Gene transfer into hematopoietic stem cells using lentiviral vectors
DE19856463B4 (de) Retrovirale, mit LCMV pseudotypisierte Hybrid-Vektoren
CA2298892A1 (en) Lentiviral vectors derived from sivagm, methods for their preparation and their use for gene transfer into mammalian cells
DE69614527T2 (de) Retrovirale vektoren aus gefluegel-sarcom-leukoseviren ermoeglichen den transfer von genen in saeugetierzellen und ihre therapeutischen anwendungen
CN107949640A (zh) 含有反向取向人泛素c启动子的逆转录病毒载体
DE102004034461B4 (de) Gentherapie solider Tumore durch retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisierte Vektoren
CZ20032574A3 (cs) Zlepšené podmíněně se replikující vektory pro inhibici virových infekcí
Richard et al. Erythropoietic porphyrias: animal models and update in gene-based therapies
JP2019122371A (ja) Ｈｕｎｔｅｒ症候群の遺伝子治療に使用されるベクタープラスミド、レンチウイルスベクターシステム、細胞、及び、細胞製剤
WO2023081003A1 (en) Constructs comprising tandem microrna-adapted short hairpin rna (shmir) for increasing fetal hemoglobin
Persons et al. Prospects for Gene Therapy of Sickle Cell Disease and Thalassemia
HOLST et al. Hematopoietic Stem Cells
Levasseur Correction of mouse models of sickle cell disease and β-thalassemia using stem cell and genetic-based therapy.
Levasseur Correction of mouse models of sickle cell disease and β-thalassemia using stem cell and genetic-based therapy
Malik et al. Genetically engineered cures: gene therapy for sickle cell disease