JP5426389B2 - 組織の再生を亢進するための方法 - Google Patents
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Description
本発明はNational Institutes of Health - NIH助成金CA103846-02により少なくとも一部支援されている。米国政府は本発明に対して特定の権利を持つ。
本発明は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、すべてLeonard I. Zon, Trista E. NorthおよびWolfram Goesslingによる、2007年10月20日出願のMethod to Modulate Hematopoietic Stem Cell Growthという表題の米国特許仮出願第60/853,351号、および2007年10月20日出願のMethod to Enhance Tissue Regenerationという表題の第60/853,202号の恩典、ならびに2007年4月26日出願のMethod to Modulate Hematopoietic Stem Cell Growthという表題の国際公開公報第2007/112084 A2の恩典も主張する。
本態様は、インビトロ、インビボ、およびエクスビボにおいて組織の発生または再生を亢進または阻害する調節物質を提供する。より具体的には、例えば、プロスタグランジンまたはwntシグナル伝達経路と相互作用する調節物質を用いて、肝臓、造血幹細胞、皮膚、血管、および他の再生可能な臓器などの臓器において、再生に対する組織の応答を増強することができる。
再生医学は事故、欠損、または疾病による臓器の損失に苦しむ人の未来を変える可能性のある治療法の開発のために、大きな可能性を持っている。発生のシグナル伝達経路を理解することで、組織の再生のみならず、癌の阻害の展望も開ける可能性がある。
本態様の組成物および方法は、組織成長の調節物質を提供し、これは、特定の効能によって望まれるように、組織の発生および成長を亢進するかまたは組織の発生を阻害する物質である。これらの調節物質は、組織の成長または再生に重要なシグナル伝達経路を刺激または抑制することによって作用する。
[本発明1001]
プロスタグランジンシグナル伝達経路またはその下流の仲介物質をアップレギュレートすることによってwntシグナル伝達活性を亢進する少なくとも1つの組織成長/再生の調節物質を組織に接触させる段階を含む、組織の成長または再生を促進する方法。
[本発明1002]
プロスタグランジンシグナル伝達経路またはその下流の仲介物質をアップレギュレートすることによってwntシグナル伝達活性を亢進する少なくとも1つの組織成長/再生の調節物質を投与する段階を含む、対象において組織の成長または再生を促進する方法。
[本発明1003]
プロスタグランジンシグナル伝達経路またはその下流の仲介物質をアップレギュレートすることによってwntシグナル伝達活性を亢進する少なくとも1つの組織成長/再生の調節物質を含む、薬学的組成物。
特に本明細書に定義しない限り、本発明に関連して使用する科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を持つ。さらに、文脈によって特に必要性がない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含む。
プロスタグランジン誘導体
(↑は肝臓の成長を増加させる相対的な有効性を意味する)
↑ PGE2
↑ PGI2
↑↑↑ 16-フェニルテトラノルPGE2
↑↑ 16,16-ジメチルPGE2
↑↑ 19(R)-ヒドロキシPGE2
↑↑ 16,16-ジメチルPGE2 p-(p-アセトアミドベンザミド)フェニルエステル
↑↑ 9-デオキシ-9-メチレン-16,16-ジメチルPGE2
↑↑ PGE2メチルエステル
↑↑ ブタプロスト
↑ 15(S)-15-メチルPGE2
↑ 15(R)-15-メチルPGE2
↑ 20-ヒドロキシPGE2
↑ 11-デオキシ-16,16-ジメチルPGE2
↑ 9-デオキシ-9-メチレンPGE2
9-ケトフルプロステノール
↑ PGE2セリノールアミド
↑ スルプロストン
17-フェニルトリノルPGE2
8-イソ-15-ケトPGE2
8-イソPGE2イソプロピルエステル
毒性 5-トランスPGE2
実施例1 ゼブラフィッシュモデルに関連する技術
ゼブラフィッシュの飼育:
ゼブラフィッシュをIACUCプロトコールにしたがって維持した。LFABP:GFP(G.M. Her & J.L. Wu, Nat'l Cheng Kung Univ., Taiwanから贈与)、gut:GFP、hs:wnt8-GFP、hs:dnTCF-GFP、およびhs:dkk-GFPトランスジェニック株を使用した。Dorsky et al., 2002: Her et al., 538 FEBS Lett 125-133(2003); Lewis et al., 131 Devel. 1299-1308(2004); Ober et al., 120 Mech. Devel. 5-18(2003); Stoick-Cooper et al., 134 Devel. 479-89(2007); Weidingder et al., 15 Curr. 489-500(2005)。APC変異体の遺伝子型決定は、記載のように実施した。Hurlstone et al., 2003。
胚の熱ショック実験は、他に記載がない限り、38℃で20分間行った。遺伝子型を熱誘導後3時間におけるGFP蛍光の存在によって決定し、非蛍光(野生型)同腹仔を対照として使用した。
ゼブラフィッシュのβカテニン、wnt2b、wnt3、wnt5、wnt8、およびwnt11(Buckles et al., 121 Mech. Devel. 437-47(2004); Lekven et al., 1 Cell Devel. 103-14(2001); Lele et al., 30 Genesis 190-94(2001); Lyman Gingerich et al., 2004; Ober et al., 442 Nature 688-91(2006))に対するMO(Gene Tools, LLC, Philomath, OR)またはミスマッチの対照を、40μMの濃度で1細胞期のゼブラフィッシュ胚に注入した。
パラホルムアルデヒド(PFA)固定した胚は、インターネットの例えばZFIN: The Zebrafish Model Organism Database(Univ. Oregon, Eugene, ORがホスト)にあるような標準的なゼブラフィッシュのプロトコールを用いて、インサイチューハイブリダイゼーションのための処理をした。以下のRNAプローブを用いて、内胚葉および肝臓の発生における変化を検出した:GFP、LFABP、ステロールキャリアタンパク質、トランスフェリン、foxA3、インスリン、トリプシン、およびIFABP。野生型の対照と比較した発現の変化は、各遺伝子型当たり変化した数/スコアした数として報告する;各分析では最低3つの独立した実験を行った。
胚、成体、および一塊とした腹部切片をPFAで固定し、パラフィン包埋し、組織学的分析用の40μmの連続階段切片を作製した。標準的な技術を用いて、一つおきにヘマトキシリン/エオシン染色を行った。βカテニンに対する抗体(1:100)(BD 610154, BD Transduction Laboratories(商標)、San Jose、CA)、TUNEL(Chemicon/Millipore, Billerica, MA)、BrdU(1:2000)(クローンBU-33、B2531、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、およびPCNA(1:80)(クローンPC10、NA03、Calbiochem/EMD Chemicals, Inc., San Diego, CA)をDABにより可視化し、ヘマトキシリンまたはメチレングリーンによって対比染色した。
単一の胚を溶解緩衝液中で手作業により解離させ、遠心分離した。製造元のプロトコール(Promega Corp., Madison, WI)に従って、上清(100ml)をCaspase-Glo(登録商標)3/7 Assay Systemに使用した。細胞の沈殿から単離したDNAは、APC遺伝子型の確認に使用した。
ガラス底の培養皿中で、GFPトランスジェニックゼブラフィッシュの胚を0.4mg/ml Tricaine-Sを含む1%低融点アガロースに包埋し、Zeiss LSM Meta共焦点顕微鏡(Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Thornwood, NY)で可視化した。
個々の胚を0.9% PBS中で手作業により解離させ、GFP蛍光および前方散乱を観察した。APCの遺伝子型決定は、FACS解析後の余剰の細胞に対するPCRにより行った。
トリカイン麻酔の投与後、解剖顕微鏡の明視野下で成体ゼブラフィッシュの肝臓の1/3肝切除を行った。顕微解剖鋏を用いて、腹部の左外側部分で心臓の後方に切開を作製した。その後、鉗子を用いて下葉を全長にわたり切除した。
ゼブラフィッシュは発癌の研究のために貴重な脊椎動物モデルだが、成体フィッシュは透明ではないので、非侵襲的イメージングは困難である。しかし、高解像度の超音波顕微鏡を用いると、腫瘍はインビボで容易に検出できる。この技術は、組織潅流の計算、細胞の吸引、腫瘍進行の解析、および治療への応答を容易にする。超音波生体顕微鏡検査は、ゼブラフィッシュモデルにおいて、腫瘍の発生の縦断的研究および治療効果のリアルタイムの評価を可能にする。本明細書で使用した可視化技術は、Goessling et al., 4(7)Nature Methods 551-53(2007)によって記載されている。
Claims (11)
- 少なくとも1つのプロスタグランジンシグナル伝達経路活性化剤およびwnt経路活性化剤を組織に接触させる段階を含む、組織の成長または再生を促進するためのエクスビボまたはインビトロ方法であって、
少なくとも1つのプロスタグランジンシグナル伝達経路活性化剤が、PGE 2 、PGI 2 、16-フェニルテトラノルPGE 2 、16,16-ジメチルPGE 2 、19(R)-ヒドロキシPGE 2 、16,16-ジメチルPGE 2 、p-(p-アセトアミドベンザミド)フェニルエステル、9-デオキシ-9-メチレン-16,16-ジメチルPGE 2 、PGE 2 メチルエステル、ブタプロスト、15(S)-15-メチルPGE 2 、15(R)-15-メチルPGE 2 、20-ヒドロキシPGE 2 、11-デオキシ-16,16-ジメチルPGE 2 、9-デオキシ-9-メチレンPGE 2 、PGE 2 セリノールアミドおよびスルプロストンからなる群より選択され、ならびに、
wnt経路活性化剤が、6-ブロモインディルビン-3'-オキシム(BIO)、LiClおよび可溶性Wntリガンドからなる群より選択される、
方法。 - 組織が、肝組織、心筋組織、骨組織および皮膚組織からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 少なくとも1つのプロスタグランジンシグナル伝達経路活性化剤が、16,16-ジメチルPGE 2 を含む、請求項1または2記載の方法。
- 対象における組織の成長または再生を促進するための医薬の製造における組成物の使用であって、該組成物が、
PGE 2 、PGI 2 、16-フェニルテトラノルPGE 2 、16,16-ジメチルPGE 2 、19(R)-ヒドロキシPGE 2 、16,16-ジメチルPGE 2 、p-(p-アセトアミドベンザミド)フェニルエステル、9-デオキシ-9-メチレン-16,16-ジメチルPGE 2 、PGE 2 メチルエステル、ブタプロスト、15(S)-15-メチルPGE 2 、15(R)-15-メチルPGE 2 、20-ヒドロキシPGE 2 、11-デオキシ-16,16-ジメチルPGE 2 、9-デオキシ-9-メチレンPGE 2 、PGE 2 セリノールアミドおよびスルプロストンからなる群より選択される少なくとも1つのプロスタグランジンシグナル伝達経路活性化剤、ならびに、
BIO、LiClおよび可溶性Wntリガンドからなる群より選択されるwnt経路活性化剤、
を含む、使用。 - 組織が、肝組織、心筋組織、骨組織および皮膚組織からなる群より選択される、請求項4記載の使用。
- 対象が、肝切除術、肝移植、肝臓提供、心筋梗塞、骨折、皮膚移植または熱傷を受けている、請求項4記載の使用。
- 少なくとも1つのプロスタグランジンシグナル伝達経路活性化剤が、16,16-ジメチルPGE 2 を含む、請求項4〜6のいずれか一項記載の使用。
- 少なくとも1つのプロスタグランジンシグナル伝達経路活性化剤およびwnt経路活性化剤を含む薬学的組成物であって、
少なくとも1つのプロスタグランジンシグナル伝達経路活性化剤が、PGE 2 、PGI 2 、16-フェニルテトラノルPGE 2 、16,16-ジメチルPGE 2 、19(R)-ヒドロキシPGE 2 、16,16-ジメチルPGE 2 、p-(p-アセトアミドベンザミド)フェニルエステル、9-デオキシ-9-メチレン-16,16-ジメチルPGE 2 、PGE 2 メチルエステル、ブタプロスト、15(S)-15-メチルPGE 2 、15(R)-15-メチルPGE 2 、20-ヒドロキシPGE 2 、11-デオキシ-16,16-ジメチルPGE 2 、9-デオキシ-9-メチレンPGE 2 、PGE 2 セリノールアミドおよびスルプロストンからなる群より選択され、ならびに、
wnt経路活性化剤が、BIO、LiClおよび可溶性Wntリガンドからなる群より選択される、
薬学的組成物。 - 肝組織、心筋組織、骨組織および皮膚組織からなる群より選択される組織における組織の成長または再生を促進するための、請求項8記載の組成物。
- 肝切除術、肝移植、肝臓提供、心筋梗塞、骨折、皮膚移植または熱傷を受けた対象に投与するための、請求項8記載の組成物。
- 少なくとも1つのプロスタグランジンシグナル伝達経路活性化剤が、16,16-ジメチルPGE 2 を含む、請求項8〜10のいずれか一項記載の組成物。
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