ES2693622T3 - Método para mejorar el injerto de células madre hematopoyéticas - Google Patents

Abstract

Un método para aumentar la capacidad de injerto de células madre hematopoyéticas (HSC) mediante un tratamiento previo ex vivo de las HSC que comprende las siguientes etapas: a. mezclar al menos un análogo de prostaciclina junto con un agente activante de AMPc inespecífico, seleccionado preferiblemente entre toxina colérica y forskolina, a una muestra que contiene células madre hematopoyéticas para obtener una mezcla, b. incubar dicha mezcla durante un periodo de tiempo suficiente para estimular la señalización de G alfas en dichas células y, opcionalmente, c. aislar dichas células estimuladas.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para mejorar el injerto de celulas madre hematopoyeticas Antecedentes de la invencion

La presente invencion proporciona un nuevo metodo para aumentar el injerto de celulas madre hematopoyeticas mediante un tratamiento previo ex-vivo que comprende las etapas de obtener una muestra que contiene celulas madre hematopoyeticas y anadir un analogo de prostaciclina junto con un agente activante de AMPc inespedfico, seleccionado preferiblemente entre toxina colerica y forskolina, para obtener una mezcla, incubar dicha mezcla durante un penodo de tiempo suficiente para estimular la senalizacion a traves de G-alfa en dichas celulas y opcionalmente aislar dichas celulas estimuladas.

Ademas, se proporciona una composicion que comprende Treprostinil junto con un agente activante de AMPc inespedfico, seleccionado preferiblemente entre toxina colerica y forskolina, para uso en el tratamiento de individuos que se someten a un trasplante de celulas madre hematopoyeticas.

Las celulas madre hematopoyeticas (HSC) son celulas primitivas capaces de regenerar todos los productos sangumeos durante la vida de un individuo, compensando su propia regeneracion con la diferenciacion de su progenie. Las HSC vanan su ubicacion durante el desarrollo y circulan durante toda la vida en los mairnferos, moviendose dentro y fuera del torrente sangumeo para ocupar nichos en la medula osea en etapas secuenciales de migracion, injerto y retencion. La migracion es el proceso mediante el cual las celulas madre del donante encuentran el camino hacia la medula osea, el injerto de celulas madre significa su crecimiento en la medula osea.

Las celulas madre hematopoyeticas tienen potencial terapeutico como resultado de su capacidad para restaurar la sangre y las celulas inmunes en receptores trasplantados. Ademas, las HSC tienen el potencial de regenerar celulas para otros tejidos, como cerebro, musculo e hngado. Los metodos de trasplante autologos y alogenicos en seres humanos se usan actualmente como terapias para enfermedades como leucemia, linfomas y otras enfermedades fatales. Se debe aislar una gran cantidad de medula osea del donante en estos procedimientos para asegurar que hay suficientes HSC para el injerto.

Las celulas madre hematopoyeticas necesitan una senal transducida por Gas in vivo para repoblar el nicho en la medula osea (1). Estos hallazgos recientes confirman experimentos anteriores in vitro, que mostraron que la activacion de Gas promueve la supervivencia y la diferenciacion de las celulas madre hematopoyeticas (2,3). Gas es la subunidad a, que se une al nucleotido de guanina, de la protema G heterotrimerica, que estimula las 9 isoformas de la adenilil ciclasa de marnfferos unidas a membrana. La Gas se puede activar in vivo o in vitro mediante el tratamiento con la toxina colerica, porque la toxina colerica ribosila mediante el ADP el resto de arginina catalttico (r186/187/201/202; el numero preciso de argininas depende de la variante de corte y empalme de Gas); se requiere un resto de arginina intacto para la hidrolisis del GTP y la desactivacion de Gas (4). La mejora del injerto se puede observar tambien despues del tratamiento previo de las celulas madre hematopoyeticas con toxina colerica: se encontro aproximadamente el doble de celulas precursoras (Lin-) en la medula osea si el preparado de celulas madre se habfa tratado previamente con toxina colerica (1).

Sin embargo, la toxina colerica podna ser muy inconveniente para la preparacion de celulas madre para pacientes que son trasplantados con medula osea. La toxina colerica (CT), especialmente el grupo pentamerico de su subunidad B no toxica (CTB) es un adyuvante de mucosas que tiene fuertes propiedades inmunomoduladoras tanto in vivo como in vitro y es uno de los inmunogenos de mucosas mas potentes. La toxina colerica y la CTB estimulan una fuerte respuesta intestinal de anticuerpos tipo IgA y memoria inmunologica a largo plazo. Basado en esto, CTB se ha convertido en un componente importante en vacunas orales desarrolladas recientemente contra el colera y la diarrea causadas por la E. coli enterotoxigenica. La fuerte inmunogenicidad de CT y CTB puede explicarse de forma generica por su habilidad para unirse a receptores de superficie de la mucosa intestinal.

Adicionalmente, durante el curso natural de la infeccion, la parte B pentamerica de la molecula de la toxina se une a la superficie de las celulas epiteliales intestinales y se endocita rapidamente junto con la subunidad A. Una vez endocitada, la subunidad A con actividad catalttica se separa de la parte B pentamerica y entra en la celula a traves de un poro que forma la subunidad B. Una vez dentro de la celula, ribosila de forma permanente la subunidad Gas de la protema G heterotrimerica, lo que da como resultado la produccion constitutiva de AMPc. Esto lleva a su vez a la secrecion de H2O, Na+, K+ y HCO3" en la luz del intestino delgado, dando como resultado una deshidratacion rapida y otros factores asociados con el colera. La mayona de las celulas captan la toxina colerica si se inyecta de forma intravenosa (solo celulas como las de la barrera hematoencefalica estan protegidas por barreras espedficas). De esta forma, se aumentara el AMPc en la mayona de las celulas del cuerpo y causara un amplio espectro de efectos secundarios (que van desde la taquicardia a la vasodilatacion, temblores musculares, hiperglucemia, etc.).

Asf, estos efectos hacen que la toxina colerica no sea apta para el uso en humanos con respecto a la estimulacion de las celulas madres hematopoyeticas.

Sin embargo, la relevancia terapeutica de la estimulacion de celulas madre es importante cuando se realizan trasplantes de medula osea heterologos (es decir, celulas madre hematopoyeticas obtenidas de donantes

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inmunocompatibles) y es un procedimiento estandar que se usa para el tratamiento de personas que padecen leucemia, para el tratamiento de personas que presentan defectos geneticos en el compartimento hematopoyetico (p.ej. hemoglobinopatias como la talasemia; defectos en la funcion de los granulocitos neutrofilos, etc.).

Tambien es importante puesto que el trasplante de medula osea autologo es un procedimiento estandar que se usa para aumentar la ventana terapeutica de drogas citotoxicas y asf permitir la quimioterapia de alta intensidad de dosis (5,6).

Las celulas madre hematopoyeticas expresan los cuatro receptores de tipo E para prostaglandinas (EP1-4). El tratamiento previo de celulas madre hematopoyeticas con la prostaglandina E2 (dimetilada) aumenta su injerto (7,8). La senalizacion canonica dependiente de Gas media este efecto, porque la activacion de la protema quinasa A (PKA) inducida por AMPc actua de forma sinergica con las senales dependientes de Wnt para estabilizar a la catenina p (9).

Segun Otsuka et al., la implantacion de celulas mononucleares (MNCs) de medula osea autologa (BM) se podna aumentar por Beraprost sodico en un modelo de conejo. El objetivo del estudio fue el mantenimiento del desarrollo arterial en la isquemia periferica y de miocardio. Sin embargo, las celulas madre hematopoyeticas son un tipo espedfico de celulas dentro de las celulas de medula osea (16).

En Madonna et al. se describe una combinacion de terapia con celulas madre y tratamientos farmacologicos, en donde se prueba la prostaciclina en un modelo de injerto de ADSC en miocardio tras su administracion intracoronaria (17).

En Ishii M. et al. se expone que la liberacion mantenida de prostaciclina aumento la funcion proangiogenica de celulas madre mesenquimales y el crecimiento de celulas musculares en tejido isquemico (18).

WO2006/017169 describe un sensor para implante con un recubrimiento biocompatible para controlar el crecimiento del tejido que puede contener, entre otros, analogos de prostaciclina.

En Crutchley D. et al. (19), se describe el efecto inhibidor del Cicaprost o el Iloprost en la smtesis del factor tisular, el factor de necrosis tumoral y la interleuquina-1p en celulas THP1 humanas.

La localizacion de las celulas madre tras el trasplante es un determinante cntico para el exito del trasplante. Actualmente, se necesita un numero grande de celulas madre para el trasplante porque las celulas madre no se injertan de forma exitosa en la medula osea y hay un periodo largo de aplasia de la medula osea que da como resultado una disminucion de las celulas sangumeas maduras.

Asf pues, aun es una necesidad no alcanzada la provision de metodos y composiciones para estimular las HSC para aumentar la migracion, injerto y retencion en nichos de la medula osea de estas HSC aisladas en sujetos que reciben trasplantes de medula osea.

El problema se soluciona con las realizaciones de la presente invencion.

Descripcion de la invencion

Se ha demostrado de forma sorprendente que los analogos sinteticos de prostaciclina I2 (PG12) como por ejemplo el Treprostinil, Iloprost, Beraprost y Cicaprost son capaces de aumentar los niveles de AMPc en celulas madre hematopoyeticas lo que da como resultado el aumento de injerto de celulas madre en medula osea.

Un analogo de prostaciclina como el Treprostinil ofreces varias ventajas frente a la prostaglandina E2:

(i) Es un analogo estable de prostaciclina/PGl2, que estimula tambien los receptores EP2 y EP4 (10). Por ello, tiene el potencial de estimular multiples receptores acoplados a Gs mientras que no activa receptores EP3 inhibidores (es decir, acoplados a Gi), que inhiben la acumulacion de AMPc. La dimetil-PGE2 es un agonista completo para este ultimo (1). En cambio, el Treprostinil solo es un agonista de baja afinidad para los receptores EP3.

(ii) Dado que son mas estables metabolicamente que las prostaciclinas naturales, Treprostinil, Iloprost, Beraprost y Cicaprost pueden provocar efectos mas duraderos si se aplican in vivo y por ello promueven injertos de medula osea mas eficientes.

(iii) Se tolera bien la administracion prolongada o repetida de un analogo de prostaciclina, espedficamente de Treprostinil, Iloprost, Beraprost y Cicaprost.

La presente invencion proporciona un metodo nuevo para aumentar el injerto de celulas madre hematopoyeticas mediante un tratamiento previo ex vivo que comprende las etapas de

a. anadir al menos un analogo de prostaciclina junto con un agente inespedfico, activante de AMPc, seleccionado preferiblemente entre toxina colerica y forskolina, a una muestra que contiene celulas madre hematopoyeticas,

b. obtener una mezcla por incubacion de dicha mezcla durante un periodo de tiempo suficiente para estimular la senalizacion a traves de Gas en dichas celulas y, de forma opcional

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c. aislar y opcionalmente purificar dichas celulas estimuladas.

Segun una realizacion de la invencion, el analogo de prostaciclina se selecciona del grupo del Treprostinil, Iloprost, Beraprost y Cicaprost o de sales de las mismas, farmaceuticamente aceptables.

Segun el metodo de la invencion, tambien se puede proporcionar una mezcla de celulas madres estimuladas o no estimuladas.

La muestra es medula osea espedficamente. Las celulas madre pueden provenir de forma general de cualquier fuente conocida, espedficamente, pueden ser HSC aisladas de sangre periferica, de sangre de cordon umbilical o de medula osea.

Segun la invencion, Treprostinil puede ser un derivado seleccionado del grupo de derivados acidos, profarmacos, polimorfos o isomeros.

De forma similar, Iloprost, Cicaprost o Beraprost pueden ser derivados del grupo de derivados acidos, profarmacos, polimorfos o isomeros, de ahora en adelante.

Segun la realizacion de la invencion, a la muestra se le anade al menos un analogo de prostaciclina junto con un agente inespedfico, activante de AMPc, seleccionado preferiblemente entre toxina colerica y forskolina.

Segun una realizacion espedfica de la invencion, se proporciona una composicion que comprende un analogo de prostaciclina junto con un agente activante de AMPc inespedfico, seleccionado preferiblemente entre toxina colerica y forskolina, para uso en el tratamiento de individuos que padecen enfermedades de la medula osea que pueden recibir un trasplante de celulas madre hematopoyeticas.

Segun una realizacion espedfica de la invencion, el analogo de prostaciclina de la composicion se selecciona del grupo del Treprostinil, Iloprost, Cicaprost o Beraprost o de sales de las mismas farmaceuticamente aceptables.

Segun una realizacion preferida, la composicion comprende Treprostinil.

Los individuos padecen, espedficamente, leucemia, un defecto del compartimento de celulas sangumeas, trasplante de medula osea despues de quimioterapia o de radioterapia.

Segun una realizacion adicional de la invencion, el defecto del compartimento de celulas sangumeas es una hemoglobinopatfa o un defecto en la funcion de granulocitos neutrofilos. La composicion de la invencion se puede usar tambien para el tratamiento de individuos que padecen una enfermedad de la medula osea que reciben un trasplante de celulas madre hematopoyeticas, mediante la administracion de un analogo de prostaciclina durante siete dfas, al menos, despues del trasplante de medula osea. Se usa espedficamente un analogo de prostaciclina seleccionado entre el grupo del Treprostinil, Iloprost, Cicaprost y Beraprost, mas espedficamente, Treprostinil.

Segun una realizacion adicional, se proporciona una composicion que comprende un analogo de prostaciclina junto con un agente activante de AMPc inespedfico, seleccionado preferiblemente entre toxina colerica y forskolina y celulas madre hematopoyeticas estimuladas.

Segun una realizacion adicional, se proporciona una composicion que comprende Treprostinil o una sal del mismo farmaceuticamente aceptable junto con un agente inespedfico, activante de AMPc, seleccionado preferiblemente entre toxina colerica y forskolina y celulas madre hematopoyeticas estimuladas.

Las composiciones de la invencion comprenden ademas forskolina o toxina colerica espedficamente para uso en animales o estudios con animales.

Las composiciones de la invencion pueden ser composiciones farmaceuticas.

La composicion de la invencion se puede administrar por todas las vfas conocidas en la tecnica, espedficamente, esta preparada para administracion intravenosa o subcutanea.

El analogo de prostaciclina se puede proporcionar en una formula oralmente disponible seleccionada del grupo de formulas, comprimidos o capsulas de liberacion prolongada.

La cantidad de analogos de prostaciclina depende de la aplicacion terapeutica o del metodo para preparar las HSC estimuladas. Muy espedficamente, para aplicaciones terapeuticas, la cantidad efectiva de Treprostinil es de al menos 1,0 ng/kg de peso corporal.

Figuras:

Figura 1: caracterizacion de la poblacion celular Lin+ retenida por las esferas magneticas. El eje x (etiquetado como APC-C7-A) indica la fluorescencia registrada para la combinacion de anticuerpos dirigidos contra los marcadores de linaje: Cd3e para celulas T, CD45R (B220) para celulas B, CD11b y Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) para el linaje mieloide

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(monocitos/granulocitos), Ter-119 para el linaje eritroide. El eje y indica la fluorescencia registrada para el anticuerpo frente al receptor para factor para celula madre murido c-Kit. Es evidente que el cuadrante superior izquierdo (que indica c-Kit+ y celulas negativas para marcadores de linaje) no contiene celulas.

Figura 2: caracterizacion de la poblacion celular Lin- que no se une a las esferas magneticas. Como en la figura 1, el eje x (etiquetado APC-C7-A) denota la fluorescencia registrada mediante la mezcla de anticuerpos directamente en contra de marcadores linaje.: CD3e para celulas T, CD45R(=B220) para celulas B, CD11b y Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) para el linaje mieloide (monodtico/granulodtico, Ter-119 para el linaje eritroide. El eje y indica la fluorescencia registrada para el anticuerpo frente al receptor para factor para celula madre murido c-Kit. Es evidente que el cuadrante inferior (que indica c-Kit+ y celulas positivas para marcadores de linaje) no contiene celulas y que las celulas se encuentran de forma predominante en el cuadrante izquierdo superior, donde se esperan las celulas positivas para c-Kit y negativas para los marcadores de linaje.

La figura 3 muestra la caracterizacion de las poblaciones celulares Lin+ (Figura 3A) y Lin' (Figura 3B) para la presencia de Sca-1 y c-Kit. Los paneles 3A y 3B muestran las celulas retenidas por las esferas magneticas (caracterizadas en la figura 1) y que aparecieron en la citometna de flujo (caracterizadas en la figura 2). Se marcaron como se describe en la seccion de metodos y se analizaron para la presencia de c-Kit (PerCP-Cy5-5-A, eje y) y de Sca-1 (PE-Cy7-A, eje x) simultaneamente. Es evidente que las celulas de linaje positivo analizadas en el panel A se localizan en el cuadrante inferior izquierdo; es decir, que estan desprovistas de c-Kit y Sca-1. En cambio, las celulas del panel B estan predominantemente en los cuadrantes superiores, es decir, que o bien tienen niveles altos de c-Kit (cuadrante superior izquierdo) o bien de ambos, c-Kit y Sca-1 (cuadrante superior derecho), como se espera para las poblaciones de celulas madre hematopoyeticas y de progenitores no comprometidos.

Figura 4: Acumulacion de AMP dclico en celulas madre hematopoyeticas (Lin-, c-Kit+, Sca-1+) tras la estimulacion con forskolina, Treprostinil, Iloprost, Beraprost o la combinacion de forskolina y prostanoides. Se incubaron celulas Lin- (7x105 por ensayo) en presencia de adenina[3H] para el marcaje metabolico previo de la reserva de nucleotidos de adenina como se describe en Metodos. Se incubaron las celulas en ausencia (columna izquierda, designada como 0) o presencia de los compuestos indicados. Se purifico el AMPc[3H] acumulado por cromatograffa secuencial en columnas de Dowex AG50-X8 y de alumina y se cuantifico mediante recuento por centelleo lfquido. Los datos representan las medias ± desviacion tfpica (SD; n=4).

Figura 5: Curva de concentracion-respuesta para la acumulacion de AMPc producida por el Treprostinil en celulas madre hematopoyeticas (Lin-, c-Kit+, Sca-1+). Las condiciones del ensayo fueron las descritas para la figura 4. Los datos representan las medias ± SD (n=2).

Figura 6: El tratamiento de celulas madre hematopoyeticas con Treprostinil ex vivo da lugar a un aumento del injerto de medula osea en ratones irradiados de forma letal. Se prepararon las celulas madre hematopoyeticas como en la figura 3 y se trataron previamente con los compuestos indicados (FSK, forskolina), como se describe en Metodos. El recuento de globulos blancos se determino mediante FACS. Se indica el numero de animales analizado.

Figura 7: Proporcion de celulas sangumeas positivas para Ly5.2 y Ly5.1, 16 semanas despues del trasplante de medula osea. Las celulas Ly5.1 se trataron previamente con CTX o Treprostinil y forskolina.

Figura 8: Proporcion de celulas sangumeas positivas para Ly5.2 y Ly5.1, 16 semanas despues del trasplante de medula osea. Las celulas Ly5.2 se trataron previamente con CTX o Treprostinil y forskolina.

Descripcion detallada de la invencion

Proporcionar metodos y medios para aumentar la migracion y el injerto de HSC al entorno de la medula osea tiene importantes implicaciones biologicas y medicas. La localizacion de las celulas madre tras el trasplante es muy importante para procedimientos clmicos que conllevan la necesidad de grandes cantidades de celulas de donante. Estos metodos tambien son muy utiles porque un numero significativo de trasplantes de donantes autologos contienen numeros insuficientes de celulas madre, o HSC. De esta forma, los pacientes son incapaces de encontrar donantes histocompatibles de forma frecuente, lo que enfatiza la necesidad de metodos y composiciones para reducir el numero de HSC necesarias para el exito del trasplante. La habilidad para mejorar la migracion y el injerto de HSC in vitro o ex vivo permite el aislamiento de pocas celulas de los donantes, por lo que se reduce el tiempo y el malestar asociado a la recogida de medula osea o celulas madre perifericas, y se aumenta el numero de donantes voluntarios de HSC.

La presente invencion proporciona por tanto un metodo nuevo para aumentar el injerto de HSC mediante un tratamiento previo de las hSc ex-vivo que comprende las etapas de a) anadir al menos un analogo de prostaciclina junto con un agente activante de AMPc inespedfico, seleccionado preferiblemente entre toxina colerica y forskolina, a una muestra que contiene celulas madre hematopoyeticas para generar una mezcla, b) incubar dicha mezcla durante un periodo de tiempo suficiente para estimular la senalizacion de Gas en dichas celulas y c) opcionalmente aislar dichas celulas asf estimuladas o usar dicha mezcla que contiene dichas celulas estimuladas para usos posteriores, por ejemplo, para tratamientos o trasplantes.

El analogo de prostaciclina se selecciona espedficamente del grupo del Treprostinil, Iloprost, Beraprost y Cicaprost o sales de los mismos farmaceuticamente aceptables.

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Treprostinil es un analogo sintetico de prostaciclina. El Treprostinil se comercializa como Remodulin™. El Treprostinil es una sal monosodica del acido (1R,2R,3aS,9aSH[2,3,3a,4,9,9a-hexahidro-2-hidroxi-1-[(3S)-3-hidroxioctil]-1H- benzo[f]inden-5-il]oxi]acetico.

Iloprost se comercializa como “Nomedina” y es un acido 5-{(E)-(1S,5S,6R,7R)-7-hidroxi-6[(E)-(3S,4RS)-3-hidroxi-4- metil-1-octen-6-inil]-bi-ciclo[3.3.0]octan-3-iliden}pentanoico.

Beraprost es un acido 2,3,3a,8Metrahidro-2-hidroxi-1-(3-hidroxi-4-metil-1-octen-6-inil)-1H-ciclopenta(b)benzofuran-5- butanoico.

Cicaprost es un acido 2-[(2E)-2-[(3aS,4S,5R,6aS)-5-hidroxi-4-[(3S,4S)-3-hidroxi-4-metilnona-1,6-dinil]-3,3a,4,5,6,6a- hexahidro-1H-pentalen-2-iliden]etoxi]acetico.

Segun una realizacion de la invencion, se pueden usar al menos dos, espedficamente al menos tres, analogos de prostaciclina distintos para dichos metodos. Alternativamente, se pueden usar dos, tres, cuatro, cinco o seis o incluso mas analogos de prostaciclina diferentes para dicho metodo.

Este metodo proporciona de forma ventajosa celulas madre estimuladas que se pueden administrar directamente a individuos y que no muestran ningun efecto secundario indeseado debido a grandes cantidades de agentes activantes del AMPc no selectivos.

Segun una realizacion adicional de la invencion, se proporciona un metodo para aumentar el injerto de celulas madre hematopoyeticas mediante un tratamiento previo ex vivo, que comprende las siguientes etapas:

a. anadir al menos un analogo de prostaciclina junto con un agente inespedfico, activante de AMPc, seleccionado preferiblemente entre toxina colerica y forskolina, a una muestra que contiene celulas madre hematopoyeticas para obtener una mezcla

b. incubar dicha mezcla durante un periodo de tiempo suficiente para estimular la senalizacion de Gas en dichas celulas y, opcionalmente,

c. aislar dichas celulas estimuladas y, opcionalmente,

d. purificar y/o concentrar dichas celulas estimuladas.

Segun una realizacion espedfica de la invencion, la razon de analogo de prostaciclina y forskolina debe ser aproximadamente 1:3. Las HSC tratadas con forskolina y analogos de prostaciclina se pueden purificar antes de ser reimplantadas, sin embargo, estas HSC tambien se pueden reimplantar sin etapas de purificacion adicionales, dado que cantidades pequenas de forskolina pueden estar presentes, pero no pueden causar ningun efecto secundario negativo.

Alternativamente, se puede anadir a las celulas madre una combinacion de Treprostinil con Iloprost, o Beraprost o bien Cicaprost. Alternativamente, se puede anadir Treprostinil en combinacion con mas de un analogo de prostaciclina, por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco de otros analogos de prostaciclina; por ejemplo, pero no limitado a, Iloprost, Beraprost o Cicaprost o sales de los mismos fisiologicamente aceptables.

Segun una realizacion para el uso en estudios con animales o el tratamiento de animales, un activante de AMPc como la forskolina y/o la toxina colerica se anade adicionalmente a las HSC o a la mezcla de HSC con Treprostinil, Iloprost, Cicaprost o Beraprost antes de la incubacion.

El periodo de tiempo que se necesita para estimular la senalizacion a traves de Gas en dichas celulas se puede medir segun metodos conocidos, por ejemplo, mediante el uso de medidas de AMPc, de las que hay numerosas variantes: RIA, transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia (FRET) con EPAC (epacl) (Ponsiouen B. et al., EMBO reports, 5, 12, 1176-1180 (2004)), metodos radioqmmicos, etc. Se pueden seleccionar o discriminar las celulas estimuladas en donde se da la senalizacion a traves de Gas de las celulas no estimuladas mediante metodos conocidos en la tecnica como una sonda para AMPc basada en FRET.

Segun una realizacion de la invencion el tiempo de incubacion es de aproximadamente 1 a 60 min, preferiblemente de aproximadamente 2 a 30 minutos.

La via de senalizacion dependiente de AMPc es una via esencial para promover el injerto de celulas madre hematopoyeticas. Los inventores han demostrado que un analogo de prostaciclina puede estimular el aumento del AMPc en celulas madre hematopoyeticas. Esto se realiza a traves de la activacion de multiples receptores, por ejemplo, receptores para prostanoides tipo I (IP) y E (EP), lo que da lugar a un aumento de la senalizacion a traves de Gas. Por consiguiente, los analogos de prostaciclina como el Treprostinil, Iloprost, Cicaprost o Beraprost son mas efectivos para el aumento de los niveles de AMPc.

Segun una realizacion muy espedfica, Treprostinil es un analogo de prostaciclina preferido usado segun el metodo de la presente invencion.

Alternativamente, en ciertos metodos y composiciones de la invencion, se puede anadir tambien al menos un agente seleccionado entre un potenciador del AMP dclico (AMPc) o un ligando de un receptor EP para prostaglandina. Ejemplos de potenciadores del AMPc incluyen, pero no se limitan a, dibutiril AMPc (DBAMPc), esteres de forbol, forskolina, esclarelina, 8-bromo-AMPc, toxina colerica (CT), aminofilina, 2,4-dinitrofenol (DNP), norepinefrina, 5 epinefrina, isoproterenol, isobutilmetil-xantina (IBMX), cafema, teofilina (dimetilxantina), dopamina, rolipram, protaglandina E1, prostaglandina E2, polipeptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria (PACAP) y peptido vasoactivo intestinal (VIP), entre otros conocidos por la tecnica, se pueden anadir a las celulas madre o a la mezcla de celulas madre con Treprostinil, Iloprost, Cicaprost y/o Beraprost antes de la incubacion. Algunos ejemplos de potenciadores del AMPc tambien incluyen AMPc y analogos del AMPc, como los sp-5,6-dicloro-BlMPS dclico 10 (BIMPS), entre otros.

Segun la invencion, la forskolina y/o la toxina colerica o la subunidad A de la toxina colerica se anade adicionalmente a las celulas madre o a la mezcla de celulas madre/Treprostinil antes de la incubacion.

Segun una realizacion espedfica, dichos potenciadores del AMPc se usan para realizar el tratamiento de celulas madre de celulas animales o para realizar estudios con animales que tienen en cuenta el injerto de celulas madre.

15 Con respecto a los analogos de prostaciclina, segun la presente invencion, el termino “analogos de prostaciclina” incluye tambien derivados y analogos de dichas sustancias.

Los terminos “analogo” o “derivado” se refieren a un compuesto qrnmico que es similar a otra sustancia qrnmica en estructura y funcion, que difiere estructuralmente por un solo elemento o grupo frecuentemente, que se puede diferenciar por la modificacion de mas de un grupo (p.ej., 2, 3 o 4 grupos) si conserva la misma funcion que el 20 compuesto original. Estas modificaciones son rutinarias para los expertos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, grupos qmmicos adicionales o sustituidos, como esteres o amidas de un acido, grupos protectores como los grupos bencilo para un alcohol o tiol, y grupos terc-butoxicarbonilo para una amina. Tambien se incluyen las modificaciones de las cadenas laterales alqmlicas, como las sustituciones con grupos alquilo (p.ej., metilo, dimetilo, etilo, etc.), modificaciones en el nivel de saturacion o insaturacion de cadenas laterales, y la adicion de grupos modificados como 25 fenilo y fenoxi sustituidos. Los derivados tambien pueden incluir conjugados, como restos biotina o avidina, enzimas como la peroxidasa del rabano y similares, y restos radiomarcados, bioluminiscentes, quimioluminiscentes o fluorescentes. Ademas, los restos se pueden anadir a los agentes descritos en la presente memoria para modificar sus propiedades farmacocineticas, tal como para aumentar su vida media in vivo o ex vivo, o para aumentar sus propiedades para penetrar en las celulas, entre otras propiedades deseables. Tambien se incluyen los profarmacos, 30 de los que se sabe que aumentan numerosas cualidades deseables de los farmacos (p-ej., solubilidad, biodisponibilidad, fabricacion, etc.).

El termino “derivado” tambien incluye dentro de su alcance modificaciones que se han hecho a una secuencia original que incluye adiciones, deleciones, y/o sustituciones que proporcionan moleculas funcionalmente equivalentes o mejoradas.

35 Segun una realizacion espedfica de la invencion, el derivado del Treprostinil se selecciona del grupo de derivados acidos del Treprostinil, profarmacos del Treprostinil, polimorfos del Treprostinil o isomeros del Treprostinil.

De forma similar, el Iloprost, Cicaprost o Beraprost pueden ser derivados del grupo de derivados acidos, profarmacos, polimorfos o isomeros de los mismos.

El termino “celulas madres hematopoyeticas” (HSC) y el termino mas general “celulas madre” se entienden como 40 terminos equivalentes en la descripcion de la presente invencion, y se refieren de forma general a “celulas madre”, bien pluripotentes, bien multipotentes que dan lugar a las estirpes de celulas sangumeas, incluyendo las mieloides (p.ej., monocitos y macrofagos, neutrofilos, basofilos, eosinofilos, eritrocitos, megacariocitos/plaquetas, celulas dendnticas), y linajes linfoides (p.ej., celulas T, celulas B, celulas NK), y otras conocidas por la tecnica. Las “celulas madre” se caracterizan habitualmente por su habilidad para dar lugar a multiples tipos celulares (es decir, por ser 45 multipotentes) y por su capacidad para autoregenerarse. Sin embargo, los progenitores oligopotentes y unipotentes se pueden incluir tambien. “Hematopoyesis” se refiere en general al proceso de diferenciacion celular o formacion de celulas sangumeas especializadas a partir de HSC. Durante el desarrollo, la hematopoyesis se traslada del dgado fetal a la medula osea, que se mantiene como centro hematopoyetico durante la edad adulta. Una vez establecidas en la medula osea, las HSC no se distribuyen al azar dentro de la cavidad osea. Mas bien, las HSC se encuentran de 50 forma caractenstica en estrecha cercama de la superficie endoosea. Las celulas madre mas maduras aumentan en

numero conforme aumenta la distancia a la superficie del hueso.

Los tejidos hematopoyeticos contienen celulas con capacidades de regeneracion a largo plazo y a corto plazo, asf como progenitores comprometidos multipotentes, oligopotentes y unipotentes.

La muestra que contiene HSC puede ser espedficamente medula osea.

55 Las HSC se pueden obtener por tecnicas conocidas de cualquier fuente conocida que contenga HSC, espedficamente de sangre periferica, cordon umbilical o sangre de cordon, placenta y medula osea. De forma alternativa, tambien son

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posibles el Idgado fetal, el bazo fetal, y la aorta-gonada-mesonefro de animales como fuente de HSC. Se prefieren las HSC de origen humano para los metodos y composiciones de la invencion.

Por ejemplo, las HSC se pueden encontrar en la medula osea de adultos, lo que incluye femur, cadera, costillas, esternon y otros huesos. Las HSC se pueden obtener extrayendolas directamente de la cadera mediante el uso de una aguja y una jeringa, o de la sangre, frecuentemente tras el tratamiento previo con citoquinas, como el G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos), que inducen la liberacion de las celulas del compartimento de la medula osea.

Las HSC se pueden identificar segun ciertos marcadores fenotipicos o genotipicos. Por ejemplo, las HSC se pueden identificar por su pequeno tamano, su falta de marcadores de linaje (lin), el bajo grado de tincion (subpoblacion) con sondas vitales como la rodamina 123 (rho10) o el Hoechst 33342, y por la presencia de varios marcadores antigenicos en su superficie, muchos de los cuales pertenecen a las series de grupos de diferenciacion (p.ej., CD5, CD11b, CD34, CD38, CD90, CD133, CD105, CD45, GR-1 (=Ly-6G/C), 7-4, Ter-119 y c-kit). Las HSC son fundamentalmente negativas para los marcadores que se usan habitualmente para detectar la determinacion del linaje, y, por ello, se refieren habitualmente como celulas (lin-). La mayona de HSC humanas se pueden caracterizar como CD5+, CD45R (B220)+, CD11+, GR-1+, CD34+, CD59+, ThyI/CD90+, CD38lo/~,c-kit/CD117+y lin (-). Sin embargo, no todas las celulas madre se incluyen en esas combinaciones, dado que ciertas HSC son CD347+ y CD38+. Algunos estudios tambien sugieren que las celulas madre mas tempranas pueden carecer de c-kit en su superficie.

Para la purificacion de HSC que sean lin(-) mediante citometna de flujo, o FACS, se puede usar para la deplecion las celulas lin(+) o progenitores multipotentes tardfos (MPP) el panel de anticuerpos de marcadores de linajes sangumeos maduros, que incluye, por ejemplo, anticuerpos para CD3epsilon, CD5, CD45R, CD11b, CD16, GR-1, 7-4, y Ter-119, CD13, CD32 y CD33, CD71, CD19, CD61, Mac-1 (CDIIb/CD18), Gr-1, 117Ra, CD3, CD4, CD5 y CD8, entre otros, conocidos por la tecnica. Se conocen por la tecnica metodos de purificacion adicionales, por ejemplo, metodos que usan la caracterizacion espedfica mediante la familia de “moleculas de senalizacion de activacion linfocitaria” (SLAM) de superficie celular.

Se pueden hacer crecer o expandir las HSC, ya sean de sangre de cordon, medula osea, sangre periferica o de otra fuente, en cualquier medio adecuado, disponible de forma comercial o hecho a medida, con o sin suero. Las HSC de origen humano son realizaciones preferidas de la invencion. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el medio sin suero puede usar albumina y/o transferrina. Ademas, se pueden incluir citoquinas, como el ligando de Flt-3, el factor de celulas madre (FSC) y la trombopoyetina (TPO), entre otras. Tambien se pueden crecer las HSC en recipientes como biorreactores. Un medio adecuado para la expansion de las HSC ex vivo tambien puede comprender celulas nodrizas para HSC, como las celulas estromales (p.ej., celulas estromales linforeticulares), que se pueden derivar, por ejemplo, de la disgregacion del tejido linfoide, y para las que se ha demostrado que apoyan el mantenimiento in vitro, ex vivo e in vivo, el crecimiento y la diferenciacion de las HSC, asf como su progenie.

“Sangre de cordon” o “sangre de cordon umbilical” se refiere en general a una cantidad relativamente pequena de sangre (hasta aproximadamente 180 ml) de un bebe recien nacido que vuelve a la circulacion neonatal. La sangre de cordon es rica en HSC y se puede extraer y almacenar para uso posterior segun metodos conocidos por la tecnica.

Los terminos “ex vivo" o “in vitro" se refieren a actividades que tienen lugar fuera de un organismo, como la experimentacion o las medidas realizadas en o sobre tejido vivo en un entorno artificial externo al organismo, preferiblemente con una alteracion minima de las condiciones naturales. En ciertas realizaciones, dichos tejidos o celulas se pueden recoger y congelar, y despues descongelar para su tratamiento ex vivo. Los experimentos con cultivos de tejido o procedimientos que duran mas de unos pocos dfas con uso de celulas o tejido vivos se consideran habitualmente como “in vitro", aunque este termino se puede usar de forma intercambiable con ex vivo. Las tecnicas “administracion ex vivo", “tratamiento ex vivo" o “uso terapeutico ex vivo", se refieren de forma general a procedimientos medicos en los que se obtienen uno o mas organos, celulas o tejidos de un sujeto vivo o recientemente fallecido, purificados o enriquecidos de forma opcional, que se exponen a tratamientos o procedimientos para tratar las celulas madre (p.ej., una etapa de administracion ex vivo que implica la incubacion de las celulas con una composicion de la presente invencion para aumentar las capacidades para el injerto de las HSC), y que se administran entonces al mismo o a otro sujeto vivo despues del tratamiento o procedimiento opcional.

Estas aplicaciones terapeuticas ex vivo pueden incluir tambien un tratamiento in vivo opcional o etapa de procedimiento, como la administracion de una composicion de la invencion, una o mas veces, al sujeto vivo tras la administracion del organo, celulas o tejido. Se contemplan tanto la administracion local como la sistemica para estas realizaciones, segun metodos bien conocidos por la tecnica. La cantidad de Treprostinil o la cantidad de preparado que contiene Treprostinil y celulas madre estimuladas, junto con agentes adicionales, de forma opcional, administradas a un sujeto dependen de las caractensticas de ese sujeto, como son la salud general, la edad, el sexo, el peso corporal, y la tolerancia a las drogas, asf como el grado, severidad y tipo de reaccion al Treprostinil y/o al trasplante de celulas.

Segun una realizacion espedfica de la invencion, se proporciona una composicion que comprende un analogo de prostaciclina junto con un agente activante de AMPc inespedfico, seleccionado preferiblemente entre toxina colerica y forskolina, para uso en el tratamiento de individuos que son trasplantados con celulas madre hematopoyeticas.

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Segun una realizacion preferida, la composicion comprende un analogo de prostaciclina seleccionado del grupo del Treprostinil, Iloprost, Cicaprost o Beraprost o sales de los mismos farmaceuticamente aceptables, mas espedficamente, comprende Treprostinil. La composicion de la invencion puede comprender tambien Treprostinil junto con uno o mas del grupo de Iloprost, Cicaprost, o Beraprost. Alternativamente, la composicion puede comprender Iloprost en combinacion con uno o mas del grupo del Treprostinil, Cicaprost, Beraprost o sales de los mismos farmaceuticamente aceptables. Alternativamente, la composicion puede comprender Beraprost en combinacion con uno o mas del grupo del Treprostinil, Cicaprost o Iloprost o sales de los mismos farmaceuticamente aceptables. Alternativamente, la composicion puede comprender Cicaprost en combinacion con uno o mas del grupo del Treprostinil, Beraprost o Iloprost o sales de los mismos farmaceuticamente aceptables.

Dichos sujetos pueden padecer cualquier enfermedad de la medula osea, es decir, una enfermedad en donde se desplaza la arquitectura normal de la medula osea por neoplasias, anemia aplasica, o infecciones que conllevan una disminucion en la produccion normal de celulas sangumeas y plaquetas en sangre. Dicha enfermedad de la medula osea puede ser, por ejemplo, leucemia, un defecto en el compartimento de celulas sangumeas o la necesidad de trasplante de medula osea despues de un tratamiento con quimioterapia o con radioterapia.

Mas espedficamente, el defecto en el compartimento de celulas sangumeas puede ser una hemoglobinopatfa de tipo talasemia o defectos en la funcion de granulocitos neutrofilos o un defecto en la funcion de granulocitos neutrofilos.

Se incluye tambien en la presente invencion el uso para el tratamiento de individuos que padecen enfermedades de la medula osea, por ejemplo, debidos a quimioterapia o radioterapia y por ello reciben un trasplante de celulas madre hematopoyeticas mediante la administracion de al menos un analogo de prostaciclina por un periodo de tiempo limitado tras el trasplante de medula osea.

Se incluye asimismo en la presente invencion el tratamiento de individuos que reciben un trasplante de medula osea usando al menos un analogo de prostaciclina, al menos un analogo de prostaciclina junto con uno o mas, espedficamente dos, mas espedficamente tres potenciadores del AMPc o una mezcla que comprende al menos uno, espedficamente dos, mas espedficamente tres analogos de prostaciclina y celulas madre estimuladas, opcionalmente junto con agentes adicionales como uno o mas potenciadores del AMPc.

Mas espedficamente, el potenciador del AMPc puede ser forskolina.

Se puede usar al menos un analogo de prostaciclina para aumentar el injerto de HSC humanas durante los trasplantes de medula osea o tras la reconstitucion de la medula osea mediante el uso de HSC. El injerto acelerado disminuye el periodo en el que los sujetos son susceptibles a infecciones potencialmente letales, sangrado y otras complicaciones de gravedad. Asf, un analogo de prostaciclina debena ser una opcion terapeutica util para el tratamiento previo de la medula osea del donante para aumentar el injerto de la medula osea (es decir, mediante la reduccion del numero de celulas requeridas y la disminucion de la duracion de la aplasia de la medula osea).

Espedficamente, el analogo de prostaciclina se selecciona del grupo de Treprostinil, Iloprost, Cicaprost o Beraprost o de sales de los mismos farmaceuticamente aceptables. Mas espedficamente, Treprostinil es el analogo de prostaciclina preferido para uso.

El tratamiento continuo de sujetos durante varios dfas tras el trasplante de medula osea con un analogo de prostaciclina debena dar lugar a una mejona clfnica por la mejora del trasplante (es decir, por la reduccion del numero de celulas requeridas y la disminucion de la duracion de la aplasia de la medula osea).

Asf, segun una realizacion espedfica, el tratamiento se realiza al menos cinco dfas despues del trasplante, mas espedficamente durante 10 dfas al menos, mas espedficamente, durante 14 dfas al menos tras el trasplante.

Segun una realizacion alternativa de la invencion, se incluye una composicion que comprende uno o mas analogos de prostaciclina junto con un agente activante de AMPc inespedfico, seleccionado preferiblemente entre toxina colerica y forskolina, y celulas madre hematopoyeticas.

En ciertas realizaciones, de forma alternativa, se puede anadir a la composicion un agente seleccionado entre un potenciador del dclico AMP (AMPc) o un ligando del receptor EP para la prostaglandina. Segun una realizacion espedfica, la composicion de la invencion puede comprender tambien forskolina.

Las composiciones de la invencion son, espedficamente, composiciones farmaceuticas. Dichas composiciones pueden contener excipientes adicionales farmaceuticamente aceptables, tal como se conocen por la tecnica.

La cantidad de analogo de prostaciclina depende de la terapia o metodo para la preparacion de las HSC estimuladas. Muy espedficamente, la cantidad efectiva de Treprostinil para aplicaciones terapeuticas es de al menos 1,0 ng/kg de peso corporal.

La composicion de la invencion se puede administrar al sujeto mediante cualquier metodo aplicable y conocido por la tecnica. Mas espedficamente, se proporciona la administracion intravenosa o subcutanea.

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Dicha composicion puede ser una formula oral disponible seleccionada del grupo de formulas, comprimidos o capsulas de liberacion prolongada.

La descripcion anterior se comprendera mas perfectamente en referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son, sin embargo, meramente representativos de metodos para la practica de una o mas realizaciones de la presente invencion y no deben ser entendidos como limitantes para el alcance de la invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1

Materiales y metodos

Aislamiento de celulas madre de medula osea

Se sacrificaron diez ratones (C57BL/6) mediante dislocacion cervical. Los huesos largos de las extremidades inferiores (es decir, femur y tibia) se limpiaron de musculo y tejido conjuntivo y se lavaron mediante una jeringa y una aguja de calibre 271^ con medio RPMI. El tejido conjuntivo visible se retiro de la suspension celular, esta se recogio y se transfirio a un tubo de centnfuga. Las celulas se recogieron mediante centrifugacion (1.200 rpm/~100g durante 5 minutos) y se resuspendieron en 3 mL de solucion de lisis de eritrocitos (0,15 M NH4Cl, l0 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH ajustado entre 7,2 y 7,4). La suspension celular se incubo durante 2 minutos a 20°C, seguido de 4 minutos en hielo. Despues se anadieron 10 mL de RPMI y las celulas se recogieron por centrifugacion y se contaron. El rendimiento tfpico fue de 3x107 celulas por raton.

Las celulas se resuspendieron en PBS (tampon fosfato salino) enfriado en hielo que contema un 2% de FCS (suero fetal bovino), a una densidad de 2,5x108 celulas por mL, a las que se anadio un coctel de anticuerpos biotinilados (kit para deplecion de linaje celular de Miltenyi Biotec) que contema anticuerpos espedficos de linaje dirigidos contra CD5, CD45R (B220), CD11b, GR-1 (=Ly-6G/C), 7-4 y Ter-119 en una proporcion de 0,1 mL de solucion de anticuerpo por cada 108 celulas. Las celulas se incubaron durante 20 minutos en hielo con los anticuerpos y se precipitaron mediante centrifugacion. Tras la resuspension (3,3x108 celulas por mL), se anadieron las microesferas recubiertas de anticuerpo secundario anti-biotina (0,2 mL por 108 celulas), suministrado con el (kit para deplecion de linaje celular de Miltenyi Biotec), a la suspension celular y la mezcla se incubo durante 15 minutos en hielo. Despues, la muestra se diluyo en tampon MACS (30 mL), las celulas se recogieron mediante centrifugacion y se resuspendieron en 6 mL de tampon MACS. Esta suspension se cargo en columnas LS preparadas previamente, que contienen esferas ferromagneticas recubiertas con un material plastico compatible con las celulas. Se usaron tres columnas para este paso, de forma habitual (2 mL de suspension celular por columna). La solucion eluida contema las celulas negativas para el marcador de linaje (celulas Lin-), mientras que las celulas de linaje comprometido se retuvieron en la columna. Las celulas se precipitaron mediante centrifugacion y se resuspendieron en mL de PBS.

El rendimiento tfpico fue de fue de 7x1 05 celulas Lin' por raton.

Analisis de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS)

Los anticuerpos empleados para tenir los marcadores de superficie celular proveman de las siguientes fuentes: el panel de anticuerpos para linaje de raton era de Becton Dickinson Biosciences (BD 559971, que contema, como conjugados con biotina, anti-CD3e, anti-CD11b, anti-CD45R, anti-Ly-6G/Ly-6c, anti-Ter-119), el anticuerpo de rata purificado por afinidad anti-raton CD16/CD32 (bloqueante para Foyii/im, BD553142) y el colorante fluorescente aloficocianina-Cy7-estreptavidina (estreptavidina ApC-Cy7, BD 554063) eran tambien de Becton Dickinson Biosciences. El anti-raton Ly6A/E marcado con ficoeritrina(PE)-Cy7 (antfgeno de celula madre -1=Sca1) PE-Cy7 (numero de catalogo 25-5981-82) y anti-raton Pe-Cy5 CD117 (c-Kit) (numero de catalogo 15-1171-811) eran de eBiosciences.

Despues de la separacion MACS, se transfirieron directamente 1x106 celulas positivas (Lin+) y negativas (Lin-) para el linaje a tubos de FACS y se mantuvieron en 50 pl de PBS en hielo. Durante este tiempo, se diluyeron (1:50) y mezclaron en PBS los siguientes anticuerpos para FACS: anti CD16/CD32 purificado (para bloquear los receptores para Fc), anti-CD3e biotinilado, anti-CD11b biotinilado, anti-CD45R biotinilado, anti-Ly-6G/Ly-6C biotinilado y anti-Ter- 119 biotinilado, estreptavidina APC-Cy7, anti-Sca1-PE-Cy7, anti-c-Kit-PE-Cy5. Esa mezcla madre se anadio a cada muestra (50 pL), que se mezclo entonces mediante vortex suave y se incubo a 4°C durante 15 minutos en la oscuridad. Despues, las celulas se recogieron por centrifugacion, se lavaron en 2 mL de PBS y se resuspendieron en PBS. Las muestras se analizaron en un FACS Canto II (Becton Dickinson). El procedimiento de identificacion fue como sigue: los parametros de identificacion (“gate”) para las celulas vivas se ajustaron mediante el registro del tamano y complejidad de la muestra (FSC y SSC). Las celulas vivas se discriminaron ademas en base a la expresion de los marcadores de linaje (es decir, CD11b, CD45R, Ly-6G/Ly-6C, Ter-119). Esto permitio definir los “gates” para las celulas Lin-, que fueron analizadas ademas para la expresion de Sca-1 y c-Kit.

Ensayo de acumulacion de AMPc[3H]

Se incubaron las celulas Lin-/sca1 + en 1 mL de medio para celulas madre (Stem Span SFEM, Sten Cell Tech #09650) que contema bencilpenicilina y estreptomicina a 0,5 mg/L , bencilpenicilina y estreptomicina, 50 ng/mL cada una, factor de celula madre murido (mSCF), Flt-3 humana y interleuquina-11 humana (hIL-11) a 50 ng/mL cada una, interleuquina 3 de raton (m-IL3, 10 ng/mL) (todas de PreProTech), adenosina desaminasa a 10 pg/mL (Roche) y adenina[3H] (Perkin 5 Elmer, 1 pCi/mL). La incubacion previa duro 4 h a 37°C. Despues se estimularon las celulas con los compuestos (forskolina, Treprostinil y otros prostanoides; toxina colerica) durante 1 h. A continuacion, se precipitaron las celulas (5 minutos a 100g), se retiro el medio y el precipitado se liso en acido perclorico al 2,5% enfriado en hielo (0,9 mL) que contema 0,1 mM de AMPc, se mantuvo en hielo durante 1 h y se neutralizo con KOH 4,2 M (0,1 mL). Se incubaron previamente, de igual forma, las celulas positivas para los marcadores de linaje, pero el medio contema RPMI en vez 10 de medio para celulas madre sin suero. Se separaron el ATP y el AMPc por cromatograffa de forma secuencial en columnas que conteman Dowex AG50-X8 y alumina neutra (12).

El hecho de que las diferencias solo puedan ser observadas en presencia de forskolina es un problema tecnico -la senal es demasiado baja en ausencia de sensibilizacion por forskolina para ver cualquier diferencia entre los distintos compuestos, es decir, Beraprost y Treprostinil. Sensibilizacion significa que las celulas se han sensibilizado para la 15 respuesta al receptor, ya que estas celulas contienen una cantidad extremadamente baja de AMPc.

Segun la curva de concentracion-respuesta (Figura 5) para Treprostinil, se puede observar claramente que el incremento de AMPc es significativo sin la adicion de forskolina.

Trasplante de medula osea:

Se sometio a irradiacion letal a los ratones isogenicos receptores. Estos ratones mueren durante las dos semanas 20 siguientes si no se les rescata mediante administracion intravenosa de celulas madre hematopoyeticas. Se prepararon las celulas madre hematopoyeticas Lin' (Sca1+ y c-Kit+) tal como se describe arriba y se trataron ex vivo previamente en ausencia o presencia de 10 pM de Treprostinil, de la combinacion de Treprostinil y 30 pM de forskolina (FSK), de 10 pg/mL de toxina colerica durante 1 h a 37°C. Despues, se inyectaron las celulas (3x105 por raton) en la vena de la cola. El recuento de globulos blancos se determino mediante FACS. Se determinaron los numeros de serie blanca 25 cada 5 dfas, empezando por el dfa 9 (en el que el recuento de globulos blancos era “1G/L).

Resultados

Purificacion de celulas madre hematopoyeticas

El procedimiento basado en MACS retiene a las celulas positivas para los marcadores de linaje (Lin+) en las esferas magneticas y permite la recuperacion de las celulas negativas para los marcadores de linaje (Lin-). Se caracterizo la 30 naturaleza de la poblacion celular mediante FACS. Ademas, la poblacion celular retenida por MACS se enriquecio en celulas que se tineron para marcadores espedficos de linaje y que caredan del receptor de celulas madre c-Kit/CD117 (figura 1).

En cambio, las celulas que se recuperaron de la solucion eluida de la columna se localizaron en el cuadrante superior izquierdo; es decir, que mostraron niveles elevados de c-Kit y se deplecionaron de fluorescencia APC-Cy7-A, lo que 35 era indicativo de deplecion de marcadores de linaje (figura 2).

Se evaluaron, ademas, las poblaciones celulares mediante la tincion para ambos, c-Kit y Sca-1 (antfgeno de celula madre-1): las celulas positivas para el linaje caredan de estos dos marcadores (Figura 3A), mientras que la fraccion negativa para el linaje expresaba niveles elevados de c-Kit o de la combinacion de c-Kit y Sca-1 (figura 3B).

Acumulacion de AMPc en celulas c-Kit+ y Sca1 +

40 Se marco metabolicamente con adenina[3H] el reservorio de nucleotidos de adenina de las celulas madre hematopoyeticas (poblacion c-Kit+ y Sca-1+, ver figura 3B) y se examino su respuesta al Treprostinil y a otros agonistas para el receptor para prostaglandinas. Se sensibilizo la enzima mediante el uso de forskolina, dado que estas celulas presentan una respuesta muy modesta de AMPc. Este diterpeno se une en la hendidura para el pseudosustrato localizado entre los dominios catalfticos C1 y C2 y da lugar a varias de las isoformas de la enzima mas sensibles a la 45 protema Gas estimuladora (13-15). Como se puede ver en la figura 4, Treprostinil, Beraprost e Iloprost causaron per

se una acumulacion modesta de AMPc, que fue comparable en magnitud a la inducida por forskolina a 30 pM. Sin embargo, cuando se combino con forskolina, el Treprostinil causo un aumento en los niveles de AMPc que excedio los causados por Iloprost y Beraprost, compuestos espedficos para el receptor IP (prostanoide I). Esto se puede racionalizar si se tiene en cuenta la accion del Treprostinil sobre los receptores EP (prostanoide E) (10). El Treprostinil 50 causo una acumulacion de AMPc dependiente de concentracion en el intervalo de 0,1 a 1,0 pM (figura 5). La EC50 se estimo en el intervalo de 0,3 pM. El Treprostinil no fue capaz de aumentar los niveles de AMPc en la fraccion de celulas hematopoyeticas Lin+ (no se muestran los datos).

Reconstitucion de la medula osea por celulas hematopoyeticas (Lin-, c-Kit+, Sca+)

Se rescataron ratones irradiados de forma letal mediante la inyeccion intravenosa de 3x105 celulas Lin-, c-Kit+, Sca1+. 55 EL recuento de globulos blancos comenzo a aumentar desde el punto mas bajo a dfa 9 y aumentaron lentamente

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durante las siguientes semanas. Se eligio el nivel de globulos blancos a d^a 60 tras la inyeccion de las celulas madre hematopoyeticas como el punto de finalizacion relevante dado que, despues de 60 dfas, las celulas de serie blanca circulantes solo se pueden producir a partir del injerto de celulas madre hematopoyeticas. Como se puede ver en la figura 6, los ratones que se inyectaron con celulas madre hematopoyeticas tratadas previamente con Treprostinil teman niveles significativamente mayores de celulas de serie blanca circulantes que aquellos que recibieron celulas madre hematopoyeticas tratadas con vetnculo (p<0,05, prueba t no pareada).

Como controles adicionales, los animales se inyectaron con

(i) celulas tratadas con toxina colerica, porque es el activador de Gas mas efectivo y persistente

(ii) forskolina, porque, como se menciona arriba, activa directamente las isoformas de la adenilato ciclasa

(iii) la combinacion de forskolina y Treprostinil

Es evidente que el Treprostinil fue tan efectivo como el control positivo con toxina colerica, que se establecio como manipulacion efectiva ex vivo (12).

Ejemplo 2

Aislamiento de celulas madre de medula osea

Se sacrificaron ratones C57BL/6 o C6SJL y las celulas madre de medula osea se aislaron tal como se describe en el ejemplo 1.

Tratamiento in vitro previo de celulas madre aisladas

Se trataron de forma previa las celulas madre de medula osea de ratones C57BL/6 o C6SJL con toxina colerica (CTX) o Treprostinil+ forskolina in vitro (FSK) y se marcaron las celulas madre con Ly5.2 o Ly5.1.

En un primer experimento, se usaron sin tratamiento previo las celulas madre de medula osea de ratones C57BL/6 y las celulas madre se marcaron con Ly5.2. Se trataron de forma previa las celulas madre de medula osea de C6JL con toxina colerica (CTX) o Treprostinil+forskolina in vitro y se marcaron las celulas madre con Ly5.1.

Para estudios comparativos, se introdujo una mezcla 1:1 de celulas Ly5.1+ y Ly5.2+ en ratones mediante trasplante de medula osea y se midio la proporcion inicial de celulas positivas en sangre. Se midio el crecimiento de las celulas tras 16 semanas despues del trasplante de medula osea. Los resultados se muestran en la figura 7, en donde se muestra claramente que las celulas tratadas previamente con Treprostinil/FSK (Ly5.1+) muestran un aumento del crecimiento significativo, comparado con las celulas no tratadas y las celulas tratadas previamente con CT.

En un segundo experimento, se trataron previamente las celulas madre de medula osea de C57BL/6 con toxina colerica o Treprostinil y forskolina in vitro y se marcaron las celulas madre con Ly5.2. Se usaron sin tratamiento alguno las celulas madre de medula osea de ratones C6JL, marcadas con Ly5.1.

De nuevo, para estudios comparativos, se introdujo una mezcla 1:1 de celulas Ly5.1+ y Ly5.2+ en ratones mediante trasplante de medula osea y se midio la proporcion inicial de celulas Ly5.1 y Ly5.2 positivas en sangre. Se midio el crecimiento de las celulas tras 16 semanas despues del trasplante de medula osea. Los resultados se muestran en la figura 8, en donde se demuestra de nuevo claramente que las celulas tratadas previamente con Treprostinil/FSK (Ly5.2+) muestran un aumento del crecimiento significativo, comparado con las celulas no tratadas y con las celulas tratadas previamente con CT. Asf, se puede demostrar que el efecto del Treprostinil y la forskolina es independiente del origen de las celulas de medula osea.

Por ello, una combinacion de Treprostinil y forskolina aumenta el injerto de celulas madre hematopoyeticas y es tan efectivo o aun mas que el tratamiento previo con toxina colerica.

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Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para aumentar la capacidad de injerto de celulas madre hematopoyeticas (HSC) mediante un tratamiento previo ex vivo de las HSC que comprende las siguientes etapas:

   a. mezclar al menos un analogo de prostaciclina junto con un agente activante de AMPc inespedfico, seleccionado preferiblemente entre toxina colerica y forskolina, a una muestra que contiene celulas madre hematopoyeticas para obtener una mezcla,

   b. incubar dicha mezcla durante un periodo de tiempo suficiente para estimular la senalizacion de G alfas en dichas celulas y, opcionalmente,

   c. aislar dichas celulas estimuladas.
2. 2. Un metodo segun la reivindicacion 1, en donde dicho analogo de prostaciclina se selecciona del grupo de Treprostinil, Iloprost, Cicaprost y Beraprost o sales de los mismos farmaceuticamente aceptables.
3. 3. Un metodo segun las reivindicaciones 1 y 2, en donde dicho analogo de prostaciclina es Treprostinil, espedficamente dicho Treprostinil es un derivado de Treprostinil seleccionado del grupo de derivados acidos de Treprostinil, profarmacos de Treprostinil, polimorfos de Treprostinil e isomeros de Treprostinil.
4. 4. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha muestra es medula osea.
5. 5. Una composicion que comprende al menos un analogo de prostaciclina junto con un agente activante de AMPc inespedfico, seleccionado preferiblemente entre toxina colerica y forskolina, para uso en el tratamiento de individuos que necesitan un trasplante de medula osea, que padecen leucemia o un defecto del compartimento de celulas sangumeas o enfermedades de la medula osea inducidas por quimioterapia o radioterapia.
6. 6. Una composicion para uso segun la reivindicacion 5, en donde dicho analogo de prostaciclina se selecciona del grupo de Treprostinil, Iloprost, Cicaprost y Beraprost o sales de los mismos farmaceuticamente aceptables.
7. 7. Una composicion para uso segun las reivindicaciones 5 o 6, en donde dicho analogo de prostaciclina es Treprostinil, preferiblemente un derivado de Treprostinil seleccionado del grupo de derivados acidos de Treprostinil, profarmacos de Treprostinil, polimorfos de Treprostinil e isomeros de Treprostinil.
8. 8. Una composicion para uso segun la reivindicacion 5, en donde dicho defecto del compartimento de celulas sangumeas es hemoglobinopatfa o un defecto en la funcion de granulocitos neutrofilos.
9. 9. Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, para uso en el tratamiento de individuos que necesitan un trasplante de medula osea, que padecen leucemia o un defecto del compartimento de celulas sangumeas o enfermedades de la medula osea inducidas por quimioterapia o radioterapia, mediante administracion de un analogo de prostaciclina junto con un agente activante de AMPc inespedfico, durante 7 dfas al menos, preferiblemente durante 10 dfas al menos, preferiblemente durante 14 dfas al menos, despues del trasplante de medula osea.
10. 10. Una composicion que comprende al menos un analogo de prostaciclina junto con un agente activante de AMPc inespedfico, seleccionado preferiblemente entre toxina colerica y forskolina, y celulas madre hematopoyeticas estimuladas.
11. 11. Una composicion segun la reivindicacion 10, que es una composicion farmaceutica.
12. 12. Una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 para administracion intravenosa o subcutanea.
13. 13. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichas celulas madre son derivadas de sangre de cordon, medula osea de donante o placenta.