EA032699B1 - Способ повышения эффективности трансдукции кроветворных клеток лентивирусом - Google Patents

Способ повышения эффективности трансдукции кроветворных клеток лентивирусом Download PDF

Info

Publication number
EA032699B1
EA032699B1 EA201490627A EA201490627A EA032699B1 EA 032699 B1 EA032699 B1 EA 032699B1 EA 201490627 A EA201490627 A EA 201490627A EA 201490627 A EA201490627 A EA 201490627A EA 032699 B1 EA032699 B1 EA 032699B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
leu
ala
cell
val
Prior art date
Application number
EA201490627A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201490627A1 (ru
Inventor
Гарретт Коллинс Хеффнер
Абрахам Исаак Бассан
Original Assignee
Блубёрд Био, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47996444&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA032699(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Блубёрд Био, Инк. filed Critical Блубёрд Био, Инк.
Publication of EA201490627A1 publication Critical patent/EA201490627A1/ru
Publication of EA032699B1 publication Critical patent/EA032699B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/867—Retroviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/02—Compounds of the arachidonic acid pathway, e.g. prostaglandins, leukotrienes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6072—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses
    • C12N2810/6081—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses rhabdoviridae, e.g. VSV

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

В изобретении предложены способы и композиции для улучшения эффективности трансдукции клеток. В частности, в настоящем изобретении предложены способы и материалы, применимые для безопасного и гарантированного повышения эффективности способов трансдукции клеток, таких как кроветворные стволовые клетки человека (HSC), вирусами и/или вирусными векторами. Композиции и способы применимы при терапевтических показаниях, когда целесообразна генная терапия с использованием кроветворных стволовых клеток.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка, в соответствии с §119(e) Главы 35 Свода Законов США, испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 61/541, 736, поданной 30 сентября 2011 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Комментарий к указанной последовательности
Последовательность, приложенная к настоящей заявке, предоставлена в текстовом формате как замена экземпляру на бумаге, и включена в описание изобретения посредством ссылки. Название файла, содержащего последовательность, -BLBD 006 01WO ST25.txt. Размер файла 30 килобайт, дата создания 27 сентября 2012 г., файл подготовлен с помощью шифровальной файловой системы EFS-Web.
Уровень техники Область техники
Настоящее изобретение относится к способу повышения эффективности трансдукции клеток. В частности, настоящее изобретение обеспечивает способы и материалы, повышающие эффективность трансдукции клеток, таких как кроветворные стволовые клетки человека (ГСК), вирусами и/или векторами, которые могут быть применены в терапевтических целях.
Описание уровня техники
Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) до сих пор не санкционировало продажу ни одного из препаратов для генной терапии человека. На сегодняшний день генная терапия остаётся экспериментальной дисциплиной и не зарекомендовала себя достаточно эффективной в процессе клинических испытаний. С первых клинических испытаний препаратов для генной терапии, начавшихся в 1990 г., значительного прогресса не отмечено. В 1999 г., после смерти 18-летнего Джесси Гелсингера генная терапия была отброшена на шаг назад. Джесси Гелсингер принимал участие в клинических испытаниях препаратов для генной терапии недостаточности орнитинтранскарбамилазы (OTCD). Смерть наступила в результате полиорганной недостаточности, наступившей через 4 дня после начала терапии. Предположительно смерть вызвал интенсивный иммунный ответ на аденовирусный носитель.
Другой серьезный скандал произошел в январе 2003, когда Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов временно приостановило проведение всех клинических испытаний препаратов для генной терапии с применением ретровирусных векторов в кроветворных стволовых клетках. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов пошло на этот шаг, когда была получена информация о том, что у второго ребенка, участвовавшего в испытаниях препаратов для генной терапии во Франции развился лейкемиеподобный синдром. Как этот ребенок, так и другой, у которого развился такой же синдром в августе 2002, успешно проходили лечение с применением генной терапии по поводу X-сцепленного синдрома тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИН, X-SCID). Консультативный комитет по модификатором биологического отклика управления (Biological Response Modifiers Advisory Committee, BRMAC) провел заседание в феврале 2003, для определения возможных мер, которые позволили бы продолжать некоторые клинические испытания с применением генной терапии для лечения заболеваний, опасных для жизни, с достаточной степенью безопасности. В апреле 2003 управление сняло запрет на применение ретровирусных векторов в стволовых кроветворных клетках при проведении испытаний препаратов для генной терапии.
Как бы то ни было, в последнее время несколько групп достигли определенных успехов в применении генной терапии при лечении некоторых серьезных заболеваний. В 2008 британские исследователи из Института Офтальмологии Университетского Колледжа Лондона (the UCL Institute of Ophthalmology) и Центра Биомедицинских исследований Национального НИИ здравоохранения (NIHR) при офтальмологической больнице Мурфилдс (Moorfields Eye Hospital) объявили об успешных клинических испытаниях с применением генной терапии для лечения амавроза Лебера, одного из видов врожденной слепоты. Результаты показали, что экспериментальное лечение безопасно и может улучшить зрение (Maguire et al., N Engl J Med. 358(21):2240 (2008)).
В 2001 г., компания Neurologix, Inc. объявила о положительных результатах второй фазы исследований применения генной терапии на поздней стадии болезни Паркинсона (PD), NLX-P101. У участников исследований, принимавших NLX-P101, отметили статистически значимые и клинически важные улучшения показателей двигательной активности при отсутствии медикаментозного лечения, в сравнении с контрольной группой, получающей лечение посредством плацебо-хирургии. Улучшение было отмечено через месяц после начала исследования, и практически не менялось в течение шести месяцев наблюдения с маскированием критериев оценки. Результаты также показали положительные характеристики безопасности NLX-P101, серьезных побочных эффектов, связанных с применением генной терапии и хирургического вмешательства, зарегистрировано не было. Пациенты, привлеченные к исследованию, страдали болезнью Паркинсона в средней и поздней стадии и не поддавались лечению общеизвестными способами.
В 2009 г. группа французских исследователей привела информацию о том, что применение генной терапии с использованием кроветворных стволовых клеток эффективно в лечении Х-сцепленной адренолейкодистрофии (ALD). Взятые у пациентов аутологичные стволовые клетки откорректировали гене
- 1 032699 тически ex vivo и ввели обратно пациентам, прошедшим миелоаблятивную терапию. За период от 24 до 30 месяцев последующего наблюдения отметили восстановление многих типов клеток: 9-14% гранулоцитов, моноцитов, а также T- и B-лимфоцитов, экспрессирующих ALD-белок. Эти результаты подтверждают, что кроветворные клетки пациентов подверглись трансдукции. Через 14-16 месяцев после введения откорректированных клеток прогрессирующая церебральная демиелинизация у двух пациентов полностью прекратилась.
Недавний прогресс в области генной терапии позволяет надеяться, что пациенты, страдающие от гемоглобинопатий, таких как β-талассемия и серповидноклеточная анемия, смогут получать эффективное лечение благодаря новейшим научным разработкам. Трансплантация кроветворных клеток, модифицированных лентивирусным вектором, несущим ген β-глобина, привела к длительному улучшению в моделях нарушения синтеза и обмена гемоглобина у мышей Imren et at., Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99(22): 14380-14385; Malik et al., Ann NY Acad Sci. 2005; 1054: 238-249; May et al., Nature. 2000; 406(6791): 82-86; Pawliuk et al., Science. 2001;294(5550): 2368-2371), но при этом, зависимость от переливаний крови исчезла лишь в случае одного пациента, страдающего β-талассемией (Cavazzana-Calvo et al., Nature. 2010;467(7313):318-322).
Несмотря на то, что главными преимуществами введения генетически модифицированных аутологичных клеток является минимальный риск возникновения реакции трансплантат против хозяина и необходимости проведения иммуносуппрессивной терапии перед трансплантацией, а также отсутствие необходимости подбора совместимого донора, современные методы лечения сталкиваются по меньшей мере с тремя серьезными проблемами: необходимо проводить токсичную процедуру миелоабляции (Dunbar et al., Hum Gene Ther. 1998;9(17): 2629-2640); современные способы трансдукции могут обеспечить трансдукцию лишь незначительной части кроветворных стволовых клеток (Santoni de Sio and Naldini, Methods Mol Biol. 2009;506:59-70); а также, различные доступные способы селекции in vivo характеризуются недостаточной степенью эффективности и безопасности (Beard et al., J Clin Invest. 2010; 120(7): 2345-2354; Cornetta et al., Cancer Gene Ther. 2006;13(9): 886-895; Milsom et al., Cancer Res. 2008;68(15): 6171-6180). В частности, в случае нарушений, при которых применяется генная терапия с использованием кроветворных стволовых клеток, например, серповидноклеточной анемии, β-талассемии, адренолейкодистрофии и адреномиелонейропатии, ограничения в применении включают, но не ограничиваются недостаточной эффективностью трансдукции стволовых кроветворных клеток или клетокпредшественников, необходимостью проведения токсичной миелосуппрессивной или миелоаблятивной терапии и отсутствием оптимальных способов селекции трансдуцированных клеток in vivo.
Таким образом, в данной области техники возникла необходимость разработать улучшенные способы применения генной терапии и, в частности, способы применения для лечения или профилактики нарушений кроветворения. В настоящем изобретении предложены способы решения основных проблем в данной области техники.
Краткое описание изобретения
В общих чертах, настоящее изобретение обеспечивает способы и композиции, содержащие соединение, которое усиливает сигнальные пути рецептора простагландина EP для повышения эффективности трансдукции. Кроме того, композиции и способы согласно изобретению обеспечивают более безопасные и надежные способы трансдукции клеток, таких как кроветворные стволовые клетки человека, вирусами и/или вирусными векторами. Композиции и способы могут применяться для лечения с помощью генной терапии с использованием кроветворных стволовых клеток при соответствующих терапевтических показаниях.
Согласно различным вариантам реализации настоящее изобретение относится, в частности, к способу повышения эффективности трансдукции клеток, культивируемых с ретровирусом. Указанный способ включает культивирование клеток и ретровируса, содержащей одно или несколько соединений, которые усиливают сигнальные пути рецептора простагландина EP. Согласно одному из вариантов реализации, указанное соединение представляет собой небольшую молекулу.
Согласно одному из вариантов реализации указанные клетки представляют собой клеткипредшественники.
Согласно определенному варианту реализации стволовые клетки или клетки-предшественники выбирают из группы, состоящей из эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плурипотентных стволовых клеток.
Согласно другому варианту реализации стволовые клетки или клетки-предшественники выбирают из группы, состоящей из мезенхимальных стволовых клеток, стволовых кроветворных клеток, стволовых клеток нервной ткани, стволовых клеток сетчатки, стволовых клеток миокарда, стволовых клеток скелетных мышц, стволовых клеток жировой ткани, стволовых клеток хрящевой ткани, стволовых клеток печени, стволовых клеток почек и стволовых клеток поджелудочной железы.
Согласно определенному варианту реализации кроветворные стволовые клетки или клеткипредшественники представляют собой стволовые клетки или кроветворные клетки-предшественники.
Согласно другому варианту реализации указанные клетки выбирают из группы, состоящей из остеобластов, хондроцитов, адипоцитов, клеток скелетных мышц, кардиомиоцитов, нейронов, астроцитов,
- 2 032699 олигодендроцитов, шванновских клеток, клеток сетчатки, клеток роговицы, клеток кожи, моноцитов, макрофагов, нейтрофилов, базофилов, эозинофилов, эритроцитов, мегакариоцитов, дендритных клеток, Т-лимфоцитов, B-лимфоцитов, NK-клеток, клеток желудка, клеток кишечника, гладкомышечных клеток, клеток сосудов, клеток мочевого пузыря, α-клеток поджелудочной железы, β-клеток поджелудочной железы, дельта-клеток поджелудочной железы, гепатоцитов, клеток почек, клеток надпочечников и клеток легких.
Согласно другому определенному варианту реализации указанные клетки представляют собой кроветворные стволовые клетки или кроветворные клетки-предшественники.
Согласно одному из вариантов реализации по меньшей мере 50% стволовых кроветворных клеток или кроветворных клеток-предшественников являются трансдуцированными.
Согласно другому варианту реализации по меньшей мере 75% кроветворных стволовых клеток или кроветворных клеток-предшественников являются трансдуцированными.
Согласно другому варианту реализации по меньшей мере 90% кроветворных стволовых клеток или кроветворных клеток-предшественников являются трансдуцированными.
Согласно определенным вариантам реализации любая из композиций или способов, указанных в настоящей заявке, включает одно или несколько соединений, которые усиливают сигнальные пути рецептора простагландина EP и выбирают из группы, состоящей из PGA2; PGB2; PGD2; PGEp PGE2; PGF2; PGI2; PGH2; PGJ2; а также их предшественников, метаболитов, производных и аналогов.
Согласно определенным вариантам реализации любая из композиций или способов, указанных в настоящей заявке, включает одно или несколько соединений, которые усиливают сигнальные пути рецептора простагландина EP и выбирают из группы, состоящей из 15d-PGJ2; дельта-12-PG.T; 2гидроксигептадекатриеновой кислоты (HHT); тромбоксана A2; тромбоксана B2; илопроста; трепростинила; травопроста; карбопрост трометамина; тафлупроста; латанопроста; биматопроста; унопростон изопропила; клопростенола; эстрофана; суперфана; мизопростола; бутапроста; линолевой кислоты; 13 (s)HODE; LY171883; мидовой кислоты; эйкозатриеновой кислоты; эпоксиэйкозатриеновой кислоты; ONO259; Cay1039; агониста рецептора PGE2; 16,16-диметил PGE2; 19(Р)-гидрокси PGE2; 16,16-диметил PGE2 p-ф-ацетамидобензамидо) фенилового эфира; 11-дезокси-16,16-диметил PGE2; 9-дезокси-9-метилен16,16-диметил PGE2; 9-дезокси-9-метилен PGE2; сульпростона; сериноламида PGE2; метилового эфира PGE2; 16-фенил-тетранор PGE2; 15^)-15-метил PGE2; 15Ш)-15-метил PGE2; BIO; 8-бром-цАМФ; форсколина; ацетоксиметилового эфира 1,2-бис этан-ККН^тетрауксусной кислоты; фендилина; никардипина; нифедипина; пимозида; строфантидина; ланатозида; L-аргинина; нитропруссида натрия; ванадата натрия; брадикинина; мебеверина; флурандренолида; атенолола; пиндолола; габоксадола; оксихинолинкарбоновой кислоты; гидралазина; тиабендазола; бикукуллина; везамикола; перувозида; имипрамина; хлорпропамида; 1,5-пентаметилентетразола; 4-аминопиридина; диазоксида; бенфотиамина; 12метоксидодеценовой кислоты; N-формил-метионил-лейцил-фенилаланина; галламина; IAA 94; и хлортрианизена.
Согласно некоторым вариантам реализации любая из композиций или способов, указанных в настоящей заявке, включает одно или несколько соединений, которые усиливают сигнальные пути рецептора простагландина EP и выбирают из группы, состоящей из простагландина E2(PGE2) или 16,16диметил PGE2.
Согласно другим вариантам реализации, любой из способов, указанных в настоящей заявке, включает культивирование клеток и ретровируса в присутствии ингибитора деацетилазы гистонов (HDAC).
Согласно одному из вариантов реализации, ингибитор деацетилазы гистонов (HDAC) выбирают из группы, состоящей из трихостатина A (TSA), вальпроевой кислоты (VPA), бутирата натрия, субероиланилида гидроксамовой кислоты (SAHA), фенилбутирата натрия, депсипептидов, трапоксина (TPX), пептида 1, содержащего циклическую гидроксамовую кислоту (CHAPI), MS-275, LBH589 и PXD-101.
Согласно различным вариантам реализации любая из композиций или способов, указанных в настоящей заявке, включает ретровирус, который представляет собой лентивирус.
Согласно определенным вариантам реализации любая из композиций или способов, указанных в настоящей заявке, включает ретровирус, который представляет собой вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).
Согласно определенным вариантам реализации любая из композиций или способов, указанных в настоящей заявке, включает ретровирус, псевдотипированный белком G оболочки вируса везикулярного стоматита (VSV-G).
Согласно другим вариантам реализации любой из способов, указанных в настоящей заявке, включает культивирование клеток в присутствии соединения, которое усиливает сигнальные пути рецептора простагландина EP до начала процесса трансдукции.
Согласно определенным вариантам реализации клетки культивируют в присутствии соединения, которое обеспечивает усиление сигнального пути рецептора простагландина EP, в течение по меньшей мере 2 ч.
Согласно другим вариантам реализации клетки культивируют в присутствии соединения, которое обеспечивает усиление сигнального пути рецептора простагландина EP, в течение по меньшей мере 4 ч.
- 3 032699
Согласно определенным вариантам реализации клетки культивируют в присутствии соединения, которое усиливает сигнальные пути рецептора простагландина EP, одновременно с процессом трансдукции.
Согласно другим вариантам реализации клетки культивируют в присутствии соединения, которое обеспечивает усиление сигнального пути рецептора простагландина EP в течение по меньшей мере 24 ч.
Согласно другим вариантам реализации клетки культивируют в присутствии соединения, которое обеспечивает усиление сигнального пути рецептора простагландина EP, в течение по меньшей мере первых 24 ч после начала процесса трансдукции.
Согласно некоторым вариантам реализации клетки культивируют в присутствии соединения, которое обеспечивает усиление сигнального пути рецептора простагландина EP, в течение по меньшей мере первых 48 ч после начала процесса трансдукции.
Согласно определенным вариантам реализации, любая из композиций или способов, указанных в настоящей заявке, включает ретровирус, который содержит вектор, состоящий из: левого (5') длинного концевого повтора (LTR-последовательности) ретровируса; последовательности контроля экспрессии, функционально связанной с геном, представляющим интерес; и правого (3') длинного концевого повтора (LTR-последовательности) ретровируса
Согласно определенным вариантам реализации, любая из композиций или способов, указанных в настоящей заявке, включает ретровирус, который содержит вектор, состоящий из левого (5') длинного концевого повтора (LTR-последовательности) ВИЧ-1; пси-последовательности для упаковки (Ψ+); элемента, связывающегося с белком rev (RRE-структуры); промотора β-глобина и локус контролирующей области (LCR) β-глобина, функционально связанных с геном, представляющим интерес, и правого (3') длинного концевого повтора (LTR-последовательности), включающей: один или несколько инсуляторов или полиадениловой последовательности β-глобина кролика (r[!gpA).
Согласно различным вариантам реализации, кроветворные стволовые клетки или клеткипредшественники вводятся в организм пациента, страдающего от гемоглобинопатий.
Согласно различным определенным вариантам реализации, гемоглобинопатия представляет собой β-талассемию или серповидноклеточную анемию.
Согласно определенным вариантам реализации, любая из композиций или способов, указанных в настоящей заявке, включает ретровирус, состоящий из левого (5') длинного концевого повтора (LTRпоследовательности) ВИЧ-1; пси-последовательности для упаковки (Ψ+); элемента, связывающегося с белком rev (RRE-структуры); промотор MND (синтетического промотора, содержащего область U3 длинного концевого повтора (LTR-последовательности) вируса мышиного лейкоза Молони (МоМмкл V) и энхансер вируса миелопролиферативной саркомы мышей), функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим полипептид ABCD1 человека; правого (3') длинного концевого повтора (LTRпоследовательности) ВИЧ-1 и полиадениловой последовательности β-глобина кролика (r[!gpA).
Согласно различным вариантам реализации стволовые кроветворные клетки или клеткипредшественники вводят пациенту, страдающему адренолейкодистрофией или адреномиелонейропатией.
Согласно различным вариантам реализации ретровирус представляет собой репликативнодефектный вирус.
Краткое описание чертежей
Чертеж иллюстрирует результаты определения соединений, стимулирующих трансдукцию клеток CD34+. Клетки подвергли процессу оттаивания и предварительно стимулировали фактором стволовых клеток (SCF), тромбопоэтином (TPO), белком FltL и интерлейкином-3 (IL3), а затем подвергли трансдукции GFP+ лентивирусом (содержащим зеленый флуоресцентный белок). Кроме того, клетки подвергли воздействию растворимых факторов в высокой, средней и низкой концентрации (см. табл. 1) в процессе предварительной стимуляции (0-24 ч), либо в процессе трансдукции (24-48 ч). Затем клетки промыли и культивировали в течение приблизительно 1 недели, после чего исследовали с помощью проточной цитометрии. Затем определили количество GFP+ клеток и иллюстрировали его на тепловой карте (двухмерной цветовой карте). Серые области соответствуют приблизительно 45%-ному количеству трансдуцированных клеток, при динамическом диапазоне от 0% (черные области) до -92% (белые области).
Краткое описание идентификаторов последовательностей
SEQ ID NO: 1 описывает полинуклеотидную последовательность кДНК α-глобина человека
SEQ ID NO: 2 описывает аминокислотную последовательность полипептидной цепи α-глобина человека
SEQ ID NO: 3 описывает аминокислотную последовательность полипептидной цепи α-глобина мыши
SEQ ID NO: 4 описывает аминокислотную последовательность полипептидной цепи α-глобина крысы
SEQ ID NO: 5 описывает полинуклеотидную последовательность кДНК β-глобина человека
SEQ ID NO: 6 описывает аминокислотную последовательность полипептидной цепи β-глобина человека
- 4 032699
SEQ ID NO: 7 описывает аминокислотную последовательность мутантной полипептидной цепи βглобина человека
SEQ ID NO: 8 описывает аминокислотную последовательность полипептидной цепи β-глобина мыши
SEQ ID NO: 9 описывает аминокислотную последовательность полипептидной цепи β-глобина крысы
SEQ ID NO: 10 описывает полинуклеотидную последовательность кДНК γ-глобина человека
SEQ ID NO: 11 описывает аминокислотную последовательность полипептидной цепи γ-глобина человека
SEQ ID NO: 12 описывает аминокислотную последовательность полипептидной цепи γ-глобина мыши
SEQ ID NO: 13 описывает аминокислотную последовательность полипептидной цепи γ-глобина крысы
SEQ ID NO: 14 описывает полинуклеотидную последовательность кДНК дельта-глобина человека
SEQ ID NO: 15 описывает аминокислотную последовательность полипептидной цепи дельтаглобина человека
SEQ ID NO: 16 далее описывает последовательность кДНК, кодирующую полинуклеотид ACBD1 SEQ ID NO: 17 далее описывает последовательность кДНК, кодирующую полинуклеотид ACBD1 SEQ ID NO: 18 далее описывает аминокислотную последовательность полипептида ACBD1
Подробное описание изобретения
A. Краткое описание
Настоящее изобретение относится к усовершенствованным композициям, применяемым в генной терапии для лечения, профилактики или улучшения течения генетических нарушений. Одной из важных задач генной терапии является повышение эффективности трансдукции клеток, содержащих гены, которые будут введены в организм субъекта, в условиях, когда откорректированные клетки не обладают естественным преимуществом при отборе перед нетрансдуцированными клетками.
Настоящее изобретение, в частности, основывается на неожиданно полученной информации о том, что новейшие способы трансдукции клеток согласно изобретению могут применяться для получения большего количества лечебных или откорректированных клеток in vitro, ex vivo или in vivo и соответственно повышения эффективности генной терапии. Не ограничиваясь какой-либо определенной теорией, настоящее изобретение, в частности, предполагает, что благодаря повышению эффективности трансдукции больше клеток становятся откорректированными и, таким образом, способы проведения генной терапии согласно настоящему изобретению требуют введения меньшего количества клеток для обеспечения лечебного, профилактического эффекта или для улучшения течения нарушений у пациентов, подвергающихся генной терапии. Кроме того, так как пациенту вводится большее количество трансдуцированных клеток, для получения лечебного, профилактического эффекта или для улучшения течения нарушений может отпасть необходимость в применении миелосуппрессивной или миелоаблятивной терапии.
В соответствии с этим, настоящее изобретение удовлетворяет клиническую потребность повышения эффективности генной терапии при лечении генетических заболеваний, ввиду того, что большее число лечебных клеток из популяции трансдуцированных клеток могут быть введены пациенту для достижения лечебного, профилактического эффекта или для улучшения течения нарушения. В частности, изобретение относится к неожиданно эффективным способам трансдукции клеток, к векторам и генномодифицированным клеткам, способствующим получению желаемых клинических эффектов при применении генной терапии.
Если не указано иначе, настоящее изобретение относится к общепринятым способам, применяемым в молекулярной биологии и в технологии рекомбинантных ДНК в рамках данных областей знаний, некоторые из которых описаны в настоящей заявке для иллюстрации. Указанные способы и технологии подробно описаны в соответствующих источниках. См., например, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, ed., 1984).
Содержание всех указанных публикаций, патентов и патентных заявок полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
B. Термины (определения)
Если не указано иначе, все технические и научные термины в настоящей заявке имеют значение, принятое средними специалистами в данной области техники. В рамках описания настоящего изобретения, ниже определены следующие термины.
В настоящей заявке термин ретровирус относится к РНК-содержащему вирусу, который с помощью обратной транскрипции копирует свою геномную РНК в виде двухцепочечной цепи линейной ДНК
- 5 032699 и затем ковалентно внедряет её в геном клетки-хозяина. Ретровирусы традиционно используются как средства внедрения генов (Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). Как только вирус внедрился в геном клетки-хозяина, его называют «провирусом». Провирус служит матрицей для РНК-полимеразы II и обусловливает экспрессию молекул РНК, кодирующих структурные белки и ферменты, необходимые для репродукции новых вирусных частиц.
Типичные ретровирусы включают, но не ограничиваются, вирусом мышиного лейкоза Молони (ММмкл V), вирусом мышиной саркомы Молони (MoMSV), вирусом саркомы мышей Харви (HaMuSV), вирусом опухоли молочной железы мышей (MmkMTV), вирусом лейкемии гиббонов (GaLV), вирусом лейкемии кошачьих (FLV), спумавирусом, вирусом лейкемии мышей Френда, вирусом стволовых клеток мышей (MSCV), вирусом саркомы Рауса (RSV) и лентивирусом.
В настоящей заявке термин лентивирус относится к группе (или роду) сложных (комплексных) ретровирусов. Типичные ретровирусы включают, но не ограничиваются, ВИЧ (вирусом иммунодефицита человека, в том числе ВИЧ-1 и ВИЧ-2); вирусом висна-мэди (VMV); вирусом козьего артритаэнцефалита (CAEV); вирусом инфекционной анемии лошадей (EIAV); вирусом иммунодефицита кошачьих (FIV); вирусом иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV) и вирусом иммунодефицита обезьян (SIV). Согласно одному из вариантов реализации, предпочтительны основные кодирующие последовательности векторов-производных ВИЧ (например, цис-действующие элементы цепи ВИЧ).
В процессе реализации настоящего изобретения могут применяться ретровирусные и, в частности, лентивирусные векторы. В соответствии с этим термины ретровирус или ретровирусный вектор в настоящей заявке также включают лентивирус или лентивирусный вектор соответственно.
Согласно настоящей заявке термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую молекулу нуклеиновой кислоты. Как правило, переносимая молекулярная кислота связана, то есть, вставлена в молекулу нуклеиновой кислоты вектора. Вектор может содержать последовательности, опосредующие самостоятельную репликацию в клетке, либо последовательности, позволяющие нуклеиновой кислоте, представляющей интерес, внедряться в ДНК клетки-хозяина. Применимые векторы, например, содержат плазмиды (например, ДНК-содержащие или РНК-содержащие плазмиды), транспозоны, космиды, искусственные бактериальные хромосомы и вирусные векторы. Применимые вирусные векторы содержат, например, репликативно-дефектные ретровирусы и лентивирусы.
Как будет очевидно специалистам в данной области техники, термин вирусный вектор широко применяется для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты (например, плазмиды-переносчика), которая содержит элементы нуклеиновой кислоты вирусного происхождения, как правило, обеспечивающие перенос молекулы нуклеиновой кислоты или интеграцию в геном клетки, либо для обозначения вирусной частицы, опосредующей перенос нуклеиновой кислоты. Как правило, вирусные частицы содержат различные компоненты вируса, а иногда и компоненты клетки-хозяина, помимо нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот).
Термин вирусный вектор может относиться к вирусу или вирусной частице, способной переносить нуклеиновую кислоту в клетку, либо к самой переносимой нуклеиновой кислоте. Вирусные векторы и плазмиды-переносчики содержат структурные и/или функциональные генетические элементы преимущественно вирусного происхождения. Термин ретровирусный вектор относится к вирусному вектору или плазмиде, содержащей структурные и функциональные элементы полностью или частично, преимущественно ретровирусного происхождения. Термин лентивирусный вектор относится к вирусному вектору или плазмиде, содержащей структурные и функциональные элементы полностью или частично, включая LTR-последовательности, преимущественно лентивирусного происхождения. Термин гибрид относится к вектору, LTR-последовательности или другой нуклеиновой кислоте, содержащей как ретровирусные, например лентивирусные последовательности, так и вирусные последовательности не лентивирусного происхождения. Согласно одному из вариантов реализации гибридный вектор относится к вектору или плазмиде-переносчику, содержащей ретровирусные, например, лентивирусные последовательности, обеспечивающие обратную транскрипцию, репликацию, интеграцию и/или упаковку.
Согласно определенным вариантам реализации термины лентивирусный вектор, лентивирусный экспрессионный вектор могут относиться к лентивирусным плазмидам-переносчикам и/или инфекционным лентивирусным частицам. Следует понимать, что ссылки на такие элементы, как сайты встраивания, промоторы, регулирующие элементы, гетерологичные нуклеиновые кислоты и т.п., в настоящей заявке подразумевают, что последовательности таких элементов присутствуют в форме РНК в лентивирусных частицах согласно изобретению, и в форме ДНК в ДНК-содержащих плазмидах согласно изобретению.
На каждом конце провируса присутствуют структуры, называемые длинными концевыми повторами или LTR-последовательностями. Термин длинный концевой повтор (LTRпоследовательность) относится к доменам комплементарных пар оснований на концах ретровирусных ДНК, представляющим собой в контексте природных последовательностей непосредственные повторы, которые содержат области U3, R и U5. LTR-последовательности, как правило, выполняют основные функции в процессе экспрессии ретровирусных генов (например, в процессе индукции, инициации и полиаденилирования генных транскриптов), а также в процессе репликации вируса. LTR
- 6 032699 последовательность содержит многочисленные регулирующие области, включающие элементы регуляции на уровне транскрипции, сигналы полиаденилирования и последовательности, необходимые для репликации и интеграции вирусного генома. Вирусные LTR-последовательности состоят из трёх областей: U3, R и U5. Область U3 содержит энхансерные и промоторные элементы. Область U5 представляет собой последовательность между участком связывания праймера и областью R, и содержит сайт полиаденилирования. Область R (repeat -повтор) находится между областями U3 и U5. LTR-последовательность состоит из областей U3, R и U5 и присутствует как на 5'-, так и на З'-конце вирусного генома. Непосредственно к 5'-концу LTR-последовательности прилегают последовательности, необходимые для обратной транскрипции генома (участок связывания тРНК-праймера) и для эффективной упаковки вирусной РНК в частицы (Psi-последовательность).
В настоящей заявке термин сигнал упаковки или последовательность упаковки относится к последовательностям в составе ретровирусного генома, необходимым для вставки вирусной РНК в вирусный капсид или частицу, см., например, Clever et al., 1995. J. of Virology, vol. 69, No. 4; p. 2101-2109. Многие ретровирусные векторы используют минимальный сигнал упаковки (обозначаемый также как psi [Ψ] или [Ψ+] последовательность), необходимый для капсидирования вирусного генома. Таким образом, в настоящей заявке термины последовательность упаковки, сигнал упаковки, psi и символ Ψ применяются в отношении некодирующей последовательности, необходимой для капсидирования ретровирусных цепочек РНК в процессе формирования вирусной частицы.
Согласно различным вариантам реализации векторы содержат модифицированные 5'-концевые и/или 3'-концевые LTR-последовательности. 3'-концевые LTR-последовательности часто подвергаются модификации для обеспечения безопасности лентивирусных или ретровирусных систем путём достижения репликативной дефектности вирусов. В настоящей заявке термин репликативно дефектный относится к вирусу, не способному к полной, эффективной репликации таким образом, что образуются неинфекционные вирионы (например, репликативно-дефектные дочерние лентивирусы). Термин репликативно-компетентный относится к вирусу дикого типа или к мутантному вирусу, способному к репликации, таким образом, что в результате репликации вируса образуются инфекционные вирионы (например, репликативно-компетентные дочерние лентивирусы).
Самоинактивирующиеся (SIN) векторы относятся к репликативно-дефектным векторам, например, ретровирусным или лентивирусным векторам, правые (3'-концевые) энхансерные и промоторные элементы LTR-последовательности которых, называемые также областью U3, подвергаются модификации (например, посредством делеции или замещения) для предотвращения вирусной транскрипции после первого цикла вирусной репликации. Это происходит ввиду того, что 3'-концевая U3 область LTRпоследовательности служит матрицей для левой (5'-концевой) области U3 LTR-последовательности в процессе вирусной репликации и, таким образом, вирусный транскрипт не может быть получен из-за отсутствия энхансерного и промоторного элемента области U3. Согласно другому варианту реализации изобретения 3'-концевая LTR-последовательность модифицируется таким образом, что область U5 замещается, например, гетерологичной или искусственной поли-A последовательностью, одним или несколькими инсуляторными элементами и/или индуцибельным промотором. Следует отметить, что модификации LTR-последовательностей, такие как 3'-концевых LTR-последовательностей, 5'концевых LTRпоследовательностей или и тех, и других, также включены в объем настоящего изобретения.
Для повышения уровня безопасности область U3 5'-концевой LTR-последовательности замещается гетерологичным промотором, запускающим транскрипцию вирусного генома в процессе репликации вирусных частиц. Примеры применимых гетерологичных промоторов включают, например, промоторы вируса обезьян 40 (вируса SV40) (например, ранние или поздние), цитомегаловируса (CMV) (например, немедленно-ранние), вируса мышиного лейкоза Молони (МоМЛ V), вируса саркомы Рауса (RSV) и вируса простого герпеса (HSV) (тимидинкиназу). Типичные промоторы способны поддерживать высокий уровень транскрипции независимо от транс-действующих транскрипционных факторов. Такое замещение понижает вероятность рекомбинации с получением репликативно-компетентных вирусов, так как в системе репликации вирусов отсутствует полная последовательность области U3. Согласно определенным вариантам реализации гетерологичный промотор может быть индуцибельным, таким образом, что транскрипция всего вирусного генома или его части может происходить только в присутствии одного или нескольких факторов индукции. Факторы индукции включают, но не ограничиваются одним или несколькими химическими соединениями или физиологическими условиями, например, температурой или кислотностью, в которых культивируются клетки.
Согласно некоторым вариантам реализации вирусные векторы содержат TAR-элемент. Термин TAR относится к генетическому элементу ответа на трансактивацию, расположенному в области R лентивирусных (например, ВИЧ) LTR-последовательностей. Этот элемент взаимодействует с лентивирусными трансдействующими транскрипционными факторами (tat), повышая уровень вирусной репликации. Тем не менее, согласно вариантам реализации, в которых область U3 5'-концевой LTRпоследовательности замещается гетерологичным промоторам, этот элемент не является необходимым.
Область R относится к области ретровирусной LTR-последовательности между кэп-структурой (кэп-группировкой, то есть, областью начала транскрипции) и началом поли-A последовательности. Об
- 7 032699 ласть R также определяется расположенными непосредственно по ее концам областями U3 и U5. Область R участвует в процессе обратной транскрипции, позволяя переносить образующуюся ДНК из одной области генома в другую.
В настоящей заявке термин ДНК-флэп элемент относится к нуклеиновой кислоте, последовательность которой включает центральный полипуриновый тракт и центральную терминирующую последовательность (сРРТ и CTS) ретровируса, например, ВИЧ-1 или ВИЧ-2. Применимые ДНК-флэп элементы описаны в патенте США № 6682907 и у Zennou, et al., 2000, Cell, 101: 173. В процессе обратной транскрипции ВИЧ-1 центральная инициация «плус-цепи» ДНК в области центрального полипуринового тракта (сРРТ) и центральная терминация в области центральной терминирующей последовательности (CTS) приводят к формированию трехцепочечной структуры ДНК: центрального ДНК-флэп элемента. Не ограничиваясь существующими теориями, ДНК-флэп элемент может быть цис-действующим фактором импорта лентивирусного генома в ядро и/или увеличить титр вируса. Согласно определенным вариантам реализации, основная кодирующая последовательность ретровирусного или лентивирусного вектора содержит один или несколько ДНК-флэп элементов, расположенных против хода или по ходу транскрипции гетерологических генов вектора, представляющих интерес. Например, согласно определенным вариантам реализации, плазмида-переносчик содержит ДНК-флэп элемент. Согласно одному из вариантов реализации, вектор согласно изобретению содержит ДНК-флэп элемент ВИЧ-1.
Согласно одному из вариантов реализации ретровирусные или лентивирусные векторыпереносчики содержат один или несколько элементов экспорта. Термин элемент экспорта относится к цис-действующему посттранскрипционному регуляторному элементу, регулирующему транспорт РНКтранскрипта из ядра клетки в цитоплазму. Примеры элементов экспорта РНК включают, но не ограничиваются элементом, связывающимся с белком rev вируса иммунодефицита человека (RRE) (см., например, Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053; и Cullen et al., 1991. Cell 58: 423), и посттранскрипционным регуляторным элементом вируса гепатита B (HPRE). Как правило, элемент экспорта РНК расположен с 3'-конца нетранслируемой области (UTR) гена и может присутствовать в одной или нескольких копиях.
Согласно определенным вариантам реализации уровень экспрессии гетерологичных последовательностей в вирусных векторах повышается с помощью вставки в векторы посттранскрипционных регуляторных элементов, эффективных поли-A последовательностей и, при необходимости, сигналов терминации транскрипции. Множество посттранскрипционных регуляторных элементов могут повысить экспрессию гетерологичных нуклеиновых кислот, например, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886), посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита B (HPRE) (Huang and Yen, 1995, Mol. Cell. Biol., 5:3864) и т.п. (Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766). Согласно определенным вариантам реализации векторы согласно изобретению не содержат посттранскрипционные регуляторные элементы, такие как WPRE или HPRE, потому что в некоторых случаях эти элементы повышают риск трансформации клеток и/или не повышают количество транскрипта иРНК и стабильность иРНК в существенной степени.
Поэтому согласно некоторым вариантам реализации векторы согласно изобретению не содержат WPRE или HPRE как дополнительные факторы безопасности.
Элементы, опосредующие эффективную терминацию и полиаденилирование транскриптов гетерологичных нуклеиновых кислот, повышают экспрессию гетерологичных генов. Сигналы терминации транскрипции, как правило, расположены по ходу транскрипции от сигнала полиаденилирования. Термин поли-A сайт или поли-A последовательность в настоящей заявке относится к последовательности ДНК, опосредующей терминацию и полиаденилирование первичного РНК-транскрипта РНКполимеразой II. Ввиду того, что транскрипты, лишенные полиаденилового хвоста, нестабильны и быстро разрушаются, предпочтительно эффективное полиаденилирование рекомбинантных транскриптов. Типичные сигналы полиаденилирования, которые могут применяться в векторах согласно изобретению, включают идеальные поли-A последовательности (например, AATAAA, ATTAAA AGTAAA), последовательность полиаденилирования из бычьего гормона роста (BGHpA), последовательность полиаденилирования β-глобина кролика (rflgpA). либо другую гетерологичную или эндогенную поли-A последовательность, известную в данной области техники.
Согласно определенным вариантам реализации ретровирусный или лентивирусный вектор также включает один или несколько инсуляторов. Инсуляторы участвуют в защите последовательностей, экспрессируемых лентивирусами, например, полипептидов, обладающих терапевтическими свойствами, от влияния сайтов интеграции, которое может быть опосредовано цис-действующими элементами геномной ДНК, нарушающими регуляцию экспрессии перенесенных последовательностей (т. е., эффект положения; см., например, Burgess-Beusse et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99:16433; and Zhan et al., 2001, Hum. Genet., 109:471). Согласно некоторым вариантам реализации векторы-переносчики включают один или несколько инсуляторов на 3'-конце LTR-последовательности; в процессе интеграции провируса в геном клетки-хозяина, провирус приобретает один или несколько инсуляторов как на 5'-концевых, так и на 3'концевых LTR-последовательностях, в результате репродукции 3'-концевых LTR-последовательностей. Применимые инсуляторы согласно изобретению включают, но не ограничиваются куриным βглобиновым инсулятором (см. Chung et al., 1993. Cell 74:505; Chung et al., 1997. PNAS 94: 575; и Bell et
- 8 032699 al., 1999. Cell 98:387, включенные в настоящую заявку посредством ссылки). Примеры инсуляторов включают, но не ограничиваются инсулятором локуса β-глобина, такого как куриный инсулятор HS4.
Согласно определенным особым вариантам реализации настоящего изобретения большая часть основных кодирующих последовательностей векторов имеет лентивирусное происхождение, например, таковые, полученные из ВИЧ-1. Тем не менее, следует понимать, что в рамках изобретения могут применяться различные лентивирусные источники; более того, определенные последовательности нуклеиновых кислот лентивирусов могут быть подвержены всевозможным замещениям и изменениям при условии сохранения способности вектора-переносчика выполнять функции, описанные в настоящей заявке. Кроме того, в данной области техники известны различные лентивирусные векторы, см. Naldini et al., (1996a, 1996b, and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, патенты США №№ 6013516 и 5994136, многие из которых могут применяться для создания вирусного вектора или плазмиды-переносчика согласно настоящему изобретению.
В настоящей заявке термин соединение относится к низкомолекулярным органическим соединениям, простагландинам, активаторам цАМФ, агонистам сигнального пути Wnt, агонистам сигнальных путей цАМФ/фосфоинозитид-3-киназы (PI3K)/серин-треониновой киназы (AKT), агонистам сигнального пути Ca2+, агонистам сигнального пути NO/ангиотензина и неорганических веществ, включающих все без исключения аналоги и производные вышеуказанных соединений.
Термины небольшая молекула, небольшая органическая молекула, небольшое молекулярное соединение относятся к низкомолекулярным соединениям, характеризующимся молекулярной массой, не превышающей приблизительно 5 кДа, приблизительно 4 кДа, приблизительно 3 кДа, приблизительно 2 кДа, приблизительно 1 кДа, либо приблизительно 0,5 кДа. Согласно определенным вариантам реализации небольшие молекулы могут представлять собой нуклеиновые кислоты, пептиды, пептидомиметики, пептоиды и другие небольшие органические соединения, препараты и т.п. Базы данных химических и/или биологических соединений, таких как бактериальные, грибковые или водорослевые экстракты, известны в данной области знаний и могут быть изучены в процессе любого рода испытаний в рамках изобретения. Примеры способов получения молекулярных баз данных могут быть изучены в следующих источниках: (Carell et al., 1994a; Carell et al., 1994b; Cho et al., 1993; DeWitt et al., 1993; Gallop et al., 1994; Zuckermann et al., 1994).
Базы данных соединений могут быть представлены в виде растворов (Houghten et al., 1992) на гранулах (Lam et al., 1991), на кристаллах (Fodor et al., 1993), бактерий, спор (Ladner et al., патент США № 5,223,409, 1993), на плазмидах (Cull et al., 1992) или на фагах (Cwirla et al., 1990; Devlin et al., 1990; Felici et al., 1991; Ladner et al., патент США № 5,223,409, 1993; Scott and Smith, 1990). Описанное в настоящей заявке изобретение подразумевает применение различных баз данных для определения небольших молекул, обеспечивающих усиление сигнального пути рецептора простагландина EP на любом из этапов. Базы данных, применимые в целях реализации настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются: (1) базами данных химических веществ, (2) базами данных природных веществ и (3) совмещенными (комбинированными) базами данных, содержащими произвольные пептиды, олигонуклеотиды и/или органические соединения.
Базы данных химических веществ состоят из структурных аналогов и производных известных соединений или соединений, определяемых как hits или leads по классификации природных соединений. Базы данных природных веществ состоят из множества микроорганизмов, животных, растений или водных организмов, используемых при получении комбинаций для классифицирования путем: (1) культивирования и выделения из жидких экстрактов почвенных, растительных и морских микроорганизмов или (2) выделения из растений или морских организмов. Базы данных природных веществ включают поликетиды, нерибосомные пептиды и их варианты (искусственного происхождения). См. Cane, D. E., et al., (1998) Science 282:63-68. Совмещенные (комбинированные) базы данных состоят из комбинации большого количества пептидов, олигонуклеотидов или органических молекул. Такие базы достаточно просто создать с помощью традиционных способов автоматизированного синтеза баз данных, ПЦР, клонирования или с помощью запатентованных способов. Особый интерес представляют совмещенные (комбинированные) базы данных пептидов и олигонуклеотидов.
В частности, совмещенная (комбинированная) база данных химических веществ представляет собой группу различных химических соединений, полученных путем химического или биологического синтеза из нескольких химических кирпичиков, таких как реагенты. Например, линейная совмещенная (комбинированная) база данных химических веществ, такая как база данных пептидов, создается путем соединения химических кирпичиков (аминокислот) в любом возможном порядке при заданной длине соединения (т.е., количестве аминокислот в полипептидной цепочке). Миллионы химических соединений могут синтезироваться посредством такого рода комбинирования химических кирпичиков.
Для более подробных данных о комбинаторной химии и созданных на ее основе баз данных, см. Huc, I. and Hruyen, R. (2001) Comb. Chem. High Throughput Screen 4:53-74; Lepre C. A. (2001) Drug Discov. Today 6: 133-140; Peng, S. X. (2000) Biomed. Chromatogr. 14:430-441; Bohm, H. J. and Stahl, M. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:283-286; Barnes, C and Balasubramanian, S. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:346-350; Lepre, Enjalbal C., et al., (2000) Mass Septrom Rev. 19:139-161; Hall, D. G., (2000) Nat. Biotechnol. 18:262
- 9 032699
262; Lazo, J. S., and Wipf, P. (2000) J. Pharmacol. Exp. Ther. 293:705-709; Houghten, R. A., (2000) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40: 273-282; Kobayashi, S. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. (2000) 4: 338-345; Kopylov, A. M. and Spiridonova, V. A. (2000) Mol. Biol. (Mosk) 34: 1097-1113; Weber, L. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4: 295-302; Dolle, R. E. (2000) J. Comb. Chem. 2: 383-433; Floyd,C D., et al., (1999) Prog. Med. Chem. 36: 91168; Kundu, B., et al., (1999) Prog. Drug Res. 53: 89-156; Cabilly, S. (1999) Mol. Biotechnol. 12: 143-148; Lowe, G. (1999) Nat. Prod. Rep. 16:641-651; Dolle, R. E. and Nelson, K. H. (1999) J. Comb. Chem. 1: 235-282; Czarnick, A. W. and Keene, J. D. (1998) Curr. Biol. 8:R705-R707; Dolle, R. E. (1998) Mol. Divers. 4: 233-256; Myers, P. L, (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8: 701-707; and Pluckthun, A. and Cortese, R. (1997) Biol. Chem. 378: 443.
Оборудование для создания совмещенных баз данных коммерчески доступно (см., например, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky., Symphony, Rainin, Woburn, Mass., 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.). Кроме того, коммерчески доступно множество готовых совмещенных баз данных (см., например, ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, Mo., ChemStar, Ltd., Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa., Martek Biosciences, Columbia, Md. и т.п.)
В настоящей заявке термин метаболический предшественник относится к форме соединения, в процессе метаболизма преобразовывающейся в соединение, представляющее интерес.
В настоящей заявке термин метаболит относится к форме соединения, полученной в результате метаболических преобразований.
В случае химических соединений, таких как органических химических соединений, термины аналог и производное относятся к молекулам химических соединений, родственных другому химическому соединения структурно и функционально, нередко структурно отличаясь одним элементом или группой; в то же время, такие молекулы могут отличаться модификацией нескольких групп (например, 2, 3 или 4-х групп) при условии сохранения функции исходного химического соединения. Указанные модификации хорошо знакомы специалистам в данной области и включают, например, присоединение или замещение химических групп, таких как сложные эфиры или амиды кислот, защитные группы, такие как бензильная группа спирта или тиола, либо трет-бутоксикарбонильная группа аминов. Также, модификации включают боковые алкильные цепи, какие, как алькильные заместители (например, метильные, диметильные, этильные и т.п.), изменения в уровне насыщенности или ненасыщенности боковых цепей и присоединение модифицированных групп, таких как замещенная фенильная или феноксигруппа. Производные могут включать конъюгаты, такие, как биотиновые или авидиновые группы, ферменты, такие как пероксидаза хрена и ей подобные, включая также радиоизотопно-меченые, биолюминисцентные, хемолюминисцентные или флуоресцентные группы. Также, к агентам, указанным в настоящей заявке, могут быть присоединены группы, изменяющие их фармакокинетические характеристики, например, повышающие период полувыведения in vivo или ex vivo, либо повышающие способность проникновения в клетку, в числе других желаемых характеристик. Также сюда включены пролекарственные препараты, как известно, улучшающие многие желаемые характеристики лекарственных препаратов (например, растворимость, биодоступность, простоту производства и т.п.) (см., например, WO/2006/047476, включенную в настоящую заявку посредством ссылки, где указаны примеры пролекарственных препаратовагонистов простагландина).
В настоящей заявке термины полинуклеотид или нуклеиновая кислота относятся к информационной РНК (иРНК), РНК, геномной РНК (гРНК), плус-цепи РНК (RNA(+)), минус-цепи РНК (RNA(-)), геномной ДНК (гДНК), комплементарной ДНК (кДНК) или ДНК. Полинуклеотиды включают одно- и двухцепочечные полинуклеотиды. Предпочтительно полинуклеотиды согласно изобретению включают полинуклеотиды или их варианты, последовательности которых идентичны, по меньшей мере, приблизительно на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% стандартным последовательностям, указанным в настоящей заявке (см., например, перечень последовательностей), в то же время, как правило, указанный вариант сохраняет по меньшей мере одну биологическую функцию стандартной последовательности. Согласно различным показательным вариантам реализации настоящее изобретение, в частности, относится к полинуклеотидным последовательностям вирусных векторов и плазмидпереносчиков, а также к композициям указанных агентов. Согласно определенным вариантам реализации изобретение обеспечивает полинуклеотиды, кодирующие один или несколько терапевтически полипептидов, и/или другие гены, вызывающие интерес. Согласно определенным вариантам реализации, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотиды, кодирующие полипептид глобина или АТФсвязывающую кассету подсемейства D (ALD), полипептид (ABCD1), как описано в настоящей заявке.
В настоящей заявке термины вариант полинуклеотида и вариант относятся к полинуклеотидам, характеризующимся значительной схожестью последовательности с последовательностями стандартных полинуклеотидов или к полинуклеотидам, гибридизирующимся со стандартными полинуклеотидами в строгих условиях, указанных в заявке. Эти термины включают полинуклеотиды, подвергающиеся вставке, делеции или замещению одного или нескольких нуклеотидов, в сравнении со стандартным полинуклеотидом. В этом отношении, специалистам в данной области очевидно, что стандартный полинуклеотид может подвергаться определенным мутациям, таким как вставки, делеции или замещения при условии,
- 10 032699 что модифицированный полинуклеотид сохраняет биологические функции стандартного полинуклеотида.
В настоящей заявке термин выделенный относится к материалу, например полинуклеотиду, полипептиду, клетке, в значительной степени или абсолютно лишенному компонентов, связанных с ним в его естественном состоянии. Согласно определенным вариантам реализации термины полученный или образованный от применяются как синонимы термина выделенный. Например, выделенный полинуклеотид в настоящей заявке относится к полинуклеотиду, полученному посредством удаления последовательностей с обоих его концов, присутствующих в его естественном состоянии, например к фрагменту ДНК, отщепленному от последовательностей, между которыми он расположен в естественном состоянии.
Термины, описывающие ориентацию полинуклеотидов, включают: 5' (как правило, конец полинуклеотида, несущий свободную фосфатную группу) и 3' (как правило, конец полинуклеотида, несущий свободную гидроксильную (-OH) группу). Полинуклеотидные последовательности могут быть указаны, как ориентированные в направлении 5' 3' или в направлении 3' 5'.
Термины комплементарный и комплементарность относятся к полинуклеотидам (т.е., нуклеотидным последовательностям), обладающим сродством согласно правилам спаривания оснований. Например, последовательность ДНК 5'AGTCATG3' комплементарна последовательности 3'TCAGTAC5'. Последняя нередко записывается в обратном направлении, слева направо от 5'-конца к 3'-концу: 5'CATGACT3'. Последовательность, совпадающая сама с собой при чтении в обратном порядке, называется палиндромной последовательностью. Комплементарность может быть частичной, когда лишь некоторые из оснований нуклеиновых кислот соответствуют правилам спаривания оснований; также комплементарность двух последовательностей нуклеиновых кислот может быть полной.
Термин кассета экспрессии нуклеиновой кислоты в настоящей заявке относится к последовательностям вектора, способным экспрессировать РНК и вслед за этим полипептид. Согласно одному из вариантов реализации кассета экспрессии нуклеиновой кислоты содержит ген(ы), представляющий(ие) интерес, например полинуклеотид(ы), представляющий(ие) интерес. Согласно другому варианту реализации кассета экспрессии нуклеиновой кислоты содержит одну или несколько регуляторных последовательностей и ген(ы), представляющий(ие) интерес, например, полинуклеотид(ы), представляющий(ие) интерес. Векторы могут содержать одну, две, три, четыре, пять или более кассет экспрессии. Кассета экспрессии расположена и ориентирована в последовательности вектора таким образом, что нуклеиновая кислота в кассете может быть транскрибирована в РНК и, при необходимости, далее транслирована в белок или полипептид, который может быть подвержен соответствующей посстрансляционной модификации, необходимой для обеспечения выполнения биологической функции в трансформированной клетке, и может быть доставлен в соответствующий отдел клетки для выполнения этой функции либо посредством направленной доставки внутри клетки, либо экспортирован из клетки во внеклеточное пространство. Предпочтительно, 3' и 5'-концы кассеты приспособлены для непосредственной интеграции в вектор, например, на обоих концах присутствуют сайты, распознаваемые рестрикционными эндонуклеазами. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения, кассета экспрессии нуклеиновой кислоты включает последовательность терапевтического гена для лечения, профилактики или улучшения течения генетических нарушений, таких как нарушений кроветворения. Кассета экспрессии может быть выделена и интегрирована в плазмиду или вирусный вектор как единый элемент.
Полинуклеотиды включают полинуклеотиды, представляющие интерес. В настоящей заявке термин полинуклеотид(ы), представляющий(ие) интерес относится к одному или нескольким полинуклеотидам, например полинуклеотиду, кодирующему полипептид (то есть, полинуклеотиду, представляющему интерес), интегрированному в вектор экспрессии, экспрессия которого желаема. Согласно предпочитаемым вариантам реализации векторы и/или плазмиды согласно изобретению включают один или несколько полинуклеотидов, представляющих интерес, например ген глобина или ген ABCD1. Согласно определенным вариантам реализации полинуклеотид, представляющий интерес, кодирует полипептид, который обеспечивает терапевтический, профилактический эффект или улучшает течение заболевания кроветворной системы или нарушения, то есть, относится к терапевтическому полипептиду, например, кодируемому геном глобина. См., например, патенты США №№ 6051402 и 7901671, описание и формула изобретения которых полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки. См., например, SEQ ID NOs: 1, 5, 10 и 14.
Согласно другим вариантам реализации, полинуклеотид, представляющий интерес, кодирует полипептид, который обеспечивает терапевтический, профилактический эффект или улучшает течение адренолейкодистрофии или адреномиелонейропатии, то есть, относится к «терапевтическому полипептиду», например, кодируемому геном ABCD1. См., например, SEQ ID NOs: 16-17. См., например, патенты США №№ 5869039 и 6013769, описание и формула изобретения которых полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки.
В настоящей заявке термин глобин относится ко всем белкам или их субъединицам, способным ковалентно или нековалентно связываться гемовой группой и, таким образом, переносить или запасать кислород. Термин глобин включает субъединицы гемоглобина, миоглобина или их мутантных вариантов
- 11 032699 позвоночных и беспозвоночных. Примера глобинов включают α-глобин и его варианты, β-глобин и его варианты, γ-глобин и его варианты, а также δ-глобин и его варианты.
Согласно одному из вариантов реализации полинуклеотид, представляющий интерес, представляет собой ген, кодирующий полипептид, который обеспечивает терапевтический эффект в процессе лечения гемоглобинопатий, например α-глобин, β-глобин или β-глобин A-T87Q. Полинуклеотиды, представляющие интерес, а также кодируемые ими полипептиды включают как полинуклеотиды, кодирующие полипептиды дикого типа, так и их функциональные варианты и фрагменты. Согласно определенным вариантам реализации последовательность функционального варианта по меньшей мере на 80, 90, 95 или 99% идентична последовательности соответствующего стандартного полинуклеотида дикого типа. Согласно определенным вариантам реализации биологическая активность функционального варианта или фрагмента соответствующего полипептида дикого типа составляет по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 100 или 110% биологической активности полипептида дикого типа. Типичные представители полинуклеотидов, применимых согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются полинуклеотидами, кодирующими α-глобин, β-глобин и β-глобин A-T87Q.
Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению, вне зависимости от длины собственной кодирующей последовательности, могут быть связаны с другими последовательностями ДНК, такими как промоторы и/или энхансеры, нетранслируемые области (UTR), последовательности Козака, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты, распознаваемые рестрикционными эндонуклеазами, сайты множественного клонирования, участки внутренней посадки рибосомы (IRES), сайты, распознаваемые рекомбиназами (например, LoxP, FRT и Att), стоп-кодоны, терминирующие транскрипцию кодоны и полинуклеотиды, кодирующие саморасщепляющиеся полипептиды, эпитопные метки, описанные в настоящей заявке или известные в данной области, таким образом, что их длина может существенно варьировать. Поэтому подразумевается, что может применяться полинуклеотид практически любой длины, предпочтительно, длины, обеспечивающей достаточную простоту получения и применения в рамках протокола рекомбинантной ДНК согласно изобретению.
Термин последовательность, регулирующая экспрессию относится к полинуклеотидной последовательности, которая включает один или несколько промоторов, энхансеров и иных элементов, регулирующих транскрипцию, а также их комбинации, способные стимулировать, регулировать и контролировать транскрипцию или экспрессию функционально связанных полинуклеотидов. Согласно определенным вариантам реализации векторы согласно изобретению содержат одну или несколько последовательностей, регулирующих экспрессию, специфичных в отношении определенных клеток, типов клеток или последовательностей клеточных поколений, например, клеток-мишеней; таким образом, экспрессия полинуклеотидов, функционально связанных с последовательностями, регулирующими экспрессию, специфичными в отношении определенных клеток, типов клеток или последовательностей клеточных поколений, происходит исключительно в клетках-мишенях, но не в других клетках. Каждая из последовательностей, регулирующих экспрессию и обладающих специфичностью в отношении определенных клеток, в векторах может функционировать в клетках одного или разных типов, в зависимости от того, какого рода терапия должна проводиться. Согласно предпочтительным вариантам реализации векторы содержат одну или несколько последовательностей, регулирующих экспрессию, специфичных в отношении кроветворных клеток, например, кроветворных стволовых клеток или кроветворных клетокпредшественников. Согласно другим предпочтительным вариантам реализации, векторы содержат одну или несколько последовательностей, регулирующих экспрессию и специфичных в отношении эритроидных клеток.
Термин промотор в настоящей заявке относится к сайту полинуклеотида (ДНК или РНК), который распознает и с которым связывается РНК-полимераза. Термин энхансер относится к сегменту ДНК, включающему последовательности, способные обеспечить повышенный уровень транскрипции и, в определенных условиях, функционировать независимо от их ориентации в отношении других регулирующих последовательностей. Энхансер может функционировать совместно или усиливать действие промотеров и/или других энхансеров. Термин промотор/энхансер относится к сегментам ДНК, способным выполнять функции как промотора, так и энхансера.
Согласно определенным вариантам реализации вектор согласно изобретению содержит экзогенные, эндогенные или гетерологичные регулирующие последовательности, такие как промоторы и/или энхансеры. Эндогенная регулирующая последовательность связана с определенным геном в естественных условиях. Экзогенная регулирующая последовательность помещается непосредственно по соседству с геном путем манипуляции с генами (т.е., посредством способов, применяемых в молекулярной биологии) таким образом, что транскрипция такого гена стимулируется связанным с ним энхансером/промотором. Гетерологичная регулирующая последовательность представляет собой экзогенную последовательность, полученную из видов, отличных от вида клетки, гены которой подвергаются манипуляции. Синтетическая регулирующая последовательность может включать элементы одной или нескольких эндогенных и/или экзогенных последовательностей и/или последовательностей, исследования которых in vitro или in silico показали, что данные последовательности оптимально функционируют как промотор и/или энхансер для проведения определенной генной терапии.
- 12 032699
Термин функционально связанный относится к расположению описанных компонентов непосредственно по соседству друг с другом таким образом, что они могут взаимодействовать заданным образом. Согласно одному из вариантов реализации термин относится к функциональной связи между последовательностью, регулирующей экспрессию нуклеиновой кислоты (такой, как промотор и/или энхансер, либо другой последовательностью, регулирующей экспрессию), и второй полинуклеотидной последовательностью, например полинуклеотидом, представляющим интерес, таким образом, что последовательность, регулирующая экспрессию, стимулирует транскрипцию нуклеиновой кислоты, соответствующей второй последовательности.
В настоящей заявке термин конститутивная последовательность, регулирующая экспрессию относится к промотору, энхансеру или промотору/энхансеру, постоянно стимулирующему транскрипцию функционально связанной последовательности. Конститутивная последовательность, регулирующая экспрессию, может представлять собой универсальный промотор, энхансер или промотор/энхансер, стимулирующий экспрессию в многих различных типах клеток и тканей; также она может представлять собой промотор, энхансер или промотор/энхансер, специфичный для определенных клеток или тканей, который стимулирует экспрессию в определенных типах клеток и тканей соответственно. Типичные универсальные последовательности, регулирующие экспрессию, включают, но не ограничиваются: немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (CMV), промотор вируса обезьян 40 (SV40) (например, ранний или поздний), LTR-промотор вируса мышиного лейкоза (МоМЛ V) Молони, LTRпоследовательность вируса саркомы Рауса (RSV), промотор (тимидинкиназу) вируса простого герпеса (HSV), промоторы H5, P7.5 и P11 вируса осповакцины (вируса вакцинии), промотор фактора элонгации 1-альфа (EF1a), белок раннего ответа EGR1, ферритин H (FerH), ферритин L (FerL), глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназу (GAPDH), эукариотический фактор инициации трансляции 4A1 (EIF4A1), белок теплового шока 70 кДа 5 (HSPA5), белок теплового шока 90 кДа бета 1 (HSP90B1), белок теплового шока 70 кДа (HSP70), β-кинезин (β-KIN), локус ROSA 26 человека (Irions et al., (2007) Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482), промотор убиквитина C (UBC), промотор фосфоглицераткиназы-1 (PGK), энхансер цитамегаловируса/промотор β-актина кур (CAG) и промотор β-актина.
Согласно определенным вариантам реализации может быть предпочтительным применение последовательностей, регулирующих экспрессию, специфичных к клеткам или тканям, для экспрессии желаемой полинуклеотидной последовательности в соответствии с типом клеток или тканей (например, для экспрессии определенной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид лишь в определенных типах клеток или тканей, либо лищь в определенные фазы жизненного цикла).
Типичные примеры промоторов, специфичных к тканям, включают, но не ограничиваются: промотор B29 (экспрессия в B-клетках), промотор транскрипционного фактора карликовости (CBFa2) (экспрессия в стволовых клетках), промотор CD14 (экспрессия в моноцитах), промотор CD43 (экспрессия в лейкоцитах и тромбоцитах), промотор CD45 (экспрессия в кроветворных клетках), промотор CD68 (экспрессия в макрофагах), промотор CYP450 3A4 (экспрессия в гепатоцитах), промотор десмина (экспрессия в мышечных клетках), промотор эластазы 1 (экспрессия в ацинарных клетках поджелудочной железы), промотор эндоклина (экспрессия в эндотелиальных клетках), промотор фибробласт-специфического белка 1 (FSP1) (экспрессия в фибробластах), промотор фибронектина (экспрессия в фибробластах), промотор тирозинкиназы FLT1 (экспрессия в эндотелиальных клетках), промотор глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) (экспрессия в астроцитах), промотор инсулина (экспрессия в β-клетках поджелудочной железы), промотор интегрина o-2b (ITGA2B) (экспрессия в мегакариоцитах), промотор фактора межклеточной адгезии 2 (ICAM-2) (экспрессия в эндотелиальных клетках), промотор интерферонабета (IFN-β) (экспрессия в кроветворных клетках), промотор кератина 5 (экспрессия в кератиноцитах), промотор миоглобина (MB) (экспрессия в мышечных клетках), промотор миогенного фактора 1 (MYOD1) ((экспрессия в мышечных клетках), промотор нефрина (экспрессия в подоцитах), промотор γкарбоксиглутамат-белка 2 костей (OG-2) (экспрессия в остеобластах), промотор 3-оксоацил-КоАтрансферазы (Oxct2B), (экспрессия в гаплоидных сперматидах), промотор сурфактантного белка B (SPB) (экспрессия в клетках легких), промотор синапсина (экспрессия в нейронах), промотор белка синдрома Вискотта-Олдрича (WASP) (экспрессия в кроветворных клетках).
Согласно одному из вариантов реализации вектор согласно настоящему изобретению содержит один или несколько промоторов и/или энхансеров, специфичных к кроветворным клеткам или тканям, выбранных из группы, которая включает: промотор β-глобина человека, LCR-последовательность βглобина человека, энхансер HS40 α-глобина человека и промотор анкирина-1, функционально связанных с полинуклеотидом, кодирующим полипептид глобина.
Согласно другому варианту реализации, согласно настоящему изобретению включает промотор, активный в клетках микроглии, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим полипептид АТФ-связывающей кассеты подсемейства D, члена 1 (ABCD1). Согласно определенным вариантам реализации промотор включает энхансер вируса миелопролиферативной саркомы с делецией участка негативного контроля, промотор dl587rev с замещенным участком связывания праймера (MND), либо их транскрипционно активные фрагменты.
В настоящей заявке термин условная экспрессия может относиться к любому виду условной экс
- 13 032699 прессии, включая, не ограничиваясь: репрессируемую экспрессию, экспрессию в клетках или тканях, характеризующихся особым физиологическим, биологическим, патологическим статусом и т.п. Данное определение не исключает экспрессию, специфичную к клеткам или тканям. Некоторые варианты реализации изобретения обеспечивают условную экспрессию полинуклеотидов, вызывающих интерес, например, экспрессия регулируется посредством обработки определенными препаратами, либо путем создания условий, стимулирующих экспрессию или повышающих/понижающих уровень экспрессии полинуклеотида, кодируемого полинуклеотидом, вызывающим интерес.
Типичные примеры индуцибельных промоторов/систем включают, но не ограничиваются: промоторы, активируемые стероидами, такие как промоторы генов, кодирующих рецепторы глюкокортикоидов или эстрогена (активируемые соответствующими гормонами), промотор металлотионеина (активируемый различными тяжелыми металлами), промотор MX-1 (активируемый интерфероном), система GeneSwitch, регулируемая мифепристоном (Sirin et al., (2003) Gene, 323:67), переключатель гена, активируемый куматом (низкомолекулярное соединение, связывающееся с репрессором CyMR) (WO 2002/088346), тертациклинзависимые регуляторные системы и т.п.
Условная экспрессия также может осуществляться посредством сайт-специфических ДНК рекомбиназ. Согласно определенным вариантам реализации изобретения вектор включает по меньшей мере один (как правило, два) сайт рекомбинации, распознаваемый сайт-специфическими рекомбиназами. В настоящее заявке термин рекомбиназа или сайт-специфическая рекомбиназа включает способствующие вырезанию или интегративные белки, ферменты, кофакторы, либо связывающиеся с нуклеиновыми кислотами белки, участвующие в реакциях рекомбинации, включающих один или несколько сайтов рекомбинации (например, два, три, четыре, пять, семь, десять, двенадцать, пятнадцать, двадцать, тридцать, пятьдесят и т.д.), в числе которых могут быть белки дикого типа (см. Landy, (1993) Current Opinion in Biotechnology 3: 699-707), мутантные белки, их производные (например, белки слияния, включающие последовательности рекомбинантных белков и их фрагменты), фрагменты и варианты. Типичные примеры рекомбиназ, применимых согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ФС31, Cin, резолвазой Tn3, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 и ParA.
Векторы могут содержать один или несколько сайтов рекомбинации, распознаваемых любой из широкого спектра сайт-специфических рекомбиназ. Следует понимать, что сайт-мишень сайтспецифической рекомбиназы наряду с другими сайтами необходим для интеграции вектора, например, ретровирусного или лентивирусного вектора. В настоящей заявке термины рекомбинантная последовательность, сайт рекомбинации, сайт сайт-специфической рекомбинации относятся к определенной последовательности нуклеиновой кислоты, которую распознает и с которой связываются рекомбиназы.
Например, одним из сайтов рекомбинации рекомбиназы Cre является loxP, представляющий собой последовательность из 34 пар оснований, включающей два инвертированных повтора из 13 пар оснований (играющие роль сайтов рекомбинации), между которыми расположена коровая (сердцевинная) последовательность из 8 пар оснований (см. фиг. 1 в Sauer, B., (1994) Current Opinion in Biotechnology 5:521-527). Другие примеры сайтов loxP включают, но не ограничиваются: lox511 (Hoess et al., 1996; Bethke and Sauer, 1997), lox5171 (Lee and Saito, 1998), lox2272 (Lee and Saito, 1998), m2 (Langer et al., 2002), lox71 (Albert et al., 1995) и lox66 (Albert et al., 1995).
Соответствующие сайты рекомбинации рекомбиназы FLP включают, но не ограничиваются: FRT (McLeod, et al., 1996), F1, F2, F3 (Schlake and Bode, 1994), F4, F5 (Schlake and Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff et al., 1988), FRT(RE) (Senecoff et al., 1988).
Другие примеры рекомбинантных последовательностей включают последовательности attB, attP, attL и attR, распознаваемые рекомбиназами семейства λ Integrase (γ-интегразы), например phi-c31 (φΟ31). Сайт-специфическая рекомбиназа φC31 опосредует рекомбинацию только между гетеротипическими сайтами attB (длиной в 34 пары оснований) и attP (длиной в 39 пар оснований) (Groth et al., 2000). attB и attP, обозначаемые так по сайтам присоединения интегразы фага в геномах бактерии и фага, соответственно, включают несовершенные инвертированные повторы, к которым с высокой долей вероятности присоединяются гомодимеры φC31 (Groth et al., 2000). Образующиеся в результате сайты attL и attR практически не подвергаются дальнейшей рекомбинации, опосредованной φC31 (Belteki et al., 2003), таким образом реакция является необратимой. В отношении катализа процесса вставки, оказалось, что ДНК, содержащая attB, вставляется в сайт attP генома с большей вероятностью, чем сайт attP в сайт attB генома (Thyagarajan et al., 2001; Belteki et al., 2003). Таким образом, типичный алгоритм заключается в гомологичной рекомбинации сайта установки, несущего attP, с определенным участком, который затем взаимодействует с присоединяющейся attB-несущей последовательностью для последующей вставки.
В настоящей заявке термин участок внутренней посадки рибосомы или IRES относится к элементу, обеспечивающему прямое проникновение кодона инициации цистрона (области, кодирующей белок), например АТГ (ATG), в рибосому, таким образом, обеспечивая трансляцию независимо от кэпа (5'-нетранслируемой области). См., например, Jackson et al., (1990) Trends Biochem Sci 15(12):477-83), а также Jackson and Kaminski, (1995) RNA 1(10):985-1000. Согласно определенным вариантам реализации векторы согласно изобретению включают один или несколько полинуклеотидов, представляющих инте
- 14 032699 рес, кодирующих один или несколько полипептидов. Согласно определенным вариантам реализации для обеспечения эффективной трансляции каждого из множества полипептидов полинуклеотидные последовательности могут разделяться одной или несколькими последовательностями IRES или полинуклеотидов, кодирующих саморасщепляющиеся полипептиды.
В настоящей заявке термин «последовательность Козака» относится к короткой нуклеотидной последовательности, в значительной мере облегчающей изначальное присоединение иРНК к малой субъединице рибосомы и повышающей уровень трансляции. Консенсусная последовательность Козака представляет собой последовательность (GCC)RCCATGG, где R - это пуриновое основание (A или G) (Kozak, (1986) Cell. 44(2):283-92 и Kozak, (1987) Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48). Согласно определенным вариантам реализации, векторы согласно изобретению содержат полинуклеотиды, содержащие последовательность Козака и кодирующие полипептид, представляющий интерес.
Согласно определенным вариантам реализации векторы содержат селектируемый ген, также обозначаемый как селективный маркер. Типичные селективные гены кодируют белки, которые:
(a) обеспечивают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например к ампициллину, неомицину, гигромицину, метотрексату, зеоцину, бластицидину или тетрациклину, (b) компенсируют ауксотрофные нарушения, либо (c) обеспечивают питательные элементы, отсутствующие в комплексной питательной среде, например, кодирующие D-аланинрацемазу в бациллах. Для выделения линий трансформированных клеток может применяться сколько угодно систем селекции, включая, но не ограничиваясь, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler et al., (1977) Cell 11: 223-232) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy et al., (1990) Cell 22: 817-823), которые могут быть использованы в соответственно tk- и aprt-клетках.
Согласно различным вариантам реализации векторы согласно изобретению могут применяться для повышения, стимуляции или поддержки уровня экспрессии одного или нескольких полипептидов, например глобинов. В настоящей заявке термины полипептид и белок взаимозаменимы и относятся к полимерам аминокислотных остатков, а также к их вариантам и синтетическим аналогам. Таким образом, эти термины относятся к полимерам аминокислот, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой синтетические неприродные аминокислоты, такие как химические аналоги соответствующих природных аминокислот, а также к природным полимерам аминокислот. Типичные примеры применимых полипептидов глобина приведены в способах и композициях определенных вариантов реализации настоящего изобретения, например SEQ ID NOs: 2-4, 6-9, 11-13 и 15. Также см., например, патенты США №№ 6051402 и 7901671, полное описание и формула изобретения которых включены в настоящую заявку посредством ссылки.
Типичные примеры применимых полипептидов ABCD1 приведены в способах и композициях определенных вариантов реализации настоящего изобретения, например SEQ ID NO: 18. Также см., например, патенты США №№ 5869039 и 6013769, полное описание и формула изобретения которых включены в настоящую заявку посредством ссылки.
Определенные варианты реализации настоящего изобретения также включают варианты полипептидов. Термин вариант полипептида относится к полипептидам, отличающимся от стандартного полипептида наличием вставки, делеции, процессинга и/или замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка при сохранении полипептидом биологической активности. Согласно определенным вариантам реализации вариант полипептида отличается от стандартного полипептида наличием одной или нескольких замен, консервативных или неконсервативных, как известно специалистам в данной области.
Согласно определенным вариантам реализации аминокислотная последовательность варианта полипептида по меньшей мере приблизительно на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентична или схожа с соответствующей последовательностью стандартного полипептида. Согласно определенным вариантам реализации, вставки или делеции аминокислот происходят на C-конце и/или на N-конце стандартного полипептида.
Как указано выше, полипептиды согласно изобретению могут быть модифицированы различными способами, включая замены, делеции, процессинг и вставки аминокислот. Способы таких манипуляций хорошо известны в данной области. Например, варианты аминокислотных последовательностей стандартных полипептидов могут быть получены посредством мутирования ДНК. Способы мутагенеза и изменения нуклеотидных последовательностей хорошо известны в данной области. См., например Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492, Kunkel et al., (1987) Methods in Enzymol, 154: 367-382, U.S. Pat. No. 4873192, Watson, J. D. et al., (1987) Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif, и включенные в эти источники ссылки. С руководством по приемлемым заменам аминокислот без потери белком, представляющим интерес, биологической активности, можно ознакомиться в Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).
Термин клетка-хозяин относится к клеткам, трансфицированным, инфицированным или трансдуцированным рекомбинантным вектором или полинуклеотидом согласно изобретению in vivo, ex vivo, либо in vitro. Клетки-хозяева могут включать упаковывающие клетки, клетки-продуценты и клетки, инфицированные вирусным вектором. Согласно определенным вариантам реализации клетки-хозяева, ин
- 15 032699 фицированные вирусным вектором согласно изобретению, вводятся субъекту в терапевтических целях. Согласно определенным вариантам реализации, термин клетка-мишень взаимозаменим с термином клетка-хозяин и относится к трансфицированным, инфицированным или трансдуцированным клеткам определенного типа. Согласно предпочтительным вариантам реализации клетка-мишень представляет собой стволовую клетку или клетку-предшественник. Согласно определенным предпочтительным вариантам реализации клетка-мишень представляет собой соматическую клетку, например зрелую стволовую клетку, клетку-предшественник или дифференцированную клетку. Согласно определенным предпочтительным вариантам реализации клетка-мишень представляет собой кроветворную клетку, например кроветворную стволовую клетку или кроветворную клетку-предшественник. Другие клетки-мишени, применимые в терапевтических целях, описаны ниже.
Термин стволовая клетка относится к недифференцированной клетке, способной (1) к самообновлению в течение длительного времени или к делению с получением по меньшей мере одной копии, идентичной материнской клетке, (2) к дифференцированию на уровне одной клетки в множество, либо, в некоторых случаях, в один специализированный тип клеток и (3) к функциональной регенерации тканей in vivo. Стволовые клетки, в соответствии с их дифференцировочным потенциалом, на тотипотентные, плюрипотентные, мультипотентные и олиго/унипотентные. Самообновление относится к специфичной способности клетки делиться с получением идентичных ей дочерних клеток и образовывать специализированные типы клеток (потентность). Самообновление может происходить двумя способами. При асимметричном делении клеток одна из дочерних клеток идентична материнской клетке, в то время как вторая дочерняя клетка отличается от нее и представляет собой клетку-предшественник или дифференцированную клетку. При асимметричном делении популяция клеток не увеличивается. При симметричном делении клеток обе дочерние клетки идентичны материнской. Пролиферация или размножение клеток относятся к симметричному делению.
В настоящей заявке термин тотипотентный относится к способности клетки дать начало любой клеточной линии организма. Например, у млекопитающих лишь зигота и бластомеры, образующиеся после первого дробления, являются плурипотентными. В настоящей заявке термин плюрипотентный относится к способности клетки дать начало любой клеточной линии тела или сомы (т.е., собственно эмбриона). Например, эмюриональные стволовые клетки представляют собой тип плурипотентных клеток, способных дать начало любому из трех зародышевых листков: эктодерме, мезодерме и энтодерме. В настоящей заявке термин мультипотентный относится к способности зрелой стволовой клетки дать начало различным типам клеток одной клеточной линии. Например, стволовые кроветворные клетки способны дать начало линии клеток крови, например лимфоидным или миелоидным клеткам. В настоящей заявке термин олигопотентный относится к способности зрелой стволовой клетки дифференцировать лишь в некоторые различные типы клеток. Например, лимфоидные или миелоидные стволовые клетки способны дать начало соответственно линии лимфоидных или линии миелоидных клеток. В настоящей заявке термин унипотентный относится к способности клетки дать начало только одному типу клеток. Например, сперматогониальные стволовые клетки способны дать начало только мужским половым клеткам.
В настоящей заявке, термин предшественник или клетка-предшественник относится к клеткам, способным к самообновлению и к дифференцированию в более зрелые клетки. Многие клеткипредшественники дифференцируют в клетки одной клеточной линии, но обладают высоким пролиферативным потенциалом.
Стволовые кроветворные клетки (HSCs) дают начало коммитированным кроветворным клеткампредшественникам (HPCs), способным дифференцировать в любые зрелые кровяные клетки в течение всей жизни организма. Термин стволовая кроветворная клетка или HSC относится к мультипотентным стволовым клеткам, способным дать начало любым кровяным клеткам организма, включая миелоидные (например, моноциты или макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, мегакариоциты/тромбоциты, дендритные клетки) и миелоидные клеточные линии (например, T-клетки, Bклетки, NK-клетки), а также другие клеточные линии, известные в данной области техники (см. Fei, R., et al., патент США № 5635387; McGlave, et al., U.S. Patent No. 5460964; Simmons, P., et al., патент США № 5677136; Tsukamoto, et al., патент США № 5750397; Schwartz, et al., патент США № 5759793; DiGuisto, et al., патент США № 5681599; Tsukamoto, et al., патент США № 5716827). Трансплантация кроветворных стволовых клеток и кроветворных клеток-предшественников животным, подвергшимся воздействию смертельных доз радиации, может восстановить популяцию эритроцитов, нейтрофилов-макрофагов и мегакариоцитов.
Для достижения достаточного титра вируса нередко возникает необходимость в получении большого количества вирусных частиц. Вирусные частицы получают посредством трансфекции в упаковочные клетки вектора-переносчика, несущего структурные и/или добавочные гены вируса, например гены gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx или nef, либо другие ретровирусные гены.
В настоящей заявке, термин упаковочный вектор относится к вектору экспрессии или вирусному вектору, лишенному упаковочного сигнала и содержащему полинуклеотид, который кодирует один, два, три, четыре или более структурных и/или добавочных генов вируса. Как правило, упаковочные векторы
- 16 032699 включены в упаковочные клетки и вводятся посредством трансфекции, трансдукции или инфицирования. Способы трансфекции, трансдукции и инфицирования хорошо известны в данной области знаний. Ретровирусный/лентивирусный вектор-переносчик согласно настоящему изобретению может быть введен в пакующую клеточную линию посредством трансфекции, трансдукции или инфицирования для получения клеток-продуцентов или линии клеток-продуцентов. Упаковочные векторы согласно настоящему изобретению можно вводить в клетки или в линии клеток человека посредством стандартных способов, включая, например, кальций-фосфатную трансфекцию, липофекцию или электропорацию. Согласно некоторым вариантам реализации упаковочный вектор вводят в клетки вместе с доминантным селектируемым маркером, таким как неомицин, гигромицин, пуромицин, бластицидин, зеоцин, тимидинкиназа, дигидрофолатредуктаза (DHFR), глутаминсинтетаза или аденозиндеаминаза (ADA), с последующим селектированием с присутствии соответствующего субстрата и выделением клонов. Селектируемый маркер может быть физически связан с генами упаковочного вектора, например, с помощью IRES или саморасщепляющихся вирусных пептидов.
Вирусные оболочечные белки (env) определяют спектр клеток, которые могут быть инфицированы и трансформированы рекомбинантными ретровирусами, полученными из клеточных линий. В случае лентивирусов, таких как ВИЧ-1, ВИЧ-2, вируса иммунодефицита обезьян (SIV), вируса иммунодефицита кошачьих (FIV) и вируса конского гриппа (EIV), белки env включают gp41 и gp120. Предпочтительно вирусные оболочечные белки, экспрессируемые упаковочными клетками согласно изобретению, кодируются особым вектором, отдельно от вирусных генов gag и pol, как было указано выше.
Типичные примеры ретровирусных генов env, применимых согласно изобретению, включают, но не ограничиваются генами оболочечных белков: вируса лейкоза мышей (МЛУ), вируса лейкоза мышей (10A1), эндогенного вируса бабуинов (BAEV), вируса лейкоза кошачьих- B (FeLV-B), RD114, вируса, ассоциированного с вирусом саркомы (SSAV), вируса Эбола, вируса Сендай, вируса птичьей чумы (FPV) и вируса гриппа. Также возможно применение генов, кодирующих оболочечные белки РНКсодержащих вирусов (например, семейства пикорнавирусов, кальцивирусов, астровирусов, тогавирусов, флавивирусов, коронавирусов, парамиксовирусов, рабдовирусов, филовирусов, ортомиксовирусов, буньявирусов, аренавирусов, реовирусов, бирнавирусов, ретровирусов) и генов ДНК-содержащих вирусов (семейства гепаднавирусов, цирковирусов, парвовирусов, паповавирусов, аденовирусов, герпесвирусов, поксвирусов и иридовирусов). Типичные примеры включают вирус лейкоза кошачьих (FeLV), вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), вирус гепатита F (HFV), вирус дермальной саркомы (глаукомы) (WDSV), вирус леса Семлики (SFV), вирус бешенства, вирус лейкоза птиц (ALV), вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV), вирус лейкоза крупного рогатого скота (BLV), вирус ЭпштейнаБарра (EBV), вирус козьего артрита-энцефалита (CAEV), вирус некроза селезенки (SNV), вирус ChTLV, T-лимфотропный вирус обезьян (STLV), вирус опухоли молочных желез мышей (MPMV), ретровирус беличьей обезьяны (SMRV), вирус, ассоциированный с вирусом Рауса (RAV), вирус саркомы Фуджинами (FuSV), вирус карциномы птиц (MH2), вирус эритробластоза птиц (AEV), вирус миелобластоза птиц (AMV), вирус саркомы птиц (CT10) и вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV).
Согласно другим вариантам реализации оболочечные белки для псевдотипирования вируса согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются, белки следующих вирусов: вирусов гриппа A, такие как H1N1, H1N2, H3N2 и H5N1 (птичий грипп), вируса гриппа B, вируса гриппа C, вируса гепатита A, вируса гепатита B, вируса гепатита C, вируса гепатита D, вируса гепатита E, ротавируса, норовируса, кишечных аденовирусов серотипа 40 и 41, парвовируса, вируса лихорадки Денге, вируса оспы обезьян, мононегавирусов, лиссавируса, такого как вирус бешенства, лагосского вируса летучих мышей, вируса Мокола, вируса Дювенхаге, европейского вируса летучих мышей 1 и 2, австралийского вируса летучих мышей, вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота, везикуловируса, вируса везикулярного стоматита (VSV), вирусов герпеса, таких как вирус простого герпеса типов 1 и 2, вируса ветряной оспы, цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барра (EBV), герпесвируса человека (HHV), герпесвируса человека типов 6 и 8, ВИЧ (HIV), папилломавируса, у герпес-вируса мышей, аренавирусов, таких как вирус аргентинской геморрагической лихорадки, вирус боливийской геморрагической лихорадки, вирус Сабиа, вирус венесуэльской геморрагической лихорадки, вирус лихорадки Ласса, вирус Мачупо, вирус лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), буньявирусов, таких как вирус крымско-конголезской геморрагической лихорадки, хантавирус, вирус геморрагической лихорадки с почечным синдромом, вирус лихорадки долины Рифт, филовирусов, включая вирус Эбола и вирус Марбург, флавивирусов, включая вирус болезни Кьясанурского леса, вирус омской геморрагической лихорадки, вирус клещевого энцефалита и парамиксовирусов, таких как вирус Хендра и вирус Нипах, вирусов черной и белой оспы (натуральной оспы) альфавирусов, таких как венесуэльский вирус энцефалита лошадей, восточный вирус энцефалита лошадей, западный вирус энцефалита лошадей, коронавируса, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом (SARS-CoV), вируса лихорадки Западного Нила и любых вирусов, вызывающих энцефалит.
Согласно одному из вариантов реализации изобретение обеспечивает упаковку клеток, производящих частицы рекомбинантного ретровируса, например лентивируса, псевдотипированного с гликопротеином вируса везикулярного стоматита (VSV-G).
- 17 032699
В настоящей заявке термины псевдотип или псевдотипирование относятся к вирусам, оболочечные белки которых заменены оболочечными белками других вирусов, обладающими желаемыми свойствами. Например, ВИЧ может быть псевдотипирован с оболочечными гликопротеинами вируса везикулярного стоматита, что позволяет ВИЧ инфицировать более широкий спектр клеток, поскольку оболочечные белки ВИЧ (кодируемые геном env), как правило, нацеливают вирус на клетки, экспрессирующие CD4 (CD4+ клетки). Согласно предпочтительному варианту реализации, лентивирусные оболочечные белки подвергаются псевдотипированию с VSV-G. Согласно одному из вариантов реализации изобретение обеспечивает упаковку клеток, производящих рекомбинантный ретровирус, например лентивирус, псевдотипированный с оболочечным гликопротеином вируса везикулярного стоматита.
В настоящей заявке термин пакующая клеточная линия относится к клеточным линиям, не содержащим упаковочный сигнал, но постоянно, либо временно экспрессирующим вирусные структурные белки и репликативные ферменты (например, gag, pol и env), необходимые для корректной упаковки вирусных частиц. Для получения упаковочных клеток согласно изобретению может использоваться любая клеточная линия. Как правило, клетки представляют собой клетки млекопитающих. Согласно определенному варианту реализации, клетки, используемые для получения упаковочных клеток, представляют собой клетки человека. Применимые клеточные линии включают, но не ограничиваются, например, следующими клетками: CHO, ВНК, MDCK, C3H 10T1/2, FLY, Psi-2, BOSC 23, PA317, WEHI, COS, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, MRC5, A549, HT1080, 293, 293T, B-50, 3T3, NIH3T3, HepG2, Saos-2, Huh7, HeLa, W163, 211 и 211A. Согласно предпочтительным вариантам реализации упаковочные клетки представляют собой клетки 293, 293T или A549. Согласно другому предпочтительному варианту реализации, используются клетки A549.
В настоящей заявке термин клеточных линий-продуцентов относится к клеточным линиям, способным производить рекомбинантные ретровирусные частицы, содержащие пакующие клеточные линии и конструкции вектора-переносчика, несущие сигнал упаковки. Производство инфекционных вирусных частиц и исходных растворов вирусов может осуществляться с применением стандартных методов. Способы получения исходных растворов вирусов хорошо известны в данной области техники и описаны, например, у Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633 и N. R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113. Инфекционные вирусные частицы могут быть выделены из упаковочных клеток с применением стандартных методов. Например, инфекционные частицы могут быть выделены посредством лизиса клеток, либо из надосадочной жидкости культур клеток, как известно в данной области знаний. При необходимости, выделенные вирусные частицы могут подвергнуться дополнительной очистке. Применимые способы очистки хорошо известны специалистам в данной области техники.
Термины усиливать, стимулировать, повышать, увеличивать относятся к способности композиций и/или способов согласно изобретению вызывать, служить причиной или способствовать продукции большего количества трансдуцированных клеток в сравнении с количеством клеток, получаемых в присутствии переносчика или контрольной молекулы/композиции по отдельности. Согласно одному из вариантов реализации, стволовая кроветворная клетка, трансдуцированная с помощью композиций и способов согласно изобретению, дает начало большему количеству трансдуцированных клеток в сравнении с клетками, трансдуцированными с помощью существующих композиций и способов. Повышение уровня трансдукции клеток может быть зафиксировано с помощью методов, известных в данной области, таких как анализ по гену-репортеру, ПЦР в масштабе реального времени и экспрессия поверхностных белков клетки и т.п. Повышенный или усиленный уровень трансдукции, как правило, указывает на статистически значимое повышение количества трансдуцированных клеток, например, в 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 или больше раз (например, в 500 или 1000 раз) (включая все целые и дробные множители >1, например, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 и т.п.) раз превышающее количество клеток, трансдуцированных в присутствии вектора, контрольной композиции по отдельности или трансдуцированных других существующим способом.
Термины ослаблять, понижать, уменьшать, подавлять относятся композициям и/или способам, в результате применения которых количество трансдуцированных клеток существенно ниже в сравнении с количеством клеток, получаемых с помощью композиций и/или способов согласно настоящему изобретению. Пониженное или меньшее количество, как правило, указывает на статистически значимое понижение количества трансдуцированных клеток, например, в 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 или больше раз (например, в 500 или 1000 раз) (включая все целые и дробные множители >1, например, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 и т.п.) раз ниже количества клеток, трансдуцированных с помощью композиций и/или способов согласно настоящему изобретению.
Термины сохраняется, поддерживается, не меняется, без существенных изменений, без существенного понижения относятся, как правило, к физиологическим реакциям в определенных клеточных линиях, по интенсивности сравнимым с реакциями в присутствии переносчика или контрольной молекулы/композиции по отдельности. Сравнимый уровень интенсивности реакции указывает на отсутствие существенного отличия от уровня реакции в стандартных условиях.
Применение терминов и понятий в единственном числе может относиться также и к множеству
- 18 032699 описываемых объектов. Например, элемент может относиться и к множеству элементов.
Разделительные/пояснительные союзы или и либо могут подразумевать как объекты по отдельности, так и вместе, а также их комбинации. В настоящей заявке термины включает, содержит и несет являются синонимами.
В настоящей заявке термин приблизительно относится к количеству, уровню, оценке, числу, частоте, процентной доле, размеру, величине, массе или длине, отличающимся от стандартного количества, уровня, оценки, числа, частоты, процентной доли, размера, величины, массы или длины на 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1%. Согласно одному из вариантов реализации термин приблизительно относится к диапазону в пределах ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% или ±1% от стандартного количества, уровня, оценки, числа, частоты, процентной доли, размера, величины, массы или длины.
В настоящем описании, если не оговорено иначе, термины включает, содержит, включающий подразумевают перечисление указанных этапов, элементов или совокупностей этапов или элементов, не исключая любые иные этапы, элементы или совокупности этапов или элементов. Состоит из означает, что обобщающее слово ограничивается перечисленными далее однородными членами. Таким образом, фраза состоит из означает, что перечисленные элементы являются необходимыми, и никакие другие элементы, кроме перечисленных, не могут быть добавлены. Фраза главным образом состоит из означает, что обобщающее слово ограничивается перечисленными элементами и другими элементами, чье присутствие не влияет на активность или функцию перечисленных элементов. Таким образом, фраза состоит из означает, что перечисленные элементы являются необходимыми, в то время как присутствие других элементов необязательно и зависит от их влияния на активность или функцию перечисленных элементов.
В настоящем описании ссылки на вариант реализации означают, что определенное свойство, структура или характеристика, описанное в связи с данным вариантом реализации, включено по меньшей мере в один из вариантов реализации согласно настоящему изобретению. Таким образом, фразы согласно одному из вариантов реализации в настоящем описании необязательно относятся к одному и тому же варианту реализации. Более того, определенные свойства, структуры и характеристики могут подразумеваться в различных приемлемых комбинациях в описании одного или различных вариантов реализации.
В дальнейшем описании для более полного понимания различных вариантов реализации изобретения приведены некоторые конкретные детали. Тем не менее, специалистам в данной области будет очевидно, что применение изобретения не требует описания этих деталей. Кроме того, следует понимать, что отдельные векторы или группы векторов, являющиеся производными описанных в настоящей заявке различных комбинаций структур и заместителей, считаются объектами изобретения так же, как если бы они были описаны отдельно. Таким образом, выбор определенных векторных структур или определенных заместителей также входит в объем изобретения.
C. Вирусные векторы
Испытания показали, что ретровирусные и лентивирусные векторы являются переносчиками, которые с высокой долей надежности обеспечивают интегрирование генов, представляющих интерес, например кодирующих терапевтические полипептиды, в широкий спектр клеток-мишеней. В частности, настоящее изобретение относится к улучшенной системе доставки векторов в популяции клеток, вводимых субъектам в рамках проведения генной терапии.
Настоящее изобретение обеспечивает векторы-переносчики, применимые в способах согласно изобретению. Специалистам в данной области техники очевидно, что такого рода векторы-переносчики могут быть получены из различных вирусных векторов; согласно определенным вариантам реализации, вектор-переносчик представляет собой ретровирусный или лентивирусный вектор, в частности потому, что лентивирусные векторы способны обеспечить эффективную доставку, интеграцию и длительную экспрессию трансгенов в клетках, находящихся в состоянии покоя как in vitro, так и in vivo. В данной области техники известны различные лентивирусные векторы, см. Naldini et al., (1996a, 1996b, and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, патенты США №№ 6013516 и 5994136, любой из которых может применяться для получения вектора-переносчика согласно настоящему изобретению.
Как правило, указанные векторы конструируются на основе плазмид или вирусов таким образом, чтобы обеспечивать перенос и доставку последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих терапевтические полипептиды, в клетку-мишень.
Согласно типичным вариантам реализации, ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. Таким образом, векторы могут быть производными ВИЧ-1, ВИЧ-2, вируса иммунодефицита обезьян (SIV), вируса иммунодефицита кошачьих (FIV), вируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV), вируса болезни Джембрана (JDV), вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV), вируса артрита-энцефалита коз (CAEV) и т.п. Основные кодирующие последовательности вектора-производного ВИЧ (т.е., цис-действующие элементы цепи и гены gag, pol и rev ВИЧ), как правило, являются предпочтительными согласно большинству аспектов настоящего изобретения ввиду того, что ВИЧ-конструкты отличаются наибольшей эффективностью в трансдукции клеток человека.
- 19 032699
Несмотря на то, что отдельные типичные варианты реализации включают более детальное описание векторов, композиций и способов, применимых для терапии нарушений кроветворения, например гемоглобинопатий, изобретение не ограничивается указанными описаниями. Специалистам в данной области техники очевидно, что принципы, описанные в настоящей заявке, могут применяться в генной терапии других систем организма, например нервной системы, включая глаз, центральную и периферическую нервную систему; системы кровоснабжения; мышечного аппарата; костной системы; органов, включая кожу, сердце, легкие, поджелудочную железу, печень, почки, кишечник и т.п.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает векторы, например лентивирусные векторы, содержащие последовательности, регулирующие экспрессию полинуклеотидов, представляющих интерес, например генов глобина, в определенных клетках или клеточных линиях. Применение последовательностей, регулирующих экспрессию и специфичных к типу клеток или линии клеток, обеспечивает дополнительную безопасность, позволяя экспрессировать полинуклеотиды лишь в определенную стадию дифференциации клеток в клеточной линии; таким образом, векторы согласно изобретению понижают вероятность эктопической экспрессии в клетках, для которых экспрессия этих полинуклеотидов нехарактерна.
Согласно одному их примеров, не ограничивающих применение изобретения, последовательность, регулирующая экспрессию, может представлять собой универсальную последовательность, как указано в настоящей заявке.
Согласно другому примеру, не ограничивающему применение изобретения, последовательность, регулирующая экспрессию, может обладать специфичностью к стволовым клеткам и стимулировать экспрессию полинуклеотидов, представляющих интерес, в эмбриональных стволовых клетках, стволовых клетках нервной ткани, мезенхимальных стволовых клетках, стволовых клетках печени, стволовых клетках поджелудочной железы, стволовых клетках сердца, стволовых клетках почек или стволовых кроветворных клетках.
Согласно другому примеру, не ограничивающему применение изобретения, последовательность, регулирующая экспрессию, может обладать специфичностью к определенным клеткам или клеточным линиям и стимулировать экспрессию полинуклеотидов, представляющих интерес, в кроветворных стволовых клетках, кроветворных клетках-предшественниках, миелоидных клетках, лимфоидных клетках, клетках-предшественниках тромбоцитов, тучных клетках, клетках-предшественниках эритроцитов, клетках-предшественниках гранулоцитов и клетках-предшественниках моноцитов.
Согласно определенным вариантам реализации вектор согласно изобретению может применяться для экспрессии полинуклеотида, например полинуклеотида, представляющего интерес, в кроветворных клетках одного или нескольких типов, включая, но не ограничиваясь, кроветворные стволовые клетки, кроветворные клетки-предшественники, миелоидные клетки-предшественники, лимфоидные клеткипредшественники, клетки-предшественники тромбоцитов, клетки-предшественники эритроцитов, клетки-предшественники гранулоцитов, клетки-предшественники моноцитов, мегакариобласты, промегакариоциты, мегакариоциты, тромбоциты, проэритробласты, базофильные эритробласты, полихроматические эритробласты, ортохроматические эритробласты, полихроматические эритроциты, эритроциты (красные кровяные клетки), базофильные промиелоциты, базофильные миелоциты, базофильные метамиелоциты, базофилы, нейтрофильные промиелоциты, нейтрофильные миелоциты, нейтрофильные метамиелоциты, нейтрофилы, эозинофильные промиелоциты, эозинофильные миелоциты, макрофаги, дендритные клетки, лимфобласты, пролимфоциты, натуральные киллеры (NK-клетки), малые лимфоциты, T-лимфоциты, B-лимфоциты, плазматические клетки и лимфоидные дендритные клетки.
Согласно предпочтительным вариантам реализации вектор согласно изобретению может применяться для экспрессии полинуклеотидов, например генов, представляющих интерес, в одном или нескольких типах эритроидных клеток, например в проэритробластах, базофильных эритробластах, полихроматических эритробластах, ортохроматических эритробластах, полихроматических эритроцитах и эритроцитах (красных кровяных клетках).
Согласно одному из вариантов реализации вектор содержит промотор, энхансер или промотор/энхансер кроветворных клеток, функционально связанный с геном, представляющим интерес, например глобином.
Применимые последовательности, регулирующие экспрессию, специфичные к определенным клеткам или типам клеток, включают, но не ограничиваются, последовательности, регулирующие экспрессию, специфичные к кроветворным клеткам, например промотор стволовых кроветворных клеток и промотор кроветворных клеток-предшественников. Согласно вариантам реализации, где экспрессия генов, вызывающих интерес, должна происходить в одном или нескольких типах эритроидных клеток, применимая последовательность, регулирующая экспрессию, может включать, не ограничиваясь, промотор, специфичный к эритроидным клеткам, и, возможно, энхансер, специфичный к эритроидным клеткам, промотор β-глобина человека, LCR-последовательность β-глобина человека, энхансер HS40 α-глобина человека и промотор анкирина-1.
Согласно одному из вариантов реализации последовательности, регулирующие экспрессию, специфичные к типу клеток или к клеточной линии, включают, но не ограничиваются клетками микроглии.
- 20 032699
Согласно определенным вариантам реализации, промотор включает промотор MND (синтетического промотора, содержащего область U3 LTR-последовательности, либо его транскрипционно активный фрагмент, функционально связанный с геном, представляющим интерес, например ABCD1.
Применение последовательностей, регулирующих экспрессию и специфичных к типу клеток или линии клеток, обеспечивает дополнительную безопасность, позволяя экспрессировать полинуклеотиды лишь в определенную стадию дифференциации клеток в клеточной линии; таким образом, векторы согласно изобретению понижают вероятность эктопической экспрессии в клетках, для которых экспрессия этих полинуклеотидов нехарактерна. Согласно одному из вариантов реализации изобретение обеспечивает вектор, включающий одну или несколько LTR-последовательностей и последовательность, регулирующую экспрессию, функционально связанные с геном, представляющим интерес. Согласно сопутствующему варианту реализации последовательность, регулирующая экспрессию, представляет собою последовательность, специфичную к эритроидным клеткам, включая промотор β-глобина человека, LCRпоследовательность β-глобина человека, энхансер α-глобина HS40 человека и промотор анкирина-1.
Согласно различным вариантам реализации вектор сконструирован таким образом, чтобы обеспечить лечение, профилактику или улучшить течение определенных заболеваний, нарушений и состояний кроветворной системы. Например, настоящее изобретение обеспечивает векторы для генной терапии гемоглобинопатий, связанных с генами, представляющими интерес, выбранными из группы, состоящей из α-глобина человека, β-глобина человека, дельта-глобина человека, γ-глобина человека, а также их биологически активных вариантов и фрагментов. Согласно одному из вариантов реализации, ген глобина выбирают из группы, состоящей из: гена β-глобина дикого типа, гена β-глобина человека с одной или несколькими делециями интронных последовательностей и мутированного гена β-глобина человека, кодирующего по меньшей мере один аминокислотный остаток, предотвращающий серповидно-клеточную анемию.
Согласно определенному варианту реализации, где состояние, при котором применяется генная терапия - серповидно-клеточная анемия, ген, представляющий интерес, может кодировать белок, предотвращающий серповидноклеточную анемию. В настоящей заявке белок, предотвращающий серповидноклеточную анемию относится к полипептиду, предотвращающему или способствующему устранению патологических процессов, ведущих к образованию серповидно-клеточных форм эритроцитов. Согласно одному из вариантов реализации изобретения трансдуцированные клетки обеспечивают доставку белков, предотвращающих серповидно-клеточную анемию, субъекту, страдающему серповидно-клеточной анемией. Белки, предотвращающие серповидно-клеточную анемию, также включают мутированные формы β-глобина, содержащие аминокислотные остатки, предотвращающие серповидно-клеточную анемию.
Согласно предпочтительному варианту реализации одним из указанных вариантов глобина является ген βA-глобина человека с заменой треонина на глутамин в позиции 87 ^A-T87Q) или ген βA-глобина человека (где зрелая форма полипептида подверглась процессингу с отщеплением N-концевого метионина, кодон 87 зрелого полипептида кодирует треонин; в нерасщепленном полипептиде глобина треонин кодирует кодон 88). Согласно настоящему изобретению, в качестве аминокислотных остатков, предотвращающих серповидно-клеточную анемию, могут служить и другие остатки, известные в данной области. Например, см. патент США № 6051402; патент США № 5861488; патент США № 6670323; патент США № 5864029; патент США № 5877288; Levasseur et al., Blood 102: 4312-4319 (2003), содержание которых включено в данное описание посредством ссылки.
Согласно определенным вариантам реализации вектор, содержащий последовательность, регулирующую экспрессию в эритроидных клетках, применяется для лечения, профилактики или улучшения течения большого числа нарушений, помимо гемоглобинопатий. Предшественники красных кровяных клеток представляют собой удобную для применения клеточную популяцию для экспрессии полипептидов, которые могут быть введены в циркуляцию и, таким образом доставлены до клеток-мишеней системно. Такого рода доставку белка in vivo обеспечивает, например, фактор IX человека - фактор свертывания крови, не вырабатывающийся у пациентов, страдающих от гемофилии B, см., например, A. H. Chahg, et al., Molecular Therapy (2008), включенный в настоящую заявку посредством ссылки.
Согласно одному из вариантов реализации клетки, трансдуцированные согласно изобретению, могут применяться как фабрики по секреции белков in vitro, ex vivo или in vivo. Например, вектор, включающий последовательность, регулирующую экспрессию в эритроидных клетках, может применяться для получения белков эритроидных клеток, развившихся их стволовых кроветворных клеток или стволовых эмбриональных клеток, в больших количествах in vitro.
Полинуклеотиды, представляющие интерес, экспрессируемые указанным способом, включают, но не ограничиваются аденозиндеаминазу, ферменты, связанные с лизосомными болезнями накопления, аполипопротеин E, нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), костный морфогенетический белок 2 (BMP-2), костный морфогенетический белок 6 (BMP-6), костный морфогенетический белок 7 (BMP-7), кардиотрофин 1 (CT-1), CD22, CD40, цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), CCL1CCL28, CXCL1-CXCL17, CXCL1, CXCL2, CX3CL1, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), допамин, эритропоэтин, фактор IX, фактор VIII, эпидермальный фактор роста (EGF), эстроген, FAS-лиганд, фактор роста фибробластов 1 (FGF-1), фактор роста фибробластов 2 (FGF-2), фактор роста фибробластов 4
- 21 032699 (FGF-4), фактор роста фибробластов 5 (FGF-5), фактор роста фибробластов 6 (FGF-6), фактор роста фибробластов 7 (FGF-7), фактор роста фибробластов 10 (FGF-10), Flt-3, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гормон роста, фактор роста гепатоцитов (HGF), интерферон альфа (IFN-a), интерферон бета (IFN-b), интерферон у (IFHg), инсулин, глюкагон, инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), инсулиноподобный фактор роста 2 (IGF-2), интерлейкин 1 (IL-1), интерлейкин 2 (IL-2), интерлейкин 3 (IL-3), интерлейкин 4 (IL-4), интерлейкин 5 (IL-5), интерлейкин 6 (IL-6), интерлейкин 7 (IL-7), интерлейкин 8 (IL-8), интерлейкин 9 (IL-9), интерлейкин 10 (IL-10), интерлейкин 11 (IL-11), интерлейкин 12 (IL-12), интерлейкин 13 (IL-13), интерлейкин 15 (IL-15), интерлейкин 17 (IL-17), интерлейкин 19 (IL-19), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), белок хемотаксиса моноцитов 1 (MCP-1), макрофагальный белок воспаления 3a (MIP-3a), макрофагальный белок воспаления 3b (MIP-3b), фактор роста нервной ткани (HTF), нейротрофин 3 (NT-3), нейротрофин 4 (NT-4), паратиреоидный гормон, фактор роста тромбоцитов AA (PDGF-AA), фактор роста тромбоцитов AB (PDGF-AB), фактор роста тромбоцитов BB (PDGFBB), фактор роста тромбоцитов CC (PDGF-CC), фактор роста тромбоцитов DD (PDGF-DD), хемокин, выделяемый T-клетками при активации RANTES, фактор стволовых клеток (SCF), фактор стромальных клеток 1 (SDF-1), тестостерон, трансформирующий фактор роста альфа (TGF-a), трансформирующий фактор роста бета (TGF-b), фактор некроза опухолей альфа (TNF-a), Wnt1, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt14, Wnt15, Wnt16, еж Соник (Sonic hedgehog), эфиопский еж (Desert hedgehog) и индийский еж (Indian hedgehog).
Согласно одному из вариантов реализации вектор согласно изобретению содержит по меньшей мере одну модифицированную или немодифицированную ретровирусную LTR-последовательность, например лентивирусную LTR-последовательность, промотор β-глобина и локус контролирующую область β-глобина, функционально связанные с полинуклеотидом, представляющим интерес, например, кодирующим полипептид глобина. Возможные модификации LTR-последовательностей включают, но не ограничиваются: замену 5'-концевой LTR-последовательности гетерологичным промотором, например, промотором цитомегаловируса, промотором вируса саркомы Рауса, промотором тимидинкиназы, промотором вируса SV40; а также одну или несколько модификаций, вставок и/или делеций 3'-концевой LTRпоследовательности, как описано в настоящей заявке.
Согласно определенному варианту реализации экспрессия полинуклеотида в эритроидных клетках обеспечивается посредством использования промотора β-глобина человека, локус контролирующей области β-глобина человека, содержащей сверхчувствительные к ДНКазе I сайты 2, 3 и 4, и/или 3'-концевой энхансер β-глобина. Согласно различным вариантам реализации, вектор согласно изобретению включает один или несколько элементов из группы, состоящей из: пси-последовательности для упаковки (Ψ+), центрального полипуринового тракта/ДНК-флэп элемента (cPPT/FLAP), элемента экспорта ретровируса, посттранскрипционного регулирующего элемента, селектируемого маркера и апоптотического гена, как описано в настоящей заявке.
Согласно различным вариантам реализации векторы согласно изобретению содержат промотор, функционально связанный с генами, кодирующими полипептид, который обеспечивает лечений гемоглобинопатий в кроветворных клетках. Векторы могут содержать одну или несколько LTRпоследовательной, подвергшихся одной или нескольким модификациям, таким как одна или несколько замен, вставок или делеций нуклеотидов. Кроме того, векторы могут содержать один или несколько дополнительных элементов для повышения эффективности трансдукции (например, центральный полипуриновый тракт/ДНК-флэп элемент(cPPT/FLAP), пси-последовательность для упаковки (Ψ'). элемент, связывающийся с белком rev (RRE-структуру) и/или другие элементы, повышающие уровень экспрессии терапевтических генов (например, поли-A последовательности).
Согласно одному из вариантов реализации вектор содержит ретровирусный левый (5') длинный концевой повтор (LTR-последовательность), пси-последовательность для упаковки (Ψ+), центральный полипуриновый тракт/ДНК-флэп элемента(cPPT/FLAP), элемент экспорта ретровируса, промотор βглобина и локус контролирующую область (LCR) β-глобина и, возможно, 3'-концевой энхансер βглобина, функционально связанные с полинуклеотидом, представляющим интерес, и ретровирусный правый (3') длинный концевой повтор (LTR-последовательность), включающий один или несколько инсуляторов или поли-A последовательность.
Согласно определенному варианту реализации вектор согласно изобретению представляет собой лентивирусный вектор, состоящий из левого (5') длинного концевого повтора (LTR-последовательности) ВИЧ-1; пси-последовательности для упаковки (Ψ+); центрального полипуринового тракта ВИЧ-1/ДНКфлэп элемента(cPPT/FLAP); элемента, связывающегося с белком rev (RRE-структуры); промотора βглобина и локус контролирующей области (LCR) β-глобина, функционально связанных с геном, представляющим интерес, и правого (3') длинного концевого повтора (LTR-последовательности), включающего: один или несколько инсуляторов и поли-A последовательность β-глобина кролика (rflgpA).
Согласно различным вариантам реализации векторы согласно изобретению содержат промотор, функционально связанный с генами, кодирующими полипептид, который обеспечивает лечение адрено
- 22 032699 лейкодистрофий и/или адреномиелонейропатий в клетках микроглии. Векторы могут содержать одну или несколько LTR-последовательной, подвергшихся одной или нескольким модификациям, таким как одна или несколько замен, вставок или делеций нуклеотидов. Кроме того, векторы могут содержать один или несколько дополнительных элементов для повышения эффективности трансдукции (например, центральный полипуриновый тракт/ДНК-флэп элемент(cPPT/FLAP), пси-последовательность для упаковки (Ψ+), элемент, связывающийся с белком rev (RRE-структуру) и/или другие элементы, повышающие уровень экспрессии терапевтических генов (например, поли-A последовательности).
Согласно определенному варианту реализации, вектор-переносчик согласно изобретению содержит: ретровирусный левый (5') длинный концевой повтор (LTR-последовательность), центральный полипуриновый тракт/ДНК-флэп элемента (cPPT/FLAP), элемент экспорта ретровируса, промотор, активный в клетках микроглии, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим АТФсвязывающую кассету подсемейства D (ALD), полипептид (ABCD1), и ретровирусный правый (3') длинный концевой повтор.
Согласно определенному варианту реализации, изобретение обеспечивает лентивирусный вектор, состоящий из: левого (5') длинного концевого повтора (LTR-последовательности) ВИЧ-1; псипоследовательности для упаковки (Ψ+); центрального полипуринового тракта ВИЧ-1/ДНК-флэп элемента (cPPT/FLAP); элемента, связывающегося с белком rev (RRE-структуры); промотора MND (синтетического промотора, содержащего область U3 длинного концевого повтора (LTR-последовательности), функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим полипептид ABCD1 человека; самоинактивирующегося правого (3') длинного концевого повтора (LTR-последовательности) ВИЧ-1 и поли-A последовательности β-глобина кролика (rPgpA).
Специалисту в данной области техники очевидно, что различные другие варианты реализации могут быть сформулированы на основе вариантов реализации согласно настоящему изобретению, в которых, например, терапевтический трансген или ген, представляющий интерес экспрессируются в клеткахмишенях или в клеточных линиях, отличных от линии кроветворных клеток, например, в линии клеток нервной ткани.
D. Способы трансдукции
Настоящее изобретение обеспечивает, в частности, способы и композиции, существенно повышающие эффективность трансдукции клеток-мишеней. Не ограничиваясь никакой определенной теорией, подразумевается, что способы и композиции согласно изобретению могут применяться для трансдукции существенно большего числа клеток, используя существенно меньшее число вирусов, таким образом минимализируя риск геномных изменений и/или активации протоонкогенов в геноме терапевтических клеток. Минимализация риска активации протоонкогенов при интеграции в геном и других геномных изменений в терапевтических клетках является важным фактором при создании применимого протокола генной терапии, так как это минимализирует вероятность того, что трансдуцированные клетки, обладающие характеристиками, схожими с раковыми клетками, будут клонально размножаться in vivo и дадут начало злокачественным и доброкачественным опухолям или заболеваниям, характеризующимся аномальной клеточной пролиферацией. Кроме того, в данной области отмечено, что трансдукция большим числом вирусов, как правило, обладает цитотоксическим эффектом в отношении трансдуцированных клеток. Таким образом, композиции и способы согласно настоящему изобретению также повышают выживаемость и жизнеспособность трансдуцированных клеток. В соответствии с этим, настоящее изобретение обеспечивает более безопасные и эффективные способы применения генной терапии.
Применение ретровирусных или лентивирусных векторов для доставки генов или других полинуклеотидов посредством инфицирования вирусом, а не посредством трансфекции известно как трансдукция. Согласно одному из вариантов реализации ретровирусные векторы трансдуцируются в клетки путем инфицирования и интеграции провирусов. Согласно определенным вариантам реализации клетка, например клетка-мишень, является трансдуцированной, если она содержит последовательность гена или другого полинуклеотида, доставленную в клетку путем инфицирования вирусным или ретровирусным вектором. Согласно определенным вариантам реализации, трансдуцированная клетка содержит одну или несколько последовательностей гена или другого полинуклеотида, доставленного в клеточный геном ретровирусным или лентивирусным вектором.
Согласно определенным вариантам реализации клетки-хозяева или клетки-мишени, трансдуцированные вирусным вектором согласно изобретению, экспрессируют терапевтический полипептид и вводят субъекту для лечения и/или профилактики заболеваний, нарушений или патологических состояний.
Получение инфекционных вирусных частиц и исходных растворов вируса может осуществляться стандартными способами. Способы получения исходных растворов вирусов известны в данной области техники и описаны, например, Y. Soneoka et al., (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633 и N. R. Landau etal. (1992) J. Virol. 66: 5110-5113.
Согласно определенным вариантам реализации вирусные частицы-производные ВИЧ-1 могут быть получены путем одновременной экспрессии упаковочных элементов вириона и вектора-переносчика в клетке-продуценте. Указанные клетки могут быть временно трансфицированы различными плазмидами. Как правило, для трансфекции применяют три-четыре плазмиды, но это число может возрасти в зависи
- 23 032699 мости от степени раздробления лентивирусных компонентов на отдельные единицы. Например, одна плазмида может кодировать коровые и ферментные компоненты вириона-производного ВИЧ-1. Такую плазмиду называют упаковочной плазмидой. Другая плазмида, как правило, кодирует оболочечные белки (белок), чаще всего, белок G вируса везикулярного стоматита (VSV G), ввиду его высоко стабильности и широкого тропизма. Эта плазмида может называться плазмидой экспрессии оболочки. Еще одна плазмида кодирует геном, переносимый в клетку-хозяин, то есть, собственно вектор, и называется вектором-переносчиком. Упаковочные плазмиды могут быть доставлены в клетку-хозяин стандартными способами, включая кальций-фосфатную трансфекцию, липофекцию или электропорацию. С помощью этого способа, а также его вариантов, можно достигнуть титра рекомбинантных вирусов порядка нескольких миллионов трансдуцирующих единиц на миллилитр (TU/мл). После центрифугирования можно получить исходные концентрации порядка приблизительно 108 TU/мл, 109 TU/мл, 1010 TU/мл, 1011 TU/мл, 1012 TU/мл или 1013 TU/мл.
Инфекционные вирусные частицы могут быть выделены из упаковочных клеток стандартными способами. Например, инфекционные частицы можно выделить посредством лизиса клеток или из надосадочной жидкости клеточной культуры, как известно в данной области. При необходимости, выделенные вирусные частицы могут подвергнуться дополнительной очистке. Применимые способы очистки хорошо известны специалистам в данной области.
Вирусы могут применяться для инфицирования клеток способами, хорошо известными в данной области техники in vivo, ex vivo или in vitro. В частности, когда клетки, например, CD34+ клетки, дендритные клетки, клетки периферийной крови или стволовые клетки трансдуцируются ex vivo, векторные частицы могут инкубироваться с клетками в дозах с величиной множественности заражения (MOI) порядка 1-50, 1 + 105 -50+105 трансдуцирующих единиц вирусного вектора на 105 клеток. Очевидно, что эта величина соответствует числу векторных единиц в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 и 50 MOI.
Также вирусы могут вводиться субъекту in vivo, непосредственно путем инъекции в клетки, ткани и органы, нуждающиеся в терапии. Множественность заражения при прямой инъекции должна составлять порядка 1-50, что также соответствует 1 + 105 - 50+105 трансдуцирующим единицам вирусного вектора на 105 клеток.
Также вирусы могут доставляться с учетом вирусного титра (TU/мл), измеряемого, например, с применением коммерчески доступного антигена p24, то есть, ИФА вирусного оболочечного белка p24. Следующая формула может применяться для измерения величины пг/мл p24: в наличии приблизительно 2000 молекул p24 на одну физическую частицу (PP) лентивируса: (2+103)+(24+103 Да p24 на PP), 48 + 106/число Авогадро = (48 + 106)/(6 + 1023)=8 + 10-17г p24 на PP, приблизительно 1PPP на 1 + 10-16г p24, 1+104 PPP на пг p24. Должным образом упакованный, псевдотипированный VSV-G лентивирусный вектор будет иметь индекс инфективности от 1 TU на 1000 физических частиц (PP) до 1 TU на 100 PP (или менее). Таким образом, границы интервала определяются величинами приблизительно от 10 до 100 TU/пг p24. Таким преобразованием можно получить величину в TU/мл.
Основываясь на полученном опыте, количество непосредственно вводимого лентивируса определяется величиной общего TU и может варьировать в зависимости от допустимого объема вводимой композиции и от типа ткани, куда лентивирус вводится. Например, в мозговую ткань допустимо введение весьма небольшого объема композиции, содержащей лентивирус, поэтому предпочтителен высокий титр, с величиной TU порядка приблизительно 1+106 - 1+107, приблизительно 1+106 - 1+ 108, 1+106 1 + 109, приблизительно 1 + 107 - 1 + 1010, 1 + 108 - 1 + 1011, приблизительно 1 + 108 - 1 + 1012, или приблизительно 1 + 1010 - 1 + 1012 или более, для каждой инъекции. В свою очередь, системное введение позволяет использовать значительно большие количества, с величиной TU порядка 1 + 108, 1 + 109, 1 + 1010, 1+ 1011, 1 + 1012, 1 + 1013, 1 + 1014 или 1 + 1015.
Настоящее изобретение подразумевает способы и композиции, обеспечивающие большую эффективность трансдукции клеток in vitro, ex vivo и in vivo, используя более низкие титры вируса для достижения эффективности трансдукции, сравнимой с описанными выше способами.
Определенные аспекты настоящего изобретения возникли благодаря тому, что неожиданно было обнаружено существенное повышение эффективности трансдукции in vitro, ex vivo или in vivo в присутствии ретровируса и одного или нескольких соединений, обеспечивающих усиление сигнального пути рецептора простагландина EP, таких как низкомолекулярные соединения или соединения, описанные в WO 2007/112084 и WO 2010/108028, каждое из которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. В настоящей заявке, термин усиливает сигнальный путь рецептора простагландина EP, как правило, относится к способности соединения усиливать клеточный сигнальный путь в направлении по ходу транскрипции рецептора простагландина EP в клетке в присутствии одного или нескольких указанных соединений в сравнении с активностью сигнального пути рецептора простагландина EP в их отсутствии. Способы измерения усиления или стимуляции активности сигнального пути простагландина EP известны в данной области и описаны, например, в WO 2010/108028, полностью включенной в настоящую заявку посредством ссылки.
Типичные примеры соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина EP, включают, но
- 24 032699 не ограничиваются указанными, низкомолекулярные соединения, например, низкомолекулярные органические соединения, простагландины, агонисты сигнального пути Wnt, агонисты сигнального пути цАМФ/фосфоинозитид-3-киназы (Т[31<)/серин-треониновой киназы (AKT), агонисты сигнального пути Ca2+, агонисты сигнального пути NO/ангиотензина и другие соединения, усиливающие сигнальный путь простагландина, выбранные из группы, состоящей из: мебеверина; флурандренолида; атенолола; пиндолола; габоксадола; оксихинолинкарбоновой кислоты; гидралазина; тиабендазола; бикукуллина; везамикола; перувозида; имипрамина; хлорпропамида; 1,5-пентаметилентетразола; 4-аминопиридина; диазоксида; бенфотиамина; 12-метоксидодеценовой кислоты; N-формилметионил-лейцилфенилаланина; галламина; IAA 94 и хлортрианизена, а также их производных.
Согласно предпочтительному варианту реализации соединение, усиливающее сигнальный путь простагландина, представляет собой природную или химически синтезированную молекулу или полипептид, который связывается и/или взаимодействует с рецептором EP, как правило, активируя или стимулируя одну или несколько последующих реакций сигнального пути, связанного с рецептором простагладнина EP, как описано в настоящей заявке и известно в данной области техники.
Согласно одному из вариантов реализации, соединение, усиливающее сигнальный путь простагландина, выбрано из группы, состоящей из: PGA2; PGB2; PGD2; PGEi (альпростадил (Caverject™; Edex™; Muse™; Prostin VR™)); PGE2; PGF2; PGI2 (эпопростенол (Flolan™; Prostacyclin™)); PGH2; PGJ2, а также их предшественников, метаболитов, производных и аналогов.
Другие типичные соединения, усиливающие сигнальный путь простагландина, включают, но не ограничиваются указанными: 15d-PGJ2; дельта12-PGJ2; 2-гидроксигептадекатриеновую кислоту (HHT); тромбоксан (TXA2 и TXB2); аналоги PGI2, например илопрост (Ventavis™) и трепростинил (Remodulin™); аналоги PGF2, например, травопрост (Travatan™), карбопрост трометамин (Hemabate™), тафлупрост (ZioptanI™), латанопрост (Xalatan™), биматопрост (Lumigan™; Latisse™), унопростон изопропил (Rescula™), клопростенол (Ciosin™, Cyclix™, Estrumate™, Lutaprost™, Onsett™, Planate™), эстрофан и суперфан; аналоги PGE1, например, мизопростол (Cytotec™) и бутапрост; также Corey alcoholA [[3α,4α,5β,6α]-(-)-[гексагидро-4-(гидроксиметил)-2-оксо-2H-циклопентафуран-5-ил][1,1'-бифенил ]-4карбоксилат]; Corey alcohol-B [2H-циклопентафуран-2-он,5-(бензоилокси)гексагидро-4(гидроксиметил)[3aR-(3α,4α,5β,6α)]]; и Corey diol ((3aR,4S,5R,6aS)гексагидро-5-гидрокси-4(гидроксиметил)-2Н-циклопентафуран-2-он).
Согласно одному из вариантов реализации соединение представляет собой лиганд рецептора простагландина EP, включая, но не ограничиваясь указанными: простагландин E2 (PGE2), а также его аналоги и производные. Как правило, простагландины относятся к гормоноподобным молекулам-производным жирных кислот, состоящим из 20 атомов углерода, включая 5-атомное кольцо, как описано в настоящей заявке и известно специалистам в данной области.
Типичные примеры аналогов или производных PGE2 включают, но не ограничиваются указанными: 16,16-диметил PGE2, 16-16 диметил PGE2 р-(р-ацетамидобензамидо) фениловый эфир, 11-дезокси16,16-диметил PGE2, 9-дезокси-9-метилен-16,16-диметил PGE2, 9-дезокси-9-метилен PGE2, 9-кето флупростенол, 5-транс PGE2, 17-фенил-омега-тринор PGE2, PGE2 сериноламид, метиловый эфир PGE2, 16фенил тетранор PGE2, 15(S)- 15- метил PGE2, 15 (R)- 15 -метил PGE2, 8-изо-15-кето PGE2, изопропиловый эфир 8-изо PGE2, 20-гидрокси PGE2, 11-дезокси PGEi, nocloprost, sulprostone, butaprost, 15-кето PGE2 и 19-Ш)-гидрокси PGE2.
Также, аналоги и производные простагландина включают соединения, сходные по строению с PGE2, где атом галогена является заместителем по позиции 9 (см., например, WO 2001/12596, включенный в настоящую заявку полностью посредством ссылки), а также 2-декарбокси-2фосфиникопроизводные, например, описанные в публикации США № 2006/0247214, включенной в настоящую заявку посредством ссылки.)
Согласно некоторым вариантам реализации соединение не представляет собой лиганд, отличный от PGE2. Согласно определенным вариантам реализации указанный лиганд выбирают из группы, состоящей из агонистов EP1, EP2, EP3 или EP4.
Согласно определенным вариантам реализации рецептор простагландина выбирают из группы, состоящей из EP1, EP2, EP3 и EP4.
Типичные примеры агонистов EP1, не относящихся к производным PGE2, включают, но не ограничиваются указанными: ONO-DI-004 и ONO-8713. Типичные примеры агонистов EP2, не являющиеся производными PGE2, включают, но не ограничиваются указанными: CAY10399, ONO_8815Ly, ONOAE1-259 и СР-533,536.
Другие примеры агонистов EP2, не относящихся к производным PGE2, включают карбазолы и флуорены, описанные в WO 2007/071456, полностью описанные в данной заявке посредством ссылки. Типичные примеры агонистов EP3, не относящихся к производным PGE2, включают, но не ограничиваются указанными: AE5-599, MB28767, GR 63799X, ONO-NT012 и ONO-AE-248. Типичные примеры агонистов EP4, не относящихся к производным PGE2, включают, но не ограничиваются указанными: ONO-4819, APS-999 Na, AH23848 и ONO-AE 1-329. Другие примеры агонистов EP2, не относящихся к производным PGE2, описаны в WO/2000/038663; патенте США № 6,747,037 и U.S. Patent No. 6610719, каждый из кото
- 25 032699 рых полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.
Согласно одному из вариантов реализации соединение, усиливающее сигнальный путь рецептора простагландина EP, представляет собой агонист Wnt. Типичные примеры агонистов Wnt включают, но не ограничиваются полипетидами-производными Wnt и ингибиторами гликоген-синтазы-киназы-3 (GSK3). Типичные примеры полипептидов-производных Wnt, применимые как соединения, усиливающие сигнальный путь рецептора простагландина EP, включают, но не ограничиваются: Wnt1, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt14, Wnt15, Wnt15, а также их биологически активные фрагменты.
Ингибиторы GSK3 применяются в качестве соединений, усиливающих сигнальный путь рецептора простагландина EP, присоединяясь и снижая активность GSI<3o или GSK3p. Типичные примеры ингибиторов GSK3 включают, но не ограничиваются указанными: BIO (6-броминдирубин-3'-оксим), LiCl, либо другие ингибиторы GSK3, как описано в патентах США №№ 6057117 и 6608063; в заявках на патент США №№ 2004/0092535 и 2004/0209878; АТФ-конкуретные, селективные ингибиторы GSK3 CHIR-911 и CHIR-837 (также обозначаемые как CT-99021 и CT-9802, соответственно). Chiron Corporation (Emeryville, CA).
Согласно другому варианту реализации, соединение, усиливающее сигнальный путь рецептора простагландина EP, действует через путь вторичных мессенджеров CAMP/PI3K/AKT и его выбирают из группы, состоящей из дибутирил цАМФ, форболового эфира, форсколина, скларелина (sclareline), 8бром-цАМФ, холерного токсина (CTx), аминофиллина, 2,4-динитрофенола (DNP), норэпинефрина, эпинефрина, изопротеренола, изобутилметилксантина (IBMX), кофеина, теофиллина (диметилксантина), дофамина, ролипрама, илопроста, гипофизарного пептида-активатора аденилатциклазы (PACAP) и вазоактивного интестинального полипептида (VIP), а также их производных.
Согласно другому варианту реализации, соединение, усиливающее сигнальный путь рецептора простагландина EP, действует через путь вторичных мессенджеров Ca2+ и его выбирают из группы, состоящей из Bapta-AM, фендилина, никардипина и их производных.
Согласно другому варианту реализации, соединение, усиливающее сигнальный путь рецептора простагландина EP, действует через сигнальный путь NO/ангиотензина и его выбирают из группы, состоящей из L-аргинина, нитропруссида натрия, ванадата натрия, брадикирина и их производных.
Согласно одному из вариантов реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ повышения эффективности трансдукции, включающий культивирование популяции клеток в присутствии ретровируса и одного или нескольких соединений, усиливающих сигнальный путь рецептора простагландина EP, выбранных из группы, состоящей из: простагландина, PGE2; PGD2; PGI2; линолевой кислоты; 13(s)HODE; LY171883; мидовой кислоты; эйкозатриеновой кислоты; эпоксиэйкозатриеновой кислоты; ONO259; Сау1039; агониста рецептора PGE2; 16,16-диметил PGE2; 19^)-гидрокси PGE2; 16,16-диметил PGE2 р-(р-ацетамидобензамидо) фенилового эфира; 11-дезокси-16,16-диметил PGE2; 9-дезокси-9-метилен16,16-диметил PGE2; 9-дезокси-9-метилен PGE2; сульпростона; сериноламида PGE2; метилового эфира PGE2; 16-фенил-тетранор PGE2; 15(Ъ)-15-метил PGE2; 15^)-15-метил PGE2; BIO; 8-бром-цАМФ; форсколина; ацетоксиметилового эфира 1,2-бис этан-Ы444-тетрауксусной кислоты; фендилина; никардипина; нифедипина; пимозида; строфантидина; ланатозида; L-аргинина; нитропруссида натрия; ванадата натрия; брадикинина; мебеверина; флурандренолида; атенолола; пиндолола; габоксадола; оксихинолинкарбоновой кислоты; гидралазина; тиабендазола; бикукуллина; везамикола; перувозида; имипрамина; хлорпропамида; 1,5-пентаметилентетразола; 4-аминопиридина; диазоксида; бенфотиамина; 12метоксидодеценовой кислоты; N-формил-метионил-лейцил-фенилаланина; галламина; IAA 94; и хлортрианизена.
Согласно определенному варианту реализации, настоящее изобретение обеспечивает способ повышения эффективности трансдукции, включающий культивирование популяции клеток в присутствии ретровируса и одного или нескольких соединений, являющихся лигандами рецептора простагландина EP, выбранных из группы, состоящей из 16,16-диметил PGE2; 16,16-диметил PGE2 p-(pацетамидобензамидо) фенилового эфира; 11-дезокси-16,16-диметил PGE2; 9-дезокси-9-метилен-16,16диметил PGE2; 9-дезокси-9-метилен PGE2; 9-кетофлупростенола, 5-транс PGE2, 17-фенил-омега-тринор PGE2, сериноламида PGE2, метилового эфира PGE2, 16-фенилтетранор PGE2, 15(Ъ)-15-метил PGE2, 15(R)15-метил PGE2, 8-изо-15-кето PGE2, 8-изопропилового эфира PGE2, 20-гидрокси PGE2, 11-дезокси PGEi, ноклопроста, сульпростона, бутапроста, 15-кето PGE2 и 19-^)-гидрокси PGE2.
Настоящее изобретение также подразумевает, что эффективность трансдукции клеток может быть повышена путем культивирования клеток в присутствии ретровируса, соединения, усиливающего сигнальный путь рецептора простагландина EP, например, PGE2, и одного или нескольких ингибиторов деацетилазы гистонов (HDAC).
Типичные примеры ингибиторов HDAC, применимые в соответствии с композициями и способами согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются указанными: TSA (трихостатин A) (см., например, Adcock, (2007) British Journal of Pharmacology 150:829-831), VPA (вальпроевую кислоту) (см., например, Munster, et al., (2007) Journal of Clinical Oncology 25: 18S: 1065), бутират натрия (NaBu) (см., например, Han, et al., (2007) Immunology Letters 108: 143-150), SAHA (субероиланилид гидроксамо
- 26 032699 вой кислоты или вориностат) (см., например, Kelly, et al., (2005) Nature Clinical Practice Oncology 2: 150157), фенилбутират натрия (см., например, Gore, et al., (2006) Cancer Research 66: 6361-6369), депсипептид (FR901228, FK228) (см., например, Zhu, et al., (2003) Current Medicinal Chemistry 3(3): 187-199), трапоксин (TPX) (см., например, Furumai, et al., (2001) PNAS 98(1): 87-92), пептид 1, содержащий циклическую гидроксамовую кислоту (CHAP1) (см., Furumai supra), MS-275 (см., например, Carninci, et al., WO 2008/126932, включенный в настоящую заявку посредством ссылки), LBH589 (см., например, Goh, et al., WO 2008/108741, включенный в настоящую заявку посредством ссылки) и PXD-101 (см., Goh, supra).
Настоящее изобретение подразумевает, что клетки могут культивироваться в присутствии ретровируса и соединения, усиливающего сигнальный путь рецептора простагландина EP и/или ингибитора HDAC в течение промежутка времени, приблизительно составляющего от 10 мин до 72 ч, от 30 мин до 72 ч, от 30 мин до 48 ч, от 30 мин до 24 ч, от 30 мин до 12 ч, от 30 мин до 8 ч, от 30 мин до 6 ч, от 30 мин до 4 ч, от 30 мин до 2 ч, от 1 до 2 ч, либо равного любому промежуточному значению в пределах, указанных выше.
Настоящее изобретение подразумевает, что клетки могут культивироваться в присутствии ретровируса и соединения, усиливающего сигнальный путь рецептора простагландина EP и/или ингибитора HDAC в течение приблизительно 30 мин, приблизительно 1 ч, приблизительно 2 ч, приблизительно 4 ч, приблизительно 5 ч, приблизительно 6 ч, приблизительно 7 ч, приблизительно 8 ч, приблизительно 9 ч, приблизительно 10 ч, приблизительно 11 ч, приблизительно 12 ч, приблизительно 13 ч, приблизительно 14 ч, приблизительно 15 ч, приблизительно 16 ч, приблизительно 17 ч, приблизительно 18 ч, приблизительно 19 ч, приблизительно 20 ч, приблизительно 21 ч, приблизительно 22 ч, приблизительно 23 ч, приблизительно 24 ч, приблизительно 48 ч, приблизительно 72 ч, либо в течение любого промежуточного временного интервала в пределах, указанных выше.
Настоящее изобретение подразумевает, что клетки могут культивироваться в присутствии одного или нескольких соединений, усиливающих сигнальный путь рецептора простагландина EP и/или один или несколько ингибиторов HDAC до культивирования с ретровирусом, во время культивирования или после него, либо комбинируя эти альтернативы в любой стадии из описанных процессов.
Кроме того, настоящее изобретение подразумевает, что клетки могут культивироваться в присутствии одного или нескольких соединений, усиливающих сигнальный путь рецептора простагландина EP, и ретровируса до культивирования, во время культивирования или после культивирования в присутствии одного или нескольких ингибиторов, либо комбинируя эти альтернативы в любой стадии из описанных процессов.
Настоящее изобретение также подразумевает, что клетки могут культивироваться в присутствии ретровируса до их культивирования в присутствии соединений, усиливающих сигнальный путь рецептора простагландина EP и/или в присутствии одного или нескольких ингибиторов HDAC, во время их культивирования в присутствии соединений, усиливающих сигнальный путь рецептора простагландина EP и/или в присутствии одного или нескольких ингибиторов HDAC или после их культивирования в присутствии соединений, усиливающих сигнальный путь рецептора простагландина EP и/или в присутствии одного или нескольких ингибиторов HDAC, либо комбинируя эти альтернативы в любой стадии из описанных процессов.
Кроме того, специалистам в данной области техники очевидно, способы повышения эффективности трансдукции согласно изобретению включают культивирование клеток в присутствии ретровируса, одного или нескольких соединений, усиливающих сигнальный путь рецептора простагландина EP и/или в присутствии одного или нескольких ингибиторов HDAC в течение первых 6 ч трансдукции, первых 12 ч трансдукции, первых 24 ч трансдукции, первых 48 ч трансдукции, первых 72 ч трансдукции, либо в течение любого промежуточного временного интервала в пределах, указанных выше.
Кроме того, настоящее изобретение подразумевает, что клетки могут трансдуцироваться в присутствии ретровируса и соединения, усиливающего сигнальный путь рецептора простагландина EP и/или ингибитора HDAC однократно, двукратно, трёхкратно или большее количество раз. Согласно другому варианту реализации, настоящее изобретение подразумевает, что клетки могут трансдуцироваться в присутствии ретровируса однократно, двукратно, трёхкратно или большее количество раз и в присутствии соединения, усиливающего сигнальный путь рецептора простагландина EP и/или ингибитора HDAC лишь однократно или двукратно.
Согласно определенному варианту реализации, изобретение подразумевает культивирование клеток в присутствии ретровируса, одного или нескольких соединений, усиливающих сигнальный путь рецептора простагландина EP и/или одного или нескольких ингибиторов HDAC, где культивирование с указанными агентами происходит в течение одинакового или разных промежутков времени, как описано в настоящей заявке.
Настоящее изобретение также подразумевает, что композиции и способы согласно изобретению могут повысить уровень трансдукции практически любого типа клеток на по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере
- 27 032699 приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или по меньшей мере приблизительно 100%.
Согласно определенным вариантам реализации эффективность трансдукции растет по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз, либо значительнее, в сравнении с клетками, трансдуцируемыми лишь в присутствии вектора.
Перед трансдукцией, в ее процессе или после нее клетки могут культивироваться в питательной среде, подходящей для поддержания жизнедеятельности, роста или пролиферации клеток. Применимые питательные среды и условия культивирования хорошо известны в данной области техники. Указанные среды включают, но не ограничиваются указанными: Dulbecco's Modified Eagle's Medium® (DMEM), DMEM F12 medium®, Eagle's Minimum Essential Medium®, F-12K medium®, Iscove's Modified Dulbecco's Medium®, RPMI- 1640 medium® и бессывороточная среда для культивирования и размножения кроветворных клеток SFEM®. Различные среды также доступны в составах с низким содержанием глюкозы, включающих пируват натрия или не содержащих его.
Для обеспечения клеток дополнительными агентами, позволяющими оптимизировать процесс роста, могут применяться и другие компоненты. Указанные соединения включают инсулин, трансферрин, соединения натрия и селена, а также их комбинации. Они могут входить в состав растворов солей, включающих, но не ограничивающихся: Hanks' Balanced Salt Solution® (HBSS), Earle's Salt Solution®, антиоксидантные агенты, агенты MCDB-201®, фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), аскорбиновую кислоту и 2-фосфат аскорбиновой кислоты, а также аминокислоты. Многие питательные среды содержат аминокислоты, однако некоторые нуждаются в добавлении дополнительных аминокислот. Указанные аминокислоты включают, но не ограничиваются: L-аланин, L-аргинин, L-аспарагиновую кислоту, Lаспарагин, L-цистеин, L-цистин, L-глутами новую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, Lизолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, Lтрипрофан, L-тирозин и L-валин. Необходимые концентрации указанных добавок могут быть определены специалистами в данной области техники.
Гормоны также могут эффективно применяться в клеточных культурах согласно настоящему изобретению и включают, не ограничиваясь: D-альдостерон, диэтилстилбэстрол (DES), дексаметазон, βэстрадиол, гидрокортизон, инсулин, пролактин, прогестерон, соматостатин/гормон роста человека (HGH), тиротропин, тироксин и L-тиронин.
Липиды и липидные переносчики также могут использоваться в качестве дополнительных агентов клеточной культуры, в зависимости от типа клетки и ее пути дифференциации. Указанные липиды и переносчики могут включать, не ограничиваясь, циклодекстрин (α, β, γ), холестерин, линолевую кислоту, связанную с альбумином, свободную линолевую кислоту, линолевую-олеиновую-арахидоновую кислоту, связанную с альбумином, и другие варианты.
Клетки также могут культивироваться в среде с низким содержанием сыворотки или в среде, без содержания сыворотки. Среды без содержания сыворотки описаны, например, в патенте США № 7015037. Различные типы клеток могут культивироваться в средах с низким содержанием или без содержания сыворотки.
После трансдукции клетки могут культивироваться в условиях, подходящих для их роста и пролиферации. Согласно определенным вариантам реализации, трансдуцированные клетки культивируются в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 до трансплантации.
До, в процессе или после трансдукции клетки могут культивироваться в условиях, стимулирующих рост стволовых клеток или клеток-предшественников. При этом может применяться любой из способов, известных в данной области техники. Согласно определенным вариантам реализации, до, в процессе или после трансдукции клетки культивируются в присутствии одного или нескольких факторов роста, стимулирующих рост стволовых клеток или клеток-предшественников. Примеры факторов роста, стимулирующих рост стволовых клеток или клеток-предшественников, включают, но не ограничиваются указанными: лиганд тирозинкиназы Flt3, фактор стволовых клеток, а также интерлейкины 6 и 11, стимулирующие самообновление стволовых кроветворных клеток мышей. Другие примеры включают Sonic hedgehog, стимулирующий пролиферацию ранних кроветворных клеток-предшественников путем активации костного морфогенетического белка 4, Wnt3a, стимулирующий самообновление стволовых кроветворных клеток, нейротрофический фатор головного мозга (BDNF), эпидермальный фатор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), цилиарный нейротрофический фактор (CNF), трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), фактор роста фибробластов (FGF, например, основной FGF, кислый FGF, FGF17, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-8b, FGF-8c, FGF-9), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (GCSF), фактор роста тромбоцитов (PDGF, например, PDGFAA, PDGFAB, PDGFBB), гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (GMCSF), фактор стволовых клеток (SCF), фактор стромальных клеток (SCDF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), тромбопоэтин (TPO) или интерлей
- 28 032699 кин-3 (IL-3). Согласно определенным вариантам реализации, до, в процессе или после трансдукции клетки культивируются в присутствии одного или нескольких факторов роста, стимулирующих рост стволовых клеток или клеток-предшественников.
В то время, как описание и примеры, приведенные в настоящей заявке, фокусируются на трансдукции и селекции мультипонентных клеток, таких как стволовые кроветворные клетки, в частности, способы и композиции согласно изобретению могут также применяться для трансдукции и селекции других типов клеток, включая другие типы плюрипотентных и мультипотентных стволовых клеток, а также легко повреждаемых клеток, прежде не подлежащих селекции из трансдуцированных клеток для терапевтического применения.
Клетки, применяемые согласно способам настоящего изобретения могут быть получены от любого животного, предпочтительно, млекопитающего, например, от примата или человека, более предпочтительно, от человека, и могут быть трансплантированы в любое животное, предпочтительно, млекопитающее, более предпочтительно, в человека.
Клетки, применимые для трансдукции и введения согласно способам генной терапии согласно изобретению включают, но ограничиваются стволовые клетки, клетки-предшественники и дифференцированные клетки.
Типичные примеры стволовых клеток, применимых для трансдукции с композициями и способами согласно изобретению включают, но не ограничиваются указанными, эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плурипотентные стволовые клетки, мезодермальные стволовые клетки, энтодермальные стволовые клетки и эктодермальные стволовые клетки.
Согласно определенным вариантам реализации популяция или источник клеток, трансдуцируемых способами и композициями, описанными в настоящей заявке, включает мезенхимальные стволовые клетки и/или клетки-предшественники, мезодермальные стволовые клетки и/или клеткипредшественники, энтодермальные стволовые клетки и/или клетки-предшественники или эктодермальные стволовые клетки и/или клетки-предшественники. Согласно определенным вариантам реализации популяция или источник клеток, трансдуцируемых способами и композициями, описанными в настоящей заявке, включает стволовые клетки костного мозга, кровяные стволовые клетки и/или клеткипредшественники пуповины, костные стволовые клетки и/или клетки-предшественники, мышечные стволовые клетки и/или клетки-предшественники, кроветворные стволовые клетки и/или клеткипредшественники, жировые стволовые клетки и/или клетки-предшественники, хрящевые стволовые клетки и/или клетки-предшественники, нервные стволовые клетки и/или клетки-предшественники, стволовые клетки и/или клетки-предшественники кожи, стволовые клетки и/или клетки-предшественники печени, стволовые клетки и/или клетки-предшественники поджелудочной железы, стволовые клетки и/или клетки-предшественники почек, стволовые клетки и/или клетки-предшественники желудка и стволовые клетки и/или клетки-предшественники кишечника.
Согласно определенным вариантам реализации популяция или источник клеток, трансдуцируемых способами и композициями, описанными в настоящей заявке, включает, но не ограничивает остеобласты, хондроциты, адипоциты, скелетные мышцы, кардиомиоциты, нейроны, глиальные клетки (астроциты, олигодендроциты, шванновские клетки), клетки клетчатки (палочки и колбочки), клетки роговицы, клетки кожи, моноциты и макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, мегакариоциты/тромбоциты, дендритные клетки, T-клетки, B-клетки, NK-клетки, клетки желудка, клетки кишечника, гладкомышечные клетки, клетки сосудов, клетки мочевого пузыря, островковые клетки поджелудочной железы (α-, β- и дельта-клетки), гепатоциты, клетки почек, клетки надпочечников и клетки легких.
Согласно различным вариантам реализации, применение стволовых клеток предпочтительно ввиду их способности дифференцировать в соответствующий тип клеток при введении в определенную биологическую нишу in vivo.
Согласно предпочтительным вариантам реализации композиции и способы согласно изобретению применяются для повышения уровня трансдукции кроветворных стволовых клеток или клетокпредшественников.
Настоящее изобретение также подразумевает выделение и трансдукцию клеточных популяций. В настоящей заявке термин клеточная популяция относится к группе клеток, состоящей из любого числа и/или комбинации гомогенных или гетерогенных типов клеток, как описано в настоящей заявке. Например, для трансдукции кроветворных стволовых клеток или клеток-предшественников клеточная популяция может быть выделена из пуповинной крови, плацентарной крови, костного мозга или периферической крови. Клеточная популяция может состоять из приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, или приблизительно 100% трансдуцируемых клетокмишеней. Согласно определенным вариантам реализации кроветворные стволовые клетки и клеткипредшественники могут быть выделены из гетерогенной клеточной популяции способами, известными в данной области техники. Согласно определенным вариантам реализации кроветворные стволовые клетки и клетки-предшественники могут быть выделены после трансдукции клеточной популяции, согласно другим вариантам реализации клетки могут быть выделены до трансдукции.
- 29 032699
Клетки согласно изобретению могут быть криоконсервированы до или после трансдукции способами, известными в данной области. Будучи помещенными в питательную среду, клетки могут использоваться замороженными или не замороженными и храниться в замороженных исходных растворах, например в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с содержанием 40%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и 10%-ным диметилсульфоксидом (DMSO). Другие способы приготовления замороженных исходных растворов для культивирования клеток также доступны специалистам в данной области техники.
Согласно определенным вариантам реализации в клеточную популяцию, состоящую из стволовых клеток или клеток-предшественников, добавляется ретровирус, например лентивирус, а также одно или несколько соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина, например лигандов рецептора простагландина EP, такой как PGE2, либо его аналог или производное. Согласно определенным вариантам реализации в клеточную популяцию впоследствии добавляется один или несколько ингибиторов деацетилазы гистонов (HDAC). Согласно различным вариантам реализации указанные агенты добавляются в клеточную популяцию ex vivo или in vivo.
Согласно предпочтительным вариантам реализации стволовые клетки и клетки-предшественники представляют собой кроветворные стволовые клетки и клетки-предшественники.
E. Композиции клеточных культур
Настоящее изобретение также подразумевает клеточные композиции, содержащие клеточные культуры в питательных средах и ретровирус, а также одно или несколько соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина. Как описано в настоящей заявке, согласно определенным вариантам реализации, указанные композиции и способы применяются для клеточной генной терапии ex vivo и in vivo. Согласно некоторым вариантам реализации, питательная среда является фармацевтически приемлемой питательной средой.
Терапевтическая культура, клеточная культура, система культур или композиция клеточной культуры, содержащая клеточную композицию согласно изобретению, может вводиться парентерально или перорально, отдельно или в комбинации с другими применимыми соединениями для достижения желаемого терапевтического эффекта, как, например, одним или несколькими факторами роста.
Согласно одному из типичных вариантов реализации терапевтическая культура, клеточная культура, система культур или композиция клеточной культуры, содержащая трансдуцированные клетки согласно изобретению, вводится системно путём инъекции в ткань.
F. Композиции и лекарственные формы
Лекарственные формы и композиции согласно изобретению могут содержать комбинации любого количества трансдуцированных или нетрансдуцированных клеток, либо их комбинаций, вирусные векторы, полипептиды, полинуклеотиды и одно или несколько соединений, например, соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина и/или ингибиторы деацетилазы гистонов, описанные в настоящей заявке, в форме фармацевтически и физиологически приемлемых растворов (например, питательных сред), для введения в клетки, ткани, органы или животный организм по отдельности или в комбинации согласно определенным терапевтическим способам.
Определенные лекарственные формы и композиции ex vivo и in vitro согласно изобретению могут содержать комбинации любого количества трансдуцированных или нетрансдуцированных клеток, либо их комбинаций, вирусные векторы и одно или несколько соединений, например, соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина и/или ингибиторы деацетилазы гистонов, описанные в настоящей заявке, в форме фармацевтически и физиологически приемлемых растворов (например, питательных сред), для введения в клетки, ткани, органы или животный организм по отдельности или в комбинации согласно определенным терапевтическим способам.
Определенные лекарственные формы и композиции in vitro согласно изобретению могут содержать комбинации вирусных векторов и одного или нескольких соединений, например, соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина и/или ингибиторы деацетилазы гистонов, описанные в настоящей заявке, в форме фармацевтически и физиологически приемлемых растворов (например, питательных сред), для введения в клетки, ткани, органы или животный организм по отдельности или в комбинации согласно определенным терапевтическим способам.
Согласно определенным вариантам реализации изобретение обеспечивает композиции, содержащие терапевтически эффективное количество трансдуцированных клеток, как описано в настоящей заявке, включенное в лекарственную форму вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми переносчиками (добавками) и/или растворителями (например, в фармацевтически приемлемой питательной среде).
Согласно определенным вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает композиции, содержащие ретровирусный вектор и одон или несколько компонентов, усиливающих сигнальный путь простагландина EP, как описано в заявке, включенные в лекарственную форму вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми переносчиками (добавками) и/или растворителями (например, в фармацевтически приемлемой питательной среде).
Согласно определенным вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает композиции,
- 30 032699 содержащие клеточные популяции, содержащие стволовые клетки или клетки-предшественники, ретровирусный вектор и одон или несколько компонентов, усиливающих сигнальный путь простагландина EP, как описано в заявке, включенные в лекарственную форму вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми переносчиками (добавками) и/или растворителями (например, в фармацевтически приемлемой питательной среде). Согласно определенному варианту реализации клеточная популяция состоит из кроветворных стволовых клеток и клеток-предшественников.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим трансдуцированные клетки, полученные с помощью способов, описанных в настоящей заявке, и фармацевтически приемлемых переносчиков. Согласно другим вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие ретровирусный вектор и одно или несколько соединений, например, соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина и/или ингибиторов деацетилазы гистонов, как описано в заявке.
Термин фармацевтически приемлемый относится к соединениям, не вызывающим аллергическую или другую подобную реакцию при введении человеку. Способы приготовления водных композиций, содержащих белок в качестве активного компонента, хорошо известны в данной области техники. Как правило, такие композиции приготавливаются для инъекций, в форме растворов или суспензий; в форме твердых соединений для растворов, суспензий или жидкостей до введения. Кроме того, для введения можно применять эмульсии.
В настоящей заявке термин переносчик относится к любого рода растворителям, дисперсиям, носителям, обволакивающим веществам, разбавителям, антибактериальным и антигрибковым агентам, изотоническим и замедляющим абсорбцию агентам, буферам, растворам-переносчикам, суспензиям, коллоидным растворам и т.п. Применение указанных сред и агентов вместе с фармацевтически активными веществами хорошо известно в данной области. Применение любой подходящей среды или агента подразумевается изобретением, при условии ее совместимости с активным ингредиентом. Вспомогательные активные ингредиенты также могут входить в состав композиций.
В настоящей заявке термин фармацевтически приемлемый переносчик относится к любого рода растворителям, дисперсиям, носителям, обволакивающим веществам, разбавителям, антибактериальным и антигрибковым агентам, изотоническим и замедляющим абсорбцию агентам и т.п., включая фармацевтически приемлемые питательные среды, физиологически совместимым с композициями согласно изобретению. Согласно одному из вариантов реализации композиция, содержащая переносчик, применима для парентерального введения, например, внутрисосудистого (внутривенного или внутриартериального), интраперитонеального или внутримышечного. Фармацевтически приемлемые переносчики включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных растворов или дисперсия для инъекций. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. Применение любой подходящей среды или агента для фармацевтических композиций согласно изобретению подразумевается изобретением при условии ее совместимости с трансдуцированными клетками.
Композиции согласно изобретению могут содержать один или несколько полипептидов, полинуклеотидов, векторов, включающих соединения, усиливающие сигнальный путь простагландина EP, ингибиторов деацетилазы гистонов и трансдуцированные клетки и т.п., как описано в настоящей заявке, в форме фармацевтически и физиологически приемлемых растворов для введения в клетку или в животный организм отдельно, либо в комбинации с другими терапевтическими формами. Очевидно также, что при необходимости композиции согласно изобретению могут вводиться в комбинации с другими агентами, такими как цитокины, факторы роста, гормоны, низкомолекулярные соединения и различные фармацевтически активные агенты. При условии, что вспомогательные агенты не нарушают способность композиций эффективно выполнять соответствующую геннотерапевтическую функцию, не существует ограничений для агентов, которые могут входить в состав композиций согласно изобретению.
В отношении фармацевтических композиций согласно изобретению лекарственные формы фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ и растворов-переносчиков хорошо известны в данной области техники, также как и определение доз и схем лечения, включая, например, пероральное, парентеральное, внутривенное, интраназальное и внутримышечное введение препарата.
В определенных условиях необходимо вводить композиции, описанные в настоящей заявке, парентерально, внутривенно, внутримышечно или даже интраперитонеально, как описано, например, в патентах США №№ 5543158; 5641515 и 5399363 (содержание каждого из которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки). Растворы активных соединений могут быть приготовлены путем перемешивания в воде, смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза, в форме свободных оснований или фармацевтически приемлемых солей. Дисперсии также могут быть приготовлены в глицерине, жидком полиэтиленгликоле, а также их смесях и маслах. В стандартных условиях хранения и применения указанные препараты содержат агенты, предотвращающие рост микроорганизмов.
Фармацевтические формы, применимые для инъекций, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных растворов и дисперсий
- 31 032699 для инъекций (патент США № 5466468, полностью включенный в настоящую заявку посредством ссылки). При любых условиях форма должна быть стерильной и достаточно жидкой для введения через иглу. Также форма должна быть устойчивой в условиях производства и хранения и должна быть защищена от контаминации микроорганизмами, такими как бактерии или грибы. Переносчик может представлять собой растворитель или дисперсную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропилен гликоль, жидкий полиэтилен гликоль и т.п.), их смеси и/или растительные масла. Соответствующая текучесть может быть достигнута, например, с помощью обволакивающего вещества, такого как лецитин, частицы которого имеют определенный размер, или с помощью ПАВ. Предотвращение контаминации микроорганизмов может обеспечиваться различными антибактериальными и антигрибковыми агентами, например парабеном, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой, тимеросалом и т.п. Как правило, предпочтительно применение изотонических агентов, например сахаров или хлорида натрия. Замедленная абсорбция вводимых композиций может быть обеспечена с помощью агентов, замедляющих абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.
Для парентерального введения водного раствора раствор должен при необходимости быть в достаточной мере разбавлен буфером, а жидкий растворитель разбавлен соответствующим количеством солевого раствора или глюкозы для достижения изотоничности. Указанные водные растворы, в частности, применимы для внутривенного, внутримышечного, подкожного и интраперитонеального введения. В этом случае, применимые стерильные водные среды в контексте настоящего изобретения хорошо известны специалистам в данной области. Например, одна доза может быть растворена в 1 мл изотоничного раствора NaCl и либо добавлена в 1000 мл жидкости для введения или введена в соответствующее место инъекции (см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2005). В зависимости от состояния субъекта, подвергающегося лечению, дозировка может меняться. Ответственный за введение специалист в любом случае определяет необходимую дозу в случае каждого отдельного субъекта. Кроме того, при введении человеку препараты должны соответствовать стандартам стерильности, апирогенности и очистки Отдела Биологических Стандартов FDA.
Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем смешивания активных соединений в соответствующем объеме приемлемого растворителя с различными другими ингредиентами, указанными выше, с последующей стерилизацией фильтрацией. Как правило, дисперсии приготавливают путем введения различных стерильных активных ингредиентов в стерильный контейнер, содержащий основную дисперсную среду и различные необходимые дополнительные ингредиенты, указанные выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций, предпочтительными способами приготовления являются сушка в вакууме и замораживание-высушивание, с получением порошка активного ингредиента и любой необходимый дополнительный ингредиент из исходного раствора, подвергшегося стерилизации фильтрацией.
Композиции, описанные в настоящей заявке, могут быть в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, полученные посредством добавления кислоты (при связывании свободных аминогрупп белка), при добавлении минеральных кислот, например, соляной или фосфорной кислоты, либо органических кислот, например, уксусной, щавелевой, винной, миндальной и т.п. Соли, получаемые при связывании свободных карбоксильных групп, могут быть получены при добавлении неорганических оснований, например гидроксида натрия, калия, аммония, кальция или железа, либо органических оснований, например, изопропиламина, триметиламина, гистидина, прокаина и т.п. Готовые лекарственные формы вводятся в терапевтически эффективных формах и количествах. Лекарственные формы могут вводиться различным образом: в виде растворов для инъекций, в виде капсул с высвобождением активного вещества и т. п.
Композиции могут вводиться посредством интраназальных спреев, ингаляций и/или других типов аэрозолей. Способы введения композиций, содержащих гены, полинуклеотиды и полипептиды, непосредственно в легкие посредством назальных аэрозолей описаны, например, в патентах США №№ 5756353 и 5804212 (каждый из которых полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки). Также, в фармацевтике хорошо известны способы введения препаратов посредством интраназальных полимерных микрочастиц (Takenaga et al., 1998) и соединений лизофосфатилдилглицерина (патент США № 5725871, полностью включенный в настоящую заявку посредством ссылки. Также в патенте США № 5780045 (полностью включенном в настоящую заявку посредством ссылки) описано чресслизистое введение в форме политетрафторэтиленовой матрицы-носителя.
Согласно определенным вариантам реализации доставка осуществляется посредством липосом, нанокапсул, микрочастиц, микросфер, жировых частиц, пузырьков, при необходимости, связанных с полипептидом казеина (CPP) и т.п., для введения композиций согласно изобретению в соответствующие клетки-хозяева. В частности, композиции согласно изобретению для введения могут быть инкапсулированы с жировую частицу, липосому, пузырек, наносферу, наночастицу и т. п. Получение и применение таких лекарственных форм осуществляется способами, известными в данной области. Лекарственные формы и композиции согласно изобретению могут содержать один или несколько репрессоров и/или активаторов, включающих комбинацию из любого количества полипептидов, полинуклеотидов и низко
- 32 032699 молекулярных соединений, как описано в настоящей заявке, в форме фармацевтически и физиологически приемлемых растворов (например, питательных сред) для введения в клетки или в животный организм отдельно или в комбинации с другими терапевтическими способами. Очевидно также, что при необходимости композиции согласно изобретению могут вводиться в комбинации с другими агентами, например, клетками, другими белками или полипептидами, или различными фармацевтически активными агентами.
Согласно определенным вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает лекарственные формы или композиции, применимые для доставки систем вирусных векторов (т.е., вирусной трансдукции), включая, но не ограничиваясь, ретровирусные (например, лентивирусные) векторы.
Типичные лекарственные формулы для доставки ex vivo могут также включать различные агенты для трансфекции, такие как фосфат кальция, электропорацию, тепловой шок и различные формы липосом (т.е., липидная трансфекция). Липосомы, как описано подробно ниже, представляют собой липидный бислой с заключенной внутри жидкой водной фракцией. ДНК непроизвольно связывается с наружной катионной поверхностью липосом (благодаря своему заряду), и липосомы взаимодействуют с клеточной мембраной.
Согласно некоторым аспектам настоящее изобретение обеспечивает фармацевтически приемлемые композиции, содержащие терапевтически эффективное количество одного или нескольких полинуклеотидов или полипептидов, описанных в настоящей заявке, в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми переносчиками (добавками) и/или разбавителями (например, фармацевтически приемлемой питательной средой).
Отдельные варианты реализации могут включать другие лекарственные формы, известные в данной области и описанные, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
Согласно определенным вариантам реализации композиции согласно изобретению содержат эффективное количество композиции и, при необходимости, один или несколько дополнительных терапевтических агентов. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения композиции, содержащие клетки и, при необходимости, один или несколько дополнительных терапевтических агентов, могут также содержать стерильный соляной раствор, раствор Рингера, сбалансированный соляной раствор Хенкса (HBSS) или Isolyte S, pH 7.4, питательную среду, не содержащую сыворотку или другую фармацевтически приемлемую среду (например, питательную среду), как описано в настоящей заявке.
Согласно определенным вариантам реализации композиция содержит клеточную популяцию, а также одно или несколько соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина EP и/или один или несколько ингибиторов деацетилазы гистонов, каждый из которых находится в итоговой концентрации, приблизительно равной от 1 мкМ до 100 мкМ. Согласно определенным вариантам реализации композиция содержит клеточную популяцию, а также одно или несколько соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина EP и/или один или несколько ингибиторов деацетилазы гистонов, каждый из которых находится в итоговой концентрации, приблизительно равной от 1 + 10-14 М до 1 + 10-3 М, от 1 + 10-13 М до 1 + 10-4 М, от 1 + 10-12 М до 1 + 10-5 М, от 1 + 10-11 М до 1 + 10-4 М, от 1 + 10-11 М до 1 + 10-5 М, от 1 + 10-10 М до 1 + 10-4 М, от 1 + 10-10 М до 1 + 10-5 М, от 1 + 10-9 М до 1 + 10-4 М, от 1 + 10-9 М до 1 +10-5 М, от 1 + 10-8 М до 1 + 10-4 М, от 1 + 10-7 М до 1 + 10-4 М, от 1 + 10-6 М до 1 + 10-4 М, либо равной любому промежуточному значению в пределах указанных выше.
Согласно другому определенному варианту реализации композиция содержит клеточную популяцию, а также одно или несколько соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина EP и/или один или несколько ингибиторов деацетилазы гистонов, каждый из которых находится в итоговой концентрации, приблизительно равной 1 + 10-14 М, 1 + 10-13 М, 1 + 10-12 М, 1 + 10-10 М, 1 + 10-9 М, 1 + 10-8 М, 1 + 10-7 М, 1 + 10-6 М, 1 + 10-5 М, 1 + 10-4 М, 1 + 10-3 М, либо равной любому промежуточному значению в пределах указанных выше. В композициях, содержащих одно или несколько соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина EP и/или один или несколько ингибиторов деацетилазы гистонов, концентрации этих агентов могут быть равными или отличаться друг от друга.
Специалист в данной области техники стандартными способами определит приемлемый способ введения и эффективную дозу композиции, содержащей трансдуцированные клетки и/или одно или несколько соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина EP и/или один или несколько ингибиторов деацетилазы гистонов согласно изобретению. Также специалисту в данной области техники станет очевидно, что при определенных методиках лечения для достижения необходимого эффекта необходимо неоднократное введение фармацевтических композиций согласно изобретению.
Например, композиция может вводиться 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз в течение 1, 2, 3, недель, 1, 2, 3, 4, 5, 6 месяцев, 1, 2, 5, 10 или более лет.
Кроме того, курс многократного введения одних и тех же или различных композиций согласно изобретению может повторяться несколько раз в течение длительного промежутка времени, как указано выше.
Кроме того, введение композиции, содержащей трансдуцированные клетки и/или одно или несколько соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина EP и/или один или несколько инги
- 33 032699 биторов деацетилазы гистонов может проводиться одним и тем же или различными способами, как описано в настоящей заявке. Введение композиции, содержащей трансдуцированные клетки и/или одно или несколько соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина EP и/или один или несколько ингибиторов деацетилазы гистонов может также осуществлять в разных местах введения одним и тем же или разными способами. Кроме того, введение композиции, содержащей трансдуцированные клетки и/или одно или несколько соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина EP и/или один или несколько ингибиторов деацетилазы гистонов может осуществляться в одном и том же месте введения одним и тем же способом, одновременно или в разное время.
G. Способы генной терапии
Трансдуцированные клетки и соответствующие ретровирусные векторы обеспечивают усовершенствованные способы проведения генной терапии. В настоящей заявке, термин генная терапия относится к внедрению гена в геном клетки. Согласно различным вариантам реализации, вирусный вектор согласно изобретению содержит последовательность, регулирующую экспрессию в кроветворных клетках, экспрессирующую терапевтический трансген, который кодирует полипептид, обеспечивающий лечебный, профилактический эффект, либо облегчающий течение нарушений у субъекта, страдающего, либо подозреваемого на наличие моногенного заболевания, нарушения или патологического состояния, подлежащего терапии кроветворными стволовыми клетками.
Согласно одному из предпочтительных вариантов реализации изобретение обеспечивает трансдуцированные клетки, потенциально способные дифференцировать в клетки микроглии головного мозга. Согласно определенным вариантам реализации, кроветворные стволовые клетки трансдуцируются вектором согласно изобретению и вводятся субъекту, нуждающемуся в лечении адренолейкодистрофии или адреномиелонейропатии. Кроветворные стволовые клетки являются предшественниками клеток микроглии головного мозга и поэтому являются предпочтительными.
Согласно определенным вариантам реализации трансдуцированные кроветворные стволовые клетки или клетки-предшественники содержат вирусный вектор, содержащий последовательность, регулирующую экспрессию в кроветворных клетках, экспрессирующую терапевтический трансген, который кодирует полипептид, обеспечивающий лечебный, профилактический эффект, либо облегчающий течение нарушений у субъекта, страдающего, либо подозреваемого на наличие моногенного заболевания, нарушения или патологического состояния системы кроветворения.
Композиции, содержащие вирус, например лентивирус и/или одно или несколько соединений, усиливающих сигнальный путь простагландина EP и/или один или несколько ингибиторов деацетилазы гистонов, могут инфицировать и трасдуцировать клетки in vivo, ex vivo или in vitro с большей эффективностью, чем вектор в отсутствии указанных соединений. Согласно вариантам реализации ex vivo и in vitro трансдуцированные клетки могут вводиться пациенту, нуждающемуся в лечении. Настоящее изобретение подразумевает, что вектор, вирусные частицы и трансдуцированные клетки согласно изобретению применяются для лечения, профилактики или облегчения течения моногенного заболевания, нарушения или патологического состояния, либо заболевания, нарушения или патологического состояния системы кроветворения субъекта, например, гемоглобинопатий.
В настоящей заявке термин кроветворение относится к образованию и развитию кровяных клеток из клеток-предшественников, а также клеток-предшественников из стволовых клеток. Кровяные клетки включают, но не ограничиваются указанными: эритроциты (красные кровяные клетки), ретикулоциты, моноциты, нейтрофилы, мегакариоциты, эозинофилы, базофилы, B-клетки, макрофаги, гранулоциты, тучные клетки, тромбоциты и лейкоциты.
В настоящей заявке термин гемоглобинопатия относится к любого рода нарушениям, характеризующимся присутствием в крови аномальных молекул гемоглобина. Примеры гемоглобинопатий включают, но не ограничиваются: гемоглобиноз C, серповидноклеточную анемию и талассемию. Также сюда входят гемоглобинопатии, при которых в крови присутствуют разные типы аномального гемоглобина (например, серповидноклеточная анемия/гемоглобиноз C).
Термин серповидноклеточная анемия в настоящей заявке относится к любому состоянию с симптомами анемии, вызванному присутствием в крови эритроцитов серповидной формы. Проявления серповидноклеточной анемии включают анемию, боли и/или дисфункцию органов, например почечную недостаточность, ретинопатию, острый грудной синдром, ишемию, приапизм и инсульт. В настоящей заявке термин серповидноклеточная анемия относится к различным клиническим проявлениям заболевания, в частности у пациентов, гомозиготных по замещению в гене HbS. В числе характерных проявлений серповидноклеточной анемии, описанных в настоящей заявке, отставание в росте и развитии, подверженность тяжелым инфекционным заболеваниям, в частности вызываемым пневмококком, выраженные повреждения селезенки, приводящие к нарушению функции выведения бактерий из циркуляции, с рецидивирующим инфарктом и, в конце концов, разрушением ткани селезенки. Также термин серповидноклеточная анемия подразумевает острые эпизоды скелетно-мышечной боли, особенно выраженной в поясничной области позвоночника, в брюшной области и в теле бедренной кости, по механизму и выраженности сходные с болями при декомпрессионной болезни. У взрослых это, как правило, проявляется в невысокой или средней интенсивности кратковременных приступах с интервалом в несколько недель
- 34 032699 или месяцев, и ежегодном приступе невыносимой боли ежегодно, длящемся приблизительно 5-7 дней. Причины, вызывающие такие приступы, включают ацидоз, гипоксию и обезвоживание, являющиеся, в свою очередь, причиной внутриклеточной полимеризации HbS (J. H. Jandl, Blood: Textbook of Hematology, 2nd Ed., Little, Brown and Company, Boston, 1996, pages 544-545). В настоящей заявке термин талассемия охватывает врожденные анемии, вызванные мутации, нарушающие синтез гемоглобина. Таким образом, этот термин включает все симптомно протекающие случаи анемии, вызванные талассемическими состояниями, например тяжелую или β-талассемию, большую талассемию, среднюю талассемию, α-талассемии, как гемоглобиноз H.
В настоящей заявке талассемия относится к наследственному нарушению, характеризующемуся выработкой дефектного гемоглобина. Примеры талассемии включают α- и β-талассемию. β-талассемии вызываются мутацией в β-цепи глобина и могут проявляться в большой и малой формах. При большой форме дети рождаются нормальными, а заболевание развивается в течение первого года жизни. При малой форме вырабатываются эритроциты маленького размера. Малая форма развивается, если дефектный ген передан одним из родителей. Лица, страдающие этой формой талассемии, являются носителями заболевания, которое, как правило, протекает бессимптомно.
A-талассемия, как правило, вызвана делециями в генах HBA1 и HBA2. Оба эти гена кодируют αглобин, являющийся субъединицей гемоглобина. В каждом клеточном геноме присутствуют по две копии гена HBA1 и HBA2. В результате, α-глобин кодируется четырьмя аллелями. Различные формы αталассемии вызываются потерей нескольких или всех этих аллелей. Синдром гемоглобина Барта, будучи наиболее тяжелой формой α-талассемии, возникает при потере всех четырех аллелей α-глобина. Гемоглобиноз H возникает при потере трех из четырех аллелей α-глобина. При обоих этих состояниях недостаток α-глобина не позволяет клеткам вырабатывать нормальный гемоглобин. Вместо этого, клетки вырабатывают дефектные формы гемоглобина, известные как гемоглобин Барта или гемоглобин H. Указанные дефектные формы гемоглобина неспособны эффективно обеспечивать ткани кислородом. Замещение нормального гемоглобина гемоглобином Барта или гемоглобином H вызывает анемию и другие тяжелые нарушения организма, ассоциированные с α-талассемией.
Согласно предпочтительному варианту реализации способы генной терапии согласно изобретению применяются для лечения, профилактики или облегчения течения гемоглобинопатий, входящих в группу, включающую: гемоглобиноз C, серповидноклеточную анемию, врожденную анемию, талассемию, βталассемию, большую талассемию, среднюю талассемию, α-талассемию и гемоглобиноз H.
Согласно различным вариантам реализации ретровирусный вектор вводится непосредственно в клетки, в ткани, в органы или в организм субъекта, подвергающегося генной терапии, in vivo. Согласно другим различным вариантам реализации клетки трансдуцируются векторами согласно изобретению in vitro или ex vivo и при необходимости культивируются ex vivo. После этого клетки вводят субъекту, подвергающемуся генной терапии.
Клетки, применимые для трансдукции и введению способами генной терапии согласно изобретению, включают, но не ограничиваются указанными: стволовые клетки, клетки-предшественники и дифференцированные клетки, как описано в настоящей заявке. Согласно определенным вариантам реализации трансдуцированные клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, стволовые клетки костного мозга, стволовые клетки пуповины, плацентарные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, стволовые нервные клетки, стволовые клетки печени, стволовые клетки поджелудочной железы, стволовые клетки сердца, стволовые клетки почек, кроветворные стволовые клетки, как описано в настоящей заявке.
Согласно предпочтительным вариантам реализации трансдуцированные клетки представляют собой кроветворные стволовые клетки и/или клетки-предшественники, выделенные из костного мозга, крови пуповины или периферической крови. Согласно определенным предпочтительным вариантам реализации трансдуцированные клетки представляют собой кроветворные стволовые клетки, выделенные из костного мозга, крови пуповины или периферической крови.
Кроветворные стволовые клетки могут распознаваться по определенным фенотипическим или генотипическим маркерам. Например, кроветворные стволовые клетки могут быть распознаны по их небольшому размеру, отсутствию маркеров клеточной линии (lin), слабому окрашиванию (боковой популяции) витальными красителями, такими как родамин 123 (rhodamineDULL, также обозначаемый как rholo) или Hoechst 33342, и присутствию различных антигенных маркеров на поверхности, многие из которые принадлежат к семейству кластеров дифференциации (например, CD34, CD38, CD90, CD133, CD105, CD45, Ter119 и c-kit, рецептор фактора стволовых клеток). Кроветворные стволовые клетки, как правило, не несут маркеры, применяемые для выявления детерминации дифференцировки и, таким образом, часто обозначаются как Lin(-) клетки.
Согласно одному из вариантов реализации кроветворные стволовые клетки человека характеризуются как CD34+, CD59+, Thy1/CD90+, CD38lo/-, C-kit/CD117+ и Lin(-). Тем не менее, некоторые из них являются CD34-/CD38-. Также некоторые исследования показали, что наименее зрелые стволовые клетки могут не нести c-kit на поверхности. В случае кроветворных стволовых клеток человека, CD133 может считаться ранним маркером, ввиду того, что как CD34+, так и CD34- клетки являются CD133+. В данной
- 35 032699 области техники известно, что CD34+ и Lin(-) клетки также включают кроветворные клеткипредшественники.
Согласно другому варианту реализации иерархия кроветворных клеток определяется с помощью кода сигнальной молекулы активации лимфоцитов (SLAM). Семейство SLAM (Signaling lymphocyte activation molecule) представляет собой группу из более 10 молекул, чьи гены расположены, как правило, тандемами в пределах одного локуса на хромосоме 1 (мыши), принадлежащих к подгруппе суперсемейства иммуноглобулинов, и изначально, как предполагается, участвовавших в активации T-клеток. Это семейство включает CD48, CD150, CD244 и т.п., где CD150 считается основным членом семейства и также обозначается как slamF1, т.е., первый член семейства (SLAM family member 1). Обозначение SLAM определяет иерархию кроветворных клеток: стволовая кроветворная клетка (HSC) - CD150+CD48CD244-; мультипотентная клетка-предшественник (MPP) - CD150-CD48-CD244+; линейноспецифическая клетка-предшественник (LRP) - CD150-CD48+CD244+; общая миелоидная клеткапредшественник (CMP) - lin-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32mid; гранулоцитарно-макрофагальная клеткапредшественник (GMP) - lin-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32hi; и эритромегакариоцитарная клеткапредшественник (MEP) - lin-SCA-1-c-kit+CD34-CD16/32low.
Группа Ирвинга Ваймана (Irving Weissman) впервые выделила стволовые кроветворные клетки мыши в Стэнфордском университете в 1988 и впервые выявила маркеры, позволяющие определить иерархию кроветворных клеток мышей. Маркеры долгоживущей стволовой кроветворной клетки long-term hematopoietic stem cells (LT-HSC) - CD34-, SCA-1+, Thy1.1+/lo, C-kit+, lin-, CD135-, Slamf1/CD150+; короткоживущей стволовой кроветворной клетки short-term hematopoietic stem cells (ST-HSC) - CD34+, SCA-1+, Thy1.1+/lo, C-kit+, lin-, CD135-, Slamf1/CD 150+, Mac-1 (CD11b)lo; ранних полипотентных предшественников early multipotent progenitors - (Early MPP) - CD34+, SCA-1+, Thy1.1-, C-kit+, lin-, CD135+, Slamf1/CD150-, Mac-1 (CD11b)lo, CD4lo; и поздних полипотентных предшественников late multipotent progenitors (Late MPP) - CD34+, SCA-1+, Thy1.1-, C-kit+, lin-, CD135high, Slamf1/CD150-, Mac-1 (CD11b)lo, CD4lo.
Согласно одному из вариантов реализации кроветворные клетки представляют собой CD105+ Scal+ клетки.
Клетки согласно изобретению могут быть аутологичными/аутогенными (собственными), либо неаутологичными (не собственными, например аллогенными, сингенными или ксеногенными). Аутологичный в данной заявке относится к клетке самого субъекта. Аллогенный в данной заявке относится к клетке, организма того же вида, но генетически отличающейся от клеток субъекта. Сингенный в данной заявке относится к клетке другого субъекта, генетически идентичной клеткам самого субъекта. Ксеногенный в данной заявке относится к клетке организма другого вида. Согласно предпочтительным вариантам реализации клетки согласно изобретению являются аллогенными.
Субъект в настоящей заявке относится к любому животному, страдающему моногенным заболеванием, нарушением или патологическим состоянием, которое может излечиваться геннотерапевтическими векторами, клеточной терапией или другими способами, описанными в настоящей заявке. Согласно предпочтительным вариантам реализации субъект может быть любым животным, у которого выявлены симптомы заболевания, нарушения или патологического состояния кроветворной системы, например гемоглобинопатий, которая может излечиваться геннотерапевтическими векторами, клеточной терапией или другими способами, описанными в настоящей заявке. Субъекты согласно изобретению (например, пациенты) включают лабораторных животных (таких как мыши, крысы, кролики или морские свинки), сельскохозяйственных животных и домашних животных (таких как кошки и собаки). Приматы и предпочтительно люди также могут являться пациентами.
Как правило, субъекты относятся к животным, характеризующимся аномальными физиологическими характеристиками (качественно и/или количественно отличающимися от таковых, присущих нормальным или здоровым субъектам), которые могут приведены в норму посредством генной терапии.
В настоящей заявке термины лечение, излечение включают любые желаемые или положительные эффекты в отношении симптомов или патологических состояний и могут включать даже минимальные заметные улучшения течения указанного заболевания или патологического состояния. Излечение может включать ослабление симптомов или улучшение течения заболевания или патологического состояния, а также задержку прогрессирования заболевания или патологического состояния. Лечение не обязательно означает полное излечение заболевания или патологического состояния или полное исчезновение симптомов.
В настоящей заявке профилактика и т.п. относится к предотвращению, подавлению или понижению вероятности возникновения или рецидива заболевания или патологического состояния. Также профилактика относится к задержке начала или рецидива заболевания или патологического состояния, а также проявления симптомов. В настоящей заявке профилактика и т.п. также относятся к понижению тяжести течения заболевания или патологического состояния до его начала или рецидива.
В настоящей заявке термин число или количество относится к эффективному количеству вируса или терапевтических клеток, достаточному для достижения положительного или желаемого профилактического или терапевтического результата, включая клинические исходы.
- 36 032699
Профилактически эффективное количество относится к количеству вируса или трансдуцированных терапевтических клеток, достаточному для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, но не обязательно, поскольку профилактическая доза применяется до проявления или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективная доза ниже терапевтически эффективной дозы.
Терапевтически эффективное количество вируса или трансдуцированных терапевтических клеток может варьировать в зависимости от ряда факторов, таких как стадия заболевания, возраст, пол и вес субъекта, а также от способности стволовых клеток или клеток-предшественников вызвать желаемый эффект в организме субъекта. Также, терапевтически эффективное количество относится к количеству, при применении которого любого рода токсические или негативные эффекты играют качественно меньшую роль в сравнении с терапевтически положительными эффектами. Термин терапевтически эффективное количество означает количество, достаточное для эффективного лечения субъекта (например, пациента).
Не ограничиваясь никакой из существующих теорий, важным преимуществом векторов, композиций и способов согласно настоящему изобретению является высокая эффективность генной терапии, достигаемая введением клеточных популяций, содержащих высокую долю трансдуцированных клеток, в сравнении с существующими способами.
Трансдуцированные клетки могут вводиться как часть костного мозга или трансплантата крови пуповины субъекту, прошедшему или не прошедшему аблятивную терапию костного мозга. Согласно одному из вариантов реализации трансдуцированные клетки согласно изобретению вводятся в составе трансплантата костного мозга субъекту, прошедшему аблятивную химио- или радиотерапию костного мозга.
Согласно одному из вариантов реализации, трансдуцированные клетки вводятся внутривенно. Согласно предпочтительным вариантам реализации субъекту внутривенно вводятся трансдуцированные кроветворные стволовые клетки.
Согласно одному типичному варианту реализации эффективное количество трансдуцированных клеток, вводимых субъекту, составляет менее чем 1*1012 клеток на 100 кг, менее чем 1*10 клеток на 100 кг, менее чем 1*1010 клеток на 100 кг, менее чем 1*109 клеток на 100 кг, менее чем 1*108 клеток на 100 кг, менее чем 1* 107 клеток на 100 кг, менее чем 5*106 клеток на 100 кг, менее чем 4*106 клеток на 100 кг, менее чем 3*106 клеток на 100 кг, менее чем 2*106 клеток на 100 кг, менее чем 1*106 клеток на 100 кг, менее чем 5*105 клеток на 100 кг, менее чем 4*105 клеток на 100 кг, менее чем 3*105 клеток на 100 кг, менее чем 2*105 клеток на 100 кг, менее чем 1*105 клеток на 100 кг, менее чем 5*104 клеток на 100 кг или менее чем 1*104 клеток на 100 кг веса субъекта.
Согласно другому типичному варианту реализации эффективное количество трансдуцированных клеток, вводимых субъекту, составляет приблизительно 1*1012 клеток на 100 кг, приблизительно 1*10 клеток на 100 кг, приблизительно 1*1010 клеток на 100 кг, приблизительно 1*109 клеток на 100 кг, приблизительно 1*108 клеток на 100 кг, приблизительно 1*107 клеток на 100 кг, приблизительно 5*106 клеток на 100 кг, приблизительно 4*106 клеток на 100 кг, приблизительно 3*106клеток на 100 кг, приблизительно 2*106 клеток на 100 кг, приблизительно 1*106 клеток на 100 кг, приблизительно 5*105 клеток на 100 кг, приблизительно 4*105 клеток на 100 кг, приблизительно 3*105 клеток на 100 кг, приблизительно 2*105 клеток на 100 кг, приблизительно 1*105 клеток на 100 кг, приблизительно 5*104 клеток на 100 кг или приблизительно 1*104 клеток на 100 кг.
Согласно другому типичному варианту реализации эффективное количество трансдуцированных клеток, вводимых субъекту, составляет приблизительно от 1*10' клеток на 100 кг до приблизительно 1*1012 клеток на 100 кг, от приблизительно 1* 102 клеток на 100 кг до приблизительно 1*10 клеток на 100 кг, от приблизительно 1 *103 клеток на 100 кг до приблизительно 1 х 1010 клеток на 100 кг, от приблизительно 1*104 клеток на 100 кг до приблизительно 1*109 клеток на 100 кг, от приблизительно 1*105 клеток на 100 кг до приблизительно 1*108 клеток на 100 кг, от приблизительно 1*106 клеток на 100 кг до приблизительно 1*107 клеток на 100 кг, либо любое другое промежуточное значение в пределах указанных на 100 кг.
Согласно различным вариантам реализации способ согласно изобретению обеспечивает более эффективную и безопасную генную терапию в сравнении с существующими способами и включает введение субъекту клеточной популяции, содержащей приблизительно 5% трансдуцированных клеток, приблизительно 10% трансдуцированных клеток, приблизительно 15% трансдуцированных клеток, приблизительно 20% трансдуцированных клеток, приблизительно 25% трансдуцированных клеток, приблизительно 30% трансдуцированных клеток, приблизительно 35% трансдуцированных клеток, приблизительно 40% трансдуцированных клеток, приблизительно 45% трансдуцированных клеток, приблизительно 50% трансдуцированных клеток, приблизительно 55% трансдуцированных клеток, приблизительно 60% трансдуцированных клеток, приблизительно 65% трансдуцированных клеток, приблизительно 70% трансдуцированных клеток, приблизительно 75% трансдуцированных клеток, приблизительно 80% трансдуцированных клеток, приблизительно 85% трансдуцированных клеток, приблизительно 90% трансдуцированных клеток, приблизительно 95% трансдуцированных клеток, приблизительно 98% трансдуциро
- 37 032699 ванных клеток или приблизительно 100% трансдуцированных клеток.
Согласно различным вариантам реализации векторы, композиции и способы согласно изобретению обеспечивают улучшенные способы генной терапии посредством применения генной терапии ex vivo и аутологической трансплантации. Согласно одному из предпочтительных вариантов реализации изобретение обеспечивает трансдуцированные клетки, такие как стволовые клетки, например, кроветворные стволовые клетки. Согласно определенным вариантам реализации, кроветворные стволовые клетки трансдуцируются вектором согласно изобретению и вводятся субъекту, нуждающемуся в лечении гемоглобинопатий.
Согласно определенным вариантам реализации кроветворные стволовые клетки трансдуцируются вектором согласно изобретению и вводятся субъекту, нуждающемуся в лечении адренолейкодистрофии или адреномиелонейропатии.
Согласно одному из предпочтительных вариантов реализации изобретение обеспечивает усовершенствованные системы вирусных векторов, оптимизированных для экспрессии большого количества одного или нескольких терапевтических белков в эритроидных клетках и в эритроидных клеткахпредшественниках. Более того, ретровирусные векторы (включая лентивирусные векторы) согласно изобретению содержат полинуклеотид, представляющий интерес, включая, например, ген глобина или ген, предотвращающий серповидноклеточную анемию. Согласно одному из вариантов реализации ген глобина, экспрессируемый в ретровирусном векторе согласно изобретению, представляет собой β-глобин, αглобин или γ-глобин. Согласно другому варианту реализации, ген β-глобина человека представляет собой ген β-глобина дикого типа или ген βА-глобина человека. Согласно другому варианту реализации ген β-глобина человека подвергается одной или нескольким делециям в интронных последовательностях или представляет собой мутированный ген β-глобина человека, кодирующий по меньшей мере один аминокислотный остаток, предотвращающий серповидноклеточную анемию. Аминокислоты, предотвращающие серповидноклеточную анемию, могут происходить из дельта-глобина или γ-глобина человека. Согласно другому варианту реализации мутированный ген β-глобина человека характеризуется заменой треонина глутамином в кодоне 87 (βΑ’Τ87°).
Ретровирусные векторы (включая лентивирусные векторы) согласно изобретению могут применяться в генной терапии, в том числе в лечении гемоглобинопатий. Согласно определенным вариантам реализации изобретение обеспечивает способы применения векторов для достижения устойчивой интенсивной экспрессии генов в эритроидных клетках, например, для лечения заболеваний, специфических к эритроидным клеткам. Согласно определенному варианту реализации векторы для генной терапии применяются для лечения гемоглобинопатий, включая, например, серповидноклеточную анемию. Согласно другому предпочтительному варианту реализации векторы для генной терапии применяются для лечения талассемий, включая, но не ограничиваясь, β-талассемию.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации кроветворные стволовые клетки трансдуцируются вектором согласно изобретению, содержащим ген ABCD1 для лечения адренолейкодистрофии и/или адреномиелонейропатии.
Настоящее изобретение более подробно описывается в примерах, представленных ниже. Изобретение, тем не менее, может быть реализовано в различных вариантах и не ограничивается приведенными вариантами реализации; напротив, указанные варианты реализации приведены для более полного и подробного описания, позволяющего в полной мере оценить объем изобретения специалистам в данной области техники.
Примеры
Пример 1. Предварительная стимуляция клеток перед трансдукцией
CD34+ клетки (AllCells) в контейнере растапливали, выдерживая при 37°C 1-2 мин, после чего содержимое помещали в 10 мл Питательной Среды для Роста Стволовых Клеток (далее - SCGM) в 15-мл конической пробирке. Клетки центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин в стандартной настольной центрифуге, взвесили в 10 мл SCGM и подсчитываали на гемацитометре. Объем, соответствующий количеству клеток, помещали в чистую 15-мл пробирку, после чего повторно центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин. Клетки взвесили до достижения желаемой концентрации в SCGM + 1* цитокинов (100 нг/мл SCF, 100 нг/мл ТРО, 100 нг/мл FltL и 30 нг/мл IL-3) и помещали на стерильную неадгезивную поверхность, после чего выдерживали при 37°C и поддержании влажности в стандартном инкубаторе тканевых культур (5% CO2).
Скрининг соединений, повышающих эффективность трансдукции CD34+ клеток вирусом осуществляли, используя различные концентрации растворимых соединений разных классов (табл. 1). Результаты скрининга иллюстрированы на фиг. 1.
- 38 032699
Таблица 1
Концентрация Wnt3 FGF1 IGF-II SHH Stemregenin- 1 dmPGE2
Высокая 100 нг/мл 100 нг/мл 200 нг/мл 100 нг/мл 1000 нм 100 мкМ
Средняя 10 нг/мл 10 нг/мл 20 нг/мл 10 нг/мл 100 нМ 10 мкМ
Низкая 1 нг/мл 1 нг/мл 2 нг/мл 1 нг/мл 10 нМ 1 мкМ
Таблица 1 (Продолжение)
Концентрация SC514 Omuralide Epoxomicin AMD3100 B18R TrichostatinA
Высокая 10 мкМ 1000 нМ 10 мкМ 100 нг/мл 200 нг/мл 3000 нМ
Средняя 1 мкМ 100 нМ 1 мкМ 10 нг/мл 20 нг/мл 300 нМ
Низкая 0.1 мкМ 10 нМ 0.1 мкМ 1 нг/мл 2 нг/мл 30 нМ
Пример 2. Трансдукция
Предварительно стимулированные клетки (пример 1) подсчитывали после 18-24 ч культивирования. Затем клетки центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин. 1.2 х106 предварительно стимулированных CD34+ клеток взвешивали в 60 мкл 10х цитокинов (1000 нг/мл SCF, 1000 нг/мл TPO, 1000 нг/мл FltL и 300 нг/мл IL-3), 7.8 мкл сульфата протамина, 111 мкл надосадочной жидкости, содержащей вирусы, и 361.2 мкл SCGM. 90 мкл кл./вир. сусп. (приблизительно 200,000 клеток) добавляли в каждую ячейку стардартной неадгезивной 96-ячеечной кассеты. В процессе вирусной трансдукции добавляли dmPGE2, с конечной концентрацией 100 мкМ, 50 мкМ, 25 мкМ, 12.5 мкМ, 1 мкМ или 0 мкМ. Исходный раствор вирусов характеризовался значением 2.7*108 TU/мл, со множественностью заражения (MOI), равной приблизительно 25.
Клетки выдерживали при 37°C и поддержании влажности в стандартном инкубаторе тканевых культур (5% CO2).
Пример 3. Стимуляция клеток DMPGE2
Из 1 мг предварительно обработанного dmPGE2 (Cayman Chemicals) приготавливали 10 мМ аликвоты dmPGE2 в DMSO. В течение короткого времени в контейнер с dmPGE2 вводили пузырьки воздуха до полного испарения метилацетата. 263 мкл DMSO добавляли к PGE2, оставшемуся в контейнере, после чего 25 мкл аликвоты помещали в 1,% мл пробирки Эппендорфа и хранили при -80°C. 10х рабочие исходные растворы получали путем серийного разведения dmPGE2 в SCGM, после чего их добавляли к клеткам в соответствующих рабочих концентрациях, как указано в табл. 2. Затем клетки выдерживали при 37°C и поддержании влажности в стандартном инкубаторе тканевых культур (5% CO2).
Таблица 2. Серийные разведения dmPGE2 и добавление dmPGE2 к клеткам
Исх. р-р А Исх. р-р В Исх. р- Р с Исх. р-р D Исх. р-р Е
Замороженный исх. р-р dmPGE2 20 0 0 0 0
Объем SCGM 180 100 100 100 92.5
Объем исх. ρ-pa А 0 100 0 0 0
Объем исх. р-ра В 0 0 100 0 0
Объем исх. р-ра С 0 0 0 100 0
Объем исх. р-ра D 0 0 0 0 8
Концентрация dmPGE2 1 мМ 500 мкМ 250 мкМ 125 мкМ 10 мкМ
До финальной концентрации: 100 мкМ 50 мкМ 25 мкМ 12.5 мкМ 1 мкМ
Добавл. 10 мкл: Исх. рра А Исх. рра В Исх. рра С Исх. рра D Исх. рра Е
Пример 4. Способы оценки
Подготовка клеток для процедур оценки
После 24 ч культивирования с вирусом и dmPGE2 клетки промывали перед дальнейшими процедурами функциональной оценки. Промывку осуществляли, поместив клетки в 96-ячеечную кассету с Uобразным дном и центрифугируя при 1500 об/мин 5 мин в стандартной настольной центрифуге. Среды выпаривали, после чего клетки взвешивали в 200 мкл SCGM. Затем клетки повторно центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин, среду выпаривали. Клетки повторно взвешивали в 200 мкл SCGM. Затем клетки повторно центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин, среду выпаривали. Отдельные процедуры функциональной оценки описаны ниже.
- 39 032699
7-дневная жидкая культура
Промытые клетки взвешивали в 200 мкл SCGM + 1* цитокинов (как описано в примере 1) и помещали в стандартную 12-ячеечную неадгезивную кассету для тканевых культур, содержащую еще 800 мкл SCGM + 1* цитокинов. Клетки выдерживали еще 6 дней при поддержании влажности в стандартном инкубаторе тканевых культур (5% CO2), после чего подвергали анализу Количества копий вектора (пример 5) и сортировке флуоресцентно-активированных клеток (FACS). Клетки анализировали на наличие трансгена, кодируемого вирусом, зеленого флуоресцентного белка (GFP). Количество клеток, меченных вирусом в пуле культивированных клеток оценивали по количеству GFP+ клеток в популяции. Количественно оценивали интенсивность флуоресценции меченых клеток. Результаты анализа 7-дневной жидкой культуры при различной концентрации dmPGE2 проиллюстрированы в табл. 3.
Оценка активности колониеобразующих единиц в метилцеллюлозе
Промытые клетки взвешивали в 200 мкл SCGM и помещали в 3 мл аликвоты метилцеллюлозы, обогащенной цитокинами (например, Methocult M4434 Classic). 1.5 мл затем помещали на 35-мм чашки для культивирования с помощью тупоконечной иглы 16-го калибра. Чашки выдерживали 14-16 дней при поддержании влажности в стандартном инкубаторе тканевых культур, после чего оценивали размер, морфологию и клеточный состав колоний. Для последующего анализа количества копий вектора (пример 5) выбирали отдельные колонии, либо, собрав вместе, использовали все колонии, культивированные на 35-мм чашках (пример 5).
Стволовые клетки, поддерживающие кроветворение в длительной культуре костного мозга (LTC-IC)
Клетки взвешивали в 200 мкл SCGM, подсчитывали, после чего помещали на заранее подготовленный стромальный слой MS-5 в различных разведениях (2000; 1000; 500; 250; 125; 62; 31; 16 кл/яч 200 мкл StemSpan SFEM (StemCell Technologies, cat#09650), обогащенный Pen-Strep 100-ед/мл-100 мкг/мл), по 24 копии на каждое разведение. Каждую неделю 100 мкл замещали 100 мкл свежей среды. Через 5 недель культуры собирали. 100 мкл слили, промывали клетки оставшимися 100 мкл, а ячейки промывали 50 мкл свежей среды, после чего все собранные образцы посеивали в Methocult™ H4434; 150 мкл клеточной суспензии гомогенизировали в 600 мкл Methocult H4434 и помещали в одну ячейку 12-ячеечной кассеты на 14 дней. Затем подсчитывали колонии. Количество ячеек, содержащих по меньшей мере одну колонию (>40 клеток) и общее количество ячеек анализировали для каждого разведения для подсчета количества LTC-IC и 95% доверительного интервала, используя программное обеспечение L-calc (Stem Cell Technologies). 100 колоний из каждой обработанной группы помещали в 100 разных ячеек, после чего каждую анализировали на предмет наличия вектора. 100 колоний из каждой обработанной группы смешивали вместе, выделяли геномную ДНК и подсчитали среднее количество копий вектора с помощью количественной ПЦР (пример 5).
Трансплантация в организм NOD/SCID Gamma (NSG) мышей
Для определения того, усиливает ли dmPGE2 вирусную трансдукцию долгоживущих стволовых кроветворных клеток человека с минимальной токсичностью, трансдуцированные клетки промывали и взвешивали в фосфатно-солевом буфере (PBS), после чего вводили в хвостовую вену облученным взрослым NSG мышам. Мышей содержали в стерильной среде в соответствии со стандартными параметрами IACUC защиты животных. Через определенные интервалы времени посредством стандартных протоколов производилась количественная оценка человеческих биологических агентов в периферийной крови мышей. Вкратце, эритроциты осаждали в 2% декстране, после чего надосадочная жидкость подвергалась дальнейшей очистке буфером для лизиса эритроцитов. Затем мононуклеарные клетки метили антителами, связанными с флуорофором, как описано в Majeti, et al., Cell Stem Cell 2007, и анализировали с помощью поточной цитометрии на LSR-II (Becton Dickinson).
Анализ сайтов интеграции
Для определения того, меняет ли dmPGE2 предпочтительные сайты интеграции лентивирусного вектора, образцы костного мозга мышей, которым трансплантировали трансдуцированные стволовые кроветворные клетки и кроветворные клетки-предшественники человека, обработанные dmPGE2 и ложными агентами, анализировали линейно-амплифицированной ПЦР (linear amplification-mediated PCR, LAM-PCR) (Cartier, (2009) Science 326(5954):818-23). Вкратце, 1-1000 нг ДНК использовали как матрицу для линейной ПЦР с биотинилированными праймерами, специфическими к ретровирусным LTRпоследовательностям. Продукты линейной ПЦР выделяли с помощью парамагнитных зерен. Далее осуществляли синтез второй цепи ДНК, обработку рестриктазами (Tsp509I, NlaIII или HpyCH4IV) и лигирование линкерных кассет на полутвердой фазе, после чего проводили 2 цикла экспонентной ПЦР. Полученные ампликоны LAM-PCR подготавливали для пиросеквенирования 454 (GS Flx; Roche Diagnostics), проведя дополнительные циклы ПЦР для присоединения GS Flx-специфических амплифицирующих и секвенирующих праймеров A и B к обоим концам ампликонов LAM-PCR. Структура и получение праймеров осуществлялись по инструкциям производителя. Распознаваемую последовательность длиной 6 оснований присоединяли к праймеру A для одновременного анализа различных последовательностей за один цикл секвенирования. Использовали 40 нг очищенного продукта LAM-PCR. Параметры ПЦР: первичная денатурация 120 с при 95°C; 12 циклов по 45 с при 95°C, 45 с при 60°C и 60 с при 72°C; финаль- 40 032699 ная элонгация 300 с при 72°C. Отщепление концов последовательностей ампликонов LAM-PCR и выравнивание цепочек осуществляли помощью BLAST.
Пример 5. Анализ количества копий вектора
Геномную ДНК выделяли из клеток с помощью стандартных протоколов (например, колонок DNEasy Qiagen). Геномную ДНК подвергали количественной ПЦР в масштабе реального времени (qRTPCR) с зондами TaqMan, специфическими к вирусным LTR-последовательностям и β-актину человека. Значения Ct для вирусного сигнала и сигнала β-актина стандартизировали в соответствии с контрольными значениями, после чего подсчитывали соотношение копий вируса и копий β-актина. При использовании вирусной конструкции, кодирующей зеленый флуоресцентный белок, между количеством копий вектора и средней интенсивностью флуоресценции обнаруживали линейную зависимость (пример 4). Результаты анализа количества копий вектора Number (VCN) при различных концентрациях dmPGE2 иллюстрированы в табл. Tables 3A-C.
Табл. 3A-C показывают зависимость стимуляции вирусной трансдукции CD34+ клеток от дозы dmPGE2 в трех различных экспериментах. CD34+ клетки размораживали и предварительно стимулировали SCF, TPO, FltL и IL3, затем трансдуцировали: (A) GFP+ лентивирусом при множественности заражения 25, (B) GFP+ лентивирусом при множественности заражения 5 и (C) ALD (ABCD1)экспрессирующим лентивирусом при множественности заражения 25. В процессе трансдукции вирусом (24-48 ч культивирования) клетки обрабатывали dmPGE2. Затем клетки промывали и анализировали поточной цитометрией и ПЦР после приблизительно одной недели культивирования. С помощью окраски FACS определяли процентное соотношение клеток, вырабатывающих GFP (A, B) и ALD (C), а также среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) и количество копий вектора (VCN) (A, B).
Таблица 3A: зеленый флуоресцентный белок, множественность заражения 25
Конц. dmPGE2 % положительн. (GFP) MFI VCN
100 мкМ 81.53 1,513,504.00 3.55
50 мкМ 67.62 977,806.75 2.2
25 мкМ 59.99 845,691,00 1.7
12.5 мкМ 54.71 759,442.75 1.5
0 мкМ 30.07 583,079.25 0.535
В отсутствии вируса 0.02 290,577.50 Не выявлено
Таблица 3B: зеленый флуоресцентный белок, множественность заражения 5
Конц. dmPGE2 % положительн. (GFP) MFI VCN
100 мкМ 42.97 732,716.25 0.83
50 мкМ 36.80 656,703.50 0.715
25 мкМ 18.69 562,428.00 0.21
12.5 мкМ 17.84 530,218.50 0.18
0 мкМ 9.05 477,691.00 0.025
В отсутствии вируса 0.02 290,577.50 Не выявлено
Таблица 3C: ABCD1 множественность , заражения 25
Конц. dmPGE2 % положительн.
100 мкМ 72.26
50 мкМ 56.10
25 мкМ 43.76
12.5 мкМ 45.36
1 мкМ 34.13
0 мкМ 21.44
Пример 6. Зависимость стимуляции вирусной трансдукции CD34+ клеток от продолжительности воздействия и дозы dmPGE2
MCD-34+ клетки размораживали и предварительно стимулировали SCF, TPO, FltL и IL3, затем трансдуцировали GFP+ лентивирусом при множественности заражения 25.
В процессе трансдукции вирусом (24-25 ч, 24-26 ч, 24-28 ч, 24-48 ч культивирования) клетки обрабатывали dmPGE2, промывали и анализировали поточной цитометрией приблизительно после одной недели культивирования. В качестве альтернативы клетки обрабатывали dmPGE2 в процессе предварительной стимуляции (22-24 ч; 23-24 ч культивирования). Процентная доля GFP положительных клеток проиллюстрирована в табл. 4.
Таблица 4
Вирус и PGE2 Предварительная стимуляция PGE2
Конц. dmPGE2 Плус 1 час Плус 2 часа Плус 4 часа 24 часа Минус 2 часа Минус 1 час
100 мкМ 2.48 4.02 21.57 76.44 34.85 25.14
50 мкМ 1.85 4.23 27.45 54.63 31.85 22.98
25 мкМ 1.76 4.76 27.46 50.69 31.90 24.05
12.5 мкМ 1.97 5.32 28.08 47.42 30.64 22.13
1 мкМ 2.94 7.17 21.10 32.03 25.74 22.29
0 мкМ 3.14 7.05 13.61 20.79 20.69 21.31
- 41 032699
Пример 7. Лечение B-талассемии или серповидноклеточной анемии после трансдукции стволовых кроветворных клеток лентивирусным вектором в присутствии dmPGE2
С согласия пациентов, в соответствии с протоколом Экспертного Совета Организации (IRB) периферическую кровь получали посредством афереза. Для удаления эритроцитов применяли градиент плотности Фиколла, после чего выделяли остаток, обогащенный CD34+ клетками с помощью Miltenyi CliniMACS system (Miltenyi Biotec). Клетки предварительно стимулировали SCF, FltL, TPO и IL3 человека в концентрации, приблизительно равной 4*106 cells/мл в течение 18-24 ч. Затем клетки трансдуцировали Лентиглобином (Lentiglobin GTP) для выделения гена β-globinA-T87Q человека, при множественности заражения 25 в течение 18-24 ч в присутствии SCF, FltL, TPO, IL3, сульфата протамина и dmPGE2.
После трансдукции часть клеток отбирали для аттестационного испытания, оставшиеся клетки криоконсервируют и хранят при -80°C. В качестве одного из этапов аттестационного испытания трансдуцированные клетки субъекта затем культивировали в течение 7 дней и подвергали анализу количества копий вектора (VCN, пример 1). Результат должен составлять в среднем 0,5-3 копии на клетку, при эффективности трансдукции, превышающей 50%. После успешных аттестационных испытаний пациентам назначали терапию бусульфаном и циклофосфамидом.
Затем пациенты однократно вводили аутологичные CD34+ клетки внутривенно, дозой, превышающей >3*106 CD34+клеток/кг. Пациенты находятся под ежедневным наблюдением в отделении трансплантации для выявления побочных эффектов и отследивания лабораторных показателей при приживлении трансплантата в костном мозге.
После приживления трансплантата, при условии стабильного состояния пациентов, их выписывали из стационара. В течение 6 первых месяцев пациенты проходили ежемесячное обследование, затем обследование проводили каждые 3 месяца в течение в общей сложности 24 месяцев. Обледование включало стандартные гематологические и химические лабораторные анализы, а также особые гематологические анализы, анализы костного мозга, выявление побочных эффектов и взаимодействия с сопутствующими препаратами, а также оценку особых гематологических и клинических параметров, связанных с конкретным заболеванием.
Основополагающими характеристиками являлись безопасность и переносимость введения клеток, трансдуцированных лентиглобином, и время приживления аутологичных модифицированных CD34+ клеток. Дополнительные характеристики включали биологические и биохимические последствия присутствия трансдуцированного гена и его продукта в кроветворных и кровяных клетках, необходимость в переливании крови и частоту госпитализаций и клинических случаев в течение 2-годового периода наблюдения после трансплантации. Все пациенты должны были проходить ежегодное обследование в течение 15-летнего посттрансплантационного периода для выявления серьезных побочных эффектов, анализ на репликативно-компетентный лентивирус и сбор кровяных клеток для анализа мутагенеза после внедрения вектора в геном, при наличии признаков развития злокачественных опухолей.
Пример 8. Лечение адренолейкодистрофии после трансдукции стволовых кроветворных клеток лентивирусным вектором в присутствии dmPGE2
С согласия пациентов, в соответствии с протоколом Экспертного Совета Организации (IRB) периферическую кровь получали посредством афереза. Для удаления эритроцитов применяли градиент плотности Фиколла, после чего выделяли остаток, обогащенный CD34+ клетками с помощью Miltenyi CliniMACS system (Miltenyi Biotec). Клетки предварительно стимулировали SCF, FltL, TPO и IL3 человека в концентрации, приблизительно равной 4*106 cells/мл в течение 18-24 ч. Затем клетки трансдуцировали Lenti-D GTP, несущего ген ABCD1 человека, при множественности заражения 25 в течение 18-24 ч в присутствии SCF, FltL, TPO, IL3, сульфата протамина и dmPGE2.
После трансдукции часть клеток отбирали для аттестационного испытания, оставшиеся клетки криоконсервировали и хранили при -80°C. В качестве одного из этапов аттестационного испытания трансдуцированные клетки субъекта затем культивируовали в течение 7 дней и подвергали анализу количества копий вектора (VCN, пример 1). Результат должен составлять в среднем 0,5-3 копии на клетку, при эффективности трансдукции, превышающей 50%. После успешных аттестационных испытаний пациентам назначали терапию бусульфаном и циклофосфамидом.
Затем пациентам однократно вводили аутологичные CD34+k.tctkh внутривенно, дозой, превышающей >3*106 CD34+ клеток/кг. Пациенты находились под ежедневным наблюдением в отделении трансплантации для выявления побочных эффектов и отслеживания лабораторных показателей при приживлении трансплантата в костном мозге.
После приживления трансплантата, при условии стабильного состояния пациентов, их выписывали из стационара. В течение 6 первых месяцев пациенты проходили ежемесячное обследование, затем обследование проводили каждые 3 месяца в течение, в общей сложности, 24 месяцев. Обледование включало стандартные гематологические и химические лабораторные анализы, а также особые гематологические анализы, анализы костного мозга, выявление побочных эффектов и взаимодействия с сопутствующими препаратами, а также оценку особых гематологических и клинических параметров, связанных с конкретным заболеванием.
- 42 032699
Основополагающими характеристиками являлись безопасность и переносимость введения клеток, трансдуцированных Lenti-D, и время приживления аутологичных модифицированных CD34+ клеток. Дополнительные характеристики включали биологические и биохимические последствия присутствия трансдуцированного гена и его продукта в кроветворных и кровяных клетках, необходимость в переливании крови и частота госпитализаций и клинических случаев в течение 2-годового периода наблюдения после трансплантации. Все пациенты должны были проходить ежегодное обследование в течение 15летнего пост-трансплантационного периода для выявления серьезных побочных эффектов, анализ на репликативно-компетентный лентивирус и сбор кровяных клеток для анализа мутагенеза после внедрения вектора в геном, при наличии признаков развития злокачественных опухолей.
Как станет очевидно специалисту в данной области техники, ознакомившемуся с настоящим описанием, варианты реализации настоящего изобретения могут быть модифицированы соответствующим образом, учитывая описанные в заявке детали и подробности. В целом, указанные в формуле изобретения понятия и термины не ограничиваются определенными вариантами реализации, описанными в настоящей заявке, но подразумевают все возможные варианты реализации в рамках объема изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> БЛУБЁРД БИО, ИНК.
Хеффнер, Гарретт Коллинс
Бассан, Абрахам Исаак <120> СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ УЛУЧШЕННОЙ ВИРУСНОЙ ТРАНСДУКЦИИ <130> BLBD-006/01WO <150> US 61/541,736 <151> 2011-09-30 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 576 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 actcttctgg tccccacaga ctcagagaga acccaccatg gtgctgtctc ctgccgacaa 60 gaccaacgtc aaggccgcct ggggtaaggt cggcgcgcac gctggcgagt atggtgcgga 120 ggccctggag aggatgttcc tgtccttccc caccaccaag acctacttcc cgcacttcga 180 cctgagccac ggctctgccc aggttaaggg ccacggcaag aaggtggccg acgcgctgac 240 caacgccgtg gcgcacgtgg acgacatgcc caacgcgctg tccgccctga gcgacctgca 300 cgcgcacaag cttcgggtgg acccggtcaa cttcaagctc ctaagccact gcctgctggt 360 gaccctggcc gcccacctcc ccgccgagtt cacccctgcg gtgcacgcct ccctggacaa 420 gttcctggct tctgtgagca ccgtgctgac ctccaaatac cgttaagctg gagcctcggt 480 ggccatgctt cttgcccctt gggcctcccc ccagcccctc ctccccttcc tgcacccgta 540 cccccgtggt ctttgaataa agtctgagtg ggcggc 576 <210>
<211>
<212>
142 PRT
- 43 032699 <213> Homo sapiens <400> 2
Met Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly
5 1015
Lys Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg
2530
Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp 35 4045
Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala 50 5560
Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala
70 7580
Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro 85 9095
Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala
100 105110
His Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys
115 120125
Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg
130 135140 <210> 3 <211> 142 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3
Met Val Leu Ser Gly Glu Asp Lys Ser Asn Ile Lys Ala Ala Trp Gly
5 1015
Lys Ile Gly Gly His Gly Ala Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg
2530
Met Phe Ala Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp 35 4045
Val Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala 50 5560
- 44 032699
Asp Ala Leu Ala Asn Ala Ala Gly His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala
70 7580
Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro 85 9095
Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ser
100 105110
His His Pro Ala Asp Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys
115 120125
Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg
130 135140 <210> 4 <211> 142 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 4
Met Val Leu Ser Ala Asp Asp Lys Thr Asn Ile Lys Asn Cys Trp Gly 1 5 1015
Lys Ile Gly Gly His Gly Gly Glu Tyr Gly Glu Glu Ala Leu Gln Arg
2530
Met Phe Ala Ala Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Ser His Ile Asp 35 4045
Val Ser Pro Gly Ser Ala Gln Val Lys Ala His Gly Lys Lys Val Ala 50 5560
Asp Ala Leu Ala Lys Ala Ala Asp His Val Glu Asp Leu Pro Gly Ala
70 7580
Leu Ser Thr Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro 85 9095
Val Asn Phe Lys Phe Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Cys
100 105110
His His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Ala Met His Ala Ser Leu Asp Lys
115 120125
Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg
130 135140
- 45 032699 <210> 5 <211> 626 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc atggtgcatc 60 tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac gtggatgaag 120 ttggtggtga ggccctgggc aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag aggttctttg 180 agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg caaccctaag gtgaaggctc 240 atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac aacctcaagg 300 gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat cctgagaact 360 tcaggctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc aaagaattca 420 ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag tggtggctgg tgtggctaat gccctggccc 480 acaagtatca ctaagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc 540 ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc 600 taataaaaaa catttatttt cattgc 626 <210> 6 <211> 147 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp 1 5 1015
Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu 20 2530
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp 35 4045
Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His 50 5560
Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp
70 7580
Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 9095
- 46 032699
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val
100 105110
Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln
115 120125
Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His
130 135140
Lys Tyr His
145 <210> 7 <211> 147 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7
Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp 1 5 1015
Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu 20 2530
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp
4045
Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His 50 5560
Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp
70 7580
Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 9095
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val
100 105110
Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln 115 120125
Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His
130 135140
Lys Tyr His
145
- 47 032699 <210> 8 <211> 147 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8
Met Val His Leu Thr Asp Ala Glu Lys Ala Ala Val Ser Gly Leu Trp 1 5 1015
Gly Lys Val Asn Ala Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu 20 2530
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Tyr Phe Asp Ser Phe Gly Asp 35 4045
Leu Ser Ser Ala Ser Ala Ile Met Gly Asn Ala Lys Val Lys Ala His 50 5560
Gly Lys Lys Val Ile Thr Ala Phe Asn Asp Gly Leu Asn His Leu Asp
70 7580
Ser Leu Lys Gly Thr Phe Ala Ser Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 9095
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Met Ile Val
100 105110
Ile Val Leu Gly His His Leu Gly Lys Asp Phe Thr Pro Ala Ala Gln
115 120125
Ala Ala Phe Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Ala Ala Leu Ala His
130 135140
Lys Tyr His
145 <210> 9 <211> 147 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 9
Met Val His Leu Thr Asp Ala Glu Lys Ala Ala Val Asn Gly Leu Trp
5 10 15
Gly Lys Val Asn Pro Asp Asp Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu 20 25 30
- 48 032699
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Tyr Phe Asp Ser Phe Gly Asp 35 4045
Leu Ser Ser Ala Ser Ala Ile Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His 50 5560
Gly Lys Lys Val Ile Asn Ala Phe Asn Asp Gly Leu Lys His Leu Asp
70 7580
Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala His Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 9095
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Met Ile Val
100 105110
Ile Val Leu Gly His His Leu Gly Lys Glu Phe Thr Pro Cys Ala Gln
115 120125
Ala Ala Phe Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Ser Ala Leu Ala His
130 135140
Lys Tyr His
145 <210> 10 <211> 583 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 acactcgctt ctggaacgtc tgaggttatc aataagctcc tagtccagac gccatgggtc 60 atttcacaga ggaggacaag gctactatca caagcctgtg gggcaaggtg aatgtggaag 120 atgctggagg agaaaccctg ggaaggctcc tggttgtcta cccatggacc cagaggttct 180 ttgacagctt tggcaacctg tcctctgcct ctgccatcat gggcaacccc aaagtcaagg 240 cacatggcaa gaaggtgctg acttccttgg gagatgccat aaagcacctg gatgatctca 300 agggcacctt tgcccagctg agtgaactgc actgtgacaa gctgcatgtg gatcctgaga 360 acttcaagct cctgggaaat gtgctggtga ccgttttggc aatccatttc ggcaaagaat 420 tcacccctga ggtgcaggct tcctggcaga agatggtgac tggagtggcc agtgccctgt 480 cctccagata ccactgagct cactgcccat gatgcagagc tttcaaggat aggctttatt 540 ctgcaagcaa tcaaataata aatctattct gctaagagat cac 583 <210> 11 <211> 147
- 49 032699 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11
Met Gly His Phe Thr Glu Glu Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Leu Trp
5 1015
Gly Lys Val Asn Val Glu Asp Ala Gly Gly Glu Thr Leu Gly Arg Leu 20 2530
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Asp Ser Phe Gly Asn 35 4045
Leu Ser Ser Ala Ser Ala Ile Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His 50 5560
Gly Lys Lys Val Leu Thr Ser Leu Gly Asp Ala Ile Lys His Leu Asp
70 7580
Asp Leu Lys Gly Thr Phe Ala Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 9095
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Val Leu Val
100 105110
Thr Val Leu Ala Ile His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Glu Val Gln
115 120125
Ala Ser Trp Gln Lys Met Val Thr Gly Val Ala Ser Ala Leu Ser Ser
130 135140
Arg Tyr His
145 <210> 12 <211> 147 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12
Met Val His Phe Thr Ala Glu Glu Lys Ala Ala Ile Thr Ser Ile Trp
5 1015
Asp Lys Val Asp Leu Glu Lys Val Gly Gly Glu Thr Leu Gly Arg Leu 20 2530
Leu Ile Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Asp Lys Phe Gly Asn 35 4045
- 50 032699
Leu Ser Ser Ala Leu Ala Ile Met Gly Asn Pro Arg Ile Arg Ala His 50 5560
Gly Lys Lys Val Leu Thr Ser Leu Gly Leu Gly Val Lys Asn Met Asp 65 70 7580
Asn Leu Lys Glu Thr Phe Ala His Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 9095
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Met Leu Val
100 105110
Ile Val Leu Ser Thr His Phe Ala Lys Glu Phe Thr Pro Glu Val Gln
115 120125
Ala Ala Trp Gln Lys Leu Val Ile Gly Val Ala Asn Ala Leu Ser His
130 135140
Lys Tyr His
145 <210> 13 <211> 147 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 13
Met Val His Phe Thr Ala Glu Glu Lys Ala Ala Ile Ile Ser Ile Trp
5 1015
Glu Lys Val Asp Leu Glu Lys Ile Gly Gly Glu Thr Leu Gly Arg Leu 20 2530
Leu Ile Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Asp Lys Phe Gly Asn 35 4045
Leu Ser Ser Ala Leu Ala Ile Met Gly Asn Pro Arg Ile Arg Ala His 50 5560
Gly Lys Lys Val Leu Thr Ser Leu Gly Ser Ala Val Glu Asn Met Asp
70 7580
Asn Leu Lys Glu Thr Phe Ala His Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 9095
Leu His Val Asp Pro Gln Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Met Leu Val
- 51 032699
100 105110
Ile Val Leu Ser Thr His Phe Ala Lys Glu Phe Thr Pro Glu Val Gln
115 120125
Ala Ala Trp Gln Lys Leu Val Met Gly Val Ala Asn Ala Leu Ser His
130 135140
Lys Tyr His
145 <210> 14 <211> 774 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 agggcaagtt aagggaatag tggaatgaag gttcattttt cattctcaca aactaatgaa 60 accctgctta tcttaaacca acctgctcac tggagcaggg aggacaggac cagcataaaa 120 ggcagggcag agtcgactgt tgcttacact ttcttctgac ataacagtgt tcactagcaa 180 cctcaaacag acaccatggt gcatctgact cctgaggaga agactgctgt caatgccctg 240 tggggcaaag tgaacgtgga tgcagttggt ggtgaggccc tgggcagatt actggtggtc 300 tacccttgga cccagaggtt ctttgagtcc tttggggatc tgtcctctcc tgatgctgtt 360 atgggcaacc ctaaggtgaa ggctcatggc aagaaggtgc taggtgcctt tagtgatggc 420 ctggctcacc tggacaacct caagggcact ttttctcagc tgagtgagct gcactgtgac 480 aagctgcacg tggatcctga gaacttcagg ctcttgggca atgtgctggt gtgtgtgctg 540 gcccgcaact ttggcaagga attcacccca caaatgcagg ctgcctatca gaaggtggtg 600 gctggtgtgg ctaatgccct ggctcacaag taccattgag atcctggact gtttcctgat 660 aaccataaga agaccctatt tccctagatt ctattttctg aacttgggaa cacaatgcct 720 acttcaaggg tatggcttct gcctaataaa gaatgttcag ctcaacttcc tgat 774 <210> 15 <211> 147 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15
Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Thr Ala Val Asn Ala Leu Trp
5 10 15
Gly Lys Val Asn Val Asp Ala Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu 20 25 30
- 52 032699
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp 35 4045
Leu Ser Ser Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His 50 5560
Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp
70 7580
Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ser Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 9095
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val
100 105110
Cys Val Leu Ala Arg Asn Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Gln Met Gln
115 120125
Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His
130 135140
Lys Tyr His
145 <210> 16 <211> 2297 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ccagccccag tccctacgcg gcagccagcc caggtgacat gccggtgctc tccaggcccc 60 ggccctggcg ggggaacacg ctgaagcgca cggccgtgct cctggccctc gcggcctatg 120 gagcccacaa agtctacccc ttggtgcgcc agtgcctggc cccggccagg ggtcttcagg 180 cgcccgccgg ggagcccacg caggaggcct ccggggtcgc ggcggccaaa gctggcatga 240 accgggtatt cctgcagcgg ctcctgtggc tcctgcggct gctgttcccc cgggtcctgt 300 gccgggagac ggggctgctg gccctgcact cggccgcctt ggtgagccgc accttcctgt 360 cggtgtatgt ggcccgcctg gacggaaggc tggcccgctg catcgtccgc aaggacccgc 420 gggcttttgg ctggcagctg ctgcagtggc tcctcatcgc cctccctgct accttcgtca 480 acagtgccat ccgttacctg gagggccaac tggccctgtc gttccgcagc cgtctggtgg 540 cccacgccta ccgcctctac ttctcccagc agacctacta ccgggtcagc aacatggacg 600 ggcggcttcg caaccctgac cagtctctga cggaggacgt ggtggccttt gcggcctctg 660 tggcccacct ctactccaac ctgaccaagc cactcctgga cgtggctgtg acttcctaca 720
- 53 032699 ccctgcttcg ggcggcccgc tcccgtggag ccggcacagc ctggccctcg gccatcgccg 780 gcctcgtggt gttcctcacg gccaacgtgc tgcgggcctt ctcgcccaag ttcggggagc 840 tggtggcaga ggaggcgcgg cggaaggggg agctgcgcta catgcactcg cgtgtggtgg 900 ccaactcgga ggagatcgcc ttctatgggg gccatgaggt ggagctggcc ctgctacagc 960 gctcctacca ggacctggcc tcgcagatca acctcatcct tctggaacgc ctgtggtatg 1020 ttatgctgga gcagttcctc atgaagtatg tgtggagcgc ctcgggcctg ctcatggtgg 1080 ctgtccccat catcactgcc actggctact cagagtcaga tgcagaggcc gtgaagaagg 1140 cagccttgga aaagaaggag gaggagctgg tgagcgagcg cacagaagcc ttcactattg 1200 cccgcaacct cctgacagcg gctgcagatg ccattgagcg gatcatgtcg tcgtacaagg 1260 aggtgacgga gctggctggc tacacagccc gggtgcacga gatgttccag gtatttgaag 1320 atgttcagcg ctgtcacttc aagaggccca gggagctaga ggacgctcag gcggggtctg 1380 ggaccatagg ccggtctggt gtccgtgtgg agggccccct gaagatccga ggccaggtgg 1440 tggatgtgga acaggggatc atctgcgaga acatccccat cgtcacgccc tcaggagagg 1500 tggtggtggc cagcctcaac atcagggtgg aggaaggcat gcatctgctc atcacaggcc 1560 ccaatggctg cggcaagagc tccctgttcc ggatcctggg tgggctctgg cccacgtacg 1620 gtggtgtgct ctacaagccc ccaccccagc gcatgttcta catcccgcag aggccctaca 1680 tgtctgtggg ctccctgcgt gaccaggtga tctacccgga ctcagtggag gacatgcaaa 1740 ggaagggcta ctcggagcag gacctggaag ccatcctgga cgtcgtgcac ctgcaccaca 1800 tcctgcagcg ggagggaggt tgggaggcta tgtgtgactg gaaggacgtc ctgtcgggtg 1860 gcgagaagca gagaatcggc atggcccgca tgttctacca caggcccaag tacgccctcc 1920 tggatgaatg caccagcgcc gtgagcatcg acgtggaagg caagatcttc caggcggcca 1980 aggacgcggg cattgccctg ctctccatca cccaccggcc ctccctgtgg aaataccaca 2040 cacacttgct acagttcgat ggggagggcg gctggaagtt cgagaagctg gactcagctg 2100 cccgcctgag cctgacggag gagaagcagc ggctggagca gcagctggcg ggcattccca 2160 agatgcagcg gcgcctccag gagctctgcc agatcctggg cgaggccgtg gccccagcgc 2220 atgtgccggc acctagcccg caaggccctg gtggcctcca gggtgcctcc acctgactcg 2280 agggggggcc cggtacc 2297 <210> 17 <211> 2238 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17
- 54 032699 atgccggtgc tctccaggcc ccggccctgg cgggggaaca cgctgaagcg cacggccgtg 60 ctcctggccc tcgcggccta tggagcccac aaagtctacc ccttggtgcg ccagtgcctg 120 gccccggcca ggggtcttca ggcgcccgcc ggggagccca cgcaggaggc ctccggggtc 180 gcggcggcca aagctggcat gaaccgggta ttcctgcagc ggctcctgtg gctcctgcgg 240 ctgctgttcc cccgggtcct gtgccgggag acggggctgc tggccctgca ctcggccgcc 300 ttggtgagcc gcaccttcct gtcggtgtat gtggcccgcc tggacggaag gctggcccgc 360 tgcatcgtcc gcaaggaccc gcgggctttt ggctggcagc tgctgcagtg gctcctcatc 420 gccctccctg ctaccttcgt caacagtgcc atccgttacc tggagggcca actggccctg 480 tcgttccgca gccgtctggt ggcccacgcc taccgcctct acttctccca gcagacctac 540 taccgggtca gcaacatgga cgggcggctt cgcaaccctg accagtctct gacggaggac 600 gtggtggcct ttgcggcctc tgtggcccac ctctactcca acctgaccaa gccactcctg 660 gacgtggctg tgacttccta caccctgctt cgggcggccc gctcccgtgg agccggcaca 720 gcctggccct cggccatcgc cggcctcgtg gtgttcctca cggccaacgt gctgcgggcc 780 ttctcgccca agttcgggga gctggtggca gaggaggcgc ggcggaaggg ggagctgcgc 840 tacatgcact cgcgtgtggt ggccaactcg gaggagatcg ccttctatgg gggccatgag 900 gtggagctgg ccctgctaca gcgctcctac caggacctgg cctcgcagat caacctcatc 960 cttctggaac gcctgtggta tgttatgctg gagcagttcc tcatgaagta tgtgtggagc 1020 gcctcgggcc tgctcatggt ggctgtcccc atcatcactg ccactggcta ctcagagtca 1080 gatgcagagg ccgtgaagaa ggcagccttg gaaaagaagg aggaggagct ggtgagcgag 1140 cgcacagaag ccttcactat tgcccgcaac ctcctgacag cggctgcaga tgccattgag 1200 cggatcatgt cgtcgtacaa ggaggtgacg gagctggctg gctacacagc ccgggtgcac 1260 gagatgttcc aggtatttga agatgttcag cgctgtcact tcaagaggcc cagggagcta 1320 gaggacgctc aggcggggtc tgggaccata ggccggtctg gtgtccgtgt ggagggcccc 1380 ctgaagatcc gaggccaggt ggtggatgtg gaacagggga tcatctgcga gaacatcccc 1440 atcgtcacgc cctcaggaga ggtggtggtg gccagcctca acatcagggt ggaggaaggc 1500 atgcatctgc tcatcacagg ccccaatggc tgcggcaaga gctccctgtt ccggatcctg 1560 ggtgggctct ggcccacgta cggtggtgtg ctctacaagc ccccacccca gcgcatgttc 1620 tacatcccgc agaggcccta catgtctgtg ggctccctgc gtgaccaggt gatctacccg 1680 gactcagtgg aggacatgca aaggaagggc tactcggagc aggacctgga agccatcctg 1740 gacgtcgtgc acctgcacca catcctgcag cgggagggag gttgggaggc tatgtgtgac 1800 tggaaggacg tcctgtcggg tggcgagaag cagagaatcg gcatggcccg catgttctac 1860
- 55 032699 cacaggccca agtacgccct cctggatgaa tgcaccagcg ccgtgagcat cgacgtggaa 1920 ggcaagatct tccaggcggc caaggacgcg ggcattgccc tgctctccat cacccaccgg 1980 ccctccctgt ggaaatacca cacacacttg ctacagttcg atggggaggg cggctggaag 2040 ttcgagaagc tggactcagc tgcccgcctg agcctgacgg aggagaagca gcggctggag 2100 cagcagctgg cgggcattcc caagatgcag cggcgcctcc aggagctctg ccagatcctg 2160 ggcgaggccg tggccccagc gcatgtgccg gcacctagcc cgcaaggccc tggtggcctc 2220 cagggtgcct ccacctga 2238 <210> 18 <211> 745 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18
Met Pro Val Leu Ser Arg Pro Arg Pro Trp Arg Gly Asn Thr Leu Lys
5 1015
Arg Thr Ala Val Leu Leu Ala Leu Ala Ala Tyr Gly Ala His Lys Val 20 2530
Tyr Pro Leu Val Arg Gln Cys Leu Ala Pro Ala Arg Gly Leu Gln Ala 35 4045
Pro Ala Gly Glu Pro Thr Gln Glu Ala Ser Gly Val Ala Ala Ala Lys 50 5560
Ala Gly Met Asn Arg Val Phe Leu Gln Arg Leu Leu Trp Leu Leu Arg
70 7580
Leu Leu Phe Pro Arg Val Leu Cys Arg Glu Thr Gly Leu Leu Ala Leu 85 9095
His Ser Ala Ala Leu Val Ser Arg Thr Phe Leu Ser Val Tyr Val Ala
100 105110
Arg Leu Asp Gly Arg Leu Ala Arg Cys Ile Val Arg Lys Asp Pro Arg 115 120125
Ala Phe Gly Trp Gln Leu Leu Gln Trp Leu Leu Ile Ala Leu Pro Ala 130 135140
Thr Phe Val Asn Ser Ala Ile Arg Tyr Leu Glu Gly Gln Leu Ala Leu
145 150 155160
- 56 032699
Ser Phe Arg Ser Arg Leu Val Ala His Ala Tyr Arg Leu Tyr Phe Ser
165 170175
Gln Gln Thr Tyr Tyr Arg Val Ser Asn Met Asp Gly Arg Leu Arg Asn
180 185190
Pro Asp Gln Ser Leu Thr Glu Asp Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val
195 200205
Ala His Leu Tyr Ser Asn Leu Thr Lys Pro Leu Leu Asp Val Ala Val
210 215220
Thr Ser Tyr Thr Leu Leu Arg Ala Ala Arg Ser Arg Gly Ala Gly Thr
225 230 235240
Ala Trp Pro Ser Ala Ile Ala Gly Leu Val Val Phe Leu Thr Ala Asn
245 250255
Val Leu Arg Ala Phe Ser Pro Lys Phe Gly Glu Leu Val Ala Glu Glu
260 265270
Ala Arg Arg Lys Gly Glu Leu Arg Tyr Met His Ser Arg Val Val Ala
275 280285
Asn Ser Glu Glu Ile Ala Phe Tyr Gly Gly His Glu Val Glu Leu Ala
290 295300
Leu Leu Gln Arg Ser Tyr Gln Asp Leu Ala Ser Gln Ile Asn Leu Ile
305 310 315320
Leu Leu Glu Arg Leu Trp Tyr Val Met Leu Glu Gln Phe Leu Met Lys
325 330335
Tyr Val Trp Ser Ala Ser Gly Leu Leu Met Val Ala Val Pro Ile Ile
340 345350
Thr Ala Thr Gly Tyr Ser Glu Ser Asp Ala Glu Ala Val Lys Lys Ala
355 360365
Ala Leu Glu Lys Lys Glu Glu Glu Leu Val Ser Glu Arg Thr Glu Ala
370 375380
Phe Thr Ile Ala Arg Asn Leu Leu Thr Ala Ala Ala Asp Ala Ile Glu
385 390 395400
Arg Ile Met Ser Ser Tyr Lys Glu Val Thr Glu Leu Ala Gly Tyr Thr
405 410415
- 57 032699
Ala Arg Val His Glu Met Phe Gln Val Phe Glu Asp Val Gln Arg Cys
420 425430
His Phe Lys Arg Pro Arg Glu Leu Glu Asp Ala Gln Ala Gly Ser Gly
435 440445
Thr Ile Gly Arg Ser Gly Val Arg Val Glu Gly Pro Leu Lys Ile Arg
450 455460
Gly Gln Val Val Asp Val Glu Gln Gly Ile Ile Cys Glu Asn Ile Pro
465 470 475480
Ile Val Thr Pro Ser Gly Glu Val Val Val Ala Ser Leu Asn Ile Arg
485 490495
Val Glu Glu Gly Met His Leu Leu Ile Thr Gly Pro Asn Gly Cys Gly
500 505510
Lys Ser Ser Leu Phe Arg Ile Leu Gly Gly Leu Trp Pro Thr Tyr Gly
515 520525
Gly Val Leu Tyr Lys Pro Pro Pro Gln Arg Met Phe Tyr Ile Pro Gln
530 535540
Arg Pro Tyr Met Ser Val Gly Ser Leu Arg Asp Gln Val Ile Tyr Pro
545 550 555560
Asp Ser Val Glu Asp Met Gln Arg Lys Gly Tyr Ser Glu Gln Asp Leu
565 570575
Glu Ala Ile Leu Asp Val Val His Leu His His Ile Leu Gln Arg Glu
580 585590
Gly Gly Trp Glu Ala Met Cys Asp Trp Lys Asp Val Leu Ser Gly Gly
595 600605
Glu Lys Gln Arg Ile Gly Met Ala Arg Met Phe Tyr His Arg Pro Lys
610 615620
Tyr Ala Leu Leu Asp Glu Cys Thr Ser Ala Val Ser Ile Asp Val Glu
625 630 635640
Gly Lys Ile Phe Gln Ala Ala Lys Asp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Ser
645 650655
- 58 032699
Ile Thr His Arg Pro Ser Leu Trp Lys Tyr His Thr His Leu Leu Gln
660 665670
Phe Asp Gly Glu Gly Gly Trp Lys Phe Glu Lys Leu Asp Ser Ala Ala
675 680685
Arg Leu Ser Leu Thr Glu Glu Lys Gln Arg Leu Glu Gln Gln Leu Ala
690 695700
Gly Ile Pro Lys Met Gln Arg Arg Leu Gln Glu Leu Cys Gln Ile Leu
705 710 715720
Gly Glu Ala Val Ala Pro Ala His Val Pro Ala Pro Ser Pro Gln Gly
725 730735
Pro Gly Gly Leu Gln Gly Ala Ser Thr

Claims (18)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ повышения эффективности трансдукции кроветворных клеток лентивирусом, который включает культивирование кроветворных клеток и лентивируса в присутствии соединения, которое обеспечивает усиление сигнального пути рецептора простагландина EP, причем указанные клетки культивируют с лентивирусом во время или до культивирования с соединением, которое обеспечивает усиление сигнального пути рецептора простагландина EP, и при этом указанное соединение, которое обеспечивает усиление сигнального пути рецептора простагландина EP, выбирают из группы, состоящей из PGA2; PGB2; PGD2; PGE,; PGE2; PGF2; PGI2; PGH2; PGJ2; или из группы, состоящей из 15d-PGJ2; дельта12-PGJ2; 2-гидроксигептадекатриеновой кислоты (HHT); тромбоксана A2; тромбоксана B2; илопроста; трепростинила; травопроста; карбопроста трометамина; тафлупроста; латанопроста; биматопроста; унопростон изопропила; клопростенола; эстрофана; суперфана; мизопростола; бутапроста; линолевой кислоты; 13(s)-HODE; LY171883; мидовой кислоты; эйкозатриеновой кислоты; эпоксиэйкозатриеновой кислоты; ONO-259; Cay1039; агониста рецептора PGE2; 16,16-диметил PGE2; 19(И)-гидрокси PGE2; 16,16-диметил PGE2 p-(p-ацетамидобензамидо) фенилового эфира; 11-дезокси-16,16-диметил PGE2; 9дезокси-9-метилен-16,16-диметил PGE2; 9-дезокси-9-метилен PGE2; сульпростона; сериноламида PGE2; метилового эфира PGE2; 16-фенил-тетранор PGE2; 15^)-15-метил PGE2; 15(R)-15-метил PGE2; BIO; 8бром-цАМФ; форсколина; ацетоксиметилового эфира 1.2-бис-этан-ККК^тетрауксусной кислоты (BAPTA-AM); фендилина; никардипина; нифедипина; пимозида; строфантидина; ланатозида; Lаргинина; нитропруссида натрия; ванадата натрия; брадикинина; мебеверина; флурандренолида; атенолола; пиндолола; габоксадола; оксихинолинкарбоновой кислоты; гидралазина; тиабендазола; бикукуллина; везамикола; перувозида; имипрамина; хлорпропамида; 1,5-пентаметилентетразола; 4-аминопиридина; диазоксида; бенфотиамина; 12-метоксидодеценовой кислоты; N-формил-метионил-лейцилфенилаланина; галламина; IAA 94 и хлортрианизена.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные клетки представляют собой кроветворные стволовые клетки или кроветворные клетки-предшественники.
  3. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный способ обеспечивает трансдукцию по меньшей мере 50% кроветворных стволовых клеток или кроветворных клеток-предшественников.
  4. 4. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный способ обеспечивает трансдукцию по меньшей мере 75% кроветворных стволовых клеток или кроветворных клеток-предшественников.
  5. 5. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный способ обеспечивает трансдукцию по меньшей мере 90% кроветворных стволовых клеток или кроветворных клеток-предшественников.
  6. 6. Способ по любому из пп.1-5, дополнительно включающий культивирование клеток и лентивируса в присутствии ингибитора деацетилазы гистонов (HDAC).
  7. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что ингибитор деацетилазы гистонов (HDAC) выбирают из группы, состоящей из трихостатина A (TSA), вальпроевой кислоты (VPA), бутирата натрия, субероила
    - 59 032699 нилида гидроксамовой кислоты (SAHA), фенилбутирата натрия, депсипептидов, трапоксина (TPX), пептида 1, содержащего циклическую гидроксамовую кислоту (CHAPI), MS-275, LBH589 и PXD-101.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что лентивирус представляет собой вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).
  9. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что лентивирус псевдотипирован белком G оболочки вируса везикулярного стоматита (VSV-G).
  10. 10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что клетки культивируют с лентивирусом в присутствии соединения, которое обеспечивает усиление сигнального пути рецептора простагландина EP.
  11. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что клетки культивируют с лентивирусом в присутствии соединения, которое обеспечивает усиление сигнального пути рецептора простагландина EP в течение по меньшей мере 24 ч.
  12. 12. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что клетки культивируют в присутствии соединения, которое обеспечивает усиление сигнального пути рецептора простагландина EP в течение по меньшей мере первых 24 ч после начала процесса трансдукции.
  13. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что клетки культивируют в присутствии соединения, которое обеспечивает усиление сигнального пути рецептора простагландина EP в течение первых 48 ч после начала процесса трансдукции.
  14. 14. Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что лентивирус содержит вектор, включающий:
    a) левый (5') длинный концевой повтор (LTR) лентивируса;
    b) последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с геном, представляющим интерес; и
    c) правый (3') длинный концевой повтор (LTR) лентивируса.
  15. 15. Способ по любому из пп.3-14, отличающийся тем, что лентивирус содержит вектор, включающий:
    a) левый (5') длинный концевой повтор (LTR-) ВИЧ-1;
    b) пси-последовательность для упаковки (Ψ+);
    c) центральный полипуриновый тракт ВИЧ-1/ДНК-флэп элемент (cPPT/FLAP);
    d) элемент, связывающийся с белком rev (RRE-структура);
    e) промотор β-глобина и локус контролирующую область (LCR) β-глобина, функционально связанные с геном, представляющим интерес; и
    f) правый (3') длинный концевой повтор (LTR-) лентивируса, содержащий:
    i) один или несколько инсуляторов или ii) полиадениловую последовательность β-глобина кролика (^gpA).
  16. 16. Способ по любому из пп.3-14, отличающийся тем, что лентивирус содержит вектор, включающий:
    a) левый (5') длинный концевой повтор (LTR-) ВИЧ-1;
    b) пси-последовательность для упаковки (Ψ+);
    c) центральный полипуриновый тракт ВИЧ-1/ДНК-флэп элемент (cPPT/FLAP);
    d) элемент, связывающийся с белком rev (RRE-структура);
    e) промотор MND, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим полипептид ABCD1 человека;
    f) правый (3') длинный концевой повтор (LTR) ВИЧ-1 и
    g) полиадениловую последовательность β-глобина кролика (^gpA).
  17. 17. Способ по любому из пп.1-16, отличающийся тем, что лентивирус представляет собой репликативно-дефектный лентивирус.
  18. 18. Способ по любому из пп.1-17, отличающийся тем, что указанное соединение, которое обеспечивает усиление сигнального пути рецептора простагландина EP, выбрано из простагландина E2 (PGE2) и 16,16-диметил PGE2.
EA201490627A 2011-09-30 2012-09-28 Способ повышения эффективности трансдукции кроветворных клеток лентивирусом EA032699B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161541736P 2011-09-30 2011-09-30
PCT/US2012/057987 WO2013049615A1 (en) 2011-09-30 2012-09-28 Compounds for improved viral transduction

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201490627A1 EA201490627A1 (ru) 2014-11-28
EA032699B1 true EA032699B1 (ru) 2019-07-31

Family

ID=47996444

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201490627A EA032699B1 (ru) 2011-09-30 2012-09-28 Способ повышения эффективности трансдукции кроветворных клеток лентивирусом

Country Status (19)

Country Link
US (4) US9988644B2 (ru)
EP (4) EP4095236A1 (ru)
JP (2) JP6285863B2 (ru)
KR (1) KR102011532B1 (ru)
CN (2) CN103958667A (ru)
AU (1) AU2012315699B2 (ru)
BR (1) BR112014007782B1 (ru)
CA (1) CA2850484C (ru)
CY (1) CY1122654T1 (ru)
DK (2) DK3269802T3 (ru)
EA (1) EA032699B1 (ru)
ES (3) ES2632444T5 (ru)
IL (2) IL231812B (ru)
IN (1) IN2014CN02518A (ru)
MX (2) MX359398B (ru)
PT (2) PT2760994T (ru)
SG (2) SG10201602423TA (ru)
UA (1) UA114796C2 (ru)
WO (1) WO2013049615A1 (ru)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3203374A1 (en) 2008-11-06 2010-05-14 Indiana University Research & Technology Corporation Materials and methods to enhance hematopoietic stem cells engraftment procedures
BR112014007782B1 (pt) 2011-09-30 2021-06-01 Bluebird Bio, Inc. Método para aumentar a eficiência de transdução lentiviral de células progenitoras ou células-tronco hematopoiéticas cd34+, bem como usos terapêuticos de composição compreendendo as ditas células e de pge2, 16,16-dimetil pge2, ou seu análogo
CA2880811C (en) 2012-08-01 2021-12-07 United Therapeutics Corporation Treatment of pulmonary arterial hypertension with prostacyclin-treated endothelial progenitor cells
JP6901823B2 (ja) 2012-08-01 2021-07-14 ユナイテッド セラピューティクス コーポレイション 間葉系幹細胞による肺動脈性高血圧症の処置
US20150216903A1 (en) * 2012-08-10 2015-08-06 Bluebird Bio, Inc. Compounds for improved viral transduction
MX361412B (es) 2012-11-27 2018-12-05 Childrens Medical Center Direccion de elementos reguladores distales de bcl11a para reinduccion de hemoglobina fetal.
ES2963968T3 (es) 2013-01-09 2024-04-03 United Therapeutics Corp Tratamiento de la vasculopatía con prostaciclina y células madre mesenquimatosas
US10617721B2 (en) * 2013-10-24 2020-04-14 Ospedale San Raffaele S.R.L. Methods for genetic modification of stem cells
US20170173083A1 (en) * 2014-03-26 2017-06-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions and methods for ex vivo expansion of human hematopoietic stem/progenitor cells
EP3598984B1 (en) 2014-04-25 2024-04-10 The Children's Medical Center Corporation Compositions and methods to treating hemoglobinopathies
ES2835861T3 (es) 2015-05-08 2021-06-23 Childrens Medical Ct Corp Direccionamiento de regiones funcionales del potenciador de BCL11A para la reinducción de hemoglobina fetal
RU2630654C2 (ru) * 2015-07-29 2017-09-11 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Балтийский Федеральный Университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) Способ хемогенетической регистрации и коррекции нейрогенеза на основе генетических конструкций для трансфекции астроцитов и нейронов
CN105062979A (zh) * 2015-08-21 2015-11-18 昆明理工大学 一种培养戊型肝炎病毒的方法
RU2021103425A (ru) * 2016-02-12 2021-02-25 Блубёрд Био, Инк. Композиции, повышающие число копий вектора (чкв), и способы их применения
US11326183B2 (en) 2016-02-12 2022-05-10 Bluebird Bio, Inc. VCN enhancer compositions and methods of using the same
US20190161530A1 (en) * 2016-04-07 2019-05-30 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptor t cell compositions
US10898494B2 (en) 2016-05-05 2021-01-26 Liquidia Technologies, Inc. Dry powder treprostinil for the treatment of pulmonary hypertension
CA3041514A1 (en) 2016-10-24 2018-05-03 United Therapeutics Corporation Enhancement of msc immunomodulatory properties by treprostinil
AU2017368050A1 (en) 2016-11-29 2019-06-20 Puretech Lyt, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
US11261441B2 (en) 2017-03-29 2022-03-01 Bluebird Bio, Inc. Vectors and compositions for treating hemoglobinopathies
CA3057862A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-04 Bluebird Bio, Inc. Vectors and compositions for treating hemoglobinopathies
US11788087B2 (en) 2017-05-25 2023-10-17 The Children's Medical Center Corporation BCL11A guide delivery
CN111247149A (zh) * 2017-09-15 2020-06-05 威斯康星州医药大学股份有限公司 肾脏靶向的环氧二十碳三烯酸(eet)类似物
FR3074189A1 (fr) * 2017-11-30 2019-05-31 Assistance Publique - Hopitaux De Paris Methode de generation de greffons de cellules souches hematopoietiques
WO2019196816A1 (zh) * 2018-04-13 2019-10-17 诺未科技（北京）有限公司 丁酸钠的用途及含有丁酸钠的培养体系
CN109207427B (zh) * 2018-09-17 2020-12-08 诺未科技（银川）有限公司 一种将人造血祖细胞转变为造血干细胞的方法
EP3784695B1 (en) * 2018-04-27 2023-08-09 The Medical College of Wisconsin, Inc. Use of lentivector-transduced t-rapa cells for amelioration of lysosomal storage disorders
US20220389448A1 (en) * 2019-06-28 2022-12-08 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating anemia
EP4045666A4 (en) * 2019-10-16 2023-11-15 Orchard Therapeutics (Europe) Limited COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING EUKARYOTIC CELLS
CN113106098B (zh) * 2021-04-21 2022-04-01 贵州医科大学 一种在红系细胞中特异表达人β珠蛋白的重组序列及其应用
AU2021202658A1 (en) 2021-04-28 2022-11-17 Fondazione Telethon Gene therapy
CN113336833A (zh) * 2021-06-04 2021-09-03 广州伯尼兹生物科技有限公司 一种高效分泌表达猪流行性腹泻病毒s1蛋白的生产方法
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
GB202206346D0 (en) 2022-04-29 2022-06-15 Ospedale San Raffaele Srl Gene therapy
WO2024033802A2 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Fondazione Telethon Ets Gene therapy
WO2024079644A1 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Fondazione Telethon Ets 3d cell culture methods
WO2024081820A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells
WO2024119157A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles with cofusogens and methods of producing and using the same

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090092589A1 (en) * 1995-09-29 2009-04-09 Williams David A Methods for enhanced virus-mediated dna transfer using molecules with virus- and cell-binding domains
WO2010054271A1 (en) * 2008-11-06 2010-05-14 Indiana University Research & Technology Corporation Materials and methds to enhance hematopoietic stem cells engraftment procedures

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US568159A (en) 1896-06-26 1896-09-22 Veneering-machine
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5399493A (en) 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
US5725871A (en) 1989-08-18 1998-03-10 Danbiosyst Uk Limited Drug delivery compositions comprising lysophosphoglycerolipid
US5707644A (en) 1989-11-04 1998-01-13 Danbiosyst Uk Limited Small particle compositions for intranasal drug delivery
US5061620A (en) 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
US5466468A (en) 1990-04-03 1995-11-14 Ciba-Geigy Corporation Parenterally administrable liposome formulation comprising synthetic lipids
US5635387A (en) 1990-04-23 1997-06-03 Cellpro, Inc. Methods and device for culturing human hematopoietic cells and their precursors
US5399363A (en) 1991-01-25 1995-03-21 Eastman Kodak Company Surface modified anticancer nanoparticles
US5756353A (en) 1991-12-17 1998-05-26 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol-and liposome-based delivery
US5460964A (en) 1992-04-03 1995-10-24 Regents Of The University Of Minnesota Method for culturing hematopoietic cells
DE69312487T2 (de) 1992-05-18 1997-11-27 Minnesota Mining & Mfg Einrichtung zur transmucosalen wirkstoffabgabe
CA2165679A1 (en) 1993-06-21 1995-01-05 Tim M. Townes Anti-sickling hemoglobin
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5409813A (en) 1993-09-30 1995-04-25 Systemix, Inc. Method for mammalian cell separation from a mixture of cell populations
US5869039A (en) 1993-10-15 1999-02-09 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale X-linked adrenoleukodystrophy gene and corresponding protein
WO1996009385A1 (en) 1994-09-19 1996-03-28 Massachusetts Institute Of Technology Anti-sickling beta-globin protein, compositions and methods for treating sickle cell disease
US5677136A (en) 1994-11-14 1997-10-14 Systemix, Inc. Methods of obtaining compositions enriched for hematopoietic stem cells, compositions derived therefrom and methods of use thereof
IE80468B1 (en) 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US6057117A (en) 1996-04-04 2000-05-02 Chiron Corporation Identification and use of selective inhibitors of glycogen synthase kinase 3
EP0915975A2 (en) 1996-07-03 1999-05-19 Chiron Corporation Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
FR2777909B1 (fr) 1998-04-24 2002-08-02 Pasteur Institut Utilisation de sequences d'adn de structure triplex pour le tranfert de sequences de nucleotides dans des cellules, vecteurs recombinants contenant ces sequences triplex
JP2002527101A (ja) 1998-10-16 2002-08-27 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト ヒストンデアセチラーゼ阻害剤による造血幹細胞への遺伝子形質導入の改良及び自己再生の促進
AU2183900A (en) 1998-12-24 2000-07-31 Alcon Laboratories, Inc. Ep4 receptor agonists for treatment of dry eye
US7015037B1 (en) 1999-08-05 2006-03-21 Regents Of The University Of Minnesota Multiponent adult stem cells and methods for isolation
EP1219600A4 (en) 1999-08-13 2004-11-03 Taisho Pharmaceutical Co Ltd PROSTAGLANDIN DERIVATIVES
AU784195B2 (en) 1999-11-12 2006-02-16 Baxter Biotech Technology S.A.R.L. Reduced side-effect hemoglobin compositions
CN1272328C (zh) 1999-12-17 2006-08-30 希龙公司 糖元合成酶激酶3的基于吡嗪的抑制剂
DK1132086T3 (da) 2000-01-31 2006-08-28 Pfizer Prod Inc Anvendelse af prostaglandin (PGE2) selektive receptor 4 (EP4) agonister til behandling af akut og kronisk nyresvigt
US20020013294A1 (en) 2000-03-31 2002-01-31 Delong Mitchell Anthony Cosmetic and pharmaceutical compositions and methods using 2-decarboxy-2-phosphinico derivatives
DE60234824D1 (de) 2001-05-01 2010-02-04 Ca Nat Research Council Induzierbares expressionssystem in eukaryotischen zellen
AU2002347563A1 (en) 2001-12-06 2003-06-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Use of cd34+ hematopoietic progenitor cells for the treatment of cns disorders
WO2003056019A1 (en) 2001-12-24 2003-07-10 Es Cell International Pte Ltd Method of transducing es cells
WO2003065871A2 (en) 2002-02-04 2003-08-14 Millennium Pharmaceuticals Inc. Methods and compositions for treating hematological disorders
EP1539754A4 (en) 2002-08-23 2009-02-25 Novartis Vaccines & Diagnostic BENZIMIDAZOLE QUINOLINONES AND USES THEREOF
US7119200B2 (en) 2002-09-04 2006-10-10 Schering Corporation Pyrazolopyrimidines as cyclin dependent kinase inhibitors
DE60333487D1 (de) 2002-12-13 2010-09-02 Genetix Pharmaceuticals Inc Therapeutische retrovirus-vektoren für gentherapie
EP1613742A2 (en) 2003-04-08 2006-01-11 YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT Co. LTD. Stem cells having increased sensitivity to a chemoattractant and methods of generating and using same
WO2004098531A2 (en) * 2003-05-05 2004-11-18 Virxsys Corporation Increased transduction using abc transporter substrates and/or inhibitors
US6747037B1 (en) 2003-06-06 2004-06-08 Allergan, Inc. Piperidinyl prostaglandin E analogs
IL158868A0 (en) 2003-11-13 2004-05-12 Yeda Res & Dev Methods of generating and using stem cells enriched with immature primitive progenitor
EP1760071A4 (en) 2004-06-23 2008-03-05 Ono Pharmaceutical Co COMPOUND WITH S1P RECEPTOR BINDING ABILITY AND USE THEREOF
EP1805139A2 (en) 2004-10-26 2007-07-11 Allergan, Inc. Therapeutic and delivery methods of prostaglandin ep4 agonists
US20080021078A1 (en) 2006-07-18 2008-01-24 Horizon Therapeutics, Inc. Methods and medicaments for administration of ibuprofen
WO2007041511A2 (en) 2005-09-30 2007-04-12 New York University Hematopoietic progenitor kinase 1 for modulation of an immune response
US8076315B2 (en) 2005-10-14 2011-12-13 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Pharmacological treatments for sleep disorders (apnoe) with prostanoid receptor antagonists
DE102005062741A1 (de) 2005-12-22 2007-06-28 Bayer Schering Pharma Ag Fluorene und Carbazole als Liganden des EP2 Rezeptors
CA2647201C (en) 2006-03-24 2016-03-08 Children's Medical Center Corporation Method to modulate hematopoietic stem cell growth
EP2021534B1 (en) * 2006-04-27 2011-12-28 Université de Montréal Assessment and reduction of risk of graft-versus-host disease
WO2007148332A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Yeda Resaerch And Development Co. Ltd Catecholamine receptor modulation
JP5426389B2 (ja) 2006-10-20 2014-02-26 チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 組織の再生を亢進するための方法
EP2094839B1 (en) 2006-12-08 2020-02-05 University of Rochester Expansion of hematopoietic stem cells
ES2703592T3 (es) 2007-03-07 2019-03-11 Mei Pharma Inc Combinación de agente anticancerígeno de bencimidazol y un segundo agente anticancerígeno
WO2008126932A2 (en) 2007-04-09 2008-10-23 Riken Epigenetical regulation of brain plasticity
WO2010108028A2 (en) 2009-03-19 2010-09-23 Fate Therapeutics, Inc. Compositions comprising cyclic amp enhancers and/or ep ligands, and methods of preparing and using the same
JP6037836B2 (ja) * 2009-11-15 2016-12-07 インディアナ・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・テクノロジー・コーポレーション 特異的プロスタグランジンｅ２受容体の特定を含む幹細胞の送達及び生着を高めるための方法
BR112014007782B1 (pt) * 2011-09-30 2021-06-01 Bluebird Bio, Inc. Método para aumentar a eficiência de transdução lentiviral de células progenitoras ou células-tronco hematopoiéticas cd34+, bem como usos terapêuticos de composição compreendendo as ditas células e de pge2, 16,16-dimetil pge2, ou seu análogo
WO2014015318A1 (en) * 2012-07-19 2014-01-23 Bluebird Bio, Inc. Soluble compounds for improved gene therapy methods
US20150216903A1 (en) * 2012-08-10 2015-08-06 Bluebird Bio, Inc. Compounds for improved viral transduction
US9943545B2 (en) * 2013-03-15 2018-04-17 Fate Therapeutics, Inc. Stem cell culture media and methods of enhancing cell survival
US10617721B2 (en) * 2013-10-24 2020-04-14 Ospedale San Raffaele S.R.L. Methods for genetic modification of stem cells
CN103937743B (zh) * 2014-04-27 2017-12-01 浙江大学 一种利用三维诱导系统获得造血干细胞的方法
EP3313420B1 (en) * 2015-06-25 2024-03-13 The Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
JP2018520688A (ja) * 2015-07-21 2018-08-02 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション Ｐｄ−ｌ１発現造血幹細胞およびその使用
US11326183B2 (en) * 2016-02-12 2022-05-10 Bluebird Bio, Inc. VCN enhancer compositions and methods of using the same
RU2021103425A (ru) * 2016-02-12 2021-02-25 Блубёрд Био, Инк. Композиции, повышающие число копий вектора (чкв), и способы их применения
GB201706394D0 (en) * 2017-04-21 2017-06-07 Ospedale San Raffaele Srl Gene Therapy
FR3074189A1 (fr) * 2017-11-30 2019-05-31 Assistance Publique - Hopitaux De Paris Methode de generation de greffons de cellules souches hematopoietiques

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090092589A1 (en) * 1995-09-29 2009-04-09 Williams David A Methods for enhanced virus-mediated dna transfer using molecules with virus- and cell-binding domains
WO2010054271A1 (en) * 2008-11-06 2010-05-14 Indiana University Research & Technology Corporation Materials and methds to enhance hematopoietic stem cells engraftment procedures

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOESSLING et al., "Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models", Cell Stem Cell, vol. 8, p.445-458 (08 April 2011), See p. 447, right column; p. 449, right column-p. 450, left column; and figure 1. *
PELUS et al., "Pleiotropic effects of prostaglandin E2 in hematopoiesis; prostaglandin E2 and other eicosanoids regulate hematopoietic stem and progenitor cell function", Prostaglandins & Other Lipid Mediators, vol. 96, p. 3-9 (21 June 2011), See the abstract and p. 5, right column. *

Also Published As

Publication number Publication date
US11834668B2 (en) 2023-12-05
AU2012315699A1 (en) 2014-05-22
KR20140069315A (ko) 2014-06-09
US20180363004A1 (en) 2018-12-20
DK2760994T3 (en) 2017-08-07
JP6745826B2 (ja) 2020-08-26
MX2014003923A (es) 2014-05-07
EA201490627A1 (ru) 2014-11-28
EP2760994B1 (en) 2017-05-31
NZ623341A (en) 2016-04-29
EP2760994B2 (en) 2021-09-15
CN108220246B (zh) 2022-07-12
WO2013049615A1 (en) 2013-04-04
IL231812B (en) 2021-03-25
JP2014530012A (ja) 2014-11-17
ES2913633T3 (es) 2022-06-03
CA2850484C (en) 2021-01-26
BR112014007782A2 (pt) 2017-04-11
CA2850484A1 (en) 2013-04-04
PT3269802T (pt) 2020-01-28
EP2760994A4 (en) 2015-03-11
EP3656848B1 (en) 2022-03-16
EP3269802B1 (en) 2019-10-23
IL281045B (en) 2022-02-01
IL281045A (en) 2021-04-29
IN2014CN02518A (ru) 2015-07-31
ES2632444T5 (es) 2022-03-02
CN108220246A (zh) 2018-06-29
US20200048657A1 (en) 2020-02-13
ES2632444T3 (es) 2017-09-13
PT2760994T (pt) 2017-08-24
SG11201401077PA (en) 2014-04-28
UA114796C2 (uk) 2017-08-10
CN103958667A (zh) 2014-07-30
US9988644B2 (en) 2018-06-05
SG10201602423TA (en) 2016-05-30
US20210171980A1 (en) 2021-06-10
IL231812A0 (en) 2014-05-28
DK3269802T3 (da) 2020-02-03
EP3656848A1 (en) 2020-05-27
EP2760994A1 (en) 2014-08-06
DK2760994T4 (da) 2021-10-11
AU2012315699B2 (en) 2017-08-17
MX2018011791A (es) 2021-12-08
EP4095236A1 (en) 2022-11-30
KR102011532B1 (ko) 2019-08-16
MX359398B (es) 2018-09-27
US10501759B2 (en) 2019-12-10
BR112014007782B1 (pt) 2021-06-01
JP2018099124A (ja) 2018-06-28
CY1122654T1 (el) 2021-03-12
US20140234278A1 (en) 2014-08-21
EP2760994B8 (en) 2017-07-26
JP6285863B2 (ja) 2018-02-28
US10907177B2 (en) 2021-02-02
EP3269802A1 (en) 2018-01-17
ES2769270T3 (es) 2020-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11834668B2 (en) Compounds for improved viral transduction
US20150216903A1 (en) Compounds for improved viral transduction
JP2019504635A (ja) Ｖｃｎエンハンサー組成物およびその使用方法
US11326183B2 (en) VCN enhancer compositions and methods of using the same
WO2014015318A1 (en) Soluble compounds for improved gene therapy methods
US20190284533A1 (en) Vcn enhancer compositions and methods of using the same
US20240229070A1 (en) Compounds for improved viral transduction
NZ623341B2 (en) Compounds for improved viral transduction